特表2024-515620生物学的製剤の薬理動態および脳透過性を予測するためのインビトロにおける細胞ベースのアッセイ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】生物学的製剤の薬理動態および脳透過性を予測するためのインビトロにおける細胞ベースのアッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240403BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240403BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240403BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
C12Q1/06
C12Q1/6851 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562826
(86)(22)【出願日】2022-04-12
(85)【翻訳文提出日】2023-12-05
(86)【国際出願番号】 US2022024345
(87)【国際公開番号】W WO2022221236
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/174,913
(32)【優先日】2021-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/187,750
(32)【優先日】2021-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リュウ， チャン
(72)【発明者】
【氏名】ロウ， ジョン ホク ニン
(72)【発明者】
【氏名】チャン， シャン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045DA36
2G045DA37
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(57)【要約】
本開示は、分子の経細胞輸送またはリサイクルを測定するために有用な方法および組成物に関する。特に、本開示は、ヒトおよび動物における治療用抗体分子およびＦｃ融合タンパク質のクリアランス速度を評価するためのインビトロ受容体依存性経細胞輸送またはリサイクルアッセイに関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の分子のリサイクルを決定することを含む方法であって、前記決定することが、前記複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、
前記第１のチャンバーが、細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーが水溶液を含む、導入すること；
前記複数の分子を前記第１のチャンバー内でインキュベートすること；
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーの両方で前記水溶液を交換すること；ならびに
前記細胞層から前記第１のチャンバー内に放出される前記複数の分子の量を測定すること、を含み
前記水溶液が生理学的ｐＨにあり、前記細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、方法。
【請求項2】
前記細胞層が細胞単層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記分子輸送を媒介する受容体が、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記分子輸送を媒介する受容体が、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞層から放出される前記複数の分子の量を測定することが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記複数の分子がＦｃ含有分子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記複数の分子が抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＦｃＲｎが、ヒトＲｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞層を横切って前記複数の分子の経細胞輸送を測定することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記経細胞輸送を測定することが、前記水溶液が前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーの両方で交換された後、前記第２のチャンバー内の前記複数の分子の量を測定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
薬剤の存在下で前記第１のチャンバー内で前記複数の分子をインキュベートすることと、前記薬剤が前記複数の分子の前記リサイクルに影響を及ぼすかどうかを決定することとを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
複数の分子の組織浸透性を決定する方法であって、ａ） 前記複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、前記第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーは水溶液を含み；
前記水溶液が生理学的ｐＨにあり、前記細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；
ｂ） 前記第１のチャンバーから前記細胞層にリサイクルされ、前記第１のチャンバーに戻る前記複数の分子の量を測定すること；
ｃ） 前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに経細胞輸送される前記複数の分子の量を測定すること；ならびに
ｄ） 前記複数の分子の前記組織浸透性を、経細胞輸送される分子とリサイクルされる分子との比に基づいて決定することを含む、方法。
【請求項14】
リサイクルされる前記複数の分子を測定することが、前記複数の分子を前記第１のチャンバーに導入した後、前記複数の分子を前記第１のチャンバー内でインキュベートすること；
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーの両方で前記水溶液を交換すること；ならびに
前記細胞層から前記第１のチャンバー内に放出される前記複数の分子の量を測定することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
経細胞輸送される前記複数の分子を測定することが、前記複数の分子を前記第１のチャンバーに導入した後、前記複数の分子を前記第１のチャンバー内でインキュベートすること；
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーの両方で前記水溶液を交換すること；ならびに
前記細胞層から前記第２のチャンバー内に放出される前記複数の分子の量を測定することを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞層が細胞単層を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記分子輸送を媒介する受容体が、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリンである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記分子輸送を媒介する受容体が、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
リサイクルされる前記複数の分子の量を測定すること、および経細胞輸送される前記複数の分子の量を測定することが、独立して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、質量分析、またはそれらの任意の組合せの使用を含む、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記複数の分子がＦｃ含有分子である、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記複数の分子が抗体である、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記組織浸透性が脳浸透性である、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
薬剤の存在下で前記第１のチャンバー内で前記複数の分子をインキュベートすることと、前記薬剤が前記複数の分子の前記組織浸透性に影響を及ぼすかどうかを判定することとを含む、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
複数の分子の薬物動態（ＰＫ）パラメータを決定する方法であって、ａ） 前記複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、前記第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーは水溶液を含み；
前記水溶液が生理学的ｐＨにあり、前記細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；
ｂ） 前記第１のチャンバーから前記細胞層にリサイクルされ、前記第１のチャンバーに戻る前記複数の分子の量を測定すること；ならびに
ｃ） リサイクルされる前記複数の分子の量に基づいて前記ＰＫパラメータを決定することを含む、方法。
【請求項27】
リサイクルされる前記複数の分子を測定することが、前記複数の分子を前記第１のチャンバーに導入した後、前記複数の分子を前記第１のチャンバー内でインキュベートすること；
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーの両方で前記水溶液を交換すること；ならびに
前記細胞層から前記第１のチャンバー内に放出される前記複数の分子の量を測定することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞層が細胞単層を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞が異種ＦｃＲｎを発現する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
リサイクルされる前記複数の分子の量を測定することが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記複数の分子がＦｃ含有分子である、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記複数の分子が抗体である、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記ＰＫパラメータが、前記複数の分子のインビボクリアランス、分布容積、曲線下面積（ＡＵＣ）またはインビボにおける半減期の測定値である、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
薬剤の存在下で前記第１のチャンバー内で前記複数の分子をインキュベートすることと、前記薬剤が前記複数の分子の前記ＰＫパラメータに影響を及ぼすかどうかを判定することとを含む、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
ａ） 各チャンバーが生理学的ｐＨの水溶液を含む、第１のチャンバーおよび第２のチャンバー；ｂ） 前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーを分離する細胞層であって、前記第１のチャンバーから前記細胞層内へ、および前記第１のチャンバー内に戻る分子のリサイクルを媒介し得る、細胞層；
ｃ） 前記第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器、を備えるアッセイ系であって；
前記アッセイ系は、複数の分子のリサイクルを決定するように構成され、前記決定することは：
前記複数の分子を前記第１のチャンバーに導入すること；
前記複数の分子を前記第１のチャンバー内でインキュベートすること；
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーの両方で前記水溶液を交換すること；ならびに
前記細胞層から前記第１のチャンバー内に放出される前記複数の分子の量を測定することを含む、アッセイ系。
【請求項38】
前記アッセイ系が、前記第２のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器をさらに備え；
前記細胞層が、前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を媒介し得るものであり；および
前記アッセイ系が、前記細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を決定するように構成され、経細胞輸送を決定することが、前記水溶液が交換された後に、前記第２のチャンバー内の前記複数の分子の量を測定することを含む、請求項３７に記載のアッセイ系。
【請求項39】
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーが、９６ウェルのトランスウェルプレートの構成要素である、請求項３７または３８に記載のアッセイ系。
【請求項40】
請求項３７～３９のいずれか一項に記載のアッセイ系と、使用説明書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，９１３号、および２０２１年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１８７，７５０号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、２０２１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，９１３号、および２０２１年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１８７，７５０号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
【0002】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年３月１５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名称は「Ｐ３６５７２－ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ」であり、サイズは１６，５８４バイトである。
【0003】
本開示は、細胞層による分子のリサイクルを測定するのに有用な方法および組成物に関する。特に、本開示は、ＦｃＲｎと相互作用する分子、例えば治療用抗体、Ｆｃ融合分子、およびアルブミンに連結された分子のインビボ薬物動態プロファイル（例えば、クリアランス速度および／または半減期）および組織浸透を評価するためのインビトロ受容体依存性リサイクルアッセイ、ならびにリサイクルおよび経細胞輸送アッセイに関する。
【背景技術】
【0004】
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々な疾患の処置におけるそれらの立証された効果およびそれらの望ましい薬理特性により、世界中で主要なクラスの医薬品製品となってきている。ｍＡｂ薬の好都合な薬理特性の１つは、それらの典型的には長い循環半減期である。バイオ医薬品の半減期を延長することにより、薬剤の投与頻度の低下および／または投与量の低下が可能になり、これにより、医療コストが低減し、患者のコンプライアンスが改善し、および／または濃度依存性細胞傷害性／有害事象が低減され得る。
【0005】
動物およびヒトにおけるｍＡｂ薬の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを理解することにおいては、著しい進歩がなされてきた。多くのｍＡｂ薬物は、内因性ＩｇＧに類似するＰＫ挙動を示すが、ヒトにおけるｍＡｂ薬物の非特異的クリアランス速度の実質的な不均一性が依然として一般的に観察されている。したがって、望ましいＰＫ特性に関する臨床候補の評価および選択は、薬物開発中の初期における重要な段階である。インシリコ、インビトロおよびインビボ分析を伴う広範囲の技術が、ヒトにおけるｍＡｂのＰＫ挙動を評価し、および／または予測するために用いられてきたＤｏｓｔａｌｅｋら，２０１７，ＭＡｂｓ ９（５）：７５６－７６６）。しかしながら、動物からヒトへ、およびインビトロアッセイからインビボ読み出しへのＰＫデータの翻訳は、薬物開発者にとっては分かりにくいままである（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒら，２０１２，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３（４）：７３－９２）。さらに、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ａｖｅｒｙら，２０１６，ＭＡｂｓ，８（６），１０６４－１０７８）および非ヒト霊長類（Ｄｅｎｇら，２０１１，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３８（４）：６００－６０５）などのいくつかの動物モデルは、ｍＡｂのヒトＰＫを予測するために首尾よく使用されているが、これらの研究は、通常は時間がかかり、費用がかかり、動物の犠牲を伴う。
【0006】
動物試験およびインビトロアッセイからｍＡｂのヒトＰＫを予測する際には、多くの複雑さがある。標的介在性の薬物体内動態（ＴＭＤＤ）は、ｍＡｂの用量依存性ＰＫ挙動に影響を及ぼして、非線形分布および排除をもたらすことが公知である。ＴＭＤＤの非存在下で、ｍＡｂは、標的非依存性の分子特異的な薬物異化作用を反映した線形排除および非特異的クリアランス速度を示すことが期待される。ｍＡｂの非特異的クリアランスは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）介在性サベージ経路が主要な役割を果たす細網内皮系におけるリソソーム分解によって主に介在される。構造的に、ＦｃＲｎは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ様分子と相同の膜貫通重鎖（ＦＣＧＲＴ）および可溶性軽鎖、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）で構成される、ヘテロ二量体である。ＦｃＲｎは、酸性ｐＨ（６．５未満）で内因性ＩｇＧのＦｃドメインと結合するが、中性または塩基性ｐＨ（７．０超）では最小限のみである。この独自の特性は、ＦｃＲｎがＦｃ含有分子を、細胞への分子の取り込み後に酸性エンドソームにおいて結合することにより分解から保護し、次いで、それらを細胞表面へ輸送して戻し、生理的ｐＨで循環中に放出することを可能にする。対照的に、ＦｃＲｎに結合していない内在化分子は、分解のためにリソソームに誘導される（図１およびＲｏｏｐｅｎｉａｎら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｓｅｐ；７（９）：７１５－２５を参照されたい）。
【0007】
Ｆｃ含有タンパク質の半減期の延長におけるＦｃＲｎの寄与は十分に認識されているが（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら，２００３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７０（７），３５２８－３５３３）、ヒトにおけるｍＡｂ薬物についてのＦｃＲｎ結合とＰＫとの間に相関がないという報告（Ｓｕｚｕｋｉ，２０１０；Ｚｈｅｎｇ，２０１１；Ｈｏｔｚｅｌ，２０１２）は、ＦｃＲｎに対する結合親和性がＦｃ含有タンパク質の排出速度の唯一の決定因子ではないことを示唆している。細胞内移動におけるＦｃＲｎの機能を考慮すると、Ｆｃ含有分子／ＦｃＲｎ複合体のエンドソーム選別および移動の動力学は、ＦｃＲｎ介在性サルベージ機序の全体的効率、およびそれ故、分子の非特異的クリアランス速度に影響を及ぼす可能性が高い。さらに、飲作用またはエンドサイトーシスによる細胞取り込みのプロセス、ならびにリソソームにおける分解もまた、ｍＡｂ分解の速度および程度の決定において役割を果たし得る（ＪｕｎｇｈａｎｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９６，ＰＮＡＳ９３（１１），５５１２－５５１６）。最後に、電荷／ｐＩ、疎水性、非特異的結合および他の因子などの生化学的特徴が、ｍＡｂの体内動態に影響を及ぼすことが報告されている（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎら，２０１５，ＭＡｂｓ７（３），４８３－４９３；Ｉｇａｗａら，２０１０Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ２３（５），３８５－３９２；Ｓｈａｒｍａら，２０１４ＰＮＡＳ１１１（５２）；Ｈｏｔｚｅｌら，２０１２ＭＡｂｓ４（６），７５３－７６０）。これらの分子特徴は、ＦｃＲｎとの「真の」相互作用をｉｎ ｖｉｖｏで変更するように、それら自体がｍＡｂ構造に影響し得るか、または、内在化のモード／速度ならびにリサイクリングおよび経細胞輸送を含むＦｃＲｎ介在性細胞内移動経路の相対的割合を変更する非特異的細胞表面結合に寄与し得る。
【0008】
げっ歯類および非ヒト霊長類で行われるインビボ動物試験は、ヒトにおける治療抗体のＰＫを予測するために一般的に使用される（Ａｖｅｒｙら，ＭＡｂｓ，２０１６，８（６），１０６４－１０７８；Ｄｅｎｇら，ＭＡｂｓ ２０１１，３（１），６１－６６）。これらのアプローチは、動物を犠牲にすることを必要とし、費用対効果が低く、ハイスループット方式で行い得ない。経験的なスケーリング法に基づいて、いくつかの場合、動物試験におけるＰＫは、ヒトにおけるＰＫの異種間差を忠実に予測し得ず、ＦｃＲｎ結合の種差、標的媒介性薬物体内動態、および示差的免疫応答の誘発に起因することが実証された（Ｗａｎｇら，２０１６，Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ，３７（２），５１－６５）。インビトロアッセイに対する取り組みは、時間および費用をかけずに、かつ、動物を節約するアプローチでＰＫを評価するために使用されている。これらの方法論のほとんどは、非特異的結合などのＰＫに影響を及ぼし得る分子特性（Ｈｏｔｚｅｌら，ＭＡｂｓ２０１２，４（６），７５３－７６０）、ＦｃＲｎの相互作用（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら，ＭＡｂｓ２０１３，５（４），５７６－５８６；Ｓｏｕｄｅｒｓら，ＭＡｂｓ２０１５，７（５），９１２－９２１）およびヘパリンまたは細胞外マトリックス（ｄｅ Ｒｉｄｄｅｒら，Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ２０１３，３５（１），６０－６３；Ｋｒａｆｔら，ＭＡｂｓ２０２０，１２（１））の１つまたはサブセットを考慮に入れる。これらの方法は、通常、カットオフ閾値に依存し、時折、直接的ＰＫ予測においては成功することが限られ、予測精度を改善するために別の方法と組み合わせなければならなかった。
【0009】
抗体の実際の挙動のためのインビトロモデルがないことは、脳への浸透の状況における特に問題となる。中枢神経系（ＣＮＳ）障害は深刻な健康上の負担であり、何十年もの間、ＣＮＳ障害のための有効な治療法を開発する強い動機があった。血液脳関門は、密着結合を有する内皮細胞（その他）を含む高度に特殊化された組織であり、血流からＣＮＳへの現在の治療薬の大部分の輸送を防ぐなど、脳への分子の通過を調節している。分子の脳浸透を改変するための様々な方法があるが、それらの有効性を評価するためのロバストなモデルなしで前臨床薬物開発にこれらの方法を適用することは非常に困難である。既存のモデルとインビボ結果との間の相関が低いため、潜在的な治療薬の脳浸透を経験的に試験しなければならないことが多く、これには時間がかかり、費用がかかる。
【0010】
ヒトＦｃＲｎを発現するように改変されたヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ１）株が開発され、評価され、リサイクル／残留ｍＡｂ比がヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるそれらの血清半減期と相関することが見出された（Ｇｒｅｖｙｓら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ２０１８，９（１），６２１）。しかし、データセットは、はるかに増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する操作されたＩｇＧに限定されたが、治療用抗体においてより一般的に使用された正常なＩｇＧフレームワークを含まなかった。さらに、細胞を通常の細胞培養プレートで培養したが、これは細胞の極性化には理想的ではなく、経細胞輸送成分がリサイクルサンプルに混入する可能性がある。
【0011】
したがって、治療分子の評価および選択を支援するために短時間で合理的なコストで実施し得る治療分子のインビボにおけるＰＫ特性（例えば、クリアランス、半減期など）および脳への浸透を予測する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0012】
本開示は、目的の分子のリサイクル、ならびに目的の分子のリサイクルおよび経細胞輸送を含む、細胞膜への、および細胞膜からの目的の分子の移動または輸送を測定するのに有用な方法、アッセイ、アッセイ系、キットおよび組成物に関する。特に、本開示は、治療用抗体、Ｆｃ融合分子、およびアルブミンに連結された分子などの分子を含む、分子輸送受容体（例えば、ＦｃＲｎ）と相互作用する分子のインビボ薬物動態プロファイル（例えば、インビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿中濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）を含む）の評価のためのインビトロ受容体依存性経細胞輸送おおびリサイクルアッセイを提供する。本明細書で提供される方法およびアッセイは、他の方法と比較して、試験分子（抗体を含む）のインビボＰＫ挙動に影響を及ぼし得る複数の因子、例えば非特異的結合および細胞表面との相互作用、ｐＨ依存性結合（例えば、ＦｃＲｎ結合）および細胞内輸送経路をより十分に包含し得る。本明細書で提供される方法およびアッセイは、他の方法と比較して、目的の分子（抗体を含む）のインビボ組織浸透性（脳浸透性など）をより十分に予測および／またはモデル化し得る。他の方法および／またはアッセイと比較して、細胞の頂端側－基底側極性化の改善、および／または経細胞輸送成分に対するリサイクルのより明確な評価をさらに提供し得る方法およびアッセイが提供される。
【0013】
特定の実施形態では、本開示は、複数の分子のリサイクルを決定する方法に関する。例えば、決定することは、複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが、細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが水溶液を含む、導入すること；複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含み得；水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む。
【0014】
特定の実施形態では、本方法は、細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を測定することをさらに含む。特定の実施形態では、経細胞輸送を測定することが、水溶液が交換された後に、第２のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む。
【0015】
特定の実施形態では、本方法は、薬剤の存在下で第１のチャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子のリサイクルに影響を及ぼすかどうかを決定することとを含む。
【0016】
特定の実施形態では、本開示は、複数の分子の組織浸透性を決定する方法であって、ａ）複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；ｂ）第１のチャンバーから細胞層にリサイクルされ、第１のチャンバーに戻る複数の分子の量を測定すること；ｃ）第１のチャンバーから第２のチャンバーに経細胞輸送される複数の分子の量を測定すること；ならびにｄ）複数の分子の組織浸透性を、経細胞輸送される分子とリサイクルされる分子との比に基づいて決定することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、組織浸透性は脳浸透性である。
【0017】
特定の実施形態では、リサイクルされる複数の分子を測定することは、複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む。
【0018】
特定の実施形態では、経細胞輸送される複数の分子を測定することは、複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第２のチャンバー内に放出される分子の量を測定することを含む。
【0019】
特定の実施形態では、リサイクルされる複数の分子の量を測定すること、および経細胞輸送される複数の分子の量を測定することは、独立して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、質量分析、またはそれらの任意の組合せの使用を含む。特定の実施形態では、組織浸透性は脳浸透性である。
【0020】
特定の実施形態では、本方法は、薬剤の存在下で第１のチャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子の組織浸透性に影響を及ぼすかどうかを決定することとを含む。
【0021】
特定の実施形態では、本開示は、複数の分子の薬物動態（ＰＫ）パラメータを決定する方法であって、ａ）複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；ｂ）第１のチャンバーから細胞層にリサイクルされ、第１のチャンバーに戻る複数の分子の量を測定すること；ｃ）リサイクルされる複数の分子の量に基づいてＰＫパラメータを決定することを含む、方法に関する。
【0022】
特定の実施形態では、リサイクルされる複数の分子を測定することは、複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む。
【0023】
特定の実施形態では、細胞は異種ＦｃＲｎを発現する。特定の実施形態では、リサイクルされる複数の分子の量を測定することは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む。
【0024】
特定の実施形態では、ＰＫパラメータは、複数の分子のインビボクリアランス、分布容積、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、またはインビボにおける半減期の測定値である。
【0025】
特定の実施形態では、本方法は、薬剤の存在下で第１のチャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子のＰＫパラメータに影響を及ぼすかどうかを判定することとを含む。
【0026】
特定の実施形態では、複数の分子は、複数の単一分子である。特定の実施形態では、複数の分子は、複数の別個の分子である。特定の実施形態では、細胞層は細胞単層を含む。特定の実施形態では、分子輸送を媒介する受容体は、分子の細胞内輸送を媒介する受容体である。特定の実施形態では、分子輸送を媒介する受容体は、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリン（ｃｕｂｕｌｉｎ）である。特定の実施形態では、分子輸送を媒介する受容体は新生児型のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である。
【0027】
特定の実施形態では、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞または腎臓細胞である。特定の実施形態では、細胞は、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である。
【0028】
特定の実施形態では、細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む。
【0029】
特定の実施形態では、複数の分子は、第１のチャンバー内で約１時間～約４８時間インキュベートされる。特定の実施形態では、複数の分子は、第１のチャンバー内で約１時間～約３０時間インキュベートされる。特定の実施形態では、水溶液を交換することは、第１のチャンバーを洗浄することを含む。特定の実施形態では、本方法は、測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む。特定の実施形態では、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは、測定前に１時間～６時間、置換水溶液とインキュベートされる。特定の実施形態では、インキュベーションは約３５℃～約３９℃の温度で行われる。
【0030】
特定の実施形態では、複数の分子はＦｃ含有分子である。特定の実施形態では、Ｆｃ含有分子は受容体Ｆｃ融合分子である。特定の実施形態では、複数の分子は抗体である。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、ＦｃＲｎは、ヒトＲｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびカニクイザルＦｃＲｎからなる群から選択される。
【0031】
特定の実施形態では、生理学的ｐＨは約７．４である。
【0032】
特定の実施形態では、本開示は、ａ）各チャンバーが生理学的ｐＨの水溶液を含む、第１のチャンバーおよび第２のチャンバー；ｂ）第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを分離する細胞層であって、第１のチャンバーから細胞層内へ、および第１のチャンバー内に戻る分子の再循環を媒介し得る、細胞層；ｃ）第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器を備えるアッセイ系であって；該アッセイ系は、複数の分子のリサイクルを決定するように構成され、決定することは：複数の分子を第１のチャンバーに導入すること；複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、アッセイ系に関する。
【0033】
特定の実施形態では、アッセイ系は、第２のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器をさらに備え；細胞層は、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を媒介し得るものであり；および細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を決定するように構成され、経細胞輸送を決定することは、水溶液が交換された後に、第２のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む。
【0034】
特定の実施形態では、本開示は、本開示のアッセイ系および／または方法を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【発明を実施するための形態】
【0044】
本開示の主題を実施する際には、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学における多くの従来技術が使用される。これらの技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第３版，Ｊ．Ｆ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，編．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｌｖｙｎ Ｌｉｔｔｌｅ，編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，１９８７，およびｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”（Ｍｕｌｌｉｓら，編，１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓら，２００１）にさらに詳細に記載されている。これらの参考文献、ならびに製造業者の使用説明書を含む、当業者に広く公知でありかつ信頼されている標準プロトコールを含有する他の参考文献の内容は、参照により本開示の一部として本明細書に組み込まれている。
【0045】
１．定義
別途指定のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語、表記法、および他の科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図されている。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語は、明確性および／または容易な参照のために本明細書に定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、必ずしも、当該技術分野において一般に理解されるものに対する実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。
別途指定のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語、表記法、および他の科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図されている。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語は、明確性および／または容易な参照のために本明細書に定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、必ずしも、当該技術分野において一般に理解されるものに対する実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。
【0046】
本明細書で使用される用語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）」）、「有する」（「ｈａｖｉｎｇ」「ｈａｓ」）、「～できる」（「ｃａｎ」）「含有する」（「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）」）、およびこれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドの移行句、用語または単語であることが意図されている。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうではない場合を除き、複数の指示対象を含む。また、本開示では、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、それら「から成る」、およびそれら「から本質的に成る」他の実施形態も企図されている。
【0047】
本明細書で用いられる場合、「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内であることを意味し、これは、一部には、値を測定または決定する方法、すなわち、測定システムの制限に依存するものである。例えば、「約」とは、ある特定の実施形態では、当該技術分野での１回の実施当たり３つまたは３つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」とは、ある特定の実施形態では、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、例えば５倍以内、または２倍以内を意味し得る。
【0048】
本明細書で使用する場合、用語「培地」および「細胞培養培地」は、細胞を成長させるまたは維持するために使用される栄養源を指す。当業者には理解されるように、該栄養源は、成長および／もしくは生残のために細胞によって必要とされる成分を含有してよく、または細胞成長および／もしくは生残を支援する成分を含有してよい。ビタミン、必須または非必須アミノ酸（例えば、システインおよびシスチン）、および微量元素（例えば、銅）は、培地成分の例である。本明細書で提供される任意の培地は、インスリン、植物加水分解物および動物加水分解物のうちのいずれか１つまたは複数を補充したものであってもよい。
【0049】
本明細書で使用される場合、「薬物動態（ＰＫ）パラメータ」という語句は、限定するものではないが、複数の分子のインビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）、またはインビボにおける半減期（ｔ１／２）を含む、当技術分野で公知の様々なＰＫパラメータのいずれかを指す。
【0050】
本明細書で使用される場合、「クリアランス」という用語は、分子またはポリペプチドが動物の血流から除去される速度を指す。動物は、例えば、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット、または他の齧歯動物）、非ヒト霊長類（カニクイザルなど）、イヌまたはヒトなどの哺乳動物であり得る。
【0051】
本明細書で使用される場合、「生理学的ｐＨ」という用語は、約６．５～約８．０のｐＨを指す。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５～約８．０の間の任意の値、例えば、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８もしくは約７．９、または約６．５～約８．０の範囲内の任意の範囲である。
【0052】
細胞を「培養すること」とは、細胞を、細胞の生残および／または成長および／または増殖に好適な条件下にて、細胞培養培地と接触させることを意味する。
【0053】
本明細書で使用する場合、「分子」は、一般に、アッセイの対象である分子を指す。例えば、限定するものではないが、分子は、ＦｃＲｎに天然に結合する（例えば、ポリペプチド、抗体、Ｆｃ含有分子など）か、またはＦｃＲｎに結合するように操作された任意の分子、例えば、限定するものではないが、アルブミン含有分子、ペプチドタグもしくは他のアミノ酸配列を介してＦｃＲｎに結合するように操作された分子、抗体、抗体断片、または以下に定義されるポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得る。そのようなポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体は、天然に存在しないアミノ酸、非アミノ酸リンカーまたはスペーサーを含むが、これらに限定されない、天然に存在しない態様を含み得、他の組成物、例えば、小分子または大分子治療薬とのコンジュゲートを含み得る。
【0054】
本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」は、概して、約１０より多くのアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を指す。ポリペプチドは、宿主細胞に相同であることができる、または好ましくは、外因性であることができる。後者は、利用される宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞により産生されるヒトタンパク質、または、哺乳動物細胞により産生される酵母ポリペプチドに対して異種である、すなわち、外部のものである、ということを意味する。特定の実施形態では、哺乳動物ポリペプチド（元々、哺乳動物生命体に由来したポリペプチド）が使用され、ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドが培地に直接分泌される。
【0055】
「タンパク質」という用語は、高次の三次構造および／または四次構造を生成するのに十分な鎖長を持つアミノ酸の配列を指す。これは、そのような構造を有しない「ペプチド」または他の低分子量の薬物と区別するためである。典型的には、本明細書のタンパク質は、少なくとも約１５～２０ｋＤ、特定の実施形態では、少なくとも約２０ｋＤの分子量を有する。本明細書の定義に包含されるタンパク質の例には、全ての哺乳動物タンパク質、特に治療用タンパク質および診断用タンパク質、例えば治療用抗体および診断用抗体、ならびに１以上の鎖間ジスルフィド結合および／または鎖内ジスルフィド結合を含む多重鎖ポリペプチドを含めた、１以上のジスルフィド結合を含むタンパク質が一般に含まれる。
【0056】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体、および所望の抗原結合活性を示す抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な種類の抗体および抗体構造を包含する。
【0057】
本明細書で使用する場合、抗体の「抗体断片」、「抗原結合部」（もしくは単に「抗体部」）、または、抗体の「抗原結合断片」とは、抗原および／またはエピトープに結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２が挙げられるが、これらに限定されない。ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体から形成された抗体断片が挙げられる。
【0058】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を含む個々の抗体は、例えば天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のあるバリアント抗体を除いて、同一であるおよび／または同じエピトープに結合し、そのようなバリアントは一般に少量存在する。モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴を、抗体の実質的に均一な集団から得られると示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に開示される主題に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法が挙げられるが、これらに限定されない、様々な技術によって作製し得、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【0059】
「ハイブリドーマ」という用語は、免疫原の不死化細胞株と、抗体産生細胞との融合により産生される、ハイブリッド細胞株を意味する。この用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株とを融合した後、トリオーマ細胞株として一般に知られる形質細胞と融合した結果である、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の後代を包含する。さらに、この用語は、抗体を産生する、あらゆる不死化ハイブリッド細胞株、例えばクアドローマなどを含むことを意味する。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３（１９８３）を参照のこと。
【0060】
本明細書で使用される場合、用語「細胞」とは、動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、宿主細胞、組み換え細胞、および組み換え宿主細胞を意味する。このような細胞は一般に、適切な栄養素および／または成長因子を含有する培地に配置されたときに、増殖および生残可能な哺乳動物組織から入手される、またはその組織に由来する細胞株である。
【0061】
本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」という用語は、チャイニーズハムスター卵巣細胞により産生されるヒトタンパク質をコードしている遺伝子、または哺乳動物細胞において産生される酵母ポリペプチドをコードしている遺伝子等、利用されている宿主細胞に対して外部のものであるタンパク質をコードしている遺伝子を指す。
【0062】
本明細書で使用される場合、「複数の分子」には、複数の単一の分子、および複数の異なる分子が含まれる。複数の単一分子は、例えば、同じ抗体の２つ以上の物理的分子、同じ抗体断片の２つ以上の物理的分子、同じポリペプチドの２つ以上の物理的分子、または同じＦｃ含有分子の２つ以上の物理的分子、または別の目的の分子の２つ以上の物理的分子であり得る。複数の異なる分子としては、１つの分子タイプの混合物（例えば、少なくとも２つの異なる抗体の物理的分子、少なくとも２つの異なる抗体断片の物理的分子、少なくとも２つの異なるポリペプチドの物理的分子、または少なくとも２つのＦｃ含有分子の物理的分子）が挙げられるが、また分子タイプ間の混合物（例えば、１つ以上の抗体および１つ以上のポリペプチドの物理的分子；または１つ以上の抗体断片、１つ以上のポリペプチド、および１つ以上のＦｃ含有分子など）が挙げられ得る。
【0063】
本明細書で使用される場合、「試験分子」および「目的の分子」は、本明細書に記載されるアッセイ、方法、キット、およびシステムで評価される複数の分子の同一性を指す。複数の分子について記載されるように、そのような用語は、単一のタイプの分子（例えば、１つの抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）および２つ以上のタイプの分子（例えば、２つ以上の抗体、抗体断片、ポリペプチドもしくはＦｃ含有分子、またはカテゴリーの組み合わせ）の両方を包含する。
【0064】
本明細書で使用される場合、「小分子」は、約２０００ダルトン以下、または好ましくは約５００ダルトン以下の分子量を有する、タンパク質またはポリペプチド以外の分子を指す。
【0065】
２．概要
本開示は、目的の分子（図１に示すような）のリサイクルなどの、細胞膜への、および細胞膜からの目的の分子の移動または輸送を測定するのに有用な方法、アッセイ、アッセイ系、キットおよび組成物に関する。本開示はさらに、目的の分子（図１に示すような）の経細胞輸送およびリサイクルを測定するために有用な方法アッセイ、アッセイ系、キットおよび組成物に関する。特に、本開示は、治療用抗体分子のクリアランス速度および／または半減期などのＰＫパラメータを評価するためのインビトロ受容体依存性リサイクルおよび経細胞輸送アッセイに関する。本明細書で詳細に開示されるように、本開示の方法によって測定された目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）の、場合により経細胞輸送とさらに組み合わせたリサイクルは、その分子のインビボクリアランスなどの細胞のＰＫ特性と高度に関連する可能性がある。したがって、目的の分子のリサイクル、場合によっては経細胞輸送とリサイクルとの組み合わせを測定するための請求項に記載されている方法を使用して、分子のインビボクリアランス、ならびに複数の分子の半減期、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティおよび最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）などの他のＰＫパラメータを評価し得る。さらに、本開示の方法によって測定された、場合により経細胞輸送とさらに組み合わせた、目的の分子（例えば、抗体またはその抗体断片）のリサイクルは、インビボでの当該目的の分子の組織浸透と高度に関連する可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、目的の分子のリサイクル、およびいくつかの例では経細胞輸送とリサイクルとの組み合わせを測定するための請求項に記載された方法を使用して、当該目的の分子のインビボ組織浸透性を評価し得る。組織浸透性は、例えば、脳浸透性を含む場合がある。
本開示は、目的の分子（図１に示すような）のリサイクルなどの、細胞膜への、および細胞膜からの目的の分子の移動または輸送を測定するのに有用な方法、アッセイ、アッセイ系、キットおよび組成物に関する。本開示はさらに、目的の分子（図１に示すような）の経細胞輸送およびリサイクルを測定するために有用な方法アッセイ、アッセイ系、キットおよび組成物に関する。特に、本開示は、治療用抗体分子のクリアランス速度および／または半減期などのＰＫパラメータを評価するためのインビトロ受容体依存性リサイクルおよび経細胞輸送アッセイに関する。本明細書で詳細に開示されるように、本開示の方法によって測定された目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）の、場合により経細胞輸送とさらに組み合わせたリサイクルは、その分子のインビボクリアランスなどの細胞のＰＫ特性と高度に関連する可能性がある。したがって、目的の分子のリサイクル、場合によっては経細胞輸送とリサイクルとの組み合わせを測定するための請求項に記載されている方法を使用して、分子のインビボクリアランス、ならびに複数の分子の半減期、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティおよび最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）などの他のＰＫパラメータを評価し得る。さらに、本開示の方法によって測定された、場合により経細胞輸送とさらに組み合わせた、目的の分子（例えば、抗体またはその抗体断片）のリサイクルは、インビボでの当該目的の分子の組織浸透と高度に関連する可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、目的の分子のリサイクル、およびいくつかの例では経細胞輸送とリサイクルとの組み合わせを測定するための請求項に記載された方法を使用して、当該目的の分子のインビボ組織浸透性を評価し得る。組織浸透性は、例えば、脳浸透性を含む場合がある。
【0066】
特定の実施形態では、本方法は、第１のチャンバー内の溶液からの１つ以上の分子の取り込み、および元の溶液が第２の溶液と交換された後の第１のチャンバーへのそれらの分子の戻りを測定することによって、第１のチャンバーから同じチャンバーへの複数の同じ目的の分子の経細胞リサイクルを測定することを含み、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーのそれぞれは、生理学的ｐＨ値（例えば、ｐＨ＝約７．４）を有する。いくつかの実施形態では、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの複数の同じ目的の分子の細胞間輸送も評価される。他の実施形態では、本方法は、複数の異なる目的の分子（例えば、２種、３種、４種、５種、またはそれを超える種類の目的の分子）の細胞間リサイクルを測定することを含み、これは場合により、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの複数の異なる目的の分子の細胞間輸送を評価することを含み得る。当該アッセイの使用は、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを分離する細胞層を使用して行われる。特定の実施形態では、細胞層は、分子輸送を媒介する１つ以上の受容体を安定に発現する。そのような受容体は、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリンを含むがこれらに限定されない任意の目的の受容体であり得る。
【0067】
したがって、例えば、一態様では、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧサルベージ経路に関連する条件下で、ポリペプチド、抗体、または他のＦｃＲｎ結合分子のリサイクル効率、さらに場合により経細胞輸送を測定するために、ヒトＦｃＲｎおよびβ２－ミクログロブリン遺伝子を安定に発現するＭＤＣＫ細胞を使用する細胞ベースのアッセイが本明細書で提供される。この経細胞輸送およびリサイクルアッセイは、生理学的ｐＨ条件下で行われ、ＩｇＧの細胞への非特異的結合、飲作用による取り込み、ＦｃＲｎとのｐＨ依存的相互作用、および細胞内輸送および選別プロセスの動態の２つ以上の複合効果からの結果を評価するように設計されている。この特定の実施形態では、ＦｃＲｎの発現は、アッセイにおける試験分子の経細胞輸送およびリサイクルを促進するのに必要であり、観察された相関に直接寄与する。さらに、本明細書で提供されるもの等のアッセイは、前臨床種におけるＦｃ含有分子の電荷またはグリコシル化バリアントのクリアランス速度を正しく順位付けし得た。実施例で提供される結果は、リード選択および最適化中の抗体医薬品候補、および所望の薬物動態学的特性のためのプロセス開発を含む、ポリペプチド、抗体、または他のＦｃＲｎ結合分子の評価のための費用効果が高く、動物を節約するスクリーニングツールとしての本明細書に開示されるアッセイの有用性を支持する。
【0068】
本開示はまた、複数の分子の経細胞輸送／リサイクル（Ｔ／Ｒ）比を決定することによって複数の分子の組織浸透性を決定するのに有用な方法および組成物に関する。特定の実施形態では、本方法は、経細胞輸送された分子とリサイクルされた分子との比に基づいて、複数の分子の脳浸透性を決定することを含む。目的の分子の経細胞輸送およびリサイクルを測定し、Ｔ／Ｒ比を決定するための請求項に記載された方法は、分子の脳浸透性および半減期などの他のＰＫパラメータを評価するために使用し得る。本明細書で提供されるようなインビトロアッセイは、前臨床種におけるＦｃ含有分子の脳浸透性との相関を実証した。したがって、実施例で提供される結果により、リード選択および最適化中の抗体薬物候補、および所望の組織浸透特性のためのプロセス開発を含む、ポリペプチド、抗体、または他のＦｃＲｎ結合分子を評価するための費用効果が高く、動物を節約するスクリーニングツールとしての本明細書に開示されるアッセイの有用性が支持される。
【0069】
本開示は、本明細書で提供される方法、アッセイ、アッセイ系、キットおよび組成物を使用して、複数の同じ目的の分子（例えば、同じ種類の抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）または複数の２つ以上の目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチド、Ｆｃ含有分子、またはそれらの任意の混合物から選択される２つ以上の目的の分子）の移動または輸送（例えば、リサイクル、またはリサイクルおよび経細胞輸送）、１つ以上のＰＫパラメータおよび／または組織浸透性（例えば、脳浸透性）を評価し得る。
【0070】
３．リサイクルアッセイ、リサイクルおよび経細胞輸送アッセイ
再利用とは、細胞の片側から同じ側への高分子の小胞輸送を指す。リサイクルは、細胞膜の陥入において細胞が細胞外物質を取り囲んで小胞を形成し、次いで小胞を細胞内に移動させて、逆のプロセスによって同じ細胞膜を通して物質を排出する、細胞を通過する輸送のための機構である。図１を参照されたい。
再利用とは、細胞の片側から同じ側への高分子の小胞輸送を指す。リサイクルは、細胞膜の陥入において細胞が細胞外物質を取り囲んで小胞を形成し、次いで小胞を細胞内に移動させて、逆のプロセスによって同じ細胞膜を通して物質を排出する、細胞を通過する輸送のための機構である。図１を参照されたい。
【0071】
細胞の片側から他側への巨大分子の小胞輸送を指す経細胞輸送は、２つの環境間で、それらの環境の独自の組成を変更することなく、材料を選択的に動かすために、多細胞生物によって使用される戦略である。経細胞輸送は、細胞が細胞外物質を細胞膜の陥入に封入して小胞を形成し、次いで、該細胞を越えて該小胞を動かして、逆のプロセスにより反対側の細胞膜を経由して該物質を噴出する、経細胞輸送のための機序である。図１を参照されたい。
【0072】
典型的なＦｃＲｎ介在性経細胞輸送アッセイでは、ＦｃＲｎ発現ＭＤＣＫ細胞を、トランスウェルプレート内のフィルタ膜上で集密度まで成長させ、アッセイの前に、内部チャンバーを酸性アッセイ緩衝液（ｐＨ＜６．０）でおよび外部チャンバーを塩基性アッセイ緩衝液（ｐＨ＞７．４）で充填することによってｐＨ勾配を作成する。このアッセイ設計は、酸性ｐＨ下での細胞表面上のＦｃＲｎとの結合および塩基性ｐＨ下での試験分子の放出を介して試験分子の細胞取り込みを促進するためにＦｃＲｎのｐＨ依存性結合特性を利用し、両方ともアッセイの堅牢性および感度を向上させる。しかしながら、当該アッセイを使用した試験分子のＰＫ挙動の予測評価を改善し得た。トランスフェクトされた細胞は典型的には高レベルのＦｃＲｎを細胞表面上で発現し、試験抗体は酸性環境下で細胞とインキュベートされるので、酸性ｐＨでＦｃＲｎに対して高い結合親和性を示す試験分子（抗体など）は容易にＦｃＲｎに結合し、ＦｃＲｎ媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に入ると考えられる。これは、ポリペプチドまたは抗体が生理学的ｐＨ下で細胞表面ＦｃＲｎに最小限に結合し、細胞取り込みが非特異的飲作用によって主に媒介されるインビボで典型的に起こることとは対照的である。結果として、理論に拘束されることを望むものではないが、ｐＨ勾配経細胞輸送アッセイの出力は、酸性ｐＨでのポリペプチドまたは抗体のＦｃＲｎ結合親和性によって大きく影響される可能性があり、したがって、静電相互作用および細胞内輸送パラメータなどのＰＫに影響を及ぼす他の因子の寄与を必ずしも十分に反映しない可能性があると考えられる。さらに、人工的なｐＨ条件は、本質的に細胞にとって有害である可能性があり、アッセイの期間を制限し、潜在的にさらなるアッセイアーチファクトを生じさせる可能性がある。
【0073】
したがって、実施例においてより詳細に記載されるように、本明細書では、細胞環境内での分子の輸送を評価するための改善された方法が提供され、この方法は、１つ以上のＰＫパラメータ（例えば、インビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）またはインビボにおける半減期（ｔ１／２））または組織浸透度（脳浸透度など）をより正確に決定または測定するためにさらに使用され得る。したがって、例えば、特定の実施形態では、本開示は、複数の分子のリサイクルを決定または測定するための方法を提供する。例えば、決定または測定することは、複数の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートする導入すること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含み得；水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む。
【0074】
本明細書で提供される方法、アッセイおよび系の特定の実施形態では、生理学的ｐＨ値は約６．５～約８．０である。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５～約８．０の間の任意の値、例えば、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８もしくは約７．９、または約６．５～約８．０の範囲内の任意の範囲である。特定の実施形態では、各チャンバーのｐＨは、両方のチャンバーが生理的ｐＨを有する限り、異なり得る。例えば、限定としてではないが、該第１のチャンバーは、６．５のｐＨを有し得るのに対し、該第２のチャンバーは、８．０のｐＨを有し得る、または逆も然りである。ある特定の実施形態では、該生理的ｐＨは、約７．４であり得る。
【0075】
特定の実施形態では、本開示は、複数の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の薬物動態（ＰＫ）パラメータを決定する方法であって、ａ）複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；ｂ）第１のチャンバーから細胞層にリサイクルされ、第１のチャンバーに戻る複数の分子の量を測定すること；ならびにｃ）リサイクルされる複数の分子の量に基づいてＰＫパラメータを決定することを含む、方法に関する。特定の実施形態では、リサイクルされる複数の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）を測定することは、複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む。特定の実施形態では、複数の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）は、第２のチャンバー内で、約１時間～約４８時間、約１時間～約３０時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約６時間、もしくは約１時間～約４時間、またはその中の任意の値、例えば約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１２時間、もしくは約１８時間インキュベートされる。特定の実施形態では、水溶液を交換することは、第１のチャンバーを洗浄することを含む。特定の実施形態では、本方法は、測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む。特定の実施形態では、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは、測定前に、約１０分～約１２時間、約２０分～約１２時間、約３０分～約６時間、約２０分～約５時間、または約１時間～約４時間、またはその中の任意の値、例えば３０分、１時間、２時間、３時間、または４時間、置換水溶液と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、インキュベーションは、約３５℃～約３９℃、例えば約３７℃の温度で行なう。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬまたは符号一桁のｐｇ／ｍＬの定量下限値（ＬＬＯＱ）を有する定量方法が使用される。そのような方法としては、例えば、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ、例えばビオチン－Ｒ１０Ｚであり得る高親和性捕捉試薬を使用するＥＬＩＳＡが挙げられ得る。特定の実施形態では、複数の分子は複数の同じ分子（例えば、同じ種類の抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）であり、他の実施形態では、複数の分子は複数の分子の混合物（例えば、１種以上の異なる抗体、抗体断片、ポリペプチドもしくはＦｃ含有分子、またはそれらの混合物）である。
【0076】
特定の実施形態では、リサイクルの尺度は、第１のチャンバー内の溶液からの１種以上の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の取り込み、および元の溶液が第２の溶液に置き換えられた後のそれらの分子の第１のチャンバーへの戻りを測定することによって決定し得る。経細胞輸送も評価されるいくつかの実施形態では、経細胞輸送の尺度は、第１のチャンバー内の溶液から第２のチャンバー内の溶液への１種以上の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の経細胞輸送を測定することによって決定し得、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは細胞単層によって分離されており、各チャンバー内の溶液は生理学的ｐＨにある。特定の実施形態では、複数の細胞は、真核生物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯類（例えば、マウス、レート、モルモット、ハムスター、または他の哺乳動物）、イヌ、非ヒト霊長類（カニクイザルなど）、またはヒトに由来する。使用され得る細胞は、本明細書においてより詳細に記載される。特定の実施形態では、該細胞または複数の細胞は、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞であり得る。いくつかの実施形態では、複数の細胞は野生型である。他の実施形態では、該細胞は、１つ以上の目的の異種受容体を発現する。特定の実施形態では、該細胞は、少なくとも１つの異種遺伝子を含む。特定の実施形態では、該少なくとも１つの異種遺伝子は、ＦＣＧＲＴ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、該細胞は、異種細胞表面タンパク質を発現し得る。特定の実施形態では、該異種細胞表面タンパク質は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を含み得る。特定の実施形態では、分子のリサイクルおよび場合により経細胞輸送を測定することは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、または蛍光リーダーシステムの使用を含む。いくつかの実施形態では、分子のリサイクルおよび場合により経細胞輸送を測定することは、ナノモル濃度以下の目的の分子を評価し得る定量方法の使用を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬまたは少なくとも５０ｐｇ／ｍＬの、より低い定量下限値（ＬＬＯＱ）を有する定量方法が使用される。そのような方法としては、例えば、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ、例えばビオチン－Ｒ１０Ｚであり得る高親和性捕捉試薬を使用するＥＬＩＳＡが挙げられ得る。そのような高感度ＥＬＩＳＡ法は、本開示の実施例の節に記載されている。いくつかの態様では、そのような高感度定量法を使用してリサイクルを測定するが、低感度の方法を使用して経細胞輸送を評価する（例えば、ナノモル濃度のＬＬＯＱを用いる）。いくつかの実施形態では、高感度自動免疫アッセイプラットフォームを使用して、リサイクルおよび／または経細胞輸送された分子（例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、Ｇｙｒｏｌａｂ、またはＳｉｎｇｕｌｅｘ由来）を定量する。特定の実施形態では、本開示の方法は、測定された分子の量に基づいて、複数の分子のインビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）、またはインビボにおける半減期（ｔ１／２）を決定することをさらに含み得る。特定の態様では、分子は、目的の受容体に自然に結合する分子、または目的の受容体に結合するように操作された分子であり得、ここで目的の受容体は複数の細胞によって発現される。したがって、いくつかの実施形態では、分子は、ＦｃＲｎに天然に結合する分子またはＦｃＲｎに結合するように操作された分子である。特定の実施形態では、該分子は、Ｆｃ含有分子であり得る。特定の実施形態では、該分子は、抗体であり得る。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体であり得る。特定の実施形態では、抗体は、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体（例えば、抗α４β７インテグリン抗体）、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、オマリズマブ、ベバシズマブ、ベドリズマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｎ２８６Ｅ；Ｎ４３４Ｙ）、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｔ３０７Ｑ；Ｑ３１１Ａ；Ｎ４３４Ｙ）、抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｖ３０８Ｐ；Ｎ４３４Ｙ）、抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｎ４３４Ｙ）、抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｍ４２８Ｌ；Ｎ４３４Ｙ；Ｙ４３６Ｉ）、または抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｑ３１１Ｉ；Ｎ４３４Ｙ）であり得る。特定の実施形態では、該分子は、アルブミン含有分子であり得る。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５から約８．０である。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５～約８．０の間の任意の値、例えば、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８もしくは約７．９、または約６．５～約８．０の範囲内の任意の範囲である。特定の実施形態では、各チャンバーのｐＨは、両方のチャンバーが生理的ｐＨを有する限り、異なり得る。例えば、限定としてではないが、該第１のチャンバーは、６．５のｐＨを有し得るのに対し、該第２のチャンバーは、８．０のｐＨを有し得る、または逆も然りである。ある特定の実施形態では、該生理的ｐＨは、約７．４であり得る。特定の実施形態では、ＰＫパラメータ、例えば、複数の分子のインビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）またはインビボにおける半減期（ｔ１／２）の尺度が決定される。他の実施形態では、別個にまたは組み合わせて、脳浸透性などの組織浸透性が決定される。
【0077】
特定の実施形態では、本開示は、ａ）各チャンバーが生理学的ｐＨの水溶液を含む、第１のチャンバーおよび第２のチャンバー；ｂ）第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを分離する細胞層であって、第１のチャンバーから細胞層内へ、および第１のチャンバー内に戻る分子の再循環を媒介し得る、細胞層；ｃ）第２のチャンバーにおける分子の存在を検出するための検出器を備える、アッセイ系であって、該アッセイ系は、複数の分子のリサイクルを決定するように構成され、決定することが、複数の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）を第１のチャンバーに導入すること；複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、アッセイ系に関する。細胞層を形成する細胞は、本明細書でさらに説明するように、細胞層を形成するために安定して成長し得るあらゆるものであってもよい。特定の実施形態では、該細胞は、細胞増殖培地中に約１×１０５細胞／ウェルの密度で播種され得る。細胞増殖培地は、選択された細胞を増殖させるための任意の適切な培地であり得る。特定の実施形態では、該細胞増殖培地は、１０％のＦＢＳ、１００単位のペニシリン／ストレプトマイシン、および５μｇ／ｍＬのプロマイシンを補充した、ＤＭＥＭ高グルコースであり得る。いくつかの実施形態では、内側および外側チャンバー内の培地の容量は、独立して、２５μＬ～５００μＬ、または５０μＬ～３５０μＬ、または５０μＬ～２００μＬである。特定の実施形態では、該内部チャンバー内の培地は、１００μＬであり得、該外部チャンバー内の培地は、２００μＬであり得る。特定の実施形態では、該細胞は、平板培養後２日目に使用され得る。特定の実施形態では、該試験分子は、約１００μｇ／ｍＬ（０．６７μＭ）の最終濃度まで添加され得、３７℃の組織培養インキュベーター内で２４時間にわたってインキュベートされ得る。特定の実施形態では、ルシファーイエロー（ルシファーイエローＣＨ、ジリチウム塩；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；セントルイス、ミズーリ州）は、細胞増殖培地中で調製し得、２４時間のアッセイインキュベーションの最後の９０分間に添加し得る。特定の実施形態では、アッセイ中におけるルシファーイエローの受動的通過のレベルは、外部チャンバー由来のサンプルにおける蛍光シグナルを、内部チャンバーのもので割ることによって算出され得る。特定の実施形態では、外側チャンバーにおいて０．１％を超えるルシファーイエローの受動的継代を示すウェル、すなわち、０．１％未満のルシファーイエローの受動的継代が使用されるウェルからの経細胞輸送およびリサイクルの結果を廃棄し得る。いくつかの実施形態では、検出器システムは、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも５０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱなどで、ナノモル濃度以下の目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）を評価し得るものである。いくつかの実施形態では、検出器システムは、例えばビオチン－Ｒ１０Ｚなどのビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃであり得る高親和性捕捉試薬を使用するＥＬＩＳＡアッセイを含む。そのような高感度の方法は、本明細書の実施例に記載されている。
【0078】
特定の実施形態では、試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）は、トランスウェルアッセイの外側または内側チャンバーに添加し得、リサイクルは、適切なインキュベーション期間（パルス工程）後に、同じチャンバー（例えば、それぞれ外側チャンバーまたは内側チャンバー）内に存在する試験分子の量を測定し、培地を除去し、それを交換することによって検出し得る（チェース工程）。いくつかの実施形態では、試験分子の経細胞輸送はまた、反対側のチャンバー（例えば、それぞれ内側チャンバーまたは外側チャンバー）に存在する試験分子の量を測定することによって検出される。特定の実施形態では、試験分子は、細胞の頂端膜に曝露されたチャンバーから同じチャンバーにリサイクルされる。いくつかの実施形態では、試験分子は、細胞の基底外側膜に曝露されたチャンバーから同じチャンバーにリサイクルされる。なおさらなる実施形態では、試験分子は、細胞の頂端膜に露出したチャンバーから細胞の基底側膜に露出したチャンバーに経細胞輸送される。
【0079】
特定の実施形態では、本開示は、１つ以上の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のＰＫパラメータを決定または予測するための方法であって、ａ）２つのチャンバーのうちの第１のチャンバーに分子を導入することであって、第１のチャンバーが１つ以上の細胞によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの各々が生理学的ｐＨ値を有する、導入すること；ならびに第１のチャンバーから第１のチャンバーにリサイクルされた分子の数を測定することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５から約８．０である。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５～約８．０の間の任意の値、例えば、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８もしくは約７．９、または約６．５～約８．０の範囲内の任意の範囲である。特定の実施形態では、各チャンバーのｐＨは、両方のチャンバーが生理的ｐＨを有する限り、異なり得る。例えば、限定としてではないが、該第１のチャンバーは、６．５のｐＨを有し得るのに対し、該第２のチャンバーは、８．０のｐＨを有し得る、または逆も然りである。ある特定の実施形態では、該生理的ｐＨは、約７．４であり得る。いくつかの態様では、ＰＫパラメータは、インビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿中濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）またはインビボにおける半減期（ｔ１／２）である。特定の実施形態では、ＰＫパラメータは、インビボクリアランスである。
【0080】
特定の実施形態では、アッセイ系は、第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器をさらに備え；細胞層は、第１のチャンバーから第１のチャンバーへの分子のリサイクルを媒介し得；アッセイ系は、細胞層から第１のチャンバーへの複数の分子のリサイクルを決定するように構成され、リサイクルを決定することが、水溶液が交換された後に、第１のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、経細胞輸送も測定される。特定の実施形態では、アッセイ系は、第２のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器をさらに備え；細胞層は、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を媒介し得るものであり；および細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を決定するように構成され、経細胞輸送を決定することは、水溶液が交換された後に、第２のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器は、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも５０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱなどで、ナノモル濃度以下の目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）を評価し得る。いくつかの実施形態では、第２のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器は、同様の感度を有する。他の実施形態では、当該検出器は、例えば、ナノモル濃度範囲のＬＬＯＱを有していなくてもよい。
【0081】
特定の実施形態では、本開示は、複数の同じ分子または複数の異なる分子の経細胞輸送を測定するためのアッセイであって、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを備え、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの各々が生理学的ｐＨ値を有し、第１のチャンバーが複数の分子を受け取り、第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を可能にし、分子を第１のチャンバーにリサイクルさせるように構成されている、アッセイを提供する。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５から約８．０である。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約６．５～約８．０の間の任意の値、例えば、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８もしくは約７．９、または約６．５～約８．０の範囲内の任意の範囲である。特定の実施形態では、各チャンバーのｐＨは、両方のチャンバーが生理的ｐＨを有する限り、異なり得る。例えば、限定としてではないが、該第１のチャンバーは、６．５のｐＨを有し得るのに対し、該第２のチャンバーは、８．０のｐＨを有し得る、または逆も然りである。ある特定の実施形態では、該生理的ｐＨは、約７．４であり得る。
【0082】
特定の実施形態では、本開示は、１つ以上の分子の１つ以上のＰＫパラメータを決定または予測するためのアッセイであって、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを備え、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの各々が生理学的ｐＨ値を有し、第１のチャンバーが複数の分子を受容し、第１のチャンバーから第１のチャンバーへの分子のリサイクルを可能にするように構成され、場合により、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を可能にするように構成される、アッセイを提供する。特定の実施形態では、該生理的ｐＨ値は、約７．４である。いくつかの態様では、ＰＫパラメータは、インビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿中濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）またはインビボにおける半減期（ｔ１／２）である。いくつかの実施形態では、ＰＫパラメータはインビボクリアランスである。
【0083】
ある特定の実施形態では、該第１のチャンバーは、細胞の単層を含み得る。特定の実施形態では、アッセイに使用される細胞は、以下の「細胞」と題するセクション４に提供されるリストから選択される。特定の実施形態では、アッセイに使用される細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は腎臓細胞である。いくつかの実施形態では、腎臓細胞は、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒトまたはイヌの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＭＤＣＫ細胞である。特定の実施形態では、本開示にて記述される方法で使用される細胞は、少なくとも１つの異種遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、該少なくとも１つの異種遺伝子は、ＦＣＧＲＴ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子からなる群より選択され得る。特定の実施形態では、本開示にて記述される方法で使用される細胞は、細胞表面タンパク質を発現し得る。特定の実施形態では、該細胞表面タンパク質は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を含む。特定の実施形態では、該細胞表面タンパク質は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を含む。
【0084】
特定の実施形態では、該分子は、標識されているか、または非標識であり得る。標識分子の非限定的な例としては、３Ｈ－標識、蛍光標識分子、または放射性同位元素、例えば、Ｉ－１２５およびＰ－３２が挙げられる。
【0085】
特定の実施形態では、本開示の方法は、リサイクルされた分子、および場合により経細胞輸送された分子の数を測定することを含む。特定の非限定的な実施形態では、リサイクルまたは経細胞輸送された分子の数の測定は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、共焦点顕微鏡法、または生細胞イメージングシステム、またはそれらの任意の組み合わせによって実施し得る。リサイクルされた分子および経細胞輸送された分子について異なる検出方法の使用が企図される。いくつかの実施形態では、測定方法は、例えば、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬまたは少なくとも５０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱを用いて、ナノモル濃度以下の目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の濃度を評価し得る方法である。いくつかの実施形態では、検出器システムは、例えばビオチン－Ｒ１０Ｚなどのビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃであり得る高親和性捕捉試薬を使用するＥＬＩＳＡアッセイを含む。特定の実施形態では、異なる方法が使用され、ここで、リサイクルを測定するために使用される方法は、ナノモル濃度以下の濃度を評価し得、経細胞輸送を測定するために使用される方法は、そうではない。高感度自動イムノアッセイプラットフォーム（例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、Ｇｙｒｏｌａｂ、またはＳｉｎｇｕｌｅｘ由来）を使用して、リサイクルおよび／または経細胞輸送された分子を定量し得る。
【0086】
特定の実施形態では、本開示は、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧサルベージ経路に類似する条件下で、ヒトＦｃＲｎおよびＢ２Ｍを発現するＭＤＣＫ細胞を介して、目的の分子（例えば、１つ以上の抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）のリサイクルおよび場合により経細胞輸送を測定するためのＦｃＲｎ依存性細胞ベースのアッセイを提供する。特定の実施形態では、このアッセイの出力は、生理学的条件でのＦｃ－ＦｃＲｎ相互作用だけでなく、目的の分子のインビボＰＫ挙動に関連する非特異的結合、細胞取り込み、選別および細胞内輸送プロセスも含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、本明細書の他の箇所に記載されているものなどのＩｇＧ ｍＡｂである。いくつかの実施形態では、アッセイは、２つ以上の目的の分子のリサイクル、および場合により経細胞輸送を測定する。
【0087】
特定の実施形態では、本開示は、リサイクルを、多様な構造、機能および薬理学的特性を有する目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）の動物における１つ以上のＰＫ特性と相関させるための方法およびアッセイを提供する。特定の実施形態では、ＰＫ特性は、インビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）、またはインビボにおける半減期（ｔ１／２）である。いくつかの実施形態では、ＰＫパラメータはインビボクリアランスである。いくつかの実施形態では、動物は、ヒトなどの哺乳動物、またはカニクイザルなどの非ヒト霊長類である。特定の実施形態では、本開示は、経細胞輸送およびリサイクルを、多様な構造、機能および薬理学的特性を有する目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子）の動物における組織浸透性と相関させるための方法およびアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、組織浸透性は脳浸透性である。いくつかの実施形態では、動物は、ヒトなどの哺乳動物、またはカニクイザルなどの非ヒト霊長類である。
【0088】
特定の実施形態では、ＦｃＲｎの発現は、アッセイにおけるｍＡｂなどの目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のリサイクル、および場合により経細胞輸送（これも評価される場合）を促進し、評価される再利用とＰＫパラメータまたは組織浸透との間の観察された関連に寄与するために必要とされることがある。特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイは、前臨床種におけるＦｃ含有分子の電荷またはグリコシル化バリアントの順序クリアランス速度をランク付けし得る。特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイは、リードの選択および最適化中の薬物候補（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の評価、ならびに所望の薬物動態学的特性のためのプロセス開発のための時間効率がよく、費用効果が高く、動物を節約するツールとして使用し得る。
【0089】
特定の実施形態では、本開示は、生理学的に適切な条件下で薬物（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のリサイクル効率を測定する細胞ベースのアッセイおよび方法を提供する。特定の実施形態では、ヒトＦｃＲｎおよびβ２－ミクログロブリン遺伝子を安定的に発現しているＭＤＣＫ細胞は、本明細書で記述されているアッセイに関連して使用される。
【0090】
特定の実施形態では、本開示は、ヒトＦｃＲｎ（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ Ｃ．ら，２００３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７，３１５－３２２）に結合することが知られているウシアルブミンを供給するウシ胎児血清を補充した正常細胞培養培地において生理学的ｐＨ下で実施される方法およびアッセイを提供する。
【0091】
特定の実施形態では、本開示は、分子が非特異的飲作用を介して細胞によって取り込まれ、アルブミンの存在下でヒトＦｃＲｎと相互作用し、ＦｃＲｎ媒介作用機序に関連する条件下で細胞によってリサイクルされる方法およびアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、当該分子の少なくとも一部は、それらが取り込まれた細胞層の側にリサイクルされる。いくつかの実施形態では、当該分子の少なくとも一部は、細胞層の反対側に経細胞輸送される。特定の実施形態では、本開示は、細胞への非特異的結合、飲作用による取り込み、ＦｃＲｎとのｐＨ依存性相互作用、および／または細胞内輸送および選別プロセスの動態の複合効果を評価する方法および／またはアッセイの能力により、哺乳動物における目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のクリアランスを決定または予測するための方法およびアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、カニクイザルなどの非ヒト霊長類である。いくつかの実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【0092】
特定の実施形態では、本開示は、目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の組織浸透性を決定または予測するための方法およびアッセイを提供する。特定の実施形態では、組織は脳組織である。特定の実施形態では、本開示は、分子のＴ／Ｒ比を決定することによって目的の分子の組織浸透性を決定または予測するための方法およびアッセイを提供する。特定の実施形態では、本開示は、細胞への非特異的結合、飲作用による取り込み、ＦｃＲｎとのｐＨ依存性相互作用、および／または細胞内輸送および選別プロセスの動態の複合効果を評価し、目的の分子のＴ／Ｒ比を決定する方法および／またはアッセイの能力により、哺乳動物における目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の組織浸透性を決定または予測するための方法およびアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、カニクイザルなどの非ヒト霊長類である。いくつかの実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【0093】
特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物において目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のＰＫパラメータを用いて得られたリサイクルおよびさらに場合により経細胞輸送出力を相関させるために使用される方法およびアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、ＰＫパラメータは、インビボクリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、最大／最小血漿中濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）またはインビボにおける半減期（ｔ１／２）である。特定の実施形態では、本開示の方法およびアッセイの出力は、内側チャンバー（例えば、第１のチャンバー）の培地中のリサイクルされた分子の濃度（ｎｇ／ｍＬ）、または場合によりさらに外側チャンバー（例えば、第２のチャンバー）の培地中の経細胞輸送された分子の濃度であり得、アッセイの報告可能な値は、同じプレートからの少なくとも２つの複製ウェルの平均濃度であり得る。特定の実施形態では、方法および／またはアッセイの出力は、リサイクル率の尺度または対照分子に対するリサイクル分子の相対リサイクルの尺度であり得る。ある特定の実施形態では、該アッセイの出力は、経細胞輸送の速度の尺度、または、対照の分子と比べた、経細胞輸送された分子の相対的な経細胞輸送の尺度であり得る。なおさらなる実施形態では、アッセイの出力は、単独でまたは対照分子を基準として、リサイクルおよび場合により経細胞輸送に基づく計算値、例えば、経細胞輸送に対するリサイクルの比またはリサイクルに対する経細胞輸送の比であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、カニクイザルなどの非ヒト霊長類である。いくつかの実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【0094】
なおさらなる実施形態では、本開示は、試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のリサイクル、経細胞輸送、組織浸透性、ＰＫパラメータまたは他の特徴に対する試験分子以外の１つ以上の薬剤の効果を決定するのに使用するための方法およびアッセイを提供する。そのような薬剤（二次分子と呼ばれることもある）は、例えば、小分子薬物などの小分子（例えば、タンパク質またはポリペプチドではない）であってもよく、またはペプチドであってもよく、またはポリペプチドであってもよく、または抗体もしくはその断片、またはそのような分子の複数もしくは組み合わせであってもよい。そのような薬剤は、試験分子に結合するか、もしくは試験分子に結合すると疑われるもの、または分子輸送を媒介する受容体への試験分子の結合を調節するもの、例えばＦｃＲｎへの試験分子の結合を調節するもの；もしくは評価されている系における目的の受容体に対するリガンドである（例えば、細胞層の１つ以上の細胞によって発現される受容体に対するリガンド）；もしくは試験分子もしくは細胞層によって発現される受容体と相互作用することが知られているか、または疑われる。薬剤は、処方薬または店頭（ＯＴＣ）薬などの治療用分子であってもよく、またはサプリメント、ビタミン、研究試薬、イメージング試薬、または他の関心対象の薬剤であってもよい。治療薬としては、免疫系、心血管系、内分泌系、胃腸管、腎臓系、呼吸器系、または中枢神経系の障害または状態を処置するため、または癌もしくは他の悪性腫瘍（化学療法薬および免疫療法薬を含む）、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症を処置するために使用されるものが挙げられ得る。２種以上の目的の薬剤の組み合わせも評価し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中に提供される方法は、１種以上の薬剤の存在下における試験分子のリサイクル、またはリサイクルおよび経細胞輸送を評価することを含む。当該１種以上の薬剤は、第１のチャンバーに含まれるが第２のチャンバーには含まれないか、または第２のチャンバーに含まれるが第１のチャンバーには含まれないか、または両方のチャンバーに含まれるか、または第１のチャンバーの第１の溶液に含まれるが、溶液が交換されるときには存在しないか、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、アッセイ出力は、１種以上の薬剤の非存在下におけるリサイクル、またはリサイクルおよび経細胞輸送とさらに比較される。本明細書中に記載される方法およびアッセイに従って試験分子のリサイクル、またはリサイクルおよび経細胞輸送に対する１種以上の薬剤の効果を評価する能力は、例えば、１種以上の薬剤が試験分子の１つ以上のＰＫパラメータにどのように影響するか、または試験分子の組織浸透性（例えば、脳浸透性）にどのように影響するかを決定するために有用であり得る。本明細書中に記載される方法およびアッセイは、例えば、目的の分子のＰＫパラメータおよび／または組織浸透性に対する一般的に同時投与される薬物の影響を理解するために使用され得る。本明細書中に記載される方法およびアッセイは、例えば、細胞内輸送の機構、ＰＫパラメータおよび／または組織浸透性を調べるために使用される場合がある。
【0095】
本開示はまた、試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のリサイクル、経細胞輸送、組織浸透性、ＰＫパラメータまたは他の特性に対する１つ以上の環境条件の変化の影響を決定する際に使用するための方法およびアッセイを提供する。そのような環境条件としては、例えば、１種以上の細胞培地成分の存在、非存在もしくは濃度、または温度、またはｐＨ、または酸化、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、組織浸透性は脳浸透性である。
【0096】
特定の実施形態では、本開示の方法およびアッセイの試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の選択は、臨床グレードの材料、ならびに処方情報、集団ＰＫもしくは組織浸透モデルに基づく公開された報告、または線形ＰＫもしくは組織浸透データが生成された社内臨床試験などの信頼できる情報源からの動物ＰＫデータおよび／または動物組織浸透データの利用可能性に基づき得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、臨床グレードの材料の使用は、試験材料の品質が、ヒトＰＫまたは組織浸透性データが生成された臨床試験で使用されたものと一致し得ることを保証し得る。
【0097】
特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイは、候補をランク付けし、動物モデルで試験される分子の数を減らし、および／または必要な動物モデルの数を減らすことを目的として、リードの選択および最適化を支援するための、薬物候補（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の非特異的クリアランスにおける潜在的な責任のインビトロ評価のためのツールとして使用し得る。
【0098】
特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイを使用して、望ましくないもしくは非定型のＰＫもしくは組織浸透挙動を示す目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の調査、または脳への曝露を促進するための血液脳関門の通過、もしくは腫瘍標的化の改善のための腫瘍微小環境における処置の増強などの特殊な用途に関連する、リサイクル特性が改善された新規薬物（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有薬物を含む）の開発を支援し得る。そのような「改善されたリサイクル特性」は、いくつかの実施形態では血清半減期を増加させ得る別の分子と比較したリサイクルの増加を含み得る。特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイは、望ましくないもしくは非定型のＰＫ挙動を示す目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の調査、または脳への曝露を促進するための血液脳関門の通過もしくは腫瘍標的化を改善するための腫瘍微小環境における処置の増強などの特殊な用途に適した、経細胞輸送特性が改善された新規薬物の開発を支援するために使用し得る。そのような「経細胞輸送特性の改善」としては、別の分子と比較した経細胞輸送特性の向上が挙げられ得る。さらにまた、特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイは、望ましくないもしくは非定型のＰＫ挙動を示す目的の分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の調査を支援するため、または脳への曝露を促進するための血液脳関門の通過、もしくは腫瘍標的化を改善するための腫瘍微小環境における処置の増強などの特殊な用途に適切な経細胞輸送特性が改善された新規薬物の開発に使用され得る。そのような「経細胞輸送特性の改善」としては、別の分子と比較した経細胞輸送特性の増加が挙げられ得る。別の分子と比較して、経細胞輸送対リサイクル比が改善された新規薬物（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の開発を支援するための本明細書に記載のアッセイの使用がさらに企図される。そのような「改善された経細胞輸送対リサイクル比」（Ｔ／Ｒ比）は、例えば経細胞輸送の増加、リサイクルの減少、またはその両方に起因して、別の分子よりも高い比を含み得る。より高いＴ／Ｒ比は、別の分子と比較して、より良好な組織浸透性、例えばより良好な脳浸透性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、目的の分子および／または薬物はｍＡｂである。
【0099】
特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイは、臨床試験における最適な用量および投与スキームの設計を支援するための改善された機構に基づくＰＫモデルの開発のために使用され得る。特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイを使用して、試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のインビトロ読み出しおよびインビボＰＫデータの間の相関を実証し得る。そのようなＰＫモデルおよび／またはデータとしては、インビボクリアランス（ＣＬ）、インビボにおける半減期（ｔ１／２）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、分布容積（Ｖｄ）または最大／最小血漿中濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）が挙げられ得る。
【0100】
特定の実施形態では、目的の分子、試験分子および／または複数の分子は、抗体であり得る。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。特定の実施形態では、抗体は異なる構造組成（キメラ、ヒト化、および完全ヒト）を有し得る。特定の実施形態では、該抗体は、様々な重鎖および軽鎖配列（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４重鎖、カッパおよびラムダ軽鎖）からなってよい。特定の実施形態では、該抗体は、異なる種類の標的（膜結合および可溶性）を認識してよい。特定の実施形態では、抗体は、様々な治療作用機序（作動性、拮抗性および細胞傷害性）を発揮し得る。特定の実施形態では、該抗体は、様々な経路（例えば、静脈内、筋肉内および皮下）を介して患者に投与される。特定の実施形態では、抗体は、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体（例えば、抗α４β７インテグリン抗体）、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体もしくは抗ｇＤ抗体、またはそれらの断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、オマリズマブ、ベバシズマブ、ベドリズマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｎ２８６Ｅ；Ｎ４３４Ｙ）、抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｔ３０７Ｑ；Ｑ３１１Ａ；Ｎ４３４Ｙ）、抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｖ３０８Ｐ；Ｎ４３４Ｙ）、抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｎ４３４Ｙ）、抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｍ４２８Ｌ；Ｎ４３４Ｙ；Ｙ４３６Ｉ）、もしくは抗－ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）（変異：Ｍ２５２Ｙ；Ｑ３１１Ｉ；Ｎ４３４Ｙ）、またはそれらの断片である。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗体が評価される。
【0101】
特定の実施形態では、目的の分子、試験分子および／または複数の分子は、それらのエフェクター機能を変化させ得る（例えば、限定されないが、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、二重特異性半抗体の会合を可能にし得る（例えば、限定されないが、エミシズマブ）、またはＩｇＧ４Ｆａｂアームを安定化し得る（例えば、限定されないが、ニボルマブ、ペンブロリズマブ）、操作された変異を有し得る。
【0102】
特定の実施形態では、目的の分子、試験分子、および／または複数の分子は、極端なＦｃＲｎ結合親和性を示す抗体であり得る。特定の実施形態では、哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、またはヒト）におけるリサイクル読み出しとＰＫパラメータとの間で観察された相関関係は、典型的なＦｃ領域を有する広範囲の抗体に適用され得る。特定の実施形態では、該試験分子は、変更されたＦｃＲｎ結合活性を有するように操作されている抗体であってよい。特定の実施形態では、目的の分子、試験分子および／または複数の分子は、アルブミン含有分子、またはペプチドタグもしくは組換えタンパク質を介してＦｃＲｎに結合するように操作された任意の分子であり得る。特定の実施形態では、目的の分子、試験分子および／または複数の分子は、ＦｃＲｎに自然に結合する分子であり得る。特定の実施形態では、目的の分子、試験分子および／または複数の分子は、ＦｃＲｎに結合するように操作された分子であり得る。
【0103】
特定の実施形態では、本開示に記載される方法およびアッセイは、ヒトＦｃＲｎの発現が、リサイクルまたはリサイクルおよび経細胞輸送アッセイにおいて、効率的なリサイクル、ならびにいくつかの実施形態ではリサイクルおよび経細胞輸送に必要であるか否かを示すために使用され得る。
【0104】
特定の実施形態では、本開示の方法およびアッセイを使用して、ＦｃＲｎとの相互作用が試験分子のリサイクル読み出しとＰＫパラメータとの間で観察された相関に寄与することを検出および／または示し得る。いくつかの実施形態では、インビボクリアランス（ＣＬ）、インビボにおける半減期（ｔ１／２）、曲線下面積（ＡＵＣ）、バイオアベイラビリティ、分布容積（Ｖｄ）、または最大／最小血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ）である。
【0105】
特定の実施形態では、本開示の方法およびアッセイは、目的の分子、試験分子および／または複数の分子の受容体への結合分析のために使用され得る。特定の実施形態では、該受容体は、ＦｃＲｎ受容体であり得る。特定の実施形態では、試験分子は抗体であり得る。特定の実施形態では、受容体はトランスフェリン受容体であり得る。特定の実施形態では、受容体は、ヒト、マウス、ラット、またはカニクイザルのトランスフェリン受容体である。特定の実施形態では、受容体は、トランスフェリン１またはトランスフェリン２受容体である。特定の実施形態では、受容体は、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ０２７８６（ＴＦＲ１＿ＨＵＭＡＮ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＵＰ５２（ＴＦＲ２＿ＨＵＭＡＮ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ａ０Ａ２Ｋ５Ｘ９５８（Ａ０Ａ２Ｋ５Ｘ９５８＿ＭＡＣＦＡ、ｃｙｎｏ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６２３５１（ＴＦＲ１＿ＭＯＵＳＥ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＪＫＸ３（ＴＦＲ２＿ＭＯＵＳＥ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９９３７６（ＴＦＲ１＿ＲＡＴ）、またはＵＮＩＰＲＯＴ Ｂ２ＧＵＹ２（ＴＦＲ２＿ＲＡＴ）に記載されるトランスフェリン受容体である。いくつかの実施形態では、受容体は、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ０２７８６（ＴＦＲ１＿ＨＵＭＡＮ）、またはＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＵＰ５２（ＴＦＲ２＿ＨＵＭＡＮ）に記載されている。特定の実施形態では、受容体はメガリン受容体であり得る。特定の実施形態では、受容体は、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ９８１６４（ＬＲＰ２＿ＨＵＭＡＮ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ａ２ＡＲＶ４（ＬＲＰ２＿ＭＯＵＳＥ）、またはＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ９８１５８（ＬＲＰ２＿ＲＡＴ）に記載のメガリン受容体である。特定の態様では、受容体はキュブリン受容体であり得る。いくつかの実施形態では、受容体は、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｏ６０４９４（ＣＵＢＮ＿ＨＵＭＡＮ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＪＬＢ４（ＣＵＢＮ＿ＭＯＵＳＥ）、ＵＮＩＰＲＯＴ Ｏ７０２４４（ＣＵＢＮ＿ＲＡＴ）、またはＵＮＩＰＲＯＴＡ０Ａ２Ｋ５ＵＳＫ６（Ａ０Ａ２Ｋ５ＵＳＫ６＿ＭＡＣＦＡ，ｃｙｎｏ）に記載されているキュブリン受容体である。
【0106】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのＦｃＲｎ受容体は、ヒトＦｃＲｎ受容体である。
【0107】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのヒトＦｃＲｎ受容体の重鎖は、以下の配列を有する。ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＮＳＬＲＧＥＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＧＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＳＳＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＬＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＳＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＶＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＬＫＤＶＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号１）
【0108】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのヒトＦｃＲｎ受容体の軽鎖は、以下の配列を有する。ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＭ（配列番号２）
【0109】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのＦｃＲｎ受容体は、マウスＦｃＲｎ受容体である。
【0110】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのマウスＦｃＲｎ受容体の重鎖は、以下の配列を有する。ＳＥＴＲＰＰＬＭＹＨＬＴＡＶＳＮＰＳＴＧＬＰＳＦＷＡＴＧＷＬＧＰＱＱＹＬＴＹＮＳＬＲＱＥＡＤＰＣＧＡＷＭＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＫＳＫＥＱＬＦＬＥＡＬＫＴＬＥＫＩＬＮＧＴＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＡＳＤＮＳＳＶＰＴＡＶＦＡＬＮＧＥＥＦＭＫＦＮＰＲＩＧＮＷＴＧＥＷＰＥＴＥＩＶＡＮＬＷＭＫＱＰＤＡＡＲＫＥＳＥＦＬＬＮＳＣＰＥＲＬＬＧＨＬＥＲＧＲＲＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＧＮＳＧＳＳＶＬＴＣＡＡＦＳＦＹＰＰＥＬＫＦＲＦＬＲＮＧＬＡＳＧＳＧＮＣＳＴＧＰＮＧＤＧＳＦＨＡＷＳＬＬＥＶＫＲＧＤＥＨＨＹＱＣＱＶＥＨＥＧＬＡＱＰＬＴＶＤＬＤＳＳＡＲＳＳＶＰＶＶＧＩＶＬＧＬＬＬＶＶＶＡＩＡＧＧＶＬＬＷＧＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＬＳＬＳＧＤＤＳＧＤＬＬＰＧＧＮＬＰＰＥＡＥＰＱＧＡＮＡＦＰＡＴＳ（配列番号３）
【0111】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのマウスＦｃＲｎ受容体の軽鎖は、以下の配列を有する。ＭＡＲＳＶＴＬＶＦＬＶＬＶＳＬＴＧＬＹＡＩＱＫＴＰＱＩＱＶＹＳＲＨＰＰＥＮＧＫＰＮＩＬＮＣＹＶＴＱＦＨＰＰＨＩＥＩＱＭＬＫＮＧＫＫＩＰＫＶＥＭＳＤＭＳＦＳＫＤＷＳＦＹＩＬＡＨＴＥＦＴＰＴＥＴＤＴＹＡＣＲＶＫＨＤＳＭＡＥＰＫＴＶＹＷＤＲＤＭ（配列番号４）
【0112】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのＦｃＲｎ受容体はラットＦｃＲｎ受容体である。
【0113】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのラットＦｃＲｎ受容体の重鎖は、以下の配列を有する。ＡＥＰＲＬＰＬＭＹＨＬＡＡＶＳＤＬＳＴＧＬＰＳＦＷＡＴＧＷＬＧＡＱＱＹＬＴＹＮＮＬＲＱＥＡＤＰＣＧＡＷＩＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＫＳＫＥＱＬＦＬＥＡＩＲＴＬＥＮＱＩＮＧＴＦＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＡＰＤＮＳＳＬＰＴＡＶＦＡＬＮＧＥＥＦＭＲＦＮＰＲＴＧＮＷＳＧＥＷＰＥＴＤＩＶＧＮＬＷＭＫＱＰＥＡＡＲＫＥＳＥＦＬＬＴＳＣＰＥＲＬＬＧＨＬＥＲＧＲＱＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＧＮＳＧＳＳＶＬＴＣＡＡＦＳＦＹＰＰＥＬＫＦＲＦＬＲＮＧＬＡＳＧＳＧＮＣＳＴＧＰＮＧＤＧＳＦＨＡＷＳＬＬＥＶＫＲＧＤＥＨＨＹＱＣＱＶＥＨＥＧＬＡＱＰＬＴＶＤＬＤＳＰＡＲＳＳＶＰＶＶＧＩＩＬＧＬＬＬＶＶＶＡＩＡＧＧＶＬＬＷＮＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＬＳＬＳＧＤＤＳＧＤＬＬＰＧＧＮＬＰＰＥＡＥＰＱＧＶＮＡＦＰＡＴＳ（配列番号５）
【0114】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのラットＦｃＲｎ受容体の軽鎖は、以下の配列を有する。ＭＡＲＳＶＴＶＩＦＬＶＬＶＳＬＡＶＶＬＡＩＱＫＴＰＱＩＱＶＹＳＲＨＰＰＥＮＧＫＰＮＦＬＮＣＹＶＳＱＦＨＰＰＱＩＥＩＥＬＬＫＮＧＫＫＩＰＮＩＥＭＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＩＬＡＨＴＥＦＴＰＴＥＴＤＶＹＡＣＲＶＫＨＶＴＬＫＥＰＫＴＶＴＷＤＲＤＭ（配列番号６）
【0115】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのＦｃＲｎ受容体は、カニクイザル（カニクイザル）ＦｃＲｎ受容体である。
【0116】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのカニクイザルＦｃＲｎ受容体の重鎖は、以下の配列を有する。ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＤＳＬＲＧＱＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＳＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＧＮＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＭＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＴＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＳＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＳＫＤＩＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号７）
【0117】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットのカニクイザルＦｃＲｎ受容体の軽鎖は、以下の配列を有する。ＭＳＰＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＰＳＧＬＥＡＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＰＥＮＧＫＰＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＫＭＧＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＮＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＧＰＲＴＶＫＷＤＲＤＭ（配列番号８）
【0118】
特定の実施形態では、本発明の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットは、限定されないが、内在化、選別および細胞内輸送の動態、およびエキソサイトーシスなどの複数の因子の、試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の回収プロセスの全体的な効率に対する寄与を評価するために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の方法およびアッセイを使用して、試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のＰＫを決定または予測するためのＦｃＲｎ媒介サルベージ経路に関与する複数のパラメータを同定および／または検出し得る。
【0119】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットを使用して、試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）のインビトロリサイクルおよびインビボクリアランスの相関を検出し得る。特定の実施形態では、本開示のアッセイを使用して、ＢＶ ＥＬＩＳＡまたはＦｖチャージ／ｐＩと比較して、分子のインビトロリサイクルおよびインビボクリアランスの相関を検出し得る。
【0120】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットを使用して、インビボでの試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の分布および異化作用に対するグリコシル化の役割を評価および／または調査し得る。特定の実施形態では、該分子は、グリコフォームバリアントであり得る。
【0121】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットを使用して、細胞内輸送パラメータに対する分子へのシアル酸の付加の役割を評価し得る。特定の実施形態では、それらは、インビボでの分子の高マンノースおよび高シアル化グリコフォームバリアントのクリアランスにおけるさらなる機構の関与の分析に使用し得る。
【0122】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットは、それらのＰＫに関連する試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の排除機構としてのＦｃＲｎ媒介性経細胞輸送およびリサイクルの研究のためのツールとして使用し得る。
【0123】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットは、ＦｃＲｎと複合体化したＩｇＧの分布を支配する分子機構の研究および解明のためのツールとして使用し得る。
【0124】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットは、ヒトにおける典型的なＦｃＲｎ結合親和性を有する試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の標的非依存的、非特異的クリアランス機構を反映する出力を提供し得る。
【0125】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットは、多様な群のＦｃ含有分子の分析に使用し得、ＰＫに影響を及ぼすことが知られている因子に応答し得る。
【0126】
特定の実施形態では、本実施形態の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットを使用して、リサイクルアッセイならびにリサイクルアッセイおよび経細胞輸送アッセイに関与する因子を分析し、これらの因子がインビボクリアランスとどのように相関するかを理解し、この相関の定量的性質を定義し得る。
【0127】
特定の実施形態では、本実施形態の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットを使用して、リサイクルアッセイならびにリサイクルアッセイおよび経細胞輸送アッセイに関与する因子を分析し、これらの因子が組織浸透性とどのように相関するかを理解し、この相関の定量的性質を定義し得る。いくつかの実施形態では、組織浸透性は脳浸透性である。
【0128】
特定の実施形態では、本開示の方法、アッセイ、アッセイ系およびキットは、様々な細胞型／組織区画におけるリサイクル経路、経細胞輸送経路の中の、飲作用または内在化試験分子（例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはＦｃ含有分子を含む）の分布、ならびにＩｇＧのクリアランスに関与する細胞におけるそのような分布を支配する分子機構の調査に使用し得る。
【0129】
特定の実施形態では、本開示は、リサイクルアッセイ系に関する。特定の実施形態では、本開示は、リサイクルおよび経細胞輸送アッセイ系に関する。例えば、限定するものではないが、そのような系は、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの各々が生理学的ｐＨの水溶液を含む、第１のチャンバーおよび第２のチャンバー；第１のチャンバーと第２のチャンバーとを分離する細胞層であって、細胞層が、第１のチャンバーに導入された分子を細胞層に戻し、第１のチャンバーに戻す、細胞層；ならびに第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器を備える。特定の実施形態では、本明細書に開示されるアッセイ系は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒト細胞などの真核細胞の細胞層を用いる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示されるアッセイ系は、腎臓細胞の細胞層を用いる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアッセイ系は、ＭＤＣＫ細胞の細胞層を用いる。いくつかの実施形態では、細胞層は単細胞層である。特定の実施形態では、本明細書で開示されるアッセイ系は、少なくとも１つの異種遺伝子を含む細胞を用いる。特定の実施形態では、本明細書で開示されるアッセイ系は、ＦＣＧＲＴ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの異種遺伝子を含む細胞を用いる。特定の実施形態では、本明細書で開示されるアッセイ系は、異種細胞表面タンパク質を発現する細胞を用いる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるアッセイ系は、異種細胞表面タンパク質を発現する細胞を用い、ここで、該異種細胞表面タンパク質は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されるアッセイ系は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、自動免疫アッセイプラットフォーム（例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、Ｇｙｒｏｌａｂ、およびＳｉｎｇｕｌｅｘ）、蛍光イメージング、または質量分析の使用を介してリサイクルされた分子の数を測定し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるアッセイ系は、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも５０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱを有する方法、例えば高親和性捕捉試薬（例えば、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ、例えばビオチン－Ｒ１０Ｚ）を使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して、リサイクルされた分子の数を測定し得る。特定の実施形態では、本開示のリサイクルおよび経細胞輸送アッセイ系において、細胞層は、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を媒介し得る。いくつかの実施形態では、アッセイ系は、第２のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器をさらに備える そのような検出器は、第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器と同じタイプおよび／または同じＬＬＯＱを有してもよく、あるいは別のタイプおよび／または異なる感度、例えば低感度タイプ（例えば、ナノモル濃度範囲のＬＬＯＱを有する）であってもよい。
【0130】
４．細胞
本開示の方法、アッセイ、アッセイ系またはキットで使用される適切な細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。
本開示の方法、アッセイ、アッセイ系またはキットで使用される適切な細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。
【0131】
特定の実施形態では、脊椎動物細胞を使用し得る。有用な哺乳動物細胞株の非限定的な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；初代ヒト内皮細胞；ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）；ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）；血管内皮細胞（ＥＡ．ｈｙ９２６）；ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）；ヒト胎児腎臓細胞株（２９３、または例えばＧｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載された２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒら、ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。有用な哺乳動物細胞株の更なる非限定的な例としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第７７巻：第４２１６頁（１９８０年））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ハイブリドーマ細胞を使用し得る。例えば、限定としてではないが、ハイブリッド細胞株は、ヒトおよびマウスを含む任意の種のものであり得る。特定の実施形態では、本開示の方法は、初代および確立された内皮および／または上皮細胞を使用し得る。例えば、限定するものではないが、内皮細胞および／または上皮細胞は、ｃａｃｏ－２、Ｔ－８４、ＨＭＥＣ－１、ＭＨＥＣ２．６、ＨＵＶＥＣ、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞（例えば、Ｌｉｄｉｎｇｔｏｎ，Ｅ．Ａ．，Ｄ．Ｌ．Ｍｏｙｅｓ，ら．（１９９９）、“Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７（４）：２３９－２４６、またはＹａｍａｕｒａ，Ｙ，Ｂ．Ｄ．Ｃｈａｐｒｏｎ，ら（２０１６）、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｆｉｒｓｔ－Ｐａｓｓ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，”Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ４４（３）：３２９－３３５を参照されたい）であり得る。
【0132】
特定の実施形態では、開示される方法、アッセイ、アッセイ系またはキットで使用するための細胞は、分子、例えば受容体をコードする核酸を含み得る。特定の実施形態では、核酸は、１つ以上のベクター、例えば発現ベクター中に存在し得る。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、それらが導入される細胞内で自己複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、細胞への導入時に細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に連結する遺伝子の発現を誘導し得る。一般に、組換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。本開示で使用するための発現ベクターの更なる非限定例としては、等価な機能的役割を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【0133】
特定の実施形態では、分子、例えば受容体をコードする核酸は、細胞に導入され得る。特定の実施形態では、細胞への核酸の導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、微小細胞媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって行い得る。特定の実施形態では、細胞は真核生物、例えばＭＤＣＫ細胞である。
【0134】
５．チャンバー
本開示の方法、アッセイ、アッセイ系またはキットは、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを必要とし、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは、細胞層によって分離されている。細胞層に沿って交差する２つの別個の区画に水溶液を保持し得る任意の適切な構成のチャンバーを使用し得る。当該チャンバーの材料としては、例えば、プラスチック（例えば、ポリカーボネート）、ガラス、セラミック、コーティング材料（例えば、可塑化金属）、またはそれらの混合物を挙げ得る。当該チャンバーは、両方のチャンバー内に十分な水溶液を保持し、当該チャンバーを分離する細胞層を維持し得る限り、完全に密閉されていてもよく、または１つ以上の側面が露出していてもよい。当該チャンバーは、一方のチャンバーが他方のチャンバーよりも容積が小さく、例えば、細胞層によって分離された他方のチャンバーの三次元空間内に嵌合する（例えば、インサートである）構成をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、小さい方のチャンバー（「内側チャンバー」と記載してもよい）が第１のチャンバーであり、大きい方のチャンバー（「外側チャンバー」と記載してもよい）が第２のチャンバーである。しかしながら、そのような用語は、現在記載されているアッセイおよびシステムの使用を、別のチャンバーの組み合わせ（例えば、外側チャンバーは第１のチャンバーとして使用され、内側チャンバーは第２のチャンバーとして使用してもよい）に限定することを意味しない。試験分子は、チャンバーのいずれの構成が使用されても、第１のチャンバーに導入される。いくつかの実施形態では、チャンバーはトランスウェルシステムである。本開示の方法、アッセイ、アッセイ系またはキットにおいて使用され得る好適なトランスウェルシステムとしては、ボイデンチャンバー、細胞遊走アッセイ、細胞浸潤アッセイ、マイクロ流体遊走デバイス、インビトロスクラッチアッセイ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法は、「汎用的な」トランスウェルプラットフォームを含む多種多様なアッセイプラットフォーム（例えば、１２ウェル、２４ウェルまたは９６ウェルマルチウェルアレイ）を利用して行い得る。アッセイプラットフォームの非限定的な例としては、ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（登録商標）細胞培養インサートおよびインサートプレート、ならびにＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）ポリカーボネート膜細胞培養インサートが挙げられる。
例示的な実施形態
Ｅ１．複数の分子のリサイクルを決定することを含む方法であって、決定することが、
複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、
第１のチャンバーが、細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが水溶液を含むこと；
複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含み；
水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、方法。
Ｅ２．複数の分子が、複数の単一分子である、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．複数の分子が複数の異なる分子である、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ４．細胞層が細胞単層を含む、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５．分子輸送を媒介する受容体が、分子の細胞内輸送を媒介する受容体である、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６．分子輸送を媒介する受容体が、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリンである、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７．分子輸送を媒介する受容体が新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８．細胞が真核細胞または哺乳動物細胞である、Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９．細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１０．細胞層から放出される複数の分子の量を測定することが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む、Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１１．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約４８時間インキュベートされる、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１２．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約３０時間インキュベートされる、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載。
Ｅ１３．水溶液を交換することが、第１のチャンバーを洗浄することを含む、Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４．測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５．第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが、測定前に１時間～６時間、置換水溶液とインキュベートされる、Ｅ１４に記載の方法。
Ｅ１６．インキュベーションが、約３５℃～約３９℃の温度で行われる、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７．複数の分子がＦｃ含有分子である、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８．Ｆｃ含有分子が受容体Ｆｃ融合分子である、Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．複数の分子が抗体である、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０．抗体がモノクローナル抗体である、Ｅ１９に記載の方法。
Ｅ２１．抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、Ｅ２０に記載の方法。
Ｅ２２．抗体が、オマリズマブ、ベバシズマブ、トシリズマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）、または抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）である、Ｅ２０に記載の方法。
Ｅ２３．ＦｃＲｎが、ヒトＲｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎからなる群から選択される、Ｅ７に記載の方法。
Ｅ２４．生理学的ｐＨが約７．４である、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２５．細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を測定することをさらに含む、Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２６．経細胞輸送を測定することが、
水溶液が第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で交換された後、第２のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む、Ｅ２５に記載の方法。
Ｅ２７．薬剤の存在下で第１のチャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子のリサイクルに影響を及ぼすかどうかを判定することとを含む、Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２８．薬剤が小分子またはポリペプチドである、Ｅ２７記載の方法。
Ｅ２９．複数の分子の組織浸透性を決定する方法であって、
ａ） 複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；
水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；
ｂ） 第１のチャンバーから細胞層にリサイクルされ、第１のチャンバーに戻る複数の分子の量を測定すること；
ｃ） 第１のチャンバーから第２のチャンバーに経細胞輸送される複数の分子の量を測定すること；および
ｄ） 複数の分子の組織浸透性を、経細胞輸送された分子とリサイクルされた分子との比に基づいて決定することを含む、方法。
Ｅ３０．Ｅ２９に記載の方法であって、リサイクルされる複数の分子を測定することが：
複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、方法。
Ｅ３１．Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法であって、経細胞輸送される複数の分子を測定することが：
複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第２のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、方法。
Ｅ３２．複数の分子が、第１のチャンバー内で少なくとも約１時間～約４８時間インキュベートされる、Ｅ３０またはＥ３１に記載の方法。
Ｅ３３．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約３０時間インキュベートされる、Ｅ３０またはＥ３１に記載の方法。
Ｅ３４．水溶液を交換することが、第１のチャンバーを洗浄することを含む、Ｅ３０～Ｅ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３５．測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む、Ｅ２９～Ｅ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３６．測定の１時間～６時間前に、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートする、Ｅ３５に記載の方法。
Ｅ３７．インキュベーションが、約３５℃～約３９℃の温度で行われる、Ｅ２９～Ｅ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３８．複数の分子が、複数の単一分子である、Ｅ２９～Ｅ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３９．複数の分子が複数の異なる分子である、Ｅ２９～Ｅ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４０．細胞層が細胞単層を含む、Ｅ２９～Ｅ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４１．分子輸送を媒介する受容体が、分子の細胞内輸送を媒介する受容体である、Ｅ２９～Ｅ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４２．分子輸送を媒介する受容体が、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリンである、Ｅ２９～Ｅ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４３．分子輸送を媒介する受容体が新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である、Ｅ２９～Ｅ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４４．細胞が真核細胞または哺乳動物細胞である、Ｅ２９～Ｅ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４５．細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、Ｅ２９～Ｅ４４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ４６．リサイクルされる複数の分子の量を測定すること、および経細胞輸送される複数の分子の量を測定することは、独立して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、質量分析、またはそれらの任意の組合せの使用を含む、Ｅ２９～Ｅ４５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４７．複数の分子がＦｃ含有分子である、Ｅ２９～Ｅ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４８．Ｆｃ含有分子が受容体Ｆｃ融合分子である、Ｅ４７に記載の方法。
Ｅ４９．複数の分子が抗体である、Ｅ２９～Ｅ４８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５０．抗体がモノクローナル抗体である、Ｅ４７に記載の方法。
Ｅ５１．抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、Ｅ５０に記載の方法。
Ｅ５２．抗体が、オマリズマブ、ベバシズマブ、トシリズマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）、または抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）である、Ｅ５０に記載の方法。
Ｅ５３．生理学的ｐＨが約７．４である、Ｅ２９～Ｅ５２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５４．組織浸透性が脳浸透性である、Ｅ２９～Ｅ５３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５５．薬剤の存在下で第１のチャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子の組織浸透性に影響を及ぼすかどうかを決定することとを含む、Ｅ２９～Ｅ５４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５６．薬剤が小分子である、Ｅ５５に記載の方法。
Ｅ５７．複数の分子の薬物動態（ＰＫ）パラメータを決定する方法であって、
ａ） 複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；
水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；
ｂ） 第１のチャンバーから細胞層にリサイクルされ、第１のチャンバーに戻る複数の分子の量を測定すること；および
ｃ） リサイクルされる複数の分子の量に基づいてＰＫパラメータを決定することを含む、方法。
Ｅ５８．Ｅ５７に記載の方法であって、リサイクルされる複数の分子を測定することが：
複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、方法。
Ｅ５９．複数の分子が、第１のチャンバー内で少なくとも約１時間～約４８時間インキュベートされる、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６０．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約３０時間インキュベートされる、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６１．水溶液を交換することが、第１のチャンバーを洗浄することを含む、Ｅ５８～Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６２．測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む、Ｅ５４～Ｅ５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６３．第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが、測定前に約１時間～約６時間、置換水溶液とインキュベートされる、Ｅ６２に記載の方法。
Ｅ６４．インキュベーションが、約３５℃～約３９℃の温度で行われる、Ｅ５８～Ｅ６３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６５．複数の分子が、複数の単一分子である、Ｅ５７～Ｅ６３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６６．複数の分子が、複数の異なる分子である、Ｅ５７～Ｅ６４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６７．細胞層が細胞単層を含む、Ｅ５７～Ｅ６６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６８．細胞が異種ＦｃＲｎを発現する、Ｅ５７～Ｅ６７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６９．細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、Ｅ５７～Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７０．リサイクルされる複数の分子の量を測定することが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む、Ｅ５７～Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７１．複数の分子がＦｃ含有分子である、Ｅ５７～Ｅ７０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７２．Ｆｃ含有分子が受容体Ｆｃ融合分子である、Ｅ７１に記載の方法。
Ｅ７３．複数の分子が抗体である、Ｅ５７～Ｅ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７４．抗体がモノクローナル抗体である、Ｅ７３に記載の方法。
Ｅ７５．抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、Ｅ７４に記載の方法。
Ｅ７６．抗体が、オマリズマブ、ベバシズマブ、トシリズマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）、または抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）である、Ｅ７４に記載の方法。
Ｅ７７．生理学的ｐＨが約７．４である、Ｅ５７～Ｅ７６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７８．ＰＫパラメータが、複数の分子のインビボクリアランス、分布容積、曲線下面積（ＡＵＣ）またはインビボにおける半減期の測定値である、Ｅ５７～Ｅ７７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７９．薬剤の存在下で第一チャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子のＰＫパラメータに影響を及ぼすかどうかを判定することとを含む、Ｅ５７～Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８０．薬剤が小分子である、Ｅ７９に記載の方法。
Ｅ８１．アッセイ系であって、
ａ） 各チャンバーが生理学的ｐＨの水溶液を含む、第１のチャンバーおよび第２のチャンバー；
ｂ） 第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを分離する細胞層であって、第１のチャンバーから細胞層内へ、および第１のチャンバー内に戻る分子の再循環を媒介し得る、細胞層；
ｃ） 第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器を備えるアッセイ系であって；
該アッセイ系は、複数の分子のリサイクルを決定するように構成され、決定することは：
複数の分子を第１のチャンバーに導入すること；
複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、アッセイ系。
Ｅ８２．Ｅ８１に記載のアッセイ系であって、
第２のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器をさらに備え；
細胞層が、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を媒介し得るものであり；および
細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を決定するように構成され、経細胞輸送を決定することが、水溶液が交換された後に、第２のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む、アッセイ系。
Ｅ８３．第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが９６ウェルトランスウェルプレートの構成要素である、Ｅ８１またはＥ８２に記載のアッセイ系。
Ｅ８４．Ｅ８１～Ｅ８３のいずれか１つに記載のアッセイ系と、使用説明書とを含むキット。
本開示の方法、アッセイ、アッセイ系またはキットは、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを必要とし、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは、細胞層によって分離されている。細胞層に沿って交差する２つの別個の区画に水溶液を保持し得る任意の適切な構成のチャンバーを使用し得る。当該チャンバーの材料としては、例えば、プラスチック（例えば、ポリカーボネート）、ガラス、セラミック、コーティング材料（例えば、可塑化金属）、またはそれらの混合物を挙げ得る。当該チャンバーは、両方のチャンバー内に十分な水溶液を保持し、当該チャンバーを分離する細胞層を維持し得る限り、完全に密閉されていてもよく、または１つ以上の側面が露出していてもよい。当該チャンバーは、一方のチャンバーが他方のチャンバーよりも容積が小さく、例えば、細胞層によって分離された他方のチャンバーの三次元空間内に嵌合する（例えば、インサートである）構成をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、小さい方のチャンバー（「内側チャンバー」と記載してもよい）が第１のチャンバーであり、大きい方のチャンバー（「外側チャンバー」と記載してもよい）が第２のチャンバーである。しかしながら、そのような用語は、現在記載されているアッセイおよびシステムの使用を、別のチャンバーの組み合わせ（例えば、外側チャンバーは第１のチャンバーとして使用され、内側チャンバーは第２のチャンバーとして使用してもよい）に限定することを意味しない。試験分子は、チャンバーのいずれの構成が使用されても、第１のチャンバーに導入される。いくつかの実施形態では、チャンバーはトランスウェルシステムである。本開示の方法、アッセイ、アッセイ系またはキットにおいて使用され得る好適なトランスウェルシステムとしては、ボイデンチャンバー、細胞遊走アッセイ、細胞浸潤アッセイ、マイクロ流体遊走デバイス、インビトロスクラッチアッセイ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法は、「汎用的な」トランスウェルプラットフォームを含む多種多様なアッセイプラットフォーム（例えば、１２ウェル、２４ウェルまたは９６ウェルマルチウェルアレイ）を利用して行い得る。アッセイプラットフォームの非限定的な例としては、ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（登録商標）細胞培養インサートおよびインサートプレート、ならびにＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）ポリカーボネート膜細胞培養インサートが挙げられる。
例示的な実施形態
Ｅ１．複数の分子のリサイクルを決定することを含む方法であって、決定することが、
複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、
第１のチャンバーが、細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが水溶液を含むこと；
複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含み；
水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、方法。
Ｅ２．複数の分子が、複数の単一分子である、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．複数の分子が複数の異なる分子である、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ４．細胞層が細胞単層を含む、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５．分子輸送を媒介する受容体が、分子の細胞内輸送を媒介する受容体である、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６．分子輸送を媒介する受容体が、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリンである、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７．分子輸送を媒介する受容体が新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８．細胞が真核細胞または哺乳動物細胞である、Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９．細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１０．細胞層から放出される複数の分子の量を測定することが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む、Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１１．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約４８時間インキュベートされる、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１２．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約３０時間インキュベートされる、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載。
Ｅ１３．水溶液を交換することが、第１のチャンバーを洗浄することを含む、Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４．測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５．第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが、測定前に１時間～６時間、置換水溶液とインキュベートされる、Ｅ１４に記載の方法。
Ｅ１６．インキュベーションが、約３５℃～約３９℃の温度で行われる、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７．複数の分子がＦｃ含有分子である、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８．Ｆｃ含有分子が受容体Ｆｃ融合分子である、Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．複数の分子が抗体である、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０．抗体がモノクローナル抗体である、Ｅ１９に記載の方法。
Ｅ２１．抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、Ｅ２０に記載の方法。
Ｅ２２．抗体が、オマリズマブ、ベバシズマブ、トシリズマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）、または抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）である、Ｅ２０に記載の方法。
Ｅ２３．ＦｃＲｎが、ヒトＲｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎからなる群から選択される、Ｅ７に記載の方法。
Ｅ２４．生理学的ｐＨが約７．４である、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２５．細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を測定することをさらに含む、Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２６．経細胞輸送を測定することが、
水溶液が第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で交換された後、第２のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む、Ｅ２５に記載の方法。
Ｅ２７．薬剤の存在下で第１のチャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子のリサイクルに影響を及ぼすかどうかを判定することとを含む、Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２８．薬剤が小分子またはポリペプチドである、Ｅ２７記載の方法。
Ｅ２９．複数の分子の組織浸透性を決定する方法であって、
ａ） 複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；
水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；
ｂ） 第１のチャンバーから細胞層にリサイクルされ、第１のチャンバーに戻る複数の分子の量を測定すること；
ｃ） 第１のチャンバーから第２のチャンバーに経細胞輸送される複数の分子の量を測定すること；および
ｄ） 複数の分子の組織浸透性を、経細胞輸送された分子とリサイクルされた分子との比に基づいて決定することを含む、方法。
Ｅ３０．Ｅ２９に記載の方法であって、リサイクルされる複数の分子を測定することが：
複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、方法。
Ｅ３１．Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法であって、経細胞輸送される複数の分子を測定することが：
複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第２のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、方法。
Ｅ３２．複数の分子が、第１のチャンバー内で少なくとも約１時間～約４８時間インキュベートされる、Ｅ３０またはＥ３１に記載の方法。
Ｅ３３．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約３０時間インキュベートされる、Ｅ３０またはＥ３１に記載の方法。
Ｅ３４．水溶液を交換することが、第１のチャンバーを洗浄することを含む、Ｅ３０～Ｅ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３５．測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む、Ｅ２９～Ｅ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３６．測定の１時間～６時間前に、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートする、Ｅ３５に記載の方法。
Ｅ３７．インキュベーションが、約３５℃～約３９℃の温度で行われる、Ｅ２９～Ｅ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３８．複数の分子が、複数の単一分子である、Ｅ２９～Ｅ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３９．複数の分子が複数の異なる分子である、Ｅ２９～Ｅ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４０．細胞層が細胞単層を含む、Ｅ２９～Ｅ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４１．分子輸送を媒介する受容体が、分子の細胞内輸送を媒介する受容体である、Ｅ２９～Ｅ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４２．分子輸送を媒介する受容体が、トランスフェリン受容体、Ｆｃ受容体、メガリンまたはキュブリンである、Ｅ２９～Ｅ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４３．分子輸送を媒介する受容体が新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である、Ｅ２９～Ｅ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４４．細胞が真核細胞または哺乳動物細胞である、Ｅ２９～Ｅ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４５．細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、Ｅ２９～Ｅ４４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ４６．リサイクルされる複数の分子の量を測定すること、および経細胞輸送される複数の分子の量を測定することは、独立して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、質量分析、またはそれらの任意の組合せの使用を含む、Ｅ２９～Ｅ４５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４７．複数の分子がＦｃ含有分子である、Ｅ２９～Ｅ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４８．Ｆｃ含有分子が受容体Ｆｃ融合分子である、Ｅ４７に記載の方法。
Ｅ４９．複数の分子が抗体である、Ｅ２９～Ｅ４８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５０．抗体がモノクローナル抗体である、Ｅ４７に記載の方法。
Ｅ５１．抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、Ｅ５０に記載の方法。
Ｅ５２．抗体が、オマリズマブ、ベバシズマブ、トシリズマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）、または抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）である、Ｅ５０に記載の方法。
Ｅ５３．生理学的ｐＨが約７．４である、Ｅ２９～Ｅ５２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５４．組織浸透性が脳浸透性である、Ｅ２９～Ｅ５３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５５．薬剤の存在下で第１のチャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子の組織浸透性に影響を及ぼすかどうかを決定することとを含む、Ｅ２９～Ｅ５４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５６．薬剤が小分子である、Ｅ５５に記載の方法。
Ｅ５７．複数の分子の薬物動態（ＰＫ）パラメータを決定する方法であって、
ａ） 複数の分子を第１のチャンバーに導入することであって、第１のチャンバーが細胞層によって第２のチャンバーから分離されており、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは水溶液を含み；
水溶液が生理学的ｐＨにあり、細胞層が、分子輸送を媒介する受容体を発現する細胞を含む、導入すること；
ｂ） 第１のチャンバーから細胞層にリサイクルされ、第１のチャンバーに戻る複数の分子の量を測定すること；および
ｃ） リサイクルされる複数の分子の量に基づいてＰＫパラメータを決定することを含む、方法。
Ｅ５８．Ｅ５７に記載の方法であって、リサイクルされる複数の分子を測定することが：
複数の分子を第１のチャンバーに導入した後、複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、方法。
Ｅ５９．複数の分子が、第１のチャンバー内で少なくとも約１時間～約４８時間インキュベートされる、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６０．複数の分子が、第１のチャンバー内で約１時間～約３０時間インキュベートされる、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６１．水溶液を交換することが、第１のチャンバーを洗浄することを含む、Ｅ５８～Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６２．測定前に第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを置換水溶液とインキュベートすることをさらに含む、Ｅ５４～Ｅ５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６３．第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが、測定前に約１時間～約６時間、置換水溶液とインキュベートされる、Ｅ６２に記載の方法。
Ｅ６４．インキュベーションが、約３５℃～約３９℃の温度で行われる、Ｅ５８～Ｅ６３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６５．複数の分子が、複数の単一分子である、Ｅ５７～Ｅ６３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６６．複数の分子が、複数の異なる分子である、Ｅ５７～Ｅ６４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６７．細胞層が細胞単層を含む、Ｅ５７～Ｅ６６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６８．細胞が異種ＦｃＲｎを発現する、Ｅ５７～Ｅ６７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６９．細胞が、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、Ｅ５７～Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７０．リサイクルされる複数の分子の量を測定することが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）、定量的ＰＣＲ、蛍光リーダーシステム、または質量分析の使用を含む、Ｅ５７～Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７１．複数の分子がＦｃ含有分子である、Ｅ５７～Ｅ７０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７２．Ｆｃ含有分子が受容体Ｆｃ融合分子である、Ｅ７１に記載の方法。
Ｅ７３．複数の分子が抗体である、Ｅ５７～Ｅ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７４．抗体がモノクローナル抗体である、Ｅ７３に記載の方法。
Ｅ７５．抗体が、抗ＩｇＥ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＢＡＣＥ１抗体、または抗ｇＤ抗体である、Ｅ７４に記載の方法。
Ｅ７６．抗体が、オマリズマブ、ベバシズマブ、トシリズマブ、抗ＢＡＣＥ１ ＷＴ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＥＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＱＡＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＰＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＹ、抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＬＹ１（Ｑ６）、または抗ＢＡＣＥ１バリアントＹＩＹ（Ｔ３）である、Ｅ７４に記載の方法。
Ｅ７７．生理学的ｐＨが約７．４である、Ｅ５７～Ｅ７６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７８．ＰＫパラメータが、複数の分子のインビボクリアランス、分布容積、曲線下面積（ＡＵＣ）またはインビボにおける半減期の測定値である、Ｅ５７～Ｅ７７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７９．薬剤の存在下で第一チャンバー内で複数の分子をインキュベートすることと、薬剤が複数の分子のＰＫパラメータに影響を及ぼすかどうかを判定することとを含む、Ｅ５７～Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８０．薬剤が小分子である、Ｅ７９に記載の方法。
Ｅ８１．アッセイ系であって、
ａ） 各チャンバーが生理学的ｐＨの水溶液を含む、第１のチャンバーおよび第２のチャンバー；
ｂ） 第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを分離する細胞層であって、第１のチャンバーから細胞層内へ、および第１のチャンバー内に戻る分子の再循環を媒介し得る、細胞層；
ｃ） 第１のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器を備えるアッセイ系であって；
該アッセイ系は、複数の分子のリサイクルを決定するように構成され、決定することは：
複数の分子を第１のチャンバーに導入すること；
複数の分子を第１のチャンバー内でインキュベートすること；
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーの両方で水溶液を交換すること；ならびに
細胞層から第１のチャンバー内に放出される複数の分子の量を測定することを含む、アッセイ系。
Ｅ８２．Ｅ８１に記載のアッセイ系であって、
第２のチャンバー内の分子の存在を検出するための検出器をさらに備え；
細胞層が、第１のチャンバーから第２のチャンバーへの分子の経細胞輸送を媒介し得るものであり；および
細胞層を横切る複数の分子の経細胞輸送を決定するように構成され、経細胞輸送を決定することが、水溶液が交換された後に、第２のチャンバー内の複数の分子の量を測定することを含む、アッセイ系。
Ｅ８３．第１のチャンバーおよび第２のチャンバーが９６ウェルトランスウェルプレートの構成要素である、Ｅ８１またはＥ８２に記載のアッセイ系。
Ｅ８４．Ｅ８１～Ｅ８３のいずれか１つに記載のアッセイ系と、使用説明書とを含むキット。
【実施例】
【0135】
以下の実施例は、本明細書で開示される主題の例示にすぎず、いかなる意味でも制限とみなすべきではない。
【0136】
材料および方法
ヒトＦｃＲｎを発現するＭＤＣＫ細胞株
ヒトＦｃＲｎ重鎖（ＦＣＧＲＴ）および軽鎖（Ｂ２Ｍ）の両方を安定的に発現するクローン細胞株を、以前に公開されたように（Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．ら，２０１９，ＭＡｂｓ，１１（５），９４２－９５５）作製した。簡単に説明すると、２つの遺伝子ＦＣＧＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５５８９９、ＦＣＧＲＴＮ＿ＨＵＭＡＮ）およびＢ２Ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ６１７６９、Ｂ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ）のｃＤＮＡを、改変ｐＰＲＫプラスミドを用いてＭＤＣＫ細胞に導入し、次いで、ピューロマイシンを用いて選択し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選別した。ＦＣＧＲＴおよびＢ２Ｍタンパク質の両方の有意な発現レベルに基づいて、アッセイに使用した最終クローンを選択した。ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ細胞を、１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、５μｇ／ｍＬピューロマイシンおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を含むダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で培養し、２～３日ごとに継代した。
ヒトＦｃＲｎを発現するＭＤＣＫ細胞株
ヒトＦｃＲｎ重鎖（ＦＣＧＲＴ）および軽鎖（Ｂ２Ｍ）の両方を安定的に発現するクローン細胞株を、以前に公開されたように（Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．ら，２０１９，ＭＡｂｓ，１１（５），９４２－９５５）作製した。簡単に説明すると、２つの遺伝子ＦＣＧＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５５８９９、ＦＣＧＲＴＮ＿ＨＵＭＡＮ）およびＢ２Ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ６１７６９、Ｂ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ）のｃＤＮＡを、改変ｐＰＲＫプラスミドを用いてＭＤＣＫ細胞に導入し、次いで、ピューロマイシンを用いて選択し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選別した。ＦＣＧＲＴおよびＢ２Ｍタンパク質の両方の有意な発現レベルに基づいて、アッセイに使用した最終クローンを選択した。ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ細胞を、１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、５μｇ／ｍＬピューロマイシンおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を含むダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で培養し、２～３日ごとに継代した。
【0137】
試験分子
試験分子には、一連のヒト化ＩｇＧ １抗体－ヒト研究においてクリアランス値が文書化または公表されている７つの治療抗体のパネル、およびＦｃ－ＦｃＲｎ結合親和性を変化させる操作された突然変異を有するそのバリアントの２つを有する抗単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ野生型（抗ｇＤ ＷＴ）（抗ｇＤ ＨＡＨＱおよび抗ｇＤ ＹＴＥ）が含まれていた。７種の治療用抗体のうち、５種は市販の製剤であり、そのうち２種（ベドリズマブおよびアダリムマブ）は製造業者から購入した。残りの治療用抗体（ベバシズマブ、オマリズマブ、トシリズマブ、ｍＡｂＸおよびｍＡｂＹ）は、抗ｇＤバリアントと共に、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ）の操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生した。
試験分子には、一連のヒト化ＩｇＧ １抗体－ヒト研究においてクリアランス値が文書化または公表されている７つの治療抗体のパネル、およびＦｃ－ＦｃＲｎ結合親和性を変化させる操作された突然変異を有するそのバリアントの２つを有する抗単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ野生型（抗ｇＤ ＷＴ）（抗ｇＤ ＨＡＨＱおよび抗ｇＤ ＹＴＥ）が含まれていた。７種の治療用抗体のうち、５種は市販の製剤であり、そのうち２種（ベドリズマブおよびアダリムマブ）は製造業者から購入した。残りの治療用抗体（ベバシズマブ、オマリズマブ、トシリズマブ、ｍＡｂＸおよびｍＡｂＹ）は、抗ｇＤバリアントと共に、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ）の操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生した。
【0138】
リサイクルアッセイ
ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ細胞を、６×１０４細胞／ウェルの密度で、９６ウェルトランスウェルプレート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、マサチューセッツ州バーリントン）の内側チャンバーに播種し、１００μＬの増殖培地を内側チャンバーに、２００μＬの増殖培地を外側チャンバーに入れ、メンブレンフィルター上でコンフルエンスに達するまで３日間培養した。リサイクルを測定するために、内側チャンバー中の培地を除去し、５０μＬの試験抗体を１００μｇ／ｍＬ（０．６７μＭ）の濃度で各内側チャンバーに負荷し、続いて５％ ＣＯ２中、３７℃で２時間インキュベートした。トランスウェルを増殖培地で洗浄して、両方のチャンバー内の残留抗体を除去し、１００μＬ／ウェルの新鮮な細胞培養培地を内側チャンバーに、２００μＬ／ウェルの培地を外側チャンバーに残した。細胞を５％ ＣＯ２中、３７℃でさらに４時間インキュベートし、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによる以下の定量のために、リサイクルサンプルを内部チャンバーから採取した。実験の最後の工程において、２０ｍＭのルシファーイエローを内側チャンバーに添加し、１時間インキュベートすることによって、細胞単層の完全性をルシファーイエロー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて評価した。次いで、外側チャンバーから採取したサンプルをルシファーイエローのレベルについて測定し、０．１％を超える受動流路（外側チャンバーからのルシファーイエローのシグナルを対応する内側チャンバーのシグナルに分割することによって測定される）を有するウェルからの結果は、細胞単層の潜在的な漏れのために無効であるとみなし、廃棄した。各リサイクルアッセイ測定を６～８回反復して行い、報告された値は、同じトランスウェルプレートにおいて並行して試験されたベバシズマブのリサイクル出力によって正規化された平均濃度である。
ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ細胞を、６×１０４細胞／ウェルの密度で、９６ウェルトランスウェルプレート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、マサチューセッツ州バーリントン）の内側チャンバーに播種し、１００μＬの増殖培地を内側チャンバーに、２００μＬの増殖培地を外側チャンバーに入れ、メンブレンフィルター上でコンフルエンスに達するまで３日間培養した。リサイクルを測定するために、内側チャンバー中の培地を除去し、５０μＬの試験抗体を１００μｇ／ｍＬ（０．６７μＭ）の濃度で各内側チャンバーに負荷し、続いて５％ ＣＯ２中、３７℃で２時間インキュベートした。トランスウェルを増殖培地で洗浄して、両方のチャンバー内の残留抗体を除去し、１００μＬ／ウェルの新鮮な細胞培養培地を内側チャンバーに、２００μＬ／ウェルの培地を外側チャンバーに残した。細胞を５％ ＣＯ２中、３７℃でさらに４時間インキュベートし、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによる以下の定量のために、リサイクルサンプルを内部チャンバーから採取した。実験の最後の工程において、２０ｍＭのルシファーイエローを内側チャンバーに添加し、１時間インキュベートすることによって、細胞単層の完全性をルシファーイエロー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて評価した。次いで、外側チャンバーから採取したサンプルをルシファーイエローのレベルについて測定し、０．１％を超える受動流路（外側チャンバーからのルシファーイエローのシグナルを対応する内側チャンバーのシグナルに分割することによって測定される）を有するウェルからの結果は、細胞単層の潜在的な漏れのために無効であるとみなし、廃棄した。各リサイクルアッセイ測定を６～８回反復して行い、報告された値は、同じトランスウェルプレートにおいて並行して試験されたベバシズマブのリサイクル出力によって正規化された平均濃度である。
【0139】
内側チャンバーから採取したサンプルはリサイクル成分を表し、外側チャンバーからのサンプルは経細胞輸送成分を表す。ＥＬＩＳＡを用いた定量のために、サンプルを－７０℃で凍結した。
【0140】
この手順の変形を使用してもよい。例えば、場合により、フィルタ上で培養された細胞層に対する外乱／損傷を最小限に抑えるため、構成要素（内部チャンバー）をリサイクルするための洗浄手順では、電子ピペットの最低速度を使用し得る。場合により、免疫アッセイの定量下限を２桁にすることにより、感度が低濃度の抗体を検出するのに十分に厳密であることを確実にし得る。場合により、９５％を超える生存率を達成する条件下で細胞を培養し得る。場合により、細胞培養培地は、使用されている細胞の種類および／または評価されている試験分子に応じて調整され得る。場合により、大きなトランスウェルプレートを使用してもよい（例えば、１２ウェルまたは２４ウェル）。さらなる変形を行ってもよい。
【0141】
ＥＬＩＳＡ法
捕捉分子としてビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ビオチン－Ｒ１０Ｚ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）、検出分子としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＦａｂ Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、および発色のための３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用する半均一架橋酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、サンプルを評価した。具体的には、標準、対照、およびサンプルを細胞培養培地で希釈してそれらの最終濃度にし、他の試薬をアッセイ希釈液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ポリソルベート２０／０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００、ｐＨ７．４±０．１）で調製した。各治療分子標準液を４ｎｇ／ｍＬ～３１．２５ｐｇ／ｍＬまで段階希釈した（ウェル内濃度）。アッセイのために、６０μＬ／ウェルの希釈標準液、対照、またはサンプルを、穏やかに撹拌しながら密封した９６ウェルポリプロピレンプレート中、６０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬのビオチン－Ｒ１０Ｚと共に周囲温度で一晩インキュベートした。一晩インキュベーションした後、１００μＬ／ウェルの混合物をストレプトアビジンでコーティングし、予めブロックしたプレート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インディアナ州、インディアナポリス）に添加した。プレートを密封し、撹拌しながら周囲温度で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．３４）でサイクルあたり４００μＬ／ウェルで４回洗浄した。次に、１００μＬ／ウェルの０．１μｇ／ｍＬ ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトを添加し、プレートを密封し、周囲温度で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液でサイクルあたり３００μＬ／ウェルで４回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ基質溶液ＢおよびＴＭＢペルオキシダーゼ基質混合物（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州、ゲイザースバーグ）を添加し、１５～２０分間インキュベートし、プレートを発色させた。発色を停止させるために、１００μＬの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４を各ウェルに添加した。プレートを、６３０ｎｍの参照フィルタを用いて４５０ｎｍ（検出波長）でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で読み取った。４パラメータフィットを使用してデータを分析し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．５．１ソフトウェアプログラムで１／ｙ２で重み付けした。
捕捉分子としてビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ビオチン－Ｒ１０Ｚ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）、検出分子としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＦａｂ Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、および発色のための３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用する半均一架橋酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、サンプルを評価した。具体的には、標準、対照、およびサンプルを細胞培養培地で希釈してそれらの最終濃度にし、他の試薬をアッセイ希釈液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ポリソルベート２０／０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００、ｐＨ７．４±０．１）で調製した。各治療分子標準液を４ｎｇ／ｍＬ～３１．２５ｐｇ／ｍＬまで段階希釈した（ウェル内濃度）。アッセイのために、６０μＬ／ウェルの希釈標準液、対照、またはサンプルを、穏やかに撹拌しながら密封した９６ウェルポリプロピレンプレート中、６０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬのビオチン－Ｒ１０Ｚと共に周囲温度で一晩インキュベートした。一晩インキュベーションした後、１００μＬ／ウェルの混合物をストレプトアビジンでコーティングし、予めブロックしたプレート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インディアナ州、インディアナポリス）に添加した。プレートを密封し、撹拌しながら周囲温度で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．３４）でサイクルあたり４００μＬ／ウェルで４回洗浄した。次に、１００μＬ／ウェルの０．１μｇ／ｍＬ ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトを添加し、プレートを密封し、周囲温度で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液でサイクルあたり３００μＬ／ウェルで４回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ基質溶液ＢおよびＴＭＢペルオキシダーゼ基質混合物（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州、ゲイザースバーグ）を添加し、１５～２０分間インキュベートし、プレートを発色させた。発色を停止させるために、１００μＬの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４を各ウェルに添加した。プレートを、６３０ｎｍの参照フィルタを用いて４５０ｎｍ（検出波長）でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で読み取った。４パラメータフィットを使用してデータを分析し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．５．１ソフトウェアプログラムで１／ｙ２で重み付けした。
【0142】
実施例１：リサイクルアッセイの開発
ヒトＦｃＲｎ重鎖（ＦＣＧＲＴ）および軽鎖（Ｂ２Ｍ）の両方を発現するように操作したクローンＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ）を使用して、ＦｃＲｎ依存性リサイクルアッセイを開発した。ＭＤＣＫ細胞株における機能的ヒトＦｃＲｎが示唆された発現レベル、細胞内共局在および機能的読み出しは以前に実証されている（Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．ら，２０１９，ＭＡｂｓ，１１（５），９４２－９５５）。リサイクルアッセイは、パルスチェース実験手順（図２）、および細胞のより完全な頂端側－基底側分極を可能にするトランスウェル培養系で設計した。ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ細胞を９６ウェルのトランスウェルプレートに播種し、コンフルエンスまで３日間培養した。パルス工程のために、抗体を内部チャンバーに添加し、２時間インキュベートして、抗体が細胞によって内在化され、細胞内経路の間でホメオスタシスに分布し到達する時間を提供した（リサイクル、トランスサイトーシスおよび分解）。内側チャンバーおよび外側チャンバーの両方を洗浄し、既存または経細胞輸送された抗体を除去した後、新鮮な培地を両方のチャンバーに添加し、細胞を４時間インキュベートした。このチェース工程の間に、３つの可能な結果が考えられ、細胞内の抗体が、内側チャンバーにリサイクルされるか、外側チャンバーに経細胞輸送されるか、または細胞内で分解される。内側チャンバーに現れる抗体は、リサイクルされた分子を表す。したがって、分析のために内部チャンバー溶液を収集した。外側チャンバーに経細胞輸送された抗体はいずれもサンプルから除外し、ＦｃＲｎ媒介経細胞輸送によるリサイクルアッセイの汚染を回避した。単層の完全性を各実験の最後に評価し、損なわれた単層からのデータを分析から除外した。
ヒトＦｃＲｎ重鎖（ＦＣＧＲＴ）および軽鎖（Ｂ２Ｍ）の両方を発現するように操作したクローンＭＤＣＫ細胞株（ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ）を使用して、ＦｃＲｎ依存性リサイクルアッセイを開発した。ＭＤＣＫ細胞株における機能的ヒトＦｃＲｎが示唆された発現レベル、細胞内共局在および機能的読み出しは以前に実証されている（Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．ら，２０１９，ＭＡｂｓ，１１（５），９４２－９５５）。リサイクルアッセイは、パルスチェース実験手順（図２）、および細胞のより完全な頂端側－基底側分極を可能にするトランスウェル培養系で設計した。ＭＤＣＫ－ｈＦｃＲｎ細胞を９６ウェルのトランスウェルプレートに播種し、コンフルエンスまで３日間培養した。パルス工程のために、抗体を内部チャンバーに添加し、２時間インキュベートして、抗体が細胞によって内在化され、細胞内経路の間でホメオスタシスに分布し到達する時間を提供した（リサイクル、トランスサイトーシスおよび分解）。内側チャンバーおよび外側チャンバーの両方を洗浄し、既存または経細胞輸送された抗体を除去した後、新鮮な培地を両方のチャンバーに添加し、細胞を４時間インキュベートした。このチェース工程の間に、３つの可能な結果が考えられ、細胞内の抗体が、内側チャンバーにリサイクルされるか、外側チャンバーに経細胞輸送されるか、または細胞内で分解される。内側チャンバーに現れる抗体は、リサイクルされた分子を表す。したがって、分析のために内部チャンバー溶液を収集した。外側チャンバーに経細胞輸送された抗体はいずれもサンプルから除外し、ＦｃＲｎ媒介経細胞輸送によるリサイクルアッセイの汚染を回避した。単層の完全性を各実験の最後に評価し、損なわれた単層からのデータを分析から除外した。
【0143】
９６ウェルアッセイ形式で細胞から放出されるリサイクル抗体の量が少ないので、高感度ヒトＩｇＧ特異的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を開発した。このサンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉にビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ、検出にＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＦａｂ、および発色にＴＭＢ溶液を使用し（図３Ａ）、定量下限（ＬＬＯＱ）は５０ｐｇ／ｍＬを達成し、ナノモル濃度以下のリサイクル出力（図３Ｂ）の定量を可能にした。
【0144】
実施例２：ヒト化ＩｇＧ１抗体のリサイクル出力は、ＦｃＲｎを発現する細胞におけるＦｃＲｎ媒介機構に大きく依存する
リサイクルアッセイにおけるＦｃＲｎ媒介機構の関与を実証するために、ヒト化ＩｇＧ１抗体－抗単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（抗ｇＤ）野生型（ＷＴ）を、Ｆｃ－ＦｃＲｎ結合親和性を変化させるＦｃ突然変異を有する２つのバリアントと比較した。抗ｇＤＨＡＨＱバリアントの１つは、ＦｃＲｎ結合を無効にするＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ変異を保有し、他の抗ｇＤＹＴＥバリアントは、ＦｃＲｎ結合増強変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを保有する。抗ｇＤＨＡＨＱのリサイクル出力は０．６ｎｇ／ｍＬであり、抗ｇＤＷＴのリサイクル出力（１．２ｎｇ／ｍＬ）よりも有意に低かったが、抗ｇＤＹＴＥはリサイクル出力が増大していた（１．９ｎｇ／ｍＬ）（図４）。これらの結果は、この系におけるリサイクル出力によって反映される主要な機構がＦｃＲｎによって媒介されることを示唆し、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧホメオスタシスを評価するためのこのアッセイの使用を支持する。
リサイクルアッセイにおけるＦｃＲｎ媒介機構の関与を実証するために、ヒト化ＩｇＧ１抗体－抗単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（抗ｇＤ）野生型（ＷＴ）を、Ｆｃ－ＦｃＲｎ結合親和性を変化させるＦｃ突然変異を有する２つのバリアントと比較した。抗ｇＤＨＡＨＱバリアントの１つは、ＦｃＲｎ結合を無効にするＨ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ変異を保有し、他の抗ｇＤＹＴＥバリアントは、ＦｃＲｎ結合増強変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを保有する。抗ｇＤＨＡＨＱのリサイクル出力は０．６ｎｇ／ｍＬであり、抗ｇＤＷＴのリサイクル出力（１．２ｎｇ／ｍＬ）よりも有意に低かったが、抗ｇＤＹＴＥはリサイクル出力が増大していた（１．９ｎｇ／ｍＬ）（図４）。これらの結果は、この系におけるリサイクル出力によって反映される主要な機構がＦｃＲｎによって媒介されることを示唆し、ＦｃＲｎ媒介ＩｇＧホメオスタシスを評価するためのこのアッセイの使用を支持する。
【0145】
次に、リサイクル測定の動態を、オマリズマブ、ベバシズマブ、ベドリズマブおよびトシリズマブを含む一群の従来のヒト化治療抗体を使用することによって評価した。リサイクルサンプルは、チェース工程中の様々な時点（２０分～４時間範囲）で採取した。個々の各分子について、リサイクルの累積的な増加が観察され、リサイクル出力は２０分で最も低く、４時間で最も高かった（図５Ａ）。評価した抗体のうちの３つは約０．４～０．５ｎｇ／ｍｌの最大リサイクル量を示したが、トシリズマブはより高いリサイクル値を有し、４時間で１．０９ｎｇ／ｍｌに達した。４つの分子間のリサイクル出力の違いにもかかわらず、リサイクルの動力学は同様であり、チェース工程の時間経過を通してほとんど変動を示さない（図５Ｂ；リサイクル出力を同じ分子の４時間データ点に対して正規化した。データを表１Ｂにまとめた）。４つの分子間のリサイクル出力の順位付けを、ベバシズマブのリサイクル出力に正規化して各時点でさらに調べた。ランキング順位および正規化されたリサイクル出力の両方が４つの時点（ベバシズマブに対して正規化された表１Ａ）にわたって同様であり、リサイクル出力の相対性が追跡時間に関係なく一貫していることを示唆している。４つの時点（２０、３０、６０、および２４０分）にわたる変動係数（ＣＶ）は、各分子について２０％未満であり、絶対リサイクル値が異なる抗体間の相対的なリサイクル出力が４時間の追跡にわたって一貫していたことを示唆した。したがって、定量に対して信頼性のある高いリサイクル出力のために、パルス工程における４時間をこのシステムの標準的なアッセイ手順として選択し、他の試験分子で測定されたリサイクル出力の正規化のための内部対照としてベバシズマブを使用することを決定した。
【表1A】
【表1B】
【0146】
実施例３：カニクイザルにおける経細胞輸送／リサイクル（Ｔ／Ｒ）比とインビボ脳血清比との相関
野生型（ＷＴ）分子および６種のバリアントを含む７種の抗ＢＡＣＥ１バリアントのパネルを、経細胞輸送／リサイクルデュアルアッセイで試験した。抗ＢＡＣＥ１抗体は、国際公開第２０２０／１３２２３０号にさらに記載されている。６種のバリアントは、中性ｐＨでＦｃＲｎに対する結合親和性を有意に増強し、ｐＨ７．４でのＫｄを１３．３～７８．１倍低下させるバリアントをそれらのＦｃ領域に有する（表１）。ＦｃＲｎに対する結合親和性が高いほど、ｍＡｂはより多く保護され、ｍＡｂは、ＦｃＲｎ媒介性のリサイクルおよび経細胞輸送経路にさらに導かれるであろう。ＷＴ分子と比較して、ｐＨ７．４バリアントは、リサイクルおよび経細胞輸送出力が、いずれも有意に増加した。この知見は、おそらく、ｐＨ７．４バリアントに対するＦｃＲｎ受容体媒介取り込みを介したｍＡｂ内在化の増強に起因する。さらに、経細胞輸送およびリサイクルの間の比は、ｐＨ７．４バリアントの間で有意に増加した。ＷＴ分子のＴ／Ｒ比は０．０２６であったが、ｐＨ７．４バリアントでは比は０．０７４から０．１９１の範囲であり（表２および図６）、変異が導入されることにより、経細胞輸送経路バイアスが生じ、細胞層を横切る抗体輸送が促進され得る。
野生型（ＷＴ）分子および６種のバリアントを含む７種の抗ＢＡＣＥ１バリアントのパネルを、経細胞輸送／リサイクルデュアルアッセイで試験した。抗ＢＡＣＥ１抗体は、国際公開第２０２０／１３２２３０号にさらに記載されている。６種のバリアントは、中性ｐＨでＦｃＲｎに対する結合親和性を有意に増強し、ｐＨ７．４でのＫｄを１３．３～７８．１倍低下させるバリアントをそれらのＦｃ領域に有する（表１）。ＦｃＲｎに対する結合親和性が高いほど、ｍＡｂはより多く保護され、ｍＡｂは、ＦｃＲｎ媒介性のリサイクルおよび経細胞輸送経路にさらに導かれるであろう。ＷＴ分子と比較して、ｐＨ７．４バリアントは、リサイクルおよび経細胞輸送出力が、いずれも有意に増加した。この知見は、おそらく、ｐＨ７．４バリアントに対するＦｃＲｎ受容体媒介取り込みを介したｍＡｂ内在化の増強に起因する。さらに、経細胞輸送およびリサイクルの間の比は、ｐＨ７．４バリアントの間で有意に増加した。ＷＴ分子のＴ／Ｒ比は０．０２６であったが、ｐＨ７．４バリアントでは比は０．０７４から０．１９１の範囲であり（表２および図６）、変異が導入されることにより、経細胞輸送経路バイアスが生じ、細胞層を横切る抗体輸送が促進され得る。
【表2】
【0147】
次いで、アッセイ出力とカニクイザルの研究からのインビボ脳浸透結果との間の潜在的相関を分析した（５分子について利用可能なカニクイザルのデータ；表３）。経細胞輸送またはリサイクル出力のみでは、脳血清比と有意な相関を示さなかった。しかし、Ｔ／Ｒ比は脳血清比と非常に強い相関を示した（ピアソンの相関係数０．８３７）。Ｔ／Ｒ比が高いほど、経細胞輸送に有利な偏った細胞内経路を示し、インビボでの脳浸透挙動が高いことを示す（図７）。したがって、Ｔ／Ｒ比は、治療候補の脳浸透能力の予測のための有意義な生物学的パラメータである。
【表3】
【0148】
実施例３：ヒトにおけるｍＡｂのインビトロでのリサイクル出力とインビボでのクリアランスとの相関
５種の市販薬および開発中の２種を含む７種の治療用抗体を試験し、ヒトにおけるインビボクリアランスとの相関の可能性について評価した。７種の分子は、ＩｇＧ１／カッパアイソタイプのヒト化抗体であり、作用機序、標的特性および投与経路を含む多様な特性を反映するが、ＰＫ特性またはＦｃＲｎ相互作用を修飾するためのＦｃ突然変異を有するものはない。薬物の処方情報および以前の刊行物に基づいて、クリアランス値は２．２～８．５ｍＬ／日／ｋｇの範囲をカバーする。類似の抗体アイソタイプ間で観察された非特異的クリアランスの不一致は、ｐＩ、電荷または疎水性などの分子特性に起因すると提案されている（Ｈｏｔｚｅｌ，Ｉ．ら，（２０１２），ＭＡｂｓ，４（６），７５３－７６０）。確立された配列ベースのアルゴリズムを使用して、本発明者らは、（ｉ）ｐＩ値、（ｉｉ）ｐＨ５．５での正味のＦｖ電荷、および（ｉｉｉ）ＣＤＲＬ１、Ｌ３、Ｈ２、およびＨ３上の疎水性指数値の和（ＨＩｓｕｍ）を含む分子パラメータを計算した（Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．Ｋ．ら，（２０１４），ＰＮＡＳ，１１１（５２），１８６０１－１８６０６）。これらのパラメータの極端な値は、クリアランスの早い抗体を示すことが示されているが、以前の知見と一致して、これらのパラメータとクリアランスとの相関の明らかな傾向は認められなかった（図８Ａ～図８Ｃ；表４）。リサイクルとクリアランスとの相関関係を調べるために、７種の分子をリサイクルアッセイで評価して、ＦｃＲｎ媒介リサイクルプロセスの定量的測定を行った。各分子のリサイクル出力は、内側チャンバーに戻された抗体の濃度によって測定し、対照として同じ９６ウェルトランスウェルプレート上で実行されたベバシズマブのリサイクル値に対して正規化した。これらの分子を用いたリサイクルアッセイの結果を、ヒトにおけるそれらの公開されたクリアランスと共に表４に示す。７種全ての分子が測定可能なリサイクル出力を示し、より速いクリアランス値の分子がより高いリサイクル出力を示した。リサイクル出力は、ヒトにおけるクリアランスとの強い正の相関を示した（リサイクルについてＲ２＝０．８５６；図８Ｄ）。平均アッセイ内精度は１０．７％であり、アッセイ間精度は１２．３％である。この結果により、開発中の治療用抗体または候補のＰＫ挙動の予測のための有望なアッセイとしてのリサイクルが示唆される。
５種の市販薬および開発中の２種を含む７種の治療用抗体を試験し、ヒトにおけるインビボクリアランスとの相関の可能性について評価した。７種の分子は、ＩｇＧ１／カッパアイソタイプのヒト化抗体であり、作用機序、標的特性および投与経路を含む多様な特性を反映するが、ＰＫ特性またはＦｃＲｎ相互作用を修飾するためのＦｃ突然変異を有するものはない。薬物の処方情報および以前の刊行物に基づいて、クリアランス値は２．２～８．５ｍＬ／日／ｋｇの範囲をカバーする。類似の抗体アイソタイプ間で観察された非特異的クリアランスの不一致は、ｐＩ、電荷または疎水性などの分子特性に起因すると提案されている（Ｈｏｔｚｅｌ，Ｉ．ら，（２０１２），ＭＡｂｓ，４（６），７５３－７６０）。確立された配列ベースのアルゴリズムを使用して、本発明者らは、（ｉ）ｐＩ値、（ｉｉ）ｐＨ５．５での正味のＦｖ電荷、および（ｉｉｉ）ＣＤＲＬ１、Ｌ３、Ｈ２、およびＨ３上の疎水性指数値の和（ＨＩｓｕｍ）を含む分子パラメータを計算した（Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．Ｋ．ら，（２０１４），ＰＮＡＳ，１１１（５２），１８６０１－１８６０６）。これらのパラメータの極端な値は、クリアランスの早い抗体を示すことが示されているが、以前の知見と一致して、これらのパラメータとクリアランスとの相関の明らかな傾向は認められなかった（図８Ａ～図８Ｃ；表４）。リサイクルとクリアランスとの相関関係を調べるために、７種の分子をリサイクルアッセイで評価して、ＦｃＲｎ媒介リサイクルプロセスの定量的測定を行った。各分子のリサイクル出力は、内側チャンバーに戻された抗体の濃度によって測定し、対照として同じ９６ウェルトランスウェルプレート上で実行されたベバシズマブのリサイクル値に対して正規化した。これらの分子を用いたリサイクルアッセイの結果を、ヒトにおけるそれらの公開されたクリアランスと共に表４に示す。７種全ての分子が測定可能なリサイクル出力を示し、より速いクリアランス値の分子がより高いリサイクル出力を示した。リサイクル出力は、ヒトにおけるクリアランスとの強い正の相関を示した（リサイクルについてＲ２＝０．８５６；図８Ｄ）。平均アッセイ内精度は１０．７％であり、アッセイ間精度は１２．３％である。この結果により、開発中の治療用抗体または候補のＰＫ挙動の予測のための有望なアッセイとしてのリサイクルが示唆される。
【表4】
【0149】
従来のＦｃ領域をそれぞれ有する７種の評価された抗体は、多様なＦａｂ領域特性にかかわらず、ヒトにおけるリサイクル出力とクリアランスとの間の顕著な相関を実証した。同一のＦｃ領域を有するＩｇＧは、ＦａｂアームのＦｖ電荷に起因すると考えられているＰｋ特性が大きく異なり得、ＦｃＲｎとの相互作用に影響を及ぼし得、内部移行中の液相飲作用に影響を及ぼし得る。この試験では、各分子について４時間で最大値に正規化した後、試験した４種のヒト化治療抗体（オマリズマブ、ベバシズマブ、ベドリズマブ、およびトシリズマブ）の間でリサイクル動態曲線間の変動はほとんどなかった。トシリズマブはリサイクルの速度（各時点での傾き）は同一であったが、４時間で他の３種の抗体よりも約２倍高いリサイクル出力値を示した。理論に拘束されることを望むものではないが、同様のリサイクル速度論は、従来のＦｃ領域を有するｍＡｂでは、リサイクル経路を通じたＦｃＲｎ媒介輸送が同様である可能性があり、その結果、リサイクル排出量の測定量の差がＦｃＲｎ媒介輸送の上流の機構から生じ得ることを示唆している。これらの４種の抗体は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対して同等の結合親和性を有するが、トシリズマブは計算上のＰＩ値が高く、Ｆｖ電荷が高い。これは、正電荷が細胞表面でのアニオン性ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの静電相互作用を介して非特異的結合を増強し得るので、トシリズマブのリサイクル値が高く、クリアランスが早いことを説明し得る。これらの相互作用は、液相飲作用によってトシリズマブの内在化を増加させる可能性がある。以前の研究により、ＦｃＲｎ非依存性機構が、同一のＦｃを共有するが異なるＦａｂ領域を有するｍＡｂのＰＫ挙動の調節において役割を果たし得ることが示されている。
【0150】
理論に拘束されることを望むものではないが、ＩｇＧをリソソーム分解から救済し、それを血液に戻すサルベージ機構であると考えられることから、当初は、高いリサイクル出力がクリアランス速度と逆相関し得ると予想された。意外にも、より高いリサイクル出力は、より速いクリアランスに対応することが観察された。理論に拘束されることを望むものではないが、クリアランスとＦｃＲｎ媒介性リサイクルとの間の正の相関は、各内在化事象中に排除機構を受ける抗体の画分に関連している可能性がある。リサイクルプロセスは、抗体を循環から取り出し、それらを同じ区画に戻すが、単独の因子としての血清濃度の正味量には影響しない。しかしながら、リサイクル事象が、リソソームにおける分解に起因する抗体のわずかな喪失を伴い得ることが以前に実証されている（Ｇｒｅｖｙｓら、２０１８）。現在説明されているトランスウエル培養系において、経細胞輸送はまた、抗体をリサイクルから遠ざけるように導く排除経路として機能する場合がある。理論に束縛されるものではないが、各リサイクル事象に対するそのような損失（分解および経細胞輸送による）は、循環に戻るリサイクル量を減少させ得ると推測される。したがって、高リサイクル分子の場合、損失は誇張されており、血清濃度の減少が速くなり、クリアランスの測定も速くなる。興味深いことに、この観察結果は、ＦｃＲｎ結合バリアント群では逆転しているようであり、Ｆｃ操作抗ｇＤバリアントのリサイクル出力とクリアランスとの間の負の相関の傾向を実証している。より遅いクリアランスを示したＹＴＥ突然変異は、ＷＴと比較してより高いリサイクル出力を有していた（実施例２参照）。理論に束縛されるものではないが、ＦｃＲｎに対する結合が非常に増強されたことで、主要な生物学的因子になっている可能性があり、これは、抗体の保護レベルが高まり、血清半減期を延長され、リソソームの分解の減少をもたらし得る。従来のｍＡｂとＦｃ操作ｍＡｂとの間の不一致を説明するには、ＰＫ挙動に影響を及ぼす支配的な因子が、分子の設計に応じて２つのシナリオの間で異なる可能性がある。したがって、このインビトロ系からの結果を解釈する場合、抗体の生化学的特性およびＦｃ操作を考慮すべきである。
【0151】
評価した７種のｍＡｂは、本明細書に記載のリサイクルアッセイが、Ｆｃ修飾を伴わないｍＡｂのＰＫ特性、特にヒトにおける循環からのクリアランスの予測因子として抗体のｐＩ、電荷または疎水性パラメータを使用する他のモデルよりも優れていたことを示している。アッセイ設計は、３コンパートメントインビトロモデルシステム（内側チャンバー、細胞、および外側チャンバー）を使用して、インビボ状況（血液区画、小胞内皮細胞、および組織区画）を模倣し、抗体の細胞代謝に影響を及ぼし得る複数の生物学的事象を組み込む。リサイクルアッセイは、抗体の細胞代謝に影響を及ぼし得る複数の生物学的因子の全体的評価を提供し、したがって、単一またはサブセットの因子、例えば非特異的結合、細胞外マトリックスへの結合、およびＦｃＲｎ相互作用のみを考慮する他の公開されたアッセイと比較して、１つ以上のＰＫ特性をより良好に予測し得る。
【0152】
さらに、理論に拘束されることを望まないが、両方のトランスウェルチャンバーにおいて使用される中性ｐＨは、抗体が細胞表面において中性ｐＨで捕捉され、放出されるインビボ状況により生理学的に関連するので、ＰＫ特性予測を成功させるために重要であり得る。これは、酸性ｐＨ（Ｃｈｕｎｇら，（２０１８），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４６２，１０１－１０５；Ｊａｒａｍｉｌｌｏら，２０１７，ＭＡｂｓ，９（５），７８１－７９１；Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙ，ＪＴら，２０１２，ＰＮＡＳ，１０９（４０），１６０９５－１６１００；Ｙｉｎｇら，２０１５，ＭＡｂｓ，７（５），９２２－９３０）で増強されたＦｃＲｎ結合を利用するために、細胞に抗体を負荷する際に酸性緩衝液を使用した他のＦｃＲｎ媒介細胞ベースのアッセイの限られた適用を説明し得る。これらの方法のいくつかは、ＦｃＲｎ結合が増強されたＦｃ操作分子のクリアランスまたは半減期を予測するものであったが、ＦｃＲｎ結合への変化がより微妙である従来のｍＡｂのＰＫ挙動を予測する能力は限られていた。さらに、リサイクルおよび経細胞輸送のいずれもが本質的に極性化され、極性化された内皮細胞の頂端面および基底外側面で独立したプロセスによって少なくとも部分的に運ばれるので、細胞の極性化は重要な因子と考えられ得る（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら，１９９９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０４（７），９０３－９１１；Ｔｚａｂａｎ，Ｓ．ら，２００９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１８５（４），６７３－６８４）。トランスウエル細胞培養系を利用する本明細書中に記載されるアッセイは、トランスサイトーシス成分からのリサイクルのより良好な極性化および分離を可能にし、これは、通常の細胞培養プレート（Ｇｒｅｖｙｓ，Ａ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，９（１）６２１）で行われる他のリサイクルアッセイと比較して、従来のｍＡｂをより正確に評価し得る。
【0153】
本明細書で引用される全ての公報、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が本開示に組み込まれている。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【配列表】
【国際調査報告】