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特表2024-515623髄腔内送達によってピット・ホプキンス症候群を治療するためのメチル－ＣＰＧ結合タンパク質２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】髄腔内送達によってピット・ホプキンス症候群を治療するためのメチル－ＣＰＧ結合タンパク質２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス
(51)【国際特許分類】
A61K 35/76 20150101AFI20240403BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240403BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240403BHJP
A61K 38/02 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
A61K35/76 ZNA
A61K48/00
A61P43/00
A61P25/00
C12N15/12
C12N7/01
C12N15/864 100Z
A61K38/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562858
(86)(22)【出願日】2022-04-13
(85)【翻訳文提出日】2023-11-20
(86)【国際出願番号】 US2022024644
(87)【国際公開番号】W WO2022221424
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/174,327
(32)【優先日】2021-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/211,822
(32)【優先日】2021-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】515289842
【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】マイヤー、キャスリン クリスティン
(72)【発明者】
【氏名】デニーズ－リバーズ、カサンドラ ニコル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA44
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZC54
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZC54
(57)【要約】
メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）の髄腔内送達を含む、ピット・ホプキンス症候群を治療するための方法及び材料を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ピット・ホプキンス症候群を治療する方法であって、それを必要とする対象に、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）を投与することを含む、方法。
【請求項2】
ピット・ホプキンス症候群に罹患している対象におけるメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）レベルを増加させる方法であって、ＭＥＣＰ２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）又はｒＡＡＶウイルス粒子を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項3】
ＰＴＨＳに罹患している対象に、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードするポリヌクレオチド配列を送達する方法であって、ＭＥＣＰ２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）又はｒＡＡＶウイルス粒子を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項4】
前記ｒＡＡＶが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｒＡＡＶが、配列番号２のプロモーター配列を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ｒＡＡＶが、ＳＶ４０イントロン及び合成ポリアデニル化シグナル配列を更に含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項7】
前記ｒＡＡＶが、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ｒＡＡＶが、変異体ＩＴＲ及び野生型ＩＴＲを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ｒＡＡＶが、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ｒＡＡＶが、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達を用いて投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
患者が、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記患者が症状のうちの１つ以上に罹患しており、前記症状が、知的障害、発達遅延、呼吸の問題、反復性の発作（てんかん）、及び特徴的な顔貌、発語の遅延又は欠如、乏しいコミュニケーションスキル、乏しい社会化スキル、過換気、無呼吸、チアノーゼ、手指及び／又は足趾のばち指、薄い眉毛、落ち窪んだ目、鼻梁が高く突出した鼻、上唇の目立つ２つの山（キューピッド弓）、唇の厚い幅広い口、歯間開離、厚みのあるかつ／又はカップ状の耳、便秘、胃腸の問題、小頭症、近視、斜視、低身長、軽度の脳異常、小さい手及び／又は足、単一手掌屈曲線（ｓｉｎｇｌｅ ｃｒｅａｓｅ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｐａｌｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｎｄｓ）、扁平足、手指及び／又は足趾の腹の肥厚化、停留精巣、常同運動、手の不随意運動、歩行の喪失、筋緊張の喪失、脊柱側弯症、睡眠障害、協調又は平衡の問題、不安、行動の問題、歯ぎしり、過度な唾液及び流涎、心臓の問題、不整脈、摂食の問題又は嚥下の問題である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ピット・ホプキンス症候群を治療するための組成物であって、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）を含む、組成物。
【請求項14】
ピット・ホプキンス症候群に罹患している対象におけるメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）レベルを増加させるための組成物であって、前記対象に対するＭＥＣＰ２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む、組成物。
【請求項15】
ＰＴＨＳに罹患している対象に、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードするポリヌクレオチド配列を送達するための組成物であって、前記対象に対するＭＥＣＰ２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む、組成物。
【請求項16】
前記ｒＡＡＶが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
前記ｒＡＡＶが、配列番号２のプロモーター配列を更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記ｒＡＡＶが、ＳＶ４０イントロン及び合成ポリアデニル化シグナル配列を更に含む、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記ｒＡＡＶが、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記ｒＡＡＶが、変異体ＩＴＲ及び野生型ＩＴＲを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記ｒＡＡＶが、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
前記組成物が、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達のために製剤化される、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
患者が、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
前記患者が症状のうちの１つ以上に罹患しており、前記症状が、知的障害、発達遅延、呼吸の問題、反復性の発作（てんかん）、及び特徴的な顔貌、発語の遅延又は欠如、乏しいコミュニケーションスキル、乏しい社会化スキル、過換気、無呼吸、チアノーゼ、手指及び／又は足趾のばち指、薄い眉毛、落ち窪んだ目、鼻梁が高く突出した鼻、上唇の目立つ２つの山（キューピッド弓）、唇の厚い幅広い口、歯間開離、厚みのあるかつ／又はカップ状の耳、便秘、胃腸の問題、小頭症、近視、斜視、低身長、軽度の脳異常、小さい手及び／又は足、単一手掌屈曲線、扁平足、手指及び／又は足趾の腹の肥厚化、停留精巣、常同運動、手の不随意運動、歩行の喪失、筋緊張の喪失、脊柱側弯症、睡眠障害、協調又は平衡の問題、不安、行動の問題、歯ぎしり、過度な唾液及び流涎、心臓の問題、不整脈、摂食の問題又は嚥下の問題である、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項25】
ピット・ホプキンス症候群（ＰＴＨＳ）を治療するための薬物を必要とする患者における薬物の調製のための、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）の、使用。
【請求項26】
ピット・ホプキンス症候群に罹患している対象におけるメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）レベルを増加させるための薬物の調製のための、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）の、使用。
【請求項27】
ＰＴＨＳに罹患している対象にメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードするポリヌクレオチド配列を送達するための薬剤の調製のための、前記メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）の、使用。
【請求項28】
前記ｒＡＡＶが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項29】
前記ｒＡＡＶが、配列番号２のプロモーター配列を更に含む、請求項２８に記載の使用。
【請求項30】
前記ｒＡＡＶが、ＳＶ４０イントロン及び合成ポリアデニル化シグナル配列を更に含む、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項31】
前記ｒＡＡＶが、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項32】
前記ｒＡＡＶが、変異体ＩＴＲ及び野生型ＩＴＲを含む、請求項３１に記載の使用。
【請求項33】
前記ｒＡＡＶが、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項34】
前記薬物が、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達を用いて投与されるように製剤化される、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項35】
前記患者が、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記患者が症状のうちの１つ以上に罹患しており、前記症状が、知的障害、発達遅延、呼吸の問題、反復性の発作（てんかん）、及び特徴的な顔貌、発語の遅延又は欠如、乏しいコミュニケーションスキル、乏しい社会化スキル、過換気、無呼吸、チアノーゼ、手指及び／又は足趾のばち指、薄い眉毛、落ち窪んだ目、鼻梁が高く突出した鼻、上唇の目立つ２つの山（キューピッド弓）、唇の厚い幅広い口、歯間開離、厚みのあるかつ／又はカップ状の耳、便秘、胃腸の問題、小頭症、近視、斜視、低身長、軽度の脳異常、小さい手及び／又は足、単一手掌屈曲線、扁平足、手指及び／又は足趾の腹の肥厚化、停留精巣、常同運動、手の不随意運動、歩行の喪失、筋緊張の喪失、脊柱側弯症、睡眠障害、協調又は平衡の問題、不安、行動の問題、歯ぎしり、過度な唾液及び流涎、心臓の問題、不整脈、摂食の問題又は嚥下の問題である、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，３２７号及び２０２１年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２１１，８２２号の優先権を主張し、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下のように特定されるコンピュータ可読形態の配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０２２年４月１２日に作成された「５６０６７＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイル、ファイルサイズ１７，２８２バイト。
本明細書と同時に提出され、以下のように特定されるコンピュータ可読形態の配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０２２年４月１２日に作成された「５６０６７＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイル、ファイルサイズ１７，２８２バイト。
【0003】
本発明は、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）を使用して、ピット・ホプキンス症候群を治療するための方法及び材料に関する。
【背景技術】
【0004】
ピット・ホプキンス症候群（ＰＴＨＳ）は、３４，０００～４１，０００人に１人に発症する、ハプロ不全をもたらすＴＣＦ４遺伝子の変異によって引き起こされる神経学的障害である。患者は、広範囲の行動症状とともに、発達遅延、知的障害、小頭症及び発作を呈する（非特許文献１）。残念ながら、ＴＣＦ４遺伝子のサイズが大きく、スプライスバリアントの数が多いため、完全な遺伝子置換療法は、現在のところ、ＰＴＨＳの治療のための実行可能な選択肢ではない。したがって、ＰＴＨＳ患者を治療するための新規治療戦略を開発する必要がある。
【0005】
ＭＥＣＰ２転写因子は、何千という遺伝子の転写を調節する。ＭＥＣＰ２は、様々な組織で発現する５２ｋＤａの核タンパク質であるが、ニューロンに豊富に存在し、神経系において最も研究されている。ヒトには、ＭＥＣＰ２Ａ及びＭＥＣＰ２Ｂとして知られるＭＥＣＰ２の２つのアイソフォームが存在する［非特許文献２］。２つのアイソフォームは、選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物に由来し、異なる翻訳開始部位を有する。ＭＥＣＰ２Ｂは、エキソン１、３及び４を含み、脳内で優勢なアイソフォームである。ＭＥＣＰ２は、メチル化ＤＮＡに可逆的に結合し、遺伝子発現を調節する［非特許文献３］。これらの機能は、それぞれ、メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）及び転写リプレッサードメイン（ＴＲＤ）にマッピングされる［非特許文献４］。もともと転写リプレッサーとして考えられていたＭＥＣＰ２は、標的遺伝子発現を誘導及び抑制することができる［非特許文献５］。ＭＥＣＰ２は、適切な神経の発達及び維持を支持すると仮定される。ニューロンにおいて、ＭＥＣＰ２は、ＤＮＡ結合及び異なる結合パートナーとの相互作用を介して、シナプス活動の遺伝子発現への翻訳を促進する［非特許文献６及び非特許文献７］。アストロサイトにおいて、ＭＥＣＰ２欠損は、マウスにおける無呼吸事象に関連している［非特許文献８］。ＭＥＣＰ２欠損は、脳サイズの縮小、ニューロン充填密度の増加、神経細胞体サイズの減少、及び樹状細胞の複雑さの減少を引き起こす可能性がある［非特許文献９］。重要なことに、ニューロンの死は、ＭＥＣＰ２欠損とは関連していない［非特許文献１０］。ＭＥＣＰ２はまた、神経系の外側にも見出されるが、レベルは組織によって異なる。
【0006】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含んで約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、非特許文献１１によって修正された非特許文献１２に提示されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用配列は、ＩＴＲ内に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。Ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、非特許文献１３に概説されている。
【0007】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレント及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、本質的にそれらの細胞の寿命にわたって、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）として存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中にクローニングされたＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の一部又は全てを、プロモーター、目的のＤＮＡ及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット等の外来ＤＮＡで置換することができる。Ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。複数のＡＡＶの血清型が存在し、多様な組織向性を提供する。既知の血清型としては、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、及びＡＡＶｒｈ７４が挙げられる。ＡＡＶ９は、特許文献１及び非特許文献１４に記載されている。
【0008】
興味深いことに、ＰＴＨＳの臨床的特徴は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）の変異によって引き起こされる別の自閉症スペクトラム障害であるレット症候群と重複している。疾患表現型の類似性は、ＰＴＨＳ患者の誤診につながる可能性がある。実際、事例研究では、ＰＴＨＳ患者の血液試料においてＭＥＣＰ２タンパク質レベルの低下が見られた（未公開の臨床データ）。したがって、新たな治療法の開発につながる可能性のある、レット症候群及びＰＴＨＳの両方を治療するための方法、並びに影響を受けた根底にある経路を破壊する方法が、当該技術分野において依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許第７，１９８，９５１号明細書
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｕｔ．１１：７９７－８０５，２００９
【非特許文献2】Ｗｅａｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２：１－７（２００５）
【非特許文献3】Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７：６３１－６５２（２０１１）
【非特許文献4】Ｎａｎ＆Ｂｉｒｄ，Ｂｒａｉｎ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２３，Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ３２－３７（２００１）
【非特許文献5】Ｃｈａｈｒｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：１２２４－１２２９（２００８）
【非特許文献6】Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４９９：３４１－３４５（２０１３）
【非特許文献7】Ｌｙｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１６：８９８－９０２（２０１３）
【非特許文献8】Ｌｉｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：４９７－５００（２０１１）
【非特許文献9】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５４：１９５－２０１（１９９５）
【非特許文献10】Ｌｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１３：３７－５１（２０１７）
【非特許文献11】Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）
【非特許文献12】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）
【非特許文献13】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）
【非特許文献14】Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）
【発明の概要】
【0011】
本開示は、ピット・ホプキンス症候群（ＰＴＨＳ）の治療を必要とする患者において、その治療に有用な遺伝子治療の方法及び材料を提供する。特に、本開示は、ＰＴＨＳの治療薬としてＭｅＣＰ２を発現する遺伝子治療ベクターを提供する。
【0012】
本開示は、ＰＴＨＳを治療する方法であって、それを必要とする対象に、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）又はｒＡＡＶウイルス粒子を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達によって投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、トレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0013】
本開示は、ＰＴＨＳに罹患している対象におけるメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）レベルを増加させる方法であって、ＭＥＣＰ２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）又はｒＡＡＶウイルス粒子を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達によって投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0014】
本開示はまた、ＰＴＨＳに罹患している対象に、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードするポリヌクレオチド配列を送達する方法であって、ＭＥＣＰ２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）又はｒＡＡＶウイルス粒子を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達によって投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0015】
本開示はまた、ＰＴＨＳに罹患している対象におけるＭＥＣＰ２タンパク質の発現を上方制御するための方法及び組成物を提供し、そのような上方制御は、ＭＥＣＰ２遺伝子の再活性化によって誘導され得る。
【0016】
他の実施形態において、患者は、症状のうちの１つ以上に罹患しており、該症状は、中等度の知的障害又は重度の知的障害を含む知的障害、精神的及び運動的スキルの発達遅延（精神運動遅延）、呼吸の問題、反復性の発作（てんかん）、及び特徴的な顔貌、発語の遅延若しくは欠如又は発語の消失、乏しいコミュニケーションスキル、乏しい社会化スキル、過換気、無呼吸、チアノーゼ、手指及び／又は足趾のばち指、薄い眉毛、落ち窪んだ目、斜視、鼻梁が高く突出した鼻、上唇の目立つ２つの山（キューピッド弓）、唇の厚い幅広い口、歯間開離、厚みのあるかつ／又はカップ状の耳、便秘、胃腸の問題、小頭症、近視、低身長、軽度の脳異常、小さい手及び／又は足、単一手掌屈曲線（ｓｉｎｇｌｅ ｃｒｅａｓｅ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｐａｌｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｎｄｓ）、扁平足、手指及び／又は足趾の腹の肥厚化、停留精巣、常同運動、手の不随意運動、歩行の喪失、筋緊張の喪失、脊柱側弯症、睡眠障害、協調又は平衡の問題、不安、行動の問題、歯ぎしり、過度な唾液及び流涎、心臓の問題、不整脈、摂食の問題又は嚥下の問題である。
【0017】
例示的な手の不随意運動は、手絞り、手洗い、又は握りしめ等の機械的、反復的な手の動きを含む。
例示的な心臓の問題は、不規則な心調律を含む。心電図によって測定される異常に長い拍動の間隔、又は他の種類の不整脈等。
例示的な心臓の問題は、不規則な心調律を含む。心電図によって測定される異常に長い拍動の間隔、又は他の種類の不整脈等。
【0018】
本開示はまた、ＰＴＨＳを治療するための組成物を必要とする対象においてＰＴＨＳを治療するための組成物であって、ＭＥＣＰ２をコードするｒＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達のために製剤化される。開示される組成物は、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0019】
本開示は、ＰＴＨＳに罹患している対象におけるメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）レベルを増加させるための組成物であって、ＭＥＣＰ２をコードするｒＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達のために製剤化される。開示される組成物は、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0020】
本開示はまた、ＰＴＨＳに罹患している対象に、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードするポリヌクレオチド配列を送達するための組成物であって、ＭＥＣＰ２をコードするｒＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達のために製剤化される。開示される組成物は、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0021】
他の実施形態において、患者は、症状のうちの１つ以上に罹患しており、該症状は、中等度の知的障害又は重度の知的障害を含む知的障害、精神的及び運動的スキルの発達遅延（精神運動遅延）、呼吸の問題、反復性の発作（てんかん）、及び特徴的な顔貌、発語の遅延若しくは欠如又は発語の消失、乏しいコミュニケーションスキル、乏しい社会化スキル、過換気、無呼吸、チアノーゼ、手指及び／又は足趾のばち指、薄い眉毛、落ち窪んだ目、鼻梁が高く突出した鼻、上唇の目立つ２つの山（キューピッド弓）、唇の厚い幅広い口、歯間開離、厚みのあるかつ／又はカップ状の耳、便秘、胃腸の問題、小頭症、近視、斜視、低身長、軽度の脳異常、小さい手及び／又は足、単一手掌屈曲線、扁平足、手指及び／又は足趾の腹の肥厚化、停留精巣、常同運動、手の不随意運動、歩行の喪失、筋緊張の喪失、脊柱側弯症、睡眠障害、協調又は平衡の問題、不安、行動の問題、歯ぎしり、過度な唾液及び流涎、心臓の問題、不整脈、摂食の問題又は嚥下の問題である。
【0022】
加えて、本開示は、ＰＴＨＳの治療を必要するための薬物を必要とする対象における薬物の調製のための、ＭＥＣＰ２をコードするｒＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子の使用を提供する。いくつかの実施形態において、薬物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達のために製剤化される。開示される薬物は、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0023】
本開示は、ＰＴＨＳに罹患している対象において、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）レベルを増加させるための医薬の調製のための、ＭＥＣＰ２をコードするｒＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子の使用を提供する。いくつかの実施形態において、薬物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達のために製剤化される。開示される薬物は、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0024】
本開示はまた、ＰＴＨＳに罹患している対象に、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードするポリヌクレオチド配列を送達するための薬物を調製するための、ＭＥＣＰ２をコードするｒＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子の使用を提供する。いくつかの実施形態において、薬物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達のために製剤化される。開示される薬剤は、トレンデレンブルグ体位で患者に投与される。例えば、患者は、ＴＣＦ４遺伝子に変異を有する。
【0025】
他の実施形態において、患者は、症状のうちの１つ以上に罹患しており、該症状は、中等度の知的障害又は重度の知的障害を含む知的障害、精神的及び運動的スキルの発達遅延（精神運動遅延）、呼吸の問題、反復性の発作（てんかん）、及び特徴的な顔貌、発語の遅延若しくは欠如又は発語の消失、乏しいコミュニケーションスキル、乏しい社会化スキル、過換気、無呼吸、チアノーゼ、手指及び／又は足趾のばち指、薄い眉毛、落ち窪んだ目、鼻梁が高く突出した鼻、上唇の目立つ２つの山（キューピッド弓）、唇の厚い幅広い口、歯間開離、厚みのあるかつ／又はカップ状の耳、便秘、胃腸の問題、小頭症、近視、斜視、低身長、軽度の脳異常、小さい手及び／又は足、単一手掌屈曲線、扁平足、手指及び／又は足趾の腹の肥厚化、停留精巣、常同運動、手の不随意運動、歩行の喪失、筋緊張の喪失、脊柱側弯症、睡眠障害、協調又は平衡の問題、不安、行動の問題、歯ぎしり、過度な唾液及び流涎、心臓の問題、不整脈、摂食の問題又は嚥下の問題である。
【0026】
一実施形態において、開示される方法、組成物、又は使用において投与されるｒＡＡＶは、配列番号３のヌクレオチド配列等の、ＭＥＣＰ２をコードするヌクレオチド配列を含む。更に、ｒＡＡＶは、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、ＭＥＣＰ２活性を保持するタンパク質をコードする。
【0027】
加えて、本開示は、配列番号２のプロモーター配列を更に含む、開示される方法、組成物又は使用において投与されるｒＡＡＶを提供する。例えば、ｒＡＡＶは、配列番号２のプロモーター配列及び配列番号３のヌクレオチド配列を含む。本開示はまた、ＳＶ４０イントロン、合成ポリアデニル化シグナル配列、及び変異体ＩＴＲ及び野生型ＩＴＲ等の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含むｒＡＡＶを提供する。
【0028】
例示的な実施形態において、開示される方法、組成物又は使用において投与されるｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド１５１～２５５８、又は配列番号５のヌクレオチド１５１～２３９３を含む。Ｌ７ 加えて、ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド１５１～２５５８、又は配列番号５のヌクレオチド１５１～２３９３に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、ＭＥＣＰ２活性を保持するタンパク質を発現する。
【0029】
開示される方法、組成物、又は使用のいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、又はＡＡＶｒｈ７４である。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶ９である。
【0030】
開示される方法、組成物、又は使用のうちのいずれかにおいて、患者は、開示されるｒＡＡＶと、組成物の粘度及び／又は密度を増加させる薬剤とを含む組成物を投与される。例えば、いくつかの実施形態において、その薬剤は造影剤である。造影剤は、２０～４０％の非イオン性低浸透圧化合物若しくは造影剤、又は約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧化合物、例えば、イオヘキソール、イオビトリドール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール若しくはイオキシラン、若しくはそれらの２つ以上の混合物であり得る。開示される組成物は、脳脊髄液への直接注射、脳室内送達、髄腔内送達、又は静脈内送達等の任意の送達手段のために製剤化され得る。
【0031】
いくつかの実施形態において、患者は、開示されるｒＡＡＶを含む組成物を投与され、組成物は、該組成物の粘度を約０．０５％、又は約１％、又は１．５％、又は約２％、又は約２．５％、又は約３％、又は約４％、又は約５％、又は約６％、又は約７％、又は約８％、又は約９％、又は約１０％増加させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、組成物の粘度を約１％～約５％、又は約２％～１２％、又は約５％～約１０％、又は約１％～約２０％、又は約１０％～約２０％、又は約１０％～約３０％、又は約２０％～約４０％、又は約２０％～約５０％、又は約１０％～約５０％、又は約１％～約５０％増加させる。
【0032】
いくつかの実施形態において、患者は、開示されるｒＡＡＶを含む組成物を投与され、組成物は、該組成物の密度を約０．０５％、又は約１％、又は１．５％、又は約２％、又は約２．５％、又は約３％、又は約４％、又は約５％、又は約６％、又は約７％、又は約８％、又は約９％、又は約１０％増加させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、組成物の密度を約１％～約５％、又は約２％～１２％、又は約５％～約１０％、又は約１％～約２０％又は約１０％～約２０％、又は約１０％～約３０％、又は約２０％～約４０％又は約２０％～約５０％、又は約１０％～約５０％、又は約１％～約５０％増加させる。
【0033】
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物であり得、患者と称されてもよい。好ましくは、対象は、脊椎動物であり、より好ましくは、対象は、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）又はペット（例えば、イヌ、ネコ）等の哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、小児対象である。いくつかの実施形態において、対象は、小児対象であり、例えば、１～１０歳の範囲の対象である。いくつかの実施形態において、対象は、４～１５歳である。対象は、一実施形態において、青年期対象であり、例えば、１０～１９歳の範囲の対象である。他の実施形態において、対象は、成人（１８歳以上）である。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】ｒＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の概略図を提供する。
【図2】ＴＣＦ４欠失を有するＰＴＨＳ誘導アストロサイト（ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ）が分化に問題を有することを示す。分化後の健常細胞及びＴＣＦ４変異体細胞からのｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅの代表的な画像が提供される。
【図3】ミスセンス変異を有するＰＴＨＳ ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅが、ＴＣＦ４タンパク質レベルの調節不全、又はタンパク質アイソフォームの調節不全を有する一方で、欠失変異が、ＴＣＦ４レベルの減少を有することを示す。神経前駆細胞（Ａ、ＮＰＣ）及びｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ（Ｂ）内のＴＣＦ４レベルの代表的なウエスタンブロットは、対照レベルに対して正規化されたときに可変発現を示す。ＴＣＦ４及びＧＡＰＤＨタンパク質レベルを定量し、健常対照に対して正規化した。重要なことに、遺伝子欠失を有する個体は、ＴＣＦ４レベルの低下を示す。組み合わされた対照データに対する一元配置分散分析を用いて行った統計解析（Ｎ＝３）。
【図4】ＰＴＨＳ ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅが異常な神経突起形態をもたらし、運動ニューロンの生存率を低下させることを示す。アストロサイトの上に播種されたニューロン（黒）の代表的な画像（Ａ）。ニューロンの定量は、生存期間、骨格長及び平均神経突起長の減少を示す（Ｂ）。
【図5】ＰＴＨＳ ＮＰＣがＭＥＣＰ２レベルを低下させたことを示す。患者ＮＰＣの代表的ウエスタンブロット（Ｎ＝３）。ＭＥＣＰ２及びＧＡＰＤＨタンパク質レベルを定量し、健常対照株に対して正規化した。統計解析は、一元配置分散分析を用いて行った（Ｎ＝最小２つの実験）。
【図6】ＴＣＦ４欠失変異が、神経前駆細胞（ＮＰＣ）からのｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ分化を妨げ、分化の２日前のＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２（１０及び１００ＭＯＩ）による形質導入が、分化を修復したことを示す。
【図7】野生型（ＷＴ）マウスにおいてＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２が良好な忍容性を示したことを示す。（Ａ）任意のベクター用量で処理したＷＴマウスにおける生存率は、未処理のＷＴマウスにおける生存率と有意差はない（ｐ＝０．１５２５）（Ｌｏｇ－Ｒａｎｋ／Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘ試験）。（Ｂ）未処理のＷＴ及びベクター処理したＷＴマウスの重症度スコアは、処理がスコアに圧倒的な影響を及ぼさないことを示す。
【図8-1】野生型動物におけるＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２処理が、生存、行動又は歩行運動を妨げないことを実証する。（Ａ）６０日時点で、ベクター処理したＷＴマウスは、未処理のＷＴと比較して統計的に異なる重症度スコアを有しない。ｐ値：（未処理ＫＯ、ｐ＜０．０００１、ＷＴ１．５０ｘ１０９、Ｐ＞０．９９９９；ＷＴ３．７５ｘ１０９、ｐ＝０．９９９２；ＷＴ７．５０ｘ１０９、ｐ＞０．９９９９；ＷＴ１．５０ｘ１０１０、ｐ＝０．９５１２；ＷＴ３．００ｘ１０１０、ｐ＝０．９８７６；ＷＴ６．００ｘ１０１０、ｐ＞０．９９９９。（Ｂ）９０日時点で、ベクター処理したＷＴマウスは、３．００ｘ１０１０ｖｇを除いて、ＷＴと比較して統計的に異なる重症度スコアを有しない。ｐ値：（未処理ＫＯ、ｐ＜０．０００１、１．５０ｘ１０９、ｐ＞０．９９９９；３．７５ｘ１０９、ｐ＝０．９９１１；７．５０ｘ１０９、ｐ＞０．８１４６；１．５０ｘ１０１０、ｐ＝０．９９８３；３．００ｘ１０１０、ｐ＝０．０４４２；６．００ｘ１０１０、ｐ＞０．４５６６。（Ｃ～Ｄ）距離及び速度に関するオープンフィールドアッセイを４９～６３日に行った。（Ｃ）ベクター処理したＷＴマウスは、未処理のＷＴマウスと比較して有意に異なるオープンフィールド速度を有しない。未処理のＷＴと比較したｐ値（未処理ＫＯ、ｐ＜０．０００１、１．５０ｘ１０９、ｐ＞０．９９９９；３．７５ｘ１０９、ｐ＞０．９９９９；７．５０ｘ１０９、ｐ＝０．９９５９；１．５０ｘ１０１０、ｐ＝０．９９９１；３．００ｘ１０１０、ｐ＞９９９９；６．００ｘ１０１０、ｐ＞０．９９９９。（Ｄ）ベクター処理したＷＴマウスは、未処理のＷＴマウスと比較して有意に異なるオープンフィールド距離を有しない。未処理のＷＴと比較したｐ値（未処理ＫＯ、ｐ＝０．００３７、１．５ｘ１０９、ｐ＞０．９９９９；３．７５ｘ１０９、ｐ＞０．９９９９；７．５ｘ１０９
、ｐ＝０．４１９９；１．５ｘ１０１０、ｐ＝０．９９９８；３．０ｘ１０１０、ｐ＝９９７６；６．０ｘ１０１０、ｐ＝０．７９８０。６０日及び９０日の平均重症度スコアを＋／－２～４日つけて、隔週のスコアリング間隔における若干の時点のばらつきを説明する。ＷＴ未処理ｎ＝４０、ＫＯ未処理ｎ＝４３、ＷＴ－１．５０ｘ１０９ｎ＝１１、ＷＴ－３．７５ｘ１０９ｎ＝３２、ＷＴ－７．５０ｘ１０９ｎ＝１６、ＷＴ－１．５０ｘ１０１０ｎ＝３６、ＷＴ－３．００ｘ１０１０ｎ＝２０、ＷＴ－６．００ｘ１０１０＝１８。統計的有意性は、テューキー検定とともにＡＮＯＶＡを用いて決定した。有意性は、未処理のＷＴマウスに関連している。
【図8-2】同上。
【図9】ＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２が、野生型脳におけるＭＥＣＰ２タンパク質の用量依存的な増加をもたらすことを示す。Ａ）抗ＭｅＣＰ２ウエスタンブロットは、Ｐ１のＩＣＶ注射の３週間後の様々な脳領域における総ＭｅＣＰ２タンパク質の用量依存的な上昇を示す。（Ｃｂ＝小脳、Ｍｅｄ＝髄質、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｔｘ＝皮質、Ｍｉｄ＝中脳）。ＴＧ３は、ＭｅＣＰ２複製症候群１の重症マウスモデルから採取された試料を示す。Ｂ）パネルＡの定量。中程度の用量ではなく高用量のＡＶＸＳ－２０１が、選択された脳領域におけるＭＥＣＰ２発現を倍加する。
【図10】非ヒト霊長類におけるＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の髄腔内注入が体重増加を妨げないことを示す。３匹のＡＶＸＳ－２０１処理動物を、対照対象（円）の体重と比較する。
【図11-1】非ヒト霊長類におけるＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の髄腔内注入が、注射後１８ヶ月にわたって血液学的値に影響を与えないことを示す。３匹のＡＶＸＳ－２０１処理動物の値を、対照対象（円）と比較する。
【図11-2】同上。
【図12-1】非ヒト霊長類におけるＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の髄腔内注入が、注射後１２～１８ヶ月にわたって血清化学に影響を与えないことを示す。肝臓及び電解質の値は、ＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２で処理した対象と、対照で処理した対象との間で類似している。３匹のＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２で処理した動物の値を、対照対象（円）と比較する。
【図12-2】同上。
【図13-1】非ヒト霊長類におけるＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の髄腔内注入が、注射後１２～１８ヶ月にわたって血清化学に影響を与えないことを示す。心臓及び腎臓の値は、ＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２で処理した対象と、対照で処理した対象との間で類似している。３匹のＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２処理動物の値を、対照対象（円）と比較する。
【図13-2】同上。
【図14】ＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２で処理した霊長類及び対照非ヒト霊長類の脳全体にわたって同様のレベルのＭｅＣＰ２発現を示す。抗ＭｅＣＰ２免疫組織化学検査では、ＭｅＣＰ２発現の肉眼的な構造的異常又は明らかな差異は示されなかった。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＬＳｃ＝腰髄、Ｔｈａｌ＝視床、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｂ＝小脳。
【図15】同様のレベルのＭｅＣＰ２を示す、対照及びＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭｅＣＰ２を注射した非ヒト霊長類からの脳領域のウエスタンブロットを提供する。総ＭｅＣＰ２レベル及びＧＡＰＤＨローディング対照が示される。パネルＡ及びＢの定量は、それぞれのブロットの下に示される。グラフ内の破線は、対照全体で検出された平均正規化値を示す。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＬＳｃ＝腰髄、Ｔｈａｌ＝視床、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｂ＝小脳。値は平均±ＳＥＭとして示されている。
【図16】対照ではなく、ＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２で処理した非ヒト霊長類の脳の調べた全ての領域におけるベクター由来転写産物を示すインサイチュハイブリダイゼーションを提供する。図は、核標識（Ｄａｐｉ）とともに、ＧＡＰＤＨ及びベクター由来ＭＥＣＰ２ ｍＲＮＡに対するプローブを示す。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＬＳｃ＝腰髄、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｂ＝小脳。スケールバー＝２０μｍ。
【図17】インサイチュハイブリダイゼーションは、注射後１８ヶ月目の、対照ではなくＡＶＸＳ－２０１で処理した非ヒト霊長類の脳の調べた全ての領域におけるベクター由来転写産物を示す。図は、核標識（Ｄａｐｉ）とともに、ＧＡＰＤＨ及びベクター由来ＭＥＣＰ２ ｍＲＮＡに対するプローブを示す。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＣＡ１及びＣＡ３＝海馬の領域、ＣＣ＝脳梁、Ｔｈａｌ＝視床、Ｃａｕ＝尾状核、Ｐｕｔ＝被殻、ＳＣｏｌｌ＝上丘、Ｍｅｄ＝髄質、Ｃｂ＝小脳、Ｃｅｒｖ＝頸髄、Ｔｈｏｒ＝胸髄、Ｌｕｍｂ＝腰髄。スケールバー＝２０μｍ。
【図18】マウスにおけるＩＣＶ注射部位の位置の概略図及び写真を提供する。
【図19】マウスにおけるＩＣＶ注射部位の位置の顕微鏡画像及び写真を提供する。
【図20】マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰのＩＣＶ注射後の脳におけるＧＦＰタンパク質発現を提供する。
【図21】野生型及びＴＣＦ＋／－マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭｅＣＰ２のＩＣＶ注射後の脳におけるＭｅＣＰ２タンパク質発現を提供する。
【図22】異なるゾーンに記録された、Ｚスタックによる海馬及び視床におけるＭｅＣＰ２タンパク質核強度を提供する。
【図23】同上。
【図24】前部及び後部皮質、海馬、並びに視床における核強度を測定するグラフを提供する。
【図25】マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰのＩＣＶ注射後のビー玉埋め試験からのデータを提供する。
【図26】マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰのＩＣＶ注射後のオープンフィールド試験からのデータを提供する。
【図27】マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰのＩＣＶ注射後の高架式十字迷路試験からのデータを提供する。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本開示は、患者がＴＣＦ４及びＭＥＣＰ２の発現を低下させたことを実証する、ＰＴＨＳ患者から得られたＮＰＣ及びｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅｓを使用したデータを提供する。したがって、本開示は、ｒＡＡＶ発現ＭＥＣＰ２を投与することを含む、ＰＴＨＳの治療方法を提供する。
【0036】
本明細書においてｓｃＡＡＶ．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２又は「ＡＶＸＳ－２０１」と称される自己相補性ＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９）等のｒＡＡＶが提供される。その遺伝子カセット（配列番号５に示されるＡＶＸＳ－２０１ゲノムのヌクレオチド１５１～２３９３）は、配列中に、マウスＭＥＣＰ２遺伝子からの５４６ｂｐプロモーターフラグメント（配列番号２）（逆方向にＮＣ＿００００８６．７のヌクレオチド７４０８５５８６～７４０８６３２３）、ＳＶ４０イントロン、ヒトＭＥＣＰ２Ｂ ｃＤＮＡ（配列番号３）（ＣＣＤＳデータベース＃ＣＣＤＳ４８１９３．１）、及び合成ポリアデニル化シグナル配列（配列番号４）を有する。遺伝子カセットは、ともに自己相補性ＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする変異体ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び野生型ＡＡＶ２逆方向末端反復に隣接する。ゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡが存在しない。
【0037】
ＴＣＦ４は、ピット・ホプキンス症候群における乏突起膠細胞の成熟、及び異常なニューロン形態（２－４）に関与する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．２４：１２３５－１２４６，２０１９；Ｃｒｕｘ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３（６）：１－９，２０１８；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９：１１３９９－１１４０８，２００９）。しかしながら、この障害における他の細胞型の役割はあまり理解されていない。直接変換技術を使用して、複数の神経学的及び神経変性障害を有する患者からのヒト線維芽細胞を神経前駆細胞（ＮＰＣ）に再プログラムし、その後、それらをアストロサイト（ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）に分化させた（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（２）：８２９－８３２，２０１４）。ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅを、ＧＦＰを発現するマウスニューロンと共培養することによって、レット症候群及びピット・ホプキンス症候群を含む、多くの神経障害の疾患病理におけるアストロサイトの役割が実証されている。
【0038】
興味深いことに、全てのＰＴＨＳ患者の細胞株が、転写因子であるメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の下方制御を示した。ＭｅＣＰ２変異は、ＰＴＨＳ患者といくつかの臨床症状の重複を共有するレット症候群につながるため、このことは特に重要である。更に、ＭｅＣＰ２及びＴＣＦ４の両方の転写因子は、下流経路を共有している。これらの観察を組み合わせると、ＭｅＣＰ２遺伝子レベルを増加させることがＰＴＨＳに対する強力な代替戦略であり得ることが示唆される。
【0039】
総合すると、これらの知見は、ｉ）ＰＴＨＳアストロサイトが疾患において役割を果たすこと、ｉｉ）ＰＴＨＳアストロサイトがニューロンに加えて治療的に標的とされるべきであること、及びｉｉｉ）遺伝子治療構築物を使用したＭＥＣＰ２レベルの調節が、ＰＴＨＳの治療のための潜在的な治療戦略であることを示唆している。本開示は、アストロサイト及び／又はニューロンの両方を治療的に処理するために、ＡＡＶ９ ｐ５４６．ＭＥＣＰ２構築物を利用することを提供する。
【0040】
一態様では、本発明は、患者へのＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドの髄腔内投与（すなわち、脳又は脊髄のくも膜の下の空間への投与）のための方法であって、ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するｒＡＡＶ９を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ９ゲノムは、自己相補性ゲノムである。他の実施形態において、ｒＡＡＶ９ゲノムは、一本鎖ゲノムである。
【0041】
本方法は、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドを患者の脳及び脊髄（すなわち、患者の中枢神経系）に送達する。送達が企図される脳のいくつかの標的領域としては、運動皮質及び脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。送達が企図される中枢神経系のいくつかの標的細胞としては、神経細胞及びグリア細胞が挙げられるが、これらに限定されない。グリア細胞の例としては、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト、及びアストロサイトが挙げられる。
【0042】
「治療」は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量又は有効な複数回用量を、それを必要とする対象動物（ヒト患者を含む）に髄腔内経路を介して投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態において、有効用量は、治療される障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和する（排除するか若しくは軽減するかのいずれか）、治療される障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を改善する、障害／疾患の状態への進行を遅延する若しくは予防する、疾患の程度を軽減する、疾患の寛解（部分寛解又は完全寛解）をもたらす、及び／又は生存を延長する用量である。
【0043】
本明細書に開示される方法、組成物及び使用のうちのいずれかにおいて、患者は、転写因子ＴＣＦ４（別名、ＩＴＦ２、ＳＥＦ２又はＥ２－２）をコードする遺伝子に変異を有し、それがＴＣＦ４タンパク質の機能の障害又は低下をもたらす。ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、及びスプライス部位の変異、並びにＴＣＦ４遺伝子を包含する転座及び大きな欠失は、ピット・ホプキンス症候群（ＰＴＨＳ）を引き起こすことが示されている。
【0044】
ＴＣＦ４遺伝子（ＭＩＭ番号６１０９５４）は、染色体１８ｑ２１．２に位置し、３６０ｋｂに及ぶ２０個のエキソン（最初と最後は非コードである）を有する。この転写因子は、ホモ又はヘテロ二量体として機能する、後半に発現する塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質である。ＴＣＦ４は、中枢神経系、硬節、気管支周囲及び腎間葉、並びに生殖器芽にわたってヒトの初期発生中に高度に発現される転写調節活性を示し、細胞増殖、系統コミットメント、及び細胞分化において重要な役割を果たす。
【0045】
いくつかの選択的にスプライシングされたＴＣＦ４バリアントが記載されており、異なるＮ末端配列を有する少なくとも１８のタンパク質アイソフォームの翻訳を可能にしている。以下は、ＰＴＨＳを引き起こすことが知られているＴＣＦ４遺伝子の例示的な変異である：全遺伝子欠失、例えば、サイズが数メガ塩基のサイズの大きな再配列、部分的遺伝子欠失、例えば、７～２０のエキソンのうちの１つ以上を伴う欠失、バランスのとれた転座、例えば、遺伝子のコード配列を破壊する欠失、ミスセンス変異、例えば、ＴＣＦ４のｂＨＬＨドメインを伴う欠失、ナンセンス変異及びフレームシフト変異、例えば、エキソン７～１８の遺伝子全体に広がる変異、並びにスライス部位変異、例えば、ドナー及びアクセプターコンセンサスススプライス部位に影響を及ぼすもの、読み取りフレームのシフトをもたらすもの。例示的なゲノム変異としては、ｔ（１４；１８）（ｑ１３．１；ｑ２１．２）及びｔ（２；１８）（ｑ３７；ｑ２１．２）が挙げられ、これらはそれぞれ、ブレークポイントが遺伝子の後半内にある、バランスのとれたデノボ転座である。ＴＣＦ４遺伝子における更なる例示的な変異は、以下の表１及び表２に提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｍｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８０（５）：９８８－９９３，２００７，Ｐｏｎｔｕａｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔ．３０：６６９－６７６，２００９，Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３３（３）：２３３－２４４，２０１８、及びＺｗｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４５（１１）：７３８－４４，２００８に記載されている。
【0046】
【表1】
【0047】
【表2-1】
【0048】
【表2-2】
【0049】
【表2-3】
【0050】
【表2-4】
【0051】
【表2-5】
【0052】
【表3-1】
【0053】
【表3-2】
【0054】
【表3-3】
【0055】
【表3-4】
【0056】
【表3-5】
【0057】
【表3-6】
【0058】
ＰＴＨＳの治療において、方法は、筋緊張の改善、歩行及び可動性の改善、発語の改善、呼吸の問題の軽減、無呼吸の軽減、発作の軽減、不安の軽減、摂食行動の正常化、社会化の増加、ＩＱの増加、睡眠パターンの正常化、及び／又は可動性の増加を含むが、これらに限定されない、対象における効果をもたらす。
【0059】
併用治療もまた、本発明によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次治療の両方を含む。本発明の方法とＰＴＨＳに対する標準的な医学的処置との組み合わせが、新規治療との組み合わせと併せて、特に企図される。
【0060】
出生後にそれを必要とする個体への送達が企図されるが、胎児への子宮内送達も企図される。
別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。ｒＡＡＶゲノムは、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ポリヌクレオチドは、「遺伝子カセット」を形成するために標的細胞において機能的である転写制御ＤＮＡ、具体的には、プロモーターＤＮＡ及びポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結されている。遺伝子カセットは、ニューロン内での特異的発現又はグリア細胞内での特異的発現を可能にするプロモーターを含み得る。例としては、ニューロン特異的エノラーゼ及びグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。摂取された薬物の制御下で誘導プロモーターも使用することができる。例としては、限定されないが、テトラサイクリン（ＴＥＴオン／オフ）系等の系［Ｕｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１４）：７９６３－７９６８（２０００）］及びエクジソン受容体調節系［Ｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：１３０８－１３１５（２００３］が挙げられる遺伝子カセットは、ポリヌクレオチドが哺乳動物細胞で発現されたときにＲＮＡ転写産物のプロセシングを促進するためのイントロン配列を更に含んでもよい。
別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。ｒＡＡＶゲノムは、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ポリヌクレオチドは、「遺伝子カセット」を形成するために標的細胞において機能的である転写制御ＤＮＡ、具体的には、プロモーターＤＮＡ及びポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結されている。遺伝子カセットは、ニューロン内での特異的発現又はグリア細胞内での特異的発現を可能にするプロモーターを含み得る。例としては、ニューロン特異的エノラーゼ及びグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。摂取された薬物の制御下で誘導プロモーターも使用することができる。例としては、限定されないが、テトラサイクリン（ＴＥＴオン／オフ）系等の系［Ｕｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１４）：７９６３－７９６８（２０００）］及びエクジソン受容体調節系［Ｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：１３０８－１３１５（２００３］が挙げられる遺伝子カセットは、ポリヌクレオチドが哺乳動物細胞で発現されたときにＲＮＡ転写産物のプロセシングを促進するためのイントロン配列を更に含んでもよい。
【0061】
本発明のｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡが存在しない。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡ（例えば、ＩＴＲ）は、限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３及びＡＡＶｒｈ７４を含む、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。例えば、ＡＡＶ９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供される。
【0062】
別の態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドを提供する。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子にアセンブリするために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）による感染を許容する細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分が単一の細胞（本明細書でパッケージング細胞と示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個（すなわち、その中には存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示されている。様々な実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、組換えベクターの送達を増強するために修飾され得る。カプシドタンパク質に対する修飾は、当該技術分野において一般的に既知である。例えば、参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／００５３９２２及びＵＳ２００９／０２０２４９０を参照されたい。
ＡＡＶ遺伝子療法
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染ヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型は１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見ることができる。しかしながら、様々な血清型が、遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されるもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする、ヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。同様の感染性パターンもまた、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることを示唆する。
ＡＡＶ遺伝子療法
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染ヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型は１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見ることができる。しかしながら、様々な血清型が、遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されるもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする、ヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。同様の感染性パターンもまた、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることを示唆する。
【0063】
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（又は導入遺伝子）を含むベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。
【0064】
「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、カプシド形成したポリヌクレオチドＡＡＶベクターとからなる、ウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
【0065】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含んで約４．７ｋｂの長さである。例示的なＩＴＲ配列は、１３０塩基対長、又は１４１塩基対長であり得る（ＩＴＲ配列等）。複数のＡＡＶの血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提供され、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提供され、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提供され、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提供され、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８６２に提供され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供され（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号もまた参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供される。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用配列は、ＩＴＲ内に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。Ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
【0066】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレント及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、本質的にそれらの細胞の寿命にわたって、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）として存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中にクローニングされたＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の一部又は全てを、プロモーター、目的のＤＮＡ及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット等の外来ＤＮＡで置換することができる。Ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
【0067】
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、本開示の核酸分子と、核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、又はＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、及びそれらの誘導体）を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術のセクションに記載したように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。
【0068】
提供される組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド形成ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。「ｒＡＡＶゲノム」という用語は、修飾された天然のＡＡＶゲノムに由来するポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、天然のｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を除去するために修飾されている。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは内因性５’及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムが由来するＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型からのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端及び３’末端に隣接された目的の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、「遺伝子カセット」を含む。例示的な実施形態において、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐのＤＮＡが存在しない。
【0069】
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態において、導入遺伝子ポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。導入遺伝子ポリヌクレオチド配列は、「遺伝子カセット」を形成するために標的細胞において機能的である転写制御要素（プロモーター、エンハンサー及び／又はポリアデニル化シグナル配列を含むが、これらに限定されない）に作動可能に連結されている。プロモーターの例は、ｐＩＲＦプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、及び配列番号２に記載されるポリヌクレオチド配列を含むＰ５４６プロモーターである。サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター（例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーター等）を含むが、これらに限定されない追加のプロモーターが、本明細書で企図される。
【0070】
更に、Ｐ５４６プロモーター配列、及び、転写促進活性を示すヌクレオチド配列又はＰ５４６（配列番号２）配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なプロモーター配列が、本明細書に提供される。
【0071】
転写制御要素の他の例は、組織特異的制御要素、例えば、ニューロン内での特異的発現又はグリア細胞内での特異的発現を可能にするプロモーターである。例としては、ニューロン特異的エノラーゼ及びグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターもまた、企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞中で発現されたときに導入遺伝子ＲＮＡ転写産物のプロセシングを促進するためのイントロン配列を含んでもよい。そのようなイントロンの一例は、ＳＶ４０イントロンである。
【0072】
限定されないが、ｒＡＡＶ９ゲノム内の遺伝子カセット内を含む、ｒＡＡＶ９ゲノム内の保存的ヌクレオチド置換が企図される。例えば、遺伝子カセット中のＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡは、ＭＥＣＰ２活性を保持するタンパク質をコードする配列番号３のヌクレオチド配列等のＭＥＣＰ２ヌクレオチド配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。
【0073】
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【0074】
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、配列番号１として示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１５１～２３９３、又は配列番号５として示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１５１～２３９３を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、配列番号１として示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１５１～２３９３、又は配列番号５として示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１５１～２３９３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。
【0075】
核酸配列又はアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、又は「パーセント同一性」という用語は、最大の一致となるように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長にわたり得るか、又は少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、より小さい断片間の同一性、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチド間の同一性もまた所望され得る。配列の同一性の割合は、当該技術分野において既知の技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、及びＢＬＡＳＴ等の容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。一実施形態において、ＢＬＡＳＴがアライメントツールとして使用される場合、次のデフォルトパラメータ：遺伝暗号＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリクッス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０個の配列；並べ替え＝高得点；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
【0076】
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態において、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号３に記載されるポリヌクレオチド配列又はその補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【0077】
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子もアセンブリするために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）による感染を許容する細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分が単一の細胞（本明細書でパッケージング細胞と示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個（すなわち、その中には存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２及びＡＡＶ－１３．を含むが、これらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示されている。
【0078】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定に発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６等の手順により細菌プラスミドに導入されてきた。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。
【0079】
ｒＡＡＶ産生の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０（１９９５）；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。上記の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
【0080】
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）等の安定に形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
【0081】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法を含む。
【0082】
別の態様では、本発明は、ＭＥＣＰ２ポリペプチドをコードするｒＡＡＶ９等のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。
本明細書に提供される組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される賦形剤を含む。許容される賦形剤は、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸塩［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］、クエン酸塩、若しくは他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール若しくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、ポロキサマー１８８等のコポリマー、プルロニック（登録商標）（例えば、プルロニックＦ６８）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、又はイオキシラン等の非イオン性低浸透圧化合物を含有する薬学的に許容される水性賦形剤を含むことができ、非イオン性低浸透圧化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特性、約１８０ｍｇＩ／ｍＬ、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇ水の蒸気圧浸透圧法によるオスモル濃度、約２７３ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度、２０℃で約２．３ｃｐ及び３７℃で約１．５ｃｐの絶対粘度、並びに３７℃で約１．１６４の比重、のうちの１つ以上を有することができる。
本明細書に提供される組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される賦形剤を含む。許容される賦形剤は、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸塩［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］、クエン酸塩、若しくは他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール若しくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、ポロキサマー１８８等のコポリマー、プルロニック（登録商標）（例えば、プルロニックＦ６８）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、又はイオキシラン等の非イオン性低浸透圧化合物を含有する薬学的に許容される水性賦形剤を含むことができ、非イオン性低浸透圧化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特性、約１８０ｍｇＩ／ｍＬ、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇ水の蒸気圧浸透圧法によるオスモル濃度、約２７３ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度、２０℃で約２．３ｃｐ及び３７℃で約１．５ｃｐの絶対粘度、並びに３７℃で約１．１６４の比重、のうちの１つ以上を有することができる。
【0083】
例示的な組成物は、組成物の粘度及び／又は密度を増加させるための薬剤を含む。例えば、組成物は、組成物の粘度及び／又は密度を増加させるための造影剤を含む。例示的な組成物は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧化合物若しくは造影剤、又は約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％ポロキサマー１８８、及び約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧化合物中に配合されたｓｃＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む。別の例示的な組成物は、１×ＰＢＳ及び０．００１％プルロニックＦ６８．ＩＧ中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
【0084】
無菌注射液は、必要な量のｒＡＡＶを、必要であれば上に列挙した他の様々な成分とともに、適切な溶媒に組み込み、その後滅菌濾過することによって調製される。一般的に、分散液は、基本的な分散媒と、上に列挙したものから必要な他の成分とを含む無菌ビヒクルに、滅菌した活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が、それらの以前に滅菌濾過した溶液から得られる。
【0085】
本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価及び投与量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、投与時期、及び標的化される細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４、又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。ＲＡＡＶのこれらの投与量は、約１×１０９ｖｇ以上、約１×１０１０ｖｇ以上、約１×１０１１ｖｇ以上、約１×１０１２ｖｇ以上、約６×１０１２ｖｇ以上、約１×１０１３ｖｇ以上、約１．３×１０１３ｖｇ以上、約１．４×１０１３ｖｇ以上、約２×１０１３ｖｇ以上、３ｘ１０１３ｖｇ以上、約６×１０１３ｖｇ以上、約１×１０１４ｖｇ以上、約３ｘ１０１４以上、約６×１０１４ｖｇ以上、約１×１０１５ｖｇ以上、約３×１０１５ｖｇ以上、約６×１０１５ｖｇ以上、約１×１０１６ｖｇ以上、約３×１０１６ｖｇ以上、又は約６×１０１６ｖｇ以上の範囲であり得る。新生児の場合、ｒＡＡＶの投与量は、約１×１０９ｖｇ以上、約１×１０１０ｖｇ以上、約１×１０１１ｖｇ以上、約１×１０１２ｖｇ以上、約６×１０１２以上、約１×１０１３ｖｇ以上、約１．３×１０１３ｖｇ以上、約１．４×１０１３ｖｇ以上、約２×１０１３ｖｇ以上、約３×１０１３ｖｇ以上、約６×１０１３ｖｇ以上、約１×１０１４ｖｇ以上、約３×１０１４ｖｇ以上、約６×１０１４ｖｇ以上、約１×１０１５ｖｇ以上、約３×１０１５ｖｇ以上、約６×１０１５ｖｇ以上、約１×１０１６ｖｇ以上、約３×１０１６ｖｇ以上、又は約６×１０１６ｖｇ以上の範囲であり得る。
【0086】
インビボ又はインビトロで、ｒＡＡＶを用いて標的細胞を形質導入する方法が、本開示によって企図される。インビボ方法は、有効用量又は有効複数回用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態において、有効用量は、治療される障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和する（排除する若しくは軽減する）、障害／疾患の状態への進行を遅延する若しくは予防する、障害／疾患の状態の進行を遅延若しくは予防する、疾患の程度を軽減する、疾患の寛解（部分寛解又は完全寛解）をもたらす、及び／又は生存を延長する用量である。本開示の方法による予防又は治療が企図される疾患の例は、ＰＴＨＳである。
【0087】
本発明のｒＡＡＶを使用した細胞の形質導入は、ｒＡＡＶによってコードされるＭＥＣＰ２ポリペプチドの持続的な発現をもたらす。いくつかの実施形態において、標的発現レベルは、ＰＴＨＳを有しない対象における正常な（又は野生型）生理学的発現レベルの約１０％～約２５％、又はＰＴＨＳを有しない対象における正常な（又は野生型）生理学的発現レベルの約２５％～約５０％、又はＰＴＨＳを有しない対象における正常な（又は野生型）生理学的発現レベルの約５０％～約７５％、又はＰＴＨＳを有しない対象における正常な（又は野生型）生理学的発現レベルの約７５％～約１２５％であることが企図される。標的発現レベルは、正常な発現レベルの約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、又は約１２５％であり得る。
【0088】
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞におけるＭＥＣＰ２の発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかのレシピエント細胞へのＭＥＣＰ２のコード領域の投与／送達を指すために使用される。
【0089】
本発明の治療方法のいくつかの実施形態において、組成物の粘度及び／又は密度を増加させる薬剤が患者に投与される。例えば、非イオン性低浸透圧造影剤もまた、患者に投与される。そのような造影剤としては、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、及び造影剤のうちの２つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療方法は、したがって、患者へのイオヘキソールの投与を更に含む。非イオン性低浸透圧造影剤は、患者の中枢神経系における標的細胞の形質導入を増加させることが企図される。本開示のｒＡＡＶを本明細書に記載の造影剤と組み合わせて使用した場合、本開示のｒＡＡＶを単独で使用した場合の細胞の形質導入と比較して、細胞の形質導入が増加することが企図される。様々な実施形態において、細胞の形質導入は、本開示のベクターが本明細書に記載の造影剤と組み合わせて使用される場合、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、少なくとも約１％、又は少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％若しくはそれ以上増加する。更なる実施形態において、細胞の形質導入は、本開示のベクターが本明細書に記載の造影剤と組み合わせて使用される場合、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、約１０％～約５０％、又は約１０％～約１００％、又は約５％～１０％、又は約５％～約５０％、又は約１％～約５００％、又は約１０％～約２００％、又は約１０％～約３００％、又は約１０％～約４００％、又は約１００％～約５００％、又は約１５０％～約３００％、又は約２００％～約５００％増加する。
【0090】
いくつかの実施形態において、患者をトレンデレンブルグ体位（頭低位）にすると、細胞の形質導入が増加することが企図される。いくつかの実施形態において、例えば、患者は、髄腔内ベクター注入中又はその後に、約１度～約３０度、約１５～約３０度、約３０～約６０度、約６０～約９０度、又は約９０～約１８０度の頭低位に傾けられる。様々な実施形態において、細胞の形質導入は、トレンデレンブルグ体位が本明細書に記載されるように使用される場合、トレンデレンブルグ体位が使用されない場合と比較して、少なくとも約１％、又は少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％若しくはそれ以上増加する。
【0091】
更なる実施形態において、細胞の形質導入は、本開示のベクターが本明細書に記載の造影剤及びトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用される場合、造影剤及びトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、約１０％～約５０％、又は約１０％～約１００％、又は約５％～１０％、又は約５％～約５０％、又は約１％～約５００％、又は約１０％～約２００％、又は約１０％～約３００％、又は約１０％～約４００％、又は約１００％～約５００％、又は約１５０％～約３００％、又は約２００％～約５００％増加する。
【0092】
本開示はまた、本開示のベクター及び造影剤の、トレンデレンブルグ体位にある、それらを必要とする患者の中枢神経系への髄腔内投与が、本開示のベクターが造影剤及びトレンデレンブルグ体位の非存在下で投与される場合の患者の生存率と比較して、患者の生存率の更なる増加をもたらす治療方法の実施形態を提供する。様々な実施形態において、本開示のベクター及び造影剤の、トレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）にある、それらを必要とする患者の中枢神経系への髄腔内投与は、本開示のベクターが造影剤及びトレンデレンブルグ体位の非存在下で投与される場合の患者の生存率と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％又はそれ以上の患者の生存率の増加をもたらす。
【0093】
併用療法もまた、本開示によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次治療の両方を含む。本開示の方法と標準的な医学的処置との組み合わせが、新規治療との組み合わせと併せて、特に企図される。いくつかの実施形態において、併用療法は、本明細書に開示される遺伝子治療と組み合わせて免疫抑制剤を投与することを含む。
【0094】
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸内、又は膣内を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される疾患の状態及びＭＥＣＰ２タンパク質を発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。
【0095】
本開示は、有効用量のｒＡＡＶ及び本開示の組成物の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与は、消化管を介した吸収等の経腸投与、及び注射、注入、又は移植による非経口投与を含む。
免疫抑制剤
免疫抑制剤は、遺伝子治療の投与後に、対象におけるｒＡＡＶに対する免疫応答の開始前又は後に投与され得る。加えて、免疫抑制剤は、遺伝子治療又はタンパク質補充療法と同時に投与され得る。対象における免疫応答は、対象へのｒＡＡＶの投与に続く、又はそれによって引き起こされる、有害な免疫応答又は炎症反応を含む。免疫応答は、投与されたｒＡＡＶに応答した、対象における抗体の産生であり得る。
免疫抑制剤
免疫抑制剤は、遺伝子治療の投与後に、対象におけるｒＡＡＶに対する免疫応答の開始前又は後に投与され得る。加えて、免疫抑制剤は、遺伝子治療又はタンパク質補充療法と同時に投与され得る。対象における免疫応答は、対象へのｒＡＡＶの投与に続く、又はそれによって引き起こされる、有害な免疫応答又は炎症反応を含む。免疫応答は、投与されたｒＡＡＶに応答した、対象における抗体の産生であり得る。
【0096】
例示的な免疫抑制剤としては、グルココルチコステロイド、ヤヌスキナーゼ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、細胞分裂阻害剤、例えば、プリン類似体、メトトレキサート、及びシクロホスファミド、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＤＨ）阻害剤、生物製剤、例えば、モノクローナル抗体又は融合タンパク質が挙げられる。
【0097】
免疫抑制剤は、炎症を減少させ、対象の免疫系を抑制又は変調するステロイドである、抗炎症ステロイドであり得る。例示的な抗炎症ステロイドは、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ブデソニド、又はプレドニゾン等のグルココルチコイドである。
【0098】
ヤヌスキナーゼ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素のうちの１つ以上を標的とすることによる、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害剤である。例示的なヤヌスキナーゼ阻害剤としては、トファシチニブ、バリシチニブ、ウパダシチニブ、ペフィシチニブ、及びオクラシチニブが挙げられる。
【0099】
カルシニューリン阻害剤は、シクロフィリンに結合し、カルシニューリンの活性を阻害する。例示的なカルシニューリン阻害剤としては、シクロスポリン、タクロリムス、及びピセクロリムスが挙げられる。
【0100】
ｍＴＯＲ阻害剤は、セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼｍＴＯＲを低減又は阻害する。例示的なｍＴＯＲ阻害剤としては、シロリムス、エベロリムス、及びテムシロリムスが挙げられる。
【0101】
免疫抑制剤は、免疫抑制マクロライドを含む。「免疫抑制マクロライド」という用語は、対象の免疫系を抑制又は調節するマクロライド剤を指す。マクロライドは、クラジノース又はデソアミン等の１つ以上のデオキシ糖が付着した大きな大環状ラクトン環を含む薬剤のクラスである。ラクトン環は通常、１４、１５、又は１６員である。マクロライドは、ポリケチドクラスの薬剤に属し、天然産物であり得る。免疫抑制マクロライドの例としては、タクロリムス、ピメクロリムス、及びシロリムスが挙げられる。
【0102】
プリン類似体は、ヌクレオチド合成を阻止し、ＩＭＤＨ阻害剤を含む。例示的なプリン類似体としては、アザチオプリン、ミコフェノール酸、及びレフノミドが挙げられる。
例示的な免疫抑制生物製剤としては、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキネヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｅｎｕｍａｂ）、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ベラタセプト、及びダクリズマブが挙げられる。
例示的な免疫抑制生物製剤としては、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキネヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｅｎｕｍａｂ）、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ベラタセプト、及びダクリズマブが挙げられる。
【0103】
特に、免疫抑制剤は、抗ＣＤ２０抗体である。抗ＣＤ２０特異的抗体という用語は、ＣＤ２０に特異的に結合するか、又はＣＤ２０の発現若しくは活性を阻害若しくは低減する抗体を指す。例示的な抗ＣＤ２０抗体としては、リツキシマブ、オクレリズマブ、又はオファツムマブが挙げられる。
【0104】
免疫抑制抗体の追加の例としては、バシリキシマブ及びダクリズマブ等の抗ＣＤ２５抗体（又は抗ＩＬ２抗体若しくは抗ＴＡＣ抗体）、並びにムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブ等の抗ＣＤ３抗体、アレムツズマブ等の抗ＣＤ５２抗体が挙げられる。
【0105】
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。記載される数値範囲には、各範囲内の各整数値が含まれ、最小及び最大の記述される整数が含まれる。
【実施例】
【0106】
実施例１
ＴＣＦ４タンパク質レベルは、ミスセンス変異を有する個体内で可変である。
患者の線維芽細胞から神経前駆細胞（ＮＰＣ）への直接変換は、目的の特定の細胞タイプにおける疾患機構の研究を可能にする。このインビトロ細胞モデルを使用して、細胞ストレスの特定の疾患マーカーの存在に基づいて患者応答者を識別することができる。疾患マーカーが存在する場合、この情報を使用して、小分子又は生物製剤等の治療分子の選択から潜在的な治療法を選択し、ＰＴＨＳ表現型に対するそれらの効果を決定することができる。
ＴＣＦ４タンパク質レベルは、ミスセンス変異を有する個体内で可変である。
患者の線維芽細胞から神経前駆細胞（ＮＰＣ）への直接変換は、目的の特定の細胞タイプにおける疾患機構の研究を可能にする。このインビトロ細胞モデルを使用して、細胞ストレスの特定の疾患マーカーの存在に基づいて患者応答者を識別することができる。疾患マーカーが存在する場合、この情報を使用して、小分子又は生物製剤等の治療分子の選択から潜在的な治療法を選択し、ＰＴＨＳ表現型に対するそれらの効果を決定することができる。
【0107】
ＴＣＦ４にヘテロ接合ミスセンス又は欠失変異のいずれかを有する６人のＰＴＨＳ患者由来の線維芽細胞を得て、以下の表３に要約する。レトロウイルス、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭｙｃ、及びＯｃｔ３／４、並びに以前に記載された化学的に定義された媒体を使用して（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８２９－８３２（２０１４））、線維芽細胞を誘導神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）に変換した。その後、ＮＰＣをアストロサイト（ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ）に分化させた。神経前駆細胞を、ＮＰＣ培地（１％ Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ Ｂ２７、１％ Ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（抗生物質－抗真菌剤）、２０ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞成長因子２を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中のフィブロネクチンでコーティングされた皿でコンフルエントになるまで培養した。アストロサイト誘導培地（０．２％ Ｎ２を含有するＤＭＥＭ培地）中の別のフィブロネクチンでコーティングされた皿で少量のＮＰＣを播種することによりｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅを分化させた。これらの誘導アストロサイトは、本明細書においてｉａｓｔｒｏｃｙｔｅ又はｉＡＳＴと称される。ニューロンを、レトロ－Ｎｇｎ２を用いた形質導入によってＮＰＣから変換した。
【0108】
【表4】
【0109】
分化の５日後、誘導アストロサイトを、９６ウェル（１０，０００細胞／ウェル）、３８４ウェル（２，５００細胞／ウェル）、２４ウェルのシーホースプレート（２０，０００細胞／ウェル）、又は９６ウェルのシーホースプレート（１０，０００細胞／ウェル）のいずれかに播種した。分化後の健常細胞及びＴＣＦ４変異体からのｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅの代表的な画像を図２に提供する。
【0110】
これらの患者系統のうちの３つに関する初期研究では、患者の神経前駆細胞及びｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅにおけるＴＣＦ４タンパク質のレベルを調査した。ＴＣＦ４（アイソフォームＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｑ）のウエスタンブロットにより、健康対照と比較してＰＴＨＳ ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅｓ及びＮＰＣの差異レベルが見出された（図３Ａ及びＢ）。重要なことに、ヘテロ接合遺伝子欠失を有する患者は、ＴＣＦ４レベルが５０％低下したのに対し、ミスセンス変異は、タンパク質レベルの変化をもたらさないか、又は有意な上方制御をもたらし、潜在的に毒性の過剰発現が示唆された（図３Ｂ）。
【0111】
加えて、ＴＣＦ４患者からのｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅと共培養したＧＦＰ＋ニューロンは、ニューロン生存率の低下を示す（図４Ａ及びＢ）。ＰＴＨＳ ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅは、ニューロン形態の変化を引き起こした（図４Ｂ）。したがって、この直接変換技術及び共培養アッセイを利用して、新しい疾患機序を特定すると同時に、ＰＴＨＳを有する患者を治療するための潜在的な治療戦略（限定されないが、遺伝子治療を含む）を評価することができる。
【0112】
試験した全ての患者系統のＮＰＣにおけるＭＥＣＰ２レベルの低下を示すウエスタンブロットデータが低減された（図５）。興味深いことに、ＴＣＦ４遺伝子欠失をもたらす変異を有するＰＴＨＳ ｉＡはまた、ｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅの分化にも悪影響を及ぼした（図２）。更に、ＰＴＨＳ患者に由来するｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅの共培養分析は、ニューロンに対する支持性が低く、潜在的な治療アプローチをスクリーニングするためのプラットフォームを提供する（図４Ａ及びＢ）。ＴＣＦ４変異を有するＮＰＣで観察されたＭＥＣＰ２レベルの低下は、ＭＥＣＰ２の修復がＰＴＨＳを治療するための有望なアプローチであることを示唆している。これは、ＴＣＦ４欠失変異を含むＮＰＣをＭＥＣＰ２．ＡＡＶ９で形質導入したときに観察された分化の回復によって更に支持される（図６）。したがって、ＭＥＣＰ２．ＡＡＶ９遺伝子治療は、ＰＴＨＳを治療するために使用され得る。
【0113】
実施例２
ＳｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の構築物
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の組換えウイルスゲノム（配列番号５；図１に示す）は、ヒトＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡの発現を駆動する５４６プロモーター（Ｐ５４６プロモーター）、及び合成ポリアデニル化シグナルを含む。遺伝子カセット（配列番号５のヌクレオチド１５１～２５５８）は、自己相補性ＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする変異体ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する。
ＳｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の構築物
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の組換えウイルスゲノム（配列番号５；図１に示す）は、ヒトＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡの発現を駆動する５４６プロモーター（Ｐ５４６プロモーター）、及び合成ポリアデニル化シグナルを含む。遺伝子カセット（配列番号５のヌクレオチド１５１～２５５８）は、自己相補性ＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする変異体ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する。
【0114】
【表5】
【0115】
自己相補性ＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９）は、２９３細胞において、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）とともに以前に記載された［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）］Ｒｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドを用いて、二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースのベクターを使用する一過性トランスフェクション手順によって産生させた。ウイルスを産生させ、２回の塩化セシウム密度勾配精製ステップによって精製し、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス凝集を防止するために０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ－Ｆ６８を配合し、４℃で保存した。全てのベクター調製物を、Ｔａｑ－Ｍａｎ技術を用いた定量的ＰＣＲにより滴定した。ベクターの純度は、４～１２％のドデシル硫酸ナトリウム－アクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって評価した。
【0116】
ｓｃＡＡＶ９は、２９３細胞において、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）とともに以前に記載された［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．上記参照］Ｒｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドを用いて、二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースのベクターを使用する一過性トランスフェクション手順によって産生させた。実験のためにウイルスを３つの別々のバッチで産生させ、２回の塩化セシウム密度勾配精製ステップによって精製し、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス凝集を防止するために０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ－Ｆ６８を配合し、４℃で保存した。全てのベクター調製物を、Ｔａｑ－Ｍａｎ技術を用いた定量的ＰＣＲにより滴定した。ベクターの純度は、４～１２％のドデシル硫酸ナトリウム－アクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって評価した。
【0117】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２を試験して、ＴＣＦ４欠失変異が神経前駆細胞（ＮＰＣ）からのｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ分化を妨げるかどうかを決定した。健常なＮＰＣは、ネスチン（前駆細胞マーカー、緑色）の減少及びＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー、紫色）染色の増加によって示されるように、誘導アストロサイト（ｉＡ）に効率的に分化する。ＴＣＦ４欠失（未処理）は、ネスチンの増加及びＧＦＡＰ染色の減少によって示されるように、分化効率の低下をもたらす。図２に示すように、分化の２日前に、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２（１０及び１００ＭＯＩ）を用いたインビトロでＴＣＦ４ノックアウト患者ＮＰＣを形質導入することにより、ｉＡの分化が回復した。データは、ＭＥＣＰ２の発現レベルを上昇させることにより、ＮＰＣからのｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅの分化が改善されることを示している。
【0118】
このｓｃＡＡＶはまた、国際出願公開第ＷＯ２０１８／０９４２５１号及び米国特許出願第２０２０／１７９４６７号に記載されており、どちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の研究は、これらの出願に開示され、野生型マウス及び非ヒト霊長類におけるｓｃＡＡＶ９発現に関するデータを提供する。
【0119】
実施例３
野生型マウス及び非ヒト霊長類におけるデータ
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２による野生型マウスの処理は、安全であり、良好な忍容性を示す
ＭＥＣＰ２補充療法に関する重要な懸案事項は、ＭＥＣＰ２の無傷なコピーを発現する細胞への影響を評価することである。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．Ｍｅｃｐ２は、ＭＥＣＰ２導入遺伝子の生理学的調節を支持するためにマウスＭｅｃｐ２プロモーターの断片を組み込むことによって、このことを考慮して設計された。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の安全性を試験するために、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２をＰ１にＩＣＶ注射した野生型マウスのコホートで生存及び行動分析を行った。
野生型マウス及び非ヒト霊長類におけるデータ
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２による野生型マウスの処理は、安全であり、良好な忍容性を示す
ＭＥＣＰ２補充療法に関する重要な懸案事項は、ＭＥＣＰ２の無傷なコピーを発現する細胞への影響を評価することである。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．Ｍｅｃｐ２は、ＭＥＣＰ２導入遺伝子の生理学的調節を支持するためにマウスＭｅｃｐ２プロモーターの断片を組み込むことによって、このことを考慮して設計された。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の安全性を試験するために、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２をＰ１にＩＣＶ注射した野生型マウスのコホートで生存及び行動分析を行った。
【0120】
合計１３１匹の野生型雄マウスを、様々なＩＣＶ用量のＡＶＸＳ－２０１で処理し、生存について追跡した（図７Ａ）。標的とする治療用量（１．４４×１０１０ｖｇ）での死亡は記録されず、２１匹の処理動物がＰ３４２まで生存した。ＰＢＳ処理群では死亡は記録されず、３．５０×１０９、２．７８×１０１０及び１．１３ｘ１０１１ｖｇ処理群で、それぞれ１件の死亡が記録された。ボックス１からの基準を使用した行動スコアリングは、主に平均表現型スコア１を有していたベクター処理群が、２つの最高用量群（５．５６×１０１０及び１．１３ｘ１０１１ｖｇ、図７Ｂ）にのみ見られたことを示す。２～３ヶ月齢でのオープンフィールド試験は、ベクターで処理した野生型雄とＰＢＳで処理した野生型雄との間に統計的差異を示さなかった（図８Ａ～Ｂ）。興味深いことに、３ヶ月齢の対照処理野生型マウスと比較して、１３ｘ１０１１ｖｇコホートにおいて、ロータロッド試験の成績に有意な低下が検出された（図８Ｃ）。これらの組み合わされたデータは、最大ＡＶＸＳ－２０１用量でのＭＥＣＰ２の過剰発現の毒性効果を示唆する。これらのデータを総合すると、野生型細胞に形質導入するのみのｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２処理の「最悪のシナリオ」において、標的とする治療用量での動物の生存及び行動への影響は最小限であることが示唆される。
【0121】
ＭＥＣＰ２の生理学的レベルは、治療用量のｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２で処理した野生型マウスの脳内で維持される
症候性ＭＥＣＰ２の過剰発現に関連するレベルを更に調査するために、野生型雄マウスに１．４４ｘ１０１０ｖｇの治療標的又は１．１３ｘ１０１１ｖｇの最大試験用量で、ＰＢＳ又はｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２をＰ１にＩＣＶ注射した。注射後３週間で動物を安楽死させ、ウエスタンブロットのために脳を採取した。比較のために、Ｔｇ３と称されるＭＥＣＰ２過剰発現のマウスモデルからの脳とともに組織をブロットした。脳を別々の領域（Ｃｂ＝小脳、Ｍｅｄ＝髄質、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｔｘ＝皮質及びＭｉｄ＝中脳；図９）に切断し、個々の領域をブロッティングのために均質化した。データを、ＰＢＳで処理した野生型脳のＭＥＣＰ２レベルに対して正規化した。標的治療用量（１．４４ｘ１０１０ｖｇ）での処理は、調べた全ての領域にわたって１～１．５倍の野生型組織のＭＥＣＰ２レベルを有していた。高用量（１．１３ｘ１０１１ｖｇ）は、野生型レベルの１．３１～２．５６倍の範囲であったが、Ｔｇ３組織の２．３１～３．９３倍のレベルには達しなかった（図９Ｂ）。これらのデータは、先に示された行動及び生存データとともに、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２が、標的用量で投与された場合、ほぼ生理学的レベルでタンパク質を発現するという確信を与える。重要なことに、治療用投与量は、ＭＥＣＰ２重複症候群に関連する２倍のタンパク質レベルに近づかない。これは、遺伝子治療を使用したＭＥＣＰ２補充アプローチの安全性を示す。
症候性ＭＥＣＰ２の過剰発現に関連するレベルを更に調査するために、野生型雄マウスに１．４４ｘ１０１０ｖｇの治療標的又は１．１３ｘ１０１１ｖｇの最大試験用量で、ＰＢＳ又はｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２をＰ１にＩＣＶ注射した。注射後３週間で動物を安楽死させ、ウエスタンブロットのために脳を採取した。比較のために、Ｔｇ３と称されるＭＥＣＰ２過剰発現のマウスモデルからの脳とともに組織をブロットした。脳を別々の領域（Ｃｂ＝小脳、Ｍｅｄ＝髄質、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｔｘ＝皮質及びＭｉｄ＝中脳；図９）に切断し、個々の領域をブロッティングのために均質化した。データを、ＰＢＳで処理した野生型脳のＭＥＣＰ２レベルに対して正規化した。標的治療用量（１．４４ｘ１０１０ｖｇ）での処理は、調べた全ての領域にわたって１～１．５倍の野生型組織のＭＥＣＰ２レベルを有していた。高用量（１．１３ｘ１０１１ｖｇ）は、野生型レベルの１．３１～２．５６倍の範囲であったが、Ｔｇ３組織の２．３１～３．９３倍のレベルには達しなかった（図９Ｂ）。これらのデータは、先に示された行動及び生存データとともに、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２が、標的用量で投与された場合、ほぼ生理学的レベルでタンパク質を発現するという確信を与える。重要なことに、治療用投与量は、ＭＥＣＰ２重複症候群に関連する２倍のタンパク質レベルに近づかない。これは、遺伝子治療を使用したＭＥＣＰ２補充アプローチの安全性を示す。
【0122】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の髄腔内注射後１８ヶ月にわたって、非ヒト霊長類の体重、血液学、及び血清化学は注目すべきものではない
ＳｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ及び関連する髄腔内注射手順の安全性及び忍容性を調査するために、３匹の処理した雄カニクイザルを注射後１８ヶ月間追跡した。投薬パラメータを表５に示す。
ＳｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ及び関連する髄腔内注射手順の安全性及び忍容性を調査するために、３匹の処理した雄カニクイザルを注射後１８ヶ月間追跡した。投薬パラメータを表５に示す。
【0123】
【表6】
【0124】
２匹の動物を意図した治療用量（体重１ｋｇ当たり約１．４４×１０９ｖｇ相当）で処理し、１匹の動物に約２倍低い用量（体重１ｋｇ当たり約７．００×１０８ｖｇ相当）を投与した。髄腔内注射手順は、以前にＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２３：４７７－４８７（２０１５）に記載されている。簡潔に述べると、ベクターの拡散を検証するために、ベクターを造影剤と混合した。麻酔した対象を側臥位にし、約Ｌ４／５レベル（脊髄円錐の下）の後正中線注射部位を調製した。無菌条件下で、スタイレット付きの脊髄針を挿入し、針からの透明なＣＳＦの流れにより、くも膜下カニューレ挿入を確認した。くも膜下腔内の圧力を低下させるために０．８ｍｌのＣＳＦを排出し、直後にベクター溶液を注射した。注射後、動物をトレンデレンブルグ体位に維持し、その体を１０分間、頭が低くなるようにして傾けた。処理した動物に６ヶ月齢又は１２ヶ月齢で投与し、体重、血球数及び血清化学を、注射後最初の６ヶ月間は毎月、その後は２ヶ月毎に収集した。体重を図１０に示し、血球数を図１１に示し、血清化学を図１２及び１３に示し、Ｍａｎｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｈｏｍｅｓｔｅａｄ，ＦＬ）の同じコロニーからの対照処理動物の値とともにグラフ化した。全体として、ベクター処理動物からの体重、細胞数及び血清値は、対照処理動物と一致していた。ベースライン時に２匹のベクター処理動物においてより高かったアミラーゼを除き、所与の動物における２回を超える連続した観察で対照から実質的に逸脱した値はなかった。これらのデータは、ＡＶＸＳ－２０１及び髄腔内注射手順が安全であり、忍容性が良好であることを示している。
【0125】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の髄腔内注射後の非ヒト霊長類由来の組織の組織病理学的解析
動物１５Ｃ３８、１５Ｃ４９及び１５Ｃ３４（上述）からの内臓及び神経系組織の試料を、パラフィン包埋、切片化、並びにヘマトキシリン及びエオシン染色のためにＧＥＭｐａｔｈ Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ）に送った。ＧＥＭｐａｔｈ Ｂｏａｒｄ認定の獣医病理学者によって、スライドが読み取られ、報告書が作成された。サンプリングして調べた組織を表６に示す。病理学的報告は、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２処理が、６週間又は１８ヶ月の時点で任意のプロトコル指定の組織において病変を誘発しなかったことに言及している。
動物１５Ｃ３８、１５Ｃ４９及び１５Ｃ３４（上述）からの内臓及び神経系組織の試料を、パラフィン包埋、切片化、並びにヘマトキシリン及びエオシン染色のためにＧＥＭｐａｔｈ Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ）に送った。ＧＥＭｐａｔｈ Ｂｏａｒｄ認定の獣医病理学者によって、スライドが読み取られ、報告書が作成された。サンプリングして調べた組織を表６に示す。病理学的報告は、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２処理が、６週間又は１８ヶ月の時点で任意のプロトコル指定の組織において病変を誘発しなかったことに言及している。
【0126】
【表7】
【0127】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の髄腔内注射後の非ヒト霊長類脳におけるＭＥＣＰ２の生理学的レベル
２匹の１２ヶ月齢の雄カニクイザルに、上述のように７．７×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＶＸＳ－２０１を髄腔内注射した。動物は、注射後６週間生存させ、ＭＥＣＰ２発現の分析のために安楽死させた。選択された脳領域を、免疫組織化学によって総ＭＥＣＰ２発現について分析した（皮質領域及び皮質下領域でＭＥＣＰ２の明らかな上昇は検出されなかった、図１４）。注射部位の近位でも検出されなかった（腰髄、図１４）。重要なことに、これらのデータはまた、注射した動物由来の組織においていずれの肉眼的な異常も示さない。導入遺伝子の発現を更に調べるために、脳領域を均質化し、同じコロニーからの動物由来の過去の対照組織と比較した（図１５）。後頭皮質及び側頭皮質、視床下部、腰髄、視床、扁桃体、海馬及び小脳の試料を、総ＭＥＣＰ２発現についてウエスタンブロットで分析した。調べた領域の全てにわたって、対照の２倍以上のＭＥＣＰ２発現レベルを示した領域はなかったＭＥＣＰ２の上昇は、それぞれ第三脳室及び外側脳室に近接する領域である視床下部及び扁桃体で検出されたが、小脳では検出されなかった。更に、注射部位の近位にある腰髄脊髄は、ＭＥＣＰ２レベルの上昇を示さなかった（図１５）。これらのデータは、ウイルス用量と発現構築物との組み合わせが、ＭＥＣＰ２発現を調節していることを示唆している。更に、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行って、ベクター由来転写産物を検出し、注射後６週間及び１８ヶ月に脳内の分布を決定した（図１６及び１７）。脳及び脊髄の調べた全ての領域（後頭皮質、側頭皮質、海馬、脳梁、視床、尾状核、被殻、上丘、脳橋、髄質、小脳、頸髄、胸髄及び腰髄）は、対照処理動物由来の組織には存在しなかったベクター由来転写産物の発現を示した。これらのデータは、ベクター由来ＭＥＣＰ２転写産物に対するＩＳＨプローブの特異性を示し、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２プロモーター構築物がＮＨＰ神経系組織において機能することを示す。これらのデータは、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２が腰椎穿刺によって投与される場合、ＣＮＳ全体に広く分布し、生理学的レベルで発現することを示す。
２匹の１２ヶ月齢の雄カニクイザルに、上述のように７．７×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＶＸＳ－２０１を髄腔内注射した。動物は、注射後６週間生存させ、ＭＥＣＰ２発現の分析のために安楽死させた。選択された脳領域を、免疫組織化学によって総ＭＥＣＰ２発現について分析した（皮質領域及び皮質下領域でＭＥＣＰ２の明らかな上昇は検出されなかった、図１４）。注射部位の近位でも検出されなかった（腰髄、図１４）。重要なことに、これらのデータはまた、注射した動物由来の組織においていずれの肉眼的な異常も示さない。導入遺伝子の発現を更に調べるために、脳領域を均質化し、同じコロニーからの動物由来の過去の対照組織と比較した（図１５）。後頭皮質及び側頭皮質、視床下部、腰髄、視床、扁桃体、海馬及び小脳の試料を、総ＭＥＣＰ２発現についてウエスタンブロットで分析した。調べた領域の全てにわたって、対照の２倍以上のＭＥＣＰ２発現レベルを示した領域はなかったＭＥＣＰ２の上昇は、それぞれ第三脳室及び外側脳室に近接する領域である視床下部及び扁桃体で検出されたが、小脳では検出されなかった。更に、注射部位の近位にある腰髄脊髄は、ＭＥＣＰ２レベルの上昇を示さなかった（図１５）。これらのデータは、ウイルス用量と発現構築物との組み合わせが、ＭＥＣＰ２発現を調節していることを示唆している。更に、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行って、ベクター由来転写産物を検出し、注射後６週間及び１８ヶ月に脳内の分布を決定した（図１６及び１７）。脳及び脊髄の調べた全ての領域（後頭皮質、側頭皮質、海馬、脳梁、視床、尾状核、被殻、上丘、脳橋、髄質、小脳、頸髄、胸髄及び腰髄）は、対照処理動物由来の組織には存在しなかったベクター由来転写産物の発現を示した。これらのデータは、ベクター由来ＭＥＣＰ２転写産物に対するＩＳＨプローブの特異性を示し、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２プロモーター構築物がＮＨＰ神経系組織において機能することを示す。これらのデータは、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２が腰椎穿刺によって投与される場合、ＣＮＳ全体に広く分布し、生理学的レベルで発現することを示す。
【0128】
実施例４
ＴＣＦ＋／－マウスにおける行動分析
野生型及びＴＣＦ＋／－マウスにおけるＭｅＣＰ２の発現及び行動への影響を調べた。野生型及びＴＣＦ＋／－マウスの生後３６時間以内（生後２日目（Ｐ２））に、ＩＣＶ注射によってｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰ又はｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の動物１匹当たり１．５ｅ１０ウイルスゲノム（ｖｇ）を投与した。ＡＡＶをＰＢＳで希釈し、注射当たり５μＬの総注射量を達成した。
ＴＣＦ＋／－マウスにおける行動分析
野生型及びＴＣＦ＋／－マウスにおけるＭｅＣＰ２の発現及び行動への影響を調べた。野生型及びＴＣＦ＋／－マウスの生後３６時間以内（生後２日目（Ｐ２））に、ＩＣＶ注射によってｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰ又はｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の動物１匹当たり１．５ｅ１０ウイルスゲノム（ｖｇ）を投与した。ＡＡＶをＰＢＳで希釈し、注射当たり５μＬの総注射量を達成した。
【0129】
動物をチャンバ内で１分間、イソフルランで麻酔した。最後に、動物を斬首し、脳を取り出して、４％ＰＦＡ／０．１Ｍ ＰＢＳに入れた。極低温ミクロトーンを使用して脳を切断し、蛍光顕微鏡下でスライスを観察した。図２０に示すように、ＧＦＰは、処理したマウスの皮質及び海馬で発現した。加えて、注射後の野生型及びＴＣＦ＋／－マウスの脳においてＭｅＣＰ２タンパク質が発現した（図２１参照）。この研究は、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２の注射が脳内でＭｅＣＰ２タンパク質の強い過剰発現を引き起こさないことを示した。
【0130】
共焦点顕微鏡法を用いて、海馬、皮質（前部及び後部）及び視床におけるＭｅＣＰ２タンパク質発現の核強度を調べた。図２２～２４に示すように、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２のＩＣＶ注射は、野生型マウスで観察されたものと同様の、ＴＣＦ＋／－マウスの皮質及び海馬におけるＭｅＣＰ２核強度をもたらした。
【0131】
Ｐ６０に、処理したマウスの行動を分析した。ビー玉埋め実験は、Ａｎｇｏａ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．８２：５０９７８、２０１３に記載されるように行った。図２５及び以下の表に示されるように、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２のＩＣＶ注射は、ビー玉埋め実験の成績を向上させた。
【0132】
【表8】
【0133】
加えて、Ｋｒａｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９１６：９９－１０３，２０１９に記載されるように、オープンフィールド試験を行った。同様に、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２のＩＣＶ注射は、ＴＣＦ＋／－マウスにおけるオープンフィールド試験でも成績の向上をもたらした（図２６）。
【0134】
【表9】
【0135】
加えて、Ｋｏｍａｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２２（２２）：１０８８，２００８に記載されるように高架式十字迷路分析を行い、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２のＩＣＶ注射が、ＴＣＦ＋／－マウスにおいて成績向上をもたらした（図２７）。
【0136】
【表10】
【0137】
実施例５
ヒトにおける予言的実施例
ヒトにおいてこの構築物の可能性を治療的に試験するために、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２を患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に送達する。ＣＳＦ送達のために、ウイルスベクターを造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ又は同様のもの）と混合する。例えば、組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性低浸透圧造影剤を含み得る。患者は、腰椎ＣＳＦ注射の直後に、頭を下向きに１５～３０度の角度で傾けたトレンデレンブルグ体位で５、１０、又は１５分間保持される。ＣＳＦ用量は、年齢群に基づいて、患者当たり１ｅ１３ウイルスゲノム（ｖｇ）～１ｅ１５ｖｇ／患者の範囲であろう。開発された新しい注入ツールを使用した新たなＣＳＦ送達技術も使用することができる。静脈内送達用量は、１ｅ１３ｖｇ／キログラム（ｋｇ）体重～２ｅ１４ｖｇ／ｋの範囲であろう。
ヒトにおける予言的実施例
ヒトにおいてこの構築物の可能性を治療的に試験するために、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２を患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に送達する。ＣＳＦ送達のために、ウイルスベクターを造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ又は同様のもの）と混合する。例えば、組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性低浸透圧造影剤を含み得る。患者は、腰椎ＣＳＦ注射の直後に、頭を下向きに１５～３０度の角度で傾けたトレンデレンブルグ体位で５、１０、又は１５分間保持される。ＣＳＦ用量は、年齢群に基づいて、患者当たり１ｅ１３ウイルスゲノム（ｖｇ）～１ｅ１５ｖｇ／患者の範囲であろう。開発された新しい注入ツールを使用した新たなＣＳＦ送達技術も使用することができる。静脈内送達用量は、１ｅ１３ｖｇ／キログラム（ｋｇ）体重～２ｅ１４ｖｇ／ｋの範囲であろう。
【0138】
本発明を様々な実施形態及び実施例に関して説明してきたが、当業者は変更及び改善を相当することを理解されたい。したがって、特許請求の範囲に見られるようなそのような制限のみが、本発明に課されるべきである。
【0139】
本明細書で参照される全ての文書は、参照によりその全体が組み込まれる。
配列
Ｐ５４６プロモーター配列（配列番号２）
ＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＧＡＣＴＴＣＣＴＴＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＴＴＡＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＴＡＧＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＧＴＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＣＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＧＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＣＣＣＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＣＧＴＣＣＧＧＡＡＡＡＣ
コード領域配列（ヒトＭＥＣＰ２ ｃｄｓ）（配列番号３）
ＡＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＴＧＣＧＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＣＧＧＴＡＡＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＴＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＴＣＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＡＡＣＧＣＣＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＴＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＣＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＴＴＡＧＣＴＧＡ
ポリＡ配列（合成）（配列番号４）
ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２（配列番号５）
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５’ＩＴＲ（配列番号６）
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ＳＶ４０イントロン（配列番号７）
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３’ＩＴＲ（配列番号８）
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配列
Ｐ５４６プロモーター配列（配列番号２）
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コード領域配列（ヒトＭＥＣＰ２ ｃｄｓ）（配列番号３）
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ポリＡ配列（合成）（配列番号４）
ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＭＥＣＰ２（配列番号５）
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５’ＩＴＲ（配列番号６）
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ＳＶ４０イントロン（配列番号７）
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３’ＩＴＲ（配列番号８）
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】