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特表2024-515629ニューロフィブロミン２／マーリン（ＮＦ２）遺伝子療法のための材料及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】ニューロフィブロミン２／マーリン（ＮＦ２）遺伝子療法のための材料及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20240403BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20240403BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240403BHJP
A61P 27/12 20060101ALI20240403BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240403BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240403BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240403BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00 ZNA
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P25/00
A61P27/16
A61P27/02
A61P27/12
A61P25/08
A61K35/76
C12N15/12
C12N15/864 100Z
A61K38/17
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562895
(86)(22)【出願日】2022-04-13
(85)【翻訳文提出日】2023-10-30
(86)【国際出願番号】 US2022024680
(87)【国際公開番号】W WO2022221447
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】63/174,803
(32)【優先日】2021-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515289842
【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ロン－シェン
(72)【発明者】
【氏名】フラニガン， ケビン
(72)【発明者】
【氏名】リキッテ， シビ
(72)【発明者】
【氏名】メイヤー， キャスリン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084BA44
4C084CA18
4C084DC50
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA061
4C084ZA062
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA341
4C084ZA342
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA09
4C087CA12
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA06
4C087ZA33
4C087ZA34
4C087ZB21
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、例えば、神経線維腫症２型（ＮＦ２）におけるような欠陥ニューロフィブロミン２／マーリン（ＮＦ２）遺伝子に起因する、マーリンタンパク質の必要性に関連する状態を治療する方法に関する。具体的には、本開示は、マーリンタンパク質の発現の喪失又はマーリンタンパク質レベルの低減を特異的に治療する遺伝子療法ベクターを提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする導入遺伝子を、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性を必要とする対象に送達する方法であって、前記方法が、前記導入遺伝子を含む遺伝子療法ベクターを、静脈内送達、腫瘍内送達、又は髄腔内送達によって前記対象に投与することを含み、
前記導入遺伝子が、腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含むか、又は前記導入遺伝子が、腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項2】
前記導入遺伝子を、少なくとも１つの欠陥ＮＦ２対立遺伝子を有する対象に送達することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記導入遺伝子が、前記対象のシュワン細胞若しくは髄膜細胞、又は両方に送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記投与が、前記対象における悪性膠芽腫を治療する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記投与が、前記対象における神経線維腫症２型を治療する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項6】
前記投与が、前記対象における腫瘍、難聴、耳鳴症、平衡障害、顔面の脱力又は痺れ、視覚障害、白内障、発作、及び脳幹圧迫のうちの１つ以上を緩和する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記腫瘍が、シュワン腫、髄膜腫、上衣腫、又は他の脳神経腫瘍のうちの１つ以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記遺伝子療法ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴ、Ａｎｃ８０、若しくはＡＡＶ７ｍ８血清型ベクター、又はその誘導体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与され、前記方法が、前記遺伝子療法ベクターの投与後に前記対象をトレンデレンブルグ体位に置くことを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記遺伝子療法ベクターが、腫瘍内送達によって投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記遺伝子療法ベクターが、静脈内送達によって投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与され、前記方法が、前記遺伝子療法ベクターの投与後に前記対象をトレンデレンブルグ体位に置くことを更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、導入遺伝子。
【請求項16】
腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、導入遺伝子。
【請求項17】
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項18】
腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項19】
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴ、Ａｎｃ８０、若しくはＡＡＶ７ｍ８血清型ベクター、又はその誘導体である、請求項１７又は１８に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項20】
ＡＡＶ９である、請求項２０に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，８０３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、例えば、神経線維腫症２型（ＮＦ２）におけるような欠陥ニューロフィブロミン２／マーリン（ＮＦ２）遺伝子に起因する、マーリンタンパク質の必要性に関連する状態を治療する方法に関する。具体的には、本開示は、マーリンタンパク質の発現の喪失又はマーリンタンパク質レベルの低減を特異的に治療する遺伝子療法ベクターを提供する。
【0003】
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５４４４６＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、７９，８４２バイト、２０２２年４月１３日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５４４４６＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、７９，８４２バイト、２０２２年４月１３日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
神経線維腫症２型（ＮＦ２）は、ＮＦ２遺伝子の喪失に起因する、世界中で４０，０００人に１人が罹患している自己優性遺伝子障害である。ＮＦ２遺伝子は、「マーリン」と呼ばれるモエシン、エズリン、及びラジキシン様タンパク質をコードする。マーリンは、神経系の組織における腫瘍サプレッサーとして機能する。マーリンは、細胞増殖の接触依存的阻害において機能する。ＮＦ２患者は、全身にわたって１つの対立遺伝子に機能喪失変異を有し、患者における腫瘍形成は、残りのＮＦ２対立遺伝子におけるヘテロ接合性の喪失に関連する。この喪失は、多くの場合、セカンドヒット変異に起因するが、発現の喪失又はＮＦ２腫瘍サプレッサータンパク質レベルの低減は、ＮＦ２遺伝子における変異がない場合、エピジェネティック又は翻訳後修飾によっても引き起こされ得る。
【0005】
ＮＦ２は、多発性髄膜腫、脊髄神経鞘腫、及び上衣腫などの他の頭蓋内、脊髄内、及び末梢腫瘍とともに、両側前庭神経鞘腫を特徴とする重度の衰弱状態である。これは、罹患率の増加及び平均余命の短縮をもたらす。症状は、幼児期に現れ、時間の経過とともに悪化する可能性がある。腫瘍を除いて、ＮＦ２は、難聴、耳鳴症（耳鳴り）、平衡障害、顔面神経麻痺及び他の脳神経機能不全、白内障、発作、並びに脳幹圧迫を含む著しい病態を引き起こす。
【0006】
ＮＦ２の治療法はなく、現在の「ゴールドスタンダード」治療の選択肢としては、手術及び放射線療法が挙げられる。腫瘍の外科的除去は、しばしば神経損傷を引き起こし、聴覚及び視覚障害、並びに顔面神経麻痺をもたらす。放射線療法は、侵襲性の低い選択肢であるが、更なる組織タイプにおいて、その後の悪性形質転換及び二次悪性腫瘍の著しい増加をもたらすと考えられる。更に、腫瘍形成への遺伝的寄与が強調されているため、成功した治療は、腫瘍の再成長及び他の罹患細胞から発生する新しい腫瘍のために短命である。したがって、合併症、副作用、腫瘍制御の非効率性、及び関連する神経学的能力の喪失により、これらの治療は不十分になる。疾患状態の進行を実際に止めることができる療法を伴わない腫瘍治療を繰り返すことによる多大な感情的及び財政的コストは、この患者集団の緊急の必要性を強調している。
【0007】
ＮＦ２関連腫瘍に加えて、前庭神経鞘腫及び髄膜腫は、一般集団において散発的に生じ得る。全てではないにしても、ほとんどの前庭神経鞘腫は、不活性化ＮＦ２変異を有する。また、散発性髄膜腫の約半数がＮＦ２喪失を有する。
【0008】
したがって、ＮＦ２関連及び散発性の前庭神経鞘腫及び髄膜腫の両方、並びにマーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性が必要とされるがんを含む他の状態の治療が、当該技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本開示は、機能性マーリンタンパク質（本明細書では「ＮＦ２タンパク質」と称されることもある）を発現する遺伝子療法ベクターを提供する。遺伝子療法ベクターは、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性（すなわち、インビボ又はインビトロでの腫瘍の成長又は新しい腫瘍の形成を減少させる活性）を必要とする対象に、マーリンタンパク質をコードする導入遺伝子を送達するのに有用である。
【0010】
提供される方法は、マーリンタンパク質レベルの低減を伴う状態を治療する。そのような状態には、ＮＦ２、並びにＮＦ２遺伝子の病理学的変異に起因しない、マーリンタンパク質レベルの低減を伴うがんも含まれるが、これらに限定されない。また、そのような状態には、ＮＦ２の転写又は翻訳後調節に起因するマーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性の低減も含まれるが、これらに限定されない。
【0011】
本開示は、腫瘍への直接注射、静脈内送達、髄腔内送達などの全身送達経路、又はベクターを腫瘍若しくは脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法によって、遺伝子療法ベクターを投与することを含む、治療の方法を提供する。治療は、既存の腫瘍の成長を停止し、既存の腫瘍を縮小させ、かつ／又は新しい腫瘍の形成を低減若しくは防止する。
【0012】
遺伝子療法ベクターは、対象におけるマーリンタンパク質レベルが低減した細胞に導入遺伝子を送達するのに有用である。細胞としては、シュワン細胞及び髄膜細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞としては、腫瘍細胞、例えば、シュワン腫、髄膜腫、及び膠芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【0013】
遺伝子療法ベクターは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴ、又はＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、及びそれらの誘導体である。遺伝子療法ベクターは、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ１０である。遺伝子療法ベクターは、例えば、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ１０である。遺伝子療法ベクターは、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ６である。
【0014】
遺伝子療法ベクター内の導入遺伝子は、例えば、２．３ｋｂのＮＦ２プロモーター又は縮小サイズのＮＦ２プロモーター、ＣＢプロモーター、Ｐ５４６プロモーター、ＭＢＰプロモーター、又は腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質の発現を駆動するＣＭＶプロモーターを含む。
【0015】
遺伝子療法ベクターは、例えば、本明細書でＮＦ２アイソフォームＩと称される、エクソン１６を欠くＮＦ２／マーリンアイソフォームｃＤＮＡを含む。ＮＦ２アイソフォームＩによってコードされるマーリンタンパク質は、腫瘍サプレッサー活性を有する。
【0016】
遺伝子療法ベクターは、別の例として、マーリンタンパク質が腫瘍サプレッサー活性を保持している間に、マーリンタンパク質のリン酸化部位を破壊する変異を有するマーリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【0017】
例示的な遺伝子療法ベクターは、配列において、ＡＡＶ２内部反復（ＩＴＲ）、ＮＦ２プロモーター、ＳＶ４０イントロン、腫瘍サプレッサー活性を有するタンパク質をコードするＮＦ２ポリヌクレオチド、合成ポリＡシグナル、及び第２のＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。
【0018】
遺伝子療法ベクターは、それを必要とする対象に、例えば、髄腔内送達を使用して投与され、対象は、遺伝子療法ベクターの投与後にトレンデレンブルグ体位に置かれる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
この特許又は出願ファイルには、少なくとも１つのカラーで作成された図面が含まれている。このカラー図面を含む特許又は特許出願公開のコピーは、請求により、必要な費用の支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供される。
【0020】
【図1】ＮＦ２遺伝子療法のための例示的な構築物設計の概略図を提供する。
【図2】哺乳動物細胞におけるＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＧＦＰ発現を示す。
【図3】哺乳動物細胞におけるＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＮＦ２発現を示す。
【図4】インビボでのＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＧＦＰ発現を示す。
【図5】前庭核におけるＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＧＦＰ発現を示す。
【図6】坐骨神経におけるＮＦ２プロモーター依存性ＧＦＰ発現を示す。
【図7】坐骨神経におけるＮＦ２プロモーター依存性ＧＦＰ発現を示す。
【図8】坐骨神経におけるプロモーター依存性ＧＦＰ発現を示す。
【図9】坐骨神経におけるプロモーター依存性ＧＦＰ発現を示す。
【図10】インビボでのＮＦ２のＮＦ２プロモーター依存性の差次的発現を示す。
【図11】インビボでのＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＮＦ２発現を示す。
【図12】インビボでのＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＮＦ２発現を示す。
【図13】インビボでのＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＮＦ２発現を示す。
【図14】哺乳動物細胞におけるＮＦ２プロモーター依存性の差次的なＮＦ２ Ｓ５１８Ａ発現を示す。
【図15】リプログラミングされた誘導シュワン細胞（ｉＳＣ）が、リプログラミングの９（Ａ）日後及び２４（Ｂ）日後にシュワン細胞マーカー（Ｓ１００及びＫｒｏｘ２０）を発現することを示す。線維芽細胞表面マーカー（ＦＳＭ）は、両方の条件において存在しない。
【図16】患者の皮膚由来線維芽細胞の、インビトロでＮＦ２疾患をモデル化するための誘導シュワン細胞（ｉＳＣ）への直接変換を示す。
【図17】患者由来ヒトｉＳＣにおけるＮＦ２発現の低減を示す。
【図18】患者由来ヒトｉＳＣにおけるＮＦ２発現の低減を示す。
【図19】患者由来ヒトｉＳＣにおけるＮＦ２発現の低減を示す。
【図20】患者由来ヒトｉＳＣにおけるＰｈｏｓｐｈ－ＮＦ２Ｓ５１８発現の増加を示す。
【図21】ＮＦ２患者ｉＳＣにおけるシュワンＫＲＯＸ２０及びＭＢＰ細胞成熟マーカー発現の低減を示す。
【図22】ＮＦ２患者由来ｉＳＣにおけるｃ－Ｍｙｃ幹細胞マーカー発現の増加を示す。
【図23】ＮＦ２患者由来ｉＳＣにおけるＳＯＸ２幹細胞マーカー発現の増加を示す。
【図24】ＡＡＶ９．ＮＦ２．ＧＦＰベクターを有する健常な対照ｉＳＣの成功した形質導入を示す。
【図25】ＡＡＶ９．ＮＦ２．ＧＦＰベクターを有するＮＦ２患者由来ｉＳＣの成功した形質導入を示す。
【図26】ＮＦ２患者ｉＳＣにおけるＡＡＶ９．ＮＦ２処理によるｃ－Ｍｙｃ幹細胞マーカー発現の低下を示す。
【図27】ＮＦ２患者ｉＳＣにおけるＡＡＶ．ＮＦ２処理によるＳＯＸ２幹細胞マーカー発現の低下を示す。
【図28】ｓｈＮＦ２で直接ヒットした、選別されたｉＳＣは、ＮＦ２レベルが低減していることを示す。
【図29】原発性ヒト前庭神経鞘腫（ｈＶＳ）腫瘍細胞におけるＮＦ２発現の低減を示す。
【図30】ｈＶＳ腫瘍細胞におけるホスホ－ＮＦ２ Ｓ５１８発現の増加を示す。
【図31】ｈＶＳ腫瘍細胞が成熟シュワン細胞からより遠いことを示す。
【図32】単一対立遺伝子変異型ＮＦ２患者ｉＳＣ及びＮＦ２二重ノックダウン患者ｉＳＣにおける高い増殖率を示す。
【図33】ｈＶＳ腫瘍細胞におけるｃ－Ｍｙｃ及びＳＯＸ２幹細胞マーカー発現の増加を示す。
【図34】ｈＶＳ細胞におけるＡＡＶ．ＮＦ２処理によるｃ－Ｍｙｃ幹細胞マーカー発現の低下を示す。
【図35】ｈＶＳ細胞におけるＡＡＶ．ＮＦ２処理によるＳＯＸ２幹細胞マーカー発現の低下を示す。
【図36】膠芽腫におけるＮＦ２タンパク質発現の低減を示す。
【図37】膠芽腫におけるＮＦ２ ｍＲＮＡの発現の低減を示す。
【図38】ＡＡＶ９．ＮＦ２処理が、膠芽腫におけるＮＦ２タンパク質発現を回復させることを示す。
【図39】ＡＡＶ９．ＮＦ２処理が、膠芽腫におけるＮＦ２ ｍＲＮＡ発現を回復させることを示す。
【図40】リン酸化抵抗性ＡＡＶ９．ＮＦ２処理が、膠芽腫におけるＮＦ２タンパク質をより良好に回復させることを示す。
【図41】リン酸化抵抗性ＡＡＶ９．ＮＦ２処理が、膠芽腫におけるＮＦ２ ｍＲＮＡ発現を回復させることを示す。
【図42】ＡＡＶ９．ＮＦ２処理が、膠芽腫における細胞増殖を低減することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
遺伝子療法ベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠陥パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂ長であり、２つの１４５ヌクレオチドの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含み、ウイルス自体又はその誘導体を指すために使用される場合がある。この用語は、他に特定されない限り、全てのサブタイプ、並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶの血清型は、各々特定のクレードと関連しており、そのメンバーは、血清学的及び機能的類似性を共有している。したがって、ＡＡＶはまた、クレードによって称される場合がある。例えば、ＡＡＶ９配列は、「クレードＦ」配列と称される（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）。本開示は、特定のクレード、例えばクレードＦ内の任意の配列の使用を企図する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されている。ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されている。ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されている。ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されている。ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されている。ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部分は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されている。ＡＡＶ－９のゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されている。ＡＡＶ－１０のゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されている。ＡＡＶ－１１のゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ－１２のゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７に提供されている。ＡＡＶ－１３のゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４のゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている（参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶ－Ｂ１のゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（７）：１２４７－１２５７（２０１６）に提供されている。Ａｎｃ８０は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９のものであるＡＡＶベクターである。Ａｎｃ８０の配列は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：１０５６－１０６８、２０１５、並びにＶａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６０１６３（いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、並びにＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＴ２３５８０４～ＫＴ２３５８１２に提供されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠陥パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂ長であり、２つの１４５ヌクレオチドの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含み、ウイルス自体又はその誘導体を指すために使用される場合がある。この用語は、他に特定されない限り、全てのサブタイプ、並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶの血清型は、各々特定のクレードと関連しており、そのメンバーは、血清学的及び機能的類似性を共有している。したがって、ＡＡＶはまた、クレードによって称される場合がある。例えば、ＡＡＶ９配列は、「クレードＦ」配列と称される（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）。本開示は、特定のクレード、例えばクレードＦ内の任意の配列の使用を企図する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されている。ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されている。ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されている。ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されている。ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されている。ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部分は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されている。ＡＡＶ－９のゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されている。ＡＡＶ－１０のゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されている。ＡＡＶ－１１のゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ－１２のゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７に提供されている。ＡＡＶ－１３のゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４のゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている（参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶ－Ｂ１のゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（７）：１２４７－１２５７（２０１６）に提供されている。Ａｎｃ８０は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９のものであるＡＡＶベクターである。Ａｎｃ８０の配列は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：１０５６－１０６８、２０１５、並びにＶａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６０１６３（いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、並びにＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＴ２３５８０４～ＫＴ２３５８１２に提供されている。
【0022】
ウイルスＤＮＡ複製、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）とカップリングした、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
【0023】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力のある固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の生涯にわたって存続し得る。天然ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつか又は全ては、プロモーター、目的のＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットなどの外来ＤＮＡと置換され得る。いくつかの事例において、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供される。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性がない。
【0024】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、野生型ＡＡＶウイルス又はウイルス粒子を指す。「ＡＡＶ」、「ＡＡＶウイルス」、及び「ＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「ｒＡＡＶ」という用語は、組換えウイルス、感染性ウイルス、カプセル化ウイルス、又はウイルス粒子を指す。「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶウイルス」、及び「ｒＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0025】
「ｒＡＡＶゲノム」という用語は、修飾された天然ＡＡＶゲノムに由来するポリヌクレオチド配列を指す。天然ＡＡＶキャップ及びｒｅｐ遺伝子を除去するように修飾されたｒＡＡＶゲノムが提供される。ｒＡＡＶゲノムは、少なくとも１つ又は両方の内因性５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムが由来したＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型由来のＩＴＲを含み得る。
【0026】
ＩＴＲによって５’及び３’末端に隣接する導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムが本明細書に提供される。
【0027】
配列番号１は、「ＮＦ２アイソフォームＩ」と称される、エクソン１６を欠くＮＦ２／マーリンアイソフォームのポリヌクレオチド配列を示す。配列番号１によってコードされるＮＦ２アイソフォームＩアミノ酸配列は、配列番号１５に示される。
【0028】
本明細書に提供される導入遺伝子としては、配列番号１のＮＦ２アイソフォームＩポリヌクレオチド、又は腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１のポリヌクレオチドに対して６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
本明細書に提供される導入遺伝子としては、配列番号６～９に示される導入遺伝子であって、それぞれ、配列番号１のＮＦ２アイソフォームＩポリヌクレオチドを含む、導入遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする導入遺伝子であって、配列番号６、７、８、又は９に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、導入遺伝子が、本明細書に提供される。
【0030】
本明細書に提供される導入遺伝子は、例えば、配列番号１５のＮＦ２アイソフォームＩに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードすることができる。
【0031】
本明細書に提供される導入遺伝子は、腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードし、かつストリンジェントな条件下で配列番号１を含む導入遺伝子、又は配列番号６、７、８、若しくは９の導入遺伝子、又はその補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【0032】
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例としては、６５～６８℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、又は４２℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、及び５０％ホルムアミドが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。
【0033】
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質は、リン酸化などの翻訳後陰性調節に抵抗性を有することができる。本明細書に提供される腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質としては、配列番号１５の１０位のセリン、配列番号１５の２３０位のスレオニン、配列番号１５の３１５位のセリン、及び配列番号１５の５１８位のセリンのうちの１つ以上を、その位置での／その周りのリン酸化を防止するためにアラニンなどの別のアミノ酸で置き換えることによって、１つ以上のリン酸化部位が除去されるマーリンタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、例えば、マーリンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を変更することによって達成され得る。例えば、配列番号１の１６０９位のチミジンをグアノシンに変更すると、コードされたマーリンタンパク質中のセリン残基に対するアラニン残基の置換がもたらされる。配列番号１６は、リン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードするように、その位置にグアノシンを有するポリヌクレオチドを示す。配列番号１７～２０は、リン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を示す。
【0034】
プロモーターの例は、２．３ｋｂのＮＦ２プロモーター（配列番号２）、切断型ＮＦ２プロモーター［４００ｂｐのＮＦ２プロモーター（配列番号３）、６１０ｂｐのＮＦ２プロモーター（本明細書では６０９ｂｐと称されることもある）（配列番号４）、及び２．１ｋｂのＮＦ２プロモーター（配列番号５）を含むが、これらに限定されない］、ＣＭＶプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ）、Ｐ５４６プロモーター、及びＭｙｏ７Ａプロモーターである。サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない追加のプロモーターが、本明細書において企図される。加えて、転写促進活性を有する、それぞれ対応する天然プロモーターヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、ＮＦ２プロモーター、切断型ＮＦ２プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＢプロモーター、Ｐ５４６プロモーター、及びＭｙｏ７Ａプロモーターが、本明細書に提供される。
【0035】
転写制御要素の他の例は、組織特異的制御要素、例えば、特異的にニューロン内、又は特異的にアストロサイト内、又は特異的にシュワン細胞内での発現を可能にするプロモーターである。例としては、ニューロン特異的エノラーゼ、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質、及びシュワン細胞特異的ミエリンタンパク質Ｐ０プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターも企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞において発現されるときに導入遺伝子ＲＮＡ転写産物のプロセシングを促進するイントロン配列を含み得る。そのようなイントロンの一例は、ＳＶ４０イントロンである。
【0036】
「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子の組み立て及びカプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。「産生」という用語は、充填細胞によるｒＡＡＶ（感染性のカプセル化されたｒＡＡＶ粒子）の産生プロセスを指す。
【0037】
ＡＡＶの「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれアデノ随伴ウイルスの複製タンパク質及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書ではＡＡＶの「パッケージング遺伝子」と称される。
【0038】
ＡＡＶについての「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアなどのポックスウイルスを含む、ＡＡＶについての様々なこのようなヘルパーウイルスは、当該技術分野において既知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含し得るが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物、及びトリ起源の多数のアデノウイルスが既知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、並びにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、これらはＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手可能である。
【0039】
「ヘルパーウイルス機能」とは、（本明細書に記載の複製及びパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶ複製及びパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされている機能を指す。本明細書中に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、又は、例えば、必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランスでプロデューサー細胞に提供することによるなどの多数の方法で提供され得る。
【0040】
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠く。本明細書で企図されるｒＡＡＶゲノム（例えば、ＩＴＲ）におけるＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ７ｍｂ、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－ＲＨ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４、及びＡＡＶ－Ｂ１、並びにそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導するのに適した任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。本明細書中の修飾カプシドもまた企図され、グリコシル化及び脱アミド化などの種々の翻訳後修飾を有するカプシドを含む。アスパラギン又はグルタミン側鎖を脱アミド化してアスパラギン残基をアスパラギン酸又はイソアスパラギン酸残基に変換すること、及びグルタミンをグルタミン酸又はイソグルタミン酸に変換することは、本明細書に提供されるｒＡＡＶカプシドにおいて企図される。例えば、Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２６（１２）：２８４８－２８６２（２０１８）を参照されたい。本明細書中の修飾カプシドもまた、治療を必要とする罹患組織及び臓器にｒＡＡＶを指向させる標的化配列を含むと企図される。
【0041】
本明細書に提供されるＤＮＡプラスミドは、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムをＡＡＶ９キャプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移入され得る。パッケージングされるｒＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供するｒＡＡＶを産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶ粒子の産生は、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶカプシドタンパク質は、組換えｒＡＡＶの送達を増強するために修飾され得る。カプシドタンパク質に対する修飾は、一般的に当該技術分野において既知である。例えば、ＵＳ２００５／００５３９２２及びＵＳ２００９／０２０２４９０（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0042】
パッケージング細胞を生成する方法は、ｒＡＡＶの産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに選択マーカー（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子）を含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれ得る。ｒＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１（１９８２）］、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加［Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３（１９８３）］、又は直接平滑末端ライゲーション［Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６（１９８４）］などの手順によって細菌プラスミドに導入され得る。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させてもよい。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の非限定例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
【0043】
ｒＡＡＶ粒子の生産の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９（１９９２）及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０ １９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には、ｒＡＡＶ粒子産生に関する文書のセクションに重点を置く。
【0044】
感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するパッケージング細胞が、本明細書で更に提供される。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定的に形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代数の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）であり得る。
【0045】
本開示のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ（例えば、感染性のカプシド形成されたｒＡＡＶ粒子）も本明細書に提供される。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＤＮＡを欠き、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐのＤＮＡが存在しない。ｒＡＡＶゲノムは、自己相補型（ｓｃ）ゲノムであり得る。ｓｃゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｃＡＡＶと称される。ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ゲノムであり得る。一本鎖ゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｓＡＡＶと称される。
【0046】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって（例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などによって）精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法を含み得る。
【0047】
組成物
ｒＡＡＶを含む組成物もまた、提供される。組成物は、マーリンタンパク質を含むが、これらに限定されない目的のポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。組成物は、目的の異なるポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。
ｒＡＡＶを含む組成物もまた、提供される。組成物は、マーリンタンパク質を含むが、これらに限定されない目的のポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。組成物は、目的の異なるポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。
【0048】
本明細書で提供される組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される賦形剤（複数可）を含む。許容される賦形剤は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸、若しくは他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、並びに／又はＴｗｅｅｎなどの非イオン性界面活性剤、ポロキサマー１８８、プルロニック（登録商標）（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのコポリマーを含むが、これらに限定されない。本明細書に提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、又はイオキシランなどの非イオン性低浸透圧化合物又は造影剤を含有する、薬学的に許容される水性賦形剤を含むことができ、非イオン性低浸透圧化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特徴のうちの１つ以上を有することができる：約１８０ｍｇＩ／ｍＬ、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇ水の蒸気圧浸透圧法によるオスモル濃度、約２７３ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度、２０℃で約２．３ｃｐ及び３７℃で約１．５ｃｐの絶対粘度、及び３７℃で約１．１６４の比重。例示的な組成物は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧化合物、又は約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、及び約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧化合物中に配合されたｓｃＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む。別の例示的な組成物は、１×ＰＢＳ及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
【0049】
髄腔内送達を含むが、これらに限定されないＣＳＦ送達のために、ウイルスベクターは、造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ又は同様のもの）と混合され得る。例えば、組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない非イオン性低浸透圧造影剤を含み得る。
【0050】
投与量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。本明細書で企図される投与量は、約１×１０７ｖｇ、約１×１０８ｖｇ、約１×１０９ｖｇ、約５×１０９ｖｇ、約６×１０９ｖｇ、約７×１０９ｖｇ、約８×１０９ｖｇ、約９×１０９ｖｇ、約１×１０１０ｖｇ、約２×１０１０ｖｇ、約３×１０１０ｖｇ、約４×１０１０ｖｇ、約５×１０１０ｖｇ、約１×１０１１ｖｇ、約１．１×１０１１ｖｇ、約１．２×１０１１ｖｇ、約１．３×１０１１ｖｇ、約１．２×１０１１ｖｇ、約１．３×１０１１ｖｇ、約１．４×１０１１ｖｇ、約１．５×１０１１ｖｇ、約１．６×１０１１ｖｇ、約１．７×１０１１ｖｇ、約１．８×１０１１ｖｇ、約１．９×１０１１ｖｇ、約２×１０１１ｖｇ、約３×１０１１ｖｇ、約４×１０１１ｖｇ、約５×１０１１ｖｇ、約１×１０１２ｖｇ、約１×１０１３ｖｇ、約１．１×１０１３ｖｇ、約１．２×１０１３ｖｇ、約１．３×１０１３ｖｇ、約１．５×１０１３ｖｇ、約２×１０１３ｖｇ、約２．５×１０１３ｖｇ、約３×１０１３ｖｇ、約３．５×１０１３ｖｇ、約４×１０１３ｖｇ、約４．５×１０１３ｖｇ、約５×１０１３ｖｇ、約６×１０１３ｖｇ、約１×１０１４ｖｇ、約２×１０１４ｖｇ、約３×１０１４ｖｇ、約４×１０１４ｖｇ、約５×１０１４ｖｇ、約１×１０１５ｖｇ、～約１×１０１６ｖｇ、又はそれ以上の全ウイルスゲノムを含む。約１×１０９ｖｇ～約１×１０１０ｖｇ、約５×１０９ｖｇ～約５×１０１０ｖｇ、約１×１０１０ｖｇ～約１×１０１１ｖｇ、約１×１０１１ｖｇ～約１×１０１５ｖｇ、約１×１０１２ｖｇ～約１×１０１５ｖｇ、約１×１０１２ｖｇ～約１×１０１４ｖｇ、約１×１０１３ｖｇ～約６×１０１４ｖｇ、及び約６×１０１３ｖｇ～約１．０×１０１４ｖｇ、２．０×１０１４ｖｇ、３．０×１０１４ｖｇ、５．０×１０１４の投与量も企図される。本明細書に例示される１つの用量は、１．６５×１０１１ｖｇである。
【0051】
例えば、ＣＳＦ用量は、年齢群に基づいて、約１×１０１３ｖｇ／患者～約１×１０１５ｖｇ／患者の範囲であり得る。例えば、静脈内送達用量は、１×１０１３ｖｇ／キログラム（ｋｇ）体重～２×１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【0052】
治療の方法
本明細書における治療の方法は、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性が低減した細胞を標的とする。本明細書における治療の方法は、「欠陥」ＮＦ２遺伝子、すなわち、腫瘍サプレッサー活性を欠くマーリンタンパク質をコードする少なくとも１つの「欠陥」（すなわち、変異した）対立遺伝子を有する遺伝子を有する細胞を標的とすることができる。当該技術分野で理解されるように、ヒト対象などの二倍体対象は、一般に、対立遺伝子と呼ばれる各遺伝子の２つのコピーを有する。本明細書における治療の方法は、欠陥ＮＦ２遺伝子によって引き起こされる活性の低減、例えば、エピジェニック調節によって、又はマーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性を低減させる翻訳後修飾（例えば、リン酸化）によって引き起こされるマーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性の低減以外の、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性が低減した細胞を標的とすることができる。対象（例えば、ヒト対象）において標的細胞に形質導入する方法が提供される。対象（例えば、ヒト対象）においてそのようなシュワン、及び／又は髄膜細胞を形質導入する方法が提供される。対象（例えば、ヒト対象）においてシュワン腫、髄膜腫、及び／又は膠芽腫を形質導入する方法が提供される。
本明細書における治療の方法は、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性が低減した細胞を標的とする。本明細書における治療の方法は、「欠陥」ＮＦ２遺伝子、すなわち、腫瘍サプレッサー活性を欠くマーリンタンパク質をコードする少なくとも１つの「欠陥」（すなわち、変異した）対立遺伝子を有する遺伝子を有する細胞を標的とすることができる。当該技術分野で理解されるように、ヒト対象などの二倍体対象は、一般に、対立遺伝子と呼ばれる各遺伝子の２つのコピーを有する。本明細書における治療の方法は、欠陥ＮＦ２遺伝子によって引き起こされる活性の低減、例えば、エピジェニック調節によって、又はマーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性を低減させる翻訳後修飾（例えば、リン酸化）によって引き起こされるマーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性の低減以外の、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性が低減した細胞を標的とすることができる。対象（例えば、ヒト対象）において標的細胞に形質導入する方法が提供される。対象（例えば、ヒト対象）においてそのようなシュワン、及び／又は髄膜細胞を形質導入する方法が提供される。対象（例えば、ヒト対象）においてシュワン腫、髄膜腫、及び／又は膠芽腫を形質導入する方法が提供される。
【0053】
本明細書に記載の治療の方法の使用は、例えば、ＮＦ２、急性骨髄性白血病、扁平上皮がん、膀胱がん、肉腫、乳がん、上皮がん、結腸直腸がん、混合腺扁平上皮がん、神経膠腫、肝細胞がん、腸がん、肝臓がん、腺がん、混合肺がん、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、漿液性がん、下垂体がん、腎細胞がん、シュワン腫（ＮＦ２を有しない患者における散発性腫瘍）、胃がん、未分化甲状腺がん、子宮内膜がん、前立腺がん、及び尿路がんにおける低減したマーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性に対して示される。
【0054】
「形質導入する」及び「形質導入」という用語は、インビボ又はインビトロのいずれかで、腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする本開示のｒＡＡＶを標的細胞に投与／送達し、標的細胞による機能性マーリンタンパク質の発現をもたらすことを指すように使用される。本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチドの持続的発現をもたらす。
【0055】
本明細書に提供する方法は、標的細胞に、本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶを形質導入する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含むｒＡＡＶウイルス粒子は、例えば、全身投与（例えば、静脈内投与）又は髄腔内投与によって、対象の脳及び／又は脊髄に投与又は送達される。髄腔内投与は、脳又は脊髄のくも膜下の空間への送達を指す。特に脳への髄腔内投与は、脳室内注射によって実施することができる。送達が企図される脳の領域としては、運動皮質、視覚野、小脳、及び脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
髄腔内投与の場合、対象は、ｒＡＡＶの注射後（例えば、約５分間、約１０分間、約１５分間、又は約２０分間）、トレンデレンブルグ体位（頭位）に保持され得る。例えば、患者は、頭位で約１度～約３０度、約１５～約３０度、約３０～約６０度、約６０～約９０度、又は約９０～約１８０度傾けられてもよい。
【0057】
本明細書に提供される治療方法は、有効用量又は有効複数用量の、本明細書に提供されるｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者を含むが、これに限定されない動物）に投与するステップを含む。用量がＮＦ２の症状の発症前に投与される場合、投与は、予防的である。用量が症状の発症後に投与される場合、投与は、治療的である。有効用量は、状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）する用量であり、状態の進行を遅延若しくは予防する用量であり、状態の程度を低減させる用量であり、状態の寛解（部分若しくは完全）をもたらす用量であり、かつ／又は生存を延長させる用量である。
【0058】
シュワン腫、髄膜腫、及び／又は膠芽腫の治療のための有効用量は、欠陥ＮＦ２遺伝子を有するシュワン腫、髄膜腫、及び／又は膠芽腫を緩和（排除若しくは低減）する用量であり、シュワン腫、髄膜腫、及び／又は膠芽腫の発症を遅延若しくは予防する用量であり、シュワン腫、髄膜腫及び／又は膠芽腫の寛解（部分若しくは完全）をもたらす用量であり、かつ／又は生存を延長させる用量である。
【0059】
ＮＦ２の治療のための有効用量は、ＮＦ２に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）する［例えば、腫瘍（腫瘍のサイズ及び／若しくは数を減少させ、かつ／又は新しい腫瘍を形成する転移を減少させる）、難聴、耳鳴症（耳鳴り）、平衡障害、顔面の脱力若しくは痺れ、視覚障害、白内障、発作、及び脳幹圧迫のうちの少なくとも１つを緩和する］用量であり、ＮＦ２の進行を遅延若しくは予防する用量であり、ＮＦ２の程度を低減させる用量であり、ＮＦ２の寛解（部分若しくは完全）をもたらす用量であり、かつ／又は生存を延長させる用量である。
【0060】
本開示は、ＮＦ２に関連する難聴を治療する方法を提供する。
【0061】
本明細書に記載の治療の方法が難聴又は聴覚障害を改善するかどうかを判定するための試験には、聴覚系の機能状態を客観的に判定する生理学的試験、及び個体が聴覚情報をどのように処理するかを主観的に判定する聴力測定が含まれる。生理学的試験には、第８脳神経及び聴覚脳幹に起因し、表面電極で記録される、電気生理学的応答を誘発する刺激（例えば、クリック）を使用する聴覚脳幹応答試験（ＡＢＲ；ＢＡＥＲ、ＢＳＥＲとしても知られる）が含まれる。ＡＢＲの「Ｖ波検出閾値」は、神経学的に正常な個体における１５００～４０００Ｈｚ領域における聴覚感度と最も良く相関する。ＡＢＲは、低周波（１５００Ｈｚ未満）感度を評価しない。
【0062】
聴覚定常状態応答試験（ＡＳＳＲ）は、客観的な統計ベースの数学的検出アルゴリズムを使用して、聴覚閾値を検出及び定義する。ＡＳＳＲは、ブロードバンド又は周波数固有の刺激を使用して得ることができ、重度～超重度（ｓｅｖｅｒｅ－ｔｏ－ｐｒｏｆｏｕｎｄ）の範囲で聴力閾値を区別することができる。ＡＳＳＲ試験は、ＡＢＲが提供しない周波数固有の情報を提供するために頻繁に使用される。５００Ｈｚ、１０００Ｈｚ、２０００Ｈｚ、及び４０００Ｈｚの試験周波数が、一般的に使用される。
【0063】
誘発耳音響放射（ＥＯＡＥ）は、マイクロホン及びトランスデューサーを備えたプローブを使用して外耳道で測定される、蝸牛内で発生する音である。ＥＯＡＥは、主に広い周波数範囲にわたる蝸牛の外毛細胞の活動を反映し、４０～５０ｄＢ ＨＬよりも優れた聴覚感度を有する耳に存在する。イミタンス試験（鼓膜計測、音響反射閾値、音響反射減衰）は、中耳圧、鼓膜可動性、エウスタキオ管機能、及び中耳小骨可動性を含む末梢聴覚系を評価する。
【0064】
聴力測定には、聴性行動反応検査（ＢＯＡ）及び視覚強化聴力検査（ＶＲＡ）などの行動試験が含まれる。純粋なトーンの聴力測定（空気及び骨伝導）は、周波数（又はピッチ）の関数として、個体が純粋なトーンを「聞く」最低強度を判定することを含む。２５０（中央のＣに近い）～８０００Ｈｚのオクターブ周波数は、イヤホンを使用して試験される。強度又はラウドネスは、２つの音圧間の比として定義されるデシベル（ｄＢ）で測定される。０ｄＢ ＨＬは、正常な聴覚成人の平均閾値であり、１２０ｄＢ ＨＬは、痛みを引き起こすほど大きい。語音聴取閾値（ＳＲＴ）及び語音弁別が評価される。気導聴力測定の場合、音はイヤホンを通して提示される。閾値は、外耳道、中耳、及び内耳の状態に依存する。骨導聴力測定の場合、音は、乳様突起又は額に配置されたバイブレータを通して提示され、したがって、外耳及び中耳を迂回する。閾値は、内耳の状態に依存する。追加の試験には、各耳についての完全な周波数固有の聴力図を開発する条件遊戯聴力測定（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｐｌａｙ ａｕｄｉｏｍｅｔｒｙ）、及び個体がいつ音を聞くかを示す従来の聴力測定が含まれる。
【0065】
聴力プロファイルは、単一のグラフ上のいくつかのオーディオグラフの記録を指す。これらの聴力図は、異なる時間に１人の個体からのものであってもよい。同じグラフ上に年齢を伴う多数の聴力図をプロットすることによって、難聴の年齢に関連する進行を識別することができる。
【0066】
その他の用語及び開示
値の範囲が本明細書に提供される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限との間にある、下限の単位の１０分の１までの各介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が、本開示に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として、本開示に包含される。記載された範囲が、限界のうちの一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちのいずれか又は両方を除く範囲も、本開示に含まれる。
値の範囲が本明細書に提供される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限との間にある、下限の単位の１０分の１までの各介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が、本開示に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として、本開示に包含される。記載された範囲が、限界のうちの一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちのいずれか又は両方を除く範囲も、本開示に含まれる。
【0067】
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施又は試験に使用することもできる。
【0068】
本明細書で言及される全ての出版物は、出版物が引用される目的のための方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【0069】
本開示を読むことで当業者に明らかになるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離することができるか、又はそれらの特徴と組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序で、又は論理的に可能である任意の他の順序で実施することができる。本開示は、そのような全ての組み合わせについての裏付けを提供することを意図している。
【0070】
本明細書で使用される場合、「～してもよい（ｍａｙ）」、「含み得る（ｍａｙ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「～であり得る（ｍａｙ ｂｅ）」、「～することができる（ｃａｎ）」、「含み得る（ｃａｎ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び「～であり得る（ｃａｎ ｂｅ）」は全て、提供される主題の一部として機能的かつ利用可能である、本発明者らによって想定されるものを示す。
【実施例】
【0071】
本開示の様々な態様及び利点は、以下の非限定例によって例示される。
【0072】
実施例１
ＮＦ２アイソフォームＩを発現するｒＡＡＶの産生
ｒＡＡＶは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１４）などのレポーターを発現するか、又はＮＦ２機能喪失病理に対する遺伝子療法再発現アプローチにおいて使用するためのヒトＮＦ２ ｃＤＮＡ（配列番号１のＮＦ２アイソフォームＩ ｃＤＮＡ）を発現する導入遺伝子を使用して産生した。
ＮＦ２アイソフォームＩを発現するｒＡＡＶの産生
ｒＡＡＶは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１４）などのレポーターを発現するか、又はＮＦ２機能喪失病理に対する遺伝子療法再発現アプローチにおいて使用するためのヒトＮＦ２ ｃＤＮＡ（配列番号１のＮＦ２アイソフォームＩ ｃＤＮＡ）を発現する導入遺伝子を使用して産生した。
【0073】
導入遺伝子は、様々なＮＦ２プロモーターを含んでいた：ＧＦＰ又はマーリンタンパク質の発現を駆動する、２．３ｋｂ、２．１ｋｂ、６１０ｂｐ（本明細書では６０９ｂｐと称されることもある）、又は４００ｂｐ（図１）。配列番号６の導入遺伝子は、４００ｂｐのプロモーターを含み、配列番号７の導入遺伝子は、６１０ｂｐのプロモーターを含み、配列番号８の導入遺伝子は、２．１ｋｂのプロモーターを含み、配列番号９の導入遺伝子は、２．３ｋｂのプロモーターを含む。本明細書の方法で使用することが企図されるプロモーターは、導入遺伝子構築物がｒＡＡＶに良好に適合することを可能にし、また導入遺伝子発現を駆動して、形質導入細胞においてマーリンタンパク質発現を少なくとも１０％増加させるサイズであり、ＮＦ２において最も頻繁に罹患する細胞型であるシュワン細胞及び髄膜細胞における発現に焦点を当てる。
【0074】
ＨＥＫ２９３細胞にｐＡＡＶ．ＮＦ２．ＧＦＰレポータープラスミドを一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションから７２時間後にＧＦＰ発現を分析した。図２、（ａ）トランスフェクトされた細胞の蛍光イメージングは、ＧＦＰを駆動する対照ニワトリβアクチン（ＣＢ）プロモーターと比較して、異なる強度でのに基づいて、ＧＦＰのＮＦ２プロモーター依存性の差次的発現を示した。（ｂ）トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞との間の内因性ＮＦ２タンパク質レベルに影響を及ぼさない、トランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰのＮＦ２プロモーター依存性発現を確認する。
【0075】
ＨＥＫ２９３細胞にｐＡＡＶ．ＮＦ２．ＮＦ２ ＣＤＳプラスミドを一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションから７２時間後にＮＦ２発現を分析した。図３、（ａ）トランスフェクション対照として使用されるｐＡＡＶ．ＣＢ．ＧＦＰプラスミド処理されたＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクション効率を確認する堅牢なＧＦＰ蛍光を示し、（ｂ）トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロット分析は、ｐＡＡＶ．ＣＢ．ＧＦＰをトランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞と比較して、ＮＦ２のＮＦ２プロモーター依存性の差次的過剰発現を確認する。
【0076】
導入遺伝子をＡＡＶ９産生プラスミドにサブクローニングし、ｓｃＡＡＶ及びｓｓＡＡＶを、二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースの産生プラスミド、Ｒｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒを使用して、２９３個の細胞を一過性三重トランスフェクションすることにより、Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７（１）：５９－６５（２００９）に記載されるように産生した。マーリンタンパク質コードｓｃＡＡＶは、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－２．３ｋｂ．ＮＦ２、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６１０ｂｐ．ＮＦ２（本明細書ではｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２と称されることもある）、及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２と名付けた。マーリンタンパク質コードｓｓＡＡＶは、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．３ｋｂ．ＮＦ２、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－６１０ｂｐ．ＮＦ２（プロモーターが実際には６０９ｂｐであるため、本明細書ではｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２と称されることもある）、及びｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２と名付けた。
【0077】
異なるＮＦ２プロモーターを試験するために、マウスに、４００ｂｐ又は６１０ｂｐのＮＦ２プロモーターからのＧＦＰ発現を駆動するｓｃＡＡＶを注射した。免疫蛍光は、両方のプロモーターが、脳内のＮＦ２陽性細胞（主に大脳皮質、海馬、基底前脳、前庭小脳、及び前庭核）、シュワン細胞、並びに坐骨神経において様々なレベルでＧＦＰを発現することを示したが、４００ｂｐのプロモーターを用いたｓｃＡＡＶの注射は、６１０ｂｐのプロモーターを用いたｓｃＡＡＶよりも、より高く、かつより広範囲のＧＦＰ発現をもたらした。同様に、マウスに、２．３ｋｂ又は２．１ｋｂのＮＦ２プロモーターからのＧＦＰの発現を駆動するｓｓＡＡＶを注射し、発現を免疫蛍光によって評価する。
【0078】
異なるプロモーターを試験する別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＧＦＰ、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＧＦＰ、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ ＧＦＰ、及びｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．３ｋｂ ＧＦＰベクターを、脳室内（ＩＣＶ）経路を介して同じ用量（５．０×１０１０ｖｇ／動物）で新生児マウスに投与し、注射から１ヶ月後に屠殺した。免疫組織化学的蛍光分析によってＧＦＰ発現について検査した異なる脳領域（基底前脳、皮質、及び海馬）は、４００ｂｐ．ＧＦＰベクターが、全体的により高いＧＦＰ発現及びＳ１００βとの共局在を有し、６０９ｂｐ．ＧＦＰ、２．１ｋｂ．ＧＦＰ、及び２．３ｋｂ ＧＦＰがそれに続くことを示した。（図４）
【0079】
更に別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＧＦＰ、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＧＦＰ、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ ＧＦＰ、及びｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．３ｋｂ ＧＦＰベクターを、ＩＣＶ経路を介して同じ用量（５．０×１０１０ｖｇ／動物）で新生児マウスに投与した。動物を注射から１ヶ月後に屠殺し、免疫組織化学的蛍光分析によって、異なる脳領域をＧＦＰ発現について検査した。前庭核において、４００ｂｐ．ＧＦＰベクターは、全体的により高いＧＦＰ発現及びＳ１００βとの共局在を示し、２．３ｋｂ．ＧＦＰ及び２．１ｋｂがそれに続いた。（図５）
【0080】
別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＧＦＰ及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＧＦＰベクターを、ＩＣＶ経路を介して同じ用量（５．０×１０１０ｖｇ／動物）で新生児マウスに投与し、動物を注射から１ヶ月後に屠殺した。マウスの坐骨神経を採取し、免疫組織化学的蛍光分析によってＧＦＰ発現について検査した。４００ｂｐ．ＧＦＰベクターは、６０９ｂｐ．ＧＦＰベクターと比較して、坐骨神経におけるＧＦＰの著しく高い発現及びＮＦ２発現細胞との共局在を示した。（図６）
【0081】
別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＧＦＰ及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＧＦＰベクターを、ＩＣＶ経路を介して同じ用量（５．０×１０１０ｖｇ／動物）で新生児マウスに投与し、動物を注射から１ヶ月後に屠殺した。マウスの坐骨神経を採取し、免疫組織化学的蛍光分析によってＧＦＰ発現について検査した。４００ｂｐ．ＧＦＰベクターは、６０９ｂｐ．ＧＦＰベクターと比較して、坐骨神経におけるＧＦＰの高い発現及びＳ１００β発現細胞との共局在を示した。（図７）
【0082】
ニワトリベータアクチンユビキタスプロモーター又はミエリン塩基性タンパク質プロモーターと対応するｓｃＡＡＶもマウスに注射した。ＮＦ２陽性細胞におけるベータアクチンプロモーターからのＧＦＰ発現は、ミエリン塩基性タンパク質プロモーターからの発現よりも多く観察された。
【0083】
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰ及びｓｃＡＡＶ９．ＭＢＰ．ＧＦＰベクターを、ＩＣＶ経路を介して同じ用量（５．０×１０１０ｖｇ／動物）で新生児マウスに投与し、動物を注射から１ヶ月後に屠殺した。マウスの坐骨神経を採取し、免疫組織化学的蛍光分析によってＧＦＰ発現を検査した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰベクターは、ＧＦＰベクターを駆動するＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）と比較して、坐骨神経におけるＧＦＰの著しい発現及びＮＦ２発現細胞との共局在を示した。（図８）
【0084】
別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰ及びｓｃＡＡＶ９．ＭＢＰ．ＧＦＰベクターを、ＩＣＶ経路を介して同じ用量（５．０×１０１０ｖｇ／動物）で新生児マウスに投与し、動物を注射から１ヶ月後に屠殺した。マウスの坐骨神経を採取し、免疫組織化学的蛍光分析によってＧＦＰ発現を検査した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰベクターは、ＧＦＰベクターを駆動するＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）と比較して、坐骨神経におけるＧＦＰの著しい発現及びＳ１００β発現細胞との共局在を示した。（図９）
【0085】
したがって、４００ｂｐ、６０９ｂｐ、及び２．１ｋＢ構築物の全ての領域（基底前脳、皮質、海馬、前庭核）で、Ｓ１００βとのレポーターＧＦＰの共局在が観察された。基底前脳、皮質、及び海馬において、４００ｂｐ．ＧＦＰ及び６０９ｂｐ．ＧＦＰの共局在が、２．１ｋＢ．ＧＦＰよりも多く観察された。４００ｂｐ．ＧＦＰベクターは、他のいずれの構築物よりも良好に前庭核内で共局在する。４００ｂｐ．ＧＦＰ及び６０９ｂｐ．ＧＦＰ構築物は、坐骨神経内で共局在し、４００ｂｐ．ＧＦＰについてより多くの共局在を有する。
【0086】
別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２ベクターを、それぞれ、動物当たり２．１０Ｅ＋１０ｖｇ及び３．５０Ｅ＋１０ｖｇの用量で、ＩＣＶ経路を介して新生児マウスに投与した。動物を、注射から１ヶ月後に屠殺した。動物からの全脳溶解物のウエスタンブロット分析は、注射されていない対照と比較して、４００ｂｐ．ＮＦ２及び６０９ｂｐ．ＮＦ２処理マウスの両方において、ＮＦ２タンパク質の中程度の過剰発現を示した。（図１０）
【0087】
別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２、及びｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２ベクターを、ＩＣＶ経路を介して様々な用量で新生児マウスに投与し、注射から１ヶ月後に屠殺した。全ての処理されたマウスがＮＦ２過剰発現を示したことを実証した免疫組織化学的蛍光分析によって、矢状脳切片をＮＦ２発現について検査した。特に、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２ ４００ｂｐ．ＮＦ２ベクターは、６０９ｂｐ．ＮＦ２及び２．１ｋｂ．ＮＦ２ベクターと比較して、更に低い用量で投与された場合、広範囲のＮＦ２過剰発現をもたらした。（図１１）
【0088】
別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２、及びｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２ベクターを、ＩＣＶ経路を介して様々な用量で新生児マウスに投与し、注射から１ヶ月後に屠殺した。異なる脳領域（海馬、前部及び後部皮質、基底前脳、小脳、前庭核）を免疫組織化学的蛍光分析によってＮＦ２発現について検査した。３つのベクター全てで処理したマウスは、６０９ｂｐ．ＮＦ２及び２．１ｋｂ．ＮＦ２ベクターと比較して、更に低い用量で投与された場合、堅牢なＮＦ２過剰発現をもたらす４００ｂｐ．ＮＦ２ベクターを有する全ての領域においてＮＦ２過剰発現を示した。（図１２）
【0089】
別の実験では、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２、及びｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２ベクターを、ＩＣＶ経路を介して様々な用量で新生児マウスに投与し、注射から１ヶ月後に屠殺した。異なる脳領域（海馬、前部及び後部皮質、基底前脳、小脳、前庭核）を免疫蛍光分析によってＮＦ２発現について検査した。３つのベクター全てで処理したマウスは、６０９ｂｐ．ＮＦ２及び２．１ｋｂ．ＮＦ２ベクターと比較して、更に低い用量で投与された場合、堅牢なＮＦ２過剰発現をもたらす４００ｂｐ．ＮＦ２ベクターを有する全ての領域においてＮＦ２過剰発現を示した。（図１３）
【0090】
結果は、どのプロモーター構築物が、ＮＦ２関連細胞型を標的とするのに最も有効であるかを実証し、導入遺伝子の潜在的な発現レベルの指標を与える。
【0091】
実施例２
Ｐｏｓｔｎ－Ｃｒｅ；Ｎｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおけるＡＡＶ．ＮＦ２の有効性
実施例１に従って産生されたｒＡＡＶ ＡＡＶ．ＮＦ２を、１００％の浸透度でヒトシュワン腫と組織学的に同一である複数の脊髄及び頭蓋神経腫瘍を発症するモデルＰｏｓｔｎ－Ｃｒｅ；Ｎｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおいて使用する（Ｃｌａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０１５，２４：１－８）。マウスはまた、脳神経ＶＩＩＩ腫瘍の発達に起因する聴覚及び平衡における機能障害を示す。
Ｐｏｓｔｎ－Ｃｒｅ；Ｎｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおけるＡＡＶ．ＮＦ２の有効性
実施例１に従って産生されたｒＡＡＶ ＡＡＶ．ＮＦ２を、１００％の浸透度でヒトシュワン腫と組織学的に同一である複数の脊髄及び頭蓋神経腫瘍を発症するモデルＰｏｓｔｎ－Ｃｒｅ；Ｎｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおいて使用する（Ｃｌａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０１５，２４：１－８）。マウスはまた、脳神経ＶＩＩＩ腫瘍の発達に起因する聴覚及び平衡における機能障害を示す。
【0092】
Ｐｏｓｔｎ－Ｃｒｅ；Ｎｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを６ヶ月間成長させ、腫瘍を発達させる。Ｐｏｓｔｎ－Ｃｒｅ；Ｎｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを、腫瘍発達の前又は後に、ＡＡＶ．ＮＦ２で、静脈内又は脊髄内液注射によって処理する。マウスに、約１×１０１１ｖｇ～約５×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ ＡＡＶ．ＮＦ２［一例として、１×ＰＢＳ及び０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＢＳ／Ｆ６８として表される）中に配合される］の髄腔内（ＩＴ）注射を１回行う。ＡＡＶ－ＧＦＰベクターの注射を、対照として使用する。発症前に（ｐｒｅ－ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ）処理されたマウスの場合は８ヶ月目、又は腫瘍形成開始後に処理されたマウスの場合は注射後３ヶ月目に、これらのマウスの聴覚障害を評価するために、聴性脳幹応答測定を実行し、別個のマウスコホートと比較する。次いで、ＡＡＶ．ＮＦ２及びＡＡＶ．ＧＦＰ処理マウスからの背根神経節及び腫瘍を切断して、処理効果を比較する。
【0093】
実験は、ＮＦ２の再発現が、この遺伝子操作されたマウスモデルにおいてシュワン腫の発達及び難聴を予防することができることを実証する。
【0094】
実施例３
様々なヒトＮＦ２変異との関連において遺伝子療法を実証するマウスインビボＮＦ２モデル
遺伝子置換療法を、誘導シュワン細胞（ｉＳＣ）にリプログラミングされた患者線維芽細胞を使用して、ヒト患者インビトロモデルにおいて実証する。リプログラミング方法は、化学的に定義された培地を利用して、９日以内にシュワン細胞マーカー（Ｓ１００及びＫｒｏｘ２０）の発現を誘導する。更に、リプログラミングされた細胞は、線維芽細胞表面マーカーを下方調節する（図１５Ａ）。細胞は、更に成長され、依然としてＳ１００及びＫｒｏｘ２０の発現を維持することができ（図１５Ｂ）、これにより、細胞の増殖及び異種移植片モデルでの使用が可能になる。
様々なヒトＮＦ２変異との関連において遺伝子療法を実証するマウスインビボＮＦ２モデル
遺伝子置換療法を、誘導シュワン細胞（ｉＳＣ）にリプログラミングされた患者線維芽細胞を使用して、ヒト患者インビトロモデルにおいて実証する。リプログラミング方法は、化学的に定義された培地を利用して、９日以内にシュワン細胞マーカー（Ｓ１００及びＫｒｏｘ２０）の発現を誘導する。更に、リプログラミングされた細胞は、線維芽細胞表面マーカーを下方調節する（図１５Ａ）。細胞は、更に成長され、依然としてＳ１００及びＫｒｏｘ２０の発現を維持することができ（図１５Ｂ）、これにより、細胞の増殖及び異種移植片モデルでの使用が可能になる。
【0095】
ｉＳＣ細胞は、インビボで遺伝子療法アプローチの効果を評価するために患者特異的異種移植マウスモデルで使用される。５０００個のヒト患者ｉＳＣ細胞を、以前にＦｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１７，１６：２３８７－２３９８に記載されたように、マウスの坐骨神経に直接注射する。注射後２週間から２ヶ月まで、マウスを屠殺し、腫瘍形成を評価する。あるいは、患者由来のｉＳＣ細胞の代わりに、患者由来の不死化腫瘍細胞（散発性シュワン腫細胞株又はＮＦ２患者シュワン腫細胞株及び髄膜腫細胞株など）を注射する。
【0096】
誘導ｉＳＣとは別に、患者由来の不死化ヒト腫瘍細胞も、異種移植片モデルに使用する。ここで、不死化散発性シュワン腫細胞、並びにＮＦ２患者シュワン腫細胞及び髄膜腫細胞をマウスに注射し、腫瘍形成について更に評価する。
【0097】
ヒト患者線維芽細胞ＮＦ２遺伝子における変異は、マウスにおいてインビボで腫瘍形成を生成することが企図される。加えて、腫瘍増殖を促進するためにＮＦ２遺伝子発現を更に低減させるために、レンチウイルスＮＦ２ ｓｈＲＮＡを使用して、ヒト患者において腫瘍形成細胞が経験する「セカンドヒット」を模倣するために、シュワン細胞分化の前にＮＦ２遺伝子発現を低減させる。これらのＮＦ２ ｓｈＲＮＡ発現線維芽細胞から生成されたシュワン細胞が、マウスにおいてインビボで腫瘍を産生する能力を、形質導入されていない線維芽細胞の能力と比較する。
【0098】
異なる患者ＮＦ２遺伝子変異を有する得られたマウスを使用して、患者変異との関連における腫瘍形成の予防又は腫瘍成長の低減におけるｒＡＡＶ ＡＡＶ．ＮＦ２の有効性を実証する。マウスを、ｉＳＣ／不死化ヒト腫瘍細胞をマウスの坐骨神経及び／又は腫瘍に注射してから２４時間後又は２週間後のいずれかにＡＡＶ．ＮＦ２で処理する。マウスに、約１×１０１１ｖｇ～約５×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ ＡＡＶ．ＮＦ２［一例として、１×ＰＢＳ及び０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＢＳ／Ｆ６８として表される）中に配合される］の範囲の髄腔内（ＩＴ）注射又は腫瘍内注射を１回行う。マウスを屠殺し、腫瘍の数及びサイズを評価する。
【0099】
誘導ｉＳＣ
３つの健常な対照（野生型）線維芽細胞株及び３つの患者（ＮＦ２変異型）線維芽細胞株を、６つの小分子を用いた連続処理を使用して誘導シュワン細胞（ｉＳＣ）に変換することに成功した。線維芽細胞及びそれぞれのｉＳＣの明視野画像は、細胞形態の違いを示した。（図１６）
３つの健常な対照（野生型）線維芽細胞株及び３つの患者（ＮＦ２変異型）線維芽細胞株を、６つの小分子を用いた連続処理を使用して誘導シュワン細胞（ｉＳＣ）に変換することに成功した。線維芽細胞及びそれぞれのｉＳＣの明視野画像は、細胞形態の違いを示した。（図１６）
【0100】
患者由来ｉＳＣのウエスタンブロット分析は、健常ｉＳＣと比較して、ＮＦ２タンパク質の発現の著しい低減を示した。（図１７）患者由来ｉＳＣのｑＲＴ－ＰＣＲによるＮＦ２ ｍＲＮＡ発現分析も、健常なｉＳＣと比較して、ＮＦ２タンパク質の発現の著しい低減を示した。（図１８）患者由来ｉＳＣの免疫蛍光分析は、健常なｉＳＣと比較して、総ＮＦ２タンパク質染色の発現の低減を示した。（図１９）
【0101】
患者由来のｉＳＣの免疫蛍光分析は、健常な対照ｉＳＣと比較して、ホスホ－Ｓ５１８マーリン（不活性腫瘍サプレッサー）の発現の増加を示した。ホスホ－Ｓ５１８マーリン発現の増加は、疾患表現型の重症度と相関するようである（患者２０７は、より重度の表現型に関連している）。加えて、ホスホ－Ｓ５１８マーリンは、健常な（野生型ＮＦ２）対照ｉＳＣと比較して、患者由来ｉＳＣにおいて誤った位置に局在化している。（図２０）
【0102】
図２１は、ＮＦ２患者のｉＳＣにおけるシュワン細胞成熟マーカーの低減を示す。ａ）免疫蛍光分析は、健常な（野生型ＮＦ２）対照ｉＳＣと比較して、ＮＦ２患者由来ｉＳＣにおける成熟髄鞘形成シュワン細胞マーカー（ＫＲＯＸ２０及びＭＢＰ）の発現の著しい低減を示した。ｂ）ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析は、健常な対照ｉＳＣと比較して、ＮＦ２患者ｉＳＣにおけるＫＲＯＸ２０及びＭＢＰ ｍＲＮＡの発現の著しい低減を示した。
【0103】
図２２は、ＮＦ２患者ｉＳＣにおける幹細胞マーカー発現の増加を示す。ａ）免疫蛍光分析は、健常な（野生型ＮＦ２）対照ｉＳＣと比較して、３人のＮＦ２患者のうちの２人において幹細胞マーカーｃ－Ｍｙｃの発現の増加を示した。ｂ）ＤＡＰＩによって測定された細胞の総数にわたるｃ－Ｍｙｃ陽性細胞の画像－Ｊ分析は、対応する患者由来ｉＳＣにおける高ｃ－Ｍｙｃ陽性のパーセンテージの著しい増加を示した。したがって、ｃ－Ｍｙｃは、インビトロで治療戦略を評価するための潜在的なバイオマーカーであり得ることが企図される。
【0104】
図２３は、ＮＦ２患者ｉＳＣにおける幹細胞マーカー発現の増加を示す。ａ）免疫蛍光分析は、健常な（野生型ＮＦ２）対照ｉＳＣと比較して、３人のＮＦ２患者のうちの２人において幹細胞マーカーＳＯＸ２の発現の増加を示した。ｂ）ＤＡＰＩによって測定された細胞の総数にわたるＳＯＸ２陽性細胞の画像－Ｊ分析は、対応する患者由来ｉＳＣにおける高ＳＯＸ２陽性のパーセンテージの著しい増加を示した。したがって、ＳＯＸ２は、インビトロで治療戦略を評価するための潜在的なバイオマーカーであり得ることが企図される。
【0105】
健常な対照ｉＳＣをノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにＡＡＶ９．ＮＦ２．ＧＦＰベクター（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にＧＦＰ蛍光について分析した。４つのベクターは全て、ＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰベクター処理細胞でＧＦＰ発現を様々な強度で示し、処理細胞は、未処理の対照ｉＳＣと比較して、高い過剰発現を示した。（図２４）
【0106】
ＮＦ２患者由来ｉＳＣをノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにＡＡＶ９．ＮＦ２．ＧＦＰベクター（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にＧＦＰ蛍光について分析した。４つのベクターは全て、形質導入されていないｉＳＣ対照と比較して、様々な強度でＧＦＰ発現を示した。ＧＦＰ過剰発現を有するＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰベクター処理細胞は、形質導入対照として機能する。（図２５）
【0107】
健常な対照及びＮＦ２患者由来ｉＳＣを、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２、又はｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入（２５Ｋを播種、７２時間の形質導入）し、形質導入から７２時間後にｃ－Ｍｙｃ発現について分析した。図２６、ａ）免疫蛍光分析は、３つのベクター全てが、ＮＦ２患者由来ｉＳＣ及び健常な（野生型ＮＦ２）対照ｉＳＣにおける幹細胞マーカーｃ－Ｍｙｃの発現を低減させたことを示し、ｂ）ＤＡＰＩによって測定された細胞の総数にわたる高ｃ－Ｍｙｃ陽性細胞のＩｍａｇｅ－Ｊ分析は、ｓｃＡＡＶ９を示した。ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２処理は、他の２つのベクターと比較して、高ｃ－Ｍｙｃ陽性細胞の最も高い減少をもたらした。
【0108】
健常な対照及びＮＦ２患者由来ｉＳＣを、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２ ４００ｂｐ．ＮＦ２、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２ ６０９ｂｐ．ＮＦ２、又はｓｓＡＶ９．ＮＦ２ ２．１ｋｂ．ＮＦ２（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にＳＯＸ２発現について分析した（ｎ＝２）。免疫蛍光分析により、３つのベクター全てが、ＮＦ２患者由来ｉＳＣ及び健常な（野生型ＮＦ２）対照ｉＳＣにおける幹細胞マーカーＳＯＸ２の発現を低減させることが示された。（図２７）
【0109】
したがって、全ての患者ｉＳＣは、アルファ－チューブリンに対して正規化した場合、ＮＦ２レベルが低減している。患者ｉＳＣは、ＳＣ成熟能力が低下したようである。患者ｉＳＣライン２０５及び２０７は、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｏｘ２レベルの上昇を示す。ＡＡＶ９．４００ｂｐ．ＮＦ２及びＡＡＶ９．６０９ｂｐ．ＮＦ２の形質導入は、ｃ－ＭＹＣレベルを低減することができ、ＡＡＶ９．４００ｂｐ．ＮＦ２ベクターにおいて観察される効果が最高である。
【0110】
上述のように、腫瘍増殖を促進するためにＮＦ２遺伝子発現を更に低減させるために、レンチウイルスＮＦ２ ｓｈＲＮＡを使用して、ヒト患者において腫瘍形成細胞が経験する「セカンドヒット」を模倣するために、シュワン細胞分化の前にＮＦ２遺伝子発現を低減させることができる。加えて、シュワン細胞分化後のＮＦ２下方調節の有効性を、健常な対照及びＮＦ２由来誘導シュワン細胞に形質導入するために、同じレンチウイルスＮＦ２ ｓｈＲＮＡ構築物を使用することによっても試験した。
【0111】
ＮＦ２発現を低減するために、ＮＦ２配列５’－ＧＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＴＡ－３’（配列番号４７）を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＮＦ２）を設計し、Ｈ１プロモーターの制御下でＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＲＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ ２６００１）にクローニングした。得られたベクターは、Ｈ１プロモーターからのｓｈＮＦ２、及びｈＰＧＫプロモーターからのＨ２Ｂ－ＲＦＰを発現し、核ＲＦＰ発現をもたらす。ｉＳＣに、ＬＶ－ｓｈＮＦ２及びＬＶ－ＲＦＰ（形質導入対照）（１００ＭＯＩ）を形質導入し、これをＲＦＰベースのＦＡＣＳを使用して選別するのに十分な細胞が存在するまで増殖させた。選別後、細胞を、選別された形質導入細胞の後続の分析（ウエスタンブロット、ｑＰＣＲ及びＭＴＴ細胞増殖アッセイ、抗レトロウイルス薬物治療）のために再播種、増殖、及び維持した。
【0112】
ｓｈＮＦ２で直接ヒットした、選別されたｉＳＣは、ＮＦ２レベルの低減を示した。図２８、（Ａ）蛍光イメージングは、ＲＦＰ及びｓｈＮＦ２を発現する選別されたｉＳＣ（黒）を示した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ウエスタンブロットデータは、ＲＦＰ対照と比較して、ｓｈＮＦ２を形質導入された選別された健常なｉＳＣ及び患者ｉＳＣにおいて、ＮＦ２タンパク質レベルが４０～５０％減少することを示した。Ｔ検定：＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００。
【0113】
播種から４８時間後に分析した細胞増殖（ＭＴＴ）アッセイは、単一対立遺伝子変異型ＮＦ２患者ｉＳＣ及びＮＦ２二重ノックダウン患者ｉＳＣにおいて高い増殖率を示した。図２９、（Ａ）３つの単一対立遺伝子変異型ＮＦ２ ｉＳＣのうちの２つは、健常なｉＳＣより１．５倍速く増殖する。（Ｂ）ｓｈＮＦ２ノックダウン患者ｉＳＣは、健常なｓｈＮＦ２ノックダウンｉＳＣよりも２～３倍速く増殖する。（Ｃ）ＲＦＰ患者ｉＳＣ（単一対立遺伝子変異体）及びｓｈＮＦ２（ＮＦ２ダブルノックダウン）増殖は、抗レトロウイルス薬物治療後に健常なレベルに近づくように低減される。Ｔ検定：＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。
【0114】
したがって、誘導シュワン細胞におけるｓｈＲＮＡベースのＮＦ２の減少は、患者における腫瘍形成細胞の経験である「セカンドヒット」を模倣する。セカンドヒットを模倣するこの更なるＮＦ２の減少は、増殖アッセイによって示されるように、インビトロでの適切な腫瘍モデリングアプローチであることが企図される。遺伝子療法構築物の使用に加えて、これらの細胞は、ＮＦ２患者の治療選択肢のための抗レトロウイルス薬及び他の小分子薬の薬物スクリーニングのためであり得ることが企図される。
【0115】
患者由来の不死化ヒト腫瘍細胞
他の実験では、ｈＶＳ腫瘍細胞におけるＮＦ２発現の低減が示された。図３０、ａ）ウエスタンブロット分析は、健常なｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ及びｉＳＣと比較して、ｈＶＳ腫瘍細胞におけるＮＦ２の発現の低減を示した。ｂ）ｑＲＴ－ＰＣＲによるＮＦ２ ｍＲＮＡ発現分析は、健常なｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ、ｉＳＣ、及び線維芽細胞と比較して、ｈＶＳ腫瘍細胞におけるＮＦ２の対応する発現の低減も示した。
他の実験では、ｈＶＳ腫瘍細胞におけるＮＦ２発現の低減が示された。図３０、ａ）ウエスタンブロット分析は、健常なｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ及びｉＳＣと比較して、ｈＶＳ腫瘍細胞におけるＮＦ２の発現の低減を示した。ｂ）ｑＲＴ－ＰＣＲによるＮＦ２ ｍＲＮＡ発現分析は、健常なｉＡｓｔｒｏｃｙｔｅ、ｉＳＣ、及び線維芽細胞と比較して、ｈＶＳ腫瘍細胞におけるＮＦ２の対応する発現の低減も示した。
【0116】
ｈＶＳ腫瘍細胞の免疫蛍光分析は、（ａ）健常な線維芽細胞と比較して、総ＮＦ２の全体的な発現の低減を示した。重要なことに、腫瘍サプレッサー（リン酸化型）の不活性型について分析すると、ｈＶＳ腫瘍細胞は、（ｂ）健常な対照線維芽細胞と比較して、ホスホ－Ｓ５１８マーリンの発現の増加を示した。（図３１）
【0117】
ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析は、健常な対照線維芽細胞と比較して、ｈＶＳ腫瘍細胞における成熟シュワン細胞マーカー（Ｋｒｏｘ２０及びＭＢＰ）の発現は低減しているが、線維芽細胞マーカー（ＦＮ１及びＣｏｌ３Ａ）の発現は増加していることを示し、これは、ｈＶＳ腫瘍細胞が、成熟した、したがって機能的なシュワン細胞から遠く離れていることを示唆する。（図３２）
【0118】
ｈＶＳ腫瘍細胞における幹細胞マーカー発現が増加した。図３３、ａ）免疫蛍光分析は、健常な（野生型ＮＦ２）対照ｉＳＣと比較して、ｈＶＳ腫瘍細胞における幹細胞マーカーｃ－Ｍｙｃ及びＳＯＸ２の発現の増加を示した。ｂ）ＤＡＰＩによって測定された細胞の総数にわたるｃ－Ｍｙｃ又はＳＯＸ２陽性細胞のＩｍａｇｅ－Ｊ分析は、健常なｉＳＣと比較して、ｈＶＳ腫瘍細胞間で高いｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２陽性のパーセンテージを示した。したがって、ｃ－Ｍｙｃ及びＳＯＸ２は、インビトロで治療戦略を評価するためのバイオマーカーであることが企図される。
【0119】
ｈＶＳ腫瘍細胞をノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２ ６０９ｂｐ．ＮＦ２又はｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２ ２．１ｋｂ．ＮＦ２（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にｃ－Ｍｙｃ発現について分析した。図３４、ａ）免疫蛍光分析は、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２ ６０９ｂｐ．ＮＦ２処理が、ｈＶＳ腫瘍細胞における幹細胞マーカーｃ－Ｍｙｃの発現を低減させることを示した。ｂ）ＤＡＰＩによって測定された細胞の総数にわたる高ｃ－Ｍｙｃ陽性細胞のＩｍａｇｅ－Ｊ分析は、ｓｃＡＡＶ９を示した。ＮＦ２ ６０９ｂｐ．ＮＦ２処理は、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２ ２．１ｋｂ．ＮＦ２処理と比較して、高ｃ－Ｍｙｃ陽性細胞の高い減少をもたらした。
【0120】
ｈＶＳ腫瘍細胞をノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２ ６０９ｂｐ．ＮＦ２又はｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２ ２．１ｋｂ．ＮＦ２（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にｃ－Ｍｙｃ発現について分析した。図３５、ａ）免疫蛍光分析は、両方のベクターが、ｈＶＳ腫瘍細胞における幹細胞マーカーＳＯＸ２の発現を低減させることを示した。ｂ）ＤＡＰＩによって測定された細胞の総数にわたる高ｃ－Ｍｙｃ陽性細胞のＩｍａｇｅ－Ｊ分析は、ｓｃＡＡＶ９を示した。ＮＦ２ ６０９ｂｐ．ＮＦ２処理は、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２ ２．１ｋｂ．ＮＦ２処理と比較して、高ＳＯＸ２陽性細胞の高い減少をもたらした。
【0121】
したがって、ｈＶＳ腫瘍細胞は、ＮＦ２レベルを低減した。ｈＶＳ腫瘍細胞は、ＳＣ成熟能力が低減されたようである。ｈＶＳ腫瘍細胞は、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｏｘ２レベルの上昇を示した。ＡＡＶ９．６０９ｂｐ．ＮＦ２及びＡＡＶ９．２．１ｋｂ．ＮＦ２の形質導入は、ｃ－ＭＹＣレベルを低減することができる。
【0122】
まとめ
上記のモデルは、各変異について新しいマウスモデルの生成を必要としないが、特定のＮＦ２変異に対する、本明細書に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターを用いた遺伝子療法の有効性を実証する。更に、モデルは、可変性の高い患者集団における遺伝子療法及び相補的な治療的併用アプローチの同時評価を可能にする。
上記のモデルは、各変異について新しいマウスモデルの生成を必要としないが、特定のＮＦ２変異に対する、本明細書に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターを用いた遺伝子療法の有効性を実証する。更に、モデルは、可変性の高い患者集団における遺伝子療法及び相補的な治療的併用アプローチの同時評価を可能にする。
【0123】
実施例４
リン酸化抵抗性マーリンタンパク質を発現するｒＡＡＶの産生
マーリンタンパク質のリン酸化は、それを開放不活性コンフォメーションに変換し、他の細胞タンパク質と細胞骨格との結合を阻害し、かつ／又はユビキチン化によってその分解をもたらすことによって、その腫瘍サプレッサー活性を低減させることができる。したがって、遺伝子療法において必要に応じて使用するために、リン酸化抵抗性マーリンタンパク質も本明細書に提供される。
リン酸化抵抗性マーリンタンパク質を発現するｒＡＡＶの産生
マーリンタンパク質のリン酸化は、それを開放不活性コンフォメーションに変換し、他の細胞タンパク質と細胞骨格との結合を阻害し、かつ／又はユビキチン化によってその分解をもたらすことによって、その腫瘍サプレッサー活性を低減させることができる。したがって、遺伝子療法において必要に応じて使用するために、リン酸化抵抗性マーリンタンパク質も本明細書に提供される。
【0124】
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質は、リン酸化などの翻訳後陰性調節に抵抗性を有することができる。本明細書に提供される腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質は、配列番号１５の１０位のセリン、配列番号１５の２３０位のスレオニン、配列番号１５の３１５位のセリン、及び配列番号１５の５１８位のセリンのうちの１つ以上を、その位置での／その周りのリン酸化を防止するためにアラニンなどの別のアミノ酸で置き換えることによって、１つ以上のリン酸化部位が除去されている。アミノ酸置換は、例えば、マーリンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を変更することによって達成される。例えば、配列番号１の１６０９位のチミジンをグアノシンに変更すると、コードされたマーリンタンパク質中のセリン残基に対するアラニン残基の置換がもたらされる。配列番号１６は、リン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードするように、その位置にグアノシンを有するポリヌクレオチドを示す。配列番号１７～２０は、そのポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を示す。
【0125】
ＨＥＫ２９３細胞にｐＡＡＶ．ＮＦ２．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａプラスミドを一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションから７２時間後にＮＦ２発現を分析した。（ａ）ｐＡＡＶ．ＮＦ２．ＮＦ２ Ｓ５１８ＡプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ｐＡＡＶ．ＣＢ．ＧＦＰをトランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞と比較して、ＮＦ２ Ｓ５１８Ａの過剰発現を駆動する４つのプロモーター全てを示した。（ｂ）トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロット分析は、ｐＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰをトランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞に対するＮＦ２プロモーター依存性ＮＦ２ Ｓ５１８Ａの過剰発現を確認する。歴史的に、ＮＦ２ ｍＲＮＡの発現は、ＮＦ２タンパク質レベルと直接相関しておらず、ＮＦ２の更なる転写後調節を示唆している。
【0126】
リン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードするｒＡＡＶは、配列番号１７～２０に示される導入遺伝子を使用して、実施例１に記載されるように産生され、各導入遺伝子は、Ｓ５１８Ａ置換（５１８位でのセリンに対するアラニンの置換）をコードする。実施例１と同様に、４つの導入遺伝子は、異なるＮＦ２プロモーター：２．３ｋｂ、２．１ｋｂ、６１０ｂｐ（実際には６０９ｂｐ）、及び４００ｂｐ（図１）を含む。
【0127】
実施例５
膠芽腫におけるＮＦ２再発現のためのＡＡＶ９ベクターのインビトロ標的化効率
膠芽腫は、アストロサイトに由来する非常に悪性の腫瘍である。Ｕ８７ヒト膠芽腫細胞株は、ステージ３の４４歳の白人女性に由来した。マーリンは、Ｕ８７高悪性度膠芽腫における発現が低減している。
膠芽腫におけるＮＦ２再発現のためのＡＡＶ９ベクターのインビトロ標的化効率
膠芽腫は、アストロサイトに由来する非常に悪性の腫瘍である。Ｕ８７ヒト膠芽腫細胞株は、ステージ３の４４歳の白人女性に由来した。マーリンは、Ｕ８７高悪性度膠芽腫における発現が低減している。
【0128】
Ｕ８７膠芽腫細胞のウエスタンブロット分析は、健常な対照系と比較して、低いＮＦ２タンパク質発現を示した。（図３６ａ～ｂ）ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析は、Ｕ８７膠芽腫細胞におけるＮＦ２アイソフォーム１及び総ＮＦ２の発現が、健常な対照系と比較して低いことを示した。（図３７ａ～ｂ）
【0129】
Ｕ８７膠芽腫細胞をノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２又はｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にＮＦ２発現について分析した。図３８、ａ）ウエスタンブロット分析は、３つのベクター全てが、処理されたＵ８７膠芽腫細胞におけるＮＦ２発現を回復させることを示した。ｂ）ウエスタンブロット分析の定量化により、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２処理が、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２処理と比較して、Ｕ８７膠芽腫細胞におけるＮＦ２発現の高い増加をもたらしたことが明らかになる。
【0130】
Ｕ８７膠芽腫細胞をノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２又はｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にＮＦ２発現について分析した。ｍＲＮＡ発現分析を実行して、特定のＮＦ２アイソフォームを決定した。図３９、ａ～ｂ）ＮＦ２アイソフォーム１及び総ＮＦ２に特異的なプライマーを使用したｍＲＮＡ発現分析では、ＡＡＶ９．ＮＦ２処理されたＵ８７膠芽腫細胞における対応する増加が示された。ｃ）ベクター由来ＮＦ２転写物の分析では、ｓｓＡＡＶ９．ＮＦ２－２．１ｋｂ．ＮＦ２処理と比較して、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－６０９ｂｐ．ＮＦ２で処理したＵ８７膠芽腫細胞における高いＮＦ２発現を伴う処理Ｕ８７細胞におけるベクター特異的ＮＦ２の著しい増加が示された。しかしながら、タンパク質発現がより低い高ＲＮＡ発現は、ＮＦ２タンパク質が分解されている可能性があることを示唆し得る。
【0131】
Ｕ８７膠芽腫細胞をノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２（野生型ＮＦ２アイソフォーム１）又はｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａ（リン抵抗性ＮＦ２アイソフォーム１）（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にＮＦ２発現について分析した。図４０、ａ）ウエスタンブロット分析は、両方のベクターが、処理されたＵ８７膠芽腫細胞におけるＮＦ２発現を回復させることを示した。ｂ）ウエスタンブロット分析の定量化により、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１Ａ処理が、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２処理と比較して、Ｕ８７膠芽腫細胞におけるＮＦ２発現の更に高い増加をもたらしたことが明らかになる。
【0132】
Ｕ８７膠芽腫細胞を、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２（野生型ＮＦ２アイソフォーム１）又はｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａ（リン抵抗性ＮＦ２アイソフォーム１）（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から７２時間後にＮＦ２発現について分析した。ｍＲＮＡ発現分析を実行して、特定のＮＦ２アイソフォームを決定した。ＮＦ２アイソフォーム１（ａ）、総ＮＦ２（ｂ）、及びベクター由来のＮＦ２転写産物（ｃ）に特異的なプライマーを使用したｍＲＮＡ発現分析は、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａの両方で処理されたＵ８７膠芽腫細胞において著しく高い発現を示した。重要なことに、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａ処理は、Ｕ８７膠芽腫細胞において、高いＲＮＡ発現及び高いタンパク質発現をもたらした。（図４１）
【0133】
Ｕ８７膠芽腫細胞をノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理し、これにｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２（野生型ＮＦ２アイソフォーム１）、ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａ（リン抵抗性ＮＦ２アイソフォーム１）、又はｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＧＦＰ）形質導入対照のみ）（ＭＯＩ ３００Ｋ）を形質導入し、形質導入から１４４時間後にＭＴＴアッセイによって細胞増殖について分析した。図４２、ａ）ＮＡ処理及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＧＦＰ後の対照Ｕ８７膠芽腫細胞の明視野及び蛍光画像は、ＧＦＰ発現によって明らかなように、細胞密度及び効率的なｔＡＡＶ９形質導入を示した。ｂ）ｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２及びｓｃＡＡＶ９．ＮＦ２－４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａを形質導入されたＵ８７膠芽腫細胞は、ＮＡのみで処理した膠芽腫細胞及び未処理の膠芽腫細胞と比較して、減少した増殖速度を示した。
【0134】
したがって、ＡＡＶ９．４００ｂｐ．ＮＦ２及びＡＡＶ９．６０９ｂｐ．ＮＦ２は、ＮＦ２レベルの増加において最も有効であった。ＡＡＶ９．４００ｂｐ．ＮＦ２ ｃＤＮＡ及びＡＡＶ９．４００ｂｐ．ＮＦ２ Ｓ５１８Ａ形質導入は、膠芽腫増殖率を低減させる。ＮＦ２ ｍＲＮＡレベルは実際に高いが、検出されたＮＦ２の量は少ないため、リン酸化抵抗性ＮＦ２タンパク質が治療方法において有用であることも企図される。
【0135】
実施例で使用される様々な材料及び方法
ＡＡＶ構築物及びベクター産生：最終構築物は、様々なプロモーター（ＣＭＶエンハンサー／ベータ－アクチン（ＣＢ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、及びＮＦ２プロモーター）に隣接するＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＳＶ４０イントロン配列、並びにＧＦＰ、ＮＦ２、又はＮＦ２ Ｓ５１８Ａコード配列、続いてＢＧＨポリＡ配列を含有する。表１に列挙されたプライマーの組み合わせを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって、４つの切断型ＮＦ２プロモーター配列を増幅した。アンプリコンを使用して、制限酵素消化によってＣＢプロモーターをＫｐｎＩ及びＰｓｔＩ隣接配列に置き換え、ＧＦＰ発現を駆動するＮＦ２プロモーターを生成した。野生型ＮＦ２ ｃＤＮＡを発現する構築物を生成するために、完全長野生型ＮＦ２アイソフォーム１配列を、以下の表１に列挙されるプライマーを使用して、市販の発現プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ＳＣ１２４０２４）から増幅した。次いで、ＮＦ２アイソフォーム１配列を使用して、ＡｇｅＩ及びＢｓｒＧＩ隣接配列による制限酵素消化によって、４つのＮＦ２．ＧＦＰ構築物中のＧＦＰ ｃＤＮＡ配列を置き換えた。リン酸化抵抗性ＮＦ２ Ｓ５１８Ａを発現する構築物を生成するために、Ｓ５１８Ａ置換を付与する点突然変異を含むＮＦ２ ｃＤＮＡ配列を商業的に合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、増幅し、４つのＮＦ２．ＧＦＰ構築物中のＧＦＰ ｃＤＮＡ配列を、制限酵素消化によって、ＡｇｅＩ及びＢｓｒＧＩ隣接配列と置き換えて使用した。構築したＮＦ２プロモーター－ＮＦ２ ｃＤＮＡ及びＮＦ２プロモーター－ＧＦＰ ｃＤＮＡ発現カセットを、いずれかの方向のアンピシリン及びカナマイシン抵抗性遺伝子を用いて、順方向又は逆方向の自己相補型及び一本鎖ＡＡＶプラスミドにクローニングした。全てのベクターＤＮＡ構築物を、小規模ベクター産生（Ａｎｄｅｌｙｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）によってＡＡＶ９カプシド（自己コメント又は一本鎖）にパッケージ化する前に配列検証した。
ＡＡＶ構築物及びベクター産生：最終構築物は、様々なプロモーター（ＣＭＶエンハンサー／ベータ－アクチン（ＣＢ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、及びＮＦ２プロモーター）に隣接するＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＳＶ４０イントロン配列、並びにＧＦＰ、ＮＦ２、又はＮＦ２ Ｓ５１８Ａコード配列、続いてＢＧＨポリＡ配列を含有する。表１に列挙されたプライマーの組み合わせを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって、４つの切断型ＮＦ２プロモーター配列を増幅した。アンプリコンを使用して、制限酵素消化によってＣＢプロモーターをＫｐｎＩ及びＰｓｔＩ隣接配列に置き換え、ＧＦＰ発現を駆動するＮＦ２プロモーターを生成した。野生型ＮＦ２ ｃＤＮＡを発現する構築物を生成するために、完全長野生型ＮＦ２アイソフォーム１配列を、以下の表１に列挙されるプライマーを使用して、市販の発現プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ＳＣ１２４０２４）から増幅した。次いで、ＮＦ２アイソフォーム１配列を使用して、ＡｇｅＩ及びＢｓｒＧＩ隣接配列による制限酵素消化によって、４つのＮＦ２．ＧＦＰ構築物中のＧＦＰ ｃＤＮＡ配列を置き換えた。リン酸化抵抗性ＮＦ２ Ｓ５１８Ａを発現する構築物を生成するために、Ｓ５１８Ａ置換を付与する点突然変異を含むＮＦ２ ｃＤＮＡ配列を商業的に合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、増幅し、４つのＮＦ２．ＧＦＰ構築物中のＧＦＰ ｃＤＮＡ配列を、制限酵素消化によって、ＡｇｅＩ及びＢｓｒＧＩ隣接配列と置き換えて使用した。構築したＮＦ２プロモーター－ＮＦ２ ｃＤＮＡ及びＮＦ２プロモーター－ＧＦＰ ｃＤＮＡ発現カセットを、いずれかの方向のアンピシリン及びカナマイシン抵抗性遺伝子を用いて、順方向又は逆方向の自己相補型及び一本鎖ＡＡＶプラスミドにクローニングした。全てのベクターＤＮＡ構築物を、小規模ベクター産生（Ａｎｄｅｌｙｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）によってＡＡＶ９カプシド（自己コメント又は一本鎖）にパッケージ化する前に配列検証した。
【0136】
動物：実行した全ての手順は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のガイドラインに従い、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（株番号０００６６４；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＥ，ＵＳＡ）について実験を実行した。Ｐ０～Ｐ２の仔を、ＡＡＶ９ベクターの片側脳室内（ＩＣＶ）注射のために使用した。健康状態を確認するために動物について毎日評価を行い、分析のために注射から１ヶ月後に屠殺した。
【0137】
注射：Ｐ０～Ｐ２におけるマウスのＩＣＶ注射について、仔を氷上で１０分間麻酔した後、注射した。注射は、前述のように、ハミルトンシリンジを３３Ｇの針に取り付けて実行した。ＡＡＶ９ベクターを、用量を減らすために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。各動物について注射された総体積は、５μＬであった。
【0138】
細胞株：ヒト皮膚線維芽細胞を、ＮＦ２患者から得られた皮膚パンチ試料から単離した。試料採取前に全ての対象からインフォームドコンセントを得た。ヒト試料の受領は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄを通じて承認された。各患者に存在するヘテロ接合性ＮＦ２変異（Ｐ１～２０５、Ｐ２～２０７、及びＰ３～２０１）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００を使用したアンプリコン配列決定によって確認した。確立された皮膚線維芽細胞株を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、及び１％抗生物質－抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で培養及び増殖させた。
【0139】
不死化されたヒト前庭神経鞘腫（ｈＶＳ）細胞株は、以前に記載されていた［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１６（７）：ｅ０２５２０４８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２５２０４８（２０２１）］。ｈＶＳ細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１０％ ＦＢＳ及び１％抗生物質－抗真菌薬、１００μＭの組換えヒトＨＲＧ１－ベータ１（ＨＲＧ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、及び１０ｍＭのフォルスコリン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）中で培養した。組織培養処理プレートを、室温で３０分間、５０μｇ／ｍＬのポリ－Ｌ－リジン（７０～１５０ｋＤａ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び０．１Ｍのホウ酸、及び０．０１％のホウ酸塩でコーティングし、１×ＰＢＳで２回洗浄し、ｈＶＳ細胞を播種する前に、室温で３０分間、４μｇ／ｍＬのラミニンマウスタンパク質（Ｇｉｂｃｏ）でコーティングした。
【0140】
Ｕ８７膠芽腫細胞株（Ｄｅａｎ Ｌｅｅ，Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨから受領）及びＨＥＫ２９３ヒト胚性腎臓細胞を、１０％ ＦＢＳ及び１％抗生物質－抗真菌薬を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【0141】
線維芽細胞の誘導シュワン細胞への直接変換：Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）によって以前に記載された修飾プロトコルを使用して、患者線維芽細胞及び健常線維芽細胞を誘導シュワン細胞（ｉＳＣ）に直接変換した。簡潔に述べると、継代５～９の間の線維芽細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１０％ ＦＢＳ、及び１％抗生物質－抗真菌薬を補充したＤＭＥＭを用いて組織培養処理プレートに７９０細胞／ｃｍ２の密度で播種した。播種の２４時間後、血清を添加せずに培地をＤＭＥＭに交換し、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した。翌日、培地を、１０％のＦＢＳ及び３５ｎｇ／ｍｌのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭと交換し、この培地中で７２時間インキュベートした。その後、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で１回洗浄し、新鮮なｉＳＣ誘導培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、５％ ＦＢＳ、１％抗生物質－抗真菌薬、以下の少量の化学物質：５μＭのフォルスコリン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子－ＡＡ（ＰＤＧＦ－ＡＡ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び２００ｎｇ／ｍＬのＨＲＧを補充したＤＭＥＭ）中でインキュベートした。細胞を、この培地中でインキュベートし、増殖のために９０％コンフルエンスで分割し、その後、顕微鏡検査並びに分子及び細胞アッセイによって特徴付けた。
【0142】
ＧＦＰ及びＮＦ２発現の評価のためのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション：ＨＥＫ２９３細胞に１．５×１０６細胞／ウェルで６ウェルプレート（２×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度）に播種した。細胞に、塩化カルシウム処理によって、１．５μｇの精製プラスミド構築物を、８０％コンフルエンスでトランスフェクトした。簡潔に述べると、プラスミドＤＮＡを２５０ｍＭのＣａＣｌ２に添加し、穏やかに旋回させてから、等量の２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（ｐＨ７．０５）を各チューブに添加した。２ｍｌのトランスフェクション培地（ＤＭＥＭ ２％ ＦＢＳ）をプラスミド溶液に添加し、ピペットによって混合し、細胞に慎重に添加した。１２時間後、トランスフェクション混合物を新鮮な培地に置き換え、７２～９６時間インキュベートして、トランスフェクション構築物からのＧＦＰ又はＮＦ２の一過性発現を可能にした。細胞をトリプシン化によって採取し、ＧＦＰ及びＮＦ２発現についてのｑＰＣＲについてのウエスタンブロットによるその後の分析のために使用した。
【0143】
培養中の細胞のＡＡＶ形質導入：ｈＶＳ腫瘍細胞及びｉＳＣを、免疫染色による後続の分析のために、２５，０００細胞／ウェルのガラスカバースリップを有する２４ウェルプレートに播種した。Ｕ８７膠芽腫細胞を、ウエスタンブロット、ｑＰＣＲ、及びＭＴＴ細胞増殖アッセイによる分析のために、８０，０００細胞／ウェルで１２ウェルの組織培養プレートに播種した。全ての培養容器を、室温でＤＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチンで３０分間前処理して、細胞接着を増強した。翌日、細胞を、２％のＦＢＳ培地（ｈＶＳ）、５％のＦＢＳ培地（ｉＳＣ）、又は無血清培地（Ｕ８７）で３回慎重に洗浄し、次いで、３７℃／５％のＣＯ２で、１００ｍＵ／ｍＬのノイラミニダーゼ（ＮＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で２時間インキュベートした。ＮＡを慎重に除去し、細胞を上記のそれぞれの培地で再び３回洗浄し、３００，０００ＤＲＰ／ｍＬで培地中で希釈したＡＡＶベクターで処理した。プレートを４℃で１時間インキュベートした後、３７℃／５％ ＣＯ２の加湿インキュベーターに移した。形質導入から４８時間後に、新鮮な完全培地を細胞に添加し、形質導入細胞のその後の分析のために７２～９６時間までインキュベートを続けた。
【0144】
免疫蛍光染色：線維芽細胞、ｈＶＳ腫瘍細胞、及びｉＳＣを、ガラスカバースリップを有する２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を室温で４％パラホルムアルデヒドで１２分間固定し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、室温で１０％ヤギ血清、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＤＰＢＳで１時間ブロッキングした。次いで、細胞を、一次抗体中で、４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートした。全ての一次抗体をブロッキング溶液で希釈した。それぞれの希釈及び供給者を、以下の表２に列挙する。翌日、細胞をＤＰＢＳ中で３回洗浄し、室温でブロッキング溶液中で１時間希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でインキュベートした。ＤＰＢＳで３回洗浄した後、カバースリップを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いてスライド上に取り付け、密封した。画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｅ電動倒立顕微鏡及びＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェアでキャプチャした。高いｃ－Ｍｙｃ又はＳｏｘ２染色を有する細胞の定量は、ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉ画像処理及び分析ソフトウェアを使用して実行した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
【0145】
免疫組織化学：マウスの脳及び坐骨神経を、１０ｍＬの０．９％生理食塩水を経心臓灌流させた深く麻酔したマウスから切断した。脳を、切片化するまで４℃で４％ ＰＦＡ中に後固定し、水中５％アガロースを使用してビブラトームステージに取り付け、４０μｍの厚さで矢状に切断した。切片を、免疫染色まで４℃で保管するために、０．１Ｍ ＰＢＳと０．２％アジ化ナトリウムを含むマルチウェルプレートの隣接ウェルに順次配置した。次いで、切片を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中で３回洗浄し、次いで、１０％正常ロバ血清、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び０．０２％アジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ中で、室温で２時間ブロッキングした。切片を、ブロッキング溶液に希釈した一次抗体中で、４８時間、４℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした。使用される全ての抗体のそれぞれの希釈及びプロバイダを表２に列挙する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体中でインキュベートする前に、ＤＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング溶液中でＤＡＰＩを、穏やかに振盪しながら、室温で２時間希釈した。切片をＰＢＳ中で再度３回洗浄し、ＤＡＢＣＯアンチフェイディング（ＰＶＡ－ＤＡＢＣＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を有するポリビニルアルコール封入剤を用いてスライドに取り付け、密封した。
【0146】
坐骨神経を、４℃で２４時間、４％ ＰＦＡ中に後固定し、次いで、室温で２時間、ＰＢＳに移した。神経を、スクロース勾配（５％、１０％、２０％）中で３０分間、室温で５％及び１０％、並びにＤＰＢＳ中の２０％スクロース中で４℃で一晩インキュベートした。神経を、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋの最適冷却温度（ＯＣＴ）封入剤（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）に取り付け、１４μｍの厚さで－２０℃のクライオスタット内で切断し、顕微鏡スライドに取り付け、染色するまで－８０℃で保存した。染色は、スライドを室温で短時間温め、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗浄してから、抗体希釈緩衝液（ＡＤＢ；０．０２％アジ化ナトリウム及び０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＢＳ）で希釈した一次抗体を室温で一晩インキュベートすることによって実行した。スライドをＴＢＳ中で３回洗浄し、次いで、ＡＤＢ中で１時間室温で希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体中でインキュベートし、ＴＢＳ中で再び３回洗浄し、ＰＶＡ－ＤＡＢＣＯを用いて取り付け、密封した。
【0147】
脳切片及び坐骨神経の視覚化及びイメージングは、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｅ電動倒立顕微鏡及びＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェア、又はＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８００共焦点顕微鏡及びＺｅｉｓｓ ＺＥＮイメージングソフトウェアを用いて行った。
【0148】
ウエスタンブロット：細胞を、１×ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する放射免疫沈降（ＲＩＰＡ）溶解及び抽出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）で溶解した。組織試料を、１×ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＴ－ＰＥＲ（商標）組織タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でインキュベートし、次いで、３０Ｈｚに設定したＱＩＡＧＥＮ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩビーズミル（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、室温で２分間ホモジナイズした。溶解物を３～５秒間超音波処理し、次いで、４℃で２０分間、５０００×ｇで遠心分離した。総タンパク質を含有する上清を、メーカーのプロトコルに従って、洗剤適合性（ＤＣ）タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により定量化した。４０μｇの細胞／組織溶解物を、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填し、１２０Ｖで１時間実行した。タンパク質をＰＤＶＦ膜上に移し、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（登録商標）（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いて、室温で１時間ブロッキングした。ＮＦ２（ＡＢｃｌｏｎａｌ Ａ２４５６、１：２０００希釈）、ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ１３９７０、１：１０００希釈）、ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ３７４、１：５０００希釈）、及びα－チューブリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔ６０７４、１：５０００希釈）に対する一次抗体を、１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ）の１：１ブロッキング緩衝液／ＴＢＳＴで希釈し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１：１ブロッキング緩衝液／ＴＢＳ－Ｔで１時間、室温で、ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ８００又は６８０二次抗体（１：７０００希釈）とともにインキュベートした。ブロットをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＤＬｘ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用してイメージングし、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ（商標）Ｌｉｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して分析した。ＧＡＰＤＨ又はα－チューブリンをハウスキーピング遺伝子として使用して、ＮＦ２又はＧＦＰ発現を正規化した。
【0149】
定量的ＰＣＲ：ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出プロトコルを使用して、細胞ペレットから総ＲＮＡを単離した。次いで、ＲＮＡ試料を、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔを使用してＤＮＡｓｅ－Ｉ処理に供した。ＲＮＡの質及び濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度分析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。第１鎖ｃＤＮＡは、メーカーのプロトコルに従って、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ ＲＴ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、セットアップ当たり１０００μｇのＲＮＡを用いて生成した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、１μＬのＲＴ生成物、５００ｎＭのプライマー、１×Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びヌクレアーゼフリー水を使用して、総量２０μＬまで実行した。ＰＣＲは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルのサイクル条件で、９６ウェルプレートｑＰＣＲシステム（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行した。使用した遺伝子特異的プライマーを以下の表３に列挙する。各試料を３回実行し、正規化のためのハウスキーピング対照として内因性ＧＡＰＤＨ及びＲＰＬ１３Ａを用いた比較Ｃｔ（ΔΔＣＴ）法を使用して相対的なｍＲＮＡ発現を計算した。各実験について、少なくとも３つの生物学的反復を実行した。
【0150】
細胞増殖アッセイ（ＭＴＴ）：Ｕ８７細胞を、上記のようなＡＡＶ形質導入時に、５％ ＦＢＳ及び１％抗生物質－抗真菌薬を補充したＤＭＥＭ中で、１５００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に３回再播種した。ウェル当たりの代謝活性細胞の数は、ウェル当たり１０μＬのＭＴＴ標識試薬を添加し、３７℃で４時間インキュベートし、１０μＬの可溶化緩衝液を添加し、３７℃で一晩インキュベートすることによって、細胞増殖キットＩ（ＭＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用して播種後４８時間で測定した。５７５ｎｍでの吸光度値を比色プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ２；ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で測定し、Ｇｅｎ５データ収集及び分析ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して分析した。平均吸光度をセットアップごとに計算し、ＮＡのみで処理した細胞に対して正規化した。
【0151】
統計分析：全ての統計的検定は、２つのセットアップ間の差を測定するために、不対両側ｔ検定によって実行した。全ての定量的実験からのデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示される。全ての検定において、有意性値は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１として定義した。グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０ソフトウェアを使用して生成した。
【表1】
【表2】
【表3】
【0152】
本発明を特定の実施形態に関して説明してきたが、当業者には、その変更及び修正が想起されることが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるようなかかる限定のみが本発明に課されるべきである。
【0153】
本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする導入遺伝子を、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性を必要とする対象に送達する方法であって、前記導入遺伝子を含む遺伝子療法ベクターを、静脈内送達、腫瘍内送達、又は髄腔内送達によって前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
少なくとも１つの欠陥ＮＦ２対立遺伝子を有する対象に、腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする導入遺伝子を送達することを含み、前記方法が、前記導入遺伝子を含む遺伝子療法ベクターを、静脈内送達、腫瘍内送達、又は髄腔内送達によって前記対象に投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記導入遺伝子が、前記対象のシュワン細胞若しくは髄膜細胞、又は両方に送達される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記投与が、前記対象における悪性膠芽腫を治療する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記投与が、前記対象における神経線維腫症２型を治療する、項目２又は３に記載の方法。
（項目６）
前記投与が、前記対象における腫瘍、難聴、耳鳴症、平衡障害、顔面の脱力又は痺れ、視覚障害、白内障、発作、及び脳幹圧迫のうちの１つ以上を緩和する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記腫瘍が、シュワン腫、髄膜腫、上衣腫、又は他の脳神経腫瘍のうちの１つ以上である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記導入遺伝子が、腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記導入遺伝子が、腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記遺伝子療法ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴ、Ａｎｃ８０、若しくはＡＡＶ７ｍ８血清型ベクター、又はその誘導体である、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与され、前記方法が、前記遺伝子療法ベクターの投与後に前記対象をトレンデレンブルグ体位に置くことを更に含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記遺伝子療法ベクターが、腫瘍内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記遺伝子療法ベクターが、静脈内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与され、前記方法が、前記遺伝子療法ベクターの投与後に前記対象をトレンデレンブルグ体位に置くことを更に含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、導入遺伝子。
（項目１８）
腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、導入遺伝子。
（項目１９）
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（項目２０）
腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（項目２１）
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴ、Ａｎｃ８０、若しくはＡＡＶ７ｍ８血清型ベクター、又はその誘導体である、項目１９又は２０に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（項目２２）
ＡＡＶ９である、項目２１に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする導入遺伝子を、マーリンタンパク質腫瘍サプレッサー活性を必要とする対象に送達する方法であって、前記導入遺伝子を含む遺伝子療法ベクターを、静脈内送達、腫瘍内送達、又は髄腔内送達によって前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
少なくとも１つの欠陥ＮＦ２対立遺伝子を有する対象に、腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする導入遺伝子を送達することを含み、前記方法が、前記導入遺伝子を含む遺伝子療法ベクターを、静脈内送達、腫瘍内送達、又は髄腔内送達によって前記対象に投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記導入遺伝子が、前記対象のシュワン細胞若しくは髄膜細胞、又は両方に送達される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記投与が、前記対象における悪性膠芽腫を治療する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記投与が、前記対象における神経線維腫症２型を治療する、項目２又は３に記載の方法。
（項目６）
前記投与が、前記対象における腫瘍、難聴、耳鳴症、平衡障害、顔面の脱力又は痺れ、視覚障害、白内障、発作、及び脳幹圧迫のうちの１つ以上を緩和する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記腫瘍が、シュワン腫、髄膜腫、上衣腫、又は他の脳神経腫瘍のうちの１つ以上である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記導入遺伝子が、腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記導入遺伝子が、腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記遺伝子療法ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴ、Ａｎｃ８０、若しくはＡＡＶ７ｍ８血清型ベクター、又はその誘導体である、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与され、前記方法が、前記遺伝子療法ベクターの投与後に前記対象をトレンデレンブルグ体位に置くことを更に含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記遺伝子療法ベクターが、腫瘍内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記遺伝子療法ベクターが、静脈内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記遺伝子療法ベクターが、髄腔内送達によって投与され、前記方法が、前記遺伝子療法ベクターの投与後に前記対象をトレンデレンブルグ体位に置くことを更に含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、導入遺伝子。
（項目１８）
腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、導入遺伝子。
（項目１９）
腫瘍サプレッサー活性を有するマーリンタンパク質をコードする配列番号１、６、７、８、若しくは９のポリヌクレオチド、又は配列番号１、６、７、８、若しくは９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（項目２０）
腫瘍サプレッサー活性を有するリン酸化抵抗性マーリンタンパク質をコードする配列番号１６、１７、１８、１９、２０のポリヌクレオチド、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（項目２１）
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴ、Ａｎｃ８０、若しくはＡＡＶ７ｍ８血清型ベクター、又はその誘導体である、項目１９又は２０に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（項目２２）
ＡＡＶ９である、項目２１に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【配列表】
【国際調査報告】