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特表2024-515651選択マーカーのないプラスミドシステム及びその生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】選択マーカーのないプラスミドシステム及びその生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240403BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20240403BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240403BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20240403BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/70 Z
C12N1/21
C12P19/34
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563241
(86)(22)【出願日】2021-11-25
(85)【翻訳文提出日】2023-10-16
(86)【国際出願番号】 CN2021133141
(87)【国際公開番号】W WO2022217934
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】202110413747.X
(32)【優先日】2021-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】519241381
【氏名又は名称】ナンジン、ジェンスクリプト、バイオテック、カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＪＩＮＧ ＧＥＮＳＣＲＩＰＴ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】２８ Ｙｏｎｇｘｉ Ｒｏａｄ，Ｊｉａｎｇｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１１１００ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110003421
【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ファン、チョウ
(72)【発明者】
【氏名】イーファン、リー
(72)【発明者】
【氏名】ルー、チャン
(72)【発明者】
【氏名】ホン、リー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CA19
4B064CC24
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、選択マーカーのないプラスミドを製造するための前駆体プラスミドを提供し、該前駆体プラスミドは、１） 複製開始部位と、２） 選択マーカー遺伝子と、３） 標的遺伝子又は前記標的遺伝子に挿入するためのクローニング部位と、４） 対になった組換え部位とを含む。これらの対になった組換え部位により、前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができる。該娘プラスミドは、複製開始部位と、クローニング部位又は標的遺伝子とを含む。該環状二本鎖ＤＮＡは、選択マーカー遺伝子を含む。本発明は、前駆体プラスミドを用いて、選択マーカーのないプラスミドを製造する方法をさらに提供した。製造された選択マーカーのないプラスミドは、プラスミドの安全性を向上させるために、ＤＮＡ送達ベクター又はウイルスパッケージングプラスミドベクターとして、遺伝子及び細胞療法分野に用いられ得る。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
前駆体プラスミドであって、１） 複製開始部位と、
２） 選択マーカー遺伝子と、
３） 標的遺伝子又は前記標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位と、
４） 対になった組換え部位とを含み、ここで、
前記対になった組換え部位により、前記前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができ、
前記娘プラスミドは、前記複製開始部位と前記標的遺伝子とを含むか、又は前記複製開始部位と前記クローニング部位とを含み、そして、
前記環状二本鎖ＤＮＡは、前記選択マーカー遺伝子を含む、前駆体プラスミド。
【請求項2】
前記対になった組換え部位の配列は、同一方向である、請求項１に記載の前駆体プラスミド。
【請求項3】
前記複製開始部位は、前記標的遺伝子又は前記クローニング部位に隣接し、前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位並びに前記標的遺伝子の上流及び下流に隣接し、又は前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位及び前記クローニング部位の上流及び下流に隣接する、請求項１又は２に記載の前駆体プラスミド。
【請求項4】
前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘＰ配列、同一方向のＦＲＴ配列及び同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項5】
前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列である、請求項４に記載の前駆体プラスミド。
【請求項6】
前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項7】
前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、請求項６に記載の前駆体プラスミド。
【請求項8】
ｒｏｐ遺伝子配列、エンドヌクレアーゼのコード配列及びプラスミド複製ヘルパータンパク質のコード配列のうちの一つ又は複数をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項9】
前記選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である、請求項１～８のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項10】
他のプラスミド骨格配列をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項11】
前記リコンビナーゼのコード遺伝子をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項12】
前記前駆体プラスミドは、適切な条件下で、前記リコンビナーゼを発現することができる、請求項１１に記載の前駆体プラスミド。
【請求項13】
前記環状二本鎖ＤＮＡは、ｒｏｐ遺伝子配列、他のプラスミド骨格配列及び前記リコンビナーゼのコード遺伝子のうちの一つ又は複数をさらに含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項14】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の前駆体プラスミドの、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドの製造における用途。
【請求項16】
選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造する方法であって、１） 請求項１～１４のいずれか一項に記載の前駆体プラスミドを、前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞に導入し、前記選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞をスクリーニングすることと、
２） ステップ１） でスクリーニングされた宿主細胞を培養して、前記リコンビナーゼの前記宿主細胞での発現を可能にし、前記宿主細胞を培養し、前記選択マーカー遺伝子を発現しない宿主細胞をスクリーニングすることと、
３）前記娘プラスミドを得るために、ステップ２） でスクリーニングされた宿主細胞を培養し、プラスミドを抽出することとを含む、方法。
【請求項17】
前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項19】
前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記前駆体プラスミドは、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、且つ前記前駆体プラスミドは、前記宿主細胞で前記リコンビナーゼを発現することができる、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記リコンビナーゼは、前記宿主細胞内で誘導的に発現される、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む、請求項１９又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記宿主細胞は、大腸菌である、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造するためのセットであって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の前駆体プラスミドを含む、セット。
【請求項25】
前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞をさらに含む、請求項２４に記載のセット。
【請求項26】
前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、前記リコンビナーゼはｐｈｉＣ３１リコンビナーゼである、請求項２４又は２５に記載のセット。
【請求項27】
前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のセット。
【請求項28】
前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のセット。
【請求項29】
前記リコンビナーゼは、前記宿主細胞で誘導的に発現される、請求項２５～２８のいずれか一項に記載のセット。
【請求項30】
前記発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む、請求項２８又は２９に記載のセット。
【請求項31】
前記宿主細胞は、大腸菌である、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のセット。
【請求項32】
標的遺伝子を前記クローニング部位に挿入することにより、組換えてから形成された前記娘プラスミドは、前記標的遺伝子を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載のセット。
【請求項33】
複製開始部位と標的遺伝子とを含む娘プラスミドであって、抗生物質耐性遺伝子を含まない、娘プラスミド。
【請求項34】
前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、請求項３３に記載の娘プラスミド。
【請求項35】
前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、請求項３３又は３４に記載の娘プラスミド。
【請求項36】
前記標的遺伝子は、プロモーター、タンパク質を発現するコード遺伝子及びターミネーターの配列のうちの一つ又は複数を含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の娘プラスミド。
【請求項37】
宿主細胞内で複製され得る、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の娘プラスミド。
【請求項38】
スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記宿主細胞内で複製することができる、請求項３７に記載の娘プラスミド。
【請求項39】
請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法によって得られた娘プラスミド。
【請求項40】
請求項３３～３９のいずれか一項に記載の娘プラスミドを含む宿主細胞であって、前記娘プラスミドは、前記宿主細胞内で複製することができる、宿主細胞。
【請求項41】
前記娘プラスミドは、培養、収集及び抽出によって前記宿主細胞から得られる、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項42】
スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記娘プラスミドを増幅することができる、請求項４０又は４１に記載の宿主細胞。
【請求項43】
請求項３３～３９のいずれか一項に記載の娘プラスミドを含む組成物であって、前記娘プラスミドの含有量は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、組成物。
【請求項44】
前記組成物における娘プラスミドの含有量を測定するための方法は、ＮＧＳ分析方法又はゲル電気泳動イメージング分析方法である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項45】
前記ＮＧＳ分析方法によって測定された前記組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、請求項４３又は４４に記載の組成物。
【請求項46】
前記ゲル電気泳動イメージング分析方法によって測定された前記組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はプラスミドに関し、且つマーカーのないプラスミドを製造するための前駆体プラスミドに関する。本発明は、該マーカーのないプラスミドを製造するための方法及び該マーカーのないプラスミドを製造するためのセット（キット）にさらに関する。
【背景技術】
【0002】
近年来、遺伝子及び細胞療法技術は、ヒト疾患を治療する新たな重要な方法となってきている。安全で効率的なＤＮＡ送達ベクターは、将来のヒト疾患の予防及び治療において、遺伝子及び細胞療法がより大きな役割を果たすことを可能にする。過去二十年間、プラスミドベクターに基づく非ウイルス送達システム及びプラスミドに基づくウイルスパッケージング／送達システムは、遺伝子欠損の修復、疾患の治療及び予防などの面で広く注目されてきた。プラスミドの安全性、安定性及び収量の向上、並びに細胞傷害性の低下は、遺伝子及び細胞療法の分野におけるプラスミドの研究の主要な方向となっている。
【0003】
遺伝子療法に使用されるプラスミドＤＮＡ分子は、通常、真核転写ユニットと原核複製ユニットとを含むモジュール化構造を有する。ＤＮＡ複製に必要な配列に加えて、従来のプラスミドは、通常、クローニングプロセスにおける陽性クローンスクリーニング及び遺伝の安定化に有利であることを確保するために、少なくとも一つの抗生物質耐性遺伝子を有する。よく使用される選択マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、テトラサイクリンなどを含む［１］。しかし、遺伝子療法に適用される場合、プラスミドＤＮＡが、気道又は消化管の表面に存在する細菌に吸収され、プラスミドに担持される抗生物質耐性遺伝子が患者に抗生物質耐性などの副作用を引き起こす可能性がある。そのため、従来のプラスミドの有害な副作用は、抗生物質耐性遺伝子のないプラスミドの開発を促した。
【0004】
現在広く使用されている、抗生物質耐性遺伝子のないプラスミドは、主に以下のものを含む。１） ミニサークル（環状ＤＮＡ分子）。ミニサークルは、大腸菌において自己組換えを起こし、標的遺伝子配列のみを含む環状ＤＮＡ分子、及び複製能力を有する抗生物質耐性遺伝子含有の小さいプラスミドを形成することによって、組換え部位を含有する従来のプラスミドから派生する。ミニサークルは、最も短いプラスミド骨格配列を有するが、複製能力が不足であり、組換え効率及び精製手段に制限されるため、製造プロセスが煩雑であり、収量及び純度が低く、大量生産が困難である［２］。２） ＲＮＡ－ＯＵＴ選択技術に基づくプラスミド。このようなプラスミドは、ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンス鎖をコードして宿主菌株のネガティブ選択遺伝子ＳａｃＢの発現を抑制することによって、ショ糖を含有する培地上で形質転換された陽性クローンを成長させてスクリーニングすることができる［３］。このようなスクリーニングシステムは、生産規模の拡大が容易である。プラスミド骨格は、ＤＮＡ複製エレメント及びＲＮＡ－ＯＵＴエレメントを含有し、配列（４５０－５００ ｂｐ）がミニサークルよりも複雑である。
【発明の概要】
【0005】
一態様によれば、本発明は、前駆体プラスミドを提供し、該前駆体プラスミドは、
１） 複製開始部位と、
２） 選択マーカー遺伝子と、
３） 標的遺伝子又は前記標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位と、
４） 対になった組換え部位とを含み、ここで、
これらの対になった組換え部位により、該前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができ、
該娘プラスミドは、該複製開始部位と該標的遺伝子とを含むか、又は該複製開始部位と該クローニング部位とを含み、且つ該環状二本鎖ＤＮＡは、選択マーカー遺伝子を含む。
１） 複製開始部位と、
２） 選択マーカー遺伝子と、
３） 標的遺伝子又は前記標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位と、
４） 対になった組換え部位とを含み、ここで、
これらの対になった組換え部位により、該前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができ、
該娘プラスミドは、該複製開始部位と該標的遺伝子とを含むか、又は該複製開始部位と該クローニング部位とを含み、且つ該環状二本鎖ＤＮＡは、選択マーカー遺伝子を含む。
【0006】
いくつかの実施例において、対になった組換え部位の配列は同一方向である。
【0007】
いくつかの実施例において、複製開始部位は、標的遺伝子又はクローニング部位に隣接し、対になった組換え部位は、それぞれ複製開始部位並びに標的遺伝子の上流及び下流に隣接し、又はこれらの対になった組換え部位は、それぞれ複製開始部位並びにクローニング部位の上流及び下流に隣接する。いくつかの好ましい実施例において、複製開始部位は、標的遺伝子又はクローニング部位に隣接し、対になった組換え部位は、それぞれ該「複製開始部位 － 標的遺伝子」の両端に位置し、又はこれらの対になった組換え部位は、それぞれ該「複製開始部位 － クローニング部位」の両端に位置する。いくつかの他の好ましい実施例において、複製開始部位は、標的遺伝子又はクローニング部位の片端に位置し、対になった組換え部位は、それぞれ該「複製開始部位 － 標的遺伝子」の両端に位置し、又はこれらの対になった組換え部位は、それぞれ該「複製開始部位 － クローニング部位」の両端に位置する。
【0008】
いくつかの実施例において、対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘＰ配列、同一方向のＦＲＴ配列又は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列である。
【0009】
いくつかの実施例において、対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列である。いくつかの実施例において、対になった組換え部位は、同一方向のａｔｔＢ配列及びａｔｔＰ配列である。
【0010】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、一対又は複数対の対になった組換え部位を含んでもよい。実施例において、前駆体プラスミドは、一対の対になった組換え部位を含む。別の実施例において、前駆体プラスミドは、少なくとも二対の対になった組換え部位を含む。
【0011】
いくつかの実施例において、複製開始部位は、細菌又はファージの複製開始部位からのものであってもよい。いくつかの特定の実施例において、複製開始部位は、細菌の複製開始部位である。いくつかの好ましい実施例において、複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される。いくつかの実施例において、複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む。いくつかの他の実施例において、複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３、４４、４５又は４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施例において、複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３、４４、４５又は４６に示すヌクレオチド配列を含む。特定の実施例において、複製開始部位のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３、４４、４５又は４６に示すとおりである。
【0012】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、ｒｏｐ（プライマーリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ））遺伝子配列、エンドヌクレアーゼのコード配列及びプラスミド複製ヘルパータンパク質のコード配列をさらに含む。エンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩであってもよい。プラスミド複製ヘルパータンパク質は、πタンパク質であってもよい。いくつかの他の実施例において、環状二本鎖ＤＮＡは、ｒｏｐ遺伝子配列、エンドヌクレアーゼのコード配列及びプラスミド複製ヘルパータンパク質のコード配列のうちの一つ又は複数を含む。
【0013】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、他のプラスミド骨格配列を含む。いくつかの他の実施例において、環状二本鎖ＤＮＡは、他のプラスミド骨格配列を含む。
【0014】
いくつかの実施例において、選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの他の実施例において、選択マーカー遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン又はテトラサイクリンに耐性を有する遺伝子から選択される。
【0015】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、リコンビナーゼのコード遺伝子をさらに含む。いくつかの他の実施例において、環状二本鎖ＤＮＡは、リコンビナーゼのコード遺伝子を含んでもよい。いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、適切な条件下で、リコンビナーゼを発現することができる。適切な条件は、前駆体プラスミドによるリコンビナーゼの発現を可能にする任意の条件であってもよく、例えば、適切な宿主細胞、成長条件、誘導条件などを含んでもよい。リコンビナーゼのコード遺伝子を加えて、前駆体プラスミドは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのような、該リコンビナーゼを発現するのに必要なエレメントをさらに含んでもよい。
【0016】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列を含む。実施例において、前駆体プラスミドのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すとおりである。
【0017】
別の態様によれば、本発明は、前述の前駆体プラスミドの、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドの製造における用途を提供した。
【0018】
別の態様によれば、本発明は、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造するための方法を提供し、該方法は、１） 前述の前駆体プラスミドを、リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞に導入し、選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞をスクリーニングすることと、２） ステップ１） でスクリーニングされた宿主細胞を培養して、リコンビナーゼの該宿主細胞での発現を可能にし、及び該宿主細胞を培養し、選択マーカー遺伝子を発現しない宿主細胞をスクリーニングすることと、３） 娘プラスミドを得るために、ステップ２） でスクリーニングされた宿主細胞を培養し、プラスミドを抽出することとを含む。
【0019】
いくつかの実施例において、製造方法は、ステップ１） の前に、前述の前駆体プラスミドを取得するか又は製造するステップをさらに含む。
【0020】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、複製開始部位と、選択マーカー遺伝子と、標的遺伝子と、対になった組換え部位とを含む。これらの対になった組換え部位により、前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができる。娘プラスミドは、複製開始部位と、標的遺伝子とを含む。環状二本鎖ＤＮＡは、選択マーカー遺伝子を含む。いくつかの実施例において、娘プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。
【0021】
いくつかの実施例において、対になった組換え部位の配列は同一方向である。
【0022】
いくつかの実施例において、対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つリコンビナーゼはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである。
【0023】
いくつかの実施例において、対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。いくつかの他の実施例において、対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼである。いくつかの実施例において、対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つリコンビナーゼはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである。
【0024】
いくつかの実施例において、複製開始部位は、細菌又はファージの複製開始部位からのものである。いくつかの特定の実施例において、複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される。いくつかの他の実施例において、複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む。
【0025】
いくつかの実施例において、選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの他の実施例において、選択マーカー遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン又はテトラサイクリンに耐性を有する遺伝子から選択される。
【0026】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、且つ前駆体プラスミドは、宿主細胞で該リコンビナーゼを発現することができる。
【0027】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの他の実施例において、前駆体プラスミドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列を含む。実施例において、前駆体プラスミドのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すとおりである。
【0028】
いくつかの実施例において、宿主細胞は、そのゲノムにリコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は該宿主細胞は、該リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む。
【0029】
いくつかの実施例において、リコンビナーゼは、宿主細胞内で誘導的に発現される。いくつかの他の特定の実施例において、宿主細胞は、誘導型プロモーターを含み、且つ該誘導型プロモーターにより、リコンビナーゼは、誘導物の存在下で誘導的に発現され得る。例えば、誘導型プロモーターは、ラクトースプロモーター（ラクトースオペロン）、アラビノースプロモーター（アラビノースオペロン）、温度誘導型プロモーター、金属イオン誘導型プロモーターなどであってもよい。いくつかの他の実施例において、リコンビナーゼ遺伝子は、誘導型プロモーター及びリコンビナーゼコード遺伝子を含有するプラスミドを介して宿主細胞ゲノムに組み込まれる。組み込み方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法を含むが、それに限らない。
【0030】
いくつかの実施例において、発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む。いくつかの特定の実施例において、発現ベクターは、温度感受性レプリコン及び金属イオンレプリコンのような、条件的誘導欠失型レプリコンを含む。誘導条件下で、発現ベクターは、複製機能を失い、宿主細胞内で徐々に失われる。
【0031】
いくつかの実施例において、宿主細胞は、大腸菌である。例えば、宿主細胞は、大腸菌ＪＭ１０８、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＧＴ１１５、ｐｉｒ１、ｐｉｒ２など、及び関連菌株から派生した他の改変された菌株であってもよい。
【0032】
前述の前駆体プラスミドの全ての定義及び技術的特徴は、いずれも娘プラスミドの製造方法における前駆体プラスミドに適用され、全て本明細書に組み込まれる。詳細な内容は、これ以上説明しない。
【0033】
なお、本発明は、前述の製造方法によって得られた娘プラスミドを含む。
【0034】
別の態様によれば、本発明は、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造するためのセットを提供し、該セットは、前述の前駆体プラスミドを含む。
【0035】
いくつかの実施例において、セットは、リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞をさらに含む。宿主細胞は、大腸菌である。例えば、宿主細胞は、大腸菌ＪＭ１０８、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＧＴ１１５、ｐｉｒ１、ｐｉｒ２など、及び関連菌株から派生した他の改変された菌株であってもよい。
【0036】
いくつかの実施例において、前駆体プラスミドにおいて、対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つリコンビナーゼはｐｈｉＣ３１リコンビナーゼである。実施例において、対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。別の実施例において、対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼである。
【0037】
いくつかの実施例において、宿主細胞は、そのゲノムにリコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は該宿主細胞は、該リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む。
【0038】
いくつかの実施例において、リコンビナーゼは、宿主細胞内で誘導的に発現される。いくつかの他の特定の実施例において、宿主細胞は、誘導型プロモーターを含み、且つ該誘導型プロモーターにより、リコンビナーゼは、誘導物の存在下で誘導的に発現され得る。例えば、誘導型プロモーターは、ラクトースプロモーター（ラクトースオペロン）、アラビノースプロモーター（アラビノースオペロン）、温度誘導型プロモーター、金属イオン誘導型プロモーターなどであってもよい。リコンビナーゼ遺伝子は、誘導型プロモーター及びリコンビナーゼコード遺伝子を含有するプラスミドを介して宿主細胞ゲノムに組み込まれる。組み込み方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法を含むが、それに限らない。
【0039】
いくつかの実施例において、発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む。いくつかの特定の実施例において、発現ベクターは、温度感受性レプリコン及び金属イオンレプリコンのような、条件的誘導欠失型レプリコンを含む。
【0040】
いくつかの実施例において、標的遺伝子をクローニング部位に挿入することにより、組換えてから形成された娘プラスミドは、該標的遺伝子を含む。
【0041】
前述の前駆体プラスミドの全ての定義及び技術的特徴は、いずれも前述のセットにおける前駆体プラスミドに適用され、全て本明細書に組み込まれる。詳細な内容は、これ以上説明しない。
【0042】
さらに別の態様によれば、本発明は、複製開始部位と標的遺伝子とを含む娘プラスミドを提供し、ここで、該娘プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。いくつかの実施例において、娘プラスミドは、選択マーカー遺伝子を含まない。いくつかの実施例において、娘プラスミドは、実質的に、複製開始部位及び標的遺伝子からなる。
【0043】
いくつかの実施例において、複製開始部位は、細菌又はファージの複製開始部位からのものである。いくつかの他の実施例において、複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される。いくつかの他の実施例において、複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む。
【0044】
いくつかの実施例において、標的遺伝子は、プロモーター、発現タンパク質のコード遺伝子及びターミネーターの配列を含む。いくつかの他の実施例において、標的遺伝子は、発現タンパク質のコード遺伝子を含み、且つプロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどをさらに含んでもよい。
【0045】
いくつかの実施例において、娘プラスミドは、宿主細胞内で複製することができる。宿主細胞は、大腸菌である。例えば、宿主細胞は、大腸菌ＪＭ１０８、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＧＴ１１５、ｐｉｒ１、ｐｉｒ２など、及び関連菌株から派生した他の改変された菌株であってもよい。娘プラスミドは、宿主細胞内で発酵し培養され、そしてプラスミド抽出によって得られる。該方法は、生産要求を満たすために、大量生産することができる。
【0046】
さらに別の態様によれば、本発明は、前述の娘プラスミドを含む宿主細胞をさらに提供し、ここで、該娘プラスミドは、該宿主細胞内で複製することができる。いくつかの実施例において、娘プラスミドは、培養、収集及び抽出によって宿主細胞から得られる。
【0047】
前述の娘プラスミドの全ての定義及び技術的特徴は、いずれも宿主細胞における娘プラスミドに適用され、全て本明細書に組み込まれる。詳細な内容は、これ以上説明しない。
【0048】
さらに別の態様によれば、本発明は、前述の娘プラスミドを含む組成物をさらに提供し、ここで、該娘プラスミドの含有量は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。
【0049】
いくつかの実施例において、娘プラスミドの含有量を測定するための方法は、ＮＧＳ分析方法又はゲル電気泳動イメージング分析方法である。実施例において、該娘プラスミドの含有量は、組成物に対してＮＧＳ分析を行うことにより、組成物における娘プラスミドの配列の割合によって確定される。いくつかの実施例において、ＮＧＳ分析方法によって測定された組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。実施例において、ＮＧＳ分析方法によって測定された組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９８％である。別の実施例において、ＮＧＳ分析方法によって測定された組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９９％である。いくつかの実施例において、組成物は、ＮＧＳ分析方法を用い、ここで、耐性遺伝子配列の含有量は、０．１％、０．０８％、０．０６％、０．０４％、０．０２％、０．０１％又は０．００８％より小さい。いくつかの他の実施例において、組成物は、ＮＧＳ分析方法を用い、ここで、宿主細胞ゲノムの含有量は、１０％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％より小さい。いくつかの他の実施例において、ＮＧＳ分析方法によって組成物を分析し、ここで、標的娘プラスミドが該組成物の９０％超を占め、耐性遺伝子配列の残留が０．０２％未満であり、且つ宿主細胞ゲノムの含有量が５％未満である。
【0050】
別の実施例において、該娘プラスミドの含有量は、組成物に対してゲル電気泳動イメージング分析を行うことにより、ゲルイメージングにおけるスーパーコイルモノマー形態の娘プラスミドの該当する位置のバンド輝度によって確定される。いくつかの実施例において、ゲル電気泳動イメージング分析方法によって測定された組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。実施例において、ゲル電気泳動イメージング分析方法によって測定された組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９０％である。
【0051】
前駆体プラスミドを用いて製造された、選択マーカーのないプラスミドは、ＤＮＡ送達ベクター又はウイルスパッケージングプラスミドベクターとして、プラスミドの安全性を向上させるために、遺伝子及び細胞療法分野に用いられ得る。ミニサークルに比べて、本発明に係る抗生物質耐性遺伝子のないプラスミドの生産は、以下の利点を有する。１） プラスミド収量が高く、本発明に係る選択マーカーのないプラスミドは、複製エレメントを含み、該複製エレメントは、自律的に複製し増幅することができ、収量が従来のプラスミドの収量に同等であり、２） プラスミド生成物の純度が高く、前駆体プラスミドが宿主細菌中で組換えられ、抗生物質感受性菌株のスクリーニングによって、前駆体プラスミドを含まない菌株が得られ、組換えによって産生された、抗生物質耐性遺伝子を含有する環状ＤＮＡが、複製能力を欠いているため、細菌培養中に自然に代謝され、それによって耐性選択マーカーのないプラスミドのみを担持する菌株を得ることができ、且つこれらの菌株で高純度のプラスミドＤＮＡを製造することができ、３） 製造プロセスを容易にスケールアップすることができ、一回の組換えによって製造された、抗生物質耐性遺伝子のないプラスミドを担持する菌株は、組換えによる製造を繰り返すことなく、異なるロットの同じプラスミドの発酵生産に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】前駆体プラスミドの構造概略図であり、ここで、ｏｒｉ：複製開始部位、ＲＳ：組換え部位、Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ＡＢＲ ｇｅｎｅ：抗生物質耐性遺伝子を含む骨格配列、及びＴａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅ：標的遺伝子。
【図2】ｃｒｅ断片増幅の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、且つレーン２及びレーン３は、二つの平行なｃｒｅ遺伝子増幅生成物である。
【図3】ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクター製造の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、且つレーン２～５は、四つの平行な消化生成物である。
【図4】ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドのＰＣＲ検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１～１２は、１２個のコロニーからのＰＣＲ生成物であり、且つレーン１３はｍａｒｋｅｒである。
【図5】ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドのサンガー配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ二つの配列決定反応は、配列決定されるｃｒｅ遺伝子断片を完全にカバーしている。
【図6】ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅプラスミドの断片製造の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、レーン２及びレーン３は、増幅されたｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片生成物であり、且つレーン４及びレーン５は、ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミド消化生成物である。
【図7】ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ｔｓ）プラスミドのサンガー配列決定結果を示した図である。
【図8】ＪＭ１０８遺伝子改変細菌のＰＣＲ検証の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、レーン２は野生型ＪＭ１０８菌株のＰＣＲ生成物であり、且つレーン３は、ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ断片がノックインされたコロニーのＰＣＲ生成物である。
【図9】ＪＭ１０８遺伝子改変細菌のサンガー配列決定結果を示した図である。
【図10】ＦＬＰ断片増幅結果のゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、且つレーン２及びレーン３は、ＦＬＰ遺伝子の増幅生成物である。
【図11】製造されたｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ線状ベクターの電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、且つレーン２～５は、ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ消化生成物（平行）である。
【図12】ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐのサンガー配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ二つの配列決定反応は、配列決定されるＦＬＰ断片を完全にカバーしている。
【図13】ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６組換え部位を含有する前駆体プラスミドベクターの概略図であり、ここで、ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ｐＭＢ１ ｏｒｉ：ｐＭＢ１複製開始部位を含む骨格配列、ＭＣＳ：多重クローニング部位、及びＲｅｄｕｎｄａｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ＫａｎＲ Ｇｅｎｅ：カナマイシン耐性遺伝子を含む骨格配列。
【図14】ｐＭＦ９－ｌｏｘＰプラスミド消化検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、且つレーン２～５はｐＭＦ９－ｌｏｘＰ消化生成物（平行）である。
【図15】製造されたｐＭＦ９－ｌｏｘＰ線状ベクターの電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、且つレーン２及びレーン３はｐＭＦ９－ｌｏｘＰ消化生成物（平行）である。
【図16】ｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－５．５ ｋｂのサンガー配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ九つの配列決定反応は、配列決定される５．５ ｋｂ断片を完全にカバーしている。
【図17】同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘｐを含有するｐＭＦ６５－ｌｏｘＰ前駆体空ベクタープラスミドの構造概略図であり、ここで、ｐＭＢ１ ｏｒｉ：ｐＭＢ１複製開始部位、ＭＣＳ：多重クローニング部位、及びＲｅｄｕｎｄａｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ＫａｎＲ Ｇｅｎｅ：カナマイシン耐性遺伝子を含む骨格配列。
【図18】製造されたｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）線状ベクターテンプレートの電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、且つレーン２及び３は、ｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）プラスミド消化生成物（平行）である。
【図19】ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ前駆体空ベクタープラスミドの断片製造の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、レーン２及びレーン３は、ｐＭＢ１レプリコン断片を含有するｐＵＣ５７ （ＫａｎＲ）の増幅生成物（平行）であり、且つレーン４及びレーン５は、ＫａｎＲ選択マーカー遺伝子及びｌｏｘｐ７１／６６部位を含有する断片の増幅生成物（平行）である。
【図20】ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ前駆体空ベクタープラスミドの配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ六つの配列決定反応は、配列決定されるプラスミド全体を完全にカバーしている。
【図21】同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘｐを含有するｐＭＦ６５－ｌｏｘＰ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの構造概略図であり、ここで、ｐＭＢ１ ｏｒｉ：ｐＭＢ１複製開始部位、ＲＦＰカセット：挿入された標的遺伝子、及びＲｅｄｕｎｄａｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ＫａｎＲ Ｇｅｎｅ：カナマイシン耐性遺伝子を含む骨格配列。
【図22】ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの断片製造の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、レーン２及びレーン３はＲＦＰ増幅断片であり、且つレーン４及びレーン５はｐＭＦ６５－ｌｏｘｐベクター断片である。
【図23】ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ五つの配列決定反応は、配列決定されるプラスミド全体を完全にカバーしている。
【図24】同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘｐを含有するｐＭＦ７－ｌｏｘＰ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの構造概略図であり、ここで、ｐＵＣ ｏｒｉ：ｐＵＣ複製開始部位、ＲＦＰカセット：挿入された標的遺伝子、Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ＫａｎＲ Ｇｅｎｅ：カナマイシン耐性遺伝子を含む骨格配列、及びｒｏｐ：ｒｏｐ遺伝子。
【図25】同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘｐを含有するｐＭＦ５－ｌｏｘＰ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの構造概略図であり、ここで、Ｒ６Ｋγ ｏｒｉ：Ｒ６Ｋγ複製開始部位、ＲＦＰカセット：挿入された標的遺伝子、及びＲｅｄｕｎｄａｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ＫａｎＲ Ｇｅｎｅ：カナマイシン耐性遺伝子を含む骨格配列。
【図26】同一方向の特異的組換え部位ＦＲＴを含有する前駆体プラスミドの構造概略図であり、ここで、ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ｐＭＢ１ ｏｒｉ：ｐＭＢ１複製開始部位を含む骨格配列、ＲＦＰカセット：標的遺伝子を含有する発現エレメント、及びＲｅｄｕｎｄａｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｉｎｃｌｕｄｅ ＫａｎＲ Ｇｅｎｅ：カナマイシン耐性遺伝子を含む骨格配列。
【図27】ＦＲＴ－ＲＦＰ断片及びベクター増幅の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、レーン２及びレーン３は、ＦＲＴ－ＲＦＰ断片の増幅生成物（平行）であり、且つレーン４及びレーン５は、ｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－ＲＦＰベクター断片の増幅生成物（平行）である。
【図28】ｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰのサンガー配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ四つの配列決定反応は、配列決定される断片を完全にカバーしている。
【図29】誘導されたＣｒｅ－ｌｏｘＰ ５．５ ｋｂプラスミド組換えの検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１は、組換えされていない前駆体プラスミドであり、レーン２は、組換え１ ｈ後の生成物である：メインバンドは、生成された、耐性遺伝子のないプラスミドであり、且つ前駆体プラスミドに対応するバンドは明らかに弱まっており、レーン４及びレーン５は、レーン１及びレーン２で消化されたプラスミドの線状ＤＮＡバンドであり、且つレーン３はｍａｒｋｅｒである。
【図30】抗生物質プレートのスクリーニングの結果を示した図であり、ここで、左パネルは、抗生物質感受性菌株のスクリーニング結果であり、選択された１０個のクローニングのいずれも、抗生物質プレート上にコロニーが生えておらず、右パネルにおける試験管＃１～５は、左パネルにおけるコロニー１～５の非抗生物質培地での成長状態を示し、コロニーが正常に成長している（左パネルのプレートにおける白い点は、モノクローニング打点操作によって培地中に生じた穴である）。
【図31】抗生物質プレートのスクリーニング後のプラスミド検証の電気泳動ゲル図であり、ここで、左側のレーン＃１～５は、図３０における試験管＃１～５から抽出されたプラスミド生成物（５個の平行なクローニング）であり、中央のレーン６はｍａｒｋｅｒであり、且つ右側のレーン＃１～５は、左側レーン＃１～５におけるプラスミドの消化生成物である。
【図32】誘導されたｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰプラスミド組換えの検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はＤＬ３０００ Ｍａｒｋｅｒであり、レーン２は、組換えされていない前駆体プラスミドであり、且つレーン３は、組換え１ ｈ後の生成物である：メインバンドは、生成された、耐性遺伝子のないプラスミドであり、且つ前駆体プラスミドに対応するバンドは明らかに弱まっている。
【図33】抗生物質プレートスクリーニング後のプラスミド検証の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、レーン２は、組換えが誘導されていない前駆体プラスミドの対照であり、且つレーン３は、組換え誘導１ ｈ後に得られた娘プラスミドである。
【図34】抗生物質プレートスクリーニング後のプラスミドの配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ三つの配列決定反応は、配列決定されるプラスミド全体を完全にカバーしており、中空の矢印は、実際の配列が配列決定されたマップ配列、該遺伝子が欠失していることを表す。
【図35】誘導されたｐＭＦ７－ｌｏｘｐ－ＲＦＰプラスミド組換えの検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はＫｂ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒであり、レーン２は、組換えされていない前駆体プラスミドであり、且つレーン３は、組換え１ ｈ後の生成物である：メインバンドは、生成された、耐性遺伝子のないプラスミドであり、且つ前駆体プラスミドに対応するバンドは明らかに弱まっている。
【図36】抗生物質プレートスクリーニング後のプラスミド検証の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｍａｒｋｅｒであり、レーン１～７は、精製されたプラスミド生成物（７つの平行なプラスミド生成物）である。
【図37】抗生物質プレートスクリーニング後のプラスミドの配列決定結果を示した図であり、ここで、上方の各矢印は、一つの配列決定反応によって得られた実際の配列を表し、且つ三つの配列決定反応は、配列決定されるプラスミド全体を完全にカバーしており、中空の矢印は、実際の配列が配列決定されたマップ配列、該遺伝子が欠失していることを表す。
【図38】ＦＬＰ－ＦＲＴ組換え後の消化のプラスミド検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、左側及び右側のレーン１～７はそれぞれ、組換えが誘導されていないこと、組換えを２ ｈ誘導すること、組換えを５ ｈ誘導すること、組換えを８ ｈ誘導すること、２ ｈ誘導し３７℃で一晩置くこと、５ ｈ誘導し３７℃で一晩置くこと、及び８ ｈ誘導し３７℃で一晩置くことを示し、左側のレーン１～７はプラスミド生成物であり、右側のレーン１～７はプラスミド消化生成物であり、且つ中央のレーン８はｍａｒｋｅｒである。
【図39】非耐性菌株のスクリーニングを示した図であり、ここで、左パネルは、それぞれカナマイシンプレート及びアンピシリンプレートで組換えを２ ｈ、５ ｈ及び８ ｈ誘導した後の１０個のコロニーの成長図であり、右パネルは、抗生物質培地のない試験管中で培養された５個のコロニーの、組換えを５ ｈ誘導した後の成長図である。
【図40】耐性スクリーニングにより得られた抗生物質感受性菌株からのプラスミドの検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、異なるレーンは、組換えを２ ｈ、５ ｈ及び８ ｈ誘導する条件下で選択された同一の菌株の平行なクローニングであり、且つレーン１はｍａｒｋｅｒである。
【図41】誘導されたｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰプラスミド組換えの検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はＫｂ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒであり、レーン２は、組換えされていない前駆体プラスミド （１）：ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ及びｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドであり、レーン３は、組換え１ ｈ後の生成物 （２）：ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ、ｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミド、ＫａｎＲ遺伝子を有する環状二本鎖ＤＮＡ及びｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰであり、且つｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドに対応するバンドは明らかに弱めっている。
【図42】耐性スクリーニングにより得られた抗生物質感受性菌株からのプラスミドの検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１～５は、同一の菌株の５つの平行なクローニングであり、且つレーン６はｍａｒｋｅｒである。
【図43】耐性スクリーニングにより得られた抗生物質感受性菌株から抽出されたプラスミドの配列決定結果を示した図であり、ここで、前駆体プラスミド配列を参照として（プラスミドエレメントが下に黒い線で標識されている）、中実の矢印によりカバーされている上方の領域は、配列決定された実際の配列を表し、結果により、プラスミド生成物から、プラスミド複製エレメント及び標的遺伝子配列のみが検出され、抗生物質耐性遺伝子ＫａｎＲ及び他の冗長ベクター配列が検出されていないことが示唆されており、これは、マーカーのないプラスミド生成物の所望の配列と一致している。
【図44】ｐＭＦ９－５．５ ｋｂプラスミドの消化生成物の検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｐＭＦ９－５．５ ｋｂプラスミド生成物であり、レーン２は、該ｐＭＦ９－５．５ ｋｂプラスミドの消化生成物であり、且つレーン３はｍａｒｋｅｒである。
【図45】大量に抽出されたｐＭＦ９－５．５ ｋｂプラスミドのサンガー配列決定結果を示した図である。
【図46】ｐＭＦ６５－ＲＦＰプラスミドの消化生成物の検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｐＭＦ６５－ＲＦＰプラスミド生成物であり、レーン２は、該ｐＭＦ６５－ＲＦＰプラスミドの消化生成物であり、且つレーン３はｍａｒｋｅｒである。
【図47】大量に抽出されたｐＭＦ６５－ＲＦＰプラスミドのサンガー配列決定結果を示した図である。
【図48】ｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミドの消化生成物の検証結果の電気泳動ゲル図であり、ここで、レーン１はｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミド生成物であり、レーン２は、該ｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミドの消化生成物であり、且つレーン３はｍａｒｋｅｒである。
【図49】大量に抽出されたｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミドのサンガー配列決定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0053】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学と技術用語は、いずれも当業者に一般に理解される意味を有する。本明細書による技術案を容易に理解できる目的のために、以下ではいくつかの技術用語を簡単に説明する。
【0054】
文脈上許容される場合、又は特に定義しない限り、本明細書の「包含する」又は「含む」という用語は、「……からなる」及び／又は「実質的に……からなる」を包含し、且つ該用語の意味は、特許法の規定に準拠する。
【0055】
「プラスミド」又は「プラスミドベクター」は、本明細書において、同義的に使用され、且つ宿主細胞内で自律的複製能力を有するために、複製開始部位（又はＤＮＡ複製エレメントと呼ばれる）を有する環状ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、天然プラスミド又は改変されたプラスミドであってもよい。プラスミドは、該プラスミドを含有する宿主細胞が特定の培養条件下で成長することができる一方、該プラスミドを含有しない宿主細胞が該特定の培養条件下で正常に成長できないように、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を含んでもよい。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドを含有する宿主細胞（例えば、大腸菌）は、テトラサイクリンを含有する培地中で成長することができ、該プラスミドを含有しないか又は失った宿主細胞は、テトラサイクリンを含有する培地中で成長することができないか又は成長が抑制される。そのため、選択マーカー遺伝子の使用により、当業者は、どの宿主細胞が所望のプラスミドを含有するかを理解して、スクリーニングを完了することができる。プラスミド又は改変されたプラスミドは、標的遺伝子の挿入を促進するために、クローニング部位をさらに含んでもよい。標的遺伝子は、クローニング部位を介してプラスミドに挿入された後、該プラスミドとともに複製して、標的遺伝子の増幅を実現することができ、又は発現プラスミドとして構築された場合、該プラスミドは、宿主細胞中で標的遺伝子を発現することに用いられてもよい。クローニング部位は、モノクローニング部位又は多重クローニング部位であってもよい。実験操作を容易にするために、通常、多重クローニング部位が好ましい。本明細書における多重クローニング部位は、限定的エンドヌクレアーゼ又は他のエンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ）により認識される複数の部位を含有するＤＮＡセグメントを指す。例えば、限定的エンドヌクレアーゼは、Ａｈｄ Ｉ、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、Ｎｄｅ Ｉ又はＥｃｏＲ Ｉであってもよい。
【0056】
本明細書の「前駆体プラスミド」は、標的プラスミド／娘プラスミド（例えば、選択マーカー遺伝子のないプラスミド）を産生するための親プラスミドを指す。「前駆体プラスミド」は、以下のエレメント：宿主細胞における前駆体プラスミド又は産生された標的プラスミドの数を増加するか又は維持するために、プラスミドの宿主細胞での複製を可能にする複製開始部位と、宿主細胞をスクリーニングするための選択マーカー遺伝子と、標的遺伝子、又は該標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位と、該当するリコンビナーゼの存在下で組換えを行って、対になった組換え部位の間の配列を除去するための対になった組換え部位とを含む。選択マーカー遺伝子のないプラスミドを産生するために、通常、対になった組換え部位の間に選択マーカー遺伝子を挿入する（図１を参照されたい）。このように、組換え過程で、前駆体プラスミド分子は二つの環状ＤＮＡ分子を形成する。一つの環状ＤＮＡ分子は、複製開始部位と標的遺伝子又はクローニング部位とを含有し、且つ選択マーカー遺伝子を含有しない。これに応じて、もう一つの環状ＤＮＡ分子は、選択マーカー遺伝子を含有し、且つ複製開始部位及びクローニング部位を含有しない。前者は、本明細書において娘プラスミド又は標的プラスミド、即ち選択マーカー遺伝子を含有しないプラスミドとも呼ばれる。本発明の目的のために、クローニング部位は、クローニング部位自体を包含するか、又は標的遺伝子が既に挿入されているクローニング部位である。代替的に、クローニング部位に標的遺伝子を含まない前駆体プラスミド（又は称「プラットフォームプラスミド」又は「前駆体空ベクタープラスミド」）は、クローニング部位に標的遺伝子を含む前駆体プラスミドの親プラスミドであると考えられ、それらは、いずれも本明細書の「前駆体プラスミド」の意味に含まれる。
【0057】
「娘プラスミド」（本明細書において「ミニプラスミド」、「標的プラスミド」及び「選択マーカーのないプラスミド」とも呼ばれる）は、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）の存在下で、組換え部位（例えば、同一方向のｌｏｘＰ配列）を含有する前駆体プラスミドの組換えにより産生された、複製開始部位及びクローニング部位及び／又は標的遺伝子を含有する配列を指す。本明細書のいくつかの実施例において、娘プラスミドは、複製開始部位とクローニング部位及び／又は標的遺伝子配列とを含むが、選択マーカー遺伝子を含まない。本明細書のいくつかの他の実施例において、娘プラスミドの骨格配列は、標的遺伝子又はクローニング部位を含有しない配列を指し、該配列の配列長さは、１０００ ｂｐ未満、９００ ｂｐ未満、８００ ｂｐ未満、７００ ｂｐ未満、６００ ｂｐ未満、５００ ｂｐ未満、４００ ｂｐ未満、３００ ｂｐ未満又は２００ ｂｐ未満である。いくつかの特定の実施例において、娘プラスミドの骨格配列の長さは、８７８ ｂｐ、８６４ ｂｐ、７０８ ｂｐ、６２３ ｂｐ又は４２９ ｂｐであってもよい。
【0058】
「娘プラスミド」は、本出願の明細書に記述されている、特許請求される、特定の構造及び特徴を有するプラスミドである。つまり、それは特別なプラスミドであり、そのため、該定義は「前駆体プラスミド」又は「親プラスミド」から独立して存在してもよい。発明者らは、このような特別なプラスミド（即ち娘プラスミド）が本発明以外の方法で得られ、例えば、前駆体プラスミドを使用することなく、他の方式によってこのような特別なプラスミドを製造することを排除していないが、得られたプラスミドが本明細書の「娘プラスミド」の構造及び／又は定義に適合している限り、依然として本出願の保護範囲に含まれる。
【0059】
本明細書の「組換え部位」は、該当するリコンビナーゼにより特異的認識され得るヌクレオチド配列を指す。前駆体プラスミドが、対になった同一方向の組換え部位を含む場合、該当するリコンビナーゼの作用により、前駆体プラスミド中の組換え部位の間に組換え反応が発生し、娘プラスミド分子及び環状ＤＮＡ分子を生成させる。前駆体プラスミド中の対になった組換え部位の配列方向は同じである。該当するリコンビナーゼの作用により、二つの組換え部位の間のＤＮＡ断片が削除されて、二つのＤＮＡ分子が生成される。いくつかの実施例において、組換え部位はｌｏｘＰ配列であり、且つ該当するリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。いくつかの他の実施例において、組換え部位はＦＲＴ配列であり、且つ該当するリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼである。さらにいくつかの実施例において、組換え部位はａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つリコンビナーゼはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである。前駆体プラスミドに用いられる組換え部位は、組換え時にそれらの間の配列（選択マーカー遺伝子を含む）を前駆体プラスミドから除去し、且つ残りの配列を娘プラスミドに形成すればよいことが、当業者に理解され得る。そのため、これらの組換え部位は、本明細書に言及される特定の配列に限定されないが、それらの変異体又は他の組換え部位であってもよい。例えば、組換え部位ｌｏｘＰ突然変異体は、ｌｏｘ７５、ｌｏｘ４４、ｌｏｘ７６、ｌｏｘ４３、ｌｏｘ７２、ｌｏｘ７８、ｌｏｘ６５、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１又はｌｏｘ２２７２であってもよい。組換え部位ＦＲＴは、野生型であってもよいか、又はＦＲＴ３、ＦＲＴ５のような突然変異体であってもよい。本明細書の特定の実施例において、組換え部位ｌｏｘＰは、ｌｏｘ７１及びｌｏｘ６６配列であり、且つヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５及び２６に示すとおりである。別の特定の実施例において、組換え部位ＦＲＴのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示すとおりである。特定の実施例において、組換え部位ａｔｔＢ及びａｔｔＰ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８及び４９に示すとおりである。
【0060】
「リコンビナーゼ」という用語は、遺伝子の位置決め及び組換え過程に関与する酵素である。それは、特定の組換え部位を認識し切断し、組換えに関与する二つの分子を連結する役割を担っている。本明細書において、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ又はｐｈｉＣ３１リコンビナーゼであってもよい。いくつかの実施例において、リコンビナーゼのコード遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２４又は５０に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９３％、９５％、９７％又は９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのコード遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すヌクレオチド配列を含み、Ｆｌｐリコンビナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示すヌクレオチド配列を含み、且つｐｈｉＣ３１リコンビナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０に示すヌクレオチド配列を含む。
【0061】
本明細書に用いられる「選択マーカー」又は「選択マーカー遺伝子」は、プラスミド、ベクター又は細胞における選択マーカー遺伝子セグメントを指す。細胞、特に培養された細菌又は細胞に遺伝子を導入することにより、人工的に選択するための適切な特徴を発現することができる。それは、レポーター遺伝子であり、微生物、分子生物学及び遺伝子工学分野において、外因性ＤＮＡの細胞へのトランスフェクト又は形質転換が他の方法で成功したか否かを示すためのものである。選択マーカー遺伝子は、通常、抗生物質耐性遺伝子、又はグルコサミン合成酵素選択マーカー及びマンノースリン酸イソメラーゼ選択マーカーのような、いくつかの栄養要求性選択マーカーであってもよく、又は抗毒性遺伝子又は抗ＳａｃＢ選択マーカーのような陰性選択マーカーであってもよい。本明細書において、選択マーカー遺伝子は、発現カセットであってもよく、且つ選択マーカー遺伝子を発現するための他の配列、例えば、プロモーター、エンハンサー及びターミネーターを含んでもよい。ＳａｃＢ遺伝子は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レボショ糖をコードする構造遺伝子である。ショ糖の存在下で、グラム陰性菌におけるＳａｃＢの発現は有毒である。
【0062】
「スクリーニングストレス」又は「選択ストレス」は、同義的に使用される。本明細書において、それは、培養条件（例えば、培地）において、宿主細胞のような生物に特定の物質又は条件を適用し、これらの特定の物質又は条件に適合する生物を生存させ、適合しない生物を淘汰することを指す。例えば、本明細書において、カナマイシン又はアンピシリンのような抗生物質を宿主細胞の培地中に添加し、且つ該培地は、抗生物質選択ストレスを含有し、該当する抗生物質耐性を有する宿主細胞をスクリーニングすることができる。
【0063】
本明細書の「隣接」は、二つのＤＮＡ配列断片が遺伝子複製方向における上流と下流に位置し、且つ両方の間の位置が非常に近いことを指す。例えば、二つの遺伝子断片の位置の間は、１００ ｂｐ未満、９０ ｂｐ未満、８０ ｂｐ未満、７０ ｂｐ未満、６０ ｂｐ未満、５０ ｂｐ未満、４０ ｂｐ未満、３０ ｂｐ未満、２０ ｂｐ未満、１０ ｂｐ未満、５ ｂｐ未満、３ ｂｐ又は１ ｂｐ未満である。いくつかの実施例において、二つの遺伝子断片は直接連結される。本明細書において、前駆体プラスミドにおいて、複製開始部位と、標的遺伝子又はクローニング部位との複製方向における位置間の距離は、５０ ｂｐ未満、４５ ｂｐ未満、４０ ｂｐ未満、３５ ｂｐ未満、３０ ｂｐ未満、２５ ｂｐ未満、２０ ｂｐ未満、１５ ｂｐ未満、１０ ｂｐ未満、５ ｂｐ未満、３ ｂｐ又は１ ｂｐ未満であってもよい。いくつかの実施例において、複製開始部位は、標的遺伝子又はクローニング部位に直接連結される。いくつかの他の実施例において、複製開始部位と、標的遺伝子又はクローニング部位との複製方向における距離は、３０ ｂｐ、２５ ｂｐ、２０ ｂｐ、１５ ｂｐ、１４ ｂｐ、１３ ｂｐ、１２ ｂｐ、１１ ｂｐ、１０ ｂｐ、９ ｂｐ、８ ｂｐ、７ ｂｐ、６ ｂｐ、５ ｂｐ、４ ｂｐ、３ ｂｐ、２ ｂｐ又は１ ｂｐである。
【0064】
本明細書において、「対になった組換え部位がそれぞれ複製開始部位及び標的遺伝子の上流及び下流に隣接する」ことは、対になった組換え部位のうちのいずれか一つと、複製部位により近い複製開始部位及び標的遺伝子のうちの一つとの位置間の距離が、１００ ｂｐ未満、９０ ｂｐ未満、８０ ｂｐ未満、７０ ｂｐ未満、６０ ｂｐ未満、５０ ｂｐ未満、４０ ｂｐ未満、３０ ｂｐ未満、２０ ｂｐ未満、１０ ｂｐ未満、５ ｂｐ未満、３ ｂｐ又は１ ｂｐ未満であり得ることを指す。いくつかの実施例において、対になった組換え部位のうちの一つ又は二つは、複製開始部位及び標的遺伝子に直接連結され、即ち距離が０ ｂｐである。いくつかの他の実施例において、対になった組換え部位のうちのいずれか一つと、複製部位により近い複製開始部位及び標的遺伝子のうちの一つとの位置間の距離は、７０ ｂｐ、６５ ｂｐ、６０ ｂｐ、５５ ｂｐ、５０ ｂｐ、４５ ｂｐ、４０ ｂｐ、３５ ｂｐ、３０ ｂｐ、２５ ｂｐ、２０ ｂｐ、１５ ｂｐ、１４ ｂｐ、１３ ｂｐ、１２ ｂｐ、１１ ｂｐ、１０ ｂｐ、９ ｂｐ、８ ｂｐ、７ ｂｐ、６ ｂｐ、５ ｂｐ、４ ｂｐ、３ ｂｐ、２ ｂｐ又は１ ｂｐであってもよい。いくつかの実施例において、対になった組換え部位のうちのいずれか一つは、複製開始部位及び標的遺伝子に直接連結され、対になった組換え部位のうちのもう一つと、複製開始部位又は標的遺伝子との位置間の距離は、７０ ｂｐ、６５ ｂｐ、６０ ｂｐ、５５ ｂｐ、５０ ｂｐ、４５ ｂｐ、４０ ｂｐ、３５ ｂｐ、３０ ｂｐ、２５ ｂｐ、２０ ｂｐ、１５ ｂｐ、１４ ｂｐ、１３ ｂｐ、１２ ｂｐ、１１ ｂｐ、１０ ｂｐ、９ ｂｐ、８ ｂｐ、７ ｂｐ、６ ｂｐ、５ ｂｐ、４ ｂｐ、３ ｂｐ、２ ｂｐ又は１ ｂｐであってもよい。いくつかの他の実施例において、対になった組換え部位のうちの二つは、いずれも複製開始部位及び標的遺伝子に直接連結される。同様に、「対になった組換え部位がそれぞれ複製開始部位及びクローニング部位の上流及び下流に隣接する」は、複製開始部位がクローニング部位に隣接し、且つ対になった組換え部位のうちのいずれか一つと、複製部位により近い複製開始部位及びクローニング部位のうちの一つとの位置間の距離が、１００ ｂｐ未満、９０ ｂｐ未満、８０ ｂｐ未満、７０ ｂｐ未満、６０ ｂｐ未満、５０ ｂｐ未満、４０ ｂｐ未満、３０ ｂｐ未満、２０ ｂｐ未満、１０ ｂｐ未満、５ ｂｐ未満、３ ｂｐ又は１ ｂｐ未満であり得ることを指す。いくつかの実施例において、対になった組換え部位のうちの一つ又は二つは、複製開始部位及びクローニング部位に直接連結され、即ち距離が０ ｂｐである。いくつかの他の実施例において、対になった組換え部位のうちのいずれか一つと、複製部位により近い複製開始部位及びクローニング部位のうちの一つとの位置間の距離は、７０ ｂｐ、６５ ｂｐ、６０ ｂｐ、５５ ｂｐ、５０ ｂｐ、４５ ｂｐ、４０ ｂｐ、３５ ｂｐ、３０ ｂｐ、２５ ｂｐ、２０ ｂｐ、１５ ｂｐ、１４ ｂｐ、１３ ｂｐ、１２ ｂｐ、１１ ｂｐ、１０ ｂｐ、９ ｂｐ、８ ｂｐ、７ ｂｐ、６ ｂｐ、５ ｂｐ、４ ｂｐ、３ ｂｐ、２ ｂｐ又は１ ｂｐであってもよい。いくつかの実施例において、対になった組換え部位のうちの一つは、複製開始部位及びクローニング部位に直接連結され、対になった組換え部位のうちのもう一つと、複製開始部位又はクローニング部位との位置間の距離は、７０ ｂｐ、６５ ｂｐ、６０ ｂｐ、５５ ｂｐ、５０ ｂｐ、４５ ｂｐ、４０ ｂｐ、３５ ｂｐ、３０ ｂｐ、２５ ｂｐ、２０ ｂｐ、１５ ｂｐ、１４ ｂｐ、１３ ｂｐ、１２ ｂｐ、１１ ｂｐ、１０ ｂｐ、９ ｂｐ、８ ｂｐ、７ ｂｐ、６ ｂｐ、５ ｂｐ、４ ｂｐ、３ ｂｐ、２ ｂｐ又は１ ｂｐであってもよい。いくつかの他の実施例において、対になった組換え部位のうちの二つは、いずれも複製開始部位及びクローニング部位に直接連結される。好ましくは、記述されている関連プラスミドにおいて、「対になった組換え部位は、それぞれ複製開始部位及び標的遺伝子の上流及び下流に隣接し」、且つ複製開始部位も標的遺伝子に隣接する。
【0065】
本明細書において、「標的遺伝子」は、異なるニーズに応じて異なるヌクレオチド配列を設計することができ、プロモーター、発現タンパク質のコード遺伝子及びターミネーターのような異なるエレメント配列を含んでもよく、エンハンサー及びポリＡのような調節エレメントをさらに含んでもよい。標的遺伝子は、タンパク質又はペプチド抗原及びタンパク質又はペプチド治療剤をコードするｍＲＮＡ遺伝子、ＲＮＡ治療剤をコードするｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ、ＲＮＡワクチンをコードするｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡなどをさらに含んでもよい。
【0066】
「宿主細胞」は、本明細書において、その中でプラスミドの維持及び／又は複製が可能な細胞を指し、細菌（大腸菌）、真菌（酵母）、昆虫細胞及び哺乳動物細胞のような原核細胞及び真核細胞を含む。本明細書による、選択マーカー遺伝子を含まないプラスミドの製造方法において、宿主細胞は、その中でのプラスミドの複製のために必要な成分（例えば、様々な酵素及びヌクレオチドモノマー分子）を提供し、組換えに必要なリコンビナーゼをさらに提供した。宿主細胞中でのリコンビナーゼの発現は、好ましくは、制御可能な発現又は誘導型発現である。いくつかの実施例において、リコンビナーゼのコード遺伝子は、宿主細胞のゲノムに組込まれる。いくつかの他の実施例において、リコンビナーゼのコード遺伝子は、別の発現ベクターに挿入され、該発現ベクターは、前駆体プラスミドの前又は前駆体プラスミドの後に、前駆体プラスミドとともに宿主細胞に導入され得る。いくつかの実施例において、リコンビナーゼのコード遺伝子は、前駆体プラスミドに含まれ、宿主細胞に導入された後に該リコンビナーゼを発現することができる。いずれの実施例においても、作業者が組換えの開始時間を制御するために、誘導型プロモーターによりリコンビナーゼ遺伝子を制御することが好ましい。
【0067】
本明細書の「条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメント」は、一定の条件（例えば、高温及び誘導物誘導）で、複製エレメントが複製能力を失い、それによりプラスミドが宿主細胞の増幅中に徐々に失われることを指す。温度感受性複製エレメント又は金属イオン誘導型複製エレメント、例えば、ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）であってもよい。
【0068】
配列の場合、「同一性」という用語は、二つの配列（例えば、クエリー配列及び参照配列）の間の同一性程度の量を指し、通常、パーセントで表される。通常、二つの配列間の同一性パーセントを計算する前に、先に配列アライメントを行い、ギャップ（あれば）を導入する。あるアライメント位置において、二つの配列における塩基又はアミノ酸が同じである場合、二つの配列は、該位置において同じであるか又はマッチングすると考えられ、二つの配列における塩基又はアミノ酸が異なっている場合、二つの配列は、該位置において同じではないか又はミスマッチングされたと考えられる。いくつかのアルゴリズムにおいて、マッチング位置の数をアライメントウィンドウ内の位置の総数で割ることにより、配列同一性が得られる。いくつかの他のアルゴリズムにおいて、ギャップの数及び／又はギャップの長さも考慮される。本発明の目的のために、デフォルト設定を用いることにより、最適な配列アライメントを得て、二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の配列同一性を計算するために、開示されたアライメントソフトウェアＢＬＡＳＴ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで見出され得る）を用いてもよい。
【0069】
本明細書において、「プラスミドコピー数」は、各細胞におけるプラスミドのコピー数を指す。シングルコピーは、細胞にはプラスミドが一つしかないことを指し、マルチコピーは、細胞にはプラスミドが複数あることを指す。プラスミドコピー数の増加は、プラスミドの生産収量を増加させた。本明細書において、娘プラスミドのコピー数は、通常、１０～２０であり、高コピー数は、５００～８００、さらにそれ以上に達することができる。
【0070】
「プラスミド骨格配列」は、標的遺伝子配列が宿主細胞中で選択され増幅され得るために、テンプレートとして標的遺伝子をロードする、遺伝子工学プラスミドにおける配列を指す。プラスミド骨格配列は、プラスミド複製功能エレメントと、プラスミド生産性に関連する他の機能エレメントとを含んでもよい。プラスミド骨格配列は、真核、原核又はウイルス由来であってもよく、標的遺伝子を含まない。
【0071】
「クローニング部位」という用語は、一つのポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子のポリヌクレオチド）と別のポリヌクレオチド（例えば、クローニングベクター）との連結に役立つ任意のヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。通常、クローニング部位は、限定されるエンドヌクレアーゼにより認識される一つ又は複数の部位、例えば、多重クローニング部位を含む。いくつかの実施例において、「クローニング部位」は、多重クローニング部位（「ＭＣＳ」又は「ポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）」とも呼ばれる）であってもよい。多重クローニング部位は、限定されるエンドヌクレアーゼ又は他のエンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ）により認識される複数の部位を含有するＤＮＡセグメントを指す。
【0072】
ポリＡは、ポリアデニル化シグナル又は部位を指す。ポリアデニル化は、ＲＮＡ分子にポリ（Ａ）テールを付加することを指す。ポリアデニル化シグナルは、ＲＮＡ切断複合体により認識される配列モチーフを含む。ほとんどのヒトにおけるポリアデニル化シグナルは、ＡＡＵＡＡＡ配列並びに、その保存配列５’及び３’を含有する。よく使用されるポリＡシグナルは、ウサギβグロビン、ウシ成長ホルモン及びＳＶ４０早期又はＳＶ４０後期ポリＡシグナルからものである。
【0073】
ｐＭＢ１複製開始部位（ｐＭＢ１ ｏｒｉ）は、ｐＭＢ１プラスミドに由来する複製開始部位を指すか、又はｐＭＢ１プラスミドからの複製開始部位の誘導体であってもよい。ｐＭＢ１複製開始部位の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４に示すとおりであってもよく、且つｐＭＢ１複製開始部位誘導体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３に示すとおりであってもよい。
【0074】
ｐＵＣ複製開始部位（ｐＵＣ ｏｒｉ）は、Ｇ～Ａ置換を有するｐＢＲ３２２から派生した複製開始部位を指す。それは、ｒｏｐ負の制御因子を欠いており、上昇した温度でコピー数を増加させることができる。その配列は、ＳＥ ＩＤ ＮＯ： ４５に示すとおりであってもよい。
【0075】
Ｒ６Ｋ複製開始部位（Ｒ６Ｋ ｏｒｉ）は、Ｒ６Ｋ Ｒｅｐタンパク質により特異的に認識されて、ＤＮＡ複製を開始させる領域を指す。それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示すＲ６Ｋγ複製開始部位配列を含むが、それに限らず、且つＤｒｏｃｏｕｒｔらにより米国特許第７２４４６０９号に記載されているＣｐＧのないバージョンをさらに含み、参照により本明細書に組込まれる。
【0076】
ｒｏｐ遺伝子配列は、プライマーのリプレッサーである。本明細書において、前駆体プラスミドは、ｒｏｐ遺伝子配列を含んでもよい。リコンビナーゼによる娘プラスミドからのｒｏｐ配列の除去は、プラスミドコピー数の大幅な増加をもたらす。
【0077】
「トランスフェクト」という用語は、核酸を細胞に送達するための方法を指す。例えば、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、非イオン性界面活性剤ベシクル（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）、ヴィロソーム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃブロックコポリマー、キトサン、及び他の生分解性ポリマー、粒子、ミクロスフェア、リン酸カルシウムナノ粒子、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、ポロキサミン（ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ）ナノスフェア、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、圧電浸透、ソノポレーション、イオン導入、超音波、ＳＱＺ高速細胞変形媒介性膜破壊、コロナプラズマ、血漿促進送達、組織耐性血漿、レーザーミクロポレーション、衝撃波エネルギー、磁場、非接触式磁場侵入、遺伝子銃、マイクロニードル、ミクロ研磨、流体力学的送達、高圧尾静脈注射などは、当分野に既知のものであり、参照により本明細書に組込まれる。
【0078】
本明細書における「ターミネーター」又は「転写ターミネーター」は、細菌において転写するためのマーカー遺伝子又はオペロン末端のＤＮＡ配列を指す。これは、内因性転写ターミネーター又はＲｈｏ依存性転写ターミネーターであり得る。ｔｒｐＡターミネーターのような内部ターミネーターの場合、転写物にはヘアピン構造が形成され、該ヘアピン構造は、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡポリメラーゼ三元複合体を破壊した。代替的に、Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターは、新生ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡポリメラーゼ三元複合体を破壊するために、Ｒｈｏ因子（ＲＮＡヘリカーゼタンパク質複合体）が必要である。真核生物において、ポリＡシグナルは、「ターミネーター」ではなく、ポリＡ部位の内部で切断され、ヌクレアーゼ消化のために、３’ＵＴＲ ＲＮＡには、ブロックされていない５’末端が残されている。ヌクレアーゼは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩに追いつき、終了をもたらす。ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ休止部位（真核転写ターミネーター）の形質転換により、ポリＡ部位の短い領域内で終了を促進することができる。ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩの休止により、ポリＡ切断後に３’ＵＴＲ ｍＲＮＡを形質転換するヌクレアーゼは、休止部位においてＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ追いつく。当分野に既知の真核転写ターミネーターの非限定的リストは、Ｃ２ｘ４と、ガストリンターミネーターとを含む。真核転写ターミネーターは、ｍＲＮＡの適切な３’末端のプロセシングを増強することによってｍＲＮＡレベルを向上させることができる。
【0079】
本発明は、リコンビナーゼ誘導型発現システムを確立するための方法をさらに提供し、該方法は、リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを製造し、宿主細菌を形質転換するための方法と、リコンビナーゼ遺伝子を含有する宿主細胞ゲノムを製造するための方法とを含む。Ｃｒｅリコンビナーゼ誘導型発現ベクターを例として、リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを製造するための方法は、ｃｒｅ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターを製造することと、ｃｒｅ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターでｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドを組織化し、該プラスミドをコンピテント細胞に形質転換し、培養及び検証を行うことと、正確であると検証されたクローニングを選択し、プラスミド抽出を行うこととを含む。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ温度感受性誘導型発現ベクターを製造するための方法は、ｐＣＰ２０プラスミドで温度感受性レプリコンｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片を製造することと、ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドを消化してａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）断片を得ることと、ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片及びａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）断片を組織化し、組織化された断片をコンピテント細胞に形質転換し、培養及び検証を行うことと、成功したと検証されたクローニングを選択し、プラスミドを抽出して、発現ベクターを得ることとを含む。
【0080】
Ｃｒｅリコンビナーゼを宿主細胞ゲノムに組み込む方法は、ｃｒｅ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターを製造することと、ｃｒｅ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターでｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドを組織化し、該プラスミドをコンピテント細胞に形質転換し、培養及び検証を行うことと、正確であると検証されたクローニングを選択し、プラスミド抽出を行うことと、λＲｅｄ組換え技術及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、宿主細胞に対して、Ｃｒｅ特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムの無傷ノックインを行い、該宿主細胞を培養してＣｒｅリコンビナーゼの誘導可能な発現菌株を得ることとを含む。Ｆｌｐリコンビナーゼを宿主細胞に組み込む方法は、ｆｌｐ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ線状ベクターを製造することと、ｆｌｐ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤでｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐプラスミドを組織化し、該プラスミドをコンピテント細胞に形質転換し、培養及び検証を行うことと、正確であると検証されたクローニングを選択し、プラスミド抽出を行うことと、λＲｅｄ組換え技術及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、宿主細胞に対して、Ｃｒｅ特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムの無傷ノックインを行い、該宿主細胞（例えば、大腸菌）を培養してＦｌｐリコンビナーゼの誘導可能な発現菌株を得ることとを含む。
【0081】
例えば、いくつかの実施例において、まずリコンビナーゼコード遺伝子が組込まれている宿主細胞（例えば、大腸菌）を前駆体プラスミドで形質転換してもよく、前駆体プラスミドを含有する大腸菌を選択マーカーでスクリーニングして培養し、培養物の一部をリコンビナーゼ発現誘導物（培養物の他の部分は後の使用のために保存してもよい）に曝露し、且つリコンビナーゼの発現により、前駆体プラスミドは組換え部位の間に組換えが発生し、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミド分子及び選択マーカー遺伝子を含有する環状ＤＮＡ分子を形成する。宿主細胞を培養し続け、選択マーカーで宿主細胞をスクリーニングする。前駆体プラスミド（組換えしていない）又は環状ＤＮＡを含有する宿主細胞は選択マーカー特徴（例えば、抗生物質耐性）を有するが、娘プラスミドのみを含有する宿主細胞は該選択マーカー特徴を有しない（抗生物質耐性を有しない）。該当する抗生物質で成長できない宿主細胞を選択する。選択マーカー特徴を有しない宿主細胞を培養して、選択マーカー遺伝子を含まないプラスミドを得る。
【0082】
発現ベクターを介してリコンビナーゼを宿主細胞に導入する実施例において、該発現ベクターによる最終生成物（即ち選択マーカー遺伝子のプラスミド）への汚染を防止するために、該発現ベクターは、好ましくは、誘導欠失型発現を有し、例えば、誘導欠失型複製エレメントを含み、又はｐＳＣ１０１（ｔｓ）プラスミドからの温度感受性複製エレメントを使用する。
【0083】
いくつかの特別な実施例において、本発明による、選択マーカー遺伝子のないプラスミドを製造するための方法は、
（１） 環状ＤＮＡに組換えされ得る前駆体プラスミドを構築するステップと、
（２） 大腸菌における部位特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムを構築するステップと、
（３） 部位特異的リコンビナーゼ発現菌株において、前駆体プラスミドを形質転換し、陽性クローンをスクリーニングするステップと、
（４） 細胞を培養し、リコンビナーゼの発現を誘導し、前駆体プラスミドを自己組換えさせ、一つの前駆体プラスミド分子は、標的遺伝子及び複製開始部位を含有する、選択マーカーのないミニプラスミド分子、並びにプラスミド骨格配列（例えば、選択マーカー遺伝子）を含有する環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成するステップと、
（５） 分離し精製し、選択マーカー遺伝子のないモノクローニング菌株をスクリーニングするステップと、
（６） 細胞を培養し、プラスミドを抽出するステップとを含む。
（１） 環状ＤＮＡに組換えされ得る前駆体プラスミドを構築するステップと、
（２） 大腸菌における部位特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムを構築するステップと、
（３） 部位特異的リコンビナーゼ発現菌株において、前駆体プラスミドを形質転換し、陽性クローンをスクリーニングするステップと、
（４） 細胞を培養し、リコンビナーゼの発現を誘導し、前駆体プラスミドを自己組換えさせ、一つの前駆体プラスミド分子は、標的遺伝子及び複製開始部位を含有する、選択マーカーのないミニプラスミド分子、並びにプラスミド骨格配列（例えば、選択マーカー遺伝子）を含有する環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成するステップと、
（５） 分離し精製し、選択マーカー遺伝子のないモノクローニング菌株をスクリーニングするステップと、
（６） 細胞を培養し、プラスミドを抽出するステップとを含む。
【0084】
当業者であれば、本発明の娘プラスミド、即ちマーカーのないプラスミドが最終的に得られる限り、場合によっては、以上に言及されたステップの一つ又は複数を省略するか又はその順序を変更してもよいことを理解するであろう。そのため、いくつかの他の特定の実施例において、本発明による、マーカーのないプラスミドを製造するための方法は、
１） 本発明の前駆体プラスミドを、リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞に導入し、選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞をスクリーニングするステップと、
２） ステップ１） でスクリーニングされた宿主細胞を培養して、リコンビナーゼの該宿主細胞での発現を可能にし、及び該宿主細胞を培養し、選択マーカー遺伝子を発現しない宿主細胞をスクリーニングするステップと、
３） 選択マーカー遺伝子のないプラスミドを得るために、ステップ２） でスクリーニングされた宿主細胞を培養し、プラスミドを抽出するステップとを含む。
１） 本発明の前駆体プラスミドを、リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞に導入し、選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞をスクリーニングするステップと、
２） ステップ１） でスクリーニングされた宿主細胞を培養して、リコンビナーゼの該宿主細胞での発現を可能にし、及び該宿主細胞を培養し、選択マーカー遺伝子を発現しない宿主細胞をスクリーニングするステップと、
３） 選択マーカー遺伝子のないプラスミドを得るために、ステップ２） でスクリーニングされた宿主細胞を培養し、プラスミドを抽出するステップとを含む。
【0085】
いくつかの実施例において、製造方法は、ステップ１） の前に、本発明の前駆体プラスミドを取得するか又は製造するステップをさらに含む。いくつかの実施例において、ステップ１） 及び２） のスクリーニングは、いずれも選択マーカーに対応するスクリーニングストレスを用いる。いくつかの実施例において、ステップ３） の細胞培養にはスクリーニングストレスがない。
【0086】
リコンビナーゼシステムは、前駆体粒子上に存在するか、宿主細胞中に存在するか、又はその両方であるかにかかわらず、誘導型発現システム又は構成型発現システムであってもよい。
【0087】
本明細書において、「構成型発現」は、遺伝子発現（例えば、リコンビナーゼシステム）が時期、部位、環境に影響されず、且つ時間的及び空間的特異性がないことを指す。誘導型発現に対して、構成型発現は、他の因子の誘導を必要とせず安定的に発現することができるが、誘導型発現は、発現するために他の因子の誘導が必要である。
【0088】
さらに具体的には、本発明による、マーカーのないプラスミドを製造するための方法は、以下のステップを含む。
【0089】
（１） 環状ＤＮＡに組換えされ得る前駆体プラスミドを構築する。
【0090】
前駆体プラスミドは、複製開始部位（例えば、ＤＮＡ複製エレメント）と、選択マーカー遺伝子と、対になった同一方向の特異的組換え部位及び標的遺伝子とを含む。標的遺伝子は、プラスミド骨格と同じタイプである特異的組換え部位を含まない。ＤＮＡ複製エレメントを加えて、プラスミド骨格配列（例えば、選択マーカー遺伝子）は、一対の特異的組換え部位の内部に位置する。標的遺伝子配列及びＤＮＡ複製エレメントを含有する前駆体プラスミドは、部位特異的リコンビナーゼの作用により再構成され、２つの環状二本鎖ＤＮＡに分割され得る。ここで、一つは、プラスミド骨格配列（例えば、選択マーカー遺伝子）を含有し、複製能力を有せず、且つ細胞増幅中に徐々に失われる。もう一つは、ＤＮＡ複製エレメント及び標的遺伝子配列のみを含有するミニプラスミドであり、細胞の増幅過程とともに持続的に増幅することができる。
【0091】
（２） 大腸菌における部位特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムを構築する。
【0092】
プラスミドベクターに部位特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムを構築し、そしてそれを大腸菌の宿主細胞内に形質転換して発現するか、又は大腸菌の宿主細胞ゲノムに組み込んで発現することができる。発現システムの構成は、誘導型原核転写プロモーター（例えば、ａｒａＢＡＤプロモーター）と、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子と、転写ターミネーターとを含む。部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、ａ．（１） における、ｌｏｘＰ配列（例えば、ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６）である一対の同一方向の特異的組換え部位に対応する、Ｐ１ファージＣｒｅ－ｌｏｘＰ組換えシステムに由来するＣｒｅリコンビナーゼと、ｂ． （１） における、ＦＲＴ配列である一対の同一方向の特異的組換え部位に対応する、ビール酵母（ｂｒｅｗｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ）Ｆｌｐ－ＦＲＴ組換えシステムに由来するＦｌｐリコンビナーゼとを含んでもよい。リコンビナーゼ発現システムがプラスミドベクター上に構築される場合、ベクタープラスミドは、選択マーカーのないプラスミド生成物がリコンビナーゼ発現プラスミド汚染を有しないことを確保するために、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメント、例えば、温度感受性複製エレメントｐＳＣ１０１（ｔｓ）プラスミドであってもよい。
【0093】
（３） 部位特異的リコンビナーゼ発現菌株において、前駆体プラスミドを形質転換し、陽性クローンをスクリーニングする。
【0094】
部位特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムを担持する大腸菌菌株でコンピテント細胞を製造し、前駆体プラスミドを形質転換し、前駆体プラスミドにおける、選択マーカー遺伝子に対応する選択的培地を用いて、形質転換された陽性クローンをスクリーニングする。リコンビナーゼシステムがプラスミド上に構築される場合、リコンビナーゼ発現プラスミド及び前駆体プラスミドを従来の大腸菌コンピテント細胞に同時形質転換し、二重選択培地を用いて培養することによって、形質転換された陽性クローンをスクリーニングしてもよい。
【0095】
（４） 細胞を培養し、リコンビナーゼの発現を誘導し、前駆体プラスミドを自己組換えさせる。
【0096】
（３） で形質転換された陽性クローンを選択し、選択マーカーに対応する選択的培地において、菌株を一晩培養し濃縮する。選択ストレスのない液体培地で細胞を洗浄し、誘導物を含有する、選択ストレスのない培地を用いて、菌株を再懸濁させ、リコンビナーゼの発現を誘導し、プラスミドが担持する二つの組換え部位の間の組換えを引き起こし、組換え部位の間のプラスミド骨格配列（例えば、選択マーカー遺伝子）を削除して、選択マーカーのないミニプラスミドを形成する。
【0097】
（５） 分離し精製し、選択マーカー遺伝子のないモノクローニング菌株をスクリーニングする。
【0098】
（４） で完全に組換えされた細菌溶液で選択ストレスのないプレート上に線を引いて、単一コロニーを分離する。選択マーカー遺伝子を含有する選択的培養プレート及び選択性のない（例えば、抗生物質がない）培養プレート上に単一コロニーをそれぞれ複製し、一晩培養する。抗生物質のないプレートにおける、該当する抗生物質プレート中で成長できないコロニーを選択して培養し、それにより選択マーカープラスミドのみを含有する菌株を得る。
【0099】
（６） （５） で得られた菌株を、選択性のない（例えば、抗生物質がない）培地中で培養し、プラスミドを抽出して、選択マーカーのないミニプラスミドの最終生成物を得る。
【0100】
抗生物質耐性遺伝子による遺伝子療法の安全上のリスクを回避し、プラスミドの高純度で大量な生産を実現するために、本発明による選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性選択マーカー）がなく、生成物プラスミド骨格が複製開始部位（ＤＮＡ複製エレメント）のみを含有するミニプラスミド及びその生産方式は、細菌に由来する配列の生成物プラスミドにおける割合を大幅に減少させ、潜在的な安全上のリスクを低下させた。それとともに、プラスミド生成物を含有する陽性菌株に対する分離、精製、培養及び増幅を実現し、選択マーカーのないプラスミドにおける純度が低く、大量生産が困難であるという問題を解決した。
【0101】
本発明の有益な技術的効果は、以下を含むが、それらに限らない。本発明の方法により得られたプラスミドは、抗生物質選択マーカーを持たず、複製開始部位以外の余分な原核ＤＮＡエレメントがなく、抗生物質選択マーカーのないプラスミドの生産過程に抗生物質薬物を添加せず、生産を拡大しやすく、大量生産を実現することができる。
【0102】
本発明による選択マーカーのないプラスミドは、プラスミドの安全性及び安定性を向上させるとともに細胞傷害性を低下させるために、ＤＮＡ送達ベクター又はウイルスパッケージングプラスミドベクターとして、遺伝子及び細胞療法分野に用いられ得る。
【0103】
以下では、例を通じて、図面を参照しながら、本発明の技術的解決手段をさらに詳しく説明する。特に定義しない限り、以下に説明する例の方法及び材料は、いずれも市販品として入手可能な一般的な製品である。当業者であれば理解できるように、以下に説明する方法及び材料は、単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0104】
例１：Ｃｒｅリコンビナーゼ発現システムの確立
【0105】
該例において、大腸菌ＪＭ１０８において、部位特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムを構築した。このシステムは、誘導型原核転写プロモーターａｒａＢＡＤプロモーターと、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子ｃｒｅと、転写ターミネーターとを含む。以下の二つの方式によって、該システムを構築し、宿主細菌中で発現する。
【0106】
１．１ Ｃｒｅ特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムをｐＳＣ１０１（ｔｓ）複製システムのベクタープラスミド上に構築して、発現するためにＪＭ１０８を形質転換した。具体的なステップは以下のとおりである。
【0107】
（１） ｃｒｅ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターの製造
ｃｒｅ遺伝子断片の製造： プライマーｃｒｅ－Ｆ及びｃｒｅ－Ｒ（プライマー配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示すとおりである）でｃｒｅ断片を増幅し、ｃｒｅ断片は、南京金斯瑞生物科技有限公司（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）により合成された（ｃｒｅ遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すとおりである）。増幅システム及びＰＣＲシステムは、表１及び表２に示すとおりである。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）から購入可能であり、製品番号が１００５８４８１である。ｃｒｅ遺伝子断片の理論的サイズは１１１６ ｂｐである。増幅生成物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、電気泳動により得られた増幅生成物の断片サイズが正確である（図２に示すとおりである）。ゲルを回収してｃｒｅ遺伝子断片を得た。
ｃｒｅ遺伝子断片の製造： プライマーｃｒｅ－Ｆ及びｃｒｅ－Ｒ（プライマー配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示すとおりである）でｃｒｅ断片を増幅し、ｃｒｅ断片は、南京金斯瑞生物科技有限公司（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）により合成された（ｃｒｅ遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すとおりである）。増幅システム及びＰＣＲシステムは、表１及び表２に示すとおりである。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）から購入可能であり、製品番号が１００５８４８１である。ｃｒｅ遺伝子断片の理論的サイズは１１１６ ｂｐである。増幅生成物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、電気泳動により得られた増幅生成物の断片サイズが正確である（図２に示すとおりである）。ゲルを回収してｃｒｅ遺伝子断片を得た。
【0108】
【表1】
【0109】
【表2】
【0110】
ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターの製造：ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターは、ｐＫＤ４６プラスミドに由来し、該ｐＫＤ４６プラスミドは、ＮＣＢＩ配列ＩＤ：ＡＹ０４８７４６．１を有する。ＥｃｏＲ ＩでｐＫＤ４６プラスミドを消化し、且つ線状ベクターを回収する。消化システムは、表３に示すとおりである。ＥｃｏＲ Ｉ限定的エンドヌクレアーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００７９６５９である。消化システムは３７℃で４５ ｍｉｎ反応した。消化生成物をアガロースゲルにかけ、電気泳動を行った。図３に示すように、消化後に二つのバンドがあり、サイズは４８２０ ｂｐ ＋ １５０９ ｂｐ（それぞれ４８２０ ｂｐ及び１５０９ ｂｐ）であり、理論値（４８２０ ｂｐ及び１５０９ ｂｐ）と一致した。ゲルを切断することによって４８２０ ｂｐのベクター断片を回収し、それによりｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ線状ベクターを得た。
【0111】
【表3】
【0112】
（２） ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドの組織化
組織化システムは表４に示すとおりである。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。反応液を調合し、５０℃で１５ ｍｉｎ反応させ、生成物をＤＨ１０ｂコンピテントに形質転換し、３７℃の培養箱中で培養した。
組織化システムは表４に示すとおりである。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。反応液を調合し、５０℃で１５ ｍｉｎ反応させ、生成物をＤＨ１０ｂコンピテントに形質転換し、３７℃の培養箱中で培養した。
【0113】
【表4】
【0114】
（３） ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドの検証
前述のステップからの形質転換プレート上で単一コロニーを選択し、そして４８ウェルプレートに転移し、３７℃及び２２０ ｒｐｍで一晩培養した。プライマーｃｒｅ－ｓｅｑ１／ｃｒｅ－ｓｅｑ２（二つのプライマーの配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示すとおりであり、且つ増幅断片のサイズは１０６９ ｂｐである）を用いてコロニーＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動によって生成物を検証した。図４に示すように、コロニー１－１２は、コロニーＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動の結果であり、クローニング＃７を除く全ての他のクローニングはバンドを示し、組織化に成功した可能性があることを示している。断片サイズが正確である陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、これらのプラスミドを南京金斯瑞生物科技有限公司に送ってサンガー配列決定を行い、配列決定の結果は正確であった（図５に示すように、試験された配列は、マップ配列（図中の黒い線）と完全に一致し、遺伝子欠失又は突然変異がなく、プラスミド組織化に成功したことを示している）。ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドの組織化に成功した。
前述のステップからの形質転換プレート上で単一コロニーを選択し、そして４８ウェルプレートに転移し、３７℃及び２２０ ｒｐｍで一晩培養した。プライマーｃｒｅ－ｓｅｑ１／ｃｒｅ－ｓｅｑ２（二つのプライマーの配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示すとおりであり、且つ増幅断片のサイズは１０６９ ｂｐである）を用いてコロニーＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動によって生成物を検証した。図４に示すように、コロニー１－１２は、コロニーＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動の結果であり、クローニング＃７を除く全ての他のクローニングはバンドを示し、組織化に成功した可能性があることを示している。断片サイズが正確である陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、これらのプラスミドを南京金斯瑞生物科技有限公司に送ってサンガー配列決定を行い、配列決定の結果は正確であった（図５に示すように、試験された配列は、マップ配列（図中の黒い線）と完全に一致し、遺伝子欠失又は突然変異がなく、プラスミド組織化に成功したことを示している）。ｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドの組織化に成功した。
【0115】
（４） 温度感受性プラスミドｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅの構築
温度感受性レプリコンｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片の製造：テンプレートとしてｐＣＰ２０プラスミド（ＮＣＢＩ配列ＩＤ：ＭＫ１７８５９８．１）を用い、ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示すとおりである）に対してＰＣＲ増幅を行った。増幅プライマーであるｐＳＣ１０１（ｔｓ）－Ｆ及びｐＳＣ１０１（ｔｓ）－Ｒは、それぞれプライマー配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示すとおりである。ＰＣＲシステム及び手順は、表５及び表６に示すとおりである。増幅により得られたｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片生成物をアガロースゲルにかけ、電気泳動を行った。図６におけるレーン２及び３に示すように、断片の正確なサイズは１４３４ ｂｐである。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００５８４８１である。
温度感受性レプリコンｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片の製造：テンプレートとしてｐＣＰ２０プラスミド（ＮＣＢＩ配列ＩＤ：ＭＫ１７８５９８．１）を用い、ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示すとおりである）に対してＰＣＲ増幅を行った。増幅プライマーであるｐＳＣ１０１（ｔｓ）－Ｆ及びｐＳＣ１０１（ｔｓ）－Ｒは、それぞれプライマー配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示すとおりである。ＰＣＲシステム及び手順は、表５及び表６に示すとおりである。増幅により得られたｐＳＣ１０１ ｏｒｉ （ｔｓ）断片生成物をアガロースゲルにかけ、電気泳動を行った。図６におけるレーン２及び３に示すように、断片の正確なサイズは１４３４ ｂｐである。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００５８４８１である。
【0116】
ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）断片の製造：Ｎｃｏ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで、ステップ （３） で製造されたｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドを処理した。消化システムは表７に示すとおりである。図６におけるレーン４及び５に示すように、消化生成物の正確な断片サイズは４４３１ ｂｐである。ゲルを切断することによって大きな断片を回収し、それによりａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）を得た。Ｎｃｏ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ限定的エンドヌクレアーゼは、いずれもニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号がそれぞれ１００８０４２４及び１００４６５７７である。
【0117】
【表5】
【0118】
【表6】
【0119】
【表7】
【0120】
ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（ＡｍｐＲ）プラスミドを組織化した。表８に示すように、反応システムは、５０℃で１５ ｍｉｎ反応した。組織化の生成物をＤＨ１０ｂコンピテントに形質転換し、３０℃の培養箱中で培養した。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。
【0121】
【表8】
【0122】
ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅプラスミドに対してＰＣＲ検証を行った。前述のステップにおける形質転換プレート中の単一コロニーを選択し、４８ウェルプレートに転移し、３０℃及び２２０ ｒｐｍで培養した。ＰＣＲにより正確に検証された８個のクローニングをランダムに選択し、プラスミドを抽出し、サンガー配列決定を行った（南京金斯瑞生物技術有限公司により提供される）。図７を参照して、配列決定結果によると、試験された配列は、マップ配列（図中の黒い線）と完全に一致し、遺伝子欠失又は突然変異がなく、プラスミド組織化に成功したことを示している。ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅプラスミドの組織化に成功した。
【0123】
１．２ λＲｅｄ組換え及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によってＣｒｅリコンビナーゼの誘導型発現システムをＪＭ１０８ゲノムに組み込んで発現した。菌株編集及び検証操作３）～５） は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成された（ＣＲＩＳＰＲ製品及びサービス（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ．ｃｎ））、具体的なステップは以下のとおりである。
【0124】
１） ｃｙａＡ及びｃｙａＹ遺伝子の間のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的標的ポイントを設計し、ここで、ｇＲＮＡの長さは２０ ｂｐであり、具体的なｇＲＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示すとおりである。
【0125】
２） ｃｙａＡ及びｃｙａＹ遺伝子の間の挿入部位の両側のＪＭ１０８－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（Ａｍｐ） Ｌ－相同性アーム及びＪＭ１０８－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ（Ａｍｐ）Ｒ－相同性アームを設計し、具体的な相同性アーム配列は、それぞれ配列表に示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１のとおりである。
【0126】
３） λＲｅｄ組換え技術及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、大腸菌ＪＭ１０８菌株に対して、Ｃｒｅ特異的リコンビナーゼ誘導型発現システム（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示すとおりである）の無傷ノックインを行った。
【0127】
４） 編集された菌株に対して、コロニーＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動スクリーニング検証を行った（プライマー：Ｃ４８１８ＦＫ０６０－６ＪＪＦ１及びＣ４８１８ＦＫ０６０－６ＪＪＲ１、配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示すとおりである）。ノックインに成功したコロニーＰＣＲにより得られたゲル電気泳動バンドの理論的サイズは３０００ ｂｐより大きい必要があり、ノックインに成功しなかったバンドの理論的サイズは１２９７ ｂｐであった。図８に示すように、結果により、ノックインに成功したコロニーＰＣＲゲル電気泳動のバンドサイズが正確であることが示唆されている。
【0128】
５） ＰＣＲにより正確に検証されたクローニングに対してサンガー配列決定を行った。図９に示すように、結果により、配列決定結果が正確であり、突然変異がないことが示唆されている。
【0129】
例２：Ｆｌｐリコンビナーゼ発現システムの確立
【0130】
Ｆｌｐリコンビナーゼ誘導型発現システムの確立は、例１におけるＣｒｅリコンビナーゼ発現システムを参照することができる。Ｆｌｐリコンビナーゼ誘導型発現システムは、誘導型原核転写プロモーターａｒａＢＡＤプロモーターと、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子ｆｌｐと、転写ターミネーターとを含む。以下の二つの方式によって、該システムを構築し、宿主細菌中で発現する。
【0131】
２．１ Ｆｌｐ特異的リコンビナーゼ誘導型発現システムを、ｐＳＣ１０１（ｔｓ）温度感受性複製システムのベクタープラスミド上に構築し、それにより発現するためにＪＭ１０８を形質転換した。具体的な操作は、以下のとおりである。
【0132】
（１） ｆｌｐ遺伝子断片及びｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ線状ベクターの製造
【0133】
ｆｌｐ遺伝子断片の製造：ｆｌｐ遺伝子（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示すとおりである）は、ｐＣＰ２０プラスミドからのものであり、プライマーｆｌｐ－Ｆ及びｆｌｐ－Ｒ（二つのプライマー配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示すとおりである）を用いて、ｆｌｐ遺伝子を増幅させた。増幅システム及びＰＣＲシステムは、表９及び表１０に示すとおりである。図１０に示すように、アガロースゲル電気泳動の結果により、断片の正確なサイズが１３３３ ｂｐであることが示されている。ゲル回収を行った。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００５８４８１である。
【0134】
【表9】
【0135】
【表10】
【0136】
ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ線状ベクターの製造：Ｎｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉ－ＨＦ（ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号がそれぞれ１００６４８９７及び１００７９６５９である）でｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅプラスミドを消化して、線状ベクターを製造した。ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅプラスミドのサイズは５８７６ ｂｐである。アガロースゲル電気泳動によって消化生成物を分析した。図１１のゲル図に示すように、消化後に二つのバンドがあり、サイズは、４８４１ ｂｐ＋１０３４ ｂｐであり、理論値と一致していた。消化システムは表１１に示すとおりである。消化システムを３７℃で６０ ｍｉｎ処理した。ゲルを切断することによって大きな断片を回収した。
【0137】
【表11】
【0138】
（２） ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐプラスミドの組織化
【0139】
組織化システムは表１２に示すとおりである。組織化システムは、５０℃で１５ ｍｉｎ反応した。組織化が完了した後、組織化の生成物をＤＨ１０ｂコンピテントに形質転換し、３０℃の培養箱中で培養した。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。
【0140】
【表12】
【0141】
（３） ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐプラスミドの検証
【0142】
前述のプレートから８個の単一コロニーをランダムに選択し、４ ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３０℃及び２２０ ｒｐｍで培養した。プラスミドを抽出しサンガー配列決定を行い、且つ該配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成された。図１２を参照して、配列決定結果によると、試験された配列は、マップ配列（図中の黒い線）と完全に一致し、遺伝子欠失又は突然変異がなく、プラスミド組織化に成功したことを示している。
【0143】
２．２ λＲｅｄ組換え及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によってＦｌｐリコンビナーゼの誘導型発現システムをＪＭ１０８ゲノムに組み込んで発現した。具体的なステップは、例１におけるステップ１．２と同じである。
【0144】
例３：ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６組換え部位を含有する前駆体プラスミドの構築
【0145】
３．１ ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ前駆体空ベクタープラスミドの構築
【0146】
ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ前駆体空ベクタープラスミドは、ＤＮＡ複製エレメントｐＭＢ１誘導体（７８４ ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）と、耐性選択マーカー遺伝子ＫａｎＲと、一対の同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６（配列表に示すように、ｌｏｘ７１配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示すとおりであり、ｌｏｘ６６配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示すとおりである）と、多重クローニング部位ＭＣＳとを含む。多重クローニング部位及び複製エレメントは、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６との間に位置し（図１３に示すように）、順序が本例を含むが、これに限らない。プラスミド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示すとおりであり、南京金斯瑞生物科技有限公司により合成された。合成されたｐＭＦ９－ｌｏｘｐプラスミドを消化によって検証された。限定的エンドヌクレアーゼは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩであり、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００５５８１１である。消化システムは表１３に示すとおりである。消化システムは３７℃で４５ ｍｉｎ反応した。標的バンドの理論的サイズは、１１７６ ｂｐ ＋ ２０１５ ｂｐでなければならない。図１４に示すように、消化生成物のアガロースゲル電気泳動の結果によると、レーン２～５は、四つの平行な消化生成物であり、バンドサイズが正確であり、得られたプラスミドが正確であることを示している。
【0147】
【表13】
【0148】
３．２．ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ線状ベクターの製造
【0149】
ＢａｍＨ Ｉ－ＨＦ（ニューイングランドバイオテクノロジー社、１００８１０１３）でｐＭＦ９－ｌｏｘｐプラスミドを消化した。消化システムは表１４に示すとおりである。消化システムは３７℃で４５ ｍｉｎ反応した。ｐＭＦ９－ｌｏｘｐプラスミドのサイズは３１９１ ｂｐである。図１５に示すように、消化生成物のアガロースゲル電気泳動の結果により、レーン２－３が二つの平行な消化生成物であり、消化後のバンドサイズが正確であることが示されている。ゲル回収を行った。
【0150】
【表14】
【0151】
３．３ ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ －５．５ ｋｂ前駆体プラスミドの組織化
【0152】
ｌｏｘＰ部位の間に、長さが５．５ ｋｂであり、ｌｏｘＰ部位を含有しない断片（標的遺伝子）を挿入した。相同性アームを有するプライマー対を用いて、増幅し回収した。プライマーの配列は、配列表を参照されたい（配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示すとおりである）。回収された断片を、例３．２で製造されたｐＭＦ９－ｌｏｘｐ線状ベクターと組織化した。組織化システムは表１５に示すとおりである。組織化は５０℃で１５ ｍｉｎ行われた。組織化システムをＪＭ１０８に形質転換した。５０ μＬ／１００ μＬの形質転換生成物を入れ、３７℃で一晩培養した。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。
【0153】
【表15】
【0154】
３．４ ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ －５．５ ｋｂプラスミドの検証
【0155】
組織化されたｐＭＦ９－ｌｏｘｐ －５．５ ｋｂプラスミドは、形質転換後にプレート上で単一コロニーが生えた。８個のモノクローニングをランダムに選択し、４ ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃及び２２０ ｒｐｍで培養した。プラスミドを抽出し、サンガー配列決定を行った。図１６に示すように、サンガー配列決定結果は、組織化に成功したことを示している。サンガー配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成された。
【0156】
例４．ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６組換え部位及びｐＭＢ１最短複製エレメントを含有する前駆体プラスミドの構築
【0157】
４．１ ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ前駆体空ベクタープラスミドの構築
【0158】
プラスミド安全性は、遺伝子及び細胞療法に極めて重要である。プラスミド骨格上の配列は、潜在的な免疫原性を有し、有害反応を引き起こす。プラスミド骨格の短縮は、遺伝子及び細胞療法に関連するプラスミドの最適化方向となってきた。本例において設計された前駆体プラスミドベクターは、組換えにより、約０．６５ＫＢのｐＭＢ１複製エレメント配列のみを含有する娘プラスミドを得ることができ、外因性遺伝子配列の導入を減少させ、潜在的細胞傷害性及び免疫原性を低下させ、安全性及び安定性を向上させた。
【0159】
プラスミドの構築は、ＤＮＡ複製エレメントｐＭＢ１（５８９ ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）と、耐性選択マーカー遺伝子ＫａｎＲと、一対の同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６と、多重クローニング部位とを含むｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）プラスミド（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示すとおりであり、南京金斯瑞生物科技有限公司により合成された）に基づいている。複製エレメント及びクローニング部位は、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６との間に位置し（プラスミドは図１７に示すとおりである）、順序が本例を含むが、これに限らない。
【0160】
多重クローニング挿入部位における限定的エンドヌクレアーゼｓａｌｌ／ＢａｍＨＩでｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）プラスミドを処理し、且つｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）プラスミドを消化して線状ベクターを形成した。消化システムは表１６に示すとおりである。図１８を参照して、結果により、ｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）プラスミドが２５７９ ｂｐであり、バンドサイズが正確であることが示されている。ゲルキットに従ってゲルを回収した。ｐＭＢ１レプリコンを含有するｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）断片、並びにＫａｎＲ選択マーカー及びｌｏｘｐ７１／６６部位を含有するｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）断片を、それぞれ二つのプライマー対で増幅させた。ｐＭＢ１レプリコンを含有する断片を増幅するためのプライマーの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１に示すとおりである。ＫａｎＲ選択マーカー及びｌｏｘｐ７１／６６部位を含有する断片を増幅するためのプライマーの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３に示すとおりである。ＰＣＲシステム及びＰＣＲ手順は、表１７及び表１８に示すとおりである。増幅生成物については、図１９に示すように、レーン１及び２における、ｐＭＢ１レプリコンを含有する断片１のサイズは６６８ ｂｐであり、レーン３及び４における、ＫａｎＲ耐性選択マーカー及びｌｏｘｐ７１／６６部位を含有する断片２のサイズは１５７４ ｂｐである。バンドサイズはいずれも正確である。ゲルキットに従ってゲルを回収した。Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼは、タカラバイオ（北京）有限公司（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）から購入可能であり、製品番号がＲ０５０Ａである。
【0161】
【表16】
【0162】
【表17】
【0163】
【表18】
【0164】
ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐプラスミドを組織化した。システムは表１９に示すとおりである。システムは、５０℃で１５ ｍｉｎ反応した。組織化が完了した後、組織化の生成物をＪＭ１０８コンピテントに形質転換し、３７℃で培養した。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。
【0165】
【表19】
【0166】
ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐプラスミドの検証
【0167】
組織化されたｐＭＦ６５－ｌｏｘｐプラスミドは、形質転換後にプレート上で単一コロニーが生えた。モノクローニングを選択し、４ ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃及び２２０ ｒｐｍで培養した。プラスミドを抽出し、サンガー配列決定を行った。図２０に示すように、サンガー配列決定結果により、設定されたプライマー配列決定結果が完全なプラスミド配列をカバーし、突然変異がなく、組織化に成功したことが示されている。サンガー配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成された。
【0168】
４．２ ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの構築
【0169】
ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの構築は、例３におけるｐＭＦ９－ｌｏｘｐ－５．５ ｋｂの構築を参照されたい。即ちｐＭＦ６５－ｌｏｘｐプラスミドのＭＣＳ位置にｒｆｐ赤色素合成遺伝子（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりである）を外因性断片（構造図が図２１を参照）として挿入した。
【0170】
ＰＣＲによって、ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐベクターを増幅し、断片ＲＦＰを挿入した。ベクター断片サイズは２１８２ ｂｐであり、ＲＦＰ断片サイズは１１５０ ｂｐである（二つのプライマー対の配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８に示すとおりである）。増幅システムは表２０に示すとおりである。増幅手順は表２１に示すとおりである。図２２を参照して、結果により、レーン２及びレーン３がＲＦＰ増幅断片であり、レーン４及びレーン５がｐＭＦ６５－ｌｏｘｐベクター断片であり、そのサイズが正確であることが示されている。ゲルキットに従ってゲルを回収した。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ （商標）クローニングキットを用いて組織化した。
【0171】
【表20】
【0172】
【表21】
【0173】
ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドを組織化した。システムは表２２に示すとおりである。システムは、５０℃で１５ ｍｉｎ反応した。組織化が完了した後、組織化の生成物をＪＭ１０８コンピテントに形質転換し、３７℃で培養した。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。
【0174】
【表22】
【0175】
ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの検証
【0176】
組織化されたｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドは、形質転換後にプレート上で単一コロニーが生えた。モノクローニングを選択し、４ ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃及び２２０ ｒｐｍで培養した。プラスミドを抽出し、サンガー配列決定を行った。図２３に示すように、サンガー配列決定結果により、設定されたプライマー配列決定結果が完全なプラスミド配列をカバーし、突然変異がなく、組織化に成功したことが示されている。サンガー配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成された。
【0177】
例５．ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６組換え部位を含有する高コピー前駆体プラスミドの構築
【0178】
５．１ ｐＭＦ７－ｌｏｘｐ－ＲＦＰプラスミドの構築
【0179】
本例におけるプラスミドは、高コピーｐＵＣレプリコンを含有し、それにより選択マーカーのないプラスミドの収量及び純度を向上させ、製造フローを簡略化し、生産コストを削減し、大量生産に有利である。
【0180】
プラスミドの構築は、ＤＮＡ複製エレメントｐＵＣ ｏｒｉ（６７４ ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５）と、耐性選択マーカー遺伝子ＫａｎＲと、Ｒｏｐタンパク質をコードする遺伝子配列と、一対の同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６と、標的遺伝子ＲＦＰ配列とを含むｐＵＣ５７（ＫａｎＲ）プラスミド（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示すとおりである）に基づいている。複製エレメント及び標的遺伝子は、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６との間に位置する（構造が図２４に示すとおりである）（プラスミドの全配列が配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示すとおりである）。プラスミドは、南京金斯瑞生物科技有限公司の遺伝子部門により合成された。ｒｏｐ遺伝子配列は、ｐＢＲ３２２複製エレメントからのものであり、複製制御タンパク質であり、ｐＵＣ複製エレメントプラスミドのコピー数を減少させる。組換え誘導前に、前駆体プラスミドはＲｏｐタンパク質を発現し、且つ前駆体プラスミドのコピー数が抑制された。組換え誘導後に、耐性選択マーカーのないプラスミドは、ｒｏｐ遺伝子配列を失い、高コピープラスミドに変換し、組換えされた菌株における耐性選択マーカーのないプラスミドの割合を向上させ、前駆体プラスミドの失いを促進し、耐性選択マーカーのないプラスミドを含有する菌株のスクリーニング効率を向上させることができる。
【0181】
例６．ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６組換え部位及びＲ６Ｋγレプリコンを含有する前駆体プラスミドの構築
【0182】
６．１ ｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの構築
【0183】
本例により、本発明の方法が異なるタイプの複製エレメントの選択マーカーのないプラスミドの製造に適し、該方法が汎用性を有することが示されている。Ｒ６Ｋγ ｏｒｉ（３８９ ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６）は、例３、４及び５におけるｐＭＢ１又はｐＵＣとは異なるレプリコンである。Ｒ６Ｋγ配列は、長さがより短く、娘プラスミドの骨格長さをさらに短縮させ、細胞傷害性を低下させることができる。
【0184】
ｐＭＦ５－ｌｏｘＰ－ＲＦＰ前駆体プラスミドは、ＤＮＡ複製エレメントＲ６Ｋγ ｏｒｉと、耐性選択マーカー遺伝子ＫａｎＲと、一対の同一方向の特異的組換え部位ｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６と、配列ＲＦＰに挿入される標的遺伝子とを含む。複製エレメント及び挿入遺伝子は、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６との間に位置する（構造が図２５に示すとおりである）（プラスミドの全配列が配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０に示すとおりである）。プラスミドは、南京金斯瑞生物科技有限公司により合成された。
【0185】
例７．同一方向の特異的組換え部位ＦＲＴを含有する前駆体プラスミドの構築
【0186】
７．１ ＦＲＴ－ＲＦＰ遺伝子断片及びベクターの製造
【0187】
ｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰ前駆体プラスミド（構造が図２６に示すとおりである）の構築は、ｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－ＲＦＰプラスミドに基づいている。ｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－ＲＦＰプラスミドの構築は、例３におけるｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－５．５ ｋｂの構築方法を参照されたい。即ちｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－ＲＦＰのｌｏｘＰ部位の間にｒｆｐ赤色素合成遺伝子（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりである）を標的遺伝子として挿入した。ＦＲＴ配列（ＦＲＴ配列が配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示すとおりである）を担持するプライマーを用いて、ｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－ＲＦＰプラスミドのｌｏｘＰ部位の間の断片を増幅した。具体的なプライマー配列は、配列表を参照されたい（ＦＲＴ－Ｆ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示すとおりであり、且つＦＲＴ－Ｒ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示すとおりである）。ＰＣＲシステム及びＰＣＲ手順は、表２３及び表２４に示すとおりである。増幅生成物に対してゲル電気泳動を行った。図２７に示すように、レーン２及びレーン３のサイズは、いずれも２１２３ ｂｐであり、正確である。ゲルキットに従ってゲルを回収した。
【0188】
ｐＭＦ９ベクター断片の製造：ｐＭＦ９－ｌｏｘＰ－ＲＦＰプラスミドをテンプレートとして、ベクターに対してＰＣＲ増幅を行った。プライマーＦＲＴ－Ｆ２及びＦＲＴ－Ｒ２は、プライマー配列表を参照されたい（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示すとおりである）。ＰＣＲシステム及びＰＣＲ手順は、表１６及び表１７に示すとおりである。増幅生成物に対してアガロースゲル電気泳動を行った。図２７におけるレーン４及び５に示すように、増幅生成物のサイズは２２３６ ｂｐである。正確なサイズのバンドを切り取り、ゲルキットに従ってゲルを回収した。ＰＣＲで使用されるＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００５８４８１である。
【0189】
【表23】
【0190】
【表24】
【0191】
７．２ ｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰプラスミドの組織化。組織化システムは表２５に示すとおりである。組織化システムは、５０℃で１５ ｍｉｎ反応した。組織化が完了した後、組織化の生成物をＤＨ１０ｂコンピテントに形質転換し、３７℃で培養した。Ｇｅｎｅ ｂｕｉｌｄｅｒ（商標）クローニングキットは、南京金斯瑞生物科技有限公司から購入可能であり、製品番号がＣ２００１２００９である。
【0192】
【表25】
【0193】
７．３ ｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰプラスミドの検証
【0194】
形質転換プレートから８個の単一コロニーをランダムに選択し、南京金斯瑞生物科技有限公司に送ってサンガー配列決定を行った。図２８を参照して、配列決定結果によると、試験された配列は、マップ配列（図中の黒い線）と一致し、遺伝子欠失又は突然変異がなく、プラスミド組織化に成功したことを示している。
【0195】
例８：ｐＭＦ９－ｌｏｘｐベクターの単一プラスミド形質転換に基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製
【0196】
本例は、ＪＭ１０８ ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ＋ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ－５．５ｋｂを例として、単一プラスミド形質転換に基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製の方法を説明したが、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ組換えシステムに限らない。具体的な操作は、以下のとおりである。
【0197】
８．１ 単一プラスミド形質転換
【0198】
例１における遺伝子改変菌株ＪＭ１０８ ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅを用いてコンピテントを製造し、前駆体プラスミドｐＭＦ９－ｌｏｘｐ－５．５ｋｂを形質転換し、そしてカナマイシンプレート上に注いだ。具体的な形質転換ステップは以下のとおりである。
【0199】
ＪＭ１０８ ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅコンピテントを氷に置いて自然融解させ、１ μＬのプラスミドを氷上のコンピテントに添加し、コンピテントをプラスミドと均一に混合し、混合物を４２℃で３０ ｍｉｎ氷浴し、熱ショックを９０ ｓ施し、そして３ ｍｉｎ氷浴した。混合物を８００ μＬの新鮮なＬＢ液体培地に添加し、全温度振盪培養箱において、３７℃及び２２０ ｒｐｍで４５ ｍｉｎインキュベートした。適量の細菌溶液をＬＢ ＋ Ｋａｎ ＋ １％グルコースの固体プレート上に注ぎ、そして３７℃の培養箱中で一晩培養した。正常なサイズに成長した単一コロニーを選択して後続の実験を行った。
【0200】
８．２ アラビノースの添加によるＣｒｅ－ｌｏｘＰ組換え誘導
【0201】
ＪＭ１０８ ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ－５．５ｋｂ培養システムに一定の量のアラビノースを添加して、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導し、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ組換えを実現した。具体的な操作は、以下のとおりである。
【0202】
３～４個のＪＭ１０８ ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ ｐＭＦ９－ｌｏｘｐ－５．５ ｋｂコロニーを選択し、４ ｍＬのＬＢ ＋ Ｋａｎ（カナマイシン、３０ μｇ／ｍＬ） ＋ １％グルコースの液体培地中でインキュベートし、３７℃及び２２０ ｒｐｍで一晩培養し、菌株を濃縮した。菌株を収集し、抗生物質のないＬＢで二回洗浄し、そして誘導液（誘導液：ＬＢ ＋ ２％アラビノース）で再懸濁させた。組換え誘導は、３７℃及び２２０ ｒｐｍで１ ｈ行われた。５ μＬの組換え細菌溶液で抗生物質のないＬＢ固体プレート上に線を引き、３７℃の培養箱中で一晩培養し、残りの細菌溶液からプラスミドを抽出し、検証を行った。消化システムは表２６に示すとおりである。Ａｈｄ Ｉ限定的エンドヌクレアーゼは、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００７９９６８である。アガロースゲル電気泳動を行った。元のプラスミドを対照とし、電気泳動結果は図２９に示すとおりである。
【0203】
結果の表示：前駆体プラスミドｐＭＦ９－ｌｏｘｐ－５．５ ｋｂのサイズは８７２０ ｂｐであり、組換え後に生成された耐性環状ＤＮＡのサイズは２２７０ ｂｐであり、生成されたｐＭＦ９－５．５ ｋｂプラスミドのサイズは６４５０ ｂｐである。図２９から分かったように、２％のアラビノースを添加して１ ｈ誘導することによりＣｒｅ－ｌｏｘＰの組換えの実現に成功し、約６．５ ｋｂのマーカーのないプラスミドを得たが、少量の前駆体プラスミドが依然として残されていた。
【0204】
【表26】
【0205】
８．３ マーカーのないプラスミドを得るためのＫａｎ耐性スクリーニング及び精製
【0206】
１） 組換えされた細菌溶液で抗生物質のないプレートに線を引いた後、１０個の単一コロニーを選択した。図３０における左パネルに示すように、ＬＢ ＋ Ｋａｎプレート上に各コロニーを点在させ、３７℃の培養箱中で一晩培養した。なお、図３０における右パネルに示すように、各コロニーを抗生物質のないＬＢ液体培地にも接種し、３７℃及び２２０ ｒｐｍで培養し、耐性スクリーニングを行った。
【0207】
２） ＬＢ ＋ Ｋａｎプレート上でコロニーが成長せず、抗生物質のないＬＢ液体培地中で正常に成長するコロニーのうちの５個のコロニーを選択し（図３０に示すとおりである）、保存後にプラスミドを抽出しプラスミド検証を行った。
【0208】
３） 抽出されたプラスミドに対して消化検証を行った。消化システムは表２６に示すとおりである。アガロースゲル電気泳動を行った。ｐＭＦ９－ ５．５ ｋｂプラスミドは６４５０ ｂｐである。得られたマーカーのないプラスミド生成物として、正確なプラスミドサイズ及び正確な消化生成物を有するプラスミドを選択した（図３１左側のレーン＃１及び＃４に示すとおりである）。
【0209】
耐性スクリーニングプレート及びプラスミド検証結果により、Ｋａｎ耐性逆方向スクリーニングによって残りの前駆体プラスミド及び耐性遺伝子を除去し、マーカーのないプラスミドを高効率で得たことが示されている。
【0210】
例９：ｐＭＢ１複製エレメントのみを含有する最短骨格前駆体プラスミドの単一プラスミド形質転換に基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製
【0211】
本例は、例４におけるｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドに基づいて、前駆体プラスミドのｐＭＢ１複製エレメントを最短に減少させることによる本発明における選択マーカーのないプラスミドの生産の可能性を試験した。具体的な実施形態は例８と同様である。誘導により、前駆体プラスミドの組換えを実現した。図３２に示すように、ゲル電気泳動の検出結果により、レーン２が組換え誘導されていない前駆体プラスミド対照であり、サイズが３２７２ ｂｐであり、レーン３が１ ｈ組換え誘導して得られたＭＦプラスミドであり、サイズが１７４３ ｂｐであり、且つバンドサイズがいずれも正確であることが示されている。後続の耐性スクリーニング及び精製によって、サイズが正確である、耐性選択マーカーのないｐＭＦ６５－ＲＦＰプラスミドを得た。図３３（３個の平行なプラスミド生成物）に示すように、ゲル電気泳動の結果によると、バンドは、サイズが正確であり、バンドがシンプルであり、半数体バンドである。ｐＭＦ６５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰプラスミドに対して配列決定検証を行った。図３４に示すように、検証結果により、組換えに成功したことが示されている。
【0212】
例１０：高コピー前駆体プラスミド骨格の単一プラスミド形質転換に基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製
【0213】
本例は、例５におけるｐＭＦ７－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドに基づいて、高コピー前駆体プラスミド骨格による本発明における選択マーカーのないプラスミドの生産の可能性を試験した。具体的な実施形態は例８と同様である。誘導により、前駆体プラスミドの組換えを実現した。図３５に示すように、ゲル電気泳動の検出結果により、レーン２が誘導組換えされていない前駆体プラスミドであり、サイズが３８７９ ｂｐであり、レーン３が１ ｈ誘導組換えして生成された、耐性遺伝子のないプラスミドであり、ここで、前駆体プラスミドに対応するバンドが明らかに弱まり、且つサイズが正確であることが示されている。後続の耐性スクリーニング及び精製によって、正確なサイズが１８２８ ｂｐである、耐性選択マーカーのないｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミドを得た。図３６（７個の平行なプラスミド生成物）に示すように、ゲル電気泳動の結果により、サイズが正確であることが示されている。精製されたｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミドに対して配列決定検証を行った。図３７に示すように、検証結果により、組換えに成功したことが示されている。
【0214】
例１１：デュアルプラスミドシステムに基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製
【0215】
デュアルプラスミド組換えシステムにおいて、リコンビナーゼ発現システムは、プラスミドベクター上にロードされ、前駆体プラスミドとともに宿主菌株に形質転換された。マルチコピープラスミドは、リコンビナーゼの発現量を向上させ、組換え効率を向上させることができる。デュアルプラスミド組換えシステムは、菌株の改変を必要とせず、一般に商用化された菌株における選択マーカーのないプラスミドの製造に適している。
【0216】
本例は、例２で製造されたｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐ温度感受性プラスミド、及び例７で製造されたｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰを例とし、デュアルプラスミド形質転換に基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製の方法を説明した。しかし該例は、ＦＬＰ－ＦＲＴ組換えシステムに限定されるものではない。具体的な操作は、以下のとおりである。
【0217】
１１．１ ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐプラスミド及びｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰプラスミドの同時形質転換
【0218】
ＪＭ１０８コンピテントを宿主細菌として、１ μＬのｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐプラスミド及び１ μＬのｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰプラスミドを形質転換した。形質転換ステップは例８．１と同様である。
【0219】
１１．２ アラビノースの添加によるＦｌｐ－ＦＲＴ組換え誘導
【0220】
本例において、ＪＭ１０８ ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐ ｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰ培養システムにアラビノースを添加することによってＦｌｐ酵素の発現を誘導し、Ｆｌｐ－ＦＲＴ組換えを実現した。対照群の処理は、実験群と同様である。具体的な操作は、以下のとおりである。
【0221】
１） ３～４個のＪＭ１０８ ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐ ｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰコロニーを選択し、ＬＢ ＋ Ａｍｐ（１００ μｇ／ｍＬ） ＋ Ｋａｎ（３０ μｇ／ｍＬ） ＋ １％グルコースの４ ｍＬの液体培地中でインキュベートし、３０℃及び２２０ ｒｐｍで一晩培養し、菌株を濃縮した。
【0222】
２） 菌株を収集し、抗生物質のないＬＢで二回洗浄し、そして誘導液（誘導液：ＬＢ ＋ ２％アラビノース）で再懸濁させた。３０℃及び２２０ ｒｐｍで組換え誘導を２～８ ｈ行った。
【0223】
３） 組換え時間に達した後、１‰で組換え菌株を４ ｍＬ 抗生物質のないＬＢ単管に転移し、３７℃でｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐの失いを誘導し、そして２２０ ｒｐｍで菌株を一晩培養した。
【0224】
４） 一晩培養された３個の試験管からそれぞれ５ μＬの細菌溶液を取り、抗生物質のないＬＢ固体プレートに線を引き、３７℃の培養箱中で培養し、残りの細菌溶液からプラスミドを抽出し検証を行った。消化システムは表２７に示すとおりである。ＡｈｄＩは、ニューイングランドバイオテクノロジー社から購入可能であり、製品番号が１００７９９６８である。アガロースゲル電気泳動を行った（図３８に示すとおりである）。前駆体プラスミドｐＭＦ９－ＦＲＴ－ＲＦＰのサイズは４３０９ ｂｐである。マーカーのない組換えプラスミドは２０２５ ｂｐである。電気泳動結果により、２～８ ｈ誘導した後、明らかなマーカーのないプラスミドバンド（プラスミドレーン２～４、及びプラスミド消化レーン２～４）が現れ、３７℃で一晩誘導した後、ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐプラスミドが明らかに失われた（プラスミドレーン５～７、及びプラスミド消化レーン５～７）ことが示されている。
【0225】
【表27】
【0226】
１１．３ マーカーのないプラスミドを得るためのＫａｎ及びＡｍｐ耐性逆方向スクリーニング及び精製
【0227】
１） 三つの抗生物質のないプレートからそれぞれ１０個の単一コロニーを選択した。ＬＢ ＋ Ａｍｐプレート及びＬＢ ＋ Ｋａｎプレートには各コロニーが点在しており、３７℃の培養箱中で培養した。なお、各コロニーを抗生物質のないＬＢ液体培地に接種し、３７℃及び２２０ ｒｐｍで培養し、耐性スクリーニングを行った。スクリーニング結果によると、組換えされた１０％～５０％の単一コロニーは、前駆体プラスミド及びＫａｎ耐性遺伝子が除去され、３７℃で誘導した後にｐＳＣ１０１－ａｒａＢＡＤ－ｆｌｐ（ｔｓ）が全て失われ、耐性のない菌株が得られた（図３９に示すとおりであり、５ ｈ群の細菌溶液試料を例とする）。
【0228】
２） ＬＢ ＋ Ａｍｐプレート及びＬＢ ＋ Ｋａｎプレート上で成長せず、抗生物質のないＬＢ液体培地中で成長するコロニーを選択し、保存後にプラスミドを抽出し消化検証を行った。消化システムは表２０に示すとおりである。アガロースゲル電気泳動を行った。検証によると、２ ｈ＃２、５ ｈ＃６及び８ ｈ＃７のプラスミド及び消化生成物は、サイズが正確であり、マーカーのないプラスミド生成物である（図４０に示すとおりである）。
【0229】
例１２：Ｒ６Ｋγレプリコンのデュアルプラスミド形質転換に基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製
【0230】
本例は、例１（４）で製造されたｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅプラスミド及び例６で製造されたｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドを例とし、デュアルプラスミド形質転換に基づく組換え誘導、耐性スクリーニング及びプラスミド精製の方法を説明した。
【0231】
１２．１ ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅプラスミド及びｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの同時形質転換
【0232】
宿主細菌は、南京金斯瑞生物科技有限公司により提供されたｐｉｒ２コンピテントを用いた。１ μＬのｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ及び１ μＬのｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドに対して形質転換を行った。形質転換ステップは例８．１と同様である。
【0233】
１２．２ 組換え、スクリーニング及び精製の特定の実施形態は、例８．２及び８．３と同様である。誘導により、前駆体プラスミドの組換えを実現した。図４１に示すように、結果によると、レーン２は、組換え誘導されていないプラスミド対照であり、ｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ及びｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミドの二つのバンドを含有し、サイズがそれぞれ５８６７ ｂｐ及び３３６９ ｂｐである。レーン３は、組換え誘導して得られた混合プラスミドのバンドであり、バンドは、上から下へ順にｐＳＣ１０１（ｔｓ）－ａｒａＢＡＤ－ｃｒｅ、ｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰ前駆体プラスミド、ＫａｎＲ遺伝子を担持する環状二本鎖ＤＮＡ及びｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰである。バンドサイズはいずれも正確である。後続の耐性スクリーニング及び精製によって、正確なサイズが１５３３ ｂｐである、耐性選択マーカーのないｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰプラスミドを得た。図４２に示すように、結果により、サイズが正確であることが示されている。精製されたｐＭＦ５－ｌｏｘｐ－ＲＦＰプラスミドに対して配列決定検証を行った。図４３に示すように、検証結果は、組換えに成功したことを示している。
【0234】
例１３：マーカーのないプラスミドの大量抽出
【0235】
本例では、例８、９及び１０における、消化が正確であり、プラスミドスーパーコイルバンドが良好であるｐＭＦ９－５．５ ｋｂ、ｐＭＦ６５－ＲＦＰ及びｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミドを例とし、上記プラスミドを担持する宿主大腸菌細胞を南京金斯瑞生物科技有限公司に送ってプラスミドの大量製造を行い、ｈｔｔｐｓ： ／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ－ｇｒａｄｅ－ｐｌａｓｍｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【0236】
ＱＣ検出結果：
ｐＭＦ９－５．５ ｋｂプラスミド：０．５－１．２ ｍｇ／Ｌ。３００ ｎｇのプラスミドに対して消化検証を行った。プラスミドのサイズは６４５０ ｂｐである。ゲル電気泳動検出結果により、バンドサイズが正確である（図４４に示すとおりである）ことが示されている。Ｔａｎｏｎ ＧＩＳにより分析すれば、モノマースーパーコイルプラスミドバンドの割合は９０％超である。プラスミドに対してサンガー配列決定を行い、配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成され、配列決定結果により、配列が正確であり、耐性遺伝子配列がない（図４５に示すとおりである）ことが示されている。
ｐＭＦ９－５．５ ｋｂプラスミド：０．５－１．２ ｍｇ／Ｌ。３００ ｎｇのプラスミドに対して消化検証を行った。プラスミドのサイズは６４５０ ｂｐである。ゲル電気泳動検出結果により、バンドサイズが正確である（図４４に示すとおりである）ことが示されている。Ｔａｎｏｎ ＧＩＳにより分析すれば、モノマースーパーコイルプラスミドバンドの割合は９０％超である。プラスミドに対してサンガー配列決定を行い、配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成され、配列決定結果により、配列が正確であり、耐性遺伝子配列がない（図４５に示すとおりである）ことが示されている。
【0237】
ｐＭＦ６５－ＲＦＰプラスミド：０．３－１ ｍｇ／Ｌ。３００ ｎｇのプラスミドに対して消化検証を行った。ゲル電気泳動検出結果により、プラスミドサイズが１７４３ ｂｐであり、バンドサイズが正確である（図４６に示すとおりである）ことが示されている。Ｔａｎｏｎ ＧＩＳにより分析すれば、モノマースーパーコイルプラスミドバンドの割合は９０％超である。プラスミドに対してサンガー配列決定を行い、配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成され、配列決定結果により、配列が正確であり、耐性遺伝子配列がない（図４７に示すとおりである）ことが示されている。プラスミドに対してＮＧＳ分析を行い、標的娘プラスミドの含有量が９８％超であり、前駆体プラスミドの含有量は０．０２％未満である。
【0238】
ｐＭＦ７－ＲＦＰプラスミド：３．２－４．１ ｍｇ／Ｌ。３００ ｎｇのプラスミドに対して消化検証を行った。ゲル電気泳動検出結果により、プラスミドサイズが１８２８ ｂｐであり、バンドサイズが正確である（図４８に示すとおりである）ことが示されている。Ｔａｎｏｎ ＧＩＳにより分析すれば、モノマースーパーコイルプラスミドバンドの割合は９０％超である。プラスミドに対してサンガー配列決定を行い、配列決定は、南京金斯瑞生物科技有限公司により完成され、配列決定結果により、配列が正確であり、耐性遺伝子配列がない（図４９に示すとおりである）ことが示されている。プラスミドに対してＮＧＳ分析を行い、標的娘プラスミドの含有量が９８％超であり、前駆体プラスミドの含有量は０．０２％未満である。
【0239】
【表28】
【0240】
本発明の実施形態は、上記例に記載のものに限定されない。本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、当業者は、形態及び詳細において本発明に様々な変更及び改良を加えることができ、これらはいずれも本発明の保護範囲に入ると考えられる。
【0241】
本明細書で言及されるいくつかの核酸配列情報は以下のとおりである。
【表29】
【0242】
本明細書で言及されるいくつかのプライマー配列情報は以下のとおりである。
引用文献：
［１］ Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ Ｉ （１９７８）． Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ３２（１）， ４６９－５０８
［２］ Ｓｃｈｌｅｅｆ， Ｍ． （２０１３） Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ａｎｄ Ｍｉｎｉｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ
［３］ Ｌｕｋｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２７， ６４５４－６４５９
【表30】
［１］ Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ Ｉ （１９７８）． Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ３２（１）， ４６９－５０８
［２］ Ｓｃｈｌｅｅｆ， Ｍ． （２０１３） Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ａｎｄ Ｍｉｎｉｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ
［３］ Ｌｕｋｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２７， ６４５４－６４５９
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
前駆体プラスミドであって、１） 複製開始部位と、
２） 選択マーカー遺伝子と、
３） 標的遺伝子又は前記標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位と、
４） 対になった組換え部位とを含み、ここで、
前記対になった組換え部位により、前記前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができ、
前記娘プラスミドは、前記複製開始部位と前記標的遺伝子とを含むか、又は前記複製開始部位と前記クローニング部位とを含み、そして、
前記環状二本鎖ＤＮＡは、前記選択マーカー遺伝子を含む、前駆体プラスミド。
【請求項2】
前記対になった組換え部位の配列は、同一方向である、請求項１に記載の前駆体プラスミド。
【請求項3】
前記複製開始部位は、前記標的遺伝子又は前記クローニング部位に隣接し、前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位並びに前記標的遺伝子の上流及び下流に隣接し、又は前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位及び前記クローニング部位の上流及び下流に隣接し、前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、請求項１又は２に記載の前駆体プラスミド。
【請求項4】
前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘＰ配列、同一方向のＦＲＴ配列及び同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列から選択され、前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項5】
前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、請求項３に記載の前駆体プラスミド。
【請求項6】
ｒｏｐ遺伝子配列、エンドヌクレアーゼのコード配列及びプラスミド複製ヘルパータンパク質のコード配列のうちの一つ又は複数をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項7】
前記選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項8】
前記リコンビナーゼのコード遺伝子をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項9】
前記前駆体プラスミドは、適切な条件下で、前記リコンビナーゼを発現することができる、請求項８に記載の前駆体プラスミド。
【請求項10】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の前駆体プラスミド。
【請求項11】
選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造する方法であって、１） 請求項１～１０のいずれか一項に記載の前駆体プラスミドを、前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞に導入し、前記選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞をスクリーニングすることと、
２） ステップ１） でスクリーニングされた宿主細胞を培養して、前記リコンビナーゼの前記宿主細胞での発現を可能にし、前記宿主細胞を培養し、前記選択マーカー遺伝子を発現しない宿主細胞をスクリーニングすることと、
３）前記娘プラスミドを得るために、ステップ２） でスクリーニングされた宿主細胞を培養し、プラスミドを抽出することとを含む、方法。
【請求項12】
前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含み、或いは、記前駆体プラスミドは、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、且つ前記前駆体プラスミドは、前記宿主細胞で前記リコンビナーゼを発現することができる、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記宿主細胞は、大腸菌である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造するためのセットであって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の前駆体プラスミドを含み、前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞をさらに含む、セット。
【請求項17】
前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、前記リコンビナーゼはｐｈｉＣ３１リコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項１６に記載のセット。
【請求項18】
前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む、請求項１６又は１７に記載のセット。
【請求項19】
前記発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む、請求項１８に記載のセット。
【請求項20】
前記宿主細胞は、大腸菌である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のセット。
【請求項21】
複製開始部位と標的遺伝子とを含む娘プラスミドであって、抗生物質耐性遺伝子を含まない、娘プラスミド。
【請求項22】
前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、請求項２１に記載の娘プラスミド。
【請求項23】
前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、請求項２１又は２２に記載の娘プラスミド。
【請求項24】
前記標的遺伝子は、プロモーター、タンパク質を発現するコード遺伝子及びターミネーターの配列のうちの一つ又は複数を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の娘プラスミド。
【請求項25】
宿主細胞内で複製され得る、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の娘プラスミド。
【請求項26】
スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記宿主細胞内で複製することができる、請求項２５に記載の娘プラスミド。
【請求項27】
請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法によって得られた娘プラスミド。
【請求項28】
請求項２１～２７のいずれか一項に記載の娘プラスミドを含む宿主細胞であって、前記娘プラスミドは、前記宿主細胞内で複製することができ、前記娘プラスミドは、培養、収集及び抽出によって前記宿主細胞から得られる、宿主細胞。
【請求項29】
スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記娘プラスミドを増幅することができる、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項30】
請求項２１～２７のいずれか一項に記載の娘プラスミドを含む組成物であって、前記娘プラスミドの含有量は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり、前記組成物における娘プラスミドの含有量を測定するための方法は、ＮＧＳ分析方法又はゲル電気泳動イメージング分析方法である、組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0102】
本発明による選択マーカーのないプラスミドは、プラスミドの安全性及び安定性を向上させるとともに細胞傷害性を低下させるために、ＤＮＡ送達ベクター又はウイルスパッケージングプラスミドベクターとして、遺伝子及び細胞療法分野に用いられ得る。
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］前駆体プラスミドであって、
１） 複製開始部位と、
２） 選択マーカー遺伝子と、
３） 標的遺伝子又は前記標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位と、
４） 対になった組換え部位とを含み、ここで、
前記対になった組換え部位により、前記前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができ、
前記娘プラスミドは、前記複製開始部位と前記標的遺伝子とを含むか、又は前記複製開始部位と前記クローニング部位とを含み、そして、
前記環状二本鎖ＤＮＡは、前記選択マーカー遺伝子を含む、前駆体プラスミド。
［２］前記対になった組換え部位の配列は、同一方向である、上記［１］に記載の前駆体プラスミド。
［３］前記複製開始部位は、前記標的遺伝子又は前記クローニング部位に隣接し、前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位並びに前記標的遺伝子の上流及び下流に隣接し、又は前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位及び前記クローニング部位の上流及び下流に隣接する、上記［１］又は［２］に記載の前駆体プラスミド。
［４］前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘＰ配列、同一方向のＦＲＴ配列及び同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列から選択される、上記［１］～［３］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［５］前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列である、上記［４］に記載の前駆体プラスミド。
［６］前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、上記［１］～［５］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［７］前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、上記［６］に記載の前駆体プラスミド。
［８］ｒｏｐ遺伝子配列、エンドヌクレアーゼのコード配列及びプラスミド複製ヘルパータンパク質のコード配列のうちの一つ又は複数をさらに含む、上記［１］～［７］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［９］前記選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である、上記［１］～［８］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１０］他のプラスミド骨格配列をさらに含む、上記［１］～［９］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１１］前記リコンビナーゼのコード遺伝子をさらに含む、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１２］前記前駆体プラスミドは、適切な条件下で、前記リコンビナーゼを発現することができる、上記［１１］に記載の前駆体プラスミド。
［１３］前記環状二本鎖ＤＮＡは、ｒｏｐ遺伝子配列、他のプラスミド骨格配列及び前記リコンビナーゼのコード遺伝子のうちの一つ又は複数をさらに含む、上記［８］～［１１］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１４］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１５］上記［１］～［１４］のいずれかに記載の前駆体プラスミドの、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドの製造における用途。
［１６］選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造する方法であって、
１） 上記［１］～［１４］のいずれかに記載の前駆体プラスミドを、前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞に導入し、前記選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞をスクリーニングすることと、
２） ステップ１） でスクリーニングされた宿主細胞を培養して、前記リコンビナーゼの前記宿主細胞での発現を可能にし、前記宿主細胞を培養し、前記選択マーカー遺伝子を発現しない宿主細胞をスクリーニングすることと、
３）前記娘プラスミドを得るために、ステップ２） でスクリーニングされた宿主細胞を培養し、プラスミドを抽出することとを含む、方法。
［１７］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである、上記［１６］に記載の方法。
［１８］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、上記［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記前駆体プラスミドは、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、且つ前記前駆体プラスミドは、前記宿主細胞で前記リコンビナーゼを発現することができる、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記リコンビナーゼは、前記宿主細胞内で誘導的に発現される、上記［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］前記発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む、上記［１９］又は［２１］に記載の方法。
［２３］前記宿主細胞は、大腸菌である、上記［１６］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造するためのセットであって、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の前駆体プラスミドを含む、セット。
［２５］前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞をさらに含む、上記［２４］に記載のセット。
［２６］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、前記リコンビナーゼはｐｈｉＣ３１リコンビナーゼである、上記［２４］又は［２５］に記載のセット。
［２７］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、上記［２４］～［２６］のいずれかに記載のセット。
［２８］前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む、上記［２５］～［２７］のいずれかに記載のセット。
［２９］前記リコンビナーゼは、前記宿主細胞で誘導的に発現される、上記［２５］～［２８］のいずれかに記載のセット。
［３０］前記発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む、上記［２８］又は［２９］に記載のセット。
［３１］前記宿主細胞は、大腸菌である、上記［２５］～［３０］のいずれかに記載のセット。
［３２］標的遺伝子を前記クローニング部位に挿入することにより、組換えてから形成された前記娘プラスミドは、前記標的遺伝子を含む、上記［２４］～［３１］のいずれかに記載のセット。
［３３］複製開始部位と標的遺伝子とを含む娘プラスミドであって、抗生物質耐性遺伝子を含まない、娘プラスミド。
［３４］前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、上記［３３］に記載の娘プラスミド。
［３５］前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、上記［３３］又は［３４］に記載の娘プラスミド。
［３６］前記標的遺伝子は、プロモーター、タンパク質を発現するコード遺伝子及びターミネーターの配列のうちの一つ又は複数を含む、上記［３３］～［３５］のいずれかに記載の娘プラスミド。
［３７］宿主細胞内で複製され得る、上記［３３］～［３６］のいずれかに記載の娘プラスミド。
［３８］スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記宿主細胞内で複製することができる、上記［３７］に記載の娘プラスミド。
［３９］上記［１６］～［２３］のいずれかに記載の方法によって得られた娘プラスミド。
［４０］上記［３３］～［３９］のいずれかに記載の娘プラスミドを含む宿主細胞であって、前記娘プラスミドは、前記宿主細胞内で複製することができる、宿主細胞。
［４１］前記娘プラスミドは、培養、収集及び抽出によって前記宿主細胞から得られる、上記［４０］に記載の宿主細胞。
［４２］スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記娘プラスミドを増幅することができる、上記［４０］又は［４１］に記載の宿主細胞。
［４３］上記［３３］～［３９］のいずれかに記載の娘プラスミドを含む組成物であって、前記娘プラスミドの含有量は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、組成物。
［４４］前記組成物における娘プラスミドの含有量を測定するための方法は、ＮＧＳ分析方法又はゲル電気泳動イメージング分析方法である、上記［４３］に記載の組成物。
［４５］前記ＮＧＳ分析方法によって測定された前記組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、上記［４３］又は［４４］に記載の組成物。
［４６］前記ゲル電気泳動イメージング分析方法によって測定された前記組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、上記［４３］～［４５］のいずれかに記載の組成物。
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］前駆体プラスミドであって、
１） 複製開始部位と、
２） 選択マーカー遺伝子と、
３） 標的遺伝子又は前記標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位と、
４） 対になった組換え部位とを含み、ここで、
前記対になった組換え部位により、前記前駆体プラスミドは、リコンビナーゼの存在下で、自己組換えを行って、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミド分子及び環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができ、
前記娘プラスミドは、前記複製開始部位と前記標的遺伝子とを含むか、又は前記複製開始部位と前記クローニング部位とを含み、そして、
前記環状二本鎖ＤＮＡは、前記選択マーカー遺伝子を含む、前駆体プラスミド。
［２］前記対になった組換え部位の配列は、同一方向である、上記［１］に記載の前駆体プラスミド。
［３］前記複製開始部位は、前記標的遺伝子又は前記クローニング部位に隣接し、前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位並びに前記標的遺伝子の上流及び下流に隣接し、又は前記対になった組換え部位は、それぞれ前記複製開始部位及び前記クローニング部位の上流及び下流に隣接する、上記［１］又は［２］に記載の前駆体プラスミド。
［４］前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘＰ配列、同一方向のＦＲＴ配列及び同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列から選択される、上記［１］～［３］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［５］前記対になった組換え部位は、同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列である、上記［４］に記載の前駆体プラスミド。
［６］前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、上記［１］～［５］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［７］前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、上記［６］に記載の前駆体プラスミド。
［８］ｒｏｐ遺伝子配列、エンドヌクレアーゼのコード配列及びプラスミド複製ヘルパータンパク質のコード配列のうちの一つ又は複数をさらに含む、上記［１］～［７］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［９］前記選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である、上記［１］～［８］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１０］他のプラスミド骨格配列をさらに含む、上記［１］～［９］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１１］前記リコンビナーゼのコード遺伝子をさらに含む、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１２］前記前駆体プラスミドは、適切な条件下で、前記リコンビナーゼを発現することができる、上記［１１］に記載の前駆体プラスミド。
［１３］前記環状二本鎖ＤＮＡは、ｒｏｐ遺伝子配列、他のプラスミド骨格配列及び前記リコンビナーゼのコード遺伝子のうちの一つ又は複数をさらに含む、上記［８］～［１１］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１４］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、３４、３９～４２又は４７に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の前駆体プラスミド。
［１５］上記［１］～［１４］のいずれかに記載の前駆体プラスミドの、選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドの製造における用途。
［１６］選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造する方法であって、
１） 上記［１］～［１４］のいずれかに記載の前駆体プラスミドを、前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞に導入し、前記選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞をスクリーニングすることと、
２） ステップ１） でスクリーニングされた宿主細胞を培養して、前記リコンビナーゼの前記宿主細胞での発現を可能にし、前記宿主細胞を培養し、前記選択マーカー遺伝子を発現しない宿主細胞をスクリーニングすることと、
３）前記娘プラスミドを得るために、ステップ２） でスクリーニングされた宿主細胞を培養し、プラスミドを抽出することとを含む、方法。
［１７］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである、上記［１６］に記載の方法。
［１８］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、上記［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記前駆体プラスミドは、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、且つ前記前駆体プラスミドは、前記宿主細胞で前記リコンビナーゼを発現することができる、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記リコンビナーゼは、前記宿主細胞内で誘導的に発現される、上記［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］前記発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む、上記［１９］又は［２１］に記載の方法。
［２３］前記宿主細胞は、大腸菌である、上記［１６］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］選択マーカー遺伝子のない娘プラスミドを製造するためのセットであって、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の前駆体プラスミドを含む、セット。
［２５］前記リコンビナーゼを発現することができるか又はその発現を補助することができる宿主細胞をさらに含む、上記［２４］に記載のセット。
［２６］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘＰ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、前記対になった組換え部位は同一方向のＦＲＴ配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、又は前記対になった組換え部位は同一方向のａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列であり、前記リコンビナーゼはｐｈｉＣ３１リコンビナーゼである、上記［２４］又は［２５］に記載のセット。
［２７］前記対になった組換え部位は同一方向のｌｏｘ７１配列及びｌｏｘ６６配列であり、且つ前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、上記［２４］～［２６］のいずれかに記載のセット。
［２８］前記宿主細胞は、そのゲノムに前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含み、又は前記宿主細胞は、前記リコンビナーゼのコード遺伝子を含有する発現ベクターを含む、上記［２５］～［２７］のいずれかに記載のセット。
［２９］前記リコンビナーゼは、前記宿主細胞で誘導的に発現される、上記［２５］～［２８］のいずれかに記載のセット。
［３０］前記発現ベクターは、条件的誘導欠失型プラスミド複製エレメントを含む、上記［２８］又は［２９］に記載のセット。
［３１］前記宿主細胞は、大腸菌である、上記［２５］～［３０］のいずれかに記載のセット。
［３２］標的遺伝子を前記クローニング部位に挿入することにより、組換えてから形成された前記娘プラスミドは、前記標的遺伝子を含む、上記［２４］～［３１］のいずれかに記載のセット。
［３３］複製開始部位と標的遺伝子とを含む娘プラスミドであって、抗生物質耐性遺伝子を含まない、娘プラスミド。
［３４］前記複製開始部位は、ｐＵＣの複製開始部位、ｐＭＢ１及びその誘導体の複製開始部位、ＣｏｌＥ１の複製開始部位並びにＲ６Ｋγの複製開始部位から選択される、上記［３３］に記載の娘プラスミド。
［３５］前記複製開始部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３～４６に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し、且つ複製始点となり得るヌクレオチド配列とを含む、上記［３３］又は［３４］に記載の娘プラスミド。
［３６］前記標的遺伝子は、プロモーター、タンパク質を発現するコード遺伝子及びターミネーターの配列のうちの一つ又は複数を含む、上記［３３］～［３５］のいずれかに記載の娘プラスミド。
［３７］宿主細胞内で複製され得る、上記［３３］～［３６］のいずれかに記載の娘プラスミド。
［３８］スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記宿主細胞内で複製することができる、上記［３７］に記載の娘プラスミド。
［３９］上記［１６］～［２３］のいずれかに記載の方法によって得られた娘プラスミド。
［４０］上記［３３］～［３９］のいずれかに記載の娘プラスミドを含む宿主細胞であって、前記娘プラスミドは、前記宿主細胞内で複製することができる、宿主細胞。
［４１］前記娘プラスミドは、培養、収集及び抽出によって前記宿主細胞から得られる、上記［４０］に記載の宿主細胞。
［４２］スクリーニングストレスのない細胞培養条件下で、前記娘プラスミドを増幅することができる、上記［４０］又は［４１］に記載の宿主細胞。
［４３］上記［３３］～［３９］のいずれかに記載の娘プラスミドを含む組成物であって、前記娘プラスミドの含有量は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、組成物。
［４４］前記組成物における娘プラスミドの含有量を測定するための方法は、ＮＧＳ分析方法又はゲル電気泳動イメージング分析方法である、上記［４３］に記載の組成物。
［４５］前記ＮＧＳ分析方法によって測定された前記組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、上記［４３］又は［４４］に記載の組成物。
［４６］前記ゲル電気泳動イメージング分析方法によって測定された前記組成物における娘プラスミドの含有量は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である、上記［４３］～［４５］のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】