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特表2024-515697再構成されていないＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を含む幹細胞及びその使用方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-10

(54)【発明の名称】再構成されていないＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を含む幹細胞及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

C12N 5/10 20060101AFI20240403BHJP

A61K 35/17 20150101ALI20240403BHJP

A61K 35/545 20150101ALI20240403BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240403BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240403BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20240403BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240403BHJP

C12N 5/0735 20100101ALN20240403BHJP

C12N 15/12 20060101ALN20240403BHJP

C12N 15/13 20060101ALN20240403BHJP

C12N 15/62 20060101ALN20240403BHJP

C12N 5/0783 20100101ALN20240403BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/17

A61K35/545

A61P43/00 105

A61P35/00

A61P37/02

A61K48/00

C12N5/0735

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023564480

(86)(22)【出願日】2022-04-22

(85)【翻訳文提出日】2023-12-18

(86)【国際出願番号】 CA2022050622

(87)【国際公開番号】W WO2022221962

(87)【国際公開日】2022-10-27

(31)【優先権主張番号】63/178,990

(32)【優先日】2021-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523142272

【氏名又は名称】サニーブルックリサーチインスティチュート

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋香元

(72)【発明者】

【氏名】ツニガ－プルッカー，ジュアンカルロス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB071

4C084ZB211

4C084ZB261

4C087AA01

4C087BB37

4C087BB63

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB21

4C087ZB26

(57)【要約】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子再構成を受けることができない幹細胞を生成する方法が提供される。具体的には、それぞれ、再構成されていないＴＣＲ遺伝子座またはＢＣＲ遺伝子座を含むＴ細胞系列またはＢ細胞系列の細胞の生成に使用するための方法、組成物及びキットを５提供する。一実施形態では、細胞は、関心の抗原に特異性を付与するＴＣＲ、ｂＣＲまたはＣＡＲを発現するように更に操作される。細胞、組成物、キット及びそれらの使用も提供される。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再構成（ＴＣＲ）を受けることができない幹細胞または前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養すること、を含み、
前記幹細胞または前記前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、前記方法。

【請求項2】

前記方法が、（ｂ）Ｔ細胞系列の細胞を単離することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な前記少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質が、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な前記少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質が、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質４（ＸＲＣＣ４）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、非相同末端結合因子１（ＮＨＥＪ１）、ＸＲＣＣ４及びＸＬＦのパラログ（ＰＡＸＸ）、ＤＮＡポリメラーゼλ及びＤＮＡポリメラーゼμからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記幹細胞または前記前駆細胞が、ヒト細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、前駆Ｔ（ｐｒｏＴ）細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞またはＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋二重陽性細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ３＋単一陽性細胞またはＣＤ４＋ＣＤ３＋単一陽性細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲβ鎖及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作されることを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、前記ＴＣＲβ鎖及び前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの前記少なくとも１つを発現する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ＴＣＲβ鎖をコードする核酸を含むように、前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｔ細胞系列の前記細胞を操作することを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、ＣＡＲをコードする核酸を更に含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＴＣＲまたはＣＡＲが、抗原、任意選択的に、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、または自己抗原に特異性を付与する、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法によって生成される、Ｔ細胞系列の細胞。

【請求項17】

前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞またはＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋二重陽性細胞である、請求項１６に記載の細胞。

【請求項18】

前記細胞が、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ３＋単一陽性細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ３＋単一陽性細胞である、請求項１６に記載の細胞。

【請求項19】

幹細胞または前駆細胞であって、前記幹細胞または前記前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、前記幹細胞または前記前駆細胞。

【請求項20】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な前記少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質が、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である、請求項１９に記載の幹細胞または前駆細胞。

【請求項21】

【請求項22】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲβ鎖及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを更に含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞。

【請求項23】

ＴＣＲβ鎖をコードする核酸を更に含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞。

【請求項24】

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞。

【請求項25】

前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２４に記載の幹細胞または前駆細胞。

【請求項26】

前記幹細胞または前記前駆細胞が、ヒト細胞である、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞。

【請求項27】

Ｔ細胞系列の細胞を生成するための、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞の使用。

【請求項28】

（ｉ）請求項１９～２７のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞と、（ｉｉ）前記Ｔ細胞系列の細胞を生成するための、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞の使用説明書と、を含む、キット。

【請求項29】

対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することであって、前記幹細胞または前記前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、前記培養することと、
（ｉｉ）有効量の前記細胞または前駆細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
前記幹細胞または前記前駆細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作される、前記方法。

【請求項30】

対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養し、前記Ｔ細胞系列の細胞を単離することであって、前記幹細胞または前記前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、前記培養し、単離することと、
（ｉｉ）有効量の前記Ｔ細胞系列の前記細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｔ細胞系列の前記細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作される、前記方法。

【請求項31】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な前記少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質が、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である、請求項２９または３０に記載の方法。

【請求項32】

【請求項33】

前記疾患が、がんであり、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

Ｔ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子再構成を受けることができない幹細胞または前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養すること、を含み、
前記幹細胞または前記前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、前記方法を提供する。

【請求項35】

前記方法が、（ｂ）前記Ｂ細胞系列の細胞を単離することを更に含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な前記少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質が、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項37】

【請求項38】

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記幹細胞または前記前駆細胞が、ヒト細胞である、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記Ｂ細胞系列の前記細胞が、ＣＤ２０＋またはＣＤ１９＋細胞である、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記Ｂ細胞系列の前記細胞が、腫瘍浸潤性Ｂ細胞（ＴＩＢ）である、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｂ細胞系列の前記細胞が、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＢＣＲβ鎖をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作されることを更に含む、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｂ細胞系列の前記細胞が、前記Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＢＣＲβ鎖を発現する、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ＢＣＲまたはＣＡＲが、抗原、任意選択的に、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原または自己抗原に特異性を付与する、請求項４３または４４に記載の方法。

【請求項46】

前記細胞が、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法によって生成される、前記Ｂ細胞系列の細胞。

【請求項47】

前記Ｂ細胞系列の前記細胞が、ＣＤ２０＋またはＣＤ１９＋細胞である、請求項４６に記載の細胞。

【請求項48】

前記Ｂ細胞系列の前記細胞が、腫瘍浸潤性Ｂ細胞（ＴＩＢ）である、請求項４６に記載の細胞。

【請求項49】

前記Ｂ細胞系列の細胞を生成するための、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞の使用。

【請求項50】

（ｉ）請求項１９～２１のいずれか一項に記載の幹細胞または前駆細胞と、（ｉｉ）前記Ｂ細胞系列の細胞を生成するための、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の前記幹細胞または前記前駆細胞の使用説明書と、を含む、キット。

【請求項51】

対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することであって、前記幹細胞または前記前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、前記培養することと、
（ｉｉ）有効量の前記幹細胞または前記前駆細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
前記幹細胞または前記前駆細胞が、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする最小１つの核酸を含むように操作される、前記方法。

【請求項52】

対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養し、前記Ｂ細胞系列の細胞を単離することであって、前記幹細胞または前記前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、前記培養し、単離することと、
（ｉｉ）有効量の前記Ｂ細胞系列の前記細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
前記幹細胞もしくは前駆細胞、または前記Ｂ細胞系列の前記細胞が、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする最小１つの核酸を含むように操作される、前記方法。

【請求項53】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な前記少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質が、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である、請求項５１または５２に記載の方法。

【請求項54】

【請求項55】

前記疾患が、がんであり、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２３日に出願された米国仮出願第６３／１７８，９９０号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本出願は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子再構成を受けることができない幹細胞に関する。具体的には、本出願は、それぞれ、再構成されていないＴＣＲ遺伝子座またはＢＣＲ遺伝子座を含むＴ細胞系列またはＢ細胞系列の細胞の生成に使用するための方法、組成物、及びキットに関する。

【背景技術】

【0003】

抗原を特異的に認識するＴ細胞の能力は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の独特に再構成されたゲノム遺伝子座によってコードされる特異的Ｔ細胞受容体の発現によって達成される。Ｔ細胞の発達は、抗原特異的受容体をコードするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座の再構成の成功に基づいている。

【0004】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）１及び２は、Ｂ細胞受容体及びＴ細胞受容体遺伝子座の再構成に必要な２つの必須ＤＮＡプロセシング酵素である（Ｓｃｈａｔｚａｔａｌ．，１９８９；Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒｅｔａｌ，１９９０）。ＲＡＧ１／２は、最初に、各Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントに隣接して見出される組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を認識して結合する複合体を形成することによって、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを開始する。別のＲＳＳとのシナプスの形成時に、ＲＡＧ複合体は、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、これは、非相同末端結合プロセスによって修復される（ＪｏｎｅｓａｎｄＧｅｌｌｅｒｔ，２００４；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ，２０１９）。これは、最終的に、数百のＶ（Ｄ）Ｊセグメントから数百万の異なる抗原受容体を潜在的に生成するために、異なるＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの不完全な結合をもたらす。

【発明の概要】

【0005】

本発明者らは、ＲＡＧ２遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９指向性欠失（ＲＡＧ２－ＫＯ）を用いてヒト多能性幹細胞を分化させ、ヒトＲＡＧ２欠損発達Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性段階まで進行することを示した。本発明者らはまた、再構成されたＴＣＲβ鎖の発現が、二重陽性段階での発達ヒトＴ細胞の細胞生存及び／または増殖を促進することを示した。

【0006】

したがって、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再構成（ＴＣＲ）を受けることができない幹細胞または前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することを含み、
幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、方法を提供する。

【0007】

一実施形態では、方法は、（ｂ）Ｔ細胞系列の細胞を単離することを更に含む。

【0008】

別の実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質は、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である。

【0009】

別の実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質は、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質４（ＸＲＣＣ４）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、非相同末端結合因子１（ＮＨＥＪ１）、ＸＲＣＣ４及びＸＬＦのパラログ（ＰＡＸＸ）、ＤＮＡポリメラーゼλ及びＤＮＡポリメラーゼμからなる群から選択される。

【0010】

別の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。任意選択的に、多能性幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0011】

別の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。

【0012】

別の実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、前駆Ｔ（ｐｒｏＴ）細胞、任意選択的に、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋前駆Ｔ（ｐｒｏＴ）細胞である。

【0013】

別の実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞またはＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋二重陽性細胞である。

【0014】

別の実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ３＋単一陽性細胞またはＣＤ４＋ＣＤ３＋単一陽性細胞である。

【0015】

別の実施形態では、方法は、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲβ鎖及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作されることを更に含む。

【0016】

別の実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲβ鎖及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの少なくとも１つを発現する。

【0017】

別の実施形態では、方法は、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸を含むように、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞を操作することを更に含む。更なる実施形態では、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸を含む幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞は、ＴＣＲβ鎖またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含まない。

【0018】

別の実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞は、ＴＣＲβ鎖を発現する。

【0019】

別の実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞は、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸及びＣＡＲをコードする核酸を含む。

【0020】

別の実施形態では、ＴＣＲまたはＣＡＲは、抗原、任意選択的に、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原または自己抗原に特異性を付与する。

【0021】

本開示はまた、Ｔ細胞系列の細胞を提供し、細胞は、本明細書に記載の方法によって生成される。

【0022】

一実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞またはＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋二重陽性細胞である。

【0023】

別の実施形態では、細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ３＋単一陽性細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ３＋単一陽性細胞である。

【0024】

本開示はまた、幹細胞または前駆細胞であって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、幹細胞または前駆細胞を提供する。

【0025】

一実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質は、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である。

【0026】

【0027】

別の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲβ鎖及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを更に含む。

【0028】

別の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸を更に含む。更なる実施形態では、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸を含む幹細胞もしくは前駆細胞は、ＴＣＲβ鎖またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含まない。

【0029】

別の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞、任意選択的に、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0030】

別の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。

【0031】

本開示はまた、Ｔ細胞系列の細胞を生成するための、本明細書に記載される幹細胞または前駆細胞の使用を提供する。

【0032】

本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載される幹細胞または前駆細胞と、（ｉｉ）Ｔ細胞系列の細胞を生成するための、本明細書に記載される幹細胞または前駆細胞の使用説明書と、を含む、キットを提供する。

【0033】

本開示は、対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、培養することと、
（ｉｉ）治療を必要とする対象に、有効量の細胞または前駆細胞を投与することと、を含み、
幹細胞または前駆細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作される、方法を更に提供する。

【0034】

本開示はまた、対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養し、Ｔ細胞系列の細胞を単離することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、培養して単離することと、
（ｉｉ）有効量のＴ細胞系列の細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作される、方法を提供する。

【0035】

一実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質は、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である。

【0036】

【0037】

別の実施形態では、疾患は、がんであり、抗原は、腫瘍関連抗原である。

【0038】

本開示はまた、Ｔ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子再構成を受けることができない幹細胞または前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することを含み、
幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、方法を提供する。

【0039】

一実施形態では、方法は、（ｂ）Ｂ細胞系列の細胞を単離することを更に含む。

【0040】

別の実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質は、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である。

【0041】

【0042】

別の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞、任意選択的に、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0043】

別の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。

【0044】

別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、ＣＤ２０＋またはＣＤ１９＋細胞である。

【0045】

別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、腫瘍浸潤性Ｂ細胞（ＴＩＢ）である。

【0046】

別の実施形態では、方法は、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＢ細胞系列の細胞が、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＢＣＲβ鎖及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作されることを更に含む。

【0047】

別の実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＢ細胞系列の細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＢＣＲβ鎖またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。

【0048】

別の実施形態では、ＢＣＲまたはＣＡＲは、抗原、任意選択的に、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原または自己抗原に特異性を付与する。

【0049】

本開示はまた、Ｂ細胞系列の細胞を提供し、細胞は、本明細書に記載の方法によって生成される。

【0050】

一実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、ＣＤ２０＋またはＣＤ１９＋細胞である。

【0051】

別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、腫瘍浸潤性Ｂ細胞（ＴＩＢ）である。

【0052】

本開示はまた、Ｂ細胞系列の細胞を生成するための、本明細書に記載される幹細胞または前駆細胞の使用を提供する。

【0053】

本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載される幹細胞または前駆細胞と、（ｉｉ）Ｂ細胞系列の細胞を生成するための、本明細書に記載される幹細胞または前駆細胞の使用説明書と、を含む、キットを提供する。

【0054】

本開示はまた、対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、培養することと、
（ｉｉ）有効量の幹細胞または前駆細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
幹細胞または前駆細胞が、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸を含むように操作される、方法を提供する。

【0055】

本開示はまた、対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養し、Ｂ細胞系列の細胞を単離することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、培養し、単離することと、
（ｉｉ）有効量のＢ細胞系列の細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
幹細胞もしくは前駆細胞、またはＢ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸を含むように操作される、方法を提供する。

【0056】

一実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質は、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２である。

【0057】

【0058】

別の実施形態では、疾患は、がんであり、抗原は、腫瘍関連抗原である。

【0059】

本出願の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかになる。しかしながら、発明を実施するための形態及び特定の実施例は、本出願の好ましい実施形態を示すが、本出願の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この発明を実施するための形態から当業者には明らかになるため、単に例示としてのみ与えられることを理解されたい。

【0060】

ここで、本開示の実施形態を、以下の図面と関連して説明する。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】ＲＡＧ２－ＫＯｈＥＳＣ系統の作製及び特徴付けを示す。Ａは、クローン１及び４のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化ＲＡＧ２のゲノムＤＮＡのＳａｎｇｅｒ配列決定を示す。変更された対立遺伝子は、クロマトグラフ及びその上の配列に示されているが、改変された対立遺伝子及びＷＴ対立遺伝子のアラインメントは下に示されている。Ｂは、ＲＡＧ２－ＫＯクローン（１及び４）及び対照ＷＴｈＥＳＣからのインビトロ由来Ｔ系列細胞、またはＴ－ＡＬＬ患者から得られた対照ＰＢＭＣのＲＡＧ２タンパク質発現のための免疫ブロットを示す。ＧＡＰＤＨは、負荷対照の役割を果たす。Ｃは、多能性マーカーのためのＲＡＧ２－ＫＯｈＥＳＣクローンの免疫蛍光を示す。スケールバーは１００μｍに対応する。Ｄは、奇形腫形成アッセイの外胚葉（神経組織）、中胚葉（軟骨）及び内胚葉（腺組織）系列に対するＲＡＧ２－ＫＯｈＥＳＣクローンの免疫組織化学を示す。Ｅは、対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及びＲＡＧ２－ＫＯ－４ｈＥＳＣからの胚様体分化の８日後のＣＤ３４^＋造血性内皮細胞の収率及び富化を示す。（ｎ＝３つの独立した実験のうちの３つ）。

【図2】対照ＷＴ及びＲＡＧ２－ＫＯｈＥＳＣ系統からのＴ細胞の発達を示す。Ａは、示されるように、ｄ８ＥＢ＋１０－３４ｄＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ共培養物からの対照ＷＴ及びＲＡＧ２－ＫＯ（クローン１及び４）ｈＰＳＣ由来Ｔ系列細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。細胞をＤＡＰＩ^－ＣＤ４５^＋について予めゲートした。（ｎ＝５つの独立した実験のうちの５つ）。Ｂは、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳでの示される培養日数後のＣＤ３４^＋細胞の１０，０００入力当たりの対照ＷＴ及びＲＡＧ２－ＫＯ（クローン１及び４）ｈＰＳＣ由来Ｔ系列細胞の細胞数を示す。（ｎ＝３つの独立した実験のうちの３つ）。

【図3】（Ａ～Ｂ）ＲＡＧ２－ＫＯＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ細胞における再構成されたＴＣＲβ鎖の強制発現が細胞拡大をもたらすことを示す。Ａは、実験アプローチの概略図を示す。Ｂは、ＣＤ３４^＋細胞の１０，０００入力当たりの空ベクター（ｄＴｏｍａｔｏ）、ＴＣＲアルファ鎖（ＴＲＡ１３８３ｉ）またはＴＣＲベータ鎖（ＴＲＢ１３８３ｉ）でレトロウイルスで形質導入されたＲＡＧ２－ＫＯＤＰ（クローン１及び４）の細胞計数を示す。形質導入Ｔ系列細胞（ｄＴｏｍａｔｏ^＋）を、最初にＣＤ７^＋ＣＤ５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋二重陽性細胞について選別した後、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ上で１０日間再培養した。（ｎ＝３つの独立した実験のうちの３つ）。

【図4】（Ａ～Ｂ）ＴＣＲ遺伝子発現及びＣＤ４^＋ＣＤ８^＋シグネチャー遺伝子発現を示す。Ａは、対照ＷＴＤＰにおいて発現されるが、ＲＡＧ２－ＫＯ１／４ＤＰ及びＴＣＲβ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯ１／４ＤＰには存在しない特定のＴＣＲ遺伝子のヒートマップ分析を示す。Ｂは、ＲＡＧ２－ＫＯ、ＴＣＲβ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯ及び臍帯血（ＵＣＢ）由来ＤＰにおけるＣＤ４^＋ＣＤ８^＋シグネチャー遺伝子の発現（表３に示される胸腺ＤＰシグネチャー遺伝子によって決定される）を示す。（対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１、ＲＡＧ２－ＫＯ－４及びＵＣＢについてはｎ＝２、１つの独立した実験のＴＣＲβ形質導入されたＲＡＧ２－ＫＯ－１及びＴＣＲβ形質導入されたＲＡＧ２－ＫＯ－４についてはｎ＝１）。

【図5】対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ及びＲＡＧ２－ＫＯＴＣＲβ形質導入ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ細胞のトランスクリプトーム分析を示す。対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ１／４及びＴＣＲβ^＋ＲＡＧ２－ＫＯ１／４ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰのＲＮＡ－ｓｅｑ分析。ＲＡＧ２－ＫＯ１／４ＤＰと比較して対照ＷＴＤＰにおいて差次的に高発現される遺伝子（Ａ）及び対照ＷＴＤＰと比較してＲＡＧ２－ＫＯ１／４ＤＰにおいて差次的に高発現される遺伝子（Ｂ）を示す。（対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及びＲＡＧ２－ＫＯ－４についてはｎ＝２、１つの独立した実験のＴＣＲβ形質導入されたＲＡＧ２－ＫＯ－１及びＴＣＲβ形質導入されたＲＡＧ２－ＫＯ－４についてはｎ＝１）。

【図6】増殖及び分化遺伝子、ならびに生物学的経路の分析を示す。Ａは、ＲＡＧ２－ＫＯ１／４（ＫＯ）及びＴＣＲβ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯ１／４（ＫＯＴＣＲｂ）細胞からのＤＰにおける差次的発現遺伝子のヒートマップ分析である。Ｂは、ＲＡＧ２－ＫＯＤＰと比較して、対照ＷＴＤＰにおいて差次的に上方制御される遺伝子を伴う遺伝子オントロジー生物学的経路の名前を示す。細胞の生存及び／または増殖に関連する生物学的経路が強調されている。白血球調節の特定の態様に関与する生物学的経路の群内で、関与する特定の遺伝子も示される。

【図7】ＲＡＧ２－ＫＯＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰにおけるＴＣＲαβ及びＴＣＲγδ鎖の強制発現を示す。Ａは、ＴＣＲαβ及びＴＣＲγδ形質導入ＤＰが、ｄＴｏｍａｔｏ形質導入ＤＰと比較して、培養の４及び１０日後により高い細胞数を示したことを示す。左から右に、ｄＴｏｍａｔｏ、ＴＣＲαβ－及びＴＣＲγδである。図７Ｂは、Ｔ系列細胞の細胞表面上の対応するαβ及びγδ ＴＣＲのそれぞれの発現を示す、ＴＣＲ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞のフローサイトメトリー分析である。

【発明を実施するための形態】

【0062】

上述のように、本発明者らは、ＲＡＧ２遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９指向性欠失（ＲＡＧ２－ＫＯ）を用いてヒト多能性幹細胞を分化させ、ヒトＲＡＧ２欠損発達Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ８＋段階まで進行することを示した。本発明者らはまた、ＲＡＧ２－ＫＯＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞が、ＴＣＲαβ及びＴＣＲγδ鎖を発現するように操作され得ること、ならびに再構成されたＴＣＲβ鎖の発現が、二重陽性段階での発達ヒトＴ細胞の細胞生存及び／または増殖を促進することを示した。

【0063】

Ｉ．細胞を生成するための方法
したがって、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再構成を受けることができない幹細胞または前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することを含み、
幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、方法を提供する。一実施形態では、方法は、（ｂ）Ｔ細胞系列の細胞を単離することを更に含む。

【0064】

本開示はまた、再構成されていないＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を含むＴ細胞系列の細胞を生成する方法であって、（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、培養することを含む、方法を提供する。

【0065】

「Ｔ細胞系列の細胞」という用語は、細胞を他のリンパ系細胞と区別するＴ細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞の少なくとも１つの表現型の特徴を示す細胞、ならびに赤血球系列または骨髄系列の細胞を指す。そのような表現型の特徴は、細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞上でのＴ系列コミットメントに特異的な１つ以上のタンパク質の発現、またはＴ細胞に特異的な生理学的、形態学的、機能的、もしくは免疫学的特徴を含むことができる。

【0066】

一実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ヒト細胞である。

【0067】

本明細書で使用される場合、「細胞（ａｃｅｌｌ）」または「細胞（ｔｈｅｃｅｌｌ）」という用語は、複数の細胞を含む。

【0068】

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞が、それらの天然環境で細胞とともに見出される細胞または生物学的材料から分離または精製されたことを意味する。したがって、細胞をその細胞の自然界での有様と区別する。

【0069】

本開示はまた、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子再構成を受けることができない幹細胞または前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することを含み、
幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、方法を提供する。一実施形態では、方法は、（ｂ）Ｂ細胞系列の細胞を単離することを更に含む。

【0070】

本開示は、再構成されていないＢ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子座を含むＢ細胞系列の細胞を生成する方法であって、（ａ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することと、（ｂ）Ｂ細胞系列の細胞を単離することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、単離することと、を含む、方法を更に提供する。

【0071】

「Ｂ細胞系列の細胞」という用語は、細胞を他のリンパ系細胞と区別するＢ細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞の少なくとも１つの表現型の特徴を示す細胞、ならびに赤血球系列または骨髄系列の細胞を指す。そのような表現型の特徴は、細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞上でのＢ系列に特異的な１つ以上のタンパク質の発現、またはＢ細胞に特異的な生理学的、形態学的、機能的、もしくは免疫学的特徴を含むことができる。別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、ＣＤ２０＋またはＣＤ１９＋細胞である。別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、腫瘍浸潤性Ｂ細胞（ＴＩＢ）である。

【0072】

一実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、ヒト細胞である。

【0073】

Ｔ細胞系列の細胞は、（ａ）Ｔ細胞系列に特化した前駆細胞または前駆体細胞（本明細書に記載される「前駆Ｔ細胞」または「ｐｒｏＴ細胞」）、（ｂ）ＣＤ７＋未成熟Ｔ細胞、（ｃ）ＣＤ４またはＣＤ８系列コミットメントを受けた細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ８^ｌｏＴＣＲ^ｉｎｔ細胞）、（ｄ）ＴＣＲ遺伝子再構成を特徴とする細胞、（ｅ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（ＤＰ）である前駆体胸腺細胞、（ｆ）ＣＤ４－ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋ＣＤ８－及び任意選択的にＴＣＲ^ｈｉ、（ｇ）ＣＤ３＋ＣＤ９０＋、（ｈ）ＣＤ４－ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋ＣＤ８－及びＴＣＲ^ｈｉである単一陽性（ＳＰ）細胞、（ｉ）ＴＣＲ－αβ^＋及び／またはＴＣＲ－γδ^＋、（ｊ）複数のＶβ鎖のうちのいずれかの発現を特徴とする細胞（例えば、Ｖβ－３、－６及び１７ａ）、または（ｋ）ＴＣＲ／ＣＤ３^ｈｉ、ＣＤ４－ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋ＣＤ８－を特徴とし得る成熟及び機能的もしくは活性化Ｔ細胞であり得る。

【0074】

一実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、「前駆Ｔ細胞」または「ｐｒｏＴ細胞」である。本明細書で使用される場合、「前駆Ｔ細胞」または「ｐｒｏＴ細胞」という用語は、成熟Ｔ細胞またはリンパ球に成熟することができるＴ細胞を意味する。一実施形態では、プロＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋ｐｒｏＴ細胞である。

【0075】

別の実施形態では、前駆Ｔ細胞は、ヒト前駆Ｔ細胞である。ヒト前駆Ｔ細胞の表現型としては、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋及びＣＤ７＋ＣＤ５＋ＣＤ１ａ－が挙げられる。

【0076】

本発明者らは、ヒトＲＡＧ２欠損発達Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性段階まで進行することを示した。したがって、別の実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋表現型を特徴とするＣＤ４及びＣＤ８二重陽性（ＤＰ）細胞である。

【0077】

別の実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＣＤ４－ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ８－またはＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ３＋表現型を特徴とするＣＤ４またはＣＤ８単一陽性（ＳＰ）細胞である。

【0078】

本明細書で使用される場合、「再構成されていないＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座」とは、再構成を受けておらず、生殖系列配置に残っているＴＣＲ遺伝子座を指す。同様に、「再構成されていないＢ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子座」とは、再構成を受けておらず、生殖系列配置に残っているＢＣＲ遺伝子座を指す。

【0079】

ＴＣＲ遺伝子座は、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖（それぞれ、例えば、遺伝子ＴＲＡ及びＴＲＢによってコードされる）、またはガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、例えば、遺伝子ＴＲＧ及びＴＲＤによってコードされる）を含むことができる。当業者には理解されるように、Ｔ細胞の発達中、ＴＣＲ遺伝子座をコードする遺伝子のセグメントの再構成は、抗原特異的受容体をコードするように生じる。

【0080】

本明細書で使用される場合、「Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子またはタンパク質」という用語は、Ｂ－またはＴ細胞受容体（ＢＣＲまたはＴＣＲ）遺伝子座の正しい再構成に必要なタンパク質の遺伝子を指す。一実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊの組換えに必要な遺伝子またはタンパク質は、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２またはＴｄＴなどのリンパ球特異的遺伝子である。

【0081】

別の実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子またはタンパク質は、ＤＮＡ修復のための非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のメンバーである。

【0082】

別の実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子またはタンパク質は、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質４（ＸＲＣＣ４）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、非相同末端結合因子１（ＮＨＥＪ１、ＣｅｒｎｕｎｎｏｓまたはＸＲＣＣ４様因子（ＸＬＦ）としても知られる）、ＸＲＣＣ４及びＸＬＦのパラログ（ＰＡＸＸ）、またはＤＮＡポリメラーゼλ及びμである。

【0083】

上記のように、一実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子またはタンパク質は、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２である。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）１及び２は、Ｂ細胞受容体及びＴ細胞受容体（ＢＣＲまたはＴＣＲ）遺伝子座の再構成に必要な２つの必須ＤＮＡプロセシング酵素をコードする（Ｓｃｈａｔｚａｔａｌ．，１９８９；Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒｅｔａｌ，１９９０）。上述のように、本発明者らは、ＲＡＧ２遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９指向性欠失（ＲＡＧ２－ＫＯ）を用いてヒト多能性幹細胞を分化させ、ヒトＲＡＧ２欠損発達Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ８＋段階まで進行することを示した。

【0084】

したがって、本明細書に開示される方法では、Ｔ細胞系列またはＢ細胞系列の細胞は、幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することによって生成され得、幹細胞または前駆細胞におけるＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の発現及び／または機能は、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される。

【0085】

本明細書で使用される場合、ＲＡＧ１は、ＲＡＧ１遺伝子によってコードされるＶ（Ｄ）Ｊ組換え活性化タンパク質（ＲＡＧ）１を指す。「ＲＡＧ１」という用語は、任意の種または供給源からのＲＡＧ１を含む。この用語はまた、ＲＡＧ１タンパク質及び遺伝子の既知の公開された配列のうちのいずれかから改変された配列を含む。ＲＡＧ１またはＲＡＧ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的な供給源から得ることができるＲＡＧ１の既知の公開された配列のうちのいずれかを有し得る。一実施形態では、ＲＡＧ１は、ヒトＲＡＧ１である。ＲＡＧ１のヒトアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＱ１３５７１．１が挙げられる。ＲＡＧ１のヒト核酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１３７７２７７．１（遺伝子ＩＤ：５８９６）が挙げられる。前述の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

ＲＡＧ２は、ＲＡＧ２遺伝子によってコードされるＶ（Ｄ）Ｊ組換え活性化タンパク質（ＲＡＧ）２を指す。「ＲＡＧ２」という用語は、任意の種または供給源からのＲＡＧ２を含む。この用語はまた、ＲＡＧ２タンパク質及びＲＡＧ２遺伝子の既知の公開された配列のうちのいずれかから改変された配列を含む。ＲＡＧ２またはＲＡＧ２遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的な供給源から得ることができるＲＡＧ２の既知の公開された配列のうちのいずれかを有し得る。一実施形態では、ＲＡＧ２は、ヒトＲＡＧ２である。ＲＡＧ２のヒトアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ２２３９７．１が挙げられる。ＲＡＧ２のヒト核酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５３６．４（遺伝子ＩＤ：５８９７）が挙げられる。前述の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0087】

本明細書で使用される場合、「ＲＡＧ１発現」という用語は、ＲＡＧ１タンパク質発現及びＲＡＧ１遺伝子発現の両方を含む。同様に、「ＲＡＧ２発現」という用語は、ＲＡＧ２タンパク質発現及びＲＡＧ２遺伝子発現の両方を含む。

【0088】

本明細書で使用される場合、「ＲＡＧ１機能」及び「ＲＡＧ２機能」という用語は、それぞれ、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２の生物学的活性を指す。例えば、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２酵素の生物学的活性を欠く細胞は、Ｂ細胞受容体及びＴ細胞受容体（ＢＣＲまたはＴＣＲ）遺伝子座の再構成を受けることができない。

【0089】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子またはタンパク質の内因性発現及び／または機能（例えば、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の内因性発現及び／または機能）は、当該技術分野で既知のいくつかの方法のうちのいずれかを使用して低減または排除することができる。

【0090】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子またはタンパク質の発現及び／または機能の低減または排除は、対応する遺伝子配列の欠失の変異によって達成され得る。ＲＡＧ１またはＲＡＧ２の発現及び／または機能の低減または排除は、例えば、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２遺伝子配列の変異または欠失によって達成することができる。例えば、ＲＡＧ１またはＲＡＧ２遺伝子配列は、例えば、遺伝子編集方法を使用して、多能性幹細胞のゲノムから変異または欠失され得る。したがって、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、及びＡｒｇｏｎａｕｔｅ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）－ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはメガヌクレアーゼを用いるアプローチを、本開示の実施形態で使用するために適応させることができる。様々な例では、挿入または欠失は、遺伝子編集によって行われ、フレームシフト変異を引き起こし、遺伝子ノックアウト（すなわち、機能的遺伝子産物の発現の欠如）をもたらす。

【0091】

ＲＡＧ２の関連において本発明で使用されるプロトコルの具体例としては、ＲＡＧ２を標的とするＧＦＰ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲキメラｃＤＮＡ及びｇＲＮＡ部分のカセットを含有する発現ベクターのトランスフェクションが挙げられる。

【0092】

別の実施形態では、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２阻害剤は、内因性ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の発現及び／または機能を低減するために使用される。「阻害剤」という用語は、その標的の発現または活性を低減、減少、またはさもなければ遮断する薬剤を指し、標的の発現または活性を阻害することができる任意の物質を含み、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子（アンチセンス核酸分子）、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、アプタマー、タンパク質、抗体（及びその断片）、遺伝子編集剤、及び標的発現または活性に向けられた他の物質を含むが、これらに限定されない。

【0093】

内因性ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の発現及び／または機能は、一時的または恒久的に（例えば、遺伝子変異または欠失を生殖系列に導入することによって）低減させることができる。

【0094】

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な遺伝子またはタンパク質の正常な（非改変）内因性発現レベルを有する細胞を指す。一実施形態では、「野生型」という用語は、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２遺伝子またはタンパク質の正常な（非改変）内因性発現レベルを有する細胞を指す。野生型細胞は、任意選択的に、幹細胞または前駆細胞である。

【0095】

本開示の一実施形態では、内因性ＲＡＧ１発現及び／または機能は、野生型細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％低減される。別の実施形態では、細胞は、検出可能な内因性ＲＡＧ１発現及び／または機能を有さない。

【0096】

別の実施形態では、内因性ＲＡＧ２発現及び／または機能は、野生型細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％低減される。別の実施形態では、細胞は、検出可能な内因性ＲＡＧ２発現及び／または機能を有さない。

【0097】

一実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、多能性幹細胞である。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、胚外組織を含まないヒトまたは動物の体の全ての細胞型に分化する可能性を有する任意の幹細胞を指す。これらの幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）の両方が含まれる。したがって、本発明の方法に好適な細胞は、ｉＰＳＣ及びＥＳＣから選択される幹細胞を含む。一実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）であり、それらは、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）及びヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）を含む。

【0098】

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」または「ＥＳＣ」という用語は、発達胚の生殖系列に組み込み、その一部となる能力を有する未分化胚性幹細胞を指す。

【0099】

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、胚様多能性状態に戻して再プログラムされた皮膚または血液細胞などの体細胞に由来する細胞を指す。一実施形態では、ｉＰＳＣは、既知または未知のＴＣＲ特異性を有するＴ細胞（例えば、がんに対する特異性を有するＴＣＲを有するＴ細胞）に由来する。

【0100】

一実施形態では、幹細胞または前駆細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。別の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＣＤ３４^＋造血前駆体細胞、任意選択で、ＥＳＣもしくはｉＰＳＣから分化したＣＤ３４^＋造血内皮前駆体細胞、またはＥＳＣもしくは多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化したＣＤ３４^＋前造血（ｐｒｅ－ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）細胞である。ＣＤ３４^＋細胞を得るための様々な分化プロトコルは当該技術分野において既知である。治療用途のために、Ｔ細胞系列の細胞を生成するために使用される幹細胞または前駆細胞は、治療される患者から得ることができる。

【0101】

幹細胞または前駆細胞は、臍帯血、胚、胚組織、胎児組織、骨髄及び血液を含むがこれらに限定されない任意の好適な供給源から得てもよい。

【0102】

典型的には、幹細胞または前駆細胞を含有する試料は、最初に非幹細胞または成熟細胞を枯渇させる。当該技術分野で既知の負及び正の選択方法は、幹細胞または前駆細胞の富化に使用され得る。例えば、細胞は、蛍光活性化細胞選別機、またはある特定の細胞表面抗原と細胞を結合する磁気ビーズを使用して、細胞表面抗原に基づいて選別することができる。負の選択カラムを使用して、系列特異的表面抗原を発現する細胞を除去することができる。

【0103】

実施形態では、幹細胞または前駆細胞を含有する試料は、系列陰性（Ｌｉｎ^－）及び系列位置（Ｌｉｎ^＋）分画に分離される。Ｌｉｎ^－分画は、ＣＤ３４^＋細胞について選別することができる。

【0104】

前駆細胞または幹細胞は、Ｔ細胞系列またはＢ細胞系列の細胞を生成するために、好適な条件下で培養され得る。Ｔ細胞系列またはＢ細胞系列の細胞を生成するための前駆細胞または幹細胞を培養する方法は、当該技術分野で既知である。

【0105】

例えば、本明細書に記載されるように、ヒト多能性幹細胞を胚様体として分化させるように誘導することができ、次いで、ＣＤ３４＋細胞を磁気補助細胞選別によって単離し、ＯＰ９－ＤＬ４細胞と共培養して、Ｔ細胞への分化を誘導することができる。そのようなプロトコルは、Ｋｅｎｎｅｄｙｅｔａｌ．２０１２に記載されている。

【0106】

一実施形態では、細胞を、懸濁液支持体にコンジュゲートされた１つ以上のノッチリガンドの存在下で、Ｔ細胞系列の細胞を形成するのに十分な時間培養する。

【0107】

前駆細胞または幹細胞は、プレート上またはバイオリアクター、任意選択的に閉鎖型のバイオリアクターまたは閉鎖型の自動バイオリアクター内の懸濁液中で培養され得る。様々なバイオリアクターが当該技術分野で既知であり、バッチバイオリアクター、流加バイオリアクター、または連続バイオリアクターを含み得る。連続バイオリアクターの例は、連続攪拌タンク反応器モデルである。

【0108】

培養物中の様々な濃度の前駆細胞または幹細胞が企図される。例えば、培養物中の前駆細胞または幹細胞の濃度は、培地１ｍｌ当たり１～数百万個の間の細胞であり得る。

【0109】

Ｔ細胞系列またはＢ細胞系列の細胞のコミットメント及び分化を促進する１つ以上の陽性サイトカインも、培養物に添加され得る。サイトカインは、ヒト起源であり得るか、または他の種に由来し得る。培養物中のサイトカインの濃度は、典型的には約１～１０ｎｇ／ｍｌである。以下は、Ｔ細胞系列の細胞のコミットメント及び分化を促進するために本出願で用いられ得るサイトカインの代表的な例である：Ｆｌｔ－３－リガンドの全てのメンバー、ならびにインターロイキン－７（ＩＬ－７）及び幹細胞因子。一実施形態では、本明細書で使用されるサイトカインは、Ｆｌｔ－３リガンド及びＩＬ－７、ならびに幹細胞因子である。サイトカインは、等モル量以上のヘパリン硫酸などのグリコサミノグリカンと併用され得る。サイトカインは、市販されているか、または組換えＤＮＡ技法によって産生され、様々な程度に精製され得る。サイトカインのいくつかは、標準的な生化学的技法によって細胞株の培養培地から精製され得る。

【0110】

懸濁液支持体に任意選択的にコンジュゲートされた１つ以上の追加の分子も、培養物に添加され得る。一実施形態では、追加の分子は、本明細書で「Ｔ細胞共刺激分子」とも称される、Ｔ細胞発達を促進する（例えば、Ｔ細胞系列の細胞のコミットメント及び分化を促進する）分子である。一例において、本発明者らは、ＨＳＰＣで培養されたマイクロビーズコンジュゲートＤＬ４及びＶＣＡＭ１が、Ｔ細胞系列への分化を加速することを示した。したがって、一実施形態では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＶＣＡＭ１である。本明細書で使用される場合、「ＶＣＡＭ１」という用語は、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）または分化クラスター１０６（ＣＤ１０６）としても知られる血管細胞接着タンパク質１を指し、ヒトでは、ＶＣＡＭ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。「ＶＣＡＭ１」という用語はまた、ＶＣＡＭ１の変異体またはバリアントを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞共刺激分子は、サイトカインまたはケモカイン（幹細胞因子、ＩＬ－７、ＣＣＬ２５またはＣＸＣＲ４）、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩもしくはクラスＩＩ、または共刺激（ＣＤ８０、ＣＤ８６）分子である。任意選択的に、Ｔ細胞共刺激分子は、少なくとも１つのタンパク質タグを含む。様々なタンパク質タグが当該技術分野で既知であり、いくつかの目的に使用され得る。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激分子は、Ｆｃタグ（Ｆｃ融合タンパク質としても知られる）を含む。

【0111】

前駆細胞及び幹細胞は、条件培地、非条件培地または胚性幹細胞培地を含む培養培地中で培養され得る。好適な条件培地の例としては、胚性線維芽細胞（例えば、ヒト胚性線維芽細胞またはマウス胚性線維芽細胞）で条件付けされたＩＭＤＭ、ＤＭＥＭもしくはαＭＥＭ、または同等の培地が挙げられる。好適な非条件培地の例としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＤＭＥＭもしくはαＭＥＭ、または同等の培地が挙げられる。培養培地は、血清（例えば、ウシ血清、ウシ胎仔血清、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清または人工血清代替物）を含み得るか、または無血清であり得る。

【0112】

一実施形態では、培養条件は、調製物中の細胞がｐｒｏＴ細胞を形成するように、前駆細胞または幹細胞を十分な期間培養することを伴う。別の実施形態では、培養条件は、調製物中の細胞が成熟Ｔ細胞、例えば、成熟ＳＰＴ細胞を形成するように、前駆細胞または幹細胞を十分な期間培養することを伴う。細胞は、所望の細胞組成物を達成するために必要な適切な時間維持され得ることを理解されたい。任意選択的に、前駆細胞または幹細胞は、少なくとも６、８、１０、１２、１４、２１、２８、３５または４２日間培養される。

【0113】

一実施形態では、方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むように細胞を操作することを更に含む。別の実施形態では、方法は、Ｔ細胞受容体ベータ鎖（ＴＣＲβ）をコードする核酸を含むように細胞を操作することを更に含む。

【0114】

細胞は、分化プロセス中の任意の時点で、ＴＣＲ、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲβをコードする核酸を含むように操作され得る。例えば、一実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲ、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲβをコードする核酸を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＴＣＲ、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲβをコードする核酸を含む。更なる実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞及び／またはＴ細胞系列の細胞は、ＴＣＲ、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲβを発現する。

【0115】

一実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞は、ＴＣＲβのみをコードする核酸を含む。言い換えれば、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞は、ＴＣＲβをコードする核酸を含み、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする核酸を含まない。

【0116】

別の実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列の細胞は、ＴＣＲβをコードする核酸及びＣＡＲをコードする核酸を含む。そのような実施形態では、ＴＣＲβは分化を指示する一方で、ＣＡＲは治療有効性を提供することができる。

【0117】

別の実施形態では、方法は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｂ細胞受容体ベータ鎖（ＢＣＲβ）及び／またはＣＡＲを発現するように、Ｂ細胞系列の細胞を操作することを更に含む。細胞は、分化プロセス中の任意の時点で、ＢＣＲ、ＢＣＲβ及び／またはＣＡＲをコードする核酸を含むように操作され得る。例えば、一実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＢＣＲ、ＢＣＲβ及び／またＣＡＲをコードする核酸を含む。別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、ＢＣＲ、ＢＣＲβ及び／またはＣＡＲをコードする核酸を含む。更なる実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞及び／またはＢ細胞系列の細胞は、ＢＣＲ、ＢＣＲβ及び／またはＣＡＲを発現する。

【0118】

細胞は、ＴＣＲ、ＴＣＲβ、ＣＡＲ、ＢＣＲまたはＢＣＲβをコードする核酸を含むように、当該技術分野で既知の任意の方法によって操作され得る。例えば、細胞は、ＴＣＲ、ＴＣＲβ、ＣＡＲ、ＢＣＲまたはＢＣＲβを担持するウイルスまたは非ウイルスベクターで形質転換され得る。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。非ウイルスベクターの例としては、限定されないが、ヌードＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡベクター、リポソーム、重合体及び分子コンジュゲートが挙げられる。

【0119】

ＴＣＲ、ＢＣＲまたはＣＡＲは、任意選択的に、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原または自己抗原などの抗原に特異性を付与する。

【0120】

「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞によって産生される抗原である。腫瘍関連抗原の例としては、限定されないが、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＷＴ１及びＮＹＥＳＯ１が挙げられる。

【0121】

「ウイルス抗原」は、ウイルスゲノムによってコードされる抗原である。ウイルス抗原の例として、限定されないが、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＩＶ及びＳＡＲＳウイルス抗原が挙げられる。

【0122】

「自己抗原」は、対象によって産生される抗原である。自己抗原は、腫瘍関連抗原であり得る。自己抗原に特異性を付与するＴＣＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞は、例えば、自己反応性Ｔ細胞を遮断する調節性Ｔ細胞を作製するために使用することができる。

【0123】

ＩＩ．多能性幹細胞
本明細書に記載されるように、本発明者らは、ＲＡＧ２欠損（ＲＡＧ２－ＫＯ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）株を生成した。

【0124】

したがって、本開示はまた、単離された幹細胞または前駆細胞であって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質、任意選択的に、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、単離された幹細胞または前駆細胞を提供する。任意選択的に、幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。

【0125】

一実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。

【0126】

別の実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0127】

ＲＡＧ１またはＲＡＧ２の発現及び／または機能の低減または排除は、当該技術分野で既知のいくつかの方法のうちのいずれか１つによって達成することができる。

【0128】

一実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、変異または欠失したＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２遺伝子配列を含む。例えば、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２遺伝子配列における挿入または欠失は、フレームシフト変異を引き起こし、遺伝子ノックアウト（すなわち、機能的遺伝子産物の発現の欠如）をもたらし得る。

【0129】

本開示の一実施形態では、内因性ＲＡＧ１発現及び／または機能は、野生型細胞と比較して、幹細胞または前駆細胞において、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％低減される。別の実施形態では、細胞は、検出可能な内因性ＲＡＧ１発現及び／または機能を有さない。

【0130】

別の実施形態では、内因性ＲＡＧ２発現及び／または機能は、野生型細胞と比較して、幹細胞または前駆細胞において、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％低減される。別の実施形態では、細胞は、検出可能な内因性ＲＡＧ２発現及び／または機能を有さない。

【0131】

加えて、一実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲβ、ＢＣＲまたはＢＣＲβをコードする核酸を更に含む。別の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲβ、ＢＣＲまたはＢＣＲβを発現する。

【0132】

更なる実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲβをコードする核酸を含み、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする核酸を含まない。

【0133】

ＩＶ．Ｔ細胞またはＢ細胞系列の細胞
本開示は、本明細書に記載の方法、システム及びキットによって生成されるＴ細胞系列もしくはＢ細胞系列の細胞、または細胞の子孫である有糸分裂細胞もしくは分化細胞を更に提供する。

【0134】

一実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法によって生成される「前駆Ｔ細胞」または「ｐｒｏＴ細胞」を提供する。別の実施形態では、前駆Ｔ細胞は、ヒト前駆Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋、ＣＤ７＋ＣＤ５＋ＣＤ１ａ－またはＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋を特徴とするヒト前駆Ｔ細胞である。

【0135】

本開示はまた、ＣＤ４＋ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋を特徴とする二重陽性（ＤＰ）Ｔ細胞を提供する。本開示は、ＣＤ４－ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ８－またはＣＤ８＋ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ３＋を特徴とする単一陽性（ＳＰ）細胞である、Ｔ細胞系列の細胞を更に提供する。

【0136】

一実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＴＣＲ、ＣＡＲまたはＴＣＲβをコードする核酸を更に含む。別の実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＴＣＲ、ＣＡＲまたはＴＣＲβを発現する。

【0137】

更なる実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、ＴＣＲβをコードする核酸を含み、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする核酸を含まない。

【0138】

別の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されるＴ細胞系列の細胞（例えば、前駆Ｔ細胞または成熟Ｔ細胞）は、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作される。

【0139】

抗原は、任意選択的に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ウイルス抗原または自己抗原である。ＴＡＡに特異性を付与するためにＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞は、がんなどの状態を治療するために有用であり得る。

【0140】

同様に、別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、ＣＡＲ、ＴＣＲβ、ＢＣＲまたはＢＣＲβをコードする核酸を更に含む。別の実施形態では、Ｂ細胞系列の細胞は、ＣＡＲ、ＢＣＲまたはＢＣＲβを発現する。

【0141】

別の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されるＢ細胞系列の細胞は、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作される。

【0142】

抗原は、任意選択的に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ウイルス抗原または自己抗原である。ＴＡＡに特異性を付与するためにＢＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞は、がんなどの状態を治療するために有用であり得る。

【0143】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法によって生成される、単離された幹細胞もしくは前駆細胞、またはＴ細胞系列もしくはＢ細胞系列の細胞と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む、薬学的組成物を提供する。

【0144】

好適な希釈剤及び担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。これに基づいて、組成物は、排他的ではないが、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と関連付けられたｐｒｏＴ細胞の溶液を含み、好適なｐＨを有し生理学的流体と等張の緩衝溶液に含有される。

【0145】

薬学的組成物としては、限定されないが、凍結乾燥粉末、または水性もしくは非水性の滅菌注射液または懸濁液が挙げられ、これらは、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、及び意図されたレシピエントの組織または血液との実質的な適合性を組成物に付与する溶質を更に含有し得る。そのような組成物中に存在し得る他の構成要素としては、例えば、水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（商標）など）、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が挙げられる。即時注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤、または濃縮溶液もしくは懸濁液から調製され得る。組成物は、例えば、限定するものではないが、患者に投与する前に滅菌水または生理食塩水で再構成される凍結乾燥粉末として供給されてもよい。

【0146】

薬学的組成物はまた、凍結保存溶液を含む。一実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されるＴ細胞系列の細胞は、適切な培地、例えば、薬学的に許容される培地またはＧＭＰグレードの培地中で凍結保存され、それを必要とする対象への投与のために任意選択的に製剤化される。

【0147】

好適な薬学的に許容される担体としては、薬学的組成物の生物学的活性の有効性を妨げない、本質的に化学的に不活性で非毒性の組成物が挙げられる。好適な薬学的担体の例としては、限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ－（１（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びリポソームが挙げられる。そのような組成物は、患者に直接投与するための形態を提供するための好適な量の担体とともに、治療有効量の化合物を含有しなければならない。

【0148】

組成物は、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼球内、脳室内、嚢内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾルまたは経口投与により投与することができる。非経口投与の場合、本明細書に記載のｐｒｏ－Ｔ細胞の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。分散液はまた、アルコールの有無にかかわらず、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。これらの調製物は、通常の保存条件及び使用条件下で、微生物の発育を阻止するための保存剤を含有する。当業者は、好適な製剤を調製する方法を知っているであろう。

【0149】

好ましくは、Ｔ細胞系列またはＢ細胞系列の細胞は、病状の治療を必要とする対象においてそれを行うのに有効な量で存在する。一実施形態では、Ｔ細胞系列の細胞は、造血前駆細胞の生着の増強を必要とする対象においてそれを行うのに有効な量で存在する。任意選択的に、組成物は、Ｔ細胞系列の細胞、または移植のための組織を更に含む。一実施形態では、組織は、胸腺を含む。別の実施形態では、組織は、器官を含む。

【0150】

ＩＩＩ．キット
本明細書に記載される幹細胞または前駆細胞は、Ｔ細胞系列の細胞またはＢ細胞系列の細胞の生成に使用するために調製され、キットにパッケージ化されてもよい。

【0151】

したがって、幹細胞または前駆細胞を含むＴ細胞系列の細胞またはＢ細胞系列の細胞を産生するためのキットも本明細書に提供され、幹細胞または前駆細胞におけるＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の発現は、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される。

【0152】

一実施形態では、キットは、Ｔ細胞系列の細胞またはＢ細胞系列の細胞を産生するための幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養するための培養培地を更に含む。培養培地の例としては、条件培地、非条件培地または胚性幹細胞培地が挙げられる。培養培地は、血清（例えば、ウシ血清、ウシ胎仔血清、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清または人工血清代替物）を含み得るか、または無血清であり得る。

【0153】

別の実施形態では、キットは、１つ以上の追加の分子を更に含む。一実施形態では、追加の分子は、本明細書で「Ｔ細胞共刺激分子」とも称される、Ｔ細胞発達を促進する（例えば、Ｔ細胞系列の細胞のコミットメント及び分化を促進する）分子である。別の実施形態では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＶＣＡＭ１である。

【0154】

培地は、任意選択的に、Ｔ細胞系列の細胞またはＢ細胞系列の細胞のコミットメント及び分化を促進する１つ以上のサイトカインを含む。サイトカインは、ヒト起源であり得るか、または他の種に由来し得る。培養物中のサイトカインの濃度は、典型的には約１～１０ｎｇ／ｍｌである。以下は、本出願で用いられ得るサイトカインの代表的な例である：Ｆｌｔ－３－リガンドの全てのメンバー、ならびにインターロイキン－７（ＩＬ－７）及び幹細胞因子。一実施形態では、本明細書で使用されるサイトカインは、Ｆｌｔ－３リガンド及びＩＬ－７、ならびに幹細胞因子である。サイトカインは、等モル量以上のヘパリン硫酸などのグリコサミノグリカンと併用され得る。サイトカインは、市販されているか、または組換えＤＮＡ技法によって産生され、様々な程度に精製され得る。サイトカインのいくつかは、標準的な生化学的技法によって細胞株の培養培地から精製され得る。

【0155】

一実施形態では、キットは、本明細書内に記載される試薬のための１つ以上の容器を含む。

【0156】

様々な実施形態では、試薬（複数可）の使用におけるガイダンスを提供する印刷された説明書もまた、キットに含まれてもよい。「説明書」または「使用説明書」という用語は、典型的には、細胞、培養期間、温度、培地条件などを説明する有形の表現を含む。例えば、一実施形態では、説明書は、幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することを含む方法を記載する。

【0157】

Ｖ．治療用途
特定の抗原を認識するように操作されたＴ細胞及びＢ細胞は、幅広い治療用途を有する。

【0158】

したがって、本開示は、対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要な少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、培養することと、
（ｉｉ）有効量の細胞または前駆細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、

【0159】

幹細胞または前駆細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含むように操作される、方法を提供する。

【0160】

本開示はまた、対象における疾患または状態を治療する方法であって、
（ｉ）幹細胞または前駆細胞を含む試料を培養することであって、幹細胞または前駆細胞におけるＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の発現が、野生型幹細胞または前駆細胞と比較して低減または排除される、培養することと、
（ｉｉ）有効量のＴ細胞系列の細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
Ｔ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するようにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作される、方法を提供する。

【0161】

本開示はまた、対象における疾患または状態を治療するための本明細書に記載の方法によって生成されるＴ細胞系列の細胞の使用であって、Ｔ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作される、使用を提供する。本開示は、対象における疾患または状態を治療するための薬剤の調製のための、本明細書に記載の方法によって生成されるＴ細胞系列の細胞の使用であって、Ｔ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作される、使用を更に提供する。

【0162】

本開示はまた、対象における疾患または状態の治療に使用するための、本明細書に記載の方法によって生成されるＴ細胞系列の細胞であって、Ｔ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作される、Ｔ細胞系列の細胞を提供する。

【0163】

【0164】

Ｂ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するように少なくとも１つのＢ細胞受容体（ＴＣＲ）で操作される、方法を提供する。

【0165】

本開示はまた、対象における疾患または状態を治療するための本明細書に記載の方法によって生成されるＢ細胞系列の細胞の使用であって、Ｂ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはＣＡＲで操作される、使用を提供する。本開示は、対象における疾患または状態を治療するための薬剤の調製のための、本明細書に記載の方法によって生成されるＢ細胞系列の細胞の使用であって、Ｂ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはＣＡＲで操作される、使用を更に提供する。

【0166】

本開示はまた、対象における疾患または状態の治療に使用するための、本明細書に記載の方法によって生成されるＢ細胞系列の細胞であって、Ｂ細胞系列の細胞が、抗原に特異性を付与するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはＣＡＲで操作される、Ｂ細胞系列の細胞を提供する。

【0167】

抗原は、任意選択的に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ウイルス抗原または自己抗原である。一実施形態では、抗原はＴＡＡであり、疾患はがんである。

【0168】

本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という語句は、所望の結果を達成するために必要な投薬量及び期間で有効な量を意味する。有効量は、対象の病状、年齢、性別、体重などの要因によって変化し得る。そのような量に対応する所与の細胞調製物の量は、様々な要因に応じて変化する。例えば、医薬製剤、投与経路、疾患または障害の種類、治療される対象または宿主の同一性などであるが、それにもかかわらず、当業者によって日常的に決定することができる。「有効量」は、Ｔ細胞系列の細胞が治療される対象に生着するのに有効な量であることが好ましい。

【0169】

本明細書で使用される場合、及び当該技術分野でよく理解されるように、「治療する」または「治療」という用語は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能または検出不能にかかわらず、限定されないが、１つ以上の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡大の予防、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、疾患の再発の減少、及び寛解（部分的もしくは完全のいずれか）が挙げられる。「治療する」及び「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することも意味する。本明細書で使用される場合、「治療すること」及び「治療」には、予防的治療も含まれる。

【0170】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを意味し、好ましくはヒトである。

【0171】

以下の非限定的な例は、本出願の例示である。

【実施例】

【0172】

実施例１
材料及び方法：
ｈＥＳＣの維持。ヒトＥＳＣ（Ｈ１；ＷｉＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を維持し、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）でコーティングしたプレート上で拡大した。細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して非酵素解離により継代した。

【0173】

ＲＡＧ２－ＫＯｈＥＳＣの生成。ＧＦＰ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲキメラｃＤＮＡ、及びＲＡＧ２［ＧＧＴＴＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号１）］を標的にするように設計されたｇＲＮＡ部分のカセットを含有するｐＤ１３２１－ＧＦＰ発現ベクターを、カスタム合成した（ＤＮＡ２．０）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるトランスフェクション後、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ^＋ｈＥＳＣを選別した。個々のクローンを採取し、拡大し、ゲノムＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡの精製のためにアリコートを収集した。変異（インデル）を、標的部位に隣接する領域のＰＣＲ増幅の生成物を配列決定することによって検証した。ＲＡＧ２ＫＯクローン１は、一方の対立遺伝子において１ｂｐの欠失を示し、他方の対立遺伝子において１６ｂｐの欠失を示し、一方、クローン４は、一方の対立遺伝子において１１ｂｐの欠失を示し、他方の対立遺伝子において２３ｂｐの欠失を示した。

【0174】

ウエスタンブロット分析。簡潔に、細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で、２０分間４℃で細胞をインキュベートし、続いて１４０００×ｇで、１５分間４℃で遠心分離することによって調製した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上に移し、抗ＲＡＧ２抗体（Ａｂｃａｍ－Ａｂ９５９５５；１：１０００希釈）で、一晩４℃でプローブし、続いて二次抗体でインキュベートした。使用した抗ＲＡＧ２抗体は、ｇＲＮＡ標的部位をはるかに超えているヒトＲＡＧ２（Ａｂｃａｍ）のアミノ酸２７１～５１９に対応する組換え断片に対して作製されたウサギポリクローナルであった。ウエスタンブロッティングルミノール試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、免疫反応性バンドを視覚化した。Ｔ－ＡＬＬ患者からのＰＢＭＣを陽性対照として使用した（Ｂｏｒｉｅｓｅｔａｌ，１９９１）。

【0175】

免疫染色。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中５％のＮＧＳ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）及び１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で３０分間透過処理及び遮断を行った。細胞を染色し、前述のように分析した（Ｌｉｅｔａｌ，２０１７）。

【0176】

奇形腫の形成。全ての動物研究は、ＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認され、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓに従った。６～８週齢の非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）／ＳＣＩＤマウスに、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌを含むＤＭＥＤ－Ｆ１２に再懸濁した１×１０^７のｈＥＳＣを皮下に注射して、８週間の奇形腫の形成を可能にした。組織学的分析は、以前に記載されたように実施した（Ｌｉｅｔａｌ，２０１７）。

【0177】

ｈＰＳＣの分化及びＣＤ３４^＋単離。ｈＰＳＣ、Ｈ１胚性幹細胞（ＥＳＣ）を、前述のように分化させた（Ｋｅｎｎｅｄｙｅｔａｌ，２０１２）。８日間の分化後、胚様体を採取し、前述のようにコラゲナーゼＩＶ型及びトリプシン－ＥＤＴＡを使用して単一細胞に解離させ（Ｋｅｎｎｅｄｙｅｔａｌ，２０１２）、抗ＣＤ３４ＰＥコンジュゲート抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗ＰＥマイクロビーズを含むＭＡＣＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して正に選択した。正の選択の細胞収率及び純度を、フローサイトメトリーにより、ＭＡＣ前及びＭＡＣ後に評価した。

【0178】

ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ共培養及び分化。ｈＩＬ－７、ｈＦＬＴ３－Ｌ及びｈＳＣＦ（７ＦＳ）を発現するＯＰ９－ＤＬ４細胞を生成し、１０～２０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びホスホ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するα－ＭＥＭ中で、３７℃、５％のＣＯ_２で成長させた。共培養の場合、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞を、前日に６ウェルプレートにプレーティングした。ＭＡＣＳ精製ＣＤ３４^＋細胞を計数し、６ウェルプレート当たり５～２０×１０^４細胞の密度で播種し、３７℃、５％のＣＯ_２で、ＯＰ９培地中でＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞と共培養することによって分化させ、細胞を継代し、約５日ごとに新鮮なＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞と共培養した。

【0179】

レトロウイルス形質導入。空ベクターｄＴｏｍａｔｏ、ＴＣＲα－ｄＴｏｍａｔｏまたはＴＣＲβ－ｄＴｏｍａｔｏを安定的に発現するＰＧ１３細胞株を、７０％のコンフルエンスに成長させ、その時点で培地を１５％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むα－ＭＥＭに切り替えて、上清を４８時間条件付けした後、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ／Ｔ細胞培養物を形質導入した。ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ／Ｔ細胞培養物のＤ８＋２４において、１日１回、１μｌ／ｍｌのポリブレンを用いて対応するＰＧ１３上清を形質導入し、２０００ｘｇで９０分間、室温で４日間遠心分離した（２ｍｌの上清当たり２～３×１０^６の細胞）。細胞を３日間静置し、次いで、ｄＴｏｍａｔｏ^＋ＣＤ７^＋ＣＤ５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰとして選別した。選別した細胞を、最大１０日間、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ共培養物中に配置した。

【0180】

フローサイトメトリー。細胞を、以下のマウス抗ヒト抗体で、氷上で３０分間染色した：ＣＤ３－ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ４２１、ＣＤ４－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＣＤ８β－ＰＥ、ＣＤ３１－ＦＩＴＣ、ＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ／ＣＦ５９４、ＴＣＲｇｄ－ＦＩＴＣ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ５－ＰＥ／Ｃｙ７、ＣＤ７－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＣＤ４５－ＡＰＣ／ｅＦｌｕｏｒ７８０、ＴＣＲａｂ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８α－ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ、ＣＤ３８－ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。細胞を、ＤＡＰＩを含有するフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏバージョン９．７．６を使用して分析した。細胞内染色のために、製造業者の指示に従って、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた固定／透過処理キットを使用して、細胞を固定及び透過処理した。

【0181】

対照及びＲＡＧ２－ＫＯインビトロ由来ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋細胞のＲＮＡ－Ｓｅｑ分析。共培養の２４～２８日目に細胞を収集し、ＣＤ４５、ＣＤ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＤＡＰＩに対する蛍光色素標識抗体で染色し、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＤｉｖａまたはＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋集団に選別した。ＴＲＩｚｏｌを使用して、選別された細胞集団から全ＲＮＡを抽出した。精製ＲＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｏｖａｓｅｑ６０００を使用してＲＮＡ配列決定に供した。ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄａｒｄＴｏｔａｌＲＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎキットを使用して、ライブラリ調製を行った。１００サイクル対合読み取りプロトコル及び多重化を使用して、配列決定を行い、約４０００万の読み取り／試料を得た。試料を、ＨＩＳＡＴ２を使用してＧＲＣｈ３８に整列させた。読み取り計数は、ＨＴＳｅｑを使用して計算した。ＲプラットフォームでｅｄｇｅＲパッケージを使用して、差次的遺伝子発現分析を行った。

【0182】

統計分析。データ及びエラーバーは、平均±平均の標準誤差として提示される。統計的有意性を決定するために、Ｐｒｉｓｍバージョン６を使用して一元配置ＡＮＯＶＡ（３つの平均を比較）を行った。統計的有意性は、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１として決定した。

【0183】

データの可用性。生の及び処理されたＲＮＡ－Ｓｅｑデータは、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓから、受入番号ＧＳＥ１６４２７６（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１６４２７６）で入手可能である。

【0184】

結果と考察
ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣ株の生成及び特徴付け。ヒトＴ細胞発達におけるＲＡＧ２の役割を評価するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して、ＲＡＧ２遺伝子のエクソン３を標的化した（図１Ａ）。ｈＰＳＣを、ＲＡＧ２標的化ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトしたＧＦＰ^＋ｈＰＳＣを単一細胞選別し、培養した。個々のクローンを拡大した後、二対立遺伝子変異（ＫＯ－１及びＫＯ－４）を含有する固有の挿入－欠失を含有する２つのクローンを同定した（図１Ａ）。タンパク質発現に対するＲＡＧ２変異の影響を評価するために、ウエスタンブロット分析を行い、ＫＯ－１及び－４由来Ｔ系列細胞の両方で検出可能なＲＡＧ２タンパク質が存在しないことを確認した（図１Ｂ）。

【0185】

ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣが多能性を維持したかどうかを評価するために、主要マーカーの発現及び奇形腫の形成を評価した。免疫蛍光染色は、ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣがＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＳＳＥＡ－４を発現したことを示した（図１Ｃ）。多能性を機能的に試験するために、ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣを免疫不全マウスに注射し、組織学的分析により、３つの生殖層全てを有するＲＡＧ２－ＫＯ奇形腫の形成が明らかになり（図１Ｄ）、ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣが多能性の主要な特徴を保持していることが示された。造血前駆細胞を生成するためのＲＡＧ２－ＫＯｈＥＳＣの能力を決定するために、８日間の胚様体分化培養後にＣＤ３４発現を分析した（Ｋｅｎｎｅｄｙｅｔａｌ，２０１２）。対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及び－４ｈＰＳＣは、同様の頻度の血液内皮ＣＤ３４^＋細胞を生じ、これは、磁気支援細胞選別（ＭＡＣＳ）によって更に富化され得る（図１Ｅ）。

【0186】

ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣからのＴ細胞発達。ＣＤ３４^＋造血内皮細胞をＭＡＣＳ富化し、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、発現ヒトＩＬ－７、ＦＬＴ３リガンド及び幹細胞因子（７ＦＳ）とともに培養して、Ｔ細胞分化を誘導した。１０日間の培養後、対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及び－４細胞は、ＣＤ７及びＣＤ５の両方の発現によって示されるように、Ｔ細胞系列に沿って進行した（図２Ａ）。３つの群は全て、１５日目までにＣＤ４^＋中間単一陽性（ＩＳＰ）段階に達し、２０日目までに細胞内ＣＤ３発現を示した（図２Ａ）。２４日間の培養後、対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及び－４群からの細胞の大部分は、ＣＤ７^＋ＣＤ５^＋であった（図２Ａ）。注目すべきことに、２９～３４日間の培養により、対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及び－４細胞は全て、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ段階に達した（図２Ａ）。しかしながら、予想通り、対照ＷＴ細胞のみが細胞内ＴＣＲβ発現及び細胞表面ＣＤ３／ＴＣＲβ発現を示した（図２Ａ）。これらの結果は、ＲＡＧ２欠損ヒトＴ細胞前駆細胞が、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ段階まで分化し得ることを示す。

【0187】

細胞の生存及び拡大を決定するために、対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及び－４発達Ｔ細胞から総細胞充実度を定量化した。２０日間の培養後、３つの試料は全て、類似した細胞数を示した（図２Ｂ）。しかしながら、４０日間の培養後、対照ＷＴ系列細胞は、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及び－４Ｔ系列細胞とは対照的に、その生存及び拡大を更に増加させ、この時点までに約１０倍の細胞充実度を有する（図２Ｂ）。

【0188】

ＲＡＧ２－ＫＯＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰにおけるＴＣＲβ鎖の強制発現。ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋細胞をＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞上で２４日間培養し、ＤＰ細胞を、空ベクター（ｄＴｏｍａｔｏ）、再構成ＴＣＲα鎖（ＴＲＡ１３８３ｉ）または再構成ＴＣＲβ鎖（ＴＲＢ１３８３ｉ）でレトロウイルス形質導入した（図３Ａ）。形質導入ＲＡＧ－ＫＯ細胞を、ＣＤ７^＋ＣＤ５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ細胞について選別し、更に１０日間、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞上に戻して、細胞生存及び拡大について評価した（図３Ａ）。ｄＴｏｍａｔｏ－及びＴＣＲα形質導入ＤＰの両方が、１０日間の培養後に同様の細胞数を示した（図３Ｂ）。しかしながら、ＴＣＲβ形質導入ＤＰは、ｄＴｏｍａｔｏ及びＴＣＲα形質導入ＤＰと比較して、１０日間の培養後に顕著に高い細胞数を示した（図３Ｂ）。理論に拘束されることなく、これは、ＴＣＲα鎖とは対照的に、再構成されたＴＣＲβ鎖の発現が、ＤＰ段階で発達ヒトＴ細胞の細胞生存及び／または拡大を促進することを示唆する。

【0189】

対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ及びＲＡＧ２－ＫＯＴＣＲβ形質導入ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ細胞のトランスクリプトーム分析。対照ＷＴ、ＲＡＧ２－ＫＯ対照形質導入及びＲＡＧ２－ＫＯＴＣＲβ形質導入ＤＰ細胞を、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）分析のために選別した。形質導入に使用される１３８３ｉＴＣＲβ及びいくつかのＴＣＲα遺伝子を含むいくつかのＴＣＲ遺伝子を明らかに除いて、対照ＷＴＤＰ細胞は、ＲＡＧ２－ＫＯ対照形質導入及びＲＡＧ－ＫＯＴＣＲβ形質導入ＤＰ細胞には存在しなかった、大きなＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及びＴＣＲδ遺伝子のセットを発現し、マウスに見られるように、β選択シグナルによって誘導された生殖系列転写物の結果である可能性が高い（Ｖｉｌｌｅｙｅｔａｌ，１９９７）（表１及び図４Ａ）。更に、ＲＡＧ２－ＫＯ対照及びＴＣＲβ形質導入ＤＰ細胞からの遺伝子の発現を、ＤＰ関連シグネチャー遺伝子のセットについて、臍帯血（ＵＣＢ）造血幹細胞由来ＤＰ細胞の発現と比較した（Ｃａｓｅｒｏｅｔａｌ，２０１５）（表１）。この分析は、ＴＣＲβ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞が、マウスにおけるβ選択後に誘導される、ＲＯＲＣを含むＵＣＢ由来ＤＰ細胞に存在した一連の遺伝子の発現を獲得したことを明らかにした（Ｈｅ２０００）（図４Ｂ）。

【0190】

差次的発現遺伝子分析を行って、ＲＡＧ２－ＫＯ（ＫＯ－１及びＫＯ－４）ＤＰ細胞と比較して、対照ＷＴにおいて上方制御された遺伝子及びその逆を決定した。ＲＡＧ２－ＫＯ－１及びＲＡＧ２－ＫＯ－４の両方と比較して、対照ＷＴで顕著に上方制御された遺伝子には、ＣＣＤＣ１５２、ＧＰＲ１８３、ＩＬ３２及びＭＡＬが含まれる（表１及び図５Ａ）。ＲＡＧ２－ＫＯ－１または－４と比較して、対照ＷＴで顕著に上方制御された遺伝子（ｐ＜０．０５）には、それぞれ、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＩＬ１ＲＬ１、ＰＬＸＮＡ２及びＴＥＡＤ１、またはＣＴＳＷ、ＩＫＢＫＧ、ＩＬ２１Ｒ及びＩＬ４Ｒが含まれた（表１及び図５Ａ）。注目すべきことに、これらの遺伝子（ＴＥＡＤ１、ＩＫＢＫＧ及びＩＬ３２など）の多くは、ＴＣＲβ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞においても、対照ＷＴＤＰ細胞に類似して高発現であった（図５Ａ）。興味深いことに、遺伝子のサブセット（ＭＡＬなど）の発現は、ＴＣＲβ鎖の強制発現によって救済されなかった（図５Ａ）。対照ＷＴと比較して、ＲＡＧ２－ＫＯ－１及びＲＡＧ２－ＫＯ－４の両方で顕著に上方制御された遺伝子には、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＬＯＣ１００２４０７３５及びＬＯＣ３３９９７５が含まれる（表１及び図５Ｂ）。対照ＷＴと比較して、ＲＡＧ２－ＫＯ－１または－４で顕著に上方制御された遺伝子には、それぞれ、ＣＣＤＣ８、ＣＰＡ４、ＥＰＨＡ４及びＩＤ１、またはＡＮＫＲＤ１、ＣＭＴＭ８、ＭＥＴ及びＲＨＯＵが含まれる（表１及び図５Ｂ）。注目すべきことに、これらの遺伝子（ＩＤ１、ＲＨＯＵ及びＨＢＧ１など）の多くは、ＴＣＲβ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞においても、対照ＷＴＤＰ細胞に類似して低発現を示した（図５Ｂ）。興味深いことに、遺伝子のサブセット（ＬＯＣ１００２４０７３５など）の発現は、ＴＣＲβ鎖の強制発現によって低減されなかった（図５Ｂ）。系統樹分析は、ＴＣＲβ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞が、対照形質導入ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞よりも対照ＷＴＤＰ細胞に類似していたことを再び示した（図５）。

【0191】

マウスβ選択に関与することが知られている細胞周期調節因子、生存及び分化遺伝子の分析（Ｌｅｆｅｂｖｒｅｅｔａｌ，２００５、Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ，２０１９、Ｓｉｃｉｎｓｋａｅｔａｌ，２００３）は、ＲＡＧ２－ＫＯＤＰにおけるＴＣＲβ発現後にも調節されるＲＯＲＣ、ＣＤ２７、ＥＲＧ及びＣＣＤＮ３などの一連の遺伝子を明らかにした（図６Ａ）。ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞と比較して、対照ＷＴで上方制御された遺伝子を伴う生物学的経路を決定するための遺伝子オントロジー分析は、「内因性アポトーシスシグナル伝達経路の負の調節」に関与する遺伝子プログラムを明らかにした（図６Ｂ）。更に、白血球調節に関連する遺伝子セット経路には、「リンパ球活性化の正の調節」及び「リンパ球増殖の調節」に関与する遺伝子が含まれた（図６Ｂ）。したがって、これらのデータは、発達ヒトＴ細胞におけるＲＡＧ２依存性ＴＣＲβ発現が、それらの生存及び／または増殖を支持する更なる証拠を提供する。
［発明の概要］

【0192】

ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣを生成して、ヒトＴ細胞発達中のＴＣＲβの役割を評価した。ＤＰ胸腺細胞の完全な欠如を示すＲａｇ１欠損マウスまたはＲａｇ２欠損マウスで見られる効果とは対照的に、発達ヒトＴ細胞は、ＲＡＧ２発現の不在下でＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ段階に達することができた。マウスにおけるＲＡＧ１／２の欠如は、ＲＡＧ１／２媒介ＴＣＲβ再構成がＤＮ３からＣＤ４４^－ＣＤ２５^－ＤＮ４及びＤＰ段階への移行を制御することが十分に文書化されているため、ＣＤ４４^－ＣＤ２５^＋ＤＮ３段階で決定的な遮断をもたらす（ｖｏｎＢｏｅｈｍｅｒｅｔａｌ，１９９９、ＭｉｃｈｉｅａｎｄＺｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ，２００２）。しかしながら、ヒトＴ細胞発達中のＲＡＧ１／２発現またはＴＣＲβ再編成の不在下で正確な発達遮断は、大部分未解決であった（ＲｏｔｈｅｎｂｅｒｇａｎｄＴａｇｈｏｎ，２００５、Ｃａｒｒａｓｃｏｅｔａｌ，２００２）。

【0193】

ＴＣＲβ誘導性生存／増殖、またはβ選択の必要性は、細胞の５％が細胞表面ＴＣＲβタンパク質を発現するＣＤ４^＋ＩＳＰ段階で生じることが以前に示唆された（Ｂｌｏｍｅｔａｌ，１９９９）。別の研究では、代わりに、細胞の２５％が細胞内ＴＣＲβタンパク質を発現するＣＤ４^＋ＣＤ８α^＋ＣＤ８β^－初期二重陽性（ＥＤＰ）段階でβ選択が後に起こることが示唆された（Ｃａｒｒａｓｃｏｅｔａｌ，１９９９）。したがって、これらの２つの研究に基づいて、β選択がＣＤ４^＋ＩＳＰ段階で始まり、ＥＤＰ段階まで続くことが提案された。ここでは、ＲＡＧ２－ＫＯ発達Ｔ細胞においてＣＤ４、ＣＤ８α及びＣＤ８βの発現が観察されたため、ＩＳＰ及びＥＤＰを過ぎてＤＰ段階まで堅牢な発達が検出された。ＤＰ段階への表現型分化におけるＴＣＲβ鎖の必要性は、マウスとヒトの間で異なるが、ＴＣＲβ鎖は、強制されたＴＣＲβ発現が細胞拡大を救済したように、マウス及びヒト発達Ｔ細胞の両方において同様に細胞拡大（生存／増殖）を促進する。理論に拘束されることなく、ヒトＴ細胞発達中のＤＰ段階の前ではなく、その間の、ＴＣＲβ、したがってｐｒｅＴＣＲの必要性は、細胞周期及び生存遺伝子の差次的発現を反映し得る。マウスにおいて、ＤＮ３細胞におけるｐｒｅＴＣＲの発現は、細胞周期阻害剤Ｃｄｋｎ２ａの発現を抑制するＢｍｉ－１の発現をもたらす。Ｃｄｋｎ２ａの抑制は、ｐｒｅＴＣＲ誘導性細胞増殖及びＤＮ３－ＤＰ移行に必要である（Ｍｉｙａｚａｋｉｅｔａｌ，２００８）。要約すると、この研究は、発達ヒトＴ細胞におけるＴＣＲβ媒介性β選択に必要な予期せぬタイミングを明らかにする。

【0194】

実施例２
ＲＡＧ２－ＫＯＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰにおけるＴＣＲαβ及びＴＣＲγδ鎖の強制発現
ＲＡＧ２－ＫＯｈＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋細胞をＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞上で２１日間培養し、ＤＰ細胞を、空のベクター（ｄＴｏｍａｔｏ）、再構成ＴＣＲαβ鎖（１３８３ｉ－ＴＣＲ）（Ｒｏｓｚｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，２００３）または再構成ＴＣＲγδ鎖（３Ｃ２－ＴＣＲ）（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅｅｔａｌ．，２０１８）（図７）でレトロウイルス形質導入した。形質導入ＲＡＧ－ＫＯ細胞を、ＣＤ７^＋ＣＤ５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ細胞について選別し、更に４及び１０日間、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞上に戻して、細胞生存及び拡大について評価した（図７Ａ）。ＴＣＲαβ－及びＴＣＲγδ形質導入ＤＰは、ｄＴｏｍａｔｏ形質導入ＤＰと比較して、４及び１０日後により高い細胞数を示し（図７Ａ）、ＴＣＲαβ形質導入細胞は、ＴＣＲγδ形質導入細胞よりもはるかに高い倍数拡大を示し、ＴＣＲβ形質導入ＤＰ細胞で見られたものと同様であった（図３）。理論に拘束されることなく、これは、ＴＣＲβ鎖のみ（ｐｒｅＴＣＲ、ｐＴα／ＴＣＲβ）に類似して、再構成ＴＣＲαβ鎖またはＴＣＲγδ鎖の発現が、ＤＰ段階での細胞生存及び／または発達ヒトＴ細胞の増殖を促進することを示唆する。加えて、ＴＣＲ形質導入ＲＡＧ２－ＫＯＤＰ細胞のフローサイトメトリー分析は、それぞれ、Ｔ系列細胞の細胞表面上の対応するαβ及びγδ ＴＣＲの発現を示す（図７Ｂ）。これらの結果は、インビトロで分化したＲＡＧ２欠損ＰＳＣから得られた発達Ｔ細胞を形質導入して、γδまたはαβ ＴＣＲを効果的に発現させることができることを示す。

【0195】

実施例３
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して、以下の遺伝子の各々を標的とする：Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質４（ＸＲＣＣ４）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、非相同末端結合因子１（ＮＨＥＪ１、ＣｅｒｎｕｎｎｏｓまたはＸＲＣＣ４様因子（ＸＬＦ）としても知られる）、ＸＲＣＣ４及びＸＬＦのパラログ（ＰＡＸＸ）、ＤＮＡポリメラーゼλ及びＤＮＡポリメラーゼμ。

【0196】

ｈＰＳＣを、遺伝子標的化ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドでトランスフェクトする。トランスフェクトしたＧＦＰ^＋ｈＰＳＣを単一細胞選別し、培養する。

【0197】

様々なＫＯｈＰＳＣが多能性を維持したかどうかを評価するために、主要マーカーの発現及び奇形腫の形成を評価した。免疫蛍光染色は、ＫＯｈＰＳＣがＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＳＳＥＡ－４を発現することを示す。

【0198】

多能性を機能的に試験するために、ＫＯｈＰＳＣを免疫不全マウスに注射し、組織学的分析により、３つの生殖層全てを有するＫＯ奇形腫の形成が明らかになり、ＫＯｈＰＳＣが多能性の主要な特徴を保持していることを示す。ＫＯｈＥＳＣが造血前駆細胞を生成する能力を決定するために、８日間の胚様体分化培養後にＣＤ３４発現を分析する（Ｋｅｎｎｅｄｙｅｔａｌ，２０１２）。対照ＷＴ及びＫＯｈＰＳＣは、同様の頻度の血液内皮ＣＤ３４^＋細胞を生じる。

【0199】

ＫＯｈＰＳＣからのＴ細胞発達。ＣＤ３４^＋造血内皮細胞をＭＡＣＳ富化し、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、発現ヒトＩＬ－７、ＦＬＴ３リガンド及び幹細胞因子（７ＦＳ）とともに培養して、Ｔ細胞分化を誘導した。１０日間の培養後、対照ＷＴ及びＫＯ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ５の両方の発現によって示されるように、Ｔ細胞系列に沿って進行する。３つの群は全て、１５日目までにＣＤ４^＋中間単一陽性（ＩＳＰ）段階に達し、２０日目までに細胞内ＣＤ３発現を示す。２４日間の培養後、対照ＷＴ及びＫＯ群からの細胞の大部分は、ＣＤ７^＋ＣＤ５^＋である。２９～３４日間の培養により、対照ＷＴ及びＫＯ細胞は全て、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ段階に達する。

【0200】

細胞の生存及び拡大を決定するために、対照ＷＴ及びＫＯ発達Ｔ細胞から総細胞充実度を定量化する。２０日間の培養後、３つの試料は全て、同様の細胞数を示す。

【0201】

ＫＯＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰにおけるＴＣＲβ鎖の強制発現。ＫＯｈＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋細胞をＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞上で２４日間培養し、ＤＰ細胞を、空ベクター（ｄＴｏｍａｔｏ）、再構成ＴＣＲα鎖（ＴＲＡ１３８３ｉ）または再構成ＴＣＲβ鎖（ＴＲＢ１３８３ｉ）でレトロウイルス形質導入する。形質導入ＫＯ細胞を、ＣＤ７^＋ＣＤ５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ＤＰ細胞について選別し、更に１０日間、ＯＰ９－ＤＬ４－７ＦＳ細胞上に戻して、細胞生存及び拡大について評価する。ｄＴｏｍａｔｏ－及びＴＣＲα形質導入ＤＰの両方が、１０日間の培養後に同様の細胞数を示す。しかしながら、ＴＣＲβ形質導入ＤＰは、ｄＴｏｍａｔｏ及びＴＣＲα形質導入ＤＰと比較して、１０日間の培養後に顕著に高い細胞数を示す。

【0202】

実施例４
ＫＯＳＰＴ細胞の生成
ＫＯＳＰＴ細胞の生成。再構成ＴＣＲβ鎖（ＴＲＢ１３８３ｉ）、ＣＡＲまたはＴＣＲのうちの１つ以上で操作されたＫＯｈＰＳＣは、上記のように、または間質細胞を含まない状態で、ＣＤ３４＋細胞及びその後のＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ細胞に分化される（例えば、ＷＯ２０１９１５７５９７Ａ１を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。生成したＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ細胞を、ＣＤ４－ＣＤ８＋ＳＰ及び／またはＣＤ８－ＣＤ４＋ＳＰＴ細胞に更に分化させる。ＴＣＲβで操作されたＫＯＤＰ細胞は、ＫＯのみの細胞と比較してＳＰＴ細胞への進行に成功する。

【表1】

【表2】

【表3】

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【図1】