特表2024-515724長期にわたり血小板の生存能力および活性化能力を維持するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】長期にわたり血小板の生存能力および活性化能力を維持するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/49 20060101AFI20240403BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240403BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20240403BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240403BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240403BHJP
A61K 35/19 20150101ALI20240403BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20240403BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
G01N33/49 X ZNA
G01N33/53 N
C12N5/078
C07K14/47
C07K7/06
A61K35/19
A61P7/04
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564676
(86)(22)【出願日】2022-03-14
(85)【翻訳文提出日】2023-12-19
(86)【国際出願番号】 US2022020115
(87)【国際公開番号】W WO2022225624
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】63/177,203
(32)【優先日】2021-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523396945
【氏名又は名称】レサム・テクノロジーズ，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(74)【代理人】
【識別番号】100220098
【弁理士】
【氏名又は名称】宮脇 薫
(72)【発明者】
【氏名】パドマナバン，アナンド
(72)【発明者】
【氏名】ジョーンズ，カーティス・ジェラルド
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045BB54
2G045CA24
2G045DA37
4B063QA01
4B063QQ02
4B063QQ08
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4B063QR48
4B063QR72
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4B063QS36
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4B065AA93X
4B065AC20
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4B065BD39
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB38
4C087CA04
4C087MA55
4C087NA03
4C087NA14
4C087ZA53
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA14
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
本明細書に記載される組成物および方法は、解凍による回収方法と結び付けられた制御された凍結プロセスによって安定化血小板を提供する。安定化血小板は、凍結および解凍後に活性化される能力を維持する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生存能力および活性化能を維持する血小板を凍結保存するための方法であって、（ａ）対象から血液または多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む懸濁緩衝液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；そして
（ｆ）約－８０℃で血小板を保存する；
ことを含む、前記方法。
【請求項2】
該方法が血小板の生存能力および活性化能を２週間以上維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
血小板の単離が、血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板を１００×ｇで１５分間遠心分離して第１のペレットおよび第１の上清を生成し；その後、第１の上清を１０００×ｇで１５分間遠心分離して第２のペレットおよび第２の上清を生成することを含み、第１の上清が血小板に富み、第２の上清が血小板に乏しい、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
第２の上清を収集し、トレハロースを約５０ｍＭまで加え、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの濃度に希釈するために使用する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
血小板の冷却が、温度を毎分約２～２０℃の速度で低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
請求項１に記載の方法によって調製された凍結保存血小板。
【請求項11】
凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、前記方法。
【請求項12】
懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
さらに、（ｈ）解凍した血小板を単離する工程；および
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる工程；
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
解凍した血小板の単離が１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
活性化緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
解凍した血小板の単離が１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する、請求項１６に記載の方法：（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する工程。
【請求項21】
工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
洗浄緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
工程（ｆ）の一定期間が１日～約５年である、請求項１６に記載の方法。
【請求項25】
請求項１１に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板。
【請求項26】
凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）請求項１１に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして
（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
【請求項27】
回収した血小板をＰＦ４で処理することが、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
請求項２６に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項31】
凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）請求項１１に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして
（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
ことを含む、前記方法。
【請求項32】
回収した血小板をＴＲＡＰで処理することが、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
請求項３１に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項36】
凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）請求項１１に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして
（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
【請求項37】
回収した血小板をヘパリンで処理することが、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
請求項３６に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項41】
血小板を凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；そして
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる；
ことを含む、前記方法。
【請求項42】
懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、請求項４１に記載の方法。
【請求項45】
希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
解凍した血小板の単離が１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項47】
活性化緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項48】
解凍した血小板の単離が１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項49】
工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する、請求項４１に記載の方法：（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する工程。
【請求項50】
工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
洗浄緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項52】
工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
工程（ｆ）の一定期間が１日～約５年である、請求項４１に記載の方法。
【請求項54】
請求項４１に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板。
【請求項55】
凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）請求項４１に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして
（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
【請求項56】
回収した血小板をＰＦ４で処理することが、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、請求項５５に記載の方法。
【請求項58】
血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
請求項５５に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項60】
凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）請求項４１に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして
（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
ことを含む、前記方法。
【請求項61】
回収した血小板をＴＲＡＰで処理することが、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、請求項６０に記載の方法。
【請求項63】
血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
請求項６０に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項65】
凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）請求項４１に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして
（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
【請求項66】
回収した血小板をヘパリンで処理することが、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、請求項６５に記載の方法。
【請求項68】
血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
請求項６５に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項70】
以下の方法：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
によって生成された、回収した凍結保存血小板。
【請求項71】
以下の方法：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；
（ｊ）回収した血小板をヘパリンまたはＰＦ４で処理し；そして
（ｋ）ヘパリンまたはＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項72】
以下の方法：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；そして
（ｊ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
【請求項73】
血液、血漿または血清中のヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）抗体を検出するためのキットであって、（ａ）凍結保存血小板；
（ｂ）血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）またはヘパリンのうちの１以上；
（ｃ）血小板活性化を検出するための１以上の試薬；
（ｄ）所望により、緩衝液および容器；ならびに
（ｅ）所望により、包装または使用説明書のうちの１以上；
のうちの２以上を含む、前記キット。
【請求項74】
血小板活性化を検出するための１以上の試薬が、トロンボスポンジン－１を検出するための試薬を含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項75】
キットが、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陰性を示す１以上の陰性対照試料；および、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陽性を示す１以上の陽性対照試料をさらに含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項76】
出血の治療または予防を必要とする対象において出血を治療または予防するための方法であって、（ａ）凍結保存血小板を得；
（ｂ）凍結保存血小板を解凍し；
（ｃ）対象を、解凍した凍結保存血小板と接触させる；
ことを含む、前記方法。
【請求項77】
工程（ａ）～（ｂ）が、（ｉ）第２の対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｉｉ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｉｉｉ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｉｖ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；
（ｖ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｖｉ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｖｉｉ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｖｉｉｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
工程（ａ）～（ｂ）が、（ｉ）第２の対象から多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｉｉ）多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板にトレハロースを加え；
（ｉｉｉ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；
（ｉｖ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｖ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｖｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項79】
工程（ｃ）における接触が、解凍した凍結保存血小板を損傷部位に適用するか、または解凍した凍結保存血小板を対象に非経口投与することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項80】
凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
【請求項81】
解凍した凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
【請求項82】
活性化された解凍した凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は２０２１年４月２０日に出願された米国仮出願第６３／１７７２０３号の優先権を主張するものであり、該米国仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は２０２１年４月２０日に出願された米国仮出願第６３／１７７２０３号の優先権を主張するものであり、該米国仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府資金による研究
本発明は、米国国立衛生研究所の中小企業イノベーション(Small Business Innovation Research)（ＳＢＩＲ）プログラムによって与えられた助成金番号ＨＬ１４７７３４の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所の中小企業イノベーション(Small Business Innovation Research)（ＳＢＩＲ）プログラムによって与えられた助成金番号ＨＬ１４７７３４の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【0003】
配列表への参照
本出願は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２１（ｃ）に従い、コンピュータ読み取りが可能な形式の配列表で出願される。ＥＦＳにより提出されたテキストファイル「２１１５０９－９００３－ＷＯ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１－ＭＡＲ－２０２２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は２０２２年３月１１日に作成され、２つの配列を含有し、１．１３Ｋバイトのファイルサイズを有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２１（ｃ）に従い、コンピュータ読み取りが可能な形式の配列表で出願される。ＥＦＳにより提出されたテキストファイル「２１１５０９－９００３－ＷＯ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１－ＭＡＲ－２０２２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は２０２２年３月１１日に作成され、２つの配列を含有し、１．１３Ｋバイトのファイルサイズを有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0004】
技術分野
本明細書に記載される組成物および方法は、解凍による回収方法と結び付けた制御された凍結プロセスによって安定化血小板（stabilized platelet）を提供する。安定化血小板は、凍結および解凍後に活性化される能力を維持する。
本明細書に記載される組成物および方法は、解凍による回収方法と結び付けた制御された凍結プロセスによって安定化血小板（stabilized platelet）を提供する。安定化血小板は、凍結および解凍後に活性化される能力を維持する。
【背景技術】
【0005】
血小板は、正常な止血に重要な巨核球の無核断片である。いくつかの病理学的状態において、活性化血小板（activated platelets）が引き起こす／寄与する血栓症は、高レベルの罹患率および死亡率をもたらす可能性がある。逆に、低レベルの血小板は、重篤な出血の素因となり得る。血小板の重要な特徴は、診断の状況で用いられるか治療の状況で用いられるかにかかわらず、その生存能力が限られていることである。生存血小板(viable platelets)は、フローサイトメトリーおよび酵素結合免疫吸着検定法を含むがこれらに限定されない技術によって好都合に測定することができる顆粒成分を放出することができるであろう。典型的には、血小板は室温で保存され、５日以内に古くなる。血小板を４℃で保存すると、生存能力を最長２週間延長することができる。凍結乾燥などの長期血小板保存のための他の方法は、出血患者の治療における潜在的有用性を明示しているが、血小板が、活性化されて顆粒成分を放出するのに十分な生存能力を有さないという事実のため、診断状況におけるそれらの有用性は限定される。
【0006】
凍結保存中に血小板を安定化するための方法であって、臨床的および診断的状況において血小板の生存能力および活性化能（activation potential）が維持される方法が必要とされている。このような安定化血小板は、さまざまな研究目的に有用である。
【発明の概要】
【0007】
本明細書に記載の一態様は、生存能力および活性化能を維持する血小板を凍結保存するための方法であって、（ａ）対象から血液または多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む懸濁緩衝液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；そして（ｆ）約－８０℃で血小板を保存する；ことを含む方法である。一観点において、本方法は血小板の生存能力および活性化能を２週間以上維持する。他の観点において、懸濁緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースを含む。他の観点において、安定剤は約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他の観点では、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する。他の観点では、希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする。他の観点において、血小板の単離は、血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板を１００×ｇで１５分間遠心分離して第１のペレットおよび第１の上清を生成し；その後、第１の上清を１０００×ｇで１５分間遠心分離して第２のペレットおよび第２の上清を生成することを含み、第１の上清は血小板に富み、第２の上清は血小板に乏しい。他の観点では、第２の上清を収集し、トレハロースを約５０ｍＭまで加え、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの濃度に希釈するために使用する。他の観点において、血小板の冷却は、温度を毎分約２～２０℃の速度で低下させることを含む。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された凍結保存血小板である。
【0008】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；ことを含む方法である。一観点において、懸濁緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースを含む。他の観点において、安定剤は約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他の観点では、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する。他の観点では、希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする。他の観点において、該方法は、（ｈ）解凍した血小板を単離する工程；および（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液(activation buffer)中に懸濁させる工程を、さらに含む。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む。他の観点において、活性化緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む。他の観点では、工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する：（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、洗浄緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、工程（ｆ）の一定期間は１日～約５年である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板である。
【0009】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＰＦ４で処理することは、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0010】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＴＲＡＰで処理することは、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化さた回収した凍結保存血小板である。
【0011】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をヘパリンで処理することは、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0012】
本明細書に記載の他の態様は、血小板を凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；（ｈ）解凍した血小板を単離し；そして（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる；ことを含む方法である。一観点において、懸濁緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースを含む。他の観点において、安定剤は約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他の観点では、工程（ｃ）の血小板を、約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する。他の観点では、希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む。他の観点において、活性化緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む。他の観点では、工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する：（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、洗浄緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、工程（ｆ）の一定期間は１日～約５年である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板である。
【0013】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＰＦ４で処理することは、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0014】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＴＲＡＰで処理することは、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0015】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をヘパリンで処理することは、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0016】
本明細書に記載の他の態様は、以下の方法によって生成された、回収した凍結保存血小板である：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する。
【0017】
本明細書に記載の他の態様は、以下の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；（ｈ）解凍した血小板を単離し；（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；（ｊ）回収した血小板をヘパリンまたはＰＦ４で処理し；そして（ｋ）ヘパリンまたはＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする。
【0018】
本明細書に記載の他の態様は、以下の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；（ｈ）解凍した血小板を単離し；（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；そして（ｊ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する。
【0019】
本明細書に記載の他の態様は、血液、血漿または血清中のヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）抗体を検出するためのキットであり、該キットは、以下のうちの２以上を含む：（ａ）凍結保存血小板；（ｂ）血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）またはヘパリンのうちの１以上；（ｃ）血小板活性化を検出するための１以上の試薬；（ｄ）所望により、緩衝液および容器；ならびに（ｅ）所望により、包装または使用説明書のうちの１以上。一観点において、血小板活性化を検出するための１以上の試薬は、トロンボスポンジン－１を検出するための試薬を含む。他の観点において、キットは、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陰性を示す１以上の陰性対照試料；および血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陽性を示す１以上の陽性対照試料をさらに含む。
【0020】
本明細書に記載の他の態様は、出血の治療または予防を必要とする対象において出血を治療または予防するための方法であって、（ａ）凍結保存血小板を得；（ｂ）凍結保存血小板を解凍し；（ｃ）対象を、解凍した凍結保存血小板と接触させる；ことを含む方法である。一観点において、工程（ａ）～（ｂ）は、（ｉ）第２の対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｉｉ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｉｉｉ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｉｖ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；（ｖ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｖｉ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｖｉｉ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｖｉｉｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；ことを含む。他の観点において、工程（ａ）～（ｂ）は、（ｉ）第２の対象から多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｉｉ）多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板にトレハロースを加え；（ｉｉｉ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；（ｉｖ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｖ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｖｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；ことを含む。他の観点において、工程（ｃ）における接触は、解凍した凍結保存血小板を損傷部位に適用するか、または解凍した凍結保存血小板を対象に非経口投与することを含む。
【0021】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
本明細書に記載の他の態様は、解凍した凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
本明細書に記載の他の態様は、解凍した凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
【0022】
本明細書に記載の他の態様は、活性化された解凍した凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図2】図２は、凍結保存し、洗浄によって回収した、２０人の異なる全血ドナーから得た多血小板血漿ユニットからの２０ロットの血小板を示す。血小板を血小板第４因子（ＰＦ４）で処理し、３つのＨＩＴ（黒丸）および３つの正常血液試料（白丸）に対する反応性について試験した。次いで、活性化反応からの上清を、血小板活性化のマーカーとしてトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）濃度についてアッセイした。ｘ軸は２０の異なる血小板ロットを示し、ｙ軸は凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均である。
【図3】図３は、凍結保存し、－８０℃で１週間以下の保存後（ベースライン、Ｂ）、または－８０℃で４週間以上の保存後（４Ｗ）のいずれかの、洗浄によって回収した７ロットの血小板を示す。洗浄による回収後、血小板をＰＦ４で処理し、３つのＨＩＴ（黒丸）および３つの正常血液試料（白丸）に対する反応性について試験した。次いで、活性化反応からの上清を、血小板活性化のマーカーとしてのＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｘ軸はベースラインおよび４週間の時間点の両方について垂直線によって分離された７つの異なる血小板ロットを示し、ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均である。
【図4】図４は、凍結保存し、－８０℃で１４週間の保存後の、洗浄によって回収した血小板を示す。回収後、血小板をＰＦ４で処理し、ＨＩＴ（黒色）または正常血液試料（白色）に対する反応性について試験した。次いで、凍結保存血小板からの上清を、血小板活性化のマーカーとしてのＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【図5】図５は、凍結保存し、解凍および洗浄（洗浄１回）、解凍および体積低減（体積低減）、または解凍のみ（洗浄なし）によって回収した、単一ドナーからの血小板を示す。次いで、血小板をＰＦ４で処理した。ＰＦ４で処理した血小板にＨＩＴ（黒色）または正常血液試料（白色）を加えた。血小板上清を、血小板活性化のマーカーとしてのＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。示すデータは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【図6】図６は、凍結保存し、解凍および洗浄（「洗浄１回」）、解凍および体積低減（「体積低減」）、または解凍のみ（「洗浄なし」）によって回収した、単一ドナーからの血小板を示す。回収した血小板にＴＲＡＰ（黒色）または緩衝液（白色）を加えた。血小板上清を、血小板活性化のマーカーとしてのＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【図7】図７は、凍結保存し、洗浄によって回収した後、０、０．１、０．３、０．５および１Ｕ／ｍＬの濃度の未分画ヘパリンで処理した血小板を示す。次いで、ヘパリンで処理した血小板にＨＩＴ（黒色）または正常血液試料（白色）を加え、上清を、血小板活性化の尺度としてＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｘ軸はヘパリン濃度を示し、ｙ軸は凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【図8】図８は、乏血小板血漿と共に凍結保存し、洗浄によって回収し、ＰＦ４で処理した血小板を示す。次いで、ＰＦ４で処理した血小板にＨＩＴ（黒色）または正常血液試料（白色）を加え、上清を、血小板活性化の尺度としてのＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【図9】図９は、乏血小板血漿の存在下で凍結保存し、洗浄によって回収した血小板を示す。次いで、ＴＲＡＰ(黒色）または緩衝液（白色）を加え、上清を、血小板活性化の尺度としてのＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【図10】図１０は、凍結させ、洗浄によって回収した後（黒色）、または凍結乾燥し、再構成した後（白色）、ＰＦ４で処理した、単一ドナーからの血小板を示す。ＰＦ４で処理した血小板にＨＩＴ（左）または正常血液試料（右）を加え、上清をＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【図11】図１１は、凍結させ、洗浄によって回収した（黒色）、または凍結乾燥し、再構成した（白色）、単一ドナーからの血小板を示す。血小板にＴＲＡＰ（左）または緩衝液（右）を加え、上清をＴＳＰ１濃度についてアッセイした。ｙ軸は、凍結血小板から放出されたＴＳＰ１の量をμｇ／ｍＬで示す。データは、３回の測定の平均＋平均の１標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法、ならびにそれらの技術は当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。矛盾する場合には、定義を含めて、本開示が優先する。代表的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載の態様および観点の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を使用することができる。
【0025】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「ベクター」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、当業者によって理解されるであろうそれらの共通の意味を有する。本明細書では、標準的な一文字ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ）および標準的な一文字アミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ）を使用する。
【0026】
本明細書で使用される場合、「包含する(include)」、「包含している(including)」、「含有する(contain)」、「含有している(containing)」、「有している(having)」などのような用語は、「含んでいる(comprising)」を意味する。本開示はまた、明確に記載されているか否かにかかわらず、本明細書で提示される態様または要素を「含む」、それら「からなる」およびそれら「から実質的になる」他の態様も企図している。
【0027】
本明細書で使用される場合、本開示の文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様の用語は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。また、特記しない限り、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、「１以上」を意味する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、接続語または離接語であることができる。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、大きな程度またはかなりの程度ではあるが、完全にではないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、大きな程度またはかなりの程度ではあるが、完全にではないことを意味する。
【0029】
本明細書で使用される場合、１以上の対象となる値に適用される「約」または「およそ」という用語は、値が、挙げた基準値に類似するか、または当業者によって決定される特定値の場合は許容可能な誤差範囲内にあることをさし、これは、測定システムの限界など、値の測定または決定方法に部分的に依存する。一観点において、用語「約」は、用語「約」によって修飾された値の±１０％までの変動内にある整数および分数成分の両方を含む任意の値をさす。あるいは、「約」は、当技術分野の実施に従って、３以上の標準偏差内を意味することができる。あるいは、例えば生物学的システムまたはプロセスに関し、用語「約」は、値の１桁以内、いくつかの態様では５倍以内、いくつかの態様では１．５倍以内を意味することができる。本明細書で使用するとき、記号「～」は、「約」または「およそ」を意味する。
【0030】
本明細書に開示されるすべての範囲は、離散値としての両端点、ならびに範囲内で特定されるすべての整数および分数を包含する。例えば、０．１ ～２．０の範囲には、０．１、０．２、０．３、０．４．．．２．０が含まれる。端点が用語「約」によって修飾されている場合、特定される範囲は、その範囲内、または端点を含む３以上の標準偏差内の任意の値の±１０％までの変動によって拡大される。
【0031】
本明細書で使用される場合、「活性成分」または「活性医薬成分」という用語は、有益なことが多い薬理学的効果を提供する、医薬品、活性な成分、化合物、または物質、組成物、またはそれらの混合物をさす。
【0032】
本明細書で使用される場合、「対照」または「基準」という用語は、互換的に使用される。「基準」または「対照」レベルは、測定結果を評価するためのベースラインまたはベンチマークとして使用される所定の値または範囲であることができる。「対照」は、対照実験または対照細胞もさす。
【0033】
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、対象に施用される作用、薬剤、組成物、または細胞（１以上）の実質的に非毒性であるが十分な量であって、経験している疾患または状態、または対象が罹患しやすい疾患または状態の症状の１以上をある程度予防、治療、または改善する量をさす。結果は、疾患の徴候、症状もしくは原因の軽減もしくは緩和、または生物系の任意の他の望ましい変化であることができる。有効量は、各対象でそれぞれ異なる因子、例えば、限定されるものではないが、対象の年齢、サイズ、疾患のタイプまたは程度、疾患の段階、投与経路、使用される補充療法のタイプまたは程度、進行中の疾患経過、および望ましい治療のタイプに基づくことができる。
【0034】
本明細書に記載の組成物は、非経口的に、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または埋め込まれたリザーバーを介して投与することができる。「非経口」または「非経口投与」という用語は、本明細書で使用される場合、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、肝臓内、病巣内、頭蓋内注射、または全身注入を包含する。いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物は、静脈内、動脈内、または注入によって投与される。
【0035】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は動物をさす。典型的には、対象は哺乳類である。対象はまた、霊長類（例えば、ヒト、男性または女性；乳児、青年、または成人）、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、魚類、鳥類などをさす。一態様において、対象は霊長類である。一態様において、対象はヒトである。一観点において、対象は、病原性抗体または血小板活性化抗体を有する疑いがある。「血小板活性化抗体を有することが疑われる対象」または「被験対象」は、本明細書で使用される場合、例えば、正常未満の血小板数、血小板数の減少、以前に診断された血餅の拡大もしくは伸長、または身体の他の場所での新たな血餅の発生など、病原性抗体を示す臨床所見を示す対象をさす。病原性抗体を示す症状としては、息切れ、脳卒中、四肢壊疸、皮膚壊死、心筋梗塞、または胸痛が挙げられる。一態様において、血小板活性化抗体はＨＩＴを引き起こすことができる抗体である。他の態様において、血小板活性化抗体は、血小板活性化ヘパリン起因性血小板減少症抗体を含む。「正常対象」は、任意の病気(aliment)に罹患していないか、または血小板活性化抗体を有する疑いがない対象さす。
【0036】
本明細書で使用される場合、対象が当該治療から生物学的に、医学的に、または生活の質において利益を得るであろう場合、そのような対象は「治療を必要とする」。治療を必要とする対象は、とりわけ防止的または予防的治療の場合、必ずしも症状を呈さない。
【0037】
本明細書で使用される場合、「阻害する」、「阻害」または「阻害すること」という用語は、所与の生物学的過程、状態、症状、障害もしくは疾患の低減もしくは抑制、または生物学的活性もしくは過程のベースライン活性における有意な低減をさす。
【0038】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、障害もしくは疾患を含む生物学的過程の進行を予防、防止、抑制、抑止、逆転、緩和、改善もしくは阻害すること、または疾患を完全に排除することをさす。治療は、短期間または長期間のいずれかの方法で行うことができる。「治療」という用語はまた、疾患で苦しむ前に、疾患または該疾患に関連する症状の重症度を低下させることをさす。疾患、障害またはその症状を「抑止」または「改善」することは、本明細書に記載の細胞、組成物または化合物を、そのような疾患、障害またはその症状の臨床的出現後の対象に投与することを包含する。疾患、障害またはその症状を「予防」または「防止」することは、本明細書に記載の細胞、組成物または化合物を、疾患、障害またはその症状の発症前に対象に投与することを包含する。疾患または障害を「抑制」することは、本明細書に記載の細胞、組成物または化合物を、疾患またはその障害の誘発後であるが、その臨床的出現または症状が現れる前に、対象に投与することを包含する。
【0039】
本明細書で使用される場合、「同定すること」または「診断すること」は、対象を病変または症状を有すると分類すること、病変の重症度（進行度または病期）を決定すること、病変の進行をモニタリングすること、または病変の転帰もしくは回復の見込みを予測することをさす。一態様において、対象は、その血液中に血小板活性化抗体を有すると同定または診断される。一観点において、血小板活性化抗体は、血小板活性化ヘパリン起因性血小板減少症抗体を含む。血小板活性化ヘパリン起因性血小板減少症抗体の同定または検出は、対象がヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）を有することを示し、またはその診断に用いられる。
【0040】
本明細書で使用される場合、「ヘパリン起因性血小板減少症」または「ＨＩＴ」は、ヘパリンに対する有害反応、またはヘパリンへの暴露なしで生じる血栓性血小板減少性反応、例えば、自然発症型ＨＩＴおよび「ワクチン起因性免疫性血栓性血小板減少症」すなわち「ＶＩＴＴ」をさし、罹患した対象は血小板活性化抗体を産生する。血小板活性化抗体は、ヘパリンとの複合体の状態にあるか、血小板膜成分との複合体の状態にあるか、または単独の状態にあるＰＦ４、ＩＬ－８およびＮＡＰ－２などの分子に結合して、生命を脅かし得る血栓形成促進性および血小板減少性状態をもたらす。
【0041】
本明細書中で使用される場合、「ヘパリン起因性」は、ヘパリンへの暴露に起因する抗体、あるいは、ＨＩＴの指標として、自然発症型ＨＩＴまたはＶＩＴＴのようにヘパリンまたは血小板膜成分と複合体化した血液因子を認識する抗体をさす。
【0042】
本明細書で使用される場合、「ヘパリン様化合物」は、ポリアニオン、ヘパリン誘導体、化学修飾ヘパリン、ヘパリン様グリコサミノグリカン分子、多数のヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンを含有するプロテオグリカン、低分子量ヘパリン、少なくとも１０個の糖単位を含む合成グリコサミノグリカン、または合成ヘパリン様グリコサミノグリカンなど、強い負電荷を有する化合物をさし、これらのいずれもが、直接的に、またはスペーサー／リンカー分子を介してコア分子に連結され得る。
【0043】
「血小板」は、「栓球」としても知られ、本明細書で使用される場合、血液凝固、止血および血栓形成に関与する巨核球の無核断片をさす。ヒト血小板は、血小板アフェレーシス、血小板フェレーシス、ゲル濾過、または分画遠心法を含むさまざまな方法によってルーチン的に単離される。単離された血小板は適切であるが、洗浄された血小板、洗浄されていない血小板、多血小板血漿または精製された血小板を含む他の供給源からの血小板も使用することができる。一態様において、血小板は、冷却、凍結、化学的保存、または凍結乾燥のうちの１以上によって保存のために安定化されている。
【0044】
「血小板活性化」は、本明細書で使用される場合、血小板が、活性化を誘発する「血小板活性化因子」分子、例えば、とりわけ、血小板活性化抗体、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ、配列番号１）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸、エピネフリン、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）模倣体Ｕ４６６１９、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、リストセチン、ロドサイチン(rhodocytin)などに遭遇したときの血小板の応答をさす。血小板活性化は、例えば、とりわけ、血小板活性化に関連するマーカーの変化、高密度顆粒およびα顆粒のエキソサイトーシス、膜酵素ホスホリパーゼＡ２の活性化、形状、凝集(aggregation)、凝集反応(agglutination)の変化、膜電位の変化、インテグリンの立体配座の変化など、血小板にさまざまな変化をもたらす。活性化されると、血小板は、他の代謝産物およびタンパク質の中でも、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）、トロンボスポンジン－１、フィブリノゲン、ＣＸＣＬ１２、トロンボキサン、血小板第４因子を含む顆粒内容物を放出し、これらは、免疫学的アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、蛍光顕微鏡法、またはフローサイトメトリーなど、さまざまな方法論を使用することによって評価することができる。活性化により、血小板は、とりわけ、Ｐ－セレクチン、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ホスファチジルセリンを含むさまざまなマーカーの表面発現における変化を有し、これは、免疫学的アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、蛍光顕微鏡法、またはフローサイトメトリーなど、さまざまな方法論を使用することによって評価することができる。
【0045】
本明細書で使用される「有効量」は、望ましい転帰に影響を及ぼすのに十分な化合物の量をさす。一態様において、血小板は、有効量の本明細書に記載の１以上の血小板活性化因子を投与することによって活性化される。
【0046】
血小板活性化レベルは、例えば、正常ドナーの血小板と、血小板活性化抗体またはＨＩＴ（例えば、陽性対照試料）を有することが知られている対象からの血液試料、および正常対象の血液試料（例えば、陰性対照試料）との反応において、活性化血小板上に見出されるか、または活性化血小板から放出されるマーカーのレベルを測定するなど、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。活性化血小板上に見出されるか、または活性化血小板から放出されることが知られている任意のマーカー、例えば、活性化血小板上に見出される１以上のＣＤマーカー（例えば、ＣＤ９、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ１０７、それらのアイソフォーム、または血小板の外側に存在する任意のマーカー）、例えば、ｐ－セレクチンとしても知られるマーカーＣＤ６２Ｐを使用して、血小板活性化を測定することができる。さらに、血小板活性化は、免疫グロブリンの結合増加、ホスファチジルセリン発現、血小板凝集、イオン化カルシウムの細胞内レベル、インテグリンの立体配座の変化、血小板顆粒内容物の放出、血小板膜電位または血小板インピーダンスの変化、Ｆｃγ受容体２切断断片のレベル、または血小板の形状変化のいずれかを測定することによって測定することができる。
【0047】
「血小板活性化の増加」は、本明細書で使用される場合、正常対象の血液試料におけるベースライン血小板活性化の増加と有意に異なるか、または本明細書に記載のアッセイを使用して得られた既知の値もしくは過去のデータと比較して有意に異なる、血小板活性化の増加をさす。血小板活性化の増加は、患者が、ＨＩＴを引き起こす抗体などの血小板活性化抗体を有することを示す。一態様において、血小板活性化の増加は、正常対象の血液試料または本明細書に記載の方法を用いて正常対象について得られた過去のデータにおけるベースライン血小板活性化の量の少なくとも２倍または３倍である。
【0048】
本明細書で使用される「試料」は、対象から得た検体または培養物をさす。生物学的試料は対象から得ることができ、流体、固体、組織、および気体を包含する。一態様において、対象の試料は血液試料である。血液試料には、全血、血漿、血清、多血小板血漿などの血液製剤、またはコーン画分Ｉ～ＩＶのうちの１つなどの分画血液成分、または抗体画分が含まれる。
【0049】
本明細書で使用される「使用説明書」は、本明細書に記載の方法を実施するための指示または工程を提供するために使用される、刊行物、図、または任意の他の表現媒体をさす。使用説明書は、印刷された形態で提供することができ、キット材料を含有する容器に添付してもよく、キットと一緒に出荷してもよく、またはインターネットサイトで提供してもよい。
【0050】
本明細書に記載の一態様は、生存能力および活性化能を維持する血小板を凍結保存するための方法であって、（ａ）対象から血液または多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む懸濁緩衝液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；そして（ｆ）約－８０℃で血小板を保存する；ことを含む方法である。一観点において、本方法は血小板の生存能力および活性化能を２週間以上維持する。他の観点において、懸濁緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースを含む。他の観点において、安定剤は約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他の観点では、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する。他の観点では、希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする。他の観点において、血小板の単離は、血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板を１００×ｇで１５分間遠心分離して第１のペレットおよび第１の上清を生成し；その後、第１の上清を１０００×ｇで１５分間遠心分離して第２のペレットおよび第２の上清を生成することを含み、第１の上清は血小板に富み、第２の上清は血小板に乏しい。他の観点では、第２の上清を収集し、トレハロースを約５０ｍＭまで加え、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの濃度に希釈するために使用する。他の観点において、血小板の冷却は、温度を毎分約２～２０℃の速度で低下させることを含む。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された凍結保存血小板である。
【0051】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；ことを含む方法である。一観点において、懸濁緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースを含む。他の観点において、安定剤は約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他の観点では、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する。他の観点では、希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする。他の観点において、該方法は、（ｈ）解凍した血小板を単離する工程；および（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる工程を、さらに含む。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む。他の観点において、活性化緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む。他の観点では、工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する：（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、洗浄緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、工程（ｆ）の一定期間は１日～約５年である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板である。
【0052】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＰＦ４で処理することは、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0053】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＴＲＡＰで処理することは、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化さた回収した凍結保存血小板である。
【0054】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をヘパリンで処理することは、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0055】
本明細書に記載の他の態様は、血小板を凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；（ｈ）解凍した血小板を単離し；そして（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる；ことを含む方法である。一観点において、懸濁緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースを含む。他の観点において、安定剤は約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他の観点では、工程（ｃ）の血小板を、約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する。他の観点では、希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む。他の観点において、活性化緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む。他の観点では、工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する：（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、洗浄緩衝液は約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む。他の観点において、工程（ｈ）における解凍した血小板の単離は、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄は、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む。他の観点において、工程（ｆ）の一定期間は１日～約５年である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板である。
【0056】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＰＦ４で処理することは、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0057】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をＴＲＡＰで処理することは、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0058】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；ことを含む方法である。一観点において、回収した血小板をヘパリンで処理することは、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む。他の観点では、血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する。他の観点において、血小板顆粒内容物はトロンボスポンジン－１である。本明細書に記載の他の態様は、本明細書に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である。
【0059】
本明細書に記載の他の態様は、以下の方法によって生成された、回収した凍結保存血小板である：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する。
【0060】
本明細書に記載の他の態様は、以下の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；（ｈ）解凍した血小板を単離し；（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；（ｊ）回収した血小板をヘパリンまたはＰＦ４で処理し；そして（ｋ）ヘパリンまたはＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする。
【0061】
本明細書に記載の他の態様は、以下の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板である：（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；（ｈ）解凍した血小板を単離し；（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；そして（ｊ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する。
【0062】
本明細書に記載の他の態様は、血液、血漿または血清中のヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）抗体を検出するためのキットであり、該キットは、以下のうちの２以上を含む：（ａ）凍結保存血小板；（ｂ）血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）またはヘパリンのうちの１以上；（ｃ）血小板活性化を検出するための１以上の試薬；（ｄ）所望により、緩衝液および容器；ならびに（ｅ）所望により、包装または使用説明書のうちの１以上。一観点において、血小板活性化を検出するための１以上の試薬は、トロンボスポンジン－１を検出するための試薬を含む。他の観点において、キットは、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陰性を示す１以上の陰性対照試料；および血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陽性を示す１以上の陽性対照試料をさらに含む。
【0063】
本明細書に記載の他の態様は、出血の治療または予防を必要とする対象において出血を治療または予防するための方法であって、（ａ）凍結保存血小板を得；（ｂ）凍結保存血小板を解凍し；（ｃ）対象を、解凍した凍結保存血小板と接触させる；ことを含む方法である。一観点において、工程（ａ）～（ｂ）は、（ｉ）第２の対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｉｉ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；（ｉｉｉ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；（ｉｖ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；（ｖ）懸濁した血小板に安定剤を加え；（ｖｉ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｖｉｉ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｖｉｉｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；ことを含む。他の観点において、工程（ａ）～（ｂ）は、（ｉ）第２の対象から多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；（ｉｉ）多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板にトレハロースを加え；（ｉｉｉ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；（ｉｖ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；（ｖ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして（ｖｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；ことを含む。他の観点において、工程（ｃ）における接触は、解凍した凍結保存血小板を損傷部位に適用するか、または解凍した凍結保存血小板を対象に非経口投与することを含む。
【0064】
本明細書に記載の他の態様は、凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
本明細書に記載の他の態様は、解凍した凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
本明細書に記載の他の態様は、解凍した凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
【0065】
本明細書に記載の他の態様は、活性化された解凍した凍結保存血小板を、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬として使用することである。
本明細書に記載の組成物、製剤、方法、プロセス、および用途に対する適切な改変および適応は、任意の態様またはその観点の範囲から逸脱することなく行うことができることは当業者には明らかであろう。提供される組成物および方法は代表的なものであり、特定の態様のいずれかの範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に開示されるさまざまな態様、観点、および選択肢はすべて、任意の変形または反復において組み合わせることができる。本明細書に記載される組成物、製剤、方法、およびプロセスの範囲は、本明細書に記載される態様、観点、選択肢、実施例、および優先傾向の実際の組み合わせまたは潜在的な組み合わせをすべて包含する。本明細書に記載される代表的な組成物および製剤は、任意の成分を除外することができ、本明細書に開示される任意の成分で置き換えることができ、または本明細書の別の箇所に開示される任意の成分を包含することができる。本明細書に開示される任意の組成物または製剤の任意の成分の質量と、製剤中の任意の他の成分の質量または製剤中の他の成分の全質量との比は、本明細書では、それらが明確に開示されたかのように開示される。参考として援用する特許または刊行物のいずれかにおける任意の用語の意味が、本開示で使用される用語の意味と矛盾する場合、本開示における用語または語句の意味が優先される。さらに、上記解説は、単に代表的な態様を開示し、説明しているに過ぎない。本明細書に引用されるすべての特許および刊行物は、その具体的な教示に関し本明細書で参考として援用される。
本明細書に記載の組成物、製剤、方法、プロセス、および用途に対する適切な改変および適応は、任意の態様またはその観点の範囲から逸脱することなく行うことができることは当業者には明らかであろう。提供される組成物および方法は代表的なものであり、特定の態様のいずれかの範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に開示されるさまざまな態様、観点、および選択肢はすべて、任意の変形または反復において組み合わせることができる。本明細書に記載される組成物、製剤、方法、およびプロセスの範囲は、本明細書に記載される態様、観点、選択肢、実施例、および優先傾向の実際の組み合わせまたは潜在的な組み合わせをすべて包含する。本明細書に記載される代表的な組成物および製剤は、任意の成分を除外することができ、本明細書に開示される任意の成分で置き換えることができ、または本明細書の別の箇所に開示される任意の成分を包含することができる。本明細書に開示される任意の組成物または製剤の任意の成分の質量と、製剤中の任意の他の成分の質量または製剤中の他の成分の全質量との比は、本明細書では、それらが明確に開示されたかのように開示される。参考として援用する特許または刊行物のいずれかにおける任意の用語の意味が、本開示で使用される用語の意味と矛盾する場合、本開示における用語または語句の意味が優先される。さらに、上記解説は、単に代表的な態様を開示し、説明しているに過ぎない。本明細書に引用されるすべての特許および刊行物は、その具体的な教示に関し本明細書で参考として援用される。
【0066】
本明細書に記載する発明のさまざまな態様および観点を、以下の条項によって要約する：
条項１．生存能力および活性化能を維持する血小板を凍結保存するための方法であって、
（ａ）対象から血液または多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む懸濁緩衝液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；そして
（ｆ）約－８０℃で血小板を保存する；
ことを含む、前記方法。
条項２．該方法が血小板の生存能力および活性化能を２週間以上維持する、条項１に記載の方法。
条項３．懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、条項１または２に記載の方法。
条項４．安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。
条項５．工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、条項１～４のいずれか一項に記載の方法。
条項６．希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、条項１～５のいずれか一項に記載の方法。
条項７．血小板の単離が、血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板を１００×ｇで１５分間遠心分離して第１のペレットおよび第１の上清を生成し；その後、第１の上清を１０００×ｇで１５分間遠心分離して第２のペレットおよび第２の上清を生成することを含み、第１の上清が血小板に富み、第２の上清が血小板に乏しい、条項１～６のいずれか一項に記載の方法。
条項８．第２の上清を収集し、トレハロースを約５０ｍＭまで加え、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの濃度に希釈するために使用する、条項１～７のいずれか一項に記載の方法。
条項９．血小板の冷却が、温度を毎分約２～２０℃の速度で低下させることを含む、条項１～８のいずれか一項に記載の方法。
条項１０．条項１～９のいずれか一項に記載の方法によって調製された凍結保存血小板。
条項１１．凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、前記方法。
条項１２．懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、条項１１に記載の方法。
条項１３．安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、条項１１または１２に記載の方法。
条項１４．工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、条項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
条項１５．希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、条項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
条項１６．さらに、
（ｈ）解凍した血小板を単離する工程；および
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる工程；
を含む、条項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
条項１７．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む、条項１１～１６のいずれか一項。
条項１８．活性化緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
条項１９．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む、条項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
条項２０．工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する、条項１１～１９のいずれか一項に記載の方法：
（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する工程。
条項２１．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項２０に記載の方法。
条項２２．洗浄緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項１１～２１のいずれか一項に記載の方法。
条項２３．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項１１～２２のいずれか一項に記載の方法。
条項２４．工程（ｆ）の一定期間が１日～約５年である、条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法。
条項２５．条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板。
条項２６．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして
（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項２７．回収した血小板をＰＦ４で処理することが、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項２６に記載の方法。
条項２８．血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項２６または２７に記載の方法。
条項２９．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
条項３０．条項２６～２９のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項３１．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして
（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
ことを含む、前記方法。
条項３２．回収した血小板をＴＲＡＰで処理することが、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む、条項３１に記載の方法。
条項３３．血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項３１または３２に記載の方法。
条項３４．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
条項３５．条項３１～３４のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項３６．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして
（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項３７．回収した血小板をヘパリンで処理することが、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項３６に記載の方法。
条項３８．血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項３６または３７に記載の方法。
条項３９．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
条項４０．事項３６～３９のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項４１．血小板を凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；そして
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる；
ことを含む、前記方法。
条項４２．懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、条項４１に記載の方法。
条項４３．安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、条項４１または４２に記載の方法。
条項４４．工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、条項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
条項４５．希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、条項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
条項４６．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む、条項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
条項４７．活性化緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。
条項４８．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む、条項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。
条項４９．工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する、条項４１～４８のいずれか一項に記載の方法：
（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する工程。
条項５０．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
条項５１．洗浄緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項４１～５０のいずれか一項に記載の方法。
条項５２．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。
条項５３．工程（ｆ）の一定期間が１日～約５年である、条項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。
条項５４．条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板。
条項５５．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして
（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項５６．回収した血小板をＰＦ４で処理することが、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項５５に記載の方法。
条項５７．血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項５５または５６に記載の方法。
条項５８．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
条項５９．条項５５～５８のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項６０．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして
（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
ことを含む、前記方法。
条項６１．回収した血小板をＴＲＡＰで処理することが、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む、条項６０に記載の方法。
条項６２．血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項６０または６１に記載の方法。
条項６３．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
条項６４．条項６０～６２のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項６５．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして
（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項６６．回収した血小板をヘパリンで処理することが、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項６５に記載の方法。
条項６７．血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項６５または６６に記載の方法。
条項６８．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
条項６９．条項６５～６８のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項７０．以下の方法：
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
によって生成された、回収した凍結保存血小板。
条項７１．以下の方法：
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；
（ｊ）回収した血小板をヘパリンまたはＰＦ４で処理し；そして
（ｋ）ヘパリンまたはＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項７２．以下の方法：
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；そして
（ｊ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項７３．血液、血漿または血清中のヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）抗体を検出するためのキットであって、
（ａ）凍結保存血小板；
（ｂ）血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）またはヘパリンのうちの１以上；
（ｃ）血小板活性化を検出するための１以上の試薬；
（ｄ）所望により、緩衝液および容器；ならびに
（ｅ）所望により、包装または使用説明書のうちの１以上；
のうちの２以上を含む、前記キット。
条項７４．血小板活性化を検出するための１以上の試薬が、トロンボスポンジン－１を検出するための試薬を含む、条項７３に記載のキット。
条項７５．キットが、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陰性を示す１以上の陰性対照試料；および、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陽性を示す１以上の陽性対照試料をさらに含む、条項７３または７４に記載のキット。
条項７６．出血の治療または予防を必要とする対象において出血を治療または予防するための方法であって、
（ａ）凍結保存血小板を得；
（ｂ）凍結保存血小板を解凍し；
（ｃ）対象を、解凍した凍結保存血小板と接触させる；
ことを含む、前記方法。
条項７７．工程（ａ）～（ｂ）が、
（ｉ）第２の対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｉｉ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｉｉｉ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｉｖ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；
（ｖ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｖｉ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｖｉｉ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｖｉｉｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、条項７６に記載の方法。
条項７８．工程（ａ）～（ｂ）が、
（ｉ）第２の対象から多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｉｉ）多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板にトレハロースを加え；
（ｉｉｉ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；
（ｉｖ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｖ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｖｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、条項７６に記載の方法。
条項７９．工程（ｃ）における接触が、解凍した凍結保存血小板を損傷部位に適用するか、または解凍した凍結保存血小板を対象に非経口投与することを含む、条項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
条項８０．凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
条項８１．解凍した凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
条項８２．活性化された解凍した凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
条項１．生存能力および活性化能を維持する血小板を凍結保存するための方法であって、
（ａ）対象から血液または多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む懸濁緩衝液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；そして
（ｆ）約－８０℃で血小板を保存する；
ことを含む、前記方法。
条項２．該方法が血小板の生存能力および活性化能を２週間以上維持する、条項１に記載の方法。
条項３．懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、条項１または２に記載の方法。
条項４．安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。
条項５．工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、条項１～４のいずれか一項に記載の方法。
条項６．希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、条項１～５のいずれか一項に記載の方法。
条項７．血小板の単離が、血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板を１００×ｇで１５分間遠心分離して第１のペレットおよび第１の上清を生成し；その後、第１の上清を１０００×ｇで１５分間遠心分離して第２のペレットおよび第２の上清を生成することを含み、第１の上清が血小板に富み、第２の上清が血小板に乏しい、条項１～６のいずれか一項に記載の方法。
条項８．第２の上清を収集し、トレハロースを約５０ｍＭまで加え、工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの濃度に希釈するために使用する、条項１～７のいずれか一項に記載の方法。
条項９．血小板の冷却が、温度を毎分約２～２０℃の速度で低下させることを含む、条項１～８のいずれか一項に記載の方法。
条項１０．条項１～９のいずれか一項に記載の方法によって調製された凍結保存血小板。
条項１１．凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、前記方法。
条項１２．懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、条項１１に記載の方法。
条項１３．安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、条項１１または１２に記載の方法。
条項１４．工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、条項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
条項１５．希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、条項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
条項１６．さらに、
（ｈ）解凍した血小板を単離する工程；および
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる工程；
を含む、条項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
条項１７．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む、条項１１～１６のいずれか一項。
条項１８．活性化緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
条項１９．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む、条項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
条項２０．工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する、条項１１～１９のいずれか一項に記載の方法：
（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する工程。
条項２１．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項２０に記載の方法。
条項２２．洗浄緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項１１～２１のいずれか一項に記載の方法。
条項２３．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項１１～２２のいずれか一項に記載の方法。
条項２４．工程（ｆ）の一定期間が１日～約５年である、条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法。
条項２５．条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板。
条項２６．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして
（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項２７．回収した血小板をＰＦ４で処理することが、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項２６に記載の方法。
条項２８．血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項２６または２７に記載の方法。
条項２９．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
条項３０．条項２６～２９のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項３１．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして
（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
ことを含む、前記方法。
条項３２．回収した血小板をＴＲＡＰで処理することが、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む、条項３１に記載の方法。
条項３３．血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項３１または３２に記載の方法。
条項３４．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
条項３５．条項３１～３４のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項３６．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項１１～２４のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして
（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項３７．回収した血小板をヘパリンで処理することが、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項３６に記載の方法。
条項３８．血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項３６または３７に記載の方法。
条項３９．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
条項４０．事項３６～３９のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項４１．血小板を凍結保存し、凍結保存から血小板を回収するための方法であって、
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；そして
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させる；
ことを含む、前記方法。
条項４２．懸濁緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースを含む、条項４１に記載の方法。
条項４３．安定剤が約４質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、条項４１または４２に記載の方法。
条項４４．工程（ｃ）の血小板を約１×１０６血小板／μＬの最終濃度に懸濁緩衝液で希釈する、条項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
条項４５．希釈した血小板を、約３７℃で約２時間にわたり定期的に撹拌しながらインキュベートする、条項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
条項４６．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで１５分間の遠心分離を含む、条項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
条項４７．活性化緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。
条項４８．解凍した血小板の単離が１０００×ｇで５分間の遠心分離を含む、条項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。
条項４９．工程（ｈ）の後、かつ工程（ｉ）の前に、以下の工程を実施する、条項４１～４８のいずれか一項に記載の方法：
（ｈ－１）解凍した血小板を洗浄緩衝液中で洗浄する工程。
条項５０．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
条項５１．洗浄緩衝液が約５０ｍＭのトレハロースをさらに含む、条項４１～５０のいずれか一項に記載の方法。
条項５２．工程（ｈ）における解凍した血小板の単離が、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含み；そして、工程（ｈ－１）における解凍した血小板の洗浄が、血小板を洗浄緩衝液中に再懸濁させ、１０００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去することを含む、条項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。
条項５３．工程（ｆ）の一定期間が１日～約５年である、条項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。
条項５４．条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法によって調製された、回収した凍結保存血小板。
条項５５．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板を血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）で処理し；そして
（ｃ）ＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項５６．回収した血小板をＰＦ４で処理することが、ＰＦ４を血小板に約１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項５５に記載の方法。
条項５７．血小板の活性化を、ＰＦ４で処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項５５または５６に記載の方法。
条項５８．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
条項５９．条項５５～５８のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項６０．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；そして
（ｂ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
ことを含む、前記方法。
条項６１．回収した血小板をＴＲＡＰで処理することが、ＴＲＡＰを血小板に約２５μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で約３０分間インキュベートすることを含む、条項６０に記載の方法。
条項６２．血小板の活性化を、回収した血小板をＴＲＡＰで処理した後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項６０または６１に記載の方法。
条項６３．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
条項６４．条項６０～６２のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項６５．凍結保存後に回収した血小板を活性化するための方法であって、
（ａ）条項４１～５３のいずれか一項に記載の方法による凍結保存後に血小板を回収し；
（ｂ）回収した血小板をヘパリンで処理し；そして
（ｃ）ヘパリンで処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
ことを含む、前記方法。
条項６６．回収した血小板をヘパリンで処理することが、ヘパリンを血小板に約０．１～５Ｕ／ｍＬの濃度で加え、室温で約２０分間インキュベートすることを含む、条項６５に記載の方法。
条項６７．血小板の活性化を、ヘパリンで処理した血小板をＨＩＴ対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートした後に放出される血小板顆粒内容物を測定することによって評価する、条項６５または６６に記載の方法。
条項６８．血小板顆粒内容物がトロンボスポンジン－１である、条項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
条項６９．条項６５～６８のいずれか一項に記載の方法によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項７０．以下の方法：
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
によって生成された、回収した凍結保存血小板。
条項７１．以下の方法：
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；
（ｊ）回収した血小板をヘパリンまたはＰＦ４で処理し；そして
（ｋ）ヘパリンまたはＰＦ４で処理した血小板を、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）と診断された対象からの血漿、血清または血液試料と一緒にインキュベートする；
によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項７２．以下の方法：
（ａ）対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｂ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｃ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｄ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｅ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｆ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；
（ｇ）約２０～４０℃で血小板を解凍し；
（ｈ）解凍した血小板を単離し；
（ｉ）単離した解凍血小板を、約１質量％のＢＳＡを含む活性化緩衝液中に懸濁させ；そして
（ｊ）回収した血小板をトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）で処理する；
によって調製された、活性化された回収した凍結保存血小板。
条項７３．血液、血漿または血清中のヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）抗体を検出するためのキットであって、
（ａ）凍結保存血小板；
（ｂ）血小板第４因子（ＰＦ４；配列番号２）またはヘパリンのうちの１以上；
（ｃ）血小板活性化を検出するための１以上の試薬；
（ｄ）所望により、緩衝液および容器；ならびに
（ｅ）所望により、包装または使用説明書のうちの１以上；
のうちの２以上を含む、前記キット。
条項７４．血小板活性化を検出するための１以上の試薬が、トロンボスポンジン－１を検出するための試薬を含む、条項７３に記載のキット。
条項７５．キットが、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陰性を示す１以上の陰性対照試料；および、血小板を活性化する病原性ＨＩＴ抗体に対し陽性を示す１以上の陽性対照試料をさらに含む、条項７３または７４に記載のキット。
条項７６．出血の治療または予防を必要とする対象において出血を治療または予防するための方法であって、
（ａ）凍結保存血小板を得；
（ｂ）凍結保存血小板を解凍し；
（ｃ）対象を、解凍した凍結保存血小板と接触させる；
ことを含む、前記方法。
条項７７．工程（ａ）～（ｂ）が、
（ｉ）第２の対象から血液、多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｉｉ）血液、多血小板血漿またはアフェレーシス血小板から血小板を単離し；
（ｉｉｉ）トレハロースを含む緩衝溶液中に血小板を懸濁させ；
（ｉｖ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；
（ｖ）懸濁した血小板に安定剤を加え；
（ｖｉ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｖｉｉ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｖｉｉｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、条項７６に記載の方法。
条項７８．工程（ａ）～（ｂ）が、
（ｉ）第２の対象から多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板を得；
（ｉｉ）多血小板血漿またはアフェレーシス由来血小板にトレハロースを加え；
（ｉｉｉ）トレハロースで処理した血小板を３７℃で約２時間インキュベートし；
（ｉｖ）血小板を約－８０℃の温度に冷却し；
（ｖ）約－８０℃で血小板を一定期間保存し；そして
（ｖｉ）約２０～４０℃で血小板を解凍する；
ことを含む、条項７６に記載の方法。
条項７９．工程（ｃ）における接触が、解凍した凍結保存血小板を損傷部位に適用するか、または解凍した凍結保存血小板を対象に非経口投与することを含む、条項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
条項８０．凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
条項８１．解凍した凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
条項８２．活性化された解凍した凍結保存血小板の、それを必要とする対象を治療するための試薬、研究ツール、または医薬としての使用。
【実施例】
【0067】
実施例１
緩衝液中の血小板の凍結保存
多血小板血漿をクエン酸リン酸デキストロース抗凝固剤（ＣＰＤ、１５．６ｍＭ クエン酸、８９ｍＭ クエン酸ナトリウム二水和物、１６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１２８ｍＭ デキストロース一水和物）中に収集し（４５ｍＬ）、５ｍＬの酸性クエン酸デキストロース緩衝液（１１７ｍＭ クエン酸ナトリウム、１３６ｍＭ デキストロース、ｐＨ５．９；最終希釈１：１０）をプロスタグランジン－Ｅ１（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）と共に加えた。組み合わせたものを１００×ｇで１５分間遠心分離した。上清（４０ｍＬ）を収集し、１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を凍結保存緩衝液（９．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１００ｍＭ ＮａＣｌ；４．８ｍＭ ＫＣｌ；５．０ｍＭ グルコース；１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３；５０ｍＭ トレハロース、ｐＨ６．８）に再懸濁させた。血小板を計数し、凍結保存緩衝液で１×１０６血小板／μＬの最終濃度に希釈した。血小板を、３０分ごとに反転させつつ３７℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を４質量％の最終濃度まで滴下して加えた。１ｍＬのアリコートをクライオバイアルに分注し、４℃／分の速度で－８０℃の最終温度に冷却した。長期保存するためにバイアルを－８０℃の冷凍庫に移した。図１参照。
緩衝液中の血小板の凍結保存
多血小板血漿をクエン酸リン酸デキストロース抗凝固剤（ＣＰＤ、１５．６ｍＭ クエン酸、８９ｍＭ クエン酸ナトリウム二水和物、１６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１２８ｍＭ デキストロース一水和物）中に収集し（４５ｍＬ）、５ｍＬの酸性クエン酸デキストロース緩衝液（１１７ｍＭ クエン酸ナトリウム、１３６ｍＭ デキストロース、ｐＨ５．９；最終希釈１：１０）をプロスタグランジン－Ｅ１（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）と共に加えた。組み合わせたものを１００×ｇで１５分間遠心分離した。上清（４０ｍＬ）を収集し、１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を凍結保存緩衝液（９．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１００ｍＭ ＮａＣｌ；４．８ｍＭ ＫＣｌ；５．０ｍＭ グルコース；１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３；５０ｍＭ トレハロース、ｐＨ６．８）に再懸濁させた。血小板を計数し、凍結保存緩衝液で１×１０６血小板／μＬの最終濃度に希釈した。血小板を、３０分ごとに反転させつつ３７℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を４質量％の最終濃度まで滴下して加えた。１ｍＬのアリコートをクライオバイアルに分注し、４℃／分の速度で－８０℃の最終温度に冷却した。長期保存するためにバイアルを－８０℃の冷凍庫に移した。図１参照。
【0068】
記載したように、２０人の異なる全血ドナーから血小板を得て、緩衝液中で凍結保存した。凍結保存血小板を、使用するまで－８０℃で保存し、洗浄により回収した。回収後、血小板を血小板第４因子（ＰＦ４）で処理し、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）であることが確認されている患者からの３つの血液試料のうちの１つ、または３つの正常対照血清のうちの１つに加えた。ＰＦ４で処理した血小板を患者／正常試料で処理した後、上清を収集し、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１)ＥＬＩＳＡキットを用いてトロンボスポンジン－１濃度についてアッセイした。図２に示すように、試験した２０の異なる血小板ロットのそれぞれで、３つのＨＩＴ血清試料と３つの正常血清試験試料は明確に区別された。
【0069】
図２に示す２０の異なる凍結保存血小板ロットのうち、７つを－８０℃で４週間以上保存した後に試験した。凍結保存血小板を洗浄によって回収し、ＰＦ４で処理し、ＨＩＴまたは正常血液試料によって活性化した。図３に示すように、４週間の保存後に試験した血小板ロットのすべてで、ＨＩＴと正常被験試料は明確に区別された。
【0070】
図２に示す凍結保存ロットの１つからの血小板を、－８０℃で１４週間保存した後に試験した。凍結保存血小板を洗浄により回収し、ＰＦ４で処理し、ＨＩＴまたは正常血清試料において活性化した。図４に示すように、１４週間の保存後、凍結保存血小板は、活性化される能力を保持している。
【0071】
実施例２
洗浄による凍結保存血小板の回収
凍結保存した血小板の１ｍＬアリコートを３７℃の水浴中で３分間解凍した。次いで、血小板を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を１ｍＬの血小板洗浄緩衝液（１０８ｍＭ ＮａＣｌ、３．８ｍＭ ＫＣｌ、１．７ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２２．９ｍＭ クエン酸ナトリウム、２７．８ｍＭ グルコース、ｐＨ６．５）に再懸濁させた。血小板を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を、１％のＢＳＡを含有する１７５μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に再懸濁させた。図１参照。
洗浄による凍結保存血小板の回収
凍結保存した血小板の１ｍＬアリコートを３７℃の水浴中で３分間解凍した。次いで、血小板を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を１ｍＬの血小板洗浄緩衝液（１０８ｍＭ ＮａＣｌ、３．８ｍＭ ＫＣｌ、１．７ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２２．９ｍＭ クエン酸ナトリウム、２７．８ｍＭ グルコース、ｐＨ６．５）に再懸濁させた。血小板を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を、１％のＢＳＡを含有する１７５μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に再懸濁させた。図１参照。
【0072】
ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）患者からの血液試料を用いた、回収した凍結保存血小板の血小板第４因子（ＰＦ４）処理および活性化
ＰＦ４（配列番号２）を、回収して洗浄した凍結保存血小板に１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で２０分間インキュベートした。ＰＦ４で処理した血小板の８０μＬアリコートを２０μＬのＨＩＴ患者血清試料または正常血清試料に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてのトロンボスポンジン－１（血小板α顆粒成分）濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
ＰＦ４（配列番号２）を、回収して洗浄した凍結保存血小板に１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で２０分間インキュベートした。ＰＦ４で処理した血小板の８０μＬアリコートを２０μＬのＨＩＴ患者血清試料または正常血清試料に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてのトロンボスポンジン－１（血小板α顆粒成分）濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
【0073】
トロンボスポンジン－１の測定
市販のトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、血小板上清中のＴＳＰ１を血小板活性化の尺度として定量した。簡潔に言えば、ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で少なくとも８時間にわたり１μｇ／ｍＬの抗ＴＳＰ１捕捉抗体でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ試薬希釈液でブロックした。血小板反応からの上清を１：１０００または１：２０００に希釈した。標準を製造業者の説明書に従って調製し、ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのビオチン標識検出抗体と一緒にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で再び３回洗浄し、１：２００西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと一緒にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で再び３回洗浄し、テトラメチルベンジジンと一緒にインキュベートした。１０分後にＨ２ＳＯ４で反応を終了させ、４５０ｎｍでの光学濃度を測定した。ＴＳＰ１濃度は、標準曲線に対する４パラメーターロジスティック回帰を用いて決定した。
市販のトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ１）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、血小板上清中のＴＳＰ１を血小板活性化の尺度として定量した。簡潔に言えば、ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で少なくとも８時間にわたり１μｇ／ｍＬの抗ＴＳＰ１捕捉抗体でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ試薬希釈液でブロックした。血小板反応からの上清を１：１０００または１：２０００に希釈した。標準を製造業者の説明書に従って調製し、ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのビオチン標識検出抗体と一緒にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で再び３回洗浄し、１：２００西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと一緒にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを４００μＬのＥＬＩＳＡプレート洗浄緩衝液で再び３回洗浄し、テトラメチルベンジジンと一緒にインキュベートした。１０分後にＨ２ＳＯ４で反応を終了させ、４５０ｎｍでの光学濃度を測定した。ＴＳＰ１濃度は、標準曲線に対する４パラメーターロジスティック回帰を用いて決定した。
【0074】
体積低減による凍結保存血小板の回収
凍結保存した血小板の１ｍＬアリコートを３７℃の水浴中で３分間解凍した。血小板を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を、１質量％のＢＳＡを含有しｐＨ７．４の１７５μＬのＰＢＳに再懸濁させた。
凍結保存した血小板の１ｍＬアリコートを３７℃の水浴中で３分間解凍した。血小板を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を、１質量％のＢＳＡを含有しｐＨ７．４の１７５μＬのＰＢＳに再懸濁させた。
【0075】
解凍による凍保存血小板の回収
凍結保存した血小板の１ｍＬアリコートを３７℃の水浴中で３分間解凍した。血小板を、さらに処理することなく使用した。
凍結保存した血小板の１ｍＬアリコートを３７℃の水浴中で３分間解凍した。血小板を、さらに処理することなく使用した。
【0076】
トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）での回収した凍結保存血小板の活性化
回収した凍結保存血小板の８０μＬアリコートを、２０μＬの１２５μｇ／ｍＬ ＴＲＡＰペプチド（ＴＲＡＰ最終濃度：２５μｇ／ｍＬ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）または１％ ＢＳＡを含有する２０μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ（対照）に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてのトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
回収した凍結保存血小板の８０μＬアリコートを、２０μＬの１２５μｇ／ｍＬ ＴＲＡＰペプチド（ＴＲＡＰ最終濃度：２５μｇ／ｍＬ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）または１％ ＢＳＡを含有する２０μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ（対照）に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてのトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
【0077】
凍結保存血小板の回収方法も検討した。単一ドナーからの血小板を緩衝液中で凍結保存した。凍結保存した血小板を、洗浄するか、体積を低減するか、または解凍により直接使用した。回収後、血小板をＰＦ４で処理し、ＨＩＴまたは正常血清試料によって活性化した。さらに、回収した血小板を、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）、強力な血小板アゴニスト、または対照としての緩衝液で処理した。洗浄した、または体積を低減したヒト試料（図５）およびＴＲＡＰ（図６）凍結保存血小板は両方とも、解凍しただけの凍結保存血小板よりも高い程度の活性化能を有する。
【0078】
実施例３
ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）患者からの血液試料を用いた、回収した凍結保存血小板のヘパリン処理および活性化
回収した洗浄した凍結保存血小板に、未分画ヘパリンを０．１、０．３、０．５、１単位／ｍＬまたは対照として０Ｕ／ｍＬの濃度で加え、混合物を室温で２０分間インキュベートした。８０μＬアリコートのヘパリンで処理した回収した凍結保存血小板を２０μＬのＨＩＴ患者血清試料または正常患者血清試料に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板の反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてのトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）患者からの血液試料を用いた、回収した凍結保存血小板のヘパリン処理および活性化
回収した洗浄した凍結保存血小板に、未分画ヘパリンを０．１、０．３、０．５、１単位／ｍＬまたは対照として０Ｕ／ｍＬの濃度で加え、混合物を室温で２０分間インキュベートした。８０μＬアリコートのヘパリンで処理した回収した凍結保存血小板を２０μＬのＨＩＴ患者血清試料または正常患者血清試料に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板の反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてのトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
【0079】
図７は、ヘパリンで処理した凍結保存血小板を用いてＨＩＴと正常血液試料を識別することができ、これによって、ＨＩＴ試料は血小板を活性化するが、正常試料は活性化しないことを示している。
【0080】
実施例４
乏血小板血漿の存在下での血小板の凍結保存
多血小板血漿（４５ｍＬ）をクエン酸リン酸デキストロース抗凝固剤（ＣＰＤ）中に収集し、５ｍＬの酸性クエン酸デキストロース緩衝液をプロスタグランジン－Ｅ１（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）と共に加えた。多血小板血漿混合物を１００×ｇで１５分間遠心分離した。上清（４０ｍＬ）を収集し、１０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清（乏血小板血漿、ＰＰＰ）を取り出し、以下に記載するように使用した。血小板を１ｍＬの凍結保存緩衝液（９．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１００ｍＭ ＮａＣｌ；４．８ｍＭ ＫＣｌ；５．０ｍＭ グルコース；１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３；５０ｍＭ トレハロース、ｐＨ６．８）に再懸濁させた。トレハロース（２００μＬの１Ｍ トレハロース）を４ｍＬのＰＰＰに加えて、５０ｍＭのトレハロースを含有するＰＰＰを作製した。血小板を計数し、５０ｍＭのトレハロースを含有するＰＰＰで１×１０６血小板／μＬの最終濃度に希釈した。血小板を、３０分ごとに反転させつつ３７℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、血小板の１ｍＬアリコートをクライオバイアルに分注し、４℃／分の速度で－８０℃の最終温度に冷却した。長期保存するためにバイアルを－８０℃の冷凍庫に移した。
乏血小板血漿の存在下での血小板の凍結保存
多血小板血漿（４５ｍＬ）をクエン酸リン酸デキストロース抗凝固剤（ＣＰＤ）中に収集し、５ｍＬの酸性クエン酸デキストロース緩衝液をプロスタグランジン－Ｅ１（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）と共に加えた。多血小板血漿混合物を１００×ｇで１５分間遠心分離した。上清（４０ｍＬ）を収集し、１０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清（乏血小板血漿、ＰＰＰ）を取り出し、以下に記載するように使用した。血小板を１ｍＬの凍結保存緩衝液（９．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１００ｍＭ ＮａＣｌ；４．８ｍＭ ＫＣｌ；５．０ｍＭ グルコース；１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３；５０ｍＭ トレハロース、ｐＨ６．８）に再懸濁させた。トレハロース（２００μＬの１Ｍ トレハロース）を４ｍＬのＰＰＰに加えて、５０ｍＭのトレハロースを含有するＰＰＰを作製した。血小板を計数し、５０ｍＭのトレハロースを含有するＰＰＰで１×１０６血小板／μＬの最終濃度に希釈した。血小板を、３０分ごとに反転させつつ３７℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、血小板の１ｍＬアリコートをクライオバイアルに分注し、４℃／分の速度で－８０℃の最終温度に冷却した。長期保存するためにバイアルを－８０℃の冷凍庫に移した。
【0081】
次いで、ＰＰＰ中で凍結保存した血小板を洗浄により回収した。回収後、血小板をＰＦ４で処理し、ＨＩＴまたは正常血清によって活性化した。さらに、回収した血小板を、ＴＲＡＰまたは対照としての緩衝液で処理した。緩衝液中で凍結保存した血小板と同様に、ＰＰＰ中で凍結保存した血小板は、ＨＩＴ抗体（図８）またはＴＲＡＰ（図９）によって活性化される能力を有する。
【0082】
実施例５
凍結保存血小板の凍結乾燥
血小板を実施例１で上記したように緩衝液中で凍結保存し、大気圧で４時間にわたり－４０℃に平衡化した凍結乾燥機にバイアルを移した。－３０℃で１３時間にわたり真空（１００ｍＴｏｒｒ）をかけた。その後、１００ｍＴｏｒｒの真空をかけながら、温度を－３０℃から＋３０℃に１２時間かけて徐々に上昇させた。その後、バイアルを－８０℃の冷凍庫に移した。
凍結保存血小板の凍結乾燥
血小板を実施例１で上記したように緩衝液中で凍結保存し、大気圧で４時間にわたり－４０℃に平衡化した凍結乾燥機にバイアルを移した。－３０℃で１３時間にわたり真空（１００ｍＴｏｒｒ）をかけた。その後、１００ｍＴｏｒｒの真空をかけながら、温度を－３０℃から＋３０℃に１２時間かけて徐々に上昇させた。その後、バイアルを－８０℃の冷凍庫に移した。
【0083】
再構成、ＰＦ４処理およびＨＩＴおよび正常血液試料での凍結乾燥血小板の処理
１ｍＬアリコートのＨ２Ｏを、それぞれの凍結乾燥血小板アリコートに加えた。再構成された凍結乾燥血小板にＰＦ４を１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で２０分間インキュベートした。ＰＦ４で処理した凍結保存血小板の８０μＬアリコートを２０μＬのＨＩＴまたは正常血清に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
１ｍＬアリコートのＨ２Ｏを、それぞれの凍結乾燥血小板アリコートに加えた。再構成された凍結乾燥血小板にＰＦ４を１５０μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で２０分間インキュベートした。ＰＦ４で処理した凍結保存血小板の８０μＬアリコートを２０μＬのＨＩＴまたは正常血清に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
【0084】
再構成およびＴＲＡＰでの凍結乾燥血小板の活性化
凍結乾燥血小板を１ｍＬのＨ２Ｏで再構成した。再構成した血小板の８０μＬアリコートを２０μＬの１２５μｇ／ｍＬのＴＲＡＰペプチド（ＴＲＡＰ最終濃度：２５μｇ／ｍＬ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）または１質量％のＢＳＡを含有する２０μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ（対照）に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
凍結乾燥血小板を１ｍＬのＨ２Ｏで再構成した。再構成した血小板の８０μＬアリコートを２０μＬの１２５μｇ／ｍＬのＴＲＡＰペプチド（ＴＲＡＰ最終濃度：２５μｇ／ｍＬ；アミノ酸配列：ＳＦＦＬＲＮ；配列番号１）または１質量％のＢＳＡを含有する２０μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ（対照）に加え、室温で３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで１５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてトロンボスポンジン－１濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
【0085】
凍結乾燥は、細胞を凍結保存するために一般的に使用されている別の技術である。単一ドナーからの血小板を緩衝液中で凍結保存し、アリコートのサブセットを凍結乾燥に供した。凍結血小板を洗浄により回収し、凍結乾燥血小板をＨ２Ｏで再構成した。回収後、凍結乾燥血小板または凍結血小板をＰＦ４で処理し、ＨＩＴまたは正常血清試料により活性化した。さらに、血小板をＴＲＡＰまたは対照としての緩衝液で処理した。凍結血小板とは異なり、凍結乾燥血小板は、ＨＩＴ試料（図１０）またはＴＲＡＰ（図１１）によって活性化される能力を有さない。
【0086】
実施例６
ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）患者からの血液試料での、凍結保存血小板の改変された回収、血小板第４因子（ＰＦ４）処理および活性化
改変された回収は、（１）異なる遠心分離条件（上記のように５分対１５分）、および（２）血小板を凍結するために使用される凍結保存緩衝液のみにおけるトレハロースの使用に対する、再懸濁緩衝液（洗浄緩衝液および活性化緩衝液）におけるトレハロースの使用をさす。
ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）患者からの血液試料での、凍結保存血小板の改変された回収、血小板第４因子（ＰＦ４）処理および活性化
改変された回収は、（１）異なる遠心分離条件（上記のように５分対１５分）、および（２）血小板を凍結するために使用される凍結保存緩衝液のみにおけるトレハロースの使用に対する、再懸濁緩衝液（洗浄緩衝液および活性化緩衝液）におけるトレハロースの使用をさす。
【0087】
血小板を５００μＬの体積、１×１０６血小板／μＬの濃度で凍結保存し、３７℃の水浴で３分間解凍した。血小板を１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を、５０ｍＭのトレハロースを含有する５００μＬの血小板洗浄緩衝液を用いて再懸濁させた。血小板を１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、廃棄した。血小板を、１質量％のＢＳＡ、５０ｍＭのトレハロース、および１５０μｇ／ｍＬのＰＦ４（配列番号２）を含有する８０μＬのｐＨ７．４のＰＢＳを用いて再懸濁させ、混合物を室温で２０分間インキュベートした。ＨＩＴ患者血清試料または正常患者血清試料の２０μＬアリコートを加え、混合物を室温でさらに３０分間インキュベートした。血小板反応混合物を１０００×ｇで５分間遠心分離し、血小板活性化のマーカーとしてのトロンボスポンジン－１（血小板α顆粒成分）濃度を評価するために４０μＬの上清を収集した。
【0088】
改変された活性化手順はまた、凍結血小板で得られたシグナル（ＨＩＴ）対バックグラウンド（正常）比を増強するために使用された。簡単に説明すると、血小板を５０ｍＭのトレハロースの存在下で凍結保存し、次いで５０ｍＭのトレハロースを含有するＲＣＤで洗浄することによって回収し、１質量％のＢＳＡ、５０ｍＭのトレハロース、および１５０μｇ／ｍＬのＰＦ４（配列番号２）を含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。さらに、解凍後のすべての遠心分離工程の遠心分離時間を、１５分から５分に変更した。図１２は、標準的な活性化手順（左）を、この改変された手順（右）と比較している。シグナル対バックグラウンド比は、標準的な手順では４．４倍、改変された手順では７．２倍である。
【0089】
血小板活性化ＨＩＴ抗体を用いた試料の検出における凍結血小板の有用性を明示することに加えて、図１３は、これらの血小板を抗血小板薬発見のために使用することができるモデルを提示する。
【0090】
実施例７
凍結保存血小板の治療的使用
血小板輸血は、外傷、がん、および自己免疫障害を含むがこれらに限定されないさまざまな状態における出血の予防および治療の状況において救命的である。輸血を目的とするドナー血小板は、典型的には室温で保存され、５～７日の貯蔵寿命を有する。４℃では、わずかにより長い期間（２週間）保存することができる。現在の技術に基づく血小板貯蔵寿命へのこの限界は、とりわけ、農村地域、紛争地帯、発展途上国など供給源の乏しい環境、ならびに自然災害および悪天候の後に頻繁に見られるような血液不足の期間における、出血患者、または出血のリスクがある血小板減少症患者の治療において、物流上の課題をもたらす。長い貯蔵寿命（数ヶ月から数年）を有する凍結乾燥血小板が代替物として提案されてきたが、これらの血小板調製物は既に活性化状態にあり、上部に血栓症(thromboses)が形成しうる表面リン脂質を暴露している一方、それらは刺激により脱顆粒しないので、最適に次ぐものである。血小板顆粒は、ＡＤＰなど血小板をさらに活性化することができる重要な分子のほか、凝固カスケードを調節する他の成分を含有する。したがって、長い貯蔵寿命を有するだけでなく、新鮮な血小板と同様に、活性化により脱顆粒する能力を有する血小板生成物を開発することが、極めて必要とされている。
凍結保存血小板の治療的使用
血小板輸血は、外傷、がん、および自己免疫障害を含むがこれらに限定されないさまざまな状態における出血の予防および治療の状況において救命的である。輸血を目的とするドナー血小板は、典型的には室温で保存され、５～７日の貯蔵寿命を有する。４℃では、わずかにより長い期間（２週間）保存することができる。現在の技術に基づく血小板貯蔵寿命へのこの限界は、とりわけ、農村地域、紛争地帯、発展途上国など供給源の乏しい環境、ならびに自然災害および悪天候の後に頻繁に見られるような血液不足の期間における、出血患者、または出血のリスクがある血小板減少症患者の治療において、物流上の課題をもたらす。長い貯蔵寿命（数ヶ月から数年）を有する凍結乾燥血小板が代替物として提案されてきたが、これらの血小板調製物は既に活性化状態にあり、上部に血栓症(thromboses)が形成しうる表面リン脂質を暴露している一方、それらは刺激により脱顆粒しないので、最適に次ぐものである。血小板顆粒は、ＡＤＰなど血小板をさらに活性化することができる重要な分子のほか、凝固カスケードを調節する他の成分を含有する。したがって、長い貯蔵寿命を有するだけでなく、新鮮な血小板と同様に、活性化により脱顆粒する能力を有する血小板生成物を開発することが、極めて必要とされている。
【0091】
長い貯蔵寿命を有し、脱顆粒することができ、輸血を目的とする血小板は、本出願に記載の診断用血小板調製物と同様に調製されるが、以下に記載するようないくつかの変更点がある。
【0092】
血小板の供給源および血小板の単離
凍結保存および治療的使用のための血小板の収集および単離方法はいくつかある。血小板はアフェレーシス法によって収集され、または多血小板血漿成分は標準的な全血収集からの遠心分離技術によって生成される。
凍結保存および治療的使用のための血小板の収集および単離方法はいくつかある。血小板はアフェレーシス法によって収集され、または多血小板血漿成分は標準的な全血収集からの遠心分離技術によって生成される。
【0093】
凍結保存用の血小板の調製
トレハロースを血小板生成物に加えて、約５０ｍＭの濃度を達成する。これは、いくつかの方法で達成することができる。例えば、血小板は、トレハロースを含有する血液バッグ中に直接収集することができ；これは、アフェレーシス血小板を用いて、または全血ユニットから遠心分離によって単離した多血小板血漿を用いて、行うことができる。トレハロースを血小板に導入する他の方法は、アフェレーシスによって得たか、または全血から多血小板血漿を生成することによって得た単離血小板に濃縮トレハロース溶液を加えることによる。あるいは、収集した血小板を、アフェレーシス血小板または多血小板血漿の血小板の遠心分離によってペレット化し、ペレットを、診断用凍結保存血小板生成物について本明細書に記載した手順と同様に、トレハロース含有緩衝液中に再懸濁させることができる。トレハロースの添加後、血小板を約３７℃で約２時間インキュベートする。
トレハロースを血小板生成物に加えて、約５０ｍＭの濃度を達成する。これは、いくつかの方法で達成することができる。例えば、血小板は、トレハロースを含有する血液バッグ中に直接収集することができ；これは、アフェレーシス血小板を用いて、または全血ユニットから遠心分離によって単離した多血小板血漿を用いて、行うことができる。トレハロースを血小板に導入する他の方法は、アフェレーシスによって得たか、または全血から多血小板血漿を生成することによって得た単離血小板に濃縮トレハロース溶液を加えることによる。あるいは、収集した血小板を、アフェレーシス血小板または多血小板血漿の血小板の遠心分離によってペレット化し、ペレットを、診断用凍結保存血小板生成物について本明細書に記載した手順と同様に、トレハロース含有緩衝液中に再懸濁させることができる。トレハロースの添加後、血小板を約３７℃で約２時間インキュベートする。
【0094】
トレハロースで処理した血小板が多血小板血漿またはアフェレーシス由来血漿（すでにヒトアルブミンを含有する）中に存在する場合、ヒトアルブミンのさらなる添加は必要ない。血小板がペレット化され、乏血小板血漿（すでにヒトアルブミンを含有する）に再懸濁される場合、ヒトアルブミンのさらなる添加は必要ない。血小板ペレットが、トレハロースを含有しアルブミンを含まない緩衝液中に再懸濁される場合、約４～５％の最終濃度のヒトアルブミンを、トレハロースで処理した血小板調製物に加える。
【0095】
凍結保存
本明細書に記載の方法のいずれかによって調製される血小板を、２～２０℃／分の速度で徐々に、または制御のない様式で、約－８０℃に冷却する。凍結の前に、凍結される血小板の体積、したがって患者に輸血される血小板の体積を低減するために、遠心分離によって血小板を濃縮し、血小板を含まない上清の一部を廃棄することが、必須ではないが、望ましい場合がある。血小板は、バッグまたはチューブで凍結することができる。
本明細書に記載の方法のいずれかによって調製される血小板を、２～２０℃／分の速度で徐々に、または制御のない様式で、約－８０℃に冷却する。凍結の前に、凍結される血小板の体積、したがって患者に輸血される血小板の体積を低減するために、遠心分離によって血小板を濃縮し、血小板を含まない上清の一部を廃棄することが、必須ではないが、望ましい場合がある。血小板は、バッグまたはチューブで凍結することができる。
【0096】
解凍および治療的使用
凍結保存した血小板を２０～４０℃で解凍する。これは、凍結される血小板の体積によって５分～１時間かかる可能性がある。解凍した血小板は、出血のリスクが高い血小板減少症患者などにおいては予防的に、または活発に出血している患者においては治療的に、患者に非経口的に直接注入することができる。
凍結保存した血小板を２０～４０℃で解凍する。これは、凍結される血小板の体積によって５分～１時間かかる可能性がある。解凍した血小板は、出血のリスクが高い血小板減少症患者などにおいては予防的に、または活発に出血している患者においては治療的に、患者に非経口的に直接注入することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】