(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】コンジュゲート、その製造方法、及び使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20240403BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240403BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240403BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240403BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20240403BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240403BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
A61K47/60
A61K47/54
A61K31/713
A61K48/00
A61P13/08
A61P43/00 111
A61K39/395 N
C12N15/11 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565281
(86)(22)【出願日】2022-04-21
(85)【翻訳文提出日】2023-10-23
(86)【国際出願番号】 CN2022088173
(87)【国際公開番号】W WO2022222993
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】202110442394.6
(32)【優先日】2021-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509159274
【氏名又は名称】南▲開▼大学
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＫＡＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】９４ Ｗｅｉｊｉｎ Ｒｏａｄ， Ｎａｎｋａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７１ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】席 真
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼ 超
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC17
4C076CC41
4C076DD54
4C076EE23
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA13
4C084NA13
4C084ZA81
4C084ZC41
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZA81
4C086ZC41
(57)【要約】
【要約】
本発明は、バイオ技術分野に関し、コンジュゲート、その製造方法、及び使用を開示する。該コンジュゲートは、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを共有結合したものである。本発明によるコンジュゲートは、薬物標的送達における使用が期待できる。また、本発明は、前記コンジュゲートの製造方法、及びその使用を提供する。該方法は、単純な化学反応のみを伴うものであり、核酸コンジュゲートを柔軟で効率的に合成するという目的を達成でき、他の複数種のリガンドを標的とする核酸コンジュゲートの構築にも適しており、実用性に優れている。
本発明は、バイオ技術分野に関し、コンジュゲート、その製造方法、及び使用を開示する。該コンジュゲートは、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを共有結合したものである。本発明によるコンジュゲートは、薬物標的送達における使用が期待できる。また、本発明は、前記コンジュゲートの製造方法、及びその使用を提供する。該方法は、単純な化学反応のみを伴うものであり、核酸コンジュゲートを柔軟で効率的に合成するという目的を達成でき、他の複数種のリガンドを標的とする核酸コンジュゲートの構築にも適しており、実用性に優れている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを共有結合したものである、ことを特徴とするコンジュゲート。
【請求項2】
前記アジド修飾された標的リガンド中のアジド基と標的リガンドは、少なくとも１つのポリエチレングリコールの断片を介して共有結合される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項3】
前記標的リガンドは、少なくとも１種のアミノ酸がグルタミン酸である２つのアミノ酸で形成されるジペプチドであり、好ましくは、前記アミノ酸は、リジンとグルタミン酸、グルタミン酸とグルタミン酸、及びグルタミン酸とグルタミン酸類似体から選択され、前記標的リガンドは、グルタミン酸によって認識され、標的細胞表面で発現される抗原を結合可能であり、前記抗原はＰＳＭＡであり、及び／又は、前記標的細胞は、前立腺癌細胞、ニューロン、腎臓癌細胞、及び結腸癌細胞から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
【請求項4】
前記アジド修飾された標的リガンドは【化1】
【請求項5】
前記小さな核酸配列は、ＳＴＡＴ３、ＰＨＢ１、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＬＫ１、及びＢＲＤ４を標的する小さな核酸から選択される少なくとも１種であり、及び／又は、前記プロパルギル基修飾は、３'－末端プロパルギル基修飾であり、
及び／又は、前記プロパルギル基修飾された小さな核酸配列は、ホスホロアミダイト法を利用して固相合成技術によりプロパルギル基化合物を小さな核酸配列の３'－末端に修飾したものであり、前記プロパルギル基化合物は少なくとも１つの活性水酸基を含有し、
好ましくは、前記プロパルギル基化合物は、
【化2】
【化3】
【請求項6】
一価銅触媒の存在下で、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを接触させるステップを含む、ことを特徴とするコンジュゲートの製造方法。
【請求項7】
前記アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とのモル比が、（１．０５－１０）：１、好ましくは（２～４）：１であり、及び／又は、標的リガンドは、少なくとも１種のアミノ酸がグルタミン酸である２つのアミノ酸で形成されるジペプチドであり、好ましくは、前記アミノ酸は、リジンとグルタミン酸、グルタミン酸とグルタミン酸、及びグルタミン酸とグルタミン酸類似体から選択され、及び／又は、
前記アジド修飾された標的リガンドは、
【化4】
前記小さな核酸配列は、ＳＴＡＴ３、ＰＨＢ１、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＬＫ１、及びＢＲＤ４を標的する小さな核酸から選択される少なくとも１種であり、
及び／又は、前記プロパルギル基修飾は、３'－末端プロパルギル基修飾であり、
及び／又は、前記プロパルギル基修飾された小さな核酸配列は、ホスホロアミダイト法を利用して固相合成技術によりプロパルギル基化合物を小さな核酸配列の３'－末端に修飾したものであり、
好ましくは、前記プロパルギル基化合物は、
【化5】
【化6】
【請求項8】
前記一価銅触媒は、Ｃｕ（Ｉ）－ＴＢＴＡ、ＣｕＢｒ、及びＣｕＣｌから選択される少なくとも１種、好ましくはＣｕ（Ｉ）－ＴＢＴＡであり、及び／又は、小さな核酸配列１ｍｏｌに対して、前記一価銅触媒の使用量は、２～１０ｍｏｌ、好ましくは３～６ｍｏｌであり、
及び／又は、前記接触の条件は、温度が３５．５～３８．５℃、好ましくは３６．５～３７．５℃であること、時間が１～５ｈ、好ましくは２～４ｈであることを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
前記接触は、有機溶媒の存在下で行われ、前記有機溶媒は、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、及びアセトンから選択される少なくとも１種である、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記小さな核酸配列は、センス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ配列であり、プロパルギル基修飾されたセンス鎖及びプロパルギル基修飾されたアンチセンス鎖をそれぞれ得るステップ（１）と、
アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾されたセンス鎖又はプロパルギル基修飾されたアンチセンス鎖とを接触させて、１本鎖コンジュゲートを得るステップ（２）と、
１本鎖コンジュゲートと別の鎖とをアニーリングバッファー中、９０～１００℃の条件下で１～５分間インキュベートし、前記コンジュゲートを得るステップ（３）と、を含み、
好ましくは、前記アニーリングバッファーは、１．５～２．５ｍＭの酢酸マグネシウム溶液から選択される、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ＰＳＭＡを発現させる組織の異常による関連疾患を治療する薬物の製造における、請求項１～５のいずれか１項に記載のコンジュゲート又は請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法によって製造されたコンジュゲートの使用であって、前記疾患は、好ましくは、腺組織、結腸、腎臓、及び神経系で発症し、
前記腺組織は、前立腺、膵臓、乳腺、及び胸腺から選択される１種である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年０４月２３日に提出された中国特許出願２０２１１０４４２３９４．６の利益を主張しており、当該出願の内容は、引用により本明細書に組み込まれている。
本願は、２０２１年０４月２３日に提出された中国特許出願２０２１１０４４２３９４．６の利益を主張しており、当該出願の内容は、引用により本明細書に組み込まれている。
【0002】
本発明は、バイオ技術分野に関し、具体的には、コンジュゲート、その製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0003】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、葉酸加水分解酵素１（ＦＯＬＨ１）、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ－アセチル化－α－連結酸性ジペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤ１）とも呼ばれ、ペプチダーゼＭ２８ファミリーのＭ２８Ｂサブファミリーに属する。ＰＳＭＡは、構造が同型二量体であるＩＩ型膜貫通タンパク質であり、１サブユニットあたり２個の亜鉛イオンを結合することができる。ＰＳＭＡは、葉酸加水分解酵素とＮ－アセチル化－α－連結酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）の活性の両方を持ち、その作用はＮ－アシルポリγ－グルタミン酸及びその誘導体の加水分解を調節することである。他の組織と比較して、ＰＳＭＡは神経系、前立腺、膵臓、腎臓や小腸で比較的に高い発現量を示し、大部分の前立腺癌の上皮層及び他の固形腫瘍の新生血管での発現量は正常組織の発現量よりはるかに高い。このような組織特異性により、ＰＳＭＡは前立腺癌送達の最も好適な標的の１つとなる。
【0004】
ＰＳＭＡは前立腺癌細胞において高度に濃縮されているため、ＰＳＭＡを特異的に認識する抗体、アプタマー及び小分子リガンドの研究開発が相次いで行われている。その中で、合成の容易と高いタンパク質結合親和性のため、ＰＳＭＡの小分子リガンドの研究に注目されている。ＰＳＭＡの小分子リガンドとして、リジンとグルタミン酸が尿素基を介して結合して形成したジペプチド（ＫＵＥ）は前立腺癌のイメージングと標的治療に利用されている。また、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｓｉＲＮＡなどの治療用オリゴヌクレオチドを用いてがんを含む様々な疾患を治療する新しい技術である。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のＰａｔｉｓｉｒａｎとＧｉｖｏｓｉｒａｎの承認に励まされ、ＲＮＡｉは前立腺癌の治療にも注目されている。また、Ｇｉｖｏｓｉｒａｎの承認により、リガンドとｓｉＲＮＡとの直接連結により形成されたコンジュゲートは、腫瘍を標的に治療するための簡単で有効な新しいアプローチとなった。しかし、治療用ｓｉＲＮＡを前立腺癌の組織／細胞に効果的に送達し、癌の治療を実現することは依然として大きな課題である。そのほか、どのようにＧｉｖｏｓｉｒａｎが採用した固相合成法の限界を突破するか（例えば、柔軟性が比較的に悪く、操作が煩雑で、合成効率が理想的でなく、適用範囲が狭いなど）もＲＮＡｉ治療法が早急に解決しなければならない肝心な問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、核酸コンジュゲートの製造の柔軟性が悪く、操作が煩雑で、生産規模が小さいなどの従来技術に存在する技術的課題を解決するために、高標的性と高活性の両方の特徴を兼ね備えるコンジュゲート、及びその製造方法を提供することである。さらに、本発明による方法は、迅速で、効率的で、簡単かつ適用範囲が広いという利点がある。さらに、本発明は、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、乳腺癌、腎臓疾患、及び神経系に関連する疾患のうちのいずれかの疾患を治療する薬物の製造、特に前立腺癌を治療する薬物の製造における、本発明で製造された核酸コンジュゲートの使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記の目的を達成させるために、本発明の第１態様は、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを共有結合したコンジュゲートを提供する。
本発明の第２態様は、一価銅触媒の存在下で、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを接触させるステップを含む、前述コンジュゲートの製造方法を提供する。
本発明の第２態様は、一価銅触媒の存在下で、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを接触させるステップを含む、前述コンジュゲートの製造方法を提供する。
【0007】
本発明の第３態様は、ＰＳＭＡを発現させる組織の異常による関連疾患を治療する薬物の製造における、前述コンジュゲート又は前述方法によって製造されたコンジュゲートの使用であって、前記疾患は、好ましくは腺組織、結腸、腎臓、及び神経系で発症し、前記腺組織は、前立腺、膵臓、乳腺、及び胸腺から選択される１種である方法を提供する。
【0008】
本発明は、プロパルギル基修飾された（特に３’－末端で修飾された）オリゴ核酸及びアジド修飾された標的リガンドを巧みに設計することによって、本発明の方法（すなわち、合成後修飾戦略（銅触媒クリックケミストリー））を使用して、本発明の核酸コンジュゲートを効率的かつ迅速に構築する。本発明によるコンジュゲート（核酸コンジュゲート）は、細胞イメージング、遺伝子サイレンシング評価、及びアポトーシス実験により、高い特異的認識能力、遺伝子サイレンシング能力、腫瘍細胞発生阻害能力を有することを見出した。本発明によるコンジュゲート（核酸コンジュゲート）の製造方法は、ＲＮＡｉ治療試薬の標的送達及び治療における使用が期待できる。また、本発明による製造方法は、単純な化学反応のみを伴うものであり、核酸コンジュゲートを、柔軟で効率的に合成することができ、他の複数種のリガンドを標的とする核酸コンジュゲートの構築にも適しており、実用性に優れている。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明におけるＫＵＥを共役した小さな核酸の概略図である。
【図2】本発明における３'－末端プロパルギル基修飾されたオリゴ核酸１（ＯＮ１）の高速液体クロマトグラフ及び質量スペクトルである。
【図3】本発明における３'－末端プロパルギル基修飾されたオリゴ核酸２（ＯＮ２）の高速液体クロマトグラフ及び質量スペクトルである。
【図4】本発明における３'－末端プロパルギル基修飾されたオリゴ核酸３（ＯＮ３）の高速液体クロマトグラフ及び質量スペクトルである。
【図5】本発明における各ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートのポリアクリルアミドゲル電気泳動を表す図である。
【図6】本発明における各ＤＵＰＡ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡコンジュゲートのポリアクリルアミドゲル電気泳動を表す図である。
【図7】本発明の実施例１における核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＲＮＡ質量スペクトルである。
【図8】本発明の実施例２１における核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡ質量スペクトルである。
【図9】本発明の実施例２２における核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＲＮＡ質量スペクトルである。
【図10】本発明の実施例２３における核酸コンジュゲートＤＵＰＡ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡ質量スペクトルである。
【図11】本発明の実施例２４における核酸コンジュゲートＤＵＰＡ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡ質量スペクトルである。
【図12】本発明の１つの特定実施形態における各核酸コンジュゲートの細胞イメージング画像である。
【図13】本発明１つの特定実施形態における各核酸コンジュゲートの細胞内平均蛍光強度の統計グラフである。
【図14】本発明１つの特定実施形態における各核酸コンジュゲートの細胞インターナリゼーション方式の評価画像である。
【図15】本発明１つの特定実施形態における各核酸コンジュゲートの前立腺癌細胞への取り込み効率の評価図である。
【図16】本発明１つの特定実施形態における各核酸コンジュゲートのｍＲＮＡサイレンシング画像である。
【図17】本発明１つの特定実施形態における各核酸コンジュゲートのタンパク質発現阻害画像である。
【図18】本発明における各核酸コンジュゲートのアポトーシス促進画像である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書で開示される範囲の端点及び任意の値は、正確な範囲又は値に限定されず、これらの範囲又は値に近い値を含むと理解されるべきである。数値範囲の場合、各範囲の端点値の間、各範囲の端点値と個々のポイント値の間、及び個々のポイント値の間は、互いに組み合わされて１つ又は複数の新しい数値範囲を得ることができ、これらの数値範囲は、本明細書で具体的に開示されるものとみなされるべきである。
【0011】
本発明者らは、多くの研究の結果、アジド修飾された標的リガンド（例えば、アジド修飾されたＫＵＥリガンド、アジド修飾されたＤＵＰＡリガンドなど）と３’末端のプロパルギル基修飾された小さな核酸（オリゴ核酸）により、抗原（例えば、ＰＳＭＡ）を標的とするｓｉＲＮＡコンジュゲートを柔軟で効率的に構築できることを見出した。さらに、３'－末端プロパルギル基修飾小さな核酸が熱安定性、全体的なコンホメーション及びＲＮＡｉ活性を保持できるかどうかを検証するために、３'－末端プロパルギル基修飾小さな核酸の関連する性質、例えば融解温度、コンホメーション及びＲＮＡｉ活性の評価などの研究を行い、ｓｉＲＮＡの３'－末端にプロパルギル基修飾を行ってもＲＮＡ本来の性質に影響を及ぼさないだけでなく、ｓｉＲＮＡの合成後の修飾特性も強調していることを明らかにした。
【0012】
以上に基づいて、本発明の第１態様は、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを共有結合したコンジュゲートを提供する。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記アジド修飾された標的リガンド中のアジド基と標的リガンドは、少なくとも１つのポリエチレングリコールの断片を介して共有結合されている。ここで、ポリエチレングリコールの断片中のポリエチレングリコールモノマーの数は特に限定されず、例えば、１～１００であってもよい。前記ポリエチレングリコールの断片は主として連結の役割を果たす。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記標的リガンドは、少なくとも１種のアミノ酸がグルタミン酸である２つのアミノ酸で形成されるジペプチドであり、好ましくは、前記アミノ酸は、リジンとグルタミン酸、グルタミン酸とグルタミン酸、及びグルタミン酸とグルタミン酸類似体から選択され、前記標的リガンドは、グルタミン酸によって認識され、標的細胞の表面で発現される抗原を結合可能であり、前記抗原はＰＳＭＡである。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記標的リガンドの末端にカルボキシ基を含有し、前記標的リガンドはカルボキシ基を介して標的細胞の表面の抗原に連結される。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記標的細胞は、前立腺癌細胞、ニューロン、腎臓癌細胞、及び結腸癌細胞から選択される少なくとも１種であってもよい。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記アジド修飾された標的リガンドは、
（ここで、ｎは１～１００の整数である。ｎは、好ましくは、１～５０の整数、より好ましくは、１～２０の整数、さらに好ましくは、１～１５の整数である。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５であってもよい。）で示される構造を有する。
【化1】
【0018】
本発明では、前記アジド修飾された標的リガンドは、下記の方法によって製造されてもよい。
【0019】
まず、ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステルで保護されたリジンとｔ－ブチルエステルで保護されたグルタミン酸とをトリホスゲンにより連結してＫＵＥを合成する。次に、エチレングリコールをアクリル化してアジド化し、アジドＰＥＧプロピオン酸を得る。最後に、これらの両方（ＫＵＥとアジドＰＥＧプロピオン酸）を縮合反応させて、前記標的リガンドを得る。
【0020】
本発明では、好ましくは、前記アジド修飾された標的リガンド（６ａ（ｎ＝２）、６ｂ（ｎ＝５）、６ｃ（ｎ＝１２））は、下記のステップによって製造されてもよい。
（１）ポリエチレングリコール１ａ－ｃを金属ナトリウムと接触させてから、アクリル酸ｔ－ブチルエステルと第１反応を行い、２ａ－ｃで示される化合物を得る。
（２）トリエチルアミンの存在下で、式２ａ－ｃで示される化合物と塩化トシルに第２反応を行い、式３ａ－ｃで示される化合物を得る。
（３）第３溶媒の存在下で、式３ａ－ｃで示される化合物とアジ化ナトリウムに第３反応を行い、式４ａ－ｃで示される化合物を得る。
（４）ＨＡＴＵ（Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩）及びＤＩＰＥＡ（Ｎ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）の存在下で、４ａ－ｃで示される化合物とＫＵＥに第４反応を行い、式５ａ－ｃで示される化合物を得る。
（５）式５ａ－ｃで示される化合物とトリフルオロ酢酸に第５反応を行い、式６ａ－ｃで示される化合物を得る。
（１）ポリエチレングリコール１ａ－ｃを金属ナトリウムと接触させてから、アクリル酸ｔ－ブチルエステルと第１反応を行い、２ａ－ｃで示される化合物を得る。
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【0021】
ステップ（１）では、前記第１反応の反応温度は２０～４０℃であってもよく、反応時間は５～２０時間であってもよい。ポリエチレングリコール（１ａ－ｃ）１ミリモルに対して、金属ナトリウムの使用量は０．０５～２ｍｍｏｌであってもよく、アクリル酸ｔ－ブチルエステルの使用量は０．３～０．８ｍｍｏｌであってもよい。前記第１反応は第１溶媒の存在下で行われ、ポリエチレングリコール１ミリモルに対して、前記第１溶媒の使用量は１～２ｍＬであってもよく、前記第１溶媒はテトラヒドロフランであってもよい。
【0022】
ステップ（２）では、前記第２反応の反応温度は－２０℃～１０℃であってもよく、反応時間は５～２０時間であってもよい。式２ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、トリエチルアミンの使用量は、０．５～１ｍＬであり、ｐ－トルエンスルホニルクロリドの使用量は、１．２～１．８ｍｍｏｌであってもよい。前記第２反応は、第２溶媒の存在下で行われ、式２ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、前記第２溶媒の使用量は１～３ｍＬであってもよい。前記第２溶媒はジクロロメタンであってもよい。前記第２反応は、好ましくは、不活性雰囲気で行われ、前記不活性雰囲気はアルゴンガスによって提供されてもよい。
【0023】
ステップ（３）では、前記第３反応の反応温度は、６０～９０℃であってもよく、反応時間は、５～２４時間であってもよい。式３ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、アジ化ナトリウムの使用量は、１．２～１．８ｍｍｏｌであってもよい。式３ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、前記第３溶媒の使用量は２～３ｍＬであってもよい。前記第３溶媒はＤＭＦ（Ｎ,Ｎジメチルホルムアミド）であってもよい。
【0024】
ステップ（４）では、前記第４反応の反応温度は、２０～４０℃であってもよく、反応時間は、５～２４時間であってもよい。式４ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、ＫＵＥの使用量は、０．９～１．５ｍｍｏｌであってもよい。４ａ－ｃで示される化合物とＫＵＥとの第４反応に先立って、まず、トリフルオロ酢酸（４ａ－ｃで示される化合物１ｍｏｌに対して、トリフルオロ酢酸の使用量は２～３ｍＬであること）の存在下で、４ａ－ｃで示される化合物を脱保護してもよく、ここで、前記脱保護の温度は、２０～３０℃であってもよく、時間は、１０～２４ｈであってもよい。次に、ＨＡＴＵとＤＩＰＥＡを用いて、４ａ－ｃで示される化合物の脱保護生成物を活性化してもよく、ここで、式４ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、ＨＡＴＵ及びＤＩＰＥＡの使用量は、それぞれ１．２～１．８ｍｍｏｌ、及び２～４ｍｍｏｌであってもよい。前記第４反応は、第４溶媒の存在下で行われる。ここで、式４ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、前記第４溶媒の使用量は０．８～１．５ｍＬであってもよい。前記第４溶媒は、ＤＭＦ（Ｎ,Ｎジメチルホルムアミド）であってもよい。
【0025】
ステップ（５）では、前記第５反応の反応温度は、２０～４０℃であってもよく、反応時間は、５～２４時間であってもよい。式５ａ－ｃで示される化合物１ミリモルに対して、トリフルオロ酢酸の使用量は、２０～３０ｍＬであってもよい。
【0026】
ステップ（１）～（５）の反応の後処理について特に限定はなく、いずれも、カラムクロマトグラフィーにより分離して精製生成物を得てもよい。
【0027】
本発明では、ＫＵＥの構造式は下記で示される。
【化7】
【0028】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記小さな核酸配列は、ＳＴＡＴ３、ＰＨＢ１、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＬＫ１、及びＢＲＤ４を標的とする小さな核酸から選択される少なくとも１種であってもよい。
【0029】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記プロパルギル基修飾は、好ましくは、３'－末端プロパルギル基修飾である。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記プロパルギル基修飾された小さな核酸配列は、ホスホロアミダイト法を利用して固相合成技術によりプロパルギル基化合物を小さな核酸配列の３'－末端に修飾したものであり、前記プロパルギル基化合物は、少なくとも１つの活性水酸基を含有する。前記プロパルギル基修飾は、複数のプロパルギル基修飾（１つ、２つ、３つなど）であってもよい。本発明では、プロパルギル基化合物を小さな核酸配列の３'－末端に修飾する方式について特に限定はなく、この修飾は以下の方式によって行われてもよい。まず、従来技術（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、２０１３、５５８３－５５８８）に基づいて、市販のHoffer's chlorosugarを原料として、４段反応により１－Ｏ－プロパルギル基－２－デオキシ－Ｄ－フラノースホスホロアミダイトモノマーを合成した後、得たホスホロアミダイトモノマーを固相担体（ＣＰＧ）に連結してから、自動核酸合成装置によってプロパルギル基モノマーＸオリゴヌクレオチドを３'－末端に修飾した。最後に、ＣＰＧ及び保護基を除去して、３'－末端プロパルギル基修飾された小さな核酸を得る。
【0031】
本発明では、好ましくは、前記プロパルギル基化合物は、
（ここで、「
」は、小さな核酸の連結部位を示す。）で示される構造を有する。
本発明の第２態様は、一価銅触媒の存在下で、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを接触させるステップを含む前述コンジュゲートの製造方法を提供する。
【化8】
【化9】
本発明の第２態様は、一価銅触媒の存在下で、アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とを接触させるステップを含む前述コンジュゲートの製造方法を提供する。
【0032】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾された小さな核酸配列とのモル比は、（１．０５～１０）：１、好ましくは、（２～４）：１である。
【0033】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記一価銅触媒は、Ｃｕ（Ｉ）－ＴＢＴＡ、ＣｕＢｒ、及びＣｕＣｌから選択される少なくとも１種、好ましくは、Ｃｕ（Ｉ）－ＴＢＴＡである。
【0034】
本発明のいくつかの実施形態によれば、小さな核酸配列１ｍｏｌに対して、前記一価銅触媒の使用量は、２～１０ｍｏｌ、好ましくは、３～６ｍｏｌであってもよい。
【0035】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記接触の条件は、温度が３５．５～３８．５℃、好ましくは３６．５～３７．５℃であること、時間が１～５ｈ、好ましくは２～４ｈであることを含む。
【0036】
本発明では、前記接触において、回転数について特に限定はなく、本発明のニーズを満たせばよく、例えば、回転数は、６００～１０００ｒ／ｍｉｎ、好ましくは７００～９００ｒ／ｍｉｎであってもよい。
【0037】
本発明では、前記接触は、好ましくは、振とうの条件下で行われ、前記振とうの条件は、０．４～０．６ｈおきに振とうを１回行うことであってもよい。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記接触は、有機溶媒の存在下で行われ、前記有機溶媒は、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、エタノール、及びアセトンから選択される少なくとも１種である。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記有機溶媒の使用量は、前記小さな核酸配列の濃度を２０～２００μＭ、好ましくは８０～１２０μＭに維持する。
【0040】
本発明では、前記コンジュゲートとは、１本鎖核酸コンジュゲート又は２本鎖核酸コンジュゲートを指してもよく、前記コンジュゲートが２本鎖核酸コンジュゲートである場合、本分野の通常の方法を参照して、センス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸をアニーリングして２本鎖核酸コンジュゲートを形成してもよく、例えば、センス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸を等モルで用いて、アニーリングバッファー（マグネシウムイオン含有）中、９０～１００℃で２本鎖核酸コンジュゲートを形成してもよい。
【0041】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記小さな核酸配列は、センス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ配列であり、前記方法は、
プロパルギル基修飾されたセンス鎖及びプロパルギル基修飾されたアンチセンス鎖をそれぞれ得るステップ（１）と、
アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾されたセンス鎖又はプロパルギル基修飾されたアンチセンス鎖とを接触させて、１本鎖コンジュゲートを得るステップ（２）と、
１本鎖コンジュゲートと別の鎖とをアニーリングバッファー中、９０～１００℃の条件下で１～５分間インキュベートし、前記コンジュゲートを得るステップ（３）と、を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記アニーリングバッファーは、１．５～２．５ｍＭの酢酸マグネシウム溶液から選択される。
プロパルギル基修飾されたセンス鎖及びプロパルギル基修飾されたアンチセンス鎖をそれぞれ得るステップ（１）と、
アジド修飾された標的リガンドとプロパルギル基修飾されたセンス鎖又はプロパルギル基修飾されたアンチセンス鎖とを接触させて、１本鎖コンジュゲートを得るステップ（２）と、
１本鎖コンジュゲートと別の鎖とをアニーリングバッファー中、９０～１００℃の条件下で１～５分間インキュベートし、前記コンジュゲートを得るステップ（３）と、を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記アニーリングバッファーは、１．５～２．５ｍＭの酢酸マグネシウム溶液から選択される。
【0042】
本発明の第３態様は、ＰＳＭＡを発現させる組織の異常による関連疾患を治療する薬物の製造における、前述コンジュゲート又は前述方法によって製造されたコンジュゲートの使用であって、前記疾患は、好ましくは、腺組織、結腸、腎臓、及び神経系で発症し、前記腺組織は、前立腺、膵臓、乳腺、及び胸腺から選択される１種である使用を提供する。前記疾患は、好ましくは、癌症である。
【0043】
本発明では、「コンジュゲート」とは、「ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート」又は「ＤＵＰＡ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート」である。
【実施例】
【0044】
以下、実施例によって本発明について詳細に説明する。
【0045】
以下の実施例では、すべての原料は市販品である。
製造例１
製造例１
【0046】
本製造例は、アジド修飾されたＫＵＥリガンド６ａ－ｃの製造を説明する。
（ｉ）ポリエチレングリコール１ａ－ｃ（１００ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を乾燥ＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解したものに、金属ナトリウム（２３０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）を加え、ナトリウムが完全に溶解するまで室温で撹拌した。次に、混合液にアクリル酸ｔ－ブチルエステル（６．４ｇ、５０ｍｍｏｌ、０．５ｅｑ）をゆっくりと滴下し、室温で１２時間反応させた。反応終了後、１Ｍ塩酸水溶液８ｍＬを加えて、反応をクエンチングした。１０分間撹拌後、反応液を飽和食塩水２００ｍＬに注入し、酢酸エチルで３回抽出し、有機相を収集して、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝１０：１～１：１）により分離して精製し、薄黄色のモノ－ｔ－ブチルエステル生成物を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.77 － 3.70 (m, 4H), 3.69 － 3.59 (m, 6H), 2.78 (s, 1H), 2.54 － 2.49 (m, 2H), 1.45 (s, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ170.92, 80.63, 72.49, 70.33, 70.31, 66.81, 61.70, 36.14, 28.05. HRMS: calculated for C11H22NaO5 [M+Na]+: 257.1365, found 257.1357.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.79 － 3.59 (m, 22H), 2.91 (s, 1H), 2.53 － 2.48 (m, 2H), 1.45 (s, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.93, 80.51, 72.52, 70.61, 70.59, 70.56, 70.54, 70.48, 70.33, 66.88, 61.72, 36.24, 28.09. HRMS: calculated for C17H34NaO8 [M+Na]+: 389.2151, found 389.2146.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.76 － 3.54 (m, 49H), 2.77 (s, 2H), 2.53 － 2.48 (m, 2H), 1.45 (d, J = 2.4 Hz, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.94, 80.53, 72.58, 70.61, 70.57, 70.51, 70.37, 70.29, 66.90, 61.71, 36.26, 28.10. HRMS: calculated for C31H62NaO15 [M+Na]+: 697.3986, found 697.3981.
（ｉｉ）化合物２ａ－ｃ（１２．３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジクロロメタン３０ｍＬとトリエチルアミン１０ｍＬの混合物に溶解し、アルゴンガス雰囲気下、氷浴中で撹拌した。その後、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（３．５３ｇ、１８．５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）をバッチ式で加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、少量のシリカゲル（１００～２００メッシュ）１０ｇを加えて乾固まで濃縮し、シリカゲル（３００～４００メッシュ）でクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝１０：１～１：３）分離を行い、無色油状物として生成物を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.19 － 4.11 (m, 2H), 3.67 (dd, J = 8.0, 4.8 Hz, 4H), 3.55 (q, J = 4.8 Hz, 4H), 2.47 (dd, J = 12.4, 6.0 Hz, 5H), 1.44 (s, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.81, 144.80, 132.99, 129.82, 127.95, 80.50, 70.60, 70.29, 69.26, 68.64, 66.88, 36.21, 28.07, 21.61. HRMS: calculated for C18H28NaO7S [M+Na]+: 411.1453, found 411.1448.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 － 7.74 (m, 2H), 7.37 － 7.33 (m, 2H), 4.24 － 4.08 (m, 2H), 3.83 － 3.51 (m, 20H), 2.59 － 2.36 (m, 5H), 1.45 (d, J = 5.6 Hz, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.89, 144.78, 133.02, 129.82, 127.98, 80.49, 70.74, 70.58, 70.51, 70.36, 69.24, 68.67, 66.89, 36.27, 28.09, 21.64. HRMS: calculated for C24H40NaO10S [M+Na]+: 543.2240, found 543.2246.
1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.83 － 7.74 (m, 2H), 7.49 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.13 － 4.10 (m, 2H), 3.64 － 3.29 (m, 48H), 2.43 (s, 5H), 1.40 (s, 9H); 13C-NMR (101 MHz, DMSO) δ 170.87, 145.34, 132.88, 130.59, 128.10, 80.15, 70.44, 70.25, 70.17, 70.14, 68.35, 66.69, 36.29, 28.20, 21.55. HRMS: calculated for C38H68NaO17S [M+Na]+: 851.4075, found 851.4071.
（ｉｉｉ）化合物３ａ－ｃ（２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、アジ化ナトリウム（１９５ｍｇ、３ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加えた。混合物を８０℃の条件で一晩反応させ、その後、シリカゲル（１００～２００メッシュ）を２ｇ加えて乾固まで濃縮し、シリカゲル（３００～４００メッシュ）でクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝２０：１～１：２）により分離し、無色油状物として生成物を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.76 － 3.60 (m, 8H), 3.42 － 3.35 (m, 2H), 2.51 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.84, 80.45, 70.56, 70.38, 70.00, 66.92, 50.64, 36.22, 28.04. HRMS: calculated for C11H21N3NaO4 [M+Na]+: 282.1430, found 282.1426.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.77 － 3.58 (m, 20H), 3.47 － 3.30 (m, 2H), 2.50 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.92, 80.51, 70.70, 70.67, 70.64, 70.59, 70.50, 70.37, 70.04, 66.90, 50.68, 36.26, 28.09. HRMS: calculated for C17H33N3NaO7 [M+Na]+: 414.2216, found 414.2211.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.75 － 3.57 (m, 48H), 3.40 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 2.53 － 2.48 (m, 2H), 1.45 (d, J = 2.4 Hz, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.91, 80.49, 70.69, 70.66, 70.63, 70.56, 70.49, 70.36, 70.04, 66.88, 50.67, 36.25, 28.09. HRMS: calculated for C31H61N3NaO4 [M+Na]+: 722.4051, found 722.4048.
（ｉｖ）化合物４ａ－ｃ（２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をトリフルオロ酢酸５ｍＬに溶解し、室温で一晩反応させ、その後、濃縮して、残りのトリフルオロ酢酸を除去し、ジクロロメタン及びシリカゲル（１００～２００メッシュ）２ｇを加えて乾固まで濃縮し、シリカゲル（３００～４００メッシュ）でクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝５：１～１：５）により分離し、無色油状物として生成物を得て、ジメチルホルムアミド２ｍＬに溶解した。ＨＡＴＵ（１．１５ｇ、３ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（７７５．５ｍｇ、６ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を加えて活性化させた。１５ｍｉｎ後、ＫＵＥ（１．１７ｇ、２．４ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩反応させ、その後、シリカゲル（１００～２００メッシュ）３ｇを加えて乾固まで濃縮し、シリカゲル（３００～４００メッシュ）でクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝１０：１～１：５）により分離し、無色油状物として生成物を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.87 (s, 1H), 5.64 (dd, J = 20.0, 6.4 Hz, 2H), 4.38 － 4.17 (m, 2H), 3.71 (d, J = 28.0 Hz, 7H), 3.44 (s, 2H), 3.34 － 3.12 (m, 2H), 2.52 (s, 2H), 2.32 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.06 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 1.84 (dd, J = 32.0, 25.2 Hz, 2H), 1.67 － 1.23 (m, 33H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.58, 172.52, 157.40, 82.17, 81.66, 80.67, 70.19, 70.00, 69.76, 67.35, 53.35, 52.99, 50.56, 38.84, 36.42, 32.02, 31.55, 28.63, 28.04, 27.96, 22.23. HRMS: calculated for C31H56N6NaO10 [M+Na]+: 695.3956, found 695.3953.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.05 (s, 1H), 5.78 (dd, J = 16.4, 8.0 Hz, 2H), 4.38 － 4.17 (m, 2H), 3.71 (d, J = 29.2 Hz, 15H), 3.41 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 23.2, 17.2 Hz, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.50 (s, 1H), 2.32 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.05 (s, 1H), 1.91 － 1.70 (m, 2H), 1.69 － 1.17 (m, 36H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.21, 161.56, 157.58, 157.41, 81.74, 81.19, 80.34, 70.47, 70.45, 70.41, 70.37, 70.35, 70.28, 70.18, 70.01, 69.87, 67.24, 53.35, 52.83, 50.54, 45.11, 39.74, 38.74, 36.60, 32.17, 31.92, 31.47, 29.03, 28.70, 28.20, 27.97, 27.91, 22.55, 22.31. HRMS: calculated for C37H68N6NaO13 [M+Na]+: 827.4742, found 827.4738.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.89 (s, 1H), 5.57 (s, 2H), 4.26 (d, J = 20.4 Hz, 2H), 3.67 (s, 45H), 3.41 (s, 2H), 3.21 (d, J = 16.8 Hz, 2H), 2.99 (s, 1H), 2.53 (s, 1H), 2.32 (s, 2H), 2.05 (s, 1H), 1.80 (d, J = 44.4 Hz, 1H), 1.65 － 1.18 (m, 36H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.41, 157.42, 81.87, 81.44, 80.50, 70.37, 70.21, 70.05, 69.99, 69.82, 69.71, 69.62, 69.49, 69.37, 53.47, 53.02, 50.61, 38.87, 31.97, 31.55, 28.20, 28.06, 27.98, 22.31. HRMS: calculated for C51H96N6NaO20 [M+Na]+: 1135.6577, found 1135.6569.
（ｖ）化合物５ａ－ｃ（０．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をトリフルオロ酢酸５ｍＬに溶解し、室温で一晩反応させ、その後、濃縮して残りのトリフルオロ酢酸を除去し、ジクロロメタンとシリカゲル（１００～２００メッシュ）１ｇを加えて乾固まで濃縮し、シリカゲル（３００～４００メッシュ）でクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１～１：２）により分離し、無色油状物として生成物を得た。６ａ－ｃで示される化合物について高分解能質量分析により確認した。
６ａ： 145mg, Yield 96%, HRMS: calcd. for C19H32N6O10 [M-H]-: 503.2102; MALDI-TOF-MS: m/z 503.2105;
6b: 179mg, Yield 94%, HRMS: calcd. for C25H44N6O13 [M-H]-: 635.2888; MALDI-TOF-MS: m/z 635.2892;
6c: 260mg, Yield 92%, HRMS: calcd. for C39H72N6O20 [M-H]-: 943.4723; MALDI-TOF-MS: m/z 943.5601。
製造例２
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
６ａ： 145mg, Yield 96%, HRMS: calcd. for C19H32N6O10 [M-H]-: 503.2102; MALDI-TOF-MS: m/z 503.2105;
6b: 179mg, Yield 94%, HRMS: calcd. for C25H44N6O13 [M-H]-: 635.2888; MALDI-TOF-MS: m/z 635.2892;
6c: 260mg, Yield 92%, HRMS: calcd. for C39H72N6O20 [M-H]-: 943.4723; MALDI-TOF-MS: m/z 943.5601。
製造例２
【0047】
本製造例は、アジド修飾されたＤＵＰＡリガンドの製造を説明する。
（ｉ）化合物Ｓ１（２４４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ、２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を一緒にジメチルホルムアミド５ｍＬに加えた。撹拌しながらＮ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１２９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加えた後、混合物を室温で１５分間撹拌した。直ちに１７－アジド－３,６,９,１２,１５－ペンタオキサヘタデカン－１－アミン（１８２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を混合物にスプレーし、室温で６時間反応させ続けた。反応終了後、反応混合物を水２０ｍＬに注入し、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を収集して、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、黄色油状の粗生成物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル＝１／５）により分離して精製し、黄色油状化合物Ｓ２（３３８ｍｇ、収率：８７％）を得た。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ6.93(s, 1H), 5.67(s, 2H), 4.28(d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.66-3.50 (m, 20H), 3.48-3.30 (m, 4H), 2.30-1.96(m, 6H), 1.89-1.72(m, 2H), 1.47-1.29(m, 27H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ172.81, 172.56, 172.28, 171.95, 157.49, 81.89, 81.66, 80.44, 70.64, 70.62, 70.55, 70.52, 70.48, 70.43, 70.42, 70.05, 69.98, 69.49, 53.02, 50.63, 39.15, 32.54, 31.63, 29.19, 28.18, 28.05, 27.98. HRMS(ESI): m/z [M+Na]+ calculated for C35H64N6NaO13 +: 799.4424, found 799.4428.
（ｉｉ）氷浴の条件下で、化合物Ｓ２（４７２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタンとトリフルオロ酢酸の等体積混合溶液（５ｍＬ）に溶解し、反応液を室温で６時間反応させた。溶媒を蒸発除去し、得た残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／３）により精製し、油状化合物Ｓ３（２３８ｍｇ、９８％）を得た。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ12.52(s, 3H), 7.94(d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.36(dd, J = 7.9, 5.6 Hz, 2H), 4.16-3.98(m, 2H), 3.63-3.58(m, 2H), 3.57-3.50(m, 14H), 3.42-3.35(m, 5H), 3.18(q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.29-2.19(m, 2H), 2.14-2.08(m, 2H), 1.95-1.84(m, 2H), 1.77-1.65(m, 2H); 13C NMR(101 MHz, DMSO)δ174.77, 174.67, 174.27, 171.83, 162.78, 157.73, 70.28, 70.24, 70.16, 70.14, 69.72, 55.40, 52.58, 52.15, 50.43, 38.97, 36.25, 32.00, 31.23, 30.42, 28.71, 28.09. HRMS(ESI): m/z [M-H]－calculated for C23H39N6O13－: 607.2581; found: 607.2578.
製造例３
【化27】
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ6.93(s, 1H), 5.67(s, 2H), 4.28(d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.66-3.50 (m, 20H), 3.48-3.30 (m, 4H), 2.30-1.96(m, 6H), 1.89-1.72(m, 2H), 1.47-1.29(m, 27H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ172.81, 172.56, 172.28, 171.95, 157.49, 81.89, 81.66, 80.44, 70.64, 70.62, 70.55, 70.52, 70.48, 70.43, 70.42, 70.05, 69.98, 69.49, 53.02, 50.63, 39.15, 32.54, 31.63, 29.19, 28.18, 28.05, 27.98. HRMS(ESI): m/z [M+Na]+ calculated for C35H64N6NaO13 +: 799.4424, found 799.4428.
【化28】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ12.52(s, 3H), 7.94(d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.36(dd, J = 7.9, 5.6 Hz, 2H), 4.16-3.98(m, 2H), 3.63-3.58(m, 2H), 3.57-3.50(m, 14H), 3.42-3.35(m, 5H), 3.18(q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.29-2.19(m, 2H), 2.14-2.08(m, 2H), 1.95-1.84(m, 2H), 1.77-1.65(m, 2H); 13C NMR(101 MHz, DMSO)δ174.77, 174.67, 174.27, 171.83, 162.78, 157.73, 70.28, 70.24, 70.16, 70.14, 69.72, 55.40, 52.58, 52.15, 50.43, 38.97, 36.25, 32.00, 31.23, 30.42, 28.71, 28.09. HRMS(ESI): m/z [M-H]－calculated for C23H39N6O13－: 607.2581; found: 607.2578.
製造例３
【0048】
本製造例は、３'－末端プロパルギル基修飾小さな核酸の合成を説明する。
１－Ｏ－プロパルギル基－２－デオキシ－Ｄ－フラノース（Ｘ、すなわち、プロパルギル基モノマー）は、共通のオーバーハング修飾として、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（ＡＢＩ、ＵＳＡ）によって小さな核酸（オリゴ核酸）の３'－末端に連結された（図１参照）。
３'－末端プロパルギル基修飾小さな核酸の合成の具体的なステップは以下の通りである。まず、市販のHoffer's chlorosugarを原料として、１－Ｏ－プロパルギル基－２－デオキシ－Ｄ－フラノースホスホロアミダイトモノマー（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、２０１３、５５８３－５５８８）を合成した後、得たホスホロアミダイトモノマーを固相担体（ＣＰＧ）に連結してから、前述自動核酸合成装置によってプロパルギル基モノマーＸオリゴヌクレオチドを３'－末端に修飾した。最後に、ＣＰＧ及び保護基を除去して、各３'－末端プロパルギル基修飾１本鎖小さな核酸を得た。本発明で製造された全てのプロパルギル基修飾された１本鎖核酸について、純度は高速液体クロマトグラフィーにより確認され、構造が質量分析計により確認された（図２～４）。
実施例１
１－Ｏ－プロパルギル基－２－デオキシ－Ｄ－フラノース（Ｘ、すなわち、プロパルギル基モノマー）は、共通のオーバーハング修飾として、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（ＡＢＩ、ＵＳＡ）によって小さな核酸（オリゴ核酸）の３'－末端に連結された（図１参照）。
３'－末端プロパルギル基修飾小さな核酸の合成の具体的なステップは以下の通りである。まず、市販のHoffer's chlorosugarを原料として、１－Ｏ－プロパルギル基－２－デオキシ－Ｄ－フラノースホスホロアミダイトモノマー（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、２０１３、５５８３－５５８８）を合成した後、得たホスホロアミダイトモノマーを固相担体（ＣＰＧ）に連結してから、前述自動核酸合成装置によってプロパルギル基モノマーＸオリゴヌクレオチドを３'－末端に修飾した。最後に、ＣＰＧ及び保護基を除去して、各３'－末端プロパルギル基修飾１本鎖小さな核酸を得た。本発明で製造された全てのプロパルギル基修飾された１本鎖核酸について、純度は高速液体クロマトグラフィーにより確認され、構造が質量分析計により確認された（図２～４）。
【表1】
【0049】
本実施例は、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの効率的な合成を説明する。
ＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成：
２００μＬ滅菌済遠沈管に、プロパルギル基修飾された小さな核酸配列（ＯＮ３）（１０ｎｍｏｌ）、アジド修飾された標的リガンド６ａ（３０ｎｍｏｌ）、Ｃｕ（Ｉ）－ＴＢＴＡ（５０ｎｍｏｌ）を順次加えて、ＲＮＡ最終濃度を１００μＭ程度に維持した。系にＤＭＦ（反応液の体積に占める体積の比が２５％）を加えた。反応系をボルテックスで軽く混合して均一にした後、金属反応器に入れて、３７℃、９００ｒ／ｍｉｎの条件で振とう反応を３ｈ行い、１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により反応結果を監視した。最後に、生成物をオリゴ核酸キットで分離して精製し、生成物の純度及び濃度についてＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ウルトラマイクロ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ,ＵＳＡ）により確認し、最終収率は９８％であった。
実施例２～１２
ＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成：
２００μＬ滅菌済遠沈管に、プロパルギル基修飾された小さな核酸配列（ＯＮ３）（１０ｎｍｏｌ）、アジド修飾された標的リガンド６ａ（３０ｎｍｏｌ）、Ｃｕ（Ｉ）－ＴＢＴＡ（５０ｎｍｏｌ）を順次加えて、ＲＮＡ最終濃度を１００μＭ程度に維持した。系にＤＭＦ（反応液の体積に占める体積の比が２５％）を加えた。反応系をボルテックスで軽く混合して均一にした後、金属反応器に入れて、３７℃、９００ｒ／ｍｉｎの条件で振とう反応を３ｈ行い、１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により反応結果を監視した。最後に、生成物をオリゴ核酸キットで分離して精製し、生成物の純度及び濃度についてＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ウルトラマイクロ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ,ＵＳＡ）により確認し、最終収率は９８％であった。
実施例２～１２
【0050】
添加される有機溶媒の種類及び／又は使用量を変更した以外、実施例１に従って行った。結果を表２に示す。
実施例１３～２０
【表2】
【0051】
触媒の種類及び／又は使用量を変更した以外、実施例１に従って行った。実験結果を表３に示す。
実施例２１
【表3】
【0052】
６ａの代わりに等モル量のアジド修飾された標的リガンド６ｂを用いた以外、実施例１に従って行った。最終収率は９６％であった。
実施例２２
実施例２２
【0053】
６ａの代わりに等モル量のアジド修飾された標的リガンド６ｃを用いた以外、実施例１に従って行った。最終収率は９５％であった。
実施例２３
実施例２３
【0054】
本実施例は、異なる遺伝子を標的とするＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの効率的な合成を説明する。
ＳＴＡＴ３遺伝子を標的とするＲＮＡ（ＯＮ３）の代わりに、ＰＨＢ－１遺伝子を標的とするＲＮＡ（ＯＮ５）を用いた以外、実施例１に従って行った。最終収率は９７％であった。
実施例２４
ＳＴＡＴ３遺伝子を標的とするＲＮＡ（ＯＮ３）の代わりに、ＰＨＢ－１遺伝子を標的とするＲＮＡ（ＯＮ５）を用いた以外、実施例１に従って行った。最終収率は９７％であった。
実施例２４
【0055】
本実施例は、ＤＵＰＡ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの効率的な合成を説明する。
６ａの代わりに等モル量のアジド修飾されたＤＵＰＡリガンドを用いた以外、実施例１に従って行った。最終収率は９８％であった。
実施例２５
６ａの代わりに等モル量のアジド修飾されたＤＵＰＡリガンドを用いた以外、実施例１に従って行った。最終収率は９８％であった。
実施例２５
【0056】
実施例１～２２で得られた１本鎖コンジュゲートと、Ｃｙ５標識相補鎖小さな核酸とを、１：１のモル比で、アニーリングバッファー（２ｍＭ酢酸マグネシウムはマグネシウムイオンを含有）中、９５℃で３分間インキュベートし、各ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート及びＤＵＰＡ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを形成した。
実施例１、実施例２１、実施例２２、実施例２３、及び実施例２４で製造された核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＲＮＡ、核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡ、核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＲＮＡ、及びＤＵＰＡ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動を表す図は、図５及び図６に示され、質量スペクトルは、それぞれ、図７、図８、図９、図１０（実施例２３）、及び図１１（実施例２４）に示される。
試験実施例１
実施例１、実施例２１、実施例２２、実施例２３、及び実施例２４で製造された核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＲＮＡ、核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡ、核酸コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＲＮＡ、及びＤＵＰＡ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動を表す図は、図５及び図６に示され、質量スペクトルは、それぞれ、図７、図８、図９、図１０（実施例２３）、及び図１１（実施例２４）に示される。
試験実施例１
【0057】
ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの前立腺癌細胞への取り込みの選択性の評価
細胞イメージング：ＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ陽性、中国科学院から購入）とＰＣ３細胞（ＰＳＭＡ陰性、中国科学院から購入）を選択し、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの細胞取り込みを評価した。Ｃｙ５標識ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート及びｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）を用いて２種類の前立腺癌細胞と共にインキュベートし、トランスフェクションした６時間後に、細胞を６４９ｎｍ励起光の条件下で蛍光イメージングした（図１２Ａ（ＬＮＣａＰ細胞の蛍光イメージング）及び図１２Ｂ（ＰＣ３細胞の蛍光イメージング））。図１２Ａから、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ブランド：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、メーカー：サーモフィッシャー社）の存在下でのみ、両細胞でｓｉＲＮＡ群からの赤色蛍光シグナルが観察され、ＬＮＣａＰ細胞では、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート群からの赤色蛍光シグナルが観察された。さらに、図１２Ｂでは、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート群からの赤色蛍光シグナルはＰＣ－３細胞ではほとんど観察されなかった。以上の結果から、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、共役されないｓｉＲＮＡと異なり、前立腺癌細胞に選択的に取り込まれ、このインターナリゼーションがｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介さずに高効率で行われることが示唆された。図１２Ａの細胞蛍光イメージングについて平均蛍光強度の統計を行い（図１３を参照）、図１３の統計結果から、ＬＮＣａＰ細胞におけるＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート群の平均蛍光強度は９５％で、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介してトランスフェクションしたｓｉＲＮＡ群の平均蛍光強度は８２％であることを発見した。ＰＣ－３細胞におけるＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの平均蛍光強度は５％未満であった。以上の結果から、ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション試薬なしでは、どの細胞にもほとんど取り込まれないが、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、トランスフェクション試薬なしでは、ＬＮＣａＰ細胞に選択的に取り込まれることが示唆された。
細胞のインターナリゼーション方式：ＰＳＭＡ特異性阻害剤（ＺＪ４３、Eur. J. Neurosci.,2004,483-494を参照して調製した）を加えることにより、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートがＬＮＣａＰ細胞に入る経路をさらに確認した。ＬＮＣａＰ細胞をＺＪ４３とともに事前にインキュベートした後、Ｃｙ５標識ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを加えた。６時間後、ＬＮＣａＰ細胞を６４０ｎｍ励起光の条件下で蛍光イメージングした（図１４参照）。図１４の結果は、ＺＪ４３の添加によりＬＮＣａＰ細胞にＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートからの赤色蛍光シグナルがＰＳＭＡ特異的阻害剤を添加しない対照群と比較してほとんど観察されないことを示している。このことは、ＺＪ４３の添加がＬＮＣａＰ細胞によるＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの取り込みを、ＺＪ４３を添加していない群に比べて有意に阻害することを示している。
試験実施例２
細胞イメージング：ＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ陽性、中国科学院から購入）とＰＣ３細胞（ＰＳＭＡ陰性、中国科学院から購入）を選択し、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの細胞取り込みを評価した。Ｃｙ５標識ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート及びｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）を用いて２種類の前立腺癌細胞と共にインキュベートし、トランスフェクションした６時間後に、細胞を６４９ｎｍ励起光の条件下で蛍光イメージングした（図１２Ａ（ＬＮＣａＰ細胞の蛍光イメージング）及び図１２Ｂ（ＰＣ３細胞の蛍光イメージング））。図１２Ａから、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ブランド：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、メーカー：サーモフィッシャー社）の存在下でのみ、両細胞でｓｉＲＮＡ群からの赤色蛍光シグナルが観察され、ＬＮＣａＰ細胞では、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート群からの赤色蛍光シグナルが観察された。さらに、図１２Ｂでは、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート群からの赤色蛍光シグナルはＰＣ－３細胞ではほとんど観察されなかった。以上の結果から、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、共役されないｓｉＲＮＡと異なり、前立腺癌細胞に選択的に取り込まれ、このインターナリゼーションがｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介さずに高効率で行われることが示唆された。図１２Ａの細胞蛍光イメージングについて平均蛍光強度の統計を行い（図１３を参照）、図１３の統計結果から、ＬＮＣａＰ細胞におけるＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート群の平均蛍光強度は９５％で、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介してトランスフェクションしたｓｉＲＮＡ群の平均蛍光強度は８２％であることを発見した。ＰＣ－３細胞におけるＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの平均蛍光強度は５％未満であった。以上の結果から、ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション試薬なしでは、どの細胞にもほとんど取り込まれないが、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、トランスフェクション試薬なしでは、ＬＮＣａＰ細胞に選択的に取り込まれることが示唆された。
細胞のインターナリゼーション方式：ＰＳＭＡ特異性阻害剤（ＺＪ４３、Eur. J. Neurosci.,2004,483-494を参照して調製した）を加えることにより、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートがＬＮＣａＰ細胞に入る経路をさらに確認した。ＬＮＣａＰ細胞をＺＪ４３とともに事前にインキュベートした後、Ｃｙ５標識ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを加えた。６時間後、ＬＮＣａＰ細胞を６４０ｎｍ励起光の条件下で蛍光イメージングした（図１４参照）。図１４の結果は、ＺＪ４３の添加によりＬＮＣａＰ細胞にＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートからの赤色蛍光シグナルがＰＳＭＡ特異的阻害剤を添加しない対照群と比較してほとんど観察されないことを示している。このことは、ＺＪ４３の添加がＬＮＣａＰ細胞によるＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの取り込みを、ＺＪ４３を添加していない群に比べて有意に阻害することを示している。
試験実施例２
【0058】
ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの前立腺癌細胞への取り込み効率の評価
ＰＳＭＡ陽性発現ＬＮＣａＰ細胞（中国科学院から購入）を選択し、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの細胞取り込み効率を評価した。Ｃｙ５標識ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（５０ｎＭ）とｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）をＬＮＣａＰ細胞と共にインキュベートし、その中で、ｓｉＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ブランド：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、メーカー：サーモフィッシャー社）と共にトランスフェクションして対照群とした。４時間後、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ細胞アポトーシス二重染色キット（ブランド：５５６５４７、メーカー：アメリカＢＤ社）の操作に従って細胞を処理した。製造された細胞サンプルについて、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータによりＣｙ５に対応する検出チャネル下で分析した。実験中に順次にブランク対照群、ｓｉＲＮＡ単独トランスフェクション群、ｓｉＲＮＡとｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００共同トランスフェクション群、及び各ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートトランスフェクション群に対して分析を行い、群ごとに１０４個の細胞を収集して検出した。すべての実験群の細胞の検出が完了した後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実験結果を解析した（図１５）。図１５より、リガンドの共役を行っていないｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＴＡＴ３）はＬＮＣａＰ細胞にはほとんど取り込まれていないことがわかり、これは、細胞イメージングの結果と一致している。さらに、ＬＮＣａＰ細胞において、ＫＵＥ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＲＮＡ、ＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡ、ＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＲＮＡ）は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション群の細胞取り込み効率（７４．２％）よりも高い細胞取り込み効率（＞９９％）を示した。これらの実験結果は、リガンドＫＵＥの結合が特定の前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）へのｓｉＲＮＡの送達に不可欠であることを示している。
試験実施例３
ＰＳＭＡ陽性発現ＬＮＣａＰ細胞（中国科学院から購入）を選択し、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの細胞取り込み効率を評価した。Ｃｙ５標識ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（５０ｎＭ）とｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）をＬＮＣａＰ細胞と共にインキュベートし、その中で、ｓｉＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ブランド：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、メーカー：サーモフィッシャー社）と共にトランスフェクションして対照群とした。４時間後、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ細胞アポトーシス二重染色キット（ブランド：５５６５４７、メーカー：アメリカＢＤ社）の操作に従って細胞を処理した。製造された細胞サンプルについて、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータによりＣｙ５に対応する検出チャネル下で分析した。実験中に順次にブランク対照群、ｓｉＲＮＡ単独トランスフェクション群、ｓｉＲＮＡとｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００共同トランスフェクション群、及び各ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートトランスフェクション群に対して分析を行い、群ごとに１０４個の細胞を収集して検出した。すべての実験群の細胞の検出が完了した後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実験結果を解析した（図１５）。図１５より、リガンドの共役を行っていないｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＴＡＴ３）はＬＮＣａＰ細胞にはほとんど取り込まれていないことがわかり、これは、細胞イメージングの結果と一致している。さらに、ＬＮＣａＰ細胞において、ＫＵＥ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＲＮＡ、ＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＲＮＡ、ＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＲＮＡ）は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション群の細胞取り込み効率（７４．２％）よりも高い細胞取り込み効率（＞９９％）を示した。これらの実験結果は、リガンドＫＵＥの結合が特定の前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）へのｓｉＲＮＡの送達に不可欠であることを示している。
試験実施例３
【0059】
ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートのＲＮＡｉ活性を検証するために、本試験実施例では、ＳＴＡＴ３遺伝子を標的とする治療用小さな核酸を使用し、その配列を表４に示す。
２００μＬ滅菌済遠沈管にプロパルギル基修飾された小さな核酸配列（ＯＮ２）（１０ｎｍｏｌ）、アジド修飾された標的リガンド（３０ｎｍｏｌ）、Ｃｕ（Ｉ）－ＴＢＴＡ（５０ｎｍｏｌ）を順次加え、ＲＮＡの最終濃度を約１００μＭに維持した。系にＤＭＦ（体積は反応液積の２５％）を加えた。反応系をボルテックスで軽く混合して均一にした後、金属反応器に入れ、３７℃、９００ｒ／ｍｉｎの条件下で３ｈ振とうして反応させた。最後に、１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により反応結果を監視し、オリゴ核酸抽出キットにより分離して精製し、１本鎖コンジュゲートを得た。使用した標的リガンドが６ａの場合、収率は９７．７％であった。標的リガンドが６ｂである場合、収量は９６．２％であった。使用した標的リガンドが６ｃの場合、収率は９５．６％であった。
その後、得られた１本鎖コンジュゲートと相補鎖小さな核酸をモル比１：１でアニーリングバッファー（２ｍＭ酢酸マグネシウム）中、９５℃で３分間インキュベートし、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートを形成した。
１）ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートの遺伝子サイレンシング効果評価
標的遺伝子サイレンシング：シグナル伝達と転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を標的とするＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３（ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡ）コンジュゲート（１００ｎＭ）をＬＮＣａＰ細胞と共にインキュベートした。４８時間後、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）によりｍＲＮＡの発現を検出した。図１６Ａに示すように、すべてのＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＳＴＡＴ３のｍＲＮＡ発現を効果的に低下させることができ、ここで、ＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＳＴＡＴ３は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介してトランスフェクションされたｓｉＲＮＡと同等のサイレンシング活性を有する。また、図１６Ｂから、コンジュゲートにおけるＰＥＧ長の増加に伴ってｍＲＮＡ発現量が徐々に低下していることが分かった。以上の結果は、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートがＬＮＣａＰ細胞に取り込まれると標的遺伝子の発現を効果的に低下させることを示している。さらに、コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＳＴＡＴ３は、ＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＳＴＡＴ３やＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＳＴＡＴ３よりも強いｍＲＮＡダウンレギュレーション効果を誘導した。
タンパク質発現阻害：ｍＲＮＡダウンレギュレーション実験のほかに、タンパク質ブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）によりコンジュゲートがＳＴＡＴ３タンパク質の発現に及ぼす影響を調べた（図１７Ａと図１７Ｂを参照）。図１７Ａの結果は、すべてのＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲート実験群に対応するバンドの濃さが、共役されないｓｉＳＴＡＴ３群に比べて低下していることを示しており、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートがＳＴＡＴ３タンパク質の発現を阻害していることを示している。図１７Ｂにおける定量実験の結果、ＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートがＳＴＡＴ３タンパク質の発現をダウンレギュレーションすることが示された。
２）ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの前立腺癌細胞への増殖阻害効果の評価
【表4】
その後、得られた１本鎖コンジュゲートと相補鎖小さな核酸をモル比１：１でアニーリングバッファー（２ｍＭ酢酸マグネシウム）中、９５℃で３分間インキュベートし、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートを形成した。
１）ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートの遺伝子サイレンシング効果評価
標的遺伝子サイレンシング：シグナル伝達と転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を標的とするＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３（ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡ）コンジュゲート（１００ｎＭ）をＬＮＣａＰ細胞と共にインキュベートした。４８時間後、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）によりｍＲＮＡの発現を検出した。図１６Ａに示すように、すべてのＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＳＴＡＴ３のｍＲＮＡ発現を効果的に低下させることができ、ここで、ＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＳＴＡＴ３は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を介してトランスフェクションされたｓｉＲＮＡと同等のサイレンシング活性を有する。また、図１６Ｂから、コンジュゲートにおけるＰＥＧ長の増加に伴ってｍＲＮＡ発現量が徐々に低下していることが分かった。以上の結果は、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートがＬＮＣａＰ細胞に取り込まれると標的遺伝子の発現を効果的に低下させることを示している。さらに、コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＳＴＡＴ３は、ＫＵＥ－ＰＥＧ２－ｓｉＳＴＡＴ３やＫＵＥ－ＰＥＧ５－ｓｉＳＴＡＴ３よりも強いｍＲＮＡダウンレギュレーション効果を誘導した。
タンパク質発現阻害：ｍＲＮＡダウンレギュレーション実験のほかに、タンパク質ブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）によりコンジュゲートがＳＴＡＴ３タンパク質の発現に及ぼす影響を調べた（図１７Ａと図１７Ｂを参照）。図１７Ａの結果は、すべてのＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲート実験群に対応するバンドの濃さが、共役されないｓｉＳＴＡＴ３群に比べて低下していることを示しており、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートがＳＴＡＴ３タンパク質の発現を阻害していることを示している。図１７Ｂにおける定量実験の結果、ＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートがＳＴＡＴ３タンパク質の発現をダウンレギュレーションすることが示された。
２）ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの前立腺癌細胞への増殖阻害効果の評価
【0060】
以上の生化学的評価に基づき、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３（ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＲＮＡ）コンジュゲートは前立腺癌細胞ＬＮＣａＰに特異的に取り込まれ、ＲＮＡｉメカニズムをトリガーし、ＳＴＡＴ３のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量を著しく低下させることが確認された。フローサイトメータ（メーカー：アメリカＢＤ社、型番：ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）を用いて、ＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートのＬＮＣａＰ細胞の成長状況に対する影響を検出した（図１８を参照）。図１８には、フローサイトメトリーの結果により、ＳＴＡＴ３遺伝子を標的とするＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートは、程度が異なるが、すべてＬＮＣａＰ細胞のアポトーシスを促進でき（２５．０１％～３４．９４％）、コンジュゲートＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＳＴＡＴ３（ＫＵＥ－ＰＥＧ１２－ｓｉＲＮＡ）は３４．９４％のＬＮＣａＰ細胞のアポトーシスを促進できることが明らかになった。
【0061】
以上のことから、本発明により構築されたＫＵＥ－ＰＥＧ－ｓｉＳＴＡＴ３コンジュゲートは、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞）に選択的に取り込まれ、ＬＮＣａＰ細胞内のＲＮＡｉ機構をトリガーし、最終的に前立腺癌細胞の増殖を阻害することに成功したことが明らかになった。
【0062】
さらに、本発明のコンジュゲートは、標的遺伝子の発現を低下させる（又は癌細胞の増殖を阻害する）ことに関しては、従来の方法（例えば、リポソーム）による小さな核酸の送達と同等の効果を有することが、更なる研究によって明らかにされた。
【0063】
以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明の技術構想の範囲内では、本発明の技術案について、各技術的特徴を他の適切な方法で組み合わせることを含め、複数の簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形及び組み合わせは同様に本発明の開示された内容と見なすべきであり、いずれも本発明の特許範囲に属する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】