特表 2024-515788 治療抗体を発現する非ウイルスＤＮＡベクター及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-10

(54)【発明の名称】治療抗体を発現する非ウイルスＤＮＡベクター及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240403BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240403BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240403BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 47/14 20170101ALI20240403BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/88 Z

C12P21/08

A61K9/51

A61P31/04

A61P31/10

A61P31/12

A61P33/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K48/00

A61P35/00

A61P37/02

A61K47/14

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023565904

(86)(22)【出願日】2022-04-27

(85)【翻訳文提出日】2023-12-20

(86)【国際出願番号】 US2022026560

(87)【国際公開番号】W WO2022232289

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/180,382

(32)【優先日】2021-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520068043

【氏名又は名称】ジェネレーション バイオ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】シルバー， ナサニエル

(72)【発明者】

【氏名】カー， ダグラス アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】サマヨア， フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ジンダル， シッダルタ

(72)【発明者】

【氏名】ガニエ， ラファエル

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C076AA65

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC32

4C076CC34

4C076CC35

4C076DD36H

4C076FF63

4C076FF68

4C084AA13

4C084NA03

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZB32

4C084ZB33

4C084ZB35

4C084ZB37

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE01

(57)【要約】

本出願は、細胞、組織又は対象における抗体及びその抗原結合断片の発現に有用なｃｅＤＮＡベクターを含む方法及び組成物、並びに様々な疾患、障害及びがんの治療及び／又は予防の方法を記載する。本明細書に記載される技術は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス）ＤＮＡベクター（本明細書において「閉端ＤＮＡベクター」又は「ｃｅＤＮＡベクター」と称される）に関し、ここで、ｃｅＤＮＡベクターは、抗体重鎖及び抗体軽鎖からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの核酸配列を含むｃｅＤＮＡベクターを含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター組成物であって、前記少なくとも１つの核酸配列が、抗体又はその抗原結合断片の重鎖（ＨＣ）及び／又は軽鎖（ＬＣ）をコードする、ｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項2】

前記少なくとも１つの核酸配列が、前記抗体又は前記その抗原結合断片の前記ＨＣをコードする、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項3】

前記少なくとも１つの核酸配列が、前記抗体又は前記その抗原結合断片の前記ＬＣをコードする、請求項１又は２に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項4】

前記少なくとも１つの核酸配列が、前記抗体又は前記その抗原結合断片の前記ＨＣ及びＬＣの両方をコードする、請求項１～３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項5】

カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター組成物であって、
隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターであって、前記少なくとも１つの核酸配列が、抗体又はその抗原結合断片の重鎖（ＨＣ）をコードする、第１のｃｅＤＮＡベクターと、
隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターであって、前記少なくとも１つの核酸配列が、抗体又はその抗原結合断片の軽鎖（ＬＣ）をコードする、第２のｃｅＤＮＡベクターと、を含む、ｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項6】

前記ＨＣ及び前記ＬＣが、１：１０又は１０：１、好ましくは１：３～３：１、最も好ましくは１．５：１（ＨＣ：LC）のモル比で存在する、請求項５に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項7】

前記ＨＣ及び前記ＬＣが、１：１～２．５：１（ＨＣ：LC）のモル比で存在する、請求項５又は６に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項8】

前記ＨＣ及び前記ＬＣが、１．５：１～２．５：１（ＨＣ：LC）のモル比で存在する、請求項５～７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項9】

前記ＨＣ及び前記ＬＣが、約１．５：１（ＨＣ：LC）のモル比で存在する、請求項５～８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項10】

前記ＨＣ及び前記ＬＣが、約２．０：１（ＨＣ：LC）のモル比で存在する、請求項５～９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項11】

前記ＨＣ及び前記ＬＣが、約２．５：１（ＨＣ：LC）のモル比で存在する、請求項５～１０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項12】

前記第１のｃｅＤＮＡ及び前記第２のｃｅＤＮＡが一緒になって、ＨＣ及びＬＣを含む少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｕｇ／ｍＬの抗体を発現する、請求項５～１１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項13】

前記少なくとも１つの核酸が、前記隣接する逆位末端（ＩＴＲ）間に第１のＯＲＦ及び第２のＯＲＧを含む二重ＯＲＦを含み、前記第１のＯＲＦが抗体のＨＣをコードし、第２のＯＲＦが抗体のＬＣをコードし、前記第１のＯＲＦ及び前記第２のＯＲＦが重複しない、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項14】

前記二重ＯＲＦが双方向である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項15】

前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記少なくとも１つの核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列、エンハンサー配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター、又は請求項５に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項16】

前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも１つのポリＡ配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項17】

前記ｃｅＤＮＡベクターが、５’ＵＴＲ及び／又はイントロン配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物、又は請求項５に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項18】

前記ｃｅＤＮＡベクターが、３’ＵＴＲ配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項19】

前記ｃｅＤＮＡベクターが、エンハンサー配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項20】

少なくとも一方のＩＴＲが、機能的末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項21】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項22】

前記隣接するＩＴＲが、互いに対して対称又は非対称である、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項23】

前記隣接するＩＴＲが、対称又は実質的に対称である、請求項２２に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項24】

前記隣接するＩＴＲが、非対称である、請求項２２に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項25】

前記ＩＴＲの一方若しくは両方が野生型であるか、又は前記ＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲである、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項26】

前記隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項１～２５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項27】

前記隣接するＩＴＲが、表２に示されるウイルス血清型のいずれかの対から選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項28】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、表３の配列のうちの１つ以上から選択される配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項29】

前記ＩＴＲのうちの少なくとも一方が、前記ＩＴＲの全体的な三次元立体構造に影響を与える欠失、付加、又は置換によって、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から変更されている、請求項１～２８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項30】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１～２９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項31】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、合成である、請求項１～３０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項32】

前記ＩＴＲの一方若しくは両方が野生型ＩＴＲでないか、又は前記ＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲでない、請求項１～３１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項33】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、及びＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～３２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項34】

前記欠失、挿入、及び／又は置換が、前記Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、又はＣ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、請求項３３に記載のｃｅＤＮＡ組成物。

【請求項35】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項36】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、前記Ｃ及びＣ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～３５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項37】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の一部、並びに／又は前記Ｃ及びＣ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～３６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項38】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、通常、前記Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステム－ループ構造と、前記Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステム－ループ構造と、を含む領域に、単一のステム－ループ構造を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項39】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、通常、前記Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステム－ループ構造と、前記Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステム－ループ構造と、を含む領域に、単一のステム及び２つのループを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項40】

前記ＩＴＲの一方又は両方が、通常、前記Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステム－ループ構造と、前記Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステム－ループ構造と、を含む領域に、単一のステム及び単一のループを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項41】

両方のＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転されている場合、全体的な三次元対称性をもたらす様式で変更されている、請求項１～４０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項42】

前記ベクター組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入されている、請求項１～４１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物。

【請求項43】

表７から選択される核酸配列を含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター。

【請求項44】

配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、又は配列番号４０８と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター。

【請求項45】

配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７又は配列番号４０８からなる群から選択される核酸配列からなる、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター。

【請求項46】

細胞において抗体又はその抗原結合断片を発現させる方法であって、前記細胞を、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項47】

前記細胞が、インビトロ又はインビボである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記少なくとも１つの核酸配列が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項４６又は４７に記載の方法。

【請求項49】

細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌感染症を有する対象を治療する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項50】

がんを有する対象を治療する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項51】

自己免疫疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項52】

対象における細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌感染症を予防する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項53】

対象におけるがんを予防する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項54】

対象における自己免疫疾患を予防する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項55】

前記ｃｅＤＮＡベクターによってコードされ、前記対象の肝臓において発現される抗体又はその抗原結合断片が、フコシルトランスフェラーゼを発現する哺乳動物細胞株から産生されるその対応物と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａに対してより高い結合親和性を有する、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ｃｅＤＮＡベクター又は前記ｃｅＤＮＡベクター組成物が、静脈内、皮下、腫瘍内又は筋肉内注射によって投与される、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記対象に免疫調節剤を投与することを更に含む、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、薬学的組成物。

【請求項59】

１つ以上の追加の治療剤を更に含む、請求項５０に記載の薬学的組成物。

【請求項60】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター組成物又は請求項４３～４５に記載のｃｅＤＮＡベクターと、脂質と、を含む、組成物。

【請求項61】

前記脂質が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター、請求項５８に記載の薬学的組成物、又は請求項６０に記載の組成物と、使用説明書と、を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年４月２７日に出願された米国仮出願第６３／１８０，３８２号に対する優先権を主張し、その全体の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（発明の分野）
本開示は、対象又は細胞において、抗体又はその抗原結合断片を発現させるための非ウイルス性ベクターを含む、抗体療法の分野に関する。本開示はまた、核酸を含む核酸構築物、プロモーター、ベクター、及び宿主細胞、並びに抗体又はその抗原結合断片をコードする導入遺伝子を標的細胞、組織、器官、又は生物に送達する方法に関する。例えば、本開示は、感染、疾患又は障害を有する対象の治療のために、非ウイルスｃｅＤＮＡベクターを使用して、抗体又はその抗原結合断片を、例えば発現する細胞から抗体又はその抗原結合断片を発現させる方法を提供する。抗体治療薬で治療され得る任意の感染、疾患又は障害が、本開示によって想定される。方法及び組成物はまた、それを必要とする対象において、例えば治療又は予防目的のために適用することができる。

【背景技術】

【0003】

抗体に基づく治療薬例えば、ｍＡｂは、免疫障害、がん及び感染症を治療するための最も成功した戦略の１つであることが示されている。長期間持続する治療効果のために十分に高い濃度の抗体を達成するために、抗体療法は、従来、反復投与によって、例えば複数回注射によって送達される。しかしながら、この投薬レジメンは、治療期間を通して一貫性のない抗体レベル、投与当たりの限られた効率、抗体の投与及び消費の高いコストをもたらす。

【0004】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、おそらくヒトにおける遺伝子導入のための最もよく研究されたベクターであり、何百もの臨床試験が形質導入の安全性を実証している。アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus、ＡＡＶ）は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属し、より具体的にはＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属を構成する。ＡＡＶに由来するベクター（すなわち、ｒＡＶＶ又はＡＡＶベクター）は、（ｉ）筋細胞及びニューロンを含む多種多様な非分裂及び分裂細胞型に感染する（これらを形質導入する）ことができ、（ｉｉ）それらはウイルス構造遺伝子を欠き、それによって、ウイルス感染に対する宿主細胞応答（例えば、インターフェロン媒介応答）を減少させ、（ｉｉｉ）野生型ウイルスは、ヒトにおいて非病的であると考えられ、（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込むことができる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは複製（ｒｅｐ）遺伝子を欠き、一般にエピソームとして存続し、したがって、挿入変異誘発又は遺伝毒性のリスクを制限し、及び（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは一般に免疫原が比較的弱いと考えられ、したがって、有意な免疫応答を誘発せず（（ｉｉ）を参照されたい）、したがって、ベクターＤＮＡの持続性及び潜在的に治療用導入遺伝子の長期発現を得る、という理由により、遺伝物質を送達するのに魅力的である。

【0005】

しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コード能力に制限されている。特に抗体送達に関連して、ＡＡＶのパッケージング制限は、天然抗体構造を形成する重鎖及び軽鎖の両方の効率的な送達のための重要な課題を表す。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補が、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングされる必要があることである。第３の欠点は、初回治療から除外されなかった患者への再投与を防ぐカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに応答して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。既存の免疫は、形質導入の効率を厳しく制限し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。

【0006】

追加的に、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、及びｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞及び組織型を非効率的に形質導入し、カプシドはまた、免疫応答を誘導することもわかった。

【0007】

したがって、抗体治療薬の送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫応答に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、及び遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。

【0008】

当技術分野では、改善された治療薬の開発のために、代替経路又は投与様式による抗体及び抗体ベースの治療薬の送達が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

本明細書に記載される技術は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス）ＤＮＡベクター（本明細書において「閉端ＤＮＡベクター」又は「ｃｅＤＮＡベクター」と称される）に関し、ここで、ｃｅＤＮＡベクターは、抗体重鎖及び抗体軽鎖からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。これらのｃｅＤＮＡベクターは、疾患及び障害（例えば、免疫障害、がん、感染症）の治療、モニタリング及び診断のための抗体又はその抗原結合断片を産生するために使用することができる。抗体重鎖及び抗体軽鎖からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を発現する１つ以上のｃｅＤＮＡベクターの対象への適用は、対象において疾患又は障害を治療する、予防する、又はその重症度を低減する、送達において最小限に侵襲性である、反復可能であり、効果に応じて投与される、治療効果の迅速な発現を有する、及び／又は抗体又はその抗原結合断片の持続的発現をもたらすのに有用である。更に、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、抗体又はその抗原結合断片をコードする導入遺伝子（例えば、核酸配列）を細胞又は組織に送達するために、適応免疫応答が回避され、所望の抗体特異性が、免疫化又は受動伝達を使用せずに産生される。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、エンドサイトーシスを介して細胞に入り、次いでエンドソーム区画から脱出し、核に輸送される。転写的に活性なｃｅＤＮＡエピソームは、コードされた抗体の発現をもたらし、これは次いで細胞から循環中に分泌され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターは、単回注射によって投与される抗体（例えば、本明細書に記載される治療用抗体、又はその中の抗原結合断片）の連続的、持続的及び長期送達を可能にし得る。

【0010】

いくつかの実施形態によれば、抗体重鎖及び抗体軽鎖からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含むｃｅＤＮＡベクターは、リポソームナノ粒子製剤（ＬＮＰ）中に存在する。

【0011】

本明細書に記載される抗体重鎖及び軽鎖からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含むｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端（直鎖状、連続的、及び非カプシド化構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されるカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、５’逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）配列及び３’ＩＴＲ配列を含み、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、互いに対して同じ対称の三次元構成（すなわち、対称若しくは実質的に対称）を有し得るか、又は代替的に５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、互いに対して異なる三次元構成（すなわち、非対称ＩＴＲ）を有し得る。加えて、ＩＴＲは、同じ又は異なる血清型に由来し得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有するように、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得る（すなわち、それらは同じであるか、又は互いに対して鏡像である）。いくつかの実施形態によれば、一方のＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。

【0012】

したがって、本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、抗体重鎖及び抗体軽鎖からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする核酸配列に隣接するＩＴＲ配列を含む、上記抗体又はその抗原結合断片の改善されたタンパク質発現及び／又は産生のためのｃｅＤＮＡベクターに関し、ここで、ＩＴＲ配列が、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの改変ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば非対称改変ＩＴＲ）；（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、真核細胞中で産生され得、したがって昆虫細胞中の原核ＤＮＡ修飾及び細菌内毒素汚染を欠き得る。

【0013】

第１の態様によれば、本開示は、隣接する逆位末端（ＩＴＲ）の間に少なくとも１つの核酸配列を含むｃｅＤＮＡベクターを含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（capsid-free closed ended DNA、ｃｅＤＮＡ）ベクター組成物であって、少なくとも１つの核酸配列が、抗体又はその抗原結合断片の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び／又は軽鎖（light chain、ＬＣ）をコードする、組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの核酸配列は、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの核酸配列は、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの核酸配列は、抗体又はその抗原結合断片のＨＣ及びＬＣの両方をコードする。

【0014】

別の態様によれば、本開示は、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも１つの核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターであって、少なくとも１つの核酸配列が抗体又はその抗原結合断片の重鎖（ＨＣ）をコードする第１のｃｅＤＮＡベクターと、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも１つの核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターであって、少なくとも１つの核酸配列が抗体又はその抗原結合断片の軽鎖（ＬＣ）をコードする第２のｃｅＤＮＡベクターとを含む、カプシド不含閉端末端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターの組み合わせを提供する。

【0015】

上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＨＣ及びＬＣは、１：１０又は１０：１、好ましくは１：３～３：１、最も好ましくは１．５：１（ＨＣ：ＬＣ）のモル比で存在する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＨＣ及びＬＣは、１：１～２．５：１（ＨＣ：ＬＣ）のモル比で存在する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＨＣ及びＬＣは、１．５：１～２．５：１（ＨＣ：ＬＣ）のモル比で存在する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＨＣ及びＬＣは、約１．５：１（ＨＣ：ＬＣ）のモル比で存在する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＨＣ及びＬＣは、約２．０：１（ＨＣ：ＬＣ）のモル比で存在する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＨＣ及びＬＣは、約２．５：１（ＨＣ：ＬＣ）のモル比で存在する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、第１のｃｅＤＮＡ及び第２のｃｅＤＮＡはともに、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｕｇ／ｍＬの、ＨＣ及びＬＣを含む抗体を発現する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、少なくとも１つの核酸は、隣接する逆位末端（ＩＴＲ）の間に第１のＯＲＦ及び第２のＯＲＧを含む二重ＯＲＦを含み、第１のＯＲＦは抗体のＨＣをコードし、第２のＯＲＦは抗体のＬＣをコードし、第１のＯＲＦ及び第２のＯＲＦは重複しない。いくつかの実施形態によれば、二重ＯＲＦは双方向性である。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１つの核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列、エンハンサー配列を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１つのポリＡ配列を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、５’ＵＴＲ及び／又はイントロン配列を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、３’ＵＴＲ配列を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、エンハンサー配列を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、少なくとも１つのＩＴＲは、機能的末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、隣接するＩＴＲは、互いに対して対称又は非対称である。いくつかの実施形態によれば、隣接するＩＴＲは、対称又は実質的に対称である。いくつかの実施形態によれば、隣接するＩＴＲは、非対称である。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方が野生型であり、又はＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲである。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、隣接するＩＴＲは、異なるウイルス血清型に由来する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、隣接するＩＴＲは、表２に示されるウイルス血清型の任意の対から選択される。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方が、表３の配列のうちの１つ以上から選択される配列を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの少なくとも一方が、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から、ＩＴＲの全体的な三次元立体構造に影響を与える欠失、付加、又は置換によって変更されている。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方が合成である。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方若しくは両方が野生型ＩＴＲでないか、又はＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲでない。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方若しくは両方は、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、及びＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾される。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、欠失、挿入、及び／又は置換は、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’Ｃ、又はＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方は、Ｂ及びＢ’領域によって通常形成されるステムループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方は、Ｃ及びＣ’領域によって通常形成されるステムループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方は、Ｂ及びＢ’領域によって通常形成されるステムループ構造の一部、並びに／又はＣ及びＣ’領域によって通常形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方は、通常、Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造と、を含む領域に、単一のステムループ構造を含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方は、通常、Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造と、を含む領域に、単一のステム及び２つのループを含む。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ＩＴＲの一方又は両方は、通常、Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造と、を含む領域に、単一のステム及び単一のループを含む。いくつかの実施形態では、両方のＩＴＲは、ＩＴＲが互いに対して反転している場合、全体的な三次元対称性をもたらす様式で変更されている。上記の態様の実施形態の実施形態によれば、ベクター組成物は、脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle、ＬＮＰ）中に封入されている。

【0016】

別の態様によれば、本開示は、表７から選択される核酸配列を含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを提供する。

【0017】

別の態様によれば、本開示は、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、又は配列番号４０８と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを提供する。

【0018】

別の態様によれば、本開示は、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７又は配列番号４０８からなる群から選択される核酸配列からなる、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを提供する。

【0019】

別の態様によれば、本開示は、細胞において抗体又はその抗原結合断片を発現させる方法を提供し、細胞を、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態によれば、細胞は、インビトロ又はインビボである。実施形態によれば、少なくとも１つの核酸配列は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0020】

別の態様によれば、本開示は、細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌感染症を有する対象を治療する方法であって、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0021】

別の態様によれば、本開示は、がんを有する対象を治療する方法であって、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0022】

別の態様によれば、本開示は、自己免疫疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0023】

別の態様によれば、本開示は、対象における細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌感染症を予防する方法であって、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0024】

別の態様によれば、本開示は、対象におけるがんを予防する方法をであって、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0025】

別の態様によれば、本開示は、対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、対象は、１つ以上の追加の治療剤を投与される。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物は、静脈内、皮下、腫瘍内又は筋肉内注射によって投与される。上記の態様の実施形態及び実施形態によれば、方法は、対象に免疫調節剤を投与することを更に含む。

【0026】

別の態様によれば、本開示は、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的組成物を提供する。複数の実施形態によれば、薬学的組成物は、１つ以上の追加の治療剤を更に含む。

【0027】

別の態様によれば、本開示は、本明細書の態様又は実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡベクター組成物、及び脂質を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、脂質は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。

【0028】

別の態様によれば、本開示は、本明細書の態様若しくは実施形態のいずれかのｃｅＤＮＡベクター若しくはｃｅＤＮＡベクター組成物、又は薬学的組成物を含むキットを提供する。

【0029】

本開示のこれらの及び他の態様は、下記で更に詳述される。

【図面の簡単な説明】

【0030】

上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。

【図1A】非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片例えば、ＨＣ又はＬＣの発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）、（例えば、抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）（発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ及び下流（３’端）の修飾型ＩＴＲ）に隣接しており、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。

【図1B】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片（例えば、ＨＣ又はＬＣ）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、抗体又は融合タンパク質をコードする核酸は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）（発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲ及び下流（３’端）の野生型ＩＴＲ）に隣接している。

【図1C】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子（例えば、抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列）、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、及びポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する、非対称ＩＴＲを含む本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲ及び下流（３’端）の修飾型ＩＴＲに隣接しており、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。

【図1D】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲ又は実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片（例えば、ＨＣ又はＬＣ）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（例えば、抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲ及び３’修飾型ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。

【図1E】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、及びポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲ又は実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片（例えば、ＨＣ又はＬＣ）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、導入遺伝子（例えば、抗体又はその抗原結合部位をコードする核酸配列）の、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への挿入を可能にする。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲ及び３’修飾型ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。

【図1F】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称のＷＴ－ＩＴＲ又は実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片（例えば、ＨＣ又はＬＣ）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（例えば、抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。

【図1G】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、及びポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲ又は実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。

【図2A】Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ及びＲＢＥ’）の特定とともに、ＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステム－ループ構造を提供し、また、末端分離部位（terminal resolution site、ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。加えて、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲ又は変異型ＩＴＲ上で組み立てられたＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。Ｄ及びＤ’領域は、転写因子結合部位及び他の保存構造を含有する。

【図2B】Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ及びＲＢＥ’）の特定とともにＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型左ＩＴＲにおける提案されたＲｅｐ触媒ニッキング及びライゲーション活性を示し、また、末端分離部位（ｔｒｓ）、並びにいくつかの転写因子結合部位を含むＤ及びＤ’領域並びに他の保存構造も示す。

【図3A】野生型左ＡＡＶ２ ＩＴＲのＡ－Ａ’アーム並びにＣ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）並びに二次構造（右）を提供する。

【図3B】左ＩＴＲについての例示的な変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、左）のＡ－Ａ’アーム、Ｃアーム、及びＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）及び予測された二次構造（右）が示される。

【図3C】野生型右ＡＡＶ２ ＩＴＲのＡ－Ａ’ループ、並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）並びに二次構造（右）を示す。

【図3D】例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な変異体右ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、右）のＡ－Ａ’アーム、並びにＢ－Ｂ’及びＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）及び予測された二次構造（右）が示される。左及び右のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ又は他のウイルス血清型又は合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを、本明細書で教示されるように使用することができる。図３Ａ～図３Ｄのポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミド又はバクミド／バキュロウイルスゲノムで使用される配列を指す。プラスミド又はバクミド／バキュロウイルスゲノムのｃｅＤＮＡベクター構成及び予測されたＧｉｂｂｓ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡの二次構造もまた、図３Ａ～図３Ｄの各々に含まれる。

【図4A】図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおける、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生に有用である、バキュロウイルス感染昆虫細胞（baculovirus infected insect cells、ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。

【図4B】ｃｅＤＮＡの産生の例示的な方法の概略図である。

【図4C】ｃｅＤＮＡベクターの産生を確認するための生化学的方法及びプロセスを示す。

【図4D】図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから回収されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、又は制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲル又は変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖及び未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体及び二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体及び単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断された場合、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さな）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様の結合分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）又は塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件及び変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂ及び２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成することができる。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件において１ｋｂ及び２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができるが、変性条件では、鎖は、接続されたままであり、２ｋｂ及び４ｋｂとして移動する一本鎖を産生する。

【図4E】図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから回収されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、又は制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲル又は変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖及び未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体及び二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体及び単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断された場合、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さな）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様の結合分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）又は塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件及び変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂ及び２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成することができる。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件において１ｋｂ及び２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができるが、変性条件では、鎖は、接続されたままであり、２ｋｂ及び４ｋｂとして移動する一本鎖を産生する。

【図5】エンドヌクレアーゼで消化した（＋）又は消化していない（－）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル泳動例の例示的な写真である（ｃｅＤＮＡ構築物１及び２についてはＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３及び４についてはＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５及び６についてはＳｐｅＩ、及びｃｅＤＮＡ構築物７及び８についてはＸｈｏＩ）構築物１～８は、国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号の実施例１に記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。

【図6】実施例６において試験したｃｅＤＮＡ構築物による抗体発現の検出を示すグラフである。抗スパイクヒトＩｇＧ（^＊＊＊）を使用して抗体発現を検出し、これを、ｃｅＤＮＡ構築物を注射してから３５日後までのｎｇ／ｍｌ抗スパイクｈＩｇＧによって定量した。図６に示されるように、ＬＮＰ１中で共製剤化されたｃｅＤＮＡ二重ベクターｃｅＤＮＡ－１８５６（ＬＣをコードする）及びｃｅＤＮＡ－１８５９（ＨＣをコードする）を用いた場合（ｃｅＤＮＡ－１：ＬＮＰ１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する約１ｕｇ／ｍＬのモノクローナル抗体が１４日目までに検出され、３５日目までに約８ｕｇ／ｍＬまでの抗体が検出された。ビヒクル（Ｖ）：ＬＮＰ製剤１（ｃｅＤＮＡ－１ ＬＮＰ１（１））中に共製剤化されたｃｅＤＮＡ二重ベクター構築物１８５６／１８５９、ＬＮＰ製剤２中のｃｅＤＮＡ二重ベクター構築物１８５６／１８５９（ｃｅＤＮＡ－１ ＬＮＰ２（２））、及びＬＮＰ製剤１（ｃｅＤＮＡ－２ ＬＮＰ１（３））中に製剤化された単一ｃｅＤＮＡ構築物２１５７（単一ｃｅＤＮＡ中のＨＣ及びＬＣの二重ＯＲＦ（「双方向性単一ｃｅＤＮＡベクター」））を含む。

【図7A】様々なｃｅＤＮＡベクターフォーマットの模式図を示す。

【図7B】全て抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）抗体をコードする、二重ＯＲＦ構築物（ＯＲＦ １に連結された構成的プロモーター）、及びＯＲＦ ２に連結された肝臓特異的プロモーター、単一ｃｅＤＮＡベクターのフーリン／２Ａ切断設計；及びｃｅＤＮＡ－１の二重ベクター設計（ｃｅＤＮＡ １８５６及び１８５９）を使用した抗体産生レベルを示すグラフである。二重ベクター設計は、最高発現構築物を生じた。

【図7C】二重ベクターのＬＮＰ送達を示すグラフであるｃｅＤＮＡ－１；「ＬＮＰ製剤１中に共製剤化されたｃｅＤＮＡ二重ベクター構築物１８５６／１８５９）は、ｃｅＤＮＡの単一ベクター（二重ＯＲＦ ｃｅＤＮＡ ２１５７、「ｃｅＤＮＡ－２」）の発現と比較して、マウスにおいて８ｕｇ／ｍＬの持続的治療関連抗スパイクｈＩｇＧ濃度を達成した。

【図8】流体力学的送達後に抗体ＨＣ及びＬＣを発現させるためのｃｅＤＮＡ二重ベクター設計とｃｅＤＮＡ二重ＯＲＦ設計との間の抗体発現の用量依存的増加を比較する。

【図9】様々なＨＣ：ＬＣモル比を有するｃｅＤＮＡベクター構築物を用いたインビトロスクリーニングの結果を示すグラフである。

【図10】様々なＨＣ：ＬＣモル比中に固定されたＨＣ又はＬＣを有するｃｅＤＮＡベクター構築物を使用したインビボ結果を示すグラフである。

【図11A】細胞株由来（組換えＬＳ）又はｃｅＤＮＡ由来抗体１（血清精製ｃｅＤＮＡ由来ＬＳ）、及び細胞株由来（組換えＬＳ－ＧＡＡＬＩＥ）又はｃｅＤＮＡ由来（血清精製ｃｅＤＮＡ由来ＬＳ－ＧＡＡＬＩＥ）抗体２が、ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ受容体に会合した後、これより解離したときの解離定数（Ｋ_Ｄ）の値を示すグラフである。

【図11B】細胞株由来（組換えＬＳ）又はｃｅＤＮＡ由来（血清精製ｃｅＤＮＡ由来ＬＳ）抗体１、及び細胞株由来（組換えＬＳ－ＧＡＡＬＩＥ）又はｃｅＤＮＡ由来（血清精製ｃｅＤＮＡ由来ＬＳ－ＧＡＡＬＩＥ）抗体２が、ＦｃγＲＩＩＩａＦ受容体に会合した後、これより解離したときの解離定数（Ｋ_Ｄ）の値を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本開示の実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターによって抗体又はその抗原結合断片を送達するための組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、治療目的に有用である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、診断目的に有用である。

【0032】

Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学的及び技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。免疫学及び分子生物学における一般用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．により発行，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）により発行（２０１３）、Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により発行，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより発行，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（編），Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより発行，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容は全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0033】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団を指す。すなわち、集団を構成する抗体分子が、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いてアミノ酸配列において同一である。組成物中の「複数の」このようなモノクローナル抗体及び断片とは、例えばマウス又はヒトなどの宿主生物の血液中に通常天然に存在するであろう濃度を超える、同一の（すなわち、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除くアミノ酸配列における）抗体及び断片の濃度を指す。

【0034】

本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々には３つのＣＤＲが存在し、可変領域の各々についてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表される。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域で生じる３つのＣＤＲのグループを指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに応じて異なって定義される。Ｋａｂａｔにより記載されているシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７；１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称される場合がある。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３）は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定の下位部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体配座を採ることを見出した。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、又はＨ１、Ｈ２及びＨ３、又は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２及びＬ－ＣＤＲ３又はＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３として表され、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域及び重鎖領域を表す。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称される場合があり、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２－４５によって記載されている。更に他のＣＤＲ境界の定義は、本明細書のシステムの１つに厳密には従わない場合もあるが、それでもＫａｂａｔ ＣＤＲと重複する。しかし、特定の残基若しくは残基の群、又はＣＤＲ全体であっても抗原結合に大きな影響を及ぼさないという予測又は実験結果に照らして短縮又は延長される場合がある（例えば、Ｌｕ Ｘ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１９ Ｊａｎ；１１（１）：４５－５７を参照されたい）。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用してもよいが、特定の実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａで定義されたＣＤＲを使用する。

【0035】

本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」又は「抗原結合部分」（又は単に「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって遂行され得ることが示されている。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、一本鎖、及び一本鎖抗体を含む。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。ダイアボディ等の他の形態の一本鎖抗体もまた、包含される。ダイアボディは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現する二価の二重特異性抗体であるが、同じ鎖上で２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いており、それによってドメインを他の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させて、２つの抗原結合部位を生じさせる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８、Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照されたい）。本開示の抗体部分は、米国特許第６，０９０，３８２号、同第６，２５８，５６２号、同第６，５０９，０１５号に更に詳細に記載されており、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0036】

「ＣＬ」という用語は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」又は「軽鎖定常領域」すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域を指す。用語「ＣＨ」は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」又は「重鎖定常領域」を指し、これは、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）に更に分割可能である。抗体重鎖のＦｃ領域は、本明細書において更に記載される。本開示の実施形態のいずれかにおいて、本開示の抗体又は抗原結合性断片は、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３のうちのいずれか１つ以上を含む。例えば、哺乳動物細胞株における産生は、抗体重鎖の１つ以上のＣ末端リジンを除去することができることが理解されるであろう（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ６（５）：１１４５－１１５４（２０１４）を参照されたい）。したがって、本開示の抗体又は抗原結合性断片は、重鎖、ＣＨ１～ＣＨ３、ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドを含むことができ、Ｃ末端リジン残基が存在するか、又は存在しない。言い換えれば、重鎖、ＣＨ１－ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドのＣ末端残基がリジンではない実施形態、及びリジンがＣ末端残基である実施形態が包含される。特定の実施形態では、組成物は、本開示の複数の抗体及び／又は抗原結合性断片を含み、抗体又は抗原結合性断片は、重鎖、ＣＨ１～ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドのＣ末端にリジン残基を含まず、抗体又は抗原結合性断片は、重鎖、ＣＨ１～ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドのＣ末端にリジン残基を含む。「キメラ抗体」は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれのいくつかの部分が、特定の種に由来するか又は特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同であるが、鎖の残りのセグメントが、別の種由来の対応する配列に相同である抗体を指す。

【0037】

「ヒト化抗体」は、実質的にヒト抗体鎖（アクセプター免疫グロブリン又は抗体と呼ばれる）由来の可変領域フレームワーク残基を含む少なくとも１つの鎖と、実質的に非ヒト抗体（例えば、マウス）由来の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む抗体を指す。加えて、ヒト化抗体は、典型的には、親和性及び／又は免疫原性を改善するために更なる改変を受ける。

【0038】

「多価抗体」という用語は、２つ以上の抗原認識部位を含む抗体を指す。例えば、「二価」抗体は２つの抗原認識部位を有し、一方、「四価」抗体は４つの抗原認識部位を有する。用語「単一特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」等。「抗原認識部位特異性」は、多価抗体に存在する（抗原認識部位の数とは対照的な）異なる抗原認識部位特異性の数を指す。例えば、「単一特異性抗体」抗原の抗原認識部位は全て、同じエピトープに結合する。「二重特異性」又は「二重特異性」抗体は、第１のエピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位と、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位とを有する。「多価単一特異性」抗体は、全てが同じエピトープに結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価二重特異性」抗体は、複数の抗原認識部位を有し、そのいくつかは第１のエピトープに結合し、そのいくつかは第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する。

【0039】

「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により導入されるか又はインビボで体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。

【0040】

「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離される全てのヒト抗体（例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体）を含むことが意図される。

【0041】

本明細書で使用される場合、「中和抗体」は、病原体が宿主において感染を開始及び／又は永続させる能力を中和すなわち、防止、阻害、低減、妨害、又は干渉することができる抗体である。この阻害は、生物学的活性（インビトロ又はインビボのいずれか）、細胞活性化、及び／又は受容体結合の１つ又は複数の指標を測定することによって評価することができる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、宿主の免疫系を刺激して体液性及び／又は細胞性の抗原特異的応答を生じさせる１つ以上のエピトープ（直鎖状、立体構造又はその両方）を含有する分子を指すことを意味する。この用語は、用語「免疫原」と互換的に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３～４個程度の少量のアミノ酸であってもよい。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７～９アミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２～２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７～１５アミノ酸（９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸などを含む）を含む。この用語は、タンパク質が本明細書中で定義されるような免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブ配列と比較して、改変（例えば、欠失、付加及び置換（一般的に、本質的に保存的））を含むポリペプチドを含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように意図的であってもよく、又は抗原を産生する宿主の変異によるように偶発的であってもよい。

【0043】

用語「エピトープ」は、抗原決定基とも称され得、結合剤、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体によって特異的に結合され得る分子決定基（例えば、ポリペプチド決定基）である。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、特定の実施形態では、特異的な三次元構造特性及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。エピトープは、構造的又は機能的として定義され得る。機能的エピトープは、一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、直鎖状であっても立体構造的であってもよく、すなわち、非直鎖状アミノ酸から構成されていてもよい。抗体又は抗体の抗原結合断片によって認識されるエピトープは、抗体又は断片のＣＤＲ（例えば、相補的部位）と相互作用する抗原の構造要素である。エピトープは、抗体のＣＤＲと相互作用して特異性を生じさせるいくつかのアミノ酸残基からの寄与によって形成され得る。抗原断片は、２つ以上のエピトープを含み得る。特定の実施形態では、抗体は、タンパク質及び／又は高分子の複合混合物中のその標的抗原を認識する場合に、抗原に特異的に結合する。例えば、抗体が交差競合する（一方が他方の結合又は調節効果を妨げる）場合、抗体は「同じエピトープに結合する」と言われる。

【0044】

本明細書で使用される場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。更なる説明については、米国特許第６，２５８，５６２号の実施例１及びＪｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５、及びＪｏｈｎｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８を参照されたい。

【0045】

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」は、抗体又は抗原結合断片の、試料中の任意の他の分子又は成分と有意に会合又は結合しない一方で、１０^５Ｍ^－１（この会合反応に関するオン速度［Ｋ_ｏｎ］のオフ速度［Ｋ_ｏｆｆ］に対する比に等しい）以上の親和性又はＫ_ａ（すなわち、１／Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡会合定数）を有する抗原に対する、会合又は結合を指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）として定義され得る（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ）。

【0046】

抗体は、「高親和性」抗体又は「低親和性」抗体として分類することができる。「高親和性」抗体は、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１又は少なくとも１０^１３Ｍ^－１のＫ_ａを有する抗体を指す。「低親和性」抗体は、１０^７Ｍ^－１まで、１０^６Ｍ^－１まで、１０^５Ｍ^－１までのＫ_ａを有する抗体を指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）として定義され得る（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ）。

【0047】

「Ｋ_ｏｆｆ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についてのオフ速度定数を指すことが意図される。

【0048】

「Ｋ_ｄ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。

【0049】

「ＩＣ_５０」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の生物学的エンドポイントを阻害するのに必要な阻害剤の濃度を指すことが意図される。

【0050】

本明細書で使用される場合、「異種核酸配列」及び「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達及び発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。いくつかの実施形態によれば、「異種核酸」という用語は、接触する細胞又は対象に存在しない、それにより発現されない、又はそれに由来しない核酸（又は導入遺伝子）を指すことを意図する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を指示するのに十分な１つ以上のプロモーター又は他の調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドコード配列、他のベクター配列、又は逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加的に、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、又はリプレッサー）、１つ以上のイントロン、及び１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。

【0052】

本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基若しくは他の天然、化学的修飾若しくは生化学的修飾、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、又は当該技術分野で既知である方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。

【0053】

ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、又はこれらのグループの誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直鎖状の二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形ＤＮＡ、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルス性ベクター又は非ウイルス性ベクターの形態にあり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体又は修飾型骨格残基若しくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、及び天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体及び／又は修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、同様に、明示的に示された配列を暗黙的に包含する。

【0054】

「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。

【0055】

「塩基」には、プリン及びピリミジンが含まれ、それらには、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、並びにプリン及びピリミジンの合成誘導体が更に含まれ、それらには、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びアルキルハライドなどであるがこれらに限定されない新しい反応基を配置する修飾が含まれるが、これらに限定されない。

【0056】

本明細書で使用される場合、「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はそうでなければ天然に存在しなであろう様式で核酸のセグメントを含有するように修飾されるか、又は合成である、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。

【0057】

「ハイブリダイズ可能」又は「相補的」若しくは「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度及び溶液イオン強度の適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下で配列特異的、逆平行様式で別の核酸に「アニール」又は「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、及びシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。加えて、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝コードの縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であるとみなされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされないが、代わりに相補的であるとみなされる。

【0058】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コード及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。

【0059】

特定の抗体又はその抗原結合断片を「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡ及び／又はタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。

【0060】

本明細書で使用される場合、「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、及びパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端反復又は合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「Rep-binding sequence、ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）及び末端分離部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳ及び少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、及びプロウイルスレスキューを媒介する。予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補体でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を遂行することができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、３つ以上のＩＴＲ又は非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲ若しくは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得るか、又はＡＡＶ ＩＴＲ若しくは非ＡＡＶ ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ及びＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓｅｓ（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来し得るか、又はＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、及び／若しくは付加によって更に修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスは、２つの亜科：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ及び無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅからなる。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。

【0061】

「野生型ＩＴＲ」又は「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性及びＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶ又は他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲの核酸配列は、遺伝コード又はドリフトの縮退に起因して天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。

【0062】

本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」又は「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性及び全体的な三次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様によれば、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ又はＲＢＥ’）及び末端分解部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。

【0063】

本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」又は「ｍｏｄ－ＩＴＲ」又は「変異型ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの三次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの一部又は複数の変化をもたらし得、三次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその三次元構造）の変化をもたらし得る。

【0064】

本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも称される「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補体ではない単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの三次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の三次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、三次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アーム及び／又は短いＢ－Ｂ’アームを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、又は点変異に起因し得る。いくつかの実施形態によれば、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型又は合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる三次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、又は短いＢ－Ｂ’アームなど）を有し得る。

【0065】

本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して変異又は修飾され、それらの全長にわたって逆相補である単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。どちらのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、変異型ＩＴＲとも称される）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、又は点変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。

【0066】

本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」又は「実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性及び全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、三次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態によれば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチドを有し得るが、依然として同じ対称な三次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な三次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な三次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得、一部のＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性又は全体的な形状に影響を及ぼさず、それらが三次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（modified ITR、ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）又はデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。

【0067】

本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」（Internal ribosomal entry site、ＩＲＥＳ）は、ｍＲＮＡ配列の中央で翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列（＞５００ヌクレオチド）を指すことを意味する（Ｋｉｒｎ，ＪＩＴｅｔ ａｌ．，２０１１．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）：ｅｌ ８５５６、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＩＲＥＳ配列の使用は、ＩＲＥＳの前後の遺伝子の同時発現を確実にするが、ＩＲＥＳに続く配列は、ＩＲＥＳ配列に先行する配列よりも低いレベルで転写及び翻訳され得る。

【0068】

本明細書で使用される場合、「２Ａペプチド」は、ウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）、オセアアシグナウイルス（Ｔ２Ａ）、又はウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ））に由来する小さな自己切断ペプチドを指すことを意味する。２Ａという名称は、特に、２ＡペプチドのＯ末端におけるグリシル－プロリル結合でリボソームスキップをもたらすピコルナウイルスポリタンパク質の領域を指す（Ｋｉｍ，Ｊ．ＩＴ．ｅｔ ａｌ．２０１１．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。このスキップは、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドとの間の切断を生じる。

【0069】

「隣接する」という用語は、別の核酸配列に関する１つの核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣにおいて、ＢはＡ及びＣに隣接している。配列Ａ×Ｂ×Ｃについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前又は後に続くが、隣接される配列と連続している、又はすぐ隣である必要はない。いくつかの実施形態によれば、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。

【0070】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域を更に組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域を更に含み得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミド又はウイルスゲノムに組み込まれる。

【0071】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のため所望の距離で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミド又はバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供するか又は増大させる。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位などに便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの迅速な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、又は既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分離部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分離部位との間に組み込むことができる。

【0072】

本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、及び「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ ７８又はＡＡＶ Ｒｅｐ ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列及びその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ ＲＢＳ配列及び他の天然に既知の又は合成ＲＢＳ配列を含む、本開示の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖核酸配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’－（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）－３’に直接結合し、安定してアセンブリする。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基及びホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性又は低配列特異性であり、タンパク質－ＤＮＡ複合体を安定させる。

【0073】

本明細書で使用される場合、「末端分離部位」及び「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌデルタ又はＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態によれば、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態によれば、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲである場合、得られる産物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたヘキサヌクレオチド配列である５’－ＧＧＴＴＧＡ－３’を含む。任意の既知のＴＲＳ配列は、他の既知のＡＡＶ ＴＲＳ配列及び他の天然に既知の又はＡＧＴＴ、ＧＧＴＴＧＧ、ＡＧＴＴＧＧ、ＡＧＴＴＧＡなどの合成ＴＲＳ配列、並びにＲＲＴＴＲＲなどの他のモチーフを含む、本開示の実施形態において使用され得る。

【0074】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成又はその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指す。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願された国際出願第ＵＳ２０１７／０２０８２８号に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号及び２０１８年１２月６日に出願された同第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、その各々は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列及び構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの生成のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。

【0075】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。

【0076】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。

【0077】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。

【0078】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。

【0079】

本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。

【0080】

本明細書で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、又は発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞又は生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起された場合に細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生じる反応を触媒させ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。実験又は診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase、ＡＰ）、チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）、及び他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase、ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、並びに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0081】

本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、又は選択された薬剤若しくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを直接標的又は損傷する任意のタンパク質又はペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的化する制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的化するプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、及びリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の応答性の範囲及び複雑性を拡張する。

【0082】

転写調節因子は、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸）の転写を活性化又は抑制する転写アクチベーター及びリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、並びに細胞条件及び環境条件に応じて、アクチベーター又はリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、及びロイシン－ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0083】

本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」又は「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに作動可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制又は活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサー及び誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤又は環境入力の存在又は不在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合及び入力剤結合、又は応答性エレメント若しくはドメインを含む形態のモジュールである。

【0084】

本明細書で使用される場合、「担体」には、任意かつ全ての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

【0085】

本明細書で使用される場合、「入力剤応答性ドメイン」は、条件又は入力剤に結合するか、又はそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件若しくは入力の存在に対して応答性にするように、条件又は入力剤に応答する転写因子のドメインである。いくつかの実施形態によれば、条件又は入力の存在は、入力剤応答性ドメイン又はそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。

【0086】

「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中又は生物内で起こるアッセイ又はプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかによれば、方法又は使用は、細菌等の単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物又は植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞及び細胞株を含む）、形質転換細胞株、及び抽出組織又は細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法及び使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイ及び方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞又は細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。

【0087】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質又はＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子等の調節タンパク質及び分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含むように上流（５’配向）に伸びる。いくつかの実施形態によれば、本開示のプロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。

【0088】

本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質又は転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、１０～１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流又は遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内又はエキソン領域内に位置付けられ得る。

【0089】

プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、又は転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、及び「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置及び／又は配向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節することができる。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。

【0090】

プロモーターは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子又は配列と天然に関連するものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態によれば、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。

【0091】

いくつかの実施形態によれば、コード核酸セグメントは、「組換えプロモーター」又は「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方は、その自然環境において作動可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組換え又は異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在」しない合成プロモーター又はエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路及びモジュールに関して、ＰＣＲを含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。更に、ミトコンドリア、クロロプラスト等の非核性細胞小器官内の配列の転写及び／又は発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。

【0092】

本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子若しくは誘導剤の存在下、それによって影響される場合、又はそれによって接触される場合に、転写活性を開始又は強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」又は「誘導剤」は、内因性であり得るか、又は誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物又はタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子又は誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、又はタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写又は発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分又はモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が制御下にあり得、若しくは誘導性プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサー等のある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、及びマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、並びに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0093】

本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド若しくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／若しくは調節し、かつ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。

【0094】

本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」という用語は、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得るいくつかのヌクレオチドトリプレットの配列を指すことを意図する。オープンリーディングフレームは、好ましくは開始コドン、すなわちアミノ酸メチオニン（amino acid methionine、ＡＴＧ）を通常コードする３つの後続ヌクレオチドの組み合わせをその５’末端に含み、また通常３ヌクレオチドの倍数の長さを示す後続領域を含む。ＯＲＦは、好ましくは終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終結する。典型的には、これはオープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明の文脈におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えばＡＴＧ）で始まり、好ましくは停止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）で終わる、３で割ることができるいくつかのヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離されてもよく、又はより長い核酸配列、例えば本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれてもよい。

【0095】

「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分が、それらが意図された方法で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写又は発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーター又は他の調節配列に作動可能に連結されているＤＮＡ配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。

【0096】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本開示によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒト又は動物を指す。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び他の動物を含む。典型的には、対象は、ヒトである。例えば、対象は、成人、１０代の若者、小児（２歳～１４歳）、乳児（出生～２歳）、又は新生児（２ヶ月まで）であり得る。特定の態様において、対象は、最大４ヶ月齢、又は最大６ヶ月齢である。いくつかの態様によれば、成人は、約６５歳以上、又は約６０歳以上の高齢者である。いくつかの態様によれば、対象は、妊婦又は妊娠しようとしている女性である。他の態様において、対象はヒトではなく、例えば、非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、又はマカクである。特定の態様において、対象は、イヌ又はネコなどのペットであってもよい。

【0097】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物又はｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４^＋細胞）、人工多能性幹細胞、又はいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、又は生物におけるインサイチュ又はインビボの細胞であり得る。

【0098】

「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸又はポリペプチドをそのような細胞又は生物に導入することが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物等の生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）又はポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞又は生物における核酸又はポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現又はレベルをもたらすことが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物等の生物系に導入された核酸又はポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系又は細胞に対して天然である物質を指す。

【0099】

「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される、（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。

【0100】

本明細書で使用される場合、「相同性」又は「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性又は未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」とみなされる。

【0101】

本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸又はタンパク質には見られないヌクレオチド又はポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（又はそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードする核酸配列を生成し得る。あるいは、「異種」という用語は、細胞又は対象に天然には存在しない核酸配列を指す場合がある。

【0102】

「ベクター」又は「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入物」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、又は異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源及び／又は最終形態でウイルス性又は非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用される場合、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝子エレメントを包含する。いくつかの実施形態によれば、ベクターは、発現ベクター又は組換えベクターであり得る。

【0103】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、多くの場合、しかし必ずしもそうではないが、細胞にとって異種である。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、並びにクローニング及び増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及びプロセシングを含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合に、インビトロ又はインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、同様に、個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合及び含まれない場合がある。

【0104】

「組換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、又はインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態によれば、他の好適な組成物及び療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態によれば、ベクターはエピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。

【0105】

本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語及びそれらの変形は、組成物又は薬剤（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物又は薬剤の同時及び連続導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、及び実験方法を指し得る。「投与」は、インビトロ及びエクスビボ治療も包含する。組成物又は薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、又は局所を含む任意の好適な経路による。投与には、自己管理及び他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路によって実行され得る。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。

【0106】

本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、宿主への病原体の最初の侵入、及び病原体が宿主の細胞又は組織の中又は上に確立された状態を指す。このような状態は、必ずしも疾患を構成又は導くわけではない。

【0107】

本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、これらの反応の結果が対象にとって有益であるか有害であるかにかかわらず、外来抗原又は自己抗原のいずれかに対する対象の免疫系の任意の機能的発現を指すことを意味する。

【0108】

本明細書で使用される場合、用語「生物学的試料」とは、対象から単離された生物学的起源の任意の型の物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、及びタンパク質を含む）を指す。用語「生物学的試料」は、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体を含む。生物学的試料は、例えば限定されるものではないが、血液全体、血漿、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、頬側、皮膚、脳脊髄液、骨髄、胆汁、毛髪、筋生検、臓器組織又は当業者に公知の生物学的起源の他の物質を含む。生物学的試料は、診断若しくは研究のために対象から得ることができ、又は対照として、若しくは基礎研究のために健康な対象から得ることができる。

【0109】

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、異常細胞が制御されずに分裂し、他の組織に侵入することができる疾患を指す。１００を超える異なるタイプのがんが存在する。ほとんどのがんは、それらが始まる器官又は細胞のタイプに対して命名され、例えば、結腸で始まるがんは結腸がんと呼ばれ、皮膚のメラノサイトで始まるがんは、黒色腫と呼ばれる。がんのタイプは、より広いカテゴリーに分類することができる。がんの主なカテゴリーには、がん種（皮膚において、又は内臓を裏打ち若しくは被覆する組織において始まるがん、及びそのサブタイプを意味し、腺がん、基底細胞がん、扁平上皮細胞がん、及び移行上皮がんを含む）、肉腫（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、又は他の結合組織若しくは支持組織において始まるがんを意味する）、白血病（造血組織（例えば、骨髄）で始まり、多数の異常な血液細胞が産生されて血液に入る原因となるがんを意味する）、リンパ腫及び骨髄腫（免疫系の細胞で始まるがんを意味する）、並びに中枢神経系（central nervous system、ＣＮＳ）がん（脳及び脊髄の組織で始まるがんを意味する）が含まれる。「骨髄異形成症候群」という用語は、骨髄が十分な健康な血液細胞（白血球、赤血球、及び血小板）を作らず、血液及び／又は骨髄中に異常な細胞が存在するタイプのがんを指す。骨髄異形成症候群は、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）になり得る。特定の実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん、骨への転移がん、脳への転移がん、肝臓への転移がん、肺への転移がん、がん腫、子宮頸がん、絨毛がん、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myeloid leukemia、ＣＭＬ）、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん、妊娠性絨毛腫瘍（gestational trophoblastic tumour、ＧＴＴ）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性がん、奇胎妊娠、口腔及び中咽頭がん、骨髄腫、鼻腔・副鼻腔がん、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（non hodgkin lymphoma、ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん、子宮がん、膣がん、外陰がんを含むがこれらに限定されないがんから選択される。

【0110】

本明細書で使用される場合、「用量」という用語は、一度に対象に摂取又は投与される物質（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ）の量を指す。

【0111】

本明細書で使用される場合、「投薬」という用語は、治療目的（例えば、治療）を達成するための物質（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ）の投与を指す。

【0112】

「第２の薬剤と組み合わせた第１の薬剤」という句における「組み合わせ」という用語は、例えば、同じ薬学的に許容される担体に溶解又は混合されていてもよい第１の薬剤及び第２の薬剤の同時投与、又は第１の薬剤の投与に続いて第２の薬剤の投与、又は第２の薬剤の投与に続いて第１の薬剤の投与を含む。したがって、本開示は、併用治療処置の方法及び併用薬学的組成物を含む。

【0113】

「併用治療的処置」という句における「併用」という用語は、第２の薬剤の存在下で薬剤を投与することを含む。併用治療処置方法は、第１、第２、第３、又は追加の薬剤が同時投与される方法を含む。併用治療処置方法はまた、第１又は追加の薬剤が第２又は追加の薬剤の存在下で投与される方法を含み、ここで、第２又は追加の薬剤は、例えば、以前に投与されていてもよい。併用治療処置方法は、異なる行為者によって段階的に実行され得る。例えば、ある行為者が対象に第１の薬剤を投与してもよく、第２の行為者が対象に第２の薬剤を投与してもよく、第１の薬剤（及び追加の薬剤）が第２の薬剤（及び追加の薬剤）の存在下で投与後である限り、投与ステップは同時に、又はほぼ同時に、又は離れた時間に実行されてもよい。行為者及び対象は、同じ実体（例えば、ヒト）であってもよい。

【0114】

本明細書で使用される「併用療法」という用語は、２つ以上の治療物質（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片、及び別の薬物）の投与を指す。他の薬物は、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の投与と同時に、その前に、又はその後に投与され得る。

【0115】

本明細書で使用される場合、「核酸治療」、「治療用核酸」及び「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患又は障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬及びＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療剤の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）若しくは非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状の二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル形ＤＮＡミニマルベクター（「ダンベルＤＮＡ」）を含む。いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、ｃｅＤＮＡである。

【0116】

本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的又は間接的に、疾患症状の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的又は間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。

【0117】

本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究及び／又は動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。

【0118】

薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。

【0119】

本明細書で使用される場合、「ウイルス感染」は、対象の身体におけるウイルスの侵入及び増殖を指すことを意味する。

【0120】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅らせる、若しくは逆転させる、状態の臨床症状を実質的に改善する、又は状態の臨床症状の出現を実質的に防ぐ、有益な若しくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、以下：（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療される障害に特徴的な症状の発症を制限すること、（ｃ）治療される障害に特徴的な症状の悪化を制限すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者において障害の再発を制限すること、及び（ｅ）以前に障害に対して無症候性であった患者において症状の再発を制限すること、のうちの１つ以上を達成することを更に指す。

【0121】

薬理学的及び／又は生理学的効果等の有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。

【0122】

「治療を必要とする」者には、既に疾患若しくは障害、感染症、又はがんを有するヒトなどの哺乳動物が含まれる。

【0123】

本明細書で使用される場合、「増加する」、「増強する」、「上昇させる」という用語（及び同様の用語）は、一般に、天然、予測若しくは平均に対して、又は対照条件に対して、直接的又は間接的に、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を増加させる作用を指す。

【0124】

本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」及び／又は「低減する」という用語（並びに同様の用語）は、一般に、天然、予想若しくは平均に対して、又は対照条件に対して、直接的又は間接的に、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を低減する行為を指す。

【0125】

本明細書で使用される場合、「対照」は、参照標準を指すことを意図する。いくつかの実施形態では、対照は、健康な患者から得られた陰性対照試料である。他の実施形態では、対照は、疾患、傷害、感染症又はがんと診断された患者から得られた陽性対照試料である。更に他の実施形態では、対照は、歴史的な対照又は標準参照値若しくは値の範囲（以前に試験された対照試料、又はベースライン若しくは正常値を表す試料の群など）である。試験試料と対照との差は、増加であってもよく、又は逆に減少であってもよい。差は、質的差又は量的差、例えば統計的に有意な差であってもよい。いくつかの例によれば、差は、対照と比較して、少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、又は５００％超の増加又は減少である。

【0126】

本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」又は「含む（comprises）」という用語は、方法又は組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定エレメントの包含に対して開かれている、その組成物、方法、及びそれぞれの構成成分に関して使用される。

【0127】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規又は機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさないエレメントの存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。

【0128】

「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意のエレメントを除いて、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成成分を指す。

【0129】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、及び／又は本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、及び／又はステップを含む。同様に、「又は」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「及び」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料は、下記で説明される。省略形「例えば（e.g.）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、略語「例えば（e.g.）」は、「例えば（for example）」と同義である。

【0130】

作動例又は別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。「約」という用語は、パーセンテージに関連して使用される場合、±１％を意味し得る。本開示は、以下の実施例によって更に詳細に説明されるが、本開示の範囲は、それに限定されるべきではない。

【0131】

本明細書に開示される本開示の代替エレメント又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各郡のメンバーは、個別に、又は群の他のメンバー又は本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照及び主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、群に含まれるか、又は群から削除することができる。そのような任意の包含又は削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュグループの記述を満たす。

【0132】

本明細書では、本開示の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。

【0133】

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

【0134】

前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。

【0135】

本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。

【0136】

ＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターからの抗体又はその抗原結合断片の発現
本明細書に記載される技術は、一般に、１つ以上の非ウイルス性ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターからの細胞における抗体又はその抗原結合断片の発現及び／又は産生を対象とする。特に、抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、一対のＩＴＲ（例えば、本明細書に記載される対称又は非対称）、及びＩＴＲ対の間に、プロモーター又は調節配列に操作可能に連結された、本明細書に記載される抗体重鎖（ＨＣ）及び／又は抗体軽鎖（ＬＣ）、若しくはその部分をコードする核酸を含む。従来のＡＡＶベクター、更にはレンチウイルスベクターを超える、抗体若しくはその抗原結合断片の発現に対するｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望のＨＣ若しくはＬＣ又はＨＣ及びＬＣの双方をコードする核酸配列にサイズの制約がないことである。ＨＣ及びＬＣが同じｃｅＤＮＡ又は異なる培養ｃｅＤＮＡｓから発現され得ることは、本開示の特徴である。

【0137】

理解されるように、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター技術は、任意のレベルの複雑さに適合させることができるか、又は抗体（例えば、ＨＣ、ＬＣ、リンカー）の異なる成分の発現が独立した様式で制御され得るモジュール方式で使用することができる。例えば、本明細書中で設計されるｃｅＤＮＡベクター技術は、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、抗体、その抗原結合断片のＨＣ及びＬＣの両方又はその一部を発現するか、あるいは複数のｃｅＤＮＡベクターを使用することができ、ここで各ベクターは、同じ又は異なるプロモーターによって各々独立して制御されるＨＣ若しくはＬＣ又はその一部又は別の成分を発現することが企図される。以下の実施形態は、本明細書で具体的に企図され、必要に応じて当業者が適応させることができる。

【0138】

いくつかの実施形態によれば、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、単一のプロモーターの制御下で抗体又はその抗原結合断片のＬＣを発現させることができる。いくつかの実施形態によれば、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、単一のプロモーターの制御下で抗体又はその抗原結合断片のＨＣを発現させることができる。

【0139】

いくつかの実施形態によれば、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、単一のプロモーター（例えば、強力なプロモーター）の制御下で、抗体又はその抗原結合断片のＬＣ及びＨＣの双方を発現させることができ、任意選択的にＩＲＥＳ配列を使用して、各成分の適切な表現を保証する。

【0140】

また本明細書において、別の実施形態では、少なくとも２つの挿入物（例えば、ＨＣ又はＬＣを発現する）を含む単一のｃｅＤＮＡベクターが企図され、各挿入物の発現はそれ自体のプロモーターの制御下にある。プロモーターは、同じプロモーターの複数のコピー、複数の異なるプロモーター、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0141】

抗体の成分例えば、ＨＣ又はＬＣを異なる発現レベルで発現させ、したがって、発現される個々の成分の化学量論を制御して、以下により詳細に記載されるように、細胞における効率的な組み合わせを確実にすることが望ましいことが多いことは、本開示の知見である。

【0142】

いくつかの態様によれば、本開示は、抗体又はその抗原結合断片をコードする１つ以上の核酸配列を含む１つ以上のｃｅＤＮＡベクターを提供する。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の標的すなわち、抗原は、例えば細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫感染因子を含む様々な病原体から選択され得る。適切な標的は、がん又はがん関連抗原などを更に含み得る。更に他の標的は、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、ＲＡ）又は多発性硬化症（multiple sclerosis、ＭＳ）などの自己免疫状態を含み得る。

【0143】

特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合性断片は、その標的抗原に特異的に結合する。

【0144】

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」は、抗体又は抗原結合断片の、試料中の任意の他の分子又は成分と有意に会合又は結合しない一方で、１０^５Ｍ^－１（この会合反応に関するオン速度［Ｋ_ｏｎ］のオフ速度［Ｋ_ｏｆｆ］に対する比に等しい）以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡会合定数）を有する抗原に対する、会合又は結合を指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ）。

【0145】

いくつかの実施形態によれば、「特異的に結合する」という用語は、例えば、２５℃又は３７℃でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイ例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサー、又は表面プラズモン共鳴例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、又は溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、Ｋｄとして表される、抗原に対する結合親和性が少なくとも約１０^－８Ｍである抗原結合タンパク質を指す。

【0146】

抗体は、「高親和性」抗体又は「低親和性」抗体として分類することができる。「高親和性」抗体とは、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１又は少なくとも１０^１３Ｍ^－１のＫａを有する抗体を指す。「低親和性」抗体とは、１０^７Ｍ^－１まで、１０^６Ｍ^－１まで、１０^５Ｍ^－１までのＫａを有する抗体を指す。あるいは、親和性は、例えば、２５℃又は３７℃でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイ、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサーによって、又は表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって、又は溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定されるような、Ｍ単位（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ）との特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。

【0147】

特定の実施形態では、本開示の抗体は、病原体による感染を中和することができる。本明細書で使用される場合、「中和抗体」は、病原体が宿主において感染を開始及び／又は永続させる能力を中和すなわち、防止、阻害、低減、妨害、又は干渉することができるものである。用語「中和抗体」及び「中和する抗体（単数又は複数）」は、本明細書において互換的に使用される。本開示の実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合断片は、感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおいて感染を予防及び／又は中和することができる。

【0148】

従来のＡＡＶベクター、更にはレンチウイルスベクターよりもｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、抗体又はその抗原結合断片をコードする１つ以上の核酸配列にサイズの制約がないことである。更に、必要な化学量論に応じて、ＨＣ及びＬＣ（又はＨＣＶＲ若しくはＬＣＶＲ）のモル比を変化させることができ、最適な発現のために同じ又は異なるプロモーターを使用することができる。

【0149】

いくつかの実施形態によれば、所望の抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、第１のｃｅＤＮＡベクター中に抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列と、第２のｃｅＤＮＡベクター中に抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列とを含む。いくつかの実施形態によれば、ＬＣをコードする核酸配列は、第１のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態によれば、ＨＣをコードする核酸配列は、第２のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２のプロモーターは同じである。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２のプロモーターは異なる。

【0150】

いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターと、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターとは、（ＨＣ：ＬＣ）のモル比が１：１０～１：１０で混合され、共製剤化される。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターと、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターとは、（ＨＣ：ＬＣ）のモル比が３：１～１：１で混合され、共製剤化される。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターと、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターとは、（ＨＣ：ＬＣ）モル比が３：１で混合され、共製剤化される。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターと、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターとは、（ＨＣ：ＬＣ）モル比が２：１で混合され、共製剤化される。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターと、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターとは、（ＨＣ：ＬＣ）モル比が１．５：１で混合され、共製剤化される。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターと、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターとは、（ＨＣ：ＬＣ）モル比が３：１～２：１で混合され、共製剤化される。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列を含む第１のｃｅＤＮＡベクターと、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターとは、１：１０、５：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：５又は１：１０から選択される（ＨＣ：ＬＣ）モル比で混合され、共製剤化される。

【0151】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列と、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列とを含む。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片のＨＣをコードする核酸配列は、第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、抗体又はその抗原結合断片のＬＣをコードする核酸配列は、第２のＯＲＦを含み、第１のＯＲＦ及び第２のＯＲＦは、バイシストロニックプロモーターの制御下にある。

【0152】

例えば、本明細書で開示される抗体（例えば、ＨＣ、ＬＣ、ＨＶ、ＬＶ）の既知の及び／又は公的に利用可能なタンパク質配列を取り、ｃＤＮＡ配列を逆操作して、そのようなタンパク質をコードすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。次いで、意図される宿主細胞と一致するようにｃＤＮＡをコドン最適化し、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。

【0153】

ＩＩＩ．抗体及び融合タンパク質の産生に使用するための一般的なｃｅＤＮＡベクター
本開示の実施形態は、抗体又はその抗原結合断片を発現することができる、閉端線形二本鎖（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む方法及び組成物に基づく。本明細書に記載されるように、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の標的（すなわち、抗原）は、例えば細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫感染因子を含む様々な病原体から選択され得る。適切な標的は、がん又はがん関連抗原などを更に含み得る。更に他の標的は、関節リウマチ（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫状態を含み得る。

【0154】

いくつかの実施形態によれば、導入遺伝子は、抗体又はその抗原結合部分のＨＣ及びＬＣをコードする核酸配列である。いくつかの実施形態によれば、導入遺伝子は、抗体又はその抗原結合部分のＨＣをコードする核酸配列である。いくつかの実施形態によれば、導入遺伝子は、抗体又はその抗原結合部分のＬＣをコードする核酸配列である。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセット等の分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。

【0155】

一般に、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的の核酸配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＩＴＲ配列は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。

【0156】

抗体又はその抗原結合断片の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む方法及び組成物が本明細書に包含され、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系を更に含み得る。使用のために包含される非限定的な例示的リポソームナノ粒子系が、本明細書に開示されている。いくつかの態様によれば、本開示は、ｃｅＤＮＡ及びイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製及び負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。

【0157】

本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を許可する。

【0158】

図１Ａ～図１Ｅは、抗体及びその抗原結合断片の発現のための非限定的な例示的ｃｅＤＮＡベクターの概略図、又は対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはカプシドを含まず、第１のＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから得ることができる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を可能にする及び／又は制御する１つ以上の調節配列を含み得、例えば、発現カセットは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順番で含み得る。

【0159】

発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の成分、例えば、抗体及びその抗原結合断片の発現を制御及び調節するための調節スイッチを含み、所望であれば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。

【0160】

発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、若しくは２０，０００ヌクレオチド、若しくは３０，０００ヌクレオチド、若しくは４０，０００ヌクレオチド、又は５０，０００ヌクレオチド、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が効率的な導入遺伝子の発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、原核生物特異的メチル化を欠いている。

【0161】

発現カセット、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの発現構築物で提供される配列は、標的宿主細胞に対してコドン最適化され得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、目的の脊椎動物、例えばマウス又はヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧＥＮＥ ＦＯＲＧＥ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）又は別の公開データベースを使用して決定することができる。いくつかの実施形態によれば、核酸はヒト発現のために最適化される。

【0162】

本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためにｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、抗体及びその抗原結合断片をコードする。プラスミドベース発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合及び末端分離部位（Ｒｅｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＲＢＳ及びＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、ヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、並びに細菌型ＤＮＡメチル化、又は実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定的な例としてプロモーター又はエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。

【0163】

本明細書に提供される方法によって産生される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって決定される場合、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｄ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（具体的には、直鎖状対環状）及びこれらの異なる対象物（下記を参照されたい）を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。

【0164】

本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためにｃｅＤＮＡベクターを使用することには、プラスミドベースの発現ベクターよりもいくつかの利点があり、そのような利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核細胞特異的メチル化（例えば、６－メチルアデノシン及び５－メチルシトシンのメチル化）を受けるが、カプシド不含ＡＡＶベクター配列は、真核生物起源であり、原核細胞特異的メチル化を受けない、結果として、カプシドを含まないＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症応答及び免疫応答を誘導する可能性が低い、２）プラスミドは産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない、３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解を回避するために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスシスエレメント（すなわち、ＩＴＲ）を含有し、これは、ヌクレアーゼに対して耐性を付与し、核に標的化及び送達するように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小規定エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’‘（配列番号＿＿））及び末端分離部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴＧＧ－３’（ＡＡＶ２の場合）＋ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列；及び４）である。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｔｏｌｌ様ファミリーの受容体のメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発すると報告されている原核生物由来プラスミドにおいてしばしば見られるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞及び組織型を効率的に標的化し得る。

【0165】

Ａ．逆位末端反復（ＩＴＲ）
本明細書に開示されているように、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子又は核酸配列を含有し、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対又は対称若しくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系を更に含み得る。

【0166】

いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲ配列は、２つの亜科：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ、及び昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに由来し得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ（パルボウイルスと称される）は、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ディペンドウイルス族は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、並びに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）を含む。パルボウイルス及びＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に一般に記載されている。

【0167】

ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２ ＷＴ－ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、又は任意の合成ＡＡＶ由来のＩＴＲ。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウス由来微小ウイルス（Minute Virus from Mouse、ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）由来である。いくつかの実施形態によれば、本明細書で論じられるように、５’ＷＴ－ＩＴＲは、１つの血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。

【0168】

当業者であれば、ＩＴＲ配列が、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形又はＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａ及び図３Ａを参照されたい）、各ＷＴ－ＩＴＲが、より大きなパリンドロームアーム（Ａ－Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアーム又はループ（Ｂ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’）、並びに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップ又はフロップ配向を定義する）ことを知っている。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４－３７９、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９；２６１；８－１４に記載される、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６）由来のＩＴＲの構造解析及び配列比較を参照されたい。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡ－プラスミドで使用するための任意のＡＡＶ血清型からＷＴ－ＩＴＲ配列を容易に決定することができる。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６、並びにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）及びウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））由来のＩＴＲの配列比較を参照されたく、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９、他の血清型由来の左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの％同一性：ＡＡＶ－１（８４％）、ＡＡＶ－３（８６％）、ＡＡＶ－４（７９％）、ＡＡＶ－５（５８％）、ＡＡＶ－６（左ＩＴＲ）（１００％）、及びＡＡＶ－６（右ＩＴＲ）（８２％）を示す。

【0169】

（ｉ）対称ＩＴＲ対
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的の核酸配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称又は実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。代替的な実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称の三次元形状を有し得る。

【0170】

（ａ）野生型ＩＴＲ
いくつかの実施形態によれば、対称のＩＴＲ、又は実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態によれば、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。

【0171】

したがって、本明細書で開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの隣接する野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子又は核酸配列を含有し、互いに逆相補（逆位）であるか、又は代替的に互いに実質的に対称である。すなわち、ＷＴ－ＩＴＲ対は、対称の三次元空間構成を有する。いくつかの実施形態によれば、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）は、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＡＡＶ２の場合、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、配列番号＿＿）及び機能的末端分離部位（ＴＲＳ；例えば、５’－ＡＧＴＴ－３’）を含む。

【0172】

ある態様によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つのＷＴ逆位末端反復配列（WT inverted terminal repeat sequence、ＷＴ－ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態によれば、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称の三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。いくつかの実施形態によれば、５’ＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じ又は異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態によれば、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、互いの鏡像であり、すなわち、それらは対称である。いくつかの実施形態によれば、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型に由来する。

【0173】

ＷＴ ＩＴＲは周知である。ある実施形態によれば、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ２血清型に由来する。ある特定の実施形態では、他の血清型からのＷＴを使用することができる。相同であるいくつかの血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８がある。いくつかの実施形態によれば、密接に相同なＩＴＲ（例えば、類似のループ構造を有するＩＴＲ）を使用することができる。別の実施形態では、より多様なＡＡＶ ＷＴ ＩＴＲ、例えばＡＡＶ２及びＡＡＶ５を使用することができ、更に別の実施形態では、実質的にＷＴであるＩＴＲを使用することができる、すなわち、それはＷＴの基本ループ構造を有するが、特性を変更しないか又は影響しないいくつかの保存的ヌクレオチド変化を有する。同じウイルス血清型に由来するＷＴ－ＩＴＲを使用する場合、１つ以上の調節配列を更に使用することができる。特定の実施形態によれば、調節配列は、ｃｅＤＮＡの活性、例えば、コードされた抗体及びその抗原結合断片の発現の調整を可能にする調節スイッチである。

【0174】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターに関し、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの野生型逆位末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた、例えば、ＨＣ及び／又はＬＣをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、ＷＴ－ＩＴＲは、同じ血清型、異なる血清型に由来し得るか、又は互いに対して実質的に対称であり得る（すなわち、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるように対称の三次元空間構成を有するか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する）。いくつかの実施形態によれば、対称ＷＴ－ＩＴＲは、機能的末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態によれば、核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシドにはない。

【0175】

いくつかの実施形態によれば、ＷＴ－ＩＴＲは同じであるが、互いの逆相補体である。例えば、５’ＩＴＲの配列ＡＡＣＧは、対応する部位の３’ＩＴＲのＣＧＴＴ（すなわち、逆相補体）であり得る。一部の実施例によれば、５’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＡＴＣＧＡＴＣＧの配列を含み、対応する３’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＣＧＡＴＣＧＡＴ（すなわち、ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補体）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＷＴ－ＩＴＲ ｃｅＤＮＡは、末端分離部位及び複製タンパク質結合部位（replication protein binding site、ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位（replicative protein binding site）とも称される）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を更に含む。

【0176】

ＷＴ－ＩＴＲを含む、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＷＴ－ＩＴＲ配列は、ＷＴ－ＩＴＲの対（５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲ）を示す本明細書の表２に示されている。

【0177】

例示的な実施例として、本開示は、調節スイッチの有無にかかわらず、導入遺伝子（例えば、核酸配列）に作動可能に連結されたプロモーターを含む、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）ＷＴ－ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ－プラスミド（例えば、図１Ｆ～図１Ｇを参照されたい）から産生され、各ＷＴ－ＩＴＲは、そのヘアピン二次構成で同じ数の分子内二重化塩基対を有し（好ましくはこれらの参照配列と比較して、この構成のいかなるＡＡＡ又はＴＴＴ末端ループの欠失も除外する）、及び（ｂ）実施例１の未変性ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの特定のためのアッセイを使用してｃｅＤＮＡとして特定される。

【0178】

いくつかの実施形態によれば、隣接するＷＴ－ＩＴＲは、互いに実質的に対称である。この実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲが同一の逆相補体ではないように、５’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの１つの血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し得る。例えば、５’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、３’ＷＴ－ＩＴＲは、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶのうちのいずれかから選択される２つの異なるパルボウイルスから選択され得る。いくつかの実施形態によれば、ＷＴ ＩＴＲのそのような組み合わせは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６からのＷＴ－ＩＴＲの組み合わせである。いくつかの実施形態によれば、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲは、一方が他方のＩＴＲに対して反転されたときに、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、及びその間の全てのポイントであり、同じ対称の三次元空間構成を有する。いくつかの実施形態によれば、ＷＴ－ＩＴＲ対は、それらが対称の三次元空間構成を有する（例えば、Ａ、Ｃ－Ｃ’．Ｂ－Ｂ’、及びＤアームの同じ三次元構成を有する）ため、実質的に対称である。特定の実施形態によれば、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲ対は、他方に対して反転され、互いに対して、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、及びその間の全てのポイントであり、一方のＷＴ－ＩＴＲは、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を保持する。いくつかの実施形態では、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲ対は、互いに対して反転され、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、及びその間の全てのポイントであり、一方のＷＴ－ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号＿＿）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を保持する。相同性は、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）、デフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなど、当該技術分野で周知の標準的な手段によって決定することができる。

【0179】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲの核酸配列、２つ以上のエレメント間の空間、又は上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、Ａ及びＡ’アーム、Ｂ及びＢ’アーム、Ｃ及びＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）及びＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、並びに末端分離部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。

【0180】

単なる例として、表２は、ＷＴ－ＩＴＲの例示的な組み合わせを示す。

【0181】

表２：同じ血清型若しくは異なる血清型、又は異なるパルボウイルスからのＷＴ－ＩＴＲの例示的な組み合わせ。示されている順序は、ＩＴＲ位置を示すものではなく、例えば、「ＡＡＶ１、ＡＡＶ２」は、ｃｅＤＮＡが５’位置にＷＴ－ＡＡＶ１ ＩＴＲ及び３’位置にＷＴ－ＡＡＶ２ ＩＴＲ、又はその逆、５’位置にＷＴ－ＡＡＶ２ ＩＴＲ及び３’位置にＷＴ－ＡＡＶ１ ＩＴＲを含み得ることを明示する。略称：ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、又はＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノム（例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ ００６２６１）、温血動物由来のＩＴＲ（トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジＡＡＶ）、Ｂ１９パルボウイルス由来のＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウス由来微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウ：ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビ：ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）。

【0182】

【表2-1】

【0183】

【表2-2】

【0184】

【表2-3】

【0185】

単なる例として、表３は、いくつかの異なるＡＡＶ血清型からの例示的なＷＴ－ＩＴＲの配列を示す。

【0186】

【表3】

【0187】

いくつかの実施形態によれば、ＷＴ－ＩＴＲ配列の核酸配列は、（例えば、１、２、３、４若しくは５個以上のヌクレオチド又はその中の任意の範囲を修飾することにより）修飾され得、それにより修飾は、相補的ヌクレオチドの置換、例えば、Ｃの場合はＧ、及びその逆、Ａの場合はＴ、及びその逆である。

【0188】

本開示の特定の実施形態では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、配列番号１、２、５～１４のうちのいずれかから選択される核酸配列からなるＷＴ－ＩＴＲを有さない。本開示の代替実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターが、配列番号１、２、５～１４のうちのいずれかから選択される核酸配列を含むＷＴ－ＩＴＲを有する場合、隣接するＩＴＲもＷＴであり、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、本明細書及び国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号に開示されているように、調節スイッチを含む（例えば、国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表１１を参照されたい）。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、及び配列番号１、２、５～１４からなる群のうちのいずれかから選択される核酸配列を有する選択されたＷＴ－ＩＴＲを含む。

【0189】

本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、作動可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ’部分を保持するＷＴ－ＩＴＲ構造を含み得る。例示の目的で野生型ＩＴＲを使用する図２Ａ及び図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の作動のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号＿＿））及び末端分離部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴ）を含む、１つ以上の機能的ＷＴ－ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲは、機能的である。抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが互いに実質的に対称である２つのＷＴ－ＩＴＲを含む代替的な実施形態では、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲが機能的であり、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲが非機能的である。

【0190】

Ｂ．非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターの一般的な修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）
本明細書で論じられるように、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対称ＩＴＲ対又は非対称ＩＴＲ対を含み得る。どちらの場合も、一方又は両方のＩＴＲは修飾型ＩＴＲであり得、その違いは、第１の場合（すなわち、対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、同じ三次元空間構成を有する（すなわち、同じＡ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’アーム構成を有する）が、第２の場合（すなわち、非対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、異なる三次元空間構成を有する（すなわち、Ａ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’アームの異なる構成を有する）ことである。

【0191】

いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されるＩＴＲである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクター中のＩＴＲのうちの少なくとも一方は、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＡＡＶ２の場合、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’）及び機能的末端分離部位（ＴＲＳ；例えば、５’－ＡＧＴＴ－３’）を含むいくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの少なくとも一方は、非機能的ＩＴＲである。いくつかの実施形態によれば、異なる又は修飾型ＩＴＲは各々、異なる血清型からの野生型ＩＴＲではない。

【0192】

ＩＴＲの特定の変更及び変異が本明細書において詳細に説明されているが、ＩＴＲの文脈では、「変更型」又は「変異型」又は「修飾型」とは、ヌクレオチドが野生型、参照、又は元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、及び／又は置換されたことを示す。変更型又は変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人間の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人間の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。

【0193】

いくつかの実施形態によれば、ｍｏｄ－ＩＴＲは、合成であり得る。いくつかの実施形態によれば、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶベース配列を含まない。更に別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、又は全く有しない。いくつかの態様によれば、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐ又は特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、又はいくつかの場合によれば、野生型Ｒｅｐによって認識されず、変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。

【0194】

当業者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、又はＤ領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）又は他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本開示は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからｍｏｄ－ＩＴＲを含む集団及び複数のｃｅＤＮＡベクターを更に提供する。すなわち、１つのｍｏｄ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のｍｏｄ－ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一部の実施形態によれば、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に由来し得るか、又はそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、又はＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、又はそれに基づき得る。

【0195】

任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、又は塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロン及び骨格筋を選好的に標的化し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、及び光受容体を標的化する。ＡＡＶ６は、骨格筋及び肺を選好的に標的化する。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、及び膵臓組織を選好的に標的化する。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、及び肺組織を選好的に標的化する。いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲに基づいている。

【0196】

より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントの核酸配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、及びｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり得、Ａ若しくはＡ’アーム又はＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５ ＩＴＲであり得、Ｃ又はＣ’アーム、ＲＢＥ、及びｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ５ ＩＴＲであり得、Ｂ及びＢ’アームは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｂ及びＢ’アームで置き換えられる。

【0197】

単なる例として、表４は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対する、そのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を示す。いくつかの実施形態では、Ｃ及び／又はＣ’及び／又はＢ及び／又はＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ－Ｃ’アーム、若しくは単一Ｂ－Ｂ’アーム）、又は修飾型Ｃ－Ｂ’アーム若しくはＣ’－Ｂアーム、又は少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ－Ｃ’アーム及び／若しくは切断されたＢ－Ｂ’アーム）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一アーム、又は２つのアームＩＴＲのアーム（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態によれば、切断されたＣ－Ｃ’アーム及び／又は切断されたＢ－Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。

【0198】

表４：ＩＴＲの異なるＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’領域又はアームに対する少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）の例示的な組み合わせ（Ｘは、ヌクレオチド修飾、例えば、領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を示す）。

【0199】

【表4】

【0200】

いくつかの実施形態では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するためのｍｏｄ－ＩＴＲは、本明細書に開示される非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含み、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、及びＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態によれば、Ｃ若しくはＣ’又はＢ若しくはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、依然としてステム－ループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態によれば、ＣとＣ’との間及び／又はＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替的な実施形態では、ＣとＣ’との間及び／又はＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ａヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態によれば、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、及び／又はＤから選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。例えば、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）も含み得る。いくつかの実施形態によれば、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。いくつかの実施形態によれば、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ及び／又はＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。いくつかの実施形態によれば、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。

【0201】

いくつかの実施形態によれば、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０以上のヌクレオチド、又はその中の任意の範囲を修飾することによって）、修飾型構造エレメントを産生することができる。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲに対する特定の修飾が本明細書に例示されているか（例えば、配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７）、又は２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７Ａ～図７Ｂに示されている（例えば、国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の配列番号９７～９８、１０１～１０３、１０５～１０８、１１１～１１２、１１７～１３４、５４５～５４）。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０以上のヌクレオチド、又はその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７の修飾型ＩＴＲのうちの１つ、又は配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７、又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号の表２～９（すなわち、配列番号１１０～１１２、１１５～１９０、２００～４６８）に示されている、Ａ－Ａ’アーム及びＣ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクションと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有し得る。

【0202】

いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ－Ａ’アームの全部若しくは一部、又はＢ－Ｂ’アームの全部若しくは一部、又はＣ－Ｃ’アームの全部若しくは一部の除去又は欠失、又は代替的にステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去（例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７ＡのＩＴＲ－２１を参照されたい）を含み得る。いくつかの実施形態によれは、修飾型ＩＴＲは、Ｂ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去を含み得る（例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図３ＢのＩＴＲ－１又は図７ＡのＩＴＲ－４５を参照されたい）。いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去、及びＢ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ－Ｃ’アームにおける６つの塩基対、及びＢ－Ｂ’アームにおける２つの塩基対が除去され得る。例示的な実施例として、図３Ｂは、修飾型ＩＴＲが、少なくとも１つのアーム（例えば、Ｃ－Ｃ’）が切断される２つのアームを含むように、Ｃ部分及びＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７つの塩基対、Ｃ領域とＣ’領域との間のループ中のヌクレオチドの置換、並びにＢ領域及びＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を有する例示的な修飾型ＩＴＲを示す。いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲはまた、Ｂ領域及びＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を含み、それによりＢ－Ｂ’アームもＷＴ ＩＴＲに対して切断される。

【0203】

いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１～５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、全長ＷＴ ＩＴＲ配列に対して１～３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２～２０ヌクレオチド欠失を有する。

【0204】

いくつかの実施形態によれば、修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、若しくは末端分離部位でのニッキング）に干渉しないように、Ａ又はＡ’領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含まない。いくつかの実施形態によれば、本明細書における使用のために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、及び／又はＣ領域に１つ以上の欠失を有する。

【0205】

いくつかの実施形態によれば、対称ＩＴＲ対又は非対称ＩＴＲ対を含む抗体及び抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される調節スイッチ、及び配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、又は１６５～１８７からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを含む。

【0206】

別の実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さ及び／又はループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、若しくは９ヌクレオチド以上、又はその中の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態によれば、ステムの高さは、約５ヌクレオチド～約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施形態では、ステム高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施例では、ステムの高さは、約３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０ヌクレオチド以上、又はその中の任意の範囲を有し得る。

【0207】

別の実施形態では、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位又はＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加又は減少され得る。一部の実施例によれば、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、若しくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、又はその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列又はＧＡＧＹと同様の配列であり得る。

【0208】

別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥ及びヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加又は減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくは２１ヌクレオチド以上、又はその中の任意の範囲であり得る。

【0209】

本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として作動可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ’部分を保持する。図２Ａ及び図２Ｂは、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’）及び末端分離部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴ）を含む、１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型又は修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、又は非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替的な実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。

【0210】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左又は右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断型アーム、又はスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断型アーム、又はスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表２（すなわち、配列番号１３５～１９０、２００～２３３）、表３（例えば、配列番号２３４～２６３）、表４（例えば、配列番号２６４～２９３）、表５（例えば、本明細書の配列番号２９４～３１８）、表６（例えば、配列番号３１９～４６８）、及び表７～９（例えば、配列番号１０１～１１０、１１１～１１２、１１５～１３４）、又は表１０Ａ若しくは１０Ｂ（例えば、配列番号９、１００、４６９～４８３、４８４～４９９）に列挙されている。

【0211】

いくつかの実施形態によれば、非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含む、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための修飾型ＩＴＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号の表２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０Ａ～１０Ｂに示されるもののうちのいずれか、又はそれらの組み合わせから選択される。

【0212】

上記のクラスの各々に非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含む抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための追加の例示的な修飾型ＩＴＲを表５Ａ及び５Ｂに示す。表５Ａの右修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７Ａに示されており、表５Ｂの左修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図７Ｂに示されている。

【0213】

表５Ａ及び表５Ｂは、例示的な右及び左修飾型ＩＴＲの配列番号を列挙する。

【0214】

表５Ａ：例示的な修飾型右ＩＴＲ。これらの例示的な修飾型右ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ）、スペーサー相補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ、及びＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥの相補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣを含み得る。

【0215】

【表5A】

【0216】

表５Ｂ：例示的な修飾型左ＩＴＲ。これらの例示的な修飾型左ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ、スペーサー相補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ、及びＲＢＥ相補体（ＲＢＥ’）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣを含み得る。

【0217】

【表5B】

【0218】

いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに非対称である、すなわち、それらは互いに異なる三次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得るか、又はその逆であり、第１のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態によれば、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、両方ともｍｏｄ－ＩＴＲであるが、異なる配列を有するか、又は異なる修飾を有し、したがって同じ修飾型ＩＴＲではなく、異なる三次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する一部のＩＴＲによる任意の変化が他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを含むか、代替的には、非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合、互いに対して異なる配列及び異なる三次元形状を有し得る。抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ－プラスミドを生成するために使用するための例示的な非対称ＩＴＲは、表５Ａ及び図５Ｂに示されている。

【0219】

代替的な実施形態では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つの対称的なｍｏｄ－ＩＴＲを含む。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ配列を有するが、互いの逆相補体（逆位）である。いくつかの実施形態によれば、対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、同じＡＡＶ血清型からの野生型ＩＴＲ配列と比較して、欠失、挿入、又は置換の少なくとも１つ又は任意の組み合わせを含む。対称ＩＴＲの付加、欠失、又は置換は同じであるが、互いの逆相補体である。例えば、５’ＩＴＲのＣ領域への３ヌクレオチドの挿入は、３’ＩＴＲのＣ’領域の対応するセクションへの３つの逆相補ヌクレオチドの挿入に反映される。単に説明の目的でのみ、付加が５’ＩＴＲのＡＡＣＧである場合、付加は、対応する部位における３’ＩＴＲのＣＧＴＴである。例えば、５’ＩＴＲセンス鎖がＡＴＣＧＡＴＣＧであり、ＧとＡとの間にＡＡＣＧの付加を伴う場合、配列ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧがもたらされる。対応する３’ＩＴＲセンス鎖は、ＣＧＡＴＣＧＡＴ（ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補体）であり、ＴとＣとの間にＣＧＴＴ（すなわち、ＡＡＣＧの逆相補体）の付加を伴い、配列ＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴ（ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧの逆相補体）をもたらす。

【0220】

代替的な実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称の三次元形状を有し得る。例えば、１つの修飾型ＩＴＲは、１つの血清型に由来し得、他の修飾型ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得るが、それらは同じ領域において同じ変異（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、又は置換）を有する。言い換えると、単なる説明の目的で、５’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、Ｃ領域に欠失を有し、３’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ５に由来し得、Ｃ’領域に対応する欠失を有する。５’ｍｏｄ－ＩＴＲ及び３’ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ又は対称な三次元空間構成を有することを条件として、それらは本明細書における修飾型ＩＴＲ対としての使用に包含される。

【0221】

いくつかの実施形態によれば、実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。単なる例として、実質的に対称のＩＴＲは、それらの構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、対称空間構成を有し得る。これは、例えば、Ｇ－Ｃ対が、例えばＣ－Ｇ対に、若しくはその逆に修飾されたとき、又はＡ－Ｔ対がＴ－Ａ対に、若しくはその逆に修飾されたときに起こり得る。したがって、上記の例示的な例であるＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧとしての修飾型５’ＩＴＲ、及びＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴとしての修飾型３’ＩＴＲ（すなわち、ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧの逆相補体）を使用して、これらの修飾型ＩＴＲは、例えば、５’ＩＴＲがＡＴＣＧＡＡＣＣＡＴＣＧの配列を有する場合、依然として対称であろう（ここで、付加におけるＧが、Ｃに修飾され、実質的に対称な３’ＩＴＲが、ＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴの配列を有し、ａに加えてＴの対応する修飾がない）。いくつかの実施形態によれば、そのような修飾型ＩＴＲ対は、修飾型ＩＴＲ対が対称な立体化学を有するので、実質的に対称である。

【0222】

表６は、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための、例示的な対称の修飾型ＩＴＲ対（すなわち、左修飾型ＩＴＲ及び対称右修飾型ＩＴＲ）を示す。配列の太字（赤）部分は、図３１Ａ～図４６Ｂにも示される、部分的なＩＴＲ配列（すなわち、Ａ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの配列）を特定する。これらの例示的な修飾型ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ、スペーサー相補体及びＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥの相補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣを含み得る。

【0223】

表６：抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける例示的な対称の修飾型ＩＴＲ対

【0224】

【表6-1】

【0225】

【表6-2】

【0226】

【表6-3】

【0227】

いくつかの実施形態によれば、非対称ＩＴＲ対を含む抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の表５Ａ～５Ｂのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列若しくはＩＴＲ部分配列、あるいは２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号（その全体が本明細書に組み込まれる）の図７Ａ～図７Ｂに示されているか、又は２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０Ａ～１０Ｂに開示されている配列における修飾のうちのいずれかに対応する修飾を有するＩＴＲを含み得る。

【0228】

Ｂ．例示的なｃｅＤＮＡベクター
上記のように、本開示は、組換えｃｅＤＮＡ発現ベクター、及び上記の非対称ＩＴＲ対、対称ＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対のうちのいずれか１つを含む、抗体及びその抗原結合断片をコードするｃｅＤＮＡベクターに関する。特定の実施形態では、本開示は、隣接するＩＴＲ配列及び導入遺伝子を有する抗体及びその抗原結合断片の発現のための組換えｃｅＤＮＡベクターに関し、ＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称であり、ｃｅＤＮＡは、隣接するＩＴＲの間に位置する目的の核酸配列（例えば、導入遺伝子の核酸を含む発現カセット）を更に含み、当該核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。

【0229】

抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも１つのＩＴＲが変更されている場合、本明細書に記載される核酸配列を含む組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる任意のｃｅＤＮＡベクターであってもよい。本開示の抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターが導入される宿主細胞と適合性がある。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、直鎖状であってもよい。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、染色体外実体として存在し得る。ある特定の実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞のゲノムへのドナー配列の組み込みを可能にするエレメントを含有し得る。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」、「核酸配列」及び「異種核酸配列」は同義であり、本明細書に記載されるように、抗体及びその抗原結合断片をコードする。

【0230】

ここで図１Ａ～図１Ｇを参照すると、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを作製するのに有用な２つの非限定的プラスミドの機能的構成成分の概略図が示されている。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、及び図１Ｆは、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの構築物又は対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット、及び第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１及び第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称である。抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子（タンパク質又は核酸）、及び第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１及び第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称である。いくつかの実施形態によれば、発現可能な導入遺伝子カセットは、必要に応じて、エンハンサー／プロモーター、１つ以上の相同性アーム、ドナー配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ、例えば、配列番号６７））、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ、例えば、配列番号６８）を含む。

【0231】

図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡは、上記の図４Ａに関して、及び実施例で論じられるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。

【0232】

（ｉ）．調節エレメント
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせを更に含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0233】

いくつかの実施形態によれば、様々なシス調節エレメントの配列は、２０２１年３月２４日に出願された国際出願第ＵＳ２０２１／０２３８９１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているもののいずれかから選択することができる。

【0234】

実施形態では、第２の核酸配列は、調節配列、及びヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子調節配列は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節配列は、宿主細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するのに適している。ある特定の実施形態では、調節配列は、本開示のヌクレアーゼをコードする核酸配列などのプロモーター配列に作動可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の核酸配列は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。ある特定の実施形態では、調節配列は、エンハンサー及びプロモーターを含み、第２の核酸配列は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。

【0235】

好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、又はそれらは、原核生物又は真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus major late promoter、Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ即時型初期プロモーター領域（CMV immediate early promoter region、ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（rous sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号８０）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、増強されたＵ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号８１又は配列番号１５５）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号８２）などが挙げられる。ある特定の実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。

【0236】

いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（human ubiquitin C、ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。

【0237】

いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。更なる実施形態によれば、組織特異的プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合性断片は、肝臓に標的化され、かつ／又は肝臓特異的プロモーターによって肝臓において産生される。

【0238】

当技術分野で公知の任意の肝臓特異的プロモーターが、本開示における使用のために企図される。いくつかの実施形態によれば、肝臓特異的プロモーターは、天然又は合成のヒトα１－アンチトリプシン（ＨＡＡＴ）から選択されるが、これらに限定されない。一実施形態によれば、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（low density lipoprotein、ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。

【0239】

本開示に従って使用するための適切なプロモーターの非限定的な例としては、以下のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない：ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＩＥ２プロモーター及びラットＥＦ１－αプロモーター、ｍＥＦ１プロモーター、又は１Ｅ１プロモーター断片が挙げられる。

【0240】

いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、２０２１年３月２４日に出願された国際出願第ＵＳ２０２１／０２３８９１号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される任意のプロモーター配列から選択することができる。

【0241】

（ｉｉ）．ポリアデニル化配列：
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、及び核輸送及び翻訳を助けるために、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又はそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、又はその間の任意の範囲を含む。

【0242】

発現カセットは、当技術分野で既知の任意のポリアデニル化配列又はその変形を含むことができる。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（upstream enhancer、ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＵＳＥ配列は、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。ポリＡ配列は、抗体及びその抗原結合断片をコードする導入遺伝子の３’に位置する。

【0243】

いくつかの実施形態によれば、ポリアデニル化配列は、２０２１年３月２４日に出願された国際出願第ＵＳ２０２１／０２３８９１号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される任意のポリアデニル化配列から選択することができる。

【0244】

発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態によれば、ウッドチャック肝炎ウイルス（Woodchuck Hepatitis Virus、ＷＨＰ）転写後調節エレメント（posttranscriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。

【0245】

いくつかの実施形態によれば、転写後調節エレメントは、２０２１年３月２４日に出願された国際出願第ＵＳ２０２１／０２３８９１号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている任意の転写後調節エレメント配列から選択することができる。

【0246】

いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片をコードする１つ又は複数の核酸配列は、タンパク質がゴルジ装置及び小胞体に向けられ、それがＥＲを通過して細胞から出る際にシャペロン分子によって正しい立体構造に折りたたまれるように、分泌配列もコードすることができる。例示的な分泌配列には、ＶＨ－０２及びＶＫ－Ａ２６及びＩｇＫシグナル配列、並びにタグ付きタンパク質が細胞質から分泌されるのを可能にするＧｌｕｃ分泌シグナル、タグ付きタンパク質をゴルジ体に向けるＴＭＤ－ＳＴ分泌配列が含まれるが、これらに限定されない。

【0247】

いくつかの実施形態によれば、分泌配列は、２０２１年３月２４日に出願された国際出願第ＵＳ２０２１／０２３８９１号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される任意の分泌配列から選択することができる。

【0248】

（ｉｉｉ）核局在化配列
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上の核局在化配列（nuclear localization sequence、ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のＮＬＳは、アミノ末端又はその近く、カルボキシ末端又はその近く、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳ及び／又はカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）に位置する。複数のＮＬＳが存在する場合、各々を他のＮＬＳから独立して選択することができ、それにより、単一のＮＬＳが複数のコピーに、及び／又は一部又は複数のコピーに従って存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在する。

【0249】

いくつかの実施形態によれば、ＮＬＳは、２０２１年３月２４日に出願された国際出願第ＵＳ２０２１／０２３８９１号に開示されている任意のＮＬＳから選択することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0250】

Ｃ．例示的なｃｅＤＮＡ抗ＣｏＶ－２ Ｓベクター
いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片を含む少なくとも１つの核酸配列を含む例示的なカプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターとして、ｃｅＤＮＡ構築物は、表７に示される構築物から選択される。

【0251】

【表7】

【0252】

いくつかの実施形態によれば、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、以下に示すように、配列番号４０４を含むｃｅＤＮＡ－１８５６である。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡ ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴ ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡ ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ ＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧ ＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴ ＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡ ＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣ ＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧ ＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡ ＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣ ＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣ ＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡ ＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣ ＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣ ＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣ ＣＧＣＧＧＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧ ＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣ ＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣ ＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧ ＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣ ＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧ ＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧ ＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧ ＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡ ＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡ ＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴ ＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡ ＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴ ＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧ ＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡ ＴＴＡＡＣＣＡＡＧＧ ＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴ ＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧ ＧＣＴＡＡＧＴＣＣＡ ＣＧＧＴＡＣＣＣＡＣ ＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧ ＴＴＧＡＧＴＡＡＧＡ ＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡ ＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣ ＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣ ＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧ ＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧ ＡＡＣＡＧＧＧＧＣＣ ＧＧＧＣＧＡＴＣＡＧ ＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣ ＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ ＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴ ＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧ ＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴ ＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣ ＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣ ＣＴＡＧＧＣＡＡＧＧ ＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧ ＴＧＴＡＧＧＴＴＡＣ ＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴ ＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴ ＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡ ＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧ ＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡ ＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧ ＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧ ＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴ ＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧ ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡ ＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣ ＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣ ＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧ ＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣ ＴＣＣＴＧＡＡＧＡＧ ＧＴＡＡＧＧＧＴＴＴ ＡＡＧＧＧＡＴＧＧＴ ＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧ ＧＧＴＡＴＴＡＡＴＧ ＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣ ＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴ ＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣ ＡＣＴＴＴＴＴＴＴＣ ＡＧＧＴＴＧＧＧＴＴ ＴＡＡＡＣＣＧＣＡＧ ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡ ＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧ ＣＣＣＧＣＣＣＡＧＣ ＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴ ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ ＴＧＧＣＴＧＴＣＣＧ ＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧ ＣＧＡＡＡＴＣＧＴＧ ＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡ ＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣ ＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＣＧＧＣＧ ＡＡＣＧＧＧＣＴＡＣ ＣＣＴＧＴＣＴＴＧＴ ＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣ ＡＧＡＣＣＧＴＧＴＣ ＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴ ＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡ ＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧ ＧＣＴＣＣＴＡＧＡＣ ＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡ ＣＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＡ ＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣ ＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣ ＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧ ＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣ ＴＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＴＡ ＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡ ＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣ ＴＴＴＧＣＣＧＴＧＴ ＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡ ＧＣＡＡＣＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡ ＣＡＴＴＣＧＧＣＧＧ ＣＧＧＡＡＣＣＡＡＡ ＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡ ＡＧＣＧＧＡＣＣＧＴ ＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡ ＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣ ＴＡＧＣＧＡＣＧＡＧ ＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴ ＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣ ＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡ ＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡ ＣＣＣＴＣＧＣＧＡＧ ＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣ ＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴ ＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧ ＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡ ＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣ ＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧ ＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡ ＣＴＣＴＡＣＡＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡ ＧＣＡＣＡＣＴＧＡＣ ＣＣＴＣＡＧＣＡＡＧ ＧＣＣＧＡＴＴＡＣＧ ＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡ ＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧ ＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣ ＣＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡ ＴＡＧＡＧＧＣＧＡＡＴＧＴＴＧＡＴＡＧＴ ＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧ ＣＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＣＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴ ＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧ ＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡ ＡＡＴＧＴＴＡＡＴＡ ＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＡＴ ＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＧＧＧＡＴＡ ＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧ ＴＡＴＴＧＣＣＡＣＡ ＡＧＡＣＡＡＡＣＡＴ ＧＴＴＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡ ＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡ ＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴ ＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡ ＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡ ＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣ ＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴ ＧＴＧＴＧＧＡＴＡＴ ＧＣＴＧＣＴＴＴＡＴＡＧＣＣＴＣＴＧＴＡ ＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡ ＣＧＧＣＴＴＴＣＧＴ ＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣ ＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴ ＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴ ＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴ ＣＣＧＴＣＡＡＣＧＴ ＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴ ＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴ ＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣ ＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣ ＣＣＣＣＴＣＣＣＧＡ ＴＣＧＣＣＡＣＧＧＣ ＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣ ＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧ ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧ ＧＣＴＡＧＧＴＴＧＣ ＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡ ＴＡＡＴＴＣＣＧＴＧ ＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧ ＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡ ＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴ ＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣ ＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣ ＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣ ＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣ ＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴ ＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡ ＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧ ＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡ ＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧ ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ ＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡ ＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧ ＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧ ＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴ ＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧ ＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴ ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧ ＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡ ＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧ ＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡ ＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣ ＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣ ＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣ ＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ ＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴ ＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣ ＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣ ＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣ ＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧ ＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧ ＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧ ＣＡＧＧ

【0253】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号４０４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。

【0254】

いくつかの実施形態によれば、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、以下に示すように、配列番号４０５を含むｃｅＤＮＡ－１８５９である。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡ ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴ ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡ ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ ＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧ ＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣ ＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴ ＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡ ＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣ ＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧ ＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡ ＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣ ＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣ ＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡ ＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣ ＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣ ＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣ ＣＧＣＧＧＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧ ＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣ ＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣ ＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧ ＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣ ＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧ ＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧ ＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧ ＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡ ＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡ ＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴ ＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡ ＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴ ＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧ ＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡ ＴＴＡＡＣＣＡＡＧＧ ＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴ ＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧ ＧＣＴＡＡＧＴＣＣＡ ＣＧＧＴＡＣＣＣＡＣ ＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧ ＴＴＧＡＧＴＡＡＧＡ ＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡ ＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣ ＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣ ＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧ ＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧ ＡＡＣＡＧＧＧＧＣＣ ＧＧＧＣＧＡＴＣＡＧ ＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣ ＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ ＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴ ＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧ ＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴ ＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣ ＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣ ＣＴＡＧＧＣＡＡＧＧ ＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧ ＴＧＴＡＧＧＴＴＡＣ ＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴ ＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴ ＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡ ＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧ ＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡ ＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧ ＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧ ＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴ ＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧ ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡ ＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣ ＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣ ＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧ ＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣ ＴＣＣＴＧＡＡＧＡＧ ＧＴＡＡＧＧＧＴＴＴ ＡＡＧＧＧＡＴＧＧＴ ＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧ ＧＧＴＡＴＴＡＡＴＧ ＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣ ＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴ ＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣ ＡＣＴＴＴＴＴＴＴＣ ＡＧＧＴＴＧＧＧＴＴ ＴＡＡＡＣＣＧＣＡＧ ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡ ＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧ ＴＣＣＴＧＧＧＴＣＴ ＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣ ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧ ＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴ ＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡ ＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧ ＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧ ＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡ ＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣ ＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧ ＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣ ＴＡＣＣＣＣＴＴＣＡ ＣＣＡＧＣＴＡＣＧＧ ＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ ＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧ ＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡ ＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧ ＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴ ＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣ ＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣ ＡＡＴＡＣＣＡＡＣＴ ＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡ ＡＴＴＣＣＡＧＧＧＣ ＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡ ＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡ ＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＣＴ ＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴ ＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧ ＡＧＡＡＧＣＧＡＴＧ ＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴ ＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴ ＡＴＡＣＡＡＧＡＧＧ ＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣ ＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣ ＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧ ＡＴＴＣＧＡＣＡＡＣ ＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧ ＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴ ＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡ ＴＣＣＧＣＣＴＣＴＡ ＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣ ＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣ ＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡ ＡＡＧＣＡＣＡＡＧＣ ＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧ ＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧ ＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴ ＴＣＣＣＡＧＡＧＣＣ ＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧ ＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡ ＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴ ＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＴＡＣＣＴ ＴＴＣＣＣＧＣＣＧＴ ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴ ＴＣＴＧＧＡＣＴＧＴ ＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴ ＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴ ＧＧＧＣＡＣＡＣＡＧ ＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴ ＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡ ＣＣＡＣＡＡＧＣＣＡ ＴＣＴＡＡＴＡＣＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡ ＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡ ＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴ ＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＴＧＣ ＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣ ＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡ ＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣ ＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧ ＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴ ＣＣＣＴＣＣＴＡＡＡ ＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡ ＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴ ＴＡＧＣＣＧＧＡＣＣ ＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡ ＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴ ＧＧＴＴＧＡＣＧＴＧ ＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧ ＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴ ＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣ ＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧ ＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡ ＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣ ＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡ ＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡ ＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣ ＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴ ＡＴＡＧＡＧＴＧＧＴ ＧＡＧＣＧＴＧＣＴＴ ＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣ ＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧ ＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣ ＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡ ＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴ ＧＴＣＣＡＡＣＡＡＡ ＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣ ＴＧＣＣＴＧＡＡＧＡ ＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣ ＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡ ＡＧＧＧＣＣＡＡＣＣ ＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴ ＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡ ＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣ ＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴ ＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡ ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴ ＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣ ＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡ ＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡ ＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣ ＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧ ＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ ＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧ ＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡ ＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣ ＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴ ＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡ ＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧ ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧ ＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣ ＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡ ＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧ ＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧ ＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴ ＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣ ＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧ ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡ ＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣ ＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴ ＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴ ＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣ ＡＡＧＴＧＡＴＡＧＴ ＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧ ＣＡＴＣＴＴＡＣＣＧ ＣＣＡＴＴＴＡＴＴＣ ＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴ ＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣ ＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧ ＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡ ＡＡＴＧＴＴＡＡＴＡ ＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧ ＧＴＧＧＧＧＣＡＡＴ ＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴ ＴＴＴＡＧＧＧＡＴＡ ＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴ ＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧ ＴＡＴＴＧＣＣＡＣＡ ＡＧＡＣＡＡＡＣＡＴ ＧＴＴＡＡＧＡＡＡＣ ＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡ ＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴ ＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡ ＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴ ＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡ ＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡ ＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣ ＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣ ＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴ ＧＴＧＴＧＧＡＴＡＴ ＧＣＴＧＣＴＴＴＡＴ ＡＧＣＣＴＣＴＧＴＡ ＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴ ＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡ ＣＧＧＣＴＴＴＣＧＴ ＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣ ＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴ ＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴ ＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡ ＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴ ＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴ ＣＣＧＴＣＡＡＣＧＴ ＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴ ＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴ ＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡ ＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴ ＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣ ＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣ ＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣ ＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣ ＣＣＣＣＴＣＣＣＧＡ ＴＣＧＣＣＡＣＧＧＣ ＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣ ＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣ ＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧ ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧ ＧＣＴＡＧＧＴＴＧＣ ＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡ ＴＡＡＴＴＣＣＧＴＧ ＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧ ＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧ ＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡ ＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴ ＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣ ＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣ ＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧ ＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣ ＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣ ＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴ ＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡ ＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧ ＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡ ＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡ ＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧ ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ ＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡ ＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧ ＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧ ＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧ ＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴ ＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧ ＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴ ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧ ＡＴＧＧＣＴＡＣＧ ＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡ ＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧ ＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡ ＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣ ＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴ ＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣ ＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣ ＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ ＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴ ＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣ ＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴ ＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣ ＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣ ＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧ ＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧ ＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧ ＣＡＧＧ

【0255】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号４０５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。

【0256】

いくつかの実施形態によれば、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、以下に示すように、配列番号４０６を含むｃｅＤＮＡ－１９６６である。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡ ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴ ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡ ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ ＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧ ＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴ ＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡ ＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣ ＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧ ＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣ ＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣ ＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡ ＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣ ＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣ ＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧ ＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣ ＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣ ＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧ ＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧ ＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧ ＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧ ＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡ ＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡ ＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡ ＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴ ＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧ ＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡ ＴＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴ ＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧ ＧＣＴＡＡＧＴＣＣＡ ＣＧＧＴＡＣＣＣＡＣ ＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧ ＴＴＧＡＧＴＡＡＧＡ ＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡ ＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣ ＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣ ＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧ ＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧ
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【0257】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号４０６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。

【0258】

いくつかの実施形態によれば、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、以下に示すように、配列番号４０７を含むｃｅＤＮＡ－１９６７である。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡ ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴ ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡ ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ ＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧ ＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴ ＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡ ＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣ ＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧ ＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣ ＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣ ＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡ ＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣ ＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣ ＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣ ＣＧＣＧＧＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧ ＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣ ＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣ ＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧ ＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧ ＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧ ＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧ ＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡ ＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡ ＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴ
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【0259】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号４０７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。

【0260】

いくつかの実施形態によれば、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、以下に示すように、配列番号４０８を含むｃｅＤＮＡ－２１５７である。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡ ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴ ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡ ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ ＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧ ＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴ ＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡ ＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣ ＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧ ＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣ ＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣ ＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡ ＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣ ＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣ ＴＴＡＴＣＴＡＣＧＴ ＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴ ＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡ ＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧ ＴＴＴＴＡＣＴＴＧＣ ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣ ＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＧＡＡ ＣＣＴＧＡＡＡＣＡＴ ＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧ ＣＡＡＴＴＧＴＴＧＴ ＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧ ＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧ ＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧ ＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡ ＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡ ＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴ ＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡ ＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴ
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【0261】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号４０８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。

【0262】

いくつかの実施形態によれば、配列番号４０４は以下の成分を含み、数字は核酸残基を示す：
８５６．．．９２１＝免疫グロブリンカッパ可変１Ｄ－３３シグナルペプチド
８５６．．１５６６＝ＬＣ１（軽鎖１）＿コドン最適化
９２２．．１２４２＝Ｓ３０９＿ＶＬ（可変軽鎖）
１２４３．．１５６３＝ｈＩｇＫａｐｐａ定常領域［Ｐ０１８３４］
１２４３．．１５６３＝Ｓ３０９定常領域（ヒトカッパ）。

【0263】

いくつかの実施形態によれば、配列番号４０５は以下の成分を含み、数字は核酸残基を示す：
８５６．．９１２＝ヒトＩＧＨＶ３－４３重鎖シグナルペプチド
８５６．．２２８６＝ＨＣ１重鎖１（ＨＣ１）＿コドン最適化
９１３．．１２９３＝Ｓ３０９＿ＶＨ（可変重鎖）
１２９４．．２２８３＝ＧＡＡＬＩＥ及びＬＳ変異を有するＳ３０９定常領域（ｈＩｇＧ１）。

【0264】

いくつかの実施形態によれば、配列番号４０６は以下の成分を含み、数字は核酸残基を示す：
８５６．．９１２＝ヒトＩＧＨＶ３－４３重鎖シグナルペプチド［Ｐ０ＤＰ０４］
８５６．２２８６＝ＨＣ１＿コドン最適化
９１３．．１２９３＝Ｓ３０９＿ＶＨ
１２９４．．２２８３ Ｓ３０９ ＧＡＡＬＩＥ及びＬＳ変異を有する定常領域（ｈＩｇＧ１）。

【0265】

いくつかの実施形態によれば、配列番号４０７は以下の成分を含み、数字は核酸残基を示す：
８５６．．９２１＝免疫グロブリンカッパ可変１Ｄ－３３シグナルペプチド
８５６．．１５６６＝ＬＣ１＿コドン最適化
９２２．．１２４２＝Ｓ３０９＿ＶＬ
１２４３．．１５６３＝ｈＩｇＫａｐｐａ定常領域［Ｐ０１８３４］
１２４３．．１５６３＝Ｓ３０９定常領域（ヒトカッパ）。

【0266】

いくつかの実施形態によれば、配列番号４０８は以下の成分を含み、数字は核酸残基を示す：
１．．１４１＝左－ＩＴＲ＿ｖ１
１４２．．１９３＝スペーサー＿左－ＩＴＲ＿５３６
相補体（１９４．４１５）＝ＳＶ４０＿ポリＡ
４１６．．８１０＝ＨＢＢ＿３ｐＵＴＲ
相補体（４１６．８１０）＝ＨＢＢｖ２＿３ｐＵＴＲ
８１１．．８１８＝ＰａｃＩ＿部位
相補体（８２２．．１５３２）＝翻訳１５３２－８２２
相補体（８２２．．１５３２）＝ＬＣ１＿コドン最適化
相補体（８２５．．１１４５）＝ｈＩｇＫａｐｐａ定常領域［Ｐ０１８３４］
相補体（８２５．．１１４５）＝Ｓ３０９定常領域（ヒトカッパ）
相補体（１１４６．．１４６６）＝Ｓ３０９＿ＶＬ（可変軽鎖）
相補体（１４６７．．１５３２）＝免疫グロブリンカッパ可変１Ｄ－３３シグナルペプチド［Ｐ０１５９３．２］
相補体（１５３３．．１５３９）＝Ｍｏｄ＿Ｍｉｎｉｍｕｍ＿Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ＿Ｋｏｚａｋ
相補体（１５３３．．１５４２）＝Ｍｏｄ＿Ｍｉｎｉｍｕｍ＿Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ＿Ｋｏｚａｋ＿ｖ２
１５４３．．１５５０＝ＰｍｅＩ＿部位
相補体（１５５１．２８２２）＝ＣｐＧｍｉｎ＿ｈＡＡＴ＿プロモーター＿セット
スペーサー相補体（２８２３．．２８３２）＝１０ｍｅｒ＿２Ａ
相補体（２８２３．．３０４８）３ｘＨＮＦ１－４＿ＰｒｏＥｎｈ＿１０ｍｅｒ
エンハンサー相補体（２８３３．．２９５２）＝ＰｒｏＥｎｈ
相補体（２９５９．．２９７５）＝ＨＮＦ４部位
相補体（２９７６．．２９８８）＝ＨＮＦ１部位
相補体（２９８９．．３００５）＝ＨＮＦ４部位
相補体（３００６．．３０１８）＝ＨＮＦ１部位
相補体（３０１９．．３０３５）＝ＨＮＦ４部位
相補体（３０３６．．３０４８）＝ＨＮＦ１部位
３０４９．．３１２０＝セルピンエンハンサー
３１２２．．３１９３＝セルピンエンハンサー
３１９５．．３２６６＝セルピンエンハンサー
３４２７．．３６１０＝マウスＴＴＲ ５ｐＵＴＲ（ＮＭ＿０１３６９７．５）
３５７９．．．３６１０＝ＥＰＤ実験的に決定された５’ＵＴＲ
３５９０．．．３６１０＝ＥＰＤ実験的に決定された５’ＵＴＲ
３６１１．．３７０１＝ＭＶＭイントロン
３７０３．．．３７０９＝ＳｅｘＡＩ＿ｓｉｔｅ。

【0267】

３７１０．．３７１９＝Ｍｏｄ＿Ｍｉｎｉｍｕｍ＿Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ＿Ｋｏｚａｋ＿ｖ２
３７１３．．３７１９＝Ｍｏｄ＿Ｍｉｎｉｍｕｍ＿Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ＿Ｋｏｚａｋ
３７２０．．３７７６＝ヒトＩＧＨＶ３－４３重鎖シグナルペプチド［Ｐ０ＤＰ０４］
３７２０．．５１５０＝ＨＣ１＿コドン最適化
３７７７．．４１５７＝Ｓ３０９＿ＶＨ
４１５８．．５１４７＝ＧＡＡＬＩＥ及びＬＳ変異を有するＳ３０９定常領域（ｈＩｇＧ１）
５１５４．．５１５９＝ＡｆｌＩＩ＿部位
５１６０．．５７４０＝ＷＰＲＥ＿３ｐＵＴＲ
５７４１．．５９６５＝ｂＧＨ
５９６６．．６０２６＝スペーサー＿右－ＩＴＲ＿ｖ１
６０２７．．６１５６＝右－ＩＴＲ＿ｖ１

【0268】

Ｖ．ｃｅＤＮＡベクターの産生の方法
Ａ．一般的な産生
本明細書で定義されるような非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの特定の産生方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号のセクションＩＶに記載されている。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生され得る。代替的な実施形態では、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号に開示されるように、合成的に、またいくつかの実施形態では無細胞法で産生することができる。

【0269】

本明細書に記載されるように、一実施形態では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から回収し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。但し、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶ又は他のウイルスベースベクターにおいて天然に課されるもの等のサイズ制限はない。

【0270】

宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化し、消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。

【0271】

更に別の態様では、本開示は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルス等の第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐ及びヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除及び増幅を可能にする。

【0272】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば図４Ａ～図４Ｃ及び実施例１に記載される、ｃｅＤＮＡの非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態によれば、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。

【0273】

次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取及び収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、回収時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞のほとんどがバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキット等のプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ－ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。

【0274】

ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソーム又は微粒子として精製される。

【0275】

抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、並びにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料及び未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。図４Ｃ及び図４Ｄは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を特定するための一実施形態を示す。

【0276】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは無細胞環境で合成的に産生される。

【0277】

Ｂ．ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、転写方向の作動可能に連結された構成成分として、少なくとも（１）修飾型５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、及び（３）修飾型３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して対称である）を提供する既知の技法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐ及びｃａｐコード領域を置き換える。

【0278】

一態様では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、及び変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と称されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’修飾型ＩＴＲは、同じ修飾を有する（すなわち、それらは互いに対して逆相補又は対称である）。

【0279】

更なる実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。加えて、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドはまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、機能的ＡＡＶ ｃａｐ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ－３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。

【0280】

本開示のｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然核酸配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムに由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されているＵＲＬで入手可能なＫｏｔｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗウェブアドレス：ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）（注記－ＵＲＬ又はデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のＵＲＬ又はデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’及び３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。

【0281】

ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能又は選択マーカーを任意選択的に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどであり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。

【0282】

抗体及びその抗原結合断片の発現のための例示的なｃｅＤＮＡ（例えば、ｒＡＡＶ０）ベクターは、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）宿主細胞に上記のようなｒＡＡＶプラスミドを提供することであって、宿主細胞及びプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を欠いている、提供することと、（ｂ）ｃｅＤＮＡゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）細胞を採取し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することと、を含み得る。

【0283】

Ｃ．ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
抗体及びその抗原結合断片の発現のためのカプシドのないｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。

【0284】

いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生方法は、（１）発現カセット及び２つの対称ＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中に導入するステップと、（２）任意選択的に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクション又は感染のいずれかによって）当該昆虫細胞中に導入するステップと、（４）細胞を回収し、ｃｅＤＮＡベクターを精製するステップと、を含む。ｃｅＤＮＡベクターの産生のために上記の発現カセット及び２つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、又は下記のようにｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミド若しくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、又は当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。

【0285】

Ｄ．細胞株
抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生において使用される宿主細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９、Ｓｆ２１など）若しくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞に由来する昆虫細胞株、又は他の無脊椎動物、脊椎動物、若しくは哺乳動物細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。当業者に既知の他の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１ １８０、単球、並びに成熟及び未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のために、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。

【0286】

ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）又は物理的手段（例えば、エレクトロポレーション）を使用し、一時的なトランスフェクションによってＳｆ９細胞中に導入され得る。代替的に、ｃｅＤＮＡ－プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したＳｆ９細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のｃｅＤＮＡ－プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクションするために使用されるｃｅＤＮＡ－プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ｃｅＤＮＡ－プラスミドでトランスフェクションされ、ｃｅＤＮＡ－プラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈又はコロニー移動技法によって単離され、伝播され得る。

【0287】

Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターを単離し、精製する
ｃｅＤＮＡベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図４Ａ～図４Ｅ及び下記の特定の実施例に記載される。本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡ－ベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現するプロデューサー細胞から取得され、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスで更に形質転換され得る。ｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なプラスミドには、抗体及びその抗原結合断片をコードするプラスミド、又は１つ以上のＲＥＰタンパク質をコードするプラスミドが含まれる。

【0288】

いくつかの態様によれば、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐ－プラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ－バクミド）、又はバキュロウイルス（Ｒｅｐ－バキュロウイルス）中のプロデューサー細胞に送達されたＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８若しくは６８）をコードする。Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、及びＲｅｐ－バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。

【0289】

抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを産生する方法は、本明細書に記載される。本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド）、バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）、及び／又はバキュロウイルス（例えば、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）であり得る。単なる例として、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス及びＲｅｐ－バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Ｒｅｐ－バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡベクターを生成し得る。代替的に、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、又はＲｅｐ－バキュロウイルス中で送達されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／５２）をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクトされた細胞から生成され得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスは、細胞に一時的にトランスフェクトされ、Ｒｅｐタンパク質によって複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生し得る。

【0290】

バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ（Trichoplusia ni）細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクトされ得、対称ＩＴＲ及び発現カセットを含む配列を含む組換えバキュロウイルスである、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを生成し得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組換えバキュロウイルスを取得することができる。任意選択的に、このステップを一回又は複数回繰り返して、より多い量の組換えバキュロウイルスを産生することができる。

【0291】

本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを細胞から回収及び採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、回収時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｑｉａｇｅｎ ＥＮＤＯ－ＦＲＥＥ ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Ｓｆ９細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ｃｅＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、並びに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。

【0292】

代替的に、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｑ（登録商標））上に上清を装填し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上で更なるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含ＡＡＶベクターは、例えば、沈殿によって回収される。

【0293】

いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、エキソソーム又は微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２００９、欧州特許第１０３０６２２６．１号）。そのような小胞は、微小胞（微粒子とも称される）及びエキソソーム（ナノ小胞とも称される）を含み、それらの両方が、タンパク質及びＲＮＡをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを含有する微小胞及び／又はエキソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミド、又はｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミド若しくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。

【0294】

微小胞は、培養培地を濾過又は２０，０００×ｇでの超遠心分離に供することによって単離することができ、エキソソームは、１００，０００×ｇで単離することができる。超遠心分離の最適な持続時間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存する。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例えば、２０００×ｇで５～２０分間）によって一掃され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用し、スピン濃度に供される。微小胞及びエキソソームは、微小胞及びエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳを介して更に精製され得る。他の微小胞及びエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、及び特定の抗体又はアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ｃｅＤＮＡ含有小胞を送達するために微小胞又はエキソソームを使用する１つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。（欧州特許第１０３０６２２６号も参照されたい）

【0295】

本明細書における本開示の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソーム又は微粒子として精製される。

【0296】

国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号の図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡ－プラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、実施例の図４Ｄに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。

【0297】

ＶＩ．薬学的組成物
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクター、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。

【0298】

本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター及び薬学的に許容される担体を含む。

【0299】

本明細書に開示される薬学的製剤は、直接投与され得る液体例えば、水性溶液、及び投与前に希釈剤を添加することによって溶液に再構成され得る凍結乾燥粉末を含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを、少なくとも１つの追加の治療剤とともに又はそれなしで含む製剤は、適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。凍結乾燥は、市販の凍結乾燥器（例えば、ＶｉｒＴｉｓ Ｌａｂ Ｓｃａｌｅ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ）上で一般的な凍結乾燥サイクルを使用して行うことができる。

【0300】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに、適切なバッファーに必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を組み込んだ後、ｃｅＤＮＡベクターを含む濾過滅菌によって調製することができ、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化して、その中の導入遺伝子又はドナー配列の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。

【0301】

抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、細胞、例えば、対象の細胞に様々な目的のための導入遺伝子を送達するように製剤化することができる。

【0302】

治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。

【0303】

特定の実施形態において、非経口投与のための製剤は、凍結乾燥形態又は溶液中で保存することができる。本発明の化合物は、一般に、非経口製剤は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルに入れられる。

【0304】

特定の実施形態では、医薬製剤が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、又は脱水若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存することができる。特定の実施形態では、そのような製剤は、すぐに使用できる形態、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで保存することができる。

【0305】

本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、腔内、硝子体内）、及び蝸牛内、並びに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射等の細胞内注射もまた、企図される。

【0306】

いくつかの態様によれば、本明細書で提供される方法は、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のための１つ以上のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、及びそのような細胞を含むか又はそのような細胞から産生される生物（動物、植物、又は真菌など）も提供される。核酸の送達方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、及び薬剤によって増強されたＤＮＡの取り込みが挙げられ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロ若しくはエクスビボ投与）又は標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。

【0307】

核酸を細胞に送達するための様々な技法及び方法が、当該技術分野において既知である。例えば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、又はコアシェルナノ粒子中に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化又はカチオン性脂質（若しくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性又は中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧ若しくはＰＥＧ－脂質コンジュゲート）、及び任意選択的にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。

【0308】

抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡなどの核酸を細胞に送達するための別の方法は、細胞によって内在化されるリガンドと核酸を複合することによるものである。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合的に連結され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的なコンジュゲートは、例えば、国際公開第２０１５／００６７４０号、同第２０１４／０２５８０５号、同第２０１２／０３７２５４号、同第２００９／０８２６０６号、同第２００９／０７３８０９号、同第２００９／０１８３３２号、同第２００６／１１２８７２号、同第２００４／０９０１０８号、同第２００４／０９１５１５号、及び同第２０１７／１７７３２６号に記載される。

【0309】

抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡなどの核酸はまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、又はリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、及びＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）が含まれるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。

【0310】

本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注射、注入、局所用途、及びエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時的であり、より効果的な反応を提供し得る。

【0311】

本開示による抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞又は標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。化合物を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を含むが、これに限定されない例示的なリポソーム及びリポソーム製剤は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０５００４２号及び２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示され、例えば、「薬学的製剤」と題されるセクションを参照されたい。

【0312】

当該技術分野において既知の様々な送達方法又はそれらの修正を使用して、ｃｅＤＮＡベクターをインビトロ又はインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、又はレーザーベースエネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化された細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、又は当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターのみが、裸のＤＮＡとして、肺、肝臓、腎臓、胆嚢、前立腺、副腎、心臓、腸、胃、皮膚、胸腺、心筋、又は骨格筋から選択される任意の１つ以上の組織のうちのいずれか１つに直接注射される。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金又はタングステン球状粒子（１～３μｍ直径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。

【0313】

本明細書では、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクター及び薬学的に許容される担体を含む組成物が具体的に企図されている。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態によれば、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び関節内、又はそれらの組み合わせを含む異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って好適に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画及び投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメントガン」、又はエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、又は超音波などの他の物理的方法によって投与することができる。

【0314】

場合によっては、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、内臓及び肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物及び粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注射によって送達される。

【0315】

いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓又は腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、プラスミドＤＮＡのサイズ及び濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、磁場を使用することによってマグネトフェクションにより送達され、核酸を含有する粒子を標的細胞中に濃縮する。

【0316】

いくつかの実施形態によれば、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセル又はカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、及び脂質－ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0317】

Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームにパッケージ化されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、Ｂ及びＴリンパ球、マスト細胞（mast cell、ＭＣ）、同様に、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態によれば、１０ｎｍ～１μｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、３０ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、又は特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本開示のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。

【0318】

Ｂ．微粒子／ナノ粒子
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ５（３）：４９８－５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びコート脂質（ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。

【0319】

いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子は、約１０～約１０００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子は、約１０～約３００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子は、約２５～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ～約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。

【0320】

当該技術分野において既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、及び同第９，５１８，２７２号に記載されている。

【0321】

Ｃ．コンジュゲート
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、コンジュゲートされる（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される）。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞貫通ペプチド（cell penetrating peptide、ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、及びポリアミン（例えば、スペルミン）にコンジュゲートし得る。細胞取り込みを増加させる薬剤の更なる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１－８０９に開示されている。

【0322】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）又は葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）にコンジュゲートされる。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、国際公開第２０００／３４３４３号及び同第２００８／０２２３０９号に記載されるように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されるように、ポリ（アミド）ポリマーにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態によれば、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されるように、葉酸分子にコンジュゲートされる。

【0323】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されるように、炭水化物にコンジュゲートされる。

【0324】

Ｄ．ナノカプセル
代替的に、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。

【0325】

Ｅ．リポソーム
本開示による抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞又は標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。

【0326】

リポソームの形成及び使用は、一般に、当業者に既知である。向上された血清安定性及び循環半減期を有するリポソームが開発されている（米国特許第５，７４１，５１６号）。更に、潜在的な薬物担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、及び同第５，７９５，５８７号）。

【0327】

Ｆ．例示的なリポソーム及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
本開示による抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要とする細胞への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。

【0328】

ｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子（Lipid nanoparticle、ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＵＳ２０１８／０５００４２号及び２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されており、それらの全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターについての方法及び組成物での使用が想定されている。

【0329】

いくつかの態様によれば、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物に対する親水性及び疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。又は、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧ又はＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ～約５，０００Ｄａであり得る。

【0330】

いくつかの態様によれば、本開示は、延長放出又は制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間～数週間の期間にわたって送達するであろうリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間～数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。

【0331】

いくつかの態様によれば、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリン及び本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様によれば、リポソーム製剤は、オプティソーム（optisome）を含む。

【0332】

いくつかの態様では、本開示は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコールコンジュゲート脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＤＳＰＥ（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）、ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）、ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）、ＳＭ（スフィンゴミエリン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステロール（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルコリン）、又はそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。

【0333】

いくつかの態様によれば、本開示は、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２～１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様によれば、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びＰＥＧ化脂質を含有するリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、本開示は、ホスファチジルコリン官能基及びコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥである。いくつかの態様によれば、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質コンジュゲート、及びコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。

【0334】

いくつかの態様によれば、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、及びエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、及びＤＯＰＥを含む。

【0335】

いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロース及び／又はグリシンを更に含むリポソーム製剤を提供する。

【0336】

いくつかの態様によれば、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０～２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様によれば、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。

【0337】

いくつかの態様によれば、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を添加することにより、本明細書に開示又は記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製及び充填されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３まで増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に送る。いくつかの態様によれば、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４～６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマー又は非ポリマー高電荷アニオン及びリポソーム内捕捉剤、例えば、ポリリン酸塩又はオクタ硫酸スクロースが利用される。

【0338】

いくつかの態様によれば、本開示は、ｃｅＤＮＡ及びイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製及び負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合及び核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去によって更に安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。

【0339】

一般に、脂質ナノ粒子は、約１０：１～６０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比で調製される。いくつかの実施形態によれば、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約６０：１、約１：１～約５５：１、約１：１～約５０：１、約１：１～約４５：１、約１：１～約４０：１、約１：１～約３５：１、約１：１～約３０：１、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、約６：１～約９：１、約３０：１～約６０：１の範囲内であり得る。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約６０：１の全脂質比に対するｃｅＤＮＡ（質量又は重量）で調製される。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子は、約１０：１～３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比で調製される。いくつかの実施形態によれば、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲内であり得る。脂質及びｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0340】

イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、及び膜会合及び膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、又は例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。

【0341】

例示的なイオン化脂質は、国際ＰＣＴ特許公開２０１５／０９５３４０号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１８／０１１６３３号、同第２０１７／０４９２４５号、同第２０１５／０６１４６７号、同第２０１２／０４０１８４号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１５／０７４０８５号、同第２０１６／０８１０２９号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１７／０７５５３１号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１１／０２２４６０号、同第２０１３／１４８５４１号、同第２０１３／１１６１２６号、同第２０１１／１５３１２０号、同第２０１２／０４４６３８号、同第２０１２／０５４３６５号、同第２０１１／０９０９６５号、同第２０１３／０１６０５８号、同第２０１２／１６２２１０号、同第２００８／０４２９７３号、同第２０１０／１２９７０９号、同第２０１０／１４４７４０号、同第２０１２／０９９７５５号、同第２０１３／０４９３２８号、同第２０１３／０８６３２２号、同第２０１３／０８６３７３号、同第２０１１／０７１８６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４８５３６号、同第２０１０／０８８５３７号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０６号、同第２０１０／０５４４０５号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１２／０１６１８４号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１１／０００１０６号、同第２０１１／０００１０７号、同第２００５／１２０１５２号、同第２０１１／１４１７０５号、同第２０１３／１２６８０３号、同第２００６／００７７１２号、同第２０１１／０３８１６０号、同第２００５／１２１３４８号、同第２０１１／０６６６５１号、同第２００９／１２７０６０号、同第２０１１／１４１７０４号、同第２００６／０６９７８２号、同第２０１２／０３１０４３号、同第２０１３／００６８２５号、同第２０１３／０３３５６３号、同第２０１３／０８９１５１号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／０９５３４６号、及び同第２０１３／０８６３５４号、並びに米国特許公開第２０１６／０３１１７５９号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０１５１２８４号、同第２０１７／０２１０６９７号、同第２０１５／０１４００７０号、同第２０１３／０１７８５４１号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１５／０１４１６７８号、同第２０１５／０２３９９２６号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１７／０１１９９０４号、同第２０１２／０１４９８９４号、同第２０１５／００５７３７３号、同第２０１３／００９０３７２号、同第２０１３／０２７４５２３号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２００９／００２３６７３号、同第２０１２／０１２８７６０号、同第２０１０／０３２４１２０号、同第２０１４／０２００２５７号、同第２０１５／０２０３４４６号、同第２０１８／０００５３６３号、同第２０１４／０３０８３０４号、同第２０１３／０３３８２１０号、同第２０１２／０１０１１４８号、同第２０１２／００２７７９６号、同第２０１２／００５８１４４号、同第２０１３／０３２３２６９号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０２０２８７１号、同第２０１１／００７６３３５号、同第２００６／００８３７８０号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１５／００６４２４２号、同第２００６／００５１４０５号、同第２０１３／００６５９３９号、同第２００６／０００８９１０号、同第２００３／００２２６４９号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１３／０１１６３０７号、同第２０１０／００６２９６７号、同第２０１３／０２０２６８４号、同第２０１４／０１４１０７０号、同第２０１４／０２５５４７２号、同第２０１４／００３９０３２号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１６／０３１７４５８号、及び同第２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0342】

いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である：

【0343】

【化1】

【0344】

脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。

【0345】

いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、国際公開第２０１５／０７４０８５号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、脂質ＡＴＸ－００２である。

【0346】

いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、国際公開第２０１２／０４０１８４号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。

【0347】

いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、国際公開第２０１５／１９９９５２号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、化合物６又は化合物２２である。

【0348】

限定なく、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、又は４０～５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。

【0349】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質を更に含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、又はアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。

【0350】

本明細書に開示される方法及び組成物での使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０５００４２号、及び２０１８年１２月６日に出願された同第第ＵＳ２０１８／０６４２４２号に記載されている。例示的な非カチオン性脂質は、国際出願公開第２０１７／０９９８２３号及び米国特許公開第２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0351】

非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。

【0352】

いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様によれば、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成成分を更に含み得る。

【0353】

脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際出願第２００９／１２７０６０号及び米国特許公開第２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0354】

ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態によれば、そのような構成成分は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。

【0355】

いくつかの態様によれば、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）又はコンジュゲートした脂質分子を更に含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／又は立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、複合脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－複合脂質である。例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１６／０３７６２２４号、及び同第２０１７／０１１９９０４号に記載されており、それら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0356】

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号に定義されている化合物であり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５／０３７６１１５号又は同第２０１６／０３７６２２４号に開示されており、これら両方の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0357】

ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択され得る。

【0358】

ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート等）、及びカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、又はそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、及びカチオン性ポリマー－脂質は、国際公開第１９９６／０１０３９２号、同第１９９８／０５１２７８号、同第２００２／０８７５４１号、同第２００５／０２６３７２号、同第２００８／１４７４３８号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１５／０９５３４６号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１２／０００１０４号、及び同第２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１６／０３１７４５８号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１３／０３０３５８７号、及び同第２０１１／０１２３４５３号、並びに米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、同第６，３２０，０１７号、及び同第６，５８６，５５９号に記載されており、これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0359】

いくつかの実施形態によれば、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的及び生物作用に従って選択され得る。

【0360】

いくつかの実施形態によれば、追加の化合物は、本明細書に記載される別の抗体又はその抗原結合断片である。

【0361】

いくつかの実施形態によれば、追加の薬剤は、抗ウイルス薬又はワクチンである。いくつかの実施形態によれば、追加の薬剤は、抗炎症剤、抗マラリア剤、及びＣｏＶ－Ｓに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片からなる群から選択される。更なる実施形態において、抗マラリア剤はクロロキン又はヒドロキシクロロキンである。いくつかの実施形態によれば、抗炎症剤は、抗体、例えば、サリルマブ、トシリズマブ、又はギムシルマブ（gimsilumab）である。

【0362】

いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。本明細書では、産生された脂質ナノ粒子に封入されている昆虫細胞、又は本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のための合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。

【0363】

いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤を更に含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンを更に含む。

【0364】

ｃｅＤＮＡベクターは、粒子の脂質部分と複合され得るか、又は脂質ナノ粒子の脂質位置に封入され得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、若しくは６０分、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。

【0365】

特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様によれば、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。

【0366】

いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。限定なく、非二層の形態には、例えば、三次元の管、ロッド、立方対称などが含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特徴付けられ得る。

【0367】

いくつかの更なる実施形態によれば、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様によれば、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様によれば、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。

【0368】

脂質構成成分の組成物及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。

【0369】

製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関させることができる（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０ｌ０）を参照されたい（これらはいずれも、参照によりその全体が組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で決定され得る。

【0370】

ＶＩＩ．治療方法
本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、目的の核酸配列を標的細胞（例えば、宿主細胞）に送達するための方法において使用され得る。この方法は、特に抗体又は抗原結合断片を、その送達を必要とする対象の細胞に送達し、疾患又は障害を治療するための方法であり得る。

【0371】

本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の標的すなわち、抗原は、例えば細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫感染因子を含む様々な病原体から選択され得る。適切な標的は、がん又はがん関連抗原などを更に含み得る。更に他の標的には、関節リウマチ（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫状態が含まれ得る。

【0372】

加えて、本開示は、抗体又はその抗原結合断片の送達を必要とする対象の細胞にこれを送達する方法であって、当該抗体及びその抗原結合断片をコードする本開示のｃｅＤＮＡベクターの複数回投与を含む、方法を提供する。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ｃｅＤＮＡベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに、抗体及びその抗原結合断片の十分なレベルの遺伝子導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。

【0373】

本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの送達は、発現された抗体及びその抗原結合断片の送達に限定されない。例えば、従来の方法で産生される（例えば、細胞ベースの産生方法（例えば、昆虫細胞産生方法）を使用して）又は合成的に産生された本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子療法の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用され得る。本開示に従ってｃｅＤＮＡベクターと組み合わせることができる系の１つの非限定的な例は、抗体又はその抗原結合断片を発現するｃｅＤＮＡベクターの効果的な遺伝子発現のために１つ以上の補因子又は免疫抑制因子を別々に送達する系を含む。

【0374】

本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の標的は、例えば、細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫感染因子を含む様々な病原体から選択され得る。適切な標的は、がん又はがん関連抗原などを更に含み得る。更に他の標的には、関節リウマチ（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫状態が含まれ得る。

【0375】

ウイルス標的の例としては、オルトミクソウイルスファミリー由来のインフルエンザウイルスが挙げられ、例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びインフルエンザＣが挙げられる。Ａ型ウイルスは、最も有毒なヒト病原体である。パンデミックに関連付けられているインフルエンザＡの血清型としては、１９１８年にスペイン風邪、及び２００９年に豚インフルエンザを引き起こしたＨ１Ｎ１、１９５７年にアジアインフルエンザを引き起こしたＨ２Ｎ２、１９６８年に香港インフルエンザを引き起こしたＨ３Ｎ２、２００４年に鳥インフルエンザを引き起こしたＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、並びにＨ１０Ｎ７が挙げられる。

【0376】

Ａ型インフルエンザに対する広域中和抗体が記載されている。本明細書で使用される場合、「広域中和抗体」は、複数のサブタイプ由来の複数の株を中和することができる中和抗体を指す。例えば、ＣＲ６２６１［Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｃｒｕｃｅｌｌ］は、１９１８年の「スペイン風邪」（ＳＣ１９１８／Ｈ１）を含む広範囲のインフルエンザウイルス、及び２００４年にベトナムでニワトリからヒトに急増したトリインフルエンザのＨ５Ｎ１クラスのウイルス（Ｖｉｅｔ０４／Ｈ５）に結合するモノクローナル抗体として記載されている。ＣＲ６２６１は、インフルエンザウイルスの表面上の優勢なタンパク質であるヘマグルチニンの膜近位ステムにおける高度に保存されたヘリックス領域を認識する。この抗体は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／１３０６３６号に記載されている。別の中和抗体、Ｆ１０［ＸＯＭＡ Ｌｔｄ］は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１に対して有用であると記載されている。［Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．２００９，１６（３）：２６５－７３）］インフルエンザに対する他の抗体、例えば、Ｆａｂ２８及びＦａｂ４９を選択してもよい。例えば、参照により組み込まれる国際公開第２０１０／１４０１１４号及び同第２００９／１１５９７２号を参照されたい。更に他の抗体、例えば、国際公開第２０１０／０１０４６６、米国特許公開第２０１１／０７６２６５号、及び国際公開第２００８／１５６７６３号に記載されている抗体を容易に選択することができる。

【0377】

他の標的病原性ウイルスとしては、アレナウイルス（ファニン、マチュポ、及びラッサを含む）、フィロウイルス（マールブルグ及びエボラを含む）、ハンタウイルス、ピコルナウイルス（ライノウイルス、エコーウイルスを含む）、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、トガウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルスＢ１９、パラインフルエンザ、アデノウイルス、レオウイルス、痘瘡（大痘瘡（天然痘））及びポックスウイルスファミリーのワクシニア（牛痘）、並びに水痘帯状疱疹（仮性狂犬病）が挙げられる。

【0378】

ウイルス性出血熱は、アレナウイルスファミリー（ラッサ熱）（このファミリーはリンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）にも関連する）、フィロウイルス（エボラウイルス）、及びハンタウイルス（puremala）のメンバーによって引き起こされる。ピコルナウイルス（ライノウイルスのサブファミリー）のメンバーは、ヒトにおける感冒に関連している。コロナウイルスファミリーには、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸管系ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集素脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）などの多数の非ヒトウイルスが含まれる。ヒト呼吸器コロナウイルスは、感冒、非Ａ、Ｂ又はＣ型肝炎、及び突発性急性呼吸器症候群（sudden acute respiratory syndrome、ＳＡＲＳ）すると推定されている。パラミクソウイルスファミリーには、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹ウイルス及びイヌジステンパーを含む麻疹ウイルス、並びに呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含むニューモウイルスが含まれる。パルボウイルスファミリーには、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルスが含まれる。アデノウイルスファミリーには、呼吸器疾患を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。

【0379】

細菌性病原体に対する中和抗体構築物もまた、本開示における使用のために選択され得る。一実施形態では、中和抗体構築物は、細菌自体に対するものである。別の実施形態では、中和抗体構築物は、細菌によって産生される毒素に対するものである。風媒性細菌性病原体の例としては、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（肺炎）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（肺炎）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ（肺炎）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（肺炎）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ、Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（肺炎／発熱）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（レジオネラ症）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ（肺炎）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核（ＴＢ））、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ（結核（ＴＢ））、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ（肺炎）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ（肺炎）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（肺炎）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（猩紅熱）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎）が挙げられる。

【0380】

炭疽の原因物質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓによって産生される毒素である。トキソイドを形成する３つのペプチドの１つである保護剤（protective agent、ＰＡ）に対する中和抗体が記載されている。他の２つのポリペプチドは、致死因子（lethal factor、ＬＦ）及び浮腫因子（edema factor、ＥＦ）からなる。抗ＰＡ中和抗体は、炭疽菌に対する受動免疫において有効であると記載されている。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，４４２，３７３；Ｒ．Ｓａｗａｄａ－Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４；２：５．（ｏｎ－ｌｉｎｅ ２００４ Ｍａｙ １２）を参照されたい。更に他の抗炭疽毒素中和抗体が記載されており、かつ／又は生成され得る。同様に、他の細菌及び／又は細菌毒素に対する中和抗体を使用して、本明細書に記載されるＡＡＶ送達抗病原体構築物を生成してもよい。

【0381】

他の感染症は、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ｒｈｉｘｐｕｓストロニファー、ムコールｐｌｕｍｂｅａｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、ブラストミセスｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、コクシジオイデスｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｆａｅｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種を含む空中浮遊真菌によって引き起こされ得る。

【0382】

更に、受動免疫は、真菌感染（例えば、水虫）、白癬、又はウイルス、細菌、寄生生物、真菌、及び直接接触によって伝染し得る他の病原体を予防するために使用され得る。更に、家庭のペット、ウシ及び他の家畜、並びに他の動物に影響を及ぼす様々な状態。例えば、イヌにおいて、イヌ副鼻腔アスペルギルス症による上気道の感染は、重大な疾患を引き起こす。ネコでは、鼻に由来する上気道疾患又はネコ呼吸器系疾患複合体は、治療せずに放置すると罹患及び死亡を引き起こす。ウシは、ウシの急性伝染性ウイルス疾患である感染性ウシ鼻気管炎（一般にＩＢＲ又はレッドノーズと呼ばれる）による感染を受けやすい。更に、ウシは、軽度から重度の呼吸器疾患を引き起こし、他の疾患に対する耐性を損なう可能性があるウシ呼吸器合胞体ウイルス（Bovine Respiratory Syncytial Virus、ＢＲＳＶ）にかかりやすい。更に他の病原体及び疾患は、当業者に明らかである。例えば、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）中和抗体の生成を記載している米国特許第５，８１１，５２４号を参照されたい。そこに記載された技術は、他の病原体に適用可能である。このような抗体は、インタクトで使用され得るか、又はその配列（足場）が改変されて、人工又は組換え中和抗体構築物を生成し得る。このような方法は記載されている［例えば、国際公開第２０１０／１３０３６号、国際公開第２００９／１１５９７２号、国際公開第２０１０／１４０１１４号を参照されたい］。

【0383】

本明細書に記載される抗新生物免疫グロブリンは、ＨＥＲ２などのヒト上皮成長因子受容体（human epidermal growth factor receptor、ＨＥＲ）を標的化し得る。例えば、トラスツズマブは、細胞ベースのアッセイにおいて高い親和性（Ｋｄ＝５ｎＭ）でヒト上皮成長因子受容体タンパク質の細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＩｇＧ１カッパ、ヒト化モノクローナル抗体である。市販の製品は、ＣＨＯ細胞培養物中で産生される。例えば、ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２を参照されたい。トラスツズマブ軽鎖１及び２並びに重鎖１及び２のアミノ酸配列、並びにトラスツズマブのＸ線構造の研究から得られた配列は、このデータベース上に受託番号ＤＢ０００７２で提供されており、この配列は参照により本明細書に組み込まれる。２１２－Ｐｂ－ＴＣＭＣ－トラスツズマブ［Ａｒｅｖａ Ｍｅｄ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．］も参照されたい。目的の別の抗体としては、例えばペルツズマブ、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ２）の細胞外二量体化ドメイン（サブドメインＩＩ）を標的化する組換えヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。それは、それぞれ４４８及び２１４残基を有する２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる。ＦＤＡは、２０１２年６月８日に承認した。その重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、例えば、このデータベース上のｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０６３６６（同義語は、２Ｃ４、ＭＯＡＢ ２Ｃ４、モノクローナル抗体２Ｃ４、及びｒｈｕＭＡｂ－２Ｃ４を含む）において受託番号ＤＢ０６３６６で提供されている。ＨＥＲ２に加えて、他のＨＥＲ標的が選択され得る。

【0384】

例えば、ＭＭ－１２１／ＳＡＲ２５６２１２は、ＨＥＲ３受容体を標的化する完全ヒトモノクローナル抗体であり［Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ’ｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｂｉｏｌｏｇｙ］、非小細胞肺がん（non-small cell lung cancer、ＮＳＣＬＣ）、乳がん及び卵巣がんの治療に有用であることが報告されている。ＳＡＲ２５６２１２は、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）受容体を標的化する研究用の完全ヒトモノクローナル抗体である［Ｓａｎｏｆｉ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ］。別の抗Ｈｅｒ３／ＥＧＦＲ抗体は、頭頸部がんにおいて有用であると記載されているＲＧ７５９７［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］である。別の抗体、マルゲツキシマブ（又はＭＧＡＨ２２）、ＨＥＲを標的化する次世代のＦｃ最適化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）［ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ］も利用することができる。

【0385】

あるいは、他のヒト上皮細胞表面マーカー及び／又は他の腫瘍受容体又は抗原が標的化され得る。他の細胞表面マーカー標的の例としては、例えば、５Ｔ４、ＣＡ－１２５、ＣＥＡ例えば、ラベツズマブによって標的化される、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、リツキシマブによって標的化される）、ＣＤ２２（例えば、エプラツズマブ又はベルツズマブによって標的化される）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１（またインテグリンαｖβ３）、ＣＤ１３３（例えば、神経膠芽腫細胞）、ＣＴＬＡ－４（例えば、神経芽細胞腫の治療に使用されるイピリムマブ）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）（脳内の異なる領域で発現される；例えば、抗ＣＸＣＲ ２（細胞外）抗体＃ＡＣＲ－０１２（Alomene Labs））、
ＥｐＣＡＭ、線維芽細胞活性化タンパク質（fibroblast activation protein、ＦＡＰ）［例えば、国際公開第２０１２０２０００６（Ａ２）号、脳腫瘍］、葉酸受容体アルファ（例えば、小児上衣脳腫瘍、頭頸部がんを参照されたい）、線維芽細胞増殖因子受容体１（fibroblast growth factor receptor 1、ＦＧＦＲ１）（抗ＦＧＦＲ１抗体を用いたがんの治療の考察については、ｅｔ ａｌ．、国際公開第２０１２１２５１２４（Ａ１）号を参照されたい）、ＦＧＦＲ２（例えば、国際公開第２０１３０７６１８６（Ａ）号及び国際公開第２０１１１４３３１８（Ａ２）号に記載されている抗体）、ＦＧＦＲ３（例えば、米国特許第８，１８７，６０１号及び国際公開第２０１０１１１３６７（Ａ１）号に記載されている抗体）、ＦＧＦＲ４（例えば、国際公開第２０１２１３８９７５（Ａ１）号に記載されている抗ＦＧＦＲ４抗体を参照されたい）、肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、ＨＧＦ）（例えば、国際公開第２０１１０１１９９９１（Ａ３）号の抗体を参照されたい）、インテグリンα５β１、ｇａｎｇｉｏｌｏｓｉｄｅ ＧＤ２（例えば（例えば、国際公開第２０１１１６０１１９（Ａ２）号に記載されている抗体）、ガングリオシドＧＤ３、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（glycoprotein NMB、ＧＰＮＭＢ）（特に、神経膠腫に関連する）、及び抗体グレムバツムマブ（ＣＲ０１１）、ムチン、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン（例えば、バビツキシマブによって標的化される、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ］、前立腺がん細胞、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８）、完全ヒトｇＧ４、例えば、転移性黒色腫］、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｌｐｈａ、ＰＤＧＦＲα）又はＣＤ１４０、腫瘍関連糖タンパク質７２（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２、ＴＡＧ－７２）、テネイシンＣ、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor、ＴＮＦ）受容体（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）－Ａ（例えば、ベバシズマブによって標的化される）及びＶＥＧＦＲ２（例えば、ラムシルマブによって標的化される）が挙げられる。

【0386】

他の抗体及びそれらの標的としては、例えば、ＡＰＮ３０１（ｈｕ１４．１９－ＩＬ２）、モノクローナル抗体［小児における悪性黒色腫及び神経芽細胞腫、Ａｐｅｉｒｏｎ Ｂｉｏｌｇｉｃ、Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ］が挙げられる。例えば、転移性脳腫瘍を含む固形腫瘍の治療に有用であると記載されているモノクローナル抗体８Ｈ９も参照されたい。モノクローナル抗体８Ｈ９は、Ｂ７Ｈ３抗原に対する特異性を有するマウスＩｇＧ１抗体である［Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］。このマウス抗体はヒト化することができる。Ｂ７－Ｈ３及び／又はＢ７－Ｈ４抗原を標的化とする更に他の免疫グロブリン構築物を本明細書で使用され得る。別の抗体は、Ｓ５８（抗ＧＤ２、神経芽細胞腫）である。Ｃｏｔａｒａ（商標）［Ｐｅｒｒｅｇｒｉｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］は、再発性神経膠芽腫の治療について記載されているモノクローナル抗体である。他の抗体には、例えば、アバスチン、フィクラツズマブ、ｍｅｄｉ－５７５、及びオララツマブが含まれ得る。更に他の免疫グロブリン構築物又はモノクローナル抗体が、本明細書における使用のために選択され得る。例えば、Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，２０１３ Ｒｅｐｏｒｔ，ｐｐ．１－８７，ＰｈＲＭＡ’ｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＆ Ｐｕｂｌｉｃ Ａｆｆａｉｒｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．[phone]（参照により本明細書に組み込まれる）という刊行物を参照されたい。

【0387】

例えば、免疫原は、様々なウイルスファミリーから選択され得る。免疫応答が望まれるウイルスファミリーの例としては、感冒の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属を含むピコルナウイルスファミリー、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、及びＡ型肝炎ウイルスなどのヒトエンテロウイルスを含むエンテロウイルス属、並びに主に非ヒト動物における口蹄疫の原因であるアプトウイルス属が挙げられる。ピコルナウイルスファミリーのウイルス内で、標的抗原には、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びＶＰＧが含まれる。別のウイルスファミリーには、流行性胃腸炎の重要な原因物質であるノーウォーク群のウイルスを包含するカルシウイルスファミリーが含まれる。ヒト及び非ヒト動物において免疫応答を誘導するために抗原を標的化する際の使用に望ましいなお別のウイルスファミリーは、トガウイルスファミリーであり、これは、アルファウイルス属（シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、及びベネズエラ、東部及び西部ウマ脳炎を含む）、及びルビウイルス（風疹ウイルスを含む）を含む。フラビウイルスファミリーには、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎及びダニ媒介性脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原は、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、及びヒト呼吸器コロナウイルスなどの多数の非ヒトウイルスを含むＣ型肝炎又はコロナウイルスファミリーから生成され得、これらは感冒及び／又は非Ａ、Ｂ若しくはＣ型肝炎を引き起こし得る。コロナウイルスファミリー内では、標的抗原は、Ｅ１（Ｍ又はマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓ又はスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥ又はヘマグルチン－エルテロースとも呼ばれる）糖タンパク質（全てのコロナウイルスに存在するわけではない）、又はＮ（ヌクレオカプシド）を含む。更に他の抗原は、ベシクロウイルス属（例えば、水疱性口内炎ウイルス）及び一般的なリッサウイルス属（例えば、狂犬病）を含むラブドウイルスファミリーに対して標的化され得る。

【0388】

ラブドウイルスファミリー内で、適切な抗原は、Ｇタンパク質又はＮタンパク質に由来し得る。マールブルグ及びエボラウイルスなどの出血熱ウイルスを含むフィロウイルスファミリーは、抗原の適切な供給源であり得る。パラミクソウイルスファミリーには、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹ウイルス及びイヌジステンパーを含む麻疹ウイルス、並びに呼吸器合胞体ウイルスを含むニューモウイルスが含まれる。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルスファミリーに分類され、抗原（例えば、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）の適切な供給源である。ブニアウイルスファミリーには、ブニアウイルス属（カリフォルニア脳炎、Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ）、フレボウイルス属（リフトバレー熱）、ハンタウイルス属（ピュアマラ（puremala）はヘマハギン（hemahagin）熱ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）及び様々な未帰属ブニヤウイルス属が含まれる。アレナウイルスファミリーは、ＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルスファミリーには、レオウイルス属、ロタウイルス属（子供に急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス属、及びコルティウイルス属（コロラドだに熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）が含まれる。

【0389】

レトロウイルスファミリーには、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（simian immunodeficiency virus、ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（feline immunodeficiency virus、ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、及びスプマウイルスウイルスを含む）などのヒト及び獣医学的疾患を包含するオンコウイルス亜科が含まれる。レンチウイルスの中で、多くの適切な抗原が記載されており、標的として容易に選択することができる。適切なＨＩＶ及びＳＩＶ抗原の例としては、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、及びＲｅｖタンパク質、並びにそれらの様々な断片が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｅｎｖタンパク質の適切な断片は、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１などのそのサブユニットのいずれか、又は例えば、少なくとも約８アミノ酸長のそれらのより小さい断片を含み得る。同様に、ｔａｔタンパク質の断片を選択してもよい。［米国特許第５，８９１，９９４号及び同第６，１９３，９８１号を参照されたい］。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２－２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１）、及びＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４（６ Ａｐｒ．２００１）に記載されているＨＩＶ及びＳＩＶタンパク質も参照されたい）。別の例において、ＨＩＶ及び／又はＳＩＶ免疫原性タンパク質又はペプチドは、融合タンパク質又は他の免疫原性分子を形成するために使用され得る。例えば、２００１年８月２日に公開された国際公開第０１／５４７１９号及び１９９９年４月８日に公開された国際公開第９９／１６８８４号に記載されるＨＩＶ－１ Ｔａｔ及び／又はＮｅｆ融合タンパク質及び免疫レジメンを参照されたい。本発明は、本明細書に記載されるＨＩＶ及び／又はＳＩＶ免疫原性タンパク質又はペプチドに限定されない。更に、これらのタンパク質に対する様々な改変が記載されているか、又は当業者によって容易になされ得る。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記載されている修飾ｇａｇタンパク質を参照されたい。

【0390】

パポーバウイルスファミリーには、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス）及びパピローマウイルス亜科（がん又はパピローマの悪性進行に関連する）が含まれる。アデノウイルスファミリーには、呼吸器疾患及び／又は腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルスファミリーには、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルスが含まれる。ヘルペスウイルスファミリーには、単純ウイルス（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス属（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）の属を包含するアルファヘルペスウイルス亜科、並びにサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）の属を包含するベータヘルペスウイルス亜科、並びにリンフォクリプトウイルス、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス及びラジノウイルスの属を包含するガンマヘルペスウイルス亜科が含まれる。ポックスウイルスファミリーには、オルトポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）及びワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属を包含するコルドポックスウイルス亜科、並びにエントモポックスウイルス亜科が含まれる。ヘパドナウイルスファミリーには、Ｂ型肝炎ウイルスが含まれる。抗原の適切な供給源であり得る１つの未分類ウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。更に他のウイルス源には、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス及びブタ呼吸器及び生殖器症候群ウイルスが含まれ得る。アルファウイルスファミリーには、ウマ動脈炎ウイルス及び様々な脳炎ウイルスが含まれる。

【0391】

抗体の他の病原性標的には、例えばヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する細菌、真菌、寄生微生物又は多細胞寄生生物、あるいはがん細胞又は腫瘍細胞由来のものが含まれ得る。細菌性病原体の例としては、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、及びｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉを含む、病原性グラム陽性球菌が挙げられる。病原性グラム陰性球菌としては、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓが挙げられる。病原性腸内グラム陰性桿菌としては、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ及びｅｉｋｅｎｅｌｌａ；ｍｅｌｉｏｉｄｏｓｉｓ；ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｓｈｉｇｅｌｌａ；ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ；ｍｏｒａｘｅｌｌａ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ（軟下疳を引き起こす）；ｂｒｕｃｅｌｌａ；Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病を引き起こす）；ｙｅｒｓｉｎｉａ（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）；ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ及びｓｐｉｒｉｌｌｕｍが挙げられる。グラム陽性桿菌としては、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）、ｃｈｏｌｅｒａ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭素病）、ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）、及びバルトネラ症が挙げられる。病原性嫌気性細菌によって引き起こされる疾患としては、破傷風、ボツリヌス中毒症、他のクロストリジウム、結核、ハンセン病、及び他のマイコバクテリアが挙げられる。病原性スピロヘータ疾患としては、梅毒；トレポネーマ症：イチゴ腫、ピンタ、及び地方病性梅毒；並びにレプトスピラ症が挙げられる。高等病原体細菌及び病原性真菌によって引き起こされる他の感染症としては、放線菌症；ノカルディア症；クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症及びコクシジオイデス症；カンジダ症、アスペルギルス症、及びムコール菌症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症、ペトリエリジウム症、トルロプシス症、菌腫及び黒色真菌症；並びに白癬が挙げられる。リケッチア性感染症としては、発疹チフス、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、及びリケッチア痘が挙げられる。マイコプラズマ及びクラミジア感染の例としては、マイコプラズマ肺炎、鼡径リンパ肉芽腫症、オウム病、及び周産期クラミジア感染症が挙げられる。病原性真核生物は、病原性原生動物及び蠕虫を包含し、それによって生じる感染症としては、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈａｎｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、バベシア症、ジアルジア症、旋毛虫症、フィラリア症、住血吸虫症、線虫、吸虫又は吸虫類；及び条虫（サナダムシ）感染症が挙げられる。

【0392】

これらの生物及び／又はそれによって産生される毒素の多くは、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ［（ＣＤＣ），Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ］によって、生物学的攻撃における使用の可能性を有する薬剤として同定されている。例えば、これらの生物剤のいくつかとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ及びそのトキシン（ボツリヌス中毒症）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ（天然痘）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、及びウイルス性出血熱［フィロウイルス（例えば、エボラ、マールブルグ］、及びアレナウイルス［例えば、ラッサ、マチュポ］］（これらは全て現在カテゴリーＡ剤に分類されている）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属の種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（類鼻疽）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ及びそのトキシン（リシントキシン）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ及びそのトキシン（エプシロントキシン）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種及びそのトキシン（エンテロトキシンＢ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病）、水の安全性の脅威物（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、発疹チフス（Richettsia powazekii）、及びウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎）、（これらは全て現在カテゴリーＢ剤に分類されている）、並びにＮｉｐａｎウイルス及びハンタウイルス（これらは現在カテゴリーＣ剤として分類される）が挙げられる。更に、そのように分類されるか、又は異なるように分類される他の生物は、将来このような目的のために同定及び／又は使用され得る。本明細書中に記載されるウイルスベクター及び他の構築物は、これらの生物、ウイルス、それらの毒素又は他の副産物由来の抗原を標的化するために有用であり、これらの生物剤による感染又は他の有害反応を予防及び／又は処置することが容易に理解される。

【0393】

ウイルス感染を治療又は予防するための、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの有効用量又は治療有効用量は、そのような徴候及び／若しくは症状の退行若しくは排除を誘導することによるか、又はそのような徴候及び／若しくは症状の進行を阻害することによるかにかかわらず、治療される対象における感染の１つ以上の徴候及び／又は症状を緩和するのに十分である、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの量を指す。投与量は、投与される対象の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。本開示の実施形態では、例えば、成人ヒト対象におけるウイルス感染症を治療又は予防するための本開示の抗体又はその抗原結合断片の有効用量又は治療有効用量は、約０．０１～約２００ｍｇ／ｋｇ例えば、最大約１５０ｍｇ／ｋｇである。本開示の一実施形態では、投与量は、最大約１０．８又は１１グラム（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１グラム）である。疾患又は感染の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調整することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、初回用量で投与され、続いて１回又は複数回の二次用量で投与され得る。ある特定の実施形態では、初回用量の後に、初回用量とほぼ同じ又はそれ未満であり得る量の抗体又はその抗原結合断片の第２の又は複数の後続用量の投与が続いてもよく、後続用量は少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、又は少なくとも１４週間隔てられる。

【0394】

ｃｅＤＮＡベクターを投与される対象は、ウイルス感染、例えば、インフルエンザ感染症を有し得るか、又は感染を発症する素因があり得る。感染を発症する素因がある対象、又は感染（例えば、コロナウイルス又はインフルエンザウイルス）に罹患するリスクが高くあり得る対象としては、自己免疫性疾患のために免疫系が損なわれた対象、免疫抑制療法を受けている対象（例えば、臓器移植後に）、ヒト免疫不全症症候群（human immunodeficiency syndrome、ＨＩＶ）若しくは後天性免疫不全症候群（acquired immune deficiency syndrome、ＡＩＤＳ）に罹患している対象、白血球を枯渇若しくは破壊する貧血症の形態を有する対象、放射若しくは化学治療を受けている対象、又は炎症障害に罹患している対象が挙げられる。更に、非常に若い対象（例えば、５歳以下）又は高齢の対象（例えば、６５歳以上）は、リスクが高い。更に、対象は、疾患の発生に近接していること、例えば、対象が人口密度の高い都市に住んでいること、又はウイルスの感染が確認された若しくは疑われる対象に近接していること、又は雇用、例えば病院労働者、製薬研究者、感染地域への旅行者、若しくは頻繁なチラシの選択により、ウイルス感染に罹患するリスクがあり得る。

【0395】

本開示はまた、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、疾患又は障害、例えばウイルス感染のリスクがある対象に、そのような感染を予防するために予防的に投与することを包含する。「予防する」又は「予防すること」は、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを対象に投与して、対象の体内の疾患又は感染（例えば、ウイルス感染）の発現を阻害することを意味し、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、有効な又は治療上有効な量又は投与量で対象に投与された場合に有効である。

【0396】

いくつかの実施形態によれば、対象におけるウイルス感染の徴候又は症状は、例えば、ウイルス力価アッセイ（例えば、発育鶏卵におけるコロナウイルス増殖又はコロナウイルススパイクタンパク質アッセイ）によって決定される、対象の体内におけるウイルスの生存又は増殖である。ウイルス感染の他の徴候及び症状は、本明細書中で考察される。

【0397】

上記のように、いくつかの実施形態によれば、対象は非ヒト動物であってもよく、本明細書で考察される抗体及び抗原結合断片は、非ヒト動物（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジなど）における疾患を治療及び／又は予防するために獣医学的状況において使用されてもよい。

【0398】

開示は、ウイルス感染（例えば、コロナウイルス感染）を治療若しくは予防し、又はウイルス感染の少なくとも１つの徴候若しくは症状の退行を誘発し、又はその進行を除去若しくは阻害する方法であって、ウイルス感染は、例えば、発熱若しくは熱感／寒気を感じること、咳、咽喉炎、鼻水又は鼻づまり、くしゃみ、筋肉又は身体の痛み、頭痛、疲労（疲労感）、嘔吐、下痢、呼吸器感染、胸内苦悶、息切れ、気管支炎、及び／又は肺炎（本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片の発現のための治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを被験体に投与することにより、それを必要とする対象（例えば、ヒト）における、ウイルス感染に続発する徴候又は症状）の退行を誘導し、又はその進行を排除若しくは阻害する方法を提供する。

【0399】

Ａ．エクスビボ治療
いくつかの実施形態によれば、細胞を対象から除去し、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボの治療のために対象から細胞を取り出し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい、その開示は、その全体が本明細書に組み込まれる）。代替的に、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、又は任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。

【0400】

本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは、薬学的担体と組み合わせて「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全又は治癒的である必要はないことを理解するであろう。

【0401】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞内インビトロ、エクスビボ又はインビボで産生される、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片をコードすることができる。例えば、本明細書で考察される治療方法における本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原発現断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを培養した細胞に導入し、発現した抗体及びその抗原結合断片を、例えば、抗体及び融合タンパク質の産生のために細胞から単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む培養細胞は、抗体又は融合タンパク質の商業的産生に使用することができ、例えば、抗体又は融合タンパク質の小規模又は大規模バイオ製造の細胞源として役立つ。代替的な実施形態では、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、小規模な産生を含む抗体又は融合タンパク質のインビボ産生、並びに商業的な大規模な抗体及びその抗原結合断片の産生のために、宿主非ヒト対象の細胞に導入される。

【0402】

本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、獣医学及び医学の両方の用途で使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、及びキジ）及び哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、及びウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、年少者、及び成人を含む。

【0403】

Ｂ．用量範囲
本明細書では、本明細書に記載される抗体及びその抗原結合断片をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む治療方法が提供される。

【0404】

インビボ及び／又はインビトロアッセイを任意選択的に用いて、使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路及び病態の重症度に依存し、当業者の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれた用量反応曲線から推定され得る。

【0405】

本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに十分なレベルの遺伝子導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されたもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内及び気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。

【0406】

特定の「治療効果」を達成するために必要な、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子又はＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患又は障害、及び遺伝子、ＲＮＡ産物、又は得られる発現タンパク質の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化するであろう。当業者は、前述の因子並びに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患又は障害を有する患者を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。

【0407】

最適な治療応答を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、数回用量が毎日投与され得るか、又は治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、又は対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量及びスケジュールを容易に判定することができるであろう。

【0408】

臨床使用のための「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（例えば、神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注射は、多量を必要とする）であろう。例えば、ヒト対象の骨格筋又は心筋への直接インビボ注射の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ～１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなるであろう。ｃｅＤＮＡベクターを送達するためにエキソソーム又は微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ～約１００ｇのベクターを送達することが予想される。更に、治療有効量とは、疾患の症状のいくつか又はそれ以上の症状の低減をもたらすが、著しいオフターゲット又は著しい有害副作用には至らない、対象に影響を与えるのに十分な量の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡベクターの量である。いくつかの実施形態によれば、「治療有効量」は、所与の疾患症状の低減の統計的に有意な測定可能な変化をもたらすのに十分である、発現した抗体、及びその抗原結合断片の量である。そのような有効量は、所与のｃｅＤＮＡベクター組成物についての臨床試験及び動物実験で評価することができる。

【0409】

インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０^６細胞）に送達される本明細書に開示される、抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１～１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１～２０μｇ、より好ましくは１～１５μｇ又は８～１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より多い用量を必要とするであろう。エキソソーム又は微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定され得るが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。

【0410】

いくつかの実施形態によれば、対象の細胞に送達される抗体又はその抗原結合断片の量は、１～１０μｇ、例えば、１～９μｇ、１～８μｇ、１～７μｇ、１～６μｇ、１～５μｇ、２～９μｇ、２～８μｇ、２～７μｇ、２～６μｇ、２～５μｇ、３～９μｇ、３～８μｇ、３～７μｇ、３～６μｇ、３～５μｇ、４～９μｇ、４～８μｇ、４～７μｇ、４～６μｇ、４～５μｇ、５～１０μｇ、５～９μｇ、５～８μｇ、５～７μｇ、５～６μｇ、６～１０μｇ、６～９μｇ、６～８μｇ、６～７μｇ、７～１０μｇ、７～９μｇ、７～８μｇ、８～１０μｇ、８～９μｇ、９～１０μｇ又は１０μｇ以上である。

【0411】

治療は、単一用量又は複数回用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態によれば、２回用量以上を対象に投与され得る。実際、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルス性カプシドの不在に起因して、抗カプシド宿主免疫応答を誘起しないため、複数回用量が、必要に応じて投与され得る。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１～１００、好ましくは２～２０用量であり得る。

【0412】

任意の特定の理論に束縛されたくはないが、本開示によって記載されるｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫応答の欠失（すなわち、カプシド構成成分の不在）は、複数の場合に抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与することが可能になる。いくつかの実施形態によれば、核酸が対象に送達される場合の数は、２～１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回）である。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、１０回以上対象に送達される。

【0413】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、又は７暦日当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月当たり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日又は閏年では３６６日）当たり１回だけ対象に投与される。

【0414】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、０日目に投与される。０日目の初回治療に続いて、ｃｅＤＮＡベクターを用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、又は約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、又は約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１年、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年又は約５０年後に、２回目の投薬（再投与）を実施することができる。

【0415】

いくつかの実施形態によれば、治療用核酸の再投薬は、治療用核酸の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態によれば、初回投薬後の治療用核酸の発現と比較して、再投薬後の治療用核酸の発現の増加は、核酸の再投薬後、約０．５倍～約１０倍、約１倍～約５倍、約１倍～約２倍、又は約０．５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍高い。

【0416】

特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの２回以上の投与（例えば、２、３、４回又はそれ以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など）、所望のレベルの抗体発現を達成することができる。

【0417】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターによってコードされる抗体及びその抗原結合断片は、それが対象において少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月／１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年以上にわたって発現されるように、調節スイッチ、誘導性又は抑制性プロモーターによって調節され得る。いくつかの実施形態によれば、発現は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを所定の又は所望の間隔で繰り返し投与することによって達成することができる。

【0418】

本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合断片を発現するｃｅＤＮＡベクターは、追加の化合物と併用して投与することができる。

【0419】

Ｃ．単位剤形
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体及びその抗原結合断片の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的組成物は、単位剤形で都合よく提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態によれば、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態によれば、単位剤形は、吸入による投与のために適合される。いくつかの実施形態によれば、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態によれば、単位剤形は、噴霧器による投与のために適合される。いくつかの実施形態によれば、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態によれば、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、又は舌下投与のために適合される。

【0420】

Ｄ．ｃｅＤＮＡベクターを使用した良好な遺伝子発現の試験
当該技術分野で周知のアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡベクターによる抗体又はその抗原結合断片の遺伝子送達の効率を試験することができ、インビトロ及びインビボの両方のモデルで実施され得る。ｃｅＤＮＡによる抗体又はその抗原結合断片の発現のレベルは、抗体又はその抗原結合断片のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを測定することによって（例えば、逆転写ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ））当業者により評価され得る。一実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、例えば、蛍光顕微鏡法又は発光プレートリーダーによりレポータータンパク質の発現を調べることによって、抗体又はその抗原結合断片の発現を評価するために使用できるレポータータンパク質を含む。インビボ適用の場合、タンパク質機能アッセイを使用して、所与の抗体又はその抗原結合断片の機能を試験して、遺伝子発現が良好に起こったかどうかを判断することができる。当業者は、インビトロ又はインビボでｃｅＤＮＡベクターによって発現された抗体又はその抗原結合断片の機能性を測定するための最良の試験を決定することができるであろう。

【0421】

本明細書では、細胞又は対象におけるｃｅＤＮＡベクターからの抗体又はその抗原結合断片の遺伝子発現の効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年にわたって継続し得るか、又は永続的であり得ることが企図される。

【0422】

本出願全体を通して引用される；参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行する開示のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。

【実施例】

【0423】

以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。本明細書に記載される野生型又は修飾型ＩＴＲのうちのいずれかからｃｅＤＮＡベクターを構築できること、及び以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターの活性を構築し、評価できることを当業者は理解するであろう。これらの方法は、ある特定のｃｅＤＮＡベクターを用いて例示されているが、それらは、説明に沿って任意のｃｅＤＮＡベクターに適用可能である。

【0424】

実施例１：昆虫細胞ベースの方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを構築する
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号の実施例１に記載される。例えば、本開示のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも一方が、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）及び発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複製する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、Ｒｅｐタンパク質を介して、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、及び第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。

【0425】

ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ－プラスミドに由来する。図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの各々のポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲ及び右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列間に以下を有する：（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element、ＷＰＲＥ））、及び（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（bovine growth hormone gene、ＢＧＨｐＡ）由来）。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～Ｒ６）（図１Ａ及び図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入され、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）及びＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中で操作される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。

【0426】

ｃｅＤＮＡ－バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミド又は制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを生成した。バクミド及びトランスポサーゼプラスミドの形質転換体及び維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組換えバクミドを選択した。β－ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍｌの培地中で培養した。

【0427】

組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを、Ｅ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍｌの培地中で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞又は細胞残屑から分離した。

【0428】

任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍｌの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径及び約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に到達するまで、細胞直径及び生存率をモニタリングした。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に採取し、細胞及び残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。

【0429】

試験構築物を含むｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性又は力価を決定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５～２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。

【0430】

国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図８Ａに開示されるような「Ｒｅｐ－プラスミド」を、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１若しくは１３３）又はＲｅｐ６８（配列番号１３０）及びＲｅｐ５２（配列番号１３２）又はＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生した。Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）を含む正の選択によって、組換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍｌの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン）中に播種した。組換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。

【0431】

Ｓｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍｌの培地中で４日間培養し、感染性組換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス」）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍｌの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、又は濾過若しくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を決定した。具体的には、２．５×１０^６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日決定した。

【0432】

ｃｅＤＮＡベクター生成及び特徴付け
図４Ｂを参照して、次いで、（１）ｃｅＤＮＡ－バクミドを含有する試料又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス、及び（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００及び１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径及び生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達した場合、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを回収した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水又は緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＤＩ ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラム当たり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。

【0433】

Ｓｆ９昆虫細胞から産生及び精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定された。

【0434】

ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件又は変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって同定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断及びゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、並びに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体及び二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。

【0435】

単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載されるように）を、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、及びｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片について更に分析した。図４Ｄ及び図４Ｅに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクター及び直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂ及び２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂ及び４ｋｂ断片を産生することが期待される。

【0436】

したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化及び電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的閉鎖状ＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さである場合（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的閉鎖状ＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐ及び４０００ｂｐ）で溶解するであろう。更に、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、及びｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片として全て溶解する（図４Ｄを参照されたい）。

【0437】

本明細書で使用される場合、「未変性ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３倍及び２／３倍のＤＮＡベクター長の産物を生成するであろう目的のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲル及び変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキット又は脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ－２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０倍変性溶液（１０倍＝０．５Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１０倍色素を添加し、緩衝せず、１０倍変性溶液を、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ ＮａＯＨで以前にインキュベーションされた０．８～１．０％ゲル上で４倍に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲル及びゲルボックス中で均一であり、１倍変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズ及び所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解するであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１倍ＴＢＥ又はＴＡＥ中で中和し、蒸留水又は１倍ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含む１倍ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（核酸ゲル染料）（ＤＭＳＯ中１０，０００倍濃縮物）及び落射蛍光灯（青色）又はＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。

【0438】

生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ－プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に充填し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミドタイトレーションを使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、又は純度パーセントを決定することができる。

【0439】

比較目的のため、実施例１は、昆虫細胞ベースの方法及びポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用するｃｅＤＮＡベクターの産生を記載し、また参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１にも記載される。例えば、実施例１に従って本開示のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも一方が、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）及び発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複製する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、Ｒｅｐタンパク質を介して、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、及び第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。

【0440】

昆虫細胞を使用する方法でｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ－プラスミドに由来する。図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの各々のポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲ及び右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列間に以下を有する：（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、及び（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）由来）。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～Ｒ６）（図１Ａ及び図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入され、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）及びＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中で操作される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。

【0441】

ｃｅＤＮＡ－バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミド又は制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを生成した。バクミド及びトランスポサーゼプラスミドの形質転換体及び維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組換えバクミドを選択した。β－ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍｌの培地中で培養した。

【0442】

組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを、Ｅ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍｌの培地中で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞又は細胞残屑から分離した。

【0443】

任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍｌの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径及び約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に到達するまで、細胞直径及び生存率をモニタリングした。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に採取し、細胞及び残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。

【0444】

試験構築物を含むｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性又は力価を決定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５～２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日決定した。

【0445】

「Ｒｅｐ－プラスミド」は、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１若しくは１３３）又はＲｅｐ６８（配列番号１３０）及びＲｅｐ５２（配列番号１３２）又はＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生された。Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）を含む正の選択によって、組換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍｌの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン）中に播種した。組換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。

【0446】

Ｓｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍｌの培地中で４日間培養し、感染性組換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス」）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍｌの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、又は濾過若しくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を決定した。具体的には、２．５×１０^６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日決定した。

【0447】

ｃｅＤＮＡベクター生成及び特徴付け
次いで、（１）ｃｅＤＮＡ－バクミド又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを含有する試料、及び（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌ、２０ｍｌ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００及び１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径及び生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達した場合、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを回収した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水又は緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＤＩ ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラム当たり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。

【0448】

Ｓｆ９昆虫細胞から産生及び精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定された。精製されたｃｅＤＮＡベクターは、実施例５に記載される電気泳動方法論を使用して、適切な閉端構成について評価され得る。

【0449】

実施例２：二本鎖ＤＮＡ分子からの切除による合成ｃｅＤＮＡ産生
ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の実施例２～６に記載される。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。簡潔には、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の図７Ａ～図８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態によれば、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６を参照されたい）。

【0450】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。

【0451】

例示の目的のため、実施例２は、この方法を使用して生成された例示的な閉端ＤＮＡベクターとして、ｃｅＤＮＡベクターを産生することを説明する。しかしながら、この実施例では、ＩＴＲ及び発現カセット（例えば、核酸配列）を含む二本鎖ポリヌクレオチドの切除に続いて、本明細書に記載される遊離３’及び５’末端のライゲーションによって閉端ＤＮＡベクターを生成するインビトロ合成産生方法を例証するためにｃｅＤＮＡベクターが例示されているが、当業者は、上で例証されるように、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡなどを含むが、これらに限定されない任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが生成されるように、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子を修飾できることを認識する。実施例２に記載される合成産生方法により産生され得る抗体又は融合タンパク質の産生のための例示的なｃｅＤＮＡベクターは、「ＩＩＩ ｃｅＤＮＡベクター全般」と題されたセクションで論じられている。ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体及び融合タンパク質は、「ＩＩＣ ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体及び融合タンパク質」と題されたセクションに記載される。

【0452】

本方法は、（ｉ）二本鎖ＤＮＡ構築物から発現カセットをコードする配列を切除することと、（ｉｉ）ＩＴＲのうちの１つ以上でヘアピン構造を形成することと、（ｉｉｉ）ライゲーションによって、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって遊離５’及び３’末端を結合することと、を伴う。

【0453】

二本鎖ＤＮＡ構築物は、５’から３’への順に、第１の制限エンドヌクレアーゼ部位、上流ＩＴＲ、発現カセットと、下流ＩＴＲ、及び第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。次いで、二本鎖ＤＮＡ構築物を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ部位の両方で二本鎖切断を生成する。１つのエンドヌクレアーゼが両方の部位を標的化することも、制限部位がｃｅＤＮＡベクターテンプレート内に存在しない限り、各部位を異なるエンドヌクレアーゼによって標的化することもできる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列が、残りの二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される（国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の図９を参照されたい）。ライゲーションすると、閉端ＤＮＡベクターが形成される。

【0454】

この方法で使用されるＩＴＲの一方又は両方は、野生型ＩＴＲであり得る。修飾型ＩＴＲが使用されてもよく、ここで修飾は、Ｂ及びＢ’アーム並びに／又はＣ及びＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含み得（例えば、国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の図６～図８及び図１０、図１１Ｂを参照されたい）、２つ以上のヘアピンループ（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図６～図８、図１１Ｂを参照されたい）又は単一のヘアピンループ（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図１０Ａ～図１０Ｂ、図１１Ｂを参照されたい）を有し得る。ヘアピンループ修飾型ＩＴＲは、既存のオリゴの遺伝子修飾によって、又は新規の生物学的合成及び／若しくは化学的合成によって生成され得る。

【0455】

非限定的な例では、ＩＴＲ－６左及び右（配列番号１１１及び１１２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’アームに４０ヌクレオチドの欠失を含む。修飾型ＩＴＲに残っているヌクレオチドは、単一のヘアピン構造を形成すると予測される。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。機能的Ｒｅｐ結合部位又はＴｒｓ部位の任意の欠失を含む、ＩＴＲへの他の修飾を行うこともできる。

【0456】

実施例３：オリゴヌクレオチドの構築によるｃｅＤＮＡの産生
様々なオリゴヌクレオチドの構築を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５’オリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。国際出願ＰＴＣ／ＵＳ１９／１４１２２号の図１１Ｂは、５’ＩＴＲオリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。

【0457】

本明細書に開示されるように、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＷＴ－ＩＴＲ（例えば、図３Ａ、図３Ｃを参照されたい）、又は修飾型ＩＴＲ（例えば、図３Ｂ及び図３Ｄを参照されたい）を含み得る。（例えば、国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号（その全体が本明細書に組み込まれる）の図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、及び図７Ｂも参照されたい）。例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドには、限定されないが、配列番号１３４～１４５が含まれる（例えば、国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の表７を参照されたい）。修飾型ＩＴＲは、Ｂ及びＢ’アーム並びに／又はＣ及びＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含み得る。無細胞合成で使用される、本明細書に記載されるＷＴ－ＩＴＲ又はｍｏｄ－ＩＴＲを含むＩＴＲオリゴヌクレオチドは、遺伝子修飾又は生物学的及び／若しくは化学的合成によって生成することができる。本明細書で論じられるように、実施例２及び３のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、本明細書で論じられるように、対称又は非対称構成のＷＴ－ＩＴＲ又は修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を含み得る。

【0458】

実施例４：一本鎖ＤＮＡ分子によるｃｅＤＮＡ産生
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接しアンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合的に結合される２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成及び／又は産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５’及び３’末端を互いにライゲーションして、閉鎖状一本鎖分子を形成する。

【0459】

ｃｅＤＮＡベクターの産生のための例示的な一本鎖ＤＮＡ分子は、５’から３’に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、及び
アンチセンス第１のＩＴＲを含む。

【0460】

実施例４の例示的な方法で使用するための一本鎖ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される任意のＤＮＡ合成方法論、例えば、インビトロＤＮＡ合成によって形成され得るか、又はヌクレアーゼでＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）を切断し、得られたｄｓＤＮＡ断片を融解して、ｓｓＤＮＡ断片を提供することによって提供され得る。

【0461】

アニーリングは、センス配列及びアンチセンス配列の対の計算された融解温度を下回って温度を下げることによって達成され得る。融解温度は、特定のヌクレオチド塩基含有量、及び使用している溶液の特性、例えば、塩濃度に依存する。任意の所与の配列及び溶液の組み合わせの融解温度は、当業者によって容易に計算される。

【0462】

アニーリングされた分子の遊離５’及び３’末端は、互いにライゲーションされるか、又はヘアピン分子にライゲーションされてｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。好適な例示的ライゲーション方法論及びヘアピン分子は、実施例２及び３に記載される。

【0463】

実施例５：ｃｅＤＮＡの精製及び／又は産生の確認
例えば、実施例１に記載される昆虫細胞ベースの産生方法、又は実施例２～４に記載される合成産生方法を含む、本明細書に記載される方法によって産生されたＤＮＡベクター産物のいずれも、例えば、熟練者に一般に知られている方法を使用して、不純物、未使用の構成成分、又は副産物を除去するために精製することができ、かつ／又は分析して、産生されたＤＮＡベクター（この例では、ｃｅＤＮＡベクター）が所望の分子であることを確認することができる。ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡの精製のための例示的な方法は、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓ精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用すること及び／又はゲル精製によるものである。

【0464】

以下は、ｃｅＤＮＡベクターの同一性を確認するための例示的な方法である。

【0465】

ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件又は変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって同定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断及びゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、並びに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体及び二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。

【0466】

単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、精製されたＤＮＡを、選択された制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、及びｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画した場合に明らかに見えるほど十分に大きな、得られる断片について更に分析した。図４Ｃ及び図４Ｄに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクター及び直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂ及び２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、２ｋｂ及び４ｋｂ断片を産生することが期待される。

【0467】

したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化及び電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的閉鎖状ＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さである場合（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的閉鎖状ＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐ及び４０００ｂｐ）で溶解するであろう。更に、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、及びｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片として全て溶解する（図４Ｅを参照されたい）。

【0468】

本明細書で使用される場合、「未変性ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３倍及び２／３倍のＤＮＡベクター長の産物を生成するであろう目的のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲル及び変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキット又は脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ－２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０倍変性溶液（１０倍＝０．５Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１０倍色素を添加し、緩衝せず、１０倍変性溶液を、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ ＮａＯＨで以前にインキュベーションされた０．８～１．０％ゲル上で４倍に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲル及びゲルボックス中で均一であり、１倍変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズ及び所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解するであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１倍ＴＢＥ又はＴＡＥ中で中和し、蒸留水又は１倍ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含む１倍ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（核酸ゲル染料）（ＤＭＳＯ中１０，０００倍濃縮物）及び落射蛍光灯（青色）又はＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。前述のゲルベースの方法は、ｃｅＤＮＡベクターをゲルバンドから単離し、それを復元できるようにすることによって、精製目的に適合させることができる。

【0469】

生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ－プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に充填し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミドタイトレーションを使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、又は純度パーセントを決定することができる。

【0470】

実施例６：雄Ｒａｇ２マウスにおける静脈内送達を介してＣｏｖｉｄ Ａｂ構築物をスクリーニングするための研究。
ｃｅＤＮＡベクターは、上記の実施例１に記載される方法に従って産生した。

【0471】

本研究の目的は、ＬＮＰ及び免疫抑制剤ＴＫＩとしてのルクソリチニブ（ヤヌス関連キナーゼ（Janus Associated Kinase、ＪＡＫ）阻害剤）を介して送達された製剤化ｃｅＤＮＡの静脈内送達後のタンパク質発現を決定すること、並びに抗体ＨＣ単独、抗体ＬＣ単独、又は抗体ＨＣ及びＬＣを一緒に発現する様々なｃｅＤＮＡ構築物におけるタンパク質発現を比較することであった。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ａｂの重鎖（ＨＣ）をコードする核酸を含むｃｅＤＮＡ及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ａｂの軽鎖（ＬＣ）をコードする核酸を含むｃｅＤＮＡを、免疫抑制剤ＴＫＩ（例えば、ルキソリチニブ）と組み合わせてマウス（ｎ＝５）に投与した。研究設計及び詳細は、以下に示すように行われた。

【0472】

研究設計
表８は、研究のキナーゼ阻害剤投与成分の設計を示す。表８に示すように、雄Ｒａｇ２マウスの４つの群（ｎ＝５）に、ルキソリチニブ（３００ｍｇ／ｋｇ）を１０ｍＬ／ｋｇの用量体積で経口投与（ＰＯ）したか、又は投与しなかった。投与された動物については、投与は０日目、投与３０分前及び投与５時間後に行った。

【0473】

【表8】

Ｎｏ．＝番号、ＰＯ＝経口投与、ＲＯＡ＝投与経路、ｍｉｎ＝分、ｈｒ＝時間。投与及び阻害剤調製のためのビヒクルは、０．５％メチルセルロースである。

【0474】

表９は、研究の試験物質投与成分の設計を示している。表９に示すように、Ｒａｇ２マウスの４つの群（ｎ＝５）に、ビヒクル（群１）又は試験化合物（群２～４）を２ｍｇ／ｋｇの用量レベル及び５ｍＬ／ｋｇの用量体積で０日目に静脈内投与した。３５日目は研究の最終時点であった。群１はビヒクル対照であった。群２では、ｃｅＤＮＡ－１８５６（ＬＣをコードする）及びｃｅＤＮＡ－１８５９（ＨＣをコードする）構築物中のＬＣに対するＨＣのモル比は３：２（ＨＣ：LC）であり、二重ｃｅＤＮＡベクターをＬＮＰ１中で製剤化した。群３における単一ベクターｃｅＤＮＡ－２１５７ ｃｅＤＮＡ構築物は、ＬＮＰ１中に製剤化された二重ＯＲＦ、二方向性構築物であった。群４では、ｃｅＤＮＡ１８５６（ＬＣ）及びｃｅＤＮＡ１８５９（ＨＣ）構築物中のＬＣに対するＨＣのモル比は３：２（ＨＣ：LC）であり、二重ｃｅＤＮＡベクターを、ＬＮＰ１とは異なるＬＮＰ２中で製剤化した。研究で使用したｃｅＤＮＡ構築物及び／又はＯＲＦの配列を上記表７に示す。

【0475】

【表9】

Ｎｏ．＝番号、ＩＶ＝静脈内、ＲＯＡ＝投与経路

【0476】

試験系
試験系は以下の通りであった。
種：ハツカネズミ（Mus Musculus）
株：Ｒａｇ２（Ｂ６．１２９Ｓ６－Ｒａｇ２＜ｔｍ１Ｆｗａ＞）
雄の数：２５プラス２スペア
齢：到着時５週齢
供給源：Ｔａｃｏｎｉｃ

【0477】

ハウジング：群を、接触床敷を備えた透明なポリカーボネートケージに、動物をグループ化して収容した。

【0478】

食物及び水：動物に、Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｅｔ ５０５８、及び２．５～３．０の目標ｐＨに１Ｎ ＨＣｌで酸性化された濾過水道水が、自由に提供された。

【0479】

試験材料
化合物のクラス：組換えＤＮＡベクター：ｃｅＤＮＡ
用量製剤：試験物品は、アリコート投与できるように供給された。試験物品濃度を受領時に記録した。

【0480】

ストックを室温まで温め、使用直前に必要に応じて、提供されたＰＢＳですぐに希釈した。投与がすぐに実施されない場合、調製された材料を約４℃で保存した。

【0481】

阻害剤は、アリコートを投与できるように毎日供給された。経口胃管投与溶液を０．５％メチルセルロース中で製剤化した。製剤は、投与前に混合（ピペッティング）及び／又は超音波処理して、経口胃管栄養懸濁液の粒子を分散させた。

【0482】

用量投与：阻害剤を、１０ｍＬ／ｋｇで、ＰＯ投与（強制経口投与）によって、上記の表８に従って０日目に投薬した。阻害剤は、０日目のｃｅＤＮＡ投与の３０分（±５分）前及び５時間（±１０分）後に投与した。

【0483】

０日目に、側尾静脈への静脈内投与により試験材料の用量を投与した。用量は、５ｍＬ／ｋｇの用量体積で投与した。用量は、０．０１ｍＬ単位で四捨五入される。

【0484】

残留材料：全ての残留オープンストックを冷蔵庫に入れ、研究の生存期間部分の完了後に廃棄した。調製された投与材料は、投与の完了時に廃棄した。

【0485】

インライフ観察及び測定
ケージ側観察（動物の健康チェック）：ケージ側動物健康チェックは、少なくとも１日１回行われ、一般的な健康、死亡率、及び瀕死状態がチェックされた。

【0486】

臨床観察：臨床観察は、０日目（投与の６０～１２０分後及び勤務日の終わり（３～６時間後））及び１日目（０日目の試験材料投与の２２～２６時間後）に実施した。例外毎に追加の観察を行った。

【0487】

体重：全ての動物の体重を、０日目、１日目、２日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、２９日目、及び３５日目に記録した。必要に応じて、追加の体重を記録した。重量は、０．１ｇ単位で四捨五入した。

【0488】

血液採取
群１～５の全ての動物は、以下に示される表１０に従って、３日目、７日目、１４日目、２１日目及び２９日目に中間採血を行った。

【0489】

【表10】

【0490】

採取後、動物は、０．５～１．０ｍＬの乳酸リンゲル液を皮下投与された。

【0491】

血清のための全血を、尾静脈ニック、伏在静脈、又は眼窩洞穿刺（吸入イソフルラン下）によって収集した。全血は、凝固活性剤チューブを備えた血清分離器に収集され、２５μＬの２つの血清アリコートに処理された。

【0492】

全ての試料を、ドライアイス上で、輸送されるまで、表示上－７０℃で保存した。

【0493】

麻酔の回復：麻酔下の間、回復中、及び移動するまで、動物を継続的にモニタリングした。

【0494】

終末手順及び採取

【0495】

【表11】

ＭＯＶ＝取得可能な最大容量
^ａ全血を血清分離チューブに収集し、凝固活性剤を添加した

【0496】

終末血液：血清のための全血は、凝固活性剤チューブを備えた血清分離器内に採取され、施設のＳＯＰに従って、２つのアリコートの５０μＬの血清と１つのアリコートの残留物に処理された。全ての試料を、ドライアイス上で、輸送されるまで、表示上－７０℃で保存した。

【0497】

結果
抗スパイクヒトＩｇＧ（^＊＊＊）を使用して、本明細書に記載されるように抗体発現を検出し、これを、ｃｅＤＮＡ構築物の注射後３日目、７日目、１４日目、２１日目、２９日目及び３５日目に検出されたｎｇ／ｍｌ抗スパイクｈＩｇＧによって定量した。図６に示すように、ｃｅＤＮＡ－１８５６（ＬＣをコードする）及びｃｅＤＮＡ－１８５９（ＨＣをコードする）ベクターを有する１．５：１（ＨＣ：LC）のモル比を有する二重ｃｅＤＮＡ構築物を使用した場合、約１μｇ／ｍｌの抗スパイクｈＩｇＧが１４日目までに検出され、抗体レベルは３５日目まで連続的に上昇し、約８μｇ／ｍｌに達した。

【0498】

実施例７：ｃｅＤＮＡベクター最適化
上記のようなＬＮＰ１中にｃｅＤＮＡ－１８５６（ＬＣをコードする）及びｃｅＤＮＡ－１８５９（ＨＣをコードする）共製剤を含む二重ｃｅＤＮＡベクター構築物を、以下の実験で使用した。

【0499】

本研究の目的は、ＨＣ及びＬＣ：バイシストロン性カセット（ｃｅＤＮＡを含有するＩＲＥＳ又はフーリン２ Ａ切断部位）、二重ＯＲＦカセット（双方向性）、及び二重ベクターを発現させるための様々なベクター設計を使用して抗体発現を決定することであった。設計の概略図を図７Ａに示す。図７Ｂは、流体力学的送達後に測定されたベクター設計間の抗体の発現（抗Ｓｐｉｋｅ ｈｕＩｇＧ ｕｇ／ｍＬの検出による）を比較する実験の結果を示す。図７Ｂに示されるように、肝臓特異的、二重ＯＲＦ及び二重ベクター設計を１：１のＨＣ：ＬＣのモル比で使用することにより、高い抗体発現をもたらした。データはまた、ベクターが流体力学的に送達される場合、ＨＣ－ＬＣ含有抗体の最適な発現のために、二重ベクターアプローチが単一ベクター設計よりも優れていることを示している（図７Ｂ）。更なる実験では、ＬＮＰ製剤（「ＬＮＰ１」）中のｃｅＤＮＡ二重ベクターフォーマットにおけるＨＣ及びＬＣの送達（ｃｅＤＮＡ－１；二重ベクター－ＬＮＰ１又はＬＮＰ２）（図６に示されるような）又は二重ＯＲＦ（ｃｅＤＮＡ－２；二重ＯＲＦ－ＬＮＰ１）は、３５日間の研究期間にわたって、これらのｃｅＤＮＡフォーマットとＬＮＰ製剤との間の抗体の発現を決定することによって（一例として抗Ｓｐｉｋｅ ｈｕＩｇＧ ｕｇ／ｍＬの検出によって）を比較した。
図７Ｃは、ｃｅＤＮＡ－１８５６（ＬＣをコードする）及びｃｅＤＮＡ－１８５９（ＨＣをコードする）の両方を封入したＬＮＰ（「二重ベクター」フォーマット）送達、並びに３５日目までの抗Ｓｐｉｋｅ ｈｕＩｇＧの得られたロバストな発現の結果を示す。図７Ｃに示されるように、二重ベクターのＬＮＰ送達は、３５日目に約８ｕｇ／ｍＬの抗Ｓｐｉｋｅ ｈＩｇＧ濃度を達成した。したがって、２つのｃｅＤＮＡ構築物（ｃｅＤＮＡ１８５６（ＬＣ）及びｃｅＤＮＡ１８５９（ＨＣ）、図７Ｃ、「ｃｅＤＮＡ－１」）を封入するＬＮＰを有する二重ベクター設計の発現は、肝細胞ｉインビボに送達することができ、単一二重ＯＲＦ ｃｅＤＮＡフォーマット（図７Ｃ、「ｃｅＤＮＡ－２」）と比較して、ｍＡｂ発現を最適化するための更なる自由度を可能にする。

【0500】

図８は、７日目に流体力学的送達後に抗体ＨＣ及びＬＣを発現するための、１．５：１（ＨＣ：LC）のモル比でのｃｅＤＮＡ二重ベクター設計（「ｃｅＤＮＡ－１」）とｃｅＤＮＡ二重ＯＲＦ設計（「ｃｅＤＮＡ－２」）との間の抗体発現の用量依存的増加を比較する。図８に示されるように、１８５６（ＬＣ）及び１８５９（ＨＣ）二重ベクターのｃｅＤＮＡフォーマット（１．５：１；ＨＣ：ＬＣ）及び二重ＯＲＦ設計は双方とも、発現の用量依存的増加を示し、最適な二重ベクター設計は、二重ＯＲＦ設計と比較して５～１０倍高い活性をもたらしたことを示した。

【0501】

一般に、抗Ｓｐｉｋｅ ｈＩｇＧ濃度の血清レベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。要するに、精製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ（登録商標）、カタログ番号４６３２８）を９６ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ（登録商標）、カタログ番号６５５０８５）上に、ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））中、２μｇ／ｍＬでコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートした。次いで、３００μＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号３７５１５）を用いて、室温で２時間、非特異的結合をブロックした。これらをウェル当たり３００μＬの１×ＰＢＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））で３回洗浄した。試料及び参照標準希釈物を、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｅｒｕｍ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カタログ番号６４９）中で調製し、１００μＬのこれらの希釈物を二連で各ウェルに添加した。プレートを５００ｒｐｍで穏やかに振盪しながら室温で６０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、吸収紙上で軽くたたいて過剰な液体を除去した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ酵素結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号３１４１０）をＧｅｎｅｒａｌ Ｓｅｒｕｍ Ｄｉｌｕｅｎｔで１：５０００に希釈し、１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で６０分間、５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。最後に、１００μＬの基質溶液（ＫＰＬＳＵＲＥＢＬＵＥ（商標）ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＳｅｒａＣａｒｅ（登録商標）、カタログ番号５１２０－００７７）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートした。１００μＬの停止溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ（登録商標）、カタログ番号５１５０－００２０）を各ウェルに添加し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。結果を標準曲線から内挿した。

【0502】

インビトロトランスフェクション例
ｃｅＤＮＡ－１８５６（ＬＣをコードする）及びｃｅＤＮＡ－１８５９（ＨＣをコードする）を含む二重形式のｃｅＤＮＡベクター構築物を、ＨＣ及びＬＣの様々なモル比で試験して、抗体発現のためのＨＣ：ＬＣの最適モル比が存在するかどうかを決定した。このアッセイは、重鎖及び軽鎖をコードする合計１０ｎｇのｃｅＤＮＡでトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞を使用した。上清を７２時間後に回収し、抗スパイクｈＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。

【0503】

ヒト肝がんＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＢ－８０６５）を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号１６１４００７１）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号１５１４０１６３）で補充した、ＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号１０５６９０１０）中で培養した。細胞を、９５％空気及び５％ＣＯ_２を含有する飽和湿度雰囲気中、３７℃で維持した。細胞（３×１０^４細胞／ウェル）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、カタログ番号３５４６５０）に播種し、１０％ＦＢＳで補充した、１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭ培地中で２４時間培養し、トランスフェクション前に約７０～８０％コンフルエンスに達した。２４時間後、ＨｅｐＧ２細胞を、各ウェルについて総量１００ｎｇのＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。ここで、ｃｅＤＮＡ量は１０ｎｇであり、残りは、製造業者のプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号Ｌ３００００１５）を使用したキャリアＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、カタログ番号Ｅ４８８２）であった。簡単に説明すると、トランスフェクションのために、別々のチューブにおいて、必要量のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬、異なる重鎖対軽鎖モル比のＤＮＡをそれぞれ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号３１９８５－０６２）中で希釈し、次いでＰ３０００試薬を希釈したＤＮＡに添加した。Ｐ３０００試薬で希釈したＤＮＡを、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬に添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、得られた複合体１０μＬを、新たに補充した完全培地中の細胞に添加し、トランスフェクションプレートを３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。トランスフェクション後７２時間後に、トランスフェクション上清中の抗体価を測定した。図９は、ＨＣ：ＬＣのモル比のインビトロスクリーニングを示し、ｃｅＤＮＡによる肝臓ＩｇＧ発現は、より高いＨＣ：ＬＣモル比である１．５：１～２：１の範囲で増強された。図９に示されるように、３：２のＨＣ対ＬＣモル比（１．５：１）が、二重ベクターｃｅＤＮＡ構築物対に最適であった。

【0504】

流体力学的インビボ実施例
次に、様々なモル比のＨＣ及びＬＣを有するｃｅＤＮＡベクター構築物を使用して、インビボスクリーニングを行った。１つの群は、ＨＣをコードするｃｅＤＮＡの固定用量を含む製剤を使用し、ＬＣをコードするｃｅＤＮＡの用量を変化させた。簡単に説明すると、ｃｅＤＮＡを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（６週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、流体力学的静脈内（ＩＶ）注射によって送達した。ｃｅＤＮＡをＰＢＳに希釈し、５秒にわたって外側尾静脈に固定体積（９０～１００ｍＬ／ｇ）で急速に注射した。ｃｅＤＮＡｓをコードする重鎖（ｃｅＤＮＡ １８５９）及び軽鎖（ｃｅＤＮＡ １８５６）を予め混合し、特定のモル比で送達した。動物に、固定用量の重鎖又は軽鎖のいずれか、及び漸増用量の同族鎖を投与した。投与後３日目に、試験のために血清試料を収集した。

【0505】

図１０に示されるように、ＬＣ又はＨＣのいずれかをコードするｃｅＤＮＡの固定用量で、ＨＣの用量の増加は発現を改善したが、ＬＣ用量の増加は限定された効果しか有さなかった。この結果は、インビトロ結果と一致しており、ＨＣ：ＬＣ＞１～２が好ましいことを示唆している。

【0506】

まとめると、本明細書に報告される結果は、構築物設計への重要な洞察、並びにｃｅＤＮＡベクター設計を更に最適化する機会、並びに抗体治療剤又は診断薬を対象に送達するためのＨＣ：ＬＣモル比を提供する。結果は、ＬＮＰにおける二重ベクターによる機能的発現が、ｍＡｂ発現を最適化するための更なる自由度を可能にすることを示した。更に、結果は、共通の発現カセットがＨＣ及びＬＣの両方に使用され得、そして単一の二重ＯＲＦ又はＦ／２Ａベクターを用いて発現を最適化する必要性を潜在的に除去することを示した。

【0507】

実施例８：細胞株から産生された組換え抗ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ Ｓ抗体対ｃｅＤＮＡ二重ベクター（ＨＣ／ＬＣ）で処置されたマウスから産生及び精製された抗ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ Ｓ抗体の比較インビトロエフェクター機能研究。
この研究の目的は、プラスミド由来及びｃｅＤＮＡ由来の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体の結合親和性を比較することであった。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、Ｓｔｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，３５３（６３０１）：８２３－８２６）に記載される方法を使用して、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＨＣ及びＬＣを発現するプラスミドで一過的に同時トランスフェクトして、プラスミド由来モノクローナル抗体を生成した。ｃｅＤＮＡ由来の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体は、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＨＣ又はＬＣをコードする裸のｃｅＤＮＡをＣ５７／Ｂｌ６マウスの尾静脈へ流体力学的ＩＶ注射することによって生成した。この方法によるＤＮＡの送達は、主に肝臓における効率的な外来ＤＮＡのインビボトランスフェクションをもたらした。（例えば、Ｋｉｍ ＆ Ａｈｉｔｕｖ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；１０１５：２７９－２８９を参照されたい）。このようにして、マウスの肝臓から抗体を産生させ、次いで血清から採取及び精製して、ｃｅＤＮＡ産生抗体を得た。

【0508】

抗体１及び抗体２は、２００３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ生存者から同定された親抗体に由来する改変抗体である。抗体１及び抗体２の両方の可変領域は、延長された半減期を有するように開発されており、抗体１は単一の「ＬＳ」変異で操作され、抗体２は二重の「ＬＳ」及び「ＧＡＡＬＩＥ」修飾で操作されている。具体的には、両方の抗体は、新生児Ｆｃ受容体に結合することによって延長された半減期を付与する、本明細書で定義されるＦｃ「ＬＳ」変異を有する。Ｆｃに対する本明細書で定義される追加の「ＧＡＡＬＩＥ」修飾を除いて、抗体２は抗体１と同一である。「ＧＡＡＬＩＥ」修飾はインビトロで、とりわけＦｃγＲＩＩＩａ受容体への結合を増強し、ウイルス呼吸器感染インビボに関連して防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発することが示されている。

【0509】

以下の抗体：トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からインビトロで組換え産生された、単一の「ＬＳ」変異体である抗体１（細胞株由来）、流体力学的ＩＶ注射を介してｃｅＤＮＡ（本明細書に記載されるＨＣ及びＬＣ）で処置されたマウスにおいて産生され、注射の３日後に処置されたマウスの血清から精製された、単一「ＬＳ」変異体であるｃｅＤＮＡ抗体１；ＣＨＯ細胞からインビトロで組換え産生された、二重「ＬＳ」及び「ＧＡＡＬＩＥ」修飾を有する抗体２；流体ＩＶ注射を介して本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ ＨＣ／ＬＣ二重ベクターで処置されたマウスにおいて産生され、流体力学的注射の３日後に処置されたマウスの血清から精製された、二重「ＬＳ」及び「ＧＡＡＬＩＥ」修飾を有するｃｅＤＮＡ抗体２を試験した。解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定するために、ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＦＡＢ２Ｇバイオセンサーのベースラインを、まず、（ＰＢＳ中０．０２％ＢＳＡ、０．００４％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）を含有する２×緩衝液中で６０秒間較正した。次いで、抗体試料を３０ｎＭで３００秒間ロードした。バイオセンサーを、上記と同じタイプの緩衝液中で再びベースラインにした。次いで、様々な濃度（約３ｎＭ～約３００ｎＭ、この範囲内の４～７種の異なる濃度を適用）のＦｃγＲＩＩＩａ受容体（「Ｖ」と命名された多形体又は「Ｆ」と命名された多形体のいずれか）を試験抗体と４８０秒間会合させ、次いで４８０秒間解離させ、解離定数（Ｋ_Ｄ）値をバイオセンサーによって測定し、ソフトウェアＯＣＴＥＴ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｔｕｄｉｏを使用して計算した。

【0510】

解離定数（Ｋ_Ｄ）値を表１２に示し、ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖについては図１１Ａ及びＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆについては図１１Ｂにも示す。表１２はまた、測定及び計算されたＫ_Ｄ値の全てが＞０．９５の統計的回帰値（Ｒ^２）を有したことを示し、それによって、測定されたデータの全てが回帰モデルに非常によく適合することを示す。

【0511】

【表12】

【0512】

より低いＫ_Ｄ値は、より高い結合親和性を示す。表１２並びに図１１Ａ及び図１１Ｂに見られるように、抗体がｃｅＤＮＡを流体力学的に注射されたマウスから産生された場合、組換え産生された抗体（「細胞株」）と比較して、受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆ）に対する抗体の結合親和性が劇的に増加した。予想通り、抗体２は、細胞株由来であろうとｃｅＤＮＡ由来であろうと、ＦｃγＲＩＩＩａ－ＶであろうとＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆであろうと、それぞれの抗体１対応物よりも高い結合親和性を示した。しかしながら、ｃｅＤＮＡ由来抗体（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ ＨＣ／ＬＣ二重ベクター）のインビボ肝臓発現は、従来の哺乳動物細胞株から組換え産生されたモノクローナル抗体のものと比較して、はるかに優れた結合効力を達成した。理論に束縛されるものではないが、これは、Ｌ－フコース糖をＧＤＰ－フコースドナー基質からアクセプター基質に転移させる酵素であるフコシルトランスフェラーゼが存在しないと予想される肝臓から産生されるｃｅＤＮＡ由来抗体のアフコシル化レベルの上昇による可能性がある。これは、次に、抗体がアフコシル化される場合、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）も増加するので、エフェクター機能のレベルの増加をもたらし得る。

【0513】

総合すると、これらの結果は、ｃｅＤＮＡ由来抗体を生成するための肝臓へのｃｅＤＮＡの送達が、ＦｃγＲＩＩＩａに対する増強された親和性を有する抗体の産生をもたらし、治療用抗体産生インビボのための新規かつ改善されたプラットフォームを表すことを実証する。

【0514】

実施例９：細胞株由来及びｃｅＤＮＡ由来の抗ＶＥＧＦ抗体の比較インビトロエフェクター機能研究
この研究の目的は、細胞株由来及びｃｅＤＮＡ由来の抗ＶＥＧＦ抗体の結合親和性を比較することである。ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブ及びラニビズマブが使用される。

【0515】

ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、Ｓｔｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，３５３（６３０１）：８２３－８２６）に記載される方法を使用して、ベバシズマブ（Ｆａｂ重鎖：受託番号７Ｖ５Ｎ＿Ｆ、Ｆａｂ軽鎖：受託番号７Ｖ５Ｎ＿Ｅ）又はラニビズマブ（重鎖ＡＢ断片：受託番号ＱＷＸ９３３８８．１、軽鎖Ａｂ断片：受託番号ＱＷＸ９３３８９．１）を発現するプラスミドで一過的に同時トランスフェクトして、細胞株由来モノクローナル抗体を生成した。ｃｅＤＮＡ由来のベバシズマブ及びラニビズマブは、ベバシズマブ及びラニビズマブをコードする裸のｃｅＤＮＡを、本明細書に記載される単一ベクター系又は二重ベクター系のいずれかで、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの尾静脈に流体力学的ＩＶ注射することによって生成される。この方法によるｃｅＤＮＡの送達は、主に肝臓におけるｃｅＤＮＡの効率的なインビボトランスフェクションをもたらす（例えば、Ｋｉｍ ＆ Ａｈｉｔｕｖ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；１０１５：２７９－２８９を参照されたい）。したがって、マウスの肝臓から産生され、次いで血清から採取及び精製された得られた抗ＶＥＧＦ抗体は、ＣＨＯ細胞から産生されたそれらの対応物と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａに対するより高い結合親和性及び高められたレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。

【0516】

これはまた、ＦｃγＲＩＩＩａに対してより高い結合親和性を有する抗体による治療を必要とするヒト対象の肝臓から、ＦｃγＲＩＩＩａに対して増加したレベルの結合親和性を有する抗体を産生するために、強力な治療剤としてｃｅＤＮＡを効果的に実施することができることを示唆する。

【0517】

参考文献
特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書及び本明細書の実施例で引用される全ての刊行物及び参考文献は、あたかも個々の刊行物又は参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それらの全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物及び参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

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【国際調査報告】