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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】ＡＡＶカプシドおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/35 20060101AFI20240403BHJP
C07K 14/015 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240403BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240403BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240403BHJP
【ＦＩ】
C12N15/35
C07K14/015 ZNA
C12N15/864 100Z
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/11 Z
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565981
(86)(22)【出願日】2022-04-27
(85)【翻訳文提出日】2023-12-20
(86)【国際出願番号】 US2022026608
(87)【国際公開番号】W WO2022232327
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】63/180,320
(32)【優先日】2021-04-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ムソリーノ，パトリシア エル．
(72)【発明者】
【氏名】マグワイア，ケイシー エー．
(72)【発明者】
【氏名】ハドリー，エロイーズ
(72)【発明者】
【氏名】ハンロン，キリアン エス．
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA20
4H045EA21
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書において、脳血管系、主に内皮細胞および周皮細胞、ならびに平滑筋細胞の効率的なＡＡＶ形質導入を媒介するカプシドペプチド、組成物（ＡＡＶを含む）、ならびにそれを使用する方法が記載される。本発明の実施形態は、配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を包含する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも４つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項2】
配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも５つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項3】
配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項4】
ＡＡＶがＡＡＶ９である、請求項１～３に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項5】
ＡＡＶ９ ＶＰ１を含む、請求項１～４に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項6】
ターゲッティング配列が、配列番号１４のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入される、請求項５に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項7】
請求項１～６に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸。
【請求項8】
請求項１～６に記載のカプシドタンパク質を含むＡＡＶ。
【請求項9】
導入遺伝子、好ましくは治療導入遺伝子をさらに含む、請求項８に記載のＡＡＶ。
【請求項10】
［Ｄ／Ｐ］ＰＳＴ（配列番号９）を含むターゲッティング配列。
【請求項11】
配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも４つの連続するアミノ酸を含むターゲッティング配列。
【請求項12】
請求項１０～１１に記載のターゲッティング配列と異種配列とを含む融合タンパク質。
【請求項13】
請求項１０～１１に記載のターゲッティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項14】
ＡＡＶ９ ＶＰ１を含む、請求項１３に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項15】
前記ターゲッティング配列が、配列番号１４のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入される、請求項１４に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項16】
請求項１０～１６に記載のターゲッティング配列、融合タンパク質、またはＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸。
【請求項17】
請求項１３～１５に記載のカプシドタンパク質を含むＡＡＶ。
【請求項18】
導入遺伝子、好ましくは治療導入遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載のＡＡＶ。
【請求項19】
導入遺伝子を細胞に送達する方法であって、前記細胞を請求項１～９、１７、または１８に記載のＡＡＶと接触させるステップを含む方法。
【請求項20】
前記細胞が、血管内皮細胞または平滑筋細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞が、周皮細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞が、生きた対象に存在する、請求項１９～２１に記載の方法。
【請求項23】
前記対象が、哺乳動物対象である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記細胞が、脳、脊髄、後根神経節、心臓、肝臓、または平滑筋、およびそれらの組合せから選択される組織に存在する、請求項１９～２３に記載の方法。
【請求項25】
前記対象が、中枢神経系の血管系に影響を及ぼす疾患、場合により、ＩＶ型コラーゲンＡ１またはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）における変異に関連する疾患を患う、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記対象が、神経変性疾患、場合により、パーキンソン病またはアルツハイマー病を患う、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞が、対象の脳に存在し、前記ＡＡＶが、非経口送達によって投与される、請求項１９～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項28】
前記非経口送達が、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内送達によってなされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞が、対象の脳に存在し、前記ＡＡＶが、静脈内送達によって投与される、請求項１９～２７のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
導入遺伝子をさらに含み、前記導入遺伝子が、ニュールツリン；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）；中脳星状細胞由来神経因子（ＭＡＮＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）；Ｔａｕ抗体；アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）抗体；ＩＶ型コラーゲンＡ１もしくはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）をコードする、請求項１～１８のいずれかに記載のＡＡＶ。
【請求項31】
前記導入遺伝子が、ニュールツリン；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）；中脳星状細胞由来神経因子（ＭＡＮＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）；Ｔａｕ抗体；アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）抗体；ＩＶ型コラーゲンＡ１もしくはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）をコードする、請求項１９～２９のいずれかに記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権主張
本出願は、２０２１年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８０，３２０号の利益を主張するものである。先述の文献の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２１年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８０，３２０号の利益を主張するものである。先述の文献の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【0002】
連邦政府による支援を受けた研究または開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって認められた認可番号ＤＣ０１７１１７の下において政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって認められた認可番号ＤＣ０１７１１７の下において政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
本明細書において、脳血管系、主に内皮細胞および周皮細胞、ならびに平滑筋細胞の効率的なＡＡＶ形質導入を媒介するカプシドペプチド、組成物（ＡＡＶを含む）、ならびにそれを使用する方法が記載される。
【背景技術】
【0004】
神経変性および脳血管疾患は、基本的な微小血管機能障害を共有しており、脳の内皮、平滑筋細胞、および周皮細胞への選択的導入遺伝子送達は、遺伝子を標的にした治療介入を可能にし得る。脳血管系は、中枢神経系全体におけるその高い密度により、ニューロンおよびグリア細胞への分泌された治療タンパク質の供給源としても機能することができる。
【発明の概要】
【0005】
静脈内（ｉｖ）送達の後に脳に輸送されるカプシドを単離するために、ヘプタマーペプチドライブラリを表すアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）カプシド足場による２回のインビボ選別を実施した。主にニューロンおよび星状細胞を形質導入する親カプシドＡＡＶ９とは対照的に、脳血管系、主に内皮細胞および周皮細胞、ならびに平滑筋細胞の効率的な形質導入を媒介するいくつかのカプシドが識別された。
【0006】
配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも４つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも５つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【0007】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【0008】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶ９である。
【0009】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９ ＶＰ１を含む。いくつかの実施形態において、ターゲッティング配列は、配列番号１４のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入される。
【0010】
本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸も、本明細書において提供される。
【0011】
さらに、本明細書に記載のカプシドタンパク質を含むＡＡＶが提供される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、導入遺伝子、好ましくは治療導入遺伝子をさらに含む。
【0012】
さらに、［Ｄ／Ｐ］ＰＳＴ（配列番号９）を含むターゲッティング配列が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ターゲッティング配列は、配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）からの少なくとも４つの連続するアミノ酸を含む。本明細書に記載のターゲッティング配列と、異種配列とを含む融合タンパク質が、さらに提供される。ターゲッティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質も提供され、例えば、この場合、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９ ＶＰ１を含む。いくつかの実施形態において、ターゲッティング配列は、配列番号１４のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入される。ターゲッティング配列、融合タンパク質、またはＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸、ならびにカプシドタンパク質を含むＡＡＶも提供される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、導入遺伝子、好ましくは治療導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ニュールツリン；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）；中脳星状細胞由来神経因子（ＭＡＮＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）；Ｔａｕ抗体；アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）抗体；ＩＶ型コラーゲンＡ１またはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）をコードする。他の例示的導入遺伝子としては、本明細書に記載されたものが挙げられる。
【0013】
配列、例えば導入遺伝子を細胞に送達する方法も、本明細書において提供され、方法は、細胞を、本明細書に記載のＡＡＶと接触させるステップを含む。細胞への配列の送達において使用するための本明細書に記載のＡＡＶも、提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、血管内皮細胞または平滑筋細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、周皮細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、生きた対象、例えば、哺乳動物対象に存在する。
【0014】
いくつかの実施形態において、細胞は、脳、脊髄、後根神経節、心臓、肝臓、または平滑筋、およびそれらの組合せから選択される組織に存在する。
【0015】
いくつかの実施形態において、対象は、中枢神経系の血管系に影響を及ぼす疾患、場合により、ＩＶ型コラーゲンＡ１もしくはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）における変異に関連する疾患を患う。
【0016】
いくつかの実施形態において、対象は、神経変性疾患、例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病を患う。
【0017】
いくつかの実施形態において、細胞は、対象の脳に存在し、ＡＡＶは、非経口送達によって投与される。いくつかの実施形態において、非経口送達は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内送達によってなされる。
【0018】
いくつかの実施形態において、細胞は、対象の脳に存在し、ＡＡＶは、静脈内送達によって投与される。
【0019】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ニュールツリン；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）；中脳星状細胞由来神経因子（ＭＡＮＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）；Ｔａｕ抗体；アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）抗体；ＩＶ型コラーゲンＡ１もしくはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）をコードする。他の例示的導入遺伝子としては、本明細書に記載されたものが挙げられる。
【0020】
特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書において記載され；当技術分野において既知の他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は、例証に過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース入力項目、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本明細書と相反する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。
【0021】
本発明の他の特徴および利点は、以下に述べる詳細な記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1-1】ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅが遺伝子導入Ａｉ９マウスにおける血管系指向性形質導入（vasculature-tropic transduction）を媒介する図である（ＣＡＧ－ｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）。マウスにＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により全身投与し、３週間後に犠牲にした。（Ａ）ＡＡＶ－ＰＲによる血管系形質導入を示すｔｄＴｏｍａｔｏ免疫蛍光の全半球画像。（Ｂ）形質導入された血管系およびＤＡＰＩを表す皮質領域の画像。（Ｃ～Ｄ）形質導入された血管系を示す（ｂ）からの囲み領域の高倍率画像。
【図1-2】ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅが遺伝子導入Ａｉ９マウスにおける血管系指向性形質導入（vasculature-tropic transduction）を媒介する図である（ＣＡＧ－ｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）。マウスにＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により全身投与し、３週間後に犠牲にした。（Ｅ）ＡＡＶ－ＭＡ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により投与されたマウスからの画像（４倍）。
【図1-3】ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅが遺伝子導入Ａｉ９マウスにおける血管系指向性形質導入（vasculature-tropic transduction）を媒介する図である（ＣＡＧ－ｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）。マウスにＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により全身投与し、３週間後に犠牲にした。（Ｆ）ＡＡＶ－ＭＡ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により投与されたマウスからの画像（１０倍）。
【図1-4】ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅが遺伝子導入Ａｉ９マウスにおける血管系指向性形質導入（vasculature-tropic transduction）を媒介する図である（ＣＡＧ－ｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）。マウスにＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により全身投与し、３週間後に犠牲にした。（Ｇ）ＡＡＶ－ＳＱ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により投与されたマウスからの画像（１０倍）。
【図1-5】ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅが遺伝子導入Ａｉ９マウスにおける血管系指向性形質導入（vasculature-tropic transduction）を媒介する図である（ＣＡＧ－ｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）。マウスにＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により全身投与し、３週間後に犠牲にした。（Ｈ）ＡＡＶ－ＭＬ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを注射により投与されたマウスからの画像（４倍）。
【図2-1】ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰ媒介血管形質導入が時間経過において減少する図である。成体の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに３×１０１０ｖｇ／マウスの自己相補性ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰを注射により静脈内投与し、ＧＦＰ分析のために５日目および２８日目に殺した。Ａ．形質導入の血管を示す体性感覚皮質、線状体、および視床下部の２０μｍの冠状切片の代表的２０倍画像。分析領域は画像の右への脳図面の正方形の画像で表される。
【図2-2】ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰ媒介血管形質導入が時間経過において減少する図である。成体の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに３×１０１０ｖｇ／マウスの自己相補性ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰを注射により静脈内投与し、ＧＦＰ分析のために５日目および２８日目に殺した。Ｂ．５日目および２８日目の３つの分析領域におけるＧＦＰ蛍光強度の定量化（それぞれ、皮質、＊＊＊はｐ＝０．０００４を表し；線状体、＊はｐ＝０．０１３５を表し；視床下部、＊はｐ＝０．０００６を表す）。
【図3】脳全体におけるＡＡＶゲノムが時間経過においてあまり減少しないことを示す図である。成体の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに２．２×１０１０ｖｇ／マウスの自己相補性ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰを注射により静脈内投与し、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ分析によるＡＡＶゲノム定量化のために、５日目（ｎ＝３）および２８日目（ｎ＝３）に殺した。
【図4】ＡＡＶ－ＰＲが全身注射の後に高効率において脳の内皮に形質導入する図である。注射の５日後および２８日後での、毛細管、小動脈、および動脈における脳のＰＣＡＭ１（ＣＤ３１：赤）内皮マーカーが共局在化する形質導入された脳内皮細胞（ＧＦＰ）を示す、ＡＡＶ－ＰＲ－ｓｃ－ＣＢＡ－ＧＦＰを注射により投与したマウスの２０μｍの脳の冠状切片における体性感覚皮質におけるＧＦＰシグナルの代表的な画像。高い倍率（４０倍の囲み画像）において、ＧＦＰとＣＤ３１との間の部分的な共局在化が示される（矢印）。
【図5】ＡＡＶ－ＰＲが全身注射の後に高効率において脳の周皮細胞に形質導入する図である。注射の５日後および２８日後での、ＰＤＧＦＲ－β（赤）陽性によって識別される周皮細胞が著しい共局在化を示す形質導入された脳の血管（ＧＦＰ）を示す、ＡＡＶ－ＰＲ－ｓｃ－ＣＢＡ－ＧＦＰを注射により投与したマウスの２０μｍの脳の冠状切片における体性感覚皮質におけるＧＦＰシグナルの代表的な画像。高い倍率（４０倍）において、ＧＦＰとＰＤＧＦＲ－βとの間の部分的な共局在化が示される（矢印）。
【図6】全身注射後にＡＡＶ－ＰＲによって形質導入された点在するグリア細胞および神経細胞。血管周囲のグリア前駆細胞（黄色の矢印）と単一の錐体ニューロン（赤色の矢印）を示す形質導入された脳の内皮（ＧＦＰ）ならびにＧＦＡＰ、ＭＢＰ、およびＮＥＵＮに対して陰性の非常にわずかな星状細胞形状の細胞を示す、ＡＡＶ－ＰＲ－ｓｃ－ＣＢＡ－ＧＦＰを注射により投与したマウスの２０μｍの脳の冠状切片における体性感覚皮質におけるＧＦＰシグナルの代表的な画像。
【図7】全身注射後の肝臓におけるＡＡＶ－ＰＲの形質導入。クッパー細胞、星細胞、または血管細胞ではない形質導入された肝細胞（ＧＦＰ）（内皮ＣＤ３１＋細胞またはＶＳＭＣ ＳＭＡおよびＳＭ２２＋細胞）を示す、ＡＡＶ－ＰＲ－ｓｃ－ＣＢＡ－ＧＦＰを注射により投与したマウスの２０μｍの肝切片におけるＧＦＰシグナルの代表的な画像。
【図8-1】実験設計の例示的概略図。Ａ．ライブラリコンストラクトの二成分系。カプシド上において発現される異なるペプチドインサートで構成されたｉＴｒａｎｓｄｕｃｅライブラリ（異なる色で表される）が、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子の上流におけるｌｏｘＰの隣接するＳＴＯＰカセットがＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ遺伝子座に挿入された、Ａｉ９遺伝子導入マウスに注射により静脈内（ｉ．ｖ．）投与される。目的の細胞に入ることができるが、細胞に機能的に形質導入しない（Ｃｒｅ発現はない）ＡＡＶカプシドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を有効にしない。機能的形質導入（Ｃｒｅを発現する）を媒介することができるカプシドはｔｄＴｏｍａｔｏ発現を有効にするであろう。
【図8-2】実験設計の例示的概略図。（Ｂ）目的の器官（例えば、脳）から細胞が単離され、形質導入された細胞が、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現と場合により細胞マーカーのために選別される。
【図8-3】実験設計の例示的概略図。Ｃ．ＡＡＶ－ＣＢＡ－Ｃｒｅを投与されたＡｉ９マウス（左側）またはｓｃＡＡＶ－ＣＢＡ－ＧＦＰを投与されたＣ５７ＢＬ．６マウス（右側）からの例示的画像。Hanlon et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Dec 13; 15: 320-332を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【0023】
アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む、多くの一般的な神経変性疾患は、脳血管系を伴う。さらに、ＩＶ型コラーゲンＡ１もしくはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）における変異に関連するものを含む、血管系に影響を及ぼすいくつかのまれな遺伝病が存在する。
【0024】
ＡＡＶベクターを使用する遺伝子療法は、血管系に影響を及ぼす疾患を治療する可能性を有する。脊髄筋萎縮の治療のためにＦＤＡによって承認された、ＣＮＳ遺伝子療法におけるゴールドスタンダードであるＡＡＶ９は、主に、いくつかの制限された血管系形質導入のみによってニューロンおよび星状細胞に形質導入する。したがって、血管系を標的にする療法に対する改良が必要とされている。
【0025】
ここで、ＡＡＶ９ペプチドディスプレイライブラリを使用するマウスにおけるインビボ選別プロセスにより、新規のカプシドターゲッティングペプチドが識別された。これらのペプチドは、アミノ酸５８８および５８９の間のＡＡＶ９に挿入された場合、静脈内全身送達の後に、ＣＮＳ血管系に対するトロピズムを示した。表１にペプチドが一覧される。
【0026】
【表1】
【0027】
ターゲッティング配列
本方法は、例えば、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ９のカプシドに挿入された場合、または、化学的に、もしくは融合タンパク質としての発現を介して、生物製剤、例えば、抗体もしくは他の巨大生物分子にコンジュゲートされた場合、ＣＮＳ血管系のターゲッティングを増強する、多くの潜在的ターゲッティングペプチドを識別した。
本方法は、例えば、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ９のカプシドに挿入された場合、または、化学的に、もしくは融合タンパク質としての発現を介して、生物製剤、例えば、抗体もしくは他の巨大生物分子にコンジュゲートされた場合、ＣＮＳ血管系のターゲッティングを増強する、多くの潜在的ターゲッティングペプチドを識別した。
【0028】
いくつかの実施形態において、ターゲッティングペプチドは、少なくとも５つのアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）の少なくとも４つ、例えば、５つ、６つ、または７つの連続するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、少なくとも［Ｄ／Ｐ］ＰＳＴ（配列番号９）を含む。
【0029】
例えば、Ｌ－ＨＴＳＰＰＲＰ（配列番号１０）；Ｌ－ＲＡＧＰＥＡＭ（配列番号１１）；Ｌ－ＬＴＳＰＤＱＳ（配列番号１２）；Ｌ－ＴＮＤＡＹＬＭ（配列番号１３）；Ｄ－ＨＴＳＰＰＲＰ（配列番号１０）；Ｄ－ＲＡＧＰＥＡＭ（配列番号１１）；Ｄ－ＬＴＳＰＤＱＳ（配列番号１２）；またはＤ－ＴＮＤＡＹＬＭ（配列番号１３）など、Ｌ－およびＤ－アミノ酸を含むターゲッティングペプチドも使用することができる。
【0030】
例えば、ＨＴＳＰＰＲＰ（配列番号１０）；ＲＡＧＰＥＡＭ（配列番号１１）；ＬＴＳＰＤＱＳ（配列番号１２）；またはＴＮＤＡＹＬＭ（配列番号１３）など、逆転した配列を含むターゲッティングペプチドも使用することができる。
【0031】
本明細書において開示されるターゲッティングペプチドは、ペプチドミメティックを作製するために当技術分野において既知の方法に従って改変することができる。例えば、Qvit et al., Drug Discov Today. 2017 Feb; 22(2): 454-462；Farhadi and Hashemian, Drug Des Devel Ther. 2018; 12: 1239-1254；Avan et al., Chem. Soc. Rev., 2014,43, 3575-3594；Pathak, et al., Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 2015. 8; Kazmierski, W.M., ed., Peptidomimetics Protocols, Human Press (Totowa NJ 1998)；Goodman et al., eds., Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003)；およびMayo et al., J. Biol. Chem., 278:45746 (2003)を参照されたい。いくつかの場合において、本明細書において開示されるペプチドおよび断片のこれらの改変されたペプチドミメティックバージョンは、非ペプチドミメティックなペプチドと比べて、高められたインビボでの安定性を示す。
【0032】
ペプチドミメティックを作製する方法は、ペプチド配列のアミノ酸の１つまたは複数、例えば、全てをＤ－アミノ酸エナンチオマーで置換するステップを含む。そのような配列は、本明細書において「レトロ」配列と呼ばれる。別の方法では、アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端への順番は逆転され、それにより、元のペプチドのＮ末端からＣ末端へのアミノ酸残基の順番は、改変されたペプチドミメティックにおけるＣ末端からＮ末端へのアミノ酸残基の順番になる。そのような配列は、「インベルソ」配列と呼ぶことができる。
【0033】
ペプチドミメティックは、レトロおよびインベルソバージョンの両方であり得、すなわち、本発明において開示されるペプチドの「レトロ－インベルソ」バージョンであり得る。新規のペプチドミメティックは、ペプチドミメティックにおけるＮ末端からＣ末端へのアミノ酸残基の順番が、元のペプチドにおけるＣ末端からＮ末端へのアミノ酸残基の順番に対応するように配置されたＤ－アミノ酸で構成され得る。
【0034】
ペプチドミメティックを作製する他の方法は、ペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸残基を、化学的に異なるが認識された当該アミノ酸の機能的類似物、すなわち、人工アミノ酸類似物で置換するステップを含む。人工アミノ酸類似物としては、β－アミノ酸、β－置換β－アミノ酸（「β３－アミノ酸」）、アミノ酸のリン類似物、例えば、∀－アミノホスホン酸および∀－アミノホスフィン酸など、ならびに非ペプチド結合を有するアミノ酸が挙げられる。人工アミノ酸は、ペプチドミメティック、例えば、ペプトイドオリゴマー（例えば、ペプトイドアミドまたはエステル類似物）、β－ペプチド、環状ペプチド、オリゴウレアもしくはオリゴカーバメートペプチド、または複素環分子を作製するために使用することができる。例示的レトロ－インベルソターゲッティングペプチドミメティックとしては、ＨＴＳＰＰＲＰ（配列番号１９）；ＲＡＧＰＥＡＭ（配列番号２０）；ＬＴＳＰＤＱＳ（配列番号２１）；またはＴＮＤＡＹＬＭ（配列番号２２）が挙げられ、この場合、配列は、全てのＤ－アミノ酸を含む。これらの配列は、例えば、アミノ末端のビオチン化およびカルボキシ末端のアミド化によって、改変することができる。
【0035】
ＡＡＶ
本方法および組成物において使用するためのウイルスベクターとしては、本明細書に記載のターゲッティングペプチドと場合により標的組織における発現のための導入遺伝子とを含む、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。
本方法および組成物において使用するためのウイルスベクターとしては、本明細書に記載のターゲッティングペプチドと場合により標的組織における発現のための導入遺伝子とを含む、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。
【0036】
本方法における核酸の送達のために有用な好ましいウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、２５ｎｍのカプシドを有する小さい非エンベロープウイルスである。当該野生型ウイルスに関連することが知られているかまたは関連することが証明されている疾患は全く存在しない。ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶは、長期のエピソーム導入遺伝子の発現を示すことがわかっており、ＡＡＶは、脳、特にニューロンにおける優れた導入遺伝子の発現を示した。ＡＡＶにおける外因性ＤＮＡのためのスペースは、概して、粒子の内側に物理的に収まることができる核酸の量に制限される。例えば、タイプ１～５のＡＡＶは、最大６ｋｂのＤＮＡをパッケージすることができ、いくつかの報告では、ＡＡＶ５は、最大８．９ｋｂのＤＮＡをパッケージすることがわかっている。Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)に記載されるようなＡＡＶベクターを使用することによって、ＤＮＡを細胞に導入することができる。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞タイプに導入された（例えば、Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985)；Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988)；Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984)；およびFlotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)を参照されたい）。多数の代替のＡＡＶバリアントが存在し（１００を超えるクローンが作られた）、ＡＡＶバリアントは、望ましい特性に基づいて識別された。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ｒｈ．８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、またはＣＳｐ３であり；ＣＮＳ用途の場合、いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。好適なＡＡＶベクターは、多量のＤＮＡを収容するように設計され得る。一例として、ＡＡＶ９は、脳血液関門を越えるためいくらか効率的であることが明らかとなった。本方法を使用することにより、ＡＡＶカプシドは、本明細書に記載のターゲッティング配列をカプシドタンパク質、例えば、アミノ酸５８８と５８９との間のＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１に挿入することによって、血管透過を増加させるように遺伝子操作することができる。
【0037】
例示的野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１（Ｑ６ＪＣ４０－１）配列は、以下の通りである。
【0038】
【化1】
【0039】
したがって、本明細書に記載のターゲッティングペプチド配列のうちの１つまたは複数を含むＡＡＶ、例えば、本明細書に記載のターゲッティング配列を含むカプシドタンパク質、例えば、ターゲッティングペプチド配列が、例えばアミノ酸５８８と５８９の間の配列に挿入された、配列番号１を含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶが、本明細書において提供される。
【0040】
ＡＡＶ－ＰＲターゲッティング配列（太字の小文字で示される）を含むＡＡＶ９ ＶＰ１の例示的アミノ酸配列は、以下の通りである。
【0041】
【化2】
【0042】
ＡＡＶ－ＭＡターゲッティング配列（太字の小文字で示される）を含むＡＡＶ９ ＶＰ１の例示的アミノ酸配列は、以下の通りである。
【0043】
【化3】
【0044】
ＡＡＶ－ＳＱターゲッティング配列（太字の小文字で示される）を含むＡＡＶ９ ＶＰ１の例示的アミノ酸配列は、以下の通りである。
【0045】
【化4】
【0046】
ＡＡＶ－ＭＬターゲッティング配列（太字の小文字で示される）を含むＡＡＶ９ ＶＰ１の例示的アミノ酸配列は、以下の通りである。
【0047】
【化5】
【0048】
これらのＶＰＩバリアントをコードする例示的配列は、以下に提供される。
【0049】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、導入遺伝子配列（すなわち、異種配列）、例えば、本明細書に記載のような、もしくは当技術分野において既知であるような、治療薬をコードする導入遺伝子など、またはレポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質など、検出可能な産物をもたらす反応を触媒する酵素、または細胞表面抗原も含む。導入遺伝子は、好ましくは、標的組織における導入遺伝子の発現を促進／駆動／調節する配列に連結される。
【0050】
治療法としての使用のための例示的導入遺伝子としては、ニュールツリン；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）；中脳星状細胞由来神経因子（ＭＡＮＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）；Ｔａｕ抗体；アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）抗体；ＩＶ型コラーゲンＡ１もしくはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）；３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）；エンドグリン（ＥＮＧ）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）；ノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）、またはアポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）をコードする導入遺伝子が挙げられる。他の例示的導入遺伝子としては、例えば、神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、血液因子、例えば、β－グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、および血液凝固因子など；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９など；成長因子、例えば、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、例えば、塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦなど）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、成長分化因子－９（ＧＤＦ－９）、ヘパトーマ由来成長因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）など；可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ－α受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ－１受容体および可溶性タイプＩＩ ＩＬ－１受容体）、可溶性γ／δＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片など；酵素、例えば、α－グルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼなど；酵素活性化剤、例えば、組織プラスミノーゲンアクティベーターなど；ケモカイン、例えば、ＩＰ－１０、インターフェロンγ誘導モノカイン（Ｍｉｇ）、Ｇｒｏａ／ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＰＦ－４など；血管形成剤、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－２）、形質転換増殖因子β、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリオーマ誘導増殖因子、アンギオゲニン、アンギオゲニン－２など；血管新生阻害剤、例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体など；タンパク質ワクチン；神経活性ペプチド、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン（gastin）、セクレチン、オキシトシン、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン、β－エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、チロトロピン、ニューロペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、睡眠ペプチドなど；血栓溶解剤；心房性利尿ペプチド；レラキシン；グリア細胞線維性酸性タンパク質；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトα－１アンチトリプシン；白血病阻止因子（ＬＩＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）；組織因子、黄体形成ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；好中球走化因子（ＮＣＦ）；神経成長因子；組織性メタロプロテアーゼ阻害因子；血管作動性腸ペプチド；アンギオゲニン；アンジオトロピン（angiotropin）；フィブリン；ヒルジン；ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト；などの発現をコードするものが挙げられる。目的のタンパク質のいくつかの他の例としては、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；ニューロトロフィン３および４／５（ＮＴ－３および４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）；血友病関連凝固タンパク質、例えば、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子；ジストロフィンまたはミニジストロフィン；リソゾーム酸性リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；糖原貯蔵障害関連酵素、例えば、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋グリコーゲンホスフォリラーゼ、肝グリコーゲンホスフォリラーゼ、筋ホスフォフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えば、ＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えば、ＧＬＵＴ２）、アルドラーゼＡ、β－エノラーゼ、およびグリコーゲンシンターゼなど；リソゾーム酵素（例えば、β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼＡ）；ならびにそれらの任意のバリアントが挙げられる。
【0051】
導入遺伝子は、抗体、例えば、免疫チェックポイント抑制抗体を、例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４；ＣＤ１５２）；ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３；ＣＤ２２３）；ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３；ＨＡＶＣＲ２）；ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫レセプター）；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＶＳＩＲ（Ｖ－セット免疫調節レセプター通称Ｖｉｓｔａ、Ｂ７Ｈ５、Ｃ１０ｏｒｆ５４）；ＢＴＬＡ３０（Ｂ－およびＴ－リンパ球アテネーター、ＣＤ２７２）；ＧＡＲＰ（糖タンパク質Ａ反復；優性）；ＰＶＲＩＧ（ＰＶＲ関連免疫グロブリンドメイン含有）；またはＶＴＣＮ１（Ｖ－セットドメイン含有Ｔ細胞活性化インヒビター１、通称Ｂ７－Ｈ４）へとコードすることもできる。
【0052】
他の導入遺伝子としては、標的遺伝子の発現を変更／減少する低分子抑制核酸（small or inhibitory nucleic acid）、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、サプレッサーｔＲＮＡ（Ｗang et al., Nature volume 604, pages343-348 (2022)）もしくは遺伝子発現を変更する長鎖ノンコーディングＲＮＡ（例えば、国際公開第２０１２０８７９８３号パンプレットおよび米国特許出願公開第２０１４０１４２１６０号明細書を参照されたい）、またはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９／ｃａｓ１２ａおよびガイドＲＮＡを挙げることができる。ゲノム編集試薬（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼ、塩基エディター、またはプライムエディター、および場合により、関連するガイドＲＮＡ）も、送達することができる。例えば、様々なＣＲＩＳＰＲシステムは、最適な標的配列を切断するように操作することができる。例えば、Ledford, Nature. 2021 Sep 10. doi:10.1038/d41586-021-02461-2.印刷前の電子出版；Ramirez-Phillips, AAPS J. 2021 Jun 2;23(4):80；Liu et al., Mol Cell. 2022 Jan 20;82(2):333-347を参照されたい。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするコンストラクトおよび特定の領域を標的にするｇＲＮＡが、導入遺伝子の一部としてＡＡＶベクターへ組み込まれる。
【0053】
ウイルスは、導入遺伝子の発現を促進する１つまたは複数の配列、例えば、１つまたは複数のプロモーター配列；エンハンサー配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３’ＵＴＲ；ポリアデニル化部位；および／またはインシュレーター配列も含むことができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、血管内皮細胞特異的プロモーター、例えば、ＶＥ－カドヘリンプロモーター、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１（ＦＬＴ－１）、細胞間接着分子－２（ＩＣＡＭ－２）、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）プロモーター、ＴＩＥ２プロモーター、または合成ＥＣ特異的プロモーターである（例えば、Dai et al., J Virol. 2004 Jun; 78(12): 6209-6221を参照されたい）。いくつかの実施形態において、プロモーターは、汎細胞タイププロモーター（pan-cell type promoter）、例えば、ほとんどの細胞タイプにおいて発現を駆動する「ユビキタス」プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを伴う）、チキンβアクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、Ｂ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、およびＣＭＶ即／初期遺伝子エンハンサー／ＣＢＡプロモーター、またはステロイドプロモーターもしくはメタロチオネインプロモーターである。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後反応エレメント（ＷＰＲＥ）も使用することができる。
【0054】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、標的組織、例えばＣＮＳへの送達を増加させるかまたはオフ組織ターゲッティングを減少させる１つまたは複数の追加の変異、例えば、ＣＮＳ、心臓、筋肉送達が意図される場合の肝臓送達（例えば、Pulicherla et al. (2011) Mol Ther 19:1070-1078に記載される）；あるいは例えば、Chen et al. (2008) Nat Med 15:1215-1218もしくはXu et al., (2005) Virology 341:203-214または米国特許第９１０２９４９号明細書；米国特許第９５８５９７１号明細書；および米国特許出願公開第２０１７０１６６９２６号明細書に記載されるような他のターゲッティングペプチドの追加を減少させる変異も有する。sfn.org/~/media/SfN/Documents/Short%20Courses/2011%20Short%20Course%20I/2011_SC1_Gray.ashxにおいて利用可能なGray and Samulski (2011) "Vector design and considerations for CNS applications," in Gene Vector Design and Application to Treat Nervous System Disorders ed. Glorioso J., editor. (Washington, DC: Society for Neuroscience) 1-9も参照されたい。
【0055】
タグ／融合物としてのターゲッティングペプチド
本明細書に記載のターゲッティングペプチドは、例えば、分子へのコンジュゲーションによって、または、例えば、抗体もしくは他の巨大生物分子などとの融合タンパク質の一部としての発現によって、ＣＮＳ血管系における内皮細胞への他の（異種）分子のターゲッティングを増加させるためにも使用することができる。これらは、治療薬またはレポーターに加えて、ゲノム編集タンパク質または複合体（例えば、本明細書に記載のペプチド（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端における、または内部的な）およびガイドＲＮＡに融合した、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、塩基エディター、および遺伝子編集タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａなど）を含むことができる。融合物／複合体は、Ｋｕ７０由来のあらゆる他の配列を含まず、例えば、異種非Ｋｕ７０配列を含み、天然には存在しない。
本明細書に記載のターゲッティングペプチドは、例えば、分子へのコンジュゲーションによって、または、例えば、抗体もしくは他の巨大生物分子などとの融合タンパク質の一部としての発現によって、ＣＮＳ血管系における内皮細胞への他の（異種）分子のターゲッティングを増加させるためにも使用することができる。これらは、治療薬またはレポーターに加えて、ゲノム編集タンパク質または複合体（例えば、本明細書に記載のペプチド（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端における、または内部的な）およびガイドＲＮＡに融合した、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、塩基エディター、および遺伝子編集タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａなど）を含むことができる。融合物／複合体は、Ｋｕ７０由来のあらゆる他の配列を含まず、例えば、異種非Ｋｕ７０配列を含み、天然には存在しない。
【0056】
使用方法
本明細書に記載の方法および組成物は、任意の組成物、例えば、目的の導入遺伝子または配列を、組織、例えば、中枢神経系（脳）、例えば、内皮細胞および周皮細胞などの血管系、ならびに血管系の平滑筋細胞に送達するために使用することができる。いくつかの実施形態において、方法は、特定の脳領域、例えば、皮質、小脳、海馬、黒質、扁桃体への送達を含む。
本明細書に記載の方法および組成物は、任意の組成物、例えば、目的の導入遺伝子または配列を、組織、例えば、中枢神経系（脳）、例えば、内皮細胞および周皮細胞などの血管系、ならびに血管系の平滑筋細胞に送達するために使用することができる。いくつかの実施形態において、方法は、特定の脳領域、例えば、皮質、小脳、海馬、黒質、扁桃体への送達を含む。
【0057】
いくつかの実施形態において、方法および組成物、例えば、ＡＡＶは、核酸配列を、疾患、例えばＣＮＳの疾患を患う対象に送達するために使用され；例えば、米国特許第９１０２９４９号明細書；米国特許第９５８５９７１号明細書；および米国特許出願公開第２０１７０１６６９２６号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、対象は、パーキンソン病を患い、ベクターは、ニュールツリン；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）；中脳星状細胞由来神経因子（ＭＡＮＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、または芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を送達するために使用される（例えば、Axelsen and Woldbye, J Parkinsons Dis. 2018; 8(2): 195-215；Qin et al., Med Sci Monit. 2022 Mar 16;28:e935026；Elabi et al., Sci Rep. 2021 Jan 13;11(1):1120；Yu et al., Front Neurosci. 2020 Apr 29;14:334を参照されたい）。いくつかの実施形態において、対象は、アルツハイマー病を患い、ベクターは、Ｔａｕ抗体またはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）抗体を送達するために使用される（例えば、Yang et al, Nature. 2022 Mar;603(7903):885-892；Bohannon et al., Cells. 2021 Apr 14;10(4):890；Kimbrough et al., Brain. 2015 Dec;138(Pt 12):3716-33；Sagare et al., Nat Commun. 2013;4:2932；Fisher et al., Brain Pathol. 2022 Mar 14;e13061；Zhang et al., Natl Sci Rev. 2019 Nov;6(6):1223-1238；Agyare et al., Mol Pharm. 2013 May 6;10(5):1557-65を参照されたい）。いくつかの実施形態において、対象は、血管系に影響を及ぼす遺伝病、例えば、ＩＶ型コラーゲンＡ１もしくはＡ２（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）（ＣＯＬ４Ａ１／Ａ２）（Vahedi and Alamowitch, Curr Opin Neurol. 2011 Feb;24(1):63-8；Mao et al. Dis Model Mech. 2017 Apr 1;10(4):475-485）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）（Ferreira et al., Genet Med. 2021 Feb;23(2):396-407；Maulding et al., Bone. 2021 Jan;142:115656）；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（ＡＢＣＣ６）（Shimada et al., Int J Mol Sci. 2021 Apr 27;22(9):4555）、３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）（Hoogeveen et al., AJNR Am J Neuroradiol. 2021 Sep;42(9):1604-1609；Rice et al., J Clin Immunol. 2015 Apr;35(3):235-43）；フォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）（Prasitsak et al., Dev Dyn. 2015 May;244(5):703-11；French et al., J Clin Invest. 2014 Nov;124(11):4877-81）；ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）（French et al., J Clin Invest. 2014 Nov;124(11):4877-81）；ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ１（ＳＡＭＨＤ１）（Li et al., Biomed Res Int. 2015;2015:739586）；エンドグリン（ＥＮＧ）（Lozano Sanchez et al., J Pers Med. 2022 Mar 25;12(4):528）；ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）（Nie et al., Immun Inflamm Dis. 2021 Dec;9(4):1306-1320）；アクチビンＡレセプター様タイプ１（ＡＣＶＲＬ１）（Walsh et al., J Med Case Rep. 2022 Mar 1;16(1):99）；ＲＡＳ ｐ２１タンパク質アクティベーター１（ＲＡＳＡ１）（Chen et al., JCI Insight. 2022 Feb 22;7(4):e156928）；またはノッチレセプター３（ＮＯＴＣＨ３）（Joutel et al., J Clin Invest. 2000 Mar;105(5):597-605；Opherk et al., Hum Mol Genet. 2009 Aug 1;18(15):2761-7）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）（Shiga et al., Hum Mol Genet. 2011 May 1;20(9):1800-10）；ジンクフィンガーＣＣＨＣタイプ含有１４（ＺＣＣＨＣ１４）（Traylor et al., Ann Neurol. 2017 Mar;81(3):383-394）、アポリポタンパク質Ｅイプシロン４（ＡＰＯＥ ε４）（Khera et al., Circulation. 2019 Mar 26;139(13):1593-1602）などにおける変異に関連するものを患う。本明細書に記載のベクターは、標的にされた細胞のゲノムにおける変異を修正する野生型導入遺伝子または遺伝子編集試薬（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼ、塩基エディター、またはプライムエディター、および関連するガイドＲＮＡ）を送達するために使用することができる。
【0058】
治療薬は、核酸として、例えば、ウイルスベクターによって送達することができ、この場合、核酸は、治療タンパク質もしくは他の核酸、例えば、アンチセンスオリゴ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどをコードし、または、治療薬は、本明細書に記載のようなターゲッティングペプチドとの融合タンパク質／複合体として送達することができる。
【0059】
医薬組成物および投与方法
本明細書に記載の方法は、有効成分としてターゲッティングペプチドを含む医薬組成物の使用を含む。
本明細書に記載の方法は、有効成分としてターゲッティングペプチドを含む医薬組成物の使用を含む。
【0060】
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用される場合、語句「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合性の、塩水、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。
【0061】
医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路に適合性であるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口的、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内注射または注入が挙げられる。したがって、送達は、全身性または局所的であり得る。
【0062】
好適な医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005；シリーズDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)の書籍を参照されたい。例えば、非経口投与のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩など、ならびに張度の調節のための薬剤、例えば、塩化ナトリウム、またはデキストロースなどを含むことができる。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムなどによって調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射筒、または多人数用バイアルに封入することができる。
【0063】
注射可能な使用にとって好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含み得る。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、容易なシリンジ使用性が存在する程度に流動性であるべきである。それらは、製造および貯蔵の条件下において安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌および真菌などの混入活動に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および、界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールなど、塩化ナトリウムを含むことは好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを組成物に含ませることによって生じさせることができる。
【0064】
滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を、上記に列挙された成分の１つまたは組合せを伴う適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて、その後に濾過滅菌を行うことによって、調製することができる。概して、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒と上記に列挙されたものから必要な他の成分とを含む滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それらは、前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分とによる粉末をもたらす。
【0065】
一実施形態において、治療化合物は、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含めた制御放出製剤など、身体からの迅速な排除から治療化合物を保護する担体を用いて調製される。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準的技術を使用して調製することができ、または例えば、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（細胞性抗原に対するモノクローナル抗体を有する選択された細胞にターゲッティングされるリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されるような、当業者に既知の方法により調製することができる。
【0066】
医薬組成物は、投与のための取扱説明書と共に、キット、容器、パック、またはディスペンサーに含ませることができる。
【実施例】
【0067】
本発明はさらに、下記の実施例において記載され、それらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【0068】
材料および方法
下記の材料および方法を、以下の実施例において使用した。
下記の材料および方法を、以下の実施例において使用した。
【0069】
動物：全ての動物実験は、実験動物飼育管理に関するマサチューセッツ総合病院分科委員会（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）よって示されたガイドラインに準拠した。発明者らは、成熟年齢（８～１０週齢）のＡｉ９（Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ、株＃００７９０９）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ（株＃０００６６４）マウスを使用し、それらは全て、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バー・ハーバー、メイン州から入手した。
【0070】
ＡＡＶ－ＰＲカプシドの構築。目的の導入遺伝子（例えば、ＧＦＰまたはＣｒｅ）をコードするベクターの作製のためにＡＡＶ－ＰＲペプチド（ＰＲＰＰＳＴＨ）を表すＡＡＶ９カプシドをコードするｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを作製するために、発明者らは、ＡＡＶ９ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ｐＡＲ９）を、ペプチド配列挿入のためにＶＰ３アミノ酸の５８８部位の横に位置する断片を除去するＢｓｉＷＩおよびＢａｅＩによって消化させた。次に、発明者らは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、コーラルビル、アイオワ州）から９９７ｂｐのｄｓＤＮＡ断片を取り寄せ、それは、ＢｓｉＷＩ／ＢａｅＩ切断ＡＡＶ９を伴う重複するギブソン相同アームならびにＶＰ３のアミノ酸５８８の後のフレームにおける目的のペプチドをコードする２１－ｍｅｒヌクレオチド配列を含む。最後に、発明者らは、ＡＡＶ９ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドへのペプチドコード化挿入をライゲートするために、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、イプスウィッチ、マサチューセッツ）を使用してギブソン・アセンブリを実施した。次に、発明者らは、２μｌのギブソン・アセンブリによってＮＥＢ ５－アルファコンピテント大腸菌（E. coli）（ＮＥＢ）を形質転換させ、形質転換させた細胞をＬＢ－Ａｍｐ寒天プレートに播種した。正しい配列が挿入されたことを確認するために、選択されたコロニーから単離したＤＮＡを、ペプチドコード領域に隣接するプライマーを使用する、ＭＧＨ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＤＮＡ Ｃｏｒｅでのサンガーシーケンシングのために送った。
【0071】
ＡＡＶベクターの製造、精製、および力価測定。ＡＡＶ－ＰＲベクターによる導入遺伝子発現研究のために、発明者らは、下記のコンストラクトを使用した：（１）Ｍｉｇｕｅｌ Ｓｅｎａ－Ｅｓｔｅｖｅｓ（ＵＭａｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）からの贈り物であるＡＡＶ発現プラスミドであるｐＡＡＶ－ＣＢＡ－ＮＬＳ－Ｃｒｅｓ。このプラスミドは、ハイブリッドＣＭＶ－ＩＥエンハンサー／チキンβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＣｒｅリコンビナーゼｃＤＮＡ、および牛成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル配列からなる、ＣＢＡ発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）を含む。（２）ｐＡＡＶ－ｓｃ－ＣＢＡ－ＧＦＰ。このコンストラクトは、ハイブリッドＣＭＶ即初期／チキンβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター下での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を駆動し、これは、親切にも、Ｄｒ．Ｍｉｇｕｅｌ Ｓｅｎａ－Ｅｓｔｅｖｅｓ（ＵＭａｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）によって提供された。ＡＡＶ－ｓｃ－ＣＢＡ－ＧＦＰは、自己相補性（ｓｃ）ゲノムである。
【0072】
前に記載したようにＡＡＶ作製を実施した６。簡潔に記載すると、２９３Ｔ細胞を、（１）ＡＡＶ－ＰＲ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド、（２）アデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ６、および（３）ＩＴＲ隣接ＡＡＶ導入遺伝子発現プラスミドによる３種類でトランスフェクトした（リン酸カルシウム法）。トランスフェクションの６８～７２時間後に細胞溶解物を収穫し、イオジキサノール密度勾配の超遠心分離によって精製した。イオジキサノールを除去し、Ｚｅｂａ脱塩カラム、７ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ；Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）へと緩衝液を交換した。２ｍｌのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ限外濾過装置を使用してベクターを濃縮した。ＶＧ／ｍｌでのベクター力価を、ＢＧＨポリＡ配列に対するプローブおよびプライマーを使用して、ＡＢＩ Ｆａｓｔ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって測定し、ＡＡＶプラスミドによって作製した標準曲線から補間した。ベクターを頓用アリコートへとピペッティングし、使用まで－８０℃で貯蔵した。
【0073】
マウスにおけるベクターの注射。Ａｉ９マウスにおけるＡＡＶ－ＰＲ媒介Ｃｒｅ組換えおよびｔｄＴｏｍａｔｏ発現を伴う実験において、発明者らは、成体（雄および雌の両方）のＡｉ９マウスにＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅベクターを側部尾静脈からの注射により全身投与した。注射の３～５週間後、動物を殺して、脳および他の器官を凍結切片法のために処理し、免疫蛍光染色して、撮像した。
【0074】
従来の導入遺伝子発現ベクターとしてＡＡＶ－ＰＲを使用する実験において、雄のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＡＶ－ＰＲ－ｓｃ－ＣＢＡ－ＧＦＰを側部尾静脈からの注射により全身投与した。マウスを、２つの時点、すなわち、注射後の５日目および２８日目に殺した。脳を凍結切片法のために処理し、次いで、免疫蛍光染色して、撮像した。
【0075】
免疫蛍光染色および顕微鏡法。切片を室温で２０分間乾燥させ、次いで、ＰＦＡを用いて１５分間インキュベートした。次いで、各スライドを、それぞれ５分間、ＰＢＳによって３回すすいだ。この後、氷冷メタノールによる１０分間のインキュベーションを行い、次いで、さらなるＰＢＳですすいだ。切片を、ＰＢＳ中における５％ヤギ血清および５％ＢＳＡにおいて、４５分間かけてブロックした。次いで、一次抗体混合物を用いて４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を、宿主種に基づいて、抗ＧＦＰ（Ｇ１０３６２；１：５００）およびＣＤ３１（ＢＤ５５０２７４；１：５０）または抗ＧＦＰ（ａｂ１２１８；１：５００）およびＰＤＧＦｒ－Ｂ（ＬＳ Ｃ１１７６９２；１：５００）のどちらかにおいて、共染色として使用した。翌日、スライドをもう一度、ＰＢＳですすぎ、次いで、ＡｌｅｘａＦｌｏｒ４８８（Ａ３２７２３またはＡ３２７３１；１：５００）およびＡｌｅｘａｆｌｏｒ５５５（Ａ－２１４２８またはＡ－２１４３４；１：５００）を用いて９０分間インキュベートした。スライドを、ＤＡＰＩ（Ｐ３６９３１）を用いたＰｒｏＬｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔによって処理した。ＭＧＨにおいてＰｒｏｇｒａｍ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＰＭＢ）のＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅに配置されたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８００ Ａｉｒｙｓｃａｎ共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影した。全てのスライドにおいて標準露光にて、１０倍、２０倍、４０倍、および６３倍で広視野蛍光画像を撮影した。画像をＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して解析した。異なる切片間およびマウス試料間での画像位置における一貫性を確保するために、Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓを参照した。全ての画像処理および定量化は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。
【0076】
[実施例１]
ＡＡＶ－ＰＲの選別および識別
発明者らは、注射による全身投与の後に、脳に形質導入することができるＡＡＶカプシドを単離するために、ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリによるインビボ選別を実施した。方法は、概して、図８Ａ～Ｃにおいて記載され；発明者らは、Ｃｒｅ感応性蛍光レポーターを発現するマウス（Ａｉ９マウス）における導入遺伝子発現を、配列をコードするレスキューされたペプチドと結び付けるために、７－ｍｅｒペプチドディスプレイライブラリをＣｒｅリコンビナーゼカセットと組み合わせる、以前に記載した発明者らのｉＴｒａｎｓｄｕｃｅライブラリ７，８（ＡＡＶ－ＣＢＡ－Ｃｒｅ－ｐ４１－Ｃａｐ）を使用した。発明者らは、最初、脳における骨髄由来細胞に形質導入することができるカプシドを単離することを目標に設定した。発明者らは、カプシドライブラリによる２回の選別を実施した。初回の選別では、ライブラリの１．２７×１０１１のベクターゲノム（ｖｇ）を、１匹の成体の雄および１匹の雌のＡｉ９マウスに注射した。注射の３週間後、脳組織からＤＮＡを抽出し、ＣＡＰ領域を増幅し、その後、それをＡＡＶプラスミド骨格へと再クローニングし、２回目の選別のために再パッケージした（「脳富化カプシドライブラリ（brain-enriched capsid library）」）。２回目では、発明者らは、形質導入コンピテントカプシドを単離するために、Ｃｒｅカセットを使用した。２匹の雌のＡｉ９マウスおよび１匹の雄のマウスに、尾静脈において、それぞれ１．９１×１０１０または７．６４×１０１１ｖｇのレスキューされ再パッケージされたライブラリを注射した。３週間後、マウスを殺して、脳細胞を分離し、抗ＣＤ１１ｂ／磁性ビーズ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して細胞を単離した。次に、細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ－フラクションへと流動選別した。初回の際に記載したように、各細胞ペレットからＤＮＡを単離し、ペプチドインサートコード領域のＰＣＲ増幅をＮＧＳに提出した。ＮＧＳのデータから、発明者らは、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋フラクションにおける高い読取り頻度を有するカプシド候補を選別した。Ｐｉｃｏ Ｐｕｒｅ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、各細胞ペレットからＤＮＡを単離し、発明者らは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってペプチドプロファイルを特定するために、当該インサートを含むｃａｐ領域をＰＣＲ増幅した。ＮＧＳの結果から、４つのカプシドクローン、ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）を、評価のために選択した。
ＡＡＶ－ＰＲの選別および識別
発明者らは、注射による全身投与の後に、脳に形質導入することができるＡＡＶカプシドを単離するために、ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリによるインビボ選別を実施した。方法は、概して、図８Ａ～Ｃにおいて記載され；発明者らは、Ｃｒｅ感応性蛍光レポーターを発現するマウス（Ａｉ９マウス）における導入遺伝子発現を、配列をコードするレスキューされたペプチドと結び付けるために、７－ｍｅｒペプチドディスプレイライブラリをＣｒｅリコンビナーゼカセットと組み合わせる、以前に記載した発明者らのｉＴｒａｎｓｄｕｃｅライブラリ７，８（ＡＡＶ－ＣＢＡ－Ｃｒｅ－ｐ４１－Ｃａｐ）を使用した。発明者らは、最初、脳における骨髄由来細胞に形質導入することができるカプシドを単離することを目標に設定した。発明者らは、カプシドライブラリによる２回の選別を実施した。初回の選別では、ライブラリの１．２７×１０１１のベクターゲノム（ｖｇ）を、１匹の成体の雄および１匹の雌のＡｉ９マウスに注射した。注射の３週間後、脳組織からＤＮＡを抽出し、ＣＡＰ領域を増幅し、その後、それをＡＡＶプラスミド骨格へと再クローニングし、２回目の選別のために再パッケージした（「脳富化カプシドライブラリ（brain-enriched capsid library）」）。２回目では、発明者らは、形質導入コンピテントカプシドを単離するために、Ｃｒｅカセットを使用した。２匹の雌のＡｉ９マウスおよび１匹の雄のマウスに、尾静脈において、それぞれ１．９１×１０１０または７．６４×１０１１ｖｇのレスキューされ再パッケージされたライブラリを注射した。３週間後、マウスを殺して、脳細胞を分離し、抗ＣＤ１１ｂ／磁性ビーズ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して細胞を単離した。次に、細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ－フラクションへと流動選別した。初回の際に記載したように、各細胞ペレットからＤＮＡを単離し、ペプチドインサートコード領域のＰＣＲ増幅をＮＧＳに提出した。ＮＧＳのデータから、発明者らは、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋フラクションにおける高い読取り頻度を有するカプシド候補を選別した。Ｐｉｃｏ Ｐｕｒｅ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、各細胞ペレットからＤＮＡを単離し、発明者らは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってペプチドプロファイルを特定するために、当該インサートを含むｃａｐ領域をＰＣＲ増幅した。ＮＧＳの結果から、４つのカプシドクローン、ＰＲＰＰＳＴＨ（配列番号１）；ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４）を、評価のために選択した。
【0077】
[実施例２]
ＡＡＶ９カプシドを表す操作されたペプチドＡＡＶ－ＰＲは静脈内送達の後に脳における血管系選択的形質導入表現型を媒介する
次に、発明者らは、全身静脈内送達の後の成体マウスの脳の形質導入に対して、これらの新規のカプシドを試験した。発明者らは、一本鎖ＡＡＶ－ＣＢＡ－Ｃｒｅゲノムをそれぞれの候補カプシドにパッケージし、これらのベクター（１×１０１２ｖｇ／マウス）を、全ての細胞にＣｒｅ感応性ＣＡＧ－ｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有する成体Ａｉ９マウスの尾静脈に注射した。ＡＡＶベクターによって首尾良く形質導入されてＣｒｅ発現した全ての細胞は、その結果として、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を生じるはずである。注射の３週間後にマウスを犠牲にし、脳を薄くスライスして、免疫蛍光染色によってｔｄＴｏｍａｔｏを検出した。ＡＡＶ－ＰＲと命名されたペプチドＰＲＰＰＳＴＨを表す１つのカプシドに対して、発明者らは、脳全体でのｔｄＴｏｍａｔｏ発現の異なる血管系免疫染色を観察した（図１Ａ～Ｄ）。このプロファイルは、ほとんどの星状細胞およびニューロンの形質導入を媒介する、成体Ａｉ９マウスにおける親のＡＡＶ９－ＣＢＡ－Ｃｒｅのトロピズムに対して、著しく対照的であった１。他のペプチド（ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４））の場合、ディスプレイングカプシドは、血管系内の細胞ならびに神経形態を有する細胞に形質導入した（図１Ｅ～Ｈ）。
ＡＡＶ９カプシドを表す操作されたペプチドＡＡＶ－ＰＲは静脈内送達の後に脳における血管系選択的形質導入表現型を媒介する
次に、発明者らは、全身静脈内送達の後の成体マウスの脳の形質導入に対して、これらの新規のカプシドを試験した。発明者らは、一本鎖ＡＡＶ－ＣＢＡ－Ｃｒｅゲノムをそれぞれの候補カプシドにパッケージし、これらのベクター（１×１０１２ｖｇ／マウス）を、全ての細胞にＣｒｅ感応性ＣＡＧ－ｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有する成体Ａｉ９マウスの尾静脈に注射した。ＡＡＶベクターによって首尾良く形質導入されてＣｒｅ発現した全ての細胞は、その結果として、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を生じるはずである。注射の３週間後にマウスを犠牲にし、脳を薄くスライスして、免疫蛍光染色によってｔｄＴｏｍａｔｏを検出した。ＡＡＶ－ＰＲと命名されたペプチドＰＲＰＰＳＴＨを表す１つのカプシドに対して、発明者らは、脳全体でのｔｄＴｏｍａｔｏ発現の異なる血管系免疫染色を観察した（図１Ａ～Ｄ）。このプロファイルは、ほとんどの星状細胞およびニューロンの形質導入を媒介する、成体Ａｉ９マウスにおける親のＡＡＶ９－ＣＢＡ－Ｃｒｅのトロピズムに対して、著しく対照的であった１。他のペプチド（ＭＡＥＰＧＡＲ（配列番号２）；ＳＱＤＰＳＴＬ（配列番号３）；またはＭＬＹＡＤＮＴ（配列番号４））の場合、ディスプレイングカプシドは、血管系内の細胞ならびに神経形態を有する細胞に形質導入した（図１Ｅ～Ｈ）。
【0078】
[実施例３]
ＧＦＰをコードするＩＶ注射されたＡＡＶ－ＰＲによる脳血管系形質導入細胞の時間依存性減少
発明者らは、このカプシドの「完全発現」プロファイルを評価するために、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系におけるＡＡＶ－ＰＲを評価する実験を開始した。最近実証されたように、従来の蛍光レポーターは、ＡＡＶによる形質導入事象（例えば、一過性発現）を過少評価し２、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の使用は、これらの形質導入事象の全てを捕捉することを可能にし、それは、異なる遺伝子送達用途、例えば、ゲノム編集などにとって有用であり得る。ＡＡＶ－ＰＲ媒介性Ｃｒｅ発現は、マウスゲノムの永久的な遺伝子改変を可能にし、それは、結果として、安定したｔｄＴｏｍａｔｏの発現を生じる。長期間の発現のために染色体外ＡＡＶゲノムの安定性を頼りにする、さらに従来的な「遺伝子追加」送達フォーマットにおけるＡＡＶ－ＰＲカプシドの形質導入プロファイルを試験するために、発明者らは、自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＧＦＰゲノムをＡＡＶ－ＰＲカプシドにパッケージした。発明者らは、成体の雄のマウスに３．５×１０１０ｖｇ／マウス（およそ１．４×１０１２ｖｇ／ｋｇ）を注射し、注射後の５日目（ｎ＝２）および２８日目（ｎ＝３）にマウスを犠牲した。脳を薄くスライスし、ＧＦＰ発現に対して免疫染色した。５日目に収穫した脳により、ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅ／Ａｉ９マウス実験と同様に、形質導入が主に血管系においてであることが明らかとなった。この形質導入パターンは、いくつかの脳領域において観察された（図２Ａ）。興味深いことに、血管系形質導入表現型は、２８日目において維持されたが、その一方で、発現レベルはかなり減少した（図２Ａ）。３つの脳領域におけるＧＦＰレベルの定量化により、５日目と２８日目時点の間における約６０％の著しい減少が明らかとなった（図２Ｂ）。
ＧＦＰをコードするＩＶ注射されたＡＡＶ－ＰＲによる脳血管系形質導入細胞の時間依存性減少
発明者らは、このカプシドの「完全発現」プロファイルを評価するために、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系におけるＡＡＶ－ＰＲを評価する実験を開始した。最近実証されたように、従来の蛍光レポーターは、ＡＡＶによる形質導入事象（例えば、一過性発現）を過少評価し２、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の使用は、これらの形質導入事象の全てを捕捉することを可能にし、それは、異なる遺伝子送達用途、例えば、ゲノム編集などにとって有用であり得る。ＡＡＶ－ＰＲ媒介性Ｃｒｅ発現は、マウスゲノムの永久的な遺伝子改変を可能にし、それは、結果として、安定したｔｄＴｏｍａｔｏの発現を生じる。長期間の発現のために染色体外ＡＡＶゲノムの安定性を頼りにする、さらに従来的な「遺伝子追加」送達フォーマットにおけるＡＡＶ－ＰＲカプシドの形質導入プロファイルを試験するために、発明者らは、自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＧＦＰゲノムをＡＡＶ－ＰＲカプシドにパッケージした。発明者らは、成体の雄のマウスに３．５×１０１０ｖｇ／マウス（およそ１．４×１０１２ｖｇ／ｋｇ）を注射し、注射後の５日目（ｎ＝２）および２８日目（ｎ＝３）にマウスを犠牲した。脳を薄くスライスし、ＧＦＰ発現に対して免疫染色した。５日目に収穫した脳により、ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－Ｃｒｅ／Ａｉ９マウス実験と同様に、形質導入が主に血管系においてであることが明らかとなった。この形質導入パターンは、いくつかの脳領域において観察された（図２Ａ）。興味深いことに、血管系形質導入表現型は、２８日目において維持されたが、その一方で、発現レベルはかなり減少した（図２Ａ）。３つの脳領域におけるＧＦＰレベルの定量化により、５日目と２８日目時点の間における約６０％の著しい減少が明らかとなった（図２Ｂ）。
【0079】
脳、心臓、および肝臓におけるベクターゲノムの安定性を評価するために、発明者らは、成体の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスへの注射による全身投与後の５日目および２８日目に、全組織からベクターおよび宿主ゲノムＤＮＡを単離した。脳では、５日目と２８日目の間において、ベクターゲノムは少なく３０％減少したが（図３）、これは、統計的に有意ではなかった。同じ時間間隔において、肝臓では、５０％減少し、心臓では、２０％増加したが（図３）、両方とも、統計的有意には達しなかった。肝臓におけるゲノムは、脳より肝臓において１００倍超高く、このことは、ＡＡＶ－ＰＲカプシドが肝臓では脱標的化されないことを示唆している。これらのデータは、この時間間隔では、ＡＡＶ－ＰＲによって送達されたＡＡＶゲノムは大幅には減少しないことを示唆しており、それは、内皮細胞におけるハイブリッドＣＢＡプロモーターの一時的な活性を示し得る。
【0080】
[実施例４]
ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰによって形質導入された脳および周辺細胞タイプのキャラクタリゼーション
ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰによって媒介される導入遺伝子発現の血管系表現型を確認するために、ベクターを注射されたマウスの脳切片を、様々な細胞マーカーで免疫染色した。最初に、発明者らは、ベクター注射後の５日目および２８日目に、内皮マーカーＣＤ３１によるＧＦＰ発現の共局在化を評価した。両方の時点において、発明者らは、予想されるようなＣＤ３１／ＧＦＰ共局在化を容易に検出した（図４）。次に、発明者らは、ＡＡＶ－ＰＲが周皮細胞に形質導入することができるか否かを評価した。興味深いことに、５日目において、発明者らは、周皮細胞の最大で５０％がＡＡＶ－ＰＲによって形質導入されたことを検出した（ＰＤＧＦＲ－β染色によって検出した）（図５）。海馬における体性感覚皮質およびニューロンでのＧＦＰ陽性星状細胞の非常にまばらな検出が検出された（図６）。全身投与されたＡＡＶベクターは、しばしば、肝臓を容易に形質導入するため、発明者らは、２８日目におけるＧＦＰ発現に対して、この器官を評価した。ＡＡＶ－ＰＲは、肝細胞をロバストに形質導入した（形態学的に評価した）（図７）。
ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰによって形質導入された脳および周辺細胞タイプのキャラクタリゼーション
ＡＡＶ－ＰＲ－ＣＢＡ－ＧＦＰによって媒介される導入遺伝子発現の血管系表現型を確認するために、ベクターを注射されたマウスの脳切片を、様々な細胞マーカーで免疫染色した。最初に、発明者らは、ベクター注射後の５日目および２８日目に、内皮マーカーＣＤ３１によるＧＦＰ発現の共局在化を評価した。両方の時点において、発明者らは、予想されるようなＣＤ３１／ＧＦＰ共局在化を容易に検出した（図４）。次に、発明者らは、ＡＡＶ－ＰＲが周皮細胞に形質導入することができるか否かを評価した。興味深いことに、５日目において、発明者らは、周皮細胞の最大で５０％がＡＡＶ－ＰＲによって形質導入されたことを検出した（ＰＤＧＦＲ－β染色によって検出した）（図５）。海馬における体性感覚皮質およびニューロンでのＧＦＰ陽性星状細胞の非常にまばらな検出が検出された（図６）。全身投与されたＡＡＶベクターは、しばしば、肝臓を容易に形質導入するため、発明者らは、２８日目におけるＧＦＰ発現に対して、この器官を評価した。ＡＡＶ－ＰＲは、肝細胞をロバストに形質導入した（形態学的に評価した）（図７）。
【0081】
参考文献
【0082】
【表2】
【0083】
他の実施形態
本発明は、その詳細な記載と併せて記載してきたが、先述の記載は、例示することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を制限することを意図しないことは理解されるべきである。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、その詳細な記載と併せて記載してきたが、先述の記載は、例示することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を制限することを意図しないことは理解されるべきである。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【配列表】
【国際調査報告】