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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-10
(54)【発明の名称】抗ＳＩＧＬＥＣ組成物及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240403BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240403BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240403BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240403BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240403BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K39/395 D
A61P35/02
A61K39/395 U
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023566870
(86)(22)【出願日】2022-04-29
(85)【翻訳文提出日】2024-01-04
(86)【国際出願番号】 US2022027006
(87)【国際公開番号】W WO2022232558
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】63/182,271
(32)【優先日】2021-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521449809
【氏名又は名称】オンコシーフォー、インク．
(71)【出願人】
【識別番号】517322042
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ メリーランド ボルチモア
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リウ、ヤン
(72)【発明者】
【氏名】チョン、パン
(72)【発明者】
【氏名】デブンポート、マーティン
(72)【発明者】
【氏名】リウ、ミンユエ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA16
4C085BB11
4C085CC21
4C085EE01
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、及びがん治療における前記抗体の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）配列番号３に記載の配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ３のうちの１つ又は複数を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ３のうちの１つ又は複数を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項2】
前記重鎖可変領域が、配列番号１に記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項3】
キメラ抗体である、請求項１又は請求項２に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項4】
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１３のうちの１つに記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１４～１８のうちの１つに記載の配列を含む、請求項１に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項5】
前記重鎖可変領域が、配列番号９、１０又は１１に記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１５に記載の配列を含む、請求項４に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項6】
前記重鎖可変領域が、配列番号９に記載の配列を含む、請求項５に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項7】
重鎖が、配列番号２５に記載の配列を含む、請求項６に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項8】
軽鎖が、配列番号２７に記載の配列を含む、請求項７に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項9】
前記重鎖可変領域が、配列番号１０に記載の配列を含む、請求項５に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項10】
重鎖が、配列番号３２に記載の配列を含む、請求項９に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項11】
軽鎖が、配列番号２７に記載の配列を含む、請求項１０に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項12】
前記重鎖可変領域が、配列番号１１に記載の配列を含む、請求項５に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項13】
前記重鎖可変領域が、配列番号１０又は１２に記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７に記載の配列を含む、請求項４に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項14】
前記重鎖可変領域が、配列番号１０に記載の配列を含む、請求項１３に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項15】
前記重鎖可変領域が、配列番号１２に記載の配列を含む、請求項１３に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項16】
前記重鎖可変領域が、配列番号１０又は１２に記載の配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に記載の配列を含む、請求項４に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項17】
前記重鎖可変領域が、配列番号１０に記載の配列を含む、請求項１６に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項18】
重鎖が、配列番号３２に記載の配列を含む、請求項１７に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項19】
軽鎖が、配列番号３４に記載の配列を含む、請求項１８に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項20】
前記重鎖可変領域が、配列番号１２に記載の配列を含む、請求項１６に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項21】
請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体を患者に投与することを含む、治療を必要とする患者におけるがんを治療する方法。
【請求項22】
前記抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体が、第２のがん治療と組み合わせて投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記第２のがん治療が、がんを標的とする免疫療法又は免疫細胞を標的とする免疫療法である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記第２のがん治療が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記がんが、進行固形腫瘍、血液がん、又は前記抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体に結合する浸潤細胞を含むがんである、請求項２１～請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記がんが、肺腺がん（ＬＵＡＤ）、皮膚黒色腫－転移（ＳＫＣＭ－ＴＭ）、肺扁平上皮がん（ＬＵＳＣ）、乳房浸潤がん－基底、乳房浸潤がん－Ｈｅｒ２、膵臓腺がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓腎明細胞がん、胃腺がん、多形性膠芽細胞腫、乳房浸潤がん－ＬｕｍＢ又は乳房浸潤がん－ＬｕｍＡ、非小細胞肺がん、膠芽腫、黒色腫、低悪性度神経膠腫、腎がん、乳がん基底型、Ｈｅｒ２＋乳がん、膵がん及び卵巣がんからなる群から選択される進行固形腫瘍である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記肺腺がんが非小細胞肺腺がんである、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記がんが、白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される血液がんである、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
重鎖が配列番号３２に記載の配列を含み、軽鎖が配列番号２７に記載の配列を含むか、重鎖が配列番号２５に記載の配列を含み、軽鎖が配列番号２７に記載の配列を含むか、又は重鎖が配列番号３２に記載の配列を含み、軽鎖が配列番号３４に記載の配列を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体。
【請求項30】
請求項２９に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体を患者に投与することを含む、治療を必要とする患者におけるがんを治療する方法。
【請求項31】
前記抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体が、第２のがん治療と組み合わせて投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記第２のがん治療が、がんを標的とする免疫療法又は免疫細胞を標的とする免疫療法である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記第２のがん治療が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記がんが、進行固形腫瘍、血液がん、又は前記抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体に結合する浸潤細胞を含むがんである、請求項３０～請求項３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記がんが、肺腺がん（ＬＵＡＤ）、皮膚黒色腫－転移（ＳＫＣＭ－ＴＭ）、肺扁平上皮がん（ＬＵＳＣ）、乳房浸潤がん－基底、乳房浸潤がん－Ｈｅｒ２、膵臓腺がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓腎明細胞がん、胃腺がん、多形性膠芽細胞腫、乳房浸潤がん－ＬｕｍＢ又は乳房浸潤がん－ＬｕｍＡ、非小細胞肺がん、膠芽腫、黒色腫、低悪性度神経膠腫、腎がん、乳がん基底型、Ｈｅｒ２＋乳がん、膵がん及び卵巣がんからなる群から選択される進行固形腫瘍である、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記肺腺がんが非小細胞肺腺がんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記がんが、白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される血液がんである、請求項３４に記載の方法。
【請求項38】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の使用。
【請求項39】
前記医薬が、第２のがん治療と組み合わせての使用を意図したものである、請求項３８に記載の使用。
【請求項40】
前記第２のがん治療が、がんを標的とする免疫療法又は免疫細胞を標的とする免疫療法である、請求項３９に記載の使用。
【請求項41】
前記第２のがん治療が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項４０に記載の使用。
【請求項42】
前記がんが、進行固形腫瘍、血液がん、又は前記抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体に結合する浸潤細胞を含むがんである、請求項３８～請求項４１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項43】
前記がんが、肺腺がん（ＬＵＡＤ）、皮膚黒色腫－転移（ＳＫＣＭ－ＴＭ）、肺扁平上皮がん（ＬＵＳＣ）、乳房浸潤がん－基底、乳房浸潤がん－Ｈｅｒ２、膵臓腺がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓腎明細胞がん、胃腺がん、多形性膠芽細胞腫、乳房浸潤がん－ＬｕｍＢ又は乳房浸潤がん－ＬｕｍＡ、非小細胞肺がん、膠芽腫、黒色腫、低悪性度神経膠腫、腎がん、乳がん基底型、Ｈｅｒ２＋乳がん、膵がん及び卵巣がんからなる群から選択される進行固形腫瘍である、請求項４２に記載の使用。
【請求項44】
前記肺腺がんが非小細胞肺腺がんである、請求項４３に記載の使用。
【請求項45】
前記がんが、白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される血液がんである、請求項４２に記載の使用。
【請求項46】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項２９に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の使用。
【請求項47】
前記医薬が、第２のがん治療と組み合わせての使用を意図したものである、請求項４６に記載の使用。
【請求項48】
前記第２のがん治療が、がんを標的とする免疫療法又は免疫細胞を標的とする免疫療法である、請求項４７に記載の使用。
【請求項49】
前記第２のがん治療が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項４８に記載の使用。
【請求項50】
前記がんが、進行固形腫瘍、血液がん、又は前記抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体に結合する浸潤細胞を含むがんである、請求項４６～請求項４９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項51】
前記がんが、肺腺がん（ＬＵＡＤ）、皮膚黒色腫－転移（ＳＫＣＭ－ＴＭ）、肺扁平上皮がん（ＬＵＳＣ）、乳房浸潤がん－基底、乳房浸潤がん－Ｈｅｒ２、膵臓腺がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓腎明細胞がん、胃腺がん、多形性膠芽細胞腫、乳房浸潤がん－ＬｕｍＢ又は乳房浸潤がん－ＬｕｍＡ、非小細胞肺がん、膠芽腫、黒色腫、低悪性度神経膠腫、腎がん、乳がん基底型、Ｈｅｒ２＋乳がん、膵がん及び卵巣がんからなる群から選択される進行固形腫瘍である、請求項５０に記載の使用。
【請求項52】
前記肺腺がんが非小細胞肺腺がんである、請求項５１に記載の使用。
【請求項53】
前記がんが、白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される血液がんである、請求項５０に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０に選択的に結合する抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、及びがん治療におけるそのような抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ２４は、小型の重度にグリコシル化されたムチン様グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞表面タンパク質である。ＣＤ２４は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、好酸球、樹状細胞及びマクロファージを含む造血細胞、並びに神経細胞、神経節細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、筋細胞、膵臓細胞及び上皮幹細胞を含む非造血細胞上で高レベルに発現される。一般に、ＣＤ２４は、前駆細胞及び代謝的に活性な細胞では発現レベルが高くなり、最終分化細胞では発現の程度が低くなる傾向がある。ＣＤ２４の機能は、ほとんどの細胞型では不明であるが、ＣＤ２４の多様な免疫学的機能が報告されている。
【0003】
ＣＤ２４は、自然免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃ－１０と相互作用して、炎症に関連する細胞損傷に対する宿主応答を負に調節し、少なくとも２つの重複する機構により、この活性が説明され得る。第１に、ＣＤ２４は、ＨＳＰ７０、９０、ＨＭＧＢ１及びヌクレオリンを含むいくつかの損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に結合して、これらのＤＡＭＰに対する宿主応答を抑制する。ＣＤ２４は、炎症性刺激を捕捉して、ＴＬＲ又はＲＡＧＥとの相互作用を防ぐのではないかと推測される。第２に、その受容体であるＳｉｇｌｅｃ Ｇ（Ｓｉｇｌｅｃ－１０のマウスホモログ）との相互作用により、ＣＤ２４は、組織傷害に対する宿主応答に対して強力な負の調節を提供する。この活性を達成するために、ＣＤ２４は、Ｓｉｇｌｅｃ Ｇに結合して、Ｓｉｇｌｅｃ Ｇによるシグナル伝達を刺激する可能性があり、ここでＳｉｇｌｅｃ Ｇ関連ＳＨＰ１が負の調節を誘発する。いずれかの遺伝子の標的化された変異を有するマウスがはるかに強い炎症反応を示したことから、両機構は協調して作用する可能性がある。
【0004】
Ｓｉｇｌｅｃは、ＮＨ３＋末端が細胞外空間にあり、ＣＯＯ－末端が細胞質ゾルにあるＩ型膜貫通タンパク質である。Ｓｉｇｌｅｃ－１０の細胞外ドメインは、シアル酸のための結合受容体として機能するＮ末端Ｖ型免疫グロブリンドメイン（Ｉｇドメイン）と、結合活性を有しないがＶ型Ｉｇ結合ドメインを細胞表面から遠ざけるように延長する５つのＣ２型Ｉｇドメインとを含有する。Ｓｉｇｌｅｃ－１０を含むほとんどのＳｉｇｌｅｃの細胞質ドメインは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ１及びＳＨＰ２などのチロシンホスファターゼの動員を介して負にシグナル伝達する。Ｓｉｇｌｅｃの主な機能は、シアル酸を含有するグリカンに結合することである。これらの受容体－グリカン相互作用は、細胞接着、細胞シグナル伝達及びその他の機能に使用することができ、これは多くの場合、それらの細胞分布に限定される。ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０は、マウスＳｉｇｌｅｃ Ｇの機能的オルソログであり、マウスＣＤ２４及びヒトＣＤ２４の両方に結合する。
【0005】
多くのがんは、「ｄｏ ｎｏｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルと呼ばれる抗ファゴサイトーシス性表面タンパク質の過剰発現を通して免疫系によるクリアランスを回避する。そのようなタンパク質の例には、それぞれ免疫細胞上のＰＤ－１及びシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）に結合し、これによりマクロファージの活性を阻害するＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７が挙げられる。したがって、これらのｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅ経路を遮断するか又はそれに拮抗する抗体が、免疫腫瘍薬として開発されている。ＣＤ２４は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０とのその相互作用を介してさらに別のそのようなｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅシグナルを表すことが実証されており、ＣＤ２４は、多くの正常組織及び細胞型に見られるものの、ヒトがんのほぼ７０％において過剰発現されており、がん細胞内における最も過剰発現されるタンパク質の１つである。ＣＤ２４発現は腫瘍形成中にアップレギュレートされ、腫瘍の進行及び転移に果たすその役割が示唆される。がんにおけるＣＤ２４の過剰発現はまた、がん患者についての予後不良と疾患がより悪性度の高い経過を辿ることを示すマーカーとして同定されている。
【0006】
したがって、当技術分野では、がんの治療のための、ＣＤ２４：Ｓｉｇｌｅｃ－１０ ｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅ系を標的とする新しい免疫療法が必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
本開示では、（ａ）配列番号３に記載の配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ３のうちの１つ又は複数を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ３のうちの１つ又は複数を含む軽鎖可変領域、を含んでもよい抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体が提供される。重鎖可変領域は、配列番号１に記載の配列を含んでもよく、また軽鎖可変領域は、配列番号２に記載の配列を含んでもよい。抗体はキメラ抗体であってもよい。
【0008】
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の重鎖可変領域は、配列番号９～１３のうちの１つに記載の配列を含んでもよく、また軽鎖可変領域は、配列番号１４～１８のうちの１つに記載の配列を含んでもよい。重鎖可変領域は、配列番号９、１０又は１１に記載の配列を含んでもよく、また軽鎖可変領域は、配列番号１５に記載の配列を含んでもよい。Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０又は１２に記載の配列を含んでもよく、また軽鎖可変領域は、配列番号１７に記載の配列を含んでもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０又は１２に記載の配列を含んでもよく、また軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載の配列を含んでもよい。抗体は、配列番号９に記載の配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５に記載の配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体は、配列番号２５に記載の配列を含む重鎖を含んでもよく、また配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖をさらに含んでもよい。抗体は、配列番号１０に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５又は１６に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでもよい。抗体は、配列番号３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖とを含んでもよい。抗体は、配列番号３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号３４に記載の配列を含む軽鎖とを含んでもよい。
【0009】
本開示では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体を患者に投与することを含んでもよい、治療を必要とする患者におけるがんを治療する方法も提供される。がんを治療するのに使用するための抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、及びがんを治療するための医薬の製造における抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の使用がさらに提供される。がんを治療するための、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体を含む組成物も提供される。この組成物は医薬組成物であってもよい。
【0010】
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、第２のがん治療と組み合わせて投与されてもよく、あるいは第２のがん治療と組み合わせての使用を意図したものであってもよい。第２のがん治療は、がんを標的とする免疫療法又は免疫細胞を標的とする免疫療法であってもよい。第２のがん治療は抗ＣＴＬＡ－４抗体であってもよい。
【0011】
がんは、進行固形腫瘍、血液がん、又は抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体に結合する浸潤細胞を含むがんであってもよい。がんは、進行固形腫瘍であってもよく、これは、肺腺がん（ＬＵＡＤ）、皮膚黒色腫－転移（ＳＫＣＭ－ＴＭ）、肺扁平上皮がん（ＬＵＳＣ）、乳房浸潤がん－基底、乳房浸潤がん－Ｈｅｒ２、膵臓腺がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓腎明細胞がん、胃腺がん、多形性膠芽細胞腫、乳房浸潤がん－ＬｕｍＢ若しくは乳房浸潤がん－ＬｕｍＡ、非小細胞肺がん、膠芽腫、黒色腫、低悪性度神経膠腫、腎がん、乳がん基底型、Ｈｅｒ２＋乳がん、膵がん又は卵巣がんであってもよい。肺腺がんは非小細胞肺腺がんであってもよい。血液がんは、白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫又は多発性骨髄腫であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【図5】図５は、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０ ｍＡｂ ３１Ｆ１１がマクロファージによるがん細胞のファゴサイトーシスを促進することを示す。４０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地によって、末梢血から単離したヒト単球を５～７日間刺激した。次いで、５０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１とＩＬ１０とによって、Ｍ２マクロファージを２４時間誘導した。ＭＣＦ－７細胞をＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ ＢＭＱＣ Ｄｙｅによって標識し、示された濃度の抗ｓｉｇｌｅｃ－１０ ｍＡｂ、５Ｇ６、１０Ｈ３及び３１Ｆ１１（ｍＦｃ＝マウスＦｃ；ｈＦｃ＝ヒトＦｃ）の存在下で２時間にわたり、ドナー由来Ｍ２マクロファージと共培養した。細胞をＡＰＣに結合させた抗ＣＤ１１ｂ Ａｂによって染色し、総ＣＤ１１ｂ＋細胞中におけるＶｉｏｌｅｔ色素陽性ＣＤ１１ｂ＋細胞の％に基づいて、フローサイトメトリーによってファゴサイトーシス（％）を測定した。示されたデータは、フローサイトメトリーによって測定した、がん細胞を貪食したマクロファージ％の平均及び標準誤差である。
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【図9】図９は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）レポーターアッセイのレスキューにおける活性に基づく、ヒト化３１Ｆ１１クローンのアンタゴニスト活性を示す。５×１０４個のＪｕｒｋａｔ－ＰＷＰＩ－Ｓ１０細胞と５×１０４個のＣＨＯ－ｈＣＴＬＡ４細胞とを、０．１μｇ／ｍｌの抗ｈＣＴＬＡ４抗体、及び示された濃度の抗ｓｉｇｌｅｃ １０抗体と共培養した。１６～２４時間のインキュベーション後、ＢＩＯ－ＧＬＯ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを全試験ウェルに添加し、グロー型発光を読取る能力を有するプレートリーダーを使用して発光を測定した。示されたデータは、抗体の段階分けした用量それぞれにおける最大ＡＤＣＣ活性の％値である。
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【図26A】図２６Ａ～図２６Ｃは、Ｓｉｇｌｅｃ１０トランスジェニックマウスＰＢＭＣ及びヒトＰＢＭＣへのＯＮＣ－８４１の結合を示す。図２６Ａ：左、ヒトＳｉｇｌｅｃ１０トランスジェニックマウスとＳｉｇｌｅｃＧノックアウトマウスとの交配から得られたＦ１マウスからの血液分析。マウスは、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０及びＳｉｇｌｅｃ Ｇの両方を発現する。右、交配Ｆ１マウスの血液分析、及びトランスジェニックコロニーを作製するために選択されたマウスの表現型。さらに繁殖させるために、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０染色のみを有するＦ２マウスを選択する。マウス血液を市販の抗体によって染色した。
【0038】
【0039】
【図28】図２８は、抗ＣＴＬＡ－４抗体処置に対する応答性についてヒトがんをランク付けするための戦略の図を示す。我々は、まず、抗ＣＴＬＡ－４抗体による新たに同定された作用機序と、ＦＣＧＲ３Ａ多型、及びイピリムマブに対する応答性についての別のグループによって行われた分析とを考慮して、ＣＴＬＡ－４応答データベースに基づいて、抗ＣＴＬＡ－４抗体の治療応答に影響を及ぼす成分を同定した。各成分の中央値に基づいてヒトがん型をランク付けした。これらの成分を等しく重み付けし、５つのカテゴリーにグループ分けし、各カテゴリーにランク付けした。次いで、５つのカテゴリーのランキングを重み付けして、最終ランキングを得た。
【0040】
【発明を実施するための形態】
【0041】
実験モデル系及び患者において、免疫系はがんを認識及び排除することができる。その結果、がん免疫療法は、がん治療の最も有望な領域の１つとして浮上している。能動的ながん免疫療法は、免疫チェックポイント又はｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅシグナルを遮断することによって自然免疫応答を増幅する薬剤（ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４及びＣＤ４７に対する抗体など）を含む。
【0042】
本開示では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体組成物及びその抗原結合断片が提供される。この抗体分子は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は多重特異性であってもよい。Ｓｉｇｌｅｃ－１０結合分子は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、特にヒトＳｉｇｌｅｃ－１０に免疫特異的に結合する、抗体の抗原結合断片を含んでもよく、前記Ｓｉｇｌｅｃ－１０は、特に内因性濃度又はトランスフェクトされた濃度で生細胞の表面に発現されたものであってもよい。自らの抗原結合断片がＳｉｇｌｅｃ－１０に結合する抗体分子も提供される。抗体は、検出可能に標識されていてもよく、又は結合した毒素、薬物、受容体、酵素若しくは受容体リガンドを含んでもよい。
【0043】
異なる腫瘍型及び患者の応答性は様々であり、これは、異なる腫瘍型又は異なる集団には異なる阻害経路が関連しているのであろうことを意味する。したがって、追加のｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅシグナルの同定は、単独で、又は可能性としては組み合わせても、特定の腫瘍型又は患者に対してさらに効果的な新しい治療法の開発につながる可能性がある。本開示に記載の抗体分子は、本開示に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体を単独で又は他の治療法と組み合わせて投与することによってがんを治療するために使用されてもよい。
【0044】
我々は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０に対して、特に細胞表面のＳｉｇｌｅｃ－１０に対して、驚くほど強力な結合を示す抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体を発見した。この抗体はまた、強力なｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅシグナルを阻害することによって、強力なＡＤＣＣ活性を増強する。
【0045】
１．定義
本開示で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することのみを目的とするものであって、限定することを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうではないことを文脈が明確に指示していない限りは、複数の指示対象を含む。数値に付随する「約」という語は、その値の合理的な近似値を示す。特定の場合には、「約」は、それが付随する特定の値からの差異が１０％以内の範囲内にあると解釈することができる。例えば、「約１００」という語句は、９０と１１０の間の任意の値を包含する。
本開示で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することのみを目的とするものであって、限定することを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうではないことを文脈が明確に指示していない限りは、複数の指示対象を含む。数値に付随する「約」という語は、その値の合理的な近似値を示す。特定の場合には、「約」は、それが付随する特定の値からの差異が１０％以内の範囲内にあると解釈することができる。例えば、「約１００」という語句は、９０と１１０の間の任意の値を包含する。
【0046】
本開示における数値範囲の列挙では、間に位置する、同じ程度の精度を有する各数字が明示的に想定（contemplate）されている。例えば、６～９の範囲では、６及び９に加えて数字７及び８が想定され、６．０～７．０の範囲では、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に想定される。
【0047】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患からの動物の保護を指す場合、疾患を予防すること、抑制すること、退縮（regress）させること、又は完全に排除することを意味する。疾患を予防することは、疾患の発症前に本開示の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘導後であるがそれが臨床的に出現する前に、本開示の組成物を動物に投与することを含む。疾患を退縮させることは、疾患が臨床的に出現した後に、本開示の組成物を動物に投与することを含む。
【0048】
本開示で使用される場合、用語「抗体」は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を指すことが意図されている。用語「可変領域」は、免疫グロブリンの当該ドメインを、抗体によって広く共有されているドメイン（抗体Ｆｃドメインなど）と区別することが意図されている。可変領域は、その残基が抗原結合を担う「超可変領域」を含む。超可変領域は、「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、典型的には、軽鎖可変ドメインにおけるおおよそ第２４～第３４残基（Ｌ１）、第５０～第５６残基（Ｌ２）及び第８９～第９７残基（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインにおけるおおよそ第２７～３５残基（Ｈ１）、第５０～６５残基（Ｈ２）及び第９５～１０２残基（Ｈ３））及び／又は「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける第２６～３２残基（Ｌ１）、第５０～５２残基（Ｌ２）及び第９１～９６残基（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインにおける第２６～３２残基（Ｈ１）、第５３～５５残基（Ｈ２）及び第９６～１０１残基（Ｈ３））を含む。「フレームワーク領域」、すなわち「ＦＲ」残基は、本開示で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体という用語には、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ抗体、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本開示に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体及び抗抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれる。特には、そのような抗体には、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子が含まれる。
【0049】
本開示で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体のＣＤＲを含み、及び任意に（optionally）抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基を含み、抗原に免疫特異的に結合する能力を示す抗体の１つ又は複数の部分を指す。そのような断片には、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）及びそれらの変異型、天然のバリアント、並びに抗体の「可変領域」抗原認識部位と異種タンパク質（例えば、毒素、異なる抗原に対する抗原認識部位、酵素、受容体又は受容体リガンドなど）とを含む融合タンパク質が含まれる。本開示で使用される場合、用語「断片」は、少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。
【0050】
ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体は、ヒトにおけるインビボで使用にとって特に好ましいが、マウス抗体又はその他の生物種の抗体は、多くの用途（例えば、インビトロ又はｉｎ ｓｉｔｕでの検出アッセイ、急性インビボ使用など）のために有利に使用され得る。
【0051】
「キメラ抗体」は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子、例えば、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体である。非ヒト種由来の１つ又は複数のＣＤＲとヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（各々その内容全体が本開示に取り込まれる欧州特許第２３９，４００号、国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７並びに米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５３０，１０１号及び米国特許第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（参照により各々その内容が本開示に取り込まれる欧州特許第５９２，１０６号、欧州特許第５１９，５９６号）及び鎖シャッフリング（参照によりその内容が本開示に取り込まれる米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当技術分野で既知の様々な技術を使用して製造することができる。
【0052】
本開示では、「ヒト化抗体」も企図される。本開示で使用される場合、用語「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（通常マウス又はラット）免疫グロブリン由来の１つ又は複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち、少なくとも約８５～９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、ＣＤＲはそうでなくてもよいが、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖免疫グロブリン及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、キメラ抗体の例えば可変領域全体が非ヒトであるため、ヒト化抗体は、典型的なキメラ抗体を包含しないことになる。ドナー抗体は、「ヒト化」のプロセスによって「ヒト化」されたと称されることがあるが、これは、得られたヒト化抗体が、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予測されるためである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、可変ドメインでは、超可変領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲの全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、アミノ酸残基の置換、欠失又は付加の導入（すなわち、変異）によって改変された免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を任意に（optionally）含み、前記一部は典型的には、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリン免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部である。
【0053】
２．抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体組成物
本開示では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体又はその抗原結合断片が提供される。本開示に記載される抗体の１つ以上の特徴も抗原結合断片に含まれていてもよいことが理解される。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、腫瘍関連マクロファージに結合してもよく、がん細胞上に発現されたＣＤ２４への結合又はシグナル伝達を阻害してもよく、それによってがん細胞からの抗ファゴサイトーシスシグナルを阻害してもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体又はキメラ抗体であってもよい。
本開示では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体又はその抗原結合断片が提供される。本開示に記載される抗体の１つ以上の特徴も抗原結合断片に含まれていてもよいことが理解される。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、腫瘍関連マクロファージに結合してもよく、がん細胞上に発現されたＣＤ２４への結合又はシグナル伝達を阻害してもよく、それによってがん細胞からの抗ファゴサイトーシスシグナルを阻害してもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体又はキメラ抗体であってもよい。
【0054】
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、それぞれ配列番号１及び２に記載の配列を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体３１Ｆ１１の１つ又は複数の配列を含んでもよい。抗体は、配列番号１に記載の配列を含む重鎖可変領域を含んでもよく、また配列番号２に記載の配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の重鎖可変領域は、配列番号３に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号４に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ３のうちの１つ又は複数を含んでもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の軽鎖可変領域は、配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ３のうちの１つ又は複数を含んでもよい。一例では、抗体は、ヒトＦｃドメインに結合した、３１Ｆ１１の可変ドメインを含むキメラ抗体である。
【0055】
一実施形態では、重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３～５を有するＣＤＲ１～３を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号６～８を有するＣＤＲ１～３を含む。さらなる例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号３～５を含む重鎖可変領域と、配列番号６～８を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0056】
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の重鎖及び軽鎖のうちの１つ又は複数は、３１Ｆ１１に対してヒト化されてもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、それぞれ配列番号９、１０、１１、１２及び１３のうちの１つに記載の配列を含む１つ又は複数の重鎖可変領域（それぞれＨｕ－ＶＨｖ１、Ｈｕ－ＶＨｖ２、Ｈｕ－ＶＨｖ３、Ｈｕ－ＶＨｖ４及びＨｕ－ＶＨｖ５と呼ばれる）を含んでもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、それぞれ配列番号１４～１８のうちの１つに記載の配列を含む１つ又は複数の軽鎖可変領域（それぞれＨｕ－ＶＬｖ１、Ｈｕ－ＶＬｖ２、Ｈｕ－ＶＬｖ３、Ｈｕ－ＶＬｖ４及びＨｕ－ＶＬｖ５と呼ばれる）を含んでもよい。
【0057】
３１Ｆ１１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を以下に与える。
【0058】
３１Ｆ１１重鎖可変領域
【0059】
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＳＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＬＳＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＲＮＱＶＦＬＫＩＴＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＶＲＧＬＹＧＮＷＦＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ （配列番号１）
【0060】
３１Ｆ１１軽鎖可変領域
【0061】
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＹＫＡＳＱＮＶＧＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＭＱＳＥＮＬＡＮＹＦＣＱＱＹＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ （配列番号２）
【0062】
ヒト化３１Ｆ１１重鎖可変領域の配列を以下に与える（ＣＤＲには下線が引かれている）。
【0063】
Ｈｕ－３１Ｆ１１－ＶＨｖ１
【0064】
【数1】
【0065】
Ｈｕ－３１Ｆ１１－ＶＨｖ２
【0066】
【数2】
【0067】
Ｈｕ－３１Ｆ１１－ＶＨｖ３
【0068】
【数3】
【0069】
Ｈｕ－３１Ｆ１１－ＶＨｖ４
【0070】
【数4】
【0071】
Ｈｕ－３１Ｆ１１－ＶＨｖ５
【0072】
【数5】
【0073】
ヒト化３１Ｆ１１軽鎖可変領域の配列を以下に与える（ＣＤＲには下線が引かれている）。
【0074】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ１
【0075】
【数6】
【0076】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ２
【0077】
【数7】
【0078】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ２－軽鎖全体
【0079】
【数8】
【0080】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ２－軽鎖全体＋シグナルペプチド
【0081】
【数9】
【0082】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ３
【0083】
【数10】
【0084】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ３－軽鎖全体
【0085】
【数11】
【0086】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ３－軽鎖全体＋シグナルペプチド
【0087】
【数12】
【0088】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ４
【0089】
【数13】
【0090】
Ｈｕ ３１Ｆ１１－ＶＬｖ５
【0091】
【数14】
【0092】
一例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号９に記載の配列を含む重鎖可変領域、又は配列番号２５に記載の配列を含む重鎖と、配列番号１５に記載の配列を含む軽鎖可変領域、又は配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖とを含む。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ｈｕ－ＶＨｖ１ＶＬｖ２を含んでもよい。
【0093】
別の例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１０に記載の配列を含む重鎖可変領域、又は配列番号３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号１５に記載の配列を含む軽鎖可変領域、又は配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖とを含む。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ｈｕ－ＶＨｖ２ＶＬｖ２を含んでもよい。
【0094】
さらなる例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１０に記載の配列を含む重鎖可変領域、又は配列番号３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号１６に記載の配列を含む軽鎖可変領域、又は配列番号３４に記載の配列を含む軽鎖とを含む。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ｈｕ－ＶＨｖ２ＶＬｖ３を含んでもよい。
【0095】
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号９、１０又は１１に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５、２７、１６又は３４に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでもよい。
【0096】
別の例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１０に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含む。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ｈｕ－ＶＨｖ２ＶＬｖ４を含んでもよい。さらなる例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１２に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含む。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ｈｕ－ＶＨｖ４ＶＬｖ４を含んでもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１０又は１２に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでもよい。
【0097】
別の例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１２に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６又は３４に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含む。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ｈｕ－ＶＨｖ４ＶＬｖ３を含んでもよい。
【0098】
別の例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１０に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５又は１７に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含む。さらなる例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１２に記載の配列を含む重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１６、３４又は１７に記載の配列を含む。
【0099】
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ヒトＩｇκポリペプチドを含んでもよい。一例では、Ｉｇκは、配列番号１９に記載の配列を有する。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、ヒトＩｇＧポリペプチドを含んでもよく、該ヒトＩｇＧポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２であってもよい。一例では、ＩｇＧはＩｇＧ４であり、該ＩｇＧ４は、配列番号２０に記載の配列を有してもよい。別の例では、ＩｇＧ４はＳ２２８Ｐ変異を含んでもよく、これは以下の配列を有してもよい。
【0100】
【数15】
【0101】
別の例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号９に記載の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４に記載の配列を含むＳ２２８Ｐ変異型ＩｇＧ４とを含む。重鎖（ＶＨｖ１）は、以下に記載の配列を含んでもよい。
【0102】
【数16】
【0103】
配列番号２５に記載の配列を有する重鎖（ＶＨｖ１）は、シグナルペプチドをさらに含んでもよく、以下に記載の配列を有してもよい。
【0104】
【数17】
【0105】
重鎖（ＶＨｖ２）は、以下の配列を含んでもよい：
【0106】
【数18】
【0107】
重鎖（ＶＨｖ２）はまた、以下の配列を含んでもよい：
【0108】
【数19】
【0109】
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号９又は２５に記載の配列を含む重鎖と、配列番号１５又は２７に記載の配列を含む軽鎖とを含んでもよい（ＶＨｖ１ＶＬｖ２）。一例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号２５に記載の配列を含む重鎖と、配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖とを含んでもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１０又は３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号１５又は２７に記載の配列を含む軽鎖とを含んでもよい（ＶＨｖ２ＶＬｖ２）。一例では、抗体は、配列番号３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号２７に記載の配列を含む軽鎖とを含む。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、配列番号１０又は３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号１６又は３４に記載の配列を含む軽鎖とを含んでもよい（ＶＨｖ２ＶＬｖ３）。一例では、抗体は、配列番号３２に記載の配列を含む重鎖と、配列番号３４に記載の配列を含む軽鎖とを含む。
【0110】
３．二重特異性抗体組成物
本開示では、他の免疫刺激分子、免疫細胞を標的とする分子又はがんを標的とする分子に結合する抗体に架橋された、Ｓｉｇｌｅｃ－１０に結合する抗体を含む二重特異性抗体も提供される。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体又はその抗原結合断片と、がんを標的とする抗体又はその抗原結合断片とを含む。そのような分子は、腫瘍微小環境内に濃縮される。がんを標的とする抗体には、特異的Ｔ抗原、ＴＮ抗原、差次的にグリコシル化されたムチン、ＣＤ２４、ｈｅｒ－２、又はＰＭＳＡが含まれてもよい。
本開示では、他の免疫刺激分子、免疫細胞を標的とする分子又はがんを標的とする分子に結合する抗体に架橋された、Ｓｉｇｌｅｃ－１０に結合する抗体を含む二重特異性抗体も提供される。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体又はその抗原結合断片と、がんを標的とする抗体又はその抗原結合断片とを含む。そのような分子は、腫瘍微小環境内に濃縮される。がんを標的とする抗体には、特異的Ｔ抗原、ＴＮ抗原、差次的にグリコシル化されたムチン、ＣＤ２４、ｈｅｒ－２、又はＰＭＳＡが含まれてもよい。
【0111】
別の実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０二重特異性抗体は、補完的（complementary）抗腫瘍経路又は補完的（complementary）抗腫瘍機構を標的とする第２の抗体又はその抗原結合断片を含んでもよい。一実施形態では、本開示に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体組成物は、自然免疫応答を増幅するがん免疫療法抗体と組み合わせられてもよい。そのようながん免疫療法抗体の例には、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＭ４抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ４７、抗ＩＣＯＳ又は抗４－１ＢＢが挙げられる。そのような抗体は、がんを治療するために用いることができる。
【0112】
当技術分野で既知の多くの異なる二重特異性抗体技術が存在する。これらの大部分は、２つの部分を単一のコンストラクトで発現することができるように、２成分抗体が一本鎖形式であることを必要とする。好ましい方法は、抗体を一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）として発現させることである。二重特異性抗体技術の非限定的な例には、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを表す）、ＤＡＲＴ（二重親和性再ターゲティングを表す）、タンデム型Ｆａｂ（Ｆａｂｓ－ｉｎ－ｔａｎｄｅｍ）免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）、及びｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓが挙げられる。
【0113】
治療方法
【0114】
本開示では、がんを治療するための、本開示に記載の抗体組成物の使用、及びその医薬組成物の使用が提供される。本開示で使用される場合、用語「がん」は、細胞の異常な制御されない増殖から生じる新生物又は腫瘍を指す。本開示で用いられる用語、がんには、白血病及びリンパ腫が明示的に含まれる。該用語は、遠位部位に転移する可能性を有する細胞を伴う疾患を指す。
【0115】
本開示では、治療を必要とする対象におけるがん又は異常増殖性疾患を治療する方法が提供され、該方法は、前記抗体組成物を対象に投与することを含んでもよい。前記対象は、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、モンキー、エイプ又はヒトなどの哺乳動物であってもよい。一例では、対象はヒト患者である。がん又は異常増殖性疾患の治療に使用するための、前記抗体組成物を含む医薬組成物も提供される。がん又は異常増殖性疾患を治療するための医薬の製造における前記抗体組成物の使用がさらに提供される。一例では、前記抗体組成物は単剤療法として使用され、単剤療法は、マクロファージ、ＡＤＣＣ及び抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）のうちの１つ又は複数によるがん細胞のファゴサイトーシスを促進し得る。
【0116】
前記がんは、がん腫、例えば、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺及び皮膚のがん腫；例えば、扁平上皮がん；リンパ系統の造血器腫瘍、例えば、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫；骨髄系統の造血器腫瘍、例えば、急性及び慢性骨髄性白血病、及び前骨髄球性白血病；間葉系起源の腫瘍、例えば、線維肉腫及び横紋筋肉腫；その他の腫瘍、例えば、黒色腫、セミノーマ、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫及び神経膠腫；中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍、例えば、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫；間葉系起源の腫瘍、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫；並びにその他の腫瘍、例えば、黒色腫、色素性乾皮症（ｘｅｎｏｄｅｒｍａ ｐｅｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞状がん及びテラトカルシノーマのうちの１つ又は複数であってもよい（ただし、これらに限定されない）。特に、前記がんは、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん又は本開示に開示される白血病であってもよい。前記がんは、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体に結合する浸潤細胞を含んでもよい。
【0117】
前記がんは、進行固形腫瘍であってもよい。進行固形腫瘍は、標準治療（standard-of-care）全身療法後に進行したものであってもよい。前記がんは、肺腺がん（ＬＵＡＤ）、皮膚黒色腫－転移（ＳＫＣＭ－ＴＭ）、肺扁平上皮がん（ＬＵＳＣ）、乳房浸潤がん－基底、乳房浸潤がん－Ｈｅｒ２、膵臓腺がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓腎明細胞がん、胃腺がん、多形性膠芽細胞腫、乳房浸潤がん－ＬｕｍＢ若しくは乳房浸潤がん－ＬｕｍＡ、非小細胞肺がん、膠芽腫、黒色腫、低悪性度神経膠腫、腎がん、乳がん基底型、Ｈｅｒ２＋乳がん、膵がん又は卵巣がんであってもよい。一例では、前記がんは、ＬＵＡＤ、ＳＫＣＭ－ＴＭ、又はＬＵＳＣである。特に、前記がんは非小細胞肺腺がんであってもよい。前記がんはまた血液学的悪性疾患であってもよく、これは、白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫又は多発性骨髄腫であってもよい。
【0118】
前記がんは、アポトーシスの異常によって引き起こされたものであってもよく、そして本開示に記載の方法及び組成物によって治療されてもよい。がんは、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有するがん腫、乳房、前立腺又は卵巣のホルモン依存性腫瘍、及び家族性腺腫性ポリポーシス又は骨髄異形成症候群などの前がん性病変のうちの１つ又は複数であってもよい（ただし、これらに限定されない）。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓又は子宮において、悪性疾患又は増殖異常性（dysproliferative）の変化（化生（metaplasias）及び異形成（dysplasias）など）又は過剰増殖性障害が、本発明の方法及び組成物によって治療又は予防される。他のある特定の実施形態では、肉腫、黒色腫及び白血病のうちの１つ又は複数が、本開示に記載の方法及び組成物によって治療又は予防される。
【0119】
別の実施形態では、前記抗体組成物は、１つ又は複数の他の抗腫瘍療法と組み合わせて使用され、該抗腫瘍療法としては、現在の標準的化学療法及び実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法又は外科手術が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記抗体組成物は、がん、自己免疫疾患、感染性疾患又は中毒の治療及び／又は予防のための、治療有効量又は予防有効量の１つ若しくは複数の薬剤、治療用抗体、又は当業者に既知の他の薬剤と組み合わせて投与される。そのような薬剤は、例えば、上記の生物学的応答調節剤、細胞毒、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質又は有糸分裂阻害剤並びに免疫療法薬うちの任意のものを含む。
【0120】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体組成物は、１つ又は複数の抗腫瘍免疫療法とともに使用される。該抗腫瘍免疫療法は、免疫調節効果を増強するために、１つ若しくは複数の代替的な免疫調節経路（ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、４－１－ＢＢ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ４７、ＴＩＧＩＴ又はＬＡＧ３など）を破壊若しくは増強するか、又はサイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＧＦ－ベータ、ＩＦＮｇ、Ｆｌｔ３、ＢＬｙｓ）及びケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１）などのエフェクター分子の活性を調節する分子であってもよい。さらに別の実施形態では、前記抗体組成物は、さらに広範な免疫応答を達成するために、免疫応答の異なる段階又は態様を活性化する１つ又は複数の分子と組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態では、前記抗体組成物は、自己免疫性副作用を悪化させることなく、抗ＰＤ－１抗体又は抗４－１ＢＢ抗体と組み合わされる。
【0121】
前記抗体組成物は、腫瘍を標的とする抗体とともに使用されてもよい。腫瘍を標的とする前記抗体は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰのうちの１つ又は複数を引き起こす任意の抗体であってもよい。腫瘍を標的とする前記抗体は、セツキシマブ（アービタックス）、リツキシマブ（リツキサン）、トラスツズマブ（ハーセプチン）又はダラツムマブ（ダラザレックス）であってもよい。前記抗体組成物はまた、宿主細胞を標的とする免疫療法薬とともに使用されてもよく、該免疫療法薬は抗ＣＴＬＡ－４抗体であってもよい。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、当技術分野で既知である。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、参照によりその内容が本開示に取り込まれる米国特許第１０，６１８，９６０号に開示されたものであってもよい。一例では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、配列番号２１を含む重鎖可変領域と、配列番号２２を含む軽鎖可変領域とを有する。抗ＣＴＬＡ－４抗体軽鎖は、配列番号２９を含む定常領域をさらに含んでもよく、重鎖は、配列番号３０又は３１を含む定常領域をさらに含んでもよい。別の例では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、配列番号２１を含む可変領域と配列番号３１を含む定常領域とを含む重鎖、及び配列番号２２を含む可変領域と配列番号２９を含む定常領域とを含む軽鎖を有する。
【0122】
製造
【0123】
本開示に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、真核生物発現系を使用して調製されてもよい。発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞内のベクターからの発現を伴ってもよい。系はまた、真核細胞を感染させるために使用されてもよい複製欠損レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。抗体はまた、細胞ゲノムにインテグレーションされたベクターの一部又はベクターから抗体を発現する安定な細胞株から産生されてもよい。安定な細胞株は、インテグレーションされた複製欠損レトロウイルスベクターから抗体を発現してもよい。
【0124】
本開示に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、又はその抗原結合断片は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過及びヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用して精製することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチドが親和性マトリックス上に捕捉されることを可能にする追加のドメイン含有アミノ酸配列を含有するように改変されてもよい。例えば、本開示に記載の抗体は、免疫グロブリンドメインのＦｃ領域を含む場合は、プロテインＡカラムを使用して細胞培養上清又は細胞質抽出物から単離することができる。さらに、ポリペプチド精製を補助するために、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン又はＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ）などのタグを使用することができる。そのようなタグは、カルボキシル末端又はアミノ末端を含め、ポリペプチド内の任意の箇所に挿入されてもよい。有用でありうるその他の融合物としては、ポリペプチドの検出を補助する酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、が挙げられる。免疫アフィニティークロマトグラフィーを使用してポリペプチドを精製することもできる。
【0125】
医薬組成物
【0126】
本開示では、本開示に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体及び組成物のうちの１つ又は複数の治療有効量、並びに生理学的に許容されるキャリア又は製剤添加剤（excipient）を含む医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、予防有効量又は治療有効量の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、及び薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい
【0127】
特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は動物、さらに具体的にはヒトに使用するために米国薬局方若しくは他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア」は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、製剤添加剤（excipient）又は溶媒（vehicle）を指す。そのような医薬キャリアは、滅菌液体、例えば水及び油、であってもよく、前記滅菌液体としては、石油起源、動物起源、植物起源又は合成起源のものが挙げられ、その例としては、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などがある。医薬組成物が静脈内投与される場合、水が好ましいキャリアである。生理食塩水並びにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液も、液体キャリア、特には注射液用の液体キャリアとして使用することができる。好適な医薬製剤添加剤（excipient）には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態をとってもよい。
【0128】
一般に、前記医薬組成物の成分は、活性剤の量が表示されたアンプル又はサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉容器内に、例えば、凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に供給されていてもよく、又は単位剤形で一緒に混合されてもよい。組成物が輸液（infusion）によって投与される場合、無菌医薬グレードの水又は生理食塩水を含有する輸液ボトルを用いて組成物を投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供されてもよい。
【0129】
前記医薬組成物は、中性形態又は塩形態として製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、限定するものではないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンと形成した塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンと形成した塩が含まれる。
【0130】
前記医薬組成物は、ヒスチジン緩衝液、スクロース及びポリソルベート８０（ＰＳ８０）のうちの１つ若しくは複数、又は全部を含んでもよい。一例では、前記医薬組成物は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４又は約２５ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。特に、ヒスチジン緩衝液濃度は２０ｍＭであってもよい。前記医薬組成物は、約６、約７、約８、約９又は約１０％ｗ／ｖのスクロースを含んでもよい。一例では、前記医薬組成物は８％のスクロースを含む。前記医薬組成物は、約０．０１、約０．０２又は約０．０３％のＰＳ８０を含んでもよい。一例では、ＰＳ８０濃度は０．０２％である。一例では、前記医薬組成物は、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、８％のスクロース、及び０．０２％ｗ／ｖのＰＳ８０を含む。前記医薬組成物は、約５、約５．５又は約６．０のｐＨを有してもよい。一例では、ｐＨは５．５である。前記医薬組成物は、対象に投与される前に、０．９％塩化ナトリウム又は５％デキストロース溶液中に希釈されてもよい。
【0131】
ＯＮＣ－８４１であってもよい抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、約１０、約１５、約２０、約２５又は約３０ｍｇ／ｍＬで前記医薬組成物中に存在してもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８又は約９ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。用量は、１０ｍｇ／ｋｇ未満であってもよい。一例では、用量は３～９ｍｇ／ｋｇである。別の例では、用量は３ｍｇ／ｋｇである。対象が抗体組成物の投与に関連する有害事象を被っている場合には、その後の用量は、以前の用量から下方へと調整されてもよい。抗体組成物ががんに対して十分に強い効果を有しない場合、その後の用量は、以前の用量から上方へと調整されてもよい。
【0132】
投与方法
【0133】
本開示に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体組成物及びその医薬組成物を投与する方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外及び粘膜（例えば、鼻腔内経路及び経口経路）が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の抗体は、筋肉内投与、静脈内投与又は皮下投与される。組成物は、任意の何らかの好都合な経路によって、例えば輸液又はボーラス注射によって、上皮ライニング又は皮膚粘膜ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身的又は局所的であってよい。
【実施例】
【0134】
本開示は、以下の非限定的な例によって例示される複数の態様を有する。
【0135】
実施例１
モノクローナル抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の作製
アンタゴニストを作製するために、Ｓｉｇｌｅｃ－１０をトランスフェクトしたマウス細胞株を用いてマウスを免疫し、３回の免疫後、ハイブリドーマの作製のために脾臓細胞を採取した。ヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するエフェクター細胞を使用して測定した、ＡＤＣＣにおけるＳｉｇｌｅｃ－１０の阻害効果を打ち消す活性について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。２０，０００を超えるクローンのうち、１つ（３１Ｆ１１）がＳｉｇｌｅｃ－１０による阻害を打ち消すのに最も強力であることが分かった（図１）。別の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体（１０Ｈ３及び５Ｇ６）と比較して、３１Ｆ１１はＳｉｇｌｅｃ－１０機能に拮抗する上でより強力である。
モノクローナル抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の作製
アンタゴニストを作製するために、Ｓｉｇｌｅｃ－１０をトランスフェクトしたマウス細胞株を用いてマウスを免疫し、３回の免疫後、ハイブリドーマの作製のために脾臓細胞を採取した。ヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するエフェクター細胞を使用して測定した、ＡＤＣＣにおけるＳｉｇｌｅｃ－１０の阻害効果を打ち消す活性について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。２０，０００を超えるクローンのうち、１つ（３１Ｆ１１）がＳｉｇｌｅｃ－１０による阻害を打ち消すのに最も強力であることが分かった（図１）。別の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体（１０Ｈ３及び５Ｇ６）と比較して、３１Ｆ１１はＳｉｇｌｅｃ－１０機能に拮抗する上でより強力である。
【0136】
３１Ｆ１１の特異性を確認するために、我々は、Ｓｉｇｌｅｃ１、２、３、５、６、７、９、１０及び１１の細胞外ドメインからなる融合タンパク質によってプレートをコーティングし、これらのＳｉｇｌｅｃへの３Ｆ１１の結合を試験した。図２に示すように、Ｓｉｇｌｅｃ－１０のみが３１Ｆ１１への明らかな結合を示した。代替的な手法として、ＧＦＰタグ付きＳｉｇｌｅｃ２、３、５、９、１０、１２及び１５を２９３Ｔ細胞株にトランスフェクトした。図３に示すように、３１Ｆ１１は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０を発現する細胞に特異的に結合するが、試験した他のいずれのＳｉｇｌｅｃにも特異的に結合しない。まとめると、図２及び図３のデータは、３１Ｆ１１がＳｉｇｌｅｃ－１０に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃ１、２、３、５、６、７、９、１１、１２及び１５には結合しないことを実証している。
【0137】
実施例２
抗ｓｉｇｌｅｃ１０抗体は、脾細胞へのＳｉｇｌｅｃ－１０－Ｆｃ結合を遮断する
そのＳｉｇｌｅｃ－１０がそのリガンドに結合することを３１Ｆ１１が遮断するかどうかを確認するために、我々は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０－Ｆｃのマウス脾臓細胞への結合に対する３１Ｆ１１の効果を試験した。図４に示すように、Ｓｉｇｌｅｃ－１０－Ｆｃが脾臓細胞に結合することを遮断する上で、３１Ｆ１１は他の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体（５Ｇ６及び１０Ｈ３）よりも強力である。
抗ｓｉｇｌｅｃ１０抗体は、脾細胞へのＳｉｇｌｅｃ－１０－Ｆｃ結合を遮断する
そのＳｉｇｌｅｃ－１０がそのリガンドに結合することを３１Ｆ１１が遮断するかどうかを確認するために、我々は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０－Ｆｃのマウス脾臓細胞への結合に対する３１Ｆ１１の効果を試験した。図４に示すように、Ｓｉｇｌｅｃ－１０－Ｆｃが脾臓細胞に結合することを遮断する上で、３１Ｆ１１は他の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体（５Ｇ６及び１０Ｈ３）よりも強力である。
【0138】
実施例３
抗ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体ファゴサイトーシスアッセイ
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０がマクロファージによるがん細胞のファゴサイトーシスを促進するかどうかを試験するために、４０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地によって、末梢血から単離したヒト単球を５～７日間刺激した。次いで、５０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１及びＩＬ１０によって、Ｍ２マクロファージを２４時間誘導した。ＭＣＦ－７細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ ＢＭＱＣ Ｄｙｅによって標識し、示された濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０ Ａｂの存在下で２時間にわたり、ドナー由来マクロファージと共培養した。ファゴサイトーシスを行ったマクロファージの％をフローサイトメトリーによって決定した。図５に示すように、３１Ｆ１１はファゴサイトーシスを２倍超にしたが、他の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は明らかな効果を有しない。したがって、３１Ｆ１１はファゴサイトーシスを促進する点で独特である。
抗ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体ファゴサイトーシスアッセイ
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０がマクロファージによるがん細胞のファゴサイトーシスを促進するかどうかを試験するために、４０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地によって、末梢血から単離したヒト単球を５～７日間刺激した。次いで、５０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１及びＩＬ１０によって、Ｍ２マクロファージを２４時間誘導した。ＭＣＦ－７細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ ＢＭＱＣ Ｄｙｅによって標識し、示された濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０ Ａｂの存在下で２時間にわたり、ドナー由来マクロファージと共培養した。ファゴサイトーシスを行ったマクロファージの％をフローサイトメトリーによって決定した。図５に示すように、３１Ｆ１１はファゴサイトーシスを２倍超にしたが、他の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体は明らかな効果を有しない。したがって、３１Ｆ１１はファゴサイトーシスを促進する点で独特である。
【0139】
実施例４
抗ｈＣＤ２４抗体と組み合わせた抗腫瘍活性
３１Ｆ１１はインビトロでＡＤＣＣを促進するため、我々は、該抗体は腫瘍細胞を標的とする抗体と組み合わせて使用されれば腫瘍拒絶を促進するのではないかと仮説立てした。この仮説を試験するために、１×１０６個のＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞をＳ１０ ＢＭキメラマウス（ｎ：４～５）に接種した。７、１０、１３及び１６日目に、１００μｇのｈＩｇＦｃ、α－ｈＣＤ２４、３１Ｆ１１（αＳ１０）又はα－ｈＣＤ２４＋３１Ｆ１１でマウスを処置した。図６に示すように、抗ＣＤ２４と３１Ｆ１１との組合せは、全てのレシピエントマウスにおいて腫瘍拒絶を誘導したが、いずれか単独の場合はそうでなかった。これらのデータは、腫瘍拒絶における抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の使用を裏付ける。
抗ｈＣＤ２４抗体と組み合わせた抗腫瘍活性
３１Ｆ１１はインビトロでＡＤＣＣを促進するため、我々は、該抗体は腫瘍細胞を標的とする抗体と組み合わせて使用されれば腫瘍拒絶を促進するのではないかと仮説立てした。この仮説を試験するために、１×１０６個のＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞をＳ１０ ＢＭキメラマウス（ｎ：４～５）に接種した。７、１０、１３及び１６日目に、１００μｇのｈＩｇＦｃ、α－ｈＣＤ２４、３１Ｆ１１（αＳ１０）又はα－ｈＣＤ２４＋３１Ｆ１１でマウスを処置した。図６に示すように、抗ＣＤ２４と３１Ｆ１１との組合せは、全てのレシピエントマウスにおいて腫瘍拒絶を誘導したが、いずれか単独の場合はそうでなかった。これらのデータは、腫瘍拒絶における抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の使用を裏付ける。
【0140】
実施例５
がん治療のための３１Ｆ１１のヒト化
ヒトＩｇデータベースをブラストすることによって、３１Ｆ１１ ＶＨのＣＤＲ領域のためのヒトフレームワークアクセプターとして、ヒト生殖系列Ｖ領域配列ＩＧＨＶ２－７０＊０４及びＪ領域配列ＪＨ６を適用した。３１Ｆ１１ ＶＬのＣＤＲ領域のためのヒトフレームワークアクセプターとして、ヒト生殖系列Ｖ領域ＩＧＫＶ３－１５＊０１及びＪ領域配列ＪＫ４を適用した。５つのｈｕＶＨバージョン（配列番号９～１３を有するＶＨｖ１、ＶＨｖ２、ＶＨｖ３、ＶＨｖ４及びＶＨｖ５）及び５つのｈｕＶＬバージョン（配列番号１４～１８を有するＶＬｖ１、ＶＬｖ２、ＶＬｖ３、ＶＬｖ４及びＶＬｖ５）を設計した。
がん治療のための３１Ｆ１１のヒト化
ヒトＩｇデータベースをブラストすることによって、３１Ｆ１１ ＶＨのＣＤＲ領域のためのヒトフレームワークアクセプターとして、ヒト生殖系列Ｖ領域配列ＩＧＨＶ２－７０＊０４及びＪ領域配列ＪＨ６を適用した。３１Ｆ１１ ＶＬのＣＤＲ領域のためのヒトフレームワークアクセプターとして、ヒト生殖系列Ｖ領域ＩＧＫＶ３－１５＊０１及びＪ領域配列ＪＫ４を適用した。５つのｈｕＶＨバージョン（配列番号９～１３を有するＶＨｖ１、ＶＨｖ２、ＶＨｖ３、ＶＨｖ４及びＶＨｖ５）及び５つのｈｕＶＬバージョン（配列番号１４～１８を有するＶＬｖ１、ＶＬｖ２、ＶＬｖ３、ＶＬｖ４及びＶＬｖ５）を設計した。
【0141】
Ｓｉｇｌｅｃ－１０結合のためのＨｕＶＨ及びＨｕＶＬの最適に働く組合せを選択するために、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを発現コンストラクト内に合成し、様々な組合せを２９３個の細胞に同時にトランスフェクトし、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０を発現するＪｕｒｋａｔ細胞への結合について、７つのヒト化抗体及びキメラ親抗体を比較した。クローンの特性を表２にまとめて示す。
表２ ３１Ｆ１１のヒト化クローンの特性評価
表２ ３１Ｆ１１のヒト化クローンの特性評価
【表2】
【0142】
抗体の組合せは以下の通りである：＃２１（配列番号９及び１５）、＃２２（配列番号１０及び１５）、＃２３（配列番号１１及び１５）、＃３２（配列番号１０及び１７）、＃３４（配列番号１２及び１７）、＃５２（配列番号１０及び１６）、及び＃５４（配列番号１２及び１６）。これらのうち、親抗体は２１０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有し、ヒト化抗体は２２８ｎｇ／ｍｌ～４２３ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有した（図７）。このことは、全ての抗体が細胞表面Ｓｉｇｌｅｃ－１０への強力な結合を示したことを示唆している。熱安定性分析では、全てのヒト化抗体が良好な熱安定性を示すことが示された（図８）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用して、上位５つにランク付けされた抗体の親和性を測定した。表２に示すように、試験した５つの抗体はいずれも、Ｓｉｇｌｅｃ－１０に対して高い親和性結合を示す。特に、５つの抗体のうち３つ（＃２２、＃２３及び＃５２）は、キメラ親クローンよりも高い親和性を有した。
【0143】
生物学的機能を試験するために、ＡＤＣＣ活性を回復させる能力について、７つのｍＡｂを親キメラ抗体と比較した。図９に示すように、試験した全てのクローンに強力なＡＤＣＣが検出された。
【0144】
実施例６
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の前臨床試験
前臨床試験は、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの治療効果が腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇によるものであり、その毒性がＣＴＬＡ－４のダウンレギュレーションによるものであることを示唆している。抗ＣＴＬＡ－４を、抗ＣＴＬＡ－４のＡＤＣＣを増加させることができる薬物と組み合わせることが興味を惹く。我々はＳｉｇｌｅｃ－１０が抗ＣＴＬＡ－４によって誘発されるＡＤＣＣを含むＡＤＣＣの負の調節因子であることを実証したため（図１０）、Ｓｉｇｌｅｃ－１０は有望な標的として浮上した。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０ ｍＡｂである３１Ｆ１１は、ＡＤＣＣを増強し（図１１）、そしてがん細胞のファゴサイトーシスを増強する（図１２）その能力に基づいて開発された。本開示によって、ヒトがんの治療のために前記抗体のヒト化バージョンが開発され、ＯＮＣ－８４１と命名された。
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の前臨床試験
前臨床試験は、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの治療効果が腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇によるものであり、その毒性がＣＴＬＡ－４のダウンレギュレーションによるものであることを示唆している。抗ＣＴＬＡ－４を、抗ＣＴＬＡ－４のＡＤＣＣを増加させることができる薬物と組み合わせることが興味を惹く。我々はＳｉｇｌｅｃ－１０が抗ＣＴＬＡ－４によって誘発されるＡＤＣＣを含むＡＤＣＣの負の調節因子であることを実証したため（図１０）、Ｓｉｇｌｅｃ－１０は有望な標的として浮上した。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０ ｍＡｂである３１Ｆ１１は、ＡＤＣＣを増強し（図１１）、そしてがん細胞のファゴサイトーシスを増強する（図１２）その能力に基づいて開発された。本開示によって、ヒトがんの治療のために前記抗体のヒト化バージョンが開発され、ＯＮＣ－８４１と命名された。
【0145】
まとめると、Ｓｉｇｌｅｃ－１０のアンタゴニストは、２つの別個の機構によって抗腫瘍免疫を促進し得る。第１に、Ｓｉｇｌｅｃ－１０のアンタゴニストは、ＤＮＥＭＳを不活性化して腫瘍細胞のファゴサイトーシスを促進し得る。第２に、前記アンタゴニストは、ＡＤＣＣの負の調節因子の不活性化によって、ＡＤＣＣに基づく治療抗体の治療活性を増強し得る。
【0146】
作用機序
蓄積データによって、Ｓｉｇｌｅｃ－１０がファゴサイトーシス、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰに対する負の調節因子であることが確立された。したがって、ＯＮＣ－８４１は、単剤療法として、又は併用療法で腫瘍拒絶を促進することができる。
蓄積データによって、Ｓｉｇｌｅｃ－１０がファゴサイトーシス、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰに対する負の調節因子であることが確立された。したがって、ＯＮＣ－８４１は、単剤療法として、又は併用療法で腫瘍拒絶を促進することができる。
【0147】
単剤療法
図１３に示すように、ＯＮＣ－８４１は、単剤療法として、Ｓｉｇｌｅｃ－１０－ＣＤ２４ ＤＮＥＭＳ相互作用を遮断することによって腫瘍拒絶を促進する。この機構は、ＣＤ２４又はその他の高親和性Ｓｉｇｌｅｃ－１０リガンドを過剰発現するがんに対して最も活性となるものである。全ヒトがんのほぼ７０％がＣＤ２４を過剰発現し、その発現が予後不良に対応することが今や明らかである。さらに、Ｓｉｇｌｅｃ－１０は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）でも高レベルで発現される。ＯＮＣ－８４１は、非小細胞肺がんを含むほとんどのがん型に対する先天性免疫に広範な影響を及ぼし得ると予測される。
図１３に示すように、ＯＮＣ－８４１は、単剤療法として、Ｓｉｇｌｅｃ－１０－ＣＤ２４ ＤＮＥＭＳ相互作用を遮断することによって腫瘍拒絶を促進する。この機構は、ＣＤ２４又はその他の高親和性Ｓｉｇｌｅｃ－１０リガンドを過剰発現するがんに対して最も活性となるものである。全ヒトがんのほぼ７０％がＣＤ２４を過剰発現し、その発現が予後不良に対応することが今や明らかである。さらに、Ｓｉｇｌｅｃ－１０は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）でも高レベルで発現される。ＯＮＣ－８４１は、非小細胞肺がんを含むほとんどのがん型に対する先天性免疫に広範な影響を及ぼし得ると予測される。
【0148】
併用療法
Ｓｉｇｌｅｃ－１０はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを負に調節するため、ＯＮＣ－８４１は、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰによって抗腫瘍活性を達成する薬物と相乗的に作用する。そのような薬物は、がん細胞を標的としていても（例えば、アービタックス、リツキシマブ）、又は宿主細胞を標的としていても（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）よい。Ｓｉｇｌｅｃ－１０はＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを負に調節し、また、ＣＤ２４はＳｉｇｌｅｃ－１０がＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを阻害するように負にシグナル伝達することができるが、データは、Ｓｉｇｌｅｃ－１０が非ＣＤ２４リガンドを認識することができることを実証している。したがって、ＣＤ２４発現とは独立している腫瘍型について宿主細胞又はがん細胞のいずれかの枯渇を増強するために、ＯＮＣ－８４１を使用することができる。図１３は、ＴＭＥ内でＴｒｅｇの枯渇を促進するよう、すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ－１０による負のシグナル伝達を遮断することによってＴＭＥ内でＴｒｅｇの枯渇を促進するよう、ＯＮＣ－８４１をＯＮＣ－３９２などの抗ＣＴＬＡ－４と組み合わせて使用することができるメカニズムを示す。
Ｓｉｇｌｅｃ－１０はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを負に調節するため、ＯＮＣ－８４１は、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰによって抗腫瘍活性を達成する薬物と相乗的に作用する。そのような薬物は、がん細胞を標的としていても（例えば、アービタックス、リツキシマブ）、又は宿主細胞を標的としていても（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）よい。Ｓｉｇｌｅｃ－１０はＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを負に調節し、また、ＣＤ２４はＳｉｇｌｅｃ－１０がＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを阻害するように負にシグナル伝達することができるが、データは、Ｓｉｇｌｅｃ－１０が非ＣＤ２４リガンドを認識することができることを実証している。したがって、ＣＤ２４発現とは独立している腫瘍型について宿主細胞又はがん細胞のいずれかの枯渇を増強するために、ＯＮＣ－８４１を使用することができる。図１３は、ＴＭＥ内でＴｒｅｇの枯渇を促進するよう、すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ－１０による負のシグナル伝達を遮断することによってＴＭＥ内でＴｒｅｇの枯渇を促進するよう、ＯＮＣ－８４１をＯＮＣ－３９２などの抗ＣＴＬＡ－４と組み合わせて使用することができるメカニズムを示す。
【0149】
実施例７
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の薬理及び毒性
インビトロ薬理
ＯＮＣ－８４１の特異性
ＯＮＣ－８４１の結合特異性を確認するために、我々は、他のヒトＳｉｇｌｅｃ組換えタンパク質へのＯＮＣ－８４１の結合をＥＬＩＳＡによって試験した。Ｈｉｓタグ又はＦｃタグを有する様々なＳｉｇｌｅｃ細胞外ドメイン組換えタンパク質をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ビオチン化されたＯＮＣ－８４１を添加して、コーティングされたＳｉｇｌｅｃタンパク質への結合を検出した。アビジン－ＨＲＰを検出のための二次抗体として使用した。図１４Ａ及びＢに示すように、ＯＮＣ－８４１は、約０．０２２４７μｇ／ｍＬのＫｄでＳｉｇｌｅｃ１０に強力に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃ１～９、１１、１４及び１５を含む試験した他の全てのＳｉｇｌｅｃには強力な結合をしない。ＯＮＣ－８４１は、高濃度で、Ｓｉｇｌｅｃ－５Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－６Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－１１Ｆｃ及びＳｉｇｌｅｃ－１４Ｆｃに対するいくらかの結合を示した。結合がＳｉｇｌｅｃ組換えタンパク質に特異的であったのか、またはＦｃへの非特異的結合であったのかを解明するために、我々は、対照としてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）を含めた。結果は、Ｓｉｇｌｅｃ－５Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－６Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－１１Ｆｃ及びＳｉｇｌｅｃ－１４ＦｃへのＯＮＣ－８４１の結合は、結合がｈＩｇＧＦｃと同等であることから、Ｆｃタグへの非特異的結合によるものであることを示唆した。（図１４Ｂ）。
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体の薬理及び毒性
インビトロ薬理
ＯＮＣ－８４１の特異性
ＯＮＣ－８４１の結合特異性を確認するために、我々は、他のヒトＳｉｇｌｅｃ組換えタンパク質へのＯＮＣ－８４１の結合をＥＬＩＳＡによって試験した。Ｈｉｓタグ又はＦｃタグを有する様々なＳｉｇｌｅｃ細胞外ドメイン組換えタンパク質をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ビオチン化されたＯＮＣ－８４１を添加して、コーティングされたＳｉｇｌｅｃタンパク質への結合を検出した。アビジン－ＨＲＰを検出のための二次抗体として使用した。図１４Ａ及びＢに示すように、ＯＮＣ－８４１は、約０．０２２４７μｇ／ｍＬのＫｄでＳｉｇｌｅｃ１０に強力に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃ１～９、１１、１４及び１５を含む試験した他の全てのＳｉｇｌｅｃには強力な結合をしない。ＯＮＣ－８４１は、高濃度で、Ｓｉｇｌｅｃ－５Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－６Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－１１Ｆｃ及びＳｉｇｌｅｃ－１４Ｆｃに対するいくらかの結合を示した。結合がＳｉｇｌｅｃ組換えタンパク質に特異的であったのか、またはＦｃへの非特異的結合であったのかを解明するために、我々は、対照としてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）を含めた。結果は、Ｓｉｇｌｅｃ－５Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－６Ｆｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－１１Ｆｃ及びＳｉｇｌｅｃ－１４ＦｃへのＯＮＣ－８４１の結合は、結合がｈＩｇＧＦｃと同等であることから、Ｆｃタグへの非特異的結合によるものであることを示唆した。（図１４Ｂ）。
【0150】
ＯＮＣ－８４１は、ヒト悪性Ｊｕｒｋａｔ細胞上及びインビトロ分化した制御性Ｔ細胞上のＳｉｇｌｅｃ－１０とそのリガンドとの相互作用を遮断する
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、細胞の表面上のシアリル化タンパク質を認識し、α２，３－シアリル化よりもα２，６シアリル化を優先する。悪性細胞上のＳｉｇｌｅｃ－１０がその天然リガンドと相互作用することをＯＮＣ－８４１が遮断するかどうかを試験するために、Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃのヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞株への結合をＯＮＣ－８４１が遮断する能力を試験した。Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃ－ビオチンをストレプトアビジン－ＰＥ（ＳＡ－ＰＥ）と４：１のモル比で１時間かけて前もって複合体化し、次いで、様々な濃度のＯＮＣ－８４１に５分間かけて添加した。Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃ－ビオチン濃度に基づいて１０μｇ／ｍＬの濃度で混合物をＪｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ４細胞に添加し、室温で１時間のインキュベーションした。細胞を十分に洗浄して過剰の未結合試薬を除去し、フローサイトメーターによって取得した。死細胞の排除後に分析を行った。図１５に示すように、Ｓｉｇｌｅｃ－１０ＦｃはＪｕｒｋａｔ細胞株に強力に結合し、この結合は用量依存的にＯＮＣ－８４１によって遮断される。ＩＣ５０は、２μｇ／ｍＬ（１３．３ｎＭ）であると見積もられる。
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、細胞の表面上のシアリル化タンパク質を認識し、α２，３－シアリル化よりもα２，６シアリル化を優先する。悪性細胞上のＳｉｇｌｅｃ－１０がその天然リガンドと相互作用することをＯＮＣ－８４１が遮断するかどうかを試験するために、Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃのヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞株への結合をＯＮＣ－８４１が遮断する能力を試験した。Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃ－ビオチンをストレプトアビジン－ＰＥ（ＳＡ－ＰＥ）と４：１のモル比で１時間かけて前もって複合体化し、次いで、様々な濃度のＯＮＣ－８４１に５分間かけて添加した。Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃ－ビオチン濃度に基づいて１０μｇ／ｍＬの濃度で混合物をＪｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ４細胞に添加し、室温で１時間のインキュベーションした。細胞を十分に洗浄して過剰の未結合試薬を除去し、フローサイトメーターによって取得した。死細胞の排除後に分析を行った。図１５に示すように、Ｓｉｇｌｅｃ－１０ＦｃはＪｕｒｋａｔ細胞株に強力に結合し、この結合は用量依存的にＯＮＣ－８４１によって遮断される。ＩＣ５０は、２μｇ／ｍＬ（１３．３ｎＭ）であると見積もられる。
【0151】
Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃ－ビオチンの正常な宿主細胞への結合に対するＯＮＣ－８４１の影響を試験するために、蛍光Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃ四量体を使用し、上記と同じ方法を使用してＯＮＣ－８４１の影響を評価した。我々の提案する併用療法を裏付けるために、我々はＴｒｅｇに注目した。新鮮なＰＢＭＣから単離されたナイーブＣＤ４ Ｔ細胞からＴｒｅｇを分化させた。図１６に示すように、Ｓｉｇｌｅｃ－１０Ｆｃは、インビトロ分化させたヒトＴｒｅｇへの明確な結合を示す。Ｓｉｇｌｅｃ－１０ＦｃとＴｒｅｇとの相互作用は、ＯＮＣ－８４１によって用量依存的に遮断された。ＩＣ５０は、３．５７μｇ／ｍＬ（２３．８ｎＭ）であると見積もられる。
【0152】
ＯＮＣ－８４１は、がんを標的とする抗体両方のＡＤＣＣレポーター活性を促進する
ＣＤ２０、ＣＴＬＡ－４及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするものを含むがんを標的とする抗体が有する、ＡＤＣＣ活性を促進する能力について、ＯＮＣ－８４１を試験した。ＰｒｏｍｅｇａのＡＤＣＣレポーターアッセイを利用して、がんを標的とする抗体の存在下でのＦｃγＲＩＩＩＡの活性化の際の、エフェクター細胞内のＮＦＡＴによって発現される発光を検出することによって、ＡＤＣＣ活性を測定した。簡潔に言えば、ＡＤＣＣエフェクター細胞、空（mock）導入ＡＤＣＣエフェクター細胞（ＡＤＣＣ－Ｍｏｃｋ）又はヒトＳｉｇｌｅｃ－１０発現ＡＤＣＣ細胞（ＡＤＣＣ－ｈＳｉｇｌｅｃ１０）のいずれかと標的細胞を共インキュベートした。滴定したＯＮＣ－８４１ ｍＡｂとともに、腫瘍を標的とする抗体を固定濃度で添加した。相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。図１７Ａに示すように、ＯＮＣ－８４１は、抗ＣＤ２０によるＲａｊｉリンパ腫細胞株に対するＡＤＣＣ活性を促進し、ＥＣ５０は０．５μｇ／ｍｌであった。固形腫瘍に対するＯＮＣ－８４１の影響を試験するために、ヒトＥＧＦＲを発現するＢ１６黒色腫細胞株を使用し、抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブを使用してＡＤＣＣを誘発した。図１７Ｂに示すように、ＯＮＣ－８９２はセツキシマブのＡＤＣＣ活性をほぼ倍増させ、ＥＣ５０は０．３μｇ／ｍｌであった。我々の併用療法試験デザインを裏付けるために、ＯＮＣ－３９２によるＡＤＣＣの促進におけるＯＮＣ－８４１の有効性を試験した。図１７Ｃに示すように、ＯＮＣ－８４１はＯＮＣ－３９２のＡＤＣＣ活性を増強し、ＩＣ５０は０．０８μｇ／ｍｌであった。ＯＮＣ－３９２との組み合わせについてＥＣ５０が最も低いという事実は、初期の治験における組み合わせパートナーとしてＯＮＣ－３９２を我々が選択したことを裏付けており、広範な活性は、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍の両方におけるがんを標的とする抗体との併用療法のためにＯＮＣ－８４１を使用する可能性を示唆している。
ＣＤ２０、ＣＴＬＡ－４及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするものを含むがんを標的とする抗体が有する、ＡＤＣＣ活性を促進する能力について、ＯＮＣ－８４１を試験した。ＰｒｏｍｅｇａのＡＤＣＣレポーターアッセイを利用して、がんを標的とする抗体の存在下でのＦｃγＲＩＩＩＡの活性化の際の、エフェクター細胞内のＮＦＡＴによって発現される発光を検出することによって、ＡＤＣＣ活性を測定した。簡潔に言えば、ＡＤＣＣエフェクター細胞、空（mock）導入ＡＤＣＣエフェクター細胞（ＡＤＣＣ－Ｍｏｃｋ）又はヒトＳｉｇｌｅｃ－１０発現ＡＤＣＣ細胞（ＡＤＣＣ－ｈＳｉｇｌｅｃ１０）のいずれかと標的細胞を共インキュベートした。滴定したＯＮＣ－８４１ ｍＡｂとともに、腫瘍を標的とする抗体を固定濃度で添加した。相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。図１７Ａに示すように、ＯＮＣ－８４１は、抗ＣＤ２０によるＲａｊｉリンパ腫細胞株に対するＡＤＣＣ活性を促進し、ＥＣ５０は０．５μｇ／ｍｌであった。固形腫瘍に対するＯＮＣ－８４１の影響を試験するために、ヒトＥＧＦＲを発現するＢ１６黒色腫細胞株を使用し、抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブを使用してＡＤＣＣを誘発した。図１７Ｂに示すように、ＯＮＣ－８９２はセツキシマブのＡＤＣＣ活性をほぼ倍増させ、ＥＣ５０は０．３μｇ／ｍｌであった。我々の併用療法試験デザインを裏付けるために、ＯＮＣ－３９２によるＡＤＣＣの促進におけるＯＮＣ－８４１の有効性を試験した。図１７Ｃに示すように、ＯＮＣ－８４１はＯＮＣ－３９２のＡＤＣＣ活性を増強し、ＩＣ５０は０．０８μｇ／ｍｌであった。ＯＮＣ－３９２との組み合わせについてＥＣ５０が最も低いという事実は、初期の治験における組み合わせパートナーとしてＯＮＣ－３９２を我々が選択したことを裏付けており、広範な活性は、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍の両方におけるがんを標的とする抗体との併用療法のためにＯＮＣ－８４１を使用する可能性を示唆している。
【0153】
ＯＮＣ－８４１は、ヒトＮＫ細胞による白血病細胞のＡＤＣＣ及び抗体非依存性殺傷を促進する
ＮＫ細胞による腫瘍細胞殺傷に対するＯＮＣ－８４１の影響を試験するために、標的細胞としてＣＴＬＡ－４をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を使用し、エフェクター細胞として新たに単離したヒトＮＫ細胞を使用した。簡潔に言えば、カルセインＡＭ標識Ｊｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ－４標的細胞を、滴定したＯＮＣ－８４１ ｍＡｂと共に、そして固定濃度のＯＮＣ－３９２と共に又はＯＮＣ－３９無しに、新鮮な全血由来のネガティブ選択したヒトＮＫ細胞と６時間共インキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。対照と比較しての、残存するカルセインＡＭ＋生細胞の数に基づいて、細胞死のパーセント値を計算した。図１８Ａ～Ｃに示すように、ＯＮＣ－８４１は、腫瘍細胞を標的とする抗体の非存在下でＪｕｒｋａｔ細胞のＮＫ媒介細胞殺傷を増強し、推定ＥＣ５０は０．３７４４μｇ／ｍｌであった。飽和量のＯＮＣ－３９２（２０μｇ／ｍｌ）の存在下では、ＯＮＣ－８４１はＮＫ細胞活性をさらに増強し、推定ＥＣ５０は２．２７４μｇ／ｍｌであった。したがって、ＯＮＣ－８４１は、ＮＫ細胞による悪性白血病細胞のＡＤＣＣ及び抗体非依存性細胞溶解の両方を促進した。
ＮＫ細胞による腫瘍細胞殺傷に対するＯＮＣ－８４１の影響を試験するために、標的細胞としてＣＴＬＡ－４をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を使用し、エフェクター細胞として新たに単離したヒトＮＫ細胞を使用した。簡潔に言えば、カルセインＡＭ標識Ｊｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ－４標的細胞を、滴定したＯＮＣ－８４１ ｍＡｂと共に、そして固定濃度のＯＮＣ－３９２と共に又はＯＮＣ－３９無しに、新鮮な全血由来のネガティブ選択したヒトＮＫ細胞と６時間共インキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。対照と比較しての、残存するカルセインＡＭ＋生細胞の数に基づいて、細胞死のパーセント値を計算した。図１８Ａ～Ｃに示すように、ＯＮＣ－８４１は、腫瘍細胞を標的とする抗体の非存在下でＪｕｒｋａｔ細胞のＮＫ媒介細胞殺傷を増強し、推定ＥＣ５０は０．３７４４μｇ／ｍｌであった。飽和量のＯＮＣ－３９２（２０μｇ／ｍｌ）の存在下では、ＯＮＣ－８４１はＮＫ細胞活性をさらに増強し、推定ＥＣ５０は２．２７４μｇ／ｍｌであった。したがって、ＯＮＣ－８４１は、ＮＫ細胞による悪性白血病細胞のＡＤＣＣ及び抗体非依存性細胞溶解の両方を促進した。
【0154】
ＯＮＣ－８４１はヒトＰＢＭＣによるヒト腫瘍細胞殺傷を促進する
Ｓｉｇｌｅｃ－１０は、骨髄細胞上に主に発現される。したがって、ＯＮＣ－３９２の影響は、ＮＫ細胞を超えて広がる可能性が高い。抗腫瘍効果のさらに包括的な理解を得るために、３個体のドナーの新鮮な全血から単離したＰＢＭＣにより、白血病細胞溶解に対するＯＮＣ－８４１の効果を試験した。カルセインＡＭ標識Ｊｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ－４標的細胞を、滴定したＯＮＣ－８４１ ｍＡｂと共に、新鮮な全血から単離したＰＢＭＣと共インキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。対照と比較しての、残存するカルセインＡＭ＋生細胞の数に基づいて、細胞死のパーセント値を計算した。図１９に示すように、低用量のＯＮＣ－８４１によって顕著な溶解が達成され、ドナー１、ドナー２及びドナー３の推定ＥＣ５０は、それぞれ０．３６４５、０．０１７６１及び０．００９５７２μｇ／ｍｌであった。これらのデータは、ＯＮＣ－８４１が白血病を標的とする抗体の非存在下で白血病殺傷を促進することができることを実証している。
Ｓｉｇｌｅｃ－１０は、骨髄細胞上に主に発現される。したがって、ＯＮＣ－３９２の影響は、ＮＫ細胞を超えて広がる可能性が高い。抗腫瘍効果のさらに包括的な理解を得るために、３個体のドナーの新鮮な全血から単離したＰＢＭＣにより、白血病細胞溶解に対するＯＮＣ－８４１の効果を試験した。カルセインＡＭ標識Ｊｕｒｋａｔ－ＣＴＬＡ－４標的細胞を、滴定したＯＮＣ－８４１ ｍＡｂと共に、新鮮な全血から単離したＰＢＭＣと共インキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。対照と比較しての、残存するカルセインＡＭ＋生細胞の数に基づいて、細胞死のパーセント値を計算した。図１９に示すように、低用量のＯＮＣ－８４１によって顕著な溶解が達成され、ドナー１、ドナー２及びドナー３の推定ＥＣ５０は、それぞれ０．３６４５、０．０１７６１及び０．００９５７２μｇ／ｍｌであった。これらのデータは、ＯＮＣ－８４１が白血病を標的とする抗体の非存在下で白血病殺傷を促進することができることを実証している。
【0155】
インビボ薬理試験
動物モデルにおけるＯＮＣ－８４１の治療活性を試験するために、マウスＳｉｇｌｅｃ－Ｇを除去してヒトＳｉｇｌｅｃ－１０オルソログを挿入したトランスジェニックマウスモデルを我々は作製したが、これはそれぞれ、Ｓｉｇｌｅｃｇ遺伝子の標的変異及びヒトＳｉｇｌｅｃ－１０を含有するＢａｃｍｉｄクローンの挿入とにより行った（下記を参照）。トランスジェニックマウスにおけるＳｉｇｌｅｃ－１０の組織分布はヒト白血球におけるその分布と一致するため、腫瘍拒絶に対するＯＮＣ－８４１の影響を試験するためにこのモデルを、２つの別個のモデルにおいて使用した。
動物モデルにおけるＯＮＣ－８４１の治療活性を試験するために、マウスＳｉｇｌｅｃ－Ｇを除去してヒトＳｉｇｌｅｃ－１０オルソログを挿入したトランスジェニックマウスモデルを我々は作製したが、これはそれぞれ、Ｓｉｇｌｅｃｇ遺伝子の標的変異及びヒトＳｉｇｌｅｃ－１０を含有するＢａｃｍｉｄクローンの挿入とにより行った（下記を参照）。トランスジェニックマウスにおけるＳｉｇｌｅｃ－１０の組織分布はヒト白血球におけるその分布と一致するため、腫瘍拒絶に対するＯＮＣ－８４１の影響を試験するためにこのモデルを、２つの別個のモデルにおいて使用した。
【0156】
単剤療法及びがんを標的とする抗体との併用療法
固形腫瘍に対する治療効果を評価するために、我々は、ヒトＥＧＦＲを発現するＢ１６Ｆ１０細胞株を使用した。腫瘍細胞負荷の６日後、対照ＩｇＧ、ＯＮＣ－８４１又はＯＮＣ－８４１＋セツキシマブを用いて腫瘍担持マウスを処置し、腫瘍増殖を盲検で測定した。腫瘍接種後６日目から開始して、３日ごとに４回の注射分、Ｂ１６－ＥＧＦＲ腫瘍担持（皮下（ｓ．ｃ．））Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－マウス（ｎ＝４～５）を２００μｇの対照ｈＩｇＧＦｃ又はＯＮＣ－８４１でｉ．ｐ．処置し、１０μｇの対照ｈＩｇＧＦｃ又はセツキシマブでｉ．ｔ．処置した。図２０に示すように、セツキシマブの腫瘍内注射は最小限の効果しか有しなかったが、ＯＮＣ－８４１での単剤療法では腫瘍増殖の部分的遅延が達成された。組み合わせでは、より顕著な腫瘍増殖遅延が達成された。これらのデータは、マウスモデルにおいて、ＯＮＣ－８４１が固形腫瘍に対する治療活性を有することを示唆している。
固形腫瘍に対する治療効果を評価するために、我々は、ヒトＥＧＦＲを発現するＢ１６Ｆ１０細胞株を使用した。腫瘍細胞負荷の６日後、対照ＩｇＧ、ＯＮＣ－８４１又はＯＮＣ－８４１＋セツキシマブを用いて腫瘍担持マウスを処置し、腫瘍増殖を盲検で測定した。腫瘍接種後６日目から開始して、３日ごとに４回の注射分、Ｂ１６－ＥＧＦＲ腫瘍担持（皮下（ｓ．ｃ．））Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－マウス（ｎ＝４～５）を２００μｇの対照ｈＩｇＧＦｃ又はＯＮＣ－８４１でｉ．ｐ．処置し、１０μｇの対照ｈＩｇＧＦｃ又はセツキシマブでｉ．ｔ．処置した。図２０に示すように、セツキシマブの腫瘍内注射は最小限の効果しか有しなかったが、ＯＮＣ－８４１での単剤療法では腫瘍増殖の部分的遅延が達成された。組み合わせでは、より顕著な腫瘍増殖遅延が達成された。これらのデータは、マウスモデルにおいて、ＯＮＣ－８４１が固形腫瘍に対する治療活性を有することを示唆している。
【0157】
腫瘍体積の５０％減少に必要なＯＮＣ－８４１の量を試験するために、我々は併用療法モデルにおいてＯＮＣ－８４１の用量を検証（titrate）した。セツキシマブの腫瘍内処置の用量を１０μｇ／注射で固定し、全身ＯＮＣ－８４１の用量を５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇとした。簡潔に言うと、５×１０５個のＢ１６－ＥＧＦＲ腫瘍細胞をＳｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－マウス（ｎ＝４～５）に注射（ｓ．ｃ．）し、腫瘍が直径４～７ｍｍに達した際に処置を開始した。３日ごとに４回の注射分、腫瘍担持マウスを２．５、１０又は２０ｍｇ／ｋｇのＯＮＣ－８４１でｉ．ｐ．処置し、１０μｇのｈＩｇＦｃ又はセツキシマブでｉ．ｔ．注射した。図２１に示すように、ＯＮＣ－８４１用量に依存的な腫瘍体積の減少が達成された。線形回帰分析を用いて、ＯＮＣ－８４１のＥＣ５０は１６．４９ｍｇ／ｋｇであると求められた。
【0158】
抗ＣＴＬＡ－４抗体との併用療法
ＯＮＣ－８４１と宿主を標的とする免疫療法抗体との組み合わせ効果を示すモデルとして、我々は、未改変Ｂ１６Ｆ１０モデル及び抗マウスＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ、９Ｄ９を使用した。図２２に示すように、９Ｄ９もＯＮＣ－８４１も腫瘍増殖遅延を引き起こさなかった。ただし、組み合わせでは、腫瘍増殖の顕著な減少が観察された。
ＯＮＣ－８４１と宿主を標的とする免疫療法抗体との組み合わせ効果を示すモデルとして、我々は、未改変Ｂ１６Ｆ１０モデル及び抗マウスＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ、９Ｄ９を使用した。図２２に示すように、９Ｄ９もＯＮＣ－８４１も腫瘍増殖遅延を引き起こさなかった。ただし、組み合わせでは、腫瘍増殖の顕著な減少が観察された。
【0159】
薬理学的に関連する生物種
ＯＮＣ－８４１はマウスＳｉｇｌｅｃ Ｇ／１０及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ Ｇ／１０と反応しない
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、異なる種のオルソログ間で相同性は限られ、急速に進化していることが知られている。ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０は、その非ヒト霊長類（ＮＨＰ）オルソログのいくつかに対して高い類似性を有し、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ－１０及びアカゲザルＳｉｇｌｅｃ－１０に対して９０％の類似性を有するが、マウスＳｉｇｌｅｃ－Ｇに対する類似性はわずか６０％である（Ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇより）。
ＯＮＣ－８４１はマウスＳｉｇｌｅｃ Ｇ／１０及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ Ｇ／１０と反応しない
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、異なる種のオルソログ間で相同性は限られ、急速に進化していることが知られている。ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０は、その非ヒト霊長類（ＮＨＰ）オルソログのいくつかに対して高い類似性を有し、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ－１０及びアカゲザルＳｉｇｌｅｃ－１０に対して９０％の類似性を有するが、マウスＳｉｇｌｅｃ－Ｇに対する類似性はわずか６０％である（Ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇより）。
【0160】
どの動物種がＯＮＣ－８４１についての適切な毒物学的種であるかを決定するために、我々は、３つのアッセイでＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０又はマウスオルソログＳｉｇｌｅｃ－ＧへのＯＮＣ－８４１抗体の結合を評価した：
【0161】
Ａ．組換えＳｉｇｌｅｃ－１０／Ｓｉｇｌｅｃ－Ｇへの結合
【0162】
Ｂ．ＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０／Ｓｉｇｌｅｃ－Ｇを一過性に発現するｅｘｐｉ２９３細胞への結合
【0163】
Ｃ．カニクイザルＰＢＭＣへの結合
【0164】
いずれのアッセイも、ＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０又はマウスＳｉｇｌｅｃ－ＧへのＯＮＣ－８４１の特異的結合を示さず、このことはＯＮＣ－８４１が結合する特異的エピトープがこれらの種と共有されていないことを示唆している。
【0165】
他の生物種由来の組換えＳｉｇｌｅｃ－１０／Ｓｉｇｌｅｃ－Ｇへの結合
組換えＨｉｓタグ付きヒトＳｉｇｌｅｃ－１０及びカニクイザルＳｉｇｌｅｃ－１０並びにマウスＳｉｇｌｅｃ－Ｇは、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。Ｓｉｇｌｅｃタンパク質を捕捉抗原としてＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ヤギ抗ヒト抗体を使用して、捕捉されたＯＮＣ－８４１を検出した。以下の図２３に示すように、ＯＮＣ－８４１は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０に対して特異的結合を示したが、カニクイザルタンパク質又はマウスタンパク質のいずれに対しても特異的結合を示さなかった。
組換えＨｉｓタグ付きヒトＳｉｇｌｅｃ－１０及びカニクイザルＳｉｇｌｅｃ－１０並びにマウスＳｉｇｌｅｃ－Ｇは、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。Ｓｉｇｌｅｃタンパク質を捕捉抗原としてＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ヤギ抗ヒト抗体を使用して、捕捉されたＯＮＣ－８４１を検出した。以下の図２３に示すように、ＯＮＣ－８４１は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０に対して特異的結合を示したが、カニクイザルタンパク質又はマウスタンパク質のいずれに対しても特異的結合を示さなかった。
【0166】
ＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０遺伝子をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への結合
ｅｘｐｉ２９３細胞に、それぞれヒト、カニクイザル、アカゲザル及びマーモセットのＳｉｇｌｅｃ－１０発現プラスミドをトランスフェクトして、細胞の表面にこれらのタンパク質を産生させた。生きたｅｘｐｉ２９３細胞に対してフローサイトメトリーを使用してＯＮＣ－８４１の結合を評価し、Ｓｉｇｌｅｃ－１０に対するポリクローナル抗体を使用して様々なＳｉｇｌｅｃ－１０タンパク質の発現を検証した（図２４、薄い灰色の線）。ＯＮＣ－８４１は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０を発現する細胞のみに結合を示し、ＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０のいずれにも結合を示さなかった（図２４、濃い灰色の線）。
ｅｘｐｉ２９３細胞に、それぞれヒト、カニクイザル、アカゲザル及びマーモセットのＳｉｇｌｅｃ－１０発現プラスミドをトランスフェクトして、細胞の表面にこれらのタンパク質を産生させた。生きたｅｘｐｉ２９３細胞に対してフローサイトメトリーを使用してＯＮＣ－８４１の結合を評価し、Ｓｉｇｌｅｃ－１０に対するポリクローナル抗体を使用して様々なＳｉｇｌｅｃ－１０タンパク質の発現を検証した（図２４、薄い灰色の線）。ＯＮＣ－８４１は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０を発現する細胞のみに結合を示し、ＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０のいずれにも結合を示さなかった（図２４、濃い灰色の線）。
【0167】
カニクイザルＰＢＭＣへの結合
天然に発現したＳｉｇｌｅｃ－１０へのＯＮＣ－８４１の結合を試験するために、ヒトＰＢＭＣ及びカニクイザルＰＢＭＣを染色し、フローサイトメトリーによって評価した。Ｓｉｇｌｅｃ－１０は単球（ＣＤ１４＋細胞）及びＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）の両方によって発現されるため、これらの集団に対してＯＮＣ－８４１結合を試験した。特異的染色を検証し、生じるおそれのあるＦｃ受容体を介したＯＮＣ－８４１の結合を排除するために、各生物種の追加の細胞試料を染色前に過剰のヒトＩｇＧでブロッキングした。ＯＮＣ－８４１は、ヒトの単球及びＢ細胞の両方に対する高度に特異的な結合を明確に示し、結合は過剰量のヒトＩｇＧの存在によって影響を受けなかった（図２５）。対照的に、ＯＮＣ－８４１は、カニクイザルの両細胞亜集団に対して弱い結合を示した。さらに、過剰量のヒトＩｇＧはこの結合を顕著に減少させ、このことは、これらのＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０に対してＯＮＣ－８４１が低特異的～非特異的な結合特性を有することを示している（図２７）。
天然に発現したＳｉｇｌｅｃ－１０へのＯＮＣ－８４１の結合を試験するために、ヒトＰＢＭＣ及びカニクイザルＰＢＭＣを染色し、フローサイトメトリーによって評価した。Ｓｉｇｌｅｃ－１０は単球（ＣＤ１４＋細胞）及びＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）の両方によって発現されるため、これらの集団に対してＯＮＣ－８４１結合を試験した。特異的染色を検証し、生じるおそれのあるＦｃ受容体を介したＯＮＣ－８４１の結合を排除するために、各生物種の追加の細胞試料を染色前に過剰のヒトＩｇＧでブロッキングした。ＯＮＣ－８４１は、ヒトの単球及びＢ細胞の両方に対する高度に特異的な結合を明確に示し、結合は過剰量のヒトＩｇＧの存在によって影響を受けなかった（図２５）。対照的に、ＯＮＣ－８４１は、カニクイザルの両細胞亜集団に対して弱い結合を示した。さらに、過剰量のヒトＩｇＧはこの結合を顕著に減少させ、このことは、これらのＮＨＰ Ｓｉｇｌｅｃ－１０に対してＯＮＣ－８４１が低特異的～非特異的な結合特性を有することを示している（図２７）。
【0168】
内因性Ｓｉｇｌｅｃｇ遺伝子を有しないヒトＳＩＧＬＥＣ１０トランスジェニックマウス：Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－の作製
ＯＮＣ－８４１は、ＮＨＰの利用可能な種及びマウス由来の白血球には結合しないため、ＮＨＰもマウスも、毒性試験及び薬理学的試験にとって適切な生物種とは考えられない。他の一般的に使用される毒性用生物種は、試験したＮＨＰよりもヒトから遺伝的に遠く離れているため、毒性試験にとって適切である可能性はより低い。したがって、我々は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１０遺伝子によってそのマウスオルソログであるＳｉｇｌｅｃｇが置き換えられている、毒性試験のためのトランスジェニックマウスモデルの開発に着手した。
ＯＮＣ－８４１は、ＮＨＰの利用可能な種及びマウス由来の白血球には結合しないため、ＮＨＰもマウスも、毒性試験及び薬理学的試験にとって適切な生物種とは考えられない。他の一般的に使用される毒性用生物種は、試験したＮＨＰよりもヒトから遺伝的に遠く離れているため、毒性試験にとって適切である可能性はより低い。したがって、我々は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１０遺伝子によってそのマウスオルソログであるＳｉｇｌｅｃｇが置き換えられている、毒性試験のためのトランスジェニックマウスモデルの開発に着手した。
【0169】
Ｓｉｇｌｅｃ１０トランスジェニック系統（本開示ではＳｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋と呼ばれる）は、ヒトのＳｉｇｌｅｃ１０遺伝子、Ｓｉｇｌｅｃ８遺伝子及びＳｉｇｌｅｃ１２遺伝子を含有するゲノム配列を有するＢａｃｍｉｄクローンを使用して、Ｃｙａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によってＣ５７／ＢＬ６マウスから作製された。ヒトの調節配列及びコード配列を有するゲノムクローンの使用は、マウスがヒト白血球内における発言態様と実質的に同様の態様でＳｉｇｌｅｃ１０を発現することを可能にし得る。本開示に提示した我々のデータは、この仮説を裏付けている。さらに、インビボでＳｉｇｌｅｃ－１０を遮断することの効果を捕捉するために、我々は、Ｓｉｇｌｅｃｇのエクソン２～１１がＧＦＰ／Ｎｅｏカセットによって置き換えられたＳｉｇｌｅｃｇ－／－マウスに導入遺伝子を交配することによって、内因性マウスＳｉｇｌｅｃｇ遺伝子を除去した。
【0170】
Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋をＳｉｇｌｅｃｇ－／－マウスと交配させることによって、Ｃ５７ＢＬ／６ Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－系統を作製した。血球（図２６上部及び中央）のフローサイトメトリーによってｈＳｉｇｌｅｃ－１０及びＳｉｇｌｅｃ－Ｇの両方の発現について交雑マウスのＦ１世代及びＦ２世代をスクリーニングして、所望の遺伝子型であるＳｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－を選択した。この染色により、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１０の発現と、マウスＳｉｇｌｅｃ－Ｇの欠如とが確認された。データは、マウスＰＢＭＣにおいて、マウスのＢ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞（ＤＣ）及び好中球のうち＞３０％並びにＴ細胞のうち＜１０％におけるＳｉｇｌｅｃ－１０の発現を示した。
【0171】
Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－に観察された血液中の細胞の亜集団へのＯＮＣ－８４１の結合を、内因性Ｓｉｇｌｅｃ－１０を発現するヒト細胞へのＯＮＣ－８４１の結合と比較するために、系列マーカーと、蛍光標識されたＯＮＣ－８４１又は市販の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体のいずれかとについてヒトＰＢＭＣを染色した。図２６の下部パネルは、単球及びＢ細胞に対するＯＮＣ－８４１によるＳｉｇｌｅｃ－１０の明確な染色を示したのに対して、Ｔ細胞は、文献に報告されているように明らかな染色を有しなかった。驚くべきことに、データは、ＯＮＣ－８４１がＰＢＭＣから単離されたＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を増強することを示したが、血液中のＮＫ細胞、ＣＤ１６陽性又は１６陰性のＮＫ細胞の明確な染色はなかった（図２６）。１つの可能な説明は、ヒトＮＫ細胞がより少ない量のＳｉｇｌｅｃ－１０を発現し、本アッセイはそのための感度がないということである。別の選択肢は、ヒトＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を凍結状態で購入し、Ｓｉｇｌｅｃ－１０染色のために解凍したことである。Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－間に観察された矛盾をさらに調査する。
【0172】
Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－マウスから得られた凍結切片に対して免疫組織化学的解析を行って、マウス組織内におけるＯＮＣ－８４１結合を検出した。簡潔に言えば、瞬間凍結マウス組織を切片化し、スライドに載せた。切片をブロッキングし、次いで、１μｇ／ｍＬのＯＮＣ－８４１を用いてプローブ付けした後、ＨＲＰで標識した抗ヒト二次抗体を使用して検出した。ＨＲＰの色素原基質としてＤＡＢを使用してＯＮＣ－８４１の結合を可視化し、これは茶色を与え、そして、細胞核を青色で可視化するためにスライドをヘマトキシリンによって対比染色した。スライドを調べることによって、造血器官及びその他ほとんどの組織内における免疫細胞の染色が示された。これは繰り返されることになる予備実験であり、切片は訓練された病理学者によって解析される。染色の例は、図２７に見ることができる。
【0173】
Ｓｉｇｌｅｃ－１０の広範な発現は、Ｓｉｇｌｅｃ１０ＴＧ＋／＋；Ｓｉｇｌｅｃｇ－／－マウス由来のほとんどの組織／器官内の組織常在白血球上に見られ、このマウスモデルが毒性試験及び薬理試験に有用であることを示唆している。
【0174】
インビトロサイトカイン放出アッセイ
特定のモノクローナル抗体治療薬は、患者に有害事象をもたらすおそれがあるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を含む様々な急性輸液反応を誘導することが示されている。分子レベルでは、ＣＲＳは、投与１～２時間後にＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γのレベルが上昇し、続いて、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、並びにときどきはＩＬ－２及びＩＬ－８が上昇することを特徴とする。ＣＲＳの誘導の可能性についてＯＮＣ－８４１を単独で又はＯＮＣ－３９２と組み合わせて試験するために、予備的なサイトカイン放出アッセイ（ＣＲＡ）を行った。ＯＮＣ－３９２を伴う又は伴わない、２ｍｇ／ｍＬまでの様々な濃度のＯＮＣ－８４１を９６ウェルプレートに一晩かけてコーティングした。市販のヒトＩｇＧ抗体（ｈＩｇＧ）を陰性対照として使用し、ＣＤ３＿ＣＤ２８ビーズを陽性対照として使用した。翌日、プレートを洗浄し、４人の異なる健常ドナー由来のＰＢＭＣをウェルに添加した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ １（カタログ番号７４０８０９）を使用して、ＰＢＭＣ添加の４８時間後に上清へのサイトカイン放出を試験し、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＩＬ－６、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３及びＩＬ－３３を含めた。４人の異なるドナー由来のＰＢＭＣを用いてアッセイを行い、結果は、ドナーのうちの１人から得られた代表的なデータである（図２９）。ＯＮＣ－３９２有り又は無しで、ＯＮＣ－８４１は、コーティングされていないウェルについて検出されたレベルを超えてサイトカインを誘導しなかった。サイトカインが誘導された唯一のウェルは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの陽性対照であった。商業的に供給されたＩｇＧ４を含有するウェルでは、いくつかのサイトカインも誘導された。全体として、データは、ＯＮＣ－８４１がｗＰＢＭＣからのサイトカイン放出を誘導せず、患者にＣＲＳを誘導するものではないことを示唆している。
特定のモノクローナル抗体治療薬は、患者に有害事象をもたらすおそれがあるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を含む様々な急性輸液反応を誘導することが示されている。分子レベルでは、ＣＲＳは、投与１～２時間後にＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γのレベルが上昇し、続いて、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、並びにときどきはＩＬ－２及びＩＬ－８が上昇することを特徴とする。ＣＲＳの誘導の可能性についてＯＮＣ－８４１を単独で又はＯＮＣ－３９２と組み合わせて試験するために、予備的なサイトカイン放出アッセイ（ＣＲＡ）を行った。ＯＮＣ－３９２を伴う又は伴わない、２ｍｇ／ｍＬまでの様々な濃度のＯＮＣ－８４１を９６ウェルプレートに一晩かけてコーティングした。市販のヒトＩｇＧ抗体（ｈＩｇＧ）を陰性対照として使用し、ＣＤ３＿ＣＤ２８ビーズを陽性対照として使用した。翌日、プレートを洗浄し、４人の異なる健常ドナー由来のＰＢＭＣをウェルに添加した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ １（カタログ番号７４０８０９）を使用して、ＰＢＭＣ添加の４８時間後に上清へのサイトカイン放出を試験し、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＩＬ－６、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３及びＩＬ－３３を含めた。４人の異なるドナー由来のＰＢＭＣを用いてアッセイを行い、結果は、ドナーのうちの１人から得られた代表的なデータである（図２９）。ＯＮＣ－３９２有り又は無しで、ＯＮＣ－８４１は、コーティングされていないウェルについて検出されたレベルを超えてサイトカインを誘導しなかった。サイトカインが誘導された唯一のウェルは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの陽性対照であった。商業的に供給されたＩｇＧ４を含有するウェルでは、いくつかのサイトカインも誘導された。全体として、データは、ＯＮＣ－８４１がｗＰＢＭＣからのサイトカイン放出を誘導せず、患者にＣＲＳを誘導するものではないことを示唆している。
【0175】
ＯＮＣ－３９２有り又は無しで、同様の濃度のＯＮＣ－８４１が正常な静止期ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出を誘導することができるかどうかを評価するために、後に追加のインビトロアッセイを行う。ＴＧＮ１４１２に関してＣＲＳの高リスクを予測したであろうプロトコルに従って、サイトカイン放出アッセイを行った。少なくとも１０人のドナーを試験することになる。ＯＮＣ－３９２を単独で用いて行った実験では、ＯＮＣ－３９２がＴ細胞を直接活性化しないことが示された。
【0176】
実施例８
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体のための治験
適応
第１相については、ＮＣＣＮガイドラインなどの標準治療ガイドラインに従った確立された標準的な医療抗がん治療が奏効しなかった又はそれを耐容できなかった後の、進行性の局所的に進行した又は転移性の疾患を有する、組織学的又は細胞学的に固形腫瘍との診断が確認された患者を登録する。
抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体のための治験
適応
第１相については、ＮＣＣＮガイドラインなどの標準治療ガイドラインに従った確立された標準的な医療抗がん治療が奏効しなかった又はそれを耐容できなかった後の、進行性の局所的に進行した又は転移性の疾患を有する、組織学的又は細胞学的に固形腫瘍との診断が確認された患者を登録する。
【0177】
第２相については、Ｓｉｍｏｎの２段階デザインを使用して臨床的有効性を試験するための非盲検試験のために、免疫療法が奏効しなかった非小細胞肺がん患者を選択する。
【0178】
理論的根拠の要約
医療施設における抗ＰＤ（Ｌ）１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の成功によって例示されるように、腫瘍微小環境内でＴ細胞の抑制を解除する抗体は、がん患者のケアに変革的影響を及ぼしてきた。この成功は、適応Ｔ細胞免疫の免疫チェックポイントを標的とすることの効力を強調している。最近の研究では、ＮＫ細胞及びマクロファージの機能を抑制する先天性免疫チェックポイントを標的とすることは、がん免疫療法を改善するための新しい手法を提供する可能性があることが示唆されている。これらの推定的な先天性チェックポイントの中には、マクロファージ及びＮＫ細胞による腫瘍細胞のファゴサイトーシス又は殺傷を負に調節する経路がある。マクロファージファゴサイトーシスを抑制する分子は、まとめて「ｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅ」シグナル（ＤＮＥＭＳ）と呼ばれる。既知のＤＮＥＭＳの中でも、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα経路はがん免疫療法のための主要な先天性免疫チェックポイントであり、抗ＣＤ４７ ｍＡｂは臨床試験において活発に試験されている。
医療施設における抗ＰＤ（Ｌ）１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の成功によって例示されるように、腫瘍微小環境内でＴ細胞の抑制を解除する抗体は、がん患者のケアに変革的影響を及ぼしてきた。この成功は、適応Ｔ細胞免疫の免疫チェックポイントを標的とすることの効力を強調している。最近の研究では、ＮＫ細胞及びマクロファージの機能を抑制する先天性免疫チェックポイントを標的とすることは、がん免疫療法を改善するための新しい手法を提供する可能性があることが示唆されている。これらの推定的な先天性チェックポイントの中には、マクロファージ及びＮＫ細胞による腫瘍細胞のファゴサイトーシス又は殺傷を負に調節する経路がある。マクロファージファゴサイトーシスを抑制する分子は、まとめて「ｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅ」シグナル（ＤＮＥＭＳ）と呼ばれる。既知のＤＮＥＭＳの中でも、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα経路はがん免疫療法のための主要な先天性免疫チェックポイントであり、抗ＣＤ４７ ｍＡｂは臨床試験において活発に試験されている。
【0179】
前臨床試験は、ＣＤ２４－Ｓｉｇｌｅｃ－１０相互作用を、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα経路に匹敵する強力なＤＮＥＭＳとして明らかにした。ＣＤ２４－Ｓｉｇｌｅｃ－１０経路は、組織傷害に対する炎症反応を最小限に抑えるための先天性免疫チェックポイントとしてＯｎｃｏＣ４共同創設者によって最初に明らかにされた［４］。Ｓｉｇｌｅｃ－１０アゴニストであるＣＤ２４Ｆｃは、ウイルス性肺炎及びウイルス性大腸炎に対する防御を発揮することが示されている。最近の第３相治験では、ＣＤ２４Ｆｃが、入院したＣＯＶＩＤ－１９患者に対して顕著な保護を与えることが実証された。対照的に、この経路を標的とすると腫瘍細胞ファゴサイトーシスが促進されるという強力な前臨床データにもかかわらず、ＣＤ２４－Ｓｉｇｌｅｃ－１０経路のアンタゴニストは臨床的に試験されていない。ここに提案された治験は、標準治療の治療法が奏効しなかったか又はそれを耐容できないがん患者において、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０ ｍＡｂであるＯＮＣ－８４１の安全性及び有効性を試験することによって、この大きなギャップを埋め得る。
【0180】
マクロファージによる腫瘍細胞のファゴサイトーシスの促進に果たすＯＮＣ－８４１の役割に加えて、我々の前臨床試験は、ＯＮＣ－８４１が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）も促進したことを明らかにした。この新たな知見は、我々を、がん細胞を標的とする抗体及び免疫細胞を標的とする抗体を含む、薬物の一次機能が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又はＡＤＣＰを介するものである薬物と組み合わせてＯＮＣ－８４１を試験するよう促す。ＣＤ１５２（分化クラスター１５２）としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）は、Ｂ７－１（ＣＤ８０）及びＢ７－２（ＣＤ８６）と相互作用して制御性Ｔ細胞の適切な機能を確実にし、そして自己炎症性疾患から宿主を保護する細胞表面タンパク質受容体である。承認された抗体であるイピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂによってＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として販売されている）などの抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々な前臨床モデルにおいて強力で広範ながん免疫療法効果（ＣＩＴＥ）を示しており、単剤療法として、及びニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂによってＯＰＤＩＶＯ（登録商標）として市販されている抗ＰＤ－１）との併用療法の一部として臨床使用されている。しかし、ＣＴＬＡ－４単剤療法は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法よりも多くの免疫療法関連有害作用（ｉｒＡＥ）を有する。さらに、重度のｉｒＡＥ（グレード３及び４）の割合は、イピリムマブとニボルマブとの組合せを投与されている黒色腫患者では５５％に達した。重度のｉｒＡＥは、がん患者によって耐容される用量をさらに制限する。とはいえ、抗ＰＤ－１ニボルマブと組み合わせたイピリムマブは、複数の種類のがんでは顕著に改善された奏効率及び全生存期間をもたらした。さらに、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、がん患者における持続性免疫を誘導する。したがって、ＣＴＬＡ－４は依然として重要な免疫療法標的であるが、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの安全性及び有効性の両方を改善することにおいて大きな課題が残っている。
【0181】
ＯＮＣ－３９２は、ＣＴＬＡ－４に対する高度に選択的なヒト化モノクローナルＩｇＧ１カッパアイソタイプ抗体である。我々は、ＯＮＣ－３９２が低ｐＨ下でＣＴＬＡ－４から解離して、ＯＮＣ－３９２がリソソーム分解から逃げ、また細胞表面に再循環することを可能とすることを実証した。我々は、ＯＮＣ－３９２のようなｐＨ感受性抗体が、ｐＨ非感受性であるイピリムマブと比べてより安全であるだけでなく、Ｔｒｅｇ枯渇及び腫瘍拒絶の点でもより効果的であるという考えに関して、いくつかの方面からの証拠を提供した。
【0182】
抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの治療効果はＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰによる腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇に起因するが、それらの毒性はＣＴＬＡ－４のダウンレギュレーションに起因するため、ＯＮＣ－３９２をＯＮＣ－８４１と組み合わせて、これがＴｒｅｇを枯渇させる増強されたＡＤＣＣを通して、より強力な抗腫瘍活性をもたらし得るかどうかを確認し、同時に、ｉｒＡＥを回避するためにＯＮＣ－３９２をさらに安全な用量レベルで維持することが関心を呼ぶ。
【0183】
Ｓｉｇｌｅｃ－１０は、免疫療法のための有望な標的として浮上している。インビトロ試験及びインビボ試験からの前臨床試験は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０が、ＯＮＣ－３９２によって誘発されるＡＤＣＣを含め、ＡＤＣＣの負の調節因子であることを実証した。我々は、ＯＮＣ－３９２のＡＤＣＣを増強するその能力に基づいて、ＯＮＣ－８４１を開発した。我々は、動物モデルにおいて、ＯＮＣ－８４１が抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによって誘導される腫瘍拒絶を増強したことを実証した。
【0184】
まとめると、Ｓｉｇｌｅｃ－１０のアンタゴニストとして、ＯＮＣ－８４１は、２つの別個の機構によって抗腫瘍免疫を促進し得る。第１に、ＯＮＣ－８４１は、腫瘍細胞のファゴサイトーシスを促進するようＤＮＥＭＳを不活性化し得る。第２に、ＯＮＣ－８４１は、ＡＤＣＣにおいてＳｉｇｌｅｃ－１０を介した陰性シグナル伝達を遮断することによって、ＡＤＣＣに基づく治療用抗体の治療活性を増強し得る。これらの生物学的活性及び治療可能性を最大限に利用するために、本試験は、進行した又は転移性の固形腫瘍を有する患者において、単剤療法としてのＯＮＣ－８４１、及びＯＮＣ－３９２と組み合わせたＯＮＣ－８４１の安全性、薬物動態及び有効性を評価するようにデザインされている。
【0185】
試験デザインの概略
進行した／転移性の固形腫瘍を有する参加者における、単剤としてのＯＮＣ－８４１の、及びＯＮＣ－３９２と組み合わせてのＯＮＣ－８４１の静脈内（ＩＶ）投与の第１／２相非盲検用量漸増試験。
進行した／転移性の固形腫瘍を有する参加者における、単剤としてのＯＮＣ－８４１の、及びＯＮＣ－３９２と組み合わせてのＯＮＣ－８４１の静脈内（ＩＶ）投与の第１／２相非盲検用量漸増試験。
【0186】
第１Ａ相、用量設定試験
第１Ａ相試験は、単剤療法（パートＡ）及び併用療法（パートＢ）のＲＰ２Ｄをそれぞれ規定するための２つの部分からなる。
第１Ａ相試験は、単剤療法（パートＡ）及び併用療法（パートＢ）のＲＰ２Ｄをそれぞれ規定するための２つの部分からなる。
【0187】
（１）パートＡ：単剤療法のための推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ－Ｍ）を規定するための単剤療法用量漸増。ＯＮＣ－８４１の用量漸増では、様々な組織型の進行がんを有するＯＮＣ－３９２ナイーブ患者が登録される。６つのレベルのＯＮＣ－８４１を試験するが、開始用量は、ＧＬＰ毒性データを考慮して決定する。ＯＮＣ－８４１は、２１日に１回（ｑ３ｗ）ＩＶ輸液によって投与される。試験では、２番目に高い用量まで患者内用量漸増が使用され、その時点で３＋３デザインに移行する。６人の患者が最終用量レベルで登録されるが、ただし用量制限毒性（ＤＬＴ）が２人以上の患者に観察された場合、用量漸減の選択肢がある。ＲＰ２Ｄ－Ｍは、６例の患者のうち２例未満がＤＬＴを発現した最高用量レベルとして決定される。
【0188】
（２）パートＢ：３．０、６．０又は１０．０ｍｇ／ｋｇのＯＮＣ－３９２と組み合わせたＯＮＣ－８４１の推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ－Ｃ）を決定するための併用療法用量設定試験。第１の用量は、３週毎（ｑ３ｗ）の、ＯＮＣ－３９２と組み合わせた、ＲＰ２Ｄ－Ｍよりも１つ低い用量レベルである。３人の患者が、３＋３デザイン後の第１のコホートに登録される。ＤＬＴが観察されない場合、用量はＲＰ２Ｄ－Ｍに増加される。１人のＤＬＴが存在した場合、別の３人の患者が登録される。６人のうち１人以下の患者がＤＬＴを有する場合、次のコホートのＯＮＣ－８４１は、ＲＰ２Ｄ－Ｍの１つ下のレベルとＲＰ２Ｄ－Ｍとの間の中間レベル、又はＲＰ２Ｄ－Ｍのいずれかであり、これは安全性データによって決められる。６人の患者が最終用量レベルで登録される。ＲＰ２Ｄ－Ｃは、６人の患者のうち２人未満がＤＬＴを発現した最高用量レベルとして決定される。
【0189】
第１Ｂ相、拡大コホート
第１Ｂ相は、用量拡大の２つのアームからなり、これはＲＰ２Ｄ－ＭでのＯＮＣ－８４１単剤療法（アームＡ）、又はＲＰ２Ｄ－ＣでのＯＮＣ－８４１と３．０、６．０若しくは１０．０ｍｇ／ｋｇのＯＮＣ－３９２との組合せ（アームＢ）の安全性及び臨床活性を試験するためのものである。
第１Ｂ相は、用量拡大の２つのアームからなり、これはＲＰ２Ｄ－ＭでのＯＮＣ－８４１単剤療法（アームＡ）、又はＲＰ２Ｄ－ＣでのＯＮＣ－８４１と３．０、６．０若しくは１０．０ｍｇ／ｋｇのＯＮＣ－３９２との組合せ（アームＢ）の安全性及び臨床活性を試験するためのものである。
【0190】
我々は、進行した固形腫瘍を有するか、又は標準治療（ＳＯＣ）下で疾患が進行しているか、又はＳＯＣに耐容性でないアームあたり３０人の患者を登録することを計画している。適格基準は、第１Ａ相と同じである。
【0191】
第２相
治験第２相は、Ｓｉｍｏｎの２段階デザインに従う。段階１では、合計２９人の非小細胞肺がん患者が、客観的奏効率を決定するために登録される。４人を超える患者が客観的奏効を達成した場合、試験は段階２に進み、奏効率が２０％未満であるという帰無仮説を棄却する８０％の検出力を達成するのに十分な患者（８０～１３０人）を登録する。
治験第２相は、Ｓｉｍｏｎの２段階デザインに従う。段階１では、合計２９人の非小細胞肺がん患者が、客観的奏効率を決定するために登録される。４人を超える患者が客観的奏効を達成した場合、試験は段階２に進み、奏効率が２０％未満であるという帰無仮説を棄却する８０％の検出力を達成するのに十分な患者（８０～１３０人）を登録する。
【0192】
我々は、ＯＮＣ－３９２＋ＯＮＣ－８４１を使用した併用療法に対する潜在的な応答性について、２２の主要ながん型をランク付けした。これは、ＲＮＡｓｅｑ、及びＴＣＧＡデータベースのゲノムデータによって再構築された免疫学的ランドスケープに基づいていた。図２８に示すように、我々は、ＲＮＡｓｅｑ、及びＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースからの２２のがん型に属する７２７９の独立したがん試料のゲノムデータから、免疫腫瘍微小環境のランドスケープを生成した。主に、抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブに対する応答者及び非応答者として後に同定された黒色腫患者の治療前臨床試料のゲノムデータ及びＲＮＡｓｅｑデータから、抗ＣＴＬＡ－４に対する応答性の５つのランキング成分を同定したが、これには、ＣＴＬＡ－４遺伝子発現、ＡＤＣＣ能（ADCC potential）、変異負荷、並びにＣＴＬＡ－４応答性に有利な遺伝子濃縮及び細胞組成が含まれる。それぞれ１～３つの成分から構成された５つの独立した区分値（partitioning values）の合計によって、総ランキング数を計算した。ＯＮＣ－８４１に対する応答のランキングは、ＲＮＡｓｅｑデータによって確立されたＳＩＧＬＥＣ１０発現の存在量及びマクロファージの存在量に基づく。併用療法に対する応答についてのランキングは、各抗体に対するそれらの応答のランキングに基づく（表３）。我々の分析は、非小細胞肺腺がんが最も応答性の高いがん型であることを示唆する。ＯＮＣ－３９２の単剤活性は、我々の進行中の治験によって支持される。
【表3】
【0193】
我々の臨床データ及びインシリコ分析に基づいて、我々は、ＯＮＣ－８４１とＯＮＣ－３９２との併用療法の臨床的有効性を試験するための第２相試験における我々の第１の臨床適応症として非小細胞肺腺がんを選択した。
【0194】
投薬／投薬形態、経路及び投与レジメン
単剤療法における用量漸増のために、ＯＮＣ－８４１は、最小６０分間のＩＶ輸液として投与される。ＯＮＣ－８４１の６つの用量レベルが評価される。投与間隔は２１日間である。ＯＮＣ－８４１は、Ｑ３Ｗのスケジュールで投与される。ＯＮＣ－３９２とＯＮＣ－８４１との組合せでは、ＯＮＣ－８４１が最初に最小６０分間のＩＶ輸液として投与される。次いで、ＯＮＣ－３９２は、３．０、６．０又は１０．０ｍｇ／ｋｇでの最小６０分間のＩＶ輸液として投与される。ＯＮＣ－３９２とＯＮＣ－８４１とは投与において混合されるべきではなく、２つの薬物の投与間に少なくとも３０分の間隔があるべきである。ＯＮＣ－８４１単独、又はＯＮＣ－３９２とＯＮＣ－８４１との組合せは、Ｑ３Ｗのスケジュールで投与される。
単剤療法における用量漸増のために、ＯＮＣ－８４１は、最小６０分間のＩＶ輸液として投与される。ＯＮＣ－８４１の６つの用量レベルが評価される。投与間隔は２１日間である。ＯＮＣ－８４１は、Ｑ３Ｗのスケジュールで投与される。ＯＮＣ－３９２とＯＮＣ－８４１との組合せでは、ＯＮＣ－８４１が最初に最小６０分間のＩＶ輸液として投与される。次いで、ＯＮＣ－３９２は、３．０、６．０又は１０．０ｍｇ／ｋｇでの最小６０分間のＩＶ輸液として投与される。ＯＮＣ－３９２とＯＮＣ－８４１とは投与において混合されるべきではなく、２つの薬物の投与間に少なくとも３０分の間隔があるべきである。ＯＮＣ－８４１単独、又はＯＮＣ－３９２とＯＮＣ－８４１との組合せは、Ｑ３Ｗのスケジュールで投与される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図26C】
【図27】
【図28】
【図29】
【配列表】
【国際調査報告】