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特表2024-515917アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物、及びＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させる方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-11
(54)【発明の名称】アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物、及びＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240404BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20240404BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240404BHJP
C12N 9/04 20060101ALN20240404BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12N15/53 ZNA
C12N15/63 Z
C12N9/04 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023529891
(86)(22)【出願日】2022-06-28
(85)【翻訳文提出日】2023-05-17
(86)【国際出願番号】 CN2022101796
(87)【国際公開番号】W WO2023193352
(87)【国際公開日】2023-10-12
(31)【優先権主張番号】202210353444.8
(32)【優先日】2022-04-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523050771
【氏名又は名称】シェンチェン ブルーファ バイオサイエンシズ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＢＬＵＥＰＨＡ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ８０８，８ Ｆｌｏｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｐａｒｋ，Ｗｅｓｔ Ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｇａｔｅ，Ｎｏ．１３，Ｌａｎｇｓｈａｎ Ｒｏａｄ，Ｓｏｎｇｐｉｎｇｓｈａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，Ｘｉｌｉ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０５７ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100077012
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍
(72)【発明者】
【氏名】イン，ジン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ユ
(72)【発明者】
【氏名】リ，ジアジア
(72)【発明者】
【氏名】ホウ，ジエ
(72)【発明者】
【氏名】ゾウ，リアン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジシアン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA12
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は微生物の技術分野に関するものであり、具体的には、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物、及びＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させる方法に関するものである。本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子は、菌株から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を有意に増加させることができ、本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子により構築された、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファから生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が有意に増加し、３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を生産する遺伝子操作された菌株の開発に新規な遺伝子及び菌株資源を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させるための、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種またはそのコーディング遺伝子の使用であって、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号９～１５のいずれかが示すとおりであることを特徴とする、前記使用。
【請求項2】
前記コーディング遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１～７のいずれかが示すとおりであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
微生物がラルストニア・ユートロファ、大腸菌またはハロモナス菌であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項4】
アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファであって、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号９～１５のいずれかが示すとおりであることを特徴とする、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項5】
前記発現は、（１）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、及び
（２）ゲノムに前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つまたは複数のコピーを挿入する方式
のいずれか一種または多種で実現されることを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項6】
前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子は、配列番号１～７のいずれかが示すとおりであることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項7】
前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファが、さらに、（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を含むことを特徴とする、請求項４～６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項8】
前記ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号１６が示すとおりであることを特徴とする、請求項７に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項9】
ラルストニア・ユートロファを修飾することにより前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させるステップを含むことを特徴とする、請求項４～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの構築方法。
【請求項10】
ラルストニア・ユートロファに対して、（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を行うことをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は微生物の技術分野に関するものであり、具体的には、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物、及びＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させる方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
ポリヒドロキシアルカノエート（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ、ＰＨＡ）は、微生物から合成される再生・分解可能な複数の材料特性を有する高分子重合体であり、医療、材料、及び環境保護の分野で広く応用される見込みがある。ＰＨＡは、主に炭素源およびエネルギーの貯蔵担体として微生物の細胞に広く存在する。ＰＨＡは、モノマーの種類や重合方法に応じて、硬くて脆い硬質プラスチックないし柔軟なエラストマー等、一連の多様な材料特性を有する。ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ、またはＰ（３ＨＢ））は、ＰＨＡの一種であって、細菌から産生される複合生体高分子であり、熱可塑性プラスチックとして、その機械的特性及び物理的特性がポリスチレンなどの従来のプラスチックに匹敵するものである。一方、Ｐ（３ＨＢ）は、結晶性が高いため、従来のプラスチックに比べて脆くて硬く、それゆえに、製品プラスチックの代替品として実用価値がない。よって、熱的特性及び物理的特性を改進するために、３ＨＢとより長い鎖を備えるモノマーの組み合わせを含む共重合体を生産する必要がある。ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））は、鎖長が異なるものが混合された共重合体であり、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーに比べてフレキシブルであり、その中の３ＨＨｘ（３－ヒドロキシヘキサン酸）モノマーの部分は重合体の特性を大きく影響する。高い３ＨＨｘモル分率（Ｈ割合と略称する）を有するＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）共重合体は、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）などの一般的な製品プラスチックに類似する特性を示すことができる。そのため、微生物から生産される３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘにおける３ＨＨｘの割合を増加させることは、重要な意義がある。
【0003】
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、カプリアビダス・ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）とも言う）は、ＰＨＡの合成を研究するための重要なモデル細菌であり、現在多く研究されているＰＨＢの生成に用いられる菌株である。炭素が過剰で窒素が不足すると、ラルストニア・ユートロファはＰＨＢを蓄積することができる。一方、細胞内の他の炭素源の代謝が活発になる場合、ＰＨＢの合成は影響されてしまう。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加できるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子、並びにＰＨＡ生産用の遺伝子操作された微生物を提供することを目的とする。
【0005】
具体的には、本発明は下記の技術案を提供する。
【0006】
第１に、本発明は、アミノ酸配列が配列番号９～１５のいずれかが示すとおりであるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を提供する。
【0007】
第２に、本発明は、ヌクレオチド配列が配列番号１～７のいずれかが示すとおりであるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼのコーディング遺伝子変種を提供する。
【0008】
本発明では、実験により、上記の遺伝子変種がいずれも菌株から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を顕著に増加できることが証明された。
【0009】
第３に、本発明は、上記の遺伝子変種を含む、発現カセット、ベクターまたは宿主細胞である生体材料を提供する。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態では、上記のような遺伝子変種を含む発現カセットは、プロモーター、上記のような遺伝子変種、及びターミネーターが作動可能に連結してなるものである。発現の需要及び発現カセットの上下流の配列の相違により、発現カセットにはターミネーターを含有しなくてもよく、或いはエンハンサーなどの他の転写・翻訳調節因子を含有してもよい。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態では、上記のような遺伝子変種を含むベクターは、複製型ベクター及び非複製型ベクターを含めたプラスミドベクターである。上記の核酸分子を載せるベクターは、プラスミドベクターに限らず、ファージ、ウイルスなどのベクターであってもよい。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態では、上記の遺伝子変種、発現カセットまたはベクターを含む大腸菌細胞及びラルストニア・ユートロファ細胞を提供するが、宿主細胞の種類は、これらに限らず、いずれの微生物細胞またはタンパク質発現に使用できる動物細胞であってもよい。
【0013】
第４に、本発明は、遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させるための、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種またはそのコーディング遺伝子の使用であって、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列が配列番号９～１５のいずれかが示すとおりである使用を提供する。
【0014】
上記で提供されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列及びコドンの規則に基づき、当業者は上記のようなアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の配列を得ることができる。同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子の配列は唯一ではなく、上記のようなアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をコードできる遺伝子はいずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態では、前記コーディング遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１～７のいずれかが示すとおりである。
【0016】
上記の使用は、
（１）前記微生物に前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、及び
（２）前記微生物のゲノムに前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つまたは複数のコピーを挿入する方式
のいずれか一種または多種で実現される。
（１）前記微生物に前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、及び
（２）前記微生物のゲノムに前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つまたは複数のコピーを挿入する方式
のいずれか一種または多種で実現される。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態では、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は不活性化されていない。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態では、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は完全に保留されている。
【0019】
上記の使用において、前記遺伝子操作された微生物は、さらに、
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を含む。
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を含む。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態では、元のＰＨＡポリメラーゼに対して、前記ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種は、１４９番目のアスパラギンからセリンへの突然変異、及び１７１番目のアスパラギン酸からグリシンへの突然変異を含む。
【0021】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号１６が示すとおりである。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態では、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性の向上は、配列番号１７で示されるプロモーターによりゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現される。
【0023】
上記の使用において、前記微生物はラルストニア・ユートロファ、大腸菌またはハロモナス菌であることが好ましい。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることは、遺伝子操作された微生物が脂質を炭素源とした場合に生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることである。
【0025】
本発明のいくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることは、遺伝子操作された微生物が植物油を炭素源とした場合に生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることである。
【0026】
上記の植物油は、パーム油、落花生油、大豆油、亜麻仁油、菜種油、ひまし油、コーン油から選ばれる一種または多種の混合物を含む。第５に、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体を生産する微生物を構築するための、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種、そのコーディング遺伝子または前記コーディング遺伝子を含む生体材料の使用を提供する。
【0027】
本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の、微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加できる機能に基づき、これらの変種のコーディング遺伝子及びこれらの遺伝子を含む生体材料は、ＰＨＡを生産する菌株の構築に用いることができる。
【0028】
上記の使用において、前記微生物はラルストニア・ユートロファ、大腸菌またはハロモナス菌であることが好ましい。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態では、配列番号１～７のいずれかで示される遺伝子をラルストニア・ユートロファに導入してＰＨＡを生産する菌株を構築する。
【0030】
第６に、本発明は、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファであって、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列が配列番号９～１５のいずれかが示すとおりである遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
【0031】
本発明において、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の発現は、
（１）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方法、及び
（２）ゲノムにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つ又は複数のコピーを挿入する方法
のいずれか一種または多種で実現することができる。
（１）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方法、及び
（２）ゲノムにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つ又は複数のコピーを挿入する方法
のいずれか一種または多種で実現することができる。
【0032】
本発明のいくつかの実施形態では、ゲノムにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つのコピーを挿入することにより、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させる。
【0033】
本発明のいくつかの実施形態では、ゲノム中のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の挿入位置がｐｈａＣ遺伝子の位置である。
【0034】
本発明のいくつかの実施形態では、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子が配列番号１～７のいずれかが示すとおりである。これらのコーディング遺伝子の配列は、ラルストニア・ユートロファのコドンバイアスに応じて人工最適化及び選別を組み合わせて得られた、ラルストニア・ユートロファにおいてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を効率良くかつ正確に発現できる配列である。これらの配列の使用は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種がラルストニア・ユートロファにおいてＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合増加作用をよりよく発揮することを促進するのに有利である。
【0035】
本発明のいくつかの実施形態では、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子が不活性化されていない。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態では、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子が完全に保留されている。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）の合成を促進するために、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、さらに、
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を含む。
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を含む。
【0038】
ここで、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種について、Ｃ６脂肪酸（３－ヒドロキシヘキサン酸）を重合できるように細菌のＰＨＡポリメラーゼのアミノ酸配列に突然変異を引き起こしてもよい。先行技術におけるＣ６脂肪酸（３－ヒドロキシヘキサン酸）を重合できるＰＨＡポリメラーゼ変種を用いてもよいが、先行技術におけるポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種の突然変異部位を組み合わせてより高い効率の新たなＰＨＡポリメラーゼ変種を得てもよい。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態では、元のＰＨＡポリメラーゼに対して、前記ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種は、１４９番目のアスパラギンからセリンへの突然変異、及び１７１番目のアスパラギン酸からグリシンへの突然変異を含む。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列が配列番号１６が示すとおりである。
【0041】
上記のポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種の発現は、
（１）前記ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、及び
（２）ゲノムにポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子の一つまたは複数のコピーを挿入する方式
の一種または多種で実現される。
（１）前記ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、及び
（２）ゲノムにポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子の一つまたは複数のコピーを挿入する方式
の一種または多種で実現される。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させるとともに、ゲノムにおける元のＰＨＡポリメラーゼのコーディング遺伝子を不活性化させる。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子をゲノムに挿入する。
【0044】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子を含む発現プラスミドを導入する。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態では、前記発現プラスミドは安定的に発現するプラスミドであり、プラスミドの安定的な発現は、プラスミドに菌株成長に必要な代謝物の合成遺伝子を含有させるとともに、ゲノムにおける当該合成遺伝子を不活性化させることにより実現される。
【0046】
本発明のいくつかの実施形態では、前記配列番号１６で示されるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドは、さらにｐｒｏＣ遺伝子を含み、且つ前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファのゲノムｐｒｏＣ遺伝子が不活性化された。
【0047】
上記の酵素の発現の向上は、下記の（１）～（４）のいずれか一種または多種の方式により実現することができる。
（１）前記酵素のコーディング遺伝子を含むベクターを導入する方式、
（２）ゲノムにおける前記酵素のコーディング遺伝子のコピー数を増やす方式、
（３）ゲノムにおける前記酵素のコーディング遺伝子の転写及び／または翻訳調節因子（プロモーターなどを含む）の配列を変化させる方式、及び
（４）前記酵素のコーディング遺伝子のヌクレオチド配列を変化させる方式。
（１）前記酵素のコーディング遺伝子を含むベクターを導入する方式、
（２）ゲノムにおける前記酵素のコーディング遺伝子のコピー数を増やす方式、
（３）ゲノムにおける前記酵素のコーディング遺伝子の転写及び／または翻訳調節因子（プロモーターなどを含む）の配列を変化させる方式、及び
（４）前記酵素のコーディング遺伝子のヌクレオチド配列を変化させる方式。
【0048】
上記の酵素活性の向上は、前記酵素における一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により実現することができる。
【0049】
本発明のいくつかの実施形態では、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性の向上は、配列番号１７で示されるプロモーターによりゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現される。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態では、配列番号１７で示されるプロモーターによりゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることは、ゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子とその上流にある遺伝子との遺伝子間領域に配列番号１７で示されるプロモーターを挿入することにより実現される。
【0051】
野生型ラルストニア・ユートロファにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現が沈黙される。本発明において、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び酵素活性の向上に用いられるプロモーターは、配列番号１７で示されるプロモーターに限らず、ラルストニア・ユートロファにおいてプロモーターの機能を発揮できるＤＮＡ断片であれば、いずれも（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの転写を開始させ、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させることができる。
【0052】
本発明のいくつかの実施形態では、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性の向上は、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０菌株における（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの遺伝子の上流プロモーターにより、ゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現される。
【0053】
本発明では、実験により、本発明のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の、遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させる機能の発揮が、特定の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの遺伝子のプロモーターの配列に依存せず、遺伝子操作された微生物における（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼが発現可能であればよいことが証明された。
【0054】
本発明のいくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、野生型ラルストニア・ユートロファ、ラルストニア・ユートロファＨ１６菌株またはラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０を出発菌株として修飾されたものである。
【0055】
ここで、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＢＰＳ－０５０は、２０２１年１０月１３日にＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣと略称し、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所、郵便番号：１００１０１）に受託され、分類学上の位置がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）で、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ.２３６００である。
【0056】
第７に、本発明は、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの少なくとも２株を含む、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの形質転換体ライブラリーを提供する。
【0057】
本発明のいくつかの実施形態では、前記形質転換体ライブラリーにおける遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、アミノ酸配列が配列番号９～１５のいずれかが示すとおりであるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現し、前記形質転換体ライブラリーにおける各株の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファが発現するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列は相違する。
【0058】
本発明のいくつかの実施形態では、前記形質転換体ライブラリーにおいて上記のような遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの２株、３株、４株、５株、６株または７株を含む。
【0059】
第８に、本発明は、ラルストニア・ユートロファを修飾することにより前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させるステップを含む前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの構築方法を提供する。
【0060】
本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファのポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）合成能力を促進するために、前記方法が、ラルストニア・ユートロファに対して、
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を行うことをさらに含む。
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種を行うことをさらに含む。
【0061】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列が配列番号１６が示すとおりである。
【0062】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、配列番号１７で示されるプロモーターにより、ゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることを含む。
【0063】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子をゲノムに挿入することを含む。
【0064】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入することを含む。
【0065】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子及びｐｒｏＣ遺伝子を含むプラスミドを導入すること、及びゲノムにおけるｐｒｏＣ遺伝子を不活性化させることを含む。
【0066】
ここで、遺伝子の不活性化は、遺伝子ノックアウト、発現の沈黙化、ＲＮＡ干渉などの方式で実現することができる。
【0067】
第９に、本発明は、下記のいずれかの前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの使用を提供する。
（１）ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産における使用、及び
（２）ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産に用いられる菌株の選別・育成における使用。
（１）ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産における使用、及び
（２）ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産に用いられる菌株の選別・育成における使用。
【0068】
上記の使用において、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産に用いられる菌株の選別・育成は、具体的には、本発明が提供する遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを出発菌株とした、遺伝子操作改造、変異誘発または馴化の方法による、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産に用いられる菌株の選別・育成であってもよい。
【0069】
第１０に、本発明は、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを培養して培養物を得るステップを含む、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産方法を提供する。
【0070】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを活性化培養し、活性化された菌体を種培地に接種して種培養を行い、種培養液を得た後、該種培養液を生産培地に接種し、前記培養物を得ることを含む。
【0071】
上記の培養では、通常のラルストニア・ユートロファ培養用培地を選択してもよい。培地には、炭素源、窒素源及び無機塩を含有してもよい。ここで、炭素源として、植物油（例えば、パーム油）、ショ糖、グルコース、糖蜜、マルトース、フルクトース、アラビノースの一種または多種の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。窒素源として、コーンスティープリカー、酵母エキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウムの一種または多種の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。無機塩として、リン酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、マンガン塩、カルシウム塩、ホウ酸塩、コバルト塩、銅塩、ニッケル塩、モリブデン塩の一種または多種の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。
【0072】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、培養した培養物に対して分離及び抽出を行い、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体を収集するステップを含む。
【0073】
第１１に、本発明は、遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させる方法であって、ラルストニア・ユートロファを修飾することによりアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させることを含み、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列が配列番号９～１５のいずれかが示すとおりである方法を提供する。
【0074】
上記の方法において、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の発現は、
（１）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方法、及び
（２）ゲノムにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つ又は複数のコピーを挿入する方法
の一種または多種により実現することができる。
（１）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方法、及び
（２）ゲノムにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つ又は複数のコピーを挿入する方法
の一種または多種により実現することができる。
【0075】
本発明のいくつかの実施形態では、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子は、配列番号１～７のいずれかが示すとおりである。
【0076】
本発明のいくつかの実施形態では、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子が不活性化されていない。
【0077】
本発明のいくつかの実施形態では、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子が完全に保留されている。
【0078】
上記の方法において、前記遺伝子操作された微生物は、
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種をさらに含む。
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
の一種または多種をさらに含む。
【0079】
本発明のいくつかの実施形態では、元のＰＨＡポリメラーゼに対して、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種は、１４９番目のアスパラギンからセリンへの突然変異、及び１７１番目のアスパラギン酸からグリシンへの突然変異を含む。
【0080】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号１６が示すとおりである。
【0081】
本発明のいくつかの実施形態では、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性の向上は、配列番号１７で示されるプロモーターにより、ゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現される。
【0082】
本発明のいくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることは、遺伝子操作された微生物が脂質を炭素源とした場合に生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることである。
【0083】
本発明のいくつかの実施形態では、前記遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることは、遺伝子操作された微生物が植物油を炭素源とした場合に生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることである。
【0084】
上記の植物油は、パーム油、落花生油、大豆油、亜麻仁油、菜種油、ひまし油、コーン油から選ばれる一種または多種の混合物を含む。
【0085】
本発明において、前記ポリヒドロキシアルカノエートは、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）であることが好ましく、３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）であることがより好ましい。
【0086】
本発明の有益な効果は、下記の通りである：本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子は、菌株から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を顕著に増加させることができ、本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子により構築された遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファから生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が顕著に増加し、３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を生産する遺伝子操作された菌株の開発に新規な遺伝子及び菌株資源を提供し、３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）の生産にとって、重要な使用価値がある。
【図面の簡単な説明】
【0087】
【図1】本発明の実施例２における各菌株の発酵生産で得られたＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸のモル分率を示す図である。
【図2】本発明の実施例２における各菌株のＰＨＡの発酵生産能力を示す図である。
【図3】本発明の実施例３における各菌株の発酵生産で得られたＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸のモル分率を示す図である。
【図4】本発明の実施例３における各菌株のＰＨＡの発酵生産能力を示す図である。
【図5】本発明の実施例４における各菌株の発酵生産で得られたＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸のモル分率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0088】
本発明の応用は、下記の明細書に記載または例示された形態に制限されない。本発明は、他の実施形態に適用でき、且つ多種の方式で実施または進行することができる。また、本明細書で用いた記述や用語は、説明を目的とするものであり、限定とみなされるべきではない。本明細書で用いた「含む」、「包含する」または「有する」、「含有する」、「関する」及びそれらの変形は、以下で挙げた事項及びその等価物並びに他の事項を含むことを趣旨とする。
【0089】
本発明が提供する具体的な実施形態の一部または全部は、本発明が、菌株から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を顕著に増加させることができるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子を見出したことに基づくものである。これらのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子は、ＰＨＡ（特にＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の合成に必要な他の遺伝子を有する菌株に導入されることにより、それらの菌株から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させることに用いられ、遺伝子操作された微生物を得ることができる。これらの遺伝子操作された微生物は、ＰＨＡ（特にＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の生産に適用することができ、従来のＰＨＡ発酵生産菌株の３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）の発酵生産能力を向上させることができる。本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現することに加え、遺伝子操作された微生物は他の修飾が施されてもよい。本発明は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の発現という修飾を、少なくともＰＨＡポリメラーゼ（ｐｈａＣ）変種の発現、ｐｈａＪの発現の向上といった修飾と組み合わせて行うことにより、３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）の生産量を更に増加させることできることを見出した。
【0090】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号９～１５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を提供する。これらの変種は菌株から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を有意に増加させることができる。
【0091】
いくつかの実施形態では、本発明は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をコードする、配列番号１～７のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子を提供する。これらの遺伝子はラルストニア・ユートロファにおいて発現するように最適化されたものである。
【0092】
いくつかの実施形態では、本発明は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を発現する遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
【0093】
いくつかの実施形態では、本発明は、ゲノムに上記のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子が挿入された遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
【0094】
いくつかの実施形態では、本発明は、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０菌株のゲノムに上記のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子が挿入された遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０菌株に比べて、これらの遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファから生産されるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）における３－ヒドロキシヘキサン酸の割合は有意に増加する。
【0095】
いくつかの実施形態では、本発明は、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０菌株のゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子の位置に上記のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子が挿入された遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
【0096】
いくつかの実施形態では、本発明は、ラルストニア・ユートロファＨ１６菌株のゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子がＰＨＡポリメラーゼ変種（配列が配列番号１６が示すとおりである）のコーディング遺伝子に置換された上で、そのゲノムに上記のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子が挿入された遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。これらの遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファから生産されるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）における３－ヒドロキシヘキサン酸の割合は有意に増加する。
【0097】
いくつかの実施形態では、本発明は、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０のゲノムにおけるｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流プロモーターが配列番号１７で示されるプロモーターに置換された上で、そのゲノムに上記のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子が挿入された遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。これらの遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファから生産されるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）における３－ヒドロキシヘキサン酸の割合は有意に増加する。
【0098】
下記の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲はそれらに制限されない。
【0099】
特に説明がない限り、下記の実施例で使用される実験方法は、いずれも通常の方法である。
【0100】
特に説明がない限り、下記の実施例で使用される材料、試薬などは、いずれも商業ルートから入手可能である。ここで、使用される酵素試薬は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社から購入されたものであり、プラスミドを抽出するためのキットは、ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ.,Ｌｔｄ.から購入されたものであり、ＤＮＡ断片を回収するためのキットは、米国ｏｍｅｇａ社から購入されたものであり、相応の操作手順は、製品の取り扱い説明書に準じて厳密に行った。特に説明がない限り、培地はいずれも脱イオン水で製造したものである。
【0101】
下記の実施例に用いられた培地の処方は、下記の通りである。
種培地I：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ。
種培地II：パーム油０．１５％、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ。
生産培地：パーム油１．０％ 、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ９．８５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ３．０ｇ／Ｌ、微量元素溶液I １０ｍＬ／Ｌ、及び微量元素溶液II １ｍＬ／Ｌ。そのうち、微量元素溶液Iの組成は、ＭｇＳＯ４ ２０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ２ｇ／Ｌである。微量元素溶液IIの組成は、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ３００ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌである。上記の試薬は、いずれもＳｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ., Ｌｔｄ．から購入されたものである。
種培地I：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ。
種培地II：パーム油０．１５％、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ。
生産培地：パーム油１．０％ 、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ９．８５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ３．０ｇ／Ｌ、微量元素溶液I １０ｍＬ／Ｌ、及び微量元素溶液II １ｍＬ／Ｌ。そのうち、微量元素溶液Iの組成は、ＭｇＳＯ４ ２０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ２ｇ／Ｌである。微量元素溶液IIの組成は、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ３００ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌである。上記の試薬は、いずれもＳｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ., Ｌｔｄ．から購入されたものである。
【実施例1】
【0102】
実施例１ ＢＰＳ－０５０を出発菌株とした、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する形質転換体ライブラリーの構築
本実施例では、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０を出発菌株として、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現するように、出発菌株を修飾した。具体的には、下記のステップを含む。
本実施例では、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０を出発菌株として、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現するように、出発菌株を修飾した。具体的には、下記のステップを含む。
【0103】
ステップ１：基礎プラスミドの構築
ラルストニア・ユートロファのゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、ｐｈａＣの上流及び下流と相同な断片ｐｈａＣ－Ｈ１及びｐｈａＣ－Ｈ２を得、後続操作を容易するために、ｐｈａＣ－Ｈ1、ｐｈａＣ－Ｈ２の後端及び前端にＢｓａＩを添加した。修飾されたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ（Ｏｒｉｔａ, I.，Ｉｗａｚａｗａ，ｅｔ ａｌ.Ｊ. Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｅｎｇ.１１３，６３－６９）をテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、ベクター断片を得た。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によりｐｈａＣ－Ｈ1、ｐｈａＣ－Ｈ２をベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃを得た。使用したプライマーは、表１に示す通りである。
ラルストニア・ユートロファのゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、ｐｈａＣの上流及び下流と相同な断片ｐｈａＣ－Ｈ１及びｐｈａＣ－Ｈ２を得、後続操作を容易するために、ｐｈａＣ－Ｈ1、ｐｈａＣ－Ｈ２の後端及び前端にＢｓａＩを添加した。修飾されたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ（Ｏｒｉｔａ, I.，Ｉｗａｚａｗａ，ｅｔ ａｌ.Ｊ. Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｅｎｇ.１１３，６３－６９）をテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、ベクター断片を得た。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によりｐｈａＣ－Ｈ1、ｐｈａＣ－Ｈ２をベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃを得た。使用したプライマーは、表１に示す通りである。
【0104】
【表1】
【0105】
ステップ２：遺伝子の合成
異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を、それぞれ、ラルストニア・ユートロファにおいて良好に発現するように、配列を最適化した。最適化されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の配列は、配列番号1～配列番号７が示すとおりである。
異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を、それぞれ、ラルストニア・ユートロファにおいて良好に発現するように、配列を最適化した。最適化されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の配列は、配列番号1～配列番号７が示すとおりである。
【0106】
上記の最適化されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を合成に供する際に、後続操作を容易するために、ＤＮＡ配列の上流にＧＧＴＣＴＣＡＴＣを添加し、下流にＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣを添加した。
【0107】
ステップ３：標的遺伝子を含む目的菌株の構築
ステップ１で構築したプラスミドｐＫＯ－Ｃ、及び遺伝子合成会社から返送した最適化されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドについて、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ組み立てを行い、それぞれ異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を持つ組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃ－Ｎ（Ｎは、載せたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を表す）を得た。各プラスミドをそれぞれ大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合導入法によりラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０に導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノム上のＨ１およびＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。
ステップ１で構築したプラスミドｐＫＯ－Ｃ、及び遺伝子合成会社から返送した最適化されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドについて、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ組み立てを行い、それぞれ異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を持つ組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃ－Ｎ（Ｎは、載せたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を表す）を得た。各プラスミドをそれぞれ大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合導入法によりラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０に導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノム上のＨ１およびＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。
【0108】
第一の相同組換え菌をショ糖１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからスペクチノマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーＦｐｈａＣＨ１－Ｆ：ｔｇｇｔｃｔｇｇｃｔｇｇｃｇｇａｃｔｇａｇ、及びプライマーｐｈａＣＨ２－Ｒ：ｇｇｃｇａａｃｔｃａｔｃｃｔｇｃｇｃｃｔｃによるＰＣＲにより、標的遺伝子が挿入された組換え菌を同定した。得られた組換え菌は、プラスミドが安定なラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｒｏＣΔｐｈａＣ：：Ｎである（Ｎは挿入された遺伝子である）。
【0109】
ステップ４：ラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＢ遺伝子を過剰発現する組換え菌の構築
ステップ３における組換えプラスミドの構築方法を参考して、Ｇｉｂｓｏｎ組み立てによりラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＢ遺伝子を含む組換えプラスミドを構築した。具体的な方法は下記の通りである。
ステップ３における組換えプラスミドの構築方法を参考して、Ｇｉｂｓｏｎ組み立てによりラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＢ遺伝子を含む組換えプラスミドを構築した。具体的な方法は下記の通りである。
【0110】
ステップ１で得られたプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、プラスミド骨格断片を得た。ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０のゲノムをテンプレートとして、増幅を行うことでｐｈａＢ遺伝子断片を得た。上記の２つの断片をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法により連結させ、組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃ－ｐｈａＢを得た。使用したプライマーは、表２に示す通りである。
【0111】
【表2】
【0112】
ｐＫＯ－Ｃ－ｐｈａＢプラスミドを大腸菌Ｓ１７－１に導入し、上記のステップ３の方法を参考して組換え菌を構築し、最終的にｐｈａＢ遺伝子がラルストニア・ユートロファゲノムのｐｈａＣ遺伝子の位置に取り込まれた過剰発現菌株ＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＢ（ｐｈａＢ過剰発現と略称する）を得た。
【実施例2】
【0113】
実施例２ 菌株の発酵特性の測定（１）
ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０及び過剰発現菌株ＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＢを対照菌とし、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株の発酵特性をそれぞれ測定した。
ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０及び過剰発現菌株ＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＢを対照菌とし、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株の発酵特性をそれぞれ測定した。
【0114】
まず、グリセロールチューブに保存された実施例１で構築された各菌株（１０００μＬ）をそれぞれ種培地I（２０ｍＬ）に接種し、種の一次培養を１２時間行った。次に、１％の種培養液Iを種培地IIに接種し、種の二次培養を行った。その後、１０ｖ／ｖ％の種培養液IIを、１．１Ｌの生産培地を含む２Ｌの小型発酵タンク（Ｔ＆Ｊ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）に接種した。操作条件は、培養温度３０℃、攪拌速度８００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／ｍｉｎであり、ｐＨを６.７～６.８とした。ｐＨ制御には、２８％のアンモニア水溶液が用いられた。培養中、炭素源としてパーム油を継続的に使用し、培養時間は５４時間であった。
【0115】
発酵液を採取して遠心分離して菌体を得た。菌体を一定の重量となるように乾燥させた。乾燥菌体の重量を測定して、乾燥重量とした。得られた乾燥菌体にクロロホルム１００ｍＬを加え、室温で一昼夜攪拌し、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣を濾別した後、全容積が約３０ｍＬとなるようにエバポレーターで濃縮させ、その後、約９０ｍＬのヘキサンをゆっくり添加し、ゆっくり攪拌しながら１時間放置した。析出したポリエステルを濾別した後、５ＣＴＣで３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの質量を測定し、菌体内のポリエステル含有量を算出した。
【0116】
その結果、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株はいずれも、対照菌より高いＰＨＡの割合を示した。また、対照菌に比べて、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合はいずれも有意に増加し、各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合を図１に示し、その対応の乾燥重量及びＰＨＡの割合を図２に示した。
【実施例3】
【0117】
実施例３ ＢＰＳ－０５０を出発菌株とした、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する形質転換体ライブラリーの構築及びその発酵特性の測定
本実施例では、ＢＰＳ－０５０を出発菌株として、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流プロモーターをｐｈａＪ１９４（配列番号１７）に置換し、そこにおいてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子（配列番号１～７）を発現させた。
本実施例では、ＢＰＳ－０５０を出発菌株として、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流プロモーターをｐｈａＪ１９４（配列番号１７）に置換し、そこにおいてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子（配列番号１～７）を発現させた。
【0118】
ステップ１：相同組換えによるＢＰＳ－０５０のｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流プロモーターの置換
（１）ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０のゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｒｐを用いて、ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターの上流と相同な断片Ｈ１を得た。ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｒｐを用いて、ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターの上流と相同な断片Ｈ２を得た。
（２）遺伝子合成によりｐｈａＪ遺伝子のプロモーターｐｈａＪ１９４（配列番号１７）を合成した。
（３）Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法により、ＰＣＲにより得られたＨ１、Ｈ２及びｐｈａＪ１９４プロモーターをベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ｐｈａＪ１９４を得た。使用したプライマーは、表３に示す通りである。
（１）ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０のゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｒｐを用いて、ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターの上流と相同な断片Ｈ１を得た。ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｒｐを用いて、ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターの上流と相同な断片Ｈ２を得た。
（２）遺伝子合成によりｐｈａＪ遺伝子のプロモーターｐｈａＪ１９４（配列番号１７）を合成した。
（３）Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法により、ＰＣＲにより得られたＨ１、Ｈ２及びｐｈａＪ１９４プロモーターをベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ｐｈａＪ１９４を得た。使用したプライマーは、表３に示す通りである。
【0119】
【表3】
【0120】
第一の相同組換え菌をショ糖１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからカナマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーｐｈａＪ ＦｐとｐｈａＪ ＲｐによるＰＣＲにより、相応のサイズの組換え菌を同定した。得られた組換え菌はラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ１９４（Ｒｅ＿ｐｈａＪ１９４と略称する）である。
【0121】
ステップ２：実施例１の方法を参考して、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子（配列番号１～７）を、それぞれラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ１９４のゲノムに挿入した。
【0122】
ステップ３：ラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ１９４においてラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＢ遺伝子を過剰発現させ、ｐｈａＢを過剰発現する菌株であるｐｈａＢ過剰発現－２を得た。
【0123】
ステップ４：ステップ２及びステップ３で構築された菌株について、実施例２の方法により発酵培養及びＰＨＡ測定を行った。その結果、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株はいずれも、対照菌より高いＰＨＡの割合を示した。また、対照菌に比べて、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合はいずれも有意に増加した。各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合を図３に示し、その対応の乾燥重量及びＰＨＡ割合を図４に示した。
【実施例4】
【0124】
実施例４ Ｈ１６を出発菌株としたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する形質転換体ライブラリーの構築及びその発酵特性の測定
本実施例では、ラルストニア・ユートロファＨ１６を出発菌株として、Ｈ１６のゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子からｐｈａＣ遺伝子変種（タンパク質をコードする配列が配列番号１６が示すとおりである）への突然変異を行うことにより、組換え菌に３ＨＨｘの合成能力を付与し、得られた組換え菌においてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子（配列番号１～７）を発現させた。
本実施例では、ラルストニア・ユートロファＨ１６を出発菌株として、Ｈ１６のゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子からｐｈａＣ遺伝子変種（タンパク質をコードする配列が配列番号１６が示すとおりである）への突然変異を行うことにより、組換え菌に３ＨＨｘの合成能力を付与し、得られた組換え菌においてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子（配列番号１～７）を発現させた。
【0125】
ステップ１：ラルストニア・ユートロファゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子の置換
遺伝子合成により配列番号８で示される配列を合成し、該配列はｐｈａＣ遺伝子の上流と下流の約６００ｂｐの断片及びｐｈａＣ遺伝子変種を持つ。プラスミドの構築には、実施例１のステップ１で構築されたプラスミドを用いて、遺伝子合成を行う際にＤＮＡ配列の上流にＧＧＴＣＴＣＡＴＣを添加し、下流にＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣを添加した。Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ法により合成遺伝子をベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃを得た。
遺伝子合成により配列番号８で示される配列を合成し、該配列はｐｈａＣ遺伝子の上流と下流の約６００ｂｐの断片及びｐｈａＣ遺伝子変種を持つ。プラスミドの構築には、実施例１のステップ１で構築されたプラスミドを用いて、遺伝子合成を行う際にＤＮＡ配列の上流にＧＧＴＣＴＣＡＴＣを添加し、下流にＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣを添加した。Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ法により合成遺伝子をベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃを得た。
【0126】
組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃを大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合導入法によりラルストニア・ユートロファに導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、カナマイシン２００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノム上のＨ１およびＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。
【0127】
第一の相同組換え菌をショ糖１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからカナマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーｐｈａＣ－Ｈ１ ＦＰとｐｈａＣ－Ｈ２ ＲＰによるＰＣＲにより、ｐｈａＣ遺伝子が置換された組換え菌を同定した。得られた組換え菌はラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ（Ｒｅ＿Ｈ１６と略称する）である。
【0128】
ステップ２：実施例１の方法を参考して、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子（配列番号１～７）を、それぞれステップ１で構築されたラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃのゲノムに挿入した。
【0129】
ステップ３：ステップ１で構築されたラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃにおいてラルストニア・ユートロファＨ１６の元のｐｈａＢ遺伝子を過剰発現させ、ｐｈａＢを過剰発現する菌株であるｐｈａＢ過剰発現－３を得た。
【0130】
ステップ４：ステップ２及びステップ３で構築された菌株について、実施例２の方法により発酵培養及びＰＨＡ測定を行った。その結果、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株はいずれも、対照菌より高いＰＨＡの割合を示した。また、対照菌に比べて、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合はいずれも有意に増加した。各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合を図５に示し、その対応の乾燥重量及びＰＨＡ割合を図６に示した。
【0131】
実施例５ 菌株の発酵特性の測定（２）
上記の実施例１、実施例３及び実施例４で構築された菌株について、他の植物油を炭素源とした発酵実験を行った。即ち、対応の発酵測定方法における炭素源を、パーム油からそれぞれ大豆油及び亜麻仁油に変換した上で、実施例１、実施例３及び実施例４で構築された菌株について発酵特性の測定を行った。その結果、大豆油または亜麻仁油を炭素源とした場合、各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合、細胞乾燥重量及びＰＨＡの割合は、パーム油を炭素源とした場合に測定した発酵特性の結果に一致する傾向があり、顕著な差異が見られなかった。
上記の実施例１、実施例３及び実施例４で構築された菌株について、他の植物油を炭素源とした発酵実験を行った。即ち、対応の発酵測定方法における炭素源を、パーム油からそれぞれ大豆油及び亜麻仁油に変換した上で、実施例１、実施例３及び実施例４で構築された菌株について発酵特性の測定を行った。その結果、大豆油または亜麻仁油を炭素源とした場合、各菌株から生産されたＰＨＡにおけるＨの割合、細胞乾燥重量及びＰＨＡの割合は、パーム油を炭素源とした場合に測定した発酵特性の結果に一致する傾向があり、顕著な差異が見られなかった。
【0132】
ここで、一般的な説明及び具体的な実施形態により本発明を詳細に説明したが、本発明を基にいくつかの修正または改進を行ってもよいことは、当業者にとって自明である。よって、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で行われたこれらの修正または改進はいずれも本発明の保護範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【0133】
本発明は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子を発現する遺伝子操作された微生物、微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させるための、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子の使用、ならびに微生物から生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させる方法を提供する。微生物においてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させることにより、微生物から合成されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が有意に増加するとともに、微生物細胞におけるＰＨＡの高い含有量を保証することができる。本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種、そのコーディング遺伝子及び遺伝子操作された微生物は、３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いＰＨＡを生産する菌株の開発に、新規な遺伝子及び菌株資源を提供し、３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が高いＰＨＡの生産において重要な経済価値及び応用見通しがある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファがパーム油を炭素源とした場合に生産されるＰＨＡにおける３－ヒドロキシヘキサン酸の割合を増加させるための、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種またはそのコーディング遺伝子の使用であって、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号１０が示すとおりであることを特徴とする、前記使用。
【請求項2】
前記コーディング遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２が示すとおりであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記使用は、
（１）ラルストニア・ユートロファに前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、及び
（２）ラルストニア・ユートロファのゲノムに前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つまたは複数のコピーを挿入する方式
のいずれか一種または多種で実現されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項4】
前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファが、さらに、
（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
のうちの一種を含み、
前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号１６が示すとおりであり、
前記（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性の向上は、配列番号１７で示されるプロモーターにより、ゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項5】
アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファであって、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号１０が示すとおりであることを特徴とする、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項6】
前記発現は、（１）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、及び
（２）ゲノムに前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の一つまたは複数のコピーを挿入する方式
のいずれか一種または多種で実現されることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項7】
前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子は、配列番号２が示すとおりであることを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項8】
前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファが、さらに、（１）ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシヘキサノエート）を合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、及び
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性を向上させる修飾
のうちの一種を含み、
前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号１６が示すとおりであり、
前記（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現及び／または酵素活性の向上は、配列番号１７で示されるプロモーターにより、ゲノムにおける（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現されることを特徴とする、請求項５～７のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファ。
【請求項9】
ラルストニア・ユートロファを修飾することにより前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させるステップを含むことを特徴とする、請求項５～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの構築方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】