特表 2024-515919 腫瘍標的化のためのキメラ抗原受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-11

(54)【発明の名称】腫瘍標的化のためのキメラ抗原受容体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240404BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240404BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240404BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240404BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240404BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240404BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240404BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240404BHJP

   A61K 35/17 20150101ALN20240404BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C12N15/63 Z

A61K39/00 H

A61K39/395 N

A61P35/00

C07K16/28

C12N15/13

A61K35/17

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023540515

(86)(22)【出願日】2023-04-07

(85)【翻訳文提出日】2023-07-06

(86)【国際出願番号】 US2023065537

(87)【国際公開番号】W WO2023196982

(87)【国際公開日】2023-10-12

(31)【優先権主張番号】63/329,287

(32)【優先日】2022-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523111348

【氏名又は名称】フェイト セラピューティクス，インコーポレイティド

(71)【出願人】

【識別番号】000185983

【氏名又は名称】小野薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】バーラム バラメール

(72)【発明者】

【氏名】トム トン リー

(72)【発明者】

【氏名】マーティン ホスキング

(72)【発明者】

【氏名】山本 晋

(72)【発明者】

【氏名】前田 達男

【テーマコード（参考）】

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA02

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085CC03

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB02

4C087ZB09

4C087ZB26

4H045AA10

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

選択された腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。提供されるＣＡＲ候補の構造設計及び機能プロファイルも提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、前記抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
（ｉｉ）配列番号４（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む、外部ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原への前記ＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項2】

前記抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
（ｂ）配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ若しくはＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、前記リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択的に、前記リンカーが、配列番号９～１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
（ｄ）配列番号１３若しくは配列番号１４に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１３及び１４の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
（ｅ）ヒト化されている、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項3】

前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、
（ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、
（ｂ）それぞれ配列番号３７～５９によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は
（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項4】

前記内部ドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、前記内部ドメインドメインが、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、又はＮＫｐ４６－２Ｂ４の形態のうちのいずれか１つにおいて、融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。

【請求項5】

前記膜貫通ドメインが、
（ａ）ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチド、
（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は
（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄの膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項6】

前記膜貫通ドメイン及びその直結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項7】

前記内部ドメインが、
（ａ）シグナルペプチド、及び／又は
（ｂ）スペーサ／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項8】

前記スペーサ／ヒンジが、
（ａ）ＩｇＧ４スペーサ、ＣＤ２８スペーサ、ＣＤ８スペーサ、ＣＨ３スペーサ、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサ、若しくはそれらの任意の組み合わせ、
（ｂ）約１０～約８０アミノ酸の短いスペーサ、８０超～約１８０アミノ酸の中程度のスペーサ、若しくは１８０アミノ酸を超える長いスペーサ、及び／又は
（ｃ）配列番号８１～８５のいずれかに対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＣＡＲ。

【請求項9】

前記スペーサ／ヒンジが、中程度のスペーサを含み、前記スペーサが、配列番号８４に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。

【請求項10】

前記ＣＡＲが、配列番号８８に対して少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項11】

前記がん細胞が、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項12】

前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、非がん細胞上で発現されるＨＥＲ２に応答しないか、又は低レベルの応答を有する、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項13】

前記がん抗原特異的応答が、細胞溶解及びサイトカイン産生を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項14】

前記ＣＡＲが、アミノからカルボキシの方向に前記ＶＨドメイン、続いて前記ＶＬドメインを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本出願は、２０２２年４月８日に出願された米国特許仮出願第６３／３２９，２８７号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

（配列表の参照による組み込み）
配列表タイトル１８４１４３－６４０６０１＿ＳＬ．ｘｍｌは、２０２３年４月１日に作成され、サイズが８７，７１４バイトであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

（発明の分野）
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関する。より具体的には、本開示は、がん治療において使用するための固形腫瘍標的化キメラ抗原受容体を開発するための戦略に関する。

【背景技術】

【0004】

がん細胞は、蓄積された遺伝的及び後成的異常を通じて正常組織から出現し、正常細胞のタンパク質と量及び質が異なるタンパク質を産生することによって正常細胞からがん細胞自体を分化する。しかしながら、有効な標的化がん治療のための腫瘍抗原として利用され得る腫瘍特異的細胞表面発現膜タンパク質は、データが示しているように、これらの腫瘍細胞表面発現膜タンパク質が正常組織上でも発現され得る可能性が高いため、ほとんど同定されていない。したがって、固形腫瘍においてキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）を介してこれらの分子を標的化することは、正常組織に対する重度の毒性の固有のリスクを伴う。

【発明の概要】

【0005】

標的化がん治療を開発し、腫瘍標的化精度、オフターゲット毒性、及び固形腫瘍に対する腫瘍外効果などの問題に対処するために、腫瘍特異的かつ機能的に改善されたＣＡＲの必要性がある。

【0006】

一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ヒト上皮成長因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（heavy chain complementary determining region1、Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（heavy chain complementary determining region2、Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（heavy chain complementary determining region3、Ｈ－ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変（heavy chain variable、ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）配列番号４（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（light chain complementary determining region1、Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（light chain complementary determining region2、Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（light chain complementary determining region3、Ｌ－ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変（light chain variable、ＶＬ）ドメインと、を含む、外部ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0007】

ＣＡＲのいくつかの実施形態では、抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、（ｂ）配列番号８（ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ若しくはＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（single chain variable fragment、ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択的に、リンカーが、配列番号９（ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ）、配列番号１０（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）、配列番号１１（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、若しくは配列番号１２（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、（ｄ）配列番号１３（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ）若しくは配列番号１４（ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ）に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１３及び１４の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は（ｅ）ヒト化されている。

【0008】

ＣＡＲのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、（ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、（ｂ）それぞれ配列番号３７～５９によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＣＡＲの様々な実施形態では、内部ドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、内部ドメインドメインが、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、又はＮＫｐ４６－２Ｂ４の形態のうちのいずれか１つにおいて、融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む。

【0009】

ＣＡＲの様々な実施形態では、膜貫通ドメインが、（ａ）ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチド、（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄの膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びその直結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である。

【0010】

ＣＡＲの様々な実施形態では、外部ドメインが、（ａ）シグナルペプチド、及び／又は（ｂ）スペーサ／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、スペーサ／ヒンジが、（ａ）ＩｇＧ４スペーサ、ＣＤ２８スペーサ、ＣＤ８スペーサ、ＣＨ３スペーサ、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサ、若しくはそれらの任意の組み合わせ、（ｂ）約１０～約８０アミノ酸の短いスペーサ、８０超～約１８０アミノ酸の中程度のスペーサ、若しくは１８０アミノ酸を超える長いスペーサ、及び／又は（ｃ）配列番号８１～８５のいずれかに対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、スペーサ／ヒンジが、中程度のスペーサを含み、スペーサが、配列番号８４に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。

【0011】

ＣＡＲの様々な実施形態では、ＣＡＲが、配列番号８８に対して少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。ＣＡＲの様々な実施形態では、がん細胞が、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である。ＣＡＲの様々な実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、非がん細胞上で発現されるＨＥＲ２に応答しないか、又は低レベルの応答を有する。ＣＡＲの様々な実施形態では、がん抗原特異的応答が、細胞溶解及びサイトカイン産生を含む。

【0012】

別の態様では、本発明は、本明細書に説明されるＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。更に別の態様では、本発明は、本明細書に説明されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0013】

本明細書で提供される組成物及び方法の様々な目的及び利点は、例示及び例として本発明の特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】ＨＥＲ２発現腫瘍細胞及びＨＥＲ２を発現する非腫瘍原性正常細胞に対する、短いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの細胞溶解効力及び特異性を示す。

【図1B】ＨＥＲ２発現腫瘍細胞及びＨＥＲ２を発現する非腫瘍原性正常細胞に対する、短いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの細胞溶解効力及び特異性を示す。

【図2A】ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍細胞及びＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性細胞に応答した、短いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲで形質導入されたドナーＴ細胞における炎症性サイトカインＩＦＮγの産生を示す。

【図2B】ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍細胞及びＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性細胞に応答した、短いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲで形質導入されたドナーＴ細胞における炎症性サイトカインＩＦＮγの産生を示す。

【図3A】ＨＥＲ２発現腫瘍細胞及びＨＥＲ２を発現する非腫瘍原性正常細胞に対する、長いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの細胞溶解効力及び特異性を示す。

【図3B】ＨＥＲ２発現腫瘍細胞及びＨＥＲ２を発現する非腫瘍原性正常細胞に対する、長いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの細胞溶解効力及び特異性を示す。

【図4A】ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍細胞及びＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性細胞に応答した、長いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲで形質導入されたドナーＴ細胞における炎症性サイトカインＩＦＮγの産生を示す。

【図4B】ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍細胞及びＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性細胞に応答した、長いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲで形質導入されたドナーＴ細胞における炎症性サイトカインＩＦＮγの産生を示す。

【図5A】ＨＥＲ２発現腫瘍細胞及びＨＥＲ２を発現する非腫瘍原性正常細胞に対する、短い又は中程度のスペーサを有する４Ｄ５ベース又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの細胞溶解効力及び腫瘍特異性を示す。

【図5B】ＨＥＲ２発現腫瘍細胞及びＨＥＲ２を発現する非腫瘍原性正常細胞に対する、短い又は中程度のスペーサを有する４Ｄ５ベース又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの細胞溶解効力及び腫瘍特異性を示す。

【図6】追加のＨＥＲ２^{Ｌｏｗ／＋}正常細胞株に対する中程度のスペーサを有するＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）ベースのＣＡＲの腫瘍特異性を示す。

【図7】ＨＥＲ２－ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＮＦκＢレポーターマーカー発現によって示されるＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍細胞及びＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性細胞に応答して活性化されたことを示す。ＨＥＲ２－ＣＡＲは、４Ｄ５ベース又はＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）ベースのいずれかである。

【図8】ＣａｓＭａｂ２５０に基づくＣＡＲの最適化された細胞外ドメインとともに、複数の細胞内シグナル伝達ドメイン構成の評価を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

定義
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0016】

本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。

【0017】

本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１又は１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。

【0018】

代替（例えば、「又は」）の使用は、代替の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。

【0019】

「及び／又は」という用語は、代替の一方又は両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。

【0020】

本明細書で使用されるとき、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％もの量で変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの、およそ、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。

【0021】

本明細書で使用されるとき、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」又は「本質的に同じ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さとほぼ同一である、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。

【0022】

本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換可能に使用され、細胞集団又は培養培地などの組成物を記載するために使用されるとき、例えば、特定の物質又はその供給源の、９５％を含まない、９６％を含まない、９７％を含まない、９８％を含まない、９９％を含まないなど、又は従来の手段で測定して検出できないなどのように、特定の物質又はその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の特定の成分又は物質を「含まない」又は「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分又は物質が（１）任意の濃度で組成物に含まれない、又は（２）機能的に不活性な低い濃度で組成物に含まれることも意味する。同様の意味が、「存在しない」という用語に適用され得、組成物の特定の物質又はその供給源が存在しないことを指す。

【0023】

本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含むこと（comprising）」は、述べられたステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるであろう。特定の実施形態では、「含む（include）」、「有する」、「含む（contain）」、及び「含む（comprise）」という用語は、同義的に使用される。

【0024】

「～からなる（consisting of）」とは、「～からなる」という語句に続く全てのものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。

【0025】

「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指定された活性又は動作を妨害しないか、又はそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は必要に応じたものではなく、列挙された要素の活性又は動作に影響するか否かに応じて存在し得るか、又は存在し得ないことを示す。

【0026】

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特質、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を参照しているとは限らない。更に、特定の特質、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わせることができる。

【0027】

「エクスビボ」という用語は、概して、好ましくは自然条件の変化を最小限に抑えて、生体外の人工環境内の生体組織内又は生体組織上で行われる実験又は測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生体から採取され、通常無菌条件下で、典型的には数時間又は約２４時間まで、しかしながら状況に応じて最大４８時間若しくは７２時間以上を含む、実験装置で培養される生細胞又は組織を含む。ある特定の実施形態では、そのような組織又は細胞は、収集及び凍結され得、エクスビボ処理のために後に解凍され得る。生細胞又は組織を使用して数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「インビトロ」であると考えられるが、ある特定の実施形態では、この用語はエクスビボと互換可能に使用され得る。

【0028】

「インビボ」という用語は、概して、生体内部で起こる活動を指す。

【0029】

本明細書で使用されるとき、「コードすること」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードしていると称され得る。

【0030】

「構築物」は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子又は分子の複合体を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、外来遺伝物質の標的細胞への送達又は移入を誘導することができ、標的細胞で複製及び／又は発現することができる任意の核酸構築物を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状又は環状分子であり得る。ベクターは、組み込まれてもよく、又は組み込まれなくてもよい。ベクターの主なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0031】

本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、参照分子が宿主細胞に導入されるか、又は宿主細胞に対して非天然であることを意味することを意図している。分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、又は非染色体の遺伝物質、例えば、プラスミドとして導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照分子又は活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用されるとき、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。

【0032】

「組み込み」とは、構築物の１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位又は「組み込み部位」で細胞の染色体又はミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「組み込み」という用語は、組み込み部位での内因性配列又はヌクレオチドの欠失を伴うか又は伴わない、構築物の１つ以上の外因性配列又はヌクレオチドの挿入を含むプロセスを更に指す。

【0033】

本明細書で使用されるとき、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子又はポリヌクレオチドは、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に見出されるポリペプチド）又はその断片、バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの突然変異体）又はその断片、操作されたポリペプチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペプチド、造影用マーカー、選択マーカーなどをコードし得る。

【0034】

本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）から構成され、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンはウラシル（Ｕ）である。ポリヌクレオチドには、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、トランスファＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが含まれ得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。

【0035】

本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用されるとき、これらの用語は、例えば、当該技術分野では概してペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短い鎖と、概して当該技術分野でポリペプチド又はタンパク質と称される長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。

【0036】

本明細書及び本出願全体で使用されるように、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較と２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当該技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して実行され得る。

【0037】

本明細書で使用されるとき、「サブユニット」という用語は、本明細書で使用されるとき、タンパク質複合体の各別個のポリペプチド鎖を指し、各別個のポリペプチド鎖は、それ自体で安定な折り畳み構造を形成することができる。多くのタンパク質分子は、２つ以上のサブユニットから構成され、ここで、アミノ酸配列は、各サブユニットについて同一であるか、又は類似しているか、又は完全に異なるかのいずれかであり得る。例えば、ＣＤ３複合体は、ＣＤ３α、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、及びＣＤ３ζサブユニットから構成され、これらは、ＣＤ３ε／ＣＤ３γ、ＣＤ３ε／ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζ二量体を形成する。単一のサブユニット内で、ポリペプチド鎖の連続した部分は、「ドメイン」と呼ばれるコンパクトで局所的な半独立単位に折り畳まれることが多い。多くのタンパク質ドメインは、ドメインの共通機能に寄与する、サブドメインとも呼ばれる独立した「構造サブユニット」を更に含み得る。したがって、本明細書で使用されるとき、「サブドメイン」という用語は、より大きなドメインの内側のタンパク質ドメイン、例えば、細胞表面受容体の外部ドメイン内の結合ドメイン、又は細胞表面受容体の内部ドメインの刺激ドメイン若しくはシグナル伝達ドメインを指す。

【0038】

「作動可能に連結された（operably-linked）」又は「作動可能に連結された（operatively linked）」は、「作動可能に接続された（operably connected）」又は「作動可能に接続された（operatively connected）」と交換可能であり、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列（又は複数のドメインを有するポリペプチド中のアミノ酸）の会合を指す。例えば、プロモータは、そのコード配列又は機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合、コード配列又は機能的ＲＮＡと作動可能に連結している（すなわち、コード配列又は機能的ＲＮＡがプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。更なる例として、受容体結合ドメインは、リガンドへの受容体の結合が当該結合に応答するシグナルを変換するように、細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に接続され得る。

【0039】

「融合タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、本明細書で使用されるとき、別々のタンパク質をコードする配列をコードする２つ以上の部分的又は完全なポリヌクレオチドを接合するための遺伝子操作を介して作製されるタンパク質であり、これらの接合されたポリヌクレオチドの発現は、元のタンパク質又はその断片の各々に由来する機能的特性を有する単一のペプチド又は複数のポリペプチドを生じる。融合タンパク質における異なる供給源の２つの隣接するポリペプチド間に、リンカー（又はスペーサ）ペプチドを付加することができる。

【0040】

本明細書で使用されるとき、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を改変、関与、阻害、活性化、低減、又は増大させる任意の分子を指す。「シグナル伝達」とは、細胞内で最終的に生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形態での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当該技術分野で周知であり、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存経路、及びＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。

【0041】

本明細書で使用されるとき、「特異的」又は「特異性」という用語は、非特異的又は非選択的な結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば受容体又はエンゲージャの能力を指すために使用され得る。

【0042】

「リガンド」という用語は、標的分子と複合体を形成して、標的上の部位に結合することによってシグナルを生成する物質を指す。リガンドは、標的に特異的に結合することができる天然又は人工物質であってもよい。リガンドは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体複合体、コンジュゲート、核酸、脂質、多糖、単糖、小分子、ナノ粒子、イオン、神経伝達物質、又は標的に特異的に結合することができる任意の他の分子実体の形態であってもよい。リガンドが結合する標的は、タンパク質、核酸、抗原、受容体、タンパク質複合体、又は細胞であり得る。標的に結合してその機能を変化させ、シグナル伝達応答を誘発するリガンドは、「アゴニスト（agonistic）」又は「アゴニスト（agonist）」と呼ばれる。標的に結合し、シグナル伝達応答を遮断又は低減するリガンドは、「アンタゴニスト性」又は「アンタゴニスト」である。

【0043】

「抗体」という用語は、目的の特定の標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位を含有する抗体及び抗体断片を包含し、標的は、抗原、又は特定の抗体と相互作用することができる受容体であり得る。「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子又はその抗原結合部分若しくは受容体結合部分を含むが、これらに限定されない。抗体が結合する抗原若しくは受容体の特定の断片若しくは部分、又は概して標的は、エピトープ又は抗原決定基として知られている。抗体という用語はまた、天然抗体及びそのバリアント、天然抗体及びそのバリアントの断片、ペプチボディ及びそのバリアント、並びに一本鎖抗体及びその断片を含む、抗体又はその特定の断片若しくは部分の構造及び／又は機能を模倣する抗体模倣体を含むが、これらに限定されない。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇＧ、単一可変新抗原受容体（variable new antigen receptor、ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（single-domain antibody、ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体若しくは多量体抗体、又はこれらの抗体断片であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖抗原結合断片（single chain fragment variable、ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、一本鎖Ｆａｂ（single chain Fab、ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（disulfide stabilized Fv、ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（single-domain antigen binding fragment、ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（heavy-chain-only antibody、ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれる。

【0044】

腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ＣＡＲは、抗原認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを一般に含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び／又はスペーサを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、１つ以上のシグナル伝達ドメインを含み、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の活性化又は機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患又は病原体と関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液体腫瘍又は固形腫瘍であってもよい。

【0045】

ある特定の実施形態では、抗原認識領域／ドメインは、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体断片を含む。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）_２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれる。

【0046】

本発明の様々な態様は、腫瘍関連抗原に結合する抗原認識領域を含むＣＡＲを提供する。様々な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞表面ＨＥＲ２抗原に特異的である。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２－ＣＡＲの外部ドメインの抗原認識ドメインが、配列番号１（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、配列番号４（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、アミノからカルボキシの方向に重鎖ＣＤＲ、続いて軽鎖ＣＤＲ（Ｈ／Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、アミノからカルボキシの方向に重鎖可変ドメイン、続いて軽鎖可変ドメインを含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号７によって表される例示的な配列と比較したときに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有するＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号７に対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号７に対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号８によって表される例示的な配列と比較したときに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有するＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号８に対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号８に対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
配列番号７
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号８
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ

【0049】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む、Ｎ末端からＣ末端への配向を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なる。いくつかの実施形態では、リンカーが、配列番号９～１２によって表される例示的な配列と比較したときに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号９～１２のいずれかに対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号９～１２のいずれかに対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号９～１２のいずれかのアミノ酸配列を含む。
配列番号９
ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ
配列番号１０
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ
配列番号１１
ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１２
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

【0050】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号１４によって表される例示的な配列と比較したときに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、配列番号１３及び１４の各々は、長さ及び／又は配列が異なり得るリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１３又は１４に対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１３又は１４に対して少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
配列番号１３
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１４
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ

【0051】

様々な実施形態では、本明細書に説明されるＣＡＲは、少なくとも外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの内部ドメインは、抗原結合時に活性化される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ内部ドメインのいくつかの実施形態では、最適化された機能性のために、１つ以上の共刺激ドメイン（多くの場合「追加のシグナル伝達ドメイン」と称される）が更に含まれる。ＣＡＲ設計に好適な例示的なシグナル伝達タンパク質としては、限定されるものではないが、２Ｂ４、４－１ＢＢ（本出願全体を通して例示的な融合構築物におけるＣＤ１３７又は「４１ＢＢ」）、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、ＣＤ３ζ又はＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、及びＣＤ８が挙げられる。タンパク質の膜貫通配列及び細胞質配列を含む例示的なシグナル伝達タンパク質の説明は、以下に提供され、表１Ａに更に提供される。

【0052】

【表1-1】

【0053】

【表1-2】

【0054】

【表1-3】

【0055】

【表1-4】

【0056】

提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、ＣＡＲの内部ドメインが、それぞれ、配列番号３７～５９によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも第１のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかに対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメインの一部分のみを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲシグナル伝達ドメインのために選択される細胞質ドメインの一部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、ＹｘｘＭモチーフ、ＴｘＹｘｘＶ／Ｉモチーフ、ＦｃＲγ、ヘミ－ＩＴＡＭ、及び／又はＩＴＴ様モチーフに対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0057】

提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの内部ドメインが、それぞれ、配列番号３７～５９によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のシグナル伝達ドメインを更に含み、第２のシグナル伝達ドメインが、第１のシグナル伝達ドメインとは異なる。いくつかの実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかに対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0058】

提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、第１及び第２のシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの内部ドメインが、それぞれ、配列番号３７～５９によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第３のシグナル伝達ドメインを更に含み、第３のシグナル伝達ドメインが、第１及び第２のシグナル伝達ドメインとは異なる。いくつかの実施形態では、第３のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかに対して少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７～５９のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ内部ドメインのシグナル伝達ドメインを設計するのに好適なシグナル伝達タンパク質は、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、又はＣＴＬＡ－４を更に含む。

【0059】

１つのシグナル伝達ドメインのみから構成される内部ドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、内部ドメインは、限定されるものではないが、ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８Ｈ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＤＡＰ１２、又はＤＡＰ１０を含む、タンパク質の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0060】

２つの異なるシグナル伝達ドメインから構成される内部ドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、内部ドメインが、限定されるものではないが、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、２Ｂ４－ＣＤ３ζ又は２Ｂ４－ＣＤ３ζ１ＸＸ、以下同様）、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、又はＮＫｐ４６－２Ｂ４を含む形態で、融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む。

【0061】

３つの異なるシグナル伝達ドメインから構成される内部ドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、内部ドメインは、限定されるものではないが、２Ｂ４－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＩＬ２１Ｒ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－４１ＢＢ－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０、又はＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸを含む形態で融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインが、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、又はＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域の完全長又は一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、（ａ）それぞれ、配列番号１５、１７～２５、３０～３６によって表される、２Ｂ４、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８、又は（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄの膜貫通領域の完全長又は一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１５、１７～２５、３０～３６のいずれかに対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１５、１７～２５、３０～３６のいずれかに対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１５、１７～２５、３０～３６のいずれかのアミノ酸配列を含む。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びその直結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来である。ＣＡＲのいくつかの他の実施形態では、膜貫通ドメイン及び直結されるシグナル伝達ドメインは、異なるタンパク質由来である。

【0063】

本出願の表１Ｂは、膜貫通ドメイン（transmembrane domain、ＴＭ）及び内部ドメインを含むＣＡＲ構築物の非限定的な例を提供する（ＴＭ－（内部ドメイン）として標識される）。一般に、例示されたＣＡＲ構築物は、各々、膜貫通ドメインと、１つ以上のシグナル伝達タンパク質の細胞質領域に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含む。概して、膜貫通ドメインは、生体膜（例えば、細胞又は細胞小胞の膜）のリン脂質二重層などの膜において熱力学的に安定である三次元タンパク質構造である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、単一のアルファヘリックス、いくつかの膜貫通アルファヘリックスの安定な複合体、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータヘリックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。様々な実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜内にある「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」の全て又は一部分を含む。本明細書で使用されるとき、「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」は、膜に及び／又は膜内に位置するタンパク質である。本発明の実施形態のＣＡＲに含まれる膜貫通ドメインを提供するのに好適である膜貫通タンパク質の例としては、限定されるものではないが、受容体、リガンド、免疫グロブリン、グリコホリン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲに含まれる膜貫通ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＳ１、ＣＴＬＡ－４、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、Ｔ細胞受容体ポリペプチド（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、又はそれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ内部ドメインに含まれる１つ以上のシグナル伝達ドメインは、ＴＭが由来する同じ又は異なるタンパク質に由来する。表１Ｂに示されるように、ＣＡＲの膜貫通ドメインを表す部分に下線が引かれ、内部ドメインに含まれるドメインは、括弧「（）」内に表示され、ＴＭ及びシグナル伝達ドメインの各々は、ドメイン配列が由来するシグナル伝達タンパク質の名称によって指定される。実施形態では、各ＴＭ又はシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、指定されたシグナル伝達タンパク質の対応する膜貫通又は細胞質領域の完全長又は一部分に対して約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性であり得る。本明細書で提供される膜貫通ドメイン及び内部ドメインを含む例示的なＣＡＲ構築物としては、限定されるものではないが、ＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ）、ＣＤ８－（４１ＢＢ－ＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＤ２８－（ＣＤ２８－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８－（ＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ）、ＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ）、ＤＡＰ１０－（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－ＣＤ２－ＤＡＰ１０）、ＣＤ２－（ＣＤ２－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ）、及びＣＳ１－（ＣＳ１－ＣＤ３ζ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及び内部ドメインを含む上記の例示的なＣＡＲ構築物の各々が、表１Ｂの配列番号６０～７８の各々によって表される配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６０～７８のいずれかに対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６０～７８のいずれかに対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６０～７８のいずれかのアミノ酸配列を含む。表１Ｂに提供される各構築物についての例示的な配列は、配列の左側の例示の対応する領域のフォーマットに一致するようにフォーマットされたテキスト（すなわち、下線付き、通常、又は太字テキスト）を有する。表１Ｂの例示的な構築物のほとんどについて、ＴＭは、第１の配列領域であるが、構築物は、ＴＭの前に細胞外ドメインを含み得（例えば、表１Ｂの構築物７参照）、ＴＭと同じ又は異なるタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ内部ドメインに含まれる２つ以上のシグナル伝達ドメインは、スペーサ又はリンカーなどの１つ以上の追加の配列によって分離され得る。

【0065】

【表2-1】

【0066】

【表2-2】

【0067】

いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び／又はスペーサ／ヒンジを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間にスペーサ／ヒンジが存在するが、いくつかの他の実施形態では、そのようなスペーサ／ヒンジは必要とされない。例示的なＮ末端シグナルペプチドとしては、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡ（配列番号７９、ＣＤ８ａｓｐ）若しくはＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲ（配列番号８０、ＩｇＫｓｐ）、又は当該技術分野で公知の任意のシグナルペプチド配列若しくはその機能的バリアントが挙げられる。ＣＡＲに含まれ得る例示的なスペーサは、当該技術分野において一般的に既知であり、ＩｇＧ４スペーサ、ＣＤ２８スペーサ、ＣＤ８スペーサ、又は２つ以上のスペーサの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。スペーサの長さもまた、約１５アミノ酸（ａ．ａ．）～約３００アミノ酸以上まで変化し得る。本出願では、説明を容易にするために、約８０アミノ酸未満、例えば、１０～８０アミノ酸のスペーサは、短いと考えられ、約８０～１８０アミノ酸のスペーサは、中程度と考えられ、１８０アミノ酸を超えるスペーサは、長いと考えられる。非限定的な例示的スペーサペプチドとしては、配列番号８１～８５のいずれかに対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列によって表されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサペプチドは、配列番号８１～８５のいずれかに対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサペプチドは、配列番号８１～８５のいずれかに対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサペプチドは、配列番号８１～８５のいずれかのアミノ酸配列を含む。
配列番号８１
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
（３９アミノ酸）
配列番号８２
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬ
（８８アミノ酸）
配列番号８３
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ
（８９アミノ酸）
配列番号８４
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（１２９アミノ酸）
配列番号８５
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（２２９アミノ酸）

【0068】

一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＣＤ２８由来の共刺激ドメインと、配列番号６３に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むシグナル伝達ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、配列番号６３に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、配列番号６３に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。更なる実施形態では、ＣＤ２８由来の共刺激ドメイン及びＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８由来のヒンジドメイン（又は「スペーサ」）及び膜貫通ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、ＣＡＲは、配列番号８６に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８６に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み、スペーサは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８６に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列を含み、スペーサは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８６に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列を含み、スペーサは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。

【0069】

【表3】

【0070】

別の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ由来の膜貫通ドメインと、２Ｂ４由来の共刺激ドメインと、配列番号８７に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列によって表される天然又は改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８７に対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８７に対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。ＮＫＧ２Ｄ由来の膜貫通ドメイン、２Ｂ４由来の共刺激ドメイン、及び天然又は改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、ヒンジを更に含み得る。

【0071】

【表4】

【0072】

一実施態様では、本明細書に提供されるＣＡＲは、配列番号８８に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含み、外部ドメイン中のリンカー及び外部ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８８に対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含み、外部ドメイン中のリンカー、及び外部ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８８に対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含み、外部ドメイン中のリンカー、及び外部ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、固形腫瘍の細胞に特異的なＨＥＲ２抗原を認識する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、肺がん、食道がん、唾液腺がん、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、又は頭頸部がんを含む、腫瘍のＨＥＲ２抗原を認識する。更にいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、腫瘍のＨＥＲ２抗原を認識し、かつ非がん細胞又は正常細胞上で発現されるＨＥＲ２に応答しないか、又は低レベルの応答を有する。

【0073】

【表5】

【0074】

非限定的なＣＡＲ戦略としては、一対の細胞内ドメインの二量体化によるヘテロ二量体条件的活性化ＣＡＲ（例えば、米国特許第９，５８７，０２０号を参照されたい）、スプリットＣＡＲ、ＣＡＲを生成するための抗原結合、ヒンジ、及び内部ドメインの相同組換え（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０１８３４０７号を参照されたい）、それぞれ抗原結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインに接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にする多重鎖ＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１３４１４２号を参照されたい）、二重特異性抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第９，４４７，１９４号を参照）、又は同じ若しくは異なる抗原若しくはエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第８，４０９，５７７号を参照）、又はタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２）；誘導性ＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００５８８５７号、及び同第２０１７／０１６６８７７号を参照されたい）、スイッチ可能なＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２１９９７５号を参照されたい）、並びに当該技術分野で既知の任意の他の設計が更に含まれる。

【0075】

いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモータに作動可能に連結されている。プロモータは誘導性又は構成的であり得、時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的であり得る。本明細書に開示される方法に好適な構成的プロモータには、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）、伸長因子１α（elongation factor 1α、ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（phosphoglycerate kinase、ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサ／ニワトリβ－アクチン（enhancer/chicken β-actin、ＣＡＧ）、及びユビキチンＣ（ubiquitin C、ＵＢＣ）プロモータが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモータはＣＡＧである。ＣＡＲ構築物は、発現のために、プラスミドベクター（例えば、ｐＡｌ－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクター）を使用して、初代Ｔ細胞などの細胞に導入され得る。細胞への標的化挿入を導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガヌクレアーゼ（zinc-finger nucleases、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nucleases、ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ、クラスタ化等間隔短鎖回分リピート）システムが含まれるが、これらに限定されない。

【0076】

実施例
次の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。

【0077】

実施例１－ＣＡＲ候補の設計及び機能的プロファイリング
ＨＥＲ２に特異的なＨＥＲ２がん特異的モノクローナル抗体（cancer-specific monoclonal antibody、ＣａｓＭａｂ）のＣＤＲを含有する様々なキメラ抗体受容体（ＣＡＲ）構築物を設計し、形質導入し、ＣＡＲの特性評価及び機能の決定に好適な、初代Ｔ細胞を含む、細胞モデルで発現させた。ＣＡＲ設計における変数としては、限定されるものではないが、可変領域配向、リンカー配列及び／若しくは長さ、スペーサ配列及び／若しくは長さ、内部ドメインシグナル伝達及び共刺激ドメインとの適合性が挙げられ、これらは全て、限定されるものではないが、発現レベル、特異性及び有効性を含むＣＡＲ機能性プロファイルに直接的又は間接的に影響し、これらは、ＣＡＲ設計を通して適切に定義及び調整される必要がある。

【0078】

外部ドメイン内に異なる長さのスペーサを組み込む候補ＣＡＲの群（例えば、約１０～約８０アミノ酸の短いスペーサ、８０超～約１８０アミノ酸の中程度のスペーサ、若しくは１８０アミノ酸を超える長いスペーサ）、並びに／又は異なる配向のＶＨ及びＶＬを構築し、がん抗原特異的応答分析のために発現させた。同じがん特異的抗原を標的化する別個のＣＡＲ構築物の細胞溶解活性を比較することによって、以下のアッセイを実施して、どの構築物、より具体的には、どの外部ドメインの構成（すなわち、スペーサ長さ）及び内部ドメイン構成要素が、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的なシグナル伝達ドメイン応答を付与するかを決定した。

【0079】

短いスペーサ（例えば、８０アミノ酸未満であるＣＤ２８）及びＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ細胞内シグナル伝達ドメインを有する既知のＨＥＲ２抗体、ハーセプチン由来のＨＥＲ２結合ドメインを有する４Ｄ５－ＣＡＲを、新規ＣａｓＭａｂ抗体に基づく候補ＨＥＲ２－ＣＡＲとの比較のための対照として使用した。ＣａｓＭａｂ２１４のＶＨドメイン（配列番号８９－－ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＦＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＲＮＫＶＦＬＫＩＴＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＶＶＡＴＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ）及びＶＬドメイン（配列番号９０－－ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＴＬＭＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＮＩＨＰＶＥＥＤＤＶＡＭＹＦＣＱＱＳＲＫＶＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬ）に基づいて、同じ短いスペーサ及び細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣａｓＭａｂ２１４－ＣＡＲ（図では２１４－ＣＡＲ又は２１４として省略される）を設計及び構築したが、一方、同じ構成のＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲ（図では２５０－ＣＡＲ又は２５０として省略される）を、本出願に開示されるＣａｓＭａｂ２５０抗体のＣＤＲ及びＶＨ／ＶＬに基づいて設計した。

【0080】

ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）リアルタイム細胞分析を介して、上記ＣＡＲの細胞溶解抗力及び特異性を評価した。１０^４個のＨＥＲ２発現標的細胞（ＳＫＯＶ３、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ１０ａ、又はＭｅｔ５ａ）をプレーティングした２４時間後に、ＣＡＲ発現エフェクター細胞を、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、高いＨＥＲ２発現レベル（ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ）を有する腫瘍細胞ＳＫＯＶ３及びＳＫＢＲ３に対して（図１Ａ）、又は５：１のＥ：Ｔ比で、正常／非腫瘍原性ＨＥＲ２発現細胞ＭＣＦ１０ａ又はＭｅｔ５ａ（ＨＥＲ２^＋）に対して（図１Ｂ）、追加した。標的細胞におけるＨＥＲ２発現のレベルを、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって決定した。ＩＨＣスコアが高いほど、ＨＥＲ２細胞表面抗原の発現が高くなる。３＋のＩＨＣスコアは、ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈとして標識され、２＋のＩＨＣスコアは、ＨＥＲ２^＋として標識され、中程度のＨＥＲ２発現体を表すが、一方、１＋のＩＨＣスコアは、ＨＥＲ２^Ｌｏｗとして標識され、これは、低ＨＥＲ２発現体を表す。細胞指数を監視し、エフェクター添加に対して正規化し、細胞溶解パーセントをＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ（商標）で計算した。

【0081】

図１Ａに示されるように、４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲ発現エフェクター細胞は、全て、ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ卵巣腫瘍（ＳＫＯＶ３）及び乳房腫瘍（ＳＫＢＲ３）細胞株細胞を認識及び排除し、ＣＡＲ発現エフェクター細胞を添加してから４８時間以内に約１００％の細胞溶解パーセントに到達した。評価された全ての初代ドナーにわたって、ＣａｓＭａｂ２１４ベース及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲによる抗腫瘍効力は、ドナー適合４Ｄ５ベースのＣＡＲと少なくとも同程度に迅速であるか、又はほとんどの場合、ドナー適合４Ｄ５ベースのＣＡＲよりも最大１２時間、腫瘍株の標的化及び排除に先行し、ＣａｓＭａｂ２１４－及びＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲの堅牢な抗腫瘍潜在性を強調した。

【0082】

非腫瘍原性／正常ＨＥＲ２^＋細胞株ＭＣＦ１０ａ（乳腺）及びＭｅｔ５ａ（中皮）に関して、４Ｄ５－ＣＡＲ発現ドナーＴ細胞は、堅牢な細胞溶解効力を実証し、正常胸部細胞株細胞（ＭＣＦ１０ａ）の１００％及び正常中皮細胞株細胞（Ｍｅｔ５ａ）の約３０～５０％を無作為かつ迅速に排除し、ＨＥＲ２抗体、ハーセプチンに基づく４Ｄ５－ＣＡＲのがん細胞標的化特異性の欠如を示した。したがって、４Ｄ５ベースのＨＥＲ２－ＣＡＲは、標的化抗原の共有発現を有する正常組織への直接攻撃から結果的に生じる、「オンターゲット腫瘍外」問題を提示した。一方、ＣａｓＭａｂ２１４ベース及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲは、５：１のＥ：Ｔ比であっても、正常乳腺ＭＣＦ１０ａ株に対して細胞溶解効力を表示しなかったが、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞株細胞に対する効力を有する。ＣａｓＭａｂ２１４ベース及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲによる正常中皮Ｍｅｔ５ａ細胞では限られたレベルのドナー依存性認識が観察されたが、それらの細胞溶解効力は、４Ｄ５ベースのＣＡＲの効力と比較して、非腫瘍原性正常細胞に反応するときに有意に低減された。また、抗腫瘍効力は、がん細胞特異的ＣａｓＭａｂ ＨＥＲ２抗体に基づく２１４－ＣＡＲと２５０－ＣＡＲとの間でほぼ同様であったが、ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲは、正常中皮Ｍｅｔ５ａ細胞株の最も低い認識を実証したことにも留意されたい。全体として、これらのデータは、ＣａｓＭａｂ由来ＣＡＲが、広く知られ使用されているＨＥＲ２抗体、ハーセプチンに基づく４Ｄ５－ＣＡＲと比較して、正常／非腫瘍原性細胞株に対するＨＥＲ２の限定された認識を有する、堅牢な抗腫瘍ＨＥＲ２標的化効力を有することを実証する。

【0083】

次いで、短いスペーサを有する４Ｄ５ベース、ＣａｓＭａｂ２１４ベース、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲで形質導入されたドナーＴ細胞における、ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍細胞（ＳＫＯＶ３及びＳＫＢＲ３、図２Ａ）、及びＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性細胞（ＭＣＦ１０ａ、Ｍｅｔ５ａ、及びケラチノサイトＨａＣａｔ細胞株、図２Ｂ）に応答したサイトカイン産生を評価した。５×１０^４個の標的細胞（ＳＫＯＶ３、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ１０Ａ、ＨａＣａｔ、又はＭｅｔ５ａ）をプレーティングした約２４時間後、ＣＡＲ形質導入細胞を１：１のＥ：Ｔ比で添加した。約４８時間の共培養後、ＩＦＮγ産生評価のために上清を収集した。評価した全てのドナーについて、腫瘍又は非腫瘍原性ＨＥＲ２発現細胞のいずれかを標的化する４Ｄ５－ＣＡＲを発現する細胞によるＩＦＮγの相対産生は、ＣａｓＭａｂ２１４又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの産生よりも実質的に大きかった（図２Ａ及び図２Ｂ）。最も注目すべきことに、４Ｄ５－ＣＡＲ形質導入細胞はまた、正常細胞共培養に応答して、約３００ｐｇ／ｍｌ～約４５００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγを産生し、正常細胞上に発現されたＨＥＲ２に対する有意な反応性を実証した。一方、ＣａｓＭａｂ２１４及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞は、全てのドナー及び評価された正常細胞株にわたって実質的により少ないＩＦＮγを産生し、はるかに少ない「オンターゲット腫瘍外」効果を示した。特に、ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、正常なＨＥＲ２発現細胞に曝露されたときに、検出可能なＩＦＮγを産生せず（約５ｐｇ／ｍｌの検出下限より少ない）、これは、ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの高度に特異的な腫瘍抗原選択性を更に強調する。

【0084】

長いスペーサを有する４Ｄ５、ＣａｓＭａｂ２１４、又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲ（例えば、１８０アミノ酸超を有するＩｇＧ４ヒンジ及びＣＨ２／３ドメイン）を構築し、上記と同じ方法を使用して、細胞溶解効力及び腫瘍細胞特異性について評価した。ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ卵巣（ＳＫＯＶ３）及び乳腺（ＳＫＢＲ３）腫瘍細胞株に対するとき、短いスペーサを有するＣＡＲと比較して、長いスペーサを有するＨＥＲ２－ＣＡＲで同様の観察がなされた。図３Ａに示されるように、全ての評価された長いスペーサＣＡＲは、７２～９６時間の間に最大効力に到達し、ＣａｓＭａｂ２１４及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲは、開始及び最大化の両方において４Ｄ５－ＣＡＲよりも速く細胞溶解効力を伝達した。

【0085】

非腫瘍原性／正常ＨＥＲ２^＋細胞株ＭＣＦ１０ａ（乳腺）及びＭｅｔ５ａ（中皮）に対するとき、長いスペーサを有する４Ｄ５－ＣＡＲは、堅牢な細胞溶解効力を実証し、正常乳腺ＭＣＦ１０ａの最大１００％及び正常中皮Ｍｅｔ５ａ細胞株の最大７５％を除去した。長いスペーサを有する２１４－ＣＡＲ及び２５０－ＣＡＲについては、４Ｄ５と比較して効力及び選択性の差がドナー間で観察されたが、スペーサを長いスペーサに延長することは、ＨＥＲ２発現正常／非腫瘍細胞に対する実質的なレベルの反応性を回復させ、これは、図１Ｂと比較した図３Ｂを参照されたい。しかしながら、正常細胞に対する反応性が増加しても、ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲは、依然として、試験されたドナーにわたって最小量の細胞溶解効力を伝達することに留意されたい。更に、４Ｄ５、ＣａｓＭａｂ２１４、及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲが、Ｍｅｔ５ａに対する選択性に差をもたらさなかったという事実は、（ｉ）スペーサ長さが、正常ＨＥＲ２^＋細胞よりもむしろ腫瘍のＣａｓＭａｂ－ＣＡＲ選択性に重要であること、及び（ｉｉ）ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞が、スペーサ構成にわたって最小量の正常細胞反応性を実証することを実証する。

【0086】

ＨＥＲ２発現腫瘍（図４Ａ）及び正常／非腫瘍原性細胞株（図４Ｂ）に応答して、長いスペーサＣＡＲによってもたらされる炎症性サイトカインＩＦＮγ産生についてのアッセイは、ＣａｓＭａｂ２１４及びＣａｓＭａｂ２５０が、腫瘍抗原のために特別に設計された同じスクリーニング方法を使用して得られた腫瘍ＨＥＲ２抗原に特異的な検証された抗体であったことを考慮して、ＨＥＲ２－ＣＡＲ候補のスペーサ長さの差次的効果、より具体的には、抗体のレベルではなく、ＣＡＲのレベルで反映された非腫瘍細胞に対する差次的標的化特異性に関して上記の概念を更に確認した。

【0087】

全体として、これらのデータは、（ｉ）ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲが、同様に構成された４Ｄ５及びＣａｓＭａｂ２１４ベースのＣＡＲよりも腫瘍選択的利点を有すること、及び（ｉｉ）スペーサ長さがＣａｓＭａｂ ＨＥＲ２抗体ベースのＣＡＲの機能的特性にとって重要であり、より短いスペーサが、長いスペーサよりも実質的により高い腫瘍選択性を結果的にもたらすことを実証する。

【0088】

実施例２－中程度のスペーサを有するＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲの効力及び特異性
ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲは、同様に構成された４Ｄ５及びＣａｓＭａｂ２１４ベースのＣＡＲよりも腫瘍選択的利点を有するため、この実験は、任意の異なる機能的特性について、短い（８０アミノ酸未満）又は中程度のスペーサ（８０～１８０アミノ酸）を有する２５０－ＣＡＲの比較に焦点を当てる。

【0089】

短い又は中程度のスペーサを有する４Ｄ５又はＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲを、本明細書に説明される同じ方法を使用して、細胞溶解効力及び腫瘍特異性について評価した。先の実施例のように、１０^４個の標的細胞（ＳＫＯＶ３、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４クローン５、ＯＥ１９、ＭＣＦ１０ａ、又はＭｅｔ５ａ）をプレーティングし、接着することを可能にした。約２４時間後、ＣＡＲ発現初代Ｔ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で添加した。

【0090】

上記の観察と一致して、図５Ａに示されるように、短いスペーサ（パネルｉ．）又は中程度のスペーサ（パネルｉｉ．）を有する４Ｄ５及びＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲは、ＨＥＲ２^ＨｉｇｈＳＫＯＶ３、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４クローン５（乳腺）、及びＯＥ１９（食道）腫瘍細胞株細胞の標的化された死滅を誘導し、４８～９６時間以内に最大細胞溶解効力に到達した。更に、ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲは、一般に、それらの同等に構成された４Ｄ５ベースのＣＡＲよりも速い標的化された死滅を誘導する。加えて、中程度のスペーサを有するＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲは、全ての評価されたＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍細胞株にわたって、短いスペーサを有するものよりも優れていた（図５Ａ）。

【0091】

図５Ｂに示されるように、短いスペーサ又は中程度のスペーサのいずれかを有する４Ｄ５ベースのＣＡＲは、非腫瘍／正常ＨＥＲ２発現細胞に対して高い細胞傷害性を無作為に誘導した。一方、短いスペーサ構成又は中程度のスペーサ構成のいずれかを有するＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲは、これらの正常ＨＥＲ２発現細胞に対する反応性を誘導しなかったか、又は最小限の反応性しか誘導せず、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞に対する高度に選択的な効力を実証した。

【0092】

別の実験では、中程度のスペーサ及びＨ／Ｌ可変領域配向を有するＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲの腫瘍特異的効力を、追加のＨＥＲ２^{Ｌｏｗ／＋}正常細胞株（ＨＵＶＥＣ、Ｂｅａｓ２ｂ、Ｔｈｌｅ２、ＳＶ－Ｈｕｃ－１、及びＨＴＲ－８／ＳＶｎｅｏ）を用いて更に評価した。同様に構築された４Ｄ５－ＣＡＲを対照として含めた。標的細胞（対照として、ＨＥＲ２腫瘍細胞株、ＳＫＯＶ３を含む）をプレーティングした。約２４時間後、ＣＡＲ形質導入初代Ｔ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で添加した。図６に示されるように、ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲ（Ｈ／Ｌ、中程度のスペーサ）は、評価された正常ＨＥＲ２発現細胞株細胞にわたって、少しの検出可能な細胞傷害性を誘導したか、検出可能な細胞傷害性（最大細胞溶解効力の約５～４０％）を誘導しなかった。これらのデータは、ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲが、非腫瘍ＨＥＲ２ではなく、腫瘍発現ＨＥＲ２に対して高度に選択的であり（したがって、最小の「オンターゲット腫瘍外」問題を提示する）、この選択性が、複数の供給源からの多様な数のＨＥＲ２発現正常／非腫瘍原性細胞株に及ぶことを実証する。

【0093】

実施例３－ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメイン及びＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲ細胞活性化
ＣＡＲ細胞活性化を示すために、ＮＦκＢレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を形質導入して、上記のように、中程度のスペーサ（ＩｇＧ４ヒンジ及びＣＨ３ドメイン）、並びにＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ細胞内シグナル伝達ドメインを有する、４Ｄ５又はＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）ベースのＣＡＲのいずれかを発現させた。４Ｄ５又はＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）－ＣＡＲのいずれかを安定的に発現するＪｕｒｋａｔを、一晩、ＨＥＲ２^Ｈｉｇｈ腫瘍（ＳＫＯＶ３、ＳＫＢＲ３）又はＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性（ＭＣＦ１０ａ）細胞株と共培養した。ＧＦＰ（ＮＦκＢの読み出し、したがってＣＡＲ活性化）及びＣＤ６９（一般的な活性化マーカー）の発現を、フローサイトメトリを介して評価した。ＰＭＡ／イオノマイシン及び並行して刺激されていないＪｕｒｋａｔ細胞株は、それぞれ、陽性及び陰性対照として役立った。

【0094】

図７に示されるように、ＰＭＡ／イオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）治療は、ほぼ１００％のＧＦＰ^＋／ＣＤ６９^＋同時発現細胞を結果的にもたらした。同様に、ＣＡＲ特異的活性化は、４Ｄ５又はＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）ベースのＣＡＲを発現する、刺激されていないＪｕｒｋａｔレポーター株において検出されなかった（＜約１％ＧＦＰ^＋／ＣＤ６９^＋）。４Ｄ５及びＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）－ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の両方は、ＳＫＯＶ３又はＳＫＢＲ３腫瘍株との共培養後に特異的活性化を実証した（ＧＦＰ^＋／ＣＤ６９^＋は、ＳＫＯＶ３について約４８～５２％、ＳＫＢＲ３について約３２～３８％であった）。重要なことに、ＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）－ＣＡＲ発現ＪｕｒｋａｔとＨＥＲ２^＋正常／非腫瘍原性ＭＣＦ１０ａ細胞との共培養は、最小限の細胞活性化を誘導し（約５％のＧＦＰ^＋／ＣＤ６９^＋）、４Ｄ５－ＣＡＲ発現ＪｕｒｋａｔとＭＣＦ１０ａ細胞との共培養は、堅牢な細胞活性化を結果的にもたらし（約３７％のＧＦＰ^＋／ＣＤ６９^＋）、これは、ＨＥＲ２^ＨｉｇｈＳＫＢＲ３腫瘍細胞株下で観察された細胞活性化と同様であった。これらのデータは、中程度のスペーサを有するＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）から構築されたＣＡＲが、腫瘍発現ＨＥＲ２に対して高度に選択的かつ有効であることを更に実証する。

【0095】

別の実験では、複数の細胞内シグナル伝達ドメイン構成（ＣＤ３ζ１ＸＸ又はＣＤ３ζＸＸ３との組み合わせにおいて、野生型ＣＤ２８又はＣＤ２８ ＹＭＦＭ変異体由来）を、ＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）ＳｃＦｖの最適化された細胞外ＣＡＲドメイン及びスペーサとともに評価した。ＣＤ３ζＸＸ３は、ＩＴＡＭ１に２つの置換を有する、ＣＤ３ζの別の変異体形態である（配列は開示されていない）。１０^４標的細胞（ＳＫＯＶ３）をプレーティングし、接着することを可能にした。約２４時間後、ＣＡＲ発現ドナーＴ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で添加した。細胞指数を監視し、エフェクター添加に対して正規化し、細胞溶解パーセントをＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ（商標）で計算した。図８に示されるように、異なる細胞内シグナル伝達ドメイン構成を有する全てのＣＡＲは、迅速かつ強力な腫瘍殺傷を呈したが、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲは、約９０％の最大細胞溶解で他の全ての対応物よりも優れており、細胞傷害性の伝達においてより良好な持続性／持続時間を有した。これらのデータは、使用される細胞内シグナル伝達ドメインにかかわらず、中程度のスペーサを有するＣａｓＭａｂ２５０（Ｈ／Ｌ）から構築されたＣＡＲが、腫瘍発現ＨＥＲ２に対して高度に選択的かつ有効であることを実証する。

【0096】

当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、及び製品が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。

【0097】

本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示が関係する当業者の技術水準を示している。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0098】

本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、限定又は複数の限定がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。用いられている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその部分のいずれかの均等物を除外する意図はなく、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び任意選択の特質によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正及び変形は、当業者によって想到されてもよく、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-08-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、前記抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
（ｉｉ）配列番号４（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む、外部ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原への前記ＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項2】

前記抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
（ｂ）配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ若しくはＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、前記リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択的に、前記リンカーが、配列番号９～１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
（ｄ）配列番号１３若しくは配列番号１４に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１３及び１４の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
（ｅ）ヒト化されている、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項3】

前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、
（ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、
（ｂ）それぞれ配列番号３７～５９によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は
（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項4】

前記内部ドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、前記内部ドメインドメインが、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、又はＮＫｐ４６－２Ｂ４の形態のうちのいずれか１つにおいて、融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。

【請求項5】

前記膜貫通ドメインが、
（ａ）ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチド、
（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は
（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄの膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項6】

前記膜貫通ドメイン及びその直結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項7】

前記内部ドメインが、
（ａ）シグナルペプチド、及び／又は
（ｂ）スペーサ／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項8】

前記スペーサ／ヒンジが、
（ａ）ＩｇＧ４スペーサ、ＣＤ２８スペーサ、ＣＤ８スペーサ、ＣＨ３スペーサ、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサ、若しくはそれらの任意の組み合わせ、
（ｂ）約１０～約８０アミノ酸の短いスペーサ、８０超～約１８０アミノ酸の中程度のスペーサ、若しくは１８０アミノ酸を超える長いスペーサ、及び／又は
（ｃ）配列番号８１～８５のいずれかに対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＣＡＲ。

【請求項9】

前記スペーサ／ヒンジが、中程度のスペーサを含み、前記スペーサが、配列番号８４に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。

【請求項10】

前記ＣＡＲが、配列番号８８に対して少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項11】

前記がん細胞が、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項12】

前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、非がん細胞上で発現されるＨＥＲ２に応答しないか、又は低レベルの応答を有する、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項13】

前記がん抗原特異的応答が、細胞溶解及びサイトカイン産生を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項14】

前記ＣＡＲが、アミノからカルボキシの方向に前記ＶＨドメイン、続いて前記ＶＬドメインを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含むと共に、任意により、前記ＣＡＲが、アミノからカルボキシの方向に前記ＶＨドメイン、続いて前記ＶＬドメインを含む、ポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【国際調査報告】