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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-11
(54)【発明の名称】シュタルガルト病（ＡＢＣＡ４）の遺伝子治療
(51)【国際特許分類】
A61K 35/76 20150101AFI20240404BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240404BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240404BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240404BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20240404BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240404BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240404BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240404BHJP
【ＦＩ】
A61K35/76
A61P27/02
A61K48/00
C12N15/12 ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/113 Z
C12N15/63 100Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565879
(86)(22)【出願日】2022-04-25
(85)【翻訳文提出日】2023-12-22
(86)【国際出願番号】 US2022026172
(87)【国際公開番号】W WO2022232041
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】63/186,753
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/179,663
(32)【優先日】2021-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507088266
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ マサチューセッツ
【住所又は居所原語表記】Ｏｎｅ Ｂｅａｃｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，３１ｓｔ Ｆｌｏｏｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１０８
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カンナ，へマント
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZC54
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA17
4C087MA58
4C087MA66
4C087NA05
4C087ZA33
4C087ZC54
(57)【要約】
本開示の側面は、対象へのミニ遺伝子の送達に有用な組成物および方法に関する。したがって、本開示は、タンパク質またはペプチド(例として、ミニ遺伝子)等の治療用遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子断片を含む、ウイルス(例として、rAAV)ベクター等の単離された核酸および遺伝子治療ベクターに部分的に基づく。いくつかの態様では、本開示は、ABCA4タンパク質(例として、ABCA4遺伝子の遺伝子産物)またはその一部をコードする遺伝子治療ベクターに関する。いくつかの態様では、本開示によって記載される組成物は、ABCA4遺伝子の突然変異に関連する疾患、例えばシュタルガルト病を治療するのに有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを増加させることを必要とする対象の網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを増加させる方法であって、方法は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することを含む、前記方法。
【請求項2】
ONLの厚さが、3～5μm、4～6μm、5～7μm、6～8μm、7～10μm、9～12μm、11～15μm、またはそれを超えて増加される、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを維持することを必要とする対象の網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを維持する方法であって、方法は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することを含む、前記方法。
【請求項4】
ONLの厚さが、AAVの投与後に約55～70μm、約55～65μm、約60～70μm、または約60～65μmである、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
網膜中のリポフスチン濃度を低下させることを必要とする対象の網膜中のリポフスチン濃度を低下させる方法であって、方法は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することを含む、前記方法。
【請求項6】
リポフスチンの濃度が、AAVベクターの投与後の期間の後に少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％低下される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
網膜中のビス-レチノイドN-レチニル-N-レチニリデンエタノールアミン(A2E)濃度を低下させることを必要とする対象の網膜中のビス-レチノイドN-レチニル-N-レチニリデンエタノールアミン(A2E)濃度を低下させる方法であって、方法は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することを含む、前記方法。
【請求項8】
A2Eの濃度が、AAVベクターの投与後の期間の後に少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％低下される、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを維持することを必要とする対象の網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを維持する方法であって、方法が、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに記載のアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することであって、網膜へのAAVベクターの投与がONL厚さを維持するのに有効である、投与すること;ならびに
対象の網膜中のリポフスチンおよび/またはA2E濃度を評価すること
を含み、ここでリポフスチンおよび/またはA2E濃度の減少は、ONL厚さの維持を示す、前記方法。
【請求項10】
ONLの厚さが、AAVの投与後少なくとも6ヶ月、少なくとも12ヶ月、少なくとも18ヶ月、または少なくとも24ヶ月で約55～70μm、約55～65μm、約60～70μm、または約60～65μmである、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
導入遺伝子が、ABCA4ミニ遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを更に含む、請求項1～10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
プロモータが、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータである、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
構成的プロモータが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ、SV40プロモータ、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモータ、β-アクチンプロモータ、増強ニワトリβ-アクチンプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモータ、またはEF1αプロモータである、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
組織特異的プロモータが眼特異的プロモータであり、任意選択的に光受容体特異的プロモータである、請求項12に記載の方法。
【請求項15】
眼特異的プロモータが、レチノシシンプロモータ、K12プロモータ、ロドプシンプロモータ、ロッド特異的プロモータ、円錐特異的プロモータ、ロドプシンキナーゼプロモータ、GRK1プロモータ、光受容体間レチノイド結合タンパク質近位(IRBP)プロモータ、またはオプシンプロモータである、請求項14に記載の方法。
【請求項16】
導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)に隣接している、請求項1～15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ITRのうちの少なくとも1つが、AAV2 ITRである、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
ABCA4ミニ遺伝子が、配列番号9、12、および13のいずれか1つに記載のアミノ酸配列をコードする、請求項1～17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ABCA4ミニ遺伝子が、配列番号13に示されるアミノ酸配列をコードする、請求項1～17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
AAVベクターが、網膜下注射によって投与される、請求項1～12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
対象が、シュタルガルト病を有するかまたは有すると疑われる、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、2021年4月26日に出願された米国仮特許出願第63/179,663号および2021年5月10日に出願された米国仮特許出願第63/186,753号の出願日の35 U.S.C.§119(e)の下での利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書において組み込まれる。
本出願は、2021年4月26日に出願された米国仮特許出願第63/179,663号および2021年5月10日に出願された米国仮特許出願第63/186,753号の出願日の35 U.S.C.§119(e)の下での利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書において組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
背景
シュタルガルト病は、最も一般的なタイプの常染色体劣性黄斑変性障害である。この疾患は、ABCA4遺伝子の変異によって引き起こされる。ヒトABCA4遺伝子は約7kb長であり、遺伝子送達のために従来のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターにパッケージングする限界を超えている。
シュタルガルト病は、最も一般的なタイプの常染色体劣性黄斑変性障害である。この疾患は、ABCA4遺伝子の変異によって引き起こされる。ヒトABCA4遺伝子は約7kb長であり、遺伝子送達のために従来のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターにパッケージングする限界を超えている。
【発明の概要】
【0003】
概要
本開示の側面は、対象にミニ遺伝子を送達するのに有用な組成物および方法に関する。したがって、本開示は、タンパク質またはペプチド(例として、ミニ遺伝子)等の治療用遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子断片を含む、ウイルス(例として、rAAV)ベクター等の単離された核酸および遺伝子治療ベクターに部分的に基づく。いくつかの態様では、本開示は、ABCA4タンパク質(例として、ABCA4の遺伝子産物)またはその一部をコードする遺伝子治療ベクターに関する。いくつかの態様では、本開示によって記載される組成物は、ABCA4遺伝子の突然変異に関連する疾患、例えばシュタルガルト病を治療するのに有用である。
本開示の側面は、対象にミニ遺伝子を送達するのに有用な組成物および方法に関する。したがって、本開示は、タンパク質またはペプチド(例として、ミニ遺伝子)等の治療用遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子断片を含む、ウイルス(例として、rAAV)ベクター等の単離された核酸および遺伝子治療ベクターに部分的に基づく。いくつかの態様では、本開示は、ABCA4タンパク質(例として、ABCA4の遺伝子産物)またはその一部をコードする遺伝子治療ベクターに関する。いくつかの態様では、本開示によって記載される組成物は、ABCA4遺伝子の突然変異に関連する疾患、例えばシュタルガルト病を治療するのに有用である。
【0004】
したがって、いくつかの側面では、本開示は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに記載の配列を有するABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含む、単離された核酸を提供する。
【0005】
いくつかの側面では、本開示は、ABCA4タンパク質をコードする核酸配列を有する導入遺伝子を含む、単離された核酸を提供し、ABCA4タンパク質は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む。
【0006】
いくつかの側面では、本開示は、対象の網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを増加させる方法を提供する。いくつかの側面では、本開示は、対象の網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを維持(または保存)する方法を提供する。いくつかの態様では、対象の網膜の外顆粒層(ONL)の厚さを増加または維持する方法は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することを含む。
【0007】
いくつかの態様では、ONLの厚さは、3～5μm、4～6μm、5～7μm、6～8μm、7～10μm、9～12μm、11～15μm、またはそれを超えて増加される(例として、投与前のONLの厚さに対して)。いくつかの態様では、ONLの厚さは、ONLの厚さが(例として、投与前のONLの厚さに対して)25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、2％未満、または1％未満だけ低下されるように保存される。いくつかの態様では、ABCA4ミニ遺伝子は、配列番号9、12、および13のいずれか1つに記載のアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、ABCA4ミニ遺伝子は、配列番号13に示されるアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、AAVベクターは網膜下注射によって投与される。いくつかの態様では、対象は、シュタルガルト病を有するか、または有すると疑われる。
【0008】
本開示のいくつかの側面は、対象の網膜(例として、眼の腹側中心、腹側周辺、背側中心、および背側周辺)中のリポフスチン濃度を減少させる方法を提供する。いくつかの態様では、対象の網膜中のリポフスチン濃度を減少させる方法は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することを含む。いくつかの態様では、リポフスチン濃度は、投与前の対象の網膜のリポフスチン濃度と比較して低下される。
【0009】
本開示のいくつかの側面は、対象の網膜中のビス-レチノイドN-レチニル-N-レチニリデンエタノールアミン(A2E)濃度を減少させる方法を提供する。いくつかの態様では、対象の網膜中のA2E濃度を低下させる方法は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを対象の網膜に投与することを含む。
【0010】
いくつかの態様では、導入遺伝子は、ABCA4ミニ遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを更に含む。いくつかの態様では、プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータであり、任意選択的に、組織特異的プロモータは光受容体特異的プロモータである。いくつかの態様では、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)に隣接し、任意選択的にITRの少なくとも1つがAAV2 ITRである。いくつかの態様では、リポフスチンおよび/またはA2Eの濃度は、AAVベクターの投与後の期間の後に少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％低下される。いくつかの態様では、AAVベクターは網膜下注射によって投与される。いくつかの態様では、対象は、シュタルガルト病を有するか、または有すると疑われる。
【0011】
いくつかの態様では、導入遺伝子は、ABCA4ミニ遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを更に含む。いくつかの態様では、プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータであり、任意選択的に、組織特異的プロモータは光受容体特異的プロモータである。いくつかの態様では、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)に隣接し、任意選択的にITRの少なくとも1つがAAV2 ITRである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
図面の簡単な記載
【図2】図2は、野生型ABCA4ノックアウトマウス(ABCA4 KO)、およびminiABCA4-1を注射したABCA4ノックアウトマウス(これは、図1に記載されるMG-4構築物に対応する)の蛍光顕微鏡によるRPE自家蛍光分析を示すグラフである。ZO-1は細胞マーカーとして使用された。
【図3】図3は、異なる年齢の非注射および注射ABCA4ノックアウトマウスのRPE自己蛍光分析の定量化を示すグラフである。矢印は、自己蛍光を有意に改善したABCA4ミニ遺伝子バージョンを示す。注射は、P10日目またはP30日目に行われた。各ミニ遺伝子で示される年齢で分析が行われた。P30での注射は、P10注射と比較して非常に有意な改善を示した。このグラフにおいて、AB-1はMG-1に対応し、AB-2はMG-2に対応し、AB-5はMG-5に対応する。
【図6】図6は、MG-1、MG-4またはMG-5の網膜下注射後のABCA4-KOマウス(Abca4-/-マウス)の網膜におけるMG-1(配列番号3に対応する)、MG-4(配列番号6に対応する)またはMG-5(配列番号7に対応する)の発現を示すRNA電気泳動ゲルの画像である。
【図7】図7は、MG-1、MG-4、MG-5、または対照(例として、平衡塩類溶液(BSS))による網膜下注射後のABCA4-KOマウスの網膜の凍結切片の画像を提供する。野生型マウスの非注射網膜(192sv-WT)も対照として使用された。網膜は抗MYC抗体(左パネル)および抗ABCA4抗体(中央パネル)で染色された。矢印は抗体特異的シグナルを示し、ABCA4タンパク質(すなわち、MG-1、MG-4、またはMG-5タンパク質)の存在を示す。
【図8A】図8A～8Bは、ABCA4-KOマウスの網膜へのMG-5の網膜下注射が、未処置マウスおよび/または対照(BSS)で処置したマウスと比較して網膜の外顆粒層(ONL)の維持された厚さにつながることを示す。図8Aは、野生型マウス(129-sv-WT 14 mo)、未処置ABCA4-KOマウス(ABCA4 ko 13 mo)、対照で処置したABCA4-KOマウス(BSS 14 mo)、およびMG-1、MG-4、またはMG-5で処置したABCA4-KOマウスの例示的なマウス網膜の画像を提供する。
【図9A】図9Aは、野生型マウス、未処置ABCA4-KOマウス、BSS対照で処置したABCA4-KOマウス、およびMG-1、MG-4、またはMG-5で処置したABCA4-KOマウスの網膜の網膜電図(ERG)トレースを示す。暗順応a波および暗順応b波の位置が示されている。
【図10】図10は、リポフェクタミンのトランスフェクション後のhTERT-RPE細胞におけるMG-1、MG-2、MG-4、およびMG-5の発現を示す。トランスフェクトしたベクターを含まない細胞は陰性対照として使用された。MYCを発現する空のベクター(pCDNA.1 CMV Myc)は陽性対照として細胞にトランスフェクトされた。細胞は、抗MYC抗体を使用して染色するために処理され、DAPIが使用されて核を染色した。矢印はトランスフェクトされた細胞を特定する。
【図11A】図11A～図11Bは、示された時点で測定されたRPEフラットマウント中の129sv-WTマウスおよびAbca4-/-マウスにおける自己蛍光を示す。RPEフラットマウントはZO-1で染色され、488nmチャネル下で画像化された。これらのデータは、野生型マウスと比較して、4ヶ月および5ヶ月の成長時にABCA4-/-において自己蛍光が増加したことを実証している。
【図11B】図11A～図11Bは、示された時点で測定されたRPEフラットマウント中の129sv-WTマウスおよびAbca4-/-マウスにおける自己蛍光を示す。RPEフラットマウントはZO-1で染色され、488nmチャネル下で画像化された。これらのデータは、野生型マウスと比較して、4ヶ月および5ヶ月の成長時にABCA4-/-において自己蛍光が増加したことを実証している。
【発明を実施するための形態】
【0013】
詳細な記載
いくつかの側面では、本開示は、特定の遺伝性疾患、例えばシュタルガルト病を治療するのに有用な組成物および方法に関する。本開示は、MiniABCA4タンパク質(例として、ABCA4ミニ遺伝子の遺伝子産物)等の治療用遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子断片を含む、ウイルス(例として、rAAV)ベクター等の単離された核酸および遺伝子治療ベクターに部分的に基づく。
いくつかの側面では、本開示は、特定の遺伝性疾患、例えばシュタルガルト病を治療するのに有用な組成物および方法に関する。本開示は、MiniABCA4タンパク質(例として、ABCA4ミニ遺伝子の遺伝子産物)等の治療用遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子断片を含む、ウイルス(例として、rAAV)ベクター等の単離された核酸および遺伝子治療ベクターに部分的に基づく。
【0014】
「核酸」配列は、DNAまたはRNA配列を指す。いくつかの態様では、本開示のタンパク質および核酸が単離される。本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、人工的に産生されたことを意味する。核酸に関して本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、(i)例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってin vitroで増幅された;(ii)クローニングにより組換え生産された;(iii)切断およびゲル分離によって精製された;または(iv)例えば化学合成によって合成された;ことを意味する。単離された核酸は、当技術分野において周知の組換えDNA技術によって容易に操作可能なものである。したがって、5'および3'制限部位が公知であるかまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマー配列が開示されているベクターに含有されるヌクレオチド配列は単離されていると見なされるが、その天然宿主中にその天然状態で存在する核酸配列は単離されているとは見なされない。単離された核酸は、実質的に精製されることもあるが、精製されている必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離される核酸は、それが存在する細胞中にごくわずかな割合の材料のみ含むこともあるという点で純粋ではない。しかしながら、このような核酸は、当業者に公知の標準的な技術によって容易に操作可能であるため、この用語が本明細書において使用される場合、単離される。タンパク質またはペプチドに関して本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、その天然環境から単離された、または人工的に産生された(例として、化学合成によって、組換えDNA技術によって、等)タンパク質またはペプチドを指す。いくつかの態様では、単離された核酸は、MiniABCA4タンパク質(例として、ABCA4ミニ遺伝子等のABCA4遺伝子またはその一部から発現される遺伝子産物)等のABCA4タンパク質をコードする。
【0015】
ヒトでは、ABCA4遺伝子(STGDとも呼ばれる)は、ATP結合カセット、サブファミリーA(ABC1)、メンバー4タンパク質をコードし、これは、桿体および錐体の外節円板縁に局在し、内向きフリッパーゼとして機能することもある。ABCA4遺伝子の変異は、黄斑変性の一形態であるシュタルガルト病を引き起こすことが観察されている。いくつかの態様では、ABCA4遺伝子は、NCBI参照配列アクセッション番号NM＿000350.3(配列番号1)に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様では、ABCA4遺伝子は、NCBI参照配列寄託番号NP＿000341.2(配列番号2)に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【0016】
本明細書において使用される場合、「ミニ遺伝子」は、天然に存在するペプチドまたはタンパク質をコードする対応する遺伝子の1つまたは複数の非必須要素が除去されており、ミニ遺伝子によってコードされるペプチドまたはタンパク質が、対応する天然に存在するペプチドまたはタンパク質の機能を保持している組換えペプチドまたはタンパク質をコードする単離された核酸配列を指す。「治療用ミニ遺伝子」は、遺伝性疾患の治療に有用なペプチドまたはタンパク質、例えばジストロフィン、ジスフェルリン、第VIII因子、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、チロシナーゼ(Tyr)等をコードするミニ遺伝子を指す。ミニ遺伝子は当技術分野で公知であり、例えばKarpati and Acsadi(1994)Clin Invest Med 17(5):499-509;Plantier et al.(2001)Thromb Haemost.86(2):596-603;and Xiao et al.(2007)World J.Gastroenterol.13(2):244-9によって記載される。いくつかの態様では、ミニ遺伝子は、対応する天然に存在するペプチドまたはタンパク質の配列を含まない。
【0017】
いくつかの側面では、本開示は、ABCA4ミニ遺伝子をコードする単離された核酸に関する。一般に、ミニ遺伝子(例として、ABCA4ミニ遺伝子等の治療用ミニ遺伝子)をコードする単離された核酸は、対応する天然に存在する野生型タンパク質(例として、配列番号1)をコードする核酸配列に対して、約10％～約99％(例として、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約90％、約99％等)トランケートされている。トランケーションは、連続的(例として、アミノ酸残基の単一の連続的な切断)または不連続的(例として、例えば、1つまたはそれを超えるペプチドによって分離されるアミノ酸の、2つまたはそれを超えるドメインの切断といった、2つまたはそれを超える切断)であることもある。例えば、いくつかの態様では、ミニABCA4タンパク質をコードするミニ遺伝子は、野生型ABCA4遺伝子(例として、配列番号1)と比較して約61％～切断型(例として、核酸配列の約50％を含む)である。いくつかの態様では、ABCA4ミニ遺伝子は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに記載の核酸配列を含む(またはそれからなる)。いくつかの態様では、ABCA4ミニ遺伝子は、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む(またはそれからなる)タンパク質(MiniABCA4タンパク質と呼ばれる)をコードする。いくつかの態様では、ABCA4タンパク質(例として、MiniABCA4タンパク質)をコードする核酸は、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸配列の前に開始コドン(例として、核酸配列ATG)を含む。いくつかの態様では、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化されている。
【0018】
ABCA4タンパク質をコードする単離された核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されることもある。「プロモータ」は、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要な細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。「作動可能に配置された」、「制御下にある」または「転写制御下にある」という語句は、プロモータが核酸に対して正しい位置および向きにあり、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御することを意味する。プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータであることもある。
【0019】
構成的プロモータの例は、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモータ(任意選択的にRSVエンハンサを有する)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ(任意選択的にCMVエンハンサを有する)［例として、Boshart et al.,Cell,41:521-530(1985)を参照されたい］、SV40プロモータ、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモータ、β-アクチンプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモータおよびEF1αプロモータ［Invitrogen］を包含する。いくつかの態様では、プロモータはニワトリβ-アクチン(CBA)プロモータを含む。いくつかの態様では、プロモータは、強化型ニワトリβ-アクチンプロモータである。いくつかの態様では、プロモータは、U6プロモータである。いくつかの態様では、プロモータはニワトリβ-アクチン(CBA)プロモータである。
【0020】
誘導性プロモータは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度等の環境因子、または特定の生理学的状態、例として、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製細胞のみにおいて調節されることができる。誘導性プロモータおよび誘導性系は、限定するものではないが、Invitrogen、ClontechおよびAriadを包含する様々な商業的供給源から利用可能である。多くの他のシステムが記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモータによって調節される誘導性プロモータの例は、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン(MT)プロモータ、デキサメタゾン(Dex)誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモータ、T7ポリメラーゼプロモータ系(国際公開第98/10088号パンフレット);エクジソン昆虫プロモータ(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、テトラサイクリン抑制系(Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、テトラサイクリン誘導系(Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995)、Harvey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998)も参照されたい)、RU486誘導系(Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)およびWang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997))およびラパマイシン誘導系(Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))を包含する。この文脈において有用であることもある、更に他のタイプの誘導性プロモータは、特定の生理学的状態、例として、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて調節されるものである。
【0021】
いくつかの態様では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。場合により、組織特異的調節配列は、組織特異的な様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。そのような組織特異的調節配列(例として、プロモータ、エンハンサ等)は、当技術分野で周知である。いくつかの態様では、組織特異的プロモータは、眼特異的プロモータ(例として、光受容体特異的プロモータ)である。眼特異的プロモータの例は、レチノシシンプロモータ、K12プロモータ、ロドプシンプロモータ、ロッド特異的プロモータ、円錐特異的プロモータ、ロドプシンキナーゼプロモータ、GRK1プロモータ、光受容体間レチノイド結合タンパク質近位(IRBP)プロモータおよびオプシンプロモータ(例として、赤色オプシンプロモータ、青色オプシンプロモータ等)を包含するが、これらに限定されない。
【0022】
いくつかの態様では、プロモータはRNAポリメラーゼIII(pol III)プロモータである。pol IIIプロモータの非限定的な例は、U6およびH1プロモータ配列を包含する。いくつかの態様では、プロモータはRNAポリメラーゼII(pol II)プロモータである。pol IIプロモータの非限定的な例は、T7、T3、SP6、RSVおよびサイトメガロウイルスプロモータ配列を包含する。
【0023】
本開示の側面は、本明細書において記載される単離された核酸を含む遺伝子療法ベクターに関する。遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクター(例として、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルス(Ad)ベクター等)、プラスミド、クローズドエンドDNA(例として、ceDNA)、脂質/DNAナノ粒子等であることもある。いくつかの態様では、遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様では、ミニ遺伝子をコードする発現カセットは、1つ以上のウイルス複製配列、例えば、レンチウイルス長末端反復配列(LTR)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)に隣接されている。いくつかの態様では、ウイルスベクターはバキュロウイルスベクターである。
【0024】
本明細書において記載される単離された核酸はまた、望ましくはプロモータ/エンハンサ配列と導入遺伝子との間に位置するイントロンを含有することもある。いくつかの態様では、イントロンは合成または人工(例として、異種)イントロンである。合成イントロンの例としては、SV-40に由来するイントロン配列(SV-40 Tイントロン配列と呼ばれる)およびニワトリベータ-アクチン遺伝子に由来するイントロン配列を包含する。いくつかの態様では、本開示によって記載される導入遺伝子は、1つ以上(1、2、3、4、5またはそれ以上)の人工イントロンを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の人工イントロンは、プロモータと導入遺伝子をコードする核酸配列との間に位置する。
【0025】
いくつかの態様では、rAAVは転写後応答エレメントを含む。本明細書において使用される場合、「転写後応答エレメント」という用語は、転写されると、遺伝子の発現を増強する三次構造をとる核酸配列を指す。転写後調節エレメントの例は、限定するものではないが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)、マウスRNA輸送エレメント(RTE)、サルレトロウイルス1型(SRV-1)の構成的輸送エレメント(CTE)、メイソン-ファイザーサルウイルス(MPMV)由来のCTE、およびヒト熱ショックタンパク質70の5'非翻訳領域(Hsp70 5'UTR)を包含する。いくつかの態様では、rAAVベクターはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を含む。
【0026】
いくつかの態様では、ベクターは、ベクターでトランスフェクトされた細胞、または本開示によって産生されたウイルスに感染した細胞においてその転写、翻訳、および/または発現を可能にする様式で、導入遺伝子のエレメントと作動可能に連結された従来の制御エレメントを更に含む。本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスまたはある距離で作用する発現制御配列の両方を包含する。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモータおよびエンハンサ配列;スプライシングおよびポリアデニル化(ポリA)シグナル等の効率的なRNAプロセシングシグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を高める配列(例として、Kozakコンセンサス配列);タンパク質安定性を高める配列;必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を包含する。天然、構成的、誘導性および/または組織特異的であるプロモータを包含する多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、利用されることもある。
【0027】
ポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後、および任意選択的に3' AAV ITR配列の前に挿入される。本開示において有用なrAAV構築物はまた、望ましくはプロモータ/エンハンサ配列と導入遺伝子との間に位置するイントロンを含有することもある。1つの可能なイントロン配列はSV-40に由来し、SV-40 Tイントロン配列と呼ばれる。使用されることもある別のベクター要素は、内部リボソーム進入部位(IRES)である。IRES配列は、単一の遺伝子転写物から2つ以上のポリペプチドを産生するために使用される。IRES配列は、2つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生するために使用されるであろう。これらおよび他の一般的なベクター要素の選択は従来的であり、多くのそのような配列が利用可能である［例として、Sambrook et al.、およびそこに参照されているもの、例えば、pages 3.18 3.26および16.17 16.27ならびにAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989を参照されたい］。
【0028】
本開示の単離された核酸は、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(rAAVベクター)であることもある。いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸は、第1のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)またはその変異体を含む領域(例として、第1の領域)を含む。単離された核酸(例として、組換えAAVベクター)は、カプシドタンパク質にパッケージングされ、対象に投与され、および/または選択された標的細胞に送達されることもある。「組換えAAV(rAAV)ベクター」は、典型的には、最低でも、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに5'および3'AAV逆位末端配列(ITR)から構成される。導入遺伝子は、本明細書の他の箇所に開示されるように、1つまたは複数のタンパク質(例として、ヒトABCA4またはその断片)をコードする1つまたは複数の領域を含むこともある。導入遺伝子はまた、例えば、miRNA結合部位および/または発現制御配列(例として、ポリAテール)をコードする領域を含むこともある。
【0029】
一般に、ITR配列は約145bp長である。好ましくは、ITRをコードする配列の実質的に全体が分子中で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な改変は許容される。これらのITR配列を改変する能力は、当業者の技術の範囲内である。(例として、Sambrook et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989);and K.Fisher et al.,J Virol.,70:520 532(1996)等のテキストを参照されたい)。本発明で使用されるそのような分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントは、5'および3'AAV ITR配列に隣接している。AAV ITR配列は、現在同定されている哺乳動物AAVタイプを包含する任意の公知のAAVから得られることもある。いくつかの態様では、単離された核酸(例として、rAAVベクター)は、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11およびそれらの変異体から選択される血清型を有する少なくとも1つのITRを含む。いくつかの態様では、単離された核酸は、AAV2 ITRをコードする領域(例として、第1の領域)を含む。
【0030】
いくつかの態様では、単離された核酸は、第2のAAV ITRを含む領域(例として、第2の領域、第3の領域、第4の領域等)を更に含む。いくつかの態様では、第2のAAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11およびそれらの変異体から選択される血清型を有する。いくつかの態様では、第2のAAV ITRはAAV2 ITRである。いくつかの態様では、第2のITRは、機能的末端解離部位(TRS)を欠く突然変異ITRである。「末端解離部位を欠く」という用語は、ITRの末端解離部位(TRS)の機能を無効にする突然変異(例として、非同義突然変異等のセンス変異、ミスセンス突然変異)を含むAAV ITR、または機能的TRSをコードする核酸配列を欠く切断型AAV ITR(例として、ΔTRS ITR、またはΔITR)を指すことができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、機能的TRSを欠くITRを含むrAAVベクターは、例えば、McCarthy(2008)Molecular Therapy 16(10):1648-1656に記載されているように、自己相補的rAAVベクターを産生する。
【0031】
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)
いくつかの側面では、本開示は、単離されたアデノ随伴ウイルス(AAV)を提供する。AAVに関して本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、人工的に産生されたまたは得られたAAVを指す。単離されたAAVは、組換え法を用いて産生されることもある。そのようなAAVは、本明細書において「組換えAAV」と呼ばれる。組換えAAV(rAAV)は、好ましくは、rAAVのヌクレアーゼ導入遺伝子が1つ以上の(1つまたは複数の)所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的標的化能力を有する。AAVカプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定する上で重要なエレメントである。したがって、標的化される組織に適したカプシドを有するrAAVが選択されることができる。
いくつかの側面では、本開示は、単離されたアデノ随伴ウイルス(AAV)を提供する。AAVに関して本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、人工的に産生されたまたは得られたAAVを指す。単離されたAAVは、組換え法を用いて産生されることもある。そのようなAAVは、本明細書において「組換えAAV」と呼ばれる。組換えAAV(rAAV)は、好ましくは、rAAVのヌクレアーゼ導入遺伝子が1つ以上の(1つまたは複数の)所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的標的化能力を有する。AAVカプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定する上で重要なエレメントである。したがって、標的化される組織に適したカプシドを有するrAAVが選択されることができる。
【0032】
所望のカプシドタンパク質を有する組換えAAVを得る方法は、当技術分野において周知である。(例えば、米国特許出願公開第2003/0138772号明細書を参照されたい)、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。典型的には、方法は、AAVカプシドタンパク質;機能的rep遺伝子;AAV逆位末端配列(ITR)および導入遺伝子から構成される組換えAAVベクター;および組換えAAVベクターのAAVカプシドタンパク質へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養することを伴う。いくつかの態様では、カプシドタンパク質は、AAVのcap遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。AAVは、3つのカプシドタンパク質、ビリオンタンパク質1～3(VP1、VP2およびVP3と命名)を含み、それらは全て、選択的スプライシング(alternative splicing)を介して単一のcap遺伝子から転写される。いくつかの態様では、VP1、VP2およびVP3の分子量はそれぞれ、約87kDa、約72kDaおよび約62kDaである。いくつかの態様では、翻訳時に、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周りに球状の60量体タンパク質殻を形成する。いくつかの態様では、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護する、ゲノムを送達する、および宿主と相互作用することである。いくつかの側面では、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムを組織特異様式で宿主に送達する。
【0033】
いくつかの態様では、AAVカプシドタンパク質は、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択されるAAV血清型のものである。いくつかの態様では、AAVカプシドタンパク質は、非ヒト霊長類に由来する血清型、例えばAAVrh8血清型のものである。いくつかの態様では、AAVカプシドタンパク質は、対象の眼に対する指向性を有する血清型、例えば、他のAAVカプシドタンパク質よりも効率的に対象の眼細胞を形質導入するAAV(例として、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39およびAAVrh.43)のものである。いくつかの態様では、AAVカプシドタンパク質は、AAV8血清型のものである。
【0034】
rAAVベクターをAAVカプシドにパッケージングするために宿主細胞内で培養される成分は、宿主細胞にトランスで提供されることもある。あるいは、必要な成分(例として、組換えAAVベクター、rep配列、cap配列、および/またはヘルパー機能)の任意の1つ以上は、当業者に公知の方法を使用して、必要な成分の1つ以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供されることもある。最も適切には、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモータの制御下で必要な(1または複数の)成分を含有するものと思われる。しかしながら、必要な(1または複数の)成分は、構成的プロモータの制御下にあることもある。適切な誘導性プロモータおよび構成的プロモータの例は、導入遺伝子と共に使用するのに適した調節エレメントの考察において、本明細書において提供される。更に別の代替形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモータの制御下にある選択された(1または複数の)成分および1つ以上の誘導性プロモータの制御下にある他の選択された(1または複数の)成分を含有することもある。例えば、293細胞(構成的プロモータの制御下でE1ヘルパー機能を含有する)に由来するが、誘導性プロモータの制御下でrepおよび/またはcapタンパク質を含有する安定な宿主細胞が作製されることもある。更に他の安定な宿主細胞は、当業者によって作製されることもある。
【0035】
いくつかの態様では、本開示は、タンパク質(例として、MiniABCA4タンパク質)をコードするコード配列を含む核酸を含有する宿主細胞に関する。いくつかの態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞(例として、HEK293細胞)または昆虫細胞(例として、SF9細胞)である。いくつかの態様では、本開示は、上記の宿主細胞を含む組成物に関する。いくつかの態様では、上記の宿主細胞を含む組成物は、凍結保存剤を更に含む。
【0036】
本開示のrAAVを産生するために必要な組換えAAVベクター、rep配列、cap配列、およびヘルパー機能は、任意の適切な遺伝エレメント(ベクター)を使用してパッケージング宿主細胞に送達されることもある。選択された遺伝エレメントは、本明細書において記載されるものを包含する任意の適切な方法によって送達されることもある。本開示の任意の態様を構築するために使用される方法は、核酸操作の当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を包含する。例として、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照されたい。同様に、rAAVビリオンを作製する方法は周知であり、適切な方法の選択は本開示に対する限定ではない。例として、K.Fisher et al.,J.Virol.,70:520-532(1993)および米国特許第5,478,745号を参照されたい。
【0037】
いくつかの態様では、組換えAAVは、トリプルトランスフェクション法(米国特許第6,001,650号明細書に詳細に記載されている)を使用して産生されることもある。典型的には、組換えAAVは、AAV粒子にパッケージングされる(導入遺伝子を含む)組換えAAVベクター、AAVヘルパー機能ベクター、およびアクセサリー機能ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生される。AAVヘルパー機能ベクターは、産生AAVの複製およびカプシド形成のためにトランスで機能する「AAVヘルパー機能」配列(すなわち、repおよびcap)をコードする。好ましくは、AAVヘルパー機能ベクターは、任意の検出可能な野生型AAVビリオン(すなわち、機能的なrepおよびcap遺伝子を含有するAAVビリオン)を生成することなく効率的なAAVベクター産生を支持する。本開示と共に使用するのに適したベクターの非限定的な例は、米国特許第6,001,650号に記載されるpHLP19および同第6,156,303号に記載されるpRep6cap6ベクターを包含し、両方の全体が参照により本明細書に組み込まれる。アクセサリー機能ベクターは、AAVが複製に依存する非AAV由来のウイルス機能および/または細胞機能(すなわち、「アクセサリー機能」)のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能は、限定するものではないが、AAV遺伝子転写の活性化、段階特異的AAV mRNAスプライシング、AAV DNA複製、cap発現産物の合成、およびAAVカプシドアセンブリを伴う部分を包含する、AAV複製に必要な機能を包含する。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルス1型以外)、およびワクシニアウイルス等の公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来されることができる。
【0038】
いくつかの側面では、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来DNAの取り込みを指すために使用され、外因性DNAが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が当技術分野において一般的に知られている。例として、Graham et al.(1973)Virology,52:456、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier、およびChu et al.(1981)Gene 13:197を参照されたい。そのような技術は、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子等の1つまたは複数の外因性核酸を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【0039】
「宿主細胞」は、目的の物質を保有する、または保有が可能である任意の細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、AAVヘルパー構築物、AAVミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組換えAAVの産生に関連する他のトランスファーDNAのレシピエントとして使用されることもある。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。したがって、本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は、外因性DNA配列をトランスフェクトされた細胞を指すこともある。単一の親細胞の子孫は、天然、偶発的、または意図的な突然変異のために、元の親と形態またはゲノム若しくは全DNA相補体が必ずしも完全に同一でないこともあることが理解されよう。
【0040】
本明細書において使用される場合、「細胞株」という用語は、in vitroで連続的または長期的な増殖および分裂が可能である細胞の集団を指す。多くの場合、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。このようなクローン集団の保存または移入中に核型に自発的または誘導的な変化が起こり得ることは、当技術分野において更に公知である。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一ではないこともあり、言及される細胞株はそのような変異体を包含する。
【0041】
本明細書において使用される場合、「組換え細胞」という用語は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはRNA等の生物学的に活性な核酸の産生をもたらすDNAセグメント等の外因性DNAセグメントが導入された細胞を指す。
【0042】
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと会合すると複製が可能であり、細胞間で遺伝子配列を移入することができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等の任意の遺伝エレメントを包含する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【0043】
方法
導入遺伝子を対象の眼(例として、桿体細胞または錐体細胞、網膜細胞等の光受容体)組織または耳に送達するための方法が本明細書において提供される。この方法は典型的には、対象に導入遺伝子(例として、MiniABCA4タンパク質)を発現させるための核酸を含む有効量のrAAVを対象に投与することを伴う。rAAVの「有効量」は、対象において十分な数の標的組織の細胞を感染させるのに十分な量である。いくつかの態様では、標的組織は眼(例として、光受容体、網膜等)組織である。いくつかの態様では、導入遺伝子は光受容体細胞または網膜色素上皮(RPE)に送達される。
導入遺伝子を対象の眼(例として、桿体細胞または錐体細胞、網膜細胞等の光受容体)組織または耳に送達するための方法が本明細書において提供される。この方法は典型的には、対象に導入遺伝子(例として、MiniABCA4タンパク質)を発現させるための核酸を含む有効量のrAAVを対象に投与することを伴う。rAAVの「有効量」は、対象において十分な数の標的組織の細胞を感染させるのに十分な量である。いくつかの態様では、標的組織は眼(例として、光受容体、網膜等)組織である。いくつかの態様では、導入遺伝子は光受容体細胞または網膜色素上皮(RPE)に送達される。
【0044】
いくつかの態様では、本開示は、MiniABCA4タンパク質(例として、MG-1、MG-4、またはMG-5;配列番号9、12および13のいずれか1つのアミノ酸配列を有するMiniABCA4タンパク質)をコードする核酸を含む有効量のrAAVを対象に投与する方法に関する。いくつかの態様では、MiniABCA4タンパク質(例として、MG-1、MG-4、またはMG-5)をコードする核酸を含むrAAVの有効量の投与は、対象に治療上の利益を提供する。
【0045】
いくつかの態様では、治療上の利益は、対照(例として、未処置対象または投与前の対象)と比較した網膜の外顆粒層(ONL)の厚さの増加である。いくつかの態様では、ONLは、野生型レベル(例として、正常な健康個体におけるONLの厚さ)まで増加される。いくつかの態様では、ONLは、少なくとも25％、40％、50％、60％、75％、100％またはそれ以上増加される。いくつかの態様では、rAAVの投与が野生型網膜と表現型的に区別できない網膜を提供するように、疾患対象のONLが増加される。いくつかの態様では、ONLは、対照対象(例として、未処置対象)に対して3～5μm、4～6μm、5～7μm、6～8μm、7～10μm、9～12μm、11～15μmまたはそれを超えて増加される。
【0046】
いくつかの態様では、治療上の利益は、網膜の外顆粒層(ONL)の厚さの保存または維持である。いくつかの態様では、ONLは野生型レベル(例として、正常な健康個体におけるONLの厚さ)で保存または維持される。いくつかの態様では、ONLの厚さは、ONLの厚さが(例として、投与前のONLの厚さに対して)25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、2％未満、または1％未満だけ低下されるように保存または維持される。いくつかの態様では、rAAVの投与が野生型網膜と表現型的に区別できない網膜を提供するように、疾患対象のONLが保存または維持される。
【0047】
いくつかの態様では、網膜のONLの厚さは、(i)本明細書において記載されるrAAVの投与前、および(ii)rAAVの投与後約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約12ヶ月、約13ヶ月、約14ヶ月、約15ヶ月、約16ヶ月、約17ヶ月、約18ヶ月、約19ヶ月、約20ヶ月、約21ヶ月、約22ヶ月、約23ヶ月、または約24ヶ月に測定される。
【0048】
いくつかの態様では、本明細書において記載されるrAAVの投与後の網膜のONLの厚さは、約55～70μm、約55～65μm、約60～70μmまたは約60～65μmである。いくつかの態様では、本明細書において記載されるrAAVの投与後約6ヶ月、約12ヶ月、約18ヶ月、または約24ヶ月での網膜のONLの厚さは、約55～70μm、約55～65μm、約60～70μm、または約60～65μmである。いくつかの態様では、本明細書において記載されるrAAVの投与後の網膜のONLの厚さは、少なくとも55μmまたは少なくとも60μmである。いくつかの態様では、本明細書において記載されるrAAV投与後の網膜のONLの厚さは、約55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69または70μmである。いくつかの態様では、本明細書において記載されるrAAVの投与後の網膜のONLの厚さは、健康なおよび/または野生型網膜とほぼ同じ厚さである。
【0049】
いくつかの態様では、本明細書において記載されるMiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むrAAVの有効量の投与は、対照(例として、未処置対象または投与前の対象)と比較して、対象の網膜におけるリポフスチンの減少をもたらす。いくつかの態様では、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むrAAVの有効量の投与は、調節不全または変異したABCA4に関連する網膜の疾患(例として、シュタルガルト病)に起因する対象の網膜におけるリポフスチン蓄積の逆転をもたらす。いくつかの態様では、また、本明細書において開示されるABCA4ミニ遺伝子、ベクター(例として、組換えAAVベクター)、ウイルスおよび組成物が使用されて、リポフスチン蓄積を特徴とする非眼疾患、状態、または障害(例として、眼の外側の疾患、状態または障害)を治療し得る。したがって、いくつかの態様では、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むrAAVの有効量の投与は、非眼疾患、状態、または障害に起因する対象のリポフスチン蓄積の逆転をもたらす。いくつかの態様では、本明細書において開示されるABCA4ミニ遺伝子、ベクター(例として、組換えAAVベクター)、ウイルスおよび組成物を使用して治療され得る非眼疾患は、神経セロイドリポフスチノース(例として、Batten病)、アルツハイマー病を包含する。パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、特定のリソソーム疾患、先端巨大症、除神経萎縮、脂質ミオパシー、慢性閉塞性肺疾患、中心核ミオパシー、および結腸メラノーシス(例として、結腸におけるリポフスチン蓄積から生じる)。更に、いくつかの態様では、本明細書において開示されるABCA4ミニ遺伝子、ベクター(例として、組換えAAVベクター)、ウイルスおよび組成物は、リポフスチンの加齢に伴う蓄積を減少させるのに有用であり得る。当業者は、疾患または状態に適した送達様式で上に列挙したもの等の非眼の状態を治療するために、本明細書において提供される開示を適切に修正し得る。
【0050】
いくつかの態様では、リポフスチンは、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むrAAVの投与後に少なくとも25％、40％、50％、60％、75％、100％またはそれを超えて低下される。いくつかの態様では、MiniABCA4タンパク質を含むrAAVの有効量の投与は、”Radu,R.A.,et.al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Apr 15;100(8):4742-4747.”に記載されているものと同様のリポフスチンレベルの低下をもたらす。
【0051】
いくつかの態様では、リポフスチンレベルは、(i)本明細書において記載されるrAAVの投与前、および(ii)rAAVの投与後約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約12ヶ月、約13ヶ月、約14ヶ月、約15ヶ月、約16ヶ月、約17ヶ月、約18ヶ月、約19ヶ月、約20ヶ月、約21ヶ月、約22ヶ月、約23ヶ月、または約24ヶ月に測定される。
【0052】
いくつかの態様では、本明細書において記載されるMiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むrAAVの有効量の投与は、対照(例として、未処置対象)と比較して、対象の網膜中のビス-レチノイドN-レチニル-N-レチニリデンエタノールアミン(A2E)の減少をもたらす。いくつかの態様では、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むrAAVの有効量の投与は、調節不全または変異したABCA4に関連する網膜の疾患(例として、シュタルガルト病)に起因する対象の網膜におけるA2E蓄積の逆転をもたらす。いくつかの態様では、A2Eは、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むrAAVの投与後に少なくとも25％、40％、50％、60％、75％、100％またはそれを超えて低下される。
【0053】
いくつかの態様では、A2Eレベルは、(i)本明細書において記載されるrAAVの投与前、および(ii)rAAVの投与後約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約12ヶ月、約13ヶ月、約14ヶ月、約15ヶ月、約16ヶ月、約17ヶ月、約18ヶ月、約19ヶ月、約20ヶ月、約21ヶ月、約22ヶ月、約23ヶ月、または約24ヶ月に測定される。
【0054】
いくつかの態様では、本明細書において記載されるMiniABCA4遺伝子をコードする核酸を含む有効量のrAAVを投与してから治療上の利益を得るまでの期間がある。いくつかの態様では、投与工程と網膜の外顆粒層(ONL)の増加、リポフスチン濃度の減少、および/またはビス-レチノイドN-レチニル-N-レチニリデンエタノールアミン(A2E)の減少との間に期間がある。いくつかの態様では、期間は、1～12時間、6～24時間、24～48時間、36～72時間、1～2日間、2～5日間、2～10日間、1～2週間、1～5週間、2～4週間、6～12週間、またはそれを超える。
【0055】
光刺激に対する網膜細胞の電気的応答を決定するために、網膜電図(ERG)を使用して、対象の網膜および網膜組織の機能が測定されることもある。ERGが使用されて、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むAAVの投与が網膜に治療上の利益をもたらすかどうかが決定されることもある。例えば、ERGが使用されて、網膜応答の差を測定し、眼疾患(例として、シュタルガルト病)および網膜変性の潜在的治療を評価し得る。いくつかの態様では、対象の網膜は、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むAAVの網膜への投与の前および/または後にERGに供され得る。いくつかの態様では、対象の網膜は、投与前およびMiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むAAVを網膜に投与した後の約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約12ヶ月、約13ヶ月、約14ヶ月、約15ヶ月、約16ヶ月、約17ヶ月、約18ヶ月、約19ヶ月、約20ヶ月、約21ヶ月、約22ヶ月、約23ヶ月、または約24ヶ月のERGに供され得る。いくつかの態様では、ERGが使用されて、本明細書において記載されるABCA4ミニ遺伝子の有効性が決定され得る。
【0056】
いくつかの態様では、ERGを使用して評価される暗順応a波および/または暗順応b波の振幅は、MiniABCA4タンパク質をコードする核酸を含むAAVを網膜に投与した後に増加される(例として、未処理網膜またはBSS等の対照で処理した網膜に対して)。いくつかの態様では、ERGを使用して評価される暗順応a波および/または暗順応b波の振幅は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、100％またはそれ以上増加される。いくつかの態様では、暗順応a波および/または暗順応b波の増加は、ABCA4ミニ遺伝子の有効性を示す。
【0057】
rAAVの有効量は、対象において治療的利益を有する、例として、対象において疾患の1つ以上の症状、例として、シュタルガルト病(例として、ABCA4遺伝子の欠失または変異に関連する疾患)の症状を改善するのに十分な量であることもある。ABCA4遺伝子の変異の例は、ABCA4タンパク質中のアミノ酸置換G1961EおよびD2177Nをもたらす変異を包含する。有効量は、例えば、種、年齢、体重、対象の健康状態、および標的とされる眼組織等の様々な因子に依存し、したがって対象および組織間で異なることもある。有効量はまた、使用されるrAAVに依存することもある。
【0058】
特定の態様では、rAAVの有効量は、1010、1011、1012、1013または1014ゲノムコピー/kgである。特定の態様では、rAAVの有効量は、1010、1011、1012、1013または1014、または1015ゲノムコピー/対象である。
【0059】
本開示の側面は、シュタルガルト病を治療することを必要とする対象のシュタルガルト病を治療する方法に関する。いくつかの態様では、対象は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類等である。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【0060】
本明細書において使用される場合、「治療する」という用語は、障害、疾患の症状、またはシュタルガルト病の素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、矯正、改善、または影響を及ぼす目的で、シュタルガルト病の1つ以上の兆候または症状(例として、視界がぼやけている、または歪んでいる、低照度で見ることができない、色覚が失われている、ABCA4遺伝子の1つまたは複数の変異等)を示す対象に組成物(例として、本明細書において記載される単離された核酸またはrAAV)を適用または投与することを指す。
【0061】
シュタルガルト病の軽減は、疾患の発症または進行の遅延、または疾患重症度の軽減を包含する。疾患を処置することは、根治した(curative)結果を必ずしも要さない。そこで使用された通り、シュタルガルト病の発症を「遅延すること」は、疾患の進行を、先送りする(defer)、妨げる(hinder)、遅らせる(slow)、妨害する(retard)、留める(stabilize)、および/または延ばす(postpone)ことを意味する。この遅延は、病歴および/または処置される個体に応じて、時間の長さを変動させることでもあり得る。疾患の発症を「遅延」若しくは緩和する方法、または疾患の発病を遅延する方法は、この方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠での疾患の1以上の症状を発症する確率を低減するか、および/または所定の時間枠での症状の程度を低減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに充分数多の対象を使用する臨床研究に基づく。
【0062】
疾患の「発症」または「進行」は、最初の兆候および/またはその後の疾患の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知の通りの標準の臨床技法を使用し検出可能であり、かつ査定され得る。しかしながら、発症はまた、検出不能であることもある進行も指す。本開示の目的上、発症または進行は、症状の生物学的な経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を包含する。
【0063】
有効量はまた、投与の様式に依存することもある。例えば、眼(例として、光受容体、網膜等)組織を基質内投与または皮下注射によって標的化することは、場合によっては、別の方法(例として、全身投与、局所投与)によって眼(例として、光受容体、網膜等)組織を標的化することとは異なる(例として、より高いまたはより低い)用量を必要とすることもある。いくつかの態様では、特定の血清型(例として、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、およびAAVrh.43)を有するrAAVの基質内注射(IS)は、眼(例として、角膜、光受容体、網膜等)細胞の効率的な形質導入を媒介する。したがって、いくつかの態様では、注射は、基質内注射(IS)である。いくつかの態様では、投与は、注射、任意選択的に網膜下注射または硝子体内注射または上脈絡膜注射によるものである。いくつかの態様では、注射は局所投与(例として、眼への局所投与)である。場合によっては、rAAVの複数回用量が投与される。
【0064】
rAAVは、当技術分野において公知の任意の適切な方法による組成物で対象に送達されることもある。rAAVは、好ましくは生理学的に適合性の担体(すなわち、組成物中)に懸濁され、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類(例として、マカク)等の宿主動物に投与されることもある。いくつかの態様では、宿主動物はヒトを包含しない。
【0065】
哺乳動物対象へのrAAVの送達は、例えば、眼内注射または局所投与(例として、点眼剤)によるものであることもある。いくつかの態様では、眼内注射は、実質内注射、結膜下注射、または硝子体内注射を含む。いくつかの態様では、注射は局所投与ではない。投与方法(例として、局所投与および基質内注射)の組合せも使用され得る。
【0066】
本開示の組成物は、rAAVを単独で、または1つ以上の他のウイルス(例として、異なるMiniABCA4タンパク質をコードする導入遺伝子等の1つまたは複数の異なる導入遺伝子を有する第2のrAAVコード)と組み合わせて含むこともある。いくつかの態様では、組成物は、それぞれが1つ以上の異なる導入遺伝子を有する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の異なるrAAVを含む。
【0067】
いくつかの態様では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。適切な担体は、rAAVが向けられる適応症を考慮して当業者によって容易に選択されることもある。例えば、1つの適切な担体は、生理食塩水を包含し、これは様々な緩衝液と共に製剤化されることもある(例として、リン酸緩衝生理食塩水)。
【0068】
他の例示的な担体は、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油および水を包含する。担体の選択は、本開示を限定するものではない。
【0069】
任意選択的に、本開示の組成物は、rAAVおよび(1または複数の)担体に加えて、防腐剤または化学安定剤等の他の医薬成分を含有することもある。適切な例示的な防腐剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含する。適切な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【0070】
rAAVは、所望の組織(例として、光受容体、網膜等の眼組織、組織)の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なしに十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供するのに十分な量で投与される。薬学的に許容され得る投与経路の例は、選択された臓器への直接送達(例として、眼への網膜下送達)、経口、吸入(鼻腔内および気管内送達を包含する)、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内および他の親投与経路を包含するが、これらに限定されない。所望であれば、投与経路は組み合わされることもある。
【0071】
特定の「治療効果」を達成するために必要なrAAVビリオンの用量、例として、体重1キログラム当たりのゲノムコピー(GC/kg)での用量の単位は、限定するものではないが、rAAVビリオンの投与経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはRNA発現のレベル、治療されている特定の疾患または障害、および遺伝子またはRNA産物の安定性を包含するいくつかの因子に基づいて変動する。当業者は、上述の因子ならびに他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有するペイシェントを治療するためのrAAVビリオン用量範囲を容易に決定し得る。
【0072】
rAAVの有効量は、動物の感染を標的とし、所望の組織を標的とするのに十分な量である。有効量は、主に、種、年齢、体重、対象の健康状態、および標的とする組織等の因子に依存するものと思われ、したがって動物および組織間で変動することもある。例えば、rAAVの有効量は、一般に、約109～1016のゲノムコピーを含有する溶液約1ml～約100mlの範囲である。場合によっては、約1011～1013のrAAVゲノムコピーの投与量が適切である。特定の態様では、109のrAAVゲノムコピーが眼組織(例として、角膜組織)を標的化するのに有効である。
【0073】
いくつかの態様では、109のrAAVゲノムコピーよりもより濃縮された用量は、対象の眼に投与した場合に毒性である。いくつかの態様では、有効量は、rAAVの複数回用量によって生成される。いくつかの態様では、対象は、rAAVの投与前に1つまたは複数の免疫抑制剤(例として、コルチコステロイド、メトトレキサート、シクロスポリンA、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムス、リツキシマブ、シロリムス、メチルプレドニゾロン、CTLA4Ig、非枯渇CD4 Ab、およびT細胞枯渇抗胸腺細胞γグロブリン(ATG)等)を投与される。
【0074】
いくつかの態様では、rAAVの用量は、暦による1日(例として、24時間の期間)当たり1回以下で対象に投与される。いくつかの態様では、rAAVの用量は、暦による2、3、4、5、6、または7日当たり1回以下で対象に投与される。いくつかの態様では、rAAVの用量は、暦による1週間(例として、暦による7日)当たり1回以下で対象に投与される。いくつかの態様では、rAAVの用量は、暦による隔週当たり1回以下(例として、2週間に1回)で対象に投与される。いくつかの態様では、rAAVの用量は、暦による1ヶ月当たり1回以下(例として、暦による30日に1回)で対象に投与される。いくつかの態様では、rAAVの用量は、暦による6ヶ月当たり1回以下で対象に投与される。いくつかの態様では、rAAVの用量は、暦による1年(例として、365日または閏年では366日)当たり1回以下で対象に投与される。
【0075】
いくつかの態様では、rAAV組成物は、特に高いrAAV濃度が存在する場合(例として、約1013GC/ml以上)、組成物中のAAV粒子の凝集を減少させるように製剤化される。例えば、界面活性剤の添加、pH調整、塩濃度調整等を包含する、凝集を減少させるための適切な方法が使用されることもある。(例として、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Wright et al.,Molecular Therapy(2005)12,171-178を参照されたい。)
【0076】
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤化は、様々な治療レジメンにおいて本明細書において記載される特定の組成物を使用するための適切な投与および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。典型的には、これらの製剤は、少なくとも約0.1％の活性化合物またはそれ以上を含有することもあるが、もちろん、活性成分(複数可)の割合は変化することもあり、好都合には、製剤全体の重量または体積の約1または2％～約70％または80％以上であることもある。当然のことながら、各治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物の任意の所与の単位用量で適切な投与量が得られるように調製されることもある。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、産物の貯蔵寿命等の因子、ならびに他の薬理学的留意事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。そのため様々な投薬量および処置計画が所望されることもある。
【0077】
いくつかの態様では、本明細書において開示される適切に製剤化された医薬組成物中のrAAVは、標的組織に直接、例として、眼組織(例として、光受容体、網膜等の組織)に直接送達される。しかしながら、特定の状況では、別の経路、例として、皮下、膵臓内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、または経口、腹腔内、または吸入によって、rAAVベースの治療用構築物が別々にまたは更に送達されることが望ましいこともある。いくつかの態様では、米国特許第5,543,158号明細書;同第5,641,515号明細書および同第5,399,363号明細書(それぞれその全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる)に記載の投与モダリティを、rAAVを送達するために使用されることもある。いくつかの態様では、好ましい投与様式は硝子体内注射または網膜下注射によるものである。
【0078】
注射使用に適した医薬形態は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を包含する。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中および油中で調製されることもある。保存および使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。多くの場合、形態は無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、それらの適切な混合物、および/または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されることもある。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを包含することが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。
【0079】
注射用水溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されることもあり、液体希釈剤は、まず十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、適切な滅菌水性媒体が利用されることもある。例えば、1回の投与量は1mlの等張性NaCl溶液に溶解し、1000mlの皮下点滴液に添加するか、または提案された注入部位に注射されることもある(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Edition,pages 1035-1038および1570-1580を参照されたい)。投与量のいくらかの変動は、宿主の状態に応じて必然的に生じるものと思われる。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の主に対する適切な用量を決定するものと思われる。
【0080】
滅菌注射溶液は、必要な量の活性rAAVを、必要に応じて、本明細書において列挙される様々な他の成分と共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎分散媒および上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を、すでに滅菌濾過されたその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【0081】
本明細書において開示されるrAAV組成物はまた、中性形態または塩形態で製剤化されることもある。薬学的に許容される塩は、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基で形成される)を包含し、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄等、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導されることができる。製剤化すると、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療上有効な量で投与されるものと思われる。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル等の様々な剤形で容易に投与される。
【0082】
本明細書において使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等を包含する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。補助活性成分も組成物に組み込まれることができる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与した場合にアレルギー反応または類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。
【0083】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等の送達ビヒクルが、本開示の組成物を適切な宿主細胞に導入するために使用されることもある。特に、rAAVベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子等に封入された送達用に製剤化されることもある。
【0084】
そのような製剤は、本明細書において開示される核酸またはrAAV構築物の薬学的に許容される製剤の導入に好ましい場合があることもある。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に公知である。最近、改善された血清安定性および循環半減時間を有するリポソームが開発された(米国特許第5,741,516号)。更に、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている(米国特許第5,567,434号;同第5,552,157号;同第5,565,213号;同第5,738,868号および同第5,795,587号)。
【0085】
リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに対して通常耐性である多数の細胞型でうまく使用されてきた。更に、リポソームは、ウイルスに基づく送達系に典型的なDNA長さの制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されてきた。更に、リポソーム媒介薬物送達の有効性を調べるいくつかの成功した臨床試験が完了している。
【0086】
リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、自発的に多層同心二重層小胞(多層小胞(MLV)とも呼ばれる)を形成する。MLVは、一般に、25nm～4μmの直径を有する。MLVの音波処理は、コアに水溶液を含有する、200～500Åの範囲の直径を有する小さな単層小胞(SUV)の形成をもたらす。
【0087】
あるいは、rAAVのナノカプセル製剤が使用されることもある。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現性のある方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を回避するために、そのような超微粒子(約0.1μmのサイズ)は、in vivoで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル-シアノアクリラートナノ粒子を使用することが企図される。
【0088】
例
例1:miniABCA4遺伝子構築物MG-1～MG-6
この例は、光受容体に機能(例として、部分ABCA4機能)を保持するABCA4(例として、ABCA4ミニ遺伝子およびその遺伝子産物、「MiniABCA4」)の1つまたは複数のドメインを有するAAVベクター(およびrAAV)の同定および産生を記載する。miniABCA4タンパク質の発現および安定性は、培養HEK293細胞においてそれらをタンパク質のMYCタグ付きバージョンとして発現させることによって試験される。最適な発現および安定性を示すバージョンが、Abca4-/-マウスにin vivoで注射される。ウイルス粒子は偽型であり(例として、AAV2/8)、発現は主に光受容体を標的とするプロモータによって駆動される。MiniABCA4構築物は、網膜下注射を用いて投与された。図1および配列番号3～8は、MiniABCA4構築物MG-1～MG-6の態様を示す。配列番号9～14は、MG-1～MG-6に対するMiniABCA4タンパク質の態様を示す。
例1:miniABCA4遺伝子構築物MG-1～MG-6
この例は、光受容体に機能(例として、部分ABCA4機能)を保持するABCA4(例として、ABCA4ミニ遺伝子およびその遺伝子産物、「MiniABCA4」)の1つまたは複数のドメインを有するAAVベクター(およびrAAV)の同定および産生を記載する。miniABCA4タンパク質の発現および安定性は、培養HEK293細胞においてそれらをタンパク質のMYCタグ付きバージョンとして発現させることによって試験される。最適な発現および安定性を示すバージョンが、Abca4-/-マウスにin vivoで注射される。ウイルス粒子は偽型であり(例として、AAV2/8)、発現は主に光受容体を標的とするプロモータによって駆動される。MiniABCA4構築物は、網膜下注射を用いて投与された。図1および配列番号3～8は、MiniABCA4構築物MG-1～MG-6の態様を示す。配列番号9～14は、MG-1～MG-6に対するMiniABCA4タンパク質の態様を示す。
【0089】
網膜色素上皮(RPE)バックグラウンド自家蛍光の減少が代用アッセイとして使用されて、miniABCA4候補の有効性を試験が試験された。Abca4-/-マウスに、生後30日のAbca4-1(MG-1)構築物が注射され、RPE自己蛍光が蛍光顕微鏡法によって測定された。RPE細胞がマーカーZO-1で染色された。代表的なデータが図2に示された。野生型対照と比較して、Abca4-/-マウスは、4月齢で488nM波長でより高いRPE自己蛍光を示した。miniABCA4-1の注射は、488nM波長での自己蛍光の有意な減少をもたらし、miniABCA4-1がレスキュー効果を有したことを示した。
【0090】
他のABCA4ミニ遺伝子構築物は、RPE自己蛍光アッセイを使用して試験され、結果は図3で定量された。Abca4-/-マウスに、miniABCA4-1(MG-1)、miniABCA4-2(MG-2)、miniABCA4-4(MG-4)、またはminiABCA4-5(MG-5)が注射された。注射は生後10日または30日(P10またはP30)のいずれかに行われ、RPE自己蛍光はグラフ上の示された年齢の時点で測定された。データは、いくつかのminiABCA4構築物が、注射を受けていないAbca4-/-マウスと比較してRPE自己蛍光を有意に減少させ、P30での注射が、P10での注射と比較してRPE自己蛍光のより良好な改善をもたらしたことを示す。
【0091】
例2:miniABCA4遺伝子構築物MG-7～MG-11
この例は、MG-7～MG-11と呼ばれる追加のABCA4ミニ遺伝子設計、およびこれらのABCA4ミニ遺伝子を発現するAAVベクター(およびrAAV)の産生を記載する。miniABCA4タンパク質の発現および安定性は、培養HEK293細胞においてそれらをタンパク質のMYCタグ付きバージョンとして発現させることによって試験された(図5)。チューブリンが負荷対照として使用された。図4および配列番号15～配列番号19は、MiniABCA4構築物MG-7～MG-11の態様を示す。配列番号20～24は、MG-7～MG-11に対するMiniABCA4タンパク質の態様を示す。
この例は、MG-7～MG-11と呼ばれる追加のABCA4ミニ遺伝子設計、およびこれらのABCA4ミニ遺伝子を発現するAAVベクター(およびrAAV)の産生を記載する。miniABCA4タンパク質の発現および安定性は、培養HEK293細胞においてそれらをタンパク質のMYCタグ付きバージョンとして発現させることによって試験された(図5)。チューブリンが負荷対照として使用された。図4および配列番号15～配列番号19は、MiniABCA4構築物MG-7～MG-11の態様を示す。配列番号20～24は、MG-7～MG-11に対するMiniABCA4タンパク質の態様を示す。
【0092】
例3.
選択されたABCA4ミニ遺伝子(配列番号3、6および7にそれぞれ対応するMG-1、MG-4およびMG-5)は、網膜下注射後のABCA4-KOマウス(Abca4-/-マウス)の網膜で発現された。4～6週齢のABCA4-KOマウスの網膜下に、対照(BSS)、MG-1を含むrAAV、MG-4を含むrAAV、またはMG-5を含むrAAVを注射された。ABCA4ミニ遺伝子を含むrAAVは、(i)内部リボソーム進入部位(IRES)の上流にCMV/ニワトリβ-アクチンプロモータ、ABCA4ミニ遺伝子、およびβ-グロビンイントロンを有し、ABCA4ミニ遺伝子がAAV2 ITRに隣接しているAAV2ベクター骨格、および(ii)AAV8カプシドタンパク質を利用した。更なる対照は、未処置ABCA4-KOマウスおよび未処置野生型マウス(192sv-WT)を包含した。13～14月齢(すなわち、網膜下注射の12～13ヶ月後)でマウスが屠殺された。RNAおよびタンパク質が注射マウスの網膜から抽出された。
選択されたABCA4ミニ遺伝子(配列番号3、6および7にそれぞれ対応するMG-1、MG-4およびMG-5)は、網膜下注射後のABCA4-KOマウス(Abca4-/-マウス)の網膜で発現された。4～6週齢のABCA4-KOマウスの網膜下に、対照(BSS)、MG-1を含むrAAV、MG-4を含むrAAV、またはMG-5を含むrAAVを注射された。ABCA4ミニ遺伝子を含むrAAVは、(i)内部リボソーム進入部位(IRES)の上流にCMV/ニワトリβ-アクチンプロモータ、ABCA4ミニ遺伝子、およびβ-グロビンイントロンを有し、ABCA4ミニ遺伝子がAAV2 ITRに隣接しているAAV2ベクター骨格、および(ii)AAV8カプシドタンパク質を利用した。更なる対照は、未処置ABCA4-KOマウスおよび未処置野生型マウス(192sv-WT)を包含した。13～14月齢(すなわち、網膜下注射の12～13ヶ月後)でマウスが屠殺された。RNAおよびタンパク質が注射マウスの網膜から抽出された。
【0093】
抽出したRNAは、RT酵素の存在下(＋)または非存在下(-)で、MYCタグエピトープおよびABCA4ミニ遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)に供された。ミニ遺伝子を注射したマウスから抽出し、RT酵素を使用して増幅したRNA試料中のABCA4ミニ遺伝子プライマー(229塩基対)の増幅によって示されるように、注射したマウス網膜中の全てのミニ遺伝子(MG-1、MG-4、MG-5)について遺伝子発現が検出され得る(図6)。RT-PCR工程内の対照として、ミニ遺伝子を注射したマウスから抽出したRNA試料中のマウスGAPDHプライマー(209塩基対)の増幅が観察された。RT-PCR反応もDNAの非存在下で行われた(すなわち、DNA対照なし)。これらのデータは、MG-1、MG-4、およびMG-5ミニ遺伝子の全てが網膜に網膜下注射され得、これらの網膜はその後、MG-1、MG-4、およびMG-5ミニ遺伝子を発現することができることを実証している。
【0094】
網膜におけるABCA4ミニ遺伝子タンパク質の発現が観察された(図7)。ミニ遺伝子の発現は、ミニ遺伝子を注射した網膜の光受容体の外側セグメント領域で検出された。検出は、MYCエピトープに対する抗体ならびに抗ABCA4抗体を使用して行われた。MG-1、MG-4、およびMG-5タンパク質が検出され、これらのミニ遺伝子タンパク質がそれらの対応する核酸配列の網膜下注射時に発現されることを示した。特に、対照(BSS)のみを注射した網膜では検出可能な発現はなかった。BSSまたは表示のミニ遺伝子を注射したマウスの網膜の凍結切片が抗MYCおよび抗ABCA4抗体で染色された。矢印は、各実験の抗体特異的シグナルを示す。これらのデータは、MG-1、MG-4、およびMG-5ミニ遺伝子タンパク質(それぞれ配列番号9、配列番号12および配列番号13に対応する)の全てが、網膜への対応する核酸の網膜下注射後に細胞で発現され得ることを実証している。
【0095】
ミニABCA4ミニ遺伝子の治療可能性は、MG-1、MG-4、MG-5またはBSSを注射したマウスの眼底検査/光干渉断層法(OCT)を使用して観察された。図8A～8Bに示すように、ImageJを使用して全てのミニ遺伝子注射マウスの外顆粒層(ONL)の厚さが測定され、BSS注射マウス(対照)と比較された。図8Aの眼底画像における横線は、OCT画像で用いられる領域に相当する。矢印は、ImageJを使用してこの実験で測定された外顆粒層(ONL)の領域を表す。各網膜のONL厚さが定量化された(図8B)。統計学的有意性のために、一元配置ANOVA多重比較およびDunnettの多重比較検定が行われた。****:p＜0.0001。未処置の野生型マウス(4匹のマウス)は、約62μmの平均ONL厚さを有していた。一方、未処置ABCA4-KOマウス(4匹のマウス)は、約53μmのはるかにより低いONL厚を有していた。しかしながら、MG-5(5匹のマウス)ミニ遺伝子で処置したABCA4-KOマウスは、野生型マウスと同じレベル、約63μmでONL厚さの保存を経験した。これらのデータは、MG-5が有意な治療上の利益および未処置ABCA4-KOマウスの表現型(例として、ONL厚さの減少)からの救済を提供することを実証している。
【0096】
治療可能性は、MG-1、MG-4またはMG-5を含むrAAVを網膜下に注射したABCA4-KOマウス(14ヶ月)のERGの改善を観察することによって更に評価された(図9A～9B)。MG-1を含むrAAVを注射したマウスの網膜の暗順応a波および暗順応b波の振幅は、約55mVの暗順応a波および約200mVのb波を示し、BSS対照処置と比較して潜在的に有意な増加であった。
【0097】
例4.
網膜色素上皮自己蛍光(RPE)の増加はABCA4媒介病変に関連するので、RPE自己蛍光に対するMGミニ遺伝子の効果が調査された。(i)MG-1、MG-2、MG-4、またはMG-5のいずれか、および(ii)MYCタグを含む構築物が、リポフェクタミンを使用してhTERT-RPE細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクトしたベクターを含まない細胞は陰性対照として使用された。MYCを発現する空のベクター(pCDNA.1 CMV Myc)は陽性対照として細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞が、抗MYC抗体(構築物を含む細胞を同定するため)およびDAPI(核を染色するため)を使用して染色するために処理された。図10に示すように、細胞は、試験した各ミニ遺伝子構築物で細胞を首尾よくトランスフェクトされ、これは各ミニ遺伝子についていくつかの細胞でMYCタグが検出されたことによって証明される。トランスフェクトされたベクターを含まない細胞は、MYCタグを示さなかった。
網膜色素上皮自己蛍光(RPE)の増加はABCA4媒介病変に関連するので、RPE自己蛍光に対するMGミニ遺伝子の効果が調査された。(i)MG-1、MG-2、MG-4、またはMG-5のいずれか、および(ii)MYCタグを含む構築物が、リポフェクタミンを使用してhTERT-RPE細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクトしたベクターを含まない細胞は陰性対照として使用された。MYCを発現する空のベクター(pCDNA.1 CMV Myc)は陽性対照として細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞が、抗MYC抗体(構築物を含む細胞を同定するため)およびDAPI(核を染色するため)を使用して染色するために処理された。図10に示すように、細胞は、試験した各ミニ遺伝子構築物で細胞を首尾よくトランスフェクトされ、これは各ミニ遺伝子についていくつかの細胞でMYCタグが検出されたことによって証明される。トランスフェクトされたベクターを含まない細胞は、MYCタグを示さなかった。
【0098】
例5.
Abca4-/-マウスに、MG-1、MG-4、またはMG-5を含む構築物が注射された。非注射ABCA4ノックアウトマウスは対照として使用された。注射後の様々な期間の後、RPE自己蛍光(波長488nM)が蛍光顕微鏡法によって測定された(図12)。非注射ABCA4-/-マウスは、寿命の全ての段階で488nMの波長でより高いRPE自己蛍光を示した。試験したミニ遺伝子のいずれか1つの注射は、可変期間のそれぞれで自己蛍光の統計的に有意な減少をもたらした。MG-1の注射は、注射後3ヶ月および10ヶ月で、非注射マウスと比較してRPE自己蛍光の減少を引き起こした。MG-4の注射は、注射後5ヶ月および7ヶ月で、非注射マウスと比較してRPE自己蛍光の減少を引き起こした。MG-5の注射は、注射後3ヶ月および10ヶ月で、非注射マウスと比較してRPE自己蛍光の減少を引き起こした。これらのデータは、細胞におけるRPE自己蛍光効果の救済におけるミニ遺伝子の有用性を実証している。
Abca4-/-マウスに、MG-1、MG-4、またはMG-5を含む構築物が注射された。非注射ABCA4ノックアウトマウスは対照として使用された。注射後の様々な期間の後、RPE自己蛍光(波長488nM)が蛍光顕微鏡法によって測定された(図12)。非注射ABCA4-/-マウスは、寿命の全ての段階で488nMの波長でより高いRPE自己蛍光を示した。試験したミニ遺伝子のいずれか1つの注射は、可変期間のそれぞれで自己蛍光の統計的に有意な減少をもたらした。MG-1の注射は、注射後3ヶ月および10ヶ月で、非注射マウスと比較してRPE自己蛍光の減少を引き起こした。MG-4の注射は、注射後5ヶ月および7ヶ月で、非注射マウスと比較してRPE自己蛍光の減少を引き起こした。MG-5の注射は、注射後3ヶ月および10ヶ月で、非注射マウスと比較してRPE自己蛍光の減少を引き起こした。これらのデータは、細胞におけるRPE自己蛍光効果の救済におけるミニ遺伝子の有用性を実証している。
【0099】
例6.
Abca4-/-マウスに、MG-1、MG-4、またはMG-5(N＝4、3、および3)を含む構築物で腹側中心網膜領域に注射された。非注射ABCA4-/-マウス、非注射野生型マウス、および平衡塩類溶液(BSS)を注射したABCA4-/-マウスが対照として使用された(各対照群についてN＝3)。ABCA4-/-マウスは12～15月齢であったが、野生型マウスは15月齢であった。
Abca4-/-マウスに、MG-1、MG-4、またはMG-5(N＝4、3、および3)を含む構築物で腹側中心網膜領域に注射された。非注射ABCA4-/-マウス、非注射野生型マウス、および平衡塩類溶液(BSS)を注射したABCA4-/-マウスが対照として使用された(各対照群についてN＝3)。ABCA4-/-マウスは12～15月齢であったが、野生型マウスは15月齢であった。
【0100】
注射後、腹側中心網膜領域(図13A)、腹側周辺部(図13B)、背側中心部(図13C)および背側周辺部(図13D)中のリポフスチン顆粒の量が電子顕微鏡法によって測定された。非注射ABCA4-/-マウスは、野生型マウスと比較してより高いリポフスチン濃度を示した。Abca4-/-マウスに試験した各ミニ遺伝子を注射すると、BSSで処置したAbca4-/-マウスと比較して、腹側中心のリポフスチン濃度が統計学的に有意に低下した。これらのデータは、in vivo(例として、網膜において)でのリポフスチン濃度の減少におけるミニ遺伝子の有用性を実証している。
【0101】
配列
いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列と相補的(例として、補足的)である配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列の逆相補体である配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列の一部を含むかまたはそれからなる。部分は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに記載の配列の少なくとも25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％を含むこともある。いくつかの態様では、本開示によって記載される核酸配列は、核酸センス鎖(例として、5'から3'鎖)であるか、またはウイルス配列の文脈ではプラス(＋)鎖である。いくつかの態様では、本開示によって記載される核酸配列は、核酸アンチセンス鎖(例として、3'から5'鎖)であるか、またはウイルス配列の文脈ではマイナス(-)鎖である。
いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列と相補的(例として、補足的)である配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列の逆相補体である配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、本開示によって記載される単離された核酸またはベクター(例として、rAAVベクター)は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに示される配列の一部を含むかまたはそれからなる。部分は、配列番号3～8および15～19のいずれか1つに記載の配列の少なくとも25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％を含むこともある。いくつかの態様では、本開示によって記載される核酸配列は、核酸センス鎖(例として、5'から3'鎖)であるか、またはウイルス配列の文脈ではプラス(＋)鎖である。いくつかの態様では、本開示によって記載される核酸配列は、核酸アンチセンス鎖(例として、3'から5'鎖)であるか、またはウイルス配列の文脈ではマイナス(-)鎖である。
【0102】
追加の態様
本開示の更なる態様は、以下の番号が付けられた段落に組み入れられる。
本開示の更なる態様は、以下の番号が付けられた段落に組み入れられる。
【0103】
1.配列番号3～8および15～19のいずれか1つに記載の配列を有するABCA4ミニ遺伝子をコードする導入遺伝子を含む、単離された核酸。
【0104】
2.導入遺伝子が、ABCA4ミニ遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータを更に含む、段落1に記載の単離された核酸。
【0105】
3.プロモータが、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータであり、任意選択的に、組織特異的プロモータは光受容体特異的プロモータである、段落2に記載の単離された核酸。
【0106】
4.導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)に隣接している、段落1～3のいずれか1つに記載の単離された核酸。
【0107】
5.ITRの少なくとも1つがAAV2 ITRである、段落4に記載の単離された核酸。
【0108】
6.少なくとも1つのITRが末端分割部位を欠き、任意選択的にITRがΔITRである、段落4または5に記載の単離された核酸。
【0109】
7.ABCA4タンパク質が、配列番号9～14および20～24のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、ABCA4タンパク質をコードする核酸配列を有する導入遺伝子を含む、単離された核酸。
【0110】
8.導入遺伝子が、ABCA4タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを更に含む、段落7に記載の単離された核酸。
【0111】
9.プロモータが、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータであり、任意選択的に、組織特異的プロモータは光受容体特異的プロモータである、段落8に記載の単離された核酸。
【0112】
10.導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)に隣接している、段落7～9のいずれか1つに記載の単離された核酸。
【0113】
11.ITRの少なくとも1つがAAV2 ITRである、段落10に記載の単離された核酸。
【0114】
12.少なくとも1つのITRが末端分割部位を欠き、任意選択的にITRがΔITRである、段落10または11に記載の単離された核酸。
【0115】
13.段落1～12のいずれか1つに記載の単離された核酸を含むベクター。
【0116】
14.ベクターが、プラスミドDNA、またはクローズドエンドDNA、または脂質/DNAナノ粒子、またはウイルスベクターである、段落13に記載のベクター。
【0117】
15.ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルス(Ad)ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである、段落14に記載のベクター。
【0118】
16.段落1～12のいずれか1つに記載の単離された核酸、または段落13～15のいずれか1つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
【0119】
17.細胞が、哺乳動物(ヒト)細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞である、段落16に記載の宿主細胞。
【0120】
18.組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)であって、
(i)段落1～12のいずれか一項に記載の単離された核酸;および
(ii)AAVカプシドタンパク質
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)。
(i)段落1～12のいずれか一項に記載の単離された核酸;および
(ii)AAVカプシドタンパク質
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)。
【0121】
19.カプシドタンパク質が眼細胞に対する親和性を有する、段落18に記載のrAAV。
【0122】
20.カプシドタンパク質がAAV8カプシドタンパク質である、段落18または19に記載のrAAV。
【0123】
21.rAAVが眼への送達のために製剤化されており、任意選択的にrAAVが光受容体細胞または網膜色素上皮(RPE)への送達のために製剤化されている、段落18から20のいずれか1つに記載のrAAV。
【0124】
22.段落1～12のいずれか1つに記載の単離された核酸、または段落18～21のいずれか1つに記載のrAAVと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【0125】
23.導入遺伝子を細胞に送達する方法であって、段落1～12のいずれか1つに記載の単離された核酸または段落18～21のいずれか1つに記載のrAAVを細胞に投与することを含む方法。
【0126】
24.細胞が、対象、任意選択的に哺乳動物(ヒト)対象にある、段落23に記載の方法。
【0127】
25.細胞が眼細胞である、段落23または24に記載の方法。
【0128】
26.眼細胞が光受容体細胞または網膜色素上皮(RPE)である、段落25に記載の方法。
【0129】
27.シュタルガルト病を治療することを必要とする対象のシュタルガルト病を治療する方法であって、方法が、段落1～12のいずれか1つの単離された核酸または段落18～21のいずれか1つのrAAVを対象に投与することを含む、方法。
【0130】
28.対象が哺乳動物であり、任意選択的に、対象がヒトである、段落27に記載の方法。
【0131】
29.対象が、ABCA4遺伝子に1つまたは複数の変異を有することを特徴とする、段落27または28に記載の方法。
【0132】
30.投与が注射、任意選択的に網膜下注射若しくは硝子体内注射または上脈絡膜注射によるものである、段落27～29のいずれか1つに記載の方法。
【0133】
31.投与が対象の眼への局所投与である、段落27～29のいずれか1つに記載の方法。
【0134】
等価物
本発明のいくつかの態様が本明細書で説明および例示されてきたが、当業者は、本明細書において記載される機能を実行し、ならびに/あるいは結果および/または1つ若しくは複数の利点を得るための様々な他の手段および/または構造を容易に想像し、そのような変形および/または修正の各々は、本発明の範囲内にあると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成が、本発明の教示が使用される1つまたは複数の特定の用途に依存するものであることを容易に理解されよう。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の態様は、単なる例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明は、具体的に記載および特許請求されたものとは別の方法で実施されることもあることを理解されたい。本発明は、本明細書において記載される個々の特徴、システム、物品、材料、および/または方法に関する。更に、2つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、および/または方法の任意の組合せは、そのような特徴、システム、物品、材料、および/または方法が互いに矛盾しない場合、本発明の範囲内に包含される。
本発明のいくつかの態様が本明細書で説明および例示されてきたが、当業者は、本明細書において記載される機能を実行し、ならびに/あるいは結果および/または1つ若しくは複数の利点を得るための様々な他の手段および/または構造を容易に想像し、そのような変形および/または修正の各々は、本発明の範囲内にあると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成が、本発明の教示が使用される1つまたは複数の特定の用途に依存するものであることを容易に理解されよう。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の態様は、単なる例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明は、具体的に記載および特許請求されたものとは別の方法で実施されることもあることを理解されたい。本発明は、本明細書において記載される個々の特徴、システム、物品、材料、および/または方法に関する。更に、2つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、および/または方法の任意の組合せは、そのような特徴、システム、物品、材料、および/または方法が互いに矛盾しない場合、本発明の範囲内に包含される。
【0135】
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
【0136】
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される「および/または」という語句は、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。別のことが明確に示されない限り、「および/または」節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定される要素に関連するか否かにかかわらず、他の要素が任意選択的に存在することもある。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」への言及は、「含む」等のオープンエンド言語と組み合わせて使用される場合、一態様では、BなしのA(B以外の要素を任意選択的に包含する)、別の態様では、AなしのB(任意選択的にA以外の要素を包含する)、更に別の態様では、AおよびBの両方に(任意選択的に他の要素を包含する)等を指し得る。
【0137】
本明細書においておよび特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上記で定義された「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および/または」は、包括的であると判断されるべきであり、すなわち、要素の数またはリストのうちの少なくとも1つを包含するが、2つ以上も包含し、任意選択的に、追加の列挙されていない項目も包含する。「～のうちの1つのみ(only one of)」または「～のうちの正確に1つ(exactly one of)」、または特許請求の範囲で使用される場合、「～からなる(consisting of)」等の反対のことが明確に示された用語のみが、いくつかの要素または要素のリストのうちの正確に1つの要素の包含を指す。一般に、本明細書において使用される「または」という用語は、特許請求の範囲で使用される場合、「いずれか」、「～のうちの1つ」、「～のうちの1つのみ」、または「～のうちの正確に1つ」、「～から本質的になる」等の排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢(すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」)を示すものとしてのみ判断されるべきであり、特許法の分野で使用される通常の意味を有するべきである。
【0138】
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される場合、1つまたは複数の要素のリストに関連して「少なくとも1つ」という語句は、要素のリスト内の要素のいずれか1つまたは複数から選択される少なくとも1つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素の少なくとも1つを必ずしも包含せず、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外しないことを理解されたい。この定義はまた、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、「少なくとも1つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が任意選択的に存在することもあることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または、同等に、「AまたはBの少なくとも1つ」、または同等に、「Aおよび/またはBの少なくとも1つ」)は、一態様では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してAを指し、Bが存在しない(およびB以外の要素を任意選択的に包含する);別の態様では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してBを指し、Aが存在しない(およびA以外の要素を任意選択的に包含する);更に別の態様では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してA、および少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してB(他の要素を任意選択的に包含する)等を指すことができる。
【0139】
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む(comprising)」、「包含する(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」等の全ての移行句は、オープンエンドであり、すなわち、包含するが限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧セクション2111.03に記載されているように、「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句のみが、それぞれ限定的または準限定的な移行句であるものとする。
【0140】
特許請求の範囲の要素を修飾するための特許請求の範囲における「第1」、「第2」、「第3」等の序数の用語の使用は、それ自体では、1つの特許請求の範囲の要素の他の要素に対する優先、先行、または方法の動作が実行される時間的順序を意味するものではなく、単に、特許請求の範囲の要素を区別するために、ある名称を有する1つの特許請求の範囲の要素を同じ名称を有する別の要素から区別するためのラベルとして(ただし、序数の用語の使用のために)使用される。
【0141】
数値の前の「約」および「実質的に」という用語は、列挙された数値の±10％を表す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【配列表】
【国際調査報告】