知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-516108非ウイルス性担体を同定および使用するための迅速な設計、構築、試験、および学習技術
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-12
(54)【発明の名称】非ウイルス性担体を同定および使用するための迅速な設計、構築、試験、および学習技術
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20240405BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240405BHJP
C12N 15/863 20060101ALI20240405BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240405BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20240405BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240405BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240405BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240405BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20240405BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240405BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20240405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
C12N15/85 Z
C12N15/863 Z
C12Q1/686 Z
A61K9/51
A61K9/14
A61K31/7088
A61K48/00
A61K47/32
A61K49/00
A61P21/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562184
(86)(22)【出願日】2022-04-07
(85)【翻訳文提出日】2023-11-28
(86)【国際出願番号】 US2022023902
(87)【国際公開番号】W WO2022216977
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】63/172,069
(32)【優先日】2021-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504306714
【氏名又は名称】バテル・メモリアル・インスティテュート
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＴＴＥＬＬＥ ＭＥＭＯＲＩＡＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【住所又は居所原語表記】５０５ Ｋｉｎｇ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ ４３２０１－２６９３ （ＵＳ）
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ズオン，アンソニー ディ
(72)【発明者】
【氏名】ハック，ダニエル ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】グプタ，チェリー
(72)【発明者】
【氏名】シムズ，ジュニア，ケネス アール
(72)【発明者】
【氏名】ケーリス，マイケル エス
(72)【発明者】
【氏名】シャンク，ザッカリー アール
(72)【発明者】
【氏名】コルバート，アシュリー ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】マキュー，アンドレア ディ
(72)【発明者】
【氏名】シュミッツ，エマ ケイ
(72)【発明者】
【氏名】ヒルリック，ケイレブ ティ
(72)【発明者】
【氏名】ミラー，シャノン ディ
(72)【発明者】
【氏名】ホイ，ジョアンナ エル
【テーマコード（参考）】
4B063
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ41
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS17
4B063QS25
4B063QX02
4C076AA31
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB21
4C076BB27
4C076CC09
4C076EE10
4C076EE12
4C076EE13
4C076FF70
4C084AA13
4C084MA38
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA66
4C084NA13
4C084ZA94
4C085HH13
4C085JJ20
4C085KA27
4C085KB68
4C085LL17
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA38
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA56
4C086MA66
4C086NA13
4C086ZA94
(57)【要約】
本開示は、インビボスクリーニングおよびインビボ治療的デリバリー用のバーコード化ポリマーナノ粒子、ならびにそのための方法に関する。より具体的には、本発明は、治療的デリバリーおよび薬物デリバリーナノ粒子の高スループットインビボスクリーニング用の、ポリヌクレオチドバーコードと会合した可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）ポリマー組成物などのポリマーナノ粒子に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーを含む非ウイルス性デリバリー媒体、およびｂ．核酸コンストラクト
を含む、組成物。
【請求項2】
非ウイルス性デリバリー媒体がポリマーナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
核酸コンストラクトが、静電相互作用を介して非ウイルス性デリバリー媒体に会合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
核酸コンストラクトが、１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーの正に荷電したポリマーセグメントと核酸コンストラクトの負に荷電したポリヌクレオチドセグメントとの静電相互作用によって非ウイルス性デリバリー媒体と会合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
核酸コンストラクトが、核酸コンストラクトの５’および／または３’末端上のビオチン分子と、１つもしくは複数のナノ粒子形成ポリマー上のビオチンに結合する分子との間の高親和性、非共有結合性相互作用によって非ウイルス性デリバリー媒体と会合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
核酸コンストラクトが、カルボキシ終端ポリマーセグメントと核酸コンストラクトの間の共有結合によって非ウイルス性デリバリー媒体と会合し、核酸コンストラクトが５’および／または３’末端に１級アミンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
核酸コンストラクトが：ａ．２つのプライマー結合セグメント；および
ｂ．２つのプライマー結合セグメントの間にある１つまたは複数の固有のポリヌクレオチドバーコード
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
プライマー結合セグメントが、長さ約１５塩基対～約３０塩基対の範囲である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
プライマー結合セグメントが、汎用プライマー結合セットである、請求項７に記載の組成物。
【請求項10】
１つまたは複数のポリヌクレオチドバーコードが、長さ６～２０ヌクレオチドの固有の配列を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項11】
ポリヌクレオチドバーコードが、任意の２つの固有のポリヌクレオチドバーコード配列間に少なくとも２～６塩基のハミング距離をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
核酸コンストラクトが、ポリヌクレオチドバーコードの３’末端に約６～約１２個のランダム塩基をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
ポリヌクレオチドバーコードの３’末端にある約６～約１２個のランダムな塩基が、ＰＣＲ重複物のバイオインフォマティクス的除去のためである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
核酸コンストラクトが、長さ約４２ヌクレオチド～約２１０ヌクレオチドの範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、制御されたリビング／ラジカル重合と適合するモノマー単位を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項16】
１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、可逆的不活性化ラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、ヨウ素移動重合（ＩＴＰ）、セレニウム中心ラジカル媒介重合、テルル化物媒介重合（ＴＥＲＰ）、スチビン媒介重合または開環重合によって調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、ビニル基を含有するモノマーから調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項18】
１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）において使用される薬剤などの連鎖移動薬剤を使用して調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項19】
１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、ａ． ＲＡＦＴ共重合プロセスにおける第１の連鎖移動薬剤から得られる第１のキャップ形成単位を含む第１の終端；
ｂ． 第１の反応性機能的単位に共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約２００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第１のブロック；
ｃ． 適宜、第１のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約２００ｋＤａの範囲および重合度約２０～約２０００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第２のブロック；ならびに
ｄ． 第１または第２の連鎖移動薬剤から得られる第２のキャップ形成単位を含む第２の終端
を含むＲＡＦＴブロックコポリマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項20】
非ウイルス性デリバリー媒体が、全体の分子量（Ｍｎ）約２５ｋＤａ～約６０ｋＤａの範囲、全体の重合度約７００～約９００の範囲、標的サイズ約１０～約６０ｎｍの範囲、および最大コロナ対コア比（ＣＣＲ）約１．５～約３．５のうち１つまたは複数を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
第１のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群から選択される１つまたは複数のモノマー単位から調製される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項22】
第１のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートまたはメチルメタクリラートのうちの１つから調製される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項23】
第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群から選択される１つまたは複数のモノマー単位から調製される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項24】
第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群からそれぞれ独立に選択される２種の異なるモノマー単位から調製されるランダムコポリマーである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項25】
第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群からそれぞれ独立に選択される３種の異なるモノマー単位から調製されるランダムコポリマーである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項26】
第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、ブチルメタクリラートおよびアクリル酸プロピル；または２－ジメチルアミノエチルアクリラートおよびブチルメタクリラート；または２－ジメチルアミノエチルアクリラート、ブチルメタクリラートおよびアクリル酸エチルから調製されるランダムコポリマーである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項27】
各連鎖移動薬剤が、トリチオ炭酸ビス（カルボキシメチル）、トリチオ炭酸ビス（２－アミノ－２－オキソエチル）、トリチオ炭酸ビス［４－（２－ヒドロキシエトキシカルボニル）ベンジル］、４－シアノ－４－（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－［（フェニルカルボノチオイル）チオ］ペンタン酸および４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸からなる群からそれぞれ独立に選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項28】
第１のキャップ形成単位が、式【化1】
【請求項29】
第２のキャップ形成単位が、式【化2】
【請求項30】
デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子のインビボスクリーニングの方法であって、（ａ）２つ以上の型のポリマーナノ粒子を含むライブラリーであって、各ポリマーナノ粒子が、異なるポリヌクレオチドバーコードを含む核酸コンストラクトと会合しているライブラリーを調製することと、（ｂ）動物にライブラリーを投与することと、（ｃ）動物から細胞または組織を取り出すことと、（ｄ）動物の細胞または組織から核酸コンストラクトを単離することと、（ｅ）動物の細胞または組織中の核酸コンストラクトを検出することと、（ｆ）デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子を同定することとを含む、方法。
【請求項31】
核酸コンストラクトと会合したポリマーナノ粒子が、請求項１～２９のいずれか一項に記載のものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
ヌクレオチド配列データを得るために、核酸コンストラクトが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、配列決定またはその組合せからなる群から選択される方法によって検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
ポリマーナノ粒子が、ペイロードを搭載される、請求項３０に記載の方法。
【請求項34】
ペイロードが、発光性分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
発光を使用して、画像化を介して体内分布または細胞取り込みを追跡する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
動物への投与が、筋肉内、静脈内、腹膜内、経口または肺経路を介する、請求項３０に記載の方法。
【請求項37】
核酸コンストラクトが、第１の有機化合物と混合し、有機相を細胞または組織試料の水性相とインキュベートし、水性相から有機相を分離し、有機相を第２の有機化合物と混合し、混合物をインキュベートし、混合物から核酸コンストラクトを沈殿させ、蒸発によって有機相を除去し、水性組成物中に核酸コンストラクトを再懸濁することによって細胞および組織から単離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項38】
有機相が、フェノールクロロホルムを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
核酸コンストラクトが、核酸コンストラクトの水性組成物を７．４を超えるｐＨに滴定することによって細胞または組織中の陽イオン性物質から分離される、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
核酸コンストラクトが、細胞または組織材料に対する結合親和性より大きい核酸コンストラクトに対する結合親和性で核酸コンストラクトを分子と結合することによって細胞または組織中の材料から分離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項41】
核酸コンストラクトが、サイズ排除クロマトグラフィーを介して細胞または組織中の材料から分離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項42】
核酸コンストラクトが、透析または透析ろ過を介して細胞または組織中の材料から分離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項43】
核酸コンストラクトが、ろ過を介して細胞または組織中の材料から分離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項44】
核酸コンストラクトが、酵素を使用してタンパク質を消化することによって細胞または組織中の材料から分離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項45】
酵素がプロテイナーゼＫである、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
ポリマーナノ粒子と会合した核酸コンストラクトが、単離された核酸コンストラクトを少なくとも１０００倍で先ず希釈し、次いでプライマーを使用してＰＣＲにより核酸コンストラクトを増幅することにより検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項47】
ＰＣＲステップのプライマーが、アンプリコンの検出前に酵素的に消化される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
ヌクレオチド配列データが、ｆａｓｔＱファイルに変換され；ｆａｓｔＱファイルが公知のポリヌクレオチドバーコードにマッピングされ、ポリヌクレオチドバーコードが列挙される、請求項３２に記載の方法。
【請求項49】
疾患のある患者を処置する方法であって、請求項３０に記載のインビボスクリーニング方法において同定した、ペイロードをさらに含むポリマーナノ粒子を患者に投与することと、患者において疾患を処置することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０２１年４月７日に出願の米国特許仮出願第６３／１７２，０６９号の優先権を主張し、そのすべての開示を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０２１年４月７日に出願の米国特許仮出願第６３／１７２，０６９号の優先権を主張し、そのすべての開示を参照により本明細書に組み込む。
【0002】
本開示は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）スクリーニングおよびインビボ治療的デリバリー用のバーコード化ポリマーナノ粒子、ならびにそのための方法に関する。より具体的には、本発明は、治療的デリバリーおよび薬物デリバリーナノ粒子の高スループットインビボスクリーニング用の、ポリヌクレオチドバーコードと会合した可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）ポリマー組成物などのポリマーナノ粒子に関する。
【背景技術】
【0003】
遺伝子医薬（遺伝子療法、遺伝子サイレンシング、スプライシング調節因子、およびヌクレアーゼに基づく遺伝子編集を含む）は、ワクチン、感染性疾患処置、抗微生物処置、抗ウイルス処置、最も注目すべきは、遺伝子疾患処置を含めて、革命的な処置をもたらすことになる。しかしながら、遺伝子医薬の有効性または安全性を減少させるおそれがある組織および細胞を回避しながら、処置される必要がある特定の組織および細胞へこれらの遺伝子医薬ペイロードをインビボデリバリーすることは、有意な課題を提起する。さらなる課題には、大きな遺伝子ペイロードまたは複数のペイロードをデリバリーする能力がある。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子医薬のデリバリーに最も広く使用されているツールであるが、ＡＡＶは、大きな遺伝子ペイロードまたは複数のペイロード［クラスター化された規則的間隔のパリンドローム様短反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システムなど］をデリバリーすることができず、それらのペイロードは、細胞媒介性応答である抗ＡＡＶ抗体の生成を含めた不要な免疫応答を誘発する場合もある。患者においてＡＡＶによって引き起こされる免疫応答のいくつかは、潜在的に致死的な免疫応答である。
【0004】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに基づく治療は、正確でプログラム可能な遺伝子編集のこのシステムの能力のため、多くの遺伝子疾患を処置する優れた潜在性を有する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する遺伝子編集および修復は、ランダムなｉｎｄｅｌ突然変異を誘導することにより切断の部位を修復する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と既存の鋳型に基づいて切断部位を修復する相同組換え修復（ＨＤＲ）を含めた、２つの主要な機序を有する。予め設計された鋳型が、ＨＤＲ特異的修復に使用され得るので、この機序に基づく療法は、異なる様々な遺伝子疾患の治癒に合わせて調整することができる。しかしながら、主要な課題は、ＨＤＲ修復は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、小さいガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびドナーＤＮＡ鎖を特定の位置に同時にデリバリーする必要があるということである。標的した同じ位置へ複数の巨大分子を確実に同時デリバリーすることは、現在のところ実現不可能なので、この要件はインビボ適用の場合に特に制限になる。例えば、Ｃａｓ９酵素配列およびガイドＲＮＡ複合体は、ＡＡＶに組み込むには大きすぎる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、遺伝子デリバリーシステムを含めた有効な非ウイルス性デリバリーシステムが必要である。リポソームなどの現在最高水準の非ウイルス性遺伝子デリバリーシステムは、低い生体適合性および容易にそれらを操作または機能化できないなど、多くの欠点を有する。さらなる懸念は、このような非ウイルス性遺伝子デリバリーシステムは、細胞内または細胞間区画を通過するので様々な酵素によって容易に分解され、これらのシステムが、複数の大きなペイロードをパッケージングすることができないことである。
【0006】
本発明者らは、バーコード化ポリマーナノ粒子（例えば、ＲＡＦＴポリマーなどの制御されたリビング／ラジカル重合から得られるポリマー）デリバリー組成物を設計した。これらの組成物は、生体適合性であり、非毒性であり、多くの方法でプログラムされ得るという優位性を有する。例えば、バーコード化ポリマーナノ粒子デリバリー組成物は、早期の分解を回避することを可能にし、免疫応答を回避することを可能にし、細胞内の画像化ならびに治療的遺伝子および他の治療的分子の制御されたデリバリーを可能にする官能基を有するようにプログラムされ得る。したがって、これらの非ウイルス性デリバリー組成物は、免疫回避、組織指向性細胞内デリバリー、ならびに大きな遺伝子ペイロードまたは複数のペイロードをデリバリーする能力を実現することによって遺伝子医薬のペイロードおよび他のペイロードの安定性、安全性および／または有効性を増強させ得る。
【0007】
本開示は、これらの非ウイルス性デリバリー組成物を、遺伝子デリバリーを大いに加速し、限定された遺伝子デリバリー媒体に存在する短所を解決することになる迅速な設計、構築、試験、および学習（ＤＢＴＬ）技術と組み合わせる。今日の編集療法が臨床に移行することを急ぐのに加えて、これらの技術は、より大きく、分子的により多様性がある遺伝子ペイロード、ならびに他のペイロードの一般的なデリバリーを可能にし、遺伝子疾患および他の疾患の処置を改善し続けることになると予想される。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一部の態様において、本開示は、１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーを含む非ウイルス性デリバリー媒体および核酸コンストラクトを含む組成物を提供する。
【0009】
一部の態様において、本開示は、デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子のインビボスクリーニングの方法を提供し、本方法は、（ａ）２つ以上の型のポリマーナノ粒子を含むライブラリーであって、各ポリマーナノ粒子が、異なるポリヌクレオチドバーコードを含む核酸コンストラクトと会合しているライブラリーを調製することと、（ｂ）動物にライブラリーを投与することと、（ｃ）動物から細胞または組織を取り出すことと、（ｄ）動物の細胞または組織から核酸コンストラクトを単離することと、（ｅ）動物の細胞または組織中の核酸コンストラクトを検出することと、（ｆ）デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子を同定することとを含む。
【0010】
一部の態様において、本開示は、疾患のある患者を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるインビボスクリーニング方法において同定した、ポリヌクレオチドもしくはタンパク質ペイロードまたは小分子治療用ペイロードなどの薬物ペイロードをさらに含むポリマーナノ粒子を患者に投与することと、患者において疾患を処置することとを含む。
【0011】
以下の条項およびその組合せは、本明細書に記述される本発明の様々な追加の例示的な態様を提供する。「例示的実施形態の詳細な説明」および「実施例」という表題の節を含めて、この特許出願の他の任意の節に記述される様々な実施形態は、以下の付番された条項に記述される本発明の下記の実施形態のいずれかに適用可能である。
【0012】
１．
ａ．１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーを含む非ウイルス性デリバリー媒体、および
ｂ．核酸コンストラクト
を含む組成物。
ａ．１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーを含む非ウイルス性デリバリー媒体、および
ｂ．核酸コンストラクト
を含む組成物。
【0013】
２． 非ウイルス性デリバリー媒体がポリマーナノ粒子を含む、条項１の組成物。
【0014】
３． 核酸コンストラクトが、静電相互作用を介して非ウイルス性デリバリー媒体に会合している、条項１または２の組成物。
【0015】
４． 核酸コンストラクトが、１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーの正に荷電したポリマーセグメントと核酸コンストラクトの負に荷電したポリヌクレオチドセグメントとの静電相互作用によって非ウイルス性デリバリー媒体と会合している、条項１～３のいずれか１つの組成物。
【0016】
５． 核酸コンストラクトが、核酸コンストラクトの５’および／または３’末端上のビオチン分子と、１つもしくは複数のナノ粒子形成ポリマー上のビオチンに結合する分子との間の高親和性、非共有結合性相互作用によって非ウイルス性デリバリー媒体と会合している、条項１～３のいずれか１つの組成物。
【0017】
６． 核酸コンストラクトが、カルボキシ終端ポリマーセグメントと核酸コンストラクトの間の共有結合によって非ウイルス性デリバリー媒体と会合し、核酸コンストラクトが５’および／または３’末端に１級アミンを含む、条項１～３のいずれか１つの組成物。
【0018】
７． 核酸コンストラクトが：
ａ．２つのプライマー結合セグメント；および
ｂ．２つのプライマー結合セグメントの間にある１つまたは複数の固有のポリヌクレオチドバーコード
を含む、先行する条項のいずれか１つの組成物。
ａ．２つのプライマー結合セグメント；および
ｂ．２つのプライマー結合セグメントの間にある１つまたは複数の固有のポリヌクレオチドバーコード
を含む、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0019】
８． プライマー結合セグメントが、長さ約１５塩基対～約３０塩基対の範囲である、条項７の組成物。
【0020】
９． プライマー結合セグメントが、汎用プライマー結合セットである、条項７または８の組成物。
【0021】
１０． １つまたは複数のポリヌクレオチドバーコードが、長さ６～２０ヌクレオチドの固有の配列を含む、条項７～９のいずれか１つの組成物。
【0022】
１１． ポリヌクレオチドバーコードが、任意の２つの固有のポリヌクレオチドバーコード配列間に少なくとも２～６塩基のハミング距離をさらに含む、条項１０の組成物。
【0023】
１２． 核酸コンストラクトが、ポリヌクレオチドバーコードの３’末端に約６～約１２個のランダム塩基をさらに含む、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0024】
１３． ポリヌクレオチドバーコードの３’末端にある約６～約１２個のランダム塩基が、ＰＣＲ重複物のバイオインフォマティクス的除去のためである、条項１２の組成物。
【0025】
１４． 核酸コンストラクトが、長さ約４２ヌクレオチド～約２１０ヌクレオチドの範囲である、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0026】
１５． １つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、制御されたリビング／ラジカル重合と適合するモノマー単位を含む、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0027】
１６． １つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、可逆的不活性化ラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、ヨウ素移動重合（ＩＴＰ）、セレニウム中心ラジカル媒介重合、テルル化物媒介重合（ＴＥＲＰ）、スチビン媒介重合または開環重合によって調製される、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0028】
１７． １つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、ビニル基を含有するモノマーから調製される、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0029】
１８． １つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）において使用される薬剤などの連鎖移動薬剤を使用して調製される、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0030】
１９． １つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーが、
ａ． ＲＡＦＴ共重合プロセスにおける第１の連鎖移動薬剤から得られる第１のキャップ形成単位を含む第１の終端；
ｂ． 第１の反応性機能的単位に共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第１のブロック；
ｃ． 適宜、第１のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約２０～約２０００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第２のブロック；ならびに
ｄ． 第１または第２の連鎖移動薬剤から得られる第２のキャップ形成単位を含む第２の終端
を含むＲＡＦＴブロックコポリマーである、先行する条項のいずれか１つの組成物。
ａ． ＲＡＦＴ共重合プロセスにおける第１の連鎖移動薬剤から得られる第１のキャップ形成単位を含む第１の終端；
ｂ． 第１の反応性機能的単位に共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第１のブロック；
ｃ． 適宜、第１のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約２０～約２０００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第２のブロック；ならびに
ｄ． 第１または第２の連鎖移動薬剤から得られる第２のキャップ形成単位を含む第２の終端
を含むＲＡＦＴブロックコポリマーである、先行する条項のいずれか１つの組成物。
【0031】
２０． 非ウイルス性デリバリー媒体が、全体の分子量（Ｍｎ）約２５ｋＤａ～約６０ｋＤａの範囲、全体の重合度約７００～約９００の範囲、標的サイズ約１０～約６０ｎｍの範囲、および最大コロナ対コア比（ＣＣＲ）約１．５～約３．５のうち１つまたは複数を有する、条項１９の組成物。
【0032】
２１． 第１のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群から選択される１つまたは複数のモノマー単位から調製される、条項１９または２０の組成物。
【0033】
２２． 第１のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートまたはメチルメタクリラートのうちの１つから調製される、条項１９または２０の組成物。
【0034】
２３． 第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群から選択される１つまたは複数のモノマー単位から調製される、条項１９～２２のいずれか１つの組成物。
【0035】
２４． 第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群からそれぞれ独立に選択される２種の異なるモノマー単位から調製されるランダムコポリマーである、条項１９～２３のいずれか１つの組成物。
【0036】
２５． 第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート、ブチルメタクリラート、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラートからなる群からそれぞれ独立に選択される３種の異なるモノマー単位から調製されるランダムコポリマーである、条項１９～２３のいずれか１つの組成物。
【0037】
２６． 第２のブロックが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート、ブチルメタクリラートおよびアクリル酸プロピル；または２－ジメチルアミノエチルアクリラートおよびブチルメタクリラート；または２－ジメチルアミノエチルアクリラート、ブチルメタクリラートおよびアクリル酸エチルから調製されるランダムコポリマーである、条項１９～２５のいずれか１つの組成物。
【0038】
２７． 各連鎖移動薬剤が、トリチオ炭酸ビス（カルボキシメチル）、トリチオ炭酸ビス（２－アミノ－２－オキソエチル）、トリチオ炭酸ビス［４－（２－ヒドロキシエトキシカルボニル）ベンジル］、４－シアノ－４－（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－［（フェニルカルボノチオイル）チオ］ペンタン酸および４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸からなる群からそれぞれ独立に選択される、条項１９～２６のいずれか１つの組成物。
【0039】
２８． 第１のキャップ形成単位が、式
【0040】
【化1】
【0041】
２９． 第２のキャップ形成単位が、式
【0042】
【化2】
【0043】
３０． デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子のインビボスクリーニングの方法であって、（ａ）２つ以上の型のポリマーナノ粒子を含むライブラリーであって、各ポリマーナノ粒子が、異なるポリヌクレオチドバーコードを含む核酸コンストラクトと会合しているライブラリーを調製することと、（ｂ）動物にライブラリーを投与することと、（ｃ）動物から細胞または組織を取り出すことと、（ｄ）動物の細胞または組織から核酸コンストラクトを単離することと、（ｅ）動物の細胞または組織中の核酸コンストラクトを検出することと、（ｆ）デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子を同定することとを含む、方法。
【0044】
３１． 核酸コンストラクトと会合したポリマーナノ粒子が、条項１～２９のいずれか１つによるものである、条項３０の方法。
【0045】
３２． ヌクレオチド配列データを得るために、核酸コンストラクトが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、配列決定またはその組合せからなる群から選択される方法によって検出される、条項３０または３１の方法。
【0046】
３３． ポリマーナノ粒子が、ペイロードを搭載される、条項３０～３２のいずれか１つの方法。
【0047】
３４． ペイロードが、発光性分子である、条項３３の方法。
【0048】
３５． 発光を使用して、画像化を介して体内分布または細胞取り込みを追跡する、条項３４の方法。
【0049】
３６． 動物への投与が、筋肉内、静脈内、腹膜内、経口または肺経路を介する、条項３０～３５のいずれか１つの方法。
【0050】
３７． 核酸コンストラクトが、第１の有機化合物と混合し、有機相を細胞または組織試料の水性相とインキュベートし、水性相から有機相を分離し、有機相を第２の有機化合物と混合し、混合物をインキュベートし、混合物から核酸コンストラクトを沈殿させ、蒸発によって有機相を除去し、水性組成物中に核酸コンストラクトを再懸濁することによって細胞および組織から単離される、条項３０～３６のいずれか１つの方法。
【0051】
３８． 有機相が、フェノールクロロホルムを含む、条項３７の方法。
【0052】
３９． 核酸コンストラクトが、核酸コンストラクトの水性組成物を、７．４を超えるｐＨに滴定することによって細胞または組織中の陽イオン性物質から分離される、条項３７の方法。
【0053】
４０． 核酸コンストラクトが、細胞または組織材料に対する結合親和性より大きい核酸コンストラクトに対する結合親和性で核酸コンストラクトを分子と結合することによって細胞または組織中の材料から分離される、条項３０の方法。
【0054】
４１． 核酸コンストラクトが、サイズ排除クロマトグラフィーを介して細胞または組織中の材料から分離される、条項３０の方法。
【0055】
４２． 核酸コンストラクトが、透析または透析ろ過を介して細胞または組織中の材料から分離される、条項３０の方法。
【0056】
４３． 核酸コンストラクトが、ろ過を介して細胞または組織中の材料から分離される、条項３０の方法。
【0057】
４４． 核酸コンストラクトが、酵素を使用してタンパク質を消化することによって細胞または組織中の材料から分離される、条項３０の方法。
【0058】
４５． 酵素がプロテイナーゼＫである、条項４４の方法。
【0059】
４６． ポリマーナノ粒子と会合した核酸コンストラクトが、単離された核酸コンストラクトを少なくとも１０００倍で先ず希釈し、次いでプライマーを使用してＰＣＲにより核酸コンストラクトを増幅することにより検出される、条項３０の方法。
【0060】
４７． ＰＣＲステップのプライマーが、アンプリコンの検出前に酵素的に消化される、条項４６の方法。
【0061】
４８． ヌクレオチド配列データが、ｆａｓｔＱファイルに変換され；ｆａｓｔＱファイルが公知のポリヌクレオチドバーコードにマッピングされ、ポリヌクレオチドバーコードが列挙される、条項３２の方法。
【0062】
４９． 疾患のある患者を処置する方法であって、条項３０～４８のいずれか１つのインビボスクリーニング方法において同定した、ペイロードをさらに含むポリマーナノ粒子を患者に投与することと、患者において疾患を処置することとを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【0063】
【図4】図４は、本開示の核酸コンストラクトの代表的な一例の例示であり、本開示のプライマー結合セグメント［塩基対（ｂｐ）］（示されるコンストラクト中で２０ｂｐおよび２１ｂｐ）、ポリヌクレオチドバーコード（示されるコンストラクト中で８ｂｐ）およびランダム配列断片（示されるコンストラクト中で７ｂｐ）の長さを示す。
【図5】図５（ａ）～５（ｃ）は、静電的ローディング反応［図５（ａ）］、アビジン－ストレプトアビジンコンジュゲーション［図５（ｂ）］および直接アミド化［図５（ｃ）］を使用する核酸コンストラクト標識反応方法の概略図である。
【図6】図６は、ポリマーナノ粒子に静電的に結合した核酸コンストラクトの増幅を示すｅゲルである。核酸コンストラクトによる試料中の二重バンドの存在から、バーコードが、ＰＮＰに結合したことが確認される。非試験対照（ＮＴＣ）に二重バンドがないことから、肯定的な結果が確認される。
【図7】図７は、９６種の固有のバーコードのプールされた試料からのＤＮＡバーコード増幅を示す一連のｅゲルであり、それぞれは、原型ＰＮＰに結合している。図中の各フレームは、４８チャネルゲル電気泳動の１列である。各ゲルの第１の段はＤＮＡラダーであり、一番下のバンドは、およそ１００塩基である。１００ｂｐの印近くの各段内の明るいバンドは、バーコードに由来するアンプリコンを示す。
【図8】図８は、ＨＥＫ－２９３細胞の培養液にスパイクされた後に抽出された、原型ＰＮＰに結合された９６種の固有のバーコードのプールされた試料からのＤＮＡバーコード増幅を示すｅゲルである。図中の各フレームは、４８チャネルゲル電気泳動の１列である。各ゲルの第１の段はＤＮＡラダーであり、一番下のバンドは、およそ１００塩基である。１００ｂｐの印近くの各段内の明るいバンドは、バーコードに由来するアンプリコンを示す。
【図9】図９は、ＨＥＫ－２９３細胞にスパイクした後の、固有のバーコードを持つ１０種の固有のＰＮＰからのＤＮＡバーコード増幅を示すｅゲルである。二重バンドの存在は、バーコード増幅の証拠であり、バーコードを有することが公知の陽性対照試料に存在し、リン酸緩衝食塩水のみの非試験対照（ＮＴＣ）試料には観察されない。
【図10】図１０は、図７の１０種の固有のバーコード化ＰＮＰのそれぞれが、蛍光ＴｄＴｏｍａｔｏタンパク質を発現するプラスミドに搭載されたことを示す一連の画像である。搭載されたＰＮＰが、ＨＥＫ－２９３細胞にそれぞれ与えられた。４８時間後、細胞を、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄフィルタを用いて蛍光顕微鏡によって撮像し、画像を上に示す。
【図11】図１１（ａ）～１１（ｅ）は、蛍光カーゴプラスミドをコードしているｔｄ－ｔｏｍａｔｏを保有する代表的なＰＮＰ［図１１（ａ）～１１（ｃ）］で処置したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞事象分布を図示するフローサイトメトリー散布図、ならびに８８種の様々なＰＮＰのライブラリーのトランスフェクション効率および生存率を図示するヒートマップ〔ＰＮＰライブラリートランスフェクション効率［図１１（ｄ）］およびＰＮＰライブラリー生存率［図１１（ｅ）］〕を示す。図１１（ａ）において、グラフ中で横棒によって示される曲線下面積は、細胞の８４．１７％を占める。
【発明を実施するための形態】
【0064】
本発明は、インビボスクリーニングおよびインビボ治療的デリバリー用のバーコード化ポリマーナノ粒子、ならびにそのための方法に関する。より具体的には、本発明は、治療的デリバリーおよび薬物デリバリーナノ粒子の高スループットインビボスクリーニング用の、ポリヌクレオチドバーコードと会合した可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）ポリマー組成物などの制御されたリビング／ラジカル重合産物などのポリマーナノ粒子に関する。一実施形態において、ペイロードは、３ｋＢもしくはより大きい核酸、または別のポリヌクレオチドもしくはタンパク質もしくは小分子治療的もしくは発光性分子などの他の任意の適切なペイロードであり得る。
【0065】
本発明は、構造および機能における高度な同調性、免疫系による有害反応もしくは分解からペイロードを保護する機会、ならびに表面電荷または粒子サイズによる受動的細胞標的化を用いるプラットフォームとしてのバーコード化ポリマーナノ粒子組成物（例えば、ＲＡＦＴコポリマーなど、制御されたリビング／ラジカル重合プロセスから得られるポリマーナノ粒子）の使用に関する。これらのデリバリーシステムはまた、コンピュータを使った設計に適しており、ウイルス性デリバリー組成物の製造プロセスより高い収率および少ない精製ステップで、強力で商業規模の製造プロセスに適切な経路を有する。
【0066】
一実施形態において、核酸コンストラクトと会合したポリマーナノ粒子（例えば、ＲＡＦＴポリマーなど、制御されたリビング／ラジカル重合プロセスから得られるポリマーナノ粒子）を含む組成物が提供される。別の実施形態において、デリバリー媒体として使用するための核酸コンストラクトと会合した所望のポリマーナノ粒子（例えば、ＲＡＦＴポリマーなど、制御されたリビング／ラジカル重合プロセスから得られるポリマーナノ粒子）を同定するためのインビボスクリーニング方法が提供される。別の実施形態において、スクリーニング方法において同定したポリマーナノ粒子を患者に投与することを含む、疾患のある患者を処置する方法が提供される。
【0067】
一実施形態において、デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子のインビボスクリーニングの方法は、（ａ）２つ以上の型のポリマーナノ粒子を含むライブラリーであって、各ポリマーナノ粒子が、異なるポリヌクレオチドバーコードを含む核酸コンストラクトと会合しているライブラリーを調製することと、（ｂ）動物にライブラリーを投与することと、（ｃ）動物から細胞または組織を取り出すことと、（ｄ）動物の細胞または組織から核酸コンストラクトを単離することと、（ｅ）動物の細胞または組織中の核酸コンストラクトを検出することと、（ｆ）デリバリー媒体として使用するための所望のポリマーナノ粒子を同定することとを含む。様々な実施形態において、核酸コンストラクトは、例えば、動物の細胞もしくは組織中にある核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、または配列決定によって検出され得る。
【0068】
別の実施形態において、インビボスクリーニング方法において同定した、ポリヌクレオチドもしくはタンパク質ペイロードまたは小分子治療的もしくは発光性分子ペイロードなどの薬物ペイロードをさらに含むポリマーナノ粒子を患者に投与することと、患者において疾患を処置することとを含む、疾患のある患者を処置する方法が提供される。
【0069】
様々な実施形態において、核酸コンストラクトと会合したポリマーナノ粒子のインビボスクリーニングの方法または処置の方法のために核酸コンストラクトと会合したポリマーナノ粒子のライブラリーを投与するのに適切な任意の経路が、非経口投与を含めて使用され得る。そのような非経口投与に適切な経路には、静脈内、動脈内、腹膜内、くも膜下腔内、硬膜外、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、腫瘍内、筋肉内および皮下デリバリーがある。一実施形態において、非経口投与の手段には、有針（極微針を含める）注射器、無針注射器および注入技術がある。他の実施形態において、経口または肺投与経路が使用され得る。
【0070】
一態様において、バーコード化ポリマーナノ粒子のライブラリーは、ポリマーナノ粒子と会合した核酸コンストラクトを動物へ投与する前にプールおよび濃縮され得る。ライブラリー調製および配列決定の方法は、Green and Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)に記述されており、参照により本明細書に組み込む。
【0071】
様々な実施形態において、細胞または組織試料は、本明細書に記述される核酸コンストラクトと会合したポリマーナノ粒子の存在について分析され得る。試料は、例えば、尿、鼻汁、経鼻洗浄液、内耳液、気道内清掃液、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、髄液、骨髄穿刺液、痰、胸腔内液、滑液、心膜液、腹膜液、唾液、涙、胃液分泌物、便、生殖器官分泌物、リンパ液、全血、血清、血漿からなる群から選択される動物由来の任意の組織、細胞もしくは液状試料、または動物由来の任意の組織もしくは細胞試料であり得る。典型的な組織または細胞試料には、脳組織もしくは細胞、筋組織もしくは細胞、皮膚組織もしくは細胞、心臓組織もしくは細胞、腎臓組織もしくは細胞、胃組織もしくは細胞、肝臓組織もしくは細胞、尿路組織もしくは細胞、消化管路組織もしくは細胞、頭頸部組織もしくは細胞、肺組織もしくは細胞、生殖器官組織もしくは細胞、膵臓組織もしくは細胞、または動物由来の他の任意の組織もしくは細胞型がある。
【0072】
動物から細胞または組織を取り出し、動物の細胞または組織から核酸コンストラクトを単離するための例示的な態様において、核酸コンストラクトは、動物の細胞または組織から取り出される。様々な実施形態において、動物の組織または細胞から採取される核酸コンストラクト（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、細胞を破裂させ、溶解物から核酸コンストラクトを単離することによって取り出すことができる。細胞を破裂させ、核酸を単離する技術は、当業者に周知であり、取り出し技術は、ビーズ－打撃技術を使用することによるなどの均質化を含む。他の実施形態において、核酸コンストラクトは、フェノール－クロロホルムなどの界面活性剤または溶媒を使用して細胞を破裂させることによって単離されてもよい。別の態様において、核酸コンストラクトは、遠心分離、透析、透析ろ過、ろ過、サイズ排除、加圧技術、プロテイナーゼＫによるタンパク質の消化を含むがこれに限定されない物理的方法、または例えば核酸を結合するビーズなど核酸に対して親和性がある物質を使用することによって溶解物から分離され得る。
【0073】
例示的な一実施形態において、核酸コンストラクトは、有機相（例えば、フェノールクロロホルム）と水性相（例えば、水）の混合物による処置によって細胞または組織から取り出される。有機相（例えば、フェノールクロロホルム）は単離され、核酸コンストラクトは、ｐＨを、例えばｐＨ７．４に上げることによって沈殿させることができる。有機相（例えば、フェノールクロロホルム）は、蒸発され得、核酸コンストラクトは、水に懸濁され、ＰＣＲおよび／または配列決定に適切な濃度に希釈され得る。一実施形態において、単離された核酸コンストラクトは、充分な洗浄後に水または緩衝液のいずれかに懸濁される。
【0074】
他の実施形態において、Ｑｉａｇｅｎ（商標）、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓｍ（商標）、Ｗｉｚａｒｄ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＱｉａＡｍｐ９６ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）およびＱｉａｃｕｂｅ ＨＴ（商標）機器、ならびにＰｒｏｍｅｇａｍ（商標）などの市販のキットが、核酸コンストラクトの単離に利用可能である。ＰＣＲおよび／または配列決定用の核酸を調製する方法は、Green and Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)にも記述されており、参照により本明細書に組み込む。
【0075】
ポリヌクレオチドバーコードは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、配列決定および／または画像化を使用することによって検出され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、実験室において核酸を分析するために開発された。ＰＣＲは、次世代塩基配列決定法（ＮＧ）として公知の新世代のデバイスおよび方法へと過去１０年にわたって進化した。ＮＧＳは、より安価な価格で核酸のより速い検出および増幅を提供する。ＮＧＳデバイスおよび方法は、核酸が大規模並列、高スループットプラットフォームで増幅されるので、迅速な配列決定が可能になる。
【0076】
例示的な態様において、核酸コンストラクトは、ポリヌクレオチドバーコードを検出するために次世代塩基配列決定法（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、またはＰａｃＢｉｏもしくはＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列決定プラットフォームを使用する）、合成による配列決定法、パイロシークエンス法、ナノ細孔配列決定法を含めた任意の適切な配列決定方法を使用して配列決定され得、またはその修飾もしく組合せが使用され得る。一実施形態において、配列決定は、アンプリコン配列決定であり得る。別の実施形態において、配列決定は、全ゲノム配列決定であり得る。別の実施形態において、配列決定は、エキソーム／標的化ハイブリダイゼーション配列決定であり得る。また、核酸配列決定の方法は当業者に周知であり、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記述されており、参照により本明細書に組み込む。
【0077】
一態様において、核酸コンストラクトは、ポリヌクレオチドバーコードを含むことができ、バーコードは、ポリヌクレオチドバーコードを同定するためのどんな公知のゲノムにも存在しない固有の配列を含む。別の実施形態において、異なるポリヌクレオチドバーコード（例えば、８８または９６種の異なるポリヌクレオチドバーコード）を含む異なる核酸コンストラクトのセットを使用して、１回の配列決定行程で試料を多重化することが可能になり得る。
【0078】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドバーコードは、長さ約５～約３５塩基対、長さ約５～約３４塩基対、長さ約５～約３３塩基対、長さ約５～約３２塩基対、長さ約５～約３１塩基対、長さ約５～約３０塩基対、長さ約５～約２９塩基対、長さ約５～約２８塩基対、長さ約５～約２７塩基対、長さ約５～約２６塩基対、長さ約５～約２５塩基対、長さ約５～約２１塩基対、長さ約５～約２２塩基対、長さ約５～約２３塩基対、長さ約５～約２４塩基対、長さ約５～約１５塩基対、長さ約５～約１６塩基対、長さ約５～約１７塩基対、長さ約５～約１８塩基対、長さ約５～約１９塩基対、長さ約５～約２０塩基対、長さ約５～１３塩基対、長さ約５～１４塩基対、長さ約５～１２塩基対、長さ約５～１１塩基対、長さ約５～１０塩基対、長さ約５～９塩基対、長さ約５～８塩基対、長さ約６～１０塩基対、長さ約７～１０塩基対、長さ約８～１０塩基対、または長さ約６～約２０塩基対であり得る。
【0079】
ポリヌクレオチドバーコードの様々な実施形態が、以下の表１に示される（標示「ポリヌクレオチドバーコード」）。これらのポリヌクレオチドバーコードは、核酸コンストラクトにおいて単独で、または例えば、２種もしくはより多くのポリヌクレオチドバーコード、３種もしくはより多くのポリヌクレオチドバーコード、４種もしくはより多くのポリヌクレオチドバーコードの組合せ、等で使用され得る。２種以上のポリヌクレオチドバーコードが使用される実施形態において、ポリヌクレオチドバーコード間のハミング距離は、約２～約６ヌクレオチドであることができ、または任意の適切な数のヌクレオチドが、ハミング距離を形成することができ、またはポリヌクレオチドバーコード間にヌクレオチドは存在しない。
【0080】
表１
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【表1-15】
【表1-16】
【0081】
別の実施形態において、ランダム配列断片が、ポリヌクレオチドバーコードの５’および／または３’末端に連結され得、ランダム配列断片を使用して、例えばＰＣＲ重複物のバイオインフォマティクス的除去をすることができる。ランダム配列断片は、核酸コンストラクトに長さを追加するために使用することもでき、配列決定後のポリヌクレオチドバーコードの始まりまたは末端を同定するためのバイオインフォマティクス分析のマーカーとして機能を果たすこともできる。別の実施形態において、核酸コンストラクトは、少なくとも第１および第２のランダム配列断片を含み、第１のランダム配列断片は、ポリヌクレオチドバーコードの５’末端に連結され得、第２のランダム配列断片は、ポリヌクレオチドバーコードの３’末端に連結され得る。別の実施形態において、１つまたは少なくとも１つのランダム配列断片がポリヌクレオチドバーコードの５’および／または３’末端に連結される。一態様において、ランダム配列断片を必要に応じて伸長させて、短い挿入が失われる可能性がある全ゲノム配列決定などの異なる適用のためにより長い核酸コンストラクトを作製することができる。
【0082】
様々な実施形態において、ランダム配列断片は、長さ約５～約１８塩基対、長さ約５～約１９塩基対、長さ約５～約２０塩基対、長さ約５～約１３塩基対、長さ約５～約１４塩基対、長さ約５～約１５塩基対、長さ約５～約１６塩基対、長さ約５～約１７塩基対、長さ約５～約９塩基対、長さ約５～約１０塩基対、長さ約５～約１１塩基対、長さ約５～約１２塩基対、長さ約５～約８塩基対、長さ約６～約１０塩基対、長さ約７～約１０塩基対、または長さ約８～約１０塩基対であり得る。
【0083】
別の例示的な態様において、ポリヌクレオチドバーコードは、ポリヌクレオチドバーコードを含む核酸コンストラクトが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または配列決定プロトコールの間に増幅され得るように、プライマー結合セグメントに挟まれてもよい（即ち、直接または間接的にポリヌクレオチドバーコードに連結される）。一態様において、プライマー結合セグメントは、１つもしくは複数の汎用プライマーまたは汎用プライマーセットへの結合に有用であり得る。例示的な一実施形態において、汎用プライマーは、配列決定のためのインデックスアダプターの結合を可能にするオーバーハング配列を含有することができる。この態様において、プライマーは、対象となる任意のプライマーであり得る。この実施形態において、第１のプライマー結合セグメントは、その３’末端で第１のランダム配列断片の５’末端に連結され得、第２のプライマー結合セグメントは、その５’末端でランダム配列断片間にポリヌクレオチドバーコードを含む第２のランダム配列断片の３’末端に連結され得る。別の実施形態において、第１のプライマー結合セグメントは、その３’末端でポリヌクレオチドバーコードの５’末端に連結され得、第２のプライマー結合セグメントは、その５’末端で、ポリヌクレオチドバーコードの３’末端に連結されているランダム配列断片（例として図１を参照のこと）の３’末端に連結され得る。別の実施形態において、第１のプライマー結合セグメントは、その３’末端でランダム配列断片の５’末端に連結され得、第２のプライマー結合セグメントは、その５’末端でポリヌクレオチドバーコードの３’末端に連結され得、ポリヌクレオチドバーコードは、その５’末端でランダム配列断片の３’末端に連結される。さらに別の実施形態において、第１のプライマー結合セグメントは、その３’末端でポリヌクレオチドバーコードの５’末端に連結され得、第２のプライマー結合セグメントは、その５’末端でポリヌクレオチドバーコードの３’末端に連結され得る。
【0084】
プライマー結合セグメントが、核酸コンストラクトに含まれる実施形態において、プライマー結合セグメントは、長さ約１５塩基対～約３０、約１５塩基対～約２９塩基対、約１５塩基対～約２８塩基対、約１５塩基対～約２６塩基対、約１５塩基対～約２４塩基対、約１５塩基対～約２２塩基対、約１５塩基対～約２０塩基対、１６塩基対～約２８塩基対、約１６塩基対～約２６塩基対、約１６塩基対～約２４塩基対、約１６塩基対～約２２塩基対、約１６塩基対～約２０塩基対、１７塩基対～約２８塩基対、約１７塩基対～約２６塩基対、約１７塩基対～約２４塩基対、約１７塩基対～約２２塩基対、約１７塩基対～約２０塩基対、１８塩基対～約２８塩基対、約１８塩基対～約２６塩基対、約１８塩基対～約２４塩基対、約１８塩基対～約２２塩基対、または約１８塩基対～約２０塩基対の範囲であり得る。
【0085】
核酸コンストラクトの典型的な配列が、以下に示される。／５ＡｍＭＣ６／は、ポリマーナノ粒子への結合のための５’アミン修飾である。＊は、安定性のためのホスホロチオエート結合修飾である。Ａ＊Ｇ＊Ａ＊ＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ配列は、５’プライマー結合セグメント配列である。ＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴは、典型的なバーコードポリヌクレオチド配列である。Ｎは、ランダム配列断片を表す。ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔは、３’プライマー結合セグメント配列である。
【0086】
／５ＡｍＭＣ６／Ａ＊Ｇ＊Ａ＊ＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ
上に記載の様々な実施形態のすべてにおいて、全体の核酸コンストラクトは、長さ約３０塩基対～約２４０塩基対、約３０塩基対～約２３０塩基対、約３０塩基対～約２２０塩基対、約３０塩基対～約２１０塩基対、約３０塩基対～約２００塩基対、約３０塩基対～約１９０塩基対、約３０塩基対～約１８０塩基対、約３０塩基対～約１７０塩基対、約３０塩基対～約１６０塩基対、約３０塩基対～約１５０塩基対、約３０塩基対～約１４０塩基対、約３０塩基対～約１３０塩基対、約３０塩基対～約１２０塩基対、約３０塩基対～約１１０塩基対、約３０塩基対～約１００塩基対、約３０塩基対～約９０塩基対、約３０塩基対～約８０塩基対、約３０塩基対～約７０塩基対、約３０塩基対～約６０塩基対、約３０塩基対～約５０塩基対、約３０塩基対～約４０塩基対、４０塩基対～約１２０塩基対、約４０塩基対～約１１０塩基対、約４０塩基対～約１００塩基対、約４０塩基対～約９０塩基対、約４０塩基対～約８０塩基対、約４０塩基対～約７０塩基対、約４０塩基対～約６０塩基対、約４０塩基対～約５０塩基対、５０塩基対～約１２０塩基対、約５０塩基対～約１１０塩基対、約５０塩基対～約１００塩基対、約５０塩基対～約９０塩基対、約５０塩基対～約８０塩基対、約５０塩基対～約７０塩基対、約５０塩基対～約６０塩基対、または約４２塩基対～約２１０塩基対の範囲であり得る。
上に記載の様々な実施形態のすべてにおいて、全体の核酸コンストラクトは、長さ約３０塩基対～約２４０塩基対、約３０塩基対～約２３０塩基対、約３０塩基対～約２２０塩基対、約３０塩基対～約２１０塩基対、約３０塩基対～約２００塩基対、約３０塩基対～約１９０塩基対、約３０塩基対～約１８０塩基対、約３０塩基対～約１７０塩基対、約３０塩基対～約１６０塩基対、約３０塩基対～約１５０塩基対、約３０塩基対～約１４０塩基対、約３０塩基対～約１３０塩基対、約３０塩基対～約１２０塩基対、約３０塩基対～約１１０塩基対、約３０塩基対～約１００塩基対、約３０塩基対～約９０塩基対、約３０塩基対～約８０塩基対、約３０塩基対～約７０塩基対、約３０塩基対～約６０塩基対、約３０塩基対～約５０塩基対、約３０塩基対～約４０塩基対、４０塩基対～約１２０塩基対、約４０塩基対～約１１０塩基対、約４０塩基対～約１００塩基対、約４０塩基対～約９０塩基対、約４０塩基対～約８０塩基対、約４０塩基対～約７０塩基対、約４０塩基対～約６０塩基対、約４０塩基対～約５０塩基対、５０塩基対～約１２０塩基対、約５０塩基対～約１１０塩基対、約５０塩基対～約１００塩基対、約５０塩基対～約９０塩基対、約５０塩基対～約８０塩基対、約５０塩基対～約７０塩基対、約５０塩基対～約６０塩基対、または約４２塩基対～約２１０塩基対の範囲であり得る。
【0087】
核酸コンストラクトは、ポリマーナノ粒子と会合しており、典型的なポリマーナノ粒子対核酸コンストラクト比の範囲は、約２０：１～約１００００：１、約２０：１～約９０００：１、約２０：１～約８０００：１、約２０：１～約７０００：１、約２０：１～約６０００：１、約２０：１～約５０００：１、約２０：１～約４０００：１、約２０：１～約３０００：１、約２０：１～約２０００：１、約２０：１～約１０００：１、約２０：１～約９００：１、約２０：１～約８００：１、約２０：１～約７００：１、約２０：１～約６００：１、約２０：１～約５００：１、約２０：１～約４００：１、約２０：１～約３００：１、約２０：１～約２００：１、または約２０：１～約１００：１である。
【0088】
例示的な一態様において、バーコード化ポリマーナノ粒子は、本開示によるデリバリー媒体として使用されてもよい。一部の実施形態において、非ウイルス性デリバリー媒体は、１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーを含む。一部の実施形態において、非ウイルス性デリバリー媒体は、ポリマーナノ粒子を含む。一部の実施形態において、非ウイルス性デリバリー媒体は、脂質性の系でない。一部の実施形態において、非ウイルス性デリバリー媒体は、制御されたリビング／ラジカル重合プロセスから作製されるポリマーナノ粒子を含む。使用されるモノマー単位が、可逆的不活性化ラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、ヨウ素移動重合（ＩＴＰ）、セレニウム中心ラジカル媒介重合、テルル化物媒介重合（ＴＥＲＰ）、スチビン媒介重合、開環重合、またはそのような重合プロセスなどの制御されたリビング／ラジカル重合に適合する限り、モノマー単位の同一性が特に限定されないことが理解されるであろう。一部の実施形態において、ポリマーナノ粒子は、多様なセットのブロックコポリマーを合成し、ペイロードと複合体を形成する能力をスクリーニングするために、ＲＡＦＴ共重合によって作製されてもよい。一態様において、ポリマーナノ粒子（例えば、ＲＡＦＴコポリマー）は、連鎖移動薬剤を使用してＲＡＦＴコポリマーにペイロードをグラフトし、その後ポリマーをデリバリー媒体へと組み立てることによるなど、構成するポリマーにペイロードを化学的に結合させることによって作製されてもよい。
【0089】
様々な実施形態において、ペイロードは、共有結合、静電相互作用およびリガンド親和性相互作用のいずれかまたはすべてを使用してポリマーナノ粒子組成物と組み合わせられてもよい。一態様において、共有結合方法は、安定性の改善（「棚上」とインビボの両方）、分離および抽出の容易さ、ならびに高感度検出のためにペイロードとポリマーナノ粒子の間に安定なアミド結合を形成するためのＥＤＣ／ＮＨＳの使用を含む。別の例示的な態様において、静電的結合方法は、ペイロードと静電的に複合体形成する陽イオン性ポリマーナノ粒子の使用を含む。別の実施形態において、リガンド親和性結合は、アビジンとビオチンなどのリガンドの使用を含み、両方とも、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によってポリマーナノ粒子およびペイロードに共有結合されて、ペイロードとポリマーナノ粒子との安定な組合せを生ずる。
【0090】
ＲＡＦＴ重合が、当業者に一般に公知であることが理解されるであろう。米国特許第９，００６，１９３号、第９，４６４，３００号および第９，４７６，０６３号に記述されるものなど、これまでに調査されてきたＲＡＦＴ重合に適切な試薬、モノマーおよび条件は、本明細書に記述されるコポリマー、方法および組成物に使用することができ、それぞれの開示をその全体を参照により組み込む。
【0091】
本開示に関連して有用な連鎖移動薬剤（ＣＴＡ）は、当業者に公知である。ＣＴＡの同一性は、特に限定されない。ＲＡＦＴ重合の基礎を形成する連鎖移動ステップが、鎖と成長ラジカルの間の官能性鎖末端基［一般にチオカルボニルチオ基、Ｚ－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－Ｒ］の可逆的移動を含むことが理解されるであろう。全体のプロセスは、ＲＡＦＴ剤（ＣＴＡ）のＲ－とＺ－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－基の間のモノマーの挿入から構成され、それらの基は、得られたポリマー鎖の大多数のαおよびω末端基を形成する。本開示に関連する使用に適切なＣＴＡには、それだけには限らないが、トリチオ炭酸（Ｚ＝Ｓ－アルキル）、ジチオ安息香酸（Ｚ＝Ｐｈ）、ジチオカルバマート（Ｚ＝Ｎ－アルキル）、キサントゲン酸塩（Ｚ＝Ｏアルキル）、等がある［Sebastien Perrier, Macromolecules 2017 50 (19), 7433-7447を参照のこと］。一部の実施形態において、ＲＡＦＴ共重合は、上に記載の方法によってペイロードに結合させるのに利用可能な末端を持つカルボキシ終端ポリマーを得るために、１つまたは複数の終端カルボキシ基を含有する連鎖移動薬剤（ＣＴＡ）を使用して達成されてもよい。
この実施形態において、得られたモノ－またはジ－カルボキシ終端ポリマーが、低ｐＨ（例えば、ｐＨ６未満）の緩衝液中に分散される場合、ポリマーの両方の末端は露出しており、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学による標識に利用可能である。この実施形態において、ポリマーが生理的ｐＨ（およそｐＨ７）へ移されると、コアブロックは自己組織化し、細胞のエンドソーム区画における酸性化により放出され、露出されるように疎水性コア内にペイロードを封入する。一部の実施形態において、第１または第２の連鎖移動薬剤は、トリチオ炭酸ビス（カルボキシメチル）、ビス（２－アミノ－２－オキソエチル）トリチオ炭酸、トリチオ炭酸＝ビス［４－（２－ヒドロキシエトキシカルボニル）ベンジル］、４－シアノ－４－（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－［（フェニルカルボノチオイル）チオ］ペンタン酸、および４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸、４－シアノ－４－（チオベンゾイルチオ）ペンタン酸、２－シアノ－２－プロピルベンゾジチオアート、シアノメチルメチル（フェニル）カルバモジチオアート、２－シアノ－２－プロピルドデシルトリチオカルボナート、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸、シアノメチルドデシルトリチオカーボナート、２－シアノ－２－プロピル４－シアノベンゾジチオアート、等からなる群から選択され得る。
この実施形態において、得られたモノ－またはジ－カルボキシ終端ポリマーが、低ｐＨ（例えば、ｐＨ６未満）の緩衝液中に分散される場合、ポリマーの両方の末端は露出しており、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学による標識に利用可能である。この実施形態において、ポリマーが生理的ｐＨ（およそｐＨ７）へ移されると、コアブロックは自己組織化し、細胞のエンドソーム区画における酸性化により放出され、露出されるように疎水性コア内にペイロードを封入する。一部の実施形態において、第１または第２の連鎖移動薬剤は、トリチオ炭酸ビス（カルボキシメチル）、ビス（２－アミノ－２－オキソエチル）トリチオ炭酸、トリチオ炭酸＝ビス［４－（２－ヒドロキシエトキシカルボニル）ベンジル］、４－シアノ－４－（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－［（フェニルカルボノチオイル）チオ］ペンタン酸、および４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸、４－シアノ－４－（チオベンゾイルチオ）ペンタン酸、２－シアノ－２－プロピルベンゾジチオアート、シアノメチルメチル（フェニル）カルバモジチオアート、２－シアノ－２－プロピルドデシルトリチオカルボナート、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸、シアノメチルドデシルトリチオカーボナート、２－シアノ－２－プロピル４－シアノベンゾジチオアート、等からなる群から選択され得る。
【0092】
本開示に関連して有用なＲＡＦＴが、様々なポリマー組成物であり得ることが理解されるであろう。例えば、本開示に関連して有用なＲＡＦＴポリマーは、単一のポリマーブロックを含むランダムブロックポリマー、もしくは２つのポリマーブロックを含むジブロックＲＡＦＴコポリマー、もしくは３つのポリマーブロックを含むトリブロックＲＡＦＴコポリマーであることができ、またはさらなる数のブロックが使用され得る。当業者は、ＲＡＦＴ重合によるブロックポリマーの調製が、当業者に公知であり、そのような重合プロセスが、本開示に適用され得ることを容易に認識することになる［Goby, et. al., Nat. Commun. 4:2505 doi: 10.1038/ncomms3505 (2013)を参照のこと］。
【0093】
一部の実施形態において、本明細書において調製されるＲＡＦＴコポリマーは、以下の構造：
ＣＴＡＣａｐ－［ブロック１］ｍ－［ブロック２］ｎ－ＣＴＡＣａｐ
によって記述され得、各ＣＴＡＣａｐは、ＲＡＦＴコポリマーを調製するプロセスにおいて使用される連鎖移動薬剤から得られるキャップ形成単位である。ブロック１およびブロック２それぞれの調製に使用されるＣＴＡは、同一であることもまたは異なることもできる。一部の実施形態において、ブロック１およびブロック２のそれぞれの調製に使用されるＣＴＡは、同一である（例えば、ｍａｃｒｏＣＴＡ）。一部の実施形態において、ブロック１およびブロック２のそれぞれの調製に使用されるＣＴＡは、異なる。一部の実施形態において、ブロック１およびブロック２の一方または両方の調製に使用されるＣＴＡは、ＲＡＦＴコポリマーに生体分子、薬物または標識を共有結合するための官能基を含む。一部の実施形態において、共有結合は、エステルまたはアミド結合によることができる。一部の実施形態において、共有結合は、ＥＤＣ－ＮＨＳ化学によることができる。一部の実施形態において、第１のキャップ形成単位は、式
ＣＴＡＣａｐ－［ブロック１］ｍ－［ブロック２］ｎ－ＣＴＡＣａｐ
によって記述され得、各ＣＴＡＣａｐは、ＲＡＦＴコポリマーを調製するプロセスにおいて使用される連鎖移動薬剤から得られるキャップ形成単位である。ブロック１およびブロック２それぞれの調製に使用されるＣＴＡは、同一であることもまたは異なることもできる。一部の実施形態において、ブロック１およびブロック２のそれぞれの調製に使用されるＣＴＡは、同一である（例えば、ｍａｃｒｏＣＴＡ）。一部の実施形態において、ブロック１およびブロック２のそれぞれの調製に使用されるＣＴＡは、異なる。一部の実施形態において、ブロック１およびブロック２の一方または両方の調製に使用されるＣＴＡは、ＲＡＦＴコポリマーに生体分子、薬物または標識を共有結合するための官能基を含む。一部の実施形態において、共有結合は、エステルまたはアミド結合によることができる。一部の実施形態において、共有結合は、ＥＤＣ－ＮＨＳ化学によることができる。一部の実施形態において、第１のキャップ形成単位は、式
【0094】
【化3】
【0095】
【化4】
【0096】
一部の実施形態において、ＲＡＦＴコポリマーは、静電相互作用、高親和性、非共有結合、アビジン－ストレプトアビジンコンジュゲーションを含めたいくつかの方法を介して、または直接共有結合、例えば、アミド結合によってＤＮＡ分子、特に本開示の核酸コンストラクトと会合され得る。一部の実施形態において、ＲＡＦＴコポリマーは、生体分子と複合体形成する静電相互作用を介してＤＮＡ分子、特に本開示の核酸コンストラクトと会合され得る。一部の実施形態において、ＲＡＦＴコポリマーは、生体分子と複合体形成する静電相互作用を介してＤＮＡ分子、特に本開示の核酸コンストラクトと会合され得る。一部の実施形態において、ＲＡＦＴコポリマーは、高親和性、非共有結合、アビジン－ストレプトアビジンコンジュゲーションを介してＤＮＡ分子、特に本開示の核酸コンストラクトと会合され得る。一部の実施形態において、ＲＡＦＴコポリマーは、直接共有結合、例えば、アミド結合によってＤＮＡ分子、特に本開示の核酸コンストラクトと会合され得る。
【0097】
図５（ａ）～５（ｅ）に示すように、本明細書に記述されるＰＮＰは、静電相互作用、アビジン－ストレプトアビジンコンジュゲーションを介して、または直接共有結合によって本開示の核酸コンストラクトと会合され得る。簡潔には、図５（ａ）～５（ｅ）に示すように、図に提供される標識は、以下の通りである：００１．静電的ローディングの場合には正に荷電したコロナを持つポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）。００２．リン酸基による負電荷がある核酸コンストラクト。００３．静電的に搭載されたＰＮＰ核酸コンストラクト複合体。００４．ＰＮＰのコロナ内にあるポリマー鎖の終末端上のカルボキシラート基。００５．アミンで停止している核酸コンストラクトの５’末端上の１級アミン基。００６．核酸コンストラクトの３’末端上のリン酸基。００７．アミン終端の核酸コンストラクトとカルボキシラートで停止しているＰＮＰの間の直接アミド化反応で形成されるアミド結合。００８．アビジンなどのビオチン結合タンパク質上の１級アミン。０１０．ＰＮＰのコロナ内にあるポリマー鎖の終末端上のカルボキシラート基とアビジンなどのビオチン結合タンパク質上の１級アミンとの間で形成されるアミド結合。０１１．５’終端にビオチン官能基を含む核酸コンストラクト。０１２．正に荷電したＰＮＰが、負に荷電した核酸コンストラクトと混合された場合に起こる静電的カップリング反応。０１３．ＰＮＰのコロナ内にあるポリマー鎖の終末端上のカルボキシラート基とアミンで停止した核酸コンストラクト上の１級アミンとの間のＥＤＡ－ＮＨＣ反応を介して実施される直接アミド化反応。０１４．ＰＮＰのコロナ内にあるポリマー鎖の終末端上のカルボキシラート基とアビジンなどのビオチン結合タンパク質上の１級アミンとの間のＥＤＡ－ＮＨＣ反応を介して実施される直接アミド化反応。０１５．核酸コンストラクトの５’末端上のビオチンとＰＮＰのコロナ上のカルボキシラート終端にコンジュゲートされたアビジンとのカップリング。
【0098】
一部の実施形態において、ブロック１およびブロック２のそれぞれは、ＲＡＦＴ重合プロセスを使用して重合される１つまたは複数のモノマー単位を含むことができる。使用されるモノマー単位が、可逆的不活性化ラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、ヨウ素移動重合（ＩＴＰ）、セレニウム中心ラジカル媒介重合、テルル化物媒介重合（ＴＥＲＰ）、スチビン媒介重合、開環重合、またはそのような重合プロセスなどの制御されたリビング／ラジカル重合に適合する限り、モノマー単位の同一性が特に限定されないことが理解されるであろう。適切なモノマー単位には、それだけには限らないが、２－ジメチルアミノエチルアクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート（ＤＥＡＥＭＡ）、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート（ＤＰＡＥＭＡ）、ブチルメタクリラート（ＢＭＡ）、アクリル酸エチル（ＥＡＡ）、アクリル酸プロピル（ＰＡＡ）、（ヒドロキシエチル）メタクリラート（ＨＥＭＡ）、メチルメタクリラート（ＭＭＡ）、アクリル酸（ＡＡ）、アセト酢酸アニリド（ＡＡＡ）、４－アミノベンゾニトリル（ＡＢＮ）、９－アントラセニルメチルアクリラート（ＡＣＭＡ）、９－アントラセニルメチルメタクリラート（ＡＣＭＭＡ）、アミノエチルメタクリラート（ＡＥＭ）、２－（２－アミノエチルアミノ）エチルメタクリラート（ＡＥＡＥＭＡ）、４－（２－アクリルオキシエトキシ）－２－ヒドロキシベンゾフェノン（ＡＥＨＢＰ）、２－アミノエチルメタクリラート（ＡＥＭＡ）、Ｎ－（２－アミノエチル）メタクリルアミド（ＡＥＭＡＡ）、３－アミノ－２－ヒドロキシプロピルメタクリラート（ＡＥＡＨＰＭＡ）、３－アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＨＰＭＡ）、アリルメタクリラート（ＡＬＭＡ）、アクリルアミド（ＡＭ）、アミドアミン（ＡＭＡ）、３－メタクリルアミド－３－メチルブタン酸（ＡＭＢＡ）、２－アリルオキシベンズアルデヒド（ＡＯＢＡ）、［２－（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＡＯＥＴＭＡ）、３－（アクリロイルオキシ）－２－ヒドロキシプロピルメタクリラート（ＡＯＨＯＰＭＡ）、４－アミノフェネチルアルコール（ＡＰＡ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、５－（３－（アミノ）－プロポキシ）－２－ニトロベンジルメタクリラート（ＡＰＮＢＭＡ）、Ｎ－［Ｎ’－（２－アミノエチル）－２－アミノエチル］アスパルトアミド［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］、２－アジドエチルメタクリラート（ＡｚＥＭＡ）、２，２’－ビチオフェン（２－２－ＢＴＰ）、ｔ－ブチルアクリラート（ＢＡ）、ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタール（ＢＡＡＤＡ）、Ｎ－（ｔ－ＢＯＣ－アミノプロピル）メタクリルアミド（ＢＡＰＭＡＡ）、ｔ－ブチル２－ブロモアクリラート（ＢＢＡ）、４－ブチルベンゾイルクロリド（ＢＢＣ）、１，３－ブタジエン（ＢＤ）、２－ブチル－２－エチル－１，３－プロパンジオール（ＢＥＰＤ）、ジ－ｔ－ブチルイミノジアセタート（ＢＩＤＡ）、３－（ブロモメチル）－５－（（トリメチルシリル）エチニル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＢＭＴＭＳＥＢＳ）、２－（ベンジルオキシ）エタノール（ＢＯＥ）、４－ｔ－ブトキシスチレン（ＢＯＳ）、分枝状ポリエチレンイミン（ＢＰＥＩ）、３－ブロモ－５－（（トリメチルシリル）エチニル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＢＴＭＳＥＢＳ）、ε－カプロラクトン（ＣＡＰ）、カルボキシベタインメタクリラート（ＣＢＭＡ）、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（ＣＥＤＰＣＰＰ）、Ｎ－シクロへキシルマレイミド（ＣＨＭＩ）、３－クロロ－２－ヒドロキシプロピルメタクリラート（ＣＨＰＭＡ）、ドデシルアクリラート（ＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ジアリルアクリルアミド（ＤＡＡ）、ジアリルメチルアミン（ＤＡＭＡ）、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＡＤＭＡＣ）、２，５－ジアミノピリジン（ＤＡＰ）、５，５’－ジブロモ－４，４’－ジドデシル－２，２’－ビチオフェン（ＤＢＤＤＢＴ）、５，５’－ジブロモ－４，４’－ジテトラデシル－２，２’－ビチオフェン（ＤＢＤＴＢＴ）、２，５－ジブロモ－３－ヘキシルチオフェン（ＤＢＨＴＰ）、ジクロロメチルビニルシラン（ＤＣＭＶＳ）、２－（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート（ＤＥＡＥＭＡ）、ジエチルオキサルプロピオナート（ＤＥＯＰ）、ＤＬ－ラクチド（ＤＬＬ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ－２－エチルメタクリラート）（ＤＭＡ）、Ｎ－［３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）プロピル］－メタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）、［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチル－（３－スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド（ＤＭＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルブチルアミン（ＤＭＢＡ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエタノールアミン（ＤＭＥＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ－２－エチルアクリラートまたは２－（ジメチルアミノ）エチルアクリラート（ＤＭＡＥＡ）、１－（ジメチルアミノ）ピロール（ＤＭＡＰ）、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジルアルコール（ＤＭＯＮＢＡ）、３，４－ジメトキシチオフェン（ＤＭＯＴ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、２－デオキシ－２－メタクリルアミドグルコピラノース（ＤＯＭＡＡＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、３－ドデシルチオフェン（３－ＤＴ）、Ｎ－［２－（２－ピリジルジチオ）］エチルメタクリルアミド（ＤＴＥＭＡ）、アクリル酸エチル（ＥＡＡ）、エチル２－（ブロモメチル）アクリラート（ＥＢＭＡ）、エチル１－シアノ－１－シクロプロパンカルボキシラート（ＥＣＣＰＣ）、３，４－エチレンジオキシチオフェン（ＥＤＯＴ）、エチレングリコールジメタクリラート（ＥＧＤＭＡ）、エチレングリコールフェニルエーテルアクリラート（ＥＧＰＥＡ）、エチルメタクリラート（ＥＭＡ）、３－（フルオロスルホニル）－５－（（トリメチルシリル）エチニル）安息香酸（３ＦＴＭＳＥＢＡ）、３－ホルミル－５－（（トリメチルシリル）エチニル）ベンゼンスルホニルフルオリド（３ＦＴＭＳＥＢＳ）、４－ホルミル－２－（（トリメチルシリル）エチニル）ベンゼンスルホニルフルオリド（４ＦＴＭＳＥＢＳ）、５－フルオロ－２，３－チオフェンジカルボキシアルデヒド（５ＦＴＰＤＣＡ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコース（ＧｌｃＮＡｃ）、グリシジルメタクリラート（ＧＭＡ）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、５，７－ヘキサデカジイン酸（ＨＤＤＡ）、２－ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロピルアクリラート（ＨＦＩＰＡ）、１，１，４，７，１０，１０－ヘキサメチルトリエチレンテトラミン（ＨＭＴＥＴＡ）、４－ヒドロキシブチルアクリラート（ＨＯＢＡ）、２－（４－ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＰＡＢＡ）、２，２，３，３，４，４，４－ヘプタフルオロブチルアクリラート（ＨＰＦＢＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）－メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、２，２，３，４，４，４－ヘキサフルオロブチルアクリラート（ＨＸＦＢＡ）、イソボルニルアクリラート（ＩＢＡ）、４－ヨードベンゾイルクロリド（ＩＢＣ）、イソボルニルメタクリラート（ＩＢＭＡ）、Ｎ－（イソブトキシメチル）アクリルアミド（ＩＢＭＡＡ）、イソデシルアクリラート（ＩＤＡ）、無水マレイン酸（ＭＡ）、［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＭＡＥＴＭＡ）、メタクリロイル－Ｌ－リジン（ＭＡＬ）、メタクリルオキシスクシンイミド（ＭＡＳ）、メタクリルアミドトレハロース（ＭＡＴ）、メチルヘプタデカノアート（ＭＨＤ）、１－メチル－１Ｈ－インドール－３－カルバルデヒド（ＭＩＣＡ）、２－Ｎ－メチルマレイミド（ＭＭＩ）、メチル－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシル無水物（ＭＮＤＣＡ）、メトキシエチルメタクリラート（ＭＯＥＭＡ）、２－（２－メトキシエトキシ）エチルメタクリラート（ＭＯＥＯＥＭＡ）、３－メチル－３－オキセタンメタノール（ＭＯＭ）、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、４－ビニル安息香酸メチル（ＭＶＢ）、２－ナフチルアクリラート（ＮＡ）、Ｎ－（アクリルオキシ）スクシンイミド（ＮＡＳ）、ｏ－ニトロベンジルメタクリラート（ＮＢＭＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－（メタアクリルオキシ）スクシンイミドメタクリラート（ＮＨＳＭＡ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、２－ナフチルメタクリラート（ＮＭＡ）、Ｎ－（メタクリロイルオキシ）スクシンイミド（ＮＭＳ）、Ｎ－（ｎ－オクタデシル）アクリルアミド（ＮＯＤＡＡ）、４－ニトロ－Ｎ－プロピルベンジルアミン塩酸塩（ＮＰＢＡＨＣ）、オリゴエチレングリコールメタクリラート（ＯＥＧＭＡ）、オリゴエチレンイミン（ＯＥＩ）、３－フェニルチオフェン（３－ＰＴＰ）、ポリ（Ｎ－メチル４－ビニルピリジンヨウ化物）（Ｐ４ＶＰＱ）、ポリ（２－アミノエチルメタクリルアミド）（ＰＡＥＭＡ）、Ｎ－（Ｎ’－｛Ｎ’’－［Ｎ’’’－（２－アミノエチル）－２－アミノエチル］－２－アミノエチル｝－２－アミノエチル）－アスパルトアミド［Ａｓｐ（ＴＥＰ）］、４－ペンテン酸無水物（ＰＡＮ）、ペンタブロモベンジルアクリラート（ＰＢＢＡ）、ペンタブロモベンジルメタクリラート（ＰＢＢＭＡ）、ペンタブロモフェニルアクリラート（ＰＢＰＡ）、ペンタブロモフェニルメタクリラート（ＰＢＰＭＡ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、トランス－２－フェニルシクロプロピルイソシアナート（ＰＣＰＩ）、１，５－ペンタンジオール（ＰＤ）、２－フェニル－１，３－ジオキサン－５－オール（ＰＤＯ）、ピリジルジスルフィドエチルメタクリラート（ＰＤＳＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレングリコール）アクリラート（ＰＥＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリラート（ＰＥＧＭＥＭＡ、ポリ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリラート（ＰＥＧＥＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）メタクリラート（ＰＥＧＭＡ）、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ペンタエリスリトールテトラアクリラート（ＰＥＴＡ）、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）、ペンタフルオロフェニルアクリラート（ＰＦＰＡ）、ペンタフルオロフェニルメタクリラート（ＰＦＰＭＡ）、ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）、ポリ（グリコアミドアミン）（ＰＧＡＡ）、ポリ（グリシジルブチルアミン）（ＰＧＢＡ）、エタノールアミンで官能化されたポリ（グリシジルメタクリラート）（ＰＧＥＡ）、ポリ（グリシジルメタクリラート）（ＰＧＭＡ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ＰＬＧ）、ポリ（乳－共同－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（ラウリルメタクリラート）（ＰＬＭＡ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ－（２－デオキシ－２－メタクリルアミドグルコピラノース）（ＰＭＡＧ）、ポリ－（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ［Ｎ－（３－（メタクリロイルアミノ）プロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド］（ＰＭＰＤ）、ポリ（ｎ－ブチルアクリラー
ト）（ＰｎＢＡ）、ポリ（ｎ‐ブチルメタクリラート）（ＰｎＢＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（オリゴエチレングリコールメタクリラート）（ＰＯＥＧＭＡ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、３，４－プロピレンジオキシチオフェン（ＰｒｏＤＯＴ）、ポリ（スチレン）（ＰＳ）、ポリ（ナトリウム４－スチレンスルホナート）（ＰＳＳ）、ポリ（トリブチル－（４－ビニルベンジル）ホスホニウムクロリド）（ＰＴＢＰ）、ポリ（トリエチル－（４－ビニルベンジル）ホスホニウムクロリド）（ＰＴＥＰ）、ポリ（（２－トリメチルアミノ）エチルメタクリラートクロリド）（ＰＴＭＡＥＭＡ）、ポリ（（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウム）（ＰＶＢＴＭＡ）、ポリ（２－ビニル－４，４－ジメチルアズラクトン）（ＰＶＤＭＡ）、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド）（ＰＶＰ）、四級化ポリ－ＤＭＡＥＭＡ（ＱＰＤＭＡＥＭＡ）、スルホベタインメタクリラート（ＳＢＭＡ）、３－スルホプロピルメタクリラートカリウム塩（ＳＰＭＡＰ）、チオコレステロール（ＴＣ）、チオフェン－２，５－ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（ＴＤＡＢＰ）、トリエチレングリコールジメタクリラート（ＴＥＧＤＭＡ）、トリフルオロエチレン（ＴＦＥ）、２，２，２－トリフルオロエチルアクリラート（ＴＦＥＡ）、２，２，２－トリフルオロエチルメタクリラート（ＴＦＥＭＡ）、テトラヒドロフルフリルアクリラート（ＴＨＦＡ）、トリアリルイソシアヌラート（ＴＩＣ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、４，４’－トリメチレンジピペリジン（ＴＭＤＰ）、トリメチロールプロパントリス（３－メルカプトプロピオナート）（ＴＭＰＴＭＰ）、（トリメチルシリル）メタクリラート（ＴＭＳＭＡ）、トリフェニルカルベニウムペンタクロロスタンナート（ＴＰＣＰＣＳ）、３－ビニルベンズアルデヒド（３ＶＢＡ）、４－ビニルピリジニウムクロリド（４ＶＰ）、ビニルアクリラート（ＶＡ）、酢酸ビニル（ＶＡＴ）、４－ビニル安息香酸（ＶＢＡ）、（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウムクロリド（ＶＢＴＡＣ）、１－ビニルイミダゾール（ＶＩ）、１－ビニル－２－ピロリドン（ＶＰ）、ｍ－キシリレンジアミン（ＸＤＡ）、ステアリン酸亜鉛（ＺＳ）、等がある。
ト）（ＰｎＢＡ）、ポリ（ｎ‐ブチルメタクリラート）（ＰｎＢＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（オリゴエチレングリコールメタクリラート）（ＰＯＥＧＭＡ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、３，４－プロピレンジオキシチオフェン（ＰｒｏＤＯＴ）、ポリ（スチレン）（ＰＳ）、ポリ（ナトリウム４－スチレンスルホナート）（ＰＳＳ）、ポリ（トリブチル－（４－ビニルベンジル）ホスホニウムクロリド）（ＰＴＢＰ）、ポリ（トリエチル－（４－ビニルベンジル）ホスホニウムクロリド）（ＰＴＥＰ）、ポリ（（２－トリメチルアミノ）エチルメタクリラートクロリド）（ＰＴＭＡＥＭＡ）、ポリ（（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウム）（ＰＶＢＴＭＡ）、ポリ（２－ビニル－４，４－ジメチルアズラクトン）（ＰＶＤＭＡ）、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド）（ＰＶＰ）、四級化ポリ－ＤＭＡＥＭＡ（ＱＰＤＭＡＥＭＡ）、スルホベタインメタクリラート（ＳＢＭＡ）、３－スルホプロピルメタクリラートカリウム塩（ＳＰＭＡＰ）、チオコレステロール（ＴＣ）、チオフェン－２，５－ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（ＴＤＡＢＰ）、トリエチレングリコールジメタクリラート（ＴＥＧＤＭＡ）、トリフルオロエチレン（ＴＦＥ）、２，２，２－トリフルオロエチルアクリラート（ＴＦＥＡ）、２，２，２－トリフルオロエチルメタクリラート（ＴＦＥＭＡ）、テトラヒドロフルフリルアクリラート（ＴＨＦＡ）、トリアリルイソシアヌラート（ＴＩＣ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、４，４’－トリメチレンジピペリジン（ＴＭＤＰ）、トリメチロールプロパントリス（３－メルカプトプロピオナート）（ＴＭＰＴＭＰ）、（トリメチルシリル）メタクリラート（ＴＭＳＭＡ）、トリフェニルカルベニウムペンタクロロスタンナート（ＴＰＣＰＣＳ）、３－ビニルベンズアルデヒド（３ＶＢＡ）、４－ビニルピリジニウムクロリド（４ＶＰ）、ビニルアクリラート（ＶＡ）、酢酸ビニル（ＶＡＴ）、４－ビニル安息香酸（ＶＢＡ）、（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウムクロリド（ＶＢＴＡＣ）、１－ビニルイミダゾール（ＶＩ）、１－ビニル－２－ピロリドン（ＶＰ）、ｍ－キシリレンジアミン（ＸＤＡ）、ステアリン酸亜鉛（ＺＳ）、等がある。
【0099】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＲＡＦＴコポリマーのブロック１および／またはブロック２を作製するために使用されるモノマー単位は、２－（ジメチルアミノ）エチルアクリラート（ＤＭＡＥＥＡ）、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリラート（ＤＥＡＥＥＡ）、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリラート（ＤＩＥＡＭＡ）、ブチルメタクリラート（ＢＭＡ）、アクリル酸エチル（ＥＡＡ）、アクリル酸プロピル（ＰＡＡ）、（ヒドロキシエチル）メタクリラートおよびメチルメタクリラート（ＭＭＡ）からなる群から選択される。
【0100】
一部の実施形態において、本明細書に提供されるＲＡＦＴコポリマーは、式：
ＣＴＡＣａｐ－［（Ｂ１Ｍ１）ｍ－Ｂ１Ｍ２－Ｂ１Ｍ３－（Ｂ１Ｍ２）－ｍ－Ｂ１Ｍ１－Ｂ１Ｍ３－（Ｂ１Ｍ３）－ｍ－Ｂ１Ｍ１－Ｂ１Ｍ２］ｍ－［（Ｂ２Ｍ１）ｎ－Ｂ２Ｍ２－Ｂ２Ｍ３－（Ｂ２Ｍ２）－ｎ－Ｂ２Ｍ１－Ｂ２Ｍ３－（Ｂ２Ｍ３）－ｎ－Ｂ２Ｍ１－Ｂ２Ｍ２］ｎ－ＣＴＡＣａｐ
によって記述できる。
ＣＴＡＣａｐ－［（Ｂ１Ｍ１）ｍ－Ｂ１Ｍ２－Ｂ１Ｍ３－（Ｂ１Ｍ２）－ｍ－Ｂ１Ｍ１－Ｂ１Ｍ３－（Ｂ１Ｍ３）－ｍ－Ｂ１Ｍ１－Ｂ１Ｍ２］ｍ－［（Ｂ２Ｍ１）ｎ－Ｂ２Ｍ２－Ｂ２Ｍ３－（Ｂ２Ｍ２）－ｎ－Ｂ２Ｍ１－Ｂ２Ｍ３－（Ｂ２Ｍ３）－ｎ－Ｂ２Ｍ１－Ｂ２Ｍ２］ｎ－ＣＴＡＣａｐ
によって記述できる。
【0101】
例えば、２５単位のブロック１中の１種のモノマー、および合計ｎ３５単位に対して平均モノマー単位比２０：１０：５を有するブロック２中の３種の異なるモノマーを有する本明細書に記載のＲＡＦＴコポリマーは、一般式
ＣＴＡＣａｐ－［Ｂ１Ｍ１］２５－［（Ｂ２Ｍ１）２０－（Ｂ２Ｍ２）１０－（Ｂ２Ｍ３）５］－ＣＴＡＣａｐ
によって記述できる。
ＣＴＡＣａｐ－［Ｂ１Ｍ１］２５－［（Ｂ２Ｍ１）２０－（Ｂ２Ｍ２）１０－（Ｂ２Ｍ３）５］－ＣＴＡＣａｐ
によって記述できる。
【0102】
ＲＡＦＴ重合を使用して調製されるポリマーが、単位、したがって分子量の分布を有するランダムなポリマーであることがさらに理解されるであろう。したがって、上の例におけるブロック２の漫画表記は、上に記載の比でＢ２Ｍ１、Ｂ２Ｍ２およびＢ２Ｍ３の３５個のモノマー単位を含むランダムコポリマーである。
【0103】
別の例示的な実施形態において、ポリマーナノ粒子組成物を１つまたは複数のポリマーでコーティングして、免疫応答から組成物を保護するまたはエンドソーム脱出を増強させることができる。一実施形態において、１つまたは複数のポリマーは、ポリエチレングリコールを含む。別の実施形態において、１つまたは複数のポリマーは、ポリエチレングリコールポリ－Ｌ－リジンを含む。さらに別の実施形態において、１つまたは複数のポリマーは、ポリエチレンイミンを含む。さらなる実施形態において、１つまたは複数のポリマーは、ポリエチレングリコールポリ－Ｌ－リジンおよびポリエチレンイミンを含む。
【0104】
本明細書に記載されるＲＡＦＴコポリマーのパラメータおよび特性を調整することが、本明細書に記載の組成物および方法におけるその使用に有利であり得ることが理解されるであろう。したがって、単体または本明細書に記載のライブラリー形式のいずれかでＲＡＦＴコポリマーを調製する方法は、ＲＡＦＴコポリマーの特定のパラメータおよび特性を提供することができる。
【0105】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＲＡＦＴブロックポリマーは、全体の分子量（Ｍｎ）（即ちすべてのブロックの合計）約１ｋＤａ～約１０００ｋＤａ、もしくは約２ｋＤａ～約５００ｋＤａ、もしくは約２ｋＤａ～約１６０ｋＤａの範囲、全体の重合度約１０～約３５００、もしくは約２０～約２５００、もしくは約３０～約９００の範囲、サイズ約１０ｎｍ～約１００００ｎｍの範囲、および最大コロナ対コア比（ＣＣＲ）約１～約４のうち１つまたは複数を有する。一部の実施形態において、全体の分子量（Ｍｎ）は、約３０ｋＤａ～約１２０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約１１０ｋＤａ、約５０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約９０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約８０ｋＤａ、および約４０ｋＤａ～約６０ｋＤａの範囲である。一部の実施形態において、全体の重合度は、約４０～約８５０、約６０～約８００、約１００～約７００、約２００～約６００、または約３００～約５００の範囲である。一部の実施形態において、サイズは、約１０ｎｍ～約１００００ｎｍ、または約２０ｎｍ～約５０００ｎｍ、または約５０ｎｍ～約３０００ｎｍ、または約２０ｎｍ～約１０００ｎｍ、または約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、または約３０ｎｍ～約５００ｎｍ、または約２００ｎｍ～約２０００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約０５００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約１５ｎｍ～約４５ｎｍ、約２０ｎｍ～約４０ｎｍ、または約２５ｎｍ～約３５ｎｍの範囲である。一部の実施形態において、最大コロナ対コア比（ＣＣＲ）は、４未満、または３未満、約１～約３．８、約１．２～約３．５、約１．５～約３、約１．５～約２．５、もしくは約１～約２である。
【0106】
一部の実施形態において、第１のブロックは、１つまたは複数のモノマー単位から調製され得、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約２００ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ、または約１ｋＤａ～約８０ｋＤａの範囲、および重合度約１０～約３５００、または約１０～約２５００、または約２０～約２０００、または約５０～約１２００、または約５０～約１０００の範囲を有する。一部の実施形態において、第１のブロックの分子量（Ｍｎ）は、約１ｋＤａ～約５００ｋＤａ、または約２ｋＤａ～約４００ｋＤａ、または約５ｋＤａ～約２００ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ、または約１５ｋＤａ～約１００ｋＤａ、または約２５ｋＤａ～約６０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ～約５５ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約５０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ～約４０ｋＤａ、等の範囲であり得る。一部の実施形態において、第１のブロックの重合度は、約３０～約３５０、約５０～約３００、約７０～約２５０、約８０～約２４０、約１００～約２００、等の範囲である。
【0107】
一部の実施形態において、第２のブロックは、１つまたは複数のモノマー単位から調製され得、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約２００ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ、または約１ｋＤａ～約８０ｋＤａの範囲、重合度約１０～約３５００、または約１０～約２５００、または約２０～約２０００、または約５０～約１２００、または約５０～約１０００の範囲を有し得る。一部の実施形態において、第２のブロックの分子量（Ｍｎ）は、約１０ｋＤａ～約７０ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約６５ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約６０ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約５５ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１５ｋＤａ、等の範囲である。一部の実施形態において、第２のブロックの重合度は、約３～約２５００；または約２０～約２０００、または約３０～約１５００、または約４０～約１２００、または約１０～約５００、または約１２～約４５０、または約２０～約４００、または約２５～約３５０、または約５０～約３００、または約１００～約２５０、または約１５０～約２００、または約５～約５０、または約５～約２０、等の範囲である。
【0108】
一部の実施形態において、第３、第４またはその後のブロックは、１つまたは複数のモノマー単位から調製され得、それぞれは、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約２００ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ、または約１ｋＤａ～約８０ｋＤａの範囲、および重合度約１０～約３５００、または約１０～約２５００、または約２０～約２０００、または約５０～約１２００、または約５０～約１０００の範囲を有することができる。一部の実施形態において、第３、第４またはその後のブロックの分子量、（Ｍｎ）は、約１０ｋＤａ～約７０ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約６５ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約６０ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約５５ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１５ｋＤａ、等の範囲である。一部の実施形態において、第３、第４またはその後のブロックの重合度は、約３～約２５００；または約２０～約２０００、または約３０～約１５００、または約４０～約１２００、または約１０～約５００、または約１２～約４５０、または約２０～約４００、または約２５～約３５０、または約５０～約３００、または約１００～約２５０、または約１５０～約２００、または約５～約５０、または約５～約２０、等の範囲である。
【0109】
一部の実施形態において、本開示に関連して単一の連鎖移動薬剤が、ＲＡＦＴ重合プロセスに使用され得る。一部の実施形態において、２つ以上のブロックを有するブロックポリマーの場合、本開示に関連して１つまたは複数の連鎖移動薬剤が、ＲＡＦＴ重合プロセスに使用され得る。一部の実施形態において、２つのブロックを有するブロックポリマーの場合、第１の連鎖移動薬剤および第２の連鎖移動薬剤（それらは同一の場合もまたは異なる場合もある）が、本開示に関連するＲＡＦＴ重合プロセスの各ステップで使用され得る。一部の実施形態において、３つのブロックを有するブロックポリマーの場合、第１の連鎖移動薬剤、第２の連鎖移動薬剤および第３の連鎖移動薬剤（それらは同一の場合もまたは異なる場合もある）が、本開示に関連するＲＡＦＴ重合プロセスの各ステップで使用され得る。
【0110】
本明細書に記述されるＲＡＦＴ重合方法ステップおよび精製ステップにおいて、様々な溶媒が使用され得ることが理解されるであろう。適切な溶媒には、２－クロルエタノール、酢酸（氷）、アセトン、アセトニトリル、アセトフェノン、アニリン、ベンズアルデヒド、酢酸ベンジル、二硫化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノール、ジ（エチレングリコール）、ジ（プロピレングリコール）、ジアセトンアルコール、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチレングリコール、ホルムアルデヒド（３７％溶液）、ホルムアミド、ギ酸、ギ酸（９６％）、ヘキサンイソブタノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、イソプロピルエーテル、ｍ－クレゾール、メタノール、酢酸メチル、メチルエチルケトン、鉱油、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ｎ－ブタノール、ｎ－オクタン、ｎ－プロパノール、プロピレングリコール、ピリジン、ｔ－ブタノール、テトラヒドロフラン、トリフルオロ酢酸、水、等、およびその組合せがあるが、これに限定されない。
【0111】
一部の実施形態において、１つまたは複数のナノ粒子形成ポリマーは、
ａ． ＲＡＦＴ共重合プロセスにおける第１の連鎖移動薬剤から得られる第１のキャップ形成単位を含む第１の終端；
ｂ． 第１の反応性機能的単位に共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第１のブロック；
ｃ． 適宜、第１のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第２のブロック；
ｄ． 適宜、第１および／または第２のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第３のブロック；
ｅ． 適宜、第１、第２および／または第３のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第４のブロック；
ｆ． 適宜、第１、第２、第３および／または第４のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第５のブロック；ならびに
ｇ． 第１、第２、第３または第４の連鎖移動薬剤から得られる第２のキャップ形成単位を含む第２の終端
を含むＲＡＦＴブロックコポリマーである。
ａ． ＲＡＦＴ共重合プロセスにおける第１の連鎖移動薬剤から得られる第１のキャップ形成単位を含む第１の終端；
ｂ． 第１の反応性機能的単位に共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第１のブロック；
ｃ． 適宜、第１のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第２のブロック；
ｄ． 適宜、第１および／または第２のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第３のブロック；
ｅ． 適宜、第１、第２および／または第３のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第４のブロック；
ｆ． 適宜、第１、第２、第３および／または第４のブロックに共有結合しており、分子量（Ｍｎ）約１ｋＤａ～約５００ｋＤａの範囲および重合度約１０～約２５００の範囲を有する１つまたは複数のモノマー単位から調製される第５のブロック；ならびに
ｇ． 第１、第２、第３または第４の連鎖移動薬剤から得られる第２のキャップ形成単位を含む第２の終端
を含むＲＡＦＴブロックコポリマーである。
【0112】
本明細書に記述されるポリマーナノ粒子に対する例示的なペイロードは：核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ｐＤＮＡ、オリゴデオキシリボ核酸（ＯＤＮ）、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（例えば、小ガイドＲＮＡ）、リボ核タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに使用されるドナーＤＮＡ鎖、および例えば、Ｃａｓ９といったＣＲＩＳＰＲ関連酵素などの酵素、ＺＦＮ、専用設計のホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳシステムなど他の遺伝子編集システムに使用される酵素、他の遺伝子編集エンドヌクレアーゼ、ならびに逆転写酵素を含む群から選択される組成物のうちいずれか１つまたは組合せを含むことができる。
【0113】
別の態様において、本開示は機械学習モデルを使用して最高の候補を速やかに同定する。例示的な実施形態において、グラフニューラルネットワーク（ＧＮＮ）が、このプロセスに使用される。ポリマーは、３つの規模：モノマー、ブロックおよび完全ポリマーで特徴付けられ得る。モノマーは、結合してブロックを形成し、ブロックは、結合して完全なポリマーを形成する。ポリマー特性は、３つの規模すべてでポリマーの特徴によって決まる。モノマー、ブロックおよびポリマー間の関係は、有向グラフで捕捉され得る。次いで、情報をグラフ中のノード間で共有して、３つすべての規模：モノマー、ブロックおよびポリマーで完全ポリマーの数値表記を作ることができる。これらの数値表記を次いでニューラルネットワークで使用して、ポリマーの特性を予測することができる。例示的な実施形態におけるポリマー特性の予測に対するＧＮＮの使用は、２つの主要な利益を提供する：第１に、グラフは、正確な予測に重要な３つの規模すべてで、ポリマーの特徴をモデル化することができ；第２に、グラフは、いくつかのポリマー構造に対応することができる柔軟なモデリング構造を提供する。
【0114】
機械学習モデルは、公開データと予備試験データの組合せに対して先ず訓練され、上に記載の大規模データセットで補充される。例示的な実施形態は、ＰＮＰの高スループットな特徴付けおよびスクリーニングを加速するための３ループ深層学習サイクルを含む。３つの深層学習ループは、ＰＮＰの物理的特性、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）生物活性およびインビボ生物活性をそれぞれ特徴付ける。各ループは、ＧＮＮ深層学習モデル（図３ａを参照のこと）を利用して、候補ＰＮＰを特徴付ける。ＧＮＮは、モノマーを入力（グラフのノード）と定義する簡易的な分子入力ライン記入システム（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｉｎｐｕｔ ｌｉｎｅ－ｅｎｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＭＩＬＥＳ）の文字列を取り込み、グラフのエッジが、モノマー間の関係、およびそれらがどのように組み合わされてＰＮＰを形成するかを定義する。グラフのエッジにより、ポリマーに関する追加の情報（例えば、モノマーの比および重合度）をＧＮＮに組み込むことが可能になる。
【0115】
現在開示されている構成は、少なくとも３つの固有の優位性を提示する。第１に、深層学習モデルは、ポリマーのフィンガープリントに依存しない。むしろ、深層学習モデルは、ＳＭＩＬＥＳ文字列から適切な数値埋め込みを学習することになる。第２に、グラフは、ＰＮＰの様々なファミリーを容易に表すための柔軟性をモデルに与える。第３に、入力としてＳＭＩＬＥＳ文字列を使用することにより、列挙されたＳＭＩＬＥＳ文字列を用いて限られた訓練データセットが強化され、利用可能な訓練データの量が増大し、モデル成績を改善することが可能になる。このＧＮＮ構成の試験は、非ウイルス性遺伝子デリバリー媒体の決定的な特徴であるゼータ電位（図３ｂを参照のこと）を予測するのに優れた能力を示した。一旦訓練されたら、これらの深層学習モデルは、高スループットシステムにおいて生物活性の要件を満たす候補ＰＮＰの合成および特徴付けの優先順位付けに使用されることになる。反復データを使用して、能動的学習サイクルにおいてモデルを微調整し、それにより今後の成績を改善することができる。
【0116】
一部の実施形態において、データ強化を実行して、機械学習モデルを訓練するために使用されるデータのサイズおよび多様性を人工的に増大させてもよい（結果的にモデル成績を増大させる）。深層学習モデルは、訓練のために比較的大きなデータセットを必要とし、小さなデータセットには過剰適合する場合がある。前述の通り、ＧＮＮは、モノマーを入力と定義するＳＭＩＬＥＳ文字列を取り込む。モノマー（ポリマーの構成ブロック）は、単一の標準的なＳＭＩＬＥＳ文字列を有するが、複数の選択的なＳＭＩＬＥＳ文字列表現も有する。ＳＭＩＬＥＳ列挙を実行して標準的なＳＭＩＬＥＳ文字列からこれらの選択的形態を生成することができ、したがって、訓練データセットのサイズを何倍にも増大させる。次いで、ニューラルネットワークモデルは、データサイズおよび表現の多様性の増大を活用して成績を改善することができる。
【0117】
他の実施形態において、修飾トランスフォーマーモデル（ＧＮＮではなく）を使用してポリマー特性を予測してもよい（したがって、他の適用において、塩基編集タンパク質をデリバリーするための非ウイルス性担体の最高の候補を速やかに同定する）。修飾トランスフォーマーモデルは、入力の相対的位置情報を活用してモノマー文字列入力のための数値埋め込みを作成する。これらの数値埋め込みは、ポリマー特性の予測のための深層学習および統計モデルに次いで使用され得る。さらに、トランスフォーマーモデルは、逐次データを処理することができる他の多くの深層学習構成と比較してより計算機的に効率的である。元のトランスフォーマー構成は、符号化および復号化構成からなる。符号器は、データの入力配列を取り込み、高次元の埋め込みを出力し、一方復号器は、入力として高次元の埋め込みを取り込み、符号器に入力した元のまたは類似の配列を予測しようと試みる。本開示は、逐次出力を予測する必要がないので、トランスフォーマーの符号化部分のみ使用して、物理的およびインビトロ／インビボの両方でポリマー特性を予測する。
【0118】
さらに別の態様において、本開示の例示的な実施形態により、ＡＬＳのマウスモデルにおけるＳＯＤ１標的化ＣＢＥのＰＮＰ媒介性デリバリーにとって最高の候補を選択することが可能になる。ＥＧＦＰまたはＳＯＤ１を安定して発現するミクログリア細胞株における機能的遺伝子編集試験が、これらの最高の候補を使用して次いで実行され得る。さらに、ＰＮＰ媒介性ＣＢＥデリバリーの有効および安全性は、ＡＬＳのＧ９３Ａ－ＳＯＤ１マウスモデルにおいて評価され得る。マウスにおいてＡＬＳの進行を遅らせるＣＢＥ塩基編集の従前の成功は、ＣＢＥ塩基編集が、新規のＡＬＳ遺伝子編集療法の臨床転換にもつながる可能性を示す。
【0119】
図面および前述の説明において特定の例示的な実施形態について詳細に記述してきたが、そのような実例および説明は、典型的な性質のものであり、限定的なものではないと見なされ、例示的な実施形態だけが示され、記述されており、本開示の精神の範囲内になるすべての変更および修飾が、保護されることが望まれることが理解される。本明細書に記述される装置、システムおよび方法の様々な特徴から生じる本開示の複数の優位性が存在する。本開示の装置、システムおよび方法の別の実施形態が、記述される特徴のすべてを含むことはできないが、そのような特徴の優位性の少なくとも一部の利益を含み得ることは注目されよう。当分野の技術者は、本開示の特徴の１つまたは複数を組み込んだ装置、システムおよび方法の独自の遂行を容易に考案し得る。
【実施例】
【0120】
［実施例１］
【0121】
バーコード設計
この例に使用される核酸コンストラクトは、ポリヌクレオチドの中央に８～１０ヌクレオチドを含む固有の部分を含み、固有の部分は、プールされる他の任意のバーコードから少なくとも３塩基のハミング距離の要件によってさらに限定された。バーコードの３’末端に直接、ランダムな７～１０塩基が、ＰＣＲ重複物のバイオインフォマティクス的除去のために含まれる。この中心配列は、配列決定ライブラリーを調製する間にインデックスアダプターを付加するための突出部を含有する汎用プライマーアニーリング部位に挟まれている。図４は、これらのバーコードの代表的な実例を示す。これらの核酸コンストラクトは、５’末端におけるビオチン官能基またはアミン官能基を考慮して設計された。
［実施例２］
この例に使用される核酸コンストラクトは、ポリヌクレオチドの中央に８～１０ヌクレオチドを含む固有の部分を含み、固有の部分は、プールされる他の任意のバーコードから少なくとも３塩基のハミング距離の要件によってさらに限定された。バーコードの３’末端に直接、ランダムな７～１０塩基が、ＰＣＲ重複物のバイオインフォマティクス的除去のために含まれる。この中心配列は、配列決定ライブラリーを調製する間にインデックスアダプターを付加するための突出部を含有する汎用プライマーアニーリング部位に挟まれている。図４は、これらのバーコードの代表的な実例を示す。これらの核酸コンストラクトは、５’末端におけるビオチン官能基またはアミン官能基を考慮して設計された。
［実施例２］
【0122】
ポリマーナノ粒子合成
ジブロックコポリマーを、表２に挙げた試薬および量を用いて可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合を使用してＰＣＴ３４９５２９（２１４７７７７９．１）に記載の通り合成した。ブロック１試薬を丸底フラスコ中で組み合わせ、アルゴンでパージし、加熱マントルを使用して６０℃に６時間加熱した。反応産物を、４回のペンタン：エーテル８０：２０沈殿洗浄および遠心分離のサイクルを使用して精製し、真空内で乾燥させた。ブロック１産物を、ブロック２に対するｍａｃｒｏＲＡＦＴ剤として使用し、算出した試薬容量（ブロック１の理論的分子量情報に基づいて算出した）を、ブロック２反応のために丸底中で組み合わせた。反応混合物を、６０℃で２４時間加熱する前にアルゴンパージした。反応産物を、同じ精製プロセスを使用して精製し、真空内で乾燥させた。得られたポリマーを、毎日複数回水を交換しながら脱イオン水中で４日間透析した。最終的に、透析した材料を４日間凍結乾燥し、実験に使用するために室温で貯蔵した。
ジブロックコポリマーを、表２に挙げた試薬および量を用いて可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合を使用してＰＣＴ３４９５２９（２１４７７７７９．１）に記載の通り合成した。ブロック１試薬を丸底フラスコ中で組み合わせ、アルゴンでパージし、加熱マントルを使用して６０℃に６時間加熱した。反応産物を、４回のペンタン：エーテル８０：２０沈殿洗浄および遠心分離のサイクルを使用して精製し、真空内で乾燥させた。ブロック１産物を、ブロック２に対するｍａｃｒｏＲＡＦＴ剤として使用し、算出した試薬容量（ブロック１の理論的分子量情報に基づいて算出した）を、ブロック２反応のために丸底中で組み合わせた。反応混合物を、６０℃で２４時間加熱する前にアルゴンパージした。反応産物を、同じ精製プロセスを使用して精製し、真空内で乾燥させた。得られたポリマーを、毎日複数回水を交換しながら脱イオン水中で４日間透析した。最終的に、透析した材料を４日間凍結乾燥し、実験に使用するために室温で貯蔵した。
【0123】
表2.バーコード化PNPを合成するために使用した試薬および量
［実施例３］
【表2-1】
【表2-2】
［実施例３］
【0124】
組成物例１（ＣＥ１）：ポリマーナノ粒子に対する核酸コンストラクト（ＤＮＡバーコードを含有する）の静電結合
ＲＡＦＴコポリマーを、上の方法および表２に挙げた試薬にしたがって合成した。ポリマーを、濃度およそ５ｍｇ／ｍＬでリン酸緩衝食塩水中に分散させた。静電的ローディングのために（図５ａ）、核酸コンストラクト（ポリヌクレオチドバーコードを含む図４に示した設計による）を、濃度およそ１００μＭ（およそ１．９ｍｇ／ｍＬ）でトリスＥＤＴＡ緩衝液に溶解させた。これらの保存溶液をＰＢＳと一緒に混合して、最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬポリマーおよび０．００３８９ｍｇ／ｍＬ核酸コンストラクトの溶液を作製した。それらを、室温で少なくとも３０分間インキュベートして、正荷電を持つポリマーを負荷電を持つ核酸コンストラクトと結合させた。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離してあらゆる結合していない核酸コンストラクトを除去した。濾液（結合していない核酸コンストラクトを含有する）を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬポリマーおよび０．００３８９ｍｇ／ｍＬ核酸コンストラクトにした。静電的に結合される核酸コンストラクトは、核酸コンストラクト上の汎用プライマー結合セグメントに結合するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された。アンプリコンを、アガロースゲルによるゲル電気泳動によって検出した。レーン中の二重のバンドの存在（図６）は、アンプリコンの存在を示し、核酸コンストラクトがＰＮＰに結合していることを示す。
［実施例４］
ＲＡＦＴコポリマーを、上の方法および表２に挙げた試薬にしたがって合成した。ポリマーを、濃度およそ５ｍｇ／ｍＬでリン酸緩衝食塩水中に分散させた。静電的ローディングのために（図５ａ）、核酸コンストラクト（ポリヌクレオチドバーコードを含む図４に示した設計による）を、濃度およそ１００μＭ（およそ１．９ｍｇ／ｍＬ）でトリスＥＤＴＡ緩衝液に溶解させた。これらの保存溶液をＰＢＳと一緒に混合して、最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬポリマーおよび０．００３８９ｍｇ／ｍＬ核酸コンストラクトの溶液を作製した。それらを、室温で少なくとも３０分間インキュベートして、正荷電を持つポリマーを負荷電を持つ核酸コンストラクトと結合させた。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離してあらゆる結合していない核酸コンストラクトを除去した。濾液（結合していない核酸コンストラクトを含有する）を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬポリマーおよび０．００３８９ｍｇ／ｍＬ核酸コンストラクトにした。静電的に結合される核酸コンストラクトは、核酸コンストラクト上の汎用プライマー結合セグメントに結合するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された。アンプリコンを、アガロースゲルによるゲル電気泳動によって検出した。レーン中の二重のバンドの存在（図６）は、アンプリコンの存在を示し、核酸コンストラクトがＰＮＰに結合していることを示す。
［実施例４］
【0125】
組成物例２（ＣＥ２）：アビジン－ビオチン連結を介するＰＮＰへの核酸コンストラクトコンジュゲーション
少なくとも１つのカルボキシ終端基を含有するＣＴＡを使用して作製されるＲＡＦＴコポリマーは、アビジンでさらに官能化された（図５ｂ）。ＲＡＦＴコポリマーを、およそ１２ｍｇ／ｍＬでＭＥＳ緩衝液中に移した。試料を、３０分間超音波処理した。ＥＤＣ試薬およびスルホＮＨＳ試薬を、ＰＮＰに対して試薬それぞれモル比１０：１および２５：１でポリマーに添加した。試料を、室温で少なくとも１０分間インキュベートして、反応を起こさせた。反応容量を、分画分子量３０ｋＤａの膜によっておよそ３０００×ｇでおよそ１５分間の遠心分離によって濾過した。濾液を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して１０ｍｇ／ｍＬポリマーに再構成した。アビジン（３６．９ｍｇ）を反応に添加し、室温で１５分間インキュベートした。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ）（最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離した。濾液を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度８ｍｇ／ｍＬポリマーにした。５’末端に結合したビオチンを含む核酸コンストラクトを、１モル核酸コンストラクトに対して１０モルポリマーのモル比でアビジン官能化ポリマーに添加した。試料を少なくとも１５分間インキュベートした。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離してあらゆる結合していない核酸コンストラクトを除去した。濾液（結合していない核酸コンストラクトを含有する）を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度８ｍｇ／ｍＬポリマーにした。コンジュゲートされる核酸コンストラクトは、核酸コンストラクト上の汎用プライマー結合セグメントに結合するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された。アンプリコンを、アガロースゲルによるゲル電気泳動によって検出した。レーン中の二重のバンドの存在（図６および図７）は、アンプリコンの存在を示し、核酸コンストラクトがＰＮＰに結合していることを示す。
少なくとも１つのカルボキシ終端基を含有するＣＴＡを使用して作製されるＲＡＦＴコポリマーは、アビジンでさらに官能化された（図５ｂ）。ＲＡＦＴコポリマーを、およそ１２ｍｇ／ｍＬでＭＥＳ緩衝液中に移した。試料を、３０分間超音波処理した。ＥＤＣ試薬およびスルホＮＨＳ試薬を、ＰＮＰに対して試薬それぞれモル比１０：１および２５：１でポリマーに添加した。試料を、室温で少なくとも１０分間インキュベートして、反応を起こさせた。反応容量を、分画分子量３０ｋＤａの膜によっておよそ３０００×ｇでおよそ１５分間の遠心分離によって濾過した。濾液を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して１０ｍｇ／ｍＬポリマーに再構成した。アビジン（３６．９ｍｇ）を反応に添加し、室温で１５分間インキュベートした。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ）（最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離した。濾液を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度８ｍｇ／ｍＬポリマーにした。５’末端に結合したビオチンを含む核酸コンストラクトを、１モル核酸コンストラクトに対して１０モルポリマーのモル比でアビジン官能化ポリマーに添加した。試料を少なくとも１５分間インキュベートした。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離してあらゆる結合していない核酸コンストラクトを除去した。濾液（結合していない核酸コンストラクトを含有する）を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度８ｍｇ／ｍＬポリマーにした。コンジュゲートされる核酸コンストラクトは、核酸コンストラクト上の汎用プライマー結合セグメントに結合するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された。アンプリコンを、アガロースゲルによるゲル電気泳動によって検出した。レーン中の二重のバンドの存在（図６および図７）は、アンプリコンの存在を示し、核酸コンストラクトがＰＮＰに結合していることを示す。
【0126】
核酸コンストラクトで標識されたＰＮＰの具体化に使用され得るＰＮＰ対バーコード比の範囲を試験するために、上の方法を使用して、ＰＮＰ対核酸コンストラクト比を最低２０：１程度～最高１００００：１程度（モルポリマー対モル核酸コンストラクト）に変動させてアビジン－ビオチン連結（図５ａ）を使用してＰＮＰに核酸コンストラクトを付加した。図１３は、これらの様々なＰＮＰ対核酸コンストラクト比を持つ核酸コンストラクトに対するＰＣＲ反応から生じる核酸コンストラクトのアンプリコンに対応するバンドを含むゲル電気泳動グラフを示し、この比が核酸コンストラクトＰＮＰ組成物の具体化に使用できる範囲であることを示す。
【0127】
アビジン－ビオチンコンジュゲーション方法を使用して、表２に記述されるポリマーのアリコート９６個に９６種の固有のバーコードを結合させ、各アリコート中のナノ粒子の集団に固有のバーコードが結合している同じポリマーからなる９６種のアリコートを生成した。これらの９６種のアリコートを、単一バイアル中に容量的に同等な量のアリコートを組み合わせることによってプールし、すべての集団が、表２に記述されるポリマーから形成されたポリマーミセルおよび９６種の固有のバーコードの集団からの固有のバーコードを含む、バーコード化ＰＮＰの９６種の固有の集団の分散液を生成した。
【0128】
アビジン－ビオチンコンジュゲートした核酸コンストラクト－ＰＮＰのプールした試料を、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にスパイクした。細胞を、培地１００μＬ中に、ウェル当たり２００００個細胞で９６ウェルプレートに播種し、終夜接着させておいた。播種２４時間後、９６種の固有のバーコードを持つＰＮＰのプールされた試料を、用量およそ０．０２４ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰで各ウェルに添加し、３７℃で終夜インキュベーター内に置いた。翌日、バーコードを、製造業者のプロトコールにしたがってＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ抽出キットおよびＱｉａｃｕｂｅ ＨＴ機器を使用して試料から抽出した。コンジュゲートされたバーコードは、バーコード上の汎用プライマー結合配列に結合するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された。アンプリコンを、アガロースゲルによるゲル電気泳動によって検出した。レーン中の二重のバンドの存在（図８）は、アンプリコンの存在を示し、核酸コンストラクトがＰＮＰに結合していることを示す。
【0129】
アビジン－ビオチン連結を介してコンジュゲートされた９６種の固有のバーコードを含むＰＮＰのプールされた試料を、マウスに投与した（後述するインビボスクリーニングプロトコールを使用した）。投薬２４時間後に、マウスを屠殺し、組織をバーコード化ＰＮＰの存在について分析した。ＰＣＲを使用して組織試料のバーコードを増幅し、アジレント断片分析を使用して核酸コンストラクト－ＰＮＰの存在を検出し、陽性対照に合致する暗いバンドを核酸コンストラクト－ＰＮＰの存在の指標とした（図１２ａ）。この実験は、固有の核酸コンストラクトでＰＮＰを標識し、マウスに投与し、次いでＰＣＲによってその体内分布を検出する能力を具体化した。肝臓組織において９６種の固有のバーコードすべてを識別する深層配列決定技術をさらに使用した。ライブラリー調製、配列決定および配列分析を、下記の通り実行した。９６種の固有のバーコードすべてを、可算で、他と識別可能な方法で検出した（図１２ｃおよび図１２ｄ）。これは、本組成物により、投薬２４時間後のマウス組織において、一意的にバーコード化したＰＮＰの検出が可能になるだけでなく、動物組織中の他のすべての一意的にバーコード化したＰＮＰと各一意的にバーコード化したＰＮＰとの定量的識別が可能になることも示す。
［実施例５］
［実施例５］
【0130】
ポリマーナノ粒子ライブラリー用のＲＡＦＴコポリマーの調製
簡潔には、ブロック１試薬（モノマー、連鎖移動薬剤、開始剤および溶媒）を、ポリプロピレン９６ウェルＵ底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）、ポリプロピレン９６ウェルクラスタ管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリプロピレンＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはポリプロピレン５０ｍＬもしくは１５ｍＬ円錐管（ＶＷＲ）のウェル中で組み合わせ、ＶＷＲ １４００Ｅ Ｓｈｅｌｄｏｎ真空オーブン内に置いた。２０ｍＬガラスバイアルを溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）およそ１０～１５ｍＬで満たし、バイアルをオーブン内に置いて、雰囲気飽和の供給源とした。オーブンを、およそ３Ｌ／分でおよそ４５分間アルゴンでパージし、６０℃～７５℃に６～２４時間加熱した。反応完了時に、ウェルまたは管にアセトンを添加してポリマーの固化を防止し、ウェルまたは管を密閉し、室温で終夜放置した。翌日、反応産物溶液を、１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管へ移し（必要に応じて）、少なくとも３回の、適切な精製溶媒溶液（例えば、８０：２０ペンタン：エーテル、イソプロピルアルコール、メタノール等）を使用する沈殿洗浄および遠心分離サイクルによって精製し、真空内で乾燥させた。ブロック１産物を、ブロック２に対するｍａｃｒｏＲＡＦＴ剤として使用し、算出した試薬容量（ブロック１の理論的または実際の分子量情報に基づいて算出した）を、ブロック２反応のためにポリプロピレン９６ウェルＵ底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）、ポリプロピレン９６ウェルクラスタ管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリプロピレンＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはポリプロピレン５０ｍＬもしくは１５ｍＬ円錐管（ＶＷＲ）中で組み合わせた。反応混合物を、６０℃～７５℃に６～２４時間加熱する前に、およそ３Ｌ／分でおよそ４５分間アルゴンパージしたＶＷＲ １４００Ｅ Ｓｈｅｌｄｏｎ真空オーブン内に置いた。反応産物を、ブロック１ライブラリー材料に使用したのと同じ精製プロセスを使用して精製し、真空内で乾燥させた。得られたポリマーを、アセトンもしくはクロロホルムのいずれかに再懸濁し、実験的使用の必要に応じて分注し（これらの移動溶媒は、材料使用の前に蒸発される）、乾燥状態で室温に貯蔵する、または脱イオン水に溶解し、冷凍し、実験的使用の前に凍結乾燥した。サイズを、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩを使用して測定した。ブロック１材料の分子量を、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩを使用して測定した。ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩのモル質量性能の閾値を上回るナノ粒子サイズは、これらのポリマーライブラリーのブロック２分子量の測定を防げた。高スループットポリマーライブラリーのすべての分子量を、重み平均分子量（Ｍｗ）として報告する。
簡潔には、ブロック１試薬（モノマー、連鎖移動薬剤、開始剤および溶媒）を、ポリプロピレン９６ウェルＵ底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）、ポリプロピレン９６ウェルクラスタ管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリプロピレンＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはポリプロピレン５０ｍＬもしくは１５ｍＬ円錐管（ＶＷＲ）のウェル中で組み合わせ、ＶＷＲ １４００Ｅ Ｓｈｅｌｄｏｎ真空オーブン内に置いた。２０ｍＬガラスバイアルを溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）およそ１０～１５ｍＬで満たし、バイアルをオーブン内に置いて、雰囲気飽和の供給源とした。オーブンを、およそ３Ｌ／分でおよそ４５分間アルゴンでパージし、６０℃～７５℃に６～２４時間加熱した。反応完了時に、ウェルまたは管にアセトンを添加してポリマーの固化を防止し、ウェルまたは管を密閉し、室温で終夜放置した。翌日、反応産物溶液を、１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管へ移し（必要に応じて）、少なくとも３回の、適切な精製溶媒溶液（例えば、８０：２０ペンタン：エーテル、イソプロピルアルコール、メタノール等）を使用する沈殿洗浄および遠心分離サイクルによって精製し、真空内で乾燥させた。ブロック１産物を、ブロック２に対するｍａｃｒｏＲＡＦＴ剤として使用し、算出した試薬容量（ブロック１の理論的または実際の分子量情報に基づいて算出した）を、ブロック２反応のためにポリプロピレン９６ウェルＵ底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）、ポリプロピレン９６ウェルクラスタ管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリプロピレンＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはポリプロピレン５０ｍＬもしくは１５ｍＬ円錐管（ＶＷＲ）中で組み合わせた。反応混合物を、６０℃～７５℃に６～２４時間加熱する前に、およそ３Ｌ／分でおよそ４５分間アルゴンパージしたＶＷＲ １４００Ｅ Ｓｈｅｌｄｏｎ真空オーブン内に置いた。反応産物を、ブロック１ライブラリー材料に使用したのと同じ精製プロセスを使用して精製し、真空内で乾燥させた。得られたポリマーを、アセトンもしくはクロロホルムのいずれかに再懸濁し、実験的使用の必要に応じて分注し（これらの移動溶媒は、材料使用の前に蒸発される）、乾燥状態で室温に貯蔵する、または脱イオン水に溶解し、冷凍し、実験的使用の前に凍結乾燥した。サイズを、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩを使用して測定した。ブロック１材料の分子量を、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩを使用して測定した。ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩのモル質量性能の閾値を上回るナノ粒子サイズは、これらのポリマーライブラリーのブロック２分子量の測定を防げた。高スループットポリマーライブラリーのすべての分子量を、重み平均分子量（Ｍｗ）として報告する。
【0131】
９６種のＰＮＰの試験的ＰＮＰライブラリーのブロック１ならびにブロック２の合成に使用した試薬、量および反応条件の概要を、それぞれ下の表３および４に示す。ＰＮＰ ２２、６１および８９～９６を、ＨＥＫ細胞研究のための１０種の固有のＰＮＰとして使用した。ＰＮＰ １～８８を、フローサイトメトリー研究のための固有のＰＮＰとして使用した。表３略語：ＡＣＶＡ、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）；ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）；ＢＭＡ（ブチルメタクリラート）；ＣＴＰ、４－シアノ－４－（チオベンゾイルチオ）ペンタン酸；ＤＭＡＥＭＡ、ジメチルアミノエチルメタクリラート；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＥＣＴ、４－シアノ－４－［（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸；ＭＭＡ、メチルメタクリラート。表４略語：ＡＣＶＡ、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）；ＡＩＢＮ、アゾビスイソブチロニトリル；ＢＭＡ、ブチルメタクリラート；ＣＴＰ、４－シアノ－４－（チオベンゾイルチオ）ペンタン酸；ＤＭＡＥＭＡ、ジメチルアミノエチルメタクリラート；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＥＣＴ、４－シアノ－４－［（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸；ＨＥＭＡ、２‐ヒドロキシエチルメタクリラート；ＭＭＡ、メチルメタクリラート。表５略語：ＰＤＩ、多分散指数。
【0132】
ブロック１のモル質量およびＰＮＰサイズ（例えば、直径）を決定する静的光散乱（ＳＬＳ）ならびに動的光散乱（ＤＬＳ）測定を、Ｗｙａｔｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩを使用して決定した。データの収集および処理を、ＤＹＮＡＭＩＣＳソフトウェアで行った。ＳＬＳおよびＤＬＳデータを、以下の条件で入手した：
溶媒：水
温度：２５℃
試料容量：２００μＬ
データ収集設定：１収集当たり５秒間を５回の収集
溶媒：水
温度：２５℃
試料容量：２００μＬ
データ収集設定：１収集当たり５秒間を５回の収集
【0133】
表3.パイロットPNPライブラリーに使用したブロック1試薬および反応条件の概要
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【0134】
表4.パイロットPNPライブラリーに使用したブロック2試薬および反応条件の概要
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【表4-6】
【表4-7】
【表4-8】
【表4-9】
【表4-10】
【表4-11】
【0135】
表5.パイロットPNPライブラリー特徴付けデータの概要
［実施例６］
【表5-1】
【表5-2】
［実施例６］
【0136】
組成物例３（ＣＥ３）：アミン終端核酸コンストラクトによるＰＮＰの直接アミド化のための核酸コンストラクトコンジュゲーション
少なくとも１つのカルボキシ終端基を含有するＣＴＡを使用して作製されるＲＡＦＴコポリマーは、アミン終端ＤＮＡバーコードでさらに官能化された。ＲＡＦＴコポリマーを、およそ１２ｍｇ／ｍＬでＭＥＳ緩衝液中に移した。試料を、３０分間超音波処理した。ＥＤＣ試薬およびスルホＮＨＳ試薬を、ＰＮＰに対して試薬それぞれモル比１０：１および２５：１でポリマーに添加した。試料を、室温で少なくとも１０分間インキュベートして、反応を起こさせた。反応容量を、分画分子量３０ｋＤａの膜によっておよそ３０００×ｇでおよそ１５分間の遠心分離によって濾過した。濾液を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して１０ｍｇ／ｍＬポリマーに再構成した。５’末端に結合した１級アミン基を含む核酸コンストラクトを、ポリマーに添加し、試料を少なくとも１５分間インキュベートした。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離してあらゆる結合していない核酸コンストラクトを除去した。濾液（結合していない核酸コンストラクトを含有する）を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度８ｍｇ／ｍＬポリマーにした。コンジュゲートされたバーコードは、核酸コンストラクト上のプライマー結合セグメントに結合するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された。アンプリコンを、アガロースゲルによるゲル電気泳動によって検出した。レーン中の二重のバンドの存在（図９）は、アンプリコンの存在を示し、核酸コンストラクトがＰＮＰに結合していることを示す。
少なくとも１つのカルボキシ終端基を含有するＣＴＡを使用して作製されるＲＡＦＴコポリマーは、アミン終端ＤＮＡバーコードでさらに官能化された。ＲＡＦＴコポリマーを、およそ１２ｍｇ／ｍＬでＭＥＳ緩衝液中に移した。試料を、３０分間超音波処理した。ＥＤＣ試薬およびスルホＮＨＳ試薬を、ＰＮＰに対して試薬それぞれモル比１０：１および２５：１でポリマーに添加した。試料を、室温で少なくとも１０分間インキュベートして、反応を起こさせた。反応容量を、分画分子量３０ｋＤａの膜によっておよそ３０００×ｇでおよそ１５分間の遠心分離によって濾過した。濾液を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して１０ｍｇ／ｍＬポリマーに再構成した。５’末端に結合した１級アミン基を含む核酸コンストラクトを、ポリマーに添加し、試料を少なくとも１５分間インキュベートした。試料を、ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－４遠心分離管（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、最大３．５ｍＬ／管）に移し、４０００×ｇで１５分間遠心分離してあらゆる結合していない核酸コンストラクトを除去した。濾液（結合していない核酸コンストラクトを含有する）を廃棄し、残留物に無菌ＰＢＳを添加して最終濃度８ｍｇ／ｍＬポリマーにした。コンジュゲートされたバーコードは、核酸コンストラクト上のプライマー結合セグメントに結合するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された。アンプリコンを、アガロースゲルによるゲル電気泳動によって検出した。レーン中の二重のバンドの存在（図９）は、アンプリコンの存在を示し、核酸コンストラクトがＰＮＰに結合していることを示す。
【0137】
直接アミド化方法を使用して、１０種の固有のバーコードを１０個の固有のＰＮＰに結合させた。１０個の固有のＰＮＰを、実施例５に示される試薬により調製した。
【0138】
その後、直接アミド化方法を使用して、固有のＤＮＡバーコード１０種を各ＰＮＰに結合させ、各固有の標識を得た。核酸コンストラクト－ＰＮＰにｔｄＴｏｍａｔｏ赤色蛍光タンパク質の発現をコードしているｐＤＮＡを搭載し、次いでＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００００個細胞で播種した２４時間後におよそ０．０２４ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰで処置するために使用した。それらの細胞を、さらに４８時間インキュベートしておき、その時に、ペイロードの発現をＴｅｘａｓ Ｒｅｄフィルタセットを使用して蛍光顕微鏡によって観察した（図１０）。赤色蛍光画像によって示されるように、これは、核酸コンストラクト－ＰＮＰが、哺乳動物細胞に取り込まれ、ペイロードをデリバリーする能力があるという証拠を提供する。
【0139】
直接アミド化方法を次いで使用して、８８種の固有のバーコードを８８個の固有のＰＮＰに結合させた。８８個の固有のＰＮＰを、実施例５に示される試薬により調製した。アミド化方法を次いで使用して、固有のＤＡＮバーコード８８種を各ＰＮＰに結合させ、各固有の標識を得た。核酸コンストラクト－ＰＮＰにｔｄＴｏｍａｔｏ赤色蛍光タンパク質の発現をコードしているｐＤＮＡを搭載し、次いでＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００００個細胞で播種した２４時間後におよそ０．０２４ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰで処置するために使用した。それらの細胞を、さらに４８時間インキュベートしておき、その時に、ペイロードの発現を、Ｃｙｔｏｆｌｅｘを使用してフローサイトメトリーによって測定した［図１１（ａ）～図１１（ｃ）］。これにより、核酸コンストラクト－ＰＮＰのいくつかが、哺乳動物細胞によって取り込まれ得るという証拠を得た。細胞にゾンビ色素を使用するリブ／デッド染色も行い、細胞生存率をフローサイトメトリーによって測定し［図１１（ｄ）～（ｅ）］、ＰＮＰの細胞毒性が比較的低く、大多数のＰＮＰについて細胞生存率数が７５％より大きいことを示した。
［実施例７］
［実施例７］
【0140】
インビトロおよびインビボで核酸コンストラクト－ＰＮＰをスクリーニングする方法
アビジン－ビオチン連結を介して結合させた９６種の固有のバーコードを持つ、表２の製法により作製したポリマーナノ粒子のプールされた試料を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインビトロでの細胞取り込みおよび細胞毒性を測定し、マウスにおいてインビボ投与の体内分布を測定した。核酸コンストラクト－ＰＮＰを、無菌の食塩液中に処方し、インビボ投薬前に最長１ヵ月間４℃で貯蔵した。細胞取り込み効率および細胞毒性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用してｐＤＮＡ処置濃度２５０ｎｇまたは１５０ｎｇ／ウェルで０．０２４ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰを用いてインビトロで評価した。細胞取り込みを、蛍光顕微鏡によって実証した。動物を、性別によって類似の群平均体重を維持するように設計された層別無作為化プログラムを使用して用量群に割り当てた。動物は、単回のボーラス尾静脈静脈内注射投与によって、対照または試験物質を投与される。試験用量は０～１５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、有害な臨床的事象が１５０ｍｇ／ｋｇで３５％の動物に観察された。血液および組織を、すべての動物から採取し、液体窒素中で瞬間凍結させる。
［実施例８］
アビジン－ビオチン連結を介して結合させた９６種の固有のバーコードを持つ、表２の製法により作製したポリマーナノ粒子のプールされた試料を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインビトロでの細胞取り込みおよび細胞毒性を測定し、マウスにおいてインビボ投与の体内分布を測定した。核酸コンストラクト－ＰＮＰを、無菌の食塩液中に処方し、インビボ投薬前に最長１ヵ月間４℃で貯蔵した。細胞取り込み効率および細胞毒性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用してｐＤＮＡ処置濃度２５０ｎｇまたは１５０ｎｇ／ウェルで０．０２４ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰを用いてインビトロで評価した。細胞取り込みを、蛍光顕微鏡によって実証した。動物を、性別によって類似の群平均体重を維持するように設計された層別無作為化プログラムを使用して用量群に割り当てた。動物は、単回のボーラス尾静脈静脈内注射投与によって、対照または試験物質を投与される。試験用量は０～１５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、有害な臨床的事象が１５０ｍｇ／ｋｇで３５％の動物に観察された。血液および組織を、すべての動物から採取し、液体窒素中で瞬間凍結させる。
［実施例８］
【0141】
インビトロ生体試料からの核酸コンストラクト－ＰＮＰの抽出。
組織１０～２０ｍｇをトリス－ＥＤＴＡ溶解緩衝液に入れ、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒビーズ破砕システムおよび５ｍｍステンレス鋼ビーズを使用して均質化する。溶液が外見上均質になるまで均質化を、２５Ｈｚで、５～７分間隔で実施する。次いでプロテイナーゼＫを、溶解物に添加してタンパク質を消化し、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ内で、５５℃で２～４時間インキュベートする。ＤＮＡは、製造業者のプロトコールにしたがってＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ抽出キットおよびＱｉａｃｕｂｅ ＨＴ機器を使用して組織溶解物から抽出される。単離された試料の濃度および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して決定される。
［実施例９］
組織１０～２０ｍｇをトリス－ＥＤＴＡ溶解緩衝液に入れ、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒビーズ破砕システムおよび５ｍｍステンレス鋼ビーズを使用して均質化する。溶液が外見上均質になるまで均質化を、２５Ｈｚで、５～７分間隔で実施する。次いでプロテイナーゼＫを、溶解物に添加してタンパク質を消化し、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ内で、５５℃で２～４時間インキュベートする。ＤＮＡは、製造業者のプロトコールにしたがってＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ抽出キットおよびＱｉａｃｕｂｅ ＨＴ機器を使用して組織溶解物から抽出される。単離された試料の濃度および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して決定される。
［実施例９］
【0142】
核酸コンストラクト中のポリヌクレオチドバーコードのＰＣＲ増幅
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抽出した核酸コンストラクトからアンプリコンを作製する。ＰＣＲを、バーコード上の汎用増幅部位にアニールする単一セットの汎用プライマーを使用して実行し、それにより１回の反応で試料内の固有のバーコードすべてを増幅する。試料内のバーコードの陽性増幅は、電気泳動（アガロースゲルまたはバイオアナライザ）を使用して決定され、およそ１２０ｂｐのバンドの存在によって示される。
［実施例１０］
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抽出した核酸コンストラクトからアンプリコンを作製する。ＰＣＲを、バーコード上の汎用増幅部位にアニールする単一セットの汎用プライマーを使用して実行し、それにより１回の反応で試料内の固有のバーコードすべてを増幅する。試料内のバーコードの陽性増幅は、電気泳動（アガロースゲルまたはバイオアナライザ）を使用して決定され、およそ１２０ｂｐのバンドの存在によって示される。
［実施例１０］
【0143】
核酸コンストラクトのライブラリー調製および配列決定。
配列決定ライブラリーを、第１ステージＰＣＲ増幅の間に生成されるアンプリコンから調製する。汎用プライマーは、配列決定のためのインデックスアダプターの結合を可能にするオーバーハング配列も含有する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘｅｓを、ＰＣＲによるアンプリコンの突出部にアニールする。個々のインデックス付きライブラリーを、次いで等量でプールし、製造業者のプロトコールにしたがってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐキットを使用して精製する。最終的な配列決定ライブラリーのモル濃度を、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＡｓｓａｙキットおよびＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して決定する。ライブラリーを、２％ ＰｈｉＸでスパイクし、１．８ｐＭまで希釈し、Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ３００サイクルＮｅｘｔＳｅｑ配列決定カートリッジにロードする。ペアエンド配列決定を、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０機器を使用して実行する。
［実施例１１］
配列決定ライブラリーを、第１ステージＰＣＲ増幅の間に生成されるアンプリコンから調製する。汎用プライマーは、配列決定のためのインデックスアダプターの結合を可能にするオーバーハング配列も含有する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘｅｓを、ＰＣＲによるアンプリコンの突出部にアニールする。個々のインデックス付きライブラリーを、次いで等量でプールし、製造業者のプロトコールにしたがってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐキットを使用して精製する。最終的な配列決定ライブラリーのモル濃度を、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＡｓｓａｙキットおよびＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して決定する。ライブラリーを、２％ ＰｈｉＸでスパイクし、１．８ｐＭまで希釈し、Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ３００サイクルＮｅｘｔＳｅｑ配列決定カートリッジにロードする。ペアエンド配列決定を、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０機器を使用して実行する。
［実施例１１］
【0144】
配列分析およびバイオインフォマティクス
各試料ＩＤから統合したリードを、ＰＥ ＦＡＳＴＱファイルに逆多重化し、単一のファイルに統合する。統合したリードを処理して、５’と３’両方のフランキングアダプターを含有するものを同定する。次いで整えたリードを、正しいバーコード長を含有する配列を選択して数を減らす。バーコードカウントを、選択して数を減らした配列から生成し、それらがスパイクされているかランダムかによってタグ付けする。次いでバーコードカウントを、試料中のＦＡＳＴＱリード数に対して標準化する。
各試料ＩＤから統合したリードを、ＰＥ ＦＡＳＴＱファイルに逆多重化し、単一のファイルに統合する。統合したリードを処理して、５’と３’両方のフランキングアダプターを含有するものを同定する。次いで整えたリードを、正しいバーコード長を含有する配列を選択して数を減らす。バーコードカウントを、選択して数を減らした配列から生成し、それらがスパイクされているかランダムかによってタグ付けする。次いでバーコードカウントを、試料中のＦＡＳＴＱリード数に対して標準化する。
【0145】
仮説例
例として、例示的な実施形態において、現在開示されている迅速なＤＢＴＬ技術は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）における機能獲得型変異の毒性に起因する筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の形態に対する遺伝子療法を開発するために使用され得る。この遺伝子療法は、非ウイルス性遺伝子デリバリー媒体を介してＣＲＩＳＰＲに基づく編集タンパク質をデリバリーして、疾患の進行をモジュレートするが効率的なウイルス性形質導入は困難なままの細胞型であるミクログリアにおける突然変異体ＳＯＤ１タンパク質の産生を不活性化することを含み得る。これにより、ＡＬＳに対して安全で効率的な治療的「奇襲」編集が可能になる。
例として、例示的な実施形態において、現在開示されている迅速なＤＢＴＬ技術は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）における機能獲得型変異の毒性に起因する筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の形態に対する遺伝子療法を開発するために使用され得る。この遺伝子療法は、非ウイルス性遺伝子デリバリー媒体を介してＣＲＩＳＰＲに基づく編集タンパク質をデリバリーして、疾患の進行をモジュレートするが効率的なウイルス性形質導入は困難なままの細胞型であるミクログリアにおける突然変異体ＳＯＤ１タンパク質の産生を不活性化することを含み得る。これにより、ＡＬＳに対して安全で効率的な治療的「奇襲」編集が可能になる。
【0146】
本明細書に記述される方法で処置され得る典型的な疾患は、ＡＬＳである。ＡＬＳは、脊髄および脳における運動ニューロンの選択的消失によって特徴付けられる急速に進行する、麻痺性で常に致命的な障害である。ほとんどの場合ＡＬＳは散発性であるが、ＳＯＤ１（スーパーオキサイドアニオンを酸素と過酸化水素に通常変換する偏在的に発現される金属酵素）において優性遺伝する突然変異は、すべての遺伝または家族型ＡＬＳの最高２０％を占める。塩基編集は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の要件なしにＤＮＡ内に標的した単一塩基置換を導入することができる最近現れた遺伝子編集様式である。塩基編集は、Ｃａｓ９ニッカーゼとして公知の、触媒的に損なわれたＣａｓ９ヌクレアーゼ変異体と核酸塩基デアミナーゼ酵素との融合からなる。この例は、塩基編集の能力、特にシチジン塩基編集（ＣＢＥ）を利用して、標的遺伝子配列中のＣＧＡ、ＣＡＧまたはＣＡＡトリプレットにおけるＣ＞Ｔ塩基転移を触媒することになり、短縮したタンパク質の形成を防止するために細胞によって使用される監視機構であるナンセンス変異媒介性分解によって標的ｍＲＮＡの分解を誘発するインフレーム終止コドンを創出する。この方法を使用して、ＳＯＤ１は、ＤＳＢを必要とせず、確率論的および突然変異誘発性ＮＨＥＪ修復経路を利用しない様式で不活性化されることになり、したがってＡＬＳに対するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の臨床的実施が直面する主要な制約の２つを克服する。したがって、第１世代ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子編集の「カットアンドペースト」と考えられているが、塩基編集により、ゲノムへの正確な単一塩基編集が可能になり、革命的なＡＬＳ処置に対する新たな機序を開く「消しゴムと鉛筆」機能と考えられている。しかしながら、遺伝子デリバリーにおける革新は、遺伝子編集自体の技術における革新に著しく遅れている。したがって、ＡＬＳの進行の促進に関係する特定の細胞型への塩基編集システムの効率的なデリバリーが、障害を処置するための安全で効率的な実施を妨げる重要な制約となっている。非ウイルス性デリバリー媒体を使用して、これらの制約の多くを解決することになる。
【0147】
この実例において、迅速なＤＢＴＬ技術は、多様なポリマーナノ粒子ライブラリーの自動化された高スループット合成、バーコード化ライブラリーのインビトロおよびインビボ並列スクリーニング、ならびに迅速な反復のために大規模データセットを分析し、新たなライブラリーを予測するために機械学習アルゴリズムを使用して、数百個もの多様なポリマーナノ粒子候補によって反復することができる。図１は、自動化合成、高スループット試験、および機械学習設計に基づく非ウイルス性遺伝子デリバリーを開発するためのＤＢＴＬサイクルを例示する単純化した流れ図を示す。
【0148】
仮説例
一態様において、ＣＢＥ ｍＲＮＡを封入している数百個のポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）のライブラリーは、高スループットインビトロおよびインビボプラットフォームでスクリーニングされ得る。例示的な実施形態において、５００個を超えるＰＮＰが、合成され、一意的に標識され、ＤＮＡバーコード化によって追跡される。可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合に基づく非常に用途が広いＰＮＰプラットフォームは、その柔軟性、再現性および拡張可能性のため使用されることになる。K. Sims et al., "Rigor and reproducibility in polymer nanoparticle synthesis and characterization," Rsc Advances 2020, 10 (5), 2513-2518を参照のこと（参照により本明細書に組み込む）。図２に示すように、ＲＡＦＴ重合プラットフォームを使用して、サイズ、電荷および化学的構成が多様に変化した高度に単分散のＰＮＰを生成することができる。ＰＮＰを機能化して細胞侵入ペプチドを結合し、それにより媒体と積荷両方に対してより高次の機能性および保護を可能にすることができる。一部の実施形態において、ＰＮＰは、アビジン－ビオチンコンジュゲーションを介して量子ドットおよび他のバイオマーカーで標識されてもよい。A. Duong et al., "Scalable, Semicontinuous Production of Micelles Encapsulating Nanoparticles via Electrospray," Langmuir 2014, 30 (14), 3939-3948を参照のこと（参照により本明細書に組み込む）。ミクログリア非ウイルス性デリバリー媒体と塩基編集ペイロードのこの組合せは、ＡＬＳに対する新たな療法をもたらす潜在性を有するので、非常に革新的である。さらに、本開示のＤＢＴＬ技術を一般化して、ＡＬＳに関係する他の細胞型を利用可能にできる先進の非ウイルス性デリバリー媒体の創作を可能にできる。
一態様において、ＣＢＥ ｍＲＮＡを封入している数百個のポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）のライブラリーは、高スループットインビトロおよびインビボプラットフォームでスクリーニングされ得る。例示的な実施形態において、５００個を超えるＰＮＰが、合成され、一意的に標識され、ＤＮＡバーコード化によって追跡される。可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合に基づく非常に用途が広いＰＮＰプラットフォームは、その柔軟性、再現性および拡張可能性のため使用されることになる。K. Sims et al., "Rigor and reproducibility in polymer nanoparticle synthesis and characterization," Rsc Advances 2020, 10 (5), 2513-2518を参照のこと（参照により本明細書に組み込む）。図２に示すように、ＲＡＦＴ重合プラットフォームを使用して、サイズ、電荷および化学的構成が多様に変化した高度に単分散のＰＮＰを生成することができる。ＰＮＰを機能化して細胞侵入ペプチドを結合し、それにより媒体と積荷両方に対してより高次の機能性および保護を可能にすることができる。一部の実施形態において、ＰＮＰは、アビジン－ビオチンコンジュゲーションを介して量子ドットおよび他のバイオマーカーで標識されてもよい。A. Duong et al., "Scalable, Semicontinuous Production of Micelles Encapsulating Nanoparticles via Electrospray," Langmuir 2014, 30 (14), 3939-3948を参照のこと（参照により本明細書に組み込む）。ミクログリア非ウイルス性デリバリー媒体と塩基編集ペイロードのこの組合せは、ＡＬＳに対する新たな療法をもたらす潜在性を有するので、非常に革新的である。さらに、本開示のＤＢＴＬ技術を一般化して、ＡＬＳに関係する他の細胞型を利用可能にできる先進の非ウイルス性デリバリー媒体の創作を可能にできる。
【0149】
ライブラリー合成後、上述の通り、これらのＰＮＰは、ＧＦＰ発現によって毒性、炎症およびｍＲＮＡデリバリー効率についてミクログリアの細胞株において次いでインビトロで迅速に試験され得る。並行して、全ライブラリーの体内分布および毒性が、くも膜下注入によりＡＬＳのＧ９３Ａ－ＳＯＤ１マウスモデルの脳脊髄液（ＣＳＦ）へデリバリーされるロードされたナノ粒子を使用し、インビトロ画像化システム（ＩＶＩＳ）によって追跡することができる生物発光ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡを使用して評価され得る。このスクリーニングにより、粒子の物理的特徴、インビトロ生物活性およびインビボ体内分布および毒性を含めた３つの大きなデータセットを得られるべきであり、それらを、総合して、第２の反復において合成されることになる新規の非ウイルス性デリバリー媒体ライブラリーの情報に基づいた設計の基礎を生成することになる。次いでこの新規のライブラリーは、突然変異体ＳＯＤ１タンパク質を発現するように修飾されたミクログリアの細胞株において機能的な遺伝子編集試験について試験され得る。ＰＮＰは、ＧＦＰおよびＳＯＤ１を不活性化するように設計され、蛍光測定および配列決定によって検出されるＣＢＥをコードしているｍＲＮＡを搭載し得る。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】