特表 2024-516153 改良されたホスホトランスフェラーゼのための材料及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-12

(54)【発明の名称】改良されたホスホトランスフェラーゼのための材料及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20240405BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240405BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54 ZNA

C12N9/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023564448

(86)(22)【出願日】2022-04-20

(85)【翻訳文提出日】2023-12-19

(86)【国際出願番号】 US2022025452

(87)【国際公開番号】W WO2022226005

(87)【国際公開日】2022-10-27

(31)【優先権主張番号】63/177,749

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,759

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,739

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,744

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,764

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,767

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,746

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,753

(32)【優先日】2021-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100217663

【弁理士】

【氏名又は名称】末広 尚也

(72)【発明者】

【氏名】ペリー，ウィリアム，ロイド，ザ サード

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA26X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA46

(57)【要約】

非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）タンパク質及びかかるＮＰＴタンパク質をコードする核酸配列が本明細書に記載される。特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴタンパク質は、野生型ＮＰＴと比較して減少した活性を有する。本明細書に提供される非天然型ＮＰＴタンパク質は、形質転換又はトランスフェクトされた細胞をスクリーニングするための選択可能マーカーとして有用である。非天然型ＮＰＴタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター及びキット、並びに非天然ＮＰＴタンパク質及び目的とするタンパク質又は目的とする非コードＲＮＡ配列を発現する細胞を産生する方法も本明細書に提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）であって、前記非天然型ＮＰＴが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（ｆ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する前記アミノ酸残基における前記アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、
を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）。

【請求項2】

ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）であって、前記非天然型ＮＰＴが、
（ａ）配列番号１の３６位及び２１０位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１０位における前記アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｂ）配列番号１の３６位及び１８２位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の１８２位における前記アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（ｃ）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位における前記アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｄ）配列番号１の２１６位及び２６１位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の２１６位における前記アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１の２６１位における前記アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｅ）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位における前記アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（ｆ）配列番号１の３６位及び２１６位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における前記アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１６位における前記アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、
を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）。

【請求項3】

前記非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１に記載のＮＰＴ。

【請求項4】

前記野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１又は３に記載のＮＰＴ。

【請求項5】

前記野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１又は３に記載のＮＰＴ。

【請求項6】

前記非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、請求項２に記載のＮＰＴ。

【請求項7】

前記非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈し、任意選択で、前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＮＰＴ。

【請求項8】

前記非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈し、任意選択で、前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＮＰＴ。

【請求項9】

前記非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される、請求項１～６のいずれか一項に記載のＮＰＴ。

【請求項10】

前記非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）、又は配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＮＰＴ。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、核酸配列。

【請求項12】

前記核酸配列が、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を更に含み、任意選択で、前記第２のタンパク質が治療用タンパク質である、請求項１１に記載の核酸配列。

【請求項13】

前記第１のヌクレオチド配列が、配列番号２０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、又は配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、請求項１１又は１２に記載の核酸配列。

【請求項14】

請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、ベクター。

【請求項15】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ＮＰＴを含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞。

【請求項16】

請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸配列又は請求項１４に記載のベクターを含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞。

【請求項17】

前記核酸配列が前記宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれる、請求項１６に記載の細胞。

【請求項18】

前記宿主細胞が、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２の核酸配列を更に含み、前記第２のタンパク質が、任意選択で、治療用タンパク質であるか、又は任意選択で、前記第２の核酸配列が非コードＲＮＡをコードし、任意選択で、前記非コードＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、又はｔＲＮＡである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項19】

前記宿主細胞が、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞であり、任意選択で、前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項20】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を、前記導入遺伝子が導入された宿主細胞集団から選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞集団に、
（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）前記導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列とを含む核酸配列を導入することと、
（ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を、前記核酸配列が導入された前記宿主細胞集団から選択することと、を含む、方法。

【請求項21】

（ａ）前記選択された細胞が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖した第２の宿主細胞集団の選択後の第２の細胞セットにおける前記導入遺伝子のコピー数と比較して２～１０００倍多いコピー数の前記導入遺伝子を含み、前記第２の宿主細胞集団が、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている、及び／又は
（ｂ）前記選択された細胞が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖した第２の宿主細胞集団の選択後の第２の細胞セットによる前記導入遺伝子の発現レベルと比較して１０～１０００倍高い発現レベルの前記導入遺伝子を達成し、前記第２の宿主細胞集団が、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞であり、任意選択で、前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項23】

前記核酸配列が前記選択された細胞のゲノムに安定して組み込まれる、請求項２０、２１、又は２２に記載の細胞。

【請求項24】

前記選択された細胞が、高コピー数の前記導入遺伝子を有する、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記選択された細胞が、高発現レベルの前記導入遺伝子を有する、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記選択された細胞が、５～１００コピーの前記導入遺伝子をそれらのゲノムＤＮＡに組み込んでいる、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記選択された細胞が、１～５コピーの前記導入遺伝子をそれらのゲノムＤＮＡに組み込んでいる、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記導入遺伝子がウイルス遺伝子若しくは増殖因子遺伝子を含むか、又は前記導入遺伝子がタンパク質若しくは非コードＲＮＡをコードし、任意選択で、前記非コードＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、若しくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのガイドＲＮＡからなる群から選択され、任意選択で、前記タンパク質が治療用タンパク質若しくは抗原である、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質が、ネオマイシン、カナマイシン、又はＧ４１８である、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを選択可能マーカーとして使用する方法であって、
（ａ）宿主細胞に、前記非天然型ＮＰＴをコードする前記核酸配列を含む前記プラスミド又はトランスポゾンを導入することと、
（ｂ）前記細胞をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させることと、を含む、方法。

【請求項31】

前記宿主細胞が、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞であり、任意選択で、前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記プラスミド又はトランスポゾンが、タンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を更に含み、任意選択で、前記タンパク質が、ウイルスタンパク質又は治療用タンパク質であり、任意選択で、前記非コードＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、又はｔＲＮＡである、請求項３０又は３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質が、ネオマイシン、カナマイシン、又はＧ４１８である、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡであって、任意選択で、前記第２のタンパク質が治療用タンパク質若しくは抗原であるか、又は任意選択で、前記非コード領域が、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、若しくはｔＲＮＡである、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列とを含む第１の核酸配列を導入することと、
（ｂ）前記宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、
（ｃ）前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。

【請求項35】

第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡであって、任意選択で、前記第２のタンパク質が治療用タンパク質若しくは抗原であるか、又は任意選択で、前記非コード領域が、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、若しくはｔＲＮＡである、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列とを共導入することと、
（ｂ）前記宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、
（ｃ）前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。

【請求項36】

第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞集団であって、前記宿主細胞集団が、（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡであって、任意選択で、前記第２のタンパク質が治療用タンパク質若しくは抗原であるか、又は任意選択で、前記非コード領域が、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、若しくはｔＲＮＡである、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列とを含む、宿主細胞集団を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、
（ｂ）前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。

【請求項37】

第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞集団であって、前記宿主細胞集団が、（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡであって、任意選択で、前記第２のタンパク質が治療用タンパク質若しくは抗原であるか、又は任意選択で、前記非コード領域が、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、若しくはｔＲＮＡである、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列とを含む、宿主細胞集団を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、
（ｂ）前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。

【請求項38】

前記宿主細胞が哺乳類細胞であり、任意選択で、前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記選択された細胞コロニーを培養することを更に含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質が、ネオマイシン、カナマイシン、又はＧ４１８である、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法によって産生される、宿主細胞。

【請求項43】

治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を製造するための方法であって、
（ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列であって、前記１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）前記治療用タンパク質又は酵素をコードする第２の核酸配列とを含む、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することと、
（ｂ）工程（ａ）の前記細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、
（ｃ）前記選択された細胞を培養して、前記治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を産生することと、を含む、方法。

【請求項44】

前記安定な細胞株が前記治療タンパク質又は酵素を発現し、任意選択で、前記治療タンパク質が抗体又は抗体断片である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

請求項４３又は４４に記載の方法によって産生される、安定な細胞株。

【請求項46】

ウイルス産生細胞株を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列であって、前記１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質であって、前記１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列とを含む、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することと、
（ｂ）前記細胞集団から、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を選択することと、
（ｃ）前記選択された細胞を増殖させて、ウイルス産生細胞株を産生することと、を含む、方法。

【請求項47】

前記１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、エンベロープタンパク質、アデノウイルス複製に必要なアデノウイルスＥ１領域タンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質、レトロウイルスｇａｇタンパク質、レトロウイルス逆転写酵素、又はレトロウイルスエンベロープタンパク質、ｇａｇタンパク質、及び逆転写酵素を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

請求項４６又は４７に記載の方法によって作製されたウイルス産生細胞株。

【請求項49】

１つ又は２つ以上の核酸配列であって、前記１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質であって、前記１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む、１つ又は２つ以上の核酸配列を含む、ウイルス産生細胞株。

【請求項50】

前記１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、エンベロープタンパク質、アデノウイルス複製に必要なアデノウイルスＥ１領域タンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質、レトロウイルスｇａｇタンパク質、レトロウイルス逆転写酵素、又はレトロウイルスエンベロープタンパク質、ｇａｇタンパク質、及び逆転写酵素を含む、請求項４９に記載のウイルス産生細胞株。

【請求項51】

抗原を発現する細胞株を製造するための方法であって、
（ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列であって、前記１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）抗原であって、任意選択で、前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又はがん抗原である、抗原をコードする第２の核酸配列とを含む、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することと、
（ｂ）工程（ａ）の前記細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、
（ｃ）前記選択された細胞を培養して、前記抗原を発現する細胞株を産生することと、を含む、方法。

【請求項52】

請求項５１に記載の方法によって作製される、抗原産生細胞株。

【請求項53】

前記細胞株が哺乳類細胞株であり、任意選択で、前記哺乳類細胞株がヒト細胞株である、請求項４３、４４、４６、４７、又は５１に記載の方法。

【請求項54】

前記細胞株が、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である、請求項４３、４４、４６、４７、又は５１に記載の方法。

【請求項55】

１つ又は２つ以上の核酸配列であって、前記１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、
（ｂ）１つ又は２つ以上の抗原であって、任意選択で、前記１つ又は２つ以上の抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又はがん抗原である、１つ又は２つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列とを含む、１つ又は２つ以上の核酸配列を含む、抗原産生細胞株。

【請求項56】

前記細胞株が哺乳類細胞株であり、任意選択で、前記哺乳類細胞株がヒト細胞株である、請求項４５、４８、４９、５０、５２、又は５５に記載の細胞株。

【請求項57】

前記細胞株が、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である、請求項４５、４８、４９、５０、５２、又は５５に記載の細胞株。

【請求項58】

細菌細胞に導入されたときにカナマイシンに対する耐性を付与し、かつ哺乳類細胞に導入されたときにＧ４１８に対する耐性を付与するための選択可能マーカー手段であって、任意選択で、前記選択可能マーカー手段が、配列番号２０の核酸配列、配列番号３２の核酸配列、配列番号３３の核酸配列、配列番号３４の核酸配列、配列番号３６の核酸配列、又は配列番号３７の核酸配列を含む、選択可能マーカー手段。

【請求項59】

産生細胞株を製造するための方法であって、
（ａ）細菌細胞又は哺乳類細胞を発現ベクターで形質転換して、形質転換細胞を作製することであって、前記発現ベクターが、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする核酸配列と、前記形質転換細胞が細菌細胞である場合にカナマイシンの存在下で増殖させるための手段と、前記形質転換細胞が哺乳類細胞である場合にＧ４１８の存在下で増殖させるための手段とを含む、作製することと、
（ｂ）前記形質転換細胞をカナマイシン又はＧ４１８の存在下で培養して、産生細胞株であって、前記産生細胞株が、ＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又はバキュロウイルス由来の１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質を発現する、産生細胞株を得ることと、を含む、方法。

【請求項60】

外因性核酸配列の安定な染色体組み込みを有する細胞を選択するための方法であって、
（ａ）真核細胞集団を、Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段を含む外因性核酸配列で形質転換することと、
（ｂ）前記形質転換細胞集団をＧ４１８の存在下で培養して、Ｇ４１８の存在下で増殖することができる形質転換細胞のコロニーを生成することと、
（ｃ）工程（ｂ）で生成されたコロニーから細胞を選択して、前記外因性核酸の安定な染色体組み込みを有する細胞を得ることと、を含み、任意選択で、前記外因性核酸配列が導入遺伝子を更に含み、前記選択された細胞が前記導入遺伝子を発現するか、又は前記外因性核酸配列が前記選択された細胞に対して内因性の遺伝子の発現を破壊する、方法。

【請求項61】

安定なエピソームを有する哺乳類細胞を選択するための方法であって、
（ａ）哺乳類細胞集団を、Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段を含むプラスミドで形質転換することと、
（ｂ）前記形質転換細胞集団をＧ４１８の存在下で培養して、Ｇ４１８の存在下で増殖することができる形質転換細胞のコロニーを生成することと、
（ｃ）工程（ｂ）で生成されたコロニーから細胞を選択して、前記プラスミドを含む安定なエピソームを有する細胞を得ることと、を含み、任意選択で、前記プラスミドがＥＢＮＡ１ ＯｒｉＰ核酸配列を更に含み、前記選択された細胞がＥＢＮＡ１を発現する、方法。

【請求項62】

導入遺伝子を一過性に発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、
（ａ）哺乳類細胞集団に、導入遺伝子をコードする核酸と、Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段とを導入することと、
（ｂ）前記哺乳類細胞集団をＧ４１８の存在下で４８～７２時間培養することと、
（ｃ）Ｇ４１８の存在下で増殖する前記培養された哺乳類細胞集団から哺乳類細胞を選択することであって、前記選択された哺乳類細胞が前記導入遺伝子を一過性に発現する、選択することと、を含み、任意選択で、前記導入遺伝子がＣｒｉｓｐｒエンドヌクレアーゼ又はＣｒｉｓｐｒガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む、方法。

【請求項63】

前記手段が、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、及び４３の群から選択されるアミノ酸配列を含む非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列である、請求項５９～６２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７３９号、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７４４号、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７４６号、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７４９号、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７５３号、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７５９号、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７６４号、２０２１年４月２１日に出願された米国特許出願第６３／１７７，７６７号の利益を主張し、これらの各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、ファイル名が「１４６２０－６８６－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔ」で、２０２２年４月９日に作成され、１１８，１１３バイトのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

（分野）
非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neomycin phosphotransferase、ＮＰＴ）タンパク質及びかかるＮＰＴタンパク質をコードする核酸配列が本明細書に提供される。特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴタンパク質は、野生型ＮＰＴと比較して減少した活性を有する。本明細書に提供される非天然型ＮＰＴタンパク質は、形質転換又はトランスフェクトされた細胞をスクリーニングするための選択可能マーカーとして有用である。非天然型ＮＰＴタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター及びキット、並びに非天然型ＮＰＴタンパク質及び目的とするタンパク質又は目的とする非コードＲＮＡ配列を発現する細胞を産生する方法も本明細書に提供される。

【背景技術】

【0004】

いくつかの例では、ゲノム内に安定に組み込まれた外因性導入遺伝子を保有する哺乳類細胞株を生成することがより困難になっているが、高レベルで及び／又は高導入遺伝子コピー数でタンパク質産物を発現するクローン株を同定することは困難であり、例えば、非効率的で時間がかかるなどである。導入遺伝子組み込み部位の配列は、導入遺伝子発現に大きな影響を及ぼすことができ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７（９）：９３１－９４２（２０１９））、異なるクローンにおいて劇的に異なる発現レベルをもたらす。ＤＮＡ調節エレメントは、導入遺伝子と宿主ＤＮＡとの間に配置される場合、染色体位置効果から導入遺伝子を遮蔽するために使用することができる（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３７（８）：１０７４１５（２０１９）に概説されている）。このアプローチは、発現及び発現安定性を増加させ得るが、高発現クローンを同定するために、有意なスクリーニングがなお必要とされ得る。ウイルス産生細胞株を開発するために、高い導入遺伝子発現を有するよりも、パッケージングされるウイルスペイロードの多くのコピーを有する株を生成することがおそらくより重要である。多コピー導入遺伝子を選択する方法は、細胞株の開発をより効率的にする。

【0005】

問題の１つは、安定な細胞株を生成するために使用される多くの構築物が、非常に低いレベルで発現される場合でさえ、形質転換された細胞に選択的利点を与える非常に効率的な選択マーカーを含むことである。したがって、高マーカー遺伝子発現又は多コピー導入遺伝子についての直接的な選択はない。選択マーカー発現又は翻訳効率を低下させるいくつかのアプローチが記載されている。これらには、発現を駆動するための弱いプロモーターの使用（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１０８（２）：１９３－１９９（１９９１）、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６８（４）：６５２－６５８（２０１３）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２９（２０１３））、代替コドン（例えば、ＡＴＧの代わりにＧＴＧ又はＴＴＧ）からの翻訳の開始（ｖａｎ Ｂｌｏｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１２８（２）：２３７－２４５（２００７）、Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ，，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ１０８（１１）：２６１１－２６２２（２０１１））、及び翻訳を開始するための内部リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）の使用（Ｇｕｒｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ２２９（１）：２９５－２９８（１９９６）、Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２１（５）：５５３－５５８（２００３）、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５７（１）：１３０－１３９（２０１２））が含まれる。

【0006】

選択マーカー効率を低下させる別のアプローチは、活性が低下した変異タンパク質を使用することである。グルタミンシンテターゼ（glutamine synthetase、ＧＳ）遺伝子における変異は、ＣＨＯ細胞における選択ストリンジェンシーを増加させるために使用されている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ１１（５）：９６５－９７６（２０１９））。Ｔｎ５（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ３’－ＩＩａ）由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）は、最も一般的に使用される選択マーカーの１つである。それは、これらの抗生物質をリン酸化することによって、細菌においてネオマイシン及びカナマイシンに対する、並びに哺乳類及び植物細胞においてＧ４１８に対する耐性を付与する（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ５７（１）：１３８－１６３（１９９３））。変異誘発研究（Ｂｌａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（６）：１５１１－１５１８（１９９１）、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＳＡＡＳ Ｂｕｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ５：５８－６３（１９９２）、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ ａｎｄ Ｐｅｒｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１８５（３）：９２５－９３１（１９９２）、Ｋｏｃａｂｉｖｉｋ ａｎｄ Ｐｅｒｌｉｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ２６（１）：６１－６６（１９９４））及び自然変異の発見（Ｙｅｎｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７（９）：３４３５－３４３９（１９９０））は、細菌における抗生物質抵抗性の付与能を減少させるが排除しない重要な残基を同定した。変異ＮＰＴ遺伝子が、ＣＨＯ細胞における安定な抗体産生細胞株を選択するために使用されるベクターに組み込まれた場合、選択のストリンジェンシーの増加は、野生型ＮＰＴ遺伝子の使用と比較して、より高い抗体発現及び生産性をもたらした（Ｓａｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｅｎｅｎｋｅｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ８９（５）：５３０－５３８（２００５）、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５７（１）：１３０－１３９（２０１２））。２ベクター系を使用して、２～１６％の酵素活性を有するＮＰＴ変異体は、野生型ＮＰＴ遺伝子を用いて選択されたプールと比較して、特異的抗体生産性を５～１０倍増加させた（Ｓａｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｅｎｅｎｋｅｌ ２００５）。３％の活性を有する変異ＮＰＴ遺伝子を単一のトリシストロン性ベクターにおいて使用した場合、比生産性は、野生型ＮＰＴ遺伝子の使用と比較して１７倍増加した（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．２０１２）。しかしながら、これらのアプローチには限界がある。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、形質転換された細胞の選択をよりストリンジェントにし、それによって、高レベルの目的の導入遺伝子を発現する細胞株を同定及び作製するために必要なスクリーニングを減少させる、有意に減少した活性を有するＮＰＴ変異体の同定を認識し、これに取り組む。一態様では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）であって、非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴに１つ、２つ、又はそれ以上のアミノ置換（例えば、表１若しくは表２に開示されるアミノ酸置換の１つ、２つ、若しくはそれ以上、又はそれらの組み合わせ）を含む、非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）であって、非天然型ＮＰＴが、（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（ｆ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）が提供される。

【0008】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、（ａ）配列番号１の３６位及び２１０位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１０位におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｂ）配列番号１の３６位及び１８２位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の１８２位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（ｃ）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｄ）配列番号１の２１６位及び２６１位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１の２６１位におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（ｅ）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（ｆ）配列番号１の３６位及び２１６位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0010】

いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0012】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0014】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。

【0015】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。

【0016】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。

【0017】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。

【0018】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。

【0019】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0020】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。

【0021】

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号２０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、又は配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は第２のタンパク質をコードし、第２のタンパク質は治療用タンパク質である。

【0023】

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の核酸配列を含むベクターが提供される。

【0024】

別の態様では、本明細書において、非天然型ＮＰＴを含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号２０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、又は配列番号３７のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベクターを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、又は植物細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞株由来である。

【0025】

別の態様では、本明細書において、非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼと比較して減弱されており、当該非天然型ＮＰＴが、（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（ｆ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴを発現するインビトロ又はエクスビボ宿主細胞が提供される。

【0026】

いくつかの実施形態では、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞は、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼと比較して減弱された活性を有する非天然型ＮＰＴを発現し、非天然型ＮＰＴが、（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸置換アミノ酸残基２１８がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（ｆ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0027】

本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0028】

本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉである。

【0029】

本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0030】

本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、発現された非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、発現された非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、発現された非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、発現された非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載のインビトロ又はエクスビボ宿主細胞のいくつかの実施形態では、発現された非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞は、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２の核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は第２のタンパク質をコードし、第２のタンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、非コードＲＮＡをコードし、非コードＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、又はｔＲＮＡである。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、又は植物細胞である。

【0032】

別の態様では、本明細書において、高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を、導入遺伝子が導入された宿主細胞集団から選択するための方法であって、当該方法が、ａ）（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸配列を含む、宿主細胞集団に導入することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を、核酸配列が導入された宿主細胞集団から選択することと、を含む、方法が提供される。

【0033】

一実施形態では、本明細書において、高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を、導入遺伝子が導入された宿主細胞集団から選択するための方法であって、当該方法が、ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸配列を導入することであって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、導入することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を、核酸配列が導入された宿主細胞集団から選択することと、を含む、方法が提供される。

【0034】

ある特定の実施形態では、高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を、導入遺伝子が導入された宿主細胞集団から選択するための方法であり、当該方法が、ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、第１の核酸配列を導入することであって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸置換アミノ酸残基２１８がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、導入することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を、核酸配列が導入された宿主細胞集団から選択することと、を含む。

【0035】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0036】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のいくつかの実施形態では、高コピー数の導入遺伝子は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列が非天然型ＮＰＴ又は変異ＮＰＴの代わりに使用される場合に達成されるよりも、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高い。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のいくつかの実施形態では、高発現レベルの導入遺伝子は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列が非天然型ＮＰＴ又は変異ＮＰＴの代わりに使用される場合に達成されるよりも、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は５～１０００倍高い。

【0037】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一でのアミノ酸配列を含む。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0038】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉである。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0039】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉである。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞は、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0040】

いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0041】

ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0042】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳類又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞株（例えば、ヒト細胞株）に由来する。

【0043】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、核酸配列は、選択された細胞のゲノム内に安定に組み込まれる。いくつかの実施形態では、選択された細胞は、５～１００コピーの導入遺伝子をそれらのゲノムＤＮＡ内に組み込んでいる。ある特定の実施形態では、選択された細胞は、それらのゲノムＤＮＡ内に組み込まれた１～５コピーの導入遺伝子を有する。

【0044】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、選択された細胞は、高コピー数の導入遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、高コピー数の導入遺伝子は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列がＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの代わりに使用される場合に達成されるよりも、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高い。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、選択された細胞は、高レベルの発現の導入遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、高発現レベルの導入遺伝子は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列が非天然型ＮＰＴ又は変異ＮＰＴの代わりに使用される場合に達成されるよりも、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高い。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、選択された細胞は、高コピー数の導入遺伝子及び高レベルの発現の導入遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、高コピー数の導入遺伝子は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列がＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの代わりに使用される場合に達成されるよりも、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高い。いくつかの実施形態では、高発現レベルの導入遺伝子は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列が非天然型ＮＰＴ又は変異ＮＰＴの代わりに使用される場合に達成されるよりも、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高い。

【0045】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ウイルス遺伝子を含む。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ヒト増殖因子遺伝子を含む。

【0046】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質は、ネオマイシン、カナマイシン又はＧ４１８である。

【0047】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、１０～１０００倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、１００～１０００倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、５００～１０００倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、７５０～１０００倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、１００～５００倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、１０～１００倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、１０～５０倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、１０～２５倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して、２～１０倍高いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。

【0048】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現のレベルと比較して、１０～１０００倍高いレベルの発現の導入遺伝子を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現のレベルと比較して、１００～１０００倍高いレベルの発現の導入遺伝子を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現のレベルと比較して、５００～１０００倍高いレベルの発現の導入遺伝子を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現のレベルと比較して、７５０～１０００倍高いレベルの発現の導入遺伝子を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現のレベルと比較して、１０～１００倍高いレベルの発現の導入遺伝子を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現のレベルと比較して、１０～５０倍高いレベルの発現の導入遺伝子を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現のレベルと比較して、５～２５倍高いレベルの発現の導入遺伝子を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の５～１０倍高いレベルの発現を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択する方法のいくつかの実施形態では、選択された細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させた第２の宿主細胞の集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の２～１０倍高いレベルの発現を達成し、第２の宿主細胞の集団は、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている。特定の実施形態では、宿主細胞の集団は同じであり、使用される条件は同じである。

【0049】

高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を選択するための方法のある特定の実施形態では、導入遺伝子は、タンパク質又は非コードＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質又は抗原である。治療用タンパク質又は抗原は、本明細書に記載されるもの、又は当業者に既知のものであってもよい。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ウイルスタンパク質である。ウイルスタンパク質は、本明細書に記載されるもの、又は当業者に既知のものであってもよい。

【0050】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然型ＮＰＴの使用は、導入遺伝子でトランスフェクト又は形質転換された細胞をスクリーニングする必要性を７，５００～１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然型ＮＰＴの使用は、導入遺伝子でトランスフェクト又は形質転換された細胞をスクリーニングする必要性を５，０００～１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然型ＮＰＴの使用は、導入遺伝子でトランスフェクト又は形質転換された細胞をスクリーニングする必要性を２，５００～１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然型ＮＰＴの使用は、導入遺伝子でトランスフェクト又は形質転換された細胞をスクリーニングする必要性を１，０００～１０，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然型ＮＰＴの使用は、導入遺伝子でトランスフェクト又は形質転換された細胞をスクリーニングする必要性を５，０００～７，５００倍減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然型ＮＰＴの使用は、導入遺伝子でトランスフェクト又は形質転換された細胞をスクリーニングする必要性を１，０００～５，０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然型ＮＰＴの使用は、導入遺伝子でトランスフェクト又は形質転換された細胞をスクリーニングする必要性を５００～１，０００倍減少させる。

【0051】

別の態様では、本明細書において、選択可能マーカーとして野生型ＮＰＴと比較して減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載の非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを使用する方法であって、当該方法が、ａ）核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを宿主細胞に導入することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で細胞を増殖させることと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する宿主細胞を選択することを更に含む。

【0052】

一実施形態では、本明細書において、選択可能マーカーとして野生型ＮＰＴと比較して減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを使用する方法であって、当該方法が、ａ）非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを宿主細胞に導入することであって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、導入することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で細胞を増殖させることと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する宿主細胞を選択することを更に含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、本明細書において、選択可能マーカーとして野生型ＮＰＴと比較して減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを使用する方法であって、当該方法が、ａ）非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを宿主細胞に導入することであって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、導入することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で細胞を増殖させることと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する宿主細胞を選択することを更に含む。

【0054】

プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0055】

プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0056】

プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0057】

プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳類又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞である。

【0058】

プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、プラスミド又はトランスポゾンは、タンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ウイルスタンパク質である。ある特定の実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。

【0059】

プラスミド又はトランスポゾンを使用する方法のある特定の実施形態では、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質は、ネオマイシン、カナマイシン又はＧ４１８である。

【0060】

別の態様では、本明細書において、宿主細胞を作製する方法であって、ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）本明細書に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、第１の核酸配列を導入することと、ｂ）宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、選択された細胞コロニーを培養することを更に含む。

【0061】

一実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、ａ）（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、第１の核酸配列を有する宿主細胞集団を導入することであって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、導入することと、ｂ）宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。

【0062】

別の態様では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）本明細書に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列と、を共導入することと、ｂ）宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、選択された細胞コロニーを培養することを更に含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）本明細書に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列と、を共導入することであって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、共導入することと、ｂ）宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。

【0064】

いくつかの実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列と、を共導入することであって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１の３６位及び２１０位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１０位におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１の３６位及び１８２位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の１８２位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１の２１６位及び２６１位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１の２６１位におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１の３６位及び２１６位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、共導入することと、ｂ）宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。

【0065】

別の態様では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、ａ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、宿主細胞集団が、（ｉ）本明細書に記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、第１の核酸配列を含む、生成することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、選択された細胞コロニーを培養することを更に含む。

【0066】

一実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、ａ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの基質の存在下で宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、宿主細胞集団が、（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、第１の核酸配列を含み、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、生成することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、選択された細胞コロニーを培養することを更に含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法は、ａ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの基質の存在下で宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、宿主細胞集団が、（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列と、を含み、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１の３６位及び２１０位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１０位におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１の３６位及び１８２位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の１８２位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１の２１６位及び２６１位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１の２６１位におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１の３６位及び２１６位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、生成することと、ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、選択された細胞コロニーを培養することを更に含む。

【0068】

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載の方法によって生成される第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞が提供される。

【0069】

別の態様では、本明細書において、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を製造するための方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列を含む、導入することと、ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を培養して、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を産生することと、を含む、方法が提供される。

【0070】

一実施形態では、本明細書において、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を製造するための方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）治療用タンパク質又は酵素をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を培養して、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を産生することと、を含む、方法が提供される。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書において、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を製造するための方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）治療用タンパク質又は酵素をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を培養して、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を産生することと、を含む、方法が提供される。

【0072】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、安定な細胞株は、哺乳類細胞株である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、安定な細胞株は、ヒト細胞株である。いくつかの実施形態では、安定な細胞株は、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、安定な細胞株は、治療用タンパク質を発現する。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、安定な細胞株は、酵素を発現する。

【0073】

別の態様では、本明細書において、本明細書で記載される方法によって産生された安定な細胞株が提供される。いくつかの実施形態では、細胞株の安定性は、例えばｑＰＣＲ又はハイブリダイゼーションなどの定量的方法によって導入遺伝子のコピー数を測定することによって決定することができる。

【0074】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0075】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。提供される方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0076】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0077】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉである。

【0078】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0079】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0080】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞は、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。

【0081】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞は、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーは、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0082】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基ではグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0083】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。

【0084】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。

【0085】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。

【0086】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。

【0087】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。

【0088】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0089】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞集団は、トランスフェクト又は形質転換され、宿主細胞集団である宿主細胞は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも少ないコロニーを生成し、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。

【0090】

宿主細胞は、例えば、哺乳類細胞であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

【0091】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質は、ネオマイシン、カナマイシン、又はＧ４１８である。

【0092】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質又は抗原である。

【0093】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、又はｔＲＮＡである。

【0094】

別の態様では、本明細書において、ウイルス産生細胞株を作製する方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列を含む、導入することと、ｂ）細胞集団から、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を増殖させて、ウイルス産生細胞株を生成することと、を含む、方法が提供される。ウイルス産生細胞株は、例えば、遺伝子治療又は癌治療のためのウイルスを生成するために使用され得る。

【0095】

一実施形態では、本明細書において、ウイルス産生細胞株を作製する方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、ｂ）細胞集団から、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を増殖させて、ウイルス産生細胞株を生成することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、ウイルス産生細胞株を作製する方法は、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、ｂ）細胞集団から、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を増殖させて、ウイルス産生細胞株を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む。

【0097】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0098】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。提供される方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0099】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0100】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0101】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。

【0102】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。

【0103】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。

【0104】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。

【0105】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。

【0106】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0107】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、細胞株は、哺乳類細胞株である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、細胞株は、ヒト細胞株である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である。

【0108】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。

【0109】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を含む。

【0110】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、エンベロープタンパク質を含む。

【0111】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、アデノウイルス複製に必要なアデノウイルスＥ１領域タンパク質を含む。

【0112】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルスエンベロープタンパク質を含む。

【0113】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルスｇａｇタンパク質を含む。

【0114】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルス逆転写酵素を含む。

【0115】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルスエンベロープタンパク質、ｇａｇタンパク質、及び逆転写酵素を含む。

【0116】

別の態様では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含むウイルス産生細胞株が提供され、１つ又は２つ以上の核酸配列は、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む。

【0117】

一実施形態では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含むウイルス産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む、ウイルス産生細胞株が提供される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含むウイルス産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸置換を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む、ウイルス産生細胞株が提供される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む。

【0119】

ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0120】

ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0121】

ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0122】

ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0123】

ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、細胞株は、哺乳類細胞株である。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、細胞株は、ヒト細胞株である。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である。

【0124】

ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、エンベロープタンパク質を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、アデノウイルス複製に必要なアデノウイルスＥ１領域タンパク質を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルスエンベロープタンパク質を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルスｇａｇタンパク質を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルス逆転写酵素を含む。ウイルス産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルスエンベロープタンパク質、ｇａｇタンパク質、及び逆転写酵素を含む。

【0125】

一態様では、本明細書において、抗原を発現する哺乳類細胞株を製造するための方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を培養して、抗原を発現する細胞株を生成することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗原は、哺乳類対象（例えば、ヒト）を免疫化するために使用されるか、又は哺乳類対象（例えば、ヒト）において免疫応答を誘導するために使用される。この抗原はまた、インビトロ又はエクスビボで使用され得る。

【0126】

一実施形態では、本明細書において、抗原を発現する哺乳類細胞株を製造するための方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ネオマイシンＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を培養して、抗原を発現する細胞株を生成することと、を含む、方法が提供される。

【0127】

いくつかの実施形態では、本明細書において、抗原を発現する哺乳類細胞株を製造するための方法であって、ａ）１つ又は２つ以上の核酸配列を宿主細胞集団に導入することであって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ネオマイシンＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、ｃ）選択された細胞を培養して、抗原を発現する細胞株を生成することと、を含む、方法が提供される。

【0128】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0129】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0130】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0131】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0132】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。

【0133】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。

【0134】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。

【0135】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。

【0136】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。

【0137】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0138】

哺乳類細胞株を製造するための方法のいくつかの実施形態では、細胞株は、哺乳類細胞株である。哺乳類細胞株を製造するための方法のいくつかの実施形態では、細胞株は、ヒト細胞株である。哺乳類細胞株を製造するための方法のいくつかの実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である。

【0139】

哺乳類細胞株を製造するための方法のいくつかの実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、又は真菌抗原である。哺乳類細胞株を製造するための方法のいくつかの実施形態では、抗原は、癌抗原である。

【0140】

別の態様では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含む抗原産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する本明細書に記載の非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、抗原産生細胞株が提供される。

【0141】

別の態様では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含む抗原産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、抗原産生細胞株が提供される。

【0142】

いくつかの実施形態では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含む抗原産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、抗原産生細胞株が提供される。

【0143】

本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0144】

本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。

【0145】

本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0146】

本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとしての減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である。いくつかの実施形態では、ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である。いくつかの実施形態では、ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である。いくつかの実施形態では、ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である。いくつかの実施形態では、ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である。

【0148】

本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む。本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、非天然型ＮＰＴは、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む。

【0149】

本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、細胞株は、哺乳類細胞株である。本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、細胞株は、ヒト細胞株である。本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である。

【0150】

本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、又は真菌抗原である。本明細書で提供される抗原産生細胞株のいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の抗原は、癌抗原である。

【0151】

別の態様では、本明細書において、細菌細胞に導入された場合にカナマイシンに対する耐性を付与し、哺乳類細胞に導入された場合にＧ４１８に対する耐性を付与するための選択可能マーカー手段が提供される。いくつかの実施形態では、選択可能マーカー手段は、配列番号２０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択可能マーカー手段は、配列番号３２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択可能マーカー手段は、配列番号３３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択可能マーカー手段は、配列番号３４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択可能マーカー手段は、配列番号３６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、選択可能マーカー手段は、配列番号３７の核酸配列を含む。

【0152】

別の態様では、本明細書において、産生細胞株を製造するための方法であって、ａ）細菌細胞又は哺乳類細胞を発現ベクターで形質転換して、形質転換細胞を作製することであって、発現ベクターが、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする核酸配列と、形質転換細胞が細菌細胞である場合にカナマイシンの存在下で増殖させるための手段と、形質転換細胞が哺乳類細胞である場合にＧ４１８の存在下で増殖させるための手段とを含む、作製することと、ｂ）形質転換細胞をカナマイシン又はＧ４１８の存在下で培養して、産生細胞株であって、産生細胞株が、ＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又はバキュロウイルス由来の１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質を発現する、産生細胞株を得ることと、を含む、方法が提供される。

【0153】

別の態様では、本明細書において、外因性核酸配列の安定した染色体組み込みを有する細胞を選択するための方法であって、ａ）Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段を含む外因性核酸配列で真核細胞集団を形質転換することと、ｂ）Ｇ４１８の存在下で形質転換細胞集団を培養して、Ｇ４１８の存在下で増殖することができる形質転換細胞コロニーを生成することと、ｃ）工程（ｂ）において生成されたコロニーから細胞を選択して、外因性核酸の安定な染色体組み込みを有する細胞を得ることと、を含む、方法が提供される。

【0154】

いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、導入遺伝子を更に含み、選択された細胞は、導入遺伝子を発現する。

【0155】

いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、選択された細胞に対して内因性の遺伝子の発現を破壊する。

【0156】

別の態様では、本明細書において、安定なエピソームを有する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ）Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段を含むプラスミドで哺乳類細胞の集団を形質転換することと、ｂ）Ｇ４１８の存在下で形質転換細胞集団を培養して、Ｇ４１８の存在下で増殖することができる形質転換細胞のコロニーを生成することと、ｃ）工程（ｂ）において生成されたコロニーから細胞を選択して、プラスミドを含む安定なエピソームを有する細胞を得ることと、を含む、方法が提供される。

【0157】

いくつかの実施形態では、プラスミドは、ＥＢＮＡ１ ＯｒｉＰ核酸配列を更に含み、選択された細胞は、ＥＢＮＡ１を発現する。

【0158】

一態様では、本明細書において、導入遺伝子を一過性に発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、ａ）哺乳類細胞集団に、導入遺伝子をコードする核酸及びＧ４１８の存在下で増殖させるための手段を導入することと、ｂ）哺乳類細胞集団を、Ｇ４１８の存在下で４８～７２時間培養することと、ｃ）培養された哺乳類細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する哺乳類細胞を選択することであって、選択された哺乳類細胞が、導入遺伝子を一過性に発現する、選択することと、を含む、方法が提供される。

【0159】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、Ｃｒｉｓｐｒエンドヌクレアーゼ又はＣｒｉｓｐｒガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、手段は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２又は４３の群から選択されるアミノ酸配列を含む非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列である。

【図面の簡単な説明】

【0161】

前述の発明の概要、並びに本出願の特定の実施形態の以下の詳細な説明は、添付図面とともに読んだときにより深く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。

【図1】本明細書に記載の代表的な発現ベクター（プラスミドＰ３１３）を示す。

【図2】トランスポゾンエレメント（「Ｌｅａｐｉｎ左」及び「Ｌｅａｐｉｎ右」）、ヒト伸長因子アルファプロモーター（「ＥＦ１α」）、ポリアデニル化シグナル（「ｐＡ」）を有するｍＣｈｅｒｒｙコード領域、ＮＰＴコード領域（「Ｋａｎ／ＮＥＯ」）、並びに複製起点（「ｐＭＢ１ Ｏｒｉ」）を含む構築物を示す。

【図3】本明細書に記載のコロニー形成アッセイからの結果を示す。

【図4】ｍＣｈｅｒｒｙ及びＮＰＴタンパク質を発現する構築物で形質転換されたＨＥＫ２９３細胞の安定なプールにおけるｍＣｈｅｒｒｙ発現（「ＮＥＯ」と標識される）を、色のない非形質転換細胞（左端のチューブ）と比較して示す。

【図5】野生型ＮＰＴをコードする構築物Ｐ７２４、ＮＰＴ変異体＃１をコードするＰ７２５（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）、又はＮＰＴ変異体＃２をコードするＰ７２６（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）で形質転換したＨＥＫ２９３細胞における導入遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）コピー数のグラフを示し、構築物は、トランスポザーゼエレメントを含む（＋）か、又は含まない（－）かのいずれかである。

【図6A-1】Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１３８－１６３（１９９３）から適合したアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼのアラインメントを示す。配列番号１８、１９及び４５～６２は、図６Ａ～６Ｂに示される配列に割り当てられている。

【図6A-2】Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１３８－１６３（１９９３）から適合したアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼのアラインメントを示す。配列番号１８、１９及び４５～６２は、図６Ａ～６Ｂに示される配列に割り当てられている。

【図6A-3】Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１３８－１６３（１９９３）から適合したアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼのアラインメントを示す。配列番号１８、１９及び４５～６２は、図６Ａ～６Ｂに示される配列に割り当てられている。

【図6B-1】Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１３８－１６３（１９９３）から適合したアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼのアラインメントを示す。配列番号１８、１９及び４５～６２は、図６Ａ～６Ｂに示される配列に割り当てられている。

【図6B-2】Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１３８－１６３（１９９３）から適合したアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼのアラインメントを示す。配列番号１８、１９及び４５～６２は、図６Ａ～６Ｂに示される配列に割り当てられている。

【図6B-3】Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１３８－１６３（１９９３）から適合したアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼのアラインメントを示す。配列番号１８、１９及び４５～６２は、図６Ａ～６Ｂに示される配列に割り当てられている。

【発明の詳細な説明】

【0162】

本開示は、野生型ＮＰＴと比較して顕著に減少しているホスホトランスフェラーゼ活性を有する特定のアミノ酸置換を有するＮＰＴの驚くべき発見に部分的に基づく。本明細書に記載のＮＰＴをコードする核酸配列の使用は、形質転換細胞株の選択及び作製のための選択可能マーカーとして十分な利点を提供し、この形質転換細胞株は、目的の遺伝子に加えて、変異したＮＰＴを発現し、この変異したＮＰＴは、形質転換細胞に非形質転換細胞を超える選択的利点を与える。

【0163】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈で明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の言及を含む。

【0164】

２つ若しくは３つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一である」又はパーセント「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセント分の同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ若しくは３つ以上の配列又はサブ配列を指す。

【0165】

配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0166】

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。

【0167】

配列同一性パーセント及び配列類似性を求めるのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと位置合わせしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（high scoring sequence pair、ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。

【0168】

ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に０より大きい）及びパラメータＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に０より小さい）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ又は２つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

【0169】

配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。

【0170】

２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１核酸によりコード化されるポリペプチドが、第２核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

【0171】

「野生型ＮＰＴ」及び野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、当業者によって理解される。一般に、野生型ＮＰＴは、天然の生物の間で優勢であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを指す。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ３’－ＩＩである。ある特定の実施形態では、野生型ＮＰＴは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ３’－ＩＩａである。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、Ｔｎ５由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ３’－ＩＩａ）である。特定の実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１又は配列番号４４以外のアミノ酸配列とともに含む。

【0172】

本明細書に記載されるＮＰＴにおける置換のアミノ酸位置の記載は、配列番号１のアミノ酸位置に対するものである。例えば、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基における野生型ＮＰＴのアミノ酸置換は、図６Ａ～図６Ｂに提供されるようなアラインメントにおいて配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応する野生型ＮＰＴのアミノ酸残基にアミノ酸置換を有する野生型ＮＰＴを指す。図６Ａ～図６Ｂにおいて、ＡＰＨ（３’）－ＩＩａの配列は参照配列（すなわち、配列番号１に対応するアミノ酸配列）であり、それに対して他の野生型ＮＰＴを比較した。配列番号１のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、配列番号６として提供される。

【0173】

本明細書で使用される場合、「選択可能マーカー手段」という語句は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で宿主細胞の増殖を可能にする、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴ、又は本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を指す。

【0174】

本明細書で使用される場合、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の「存在下で増殖させるための手段」という語句は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で宿主細胞の増殖を可能にする、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴ、又は本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を指す。

【0175】

７．１ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）タンパク質
一態様では、本明細書において、野生型ＮＰＴとアミノ酸配列が異なり、野生型ＮＰＴと比較して変化したホスホトランスフェラーゼ活性（例えば、低下したホスホトランスフェラーゼ活性）を有するＮＰＴ変異体が提供される。一実施形態では、ＮＰＴ変異体は、野生型ＮＰＴ（例えば、表１又は表２中）において本明細書に記載される１つ、２つ、若しくはそれ以上のアミノ酸置換、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、非天然型ＮＰＴタンパク質である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、単離されたＮＰＴタンパク質である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、野生型ＮＰＴと比較して選択可能マーカーとして減弱された活性を有する。特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、本明細書に記載された又は当業者に既知のアッセイにおいて、対応する野生型ＮＰＴと比較して低下した酵素活性を有する。例えば、ＮＰＴの酵素活性は、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ ａｎｄ Ｐｅｒｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１８５（３）：９２５－９３１（１９９２）に記載されているようなインビトロキナーゼアッセイで測定することができる。ＮＰＴ変異体の酵素活性は、同じ条件下で対応する野生型ＮＰＴと比較される。代替的に又は追加的に、酵素活性ＮＰＴは、一定量のカナマイシン（例えば、２５μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、又は１００μｇ／ｍｌ）及び細菌の増殖のための適切な栄養素並びに細菌が増殖するための適切な条件（例えば、温度など）を含むプレート上で一定期間（例えば、３６時間、４８時間、７２時間又はそれ以上）後に、ＮＰＴ変異体をコードするプラスミドで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）によるコロニー形成を評価することによって間接的に測定されてもよい。ＮＰＴ変異体をコードするヌクレオチド配列で形質転換された細菌のコロニー形成を、ＮＰＴ変異体をコードするヌクレオチド配列で形質転換された細菌と同じ増殖条件下で増殖させた、対応する野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列で形質転換された同じ種の細菌のコロニー形成と比較し、野生型ＮＰＴをコードするプラスミドで形質転換された細菌によって形成されるコロニーと比較して、ＮＰＴ変異体をコードするヌクレオチド配列で形質転換された細菌によって形成されたコロニーの数が少ない及び／又は小さいことは、ＮＰＴ変異体の酵素活性及び／又はタンパク質安定性が減弱していることを示す。酵素活性ＮＰＴ変異体を評価するための間接アッセイの別の例は、ＮＰＴ変異タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクト又は形質転換された哺乳類細胞によるコロニー形成を、対応する野生型ＮＰＴをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた哺乳類細胞によるコロニー形成と比較することを含み、哺乳類細胞の両方の集団を、増殖に必要な培地及びある濃度のＧ４１８（例えば、５００μｇ／ｍｌ）を含むプレート又は別の適切な種類の容器上で、同じ条件下（例えば、同じ温度、ＣＯ_２など）で、ある期間（例えば、２週間、２．５週間、３週間、又はそれ以上）増殖させ、野生型ＮＰＴでトランスフェクトされた哺乳類細胞によるコロニー形成と比較して、ＮＰＴ変異体でトランスフェクトされた哺乳類細胞によるコロニー形成が減少することは、ＮＰＴ変異体が減弱された酵素活性を有することを示す。

【0176】

ＮＰＴ遺伝子の酵素活性を評価するための間接的アッセイの別の例は、哺乳類発現構築物でトランスフェクトされた細胞の割合を測定することを含み、当該細胞は、構築物を宿主染色体に安定に組み込み、希釈して組織培養皿中に選択剤を含有する培地にプレーティングした場合にコロニーを形成する。例えば、野生型又は変異型ＮＰＴアイソフォームを発現するように設計されたプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清及び６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ培地の皿状にした１５０ｍｍ組織培養物に２Ｅ６細胞以下でプレーティングし、３７℃、８％ＣＯ_２で２週間培養する。培地を除去し、室温で１０分間インキュベートすることにより、５０％メタノール中の１０ｍｌの０．４％メチレンブルーで細胞を染色する。染色剤を除去し、細胞を１００％メタノールで洗浄し、空気乾燥させ、写真撮影する。野生型ＮＰＴ発現構築物と比較して、変異体ＮＰＴ発現構築物を使用してプレーティングしたコロニー：細胞数の割合が減少することは、変異体が減弱された酵素活性を有することを示す。

【0177】

ある特定の実施形態では、野生型ＮＰＴと比較して減少した活性を有するＮＰＴ変異体は、好適なアッセイで決定される、野生型ＮＰＴ（例えば、配列番号１又は配列番号４４）のホスホトランスフェラーゼ活性の０．００１％～１０％を呈する。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴと比較して減少した活性を有するＮＰＴ変異体は、好適なアッセイで決定される、野生型ＮＰＴ（例えば、配列番号１又は配列番号４４）のホスホトランスフェラーゼ活性の０．００１％～８％を呈する。ある特定の実施形態では、野生型ＮＰＴと比較して減少した活性を有するＮＰＴ変異体は、好適なアッセイで決定される、野生型ＮＰＴ（例えば、配列番号１又は配列番号４４）のホスホトランスフェラーゼ活性の０．０１％～６％を呈する。ＮＰＴホスホトランスフェラーゼ活性は、当該技術分野で既知のアッセイ（例えば、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ ａｎｄ Ｐｅｒｌｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１８５（３）：９２５－９３１（１９９２）、及びホスホトランスフェラーゼ活性をアッセイする例示的な方法についてその中で引用されている参考文献を参照されたい）、又は本明細書に記載されているアッセイ（例えば、コロニー形成）のいずれかを使用して測定することができる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、野生型ＮＰＴのアミノ酸配列に１つ又は２つのアミノ酸置換を有し、野生型ＮＰＴのアミノ酸残基におけるアミノ酸置換は、表１又は表２に列挙された配列番号１のアミノ酸残基の１つ又は２つに対応する。いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異体は、野生型ＮＰＴのアミノ酸配列に１つのアミノ酸置換を有し、アミノ酸置換は、表１又は表２に列挙された配列番号１のアミノ酸残基の１つに対応する野生型ＮＰＴのアミノ酸残基にある。特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、当業者に既知の技術又は本明細書に記載の技術によって評価される場合、減少した活性を有する。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、野生型ＮＰＴのアミノ酸配列に２つのアミノ酸置換を有し、アミノ酸置換は、表１又は表２に列挙された配列番号１のアミノ酸残基のうちの２つに対応する野生型ＮＰＴのアミノ酸残基のうちの２つにある。特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、当業者に既知の技術又は本明細書に記載の技術によって評価される場合、減少した活性を有する。

【0178】

ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列に１つ又は２つのアミノ酸置換を有し、バリアントのアミノ酸残基におけるアミノ酸置換は、表１又は表２に列挙された配列番号１のアミノ酸残基の１つ又は２つに対応する。いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異体は、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列に１つのアミノ酸置換を有し、アミノ酸置換は、表１又は表２に列挙された配列番号１のアミノ酸残基の１つに対応するバリアントのアミノ酸残基にある。特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、当業者に既知の技術又は本明細書に記載の技術によって評価される場合、減少した活性を有する。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列において２つのアミノ酸置換を有し、アミノ酸置換は、表１又は表２に列挙された配列番号１のアミノ酸残基のうちの２つに対応するバリアントのアミノ酸残基のうちの２つにある。特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、当業者に既知の技術又は本明細書に記載の技術によって評価される場合、減少した活性を有する。

【0179】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１の３６位のアミノ酸に対応する位置にメチオニンを有し、配列番号１の２１０位のアミノ酸に対応する位置にアラニンを有する点で野生型ＮＰＴとは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１の３６位のアミノ酸に対応する位置にメチオニンを有し、配列番号１の１８２位のアミノ酸に対応する位置にアスパラギン酸を有する点で野生型ＮＰＴとは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１の３６位のアミノ酸に対応する位置にメチオニンを有し、配列番号１の２１８位のアミノ酸に対応する位置にフェニルアラニンを有する点で野生型ＮＰＴとは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１の２１６位のアミノ酸に対応する位置にグリシンを有し、配列番号１の２６１位のアミノ酸に対応する位置にアスパラギンを有する点で野生型ＮＰＴとは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１の３６位のアミノ酸に対応する位置にメチオニンを有し、配列番号１の２１８位のアミノ酸に対応する位置にセリンを有する点で野生型ＮＰＴとは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１の３６位のアミノ酸に対応する位置にメチオニンを有し、配列番号１の２１６位のアミノ酸に対応する位置にグリシンを有する点で野生型ＮＰＴとは異なる。特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、当業者に既知の技術又は本明細書に記載の技術によって評価される場合、減少した活性を有する。

【0180】

ある特定の実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴは、当業者に既知の技術又は本明細書に記載の技術によって評価される場合、減少した活性を有する。

【0181】

いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１又は配列番号４４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１又は配列番号４４と少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１又は配列番号４４と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、野生型ＮＰＴは、配列番号１又は配列番号４４と５０％～７５％、５０％～８０％、５０％～６０％、７５％～９５％、又は８５％～９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型配列のモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３と同一である。ある特定の実施形態では、野生型配列のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３と同一である。いくつかの実施形態では、野生型配列のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせは、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせと同一である。いくつかの実施形態では、野生型配列のモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である。ある特定の実施形態では、野生型配列のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、野生型配列のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせは、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせと少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、野生型配列のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせは、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせと少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。

【0182】

ある特定の実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴが提供される。特定の実施形態では、非天然型ＮＰＴ変異体は、当業者に既知の技術又は本明細書に記載の技術によって評価される場合、減少した活性を有する。

【0183】

ある特定の実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントは、配列番号１又は配列番号４４と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントは、配列番号１又は配列番号４４と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３と同一である。ある特定の実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３と同一である。例えば、アミノグリコシドトランスフェラーゼのモチーフ１、２、及び３の位置についての図６Ａ～図６Ｂを参照されたい。いくつかの実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせは、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせと同一である。いくつかの実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、又はモチーフ３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である。ある特定の実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３は、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせは、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせと少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼバリアントのモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせは、それぞれ、配列番号１又は配列番号４４のモチーフ１、モチーフ２、及びモチーフ３の組み合わせと少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。

【0184】

ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、本明細書に提供されるＮＰＴ変異体が列挙された表１のうちのいずれか１つである。別の特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、本明細書に提供される表２に列挙されたＮＰＴ変異体のうちのいずれか１つである。

【0185】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置３６にメチオニンを有し、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置２１０にアラニンを有する点で、配列番号１又は配列番号４４とは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置３６にメチオニンを有し、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置１８２にアスパラギン酸を有する点で、配列番号１又は配列番号４４とは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置３６にメチオニンを有し、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置２１８にフェニルアラニンを有する点で、配列番号１又は配列番号４４とは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置２１６にグリシンを有し、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置２６１にアスパラギンを有する点で、配列番号１又は配列番号４４とは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置３６にメチオニンを有し、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置２１８にセリンを有する点で、配列番号１又は配列番号４４とは異なる。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置３６のメチオニン、及び配列番号１又は配列番号４４のアミノ酸位置２１６にグリシンを有する点で、配列番号１又は配列番号４４とは異なる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１の二重点ＮＰＴ変異体である。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＮＰＴ変異体は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。

【0186】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１５のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号１９のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２１のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２２のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２３のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２４のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２５のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２６のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２７のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２８のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２９のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３０のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３１のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３５のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。

【0187】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号２０のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３２のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３３のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３４のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３６のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体は、配列番号３７のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。

【0188】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞は、対応する野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１）でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。「減少したコロニー形成」は、例えば、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞のカナマイシン耐性コロニーと比較して、コロニーの０．００１％～７５％の減少であり得る。いくつかの実施形態では、減少したコロニー形成は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞のカナマイシン耐性コロニーと比較して０．００１％～１０％の減少である。ある特定の実施形態では、減少したコロニー形成は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞のカナマイシン耐性コロニーと比較して０．０１％～６％の減少である。

【0189】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された哺乳類細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１）でトランスフェクト又は形質転換された哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。「減少したコロニー形成」は、例えば、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、コロニーの０．００１％～７５％の減少であり得る。いくつかの実施形態では、減少したコロニー形成は、野生型ＮＰＴでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して０．００１％～１０％の減少である。ある特定の実施形態では、減少したコロニー形成は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して０．０１％～６％の減少である。

【0190】

本明細書に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴは、ある特定の抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８、又は前述のいずれかの誘導体）に対する耐性を付与する。特定の実施形態では、細胞による本明細書に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの発現は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８、又は前述のいずれかの誘導体）の存在下で細胞が増殖することを可能にする。いくつかの実施形態では、変異体ＮＰＴ又は非天然型ＮＰＴは、以下の第８節に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0191】

７．２核酸配列
一態様では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体をコードする核酸が提供される。特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。別の特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載の非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。コードの縮重に起因して、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする任意のヌクレオチド配列は、本開示に包含される。ある特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている（例えば、特定の対象又は特定の対象由来の細胞における発現のためにコドン最適化されている）。当該分野で既知の技術を使用して、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列をコドン最適化することができる。核酸配列又はヌクレオチド配列は、１つ又は２つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸配列又はヌクレオチド配列は、以下：プロモーター、エンハンサー、イントロン、及びポリ－Ａ配列のうちの１つ、２つ若しくはそれ以上、又は全てを更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸配列又はヌクレオチド配列は、プロモーター及び複製起点配列を更に含んでもよい。

【0192】

特定の実施形態では、核酸配列又はヌクレオチド配列は、それが天然に見出される核酸配列から単離される。ある特定の実施形態では、核酸配列又はヌクレオチド配列は、それが天然に見出される生物から単離される。更に、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸配列は、組換え技術によって製造された場合には、他の細胞物質若しくは培養培地を実質的に含まなくてもよいか、又は化学合成された場合には、化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。例えば、「実質的に含まない」という文言には、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、又は０．１％未満）（特に約１０％未満）の他の物質、例えば、細胞物質、培養培地、他の核酸分子、化学前駆体及び／又は他の化学物質を有するポリヌクレオチド又は核酸分子の調製物が含まれる。

【0193】

本明細書で使用される場合、「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボヌクレオチド、及びリボ核酸、並びにそれらのポリマー形態を含み、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかを含む。ある特定の実施形態では、「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、例えば、参照核酸と同様の結合特性を有するペプチド核酸（peptide nucleic acid、「ＰＮＡ」）を含む。いくつかの実施形態では、「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）を指す。他の実施形態では、「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はＲＮＡ）を指す。

【0194】

ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。

【0195】

ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号３４のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供される。

【0196】

ある特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸配列が提供される。第２のヌクレオチド配列は、目的のタンパク質若しくは非コードＲＮＡをコードし得るか、又は宿主細胞中の内因性遺伝子を破壊するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸配列が提供される。ある特定の実施形態では、核酸配列は、追加のヌクレオチド配列（例えば、トランスポゾンエレメント）を更に含み得る。核酸配列は、１つ又は２つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、複製起点、及び／又はポリ－Ａ配列を更に含み得る。ある特定の実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列は、同じプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結される。

【0197】

ある特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列、目的の遺伝子の第１の断片の第２のヌクレオチド配列、及び目的の遺伝子の第２の断片の第３のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供され、第２のヌクレオチド配列は５’末端で第１のヌクレオチド配列に隣接し、第３のヌクレオチド配列は３’末端で第１のヌクレオチド配列に隣接し、第１及び第２の断片は目的の遺伝子の組換え及び破壊を促進する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、第２のヌクレオチド配列の上流にｌｏｘＰヌクレオチド配列、及び第３のヌクレオチド配列の下流にｌｏｘＰヌクレオチド配列を更に含む。このような核酸配列を産生し、使用することができる方法に関しては、例えば、Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（１３）：２５１９－２５２４（１９９６）を参照されたい。核酸配列は、１つ又は２つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、ポリ－Ａ配列などを更に含んでもよい。

【0198】

ある特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、第１のトランスポザーゼ配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び第２のトランスポザーゼ配列を含む第４のヌクレオチド配列を含む核酸配列が提供され、第３のヌクレオチド配列は、第１及び第２のヌクレオチド配列の上流にあり、第４のヌクレオチド配列は、第１及び第２のヌクレオチド配列の下流にある。いくつかの実施形態では、第１のトランスポザーゼ配列は、Ｌｅａｐ－Ｉｎ左トランスポザーゼであり、第２のトランスポザーゼは、Ｌｅａｐ－Ｉｎトランスポザーゼである。核酸配列は、１つ又は２つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、複製起点、及び／又はポリ－Ａ配列を更に含み得る。

【0199】

特定の実施形態では、核酸配列は、以下の第８節に記載されるものである。

【0200】

特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、導入遺伝子と、を含む、核酸配列が提供される。導入遺伝子は天然遺伝子配列であってもよいか、又は例えば、特定の宿主細胞における発現に適合させるためのコドン最適化を含むように修飾されていてもよい。導入遺伝子は、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、導入遺伝子は、１つ又は２つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に作動可能に連結されている。

【0201】

目的のタンパク質は、例えば、治療用タンパク質又は検出可能なマーカーであり得る。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ホルモン、増殖因子、抗体、ウイルスタンパク質、酵素、サイトカイン、又はそれらの断片である。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、又は少なくとも１２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、抗原（例えば、ウイルス、細菌、真菌、又は癌抗原）である。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、又はウイルス複製に必要なタンパク質などのウイルスタンパク質である。ウイルスタンパクは、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又はバキュロウイルスタンパクであってもよい。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ペプチド又はポリペプチドであり、これは、治療アッセイとして、又は診断アッセイにおいて有用であり得る。

【0202】

非コードＲＮＡは、例えば、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（microRNA、ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（short hairpin RNA、ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ、触媒ＲＮＡ（例えば、リボザイムを含む）、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのガイドＲＮＡであり得る。

【0203】

本明細書で提供される核酸配列のいくつかの実施形態では、核酸配列は、ＮＰＴタンパク質以外の選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列を更に含む。選択可能マーカーは、細胞に導入されると、人工的選択に好適な形質を付与する。選択可能マーカーは、例えば、抗生物質に対する耐性を付与し得るか、又は特定の培養条件下での真核細胞の増殖に必要な酵素をコードし得る。選択可能マーカーは、当該技術分野において周知である。ある特定の実施形態では、選択可能マーカーは、アンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼである。いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、「選択性マーカー」という用語は、「選択可能マーカー」と互換的に使用される。

【0204】

使用され得る選択マーカーとしては、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２２：８－１７（１９８０））が挙げられ、遺伝子は、それぞれ、ｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、又はａｐｒｔ－細胞で利用することができる。また、代謝拮抗剤耐性も、以下の遺伝子の選択基準として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｍｄ ｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。

【0205】

７．３ベクター
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含むベクターが提供される。特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載の核酸配列又はヌクレオチド配列（例えば、第７．２節又は第８節）を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む、ベクターが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列、目的の遺伝子の第１の断片の第２のヌクレオチド配列、及び目的の遺伝子の第２の断片の第３のヌクレオチド配列を含むベクターが提供され、第２のヌクレオチド配列は５’末端で第１のヌクレオチド配列に隣接し、第３のヌクレオチド配列は３’末端で第１のヌクレオチド配列に隣接し、第１及び第２の断片は目的の遺伝子の組換え及び破壊を促進する。いくつかの実施形態では、ベクターは、第２のヌクレオチド配列の上流にｌｏｘＰヌクレオチド配列、及び第３のヌクレオチド配列の下流にｌｏｘＰヌクレオチド配列を更に含む。

【0206】

特定の実施形態では、ベクターは、以下の第８節に記載されるベクターである。

【0207】

本開示を考慮して、当業者に既知である任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモーターは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において既知であり、細胞内でタンパク質又は非コードＲＮＡを生成するために、本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術又は人工遺伝子合成を使用して、本明細書に提供される実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。このような技術は、本開示の観点から、当業者に周知である。

【0208】

ある特定の実施形態では、ベクターは、ＮＰＴ変異体をコードする核酸を含むクローニングベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド、エピソーム、又は細菌人工染色体であり得る。本明細書に包含される発現ベクターを含むベクターについては第７．４節も参照されたい。

【0209】

７．４ＮＰＴ変異体を発現するための方法
一態様では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ、及び任意選択で、１つ又は２つ以上の追加のタンパク質又は非コードＲＮＡを生成するための方法が提供される。

【0210】

ある特定の態様では、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ、及び任意選択で、１つ若しくは２つ以上の追加のタンパク質又は１つ若しくは２つ以上の非コードＲＮＡ、あるいは両方を発現する（例えば、組換えにより発現する）細胞（例えば、宿主細胞）が提供される。別の態様では、本明細書において、核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）が提供され、核酸配列は、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列、及び任意選択で、宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）における組換え発現のための１つ若しくは２つ以上の追加のタンパク質若しくは非コードＲＮＡ、又は両方をコードする１つ又は２つ以上のヌクレオチド配列を含む。また、本明細書において、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチドを含む核酸配列、及び任意選択で、１つ若しくは２つ以上の追加のタンパク質若しくは非コードＲＮＡ、又は両方をコードする１つ又は２つ以上のヌクレオチド配列を含む宿主細胞も提供される。特定の実施形態では、本明細書において、２つのベクターを含む宿主細胞が提供され、第１のベクターは、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含み、第２のベクターは、１つ若しくは２つ以上の追加のタンパク質又は１つ若しくは２つ以上の非コードＲＮＡ、あるいは両方をコードする１つ又は２つ以上のヌクレオチド配列を含む、核酸配列を含む。

【0211】

使用され得る細胞の例としては、本節並びに以下の第７．５節及び第８節に記載されるものが挙げられる。細胞は、初代細胞又は細胞株であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、他の細胞から単離される。別の実施形態では、宿主細胞は、対象の体内に見出されない。細胞又は身体の文脈における「対象」という用語は、任意の生物（例えば、細菌又は哺乳類）を指す。対象は、ヒト又は非ヒト哺乳類であり得る。

【0212】

ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ、及び任意選択で、１つ若しくは２つ以上の追加のタンパク質又は１つ若しくは２つ以上の非コードＲＮＡ、あるいは両方は、例えば、化学合成又は組換え発現技術などの当該技術分野で既知の任意の方法によって生成することができる。本明細書に記載の方法は、別段の指示がない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子分析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当該技術分野の技術の範囲内の関連分野における従来の技術を利用する。これらの技術は、本明細書に引用された参考文献に記載されており、文献において十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

【0213】

タンパク質（例えば、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ、及び任意選択で、目的のタンパク質）は、組換え及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせを含む、当該技術分野で既知の多種多様な技術を使用して調製することができる。ファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０、Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２－９５８、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｇｅｎｅ １８７：９－１８、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１－２８０、国際出願第ＧＢ９１／０１１３４号、国際公開第９０／０２８０９号、同第９１／１０７３７号、同第９２／０１０４７号、同第９２／１８６１９号、同第９３／１１２３６号、同第９５／１５９８２号、同第９５／２０４０１号、及び同第０９７／１３８４４号、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号において開示されているファージディスプレイ法が挙げられる。

【0214】

発現ベクターは、従来の技術によって細胞（例えば、宿主細胞）に移入することができ、次いで、得られた細胞を従来の技術によって培養して、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴを生成することができ、任意選択で、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡを精製又は単離することができる。ベクター（例えば、発現ベクター）又は核酸配列若しくはヌクレオチド配列は、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、熱ショック、マイクロインジェクション、染色体移入、又は当業者に既知の任意若しくは技術によって、細胞（例えば、宿主細胞）に導入することができる。

【0215】

種々の宿主－発現ベクター系を利用して、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ、及び任意選択で、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡを発現させることができる。そのような宿主－発現系は、目的のコード配列が生成され、続いて精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクションされた場合に、本明細書に記載されるタンパク質をインサイチュで発現し得る細胞も表す。これらには、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物、組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、cauliflower mosaic virus、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、tobacco mosaic virus、ＴＭＶ）に感染した、若しくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの緑藻類、若しくはタバコ植物）、又は哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７０３０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、及びＮＩＨ ３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0216】

細菌系では、発現ベクターの数は、発現させる非コードＲＮＡの目的のタンパク質の意図する用途に応じて有利に選択され得る。昆虫系では、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus、ＡｃＮＰＶ）が使用され得る。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。哺乳類の宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が利用され得る。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、目的のタンパク質は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部リーダー配列にライゲーションされ得る。次いで、インビトロ又はインビボにおける組換えにより、このキメラ遺伝子は、アデノウイルスゲノム内に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅｌ又はＥ３）に挿入することで、生存能力があり、感染した宿主において目的のタンパク質を発現可能な組換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５－３５９を参照されたい）。また、挿入されたコード配列を効率的に翻訳するためには、特定の開始シグナルが必要となり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接する配列が含まれる。更に、挿入全体の翻訳を確実にするためには、開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームと一致している必要がある。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１－５４４を参照されたい）。

【0217】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、例えば、初代細胞、又は細胞株由来の細胞といった任意の種類の細胞を指す。宿主細胞は、線維芽細胞、リンパ球（例えば、Ｂ又はＴ細胞）、上皮細胞、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、肝細胞、筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、又は幹細胞（例えば、胚性幹細胞）などの初代細胞であってもよい。代替的に、宿主細胞は不死化細胞であってもよい。特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、核酸配列若しくはヌクレオチド配列をトランスフェクト、感染、マイクロインジェクション、若しくは形質転換された細胞、又は核酸配列若しくはヌクレオチド配列を含むように操作された細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指す。そのような細胞の子孫は、核酸配列又はヌクレオチド配列でトランスフェクトされた親細胞とは、宿主細胞ゲノムへの核酸配列又はヌクレオチド配列の後続の生成又は組み込みにおいて生じ得る、変異又は環境からの影響により、同一ではないことがある。

【0218】

更に、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及び処理（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後の処理及び修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株又は宿主系を選択することで、発現した外来タンパク質を正しく修飾及び処理することができる。そのためには、一次転写物の適切な処理、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（マウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７０３０、並びにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0219】

組換えタンパク質を長期間、高収率で産生するためには、安定した発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカー（例えば、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ）によって制御される核酸配列（例えば、ＤＮＡ）で、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、富化培地中で一定期間（例えば、１～２日）増殖させることができ、次いで、選択培地（例えば、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの場合、ネオマイシン、カナマイシン又はＧ４１８などの抗生物質を含む培地）に切り替えられる。組換えプラスミドの選択可能マーカーは、選択（例えば、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの場合、ネオマイシン、カナマイシン又はＧ４１８）に耐性を付与し、細胞が、染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成することを可能にし、次にこの増殖巣は、クローン化して細胞株に増殖することができる。この方法は、タンパク質を発現する細胞株を操作するのに有利に使用することができる。

【0220】

ある特定の実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を生成するための方法であって、当該方法が、（ａ）第１の宿主細胞集団に、（ｉ）ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）と、を含む、第１の核酸配列を導入することと、（ｂ）第１の宿主細胞集団を、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、（ｃ）カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８の存在下で増殖する細胞のコロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を生成するための方法であって、当該方法が、（ａ）カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体の存在下で第１の宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、第１の核酸配列が、第１の宿主細胞集団に導入され、第１の核酸配列が、（ｉ）ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）と、を含む、生成することと、（ｂ）カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも少ないコロニー及び／又は小さいコロニーを生成し、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも、５０～１００、１００～１，０００、１，０００～５，０００、５，０００～１０，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１５，０００、５，０００～１５，０００、１５，０００～２５，０００、１０，０００～２５，０００倍少ないコロニーを生成し、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、より高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、より高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１，０００倍高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。コピー数は、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して決定することができる（例えば、コピー数は、宿主細胞のゲノム中の単一コピー内在性遺伝子に対する第２のヌクレオチド配列の存在量を測定するためにデジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定することができる）。第２のヌクレオチド配列の発現は、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＲＮＡレベルで、又はイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット又は免疫細胞化学）によってタンパク質レベルで評価することができる。更に、第２のヌクレオチド配列によってコードされたいくつかのタンパク質に関して、タンパク質の活性（例えば、酵素活性）を評価することができる。

【0221】

ある特定の実施形態では、本明細書において、導入遺伝子を含む宿主細胞を生成するための方法であって、（ａ）第１の宿主細胞集団に、（ｉ）ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）導入遺伝子と、を含む、第１の核酸配列を導入することと、（ｂ）第１の宿主細胞集団を、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、（ｃ）カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８の存在下で増殖する細胞のコロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、導入遺伝子を含む宿主細胞を生成するための方法であって、当該方法が、（ａ）カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体の存在下で第１の宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、第１の核酸配列が、第１の宿主細胞集団に導入され、第１の核酸配列が、（ｉ）ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）導入遺伝子と、を含む、生成することと、（ｂ）カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、かつカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも少ないコロニー及び／又は小さいコロニーを生成する。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、かつカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも、１０～１００、１００～１，０００、１，０００～５，０００、５，０００～１０，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１５，０００、５，０００～１５，０００、１５，０００～２５，０００、１０，０００～２５，０００倍少ないコロニーを生成する。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、より高いコピー数の第１の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍高いコピー数の第１の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、より高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成する。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成する。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列であって、当該第２の核酸配列が野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される導入遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１，０００倍高いレベルの導入遺伝子の発現を達成する。コピー数は、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して決定することができる（例えば、コピー数は、宿主細胞のゲノム中の単一コピー内在性遺伝子に対する導入遺伝子の存在量を測定するためにデジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定することができる）。導入遺伝子の発現は、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＲＮＡレベルで、又はイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット又は免疫細胞化学）によってタンパク質レベルで評価することができる。更に、導入遺伝子によってコードされたいくつかのタンパク質に関して、タンパク質の活性（例えば、酵素活性）を評価することができる。

【0222】

ある特定の実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を生成するための方法であって、当該方法が、（ａ）第１の宿主細胞集団に、（１）ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（２）第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む第２の核酸配列と、を導入することと、（ｂ）第１の宿主細胞集団を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、（ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を生成するための方法であって、当該方法が、（ａ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で第１の宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、第１の核酸配列及び第２の核酸配列が、第１の宿主細胞集団に導入され、第１の核酸配列が、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第２の核酸配列が、第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む、生成することと、（ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも少ないコロニー及び／又は小さいコロニーを生成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも、５０～１００、１００～１，０００、１，０００～５，０００、５，０００～１０，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１５，０００、５，０００～１５，０００、１５，０００～２５，０００、１０，０００～２５，０００倍少ないコロニーを生成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第３の核酸配列及び／又は第４の核酸配列のコピー数と比較して、より高いコピー数の第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列を含み、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第３の核酸配列及び／又は第４の核酸配列のコピー数と比較して、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列を含み、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第３の核酸配列及び／又は第４の核酸配列のコピー数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列のコピー数を含み、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、より高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１，０００倍高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、第２のヌクレオチド配列を含む。コピー数は、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して決定することができる（例えば、コピー数は、宿主細胞のゲノム中の単一コピー内在性遺伝子に対する第２のヌクレオチド配列の存在量を測定するためにデジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定することができる）。第２のヌクレオチド配列の発現は、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＲＮＡレベルで、又はイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット又は免疫細胞化学）によってタンパク質レベルで評価することができる。更に、第２のヌクレオチド配列によってコードされたいくつかのタンパク質に関して、タンパク質の活性（例えば、酵素活性）を評価することができる。

【0223】

ある特定の実施形態では、本明細書において、導入遺伝子を含む宿主細胞を生成するための方法であって、当該方法が、（ａ）第１の宿主細胞集団に、（１）ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（２）導入遺伝子（例えば、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子）を含む第２の核酸配列と、を導入することと、（ｂ）第１の宿主細胞集団を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、（ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、導入遺伝子を含む宿主細胞を生成するための方法であって、当該方法が、（ａ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で第１の宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、第１の核酸配列及び第２の核酸配列が、第１の宿主細胞集団に導入され、第１の核酸配列が、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第２の核酸配列が、導入遺伝子（例えば、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子）を含む、生成することと、（ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも少ないコロニーを生成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも、１００～１，０００、１，０００～５，０００、５，０００～１０，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１５，０００、５，０００～１５，０００、１５，０００～２５，０００、１０，０００～２５，０００倍少ないコロニーを生成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第３の核酸配列及び／又は第４の核酸配列のコピー数と比較して、より高いコピー数の第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列を含み、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第３の核酸配列及び／又は第４の核酸配列のコピー数と比較して、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列を含み、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第３の核酸配列及び／又は第４の核酸配列のコピー数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列のコピー数を含み、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される導入遺伝子の発現レベルと比較して、より高いレベルの導入遺伝子の発現を達成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される導入遺伝子の発現レベルと比較して、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高いレベルの導入遺伝子の発現を達成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞集団は、第３の核酸配列及び第４の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される導入遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１，０００倍高いレベルの導入遺伝子の発現を達成し、第３の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、第４の核酸配列は、導入遺伝子を含む。コピー数は、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して決定することができる（例えば、コピー数は、宿主細胞のゲノム中の単一コピー内在性遺伝子に対する導入遺伝子の存在量を測定するためにデジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定することができる）。導入遺伝子の発現は、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＲＮＡレベルで、又はイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット又は免疫細胞化学）によってタンパク質レベルで評価することができる。更に、導入遺伝子によってコードされたいくつかのタンパク質に関して、タンパク質の活性（例えば、酵素活性）を評価することができる。

【0224】

特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴは、第７．１節又は第８節に記載されたものである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、第７．２節に記載されているものである。

【0225】

組換えＤＮＡ技術の分野で当該技術分野で一般に知られている方法を、規定どおりに適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法については、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、及びＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。

【0226】

宿主細胞は、本明細書に記載される２つ又は３つ以上の発現ベクターで同時トランスフェクトされ得る。２つのベクターは、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡの等しい発現を可能にする同一の選択可能マーカー（例えば、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ）を含有することができる。宿主細胞は、異なる量の２つ又は３つ以上の発現ベクターで同時トランスフェクトされ得る。例えば、宿主細胞は、以下の比の第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターのいずれか１つでトランスフェクトされ得る：１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、又は１：５０。

【0227】

代替的に、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ及び目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードし、発現することができる単一のベクターを使用することができる。発現ベクターは、モノシストロン性又はマルチシストロン性であり得る。マルチシストロン性核酸構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上、又は２～５、５～１０若しくは１０～２０個の範囲の遺伝子／ヌクレオチド配列をコードすることができる。例えば、バイシストロン性核酸構築物は、以下の順序で、プロモーター、第１の遺伝子（例えば、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ）、及び第２の遺伝子（例えば、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡ）を含むことができる。このような発現ベクターにおいて、両方の遺伝子の転写は、プロモーターによって駆動され得るが、第１の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性スキャニング機構によるものであり得、第２の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ非依存性機構、例えば、ＩＲＥＳによるものであり得る。

【0228】

本明細書に記載される目的のタンパク質が、組換え発現により産生されると、これは、タンパク質を精製するための当該技術分野で既知である任意の方法、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、特に、プロテインＡクロマトグラフィの後における特異的抗原についての親和性クロマトグラフィ、及びサイズ除外カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差的可溶性によって、又はタンパク質を精製するための他の任意の標準的な技法によって、精製され得る。更に、目的のタンパク質は、精製を容易にするために、当該分野で既知の異種ポリペプチド配列（例えば、Ｆｌａｇタグ又はＨｉｓタグ）に融合され得る。

【0229】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ、又は目的のタンパク質）は、単離又は精製される。一般に、単離されたタンパク質は、単離されたタンパク質以外の他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質である。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質の調製物は、細胞物質及び／又は化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、タンパク質が、それが単離されるか又は組換えにより生成される細胞の細胞成分から分離されている、本明細書に記載されるタンパク質の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まない本明細書に記載のタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、又は０．１％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称される）及び／又はタンパク質のバリアント、例えば、タンパク質の異なる翻訳後修飾形態又はタンパク質の他の異なるバージョンを有するタンパク質の調製物を含む。タンパク質が組換えにより生成される場合、それはまた、一般に、培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、又は０．１％未満に相当する。タンパク質が化学合成によって生成された場合、これは一般に化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、タンパク質の合成に関与した化学的前駆体又は他の化学物質から分離されている。したがって、タンパク質のこのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量で）未満の化学的前駆体又は目的のタンパク質以外の化合物を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質は、単離又は精製される。

【0230】

７．５細胞
別の態様では、本明細書において、宿主細胞が提供される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書（例えば、第７．２節又は第８節）に記載の核酸配列又はヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号２０を含む核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号３２を含む核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号３３を含む核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号３４を含む核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号３６を含む核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号３７を含む核酸配列を含む。

【0231】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書（例えば、第７．１節又は第８節）に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書（例えば、第７．１節又は第８節）に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴを発現する。

【0232】

本明細書（例えば、第７．４節又は第８節）に記載される任意の宿主細胞又は本開示を考慮して当業者に既知の任意の宿主細胞は、本明細書（例えば、第７．１節又は第８節）に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの組換え発現に使用することができる。例えば、そのような宿主細胞を培養して、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ及び導入遺伝子をコードする核酸配列が細胞に導入された場合に、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ及び導入遺伝子を同時発現させることができる。例えば、宿主細胞の例については、第７．４節及び第８節を参照されたい。

【0233】

ある特定の実施形態では、細胞（例えば、宿主細胞）は、インビトロ又はエクスビボ細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列によってトランスフェクト又は形質転換されていない細胞から単離される。宿主細胞は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野で既知の任意の種類の細胞であり得る。

【0234】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌又は真核細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、酵母、昆虫、哺乳類又は植物細胞である。宿主細胞が細菌細胞である実施形態では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。例示的なＥ．ｃｏｌｉ細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１又はＢＬ２１細胞であり得るが、これらに限定されない。

【0235】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞株由来である。好適な哺乳類細胞には、例えば、ＣＨＯ及びＨＥＫ２３９細胞、並びにそれらのバリアント（例えば、ＣＨＯ－ＤＧ４４又はＣＨＯ－Ｋ１細胞）が含まれる。

【0236】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、不死化細胞株である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である。

【0237】

特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば、限定されないが、線維芽細胞又は血液細胞（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞）などの初代細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、胚性幹細胞である。

【0238】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、植物細胞である。

【0239】

培養不死化細胞は、細胞に導入された核酸が宿主細胞ゲノムに組み込まれるかどうかに依存して、短期間（一過性）又は長期間（安定）発現のために、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする核酸でトランスフェクトすることができる。一過性のＤＮＡ発現は典型的には２４～７２時間続くが、安定なＤＮＡ発現は潜在的にタンパク質の永続的な過剰発現を可能にする。

【0240】

特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、組換え核酸配列が効果的に発現するように、化学的トランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞に導入される。

【0241】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列は、細胞（例えば、宿主細胞）のゲノムに安定的に組み込まれる。核酸配列又はヌクレオチド配列は、細胞（例えば、宿主細胞）のゲノムにランダムに組み込まれ得る。代替的に、核酸配列又はヌクレオチド配列は、細胞（例えば、宿主細胞）のゲノムの特定の位置に組み込まれ得る。核酸配列又はヌクレオチド配列の複数のコピーを細胞のゲノムに組み込むことができる。（例えば、宿主細胞）。例えば、宿主細胞は、そのゲノムに組み込まれた核酸配列又はヌクレオチド配列の５、１０、１５、２０、２５又はそれ以上のコピーを含有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書（例えば、第７．２節）に記載されるものである。

【0242】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞であり、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴ、及び任意選択で、導入遺伝子をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列は、トランスフェクション、形質導入、感染、マイクロインジェクション又は染色体移入によって細胞に導入される。

【0243】

いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、目的のタンパク質又は本明細書（例えば、第７．２節）に記載される非コードＲＮＡをコードする。

【0244】

特定の実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、より高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞の集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、２～２０倍、２～１００倍、２～５００倍、２～１０００倍、５０～１００倍、５０～５００倍、５０～１０００倍、又は５００～１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、より高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される第２のヌクレオチド配列の発現レベルと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１，０００倍高いレベルの第２のヌクレオチド配列の発現を達成し、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。コピー数は、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して決定することができる（例えば、コピー数は、宿主細胞のゲノム中の単一コピー内在性遺伝子に対する第２のヌクレオチド配列の存在量を測定するためにデジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定することができる）。第２のヌクレオチド配列の発現は、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＲＮＡレベルで、又はイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット又は免疫細胞化学）によってタンパク質レベルで評価することができる。更に、第２のヌクレオチド配列によってコードされたいくつかのタンパク質に関して、タンパク質の活性（例えば、酵素活性）を評価することができる。

【0245】

特定の実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、より高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の宿主細胞集団によって達成される第２の核酸配列のコピー数と比較して、２～２０倍、２～１００倍、２～５００倍、２～１０００倍、５０～１００倍、５０～５００倍、５０～１０００倍、又は５００～１０００倍高いコピー数の第１の核酸配列を含み、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される導入遺伝子の発現レベルと比較して、より高いレベルの導入遺伝子の発現を達成し、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される導入遺伝子の発現レベルと比較して、５～２５倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１，０００倍、又は５～１０００倍高いレベルの導入遺伝子の発現を達成し、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた第１の宿主細胞集団は、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換された第２の細胞集団によって達成される導入遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１，０００倍高いレベルの導入遺伝子の発現を達成し、第１の細胞集団は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む第１の核酸配列を含み、第２の核酸配列は、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び導入遺伝子を含む。コピー数は、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して決定することができる（例えば、コピー数は、宿主細胞のゲノム中の単一コピー内在性遺伝子に対する導入遺伝子の存在量を測定するためにデジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定することができる）。導入遺伝子の発現は、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＲＮＡレベルで、又はイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット又は免疫細胞化学）によってタンパク質レベルで評価することができる。更に、導入遺伝子によってコードされたいくつかのタンパク質に関して、タンパク質の活性（例えば、酵素活性）を評価することができる。

【0246】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書（例えば、第７．２節）に記載されるものである。いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴは、本明細書（例えば、第７．１節又は第８節）に記載されるものである。

【0247】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列を含むウイルス細胞産生細胞株である。ウイルス産生細胞株は、カプシドタンパク質若しくは他の表面タンパク質（例えば、エンベロープタンパク質）、複製に必要なタンパク質、又は両方を発現し得る。好適なウイルス産生細胞株は、ＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又はバキュロウイルス用であり得る。ウイルス産生細胞株は、例えば、遺伝子治療又はワクチン接種目的のためにウイルスを生成するために使用され得る。

【0248】

特定の実施形態では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含むウイルス産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質であって、当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質、若しくはエンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又は両方である、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む、ウイルス産生細胞株が提供される。

【0249】

いくつかの実施形態では、ウイルス産生細胞株は、配列番号２０、３２、３３、３４、３６、又は３７のいずれか１つのＮＰＴ変異核酸配列を含む。

【0250】

本明細書で提供されるウイルス産生細胞株のある特定の実施形態では、コードされる１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、アデノウイルス複製に必要とされるアデノウイルスＥ１領域タンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質、レトロウイルスｇａｇタンパク質、若しくはレトロウイルス逆転写酵素、又はそれらの組み合わせであり得る。例えば、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質は、レトロウイルスエンベロープタンパク質、ｇａｇタンパク質及び逆転写酵素であり得る。

【0251】

別の実施形態では、本明細書において、１つ又は２つ以上の核酸配列を含む抗原産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）であって、当該非天然型ＮＰＴが、（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴをコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）１つ又は２つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、抗原産生細胞株が提供される。

【0252】

いくつかの実施形態では、抗原産生細胞株は、配列番号２０、３２、３３、３４、３６、及び３７のいずれか１つのＮＰＴ変異核酸配列を含む。

【0253】

ある特定の実施形態では、抗原産生細胞株は、ウイルス抗原、細菌抗原、又は真菌抗原をコードする核酸配列を含む。他の実施形態では、抗原産生細胞株は、癌抗原をコードする核酸配列を含む。

【0254】

ある特定の実施形態では、本明細書において、非天然型ＮＰＴであって、当該非天然型ＮＰＴが、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼと比較して減弱されており、当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、及び４３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、非天然型ＮＰＴを発現するインビトロ又はエクスビボ細胞が提供される。

【0255】

宿主細胞が、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞である特定の実施形態では、細菌細胞は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。

【0256】

宿主細胞が、本明細書で提供されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列をトランスフェクトされた哺乳類細胞である特定の実施形態では、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する。

【0257】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１の核酸配列と、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２の核酸配列と、を含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡは、本明細書（例えば、第７．２節）に記載されるものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞又は宿主細胞集団は、本明細書（例えば、第７．４節又は第８節）に記載される方法によって生成される。

【0259】

７．６使用方法
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴ、又は本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列は、当業者が野生型ＮＰＴを使用する任意の方法で使用される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴ、又は本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列は、当業者によって選択可能なマーカーが使用される任意の方法で使用される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴ、又は本明細書に記載されるＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるように使用される。

【0260】

特定の実施形態では、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）を使用して、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列及び外因性配列を含む核酸配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）を選択し、この宿主細胞は染色体に安定に組み込まれた外因性配列を有する。トランスフェクション、形質導入、感染、マイクロインジェクション又は染色体移入を使用して、核酸配列を宿主細胞に導入することができる。この方法論は、目的のタンパク質を発現させるために、又は挿入変異誘発によって（例えば、相同組換え又はトランスポゾン挿入によってＤＮＡを挿入することによって）遺伝子を破壊するために使用され得る。

【0261】

特定の実施形態では、安定なエピソーム（ＥＢＮＡ１ ＯｒｉＰ配列を含有し、ＥＢＮＡ１及びＮＰＴ変異体又は本明細書に記載の非天然型ＮＰＴを発現するものなどの、複製する非組み込みプラスミド）を多数有する宿主細胞は、例えば、ネオマイシン、カナマイシン又はＧ４１８を使用して選択することができる。ある特定の実施形態では、高コピー数は、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列がＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの代わりに使用される場合に達成されるよりも、５～１０倍、５～１５倍、２～５倍、２～１０倍、２～１５倍、又は１０～２０倍、１０～５０倍、１０～１００倍、５０～１００倍、５０～２００倍、５０～５００倍、１００～５００倍、１００～１０００倍、５００～１０００倍、又は２～１０００倍高い。

【0262】

特定の実施形態では、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）とともに宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）の短期培養を使用して、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴを発現する構築物、及びＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴを発現する構築物が組み込まれていないタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする他の同時トランスフェクト核酸配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を受け取った細胞を濃縮することができる。例えば、いくつかの細胞はトランスフェクトすることが困難であり、ＮＰＴ遺伝子を受け取って発現した細胞を濃縮することは、同時トランスフェクトされたＣｒｉｓｐｒ構築物を受け取った細胞も濃縮することができ、したがって、所望の修飾（例えば、遺伝子ノックアウト）を有する細胞を同定するためのスクリーニングの必要性を減少させる。

【0263】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴを発現するように操作された宿主細胞を使用して、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８又はそれらの誘導体を使用して遺伝子増幅を受けた宿主細胞を選択してもよい。例えば、ＤＨＦＲの阻害剤をこのように使用して、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞）中に組み込まれた導入遺伝子を含有する染色体領域を「増幅」することができる。

【0264】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列は、ヒトハムスターハイブリッドの作製又は細胞融合による細胞間の染色体の移動などの染色体移動によって細胞株を作製する場合に、選択遺伝子として使用されてもよい。

【0265】

特定の実施形態では、胚性幹細胞は、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含むように操作され、ｎｐｔ遺伝子は、胚性幹細胞における相同組換え中に染色体に導入され（ヘテロ接合挿入を作製する）、不分離現象によって２つのノックアウト染色体を受け継いだまれな細胞を選択するために、より高い濃度のＧ４１８が使用され得る。これは、最初に細胞をマウスに導入し、マウスを繁殖させてホモ接合体を生成する必要なく、インビトロ又はインビボでの細胞の特徴付けによるノックアウト表現型のいくつかの分析を可能にする。

【0266】

特定の実施形態では、宿主細胞における高度に活性な遺伝子プロモーターは、スプライスアクセプターの下流に配置されたプロモーターのないＮＰＴ変異ヌクレオチド遺伝子又は非天然型ＮＰＴ遺伝子で操作されたトランスポゾンを使用するゲノムワイドスクリーニングによって同定され得る。ＮＰＴ発現を活性化する非常に活性なプロモーターを有する遺伝子に挿入されるトランスポゾンは、適切なレベルのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）を使用して選択することができる。続いて、生存細胞中のトランスポゾン挿入部位を特徴付けることによって、関連遺伝子及びプロモーターの同一性を同定することができる。

【0267】

特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列及び１つ又は２つ以上の共有結合した追加のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞（例えば、細菌）は、適切なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体）とともに細胞を培養することによって選択され得る。ＮＰＴ遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、クローニングベクター、ウイルス又は宿主細胞中のゲノム挿入物中に存在してもよい。

【0268】

特定の実施形態では、細菌においてのみ発現されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを使用して、例えば、レンチウイルス又はＡＡＶを含む遺伝子治療産物を作製してもよい。ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの高度に減弱された性質は、遺伝子の活性が非常に低いため、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列の任意の異常なパッケージング及び患者への送達を非常に安全にする。

【0269】

特定の実施形態では、ＤＮＡのコンカテマーは、例えば、目的の遺伝子及びＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む直鎖状断片を細菌複製起点を有する断片にライゲーションし、宿主細胞を形質転換し、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、若しくはＧ４１８、又はそれらの誘導体を使用して、一緒にライゲーションされた遺伝子の複数のコピーを有する生存細胞を選択することによって作製することができる。これは、哺乳類宿主細胞に送達され得、宿主染色体へのより高い頻度の多コピー挿入を生じ得る遺伝子の頭－尾アレイを生成するために使用され得る。

【0270】

特定の実施形態では、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ４１８及び他のＮＰＴ基質が細胞（例えば、酵母、細菌、昆虫細胞、動物細胞、植物及びこれらの生物の任意の病原体）に対して毒性である任意の場所で使用されてもよい。

【0271】

いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列は、第８節に記載されるように使用される。

【0272】

７．７キット
別の態様では、本明細書において、キットが提供される。一実施形態では、本明細書で提供されるキットは、容器内に、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、容器内に、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）を含む。別の実施形態では、キットは、容器内に、ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムライブラリー又は個々のクローンを含む。いくつかの実施形態では、ＮＰＴ変異核酸配列は、第７．２節又は第８節に記載されるものである。ある特定の具体的な実施形態では、ＮＰＴ変異核酸配列は、配列番号２０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キットは、容器内に、ネオマイシン、カナマイシン、若しくはＧ４１８、又は前述のいずれかの誘導体を更に含む。ある特定の実施形態では、キットは、容器内に、ＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列、又はＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列若しくはヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）を導入することができる細胞（例えば、宿主細胞）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、容器内に、ＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列、又はＮＰＴ変異体若しくは非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列若しくはヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）を導入することができる細胞（例えば、宿主細胞）を更に含む。

【0273】

ある特定の実施形態では、本明細書において、容器内に、核酸配列であって、当該核酸配列がＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列を含むベクターを含むキットが提供される。ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド、又は細菌人工染色体であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書において、容器内に、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムライブラリー、又は核酸配列であって、当該核酸配列がＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列を含む個々のクローンを含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、容器内に、ネオマイシン、カナマイシン、若しくはＧ４１８、又は前述のいずれかの誘導体を更に含む。

【0274】

いくつかの実施形態では、キットは、容器内に、本明細書に記載されるＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの断片をコードする合成ＤＮＡ断片又は生細胞中で増殖していない断片を含む。ＮＰＴ変異体又は非天然型ＮＰＴの２つ又は３つ以上の相補的断片は、ベクター中の別々の部分であってもよく、ＮＰＴ変異体遺伝子又は非天然型ＮＰＴは、宿主細胞に導入された場合、別々の部分から再構成される。

【0275】

いくつかの実施形態では、本明細書において、容器内に、本明細書に記載される宿主細胞を含むキットが提供される。

【実施例】

【0276】

８．１実施例１：減少した活性を有するＮＰＴ変異体の同定
本実施例は、ＮＰＴ変異体がどのように作製され、減少したホスホトランスフェラーゼ活性についてスクリーニングされたかを記載する。

【0277】

プラスミド発現ベクターの構築
プラスミドベクターＰ３１３を構築した（図１、配列番号２）。これは、ヒト伸長因子アルファプロモーター及び第１のイントロン（配列番号３）、ｍＣｈｅｒｒｙコード領域（配列番号４）、並びにＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号５）を含むｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質発現カセットをコードする。Ｐ３１３は、哺乳類細胞における発現のためにマウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（配列番号７）によって、及び細菌における発現のためにＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃｚｙａプロモーター（配列番号８）によって駆動されるトランスポゾンＴｎ５（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ３’－ＩＩａ）（配列番号１；配列番号６を含むヌクレオチド配列）に由来するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）タンパク質をコードする。ＮＰＴ転写は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル（配列番号９）によって哺乳類細胞において終結する。このプラスミドはまた、アンピシリン耐性遺伝子（配列番号１０）及びｐＵＣ５７プラスミド複製起点（配列番号１１）をコードする。

【0278】

ＮＰＴオープンリーディングフレームの一部を遺伝子合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）により生成したＤＮＡ断片で置換することにより、ＮＰＴ遺伝子に変異を含むプラスミドを作製した。プラスミドＰ３１３を、特有の部位を有する制限エンドヌクレアーゼの適切な対（Ｂｓｐ Ｅ１、Ｔｔｈ１１１ Ｉ、Ｒｓｒ ＩＩ、及びＡｖｒ ＩＩを含む）で消化して、レシピエントベクターを作製した。クローニング混合物は、５μｌの２×ＨｉＦｉクローニングミックス、５０ｎｇの合成ＤＮＡ及び５０９ｎｇの消化ベクターを含んだ。混合物を５０℃で１５分間インキュベートし、４℃に冷却した。２μｌをＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＳｔｅｌｌａｒコンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に形質転換し、ＬＢ－カルベニシリンプレート上にプレーティングし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーを５ｍｌのＬＢ－カルベニシリン培養物に接種し、振盪インキュベーター中で、３７℃で一晩増殖させた。Ｑｉａｇｅｎ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを精製した。プラスミド配列をＤＮＡ配列決定（ＧＥＮＥＷＩＺ、Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によって確認した。以下に記載されるように、２５μｇ／ｍＬ（ＫＡＮ２５）５０μｇ／ｍＬ（ＫＡＮ５０）、７５μｇ／ｍＬ（ＫＡＮ７５）、及び１００μｇ／ｍＬ（ＫＡＮ１００）の濃度でカナマイシンを含むプレート上でＮＰＴ活性をスクリーニングした。

【0279】

細菌におけるＮＰＴ変異体のスクリーニング
ＬＢ－カルベニシリン中で増殖させた一晩培養物をＰＢＳで連続希釈し、ＬＢ－カルベニシリン、ＬＢ－ＫＡＮ２５、及びＬＢ－ＫＡＮ１００プレート上にプレーティングし、２４時間インキュベートした。コロニーを計数し、３７℃で更に２４時間インキュベートし、再計数した。コロニー数が有意に減少したが、ＫＡＮ２５及びカルベニシリンプレートと比較してＫＡＮ１００プレート上に存在しなかったプラスミドを、カルベニシリン、ＫＡＮ２５、ＫＡＮ５０、ＫＡＮ７５、及びＫＡＮ１００上に再プレーティングし、上記のようにインキュベートし、計数した。４８時間のインキュベーションから得られたコロニー数を表１に示す。

【0280】

【表1】

【0281】

結果
単一部位点変異体のうちの２つは、このアッセイにおいて活性の完全な喪失をもたらした（Ｇ２０５Ｅ及びＤ２０８Ｇ）。残りの８つの変異体のうちの２つだけが、このアッセイにおいて活性の低下を示した。変異体Ｒ２１１Ｇはまた、総コロニー数がより低いＫＡＮ濃度での増殖と同様であったとしても、ＫＡＮ１００プレート上でよりゆっくりと増殖した。Ｄ２６１Ｎは、ＫＡＮ１００プレート上で増殖することができず、他のＫＡＮプレート上で約半分の数のコロニーしか産生しなかった。本発明者らのアッセイにおいて完全な活性を示した変異体のうちの４つ（Ｇ２１０Ａ、Ｙ２１８Ｓ、Ｙ２１８Ｆ、及びＶ３６Ｍ）は、カナマイシンに対する耐性の低下を付与することが以前に報告されている（Ｂｌａｚｑｕｅｚ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１５１１－１５１８、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８５：９２５－９３１、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ（１９９２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ９３：１９９－２０２）。これらのＮＰＴ変異体は、高コピープラスミド及び／又はより強力な細菌プロモーターの使用を通じて以前の研究よりも高いレベルで発現される可能性がある。

【0282】

Ｄ２６１Ｎを有する二重変異体を構築して、更に低い活性を有するものを同定した。４つのＤ２６１Ｎ二重変異体は完全に欠損しており、１つ（Ｅ１８２Ｄ；Ｄ２６１Ｎ）は非常に欠損していた（カルベニシリンプレートに対してＫＡＮ２５上のコロニーの２パーセントであり、他のカナマイシン濃度では増殖しなかった）。２つのクローンのみがＫＡＮ２５プレート上でコロニーを生成したが、コロニー数はカルベニシリンプレート上のコロニー数と同様であった（すなわち、クローンＮ、（Ｄ２１６Ｇ；Ｄ２６１Ｎ）及びクローンＯ（Ｄ２２７Ｇ；Ｄ２６１Ｎ）。１つの変異は、Ｄ２６１Ｎ変異を部分的に補完するようであり、カルベニシリンプレート上での増殖と比較して減少した効率ではあるが、ＫＡＮ１００プレート上での増殖を可能にした（クローンＫ（Ｈ１８８Ｌ、Ｄ２６１Ｎ）。

【0283】

４つのクローン（Ｓ、Ｔ、Ｕ、及びＶ）は、独立して上記の完全な活性を有したが、減少した活性を有することが以前に報告されている２つの変異を組み合わせた（Ｂｌａｚｑｕｅｚ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１５１１－１５１８、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８５：９２５－９３１、Ｋｏｃａｂｉｙｉｋ（１９９２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ９３：１９９－２０２）。２つの更なるクローンは、Ｖ３６Ｍと、上記で試験されなかった変異とを組み合わせた。変異Ｈ１８８Ｓは、報告によれば、カナマイシンに対する耐性を減少させ（Ｂｌａｚｑｕｅｚ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１５１１－１５１８）、一方、変異Ｅ１８２Ｄは、カナマイシンではなくＧ４１８に対する耐性を減少させることが報告された（Ｙｅｎｏｆｓｋｙ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３４３５－３４３９）。Ｖ３６Ｍを含むクローン；Ｈ１８８Ｓ変異は完全に欠損していた。３つのクローンのみがＫＡＮ２５プレート上で増殖する能力を保持したが、残りの２つのクローンはＫＡＮ１００プレート上で増殖欠損を示したのみであった（それぞれ、クローンＵ（Ｖ３６Ｍ；Ｙ２１８Ｆ）及びＷ（Ｖ３６Ｍ及びＥ１８２Ｄ）に対して１及び０コロニー）。これらの結果は、驚くべきことに、個々にＮＰＴ活性に対して弱い効果を有するか又は効果を有しない特定の変異を組み合わせると、多数の用途に好適な活性を有する二重変異体ＮＰＴが生成されることを実証する。

【0284】

８．２実施例２：選択としての変異ＮＰＴタンパク質
ＨＥＫ２９３細胞におけるマーカー
減弱されたＮＰＴ遺伝子カセットを含有するプラスミドがヒト細胞においてＧ４１８に対する耐性を依然として付与し得ることを実証するために、上記で構築したプラスミドのいくつかをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、コロニー形成アッセイに供した。ＱｉａｇｅｎのＨｉＳｐｅｅｄ ｍａｘｉｐｒｅｐキットを製造業者の指示に従って使用して、カルベニシリンを含有する２００ｍｌのＬＢ培養物からＤＮＡを精製した。

【0285】

トランスフェクションのために、２Ｅ７ ＨＥＫ２９３細胞を、４０ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＰｅｎＳｔｒｅｐ）中の８つのＴ－７５フラスコにプレーティングし、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションを１５ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇチューブ中で組み立て、３７℃で２２μｇのＤＮＡ＋３ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ＋６６μｌのＦｕｇｅｎｅ－６トランスフェクション試薬を含んだ。トランスフェクション混合物を短時間ボルテックスし、３７℃のＣＯ_２インキュベーター中で１５分間インキュベートした。増殖培地（２ｍｌ）を添加し、混合物全体を、先にプレーティングしたＨＥＫ２９３細胞のフラスコに添加した。フラスコを３７℃でインキュベートした。４８時間後、全てのフラスコは明るい赤色蛍光を有する細胞を有していた。フラスコを１０ｍｌのＰＢＳ及び１ｍｌのＴｒｙＰＬＥで洗浄し、３７℃で５分間インキュベートした。細胞を１０ｍｌの増殖培地でフラスコから洗浄し、続いて２５ｍｌの培地中のＴ１５０フラスコに再プレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を、前のように増殖表面から回収し、細胞密度を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞カウンターを使用する二重の読み取りを使用して決定した。連続希釈物を、５０ｍｌの選択増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＰｅｎＳｔｒｅｐ＋５００μｇ／ｍｌのゲネチシン）中のＮｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅを有する２連の１５０ｍｍプレートにプレーティングした。プレートを１８日間インキュベートし、プラスミドＰ３１３、Ｃ及びＳのトランスフェクションを有するプレートを染色し、写真撮影した。他のトランスフェクションからのプレートを更に１３日間インキュベートした後、染色し、写真撮影した。染色のために、培地をピペッティングによって穏やかに除去した。細胞を１０ｍｌの染色溶液（５０％メタノール中０．４％メチレンブルー）で覆い、室温で１０分間インキュベートした。染色溶液をピペッティングにより除去し、細胞を５ｍｌの１００％メタノールで洗浄し、空気乾燥させた。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｉｍａｇｉｎｇステーションを使用してプレートを写真撮影した。

【0286】

結果
コロニー形成アッセイからの結果を表２に示す。変異体構築物のうちの４つは、野生型ＮＰＴ遺伝子を有する構築物Ｐ３１３について測定された頻度の５．５％～０．００４％の範囲の頻度でＧ４１８耐性コロニーを生成した。

【0287】

このアッセイにおいて、コロニー形成頻度は、ＮＰＴタンパク質活性の間接的な尺度である。トランスフェクトされた細胞の集団中の他の細胞と比較してより多くの変異体ＮＰＴを発現する細胞は、発現カセットのより多くの多コピー組み込みに起因するか、かつ／又はカセットの組み込みのより好ましいゲノム位置に起因するかにかかわらず、Ｇ４１８の存在下で増殖させた場合に生存してコロニーを形成することができる。本実施例の結果は、選択マーカーとして減少した活性を有するＮＰＴ変異体の使用が、安定に組み込まれた高導入遺伝子発現細胞について複数のコロニーをスクリーニングしなければならない時間及び労力を減少させるために使用され得ることを示す。

【0288】

細菌において最も減弱された表現型を有する変異構築物のうちの３つは、プレーティングされた１Ｅ７細胞からＧ４１８耐性コロニーを生成しなかった。これらの変異体タンパク質は哺乳類細胞において完全に不活性である可能性があるが、十分に高いレベルを発現する細胞が選択を生き延びる可能性もある。このようなマーカーは、レトロウイルス感染又は転移のような高コピー数組み込みを生成する際により効率的である方法と組み合わせて有用であり得る。

【0289】

【表2】

【0290】

８．３実施例３：トランスポザーゼによる導入遺伝子の導入
本実施例は、トランスポザーゼ活性を使用したヒト細胞へのｍＣｈｅｒｒｙ及びＮＰＴ発現カセットの組み込みを実証する。本明細書に記載のＮＰＴ変異体を本実施例で使用する。

【0291】

図２に示す構造を有する３つの異なる構築物を作製した。これらの構築物は、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、変異体１（Ｐ７２５）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｖ３６Ｍ；Ｇ２１０Ａ）、又は変異体２（Ｐ７２６）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｅ１８２Ｄ；Ｄ２６１Ｎ）のいずれかをコードする核酸配列を含んでいた点で互いに異なっていた。構築物を、Ｌｅａｐ－ＩｎトランスポザーゼＲＮＡ（ＡＴＵＭ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を含む又は含まないヒトＶＰＣ細胞（ＨＥＫ２９３バリアント）に電気穿孔した。細胞を１５０ｍｍプレート上にプレーティングし、ネオマイシン選択下で２週間培養した。次いで、細胞を染色し、コロニー形成について測定した。染色されていない異なるプレートから８～１２個のコロニーを選択し、ｍＣｈｅｒｒｙコピー数を内因性グルタミンシンテターゼ遺伝子ドロップレットデジタルＰＣＲ（droplet digital PCR、ｄｄＰＣＲ）と比較して測定した。

【0292】

結果
コロニー形成アッセイからの結果を図３に示し、これは、ＮＰＴ変異体が、転移によってではなく、発現構築物のランダムな組み込みによってコロニー形成の効率を劇的に減少させたことを示す。図４は、トランスポザーゼを用いて作製された細胞の安定なプールの写真であり、ｍＣｈｅｒｒｙ発現によって生成された色は、色を欠く非形質転換細胞と比較した場合、通常の白色光照明において明らかに明白である。

【0293】

選択されたクローンにおけるｍＣｈｅｒｒｙコピー数の測定からの結果を図５に示す。結果は、ＮＰＴ変異体含有細胞が、野生型ＮＰＴを有するものと比較して、連結されたｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の一貫してより高い平均コピー数を有することを実証する。野生型ＮＰＴ遺伝子を有する構築物のランダムな組み込みによって生成されたクローンのほとんどは、蛍光があったとしてもわずかであったが、２つの変異体ＮＰＴ遺伝子のランダムな組み込みによって誘導されたクローンのほとんどは蛍光であった。これは、Ｇ４１８選択中の生存のためには、コピー数の増加によるか又は好ましいゲノム位置への組み込みによるかに関係なく、変異体ＮＰＴ遺伝子が野生型ＮＰＴ遺伝子よりも高いレベルで発現されなければならず、これが、ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の発現の増加をもたらすことを意味すると解釈することができる。

【0294】

転移による宿主染色体への導入遺伝子の酵素的組み込みは、ランダムな組み込みよりもはるかに効率的であり、野生型ＮＰＴ遺伝子を使用してもより高い平均コピー数をもたらした。変異体ＮＰＴ遺伝子はまた、野生型ＮＰＴ遺伝子の使用と比較してコピー数を増加させ、これは、大きな構築物の場合のように遺伝子送達又は転移が非効率的である場合に利点を提供する。

【0295】

９．実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。

【0296】

１組の実施形態では、以下が提供される。
Ａ１．ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（ｆ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、
を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）。
Ａ２．ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（ａ）配列番号１の３６位及び２１０位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１０位における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｂ）配列番号１の３６位及び１８２位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の１８２位における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（ｃ）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｄ）配列番号１の２１６位及び２６１位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の２１６位における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１の２６１位における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｅ）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（ｆ）配列番号１の３６位及び２１６位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１６位における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、
を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）。
Ａ３．当該非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ａ１に記載のＮＰＴ。
Ａ４．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１又はＡ３に記載のＮＰＴ。
Ａ５．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１又はＡ３に記載のＮＰＴ。
Ａ６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ａ２に記載のＮＰＴ。
Ａ７．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、又はＡ５に記載のＮＰＴ。
Ａ８．当該細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、実施形態Ａ７に記載のＮＰＴ。
Ａ９．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、又はＡ５に記載のＮＰＴ。
Ａ１０．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ａ９に記載のＮＰＴ。
Ａ１１．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、又はＡ５に記載のＮＰＴ。
Ａ１２．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ａ２に記載のＮＰＴ。
Ａ１３．当該細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、実施形態Ａ１２に記載のＮＰＴ。
Ａ１４．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ａ２に記載のＮＰＴ。
Ａ１５．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ａ１４に記載のＮＰＴ。
Ａ１６．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ａ２に記載のＮＰＴ。
Ａ１７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基において含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５、又はＡ７～Ａ１１のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ１８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５、又はＡ７～Ａ１１のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ１９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５、又はＡ７～Ａ１１のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５、又はＡ７～Ａ１１のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５、又はＡ７～Ａ１１のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ａ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５、又はＡ７～Ａ１１のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２又はＡ１２～Ａ１６のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２又はＡ１２～Ａ１６のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２又はＡ１２～Ａ１６のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２又はＡ１２～Ａ１６のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２又はＡ１２～Ａ１６のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２又はＡ１２～Ａ１６のいずれか１つに記載のＮＰＴ。
Ａ２９．実施形態Ａ１～Ａ２８のいずれか１つに記載の非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、核酸配列。
Ａ３０．当該核酸配列が、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む、Ａ２９の実施形態に記載の核酸配列。
Ａ３１．当該第２のヌクレオチド配列が、第２のタンパク質をコードし、当該第２のタンパク質が、治療用タンパク質である、実施形態Ａ３０に記載の核酸配列。
Ａ３２．当該第１のヌクレオチド配列が、配列番号２０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、又は配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ２９～Ａ３１のいずれか１つに記載の核酸配列。
Ａ３３．実施形態Ａ２９～Ａ３２のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、ベクター。
Ａ３４．実施形態Ａ１～Ａ２８のいずれか１つに記載の非天然型ＮＰＴを含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞。
Ａ３５．実施形態Ａ２９～Ａ３２のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞。
Ａ３６．当該核酸配列が、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる、実施形態Ａ３５に記載の細胞。
Ａ３７．実施形態Ａ３３に記載のベクターを含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞。
Ａ３８．当該宿主細胞が、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、又は植物細胞である、実施形態Ａ３４～Ａ３７のいずれか１つに記載の宿主細胞。
Ａ３９．当該宿主細胞が、ヒト細胞株由来である、実施形態Ａ３４～Ａ３７のいずれか１つに記載の宿主細胞。

【0297】

第２の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｂ１．非天然型ＮＰＴを発現するインビトロ又はエクスビボ宿主細胞であって、当該非天然型ＮＰＴが、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼと比較して減弱されており、当該非天然型ＮＰＴが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（ｆ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、
を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞。
Ｂ２．ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴを発現するインビトロ又はエクスビボ宿主細胞であって、当該非天然型ＮＰＴが、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼと比較して減弱されており、当該非天然型ＮＰＴが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸置換アミノ酸残基２１８がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（ｆ）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、
を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、インビトロ又はエクスビボ宿主細胞。
Ｂ３．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ１に記載の細胞。
Ｂ４．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ１に記載の細胞。
Ｂ５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｂ２に記載の細胞。
Ｂ６．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｂ１、Ｂ３、又はＢ４に記載の細胞。
Ｂ７．当該細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、実施形態Ｂ６に記載の細胞。
Ｂ８．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｂ１、Ｂ３、又はＢ４に記載の細胞。
Ｂ９．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ｂ８に記載の細胞。
Ｂ１０．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ｂ１、Ｂ３、又はＢ４に記載の細胞。
Ｂ１１．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｂ２又はＢ５に記載の細胞。
Ｂ１２．当該細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、実施形態Ｂ１１に記載の細胞。
Ｂ１３．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｂ２又はＢ５に記載の細胞。
Ｂ１４．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ｂ１３に記載の細胞。
Ｂ１５．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ｂ２又はＢ５に記載の細胞。
Ｂ１６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、又はＢ６～Ｂ１０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、又はＢ６～Ｂ１０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、又はＢ６～Ｂ１０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、又はＢ６～Ｂ１０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、又はＢ６～Ｂ１０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、又はＢ６～Ｂ１０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ２、Ｂ５又はＢ１１～Ｂ１５のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ２、Ｂ５又はＢ１１～Ｂ１５のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ２、Ｂ５又はＢ１１～Ｂ１５のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ２、Ｂ５又はＢ１１～Ｂ１５のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ２、Ｂ５又はＢ１１～Ｂ１５のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ２、Ｂ５又はＢ１１～Ｂ１５のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２８．当該細胞が、第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２の核酸配列を更に含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２７のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２９．当該第２の核酸配列が、第２のタンパク質をコードし、当該第２のタンパク質が、治療用タンパク質である、実施形態Ｂ２８に記載の細胞。
Ｂ３０．当該第２の核酸配列が、非コードＲＮＡをコードし、当該非コードＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、又はｔＲＮＡである、実施形態Ｂ２８に記載の細胞。
Ｂ３１．当該宿主細胞が、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、又は植物細胞である、実施形態Ｂ１～Ｂ３０のいずれか１つに記載の細胞。

【0298】

第３の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｃ１．高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を、導入遺伝子が導入された宿主細胞集団から選択するための方法であって、当該方法が、
ａ）宿主細胞集団に、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸配列を導入することであって、
当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、導入することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を、核酸配列が導入された宿主細胞集団から選択することと、を含む、方法。
Ｃ２．高コピー数の導入遺伝子及び／又は高発現レベルの導入遺伝子を有する細胞を、導入遺伝子が導入された宿主細胞集団から選択するための方法であって、当該方法が、
ａ）宿主細胞集団に、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、核酸配列を導入することであって、
当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸置換アミノ酸残基２１８がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、導入することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞を、核酸配列が導入された宿主細胞集団から選択することと、を含む、方法。
Ｃ３．当該非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ４．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ１又はＣ３に記載の方法。
Ｃ５．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｃ２に記載の方法。
Ｃ７．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５に記載の方法。
Ｃ８．当該細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、実施形態Ｃ７に記載の方法。
Ｃ９．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５に記載の方法。
Ｃ１０．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ｃ９に記載の方法。
Ｃ１１．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５に記載の方法。
Ｃ１２．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ１３．当該細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、実施形態Ｃ１２に記載の方法。
Ｃ１４．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ１５．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ｃ１４に記載の方法。
Ｃ１６．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ１７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、又はＣ７～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１８．当該ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、又はＣ７～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、又はＣ７～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、又はＣ７～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、又はＣ７～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、又はＣ７～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ２４．非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ２５．非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ２６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ２７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ２８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ２又はＣ６に記載の方法。
Ｃ２９．
（ａ）選択された細胞が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖した第２の宿主細胞集団の選択後の第２の細胞セットにおける導入遺伝子のコピー数と比較して２～１０００倍多いコピー数の導入遺伝子を含み、第２の宿主細胞集団が、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている、かつ／又は
（ｂ）選択された細胞が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖した第２の宿主細胞集団の選択後の第２の細胞セットによる導入遺伝子の発現レベルと比較して１０～１０００倍高いレベルの導入遺伝子の発現を達成し、第２の宿主細胞集団が、野生型ＮＰＴタンパク質及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクト又は形質転換されている、実施形態Ｃ１～Ｃ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３０．当該宿主細胞が、細菌、酵母、哺乳類又は植物細胞である、実施形態Ｃ１～Ｃ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３１．当該宿主細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｃ１～Ｃ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３２．当該核酸配列が、選択された細胞のゲノムに安定に組み込まれる、実施形態Ｃ１～Ｃ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３３．当該選択された細胞が、高コピー数の導入遺伝子を有する、実施形態Ｃ１～Ｃ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３４．当該選択された細胞が、高発現レベルの導入遺伝子を有する、実施形態Ｃ１～Ｃ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３５．当該選択された細胞が、５～１００コピーの導入遺伝子をそれらのゲノムＤＮＡに組み込んでいる、実施形態Ｃ１～Ｃ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３６．当該選択された細胞が、１～５コピーの導入遺伝子をそれらのゲノムＤＮＡに組み込んでいる、実施形態Ｃ１～Ｃ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３７．当該導入遺伝子が、ウイルス遺伝子を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３８．当該導入遺伝子が、ヒト増殖因子遺伝子を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３９．当該ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質が、ネオマイシン、カナマイシン、又はＧ４１８である、実施形態Ｃ１～Ｃ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４０．選択可能マーカーとして野生型ＮＰＴと比較して減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを使用する方法であって、当該方法が、
ａ）非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを宿主細胞に導入することであって、非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、導入することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で細胞を増殖させることと、を含む、方法。
Ｃ４１．選択可能マーカーとして野生型ＮＰＴと比較して減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを使用する方法であって、当該方法が、
ａ）非天然型ＮＰＴをコードする核酸配列を含むプラスミド又はトランスポゾンを宿主細胞に導入することであって、非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、導入することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で細胞を増殖させることと、を含む、方法。
Ｃ４２．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４０に記載の方法。
Ｃ４３．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４０に記載の方法。
Ｃ４４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｃ４０、Ｃ４２、又はＣ４３に記載の方法。
Ｃ４５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｃ４０、Ｃ４２、又はＣ４３に記載の方法。
Ｃ４６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｃ４０、Ｃ４２、又はＣ４３に記載の方法。
Ｃ４７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｃ４０、Ｃ４２、又はＣ４３に記載の方法。
Ｃ４８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｃ４０、Ｃ４２、又はＣ４３に記載の方法。
Ｃ４９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｃ４０、Ｃ４２、又はＣ４３に記載の方法。
Ｃ５０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ５１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ５２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ５３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ５４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ５５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ５６．当該宿主細胞が、細菌、酵母、哺乳類又は植物細胞である、実施形態Ｃ４０～Ｃ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５７．当該宿主細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｃ４０～Ｃ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５８．当該プラスミド又はトランスポゾンが、タンパク質又は非コードＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む、実施形態Ｃ４０～Ｃ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５９．当該タンパク質が、ウイルスタンパク質である、実施形態Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６０．当該タンパク質が、治療用タンパク質である、実施形態Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６１．当該ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質が、ネオマイシン、カナマイシン、又はＧ４１８である、実施形態Ｃ４０～Ｃ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６２．当該導入遺伝子が、タンパク質又は非コードＲＮＡをコードする、実施形態Ｃ１～Ｃ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６３．当該導入遺伝子が、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される非コードＲＮＡをコードする、実施形態Ｃ６２に記載の方法。
Ｃ６４．当該導入遺伝子が、タンパク質をコードし、タンパク質が、治療用タンパク質又は抗原である、実施形態Ｃ６２に記載の方法。

【0299】

第４の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｄ１．第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、第１の核酸配列を導入することであって、非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、導入することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することと、
ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。
Ｄ２．第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列と、を共導入することであって、非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１の３６位及び２１０位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１０位におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１の３６位及び１８２位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の１８２位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１の２１６位及び２６１位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１の２６１位におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１の３６位及び２１６位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、共導入することと、
ｂ）宿主細胞集団をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖させて、コロニーを生成することと、
ｃ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。
Ｄ３．第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
ａ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、宿主細胞集団が、（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列と、を含む、第１の核酸配列を含み、非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、生成することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。
Ｄ４．第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を作製する方法であって、
ａ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で宿主細胞集団を増殖させて、コロニーを生成することであって、宿主細胞集団が、（ｉ）非天然型ＮＰＴをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質又は非コードＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の核酸配列と、を含み、当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１の３６位及び２１０位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１０位におけるアミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１の３６位及び１８２位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の１８２位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１の２１６位及び２６１位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１の２６１位におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１の３６位及び２１８位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１８位におけるアミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１の３６位及び２１６位におけるアミノ酸置換であって、配列番号１の３６位におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１の２１６位におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、生成することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞コロニーを選択することと、を含む、方法。
Ｄ５．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ１又はＤ３に記載の方法。
Ｄ６．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ１又はＤ３に記載の方法。
Ｄ７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｄ２に記載の方法。
Ｄ８．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、又はＤ６に記載の方法。
Ｄ９．当該細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、実施形態Ｄ８に記載の方法。
Ｄ１０．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、又はＤ６に記載の方法。
Ｄ１１．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ｄ１０に記載の方法。
Ｄ１２．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、０．００１％～７５％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、又はＤ６に記載の方法。
Ｄ１３．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞が、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクト又は形質転換された細菌細胞と比較して、２５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むプレート上で４８時間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｄ２又はＤ７に記載の方法。
Ｄ１４．当該細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、実施形態Ｄ１３に記載の方法。
Ｄ１５．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞が、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞と比較して、５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）を含む培地中の組織培養プレート上で２週間増殖させた後にコロニー形成アッセイによって評価される、減少したコロニー形成を呈する、実施形態Ｄ２又はＤ７に記載の方法。
Ｄ１６．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ｄ１５に記載の方法。
Ｄ１７．当該非天然型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーが、野生型ＮＰＴであって、当該野生型ＮＰＴが配列番号１のアミノ酸配列を含む、野生型ＮＰＴをコードするヌクレオチド配列を含む以外は同じ発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞のＧ４１８耐性コロニーと比較して、５．５％～０．００４％の範囲の頻度で生成される、実施形態Ｄ２又はＤ７に記載の方法。
Ｄ１８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、又はＤ８～Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、又はＤ８～Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、又はＤ８～Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、又はＤ８～Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、又はＤ８～Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、又はＤ８～Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ２、Ｄ７、又はＤ１３～Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ２、Ｄ７、又はＤ１３～Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ２、Ｄ７、又はＤ１３～Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ２、Ｄ７、又はＤ１３～Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ２、Ｄ７、又はＤ１３～Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ２、Ｄ７、又はＤ１３～Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３０．当該宿主細胞集団が、第２の核酸配列でトランスフェクト又は形質転換され、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖された第２の宿主細胞集団よりも少ないコロニーを生成し、第２の核酸配列が、野生型ＮＰＴタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３１．当該宿主細胞が、哺乳類細胞である、実施形態Ｄ１～Ｄ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３２．当該哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、マウスＮＳ０細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、マウスＳｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、又はマウスＣ１２７細胞である、実施形態Ｄ３１に記載の方法。
Ｄ３３．当該細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｄ１～Ｄ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３４．当該選択された細胞コロニーを培養することを更に含む、実施形態Ｄ１～Ｄ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３５．当該ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質が、ネオマイシン、カナマイシン、又はＧ４１８である、実施形態Ｄ１～Ｄ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３６．当該タンパク質が、治療用タンパク質又は抗原である、実施形態Ｄ１～Ｄ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３７．当該非コードＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒヌクレアーゼのガイドＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、又はｔＲＮＡである、実施形態Ｄ１～Ｄ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３８．実施形態Ｄ１～Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法によって生成される、宿主細胞。

【0300】

第５の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｅ１．治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を製造するための方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することであって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）治療用タンパク質又は酵素をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、
ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、
ｃ）選択された細胞を培養して、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を産生することと、を含む、方法。
Ｅ２．治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を製造するための方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することであって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）治療用タンパク質又は酵素をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、
ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、
ｃ）選択された細胞を培養して、治療用タンパク質又は酵素を発現する安定な細胞株を産生することと、を含む、方法。
Ｅ３．当該非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ４．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１又はＥ３に記載の方法。
Ｅ５．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１又はＥ３に記載の方法。
Ｅ６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｅ２に記載の方法。
Ｅ７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、又はＥ５に記載の方法。
Ｅ８．非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、又はＥ５に記載の方法。
Ｅ９．非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、又はＥ５に記載の方法。
Ｅ１０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、又はＥ５に記載の方法。
Ｅ１１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、又はＥ５に記載の方法。

【0301】

Ｅ１２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、又はＥ５に記載の方法。
Ｅ１３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ２又はＥ６に記載の方法。
Ｅ１４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ２又はＥ６に記載の方法。
Ｅ１５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ２又はＥ６に記載の方法。
Ｅ１６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ２又はＥ６に記載の方法。
Ｅ１７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ２又はＥ６に記載の方法。
Ｅ１８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ２又はＥ６に記載の方法。
Ｅ１９．当該安定な細胞株が、哺乳類細胞株である、実施形態Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０．当該安定な細胞株が、ヒト細胞株である、実施形態Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２１．当該安定な細胞株が、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である、実施形態Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２２．当該安定な細胞株が、治療用タンパク質を発現する、実施形態Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２３．当該治療用タンパク質が、抗体又は抗体断片である、実施形態Ｅ２２に記載の方法。
Ｅ２４．当該安定な細胞株が、酵素を発現する、実施形態Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２５．実施形態Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法によって産生される、安定な細胞株。

【0302】

第６の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｆ１．ウイルス産生細胞株を作製する方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することであって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列であって、当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、第２の核酸配列と、を含む、導入することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞集団から細胞を選択することと、
ｃ）選択された細胞を増殖させて、ウイルス産生細胞株を産生することと、を含む、方法。
Ｆ２．ウイルス産生細胞株を作製する方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することであって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列であって、当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、第２の核酸配列と、を含む、導入することと、
ｂ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ基質の存在下で増殖する細胞集団から細胞を選択することと、
ｃ）選択された細胞を増殖させて、ウイルス産生細胞株を産生することと、を含む、方法。
Ｆ３．当該非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｆ１に記載の方法。
Ｆ４．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ１又はＦ３に記載の方法。
Ｆ５．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ１又はＦ３に記載の方法。
Ｆ６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｆ２に記載の方法。
Ｆ７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｆ１、Ｆ３、Ｆ４、又はＦ５に記載の方法。
Ｆ８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｆ１、Ｆ３、Ｆ４、又はＦ５に記載の方法。
Ｆ９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｆ１、Ｆ３、Ｆ４、又はＦ５に記載の方法。
Ｆ１０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｆ１、Ｆ３、Ｆ４、又はＦ５に記載の方法。
Ｆ１１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｆ１、Ｆ３、Ｆ４、又はＦ５に記載の方法。
Ｆ１２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｆ１、Ｆ３、Ｆ４、又はＦ５に記載の方法。
Ｆ１３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ２又はＦ６に記載の方法。
Ｆ１４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ２又はＦ６に記載の方法。
Ｆ１５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ２又はＦ６に記載の方法。
Ｆ１６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ２又はＦ６に記載の方法。
Ｆ１７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ２又はＦ６に記載の方法。
Ｆ１８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ２又はＦ６に記載の方法。
Ｆ１９．当該細胞株が、哺乳類細胞株である、実施形態Ｆ１～Ｆ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２０．当該細胞株が、ヒト細胞株である、実施形態Ｆ１～Ｆ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２１．当該細胞株が、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である、実施形態Ｆ１～Ｆ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２２．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２３．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２４．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、エンベロープタンパク質を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２５．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、アデノウイルス複製に必要なアデノウイルスＥ１領域タンパク質を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２６．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルスエンベロープタンパク質を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２７．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルスｇａｇタンパク質を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２８．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルス逆転写酵素を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ２９．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルスエンベロープタンパク質、ｇａｇタンパク質及び逆転写酵素を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ３０．実施形態Ｆ１～Ｆ２９のいずれか１つに記載の方法によって作製されたウイルス産生細胞株。
Ｆ３１．１つ又は２つ以上の核酸配列を含むウイルス産生細胞株であって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列であって、当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、第２の核酸配列と、を含む、ウイルス産生細胞株。
Ｆ３２．１つ又は２つ以上の核酸配列を含むウイルス産生細胞株であって、１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換；
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列であって、当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、複製に必要なウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、第２の核酸配列と、を含む、ウイルス産生細胞株。
Ｆ３３．当該非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｆ３１に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ３４．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３１又はＦ３３に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ３５．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３１又はＦ３３に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ３６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択可能マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｆ３２に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ３７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｆ３１、Ｆ３３、Ｆ３４、又はＦ３５に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ３８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｆ３１、Ｆ３３、Ｆ３４、又はＦ３５に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ３９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｆ３１、Ｆ３３、Ｆ３４、又はＦ３５に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｆ３１、Ｆ３３、Ｆ３４、又はＦ３５に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｆ３１、Ｆ３３、Ｆ３４、又はＦ３５に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｆ３１、Ｆ３３、Ｆ３４、又はＦ３５に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３２又はＦ３６に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３２又はＦ３６に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３２又はＦ３６に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３２又はＦ３６に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３２又はＦ３６に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ３２又はＦ３６に記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ４９．当該細胞株が、哺乳類細胞株である、実施形態Ｆ３１～Ｆ４８のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５０．当該細胞株が、ヒト細胞株である、実施形態Ｆ３１～Ｆ４８のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５１．当該細胞株が、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である、実施形態Ｆ３１～Ｆ４８のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５２．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５３．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５４．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、エンベロープタンパク質を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５５．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、アデノウイルス複製に必要なアデノウイルスＥ１領域タンパク質を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５６．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルスエンベロープタンパク質を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５７．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルスｇａｇタンパク質を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５８．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルス逆転写酵素を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。
Ｆ５９．当該１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質が、レトロウイルスエンベロープタンパク質、ｇａｇタンパク質及び逆転写酵素を含む、実施形態Ｆ３１～Ｆ５１のいずれか１つに記載のウイルス産生細胞株。

【0303】

第７の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｇ１．抗原を発現する細胞株を製造するための方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することであって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ネオマイシンＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、
ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、
ｃ）選択された細胞を培養して、抗原を発現する細胞株を産生することと、を含む、方法。
Ｇ２．抗原を発現する細胞株を製造するための方法であって、
ａ）宿主細胞集団に、１つ又は２つ以上の核酸配列を導入することであって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ネオマイシンＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換；
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、導入することと、
ｂ）工程（ａ）の細胞集団から、Ｇ４１８の存在下で増殖する細胞を選択することと、
ｃ）選択された細胞を培養して、抗原を発現する細胞株を産生することと、を含む、方法。
Ｇ３．当該非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｇ１に記載の方法。
Ｇ４．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１又はＧ３に記載の方法。
Ｇ５．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ１に記載の方法。
Ｇ６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｇ２に記載の方法。
Ｇ７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｇ１、Ｇ３、Ｇ４、又はＧ５に記載の方法。
Ｇ８．非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｇ１、Ｇ３、Ｇ４、又はＧ５に記載の方法。
Ｇ９．非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｇ１、Ｇ３、Ｇ４、又はＧ５に記載の方法。
Ｇ１０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基におけるアミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基におけるアミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｇ１、Ｇ３、Ｇ４、又はＧ５に記載の方法。
Ｇ１１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｇ１、Ｇ３、Ｇ４、又はＧ５に記載の方法。
Ｇ１２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｇ１、Ｇ３、Ｇ４、又はＧ５に記載の方法。
Ｇ１３．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２又はＧ６に記載の方法。
Ｇ１４．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２又はＧ６に記載の方法。
Ｇ１５．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２又はＧ６に記載の方法。
Ｇ１６．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２又はＧ６に記載の方法。
Ｇ１７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２又はＧ６に記載の方法。
Ｇ１８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２又はＧ６に記載の方法。
Ｇ１９．当該細胞株が、哺乳類細胞株である、実施形態Ｇ１～Ｇ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ２０．当該細胞株が、ヒト細胞株である、実施形態Ｇ１～Ｇ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ２１．当該細胞株が、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である、実施形態Ｇ１～Ｇ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ２２．当該抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、又は真菌抗原である、実施形態Ｇ１～Ｇ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ２３．当該抗原が、癌抗原である、実施形態Ｇ１～Ｇ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ２４．実施形態Ｇ１～Ｇ２３のいずれか１つに記載の方法によって作製された、抗原産生細胞株。
Ｇ２５．１つ又は２つ以上の核酸配列を含む抗原産生細胞株であって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）１つ又は２つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、抗原産生細胞株。
Ｇ２６．１つ又は２つ以上の核酸配列を含む抗原産生細胞株であって、当該１つ又は２つ以上の核酸配列が、
（ｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする第１の核酸配列であって、当該非天然型ＮＰＴが、
（１）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（２）配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、アミノ酸置換、
（３）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、アミノ酸置換、
（４）配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、アミノ酸置換、
（５）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、アミノ酸置換、又は
（６）配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６におけるアミノ酸置換であって、配列番号１のアミノ酸残基３６における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、アミノ酸置換、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）１つ又は２つ以上の抗原をコードする第２の核酸配列と、を含む、抗原産生細胞株。
Ｇ２７．当該非天然型ＮＰＴが、野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｇ２５に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ２８．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２５又はＧ２７に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ２９．当該野生型ＮＰＴが、配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２５又はＧ２７に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＮＰＴと比較して、選択性マーカーとして減弱されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を有する、実施形態Ｇ２６に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３１．当該ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１０に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１０に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアラニンへの置換である、実施形態Ｇ２５、Ｇ２７、Ｇ２８、又はＧ２９に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３２．当該ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び１８２に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基１８２に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギン酸への置換である、実施形態Ｇ２５、Ｇ２７、Ｇ２８、又はＧ２９に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３３．当該ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がフェニルアラニンへの置換である、実施形態Ｇ２５、Ｇ２７、Ｇ２８、又はＧ２９に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３４．当該ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基２１６及び２６１に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２６１に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がアスパラギンへの置換である、実施形態Ｇ２５、Ｇ２７、Ｇ２８、又はＧ２９に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３５．当該ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１８に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１８に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がセリンへの置換である、実施形態Ｇ２５、Ｇ２７、Ｇ２８、又はＧ２９に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３６．当該ＮＰＴが、配列番号１のアミノ酸残基３６及び２１６に対応するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がメチオニンへの置換であり、配列番号１のアミノ酸残基２１６に対応する当該アミノ酸残基における当該アミノ酸置換がグリシンへの置換である、実施形態Ｇ２５、Ｇ２７、Ｇ２８、又はＧ２９に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３７．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３８（Ｖ３６Ｍ、Ｇ２１０Ａ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２６又はＧ３０に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３８．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号３９（Ｖ３６Ｍ、Ｅ１８２Ｄ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２６又はＧ３０に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ３９．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４０（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｆ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２６又はＧ３０に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４０．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４１（Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２６１Ｎ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２６又はＧ３０に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４１．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４２（Ｖ３６Ｍ、Ｙ２１８Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２６又はＧ３０に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４２．当該非天然型ＮＰＴが、配列番号４３（Ｖ３６Ｍ、Ｄ２１６Ｇ）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｇ２６又はＧ３０に記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４３．当該細胞株が、哺乳類細胞株である、実施形態Ｇ２５～Ｇ４２のいずれか１つに記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４４．当該細胞株が、ヒト細胞株である、実施形態Ｇ２５～Ｇ４２のいずれか１つに記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４５．当該細胞株が、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、マウスＮＳ０、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、マウスＳｐ２／０、ＢＨＫ、又はマウスＣ１２７細胞株である、実施形態Ｇ２５～Ｇ４２のいずれか１つに記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４６．当該１つ又は２つ以上の抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、又は真菌抗原である、実施形態Ｇ２５～Ｇ４５のいずれか１つに記載の抗原産生細胞株。
Ｇ４７．当該１つ又は２つ以上の抗原が、癌抗原である、実施形態Ｇ２５～Ｇ４５のいずれか１つに記載の抗原産生細胞株。

【0304】

第８の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｈ１．細菌細胞に導入されたときにカナマイシンに対する耐性を付与し、かつ哺乳類細胞に導入されたときにＧ４１８に対する耐性を付与するための選択可能マーカー手段。
Ｈ２．配列番号２０の核酸配列を含む、実施形態Ｈ１に記載の選択可能マーカー手段。
Ｈ３．配列番号３２の核酸配列を含む、実施形態Ｈ１に記載の選択可能マーカー手段。
Ｈ４．配列番号３３の核酸配列を含む、実施形態Ｈ１に記載の選択可能マーカー手段。
Ｈ５．配列番号３４の核酸配列を含む、実施形態Ｈ１に記載の選択可能マーカー手段。
Ｈ６．配列番号３６の核酸配列を含む、実施形態Ｈ１に記載の選択可能マーカー手段。
Ｈ７．配列番号３７の核酸配列を含む、実施形態Ｈ１に記載の選択可能マーカー手段。
Ｈ８．産生細胞株を製造するための方法であって、
ａ）細菌細胞又は哺乳類細胞を発現ベクターで形質転換して、形質転換細胞を作製することであって、発現ベクターが、１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質をコードする核酸配列と、形質転換細胞が細菌細胞である場合にカナマイシンの存在下で増殖させるための手段と、形質転換細胞が哺乳類細胞である場合にＧ４１８の存在下で増殖させるための手段とを含む、作製することと、
ｂ）形質転換細胞をカナマイシン又はＧ４１８の存在下で培養して、産生細胞株であって、産生細胞株が、ＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又はバキュロウイルス由来の１つ又は２つ以上のウイルスタンパク質を発現する、産生細胞株を得ることと、を含む、方法。
Ｈ９．外因性核酸配列の安定な染色体組み込みを有する細胞を選択するための方法であって、
ａ）真核細胞集団を、Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段を含む外因性核酸配列で形質転換することと、
ｂ）形質転換細胞集団をＧ４１８の存在下で培養して、Ｇ４１８の存在下で増殖することができる形質転換細胞のコロニーを生成することと、
ｃ）工程（ｂ）で生成されたコロニーから細胞を選択して、外因性核酸の安定な染色体組み込みを有する細胞を得ることと、を含む、方法。
Ｈ１０．外因性核酸配列が、導入遺伝子を更に含み、選択された細胞が、導入遺伝子を発現する、実施形態Ｈ９に記載の方法。
Ｈ１１．外因性核酸配列が、選択された細胞に対して内因性の遺伝子の発現を破壊する、実施形態Ｈ９に記載の方法。
Ｈ１２．安定なエピソームを有する哺乳類細胞を選択するための方法であって、
ａ）哺乳類細胞集団を、Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段を含むプラスミドで形質転換することと、
ｂ）形質転換細胞集団をＧ４１８の存在下で培養して、Ｇ４１８の存在下で増殖することができる形質転換細胞のコロニーを生成することと、
ｃ）工程（ｂ）で生成されたコロニーから細胞を選択して、プラスミドを含む安定なエピソームを有する細胞を得ることと、を含む、方法。
Ｈ１３．プラスミドが、ＥＢＮＡ１ ＯｒｉＰ核酸配列を更に含み、選択された細胞が、ＥＢＮＡ１を発現する、実施形態Ｈ１２に記載の方法。
Ｈ１４．導入遺伝子を一過性に発現する哺乳類細胞を選択するための方法であって、
ａ）哺乳類細胞集団に、導入遺伝子をコードする核酸と、Ｇ４１８の存在下で増殖させるための手段とを導入することと、
ｂ）哺乳類細胞集団をＧ４１８の存在下で４８～７２時間培養することと、
ｃ）Ｇ４１８の存在下で増殖する培養された哺乳類細胞集団から哺乳類細胞を選択することであって、選択された哺乳類細胞が導入遺伝子を一過性に発現する、選択することと、を含む、方法。
Ｈ１５．当該導入遺伝子が、Ｃｒｉｓｐｒエンドヌクレアーゼ又はＣｒｉｓｐｒガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む、実施形態Ｈ１４に記載の方法。
Ｈ１６．当該手段が、配列番号３８、３９、４０、４１、４２又は４３の群から選択されるアミノ酸配列を含む非天然型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列である、実施形態Ｈ８～Ｈ１５のいずれか１つに記載の方法。

【0305】

１０．本明細書に開示される配列
以下の表は、本明細書に記載される配列に割り当てられた配列識別番号の概要を提供する。

【0306】

【表3-1】

【0307】

【表3-2】

【0308】

＞配列番号１、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質のタンパク質配列
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＶＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＳＭＰＤＧＥＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＧＲＬＧＶＡＤＲＹＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＤＥＦＦ

【0309】

＞配列番号２、Ｐ３１３ ＷＴベクター
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【0310】

＞配列番号３、ヒト伸長因子アルファプロモーター
ｃｇｔｇａｇｇｃｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｇｔｃａｇｔｇｇｇｃａｇａｇｃｇｃａｃａｔｃｇｃｃｃａｃａｇｔｃｃｃｃｇａｇａａｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｃｇｇｃａａｔｔｇａａｃｃｇｇｔｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｔａａａｃｔｇｇｇａａａｇｔｇａｔｇｔｃｇｔｇｔａｃｔｇｇｃｔｃｃｇｃｃｔｔｔｔｔｃｃｃｇａｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇａａｃｃｇｔａｔａｔａａｇｔｇｃａｇｔａｇｔｃｇｃｃｇｔｇａａｃｇｔｔｃｔｔｔｔｔｃｇｃａａｃｇｇｇｔｔｔｇｃｃｇｃｃａｇａａｃａｃａｇｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｔｃｃａｃｇｃｃｃｃｔｇｇｃｔｇｃａｇｔａｃｇｔｇａｔｔｃｔｔｇａｔｃｃｃｇａｇｃｔｔｃｇｇｇｔｔｇｇａａｇｔｇｇｇｔｇｇｇａｇａｇｔｔｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃｇｃｔｔａａｇｇａｇｃｃｃｃｔｔｃｇｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｇａｇｔｔｇａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｇｇｇｃｃｇｃｃｇｃｇｔｇｃｇａａｔｃｔｇｇｔｇｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｇｃｃｔｇｔｃｔｃｇｃｔｇｃｔｔｔｃｇａｔａａｇｔｃｔｃｔａｇｃｃａｔｔｔａａａａｔｔｔｔｔｇａｔｇａｃｃｔｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｇｃａａｇａｔａｇｔｃｔｔｇｔａａａｔｇｃｇｇｇｃｃａａｇａｔｃｔｇｃａｃａｃｔｇｇｔａｔｔｔｃｇｇｔｔｔｔｔｇｇｇｇｃｃｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇａｃｇｇｇｇｃｃｃｇｔｇｃｇｔｃｃｃａｇｃｇｃｔｃａｔｇｔｔｃｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｇｇｃｃｔｇｃｇａｇｃｇｃｇｇｃｃａｃｃｇａｇａａｔｃｇｇａｃｇｇｇｇｇｔａｇｔｃｔｃａａｇｃｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｇｃｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｇｇｃａａｇｇｃｔｇｇｃｃｃｇｇｔｃｇｇｃａｃｃａｇｔｔｇｃｇｔｇａｇｃｇｇａａａｇａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃａｇｇｇａｇｃｔｃａａａａｔｇｇａｇｇａｃｇｃｇｇｃｇｃｔｃｇｇｇａｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇａｇｔｃａｃｃｃａｃａｃａａａｇｇａａａａｇｇｇｃｃｔｔｔｃｃｇｔｃｃｔｃａｇｃｃｇｔｃｇｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｃａｃｇｇａｇｔａｃｃｇｇｇｃｇｃｃｇｔｃｃａｇｇｃａｃｃｔｃｇａｔｔａｇｔｔｃｔｃｇａｇｃｔｔｔｔｇｇａｇｔａｃｇｔｃｇｔｃｔｔｔａｇｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｔｔｔａｔｇｃｇａｔｇｇａｇｔｔｔｃｃｃｃａｃａｃｔｇａｇｔｇｇｇｔｇｇａｇａｃｔｇａａｇｔｔａｇｇｃｃａｇｃｔｔｇｇｃａｃｔｔｇａｔｇｔａａｔｔｃｔｃｃｔｔｇｇａａｔｔｔｇｃｃｃｔｔｔｔｔｇａｇｔｔｔｇｇａｔｃｔｔｇｇｔｔｃａｔｔｃｔｃａａｇｃｃｔｃａｇａｃａｇｔｇｇｔｔｃａａａｇｔｔｔｔｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｔｔｃａｇｇｔｇｔｃｇｔｇａ

【0311】

＞配列番号４、ｍＣｈｅｒｒｙコード領域
Ａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｇａｔａａｃａｔｇｇｃｃａｔｃａｔｃａａｇｇａｇｔｔｃａｔｇｃｇｃｔｔｃａａｇｇｔｇｃａｃａｔｇｇａｇｇｇｃｔｃｃｇｔｇａａｃｇｇｃｃａｃｇａｇｔｔｃｇａｇａｔｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｃｇｃｃｃｃｔａｃｇａｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇｃｔｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｇｇｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃｔｔｃｇｃｃｔｇｇｇａｃａｔｃｃｔｇｔｃｃｃｃｔｃａｇｔｔｃａｔｇｔａｃｇｇｃｔｃｃａａｇｇｃｃｔａｃｇｔｇａａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃａｔｃｃｃｃｇａｃｔａｃｔｔｇａａｇｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｃｃｇａｇｇｇｃｔｔｃａａｇｔｇｇｇａｇｃｇｃｇｔｇａｔｇａａｃｔｔｃｇａｇｇａｃｇｇｃｇｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｇａｃｇｇｃｇａｇｔｔｃａｔｃｔａｃａａｇｇｔｇａａｇｃｔｇｃｇｃｇｇｃａｃｃａａｃｔｔｃｃｃｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｃｃｃｇｔａａｔｇｃａｇａａｇａａｇａｃｃａｔｇｇｇｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｇｃｇｇａｔｇｔａｃｃｃｃｇａｇｇａｃｇｇｃｇｃｃｃｔｇａａｇｇｇｃｇａｇａｔｃａａｇｃａｇａｇｇｃｔｇａａｇｃｔｇａａｇｇａｃｇｇｃｇｇｃｃａｃｔａｃｇａｃｇｃｔｇａｇｇｔｃａａｇａｃｃａｃｃｔａｃａａｇｇｃｃａａｇａａｇｃｃｃｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃｇｃｃｔａｃａａｃｇｔｃａａｃａｔｃａａｇｔｔｇｇａｃａｔｃａｃｃｔｃｃｃａｃａａｃｇａｇｇａｃｔａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔａｃｇａａｃｇｃｇｃｃｇａｇｇｇｃｃｇｃｃａｃｔｃｃａｃｃｇｇｃｇｇｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃａａｇｔａｇ

【0312】

＞配列番号５、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
Ｇａｔａｃａｔｔｇａｔｇａｇｔｔｔｇｇａｃａａａｃｃａｃａａｃｔａｇａａｔｇｃａｇｔｇａａａａａａａｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｇｔｇａａａｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔａｔｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｇｔａａｃｃａｔｔａｔａａｇｃｔｇｃａａｔａａａｃａａｇｔｔａａｃａａｃａａｃａａｔｔｇｃａｔｔｃａｔｔｔｔａｔｇｔｔｔｃａｇｇｔｔｃａｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｔｔｔｔｔｔａａａｇｃａａｇｔａａａａｃｃｔｃｔａｃａａａｔｇｔｇｇｔａｔｇｇｃｔｇａｔｔａｔｇａｔｃ

【0313】

＞配列番号６、野生型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0314】

＞配列番号７、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター
Ａｔｔｃｔａｃｃｇｇｇｔａｇｇｇｇａｇｇｃｇｃｔｔｔｔｃｃｃａａｇｇｃａｇｔｃｔｇｇａｇｃａｔｇｃｇｃｔｔｔａｇｃａｇｃｃｃｃｇｃｔｇｇｇｃａｃｔｔｇｇｃｇｃｔａｃａｃａａｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｇｃｃｔｃｇｃａｃａｃａｔｔｃｃａｃａｔｃｃａｃｃｇｇｔａｇｇｃｇｃｃａａｃｃｇｇｃｔｃｃｇｔｔｃｔｔｔｇｇｔｇｇｃｃｃｃｔｔｃｇｃｇｃｃａｃｃｔｔｃｔａｃｔｃｃｔｃｃｃｃｔａｇｔｃａｇｇａａｇｔｔｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｇｃａｇｃｔｃｇｃｇｔｃｇｔｇｃａｇｇａｃｇｔｇａｃａａａｔｇｇａａｇｔａｇｃａｃｇｔｃｔｃａｃｔａｇｔｃｔｃｇｔｇｃａｇａｔｇｇａｃａｇｃａｃｃｇｃｔｇａｇｃａａｔｇｇａａｇｃｇｇｇｔａｇｇｃｃｔｔｔｇｇｇｇｃａｇｃｇｇｃｃａａｔａｇｃａｇｃｔｔｔｇｃｔｃｃｔｔｃｇｃｔｔｔｃｔｇｇｇｃｔｃａｇａｇｇｃｔｇｇｇａａｇｇｇｇｔｇｇｇｔｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｃｔｃａｇｇｇｇｃｇｇｇｃｔｃ

【0315】

＞配列番号８、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｌａｃｚｙａプロモーター
Ａｇｃｇｇｇｃａｇｔｇａｇｃｇｃａａｃｇｃａａｔｔａａｔｇｔｇａｇｔｔａｇｃｔｃａｃｔｃａｔｔａｇｇｃａｃｃｃｃａｇｇｃｔｔｔａｃａｃｔｔｔａｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇｇ

【0316】

＞配列番号９、単純ヘルペスウイルスポリアデニル化シグナル
Ｇｇｇｇｇａｇｇｃｔａａｃｔｇａａａｃａｃｇｇａａｇｇａｇａｃａａｔａｃｃｇｇａａｇｇａａｃｃｃｇｃｇｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａｔａａａａａｇａｃａｇａａｔａａａａｃｇｃａｃｇｇｔｇｔｔｇｇｇｔｃｇｔｔｔｇｔｔｃａｔａａａｃｇｃｇｇｇｇｔｔｃｇｇｔｃｃｃａｇｇｇｃｔｇｇｃａｃｔｃｔｇｔｃｇａｔａｃｃｃｃａｃｃｇａｇａｃｃｃｃａｔｔｇｇｇｇｃｃａａｔａｃｇｃｃｃｇｃｇｔｔｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃｃｃａｃｃｃｃａｃｃｃｃｃｃａａｇｔｔｃｇｇｇｔｇａａｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｃｃａａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｔａｇｃｃ

【0317】

＞配列番号１０、アンピシリン耐性遺伝子
ＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＴＡＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣ

【0318】

＞配列番号１１、ｐＵＣ５７プラスミド複製起点
Ｃｇｃｇｔｔｇｃｔｇｇｃｇｔｔｔｔｔｃｃａｔａｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａｃｇａｇｃａｔｃａｃａａａａａｔｃｇａｃｇｃｔｃａａｇｔｃａｇａｇｇｔｇｇｃｇａａａｃｃｃｇａｃａｇｇａｃｔａｔａａａｇａｔａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｃｃｃｔｃｇｔｇｃｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｇａｃｃｃｔｇｃｃｇｃｔｔａｃｃｇｇａｔａｃｃｔｇｔｃｃｇｃｃｔｔｔｃｔｃｃｃｔｔｃｇｇｇａａｇｃｇｔｇｇｃｇｃｔｔｔｃｔｃａｔａｇｃｔｃａｃｇｃｔｇｔａｇｇｔａｔｃｔｃａｇｔｔｃｇｇｔｇｔａｇｇｔｃｇｔｔｃｇｃｔｃｃａａｇｃｔｇｇｇｃｔｇｔｇｔｇｃａｃｇａａｃｃｃｃｃｃｇｔｔｃａｇｃｃｃｇａｃｃｇｃｔｇｃｇｃｃｔｔａｔｃｃｇｇｔａａｃｔａｔｃｇｔｃｔｔｇａｇｔｃｃａａｃｃｃｇｇｔａａｇａｃａｃｇａｃｔｔａｔｃｇｃｃａｃｔｇｇｃａｇｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔａａｃａｇｇａｔｔａｇｃａｇａｇｃｇａｇｇｔａｔｇｔａｇｇｃｇｇｔｇｃｔａｃａｇａｇｔｔｃｔｔｇａａｇｔｇｇｔｇｇｃｃｔａａｃｔａｃｇｇｃｔａｃａｃｔａｇａａｇａａｃａｇｔａｔｔｔｇｇｔａｔｃｔｇｃｇｃｔｃｔｇｃｔｇａａｇｃｃａｇｔｔａｃｃｔｔｃｇｇａａａａａｇａｇｔｔｇｇｔａｇｃｔｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃａａａｃａａａｃｃａｃｃｇｃｔｇｇｔａｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔｇｃａａｇｃａｇｃａｇａｔｔａｃｇｃｇｃａｇａａａａａａａｇｇａｔｃｔｃａａｇａａｇａｔｃｃｔｔｔ

【0319】

＞配列番号１２、Ｐ６１４ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0320】

＞配列番号１３、Ｐ６１５ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0321】

＞配列番号１４、Ｐ６１６ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0322】

＞配列番号１５、Ｐ６２３ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔａａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0323】

＞配列番号１６、Ｐ６２４ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔａａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0324】

＞配列番号１７、Ｐ６２６ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇｇｃｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔａａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0325】

＞配列番号１８、ＡＰＨ（６）－Ｉａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0326】

＞配列番号１９、ＡＰＨ（６）－Ｉｂアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0327】

＞配列番号２０、Ｐ６２９ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇｇｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔａａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0328】

＞配列番号２１、Ｐ６４１ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇａｇｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0329】

＞配列番号２２、Ｐ６４２ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇｇｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0330】

＞配列番号２３、Ｐ６４３ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇｇｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0331】

＞配列番号２４、Ｐ６７５ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇｇｃａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔａａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0332】

＞配列番号２５、Ｐ６７６ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0333】

＞配列番号２６、Ｐ６７７ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0334】

＞配列番号２７、Ｐ６７８ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｔｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔａａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0335】

＞配列番号２８、Ｐ６７９ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0336】

＞配列番号２９、Ｐ６８０ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0337】

＞配列番号３０、Ｐ６８１ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0338】

＞配列番号３１、Ｐ６８２ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0339】

＞配列番号３２、Ｐ６８３ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0340】

＞配列番号３３、Ｐ６８４ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0341】

＞配列番号３４、Ｐ６８５ Ｎｅｏ ＯＲＦ
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【0342】

＞配列番号３５、Ｐ６８６ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃａｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0343】

＞配列番号３６、Ｐ６８７ Ｎｅｏ ＯＲＦ
Ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃａｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｔｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0344】

＞配列番号３７、Ｐ６８８ Ｎｅｏ ＯＲＦ
ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃａｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇｇｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａ

【0345】

＞配列番号３８、Ｐ６８３（Ｖ３６Ｍ Ｇ２１０Ａ）
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＭＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＳＭＰＤＧＥＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＡＲＬＧＶＡＤＲＹＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＤＥＦＦ

【0346】

＞配列番号３９、Ｐ６８７（Ｖ３６Ｍ Ｅ１８２Ｄ）
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＭＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＳＭＰＤＧＤＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＧＲＬＧＶＡＤＲＹＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＤＥＦＦ

【0347】

＞配列番号４０、Ｐ６８５（Ｖ３６Ｍ Ｙ２１８Ｆ）
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＭＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＳＭＰＤＧＥＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＧＲＬＧＶＡＤＲＦＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＤＥＦＦ

【0348】

＞配列番号４１、Ｐ６２９（Ｄ２１６Ｇ Ｄ２６１Ｎ）
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＶＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＳＭＰＤＧＥＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＧＲＬＧＶＡＧＲＹＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＮＥＦＦ

【0349】

＞配列番号４２、Ｐ６８４（Ｖ３６Ｍ Ｙ２１８Ｓ）
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＭＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＳＭＰＤＧＥＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＧＲＬＧＶＡＤＲＳＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＤＥＦＦ

【0350】

＞配列番号４３、Ｐ６８８（Ｖ３６Ｍ Ｄ２１６Ｇ）
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＭＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＳＭＰＤＧＥＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＧＲＬＧＶＡＧＲＹＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＤＥＦＦ

【0351】

＞配列番号４４
ＭＩＥＱＤＧＬＨＡＧＳＰＡＡＷＶＥＲＬＦＧＹＤＷＡＱＱＴＩＧＣＳＤＡＡＶＦＲＬＳＡＱＧＲＰＶＬＦＶＫＴＤＬＳＧＡＬＮＥＬＱＤＥＡＡＲＬＳＷＬＡＴＴＧＶＰＣＡＡＶＬＤＶＶＴＥＡＧＲＤＷＬＬＬＧＥＶＰＧＱＤＬＬＳＳＨＬＡＰＡＥＫＶＳＩＭＡＤＡＭＲＲＬＨＴＬＤＰＡＴＣＰＦＤＨＱＡＫＨＲＩＥＲＡＲＴＲＭＥＡＧＬＶＤＱＤＤＬＤＥＥＨＱＧＬＡＰＡＥＬＦＡＲＬＫＡＲＭＰＤＧＥＤＬＶＶＴＨＧＤＡＣＬＰＮＩＭＶＥＮＧＲＦＳＧＦＩＤＣＧＲＬＧＶＡＤＲＹＱＤＩＡＬＡＴＲＤＩＡＥＥＬＧＧＥＷＡＤＲＦＬＶＬＹＧＩＡＡＰＤＳＱＲＩＡＦＹＲＬＬＤＥＦＦ

【0352】

＞配列番号４５、ＡＰＨ（６）－Ｉｃアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0353】

＞配列番号４６、ＡＰＨ（６）－Ｉｄアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0354】

＞配列番号４７、ＡＰＨ（３’）－ＩＩＩａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0355】

配列番号４８、ＡＰＨ（３’）－ＶＩＩａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0356】

配列番号４９、ＡＰＨ（３’）－ＶＩａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0357】

配列番号５０、ＡＰＨ（３’）－ＩＶａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0358】

配列番号５１、ＡＰＨ（３’）－Ｉａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0359】

配列番号５２、ＡＰＨ（３’）－Ｉｃアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0360】

配列番号５３、ＡＰＨ（３’）－Ｉｂアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0361】

配列番号５４、ＡＰＨ（３’）－ＩＩａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0362】

配列番号５５、ＡＰＨ（３’）－Ｖｂアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0363】

配列番号５６、ＡＰＨ（３’）－Ｖａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0364】

配列番号５７、ＡＰＨ（３’）－Ｖｃアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0365】

配列番号５８、ＡＰＨ（３”）－Ｉａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0366】

配列番号５９、ＡＰＨ（３”）－Ｉｂアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0367】

配列番号６０、ＡＰＨ（２”）－Ｉａアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0368】

配列番号６１、ＡＰＨ（４）－Ｉｂアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0369】

配列番号６２、ＡＰＨ（４）－Ｉｂアミノ酸配列
（アミノ酸配列については図６Ａ～図６Ｂを参照されたい）

【0370】

本発明の特定の実施形態が本明細書に記載される。前述の説明を読むと、開示された実施形態の変形形態は、当業者に明らかになり得、必要に応じてかかる変形形態を採用し得ることが予想される。したがって、本発明が、本明細書に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されること、並びに本発明が、適用法によって許可されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての修正物及び均等物を含むことが意図される。更に、全ての可能性のあるこれらの変形形態における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において別途記載のない限り、又は文脈が明らかに矛盾しない限り、本明細書に包含される。本発明の多くの実施形態が説明されてきた。しかしながら、様々な修正が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく実行され得ることが、理解されるであろう。したがって、実施例のセクションにおける説明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するのではなく、例示することを意図するものである。

【0371】

本明細書に引用される全ての参照は、その全体を参照することにより、各個別の文献又は特許若しくは特許出願書があらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示した場合と同程度にあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A-1】

【図6A-2】

【図6A-3】

【図6B-1】

【図6B-2】

【図6B-3】

【配列表】

2024516153000001.app

【国際調査報告】