特表 2024-516200 環状ＲＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-12

(54)【発明の名称】環状ＲＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240405BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/67 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/90 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240405BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240405BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/67 Z

C12N15/12

C12N15/31

C12N15/55

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/85 Z

C12N15/87 Z

C12N15/90 100Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/071

C12P19/34 A

A61K31/7105

A61K31/712

A61P27/02

A61P17/00

A61P17/06

A61P17/02

A61P35/00

A61P3/04

A61P7/06

A61K38/20

A61K38/16

A61K39/00 H

A61K35/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565371

(86)(22)【出願日】2022-04-27

(85)【翻訳文提出日】2023-12-18

(86)【国際出願番号】 US2022026564

(87)【国際公開番号】W WO2022232291

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/180,387

(32)【優先日】2021-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514141673

【氏名又は名称】ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】エンジェル，マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ローデ，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】スヴィフラ，アイシャ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B064AF27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084DA12

4C084NA14

4C084ZA33

4C084ZA55

4C084ZA70

4C084ZA89

4C084ZB26

4C085AA03

4C085BA99

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA33

4C086ZA55

4C086ZA70

4C086ZA89

4C086ZB26

4C086ZC52

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB44

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZC41

4C087ZC52

(57)【要約】

【課題】
改善された環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）組成物、及びｃｉｒｃＲＮＡの作製方法が必要とされる。
【解決方法】
核酸内の実質的に相補的な領域のハイブリダイゼーション及びＲＮＡリガーゼとの接触を含み得る、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の形成を促進する核酸構造。該核酸構造は、遺伝子編集応用及び／または治療応用に使用され得る。一部の実施形態では、該核酸は、構造：５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’を含み、構造中、Ｘ、Ｙ、Ｙ’、及びＺは各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含み、Ｙ及びＹ’は、実質的に相補的であり、Ｘ及びＺは、実質的に相補的ではなく、ＩＲＥＳは、配列内リボソーム進入部位を含み、ＣＤＳは、コード配列を含み、Ａ、Ｂ、及びＣは各々独立して、１つもしくは複数のヌクレオチドを含むスペーサー、またはヌルである。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記構造：
５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’、
の核酸を含み、構造中、
Ｙ及びＹ’が各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含み、Ｙ及びＹ’が、実質的に相補的であり、
Ｘ及びＺが各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含み、Ｘ及びＺが、実質的に相補的ではなく、
ＩＲＥＳが、配列内リボソーム進入部位を含み、
ＣＤＳが、コード配列を含み、
Ａ、Ｂ、及びＣが各々独立して、１つもしくは複数のヌクレオチドを含むスペーサー、またはヌルである、組成物。

【請求項2】

前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＲＮＡが合成ＲＮＡである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記核酸が、例えば、ＲＮＡリガーゼと接触させられたときに、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を形成する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＣＤＳが、１つまたは複数のエクソンを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ＣＤＳが、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードする、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記目的のタンパク質が、可溶性タンパク質である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記目的のタンパク質が、表１、表２、または表３の任意の遺伝子のタンパク質産物を含めて、表１、表２、または表３から選択される、請求項６または請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記目的のタンパク質が、任意選択でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９１マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９４マイクロ－ＲＮＡ及びｍｉＲ２９５マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロ－ＲＮＡ、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数のリプログラミング因子である、請求項６または請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

前記目的のタンパク質が、任意選択でヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１ Ｃａｓタンパク質、クラス２ Ｃａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である、請求項６または請求項７に記載の組成物。

【請求項11】

前記目的のタンパク質が、（ｉ）複数のリピート配列を含み、前記リピート配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧまたはＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＴＨＧを含み、３６～３９アミノ酸長であり、前記配列中、「ｖ」が、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」が、ＳまたはＮであり、「ｘ」が、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」が、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはヌルであり、「ｚ」が、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤまたはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである、ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインとを含む、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である、請求項６または請求項７に記載の組成物。

【請求項12】

前記目的のタンパク質が、（ｉ）複数のリピート配列を含み、前記リピート配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚαを含み、３６～３９アミノ酸長であり、前記配列中、ｖが、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、ｗが、ＳまたはＮであり、ｘが、Ｉ、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、ｙが、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、またはヌルであり、ｚが、ＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡであり、αが、４つの連続したアミノ酸である、ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインとを含む、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である、請求項６または請求項７に記載の組成物。

【請求項13】

αが、ＧＨＧＧ、ＨＧＳＧ、ＨＧＧＧ、ＧＧＨＤ、ＧＡＨＤ、ＡＨＤＧ、ＰＨＤＧ、ＧＰＨＤ、ＧＨＧＰ、ＰＨＧＧ、ＰＨＧＰ、ＡＨＧＡ、ＬＨＧＡ、ＶＨＧＡ、ＩＶＨＧ、ＩＨＧＭ、ＲＨＧＤ、ＲＤＨＧ、ＲＨＧＥ、ＨＲＧＥ、ＲＨＧＤ、ＨＲＧＤ、ＧＰＹＥ、ＮＨＧＧ、ＴＨＧＧ、ＧＴＨＧ、ＧＳＧＳ、ＧＳＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＲＧＧ、及びＧＫＧＧから選択される、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記ＩＲＥＳが、ｃＭｙｃ、ＣＶＢ３（コクサッキーウイルスＢ３）、ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

前記ＩＲＥＳが、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｏｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、及びコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

前記核酸が、３’末端またはその近くにＩＩＳ型制限酵素部位をさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項17】

Ａが、１つまたは複数のヌクレオチドを含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項18】

前記Ａがヌルである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

Ｙ及びＹ’が、完全に相補的である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

Ｙ及びＹ’が、部分的に相補的である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

Ｘ、Ｚ、Ｙ、及びＹ’が、ヘアピン構造を形成する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

前記ヘアピン構造が、緩いヘアピンである、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記ヘアピン構造が、堅いヘアピンである、請求項２１に記載の組成物。

【請求項24】

Ｘ、Ｚ、Ｙ、及びＹ’が、ヘアピン構造を形成しない、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項25】

Ｘ、Ｚ、Ｙ、及びＹ’が、図２の構造を形成する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項26】

Ｘ及びＺが、ＲＮＡリガーゼとの相互作用に好適である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項27】

前記ＲＮＡリガーゼが、一本鎖ＲＮＡリガーゼである、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記一本鎖ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物である、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

前記ｃｉｒｃＲＮＡが、エキソヌクレアーゼから実質的に安定している、請求項４～２８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項30】

前記核酸が、インビトロ転写による合成に好適である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか１項に記載の核酸組成物または請求項４～３０のいずれか１項に記載のｃｉｒｃＲＮＡ組成物と、薬学的に許容される担体、ビヒクル、または賦形剤とを含む、薬学的組成物。

【請求項32】

請求項１～３０のいずれか１項に記載の組成物を含む宿主細胞。

【請求項33】

ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載の核酸組成物を１つまたは複数のＲＮＡリガーゼと接触させて、前記核酸の環状化及び前記ｃｉｒｃＲＮＡの形成をもたらすことを含む、前記方法。

【請求項34】

前記ＲＮＡリガーゼが、一本鎖ＲＮＡリガーゼである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記一本鎖ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記核酸が、インビトロ転写によって合成される、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記核酸が、任意選択で５－メチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－メトキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－メトキシシュードウリジン、及び５－ホルミルシュードウリジンから選択される、少なくとも１つの非標準ヌクレオチドを含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記核酸が、いずれの非標準ヌクレオチドも欠いている、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

細胞において目的のタンパク質を発現させる方法であって、前記細胞を請求項１～３０のいずれか１項に記載の核酸組成物または請求項４～３０のいずれか１項に記載のｃｉｒｃＲＮＡ組成物と接触させることを含む、前記方法。

【請求項40】

前記細胞が、軽度低温条件で接触させられる、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記軽度低温条件が、約３０℃～約３６℃である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

細胞において標的核酸を遺伝子編集する方法であって、前記細胞を請求項１０～３１のいずれか１項に記載の組成物または薬学的組成物と接触させることを含み、
ａ．前記組成物が、ｃｉｒｃＲＮＡを含み、
ｂ．前記ＣＤＳが、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードし、前記目的のタンパク質が、任意選択でヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１ Ｃａｓタンパク質、クラス２ Ｃａｓタンパク質、ＭＡＤ７、及びＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚαを含むリピート配列を含む遺伝子編集タンパク質、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質であり、
ｃ．前記遺伝子編集タンパク質が、前記標的核酸に指向される、前記方法。

【請求項43】

前記細胞が、軽度低温条件、例えば、約３０℃～約３６℃で接触させられる、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記標的核酸が、表２から選択される遺伝子であるか、または表１もしくは表３から選択されるペプチドもしくはタンパク質をコードする、請求項４２または４３に記載の方法。

【請求項45】

前記方法が、例えば、前記細胞を請求項９または１４～３０のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記細胞をリプログラミングすることをさらに含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

細胞をリプログラミングする方法であって、前記細胞を請求項９または１４～３１のいずれか１項に記載の組成物または薬学的組成物と接触させることを含み、
ａ．前記組成物が、ｃｉｒｃＲＮＡを含み、
ｂ．前記ＣＤＳが、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードし、前記目的のタンパク質が、任意選択でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９１マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９４マイクロ－ＲＮＡ及びｍｉＲ２９５マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロ－ＲＮＡ、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数のリプログラミング因子である、前記方法。

【請求項47】

前記方法が、（ａ）分化細胞または非多能性細胞を用意することと、（ｂ）前記分化細胞または前記非多能性細胞を培養することと、（ｃ）前記分化細胞または前記非多能性細胞に前記ｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトすることとを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記トランスフェクトすることが、エレクトロポレーションを介する、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

ステップ（ｃ）が、分化状態または非多能性状態からより低い分化状態へのリプログラミングを補助する成分を含有する培地の存在下で起こる、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

ステップ（ｃ）を連続５日間の間に少なくとも２回繰り返すことをさらに含む、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

１つまたは複数のより後のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡ分子の量が、１つまたは複数のより先のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる量よりも多い、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

ステップ（ａ）～（ｃ）が、フィーダー細胞を使用することなく実施され、フィーダー細胞馴化培地の存在下で起こる、請求項４６～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

ステップ（ｃ）が、放射線照射したヒト新生児線維芽細胞フィーダー細胞を使用することなく実施され、フィーダー細胞馴化培地の存在下で起こる、請求項４６～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記ｃｉｒｃＲＮＡ分子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９１マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９４マイクロ－ＲＮＡ及びｍｉＲ２９５マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロ－ＲＮＡ、ならびにそれらの生物学的に活性な断片、類似体、バリアント、及びファミリーメンバーから選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、またはそれよりも多くのリプログラミング因子（複数可）をコードする、請求項４６～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記分化細胞または前記非多能性細胞が、生検に由来する、請求項４７～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記分化細胞または前記非多能性細胞が、ヒト対象からのものである、請求項４７～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記分化細胞または前記非多能性細胞が、皮膚パンチ生検試料に由来する、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

前記分化細胞または前記非多能性細胞が、皮膚細胞、例えば、線維芽細胞またはケラチノサイトである、請求項４７～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記細胞をポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ＲＧＤペプチド、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、及びラミニンの群の少なくとも１つの成員と接触させること、または前記細胞をポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ＲＧＤペプチド、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、及びラミニンの群の少なくとも１つの成員とさらに接触させることをさらに含む、請求項４６～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記ｃｉｒｃＲＮＡ分子が、任意選択で５－メチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－メトキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－メトキシシュードウリジン、及び５－ホルミルシュードウリジンから選択される、少なくとも１つの非標準ヌクレオチドを含む、請求項４６～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記ｃｉｒｃＲＮＡ分子が、いずれの非標準ヌクレオチドも欠いている、請求項４６～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記培地が、免疫抑制剤を実質的に含まない、請求項４９～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記細胞が、軽度低温条件、例えば、約３０℃～約３６℃で接触させられる、請求項４６～６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記方法が、例えば、前記細胞を請求項１０～３０のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記細胞を遺伝子編集することをさらに含む、請求項４９～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記遺伝子編集が、表２から選択される遺伝子であるか、または表１もしくは表３から選択されるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸を標的とする、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

疾患、障害、または病態を処置する方法であって、
（ａ）細胞を請求項１～３１のいずれか１項に記載の組成物もしくは薬学的組成物と接触させ、前記細胞を、それを必要とする患者に投与すること、または
（ｂ）請求項１～３１のいずれか１項に記載の組成物もしくは薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与すること、を含む、前記方法。

【請求項67】

前記疾患、障害、または病態が、表１または表３から選択される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記ｃｉｒｃＲＮＡ分子が、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、チェックポイント阻害剤、抗体、ナノボディ、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物のうちの１つまたは複数をコードする、請求項３３～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記ｃｉｒｃＲＮＡ分子が、インターロイキン７、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８、ドミナントネガティブＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ｄｎＴＧＦ－βＲＩＩ）、構成的に活性なＡｋｔ（ｃａＡｋｔ）、もしくはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物のうちの１つまたは複数をコードする、請求項３３～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記ｃｉｒｃＲＮＡが、ワクチン接種を必要とする対象に導入されたときにワクチンとしての役目を果たす目的のタンパク質をコードする、請求項３３～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記遺伝子編集が、前記細胞に修復鋳型として作用する核酸をトランスフェクトすることをさらに含む、請求項４２～４５または請求項６４～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記修復鋳型が、遺伝子編集の領域、例えば、一本鎖切断もしくは二本鎖切断におけるＤＮＡ配列の挿入を引き起こすか、または前記遺伝子編集の前記領域における前記ＤＮＡ配列を別様に変化させるかのいずれかである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記遺伝子編集が、ゲノム内セーフハーバー遺伝子座、例えば、ＴＲＡＣ及びＡＡＶＳ１を標的とする、請求項４２～４５、６４～６７、７１、または７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記リプログラミングされた細胞が、幹細胞療法の関連においてそれを必要とする対象に提供される、請求項４６～６７のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８０，３８７号の利益を主張する。前述の特許出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

線状ＲＮＡ分子は、生物学的研究及び治療法の開発において多くの応用を有する。しかしながら、長い線状ＲＮＡ分子の比較的短い半減期が、長期的なタンパク質翻訳が所望される応用におけるそれらの使用を限定し得る。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、マウス、及びヒトを含めた種々の生物に存在することが報告されており、マイクロＲＮＡスポンジ及びタンパク質発現を含めた応用のために探索されている。ｃｉｒｃＲＮＡを合成するための方法には、線状ＲＮＡの５’及び３’末端をライゲーションのために近接させるためのスプリント分子の使用、及びインビトロで転写された（ｉＶＴ）ＲＮＡ分子の５’及び３’末端を共有結合性で連結するための自己スプライシングイントロンと併せたリボザイム方法の使用が含まれる。しかしながら、これらの方法は、効率が低いという難点があるか、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して除去されなければならない細胞毒性副産物をもたらす。必要とされるのは、改善されたｃｉｒｃＲＮＡ組成物、及びｃｉｒｃＲＮＡの作製方法である。

【発明の概要】

【0003】

したがって、本開示は、複数の態様において、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の形成を促進するように操作されているＲＮＡ分子、ｃｉｒｃＲＮＡを作製するための方法、及びｃｉｒｃＲＮＡ自体に関する。

【0004】

複数の態様では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法及びそれからもたらされるｃｉｒｃＲＮＡを提供する。

【0005】

複数の態様では、本開示は、細胞毒性副産物を実質的に含まないｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。複数の実施形態では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するためのライゲーションを補助するために線状ＲＮＡの２つの反応末端を予め配向させるための線状オリゴヌクレオチド（スプリント）を必要としない、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。複数の実施形態では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するためにリボザイムを必要としない、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。複数の実施形態では、本開示は、例えばライゲーション後に、ＨＰＬＣに基づく精製を必要としない、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。

【0006】

本開示のある態様は、構造：５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’の核酸を含む組成物である。この態様では、Ｙ及びＹ’は各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含み、Ｙ及びＹ’は、実質的に相補的であり、Ｘ及びＺは各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含み、Ｘ及びＺは、実質的に相補的ではなく、ＩＲＥＳは、配列内リボソーム進入部位を含み、ＣＤＳは、コード配列を含み、Ａ、Ｂ、及びＣは各々独立して、１つもしくは複数のヌクレオチドを含むスペーサー、またはヌルである。

【0007】

複数の実施形態では、目的のタンパク質は、表１、表２、または表３の任意の遺伝子のタンパク質産物を含めて、表１、表２、または表３から選択される。

【0008】

一部の実施形態では、目的のタンパク質は、（ｉ）複数のリピート配列を含み、該リピート配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧまたはＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＴＨＧを含み、３６～３９アミノ酸長であり、配列中、「ｖ」が、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」が、ＳまたはＮであり、「ｘ」が、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」が、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはヌルであり、「ｚ」が、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤまたはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである、ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインとを含む、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である。

【0009】

種々の実施形態では、目的のタンパク質は、（ｉ）複数のリピート配列を含み、該リピート配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚαを含み、３６～３９アミノ酸長であり、配列中、ｖが、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、ｗが、ＳまたはＮであり、ｘが、Ｉ、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、ｙが、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、またはヌルであり、ｚが、ＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡであり、αが、４つの連続したアミノ酸である、ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインとを含む、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である。一部の実例では、αは、ＧＨＧＧ、ＨＧＳＧ、ＨＧＧＧ、ＧＧＨＤ、ＧＡＨＤ、ＡＨＤＧ、ＰＨＤＧ、ＧＰＨＤ、ＧＨＧＰ、ＰＨＧＧ、ＰＨＧＰ、ＡＨＧＡ、ＬＨＧＡ、ＶＨＧＡ、ＩＶＨＧ、ＩＨＧＭ、ＲＨＧＤ、ＲＤＨＧ、ＲＨＧＥ、ＨＲＧＥ、ＲＨＧＤ、ＨＲＧＤ、ＧＰＹＥ、ＮＨＧＧ、ＴＨＧＧ、ＧＴＨＧ、ＧＳＧＳ、ＧＳＧＧ、ＧＧＧＧから選択される。

【0010】

本開示の別の態様は、本明細書に開示されるいずれかの核酸組成物または本明細書に開示されるいずれかのｃｉｒｃＲＮＡ組成物と、薬学的に許容される担体、ビヒクル、または賦形剤とを含む、薬学的組成物である。

【0011】

本開示のなおも別の態様は、本明細書に開示されるいずれかの組成物を含む宿主細胞である。

【0012】

ある態様では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。該方法は、本明細書に開示されるいずれかの核酸組成物を１つまたは複数のＲＮＡリガーゼと接触させて、該核酸の環状化及びｃｉｒｃＲＮＡの形成をもたらすステップを含む。

【0013】

別の態様では、本開示は、細胞において目的のタンパク質を発現させる方法を提供する。該方法は、細胞を本明細書に開示されるいずれかの核酸または本明細書に開示されるいずれかのｃｉｒｃＲＮＡ組成物と接触させるステップを含む。

【0014】

なおも別の態様では、本開示は、細胞において標的核酸を遺伝子編集する方法を提供する。該方法は、細胞を本明細書に開示されるいずれかの組成物または本明細書に開示されるいずれかの薬学的組成物と接触させるステップを含む。この態様では、該組成物は、ＣＤＳが、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードし、該目的のタンパク質が、任意選択でヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１ Ｃａｓタンパク質、クラス２ Ｃａｓタンパク質、ＭＡＤ７、及びＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚαを含むリピート配列を含む遺伝子編集タンパク質、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である、ｃｉｒｃＲＮＡを含む。この態様では、遺伝子編集タンパク質は、標的核酸に指向される。

【0015】

複数の実施形態では、標的核酸は、表２から選択される遺伝子であるか、または表１もしくは表３から選択されるペプチドもしくはタンパク質をコードする。

【0016】

一部の実施形態では、該方法は、例えば、リプログラミング因子をコードするＣＤＳを含むｃｉｒＣＲＮＡを含む本明細書に開示される組成物と細胞を接触させることを含む、細胞をリプログラミングすることをさらに含む。

【0017】

本開示のある態様は、細胞をリプログラミングする方法である。該方法は、細胞を本明細書に開示されるいずれかの組成物または本明細書に開示されるいずれかの薬学的組成物と接触させるステップを含む。この態様では、該組成物は、ｃｉｒｃＲＮＡを含み、ＣＤＳは、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードし、目的のタンパク質が、任意選択でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９１マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９４マイクロ－ＲＮＡ及びｍｉＲ２９５マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロ－ＲＮＡ、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数のリプログラミング因子である。一部の実例では、ＣＤＳは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、またはそれよりも多くのリプログラミング因子（複数可）をコードする。

【0018】

種々の実施形態では、該方法は、（ａ）分化細胞または非多能性細胞を用意することと、（ｂ）分化細胞または非多能性細胞を培養することと、（ｃ）分化細胞または非多能性細胞にｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトすることとを含む。

【0019】

複数の実施形態では、該方法は、例えば、ＣＤＳが、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードし、該目的のタンパク質が、任意選択でヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１ Ｃａｓタンパク質、クラス２ Ｃａｓタンパク質、ＭＡＤ７、及びＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚαを含むリピート配列を含む遺伝子編集タンパク質、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である、ｃｉｒｃＲＮＡを含む本明細書のいずれかの組成物と細胞を接触させることを含む、細胞を遺伝子編集することをさらに含む。複数の実施形態では、遺伝子編集は、表２から選択される遺伝子であるか、または表１もしくは表３から選択されるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸を標的とする。

【0020】

本開示の別の態様は、疾患、障害、または病態を処置する方法である。該方法は、（１）細胞を本明細書に開示されるいずれかの組成物または本明細書に開示されるいずれかの薬学的組成物と接触させ、細胞を、それを必要とする患者に投与するステップ、または（２）本明細書に開示されるいずれかの組成物または本明細書に開示されるいずれかの薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む。複数の実施形態では、疾患、障害、または病態は、表１または表３から選択される。

【0021】

本明細書に記載の任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】非相補的及び相補的配列エレメントを介したＲＮＡ環状化の向上の非限定的な図である。

【図2】種々の５’及び３’のＲＮＡ塩基付加から予測される二次構造を示す。丸で囲まれた領域は、一番５’側のヌクレオチドを示す。

【図3】ｃｉｒｃＲＮＡの生成を示すゲルである（条件については図２を参照されたい）。

【図4】ｃｉｒｃＲＮＡ合成中のＲＮＡ産物を示す。レーン１：インビトロ転写反応。レーン２：Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１を使用したｉｖＴ産物の一晩のライゲーション。レーン３：子ウシ腸由来ホスファターゼ処理後のライゲーション産物。レーン４：子ウシ腸由来ホスファターゼ処理及び線状産物のＲＮａｓｅ Ｒ消化後のライゲーション産物。

【図5】ヒト初代皮膚線維芽細胞にｃｉｒｃＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入したトランスフェクションを示す。エレクトロポレーションから２４時間後に取得した画像が示される。

【図6】ヒト初代皮膚線維芽細胞にｃｉｒｃＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入したトランスフェクションを示す。エレクトロポレーションから４８時間後に取得した画像が示される。

【図7】ヒト初代皮膚線維芽細胞にｃｉｒｃＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入したトランスフェクションを示す。エレクトロポレーションから７２時間後に取得した画像が示される。

【図8】細胞の平均蛍光強度対時間を示す。１２０，０００個のヒト初代皮膚線維芽細胞に、表示されるＩＲＥＳ、またはＧＦＰをコードする線状ＲＮＡを含む７５０ｎｇの環状ＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入した。細胞をエレクトロポレーション後の表示される時点で撮像し、各緑色細胞の平均強度を算出した。明確化のために、時点７２で、曲線は、上から下に、ＣＶＢ３＿ｖ４、ＣＶＢ３＿ｖ３、線状、ＥＭＣＶ、ｍｉｎＥ、及びＣｒＰＶである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本開示は、部分的には、ｃｉｒｃＲＮＡを効率的な様態で産出する方法の発見に基づく。

【0024】

複数の態様では、本開示は、例えば、非相補的及び相補的配列エレメントを介して、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するように操作されているＲＮＡを提供する。

【0025】

複数の態様では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法及びそれからもたらされるｃｉｒｃＲＮＡを提供する。

【0026】

ｃｉｒｃＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡを含む組成物
ｃｉｒｃＲＮＡは、頭部と尾部が接合されている一本鎖ＲＮＡを含む。ｃｉｒｃＲＮＡは、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及び植物ウイロイド等の病原性ゲノムにおいて最初に発見された。ｃｉｒｃＲＮＡは、疾患の潜在的な分子マーカーとして機能し得、腫瘍を含めたヒト疾患の発症及び進行において重要な役割を果たし得る。

【0027】

本開示のｃｉｒｃＲＮＡは、約１００ヌクレオチド長、約２００ヌクレオチド長、約３００ヌクレオチド長、約４００ヌクレオチド長、約５００ヌクレオチド長、約６００ヌクレオチド長、約７００ヌクレオチド長、約８００ヌクレオチド長、約９００ヌクレオチド長、約１０００ヌクレオチド長、約１１００ヌクレオチド長、約１２００ヌクレオチド長、約１３００ヌクレオチド長、約１４００ヌクレオチド長、約１５００ヌクレオチド長、約２０００ヌクレオチド長、約２５００ヌクレオチド長、約３０００ヌクレオチド長、約３５００ヌクレオチド長、約４０００ヌクレオチド長、約４５００ヌクレオチド長、約５０００ヌクレオチド長、約５５００ヌクレオチド長、約６０００ヌクレオチド長、約６５００ヌクレオチド長、約７０００ヌクレオチド長、約７５００ヌクレオチド長、約８０００ヌクレオチド長、約８５００ヌクレオチド長、約９０００ヌクレオチド長、約９５００ヌクレオチド長、または約１００００ヌクレオチド長であり得る。本開示のｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも約１００ヌクレオチド長、少なくとも約２００ヌクレオチド長、少なくとも約３００ヌクレオチド長、少なくとも約４００ヌクレオチド長、少なくとも約５００ヌクレオチド長、少なくとも約６００ヌクレオチド長、少なくとも約７００ヌクレオチド長、少なくとも約８００ヌクレオチド長、少なくとも約９００ヌクレオチド長、少なくとも約１０００ヌクレオチド長、少なくとも約１１００ヌクレオチド長、少なくとも約１２００ヌクレオチド長、少なくとも約１３００ヌクレオチド長、少なくとも約１４００ヌクレオチド長、少なくとも約１５００ヌクレオチド長、少なくとも約１６００ヌクレオチド長、少なくとも約１７００ヌクレオチド長、少なくとも約１８００ヌクレオチド長、少なくとも約１９００ヌクレオチド長、少なくとも約２０００ヌクレオチド長、少なくとも約２５００ヌクレオチド長、少なくとも約３０００ヌクレオチド長、少なくとも約３５００ヌクレオチド長、少なくとも約４０００ヌクレオチド長、少なくとも約４５００ヌクレオチド長、少なくとも約５０００ヌクレオチド長、少なくとも約５５００ヌクレオチド長、少なくとも約６０００ヌクレオチド長、少なくとも約６５００ヌクレオチド長、少なくとも約７０００ヌクレオチド長、少なくとも約７５００ヌクレオチド長、少なくとも約８０００ヌクレオチド長、少なくとも約８５００ヌクレオチド長、少なくとも約９０００ヌクレオチド長、少なくとも約９５００ヌクレオチド長、または少なくとも約１００００ヌクレオチド長であり得る。本開示のｃｉｒｃＲＮＡは、約１００～約２００ヌクレオチド長、約２００～約３００ヌクレオチド長、約３００～約４００ヌクレオチド長、約４００～約５００ヌクレオチド長、約５００～約６００ヌクレオチド長、約６００～約７００ヌクレオチド長、約７００～約８００ヌクレオチド長、約８００～約９００ヌクレオチド長、約９００～約１０００ヌクレオチド長、約１０００～約１１００ヌクレオチド長、約１１００～約１２００ヌクレオチド長、約１２００～約１３００ヌクレオチド長、約１３００～約１４００ヌクレオチド長、約１４００～約１５００ヌクレオチド長、約１５００～約２０００ヌクレオチド長、約２０００～約２５００ヌクレオチド長、約２５００～約３０００ヌクレオチド長、約３０００～約３５００ヌクレオチド長、約３５００～約４０００ヌクレオチド長、約４０００～約４５００ヌクレオチド長、約４５００～約５０００ヌクレオチド長、約５０００～約５５００ヌクレオチド長、約５５００～約６０００ヌクレオチド長、約６０００～約６５００ヌクレオチド長、約６５００～約７０００ヌクレオチド長、約７０００～約７５００ヌクレオチド長、約７５００～約８０００ヌクレオチド長、約８０００～約８５００ヌクレオチド長、約８５００～約９０００ヌクレオチド長、約９０００～約９５００ヌクレオチド長、または約９５００～約１００００ヌクレオチド長、及びそれらの間の任意の長さであり得る。

【0028】

線状前駆体からのｃｉｒｃＲＮＡの調製は、とりわけ、環状化ステップに関連する負のエントロピーに起因して、重大な課題を提示し得る。最も顕著な副反応は、分子内結合の形成が環状化の代わりに線状前駆体のオリゴマー形成をもたらすことであり得る。

【0029】

複数の態様では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するための効率的な環状化に好適である、操作された核酸、例えば、ＲＮＡに関する。複数の態様では、本開示は、５’及び３’末端に近接してヘアピンループを形成し、かかるヘアピンループを含まないＲＮＡ配列よりも分子内ライゲーションをより良好に補助する、ＲＮＡ配列に関する。

【0030】

複数の態様では、本開示は、構造：
５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’、
の核酸を含む組成物に関し、構造中、Ｙ及びＹ’は各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含み、Ｙ及びＹ’は、実質的に相補的であり、Ｘ及びＺは各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含み、Ｘ及びＺは、実質的に相補的ではなく、ＩＲＥＳは、配列内リボソーム進入部位を含み、ＣＤＳは、コード配列を含み、Ａ、Ｂ、及びＣは各々独立して、１つもしくは複数のヌクレオチドを含むスペーサー、またはヌルである。

【0031】

複数の実施形態では、該核酸はＲＮＡである。複数の実施形態では、該ＲＮＡは合成ＲＮＡである。

【0032】

複数の実施形態では、該核酸は、例えば、ＲＮＡリガーゼと接触させられたときに、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を形成する。

【0033】

複数の実施形態では、ＣＤＳは、さらに１つのエクソンを含む。複数の実施形態では、ＣＤＳは、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードする。複数の実施形態では、目的のタンパク質は、可溶性タンパク質である。複数の実施形態では、目的のタンパク質は、表１、表２、または表３の任意の遺伝子のタンパク質産物を含めて、表１、表２、または表３から選択される。

【0034】

複数の実施形態では、目的のタンパク質は、任意選択でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９１マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９４マイクロ－ＲＮＡ及びｍｉＲ２９５マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロ－ＲＮＡ、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数のリプログラミング因子である。

【0035】

複数の実施形態では、目的のタンパク質は、任意選択でヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１ Ｃａｓタンパク質、クラス２ Ｃａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である。

【0036】

複数の実施形態では、目的のタンパク質は、（ｉ）複数のリピート配列を含み、該リピート配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧまたはＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＴＨＧを含み、３６～３９アミノ酸長であり、配列中、「ｖ」が、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、「ｗ」が、ＳまたはＮであり、「ｘ」が、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」が、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはヌルであり、「ｚ」が、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤまたはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡである、ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインとを含む、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である。

【0037】

複数の実施形態では、目的のタンパク質は、（ｉ）複数のリピート配列を含み、該リピート配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚαを含み、３６～３９アミノ酸長であり、配列中、ｖが、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、ｗが、ＳまたはＮであり、ｘが、Ｉ、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、ｙが、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、またはヌルであり、ｚが、ＧＧＲＰＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ、またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡであり、αが、４つの連続したアミノ酸である、ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインとを含む、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質である。複数の実施形態では、αは、ＧＨＧＧ、ＨＧＳＧ、ＨＧＧＧ、ＧＧＨＤ、ＧＡＨＤ、ＡＨＤＧ、ＰＨＤＧ、ＧＰＨＤ、ＧＨＧＰ、ＰＨＧＧ、ＰＨＧＰ、ＡＨＧＡ、ＬＨＧＡ、ＶＨＧＡ、ＩＶＨＧ、ＩＨＧＭ、ＲＨＧＤ、ＲＤＨＧ、ＲＨＧＥ、ＨＲＧＥ、ＲＨＧＤ、ＨＲＧＤ、ＧＰＹＥ、ＮＨＧＧ、ＴＨＧＧ、ＧＴＨＧ、ＧＳＧＳ、ＧＳＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＲＧＧ、及びＧＫＧＧから選択される。

【0038】

複数の実施形態では、ＩＲＥＳは、ｃＭｙｃ、ＣＶＢ３（コクサッキーウイルスＢ３）、ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される。複数の実施形態では、ＩＲＥＳは、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｏｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、及びコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される。

【0039】

複数の実施形態では、該核酸は、３’末端またはその近くにＩＩＳ型制限酵素部位をさらに含む。

【0040】

複数の実施形態では、Ａは、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約５～２５、または約５～２０、または約５～１５、または約５～１５個のヌクレオチド、例えば、約５、または約１０、または約１５、または約２０、または約２５個のヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、Ａはヌルである。

【0041】

複数の実施形態では、Ｂは、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約５～２５、または約５～２０、または約５～１５、または約５～１５個のヌクレオチド、例えば、約５、または約１０、または約１５、または約２０、または約２５個のヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、Ｂはヌルである。

【0042】

複数の実施形態では、Ｃは、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約５～２５、または約５～２０、または約５～１５、または約５～１５個のヌクレオチド、例えば、約５、または約１０、または約１５、または約２０、または約２５個のヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、Ｃはヌルである。

【0043】

複数の実施形態では、Ａは、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約１～２００、または約５０～２００、または約１００～２００、または約１５０～２００個のヌクレオチド、例えば、約５０、または約７５、または約１００、または約１５０、または約２００個のヌクレオチドを含む。

【0044】

複数の実施形態では、Ｂは、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約１～２００、または約５０～２００、または約１００～２００、または約１５０～２００個のヌクレオチド、例えば、約５０、または約７５、または約１００、または約１５０、または約２００個のヌクレオチドを含む。

【0045】

複数の実施形態では、Ｃは、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約１～２００、または約５０～２００、または約１００～２００、または約１５０～２００個のヌクレオチド、例えば、約５０、または約７５、または約１００、または約１５０、または約２００個のヌクレオチドを含む。

【0046】

複数の実施形態では、Ａ、Ｂ、及びＣは、同一である。複数の実施形態では、Ａ、Ｂ、及びＣのうちの２つは、同一である。複数の実施形態では、Ａ、Ｂ、及びＣは、同一でない。

【0047】

複数の実施形態では、Ｙ及びＹ’は各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約１～２５、または約１～２０、または約１～１５、または約１～１５個のヌクレオチド、または約５～１０個のヌクレオチド、例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約１０、または約１５、または約２０、または約２５個のヌクレオチドを含む。

【0048】

複数の実施形態では、Ｘ及びＺは各々独立して、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、約１～２５、または約１～２０、または約１～１５、または約１～１５個のヌクレオチド、または約５～１０個のヌクレオチド、例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約１０、または約１５、または約２０、または約２５個のヌクレオチドを含む。

【0049】

複数の実施形態では、Ｙ及びＹ’は、完全に相補的である。複数の実施形態では、Ｙ及びＹ’は、部分的に相補的である。

【0050】

複数の実施形態では、Ｘ、Ｚ、Ｙ、及びＹ’は、ヘアピン構造を形成する。複数の実施形態では、ヘアピン構造は、２４個以下のヌクレオチドがヘアピン内で優先的に結合した緩いヘアピンである。複数の実施形態では、ヘアピン構造は、２４個を超えるヌクレオチドがヘアピン内で優先的に結合した堅い（ｔｉｇｈｔ）ヘアピンである。複数の実施形態では、Ｘ、Ｚ、Ｙ、及びＹ’は、ヘアピン構造を形成しない。複数の実施形態では、Ｘ、Ｚ、Ｙ、及びＹ’は、図２に例示される構造のうちの１つを形成する。

【0051】

複数の実施形態では、Ｘ及びＺは、ＲＮＡリガーゼとの相互作用に好適である。複数の実施形態では、ＲＮＡリガーゼは、一本鎖ＲＮＡリガーゼである。複数の実施形態では、一本鎖ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物である。

【0052】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、エキソヌクレアーゼから実質的に安定している。

【0053】

複数の実施形態では、該核酸は、インビトロ転写による合成に好適である。

【0054】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と同じ配列、または同等の配列を含む線状ＲＮＡ分子よりも良好な、吸収、有効性、生物学的利用能、及び／または半減期等の薬物動態挙動を有する。

【0055】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と同じ配列、または同等の配列を含む線状ＲＮＡ分子よりも良好な安定性を有する。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と同じ配列、または同等の配列を含む線状ＲＮＡ分子よりも良好な細胞内安定性を有する。

【0056】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と同じ配列、または同等の配列を含む線状ＲＮＡ分子よりも長い細胞内半減期を有する。

【0057】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子の細胞内半減期は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と同じ配列、または同等の配列を含む線状ＲＮＡ分子よりも少なくとも約３時間長いか、または少なくとも約６時間長いか、または少なくとも約１２時間長い。

【0058】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子の細胞内半減期は、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と同じ配列、または同等の配列を含む線状ＲＮＡ分子の少なくとも約１．５倍長いか、または少なくとも約３倍長いか、または少なくとも約５倍長いか、または少なくとも約１０倍長いか、または少なくとも約３０倍長いか、または少なくとも約１００倍長い。

【0059】

複数の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を含む（例えば、構造：５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’の線状核酸を含む）組成物と、薬学的に許容される担体、ビヒクル、または賦形剤とを含む、薬学的組成物が提供される。

【0060】

複数の実施形態では、本明細書に開示されるｃｉｒｃＲＮＡ分子を含む組成物と、薬学的に許容される担体、ビヒクル、または賦形剤とを含む、薬学的組成物が提供される。

【0061】

複数の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を含む（例えば、構造：５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’の線状核酸を含む）、または本明細書に開示される核酸を含む組成物を含む、宿主細胞が提供される。

【0062】

複数の実施形態では、本明細書に開示されるｃｉｒｃＲＮＡ分子、または本明細書に開示されるｃｉｒｃＲＮＡ分子を含む組成物を含む、宿主細胞が提供される。

【0063】

作製方法
複数の実施形態では、本開示は、細胞毒性副産物を実質的に含まないｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。

【0064】

複数の実施形態では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するためのライゲーションを補助するために線状ＲＮＡの２つの反応末端を予め配向させるための線状オリゴヌクレオチド（スプリント）を必要としない、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。複数の実施形態では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するためにリボザイムを必要としない、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。複数の実施形態では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するためのライゲーションを補助するために線状ＲＮＡの２つの反応末端を予め配向させるための線状オリゴヌクレオチド（スプリント）を必要とせず、かつｃｉｒｃＲＮＡを産出するためにリボザイムを必要としない、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。複数の実施形態では、本開示は、代替の方法、例えば、スプリントまたはリボザイムを伴う方法よりも良好なライゲーション効率を有する、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。

【0065】

複数の実施形態では、本開示は、例えばライゲーション後に、ＨＰＬＣに基づく精製を必要としない、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。

【0066】

複数の実施形態では、本開示は、５’及び３’末端に近接してヘアピンループを形成し、分子内ライゲーションを補助し、かかる分子内ライゲーションが、例えば、かかるヘアピンループを含まないＲＮＡ配列と比べて改善されている、核酸（例えば、構造：５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’の線状ＲＮＡ分子）を提供する。

【0067】

複数の実施形態では、本開示は、核酸（例えば、構造：５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’の線状ＲＮＡ分子）を含む本明細書に開示される組成物を１つまたは複数のＲＮＡリガーゼと接触させて、該核酸の環状化をもたらすことを含む、ｃｉｒｃＲＮＡの作製方法を提供する。複数の実施形態では、ＲＮＡリガーゼは、一本鎖ＲＮＡリガーゼである。複数の実施形態では、一本鎖ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物である。

【0068】

複数の実施形態では、該核酸（例えば、構造：５’－Ｘ－Ｙ－Ａ－ＩＲＥＳ－Ｂ－ＣＤＳ－Ｃ－Ｙ’－Ｚ－３’の線状ＲＮＡ分子）は、インビトロ転写（ｉＶＴ）で合成される。複数の実施形態では、該核酸は、ｉＶＴ反応においてグアノシン一リン酸及びグアノシン三リン酸の両方を使用して合成される。複数の実施形態では、グアノシン一リン酸及びグアノシン三リン酸は、例えば、約１：１、または約２：１、または約５：１、または約１０：１、または約２０：１の比で存在する。

【0069】

複数の実施形態では、該核酸及び／またはｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも１つの非標準ヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－メトキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－メトキシシュードウリジン、及び５－ホルミルシュードウリジンから選択される。

【0070】

複数の実施形態では、該核酸及び／またはｃｉｒｃＲＮＡは、いずれの非標準ヌクレオチドも欠いている。

【0071】

目的のタンパク質の発現／リプログラミング／遺伝子編集／疾患処置の方法
複数の実施形態では、本開示は、細胞において目的のタンパク質を発現させる方法を提供し、該方法は、細胞を、ｃｉｒＣＲＮＡを含む本明細書に開示される組成物と接触させることを含む。

【0072】

複数の実施形態では、細胞は、軽度低温条件、例えば、約３０℃～約３６℃で接触させられる。

【0073】

複数の実施形態では、本開示は、細胞において標的核酸を遺伝子編集する方法を提供し、該方法は、細胞を本明細書に記載の組成物または薬学的組成物と接触させることを含み、該組成物は、ｃｉｒｃＲＮＡを含み、ＣＤＳは、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードし、目的のタンパク質が、任意選択でヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１ Ｃａｓタンパク質、クラス２ Ｃａｓタンパク質、ＭＡＤ７、及び本明細書で定義されるＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚαを含むリピート配列を含む遺伝子編集タンパク質、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数の遺伝子編集タンパク質であり、該遺伝子編集タンパク質は、標的核酸に指向される。一部の実例では、標的核酸は、表２から選択される遺伝子であるか、または表１もしくは表３から選択されるペプチドもしくはタンパク質をコードする。複数の実施形態では、本開示は、細胞の複製能を増加させる方法を提供し、該方法は、細胞を本明細書に記載の組成物または薬学的組成物と接触させることを含み、該組成物は、ｃｉｒｃＲＮＡを含み、ＣＤＳは、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードする。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、細胞の複製能を増加させるタンパク質をコードする。複数の実施形態では、コードされたタンパク質は、ＴＥＲＴである。複数の実施形態では、細胞は、造血細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、骨髄系細胞、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球、骨髄浸潤リンパ球、末梢血リンパ球、及び毛包幹細胞から選択される。

【0074】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、細胞とタンパク質との間の相互作用を増加させるタンパク質をコードする。複数の実施形態では、コードされたタンパク質は、キメラ抗原受容体である。複数の実施形態では、細胞は、造血細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、骨髄系細胞、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球、骨髄浸潤リンパ球、末梢血リンパ球、及び毛包幹細胞から選択される。

【0075】

複数の実施形態では、細胞は、軽度低温条件、例えば、約３０℃～約３６℃で接触させられる。

【0076】

複数の実施形態では、該方法は、細胞をリプログラミングすることをさらに含む。複数の実施形態では、本開示は、細胞をリプログラミングする方法を提供し、該方法は、細胞を本明細書に記載の組成物と接触させることを含み、該組成物は、ｃｉｒｃＲＮＡであり、ＣＤＳは、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードし、目的のタンパク質が、任意選択でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９１マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９４マイクロ－ＲＮＡ及びｍｉＲ２９５マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロ－ＲＮＡ、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物から選択される、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、またはそれよりも多く）のリプログラミング因子である。

【0077】

複数の実施形態では、方法は、（ａ）分化細胞または非多能性細胞を用意することと、（ｂ）分化細胞または非多能性細胞を培養することと、（ｃ）分化細胞または非多能性細胞にｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトすることとを含む。複数の実施形態では、トランスフェクトすることは、エレクトロポレーションを介して遂行される。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、分化状態または非多能性状態からより低い分化状態へのリプログラミングを補助する成分を含有する培地の存在下で起こる。複数の実施形態では、該方法は、ステップ（ｃ）を連続５日間の間に少なくとも２回繰り返すことをさらに含む。複数の実施形態では、１つまたは複数のより後のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡ分子の量は、１つまたは複数のより先のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる量よりも多い。複数の実施形態では、ステップ（ａ）～（ｃ）は、フィーダー細胞を使用することなく実施され、フィーダー細胞馴化培地の存在下で起こる。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、放射線照射したヒト新生児線維芽細胞フィーダー細胞を使用することなく実施され、フィーダー細胞馴化培地の存在下で起こる。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９１マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ２９４マイクロ－ＲＮＡ及びｍｉＲ２９５マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロ－ＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロ－ＲＮＡ、ならびにそれらの生物学的に活性な断片、類似体、バリアント、及びファミリーメンバーから選択される１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、またはそれよりも多く）のリプログラミング因子（複数可）をコードする。複数の実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、生検に由来する。複数の実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、ヒト対象からのものである。複数の実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、皮膚パンチ生検試料に由来する。複数の実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、皮膚細胞（例えば、線維芽細胞またはケラチノサイト）である。複数の実施形態では、該方法は、細胞をポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ＲＧＤペプチド、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、及びラミニンの群の少なくとも１つの成員と接触させることを含むか、またはそれをさらに含む。複数の実施形態では、該方法は、細胞を遺伝子編集することをさらに含む。

【0078】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、任意選択で５－メチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－メトキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－メトキシシュードウリジン、及び５－ホルミルシュードウリジンから選択される、少なくとも１つの非標準ヌクレオチドを含む。

【0079】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、いずれの非標準ヌクレオチドも欠いている。

【0080】

複数の実施形態では、培地は、免疫抑制剤を実質的に含まない。

【0081】

複数の実施形態では、細胞は、軽度低温条件、例えば、約３０℃～約３６℃で接触させられる。

【0082】

複数の実施形態では、該方法は、細胞を遺伝子編集することをさらに含む。

【0083】

複数の実施形態では、本開示は、疾患、障害、または病態を処置する方法を提供し、該方法は、（ａ）細胞を本明細書に記載の組成物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡを含む）と接触させ、細胞を、それを必要とする患者に投与すること、または（ｂ）該組成物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡを含む）を、それを必要とする患者に投与することを含む。複数の実施形態では、疾患、障害、または病態は、表１または表３から選択される。

【0084】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、チェックポイント阻害剤、抗体、ナノボディ、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物のうちの１つまたは複数をコードする。

【0085】

一部の実例では、ｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトされる細胞は、Ｔ細胞であり、ｃｉｒｃＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞がＣＡＲ－Ｔになるようにキメラ抗原受容体をコードする。他の実例では、ｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトされる細胞は、ＮＫ細胞であり、ｃｉｒｃＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞がＣＡＲ－ＮＫになるようにキメラ抗原受容体をコードする。

【0086】

種々の実例では、（遺伝子編集を用いてまたは用いずに）リプログラミングされた細胞は、幹細胞療法の関連においてそれを必要とする対象に提供される。

【0087】

複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、インターロイキン７、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８、ドミナントネガティブＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ｄｎＴＧＦ－βＲＩＩ）、構成的に活性なＡｋｔ（ｃａＡｋｔ）、もしくはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、もしくは融合構築物のうちの１つまたは複数をコードする。

【0088】

複数の実施形態では、疾患／適応症は、１つまたは複数のがんに関連する。１つまたは複数のがんは、腺様嚢胞癌、副腎腫瘍、アミロイドーシス、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、胆管癌（ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ ｃａｎｅｒ）（胆管癌（Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、バート・ホッグ・デューベ症候群、膀胱癌、骨癌（骨の肉腫）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、乳癌（炎症性）、乳癌（転移性）、男性の乳癌、カーニー複合、中枢神経系腫瘍（脳及び脊髄）、子宮頸癌、小児がん、結腸直腸癌、カウデン症候群、頭蓋咽頭腫、デスモイド腫瘍、線維形成性乳児神経節膠腫、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼のがん、眼瞼のがん、家族性腺腫性ポリポーシス、家族性ＧＩＳＴ、家族性悪性黒色腫、家族性膵臓癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍ＧＩＳＴ、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、頭頸部癌、遺伝性乳癌及び卵巣癌、遺伝性びまん性胃癌、遺伝性平滑筋腫症及び腎細胞癌、遺伝性混合ポリポーシス症候群、遺伝性膵炎、遺伝性乳頭状腎癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連がん、若年性ポリポーシス症候群、腎臓癌、涙腺腫瘍、喉頭癌及び下咽頭癌、白血病－急性リンパ芽球性－ＡＬＬ、白血病、急性リンパ性－ＡＬＬ、白血病－急性骨髄性－ＡＬＬ、白血病－急性骨髄性－ＡＭＬ、白血病－Ｂ細胞性前リンパ球性白血病及び有毛細胞白血病、白血病－慢性リンパ性－ＣＬＬ、白血病－慢性骨髄性－ＣＭＬ、白血病－慢性Ｔ細胞リンパ性、白血病－好酸球性、リー・フラウメニ症候群、肝臓癌、肺癌－非小細胞、肺癌－小細胞、リンパ腫－ホジキン、リンパ腫－非ホジキン、リンチ症候群、肥満細胞症、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、多発性内分泌腫瘍症１型、多発性内分泌腫瘍症２型、多発性骨髄腫、ＭＵＴＹＨ／ＭＹＨ関連ポリポーシス、骨髄異形成症候群－ＭＤＳ、鼻腔癌及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、消化管神経内分泌腫瘍、肺神経内分泌腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、神経内分泌腫瘍、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、母斑性基底細胞癌症候群、口腔癌及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、卵管癌、腹腔癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、ポイツ・ジェガース症候群、褐色細胞腫及び傍神経節腫、脳下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫－カポジ、特定臓器の肉腫、肉腫－軟部組織、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺腫（ｔｈｙｏｍａ）及び胸腺癌、甲状腺癌、結節性硬化症複合体、原発部位不明、子宮癌、膣癌、フォンヒッペル・リンドウ症候群、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫）、ウェルナー症候群、ウィルムス腫瘍、ならびに色素性乾皮症を含み得る。

【0089】

複数の実施形態では、遺伝子編集は、遺伝子編集の領域、例えば、一本鎖切断もしくは二本鎖切断におけるＤＮＡ配列の挿入を引き起こすか、または遺伝子編集の領域におけるＤＮＡ配列を別様に変化させるかのいずれかによって修復鋳型として作用する核酸を、細胞にトランスフェクトすることをさらに含む。

【0090】

一部の実例では、遺伝子編集は、ゲノム内セーフハーバー遺伝子座、例えば、ＴＲＡＣ及びＡＡＶＳ１を標的とする。

【0091】

種々の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ワクチン接種を必要とする対象に導入されたときにワクチンとしての役目を果たす目的のタンパク質をコードする。

【0092】

本開示のｃｉｒｃＲＮＡ及び核酸は、ＷＯ／２０１３／０８６００８、ＷＯ／２０１４／０７１２１９、ＷＯ／２０１５／１１７０２１、ＷＯ／２０１６／１３１０５２、ＷＯ／２０１８／０３５３７７、ＷＯ／２０１９／１９１３４１、ＷＯ／２０２１／００３４６２、ＷＯ２０２１／２３１５４９、またはＷＯ２０２１／２２２３８９に記載される方法または組成物に適合され、それにおいて使用され得る。同文献の内容全体は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

【表2-14】

【表2-15】

【表2-16】

【表2-17】

【表2-18】

【表2-19】

【表2-20】

【表2-21】

【表2-22】

【表2-23】

【表2-24】

【表2-25】

【表2-26】

【表2-27】

【表2-28】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【0093】

上記の表に列挙されるＥｎｔｒｅｚエントリーは、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

【0094】

表１、表２、または表３に特定される例示的なタンパク質、ペプチド、または遺伝子の各々について、本開示は、例示的なタンパク質、ペプチド、または遺伝子のその天然または操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片、または融合構築物を考慮し、それを包含する。

【0095】

定義
以下の定義は、本明細書に開示される本発明に関連して使用される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。

【0096】

「インビボ」という用語は、対象の身体で起こる事象を指す。

【0097】

「エクスビボ」という用語は、対象の身体から取り出された細胞、組織、及び／または臓器を処置することまたはそれに対して手技を実施することを伴う事象を指す。適切に、細胞、組織、及び／または臓器は、処置方法または外科手術方法において対象の身体に戻されてもよい。

【0098】

本明細書で使用されるとき、「バリアント」という用語は、ある特定の位置での１つまたは複数の置換、欠失、及び／または付加のために参照物質の核酸またはアミノ酸配列とは異なる核酸またはアミノ酸配列を含む核酸またはタンパク質を包含するが、これに限定されない。バリアントは、１つまたは複数の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換を伴ってもよい。

【0099】

本明細書で使用される「担体」または「ビヒクル」は、薬物投与に好適な担体材料を指す。本明細書で有用な担体及びビヒクルには、無毒であり、組成物の他の構成成分と有害な様態で相互作用しない、当該技術分野で既知の任意のかかる材料、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、脂質等が含まれる。

【0100】

「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、賢明な医療判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。

【0101】

「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに不活性成分を含むことが意図される。医薬品有効成分のためのかかる薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野で周知されている。いずれかの従来の薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤が医薬品有効成分と不適合性でない限り、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物等の追加の医薬品有効成分もまた、記載される組成物及び方法に組み込まれ得る。

【0102】

本明細書で使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。

【0103】

本明細書で「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対して許容される誤差範囲内であることを意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣習に従って、１標準偏差以内または１標準偏差超を意味し得る。代替として、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。さらに、参照される数字表示に関連して使用されるときの「約」という用語は、参照される数字表示と、その数字表示の最大１０％を足したまたは差し引いたものを意味する。例えば、「約５０」という文言は、４５～５５の範囲を包含する。代替として、特に生物系またはプロセスに関して、この用語は、値の一桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別途定めのない限り、その特定の値に対して許容される誤差範囲内であることを意味する「約」という用語が想定されるべきである。

【0104】

本願全体を通して、種々の実施形態が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本開示の範囲に対する一定不動の制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値と同様に、全ての考えられる部分範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６等の範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等といった部分範囲、ならびにそれらの範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0105】

本明細書で使用されるとき、「含む」という語及びその変形は、リストにおける項目の列挙により、本技術の組成物及び方法において同じく有用であり得る他の同様の項目が除外されることのないように、非限定的であることが意図される。同様に、「～できる、～得る（ｃａｎ）」及び「～てもよい、～得る（ｍａｙ）」という用語ならびにそれらの変形は、ある実施形態がある特定の要素または特徴を含むことができる（ｃａｎ）、または含んでもよい（ｍａｙ）という列挙が、それらの要素または特徴を含有しない本技術の他の実施形態を除外するものではないように、非限定的であることが意図される。

【0106】

本開示及び／または特許請求の範囲のいずれかで使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変形は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の様態で包括的であることが意図される。本明細書では、本発明を説明及び特許請求するために、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という開放形式の用語が使用されるが、本発明、またはその実施形態は、代替として、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」等の代替的な用語を使用して説明されてもよい。

【0107】

本明細書で使用されるとき、「好ましい」及び「好ましくは」という語は、ある特定の状況下で、ある特定の有益性をもたらす本技術の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施形態もまた好ましい場合がある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを黙示するものではなく、他の実施形態を本技術の範囲から除外することを意図するものではない。

【0108】

処置するとは、疾患の徴候または症状を低減することを含めて、少なくとも疾患を改善させることまたは疾患の影響を回避することを意味する。

【0109】

本明細書に記載の任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。

【0110】

均等物
本発明は、その具体的な実施形態に関連して説明されたが、さらなる修正が可能であることが理解され、本願は、一般に本発明の原理に従って、また本発明が関連する既知または通例の慣習の範囲内に入るような本開示からの逸脱を含めて、本明細書に定められる本質的な特徴に適用され得るような、また添付の特許請求の範囲に従うような、本発明の任意の変形例、用途、または適合を包含することが意図される。

【0111】

当業者であれば、本明細書に明確に記載される具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識するか、またはほんの日常的な実験を使用して確認することができる。かかる均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0112】

参照による援用
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

【0113】

本明細書で考察される刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示のために提供されるにすぎない。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行発明に基づいてかかる刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0114】

本明細書で使用されるとき、全ての見出しは、単に編成のためのものであり、本開示をいかなる様態でも限定することを意図するものではない。いずれの個々の節の内容も、全ての節に等しく適用可能であり得る。

【0115】

配列
複数の実施形態では、本開示は、例えば、組成物として及び／または本明細書に記載の方法において使用するために、下記の配列のうちのいずれか、またはそれに対して少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有する配列を提供する。

【0116】

複数の実施形態では、配列のＧＦＰ部分（太字及び下線付きの文字を参照されたい）は、ｃｉｒｃＲＮＡを産出するために異なるコード配列と交換されてもよい。

【化1-1】

【化1-2】

【化1-3】

【化1-4】

【実施例】

【0117】

実施例１：ｃｉｒｃＲＮＡの設計
図１は、非相補的及び相補的配列エレメントを介してＲＮＡ環状化を向上させる方法の概略図を示す。具体的には、相補性領域の上流に５’及び３’オーバーハングが存在し、これが例えば、ＲＮＡリガーゼを介して環状化を駆動する。

【0118】

図１は、種々の５’及び３’のＲＮＡ塩基付加から予測される二次構造を示す。丸で囲まれた領域は、最も５’側のヌクレオチドを示す。本明細書では、緩いヘアピン、堅いヘアピン、及び遊離／結合の３つのバージョンが示され、試験される。

【0119】

実施例２：ｃｉｒｃＲＮＡの構築
図２に記載されるｃｉｒｃＲＮＡを合成し、ゲル電気泳動を介して評価した。図２は、遊離末端とそれに続く結合末端（例えば、図１）を使用する手法が環状ＲＮＡの効率的な生成を可能にすることを示す。

【0120】

図３は、ｃｉｒｃＲＮＡの生成を示すゲルである（条件については図２を参照されたい）。

【0121】

図４は、環状ＲＮＡ合成中のＲＮＡ産物を示す。レーン１：インビトロ転写反応。レーン２：Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１を使用したｉｖＴ産物の一晩のライゲーション。レーン３：子ウシ腸由来ホスファターゼ処理後のライゲーション産物。レーン４：子ウシ腸由来ホスファターゼ処理及び線状産物のＲＮａｓｅ Ｒ消化後のライゲーション産物。

【0122】

実施例３：ｃｉｒｃＲＮＡによるトランスフェクション
ｃｉｒｃＲＮＡを、細胞のトランスフェクションにおけるその効率に関して試験した。図５は、１２０，０００個のヒト初代皮膚線維芽細胞に、表示されるＩＲＥＳ、またはＧＦＰをコードする線状ＲＮＡを含む７５０ｎｇの環状ＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入した実験を示す。エレクトロポレーションから２４時間後に取得した代表的な画像が示される。図６は、１２０，０００個のヒト初代皮膚線維芽細胞に、表示されるＩＲＥＳ、またはＧＦＰをコードする線状ＲＮＡを含む７５０ｎｇの環状ＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入した実験を示す。エレクトロポレーションから４８時間後に取得した代表的な画像が示される。図７は、エレクトロポレーションから７２時間後のＧＦＰ発現を示す。１２０，０００個のヒト初代皮膚線維芽細胞に、表示されるＩＲＥＳ、またはＧＦＰをコードする線状ＲＮＡを含む７５０ｎｇの環状ＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーションから７２時間後に取得した代表的な画像が示される。

【0123】

図８は、細胞の平均蛍光強度対時間を示す。明確化のために、時点７２で、曲線は、上から下に、ＣＶＢ３＿ｖ４、ＣＶＢ３＿ｖ３、線状、ＥＭＣＶ、ｍｉｎＥ、及びＣｒＰＶである。１２０，０００個のヒト初代皮膚線維芽細胞に、表示されるＩＲＥＳ、またはＧＦＰをコードする線状ＲＮＡを含む７５０ｎｇの環状ＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入した。細胞をエレクトロポレーション後の表示される時点で撮像し、各緑色細胞の平均強度を算出した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】