▶ トランスレイト バイオ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-12
(54)【発明の名称】ポリＡテール長を測定する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240405BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240405BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20240405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z
C12Q1/68 100Z
C12Q1/34 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023566454
(86)(22)【出願日】2022-04-29
(85)【翻訳文提出日】2023-12-07
(86)【国際出願番号】 US2022026913
(87)【国際公開番号】W WO2022232499
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】63/181,488
(32)【優先日】2021-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517316797
【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ジョレル・イー・バルガス
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー・エス・デュビンス
(72)【発明者】
【氏名】アニュシャ・ディアス
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン・アビサル
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ53
4B063QR14
4B063QR55
4B063QR66
4B063QS16
4B063QS32
4B063QX01
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡを含む核酸中のホモポリマーヌクレオチド長を測定する方法を提供する。一部の態様では、本明細書では、ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法であって、ｍＲＮＡを副溝結合色素と結合させ、続くリボヌクレアーゼ消化およびキャピラリー電気泳動を含む方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍＲＮＡ試料中のポリＡテール長を測定する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡ試料を副溝結合色素と接触させる工程と；
（ｂ）（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程と；
（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により（ｂ）からの試料をアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
副溝結合色素が、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、または４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
副溝結合色素がＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅがＲＮａｓｅＡおよびＲＮａｓｅＴ１から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅがＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
ＣＥが蛍光ベースの検出と結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ＣＥがＵＶ吸収分光検出と結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程が、約１５分間、３０分間、４５分間、または６０分間である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程が約３０分間である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ポリＡテール長が２５ヌクレオチドまたはそれ以上である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ポリＡテール長が５０ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
ポリＡテール長が、５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、１００もしくはそれ以上のヌクレオチド、１５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または２００もしくはそれ以上のヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ポリＡテール長が、１００ヌクレオチド～１，５００ヌクレオチドの間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
ポリＡテール長が、２５０ヌクレオチド～５００ヌクレオチドの間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
方法の１つまたはそれ以上の工程が自動化される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程が自動化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
副溝結合色素が一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に非共有結合的に結合する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
副溝結合色素がインターカレーティング色素ではない、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡ試料をＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）副溝結合色素と接触させる工程と；
（ｂ）（ａ）からのｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程と；
（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により（ｂ）からの試料をアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項20】
ＣＥが蛍光ベースの検出と結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
ＣＥがＵＶ吸収分光検出と結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
（ａ）からのｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程が、約１５分間、３０分間、４５分間、または６０分間である、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
（ａ）からのｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程が約３０分間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ポリＡテール長が２５もしくはそれ以上のヌクレオチド、５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、１００もしくはそれ以上のヌクレオチド、１５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または２００もしくはそれ以上のヌクレオチドである、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
方法の１つまたはそれ以上の工程が自動化される、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
ハイスループットである、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
ｍＲＮＡ試料中のホモポリマーヌクレオチド長を測定する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡ試料を副溝結合色素と接触させる工程と；
（ｂ）（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程と；
（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により（ｂ）からの試料をアッセイして、ｍＲＮＡのホモポリマーヌクレオチド長を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項28】
ホモポリマーヌクレオチド長が２５ヌクレオチドまたはそれ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
ホモポリマーヌクレオチド長が５０ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドの間である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
ホモポリマーヌクレオチド長が、５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、１００もしくはそれ以上のヌクレオチド、１５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または２００もしくはそれ以上のヌクレオチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドが、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣから選択される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的で全体を参照により本明細書に組み入れる、２０２１年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／１８１，４８８号の優先権を主張する。
本出願は、全ての目的で全体を参照により本明細書に組み入れる、２０２１年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／１８１，４８８号の優先権を主張する。
【0002】
配列表の参照による組み入れ
２０２２年４月１５日に作成され、サイズが６８８バイトである「ＭＲＴ－２２２０ＷＯｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名されたテキストファイルの内容は、全体を参照により本明細書に組み入れる。
２０２２年４月１５日に作成され、サイズが６８８バイトである「ＭＲＴ－２２２０ＷＯｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名されたテキストファイルの内容は、全体を参照により本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【0003】
メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、種々の疾患を処置する有望なアプローチである。ＭＲＴは、治療を必要とする患者にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与することを伴う。投与されたｍＲＮＡは、患者の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドを生成する。ｍＲＮＡは、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼによる酵素反応を含むインビトロ転写系（ＩＶＴ）を用いて合成される。ＩＶＴ合成プロセスには、通常、５’－キャップ（キャッピング反応）および３’－ポリＡテール（ポリアデニル化）を付加するための反応（複数可）が続く。
【0004】
効果的なｍＲＮＡ療法は、患者にｍＲＮＡを送達し、患者の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を効率的に生成することを必要とする。５’キャップおよび３’ポリＡテールは、インビボでのｍＲＮＡ送達およびタンパク質生成の最適化において役割を果たす。５’末端のキャップは分解を防ぎ、翻訳を改善する。３’末端のポリＡテールは、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護し、ｍＲＮＡ療法のためのｍＲＮＡの完全性および安定性を改善する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ｍＲＮＡ療法の品質管理測定としてポリＡテール長の評価を行われる。正確なポリＡテール長測定はまた、無傷であり、完全長であり、送達時に機能的タンパク質に翻訳される安定なｍＲＮＡ治療薬を正確に定量することによって、用量を確立するために使用される。ポリＡテール長を決定する現在利用可能な方法は、とりわけ精度が低いことを含む、ある特定の欠点を有する。
【0006】
ポリＡテール長を決定するための現在の方法は、例えば、ポリＡ結合タンパク質アッセイを用いた測定を含み、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４モノマーに結合するのに十分な長さのポリＡテールを必要とし、各モノマーは、およそ３８ヌクレオチドのストレッチに結合する。他の方法には、逆転写工程を必要とするＰＣＲアッセイに基づく連結媒介性ポリＡ測定、およびより長いポリＡテールに対して不正確であり得るオリゴｄＴプライマーからのｃＤＮＡ合成を用いることが含まれる。別の方法であるＲＮａｓｅ Ｈベースの方法は、目的のｍＲＮＡからポリＡテールを除去することを伴い、無傷のポリＡテールを必要とするｍＲＮＡ療法には適さない。
【0007】
ｍＲＮＡ療法のためのｍＲＮＡテール長を測定する方法には、例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）法およびＲＮａｓｅ Ａ法が含まれる。
【0008】
ＣＥ法は、酵素消化を必要とせず、約１時間の短い泳動時間で達成される。これは、最大４８個の試料を同時に処理されるハイスループット方式で採用することができる。しかしながら、テール長が増加するにつれて、キャピラリー電気泳動における保持時間がシフトするため、測定されたテールの長さはしばしば不正確になる。ＣＥ方法は、一般に、ポリＡテールを含むホモポリマーストレッチを有する弱いシグナルをもたらす、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素などのインターカレーティング色素を採用する。
【0009】
ＲＮａｓｅ Ａゲル法は、ＣおよびＵの後で特異的分解を可能にする酵素消化を必要とし、ポリＡテールを測定する状態にする。それは、再現性があり、テール長の一貫した測定を提供する。しかしながら、それは３０分間の酵素消化工程と２時間３０分間のゲル泳動時間を必要とする。この方法は、約１０試料／ゲルのロースループットの方法で行われる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ試料中のポリＡテール長を迅速およびハイスループットな方法で正確に測定する方法を提供する。本発明は、部分的に、副溝結合色素とｍＲＮＡとの結合、続くリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）消化およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）が、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する正確な方法を提供するという、驚くべき予期せぬ発見に基づく。一部の実施形態では、本方法の１つまたはそれ以上の工程は自動化される。一部の実施形態では、本方法はハイスループットである。
【0011】
５０～２００ヌクレオチドまたはそれ以上の長いポリＡテール長を正確に測定することは、現在の方法を用いて困難である。本明細書では、５０もしくはそれ以上、１００もしくはそれ以上、１５０もしくはそれ以上、または２００もしくはそれ以上のヌクレオチドの長いポリＡテール長を、効率的であり、ハイスループットな方法で、確実であり、正確に測定することができる方法が提供される。一部の実施形態では、この方法を用いて測定されたポリＡテール長は、理論的なテール長に等しい。一部の実施形態では、測定されたテール長は、１００％正確である。一部の実施形態では、この方法を用いて測定されたポリＡテール長は、理論的なテール長に近づく。一部の実施形態では、測定されたポリＡテール長は、９０％より大きく、９１％より大きく、９２％より大きく、９３％より大きく、９４％より大きく、９５％より大きく、９６％より大きく、９７％より大きく、９８％より大きく、または９９％より大きく正確である。一部の実施形態では、測定されたポリＡテール長は、５０％より大きく、６０％より大きく、７０％より大きく、８０％より大きく、または９０％より大きく正確である。
【0012】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、典型的にはインターカレーティング色素を用いて行われる。一部の実施形態では、インターカレーティング色素は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素である。本発明は、部分的には、キャピラリー電気泳動において副溝結合色素を使用することによって得られる予期せぬ結果に基づく。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される色素は、副溝結合色素である。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）である。
【0013】
ポリＡテールは螺旋状であり、平面状にスタックされた塩基で構成される。副溝結合色素は、水素結合および疎水性相互作用を介して非共有結合的にＲＮＡに選択的に結合する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）を含む副溝結合色素は、塩基スタッキングに依存しない相互作用のために、ポリＡテールによって形成される平面構造に結合することができると考えられる。Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素などのインターカレーティング色素は、インターカレーティング色素がポリＡテールによって作製される平面構造に適切にπスタックすることができないため、水を含んだポリＡシグナルを生成し、ポリＡテール長測定が不正確になる。対照的に、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）は、一本鎖の二次構造によって形成される副溝に結合することによって、ポリＡテールの螺旋構造に非共有結合的に結合し、ポリＡテール長を正確に測定する方法を提供する（図１Ｂ）。
【0014】
一部の態様では、本明細書では、ｍＲＮＡ試料中のポリＡテール長を測定する方法が提供され、本方法は：（ａ）ｍＲＮＡ試料を副溝結合色素と接触させる工程と；（ｂ）（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程と；（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により（ｂ）からの試料をアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する工程とを含む。
【0015】
一部の実施形態では、本明細書では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、または４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である方法が提供される。一部の実施形態では、副溝結合色素はＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）である。一部の実施形態では、副溝結合色素はＨｏｅｃｈｓｔ色素である。一部の実施形態では、副溝結合色素は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。
【0016】
一部の実施形態では、本明細書では、ｍＲＮＡ試料がＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１から選択される１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともにインキュベートされる方法が提供される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ Ａである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ Ｔ１である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ａ１およびＲＮａｓｅ Ｔ１を含む。ＲＮａｓｅ Ａは、Ｃ残基とＵ残基の後でＲＮＡを分解し、ＲＮａｓｅ Ｔ１はＧ残基の後で分解する。ＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１による消化は、ポリＡテールだけが残ることを確実にする。
【0017】
一部の実施形態では、本明細書では、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が蛍光ベースの検出と結合される方法が提供される。
【0018】
一部の実施形態では、本明細書では、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）がＵＶ吸収分光検出と結合される方法が提供される。
【0019】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともに約１５分間、３０分間、４５分間、または６０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともに約１５分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともに約３０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともに約４５分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともに約６０分間インキュベートされる。
【0020】
一部の実施形態では、ポリＡテール長は２５ヌクレオチドまたはそれ以上である。
【0021】
一部の実施形態では、ポリＡテール長は、５０ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約５５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約６５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約７５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約８５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約９５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約５０００ヌクレオチドである。
【0022】
一部の実施形態では、ポリＡテール長は５０またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は１００またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は１５０またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は２００またはそれ以上のヌクレオチドである。
【0023】
一部の実施形態では、ポリＡテール長は、１００ヌクレオチド～１，５００ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約１０００ヌクレオチドである。
【0024】
一部の実施形態では、ポリＡテール長は、２５０ヌクレオチド～５００ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約２９０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３１０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約３９０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４１０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約４９０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は約５００ヌクレオチドである。
【0025】
一部の実施形態では、本方法の１つまたはそれ以上の工程は自動化される。
【0026】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートすることは自動化される。
【0027】
一部の実施形態では、副溝結合色素は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に非共有結合的に結合する。
【0028】
一部の実施形態では、副溝結合色素は、インターカレーティング色素ではない。
【0029】
一部の態様では、本明細書では、ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法が提供され、該方法は：（ａ）ｍＲＮＡ試料をＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）副溝結合色素と接触させる工程と；（ｂ）（ａ）からのｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程と；（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により（ｂ）からの試料をアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する工程とを含む。
【0030】
一部の実施形態では、本方法は、蛍光ベースの検出と結合させたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含む。
【0031】
一部の実施形態では、本方法は、ＵＶ吸収分光検出と結合させたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含む。
【0032】
一部の実施形態では、本方法は、ｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともに約１５分間、３０分間、４５分間、または６０分間インキュベートする工程を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程は約１５分間である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程は約３０分間である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程は約４５分間である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料をＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１とともにインキュベートする工程は約６０分間である。
【0033】
一部の実施形態では、ポリＡテール長は、２５もしくはそれ以上のヌクレオチド、５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、１００もしくはそれ以上のヌクレオチド、１５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または２００もしくはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は、２５またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は、５０またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は、１００またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテール長は、１５０またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡは、２００またはそれ以上のヌクレオチドである。
【0034】
一部の実施形態では、本方法の１つまたはそれ以上の工程は自動化される。
【0035】
一部の実施形態では、本方法は、ハイスループットである。
【0036】
一部の態様では、本明細書では、ｍＲＮＡ試料中のホモポリマーヌクレオチド長を測定する方法が提供され、本方法は：（ａ）ｍＲＮＡ試料を副溝結合色素と接触させる工程と；（ｂ）（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程と；（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により（ｂ）からの試料をアッセイして、ｍＲＮＡのホモポリマーヌクレオチド長を決定する工程とを含む。
【0037】
一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、２５ヌクレオチドまたはそれ以上である。
【0038】
一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、５０ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は６５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は７５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は８５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は９５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１０００ヌクレオチドである。
【0039】
一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５０００ヌクレオチドである。
【0040】
一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、１００もしくはそれ以上のヌクレオチド、１５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または２００もしくはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、５０またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、１００またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、１５０またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、２００またはそれ以上のヌクレオチドである。
【0041】
一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドトラクトを含むヌクレオチドは、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣから選択される。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、アデニンである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、ウラシルである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、グアニンである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、シトシンである。
【0042】
本出願において、「または」の使用は、特に断らない限り、「および／または」を意味する。本開示で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のような用語の変形は、他の添加剤、成分、整数または工程を除外することを意図しない。本出願で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、同等物として使用される。両方の用語は、関連技術分野の当業者によって認識される任意の正常な揺らぎをカバーすることを意味する。
【0043】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかである。しかしながら、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示しているが、限定ではなく、例示としてのみ示されていることを理解されたい。本発明の範囲内の種々の変更および修正は、当業者に明らかになる。
【0044】
図面は、限定のためではなく、例示目的のみのためのものである。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1A】核酸に対する異なるメカニズムによる色素および他のリガンドの結合を示す概略図である。この概略図において、例示的な二本鎖ＤＮＡ分子は、例えば、インターカレーティング色素、主溝結合剤、副溝結合剤またはビスインターカレーターによって、色素結合位置を示すために使用される。
【図2A】Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料および従来のＲＮａｓｅ Ａ消化された試料について、２５ｎｔ、５０ｎｔおよび１１４ｎｔのポリＡテール長を有する、同時転写的に付加されたポリＡテールを含むＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ分析を示すゲルを示す。
【図2B】２５ｎｔ、５０ｎｔおよび１１４ｎｔのポリＡテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間のグラフを示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＣＥ試料、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【図3A】Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）結合、続くＲＮａｓｅ Ａ消化後の１００～６００ヌクレオチドのポリＡテール長を有する例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡを示すキャピラリー電気泳動ゲルを示す。
【図3B】Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素結合、続くＲＮａｓｅ Ａ消化後の１００～６００ヌクレオチドの間のポリＡテール長を有する例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡを示すキャピラリー電気泳動ゲルを示す。
【図4A】長さが１００～６００ヌクレオチドのポリＡテールを有するＥＰＯ ｍＲＮＡの従来のＲＮａｓｅ Ａ分析を示すゲルを示す。
【図4B】１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間のグラフを示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＣＥ試料、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【図5A】１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図5B】１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図6A】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料とＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料のシグナル強度の比較を示す図である。図６Ａは、２００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図6B】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料とＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料のシグナル強度の比較を示す図である。図６Ｂは、２００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図7】ＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ａ／Ｔ１消化された生成物を比較する、１００～１８００ヌクレオチドのポリＡテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間のグラフを示す。
【図8A】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有するＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＦＴＲ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のゲルを示す。
【図8B】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有するＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＣＦＴＲ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のゲルを示す。
【図9A】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図9B】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図10】１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＣＦＴＲ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間のグラフを示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＣＥ試料、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【図11A】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有するＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＯＴＣ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のゲルを示す。
【図11B】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有するＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＯＴＣ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のゲルを示す。
【図12A】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＯＴＣ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図12B】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＯＴＣ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図13】１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＯＴＣ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間のグラフを示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＣＥ試料、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【図14A】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有するＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＭＭＡ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のゲルを示す。
【図14B】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有するＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＭＭＡ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のゲルを示す。
【図15A】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＭＭＡ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図15B】未消化対照と比較して、１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＭＭＡ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を示す。
【図16】１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＭＭＡ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間のグラフを示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＣＥ試料、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【発明を実施するための形態】
【0046】
定義
本発明がより容易に理解されるようにするために、ある特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義は本明細書を通して示される。本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は参照によって本明細書に組み入れられる。
本発明がより容易に理解されるようにするために、ある特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義は本明細書を通して示される。本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は参照によって本明細書に組み入れられる。
【0047】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、言及される参照値に類似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、上述の参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内の、いずれかの方向での（より大きいかまたはより小さい）、該当する値の範囲を指す。
【0048】
バッチ：本明細書で使用される場合、「バッチ」という用語は、例えば、同じ製造サイクル中に単一製造順序に従って製造される、一度に合成されるｍＲＮＡの含量または量を指す。バッチとは、１セットの条件下で連続的に合成するために、酵素の単一アリコートおよび／またはＤＮＡ鋳型の単一アリコートを介して起こる１つの反応において合成されるｍＲＮＡの量を指すことができる。一部の実施形態では、バッチは、反応が進行するにつれて全ての試薬および／または成分が補充および／または補給されるわけではない反応から産生されるｍＲＮＡを含む。「バッチ」という用語は、所望の量を達成するために組み合わされる異なる時間に合成されたｍＲＮＡを意味しない。
【0049】
生物学的活性：本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性である」とは、生物学的システム、特に生物体において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、ある生物に投与された場合に、その生物に生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。
【0050】
送達：本明細書で使用される場合、用語「送達」は、局所送達と全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて標的組織内に保持される状況（「局所分配」または「局所送達」とも呼ばれる）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、全身に分配され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分配」または「全身送達」とも呼ばれる）を包含する。一部の実施形態では、送達は、例えば噴霧を含む、肺送達である。
【0051】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、複数のポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のインタクトタンパク質（例えば、抗体）への組み立て、および／またはポリペプチドもしくは完全に組み立てられたタンパク質（例えば、抗体）の翻訳後修飾を指す。本出願において、「発現」および「産生」という用語、ならびにそれらの文法的同等物は、互換的に使用される。
【0052】
完全長ｍＲＮＡ：本明細書で使用される場合、「完全長ｍＲＮＡ」は、特定のアッセイ、例えば、ゲル電気泳動、またはキャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶを用いる検出およびＵＶ吸収分光法を使用する場合に特徴付けられるものである。全長ポリペプチドをコードし、本明細書に記載される精製方法のいずれかに従って得られるｍＲＮＡ分子の長さは、標的ＤＮＡから転写される完全長ｍＲＮＡ分子の長さの少なくとも５０％、例えば、標的ＤＮＡから転写され、本明細書に記載される任意の方法に従って精製される前の完全長ｍＲＮＡ分子の長さの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．０１％、９９．０５％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。
【0053】
機能的：本明細書で使用される場合、「機能的」生物学的分子は、それによって特徴付けられる特性および／または活性を示す形態の生物学的分子である。
【0054】
ホモポリマーまたはホモポリマーヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ホモポリマー」またはホモポリマーヌクレオチド」およびそれらの文法上同等物は、連続する同一の塩基の配列を指す。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣから選択される。一部の実施形態では、用語「ホモポリマー」または「ホモポリマーヌクレオチド」は、実質的に同一の塩基の配列を指す。例えば、一部の実施形態では、用語は、１つまたはそれ以上の非同一のヌクレオチドを有する連続した一連のヌクレオチドを含む。
【0055】
インターカレーティング色素：本明細書で使用する場合、インターカレーティング色素またはリガンドもしくは薬剤は、ＤＮＡ二重螺旋の塩基対間で結合する。インターカレーティング色素は、塩基対の環構造に類似する疎水性複素環分子、例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジおよびアクチノマイシンＤである。一部の実施形態では、インターカレーティング色素は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素である。
【0056】
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」という用語、または文法上同等物は、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下の対照となる対象（または複数の対照となる対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照となる対象」は、処置される対象とほぼ同じ年齢の、処置される対象と同じ形態の疾患に罹患している対象である。
【0057】
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工的な環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養物等で起こるイベントを指す。
【0058】
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で起こるイベントを指す。細胞系の文脈においては、この用語は、生細胞内で起こるイベントを指すために使用される（例えば、インビトロ系と対照的に）。
【0059】
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）（天然および／または実験設定のいずれにせよ）最初に産生された際に会合していた成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって産生、製造、および／もしくは製作された、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超のこれらが最初に会合していた他の成分から分離される。一部の実施形態では、単離された薬剤が、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体のパーセント純度の計算は賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水等）を含むべきでない。
【0060】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、本明細書で使用される場合、修飾ＲＮＡと未修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコード領域および非コード領域を含有する。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学的に合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、ｍＲＮＡは、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。特に断らない限り、ｍＲＮＡ配列は５’から３’方向に提示される。
【0061】
副溝または副溝結合色素：本明細書で使用される場合、「副溝」とは、副溝結合色素が水素結合または疎水性相互作用によって結合する、ＤＮＡ二重螺旋中の２つの溝のうち狭い方を指す。ＲＮＡ分子において、副溝結合色素は、一本鎖核酸によって形成される二次構造に非共有結合的に結合する。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、または４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。
【0062】
ｍＲＮＡの完全性：本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡの完全性」は、一般に、ｍＲＮＡの品質を指す。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性とは、精製プロセス（例えば、本明細書に記載される方法）後に分解されないｍＲＮＡのパーセンテージを指す。ｍＲＮＡの完全性は、ＴＡＥアガロースゲル電気泳動などの本明細書に特に記載される方法を用いるか、または銀染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥによるか、または、当該技術分野において周知である方法、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって決定される。
【0063】
核酸：本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、その最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に取り込まれるかまたは取り込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる化合物および／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は本発明の範囲内にあると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重バージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＲＮＡはイントロンを含む。核酸は、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、核酸は、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に指示しない限り、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、本発明は、具体的には、送達を容易にするまたは達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「未修飾核酸」に関する。一部の実施形態では、ヌクレオチドＴおよびＵは、配列記載において互換的に使用される。
【0064】
πスタック：本明細書で使用される場合、πスタックは、それらがπ結合を含むため、芳香族環間の引力的な非共有相互作用を指す。これらの相互作用は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子内でのヌクレオベーススタッキングにおいて重要である。
【0065】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全部または全部に近い程度または度合いを示す定量的状態を指す。生物分野の当業者であれば、生物および化学現象が、完了するおよび／または完了まで進行するまたは絶対的な結果を達成するもしくは回避することがあったとしても稀であることを理解するだろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物および化学現象に固有の完全性の潜在的な欠如をとらえるために本明細書で使用される。
【0066】
詳細な説明
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ試料中のポリＡテール長を迅速およびハイスループットな方法で正確に測定する方法を提供する。本発明は、部分的に、副溝結合色素とｍＲＮＡとの結合、続くリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）消化およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）が、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する正確な方法を提供するという、驚くべき予期せぬ発見に基づく。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、典型的には、インターカレーティング色素を用いて行われる。一部の実施形態では、インターカレーティング色素は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素である。本発明は、部分的には、キャピラリー電気泳動における副溝結合色素の使用に基づく。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）である。
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ試料中のポリＡテール長を迅速およびハイスループットな方法で正確に測定する方法を提供する。本発明は、部分的に、副溝結合色素とｍＲＮＡとの結合、続くリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）消化およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）が、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する正確な方法を提供するという、驚くべき予期せぬ発見に基づく。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、典型的には、インターカレーティング色素を用いて行われる。一部の実施形態では、インターカレーティング色素は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素である。本発明は、部分的には、キャピラリー電気泳動における副溝結合色素の使用に基づく。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）である。
【0067】
ポリＡテールは螺旋状であるが；それらは平面状にスタックされた塩基で構成される。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）を含む副溝結合色素は、塩基スタッキングに依存しない相互作用のために、ポリＡテールによって形成される平面構造に結合することができると考えられる。Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素などのインターカレーティング色素は、インターカレーティング色素がポリＡテールによって作製される平面構造に適切にπスタックすることができないため、水を含んだポリＡシグナルを生成する。対照的に、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）は、一本鎖の二次構造により形成される副溝に結合することによって、水素結合および疎水性シグナルを介して、ポリＡテールの螺旋構造に非共有結合的に結合する（図１Ｂ）。
【0068】
本発明の種々の態様を下記にさらに説明する。
【0069】
ｍＲＮＡポリＡテール長の測定
下記の明細書により詳細に記載されるように、ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を含む種々の公知の方法のいずれかに従って合成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはキャップされ、ポリＡテールが付加される。一部の実施形態では、ポリＡテールは、転写後または転写と同時に付加される。ポリＡテールは、ｍＲＮＡ治療製造品に安定性を付与する。
下記の明細書により詳細に記載されるように、ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を含む種々の公知の方法のいずれかに従って合成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはキャップされ、ポリＡテールが付加される。一部の実施形態では、ポリＡテールは、転写後または転写と同時に付加される。ポリＡテールは、ｍＲＮＡ治療製造品に安定性を付与する。
【0070】
一部の態様では、本明細書では、ｍＲＮＡ試料中のポリＡテール長を測定する方法が提供され、本方法は：（ａ）ｍＲＮＡ試料を副溝結合色素と接触させる工程と；（ｂ）（ａ）からのｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とともにインキュベートする工程と；（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により（ｂ）からの試料をアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定する工程とを含む。一部の実施形態では、本方法の１つまたはそれ以上の工程は自動化される。一部の実施形態では、本方法はハイスループットである。
【0071】
副溝結合色素
一部の態様では、本発明の方法は、部分的に、ｍＲＮＡを含む核酸の副溝結合色素への結合に基づく（図１Ａおよび図１Ｂ）。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、または４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）である。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素である。一部の実施形態では、副溝結合色素は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。
一部の態様では、本発明の方法は、部分的に、ｍＲＮＡを含む核酸の副溝結合色素への結合に基づく（図１Ａおよび図１Ｂ）。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、または４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）である。一部の実施形態では、副溝結合色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素である。一部の実施形態では、副溝結合色素は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。
【0072】
リボヌクレアーゼ
一部の実施形態では、本明細書では、ｍＲＮＡ試料が、ＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１から選択される１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともにインキュベートされる方法が提供される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ Ａである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ Ｔ１である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ ＡｌおよびＲＮａｓｅ Ｔ１を含む。ＲＮａｓｅ ＡはＣ残基とＵ残基の後でＲＮＡを分解し、一方、ＲＮａｓｅ Ｔ１はＧ残基の後で分解する。ＲＮａｓｅ ＡとＲＮａｓｅ Ｔ１による消化は、ポリＡテールだけが残ることを確実にする。
一部の実施形態では、本明細書では、ｍＲＮＡ試料が、ＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１から選択される１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともにインキュベートされる方法が提供される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ Ａである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ Ｔ１である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ ＡｌおよびＲＮａｓｅ Ｔ１を含む。ＲＮａｓｅ ＡはＣ残基とＵ残基の後でＲＮＡを分解し、一方、ＲＮａｓｅ Ｔ１はＧ残基の後で分解する。ＲＮａｓｅ ＡとＲＮａｓｅ Ｔ１による消化は、ポリＡテールだけが残ることを確実にする。
【0073】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともに約１５分間、３０分間、４５分間、または６０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともに約１５分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともに約３０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともに約４５分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ試料は、１つまたはそれ以上のＲＮａｓｅとともに約６０分間インキュベートされる。
【0074】
キャピラリーゲル電気泳動
本発明の方法は、ｍＲＮＡの等質量電荷比に基づく、ｍＲＮＡの分離のための検出システムと結合させたキャピラリー電気泳動を採用する。キャピラリーゲル電気泳動法は、２５ｎｔから約５０００ヌクレオチドより大きい種々の長さの消化生成物を分離する。長さは、標準サイズマーカーに基づいて正確に定量される。
本発明の方法は、ｍＲＮＡの等質量電荷比に基づく、ｍＲＮＡの分離のための検出システムと結合させたキャピラリー電気泳動を採用する。キャピラリーゲル電気泳動法は、２５ｎｔから約５０００ヌクレオチドより大きい種々の長さの消化生成物を分離する。長さは、標準サイズマーカーに基づいて正確に定量される。
【0075】
一部の実施形態では、キャピラリー電気泳動は、蛍光ベースの検出と結合される。例えば、一部の実施形態では、蛍光ベースの検出方法は、レーザー誘導性蛍光検出を含む。
【0076】
一部の実施形態では、キャピラリー電気泳動は、ＵＶ吸収分光検出と結合される。
【0077】
ｍＲＮＡの合成
ｍＲＮＡは、種々の公知である方法のいずれかに従って合成することができる。例えば、ｍＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的にはプロモーターを含有する直鎖または環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含むことができる緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて実施される。正確な条件は具体的な用途によって変化する。
ｍＲＮＡは、種々の公知である方法のいずれかに従って合成することができる。例えば、ｍＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的にはプロモーターを含有する直鎖または環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含むことができる緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて実施される。正確な条件は具体的な用途によって変化する。
【0078】
一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡを調製するために、ＤＮＡ鋳型をインビトロで転写する。適切なＤＮＡ鋳型は、典型的には、インビトロ転写のためのプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターを有し、続いて所望のｍＲＮＡおよび終止シグナルのための所望のヌクレオチド配列を有する。
【0079】
Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｍＲＮＡの合成
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用い生成される。Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのいずれかの５’→３’方向でＤＮＡからのＲＮＡの形成を触媒し、修飾されたヌクレオチドを取り込むことができる。Ｔ３ポリメラーゼは極めてプロモーター特異的であり、Ｔ３プロモーターの下流のＤＮＡのみを転写する。Ｔ３は、５’－ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ－３’（配列番号１）のコンセンサスプロモーター配列に結合する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用い生成される。Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのいずれかの５’→３’方向でＤＮＡからのＲＮＡの形成を触媒し、修飾されたヌクレオチドを取り込むことができる。Ｔ３ポリメラーゼは極めてプロモーター特異的であり、Ｔ３プロモーターの下流のＤＮＡのみを転写する。Ｔ３は、５’－ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ－３’（配列番号１）のコンセンサスプロモーター配列に結合する。
【0080】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｍＲＮＡの合成
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、５’→３’方向でＤＮＡからＲＮＡの形成を触媒する。Ｔ７ポリメラーゼは極めてプロモーター特異的であり、Ｔ７プロモーターの下流のＤＮＡのみを転写する。Ｔ７は、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ－３’（配列番号２）のコンセンサスプロモーター配列に結合する。Ｔ７ポリメラーゼはまた、ＲＮＡ合成のための補因子として二本鎖ＤＮＡ鋳型およびＭｇ２＋イオンを必要とする。それはエラー率が非常に低い。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、５’→３’方向でＤＮＡからＲＮＡの形成を触媒する。Ｔ７ポリメラーゼは極めてプロモーター特異的であり、Ｔ７プロモーターの下流のＤＮＡのみを転写する。Ｔ７は、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ－３’（配列番号２）のコンセンサスプロモーター配列に結合する。Ｔ７ポリメラーゼはまた、ＲＮＡ合成のための補因子として二本鎖ＤＮＡ鋳型およびＭｇ２＋イオンを必要とする。それはエラー率が非常に低い。
【0081】
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｍＲＮＡの合成
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成される。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６プロモーター配列に対して高い配列特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＳＰ６ポリメラーゼは、プロモーターから下流の一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ上のＲＮＡの５’→３’インビトロ合成を触媒し、天然リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドおよび／または標識リボヌクレオチドを重合転写産物に取り込む。ＳＰ６は、５’－ＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＡ－３’（配列番号３）のコンセンサスプロモーター配列に結合する。このような標識されたリボヌクレオチドの例としては、ビオチン－、フルオレセイン－、ジゴキシゲニン－、アミノアリル－、および同位体標識ヌクレオチドが挙げられる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成される。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６プロモーター配列に対して高い配列特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＳＰ６ポリメラーゼは、プロモーターから下流の一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ上のＲＮＡの５’→３’インビトロ合成を触媒し、天然リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドおよび／または標識リボヌクレオチドを重合転写産物に取り込む。ＳＰ６は、５’－ＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＡ－３’（配列番号３）のコンセンサスプロモーター配列に結合する。このような標識されたリボヌクレオチドの例としては、ビオチン－、フルオレセイン－、ジゴキシゲニン－、アミノアリル－、および同位体標識ヌクレオチドが挙げられる。
【0082】
ＤＮＡ鋳型
典型的には、ＤＮＡ鋳型は、完全に二本鎖であるか、または大部分が適切なプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター）を有する一本鎖のいずれかである。
典型的には、ＤＮＡ鋳型は、完全に二本鎖であるか、または大部分が適切なプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター）を有する一本鎖のいずれかである。
【0083】
線状化プラスミドＤＮＡ（１つまたはそれ以上の制限酵素を介して線状化される）、線状化ゲノムＤＮＡフラグメント（制限酵素および／または物理的手段を介する）、ＰＣＲ産物、および／または合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それらが転写されるＤＮＡ配列の上流（および正方向）に二本鎖プロモーターを含むことを条件として、インビトロ転写のための鋳型として用いることができる。
【0084】
一部の実施形態では、線状化ＤＮＡ鋳型は、平滑末端を有する。
【0085】
一部の実施形態では、転写されるＤＮＡ配列は、より効率的な転写および／または翻訳を促進するために最適化される。例えば、ＤＮＡ配列は、シス調節エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス、終止シグナルおよびタンパク質結合部位）、人工組換え部位、カイ部位、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ネガティブＣｐＧアイランド、ＧＣ含有量、ポリメラーゼスリップ部位、および／または転写に関連する他のエレメントに関して最適化される；ＤＮＡ配列は、潜在的スプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定な自由エネルギー、反復配列、ＲＮＡ不安定モチーフ、および／またはｍＲＮＡプロセシングおよび安定性に関連する他のエレメントに関して最適化される；ＤＮＡ配列は、コドン使用バイアス、コドン適合性、内部カイ部位、リボソーム結合部位（例えば、ＩＲＥＳ）、未成熟ポリＡ部位、シャイン－ダルガーノ（ＳＤ）配列、および／または翻訳に関連する他のエレメントに関して最適化される；および／またはＤＮＡ配列は、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、翻訳休止部位、および／またはタンパク質折り畳みに関連する他のエレメントに関して最適化される。当技術分野において公知である最適化方法、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／００８１７０８号に記載されるＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよびＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）によるＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒを本発明で使用することができる。
【0086】
一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響する１つまたはそれ以上のエレメント、例えば、鉄応答性エレメントを含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０～５００ヌクレオチドの間であり得る。
【0087】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルのうちの１つもしくはそれ以上、細胞内での位置のｍＲＮＡの安定性に影響するタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つもしくはそれ以上の結合部位を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０～５００ヌクレオチドの間またはそれ以上であり得る。
【0088】
例示的な３’および／または５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、安定であるｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸サイクル酵素）から誘導することができる。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善し、および／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列またはそのフラグメントを含み得る。また、ポリヌクレオチドをさらに安定化するために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列またはそのフラグメントをポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域に含めることが考えられる。一般に、これらの修飾は、修飾されていない対応物と比較して、ポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を改善し、例えば、インビボヌクレアーゼ消化に対するこのようなポリヌクレオチドの抵抗性を改善するためになされる修飾を含む。
【0089】
大規模ｍＲＮＡ合成
一部の実施形態では、ポリＡテールを有するｍＲＮＡは、大規模に合成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、単一バッチで少なくとも１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１０００ｋｇまたはそれ以上で合成される。本明細書で使用される場合、「バッチ」という用語は、一度に合成されたｍＲＮＡの含量または量、例えば、単一の製造設定に従って製造されたｍＲＮＡの含量または量を指す。バッチとは、１セットの条件下で連続的に合成するために、酵素の単一アリコートおよび／またはＤＮＡ鋳型の単一アリコートを介して起こる１つの反応において合成されるｍＲＮＡの量を指すことができる。単一のバッチで合成されたｍＲＮＡは、所望の量を達成するために組み合わされる異なる時間に合成されたｍＲＮＡを含まない。
一部の実施形態では、ポリＡテールを有するｍＲＮＡは、大規模に合成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、単一バッチで少なくとも１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１０００ｋｇまたはそれ以上で合成される。本明細書で使用される場合、「バッチ」という用語は、一度に合成されたｍＲＮＡの含量または量、例えば、単一の製造設定に従って製造されたｍＲＮＡの含量または量を指す。バッチとは、１セットの条件下で連続的に合成するために、酵素の単一アリコートおよび／またはＤＮＡ鋳型の単一アリコートを介して起こる１つの反応において合成されるｍＲＮＡの量を指すことができる。単一のバッチで合成されたｍＲＮＡは、所望の量を達成するために組み合わされる異なる時間に合成されたｍＲＮＡを含まない。
【0090】
本発明によれば、１～１００ｍｇのＲＮＡポリメラーゼが、典型的には、生成されたｍＲＮＡの１グラム（ｇ）あたり使用される。一部の実施形態では、生成されたｍＲＮＡの１ｇあたり約１～９０ｍｇ、１～８０ｍｇ、１～６０ｍｇ、１～５０ｍｇ、１～４０ｍｇ、１０～１００ｍｇ、１０～８０ｍｇ、１０～６０ｍｇ、１０～５０ｍｇのＲＮＡポリメラーゼが使用される。一部の実施形態では、約５～２０ｍｇのＲＮＡポリメラーゼを使用して、約１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約０．５～２グラムのＲＮＡポリメラーゼを使用して、約１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約５～２０グラムのＲＮＡポリメラーゼを使用して、約１キログラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも５ｍｇのＲＮＡポリメラーゼを使用して、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも５００ｍｇのＲＮＡポリメラーゼを使用して、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも５グラムのＲＮＡポリメラーゼを使用して、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、生成されたｍＲＮＡ１ｇあたり約１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇのプラスミドＤＮＡが使用される。一部の実施形態では、約１０～３０ｍｇのプラスミドＤＮＡを使用して、約１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約１～３グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、約１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約１０～３０グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、約１キログラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも１０ｍｇのプラスミドＤＮＡを使用して、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも１グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも１０グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを生成する。
【0091】
一部の実施形態では、反応混合物中のＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１～１００ｎＭ、１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、または約１～１０ｎＭであり得る。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１０～５０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、または３０～５０ｎＭである。ＲＮＡポリメラーゼの１００～１００００単位／ｍｌの濃度、例として、１００～９０００単位／ｍｌ、１００～８０００単位／ｍｌ、１００～７０００単位／ｍｌ、１００～６０００単位／ｍｌ、１００～５０００単位／ｍｌ、１００～１０００単位／ｍｌ、２００～２０００単位／ｍｌ、５００～１０００単位／ｍｌ、５００～２０００単位／ｍｌ、５００～３０００単位／ｍｌ、５００～４０００単位／ｍｌ、５００～５０００単位／ｍｌ、５００～６０００単位／ｍｌ、１０００～７５００単位／ｍｌ、および２５００～５０００単位／ｍｌの濃度を用いることができる。
【0092】
反応混合物中の各リボヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰ）の濃度は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約１０ｍＭの間、約２ｍＭ～約１０ｍＭの間、約３ｍＭ～約１０ｍＭの間、約１ｍＭ～約８ｍＭの間、約１ｍＭ～約６ｍＭの間、約３ｍＭ～約１０ｍＭの間、約３ｍＭ～約８ｍＭの間、約３ｍＭ～約６ｍＭの間、約４ｍＭ～約５ｍＭの間である。一部の実施形態では、各リボヌクレオチドは、反応混合物中で約５ｍＭである。一部の実施形態では、反応において使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの組合せ）の全濃度は、１ｍＭ～４０ｍＭの間の範囲である。一部の実施形態では、反応において使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの組合せ）の全濃度は、１ｍＭ～３０ｍＭの間、または１ｍＭ～２８ｍＭの間、または１ｍＭ～２５ｍＭの間、または１ｍＭ～２０ｍＭの間の範囲である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は３０ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は２５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は２０ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は１５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は１０ｍＭ未満である。
【0093】
ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液には、典型的には、塩／緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化マグネシウムが含まれる。
【0094】
反応混合物のｐＨは、約６～８．５、６．５～８．０、７．０～７．５であり得、一部の実施形態では、ｐＨは７．５である。
【0095】
直鎖または線状化のＤＮＡ鋳型（例えば、上記されるように、所望の量のＲＮＡを提供するのに十分な量／濃度で）、ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液、およびＲＮＡポリメラーゼを組み合わせて、反応混合物を形成する。反応混合物を約３７℃～約４２℃で３０分～６時間、例えば約６０～約９０分間インキュベートする。
【0096】
一部の実施形態では、適切なＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（最終反応混合物のｐＨは約７．５である）中の約５ｍＭ ＮＴＰ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡポリメラーゼ、および約０．１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡ鋳型を約３７℃～約４２℃で６０～９０分間インキュベートする。
【0097】
一部の実施形態では、反応混合物は、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、２９ｍＭ ＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび反応緩衝液（１０×の場合は８００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭスペルミジン、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．７）および所望の反応体積に十分な含量（ＱＳ）をＲＮａｓｅフリー水とともに有する線状化二本鎖ＤＮＡ鋳型を含有する。次に、この反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。次に、ポリメラーゼ反応を、ＤＮａｓｅ ＩおよびＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（１０×の場合は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．６）の添加によってクエンチさせ、精製のための調製における二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進する。この実施形態は、１００グラムのｍＲＮＡを生成するのに十分であることが示されている。
【0098】
一部の実施形態では、反応混合物は、１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＲＮＡポリメラーゼを含み、例えば、反応混合物は、５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡポリメラーゼを含む。
【0099】
ヌクレオチド
種々の天然に存在するかまたは修飾されたヌクレオシドを用いて、本発明によるｍＲＮＡを生成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、シュードウリジン、（例えば、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン）、２－チオウリジン、および２－チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートされた塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるかまたはそれを含む。
種々の天然に存在するかまたは修飾されたヌクレオシドを用いて、本発明によるｍＲＮＡを生成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、シュードウリジン、（例えば、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン）、２－チオウリジン、および２－チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートされた塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるかまたはそれを含む。
【0100】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含む。非標準ヌクレオチド残基は、例えば、５－メチル－シチジン（「５ｍＣ」）、シュードウリジン（「ψＵ」）、および／または２－チオ－ウリジン（「２ｓＵ」）を含み得る。このような残基の検討およびそれらのｍＲＮＡへの取り込みについては、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号または国際公開第２０１１／０１２３１６号を参照されたい。ｍＲＮＡはＲＮＡであり得、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンであるＲＮＡとして定義される。ＲＮＡの使用のための教示は、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号および国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示され、いずれも参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。非標準ヌクレオチド残基の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが、標準残基のみを含有する対照ｍＲＮＡよりも安定におよび／またはあまり免疫原性ではなくすることができる。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾および他の核酸塩基修飾の組合せから選択される１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含むことができる。一部の実施形態は、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾をさらに含むことができる。追加の修飾には、例えば、糖修飾または置換（例えば、２’－Ｏ－アルキル修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）の１つまたはそれ以上）が含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡは追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体化またはハイブリダイズされる。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾である一部の実施形態では、このような修飾には、それだけに限らないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾および２’－デオキシ修飾が含まれる。一部の実施形態では、これらの修飾のいずれもヌクレオチドの０～１００％－例えば、個別にまたは組み合わせて構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％超または１００％で存在することができる。
【0101】
合成後プロセシング
典型的には、５’キャップおよび／または３’テールを合成後に付加することができる。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。
典型的には、５’キャップおよび／または３’テールを合成後に付加することができる。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。
【0102】
５’キャップ
５’キャップは、典型的には、以下のように付加される：第１に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去し、２つの末端リン酸を残す；次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニル基転移酵素を介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合を生成し；次に、グアニンの７－窒素がメチル基転移酵素によってメチル化される。キャップ構造の例としては、限定されないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。追加のキャップ構造は、参照により本明細書に組み入れる、２０１７年２月２７日に出願された米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号および米国仮特許出願第６２／４６４，３２７号に記載されている。
５’キャップは、典型的には、以下のように付加される：第１に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去し、２つの末端リン酸を残す；次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニル基転移酵素を介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合を生成し；次に、グアニンの７－窒素がメチル基転移酵素によってメチル化される。キャップ構造の例としては、限定されないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。追加のキャップ構造は、参照により本明細書に組み入れる、２０１７年２月２７日に出願された米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号および米国仮特許出願第６２／４６４，３２７号に記載されている。
【0103】
３’－ポリＡテール
３’末端における「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。３’テールは、５’キャップを付加する前、後、または同時に付加される。
３’末端における「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。３’テールは、５’キャップを付加する前、後、または同時に付加される。
【0104】
一部の実施形態では、ポリＡテールは、転写と同時に付加される。一部の実施形態では、ポリＡテールは、転写後に付加される。一部の実施形態では、ポリＣテールは、転写と同時に付加される。一部の実施形態では、ポリＣテールは、転写後に付加される。
【0105】
一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが２５～５，０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが２５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが７５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが１５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが３５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが４５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが５５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが６５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが７５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが８５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが９５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが１０００ヌクレオチドである。
【0106】
一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが１５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが２０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが２５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが３０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが３５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが４０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが４５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さが５０００ヌクレオチドである。
【0107】
典型的には、テール構造は、ポリＡおよび／またはポリＣテールを含む。（Ａ、アデノシン；Ｃ、シトシン）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの３’末端のポリＡまたはポリＣテールは、それぞれ、少なくとも２５のアデニンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡまたはポリＣテールは、それぞれ約１０～８００個のアデノシンまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド）であることができる。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載される様々な長さのポリＡテールとポリＣテールの組合せである。一部の実施形態では、ポリＡテール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡテール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
【0108】
本明細書に記載されるように、キャッピングおよび／またはテーリングがないと、早期中断ｍＲＮＡ転写産物のサイズがあまりに小さすぎて検出することができないために、５’キャップおよび／または３’テールの付加によって、インビトロ合成中に産生される中断転写産物の検出が容易になる。よって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを純度（ｍＲＮＡ中に存在する中断転写産物のレベル）について試験する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを精製する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。他の実施形態では、ｍＲＮＡを精製した後に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。
【0109】
ｍＲＮＡの精製
本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、ショートマーを除去する工程なしで使用することができる。一部の実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡをさらに精製することができる。種々の方法を用いて、本発明に従って合成されたｍＲＮＡを精製することができる。例えば、遠心分離、濾過および／またはクロマトグラフィー法を使用して、ｍＲＮＡの精製を実施することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿もしくは濾過もしくはクロマトグラフィー、もしくはゲル精製または任意の他の適切な手段によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＨＰＬＣによって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、当業者に周知の、標準フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液中で抽出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはタンジェンシャルフローフィルトレーションを使用して精製される。適切な精製方法には、２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題する米国特許出願公開第２０１６／００４０１５４号、米国特許出願公開第２０１５／０３７６２２０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９５４号、および２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９７８号に記載されたものが含まれ、全て参照により本明細書に組み入れられ、本発明を実施するために使用することができる。
本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、ショートマーを除去する工程なしで使用することができる。一部の実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡをさらに精製することができる。種々の方法を用いて、本発明に従って合成されたｍＲＮＡを精製することができる。例えば、遠心分離、濾過および／またはクロマトグラフィー法を使用して、ｍＲＮＡの精製を実施することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿もしくは濾過もしくはクロマトグラフィー、もしくはゲル精製または任意の他の適切な手段によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＨＰＬＣによって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、当業者に周知の、標準フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液中で抽出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはタンジェンシャルフローフィルトレーションを使用して精製される。適切な精製方法には、２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題する米国特許出願公開第２０１６／００４０１５４号、米国特許出願公開第２０１５／０３７６２２０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９５４号、および２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９７８号に記載されたものが含まれ、全て参照により本明細書に組み入れられ、本発明を実施するために使用することができる。
【0110】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング前に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング後に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリングの前と後の両方で精製される。
【0111】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、遠心分離によってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。
【0112】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、濾過によってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。
【0113】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。
【0114】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、クロマトグラフィーによってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。
【0115】
ｍＲＮＡの特徴付け
ｍＲＮＡの完全長または中断転写産物は、当技術分野において利用可能な任意の方法を用いて検出および定量することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、ブロット法、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、もしくはＵＰＬＣ、またはそれらの組合せを用いて検出される。当技術分野において公知である他の検出方法が、本発明に含まれる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、キャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶ吸収分光法を用いて検出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、ゲル電気泳動（「グリオキサールゲル電気泳動」）の前にまずグリオキサール色素によって変性させる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングまたはテーリング前に特性評価する。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングおよびテーリング後に特性評価する。
ｍＲＮＡの完全長または中断転写産物は、当技術分野において利用可能な任意の方法を用いて検出および定量することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、ブロット法、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、もしくはＵＰＬＣ、またはそれらの組合せを用いて検出される。当技術分野において公知である他の検出方法が、本発明に含まれる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、キャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶ吸収分光法を用いて検出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、ゲル電気泳動（「グリオキサールゲル電気泳動」）の前にまずグリオキサール色素によって変性させる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングまたはテーリング前に特性評価する。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングおよびテーリング後に特性評価する。
【0116】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成されたｍＲＮＡは、完全長ｍＲＮＡ以外の不純物を１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満で含む。不純物には、ＩＶＴ汚染物質、例えば、タンパク質、酵素、遊離ヌクレオチドおよび／またはショートマーが含まれる。
【0117】
一部の実施形態では、本発明に従って生成されたｍＲＮＡは、ショートマーおよび中断転写産物を実質的に含まない。特に、本発明に従って生成されたｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動またはグリオキサールゲル電気泳動により検出不能なレベルのショートマーまたは中断転写産物を含有する。本明細書で使用される場合、「ショートマー」または「中断転写産物」という用語は、完全長未満である任意の転写産物を指す。一部の実施形態では、「ショートマー」または「中断転写産物」は、長さが１００ヌクレオチド未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、または１０未満のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ショートマーは、５’－キャップおよび／または３’－ポリＡテールを付加した後に検出または定量される。
【0118】
ホモポリマー核酸トラクト
一部の態様では、本発明は、ｍＲＮＡを含む、核酸中のホモポリマーヌクレオチド長を測定する方法を提供し、ｍＲＮＡを副溝結合色素と接触させる工程、続いて、ｍＲＮＡを１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼで処理する工程、キャピラリー電気泳動を行い、ホモポリマーヌクレオチド長を決定する工程を含む。一部の実施形態では、本方法の１つまたはそれ以上の工程は自動化される。一部の実施形態では、本方法はハイスループットである。
一部の態様では、本発明は、ｍＲＮＡを含む、核酸中のホモポリマーヌクレオチド長を測定する方法を提供し、ｍＲＮＡを副溝結合色素と接触させる工程、続いて、ｍＲＮＡを１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼで処理する工程、キャピラリー電気泳動を行い、ホモポリマーヌクレオチド長を決定する工程を含む。一部の実施形態では、本方法の１つまたはそれ以上の工程は自動化される。一部の実施形態では、本方法はハイスループットである。
【0119】
一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣから選択される。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、アデニンである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、ウラシルである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、グアニンである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチドを含むヌクレオチドは、シトシンである。
【0120】
本発明の方法に従って測定されるホモポリマーヌクレオチド長は、約２５ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドより大きい範囲である。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドであるかまたは約２００ヌクレオチドより大きい。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は、約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドであるかまたは約２００ヌクレオチドより大きい。
【0121】
一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５０ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は３５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は４５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は５５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は６５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は７５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は８５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は９５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は１０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ホモポリマーヌクレオチド長は約１１００～５０００ヌクレオチドの間である。
【0122】
ホモポリマーヌクレオチドは、いくつかの機能、例えば、タンパク質結合領域、上流プロモーターエレメント、およびヌクレオソーム構造におけるＤＮＡ位置の決定に役立つ。本発明の方法は、とりわけ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸中のホモポリマー配列の長さを測定する方法を提供する。
【0123】
一部の態様では、本発明は、さらに、繰り返し単位（ＳＳＲ）、マイクロサテライト、ミニサテライトおよびマクロサテライトを含有するホモポリマーの長さを測定する方法を提供する。ＳＳＲは１～５ｂｐのタンデム繰り返し単位で構成される。例えば、最も豊富なＳＳＲは、ポリｄＡ－ポリｄＴおよびポリｄＧ－ポリｄＣであり、一般に非コード領域に見出され、しばしば長さが９ｂｐより大きい。ポリｄＡ－ポリｄＴトラクトはＡＴに富む配列では一般的である。ＳＳＲは、配列特異的なＤＮＡ結合において役割を果たす。
【0124】
マイクロサテライトは、約１０ｂｐ反復で構成され、しばしば６～８ｂｐ反復を含む、テロメアを含む領域に見出される。コード領域において、ホモポリマーから生じるフレームシフトエラーはがんをもたらす。いくつかのがんでは、腫瘍試料中のＤＮＡマイクロサテライトの長さを測定することは、マイクロサテライトの不安定性の尺度（それらがより短いかより長いかにかかわらず）を明らかにし、がんの進行の指標を提供する。
【0125】
一部の実施形態では、本発明の方法は、１０～１００ｂｐの繰り返し単位で構成されるミニサテライトの長さを測定するために使用される。ミニサテライトは、しばしばセントロメアおよびヘテロクロマチン領域に見出される。一部の実施形態では、本発明の方法は、１００ｂｐを超える繰り返し単位を含むマクロサテライトの長さを測定するために使用される。
【0126】
一部の実施形態では、本発明の方法は、ウイルス様粒子を作製するために使用されるポリＡおよびポリＵなどのＲＮＡホモポリマーの長さを測定するために使用される。これらは、塩基の混合物を含む通常の組成物を有するＲＮＡよりも利点を提供するためである。
【0127】
一部の実施形態では、本発明の方法は、ホモポリマーヌクレオチドを含む次世代シークエンシング読み取りにおける品質制御としてホモポリマーの長さを測定するために使用される。短い読み取りからの反復ＤＮＡ配列組み立ては、マイクロサテライトなどの反復配列の長さを決定することができず、これらは、しばしば報告された配列から省略される。
【0128】
一部の実施形態では、本発明の方法は、タンデム反復、散在反復、転移因子、ＤＮＡトランスポゾン、レトロトランスポゾン、ＳＩＮＥ（短鎖散在核エレメント）、ＬＩＮＥ（長鎖散在核エレメント）、およびＣＲＩＳＰＲ配列中のホモポリマーヌクレオチドの長さを測定するために使用される。
【実施例】
【0129】
本発明のある特定の化合物、組成物および方法は、ある特定の実施形態に従って特異性をもって記載されてきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を例示するためにのみ役立ち、本発明の化合物を限定することを意図するものではない。
【0130】
ｍＲＮＡの合成
下記の実施例の各々において、ｍＲＮＡの合成は、完全なＲＮａｓｅ不含条件下で行われた。以下の実施例では、ｍＲＮＡは、線状ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写を介して合成された。所望のｍＲＮＡ前駆体（ＩＶＴ）構築物を生成するために、約８ｍｇの線形化ＤＮＡ、ｒＮＴＰ（７．２５ｍＭ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼおよび反応緩衝液（１０×、８００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭスペルミジン、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．７）の混合物を、ＲＮａｓｅフリー水を用いて１８０ｍＬの最終体積に調製された。反応混合物を３７℃で２０分～６０分間の間の時間範囲でインキュベートする。完了後、混合物をＤＮａｓｅ Ｉでさらに１５分間処理し、適切にクエンチする。
下記の実施例の各々において、ｍＲＮＡの合成は、完全なＲＮａｓｅ不含条件下で行われた。以下の実施例では、ｍＲＮＡは、線状ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写を介して合成された。所望のｍＲＮＡ前駆体（ＩＶＴ）構築物を生成するために、約８ｍｇの線形化ＤＮＡ、ｒＮＴＰ（７．２５ｍＭ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼおよび反応緩衝液（１０×、８００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭスペルミジン、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．７）の混合物を、ＲＮａｓｅフリー水を用いて１８０ｍＬの最終体積に調製された。反応混合物を３７℃で２０分～６０分間の間の時間範囲でインキュベートする。完了後、混合物をＤＮａｓｅ Ｉでさらに１５分間処理し、適切にクエンチする。
【0131】
５’キャップおよび３’テールの付加
上述のＩＶＴ工程から精製されたｍＲＮＡ生成物を６５℃で１０分間変性させた。別に、ＧＴＰ（１．０ｍＭ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、ＲＮａｓｅ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼの一部を、反応緩衝液（１０×、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）とともに１．６Ｌの最終濃度まで混合した。変性時に、ｍＲＮＡを氷上で冷却し、次に反応混合物に添加した。合わせた溶液を、３７℃で２５～９０分間の時間範囲でインキュベートした。完了後、ＡＴＰ（２．０ｍＭ）、ポリＡポリメラーゼおよびテーリング反応緩衝液（１０×、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）のアリコートを添加し、全反応混合物をさらに３７℃で２０～４５分間の時間範囲でインキュベートした。完了後、最終反応混合物をクエンチし、適切に精製した。ポリＡテール長は、一部の実施形態では、以下の実施例に記載されるように、本発明の方法に従って測定された。
上述のＩＶＴ工程から精製されたｍＲＮＡ生成物を６５℃で１０分間変性させた。別に、ＧＴＰ（１．０ｍＭ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、ＲＮａｓｅ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼの一部を、反応緩衝液（１０×、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）とともに１．６Ｌの最終濃度まで混合した。変性時に、ｍＲＮＡを氷上で冷却し、次に反応混合物に添加した。合わせた溶液を、３７℃で２５～９０分間の時間範囲でインキュベートした。完了後、ＡＴＰ（２．０ｍＭ）、ポリＡポリメラーゼおよびテーリング反応緩衝液（１０×、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）のアリコートを添加し、全反応混合物をさらに３７℃で２０～４５分間の時間範囲でインキュベートした。完了後、最終反応混合物をクエンチし、適切に精製した。ポリＡテール長は、一部の実施形態では、以下の実施例に記載されるように、本発明の方法に従って測定された。
【実施例1】
【0132】
１５０未満のヌクレオチドの短いテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡのポリＡテール長の測定
この実施例は、約２５ｎｔ、５０ｎｔ、および１１４ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
この実施例は、約２５ｎｔ、５０ｎｔ、および１１４ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
【0133】
手短に言えば、例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で消化した。この実施例では、一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ａを使用した。次に、ｍＲＮＡ試料をキャピラリー電気泳動によりアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定した。
【0134】
ｍＲＮＡ試料を有機溶媒メタンアミド（ホルムアミド）とともに７５℃で約１０分間インキュベートした。次に、フラグメントアナライザー機器を用いてｍＲＮＡ試料を泳動して、ＣＥを行った。このプロセスの間、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ色素は、試料を添加し、泳動を開始する前に、ストックの１：１０，０００希釈でＲＮＡ分離ゲルに添加された。その後、色素は、室温で水素結合および疎水性相互作用を介して非共有結合的にｍＲＮＡ試料に結合した。
【0135】
Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料および従来のＲＮａｓｅ Ａ消化された試料について２５ｎｔ、５０ｎｔおよび１１４ｎｔのポリＡテール長を有する、同時転写的に添加されたポリＡテールを含むＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図２Ａに示す。分析の結果は、２５ｎｔ、５０ｎｔおよび１１４ｎｔのポリＡテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長およびｘ軸上の理論的なテール長のグラフに示される（図２Ｂ）。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（非常に低い生シグナルからプロットした）、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【0136】
図２Ｂに示された結果から分かるように、観察されたテール長は、アッセイされた全３つのテール長、すなわち２５ｎｔ、５０ｎｔ、および１１４ｎｔで、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料において過大評価され、非常に不正確である。Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料およびＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析は、観察されたテール長と理論的なテール長の間に良好な相関を示した。
【0137】
全体として、この実施例の結果は、ｍＲＮＡを副溝結合色素と結合させ、続くＲＮａｓｅ消化およびキャピラリー電気泳動を行う方法によって、ポリＡテール長を正確に測定したことを示した。本方法は高精度であり、観察されたポリＡテール長は理論的なテール長と同等であった。この方法は、従来のＲＮａｓｅ Ａ消化、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析と精度が同等であった。
【実施例2】
【0138】
１００ヌクレオチドより大きい長いテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡのポリＡテール長の測定
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
【0139】
手短に言えば、例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で消化した。この実施例では、一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ａを使用した。次に、ｍＲＮＡ試料をキャピラリー電気泳動によりアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定した。
【0140】
ｍＲＮＡ試料を有機溶媒メタンアミド（ホルムアミド）とともに７５℃で約１０分間インキュベートした。次に、フラグメントアナライザー機器を用いてｍＲＮＡ試料を泳動して、ＣＥを行った。このプロセスの間、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ色素は、試料を添加し、泳動を開始する前に、ストックの１：１０，０００希釈でＲＮＡ分離ゲルに添加された。その後、色素は、室温で水素結合および疎水性相互作用を介して非共有結合的にｍＲＮＡ試料に結合した。
【0141】
Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥについて１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するポリＡテールを含むＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図３Ａに示す。Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素処理されたＣＥについて１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するポリＡテールを含むＥＰＯ ｍＲＮＡのゲル分析を図３Ｂに示す。
【0142】
一部の実施形態では、ポリＡテール長はまた、従来のＲＮａｓｅ Ａ法によって評価された。手短に言えば、ｍＲＮＡ試料はＲＮａｓｅ Ａで３０分間消化され、２％アガロースゲル上で２時間３０分、泳動された。生成物を図４Ａに示す。次に、Ｂｉｏｒａｄ ＭＷ分析によりポリＡテール長を分析した。
【0143】
分析の結果は、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長およびｘ軸上の理論的なテール長のグラフに示される（図４Ｂ）。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（非常に低い生シグナルからプロットした）、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【0144】
図４Ｂに示された結果から分かるように、観察されたテール長は、アッセイされた全６つのテール長、すなわち１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔで、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料において非常に不正確である。観察されたテール長は１００ｎｔで非常に過小評価され、２００～６００ｎｔテール長で過大評価される。Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＥ試料は、観察されたテール長と理論的なテール長の間に良好な相関を示した。Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）で処理されたＣＥ試料は、従来のＲＮａｓｅ Ａ法、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析よりも、観察されたテール長と理論的なテール長の間に改善された相関を示した。
【0145】
１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を図５Ａに示す。１００、２００、３００、４００、５００および６００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料のＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を図５Ｂに示す。
【0146】
Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料とＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料のシグナル強度の比較を図６Ａおよび６Ｂに示す。２００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を図６Ａに示す。２００ｎｔのポリＡテール長を有する、１．２μｇのＡｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理されたＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ消化後のキャピラリー電気泳動図を図６Ｂに示す。
【0147】
全体として、この実施例の結果は、ｍＲＮＡを副溝結合色素と結合させ、続くＲＮａｓｅ消化およびキャピラリー電気泳動を行う方法によって、ポリＡテール長を正確に測定したことを示した。本方法は高精度であり、観察されたポリＡテール長は理論的なテール長と同等であった。本方法は、従来のＲＮａｓｅ Ａ消化、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析と精度が同等であった。
【実施例3】
【0148】
ＲＮａｓｅ Ａ単独またはＲＮａｓｅ ＡとＲＮａｓｅ Ｔ１酵素の両方のいずれかを用いるｍＲＮＡ消化を含む方法によるポリＡテール長測定の精度の比較
この実施例は、ＲＮａｓｅ Ａ単独またはＲＮａｓｅ ＡとＲＮａｓｅ Ｔ１酵素の両方のいずれかによるｍＲＮＡ消化を含む方法を用いたポリＡテール長測定の精度の比較を示す。
この実施例は、ＲＮａｓｅ Ａ単独またはＲＮａｓｅ ＡとＲＮａｓｅ Ｔ１酵素の両方のいずれかによるｍＲＮＡ消化を含む方法を用いたポリＡテール長測定の精度の比較を示す。
【0149】
ＲＮａｓｅ ＡはＣ残基とＵ残基の後でＲＮＡを分解し、一方、ＲＮａｓｅ Ｔ１はＧ残基の後で分解する。ＲＮａｓｅ ＡとＲＮａｓｅ Ｔ１による消化は、ポリＡテールだけが残ることを確実にする。この実施例では、ポリＡテール長測定の精度は、ＲＮａｓｅＡまたはＲＮａｓｅ ＡとＲＮａｓｅ Ｔ１で消化された５０～１８００ヌクレオチドの範囲のポリＡテール長を有する例示的なＥＰＯ ｍＲＮＡ試料について比較された。
【0150】
この実施例では、５０～１８００ヌクレオチド（例えば、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、１５００ｎｔおよび１８００ｎｔ）の理論的なポリＡテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡの試料は、３０分間、ＲＮａｓｅ Ａで消化された。消化生成物を２％アガロースゲル上で泳動し、分子量をＢＩＯＲＡＤ上で評価して、ポリＡテール長を決定した。グラフは、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間をプロットした。
【0151】
並行して、５０～１８００ヌクレオチド（例えば、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、１５００ｎｔおよび１８００ｎｔ）の間のポリＡテール長を有するＥＰＯ ｍＲＮＡの試料は、３０分間、ＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１で消化された。消化生成物を２％アガロースゲル上で泳動し、分子量をＢＩＯＲＡＤ上で評価して、ポリＡテール長を決定した。グラフは、ｙ軸上の観察されたテール長とｘ軸上の理論的なテール長の間をプロットした。
結果を図７および表１に示す。グラフは、観察されたテール長と理論的なテール長の間に相関を示した。観察されたテール長は理論的なテール長に近づいた。
結果を図７および表１に示す。グラフは、観察されたテール長と理論的なテール長の間に相関を示した。観察されたテール長は理論的なテール長に近づいた。
【0152】
【表1】
【0153】
この例はまた、観察されたテール長が、５０～１８００ヌクレオチドの間のテール長を有するＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ａ／Ｔ１消化されたＥＰＯ ｍＲＮＡ試料において同等であることを示した。
【実施例4】
【0154】
１００ヌクレオチドより大きい長いテール長を有するＣＦＴＲ ｍＲＮＡのポリＡテール長を測定する方法
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＣＦＴＲ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＣＦＴＲ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
【0155】
手短に言えば、例示的なＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で消化した。この実施例では、一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ａを使用した。次に、ｍＲＮＡ試料をキャピラリー電気泳動によりアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定した。
【0156】
ｍＲＮＡ試料を有機溶媒メタンアミド（ホルムアミド）とともに７５℃で約１０分間インキュベートした。次に、フラグメントアナライザー機器を用いてｍＲＮＡ試料を泳動して、ＣＥを行った。このプロセスの間、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ色素は、試料を添加し、泳動を開始する前に、ストックの１：１０，０００希釈でＲＮＡ分離ゲルに添加された。その後、色素は、室温で水素結合および疎水性相互作用を介して非共有結合的にｍＲＮＡ試料に結合した。４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料について１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するポリＡテールを含むＣＦＴＲ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図８Ａに示す。４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素処理されたＣＥについて１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔを有するポリＡテールを含むＣＦＴＲ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図８Ｂに示す。
【0157】
４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、および６００ｎｔのポリＡテール長を含むＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料のピークを示すキャピラリー電気泳動図を図９Ａに示す。４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、および６００ｎｔのポリＡテール長を含むＡｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素処理されたＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料のピークを示すキャピラリー電気泳動図を図９Ｂに示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（図９Ｂ）のシグナル強度が、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）処理された試料（図９Ａ）よりもはるかに低いことを示す。
【0158】
分析の結果は、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＣＦＴＲ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長およびｘ軸上の理論的なテール長のグラフに示される（図１０）。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（非常に低い生シグナルからプロットした）、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【0159】
図１０に見られるように、観察されたテール長は、１００ｎｔおよび２００ｎｔの長さで過小評価されるが、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料では３００～６００ｎｔの間のテール長で過大評価され、全体的に不正確なポリＡテール長の測定結果となる。
【0160】
ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析は、１００ｎｔなどの短いテール長についての理論的なテール長に匹敵する正確なテール長測定を示した。しかしながら、２００～６００ｎｔの間の長さで、観察されたテール長は理論的なテール長と比較して過小評価された。
【0161】
Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）処理された試料は１００ｎｔで正確な短いテール長測定を示した。より長いテール長は、２００～６００ｎｔの間のテール長についてのＲＮａｓｅ Ａ法、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ測定で観察されたものよりも正確に測定された。
【実施例5】
【0162】
１００ヌクレオチドより大きい長いテール長を有するＯＴＣ ｍＲＮＡのポリＡテール長を測定する方法
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＯＴＣ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＯＴＣ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
【0163】
手短に言えば、例示的なＯＴＣ ｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で消化した。この実施例では、一部では、ＲＮａｓｅ Ａを使用した。次に、ｍＲＮＡ試料をキャピラリー電気泳動によりアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定した。
【0164】
ｍＲＮＡ試料を有機溶媒メタンアミド（ホルムアミド）とともに７５℃で約１０分間インキュベートした。次に、フラグメントアナライザー機器を用いてｍＲＮＡ試料を泳動して、ＣＥを行った。このプロセスの間、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ色素は、試料を添加し、泳動を開始する前に、ストックの１：１０，０００希釈でＲＮＡ分離ゲルに添加された。その後、色素は、室温で水素結合および疎水性相互作用を介して非共有結合的にｍＲＮＡ試料に結合した。
【0165】
４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料について１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するポリＡテールを含むＯＴＣ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図１１Ａに示す。４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素処理されたＣＥについて１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するポリＡテールを含むＯＴＣ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図１１Ｂに示す。
【0166】
４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、および６００ｎｔのポリＡテール長を含むＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＯＴＣ ｍＲＮＡ試料のピークを示すキャピラリー電気泳動図を図１２Ａに示す。４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、および６００ｎｔのポリＡテール長を含むＡｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素処理されたＯＴＣ ｍＲＮＡ試料のピークを示すキャピラリー電気泳動図を図１２Ｂに示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（図１２Ｂ）のシグナル強度が、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）処理された試料（図１２Ａ）よりもはるかに低いことを示す。
【0167】
分析の結果は、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＯＴＣ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長およびｘ軸上の理論的なテール長のグラフに示される（図１３）。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（非常に低い生シグナルからプロットした）、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【0168】
図１３に見られるように、観察されたテール長は、１００ｎｔの長さで過小評価されるが、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料では２００～６００ｎｔの間のテール長で過大評価され、全体的に不正確なポリＡテール長の測定結果となる。
【0169】
ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析は、１００ｎｔなどの短いテール長についての理論的なテール長に匹敵する正確なテール長測定を示した。しかしながら、２００～６００ｎｔの間のテール長で、観察されたテール長は理論的なテール長と比較して過小評価された。
【0170】
Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）処理された試料は１００ｎｔ～４００ｎｔの間の正確なテール長測定を示した。５００ｎｔ～６００ｎｔなどのより長いテール長は、１００ｎｔ～６００ｎｔの間のテール長についてのＲＮａｓｅ Ａ法、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ測定で観察されたものよりも理論的なテール長により密接に対応した。
【実施例6】
【0171】
１００ヌクレオチドより大きい長いテール長を有するＭＭＡ ｍＲＮＡのポリＡテール長を測定する方法
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＭＭＡ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
この実施例は、約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔの例示的なテール長を有する例示的なＭＭＡ ｍＲＮＡ中のポリＡテール長を測定する方法を示す。
【0172】
手短に言えば、例示的なＭＭＡ ｍＲＮＡ試料を１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で消化した。この実施例では、一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ａを使用した。次に、ｍＲＮＡ試料をキャピラリー電気泳動によりアッセイして、ｍＲＮＡのポリＡテール長を決定した。
【0173】
ｍＲＮＡ試料を有機溶媒メタンアミド（ホルムアミド）とともに７５℃で約１０分間インキュベートした。次に、フラグメントアナライザー機器を用いてｍＲＮＡ試料を泳動して、ＣＥを行った。このプロセスの間、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ色素は、試料を添加し、泳動を開始する前に、ストックの１：１０，０００希釈でＲＮＡ分離ゲルに添加された。その後、色素は、室温で水素結合および疎水性相互作用を介して非共有結合的にｍＲＮＡ試料に結合した。
【0174】
４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料について１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するポリＡテールを含むＭＭＡ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図１４Ａに示す。４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素処理されたＣＥについて１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するポリＡテールを含むＭＭＡ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａゲル分析を図１４Ｂに示す。
【0175】
４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、および６００ｎｔのポリＡテール長を含むＳｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理されたＭＭＡ ｍＲＮＡ試料のピークを示すキャピラリー電気泳動図を図１５Ａに示す。４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有する未消化対照に対して、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、および６００ｎｔのポリＡテール長を含むＡｇｉｌｅｎｔ（商標）インターカレーティング色素処理されたＭＭＡ ｍＲＮＡ試料のピークを示すキャピラリー電気泳動図を図１５Ｂに示す。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（図１５Ｂ）のシグナル強度が、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）処理された試料（図１５Ａ）よりもはるかに低いことを示す。
【0176】
分析の結果は、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔおよび６００ｎｔのポリＡテール長を有するＭＭＡ ｍＲＮＡについて、ｙ軸上の観察されたテール長およびｘ軸上の理論的なテール長のグラフに示される（図１６）。結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料（非常に低い生シグナルからプロットした）、Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）色素処理された試料、ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析および理論的なテール長について示される。
【0177】
図１６に見られるように、観察されたテール長は、１００ｎｔの長さで過小評価されるが、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）色素処理された試料では２００～６００ｎｔの間のテール長で過大評価され、全体的に不正確なポリＡテール長の測定結果となる。
【0178】
ＲＮａｓｅ Ａ消化された試料、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ分析は、１００ｎｔなどの短いテール長についての理論的なテール長に匹敵する正確なテール長測定を示した。しかしながら、２００～６００ｎｔの間のテール長で、観察されたテール長は理論的なテール長と比較して過小評価された。
【0179】
Ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ（商標）処理された試料は１００ｎｔ～３００ｎｔの間の正確なテール長測定を示した。４００ｎｔ～６００ｎｔなどのより長いテール長は、４００ｎｔ～６００ｎｔの間のテール長についてのＲＮａｓｅ Ａ法、続くＢｉｏｒａｄ ＭＷ測定で観察されたものよりも理論的なテール長により密接に対応した。
【0180】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示的であり、限定することを意図しない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が本明細書に記載される。
【0181】
等価物
当業者であれば、日常的な実験でしかないものを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の明細書に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に示される通りである。
当業者であれば、日常的な実験でしかないものを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の明細書に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に示される通りである。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】