特表 2024-516263 新規な抗ＣＤ５キメラ抗原受容体及びそれを発現する免疫細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-12

(54)【発明の名称】新規な抗ＣＤ５キメラ抗原受容体及びそれを発現する免疫細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240405BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240405BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240405BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240405BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20240405BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20240405BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240405BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240405BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K16/28 ZNA

C07K19/00

C07K14/725

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N5/0783

C12N5/0784

C12N5/0786

C12N5/10

C07K16/46

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/17

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566973

(86)(22)【出願日】2022-04-27

(85)【翻訳文提出日】2023-10-30

(86)【国際出願番号】 KR2022006009

(87)【国際公開番号】W WO2022231298

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】10-2021-0055886

(32)【優先日】2021-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500197682

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】キム，テ－ドン

(72)【発明者】

【氏名】チョ，ソンア

(72)【発明者】

【氏名】イ，スヨン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＣＤ５抗体及びそれを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関するものであって、本発明のキメラ抗原受容体は、免疫細胞に発現されて正常Ｔ細胞に対する毒性が減少した抗ガン免疫療法に有用に活用されうる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８及び配列番号２６からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９及び配列番号２７からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０及び配列番号２８からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
ｉｖ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２及び配列番号３０からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ｖ）配列番号７、配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びｖｉ）配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
を含むＣＤ５に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

前記重鎖可変領域は、配列番号５、配列番号１３、配列番号２１及び配列番号２９からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域は、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５及び配列番号３３からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

ＣＤ５に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内信号伝達ドメインと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記ＣＤ５に特異的に結合する抗原結合部位は、ｉ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８及び配列番号２６からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９及び配列番号２７からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０及び配列番号２８からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ｉｖ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２及び配列番号３０からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ｖ）配列番号７、配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びｖｉ）配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ＣＤ５抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、キメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記ＣＤ５に特異的に結合する抗原結合部位は、
配列番号５、配列番号１３、配列番号２１及び配列番号２９からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗ＣＤ５抗体の一本鎖可変断片である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記ＣＤ５に特異的に結合する抗原結合部位は、
配列番号９、配列番号１７、配列番号２５及び配列番号３３からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ５抗体の一本鎖可変断片である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

請求項４から請求項６のうち何れか一項に記載のキメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項8】

請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項9】

請求項４から請求項６のうち何れか一項に記載のキメラ抗原受容体を表面に発現する、免疫細胞。

【請求項10】

前記免疫細胞は、自然殺害細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、自然殺害Ｔ細胞（ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、大食細胞及び樹状細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９に記載の免疫細胞。

【請求項11】

請求項９に記載の免疫細胞を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項12】

前記癌は、白血病またはリンパ腫を含む血液癌である、請求項１１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項13】

前記癌は、胸腺癌、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、小リンパ球性細胞リンパ腫、Ｔ細胞腫瘍、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、及び慢性リンパ性白血病からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項14】

抗ガン化学療法剤をさらに含む、請求項１１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［技術分野］
本発明は、ＣＤ５に対して特異的に結合する新規な抗体またはその抗原結合断片、該抗体の抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、該キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞に関する。
［背景技術］
癌を治療するための方法は、持続的な発展と変化過程とを経てきており、外科的手術、化学療法、放射線療法などの方法が現在まで利用され続けているが、このような既存の癌治療方法は、癌が転移されていない初期に限って効果がある場合がほとんどであり、既に転移が進められた状態では、例えば、外科的手術をしても、今後の再発の可能性が高いという問題点がある。これにより、最近、癌を治療するために、免疫反応を用いる方法についての研究が続いている。

【0002】

その中でも、免疫細胞を用いて、それを強化させるか、遺伝子工学的に変形して、再び患者に注入する細胞治療方法についての関心が高まっており、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）技術などが研究されている。特に、抗原特異性を伝達するように設計された人工受容体であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入されたＴ細胞であるＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、２０１７年にＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞が抗ガン剤としてＦＤＡ承認を受けた以後に、その研究が活発に進められたが、ほとんど試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみで効果を奏することがほとんどであり、実際に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）では、有意な治療効果を奏し得ないという問題があった。

【0003】

一方、ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、腫瘍に対しては効果的であるが、一部の場合に元気な組織に対しても、非特異的に攻撃する副作用もあった。前記ＣＤ５は、Ｔ細胞及びＢ細胞で発現される分化クラスタの一種であって、骨髄やリンパ組織で主に見つけられ、Ｂ細胞よりもＴ細胞で過発現されているために、Ｔ細胞のマーカーとして主に活用される。特に、ＣＤ５は、ほとんどのＴ細胞腫瘍だけではなく、正常Ｔ細胞でも発現されているために、抗ＣＤ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、Ｔ細胞腫瘍だけではなく、正常Ｔ細胞を攻撃するか、さらには注入された抗ＣＤ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞自体を攻撃する自体交差反応の問題があった（参考文献１）。それによって、正常Ｔ細胞と抗ＣＤ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞とが減少し、結局には、抗ガン効果までも低下するという問題があった。

【0004】

これにより、ＣＤ５を発現する癌細胞に対する抗ガン活性をそのまま保持しながらも、抗ＣＤ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞が有する前記のような問題点を補完することができる免疫細胞を研究・開発が必要な実情である。
［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］大韓民国公開特許公報第２０１８－０００２６０４号
［特許文献２］大韓民国登録特許公報第２，１２２，５４６号
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、ＣＤ５に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片を提供することを目的とする。

【0005】

また、本発明は、免疫細胞で発現された時、癌細胞に対する細胞毒性または細胞溶解活性を増幅させる新規なキメラ抗原受容体を提供することを目的とする。

【0006】

また、本発明は、前記キメラ抗原受容体を発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクターを提供することを目的とする。

【0007】

また、本発明は、前記キメラ抗原受容体を表面に発現させることにより、癌に対する治療効果に優れた免疫細胞を提供することを目的とする。

【0008】

また、本発明は、前記免疫細胞を用いて癌を治療するための薬学的組成物を提供することを目的とする。
［課題を解決するための手段］
前記目的を果たすために、本発明の一側面は、ｉ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８及び配列番号２６からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９及び配列番号２７からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０及び配列番号２８からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及びｉｖ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２及び配列番号３０からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ｖ）配列番号７、配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びｖｉ）配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含むＣＤ５に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0009】

前記重鎖可変領域は、配列番号５、配列番号１３、配列番号２１及び配列番号２９からなる群から選択される何れか１つである。

【0010】

前記軽鎖可変領域は、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５及び配列番号３３からなる群から選択される何れか１つである。

【0011】

本発明の他の側面は、ＣＤ５に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；及び細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＤ５に特異的に結合する抗原結合部位は、ｉ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８及び配列番号２６からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９及び配列番号２７からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０及び配列番号２８からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ｉｖ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２及び配列番号３０からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ｖ）配列番号７、配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びｖｉ）配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ＣＤ５抗体の一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）であるキメラ抗原受容体を提供する。

【0012】

本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含むポリヌクレオチド、そして、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

【0013】

本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞を提供する。

【0014】

前記免疫細胞は、自然殺害細胞、Ｔ細胞、自然殺害Ｔ細胞、サイトカイン誘導殺害細胞、マクロファージまたは樹状細胞である。本発明のさらに他の側面は、前記免疫細胞を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0015】

前記癌は、白血病またはリンパ腫を含む血液癌であり、癌は、胸腺癌（ｔｈｙｍｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、びまん性大細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、小リンパ球性細胞リンパ腫（ｓｍａｌｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｔ細胞腫瘍（Ｔ－ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｍａ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、マントル細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂａｌｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）または慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）である。
［発明の効果］
本発明の抗体、その抗原結合断片、そして、それを利用したキメラ抗原受容体は、癌細胞で発現されるＣＤ５に対して特異的に結合することができ、これにより、前記キメラ抗原受容体が発現された免疫細胞で信号伝達が発生するにつれて、免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性を顕著に向上させ、サイトカインの分泌を促進する効果を示す。また、これにより、前記免疫細胞と共培養された癌細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を増加させる効果があるだけではなく、前記キメラ抗原受容体が発現された免疫細胞の場合、ＣＤ５が発現される正常細胞に対しては、減少した反応性を示す。

【0016】

したがって、本発明の抗体やそれを含むキメラ抗原受容体、そして、それを発現させた免疫細胞は、癌を治療するための用途として用いられる。

【0017】

但し、本発明の効果は、前述した効果に制限されず、言及されていないさらに他の効果は、下記の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
［図面の簡単な説明］
［図１］ＣＤ５に特異的に結合する一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）を細胞外ドメインとして含む本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５－ＣＡＲ）の構造を示す模式図である。
［図２］本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を対象にして、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ）の発現有無を確認した結果を示した図面である。
［図３］本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）の、ＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞とＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞とに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。
［図４］本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）の、ＣＤ５を発現するＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞とＣＤ５を発現しないＤａｕｄｉ細胞とに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。
［図５Ａ及び図５Ｂないし図５Ｅ］本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）をＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞またはＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞と共培養した時、自然殺害細胞から分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）の量（図５Ａ）と脱顆粒指標であるＣＤ１０７αの発現量（図５Ｂないし図５Ｅ）をそれぞれ測定して比較した結果を示した図面である。
［図６］本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）の、ＣＤ５を発現する正常細胞を含むＭＮＣ（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）に対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。
［図７Ａ］本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を単一細胞に分離及び増殖させた単一細胞株のＣＤ５－ＣＡＲの発現量を確認した結果を示した図面である。
［図７Ｂ］前記確立されたそれぞれの単一細胞株のＭＯＬＴ４細胞及びＭＮＣに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。
［図７Ｃ］前記のように確立された単一細胞株のうちから先導細胞株を選別する過程を示した図面である。
［図８］本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５－ＣＡＲ）を一時的に発現させるために設計されたｍＲＮＡ構造体の構造を示す模式図である。
［図９］本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させたｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞を対象にして、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ）の発現有無を確認した結果を示した図面である。
［図１０］本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させたｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞の、ＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞とＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞とに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。
［図１１Ａ］正常細胞とＣＤ５を発現する癌細胞株とで、自然殺害細胞の活性化に関与するリガンドの発現量を確認した結果を示した図面である。
［図１１Ｂ］ＭＮＣを用いて、各白血球細胞ごとにＢ７－Ｈ６の発現程度を測定した結果を示した図面である。
［図１２］ＣＤ５を発現する癌細胞株であるＭＯＬＴ４細胞とＪｕｒｋａｔ細胞とでＢ７－Ｈ６の発現をノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）させた場合に、前記癌細胞株に対する本発明のＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性の変化を確認した結果を示した図面である。
［図１３］ＣＤ５を発現する癌細胞株であるＭＯＬＴ４とＭＮＣとに本発明のＣＤ５＃１１－ＣＡＲＮＫ細胞を処理した以後、経時的にＢ７－Ｈ６とＣＤ５との発現程度を測定した結果を示した図面である。
［発明を実施するための形態］
本発明は、多様な変換を加え、さまざまな実施例を有しうるので、以下、特定実施例を図面に例示し、詳細な説明で詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる、あらゆる変換、均等物または代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するに当って、関連した公知技術についての具体的な説明が、本発明の要旨を不明にする恐れがあると判断される場合、その詳細な説明を省略する。

【0018】

１．新規な抗ＣＤ５抗体、その抗原結合断片、そして、それを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター
本発明の一側面は、ＣＤ５に対して特異的に結合することができる抗ＣＤ５抗体及びその抗原結合断片を提供する。

【0019】

本発明において、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫学的に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）と特異的結合して反応性を有する免疫グロブリン分子を意味する。前記抗体は、単クローン抗体、多クローン抗体、全長の鎖の構造を有した抗体（全長抗体、ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、少なくとも抗原結合機能を有する機能的な断片（抗原結合断片）及び組換え抗体をいずれも含むことができ、具体的に、本発明の抗体は、単クローン抗体またはその抗原結合断片である。前記単クローン抗体は、実質的に同じ抗体集団で収得した単一分子組成の抗体分子を称し、このような単クローン抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。前記全長抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結される。前記抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ）ポリペプチドを含み、前記重鎖及び軽鎖は、可変領域及び不変領域を含みうる。

【0020】

前記不変領域は、免疫系の多種の細胞（Ｔ細胞など）、補体系の成分を含む宿主組織などに、前記抗体が結合できるように媒介する部位である。前記不変領域は、同種に由来する同じ種類の抗体であれば、抗原の種類と無関係に同じ機能を行い、それを成すアミノ酸配列も、抗体ごとに同一であるか、高い類似度を有する。前記不変領域は、重鎖不変領域（ＣＨと略称される）と軽鎖不変領域（ＣＬと略称される）とに分けられる。前記重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及び／またはイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及び／またはアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。ＩｇＧは、亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）であって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。

【0021】

前記可変領域は、抗原に対して特異性を有する抗体部位であって、重鎖の可変領域（ＶＨと略称される）と軽鎖の可変領域（ＶＬと略称される）とに分けられる。前記可変領域には、３個のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、または、相補性決定領域）と４個のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）とが含まれる。前記ＣＤＲは、抗原の認識に関与する環状の部位であり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列によって抗原に対する特異性が決定される。前記ＣＤＲは、その順序によってＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と称され、重鎖及び軽鎖のうち、如何なるポリペプチドのＣＤＲであるかによって、重鎖可変領域の場合、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３と、軽鎖可変領域の場合、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３と称される。ＦＲも同様に、重鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４と、軽鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４と称される。また、前記ＣＤＲ及びＦＲは、それぞれの可変領域で次のような順序で配列される。

【0022】

本発明において、用語「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合機能を保有する本発明のヒト化抗体の任意の断片を意味する。前記抗原結合断片は、「断片」、「抗体断片」などの用語と互換されて称され、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどであるが、これらに制限されるものではない。

【0023】

前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。前記「Ｆａｂ」は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点で前記Ｆａｂと差がある。前記Ｆ（ａｂ’）_２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。前記Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体切片を意味する。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ末端で直ちに連結されており、二本鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を成しうる。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いるか（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂが得られ、ペプシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）_２断片が得られる）、または遺伝子組換え技術を通じて作製することができるが、これらに制限されるものではない。

【0024】

前記リンカーは、ペプチドリンカーであり、約１０～２５個のアミノ酸長さを有するものである。例えば、前記リンカーには、グリシン（Ｇ）及び／またはセリン（Ｓ）のような親水性アミノ酸が含まれる。前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含むことができ、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であるが、これらに制限されるものではない。

【0025】

本発明において、用語、「エピトープ」は、免疫グロブリン、抗体またはその抗原結合断片が特異的に認識し、結合することができる抗原上の特定部位を意味する。前記エピトープは、連続アミノ酸から、またはタンパク質の３次折り曲げによって並置された不連続アミノ酸から形成されうる。

【0026】

前記「特異的に結合する」ことは、背景結合よりも大きな結合親和性で他の分子に対して結合することを意味することができ、例えば、前記細胞外ドメインは、標的抗原に対して約１０^－５Ｍ以上の親和性またはＫａ（１／Ｍの単位を有する特定結合相互作用の平衡解離定数）で標的抗原に結合するものである。前記親和性は、Ｍの単位を有する特定結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）が１０^－５～１０^－１３Ｍまたは前記範囲以下であるものである。

【0027】

本発明の前記抗体またはその抗原結合断片は、ｉ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８及び配列番号２６からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９及び配列番号２７からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０及び配列番号２８からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及びｉｖ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２及び配列番号３０からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ｖ）配列番号７、配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びｖｉ）配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含み、ＣＤ５に特異的に結合する。

【0028】

前記重鎖可変領域は、配列番号５、配列番号１３、配列番号２１または配列番号２９のアミノ酸配列を有するものである。

【0029】

前記軽鎖可変領域は、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５または配列番号３３のアミノ酸配列を有するものである。

【0030】

前記軽鎖可変領域は、配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を有するものである。

【0031】

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ヒトに由来する抗体の重鎖不変領域及び／または軽鎖不変領域をさらに含むことができ、前記抗体またはその抗原結合断片がＣＤ５に対して特異的に結合する特性を阻害しないものであれば、前記ヒトに由来する抗体の重鎖不変領域及び／または軽鎖不変領域は、その種類やアミノ酸配列に制限なしに用いられる。

【0032】

前述したアミノ酸配列は、それを含むポリペプチドの構造、機能、活性などに影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有する変異体を含みうる。また、前記アミノ酸配列は、当業者に知られている通常の変形が起こったアミノ酸を含むものであり、前記アミノ酸変形は、例えば、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などである。本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片は、前述したアミノ酸配列を含むものだけではなく、これと実質的に同じアミノ酸配列を有するものやその変異体を含む。前記実質的に同じアミノ酸配列を有するものの意味は、前述したアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであるが、これらに制限されるものではない。

【0033】

本発明において、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、標的抗原及び前記抗原を発現する細胞を認識して結合した時、これに対して免疫反応を誘導できるように設計された合成複合体である。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメインを含みうる。キメラ抗原受容体は、免疫細胞の表面に発現されて細胞外ドメインに含まれた抗原結合部位を通じて、特定の抗原、例えば、癌細胞の表面に特異的に発現される抗原を認識して結合されることにより、免疫細胞内で信号伝達を起こして免疫細胞の活性を変化させることができるので、特定の抗原のみを標的として免疫反応を誘発させることができる。

【0034】

本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＤ５（ｅｐｈｒｉｎ ｔｙｐｅ－Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン；及び細胞内信号伝達ドメイン；を含む。

【0035】

前記ＣＤ５に特異的に結合する抗原結合部位は、ｉ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８及び配列番号２６からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号３、配列番号１１、配列番号１９及び配列番号２７からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号４、配列番号１２、配列番号２０及び配列番号２８からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ｉｖ）配列番号６、配列番号１４、配列番号２２及び配列番号３０からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ｖ）配列番号７、配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びｖｉ）配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択される何れか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ＣＤ５抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

【0036】

本発明の前記キメラ抗原受容体が免疫細胞の表面に発現された時、標的抗原であるＣＤ５が前記受容体に結合すれば、免疫細胞内で信号伝達が発生し、前記免疫細胞の細胞毒性（または、細胞溶解活性）の向上及び／または前記免疫細胞のサイトカインの分泌促進が誘導される。前記細胞毒性（または、細胞溶解活性）の向上またはサイトカインの分泌促進は、抗原が存在しない状態の免疫細胞が表わす細胞毒性（または、細胞溶解活性）やサイトカインの分泌よりも高いレベルに細胞毒性（または、細胞溶解活性）を示すか、高いレベルにサイトカインを分泌するものである。

【0037】

前記細胞外ドメインは、ヒンジドメイン（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）及びスぺーサドメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含みうる。前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、ヒンジドメイン及び／またはスぺーサドメインを通じて膜貫通ドメインと連結される。

【0038】

前記ヒンジドメインは、適切な細胞／細胞接触、適切な抗原／抗原結合部位の結合及び適切なキメラ抗原受容体の活性化を可能にするように、前記キメラ抗原受容体が発現される免疫細胞の表面から前記抗原結合部位を物理的に離隔させる部分であって、細胞外ドメインの位置決めに重要な役割を担当することができる。前記キメラ抗原受容体は、前記細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に１つ以上のヒンジドメインを含みうる。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源に由来する。ヒンジドメインは、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含みうる。前記変化したヒンジ領域は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例：最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する天然発生ヒンジ領域、（ｂ）最大３０％アミノ酸変化（例：最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する少なくとも１０個のアミノ酸（例：少なくとも１２、１３、１４または１５個のアミノ酸）長さの天然発生ヒンジ領域の一部、または（ｃ）コアヒンジ領域（これは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸長さである）を含む天然発生ヒンジ領域の一部を称する。特定の実施形態において、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域で１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例：１つ以上のセリン残基）で置換される。変化した免疫グロブリンヒンジ領域は、代案的に、または追加的にさらに他のアミノ酸残基、例えば、システインで置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有しうる。ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの類型１膜タンパク質の細胞外ドメインに由来するヒンジ領域であるが、前記抗原結合部位と膜貫通ドメイン、そして、細胞内信号伝達ドメインを細胞膜の間に連結可能なものであれば、如何なるものでも制限なしに用いられる。また、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であるか、変化することができる。

【0039】

前記スぺーサドメインは、連結ドメインと称され、例えば、ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／またはＣＤ８由来のヒンジドメインを含むものであり、前記ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／またはＣＤ８由来のヒンジドメインの全体または一部を含むものである。

【0040】

前記ヒンジドメイン及び／またはスぺーサドメインは、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジドメイン及びＦｃからなる群から選択される少なくとも１つであり、具体的に、Ｍｙｃエピトープ及びＣＤ８ヒンジドメインを含むものである。

【0041】

前記膜貫通ドメインは、細胞外ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインを互いに連結して融合させ、免疫細胞の原形質膜にキメラ抗原受容体を固定させる役割を行う一部の領域を意味する。前記膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源に由来するものである。前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ（α）、ベータ（β）またはゼータ（ζ）鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選択される何れか１つであるが、これらに制限されるものではない。

【0042】

前記膜貫通ドメインは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を通じて前記細胞外ドメインに付着される。例えば、リンカーは、２～１０個のアミノ酸長さの短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーであり、例えば、グリシン（Ｇ）－セリン（Ｓ）二重体（ｄｏｕｂｌｅｔ）であるが、これらに制限されるものではない。

【0043】

前記細胞内信号伝達ドメインは、免疫細胞の機能（例えば、キメラ抗原受容体と抗原が結合された標的細胞に対する細胞毒性（または、細胞溶解活性）因子の放出を含む活性化、サイトカイン生成、増殖及び細胞毒性または細胞溶解活性、または、前記抗原結合で誘発されたその他の細胞反応）を誘発するために、前記キメラ抗原受容体と抗原の結合によって発生する信号を免疫細胞の内部に伝達する役割を行う部分に該当する。前記細胞内信号伝達ドメインは、作動機能信号を伝達し、細胞が特殊な機能を行うように指示するタンパク質の一部である。

【0044】

前記細胞内信号伝達ドメインは、既存にキメラ抗原受容体の発展過程で用いられた細胞内信号伝達ドメインが用いられる。具体的に、１世代ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）で用いられたＣＤ３ζのみを含みうる。そして、２世代ＣＡＲで用いられたように、免疫細胞に対する反応性の向上のために、共刺激ドメイン（ＣＤ２８またはＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζとを結合した形態が用いられる。また、３世代ＣＡＲで用いられたように、２種以上の共刺激ドメインが用いられ、この際、生体内ＣＡＲを含む免疫細胞の拡張及び持続性の達成のために、共刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０などと結合させることができる。さらに、４世代ＣＡＲで利用したように、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５のようなサイトカインを暗号化する追加遺伝子を含んで、サイトカインのＣＡＲ基盤の免疫タンパク質をさらに発現させることができ、５世代ＣＡＲで利用したように、免疫細胞の強化のために、インターロイキンレセプターチェーン、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含みうる。

【0045】

前記細胞内信号伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ（ζ）、ＦｃＲガンマ（γ）、ＦｃＲベータ（β）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つを含みうる。

【0046】

より具体的に、前記細胞内信号伝達ドメインによる前記免疫細胞の活性化は、細胞内信号伝達ドメインの２個異なる部類によって媒介される。例えば、抗原－依存性一次活性化を開始する１次信号伝達ドメイン及び２次信号を提供するために、抗原－独立した方式で作用する共刺激信号伝達ドメインによって免疫細胞の活性化が媒介される。したがって、前記細胞内信号伝達ドメインは、１次信号伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及び共刺激信号伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含みうる。

【0047】

前記１次信号伝達ドメインとは、免疫細胞の活性化を刺激または抑制方式で調節する信号伝達ドメインを意味する。刺激方式で作用する１次信号伝達ドメインは、免疫受容体チロシン－基盤活性化モチーフまたはＩＴＡＭで公知されている信号伝達モチーフを含有することができる。１次信号伝達ドメインを含有するＩＴＡＭは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄなどであるが、これらに制限されるものではない。より具体的に、前記１次信号伝達ドメインは、ＣＤ３ζ（ｚｅｔａ）であるが、これに制限されるものではない。

【0048】

前記共刺激信号伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内信号伝達ドメインを意味する。前記共刺激信号伝達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５、ＣＤ８３などからなる群から選択される共刺激信号伝達ドメインを含みうるが、これらに制限されるものではない。具体的に、前記共刺激分子は、ＤＡＰ１０であるが、これらに制限されるものではない。

【0049】

前記キメラ抗原受容体は、２個以上の細胞内信号伝達ドメインを含むことができ、２個以上の細胞内信号伝達ドメインを含む場合には、細胞内信号伝達ドメインが互いに直列連結される。または、２～１０個のアミノ酸からなるポリペプチドリンカーを通じて連結されても良く、前記リンカー配列は、例えば、グリシン－セリン連続配列である。前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含むことができ、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であるが、これらに制限されるものではない。

【0050】

前記キメラ抗原受容体は、免疫細胞の免疫機能促進因子をさらに含むことができ、例えば、前記免疫細胞の免疫機能促進因子は、インターロイキン信号配列（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。前記インターロイキン信号配列は、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－１２、ＩＬ－８、ＩＬ－２などの発現を誘導することを特徴とするが、これらに制限されるものではない。また、前記免疫細胞がＴ細胞である場合、前記免疫機能促進因子は、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９などであるが、これらに制限されるものではない。

【0051】

一方、前記キメラ抗原受容体は、ドメイン露出のためのシグナル（信号）ペプチドをさらに含みうる。前記シグナル（信号）ペプチドは、任意の分泌された、または膜貫通タンパク質の一種であり、これは、キメラ抗原受容体が細胞膜または細胞表面に輸送されるように指示し、正確な位置選定を提供することができる。具体的な種類は、ＣＤ８アルファまたはマウス軽鎖カッパ信号ペプチド（ｍｏｕｓｅ ｌｉｇｈｔ ｋａｐｐａ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）であるが、これらに制限されるものではない。

【0052】

本発明の具体的な一実施例では、前述したようなアミノ酸配列を有する４種（＃１、＃４、＃１１及び＃１４）の抗ＣＤ５抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインに含み、これとＭｙｃ及びヒンジドメインで連結されたＣＤ２８を膜貫通ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインで含み、ＣＤ３－ｚｅｔａ及びＤＡＰ１０を細胞内信号伝達ドメインで連結された形態のキメラ抗原受容体を設計して、本発明のキメラ抗原受容体を製造した（ＣＤ５－ＣＡＲ）。

【0053】

前述したように、本発明のキメラ抗原受容体は、免疫細胞の表面で発現してＣＤ５を認識して結合すれば、免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性を向上させるか、免疫細胞のサイトカインの分泌を促進するように誘導することができる。したがって、ＣＤ５を発現する癌細胞が存在する時、前記キメラ抗原受容体の抗原結合部位が抗原を認識して結合する場合、信号伝達によって免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性の向上及び／またはサイトカインの分泌促進が誘導されて、癌細胞を攻撃する細胞毒性の効能または細胞溶解の効能に優れたキメラ抗原受容体として有用に用いられる。

【0054】

本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクターを提供する。

【0055】

前記ポリヌクレオチドは、前記キメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含む。

【0056】

本発明において、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含むものであって、基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。

【0057】

前記キメラ抗原受容体を暗号化するということは、前記ポリヌクレオチドが転写、翻訳などの通常のタンパク質発現過程を経て、本発明のキメラ抗原受容体のアミノ酸配列を有するタンパク質が合成される遺伝情報が暗号化されているということを意味する。この際、前記キメラ抗原受容体と完全に同じアミノ酸配列を有するタンパク質だけではなく、前述したように、前記タンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質であるが、前記タンパク質と同一及び／または類似した活性を有するタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドまで本発明の範囲に含まれる。

【0058】

具体的に、本発明のポリヌクレオチドは、前記ＣＤ５に特異的に結合する抗ＣＤ５抗体の抗原結合断片を暗号化する塩基配列を含むものである。

【0059】

また、本発明のポリヌクレオチドは、前記抗原結合断片を暗号化する塩基配列だけではなく、これと連結された他の細胞外ドメイン部分、前記膜貫通ドメイン及び／または前記細胞内信号伝達ドメインを暗号化する塩基配列を含むものである。

【0060】

前記抗体、抗原結合断片、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内信号伝達ドメインなど前記キメラ抗原受容体についての説明は、先立ってこれらについて説明したものと同一である。

【0061】

本発明のポリヌクレオチドは、前記羅列された塩基配列と実質的に同じ塩基配列を含みうる。前記実質的に同じ塩基配列とは、例えば、転写及び翻訳された時、同じアミノ酸が合成される場合を含み、前記羅列された塩基配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の相同性を有する塩基配列であるが、これらに制限されるものではない。

【0062】

前記キメラ抗原受容体を暗号化するポリヌクレオチドは、それを導入させて発現させようとする生物の種類と前記生物の転写、翻訳など発現システムによって、最適化された塩基配列を含みうる。これは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）から起因したものであって、これにより、発現されるタンパク質を暗号化することができる多様な組み合わせのヌクレオチド配列が存在することができ、これらは、いずれも本発明の範囲に含まれる。前記コドン最適化によるポリヌクレオチドの変形は、本発明のキメラ抗原受容体を発現させて適用させようとする生物の種類によって決定され、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物、霊長類のコドン選択に最適化して変形されたポリヌクレオチドであり、さらに具体的には、ヒトから発現させて作用するのに適するように最適化されて変形されたものである。

【0063】

本発明の発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。

【0064】

前記ポリヌクレオチドは、本発明の前記キメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含むので、それを含む前記発現ベクターは、前記キメラ抗原受容体を発現させて製造するために用いられ、前記キメラ抗原受容体が発現されるように、前記ポリヌクレオチドを特定の細胞または生物に移動させる役割を行うか、前記ポリヌクレオチドを保管、保存するために用いられる。

【0065】

前記「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、適した宿主内でＤＮＡを発現させることができる適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム挿入物である。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは、宿主ゲノムと無関係に複製し、機能することができるか、または一部の場合にゲノムそれ自体に統合される。また、前記「発現ベクター」は、通常、異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｒｒｉｅｒ）であって、一般的に、二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞で天然的に見つけられないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦、宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成されうる。

【0066】

前記発現ベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築される。

【0067】

例えば、前記発現ベクターが原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボソーム結合位置及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）、そして、ファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ ａｎｄ Ｈａｇｅｎ，Ｄ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，（１９８０）１４：３９９－４４５）が調節部位として用いられる。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９９６）２５０：７３４－７４１）またはバチルス菌で発現可能な如何なるプロモーターでも調節部位として用いられる。前記発現ベクターは、当業者で度々使われるプラスミド（例えば、ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製される。

【0068】

前記発現ベクターが真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有しうる。前記発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターを有するものである。

【0069】

また、前記発現ベクターは、これにより発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合される。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。また、本発明の発現ベクターによって発現されるタンパク質がキメラ抗原受容体なので、その特性を考慮する時、精製のための追加的な配列なしにも発現されたタンパク質をタンパク質Ａカラムなどを通じて容易に精製することもできる。

【0070】

前記発現ベクターは、選択標識として当業者で通用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含みうる。

【0071】

また、前記発現ベクターは、形質注入しようとする遺伝子の発現を促進させるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と転写に必要な基本因子（Ｂａｓａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）だけではなく、発現の促進及び調節に使われるエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）をさらに含みうる。

【0072】

２．ＣＤ５に対するキメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞
本発明の他の側面は、ＣＤ５を発現する癌細胞に対して向上した細胞毒性または細胞溶解活性を示す特徴がある免疫細胞を提供する。

【0073】

前記免疫細胞は、前述した本発明の前記キメラ抗原受容体を表面に発現する。前記キメラ抗原受容体は、先立って「１．新規な抗ＣＤ５抗体、その抗原結合断片、そして、それを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」でこれについて説明したものと同一である。具体的に、前記キメラ抗原受容体は、癌細胞で発現されるＣＤ５抗原に対して特異的に結合することができる抗原結合部位を含みうる。

【0074】

前記キメラ抗原受容体が免疫細胞の表面に「発現」」されるということは、キメラ抗原受容体を暗号化する核酸の添加または変形によって操作された任意の免疫細胞を意味する。したがって、前記のように免疫細胞の表面にキメラ抗原受容体を発現させるために、前記キメラ抗原受容体を暗号化するポリヌクレオチドまたはそれを含む発現ベクターを前記免疫細胞に形質注入（トランスフェクション；ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または形質導入（トランスダクション；ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）することができる。前記形質注入は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈澱法、ＤＥＡＥ－デキストラン－媒介形質感染法、ポリブレン－媒介形質感染法、電気衝撃法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法などの当該分野に公知の多様な方法によって行われる。また、前記形質注入は、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を手段としてウイルスまたはウイルスベクター粒子を使用して細胞内に遺伝子を伝達させることを意味する。本明細書で形質注入と形質導入は混用されるが、両者、大きな意味として宿主細胞に外来遺伝子伝達の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に解析されることが望ましく、形質注入または形質導入によって外来遺伝子が導入された細胞は、形質転換体と称する。

【0075】

前記免疫細胞は、免疫を誘導して所望の治療効果を誘発することができる細胞であれば、制限なしに用いられ、末梢血液、臍帯血、骨髄、腫瘍浸潤リンパ球、リンパ節組織または胸腺組織から獲得され、胎盤細胞、胚性幹細胞、誘導万能幹細胞または造血幹細胞から分化させて獲得することができる。また、前記免疫細胞は、ヒト、猿、チンパンジー、犬、猫、マウス、ラット及びその遺伝子挿入種だけではなく、確立細胞株から獲得することができる。

【0076】

免疫細胞の獲得方法は、任意の当業者に知られている手段を使用することができ、自家、同種または異種から獲得することができる。「自家」は、以後に個体に再導入される同じ個体から派生されたあらゆる細胞を意味し、「同種」は、細胞が導入される個体と同じ種の他の動物に由来したあらゆる細胞を意味するものであり、「異種」は、他の種の動物に由来した細胞を意味する。

【0077】

特に、前記免疫細胞は、自然殺害細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、自然殺害Ｔ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ、ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、サイトカイン誘導殺害細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、マクロファージ、樹状細胞などから選択される何れか１つであるが、これらに制限されるものではない。したがって、本発明によるキメラ抗原受容体を細胞表面に発現する免疫細胞は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－大食細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ ＲｅｃｅｐｔｏｒＭａｃｒｏｐｈａｇｅ）などである。

【0078】

本発明から提供される免疫細胞は、通常のキメラ抗原受容体の標的細胞に対する反応開始（ｏｎ）／中止（ｏｆｆ）を調節することができるので、後続細胞療法、治療細胞の活性が増加または減少する必要がある状況で非常に有益な安全性スイッチを含む。例えば、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞が患者に提供される場合、ある状況では、副作用、例えば、オフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）毒性がある。または、例えば、治療細胞が腫瘍細胞の数または腫瘍サイズを減少させる作用ができ、それ以上必要ではない。このような状況では、治療細胞がそれ以上活性化されないように調節することができる。特に、自然殺害細胞にキメラ抗原受容体が導入された前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、既存のＴ細胞を基盤としたＣＡＲ－Ｔ治療剤を利用した時の癌免疫治療が有している持続的な毒性による問題点、自己免疫疾患の危険、異種細胞移植に対する移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の問題点、非標的毒性問題などを反応開始（ｏｎ）／中止（ｏｆｆ）のスイッチを通じて解決するだけではなく、多様な癌細胞を標的可能にして汎用の治療剤として活用可能な長所がある。

【0079】

本発明の免疫細胞は、癌細胞で特異的に発現されるＣＤ５を特異的に認識して結合することができる抗体の抗原結合可変断片（ｓｃＦｖ）を細胞外ドメインとして含むキメラ抗原受容体を、細胞表面に発現している。したがって、前記ＣＤ５が発現された癌細胞が存在する場合、前記キメラ抗原受容体によって信号伝達が発生することができ、これを通じて免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性がさらに向上し、サイトカインの分泌量が増加する。したがって、本発明の免疫細胞は、癌細胞を攻撃して、それを治療する活性を有しうる。

【0080】

本発明の具体的な実施例では、本発明のＣＤ５特異的抗体４種の抗原結合可変断片を細胞外ドメインとして含むキメラ抗原受容体を自然殺害細胞の表面に発現させた。前記それぞれの４種の自然殺害細胞は、ＣＤ５を発現する癌細胞株であるＭＯＬＴ４細胞やＣＣＲＦ－ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ細胞などと共培養された時、細胞毒性（または、細胞溶解活性）が向上し、サイトカインの分泌量と脱顆粒程度が顕著に増加するだけではなく、ＣＤ５を発現する正常細胞が含まれたＭＮＣに対しては、減少した細胞毒性を示すと確認されて、本発明の免疫細胞、ＣＤ５を発現する癌細胞に対して選択的に卓越した治療効果があるということを確認することができた。

【0081】

３．本発明の免疫細胞の癌に対する予防または治療用途
本発明のさらに他の側面は、前記免疫細胞を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0082】

前記免疫細胞、これにより発現されるキメラ抗原受容体などに関する説明は、「１．新規な抗ＣＤ５抗体、その抗原結合断片、そして、それを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」及び「２．ＣＤ５に対するキメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞」項目でこれらについて説明したものと同一なので、繰り返し説明を避けるために、記載を省略する。

【0083】

本発明において、用語「癌」は、「腫瘍」は同じ意味として使われ、典型的に調節されていない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を称するか、意味する。

【0084】

本発明の前記薬学的組成物で治療することができる癌または癌腫は、特に制限されず、固形癌及び血液癌をいずれも含む。特に、前記白血病またはリンパ腫のような血液癌であり、具体的に、胸腺癌、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、小リンパ球性細胞リンパ腫、Ｔ細胞腫瘍、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などから選択されたものである。

【0085】

また、本発明の前記薬学的組成物は、治療対象である個体の腫瘍細胞の数に比べて、前記免疫細胞の数が１～１０倍、２～１０倍、または５～８倍に含まれるが、これらに制限されるものではない。

【0086】

一方、癌の治療には、化学療法及び放射線療法を並行することが一般的である。化学療法に用いられる抗ガン剤は、増殖が活発な細胞の細胞死を誘導し、抗ガン剤の治療効果を高めるための放射線照射は、このような細胞死を増加させる。この際、抗ガン剤及び放射線によって細胞死が誘導される細胞は、癌細胞に限定されるものではなく、免疫治療のために個体に投与された免疫細胞治療剤にも影響を及ぼしうる。

【0087】

化学療法は、ＣＨＯＰ（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、ＥＰＯＣＨ（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）または任意の他の多様な薬物療法を含むが、これらに限定されるものではない。

【0088】

本発明において、「細胞治療剤」は、個体から分離、培養及び特殊な操作を通じて製造された細胞及び組織で治療、診断及び予防の目的として使われる医薬品（米国ＦＤＡ規定）であって、細胞あるいは組織の機能を復元させるために、生きている自家、同種、または異種細胞を体外で増殖選別するか、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて治療、診断及び予防の目的として使われる医薬品を意味する。

【0089】

一方、本発明の薬学的組成物は、薬学的または薬剤学的に許容される担体をさらに含みうる。前記「薬学的に許容可能な」の意味は、有効成分の活性を抑制せずとも、適用（処方）対象が適応可能な以上の毒性を有さないというものであり、前記「担体」は、細胞または組織内への化合物の付加を容易にする化合物と定義される。

【0090】

本発明の前記薬学的組成物は、単独で、またはある便利な担体などと共に混合して投与され、そのような投与剤形は、単回投与または繰り返し投与剤形である。前記薬学組成物は、固形製剤または液状製剤である。固形製剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これらに限定されるものではない。固形製剤には、担体、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれるが、これらに制限されるものではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これらに限定されるものではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。例えば、散剤は、本発明の有効成分である多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体と乳糖、澱粉、微結晶セルロースなど薬剤学的に許容可能な適当な担体を単純混合することで製造可能である。顆粒剤は、本発明の前記多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体、薬学的に許容可能な適当な担体及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬学的に許容可能な適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を利用した湿式顆粒法または圧縮力を利用した乾式顆粒法を用いて製造可能である。また、錠剤は、前記顆粒剤をステアリン酸マグネシウムなどの薬学的に許容可能な適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することで製造可能である。

【0091】

本発明の薬学的組成物は、治療しなければならない疾患及び個体の状態によって敬具剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、トランスダー末剤、トピカル剤などで投与されるが、これらに制限されるものではない。投与経路によって通常使われ、非毒性である、薬学的に許容可能な担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット剤形で製剤化される。

【0092】

特に、本発明の薬学的組成物は、注射用アンプルを通じて使われる。前記注射用アンプルは、使用直前に注射液と混合調剤することができ、注射液としては、生理食塩水、ブドウ糖、マンニトール、リンゲル液などを使用することができる。このように製造された本発明の薬学的組成物または製剤は、当業者で通常の投与方法を用いて移植及びその他の用途に使われる細胞と共に混合物の形態で投与される。有効成分の実際投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの多様な関連因子に照らして決定されなければならない。

【0093】

また、本発明の薬学的組成物の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路、及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうる。例えば、前記薬学的組成物は、毎日約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｇ／ｋｇが投与され、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｇ／ｋｇの１日投与容量で投与される。しかし、前記投与量は、前記混合物の精製程度、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性などによって多様である。必要に応じて便利性のために、１日総投与量を一日間数回分けて投与される。

【0094】

一方、前記組成物は、薬学的組成物以外にも、医薬外品組成物、健康食品用組成物などの形態である。

【0095】

また、本発明のさらに他の側面は、前記免疫細胞を治療が必要な個体に投与する段階を含む癌の予防または治療方法を提供する。

【0096】

前記免疫細胞は、前述した薬学的組成物の形態であり、当業者が前記薬学的組成物の適切な投与経路と容量とを決定することができる。

【0097】

以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。

【0098】

但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。

【0099】

［実施例１］
ＣＤ５に対するキメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞の製造
［１－１］ＣＤ５に特異的に結合する抗体の一本鎖可変断片の作製
ＣＤ５に対して特異的に結合することができる抗ＣＤ５抗体配列中で、特異的結合に重要な役割を行う配列を用いて一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）４種（＃１、＃４、＃１１、＃１４）を製造した。

【0100】

下記表１に記載のように、＃１ ｓｃＦｖの場合、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むように設計した。＃４ ｓｃＦｖの場合、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むように設計した。＃１１ ｓｃＦｖの場合、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むように設計した。そして、＃１４ ｓｃＦｖの場合、配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むように設計した。

【0101】

【表1】

【0102】

［１－２］キメラ抗原受容体の設計
前記のように設計された４種のｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインとし、下記表２に記載のような配列のＣＡＲ領域を用いて自然殺害細胞に導入するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を設計した。具体的に、前記４種のｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインと、ＣＤ２８を膜貫通ドメインとしてＭｙｃ及びヒンジドメインで連結させ、前記膜貫通ドメインに細胞内信号伝達ドメインでＣＤ３－ｚｅｔａと共刺激分子でＣＤ２８ ＤＡＰ１０を追加して連結することにより、いわゆる３世代ＣＡＲに分類されるキメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインを有するように、本発明のキメラ抗原受容体を設計した（それぞれ「ＣＤ５＃１－ＣＡＲ」、「ＣＤ５＃４－ＣＡＲ」、「ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ」及び「ＣＤ５＃１４－ＣＡＲ」とし、これらを通称して「ＣＤ５－ＣＡＲ」と称する）。そして、それを暗号化する遺伝子コンストラクトの塩基配列をレンチウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、６３２１５５）に挿入した（図１）。

【0103】

【表2】

【0104】

［１－３］ＣＤ５－ＣＡＲを発現する自然殺害細胞の製造
前記実施例１－２で準備したレンチウイルスベクターを、ウイルスパッケージングベクター（ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ；ＰＭＤＬｇ／ＲＲＥ、ＲＳＶ／ＲＥＶ、ＶＳＶＧ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換させ、それからＣＤ５－ＣＡＲを発現するレンチウイルスを得た。前記レンチウイルスを超高速遠心分離機を用いて濃縮させ、該濃縮された前記レンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させた後、ＣＤ５－ＣＡＲのＭｙｃエピトープ量を流動細胞計数法（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認して感染単位（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）を計算した。感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）が３０になるように自然殺害細胞数及びレンチウイルスの量を計算し、ＣＤ５－ＣＡＲを発現するレンチウイルスを自然殺害細胞（ＮＫ９２細胞）にｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ方法（３６０ｇ、９０ｍｉｎ、ＲＴ）で感染させた。前記のように感染された自然殺害細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２条件で５時間培養した後、新鮮な培養培地に交換し、３日後に十分に感染された自然殺害細胞の選別のために、３ｕｇ／ｍｌ濃度のピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を処理して培養を進行し続けた。

【0105】

対照群として、感染されていない自然殺害細胞にもピューロマイシンを処理し、対照群で自然殺害細胞がピューロマイシンによっていずれも死滅するまでピューロマイシンが処理された培地を用いて培養を続けた。対照群の自然殺害細胞がいずれも死滅した時点で感染された自然殺害細胞を選別し、前記選別された自然殺害細胞をピューロマイシンがない培地で再び培養して増殖または拡張させた。前記選別された自然殺害細胞の増殖または拡張には、Ａｌｐｈａ－ＭＥＭ含有１２．５％ウシ胎児血清、１２．５％ウマ血清、０．２ｍＭ イノシトール、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．０２ｍＭ 葉酸及び２００Ｕ／ｍｌ 組換えＩＬ－２を利用した培地を利用した。

【0106】

前記のように作製及び選別されたＣＤ５＃１－ＣＡＲ、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲを発現する自然殺害細胞（それぞれ「ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞」及び「ＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞」とし、これらを通称して「ＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞」と称する）に、ＣＤ５－ＣＡＲのｍｙｃに特異的に結合する抗ｍｙｃ抗体（ＣＳＴ；９Ｂ１１）を処理し（４℃、雌牛で３０分）、流動細胞計数法を通じてＭｙｃの発現を確認することにより、ＣＤ５－ＣＡＲの発現を確認した。この際、対照群としては、ＣＤ５－ＣＡＲを発現しない本来の自然殺害細胞を使用した。

【0107】

その結果、図２に示したように、対照群に比べて４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞いずれもでＣＤ５－ＣＡＲが十分に発現されているということを確認した。

【0108】

［実施例２］
ＣＤ５を発現する癌細胞に対する、ＣＤ５－ＣＡＲを発現する免疫細胞の活性確認
［２－１］ＣＤ５を発現する癌細胞に対する、ＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性確認
ＣＤ５を発現すると知られた癌細胞株であるＭＯＬＴ４とＣＤ５を発現しないと知られた癌細胞株Ｕ９３７とについて、前記実施例１－３で製造した４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（または、細胞殺傷能、細胞溶解活性）をカルセインＡＭ分析法で確認した。具体的に、ＭＯＬＴ４細胞とＵ９３７細胞とにカルセイン－ＡＭ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃ１４３０）を５ｕｇ／ｍｌの濃度で処理して反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２、雌牛で１時間）、カルセインで染色されたＭＯＬＴ４細胞とＵ９３７細胞とに前記４種の各ＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞をそれぞれ２：１、１：１、０．５：１の比率（自然殺害細胞：癌細胞）で処理して２００ｕｌのＲＰＭＩ１６４０（１０％ ＦＢＳ）で反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２で２時間）、上澄み液１００ｕｌを取って上澄み液内に存在するカルセインの量を確認して、各条件による細胞毒性を下記のような方法で計算した。

【0109】

細胞毒性（％）＝（条件によるカルセインｒｅｌｅａｓｅ ｖａｌｕｅ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｖａｌｕｅ）／（ｍａｘｉｍｕｍ ｖａｌｕｅ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｖａｌｕｅ）ｘ１００
対照群としては、本発明のＣＤ５－ＣＡＲを暗号化する遺伝子コンストラクトが含まれていない空き（ｅｍｐｔｙ）レンチウイルスベクター、または、本発明のＣＤ５－ＣＡＲから細胞外ドメインが除去された遺伝子コンストラクトが含まれたレンチウイルスベクターを、前記実施例［１－３］のような方法で自然殺害細胞に導入し、ピューロマイシンで選別する過程を経て得た自然殺害細胞を利用し、これらをそれぞれ「ＰＵＲＯ ＮＫ細胞」及び「ｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞」と称する。

【0110】

その結果、図３に示したように、ＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞に対しては、前記４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞がいずれも対照群（ＰＵＲＯ ＮＫ細胞またはｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞）に比べて遥かに高い細胞毒性を示すだけではなく、このような細胞毒性が、処理されたＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞に濃度依存的であると確認された。それに対して、ＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞に対しては、対照群と前記４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞いずれも細胞毒性をほとんど示すことができないと確認された。

【0111】

また、前記のような４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞うち、細胞毒性が最も優れていると確認された２種（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を選別して、ＣＤ５を発現すると知られた他の癌細胞株であるＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＪｕｒｋａｔとＣＤ５を発現しないと知られた他の癌細胞株であるＤａｕｄｉを対象にして、前記２種の各ＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞をそれぞれ２：１の比率（自然殺害細胞：癌細胞）で処理して、前記と同じ方法でＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性をもう一度確認した。

【0112】

その結果、図４に示したように、ＣＤ５を発現するＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞とに対しては、前記２種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞がいずれも対照群（ＰＵＲＯ ＮＫ細胞またはｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞）に比べて遥かに高い細胞毒性を示したと確認されたのに反して、ＣＤ５を発現しないＤａｕｄｉ細胞に対しては、対照群と前記２種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞いずれも細胞毒性をほとんど示すことができないと確認された。

【0113】

さらに、前記４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対してサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）とグレニュル（ｇｒａｎｕｌｅ）との分泌を確認した。具体的に、ＭＯＬＴ４細胞とＵ９３７細胞とにＰｕｒｏ ＮＫ細胞、ｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞または前記実施例１－３で製造した４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞のそれぞれを１：１に処理してＲＰＭＩ１６４０（１０％ ＦＢＳ）で反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２条件で１２時間）、上澄み液を集めて上澄み液内に存在するサイトカインであるＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡを通じて確認した。この際、Ｐｕｒｏ ＮＫ細胞、ｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞及びＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の単独から分泌されるサイトカインの量を対照群として使用した。

【0114】

その結果、図５Ａに示したように、ＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞に処理したＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞のみでＩＮＦ－γの分泌量が著しく向上したと確認された。

【0115】

また、ＭＯＬＴ４細胞とＵ９３７細胞とにＰｕｒｏ ＮＫ細胞、ｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞または前記実施例１－３で製造した４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞のそれぞれを１：１に処理してＲＰＭＩ１６４０（１０％ ＦＢＳ）で反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２条件で４時間）、自然殺害細胞を選別できるように抗ＣＤ５６抗体を処理して染色し、流動細胞計数法を用いてＰｕｒｏ ＮＫ細胞、ｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞及び前記４種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞でのＣＤ１０７ａが発現される程度を分析した。

【0116】

その結果、図５Ｂないし図５Ｅに示したように、ＩＮＦ－γの場合と同様に、ＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞に処理したＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞のみでＣＤ１０７ａの発現が著しく向上していると確認された。

【0117】

［２－２］ＣＤ５を発現する正常Ｔ細胞に対する、ＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性確認
本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞が、ＣＤ５を発現する癌細胞ではないＣＤ５を発現する正常Ｔ細胞に対しては、如何なる活性を示すかを確認するために、まず、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標） Ｇｒａｄｉｅｎｔ方法を用いて臍帯血からＮＭＣ（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を分離した。具体的に、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）上に臍帯血が混ざらないように気をつけて入れ、常温で２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、白血球と血小板とを含むバフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）（Ｅｎｒｉｃｈｅｄ ＭＮＣ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分離した。前記のように分離した分画に１ＸＡＣＫ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ－Ｃｈｌｏｒｉｄｅ－Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）溶解緩衝溶液を３７℃で１０分間処理して残っている赤血球を壊して純粋なＭＮＣのみを分離した。

【0118】

前記のように分離されたＭＮＣを対象にして、前記実施例１－３で製造したＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞をそれぞれ１：１の比率（自然殺害細胞：ＭＮＣ）で処理して、前記実施例［２－１］と同じ方法でＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性を確認した。

【0119】

その結果、図６に示したように、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞とＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞いずれも、ＭＮＣに対しては、ＣＤ５を発現する癌細胞であるＭＯＬＴ４に比べて減少した細胞毒性を示すと確認された。

【0120】

［２－３］ＣＤ５－ＣＡＲの発現量によるＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性確認
超高速流細胞分離器（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ）を用いて、前記実施例１－３で製造したＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞のそれぞれを９６ウェルプレートに単一細胞に分離した。そして、そのうち、互いに類似している速度で増殖する細胞を繰り返して選別して４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、６ウェルプレート及び２５Ｔフラスコの順に増殖させた。

【0121】

その後、前記のように分離されたＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の単一細胞のそれぞれを対象にしてＣＤ５－ＣＡＲの発現量を確認し、これに基づいてＣＤ５－ＣＡＲの発現程度が異なる細胞株を構築した（図７Ａ）。

【0122】

その後、ＣＤ５が発現される癌細胞株であるＭＯＬＴ４と前記実施例［２－２］から分離したＭＮＣとを対象にして、前記のように構築されたＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の単一細胞株をそれぞれ１：１の比率（自然殺害細胞：癌細胞またはＭＮＣ）で処理して、前記実施例［２－１］と同じ方法でＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の個別単一細胞株の細胞毒性を確認した。

【0123】

その結果、図７Ｂに示したように、たとえＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の個別単一細胞株がＣＤ５を発現する癌細胞であるＭＯＬＴ４に対して向上した細胞毒性を示しているにしても、細胞毒性自体がＣＤ５－ＣＡＲの発現量に比例しないと確認された。また、正常Ｔ細胞が含まれたＭＮＣに対しては、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の個別単一細胞株はいずれも減少した細胞毒性を示したが、ＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の個別単一細胞株は、細胞毒性がそれほど減少しないと確認された。

【0124】

前記のような結果から、前記２種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞うち、正常Ｔ細胞により低い細胞毒性を示すＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の個別単一細胞株を対象にして、ＣＤ５を発現する癌細胞であるＭＯＬＴ４に対しては、高い細胞毒性を示しながらも、正常Ｔ細胞が含まれたＭＮＣに対しては、低い細胞毒性を示す単一細胞株を選別し、その結果、図７Ｃに示したように、Ｌ４単一細胞株を先導細胞株として選択した。

【0125】

［２－４］ｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞基盤のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性確認
さらに、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞をＮＫ９２細胞ではないｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞を用いて作製した時も、前記実施例［２－１］ないし実施例［２－３］で確認されたような優れた活性を示すことができるかを確認した。

【0126】

そのために、まず、図８に示したように、ｍＲＮＡのＵＴＲを組み合わせてタンパク質発現及びｍＲＮＡ安全性を向上させる構造を有するＣＤ５＃１１－ＣＡＲとＣＤ５＃１４－ＣＡＲとのｍＲＮＡ構造体を設計及び作製し、前記のようなｍＲＮＡ構造体の塩基配列をレンチウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、６３２１５５）に挿入した。その後、ｍＲＮＡ合成Ｋｉｔ（ＥＺ^ＴＭ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて前記遺伝子コンストラクトを鋳型として、図８に示された構造を有するＣＤ５－ＣＡＲのｍＲＮＡを合成した。

【0127】

前記のように合成されたＣＤ５－ＣＡＲのｍＲＮＡを電気穿孔法でｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞に導入し、７時間が経過した後に、ＣＤ５－ＣＡＲのＭｙｃに特異的に結合する抗ｍｙｃ抗体（ＣＳＴ；９Ｂ１１）を処理し（４℃、雌牛で３０分）、流動細胞計数法を通じてＭｙｃの発現を確認することにより、ＣＤ５－ＣＡＲの発現を確認した。その結果、図９に示したように、ｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞でＣＤ５－ＣＡＲが十分に発現されているということを確認した。

【0128】

また、ＣＤ５を発現すると知られた癌細胞株であるＭＯＬＴ４、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ及び前記実施例［２－２］から分離したＭＮＣを対象にして、前記のようにｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞に基づいて製造した２種のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞をそれぞれ０．５：１、１：１の比率（ｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞：癌細胞）で処理して、前記実施例［２－１］と同じ方法でｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞基盤のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性を確認した。

【0129】

その結果、図１０に示したように、ＣＤ５を発現する癌細胞であるＭＯＬＴ４細胞及びＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞に対しては、前記２種のｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞基盤のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞がいずれも対照群（ＰＵＲＯ ＮＫ細胞またはｄＥｃｔｏ－ＮＫ細胞）に比べて遥かに高い細胞毒性を示すだけではなく、このような細胞毒性が、処理されたＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞に濃度依存的であると確認された。それに対して、ＣＤ５を発現する正常Ｔ細胞が含まれたＭＮＣに対しては、より減少した細胞毒性を示すと確認された。

【0130】

［実施例３］
本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性を調節するリガンド確認
［３－１］本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対するリガンドスクリーニング
正常Ｔ細胞とＴ細胞基盤の癌細胞とがいずれもＣＤ５を発現するにも拘らず、前記実施例２で確認されたように、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞がＣＤ５を発現する癌細胞に対して特に高い細胞毒性を示す理由を調べるために、正常細胞である前記実施例［２－２］から分離したＭＮＣとＣＤ５とを発現する癌細胞であるＭＯＬＴ４、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔで自然殺害細胞の活性化に関与するリガンドの発現を確認した。前記それぞれの細胞にそれぞれのリガンドに特異的に結合する抗体を処理し、流動細胞計数法で当該リガンドの発現程度を分析した。

【0131】

その結果、図１１Ａに示したように、多様なリガンドの中でＢ７－Ｈ６が、前記のような３種の癌細胞いずれもで有意的に高く発現されており、抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）リガンドであるＨＬＡ ｃｌａｓｓ１が正常細胞に高く発現されていると確認された。

【0132】

また、前記実施例［２－２］から分離したＭＮＣを対象にして、Ｔ細胞に対するマーカーであるＣＤ３、造血母細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＨＳＣ）に対するマーカーであるＣＤ３４、骨髄性細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ）に対するマーカーであるＣＤ３３及び自然殺害細胞に対するマーカーであるＣＤ５６にそれぞれ特異的に結合する抗体を処理し、流動計数法で各白血球細胞の種類別にＢ７－Ｈ６の発現程度を測定した結果、図１１Ｂに示したように、ほとんどの正常白血球では、Ｂ７－Ｈ６が発現されないと確認された。

【0133】

［３－２］Ｂ７－Ｈ６発現がＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性に及ぼす影響確認
前記実施例［３－１］から確認された自然殺害細胞活性化リガンドであるＢ７－Ｈ６の発現が、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性に如何なる影響を及ぼすかを確認した。

【0134】

そのために、ＣＤ５を発現する癌細胞株であるＭＯＬＴ４細胞とＪｕｒｋａｔ細胞とにＢ７－Ｈ６の遺伝子に相補的な配列を有したｓｉＲＮＡを導入して、導入させて一時的にＢ７－Ｈ６の発現をノックダウンさせた。その後、前記のようにＢ７－Ｈ６の発現が減少した癌細胞を対象にして、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞をそれぞれ１：１の比率（自然殺害細胞：癌細胞）で処理して、前記実施例［２－１］と同じ方法でＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性を確認した。

【0135】

その結果、図１２に示したように、Ｂ７－Ｈ６の発現を減少させていない癌細胞に比べて、Ｂ７－Ｈ６の発現を減少させた癌細胞でＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性が減少したと確認された。

【0136】

さらに、ＣＤ５を発現する癌細胞株であるＭＯＬＴ４と前記実施例［２－２］から分離したＭＮＣとを対象にして、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲＮＫ細胞をそれぞれ１：１の比率（自然殺害細胞：癌細胞またはＭＮＣ）で処理し、流動細胞計数法で２時間ごとに生きているＭＯＬＴ４細胞とＭＮＣでＢ７－Ｈ６とＣＤ５との発現程度を測定した。

【0137】

その結果、図１３に示したように、経時的に生きているＭＯＬＴ４でＢ７－Ｈ６の発現とＣＤ５の発現とが減少すると確認された。前記のような結果から、Ｂ７－Ｈ６発現が高い細胞が相対的にＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞によって先に殺傷されたということが分かる。

【0138】

［実施例２］及び［実施例３］の考察
本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＤ５を発現する癌細胞に対して、濃度依存的に向上した細胞毒性を示すだけではなく、ＩＦＮ－γの分泌と脱顆粒化も増加すると確認されたので、これにより本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞がＣＤ５を発現する癌細胞に対して特異的に反応するということが分かる。

【0139】

ＣＤ５は、ほとんどのＴ細胞悪性腫瘍で発現されているが、正常Ｔ細胞にも発現されるものであり、従来まで開発されたＣＤ５－ＣＡＲは、いずれも正常Ｔ細胞に対して副作用を示すと報告されている。しかし、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の場合、臍帯血から分離したＭＮＣに対してより減少した細胞毒性を示すと確認され、特に、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞がＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞に比べてさらに低い細胞毒性を示すと確認された。前記のようなＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞とＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞との間の差は、一本鎖可変断片の構造の差によるものと考えられ、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む＃１１ ＳｃＦｖが安全性にさらに有利な効果を有すると判断される。さらに、ＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞を単一細胞に分離及び増殖して確立した個別細胞株の細胞毒性の評価でも類似している態様が表われ、特に、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の場合、ＣＤ５を発現する癌細胞に対する細胞毒性は、対照群に比べて約１０倍程度高いのに対して、ＣＤ５を発現する正常細胞に対する細胞毒性は、対照群に比べて約２倍程度しか上昇しないと確認された。前記のような結果から、本発明のＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、既存に報告されたＣＤ５－ＣＡＲに比べて安全性が遥かに高いと判断される。また、ＮＫ９２細胞に永久的に発現させたＣＤ５－ＣＡＲだけではなく、ｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞にＣＤ５－ＣＡＲのｍＲＮＡを導入して一時的にＣＤ５－ＣＡＲを発現させたｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞基盤のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞も、ＣＤ５を発現する癌細胞に対する細胞毒性を有するということを示すことにより、ＣＤ５を発現する正常細胞まで減少する副作用を下げることができる可能性を確認した。

【0140】

一方、正常細胞とは異なって、ＣＤ５を発現する癌細胞で、自然殺害細胞の活性化に関与する多様なリガンドのうち、Ｂ７－Ｈ６が特に高く発現されているということを確認し、これによりＢ７－Ｈ６の発現の差によって、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞がＣＤ５を発現する癌細胞と正常細胞とに異なって反応すると予想した。さらに、ＣＤ５を発現する癌細胞でＢ７－Ｈ６の発現量を調節した場合に、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性がＢ７－Ｈ６の発現量によって変わるということを確認し、これによりＢ７－Ｈ６が、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の活性に主要な要因として作用し、ＣＤ５を発現する癌細胞に相対的に高く発現されているために、本発明のＣＤ５－ＣＡＲ－ＮＫ細胞が、正常細胞よりも癌細胞に先に反応するということが分かる。

【0141】

つまり、ＣＤ５に対する抗体のＣＤＲ配列の差によるＣＤ５－ＣＡＲの活性の差によってＣＤ５を発現する癌細胞と正常細胞とに対する細胞毒性が完全に差別化され、ＣＤ５－ＣＡＲの発現程度によって、それぞれ異なる細胞毒性を有した単一細胞株を活用して癌細胞に対しては、高い抗ガン効果を示すと同時に、正常細胞に対しては、反応性が低いＴ細胞血液癌に対する新たな治療剤の開発が可能であると判断される。

【0142】

以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

【図面の簡単な説明】

【0143】

【図1】ＣＤ５に特異的に結合する一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）を細胞外ドメインとして含む本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５－ＣＡＲ）の構造を示す模式図である。

【図2】本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を対象にして、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ）の発現有無を確認した結果を示した図面である。

【図3】本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）の、ＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞とＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞とに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。

【図4】本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）の、ＣＤ５を発現するＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞とＣＤ５を発現しないＤａｕｄｉ細胞とに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。

【図5A】本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）をＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞またはＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞と共培養した時、自然殺害細胞から分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）の量（図５Ａ）と脱顆粒指標であるＣＤ１０７αの発現量（図５Ｂないし図５Ｅ）をそれぞれ測定して比較した結果を示した図面である。

【図5B】本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）をＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞またはＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞と共培養した時、自然殺害細胞から分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）の量（図５Ａ）と脱顆粒指標であるＣＤ１０７αの発現量（図５Ｂないし図５Ｅ）をそれぞれ測定して比較した結果を示した図面である。

【図5C】本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）をＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞またはＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞と共培養した時、自然殺害細胞から分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）の量（図５Ａ）と脱顆粒指標であるＣＤ１０７αの発現量（図５Ｂないし図５Ｅ）をそれぞれ測定して比較した結果を示した図面である。

【図5D】本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）をＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞またはＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞と共培養した時、自然殺害細胞から分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）の量（図５Ａ）と脱顆粒指標であるＣＤ１０７αの発現量（図５Ｂないし図５Ｅ）をそれぞれ測定して比較した結果を示した図面である。

【図5E】本発明のキメラ抗原受容体４種の遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）をＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞またはＣＤ５を発現しないＵ９３７細胞と共培養した時、自然殺害細胞から分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）の量（図５Ａ）と脱顆粒指標であるＣＤ１０７αの発現量（図５Ｂないし図５Ｅ）をそれぞれ測定して比較した結果を示した図面である。

【図6】本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）の、ＣＤ５を発現する正常細胞を含むＭＮＣ（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）に対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。

【図7A】本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させた自然殺害細胞（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を単一細胞に分離及び増殖させた単一細胞株のＣＤ５－ＣＡＲの発現量を確認した結果を示した図面である。

【図7B】前記確立されたそれぞれの単一細胞株のＭＯＬＴ４細胞及びＭＮＣに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。

【図7C】前記のように確立された単一細胞株のうちから先導細胞株を選別する過程を示した図面である。

【図8】本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５－ＣＡＲ）を一時的に発現させるために設計されたｍＲＮＡ構造体の構造を示す模式図である。

【図9】本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させたｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞を対象にして、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲ）の発現有無を確認した結果を示した図面である。

【図10】本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ５＃１１－ＣＡＲ及びＣＤ５＃１４－ＣＡＲの遺伝子を導入及び発現させたｐｒｉｍａｒｙ自然殺害細胞の、ＣＤ５を発現するＭＯＬＴ４細胞とＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞とに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。

【図11A】正常細胞とＣＤ５を発現する癌細胞株とで、自然殺害細胞の活性化に関与するリガンドの発現量を確認した結果を示した図面である。

【図11B】ＭＮＣを用いて、各白血球細胞ごとにＢ７－Ｈ６の発現程度を測定した結果を示した図面である。

【図12】ＣＤ５を発現する癌細胞株であるＭＯＬＴ４細胞とＪｕｒｋａｔ細胞とでＢ７－Ｈ６の発現をノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）させた場合に、前記癌細胞株に対する本発明のＣＤ５＃１１－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性の変化を確認した結果を示した図面である。

【図13】ＣＤ５を発現する癌細胞株であるＭＯＬＴ４とＭＮＣとに本発明のＣＤ５＃１１－ＣＡＲＮＫ細胞を処理した以後、経時的にＢ７－Ｈ６とＣＤ５との発現程度を測定した結果を示した図面である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】