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特表2024-516272エキソヌクレアーゼに対する増加した耐性を有する直鎖状ＤＮＡ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-12
(54)【発明の名称】エキソヌクレアーゼに対する増加した耐性を有する直鎖状ＤＮＡ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240405BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20240405BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240405BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20240405BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240405BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240405BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240405BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240405BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C40B40/06
C12P21/02 C
C12P19/34
A61P37/04
A61K48/00
A61K31/713
A61K39/00 E
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023567068
(86)(22)【出願日】2022-04-29
(85)【翻訳文提出日】2023-12-18
(86)【国際出願番号】 EP2022061630
(87)【国際公開番号】W WO2022229460
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】21382377.6
(32)【優先日】2021-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523410366
【氏名又は名称】フォーベースバイオ・ソシエダッド・リミターダ・ウニペルソナル
【氏名又は名称原語表記】４ｂａｓｅｂｉｏ， Ｓ．Ｌ．Ｕ．
(71)【出願人】
【識別番号】523410377
【氏名又は名称】フォーベースバイオ・ユーケー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】４ｂａｓｅｂｉｏ ＵＫ Ｌｔｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ランクリート，ヘイッキ
(72)【発明者】
【氏名】ピチェル，アンヘル
(72)【発明者】
【氏名】ウォーカー，エイミー
【テーマコード（参考）】
4B064
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CA21
4B064CB01
4B064CC01
4B064CD19
4C084AA13
4C084MA41
4C084MA52
4C084MA55
4C084NA03
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZC021
4C084ZC022
4C085AA03
4C085AA21
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA41
4C086MA52
4C086MA55
4C086NA03
4C086NA14
4C086ZB09
(57)【要約】
本発明は、各鎖の内部位置にヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に関する。さらに、本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む複合体分子、ナノ粒子、組成物およびライブラリーに関する。また、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法および使用方法も提供する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が単一カセットおよび各鎖の内部位置に少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、該各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、該カセットはコーディング配列を含み、かつ該センス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり；および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあり、ここで、該センス鎖の第１領域は、カセットの５’であり；および、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり；および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドの１つは、センス鎖の第２領域にあり、ここで、該センス鎖の第２領域は、カセットの３’である、
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
【請求項2】
（ａ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあり、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’であり；（ｂ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域にあり、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’であり；
（ｃ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’であり；および、
（ｄ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である、
請求項１に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
【請求項3】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がオーバーハングを含み、要すれば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、（ａ）５’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｂ）２つの５’オーバーハング；
（ｃ）３’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｄ）２つの３’オーバーハング；および／または
（ｅ）５’オーバーハングおよび３’オーバーハング
を含んでいてもよい、請求項１または２に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
【請求項4】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、全ヌクレオチドに対して少なくとも０．０１の割合でホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
【請求項5】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、全ヌクレオチドに対して０．０１～０．１の割合でホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
【請求項6】
請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物および機能性部分を含む複合体分子であって、要すれば、機能性部分が結合分子またはプローブであってもよい、複合体分子。
【請求項7】
請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または請求項６に記載の複合体分子を含む、ナノ粒子。
【請求項8】
少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーであって、各二本鎖ＤＮＡ産物が請求項１から５のいずれか一項に定義されるものである、ライブラリー。
【請求項9】
治療に使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、請求項６に記載の複合体分子、請求項７に記載のナノ粒子、または請求項８に記載のライブラリー。
【請求項10】
ＲＮＡの産生における、請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、請求項６に記載の複合体分子、請求項７に記載のナノ粒子、または請求項８に記載のライブラリーの使用であって、要すれば、前記ＲＮＡはｍＲＮＡであってもよい、使用。
【請求項11】
ナノ粒子の製造における、請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、請求項６に記載の複合体分子、請求項７に記載のナノ粒子、または請求項８に記載のライブラリーの使用。
【請求項12】
インビトロ転写の方法であって、（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をポリメラーゼと接触させる工程；および
（ｂ）転写産物を産生する工程
を含む、方法。
【請求項13】
請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を、原核細胞、真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入して、所望のＲＮＡまたはタンパク質を生成することを含む、タンパク質の発現方法。
【請求項14】
請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法であって、（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡ鋳型分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を作製する工程、および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がエンドヌクレアーゼに対して増加した耐性を有する、
を含む、製造方法。
【請求項15】
ワクチンの製造における、請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、請求項６に記載の複合体分子、または請求項８に記載のライブラリーの使用。
【請求項16】
請求項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、請求項６に記載の複合体分子、または請求項８に記載のライブラリーを含む、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、各鎖の内部位置にヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に関する。さらに、本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む複合体分子、ナノ粒子、組成物およびライブラリーに関する。また、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法および使用方法も提供する。
本発明は、各鎖の内部位置にヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に関する。さらに、本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む複合体分子、ナノ粒子、組成物およびライブラリーに関する。また、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法および使用方法も提供する。
【背景技術】
【0002】
背景
天然の核酸は、生物学的環境では酵素による分解を受けやすい。エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端のいずれかでホスホジエステル結合を加水分解することにより、ポリヌクレオチド鎖末端からモノヌクレオチドを切断する。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩはポリヌクレオチド鎖の３’末端からモノヌクレオチドを除去し、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩはポリヌクレオチド鎖を５’から３’方向に切断する。一方、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合は、エンドヌクレアーゼの作用によって切断される。
天然の核酸は、生物学的環境では酵素による分解を受けやすい。エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端のいずれかでホスホジエステル結合を加水分解することにより、ポリヌクレオチド鎖末端からモノヌクレオチドを切断する。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩはポリヌクレオチド鎖の３’末端からモノヌクレオチドを除去し、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩはポリヌクレオチド鎖を５’から３’方向に切断する。一方、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合は、エンドヌクレアーゼの作用によって切断される。
【0003】
細胞外および細胞内の両方のヌクレアーゼによる消化に耐え得る核酸類縁体を作製することにより核酸の有効分子寿命を延ばすために、かなりの努力が払われてきた。提案されている解決策のひとつに、ホスホロチオエート化ヌクレオチド（すなわち、２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸）の使用が挙げられる。
【0004】
ホスホロチオエート化ヌクレオチドは、非架橋酸素原子の代わりに硫黄原子を含む。これらの修飾ヌクレオチドは、対応する非修飾ヌクレオチドと同等の物理的および化学的特性を示すが、エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性を有する。このように、ホスホロチオエート官能基を組み込むことで、核酸分子の半減期を延ばすことができる。
【0005】
ホスホロチオエート修飾は核酸医薬品開発プログラムで用いられている。治療用核酸では、ホスホロチオエート化ヌクレオチドは短い一本鎖ポリヌクレオチド鎖に組み込まれている。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるフォミビルセンは、サイトメガロウイルス網膜炎の処置に用いられる２１マーのホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである（Stein and Castanotto, “FDA-approved oligonucleotide therapies in 2017”. Molecular Therapy 25.5 (2017):1069-1075）。同様に、ペガプタニブ（商品名マキュゲン(Macugen)）は、ホスホロチオエート３’－３’デオキシチミジンキャップを有する短い（２７ヌクレオチド）アプタマーであり、網膜の加齢黄斑変性の処置に用いられている。
【0006】
ホスホロチオエート修飾はまた、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を高めるためにポリヌクレオチド鎖の末端にキャップをするために、直鎖状二本鎖ポリヌクレオチド鎖（例えば二本鎖ＤＮＡ）にて用いられている（Putney et al. “A DNA fragment with an alpha-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from digestion by exonuclease III and can be replicate in vivo.” Proceedings of the National Academy of Sciences 78.12 (1981):7350-7354）。ポリヌクレオチド鎖の末端をキャップするために、該末端を制限酵素で消化し、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物で処理する。前記ｄＮＴＰの少なくとも１つは、オーバーハング鎖のヌクレオチドに相補的なホスホロチオエート化ヌクレオチドである。ＤＮＡポリメラーゼは５’から３’方向にヌクレオチドを付加するため、この処理の結果、各鎖の３’末端（すなわち、“キャップ”内）にホスホロチオエートヌクレオチドを有する平滑末端ポリヌクレオチドフラグメントが生じる。
【0007】
米国特許ＵＳ１０３５０３０７ Ｂ２は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを、複数のタンデムリピート配列を含む環状二本鎖連結型ＤＮＡに組み込むことを記載している。米国特許ＵＳ１０３５０３０７ Ｂ２の連結型ＤＮＡ産物は、タンパク質発現のための改良されたシステムをもたらすために、単一の環状産物中に発現配列の複数のコピーを提供する。米国特許ＵＳ１０３５０３０７ Ｂ２の連結型ＤＮＡ産物のサイズおよび多分散性の性質は、ナノ粒子の製造および／またはウイルスもしくは非ウイルスベクターのアセンブリーにおける使用にはあまり適していない。
【0008】
従って、ヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼ消化）に対する耐性が増強され、ＲＮＡ産生およびタンパク質発現に適した直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に対するニーズが存在する。さらに、ヌクレアーゼ消化に対する耐性が増強され、ナノ粒子の製造、および／またはウイルスもしくは非ウイルスベクターのアセンブリー、およびライブラリー作成に適した直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に対するニーズも存在する。
【発明の概要】
【0009】
説明
本発明は、ヌクレアーゼ消化に対する増加した耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。本発明は、ＤＮＡ産物中のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド（すなわち、保護ヌクレオチド）の存在に基づいている。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化に対して耐性を有する１以上のヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＤＮＡ産物の一方の鎖または各鎖の内部位置にエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化に対して耐性を有するヌクレオチドを含む。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットを含んでいてもよい。カセットは、コーディング配列を含んでいてもよい。一方の鎖または各鎖の内部位置における保護ヌクレオチドの位置は、カセットの外側であってもよい。この保護されたヌクレオチドの位置は、エキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化）でもカセットが無傷のまま（intact）であることを確実にする。エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド（すなわち、保護されたヌクレオチド）は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドであり得る。
本発明は、ヌクレアーゼ消化に対する増加した耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。本発明は、ＤＮＡ産物中のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド（すなわち、保護ヌクレオチド）の存在に基づいている。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化に対して耐性を有する１以上のヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＤＮＡ産物の一方の鎖または各鎖の内部位置にエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化に対して耐性を有するヌクレオチドを含む。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットを含んでいてもよい。カセットは、コーディング配列を含んでいてもよい。一方の鎖または各鎖の内部位置における保護ヌクレオチドの位置は、カセットの外側であってもよい。この保護されたヌクレオチドの位置は、エキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化）でもカセットが無傷のまま（intact）であることを確実にする。エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド（すなわち、保護されたヌクレオチド）は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドであり得る。
【0010】
本発明者らは、驚くべきことに、ヌクレアーゼ消化に対する増加した耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法を発見した。具体的には、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化）に対する耐性が増強されている。エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性が増強されたことにより、細胞内（すなわち、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、細胞内エキソヌクレアーゼに対する増強された耐性を有する）および無細胞系（すなわち、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、細胞外エキソヌクレアーゼに対する増強された耐性を有する）での直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の寿命が延長された。さらに、本発明者らは、ＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端および５’末端の両方に保護されたヌクレオチドを効率的に導入する方法を見出し、これにより、３’末端のヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）および５’末端のヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ）による消化から保護される。従って、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、保護ヌクレオチドを含まない直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物と比較して、インビボ発現が延長される。
【0011】
本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、細菌骨格および／または抗生物質耐性遺伝子を実質的に含まないなど、さらに有利な特性を有する。これらの特徴を欠くことは、例えば細胞治療のためのウイルスベクターまたはナノ粒子などの細胞送達システムの製造において特に有益である。これらの特徴を欠くことにより、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は医薬組成物での使用に特に適している。
【0012】
予期せぬことに、本発明者らは、ヌクレアーゼ消化に対する耐性が増強された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を効率的に大量生産できる、ヌクレアーゼ消化に対する増強された耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の生産方法を発見した。前記産物の大規模な製造は、無細胞系で行うことができ、その結果、細菌汚染物質（例えば、細胞溶解後の残渣物）を含まない直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む純粋なサンプルを製造できる。
【0013】
重要なことは、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、ウイルスベクターまたはナノ粒子のような、改良された細胞送達システムを作製できることである。このことは、本発明者らが、分散性が低く、かつ目的の遺伝子の単一コピーを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を製造する方法を見出したためである。目的の遺伝子の１コピーを含む分散性の低い直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物（または目的の遺伝子コレクション）の使用は、ナノ粒子のような均一な細胞送達システム（すなわち、分散性の低い細胞送達システム）の製造を容易にし、これは細胞取り込みの改善およびトランスフェクション効率の向上の観点からとても有益である。
【0014】
１．直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に１以上の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を含んでいる。
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に１以上の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を含んでいる。
【0015】
内部位置は、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端および５’末端の最後のヌクレオチド以外の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中の何れかの位置であり得る。内部位置は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各鎖の３’末端および／または５’末端から少なくとも２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチド離れた位置に位置し得る。内部位置は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各鎖の３’末端および／または５’末端から少なくとも７ヌクレオチド離れた位置に位置し得る。好ましくは、内部位置は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各鎖の３’末端および／または５’末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置にある。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、内部位置は、センス鎖の３’末端および５’末端から少なくとも７ヌクレオチド離れて位置し得る。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、内部位置はセンス鎖の３’末端および５’末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置にある。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、内部位置は、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端から少なくとも７ヌクレオチド離れた位置に位置し得る。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、内部位置は、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れて位置し得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物では、内部位置は各鎖の３’末端から少なくとも７ヌクレオチド離れて位置し得る。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、内部位置は各鎖の３’末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れて位置し得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物では、内部位置は各鎖の５’末端から少なくとも７ヌクレオチド離れて位置し得る。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、内部位置は各鎖の５’末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れて位置し得る。
【0016】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＤＮＡ産物の各鎖の末端に近い位置に保護された(例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいなくてもよい。保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドは、３’末端および／または５’末端からセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目および／または１０番目のヌクレオチドでなくてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’末端および／または５’末端からセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１－３位、１－４位、１－５位、１－６位、１－７位、１－８位、１－９位、１－１０位、１－１２位、１－１４位、１－１６位、１－１８位または１－２０位のいずれか１つにおいて保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含まなくてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’－末端および／または５’－末端からセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１－９位に保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含まない。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖の３’末端および／または５’末端から１－９位において保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいなくてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’末端および／または５’末端からアンチセンス鎖の１－９位に保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいなくてもよい。例えば、センス鎖の最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端から数えて６番目のヌクレオチドであってもよい。例えば、アンチセンス鎖の最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端から数えて１０番目のヌクレオチドであってもよい。各鎖における最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドの位置は異なっていてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖の３’末端から数えて８番目の位置、およびアンチセンス鎖の３’末端から数えて１２番目の位置に、最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。同様に、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖の３’末端から数えて８番目の位置、センス鎖の５’末端から数えて６番目の位置、アンチセンス鎖の３’末端から数えて１２番目の位置、およびアンチセンス鎖の５’末端から数えて７番目の位置に位置する保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。各鎖における最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドの位置は同じであってもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖の３’末端から数えて８番目の位置、およびアンチセンス鎖の３’末端から数えて８番目の位置に、最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含み得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて６番目、８番目または１０番目のヌクレオチドである最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて１～６位において、最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいなくてもよい。従って、内部位置は、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端および５’末端の最後の６ヌクレオチド、８ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチド以外の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物内の何れかの位置であり得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて７番目のヌクレオチドである最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて１０番目のヌクレオチドである最初の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【0017】
本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットを含んでいてもよい。従って、本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含む。
【0018】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、本明細書で用いる用語“単一カセット”とは、複数のカセットを含んでいないか、または複数のカセットから構成されていない直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を包含することを意図している。すなわち、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、目的の遺伝子の単一コーディング配列を含み得る単一カセットのみを含む。単一カセットは、複数のタンデムリピート配列、および／または連結型ＤＮＡを含まなくてもよいか、またはそれらから構成されなくてもよい。例えば、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、例えば米国特許ＵＳ１０３５０３０７ Ｂ２に記載のような公知の方法によって産生される連結型ＤＮＡを含んでいなくてもよいか、またはそれから構成されていなくてもよい。本明細書で用いる用語“単一カセット”とは、目的のＤＮＡ配列の単一コピー、例えば、コーディング配列の単一コピーを包含することを意図している。従って、“単一カセット”は、同じＤＮＡ配列の複数のコピーを順に含むか、またはそれから構成されるカセットを包含していなくてもよい。単一カセットは、目的とする遺伝子の集合体を含んでいてもよい。例えば、単一カセットは、少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つの目的の遺伝子の配列を含んでいてもよい。目的の遺伝子が単一カセットで同じでなくてもよい。
【0019】
カセットは、コーディング配列を含んでいてもよい。コーディング配列は、例えばタンパク質をコードする遺伝子など、目的の遺伝子をコードしていてもよい。タンパク質発現のために、コーディング配列を含むカセットは、プロモーターの一部がコーディング配列に作動可能に連結されるように（例えば、プロモーターはコーディング配列の上流であり得る）、プロモーターの少なくとも一部を含むベクターまたはプラスミドにライゲーションされてもよい。ベクターまたはプラスミドは、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)システムのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含んでいてもよい。カセットは、プロモーターおよびコーディング配列の少なくとも一部を含んでいてもよい。カセットはプロモーターおよびコーディング配列を含んでいてもよい。カセットは、プロモーター、コーディング配列、リボソーム結合部位および翻訳終結配列を含んでいてもよい。カセットはさらに、キャップ非依存性翻訳エレメントなど、タンパク質の発現を補助する配列を含んでいてもよい。カセットは、修復テンプレート（または、編集テンプレート）を含み得る（またはコードし得る）。修復テンプレート（または、編集テンプレート）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを介した相同性指向性修復（ＨＤＲ）に使用できる。カセットはＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードしていてもよい。カセットは哺乳動物発現カセットであってもよい。プロモーターはＣＭＶプロモーターであってもよい。カセットは、エンハンサーをさらに含んでいてもよい。カセットは、ｅＧＦＰレポーター遺伝子またはルシフェラーゼレポーター遺伝子などのレポーター遺伝子をさらに含んでいてもよい。カセットは、ポリＡ配列、ポリＣ配列、ポリＴ配列またはポリＧ配列などのホモポリマー配列をさらに含んでいてもよい。ホモポリマー配列の長さは３～２００ヌクレオチド長である。ホモポリマー配列は、カセットの精製を容易にするために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは４～１２ヌクレオチド長の間、または５～１０ヌクレオチド長の間であってもよい。ホモポリマー配列はｍＲＮＡの発現を改善するために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは１０～２００ヌクレオチド長の間、好ましくは８０～１５０ヌクレオチド長の間であってもよい。ホモポリマー配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１１０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１３０ヌクレオチド長、１４０ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長、１７０ヌクレオチド長、１８０ヌクレオチド長、１９０ヌクレオチド長または２００ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１００ヌクレオチド長である。さらに好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１２０ヌクレオチド長である。例えば、ホモポリマー配列は、少なくとも１２０ヌクレオチド長のポリＡ配列を含んでいてもよい。
【0020】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドの位置は、カセットがヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化から保護されるようなものであってもよい。従って、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、以下から選択され得る：
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド。
【0021】
本明細書で用いる用語“カセットの５’－末端ヌクレオチド”とは、カセットの各鎖の５’－末端ヌクレオチドを包含することを意図する。従って、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、カセットは一般的にはセンス鎖の５’末端ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドを含む。
【0022】
本明細書で用いる用語“カセットの３’－末端ヌクレオチド”とは、カセットの各鎖の３’－末端ヌクレオチドを包含することを意図する。従って、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、カセットは一般的にはセンス鎖の３’末端ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドを含む。
【0023】
本明細書で用いる用語“カセットの外側”とは、カセットの一部ではない何れかのヌクレオチドを包含することを意図する。これには、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に含まれ、かつカセットの一部を形成しないヌクレオチドも含まれる。用語“カセットの外側のＮヌクレオチド”または“カセットから離れたＮヌクレオチド”とは、カセットの末端から直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の末端に向かってＮヌクレオチドの位置に位置するヌクレオチドを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの内部位置における用語“カセットの外側の２ヌクレオチド”とは、カセットの外側にあり、かつカセットの最後のヌクレオチドから２ヌクレオチド離れているヌクレオチドを示すことを意味する。例えば、配列において５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ （配列番号１）では、カセットはヌクレオチド“Ｔ”（５’から３’方向）から始まり、用語“カセットの外側の２ヌクレオチド”は、“Ｃ”ヌクレオチドを意味する。従って、用語“カセットの外側に少なくとも２ヌクレオチド”または“カセットから少なくとも２ヌクレオチド離れている”とは、カセットの外側にあり、かつカセットの最後のヌクレオチドから少なくとも２ヌクレオチド離れているヌクレオチドを表すことを意味する。上記の例では、“カセットから少なくとも２ヌクレオチド離れている”ヌクレオチドは、５’－ＡＡＡＡＡＣから選択される何れかのヌクレオチドであり得る。同様に、用語“カセットの５’－末端から少なくとも２ヌクレオチド離れている”とは、カセットの外側にあり、かつカセットの５’－末端の最後のヌクレオチドから少なくとも２ヌクレオチド離れているヌクレオチドを表すことを意味する。上記の例では、カセットの５’末端の最後のヌクレオチドは“Ｔ”であり、“カセットの５’末端から少なくとも２ヌクレオチド離れた”ヌクレオチドは、５’－ＡＡＡＡＡＡＡＣから選択される何れかのヌクレオチドであり得る。
【0024】
内部位置は、カセットの２番目のヌクレオチドと最後のヌクレオチドとの間に位置していなくてもよい。内部位置は、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端および５’末端の最後のヌクレオチド以外の、かつカセットの２番目のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間に位置するヌクレオチド以外の、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の何れかの位置であり得る。内部位置は、カセットの外側に位置してもよく、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各鎖の３’末端および／または５’末端から少なくとも２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチドもしくは１００ヌクレオチド、および／または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各鎖の３’末端および／もしくは５’末端から少なくとも２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチドもしくは１００ヌクレオチド離れた位置（すなわち、カセットの外側）に位置していてもよい。好ましくは、内部位置は、カセットの外側に位置し、かつ直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各鎖の３’末端および／または５’末端から少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチド離れており、および／またはカセットの各鎖の３’末端および／または５’末端から少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチド（すなわち、カセットの外側の少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチド）離れている。好ましくは、カセットは、カセットの３’末端および／または５’末端から離れたセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１－２、１－３、１－４、１－５、１－６、１－７、１－８、１－９、１－１０、１－１２、１－１４、１－１６、１－１８または１－２０のいずれかの位置（すなわち、カセットの外側）にホスホロチオエートヌクレオチドを含まない。好ましくは、各鎖の内部位置は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の末端から少なくとも６ヌクレオチド離れた位置にあり、かつカセットの２番目のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間には位置しない。好ましくは、各鎖の内部位置は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置にあり、かつカセットの２番目のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間には位置しない。好ましくは、各鎖の内部位置は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の末端から少なくとも６ヌクレオチド離れており、かつカセットの末端から少なくとも６ヌクレオチド（すなわち、カセットの外側で少なくとも６ヌクレオチド）離れている。好ましくは、各鎖の内部位置は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れており、かつカセットの末端から少なくとも１０ヌクレオチド（すなわち、カセットの外側に少なくとも１０ヌクレオチド）離れている。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、この位置がカセットの少なくとも２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチド外側に位置する限り、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端および５’末端の最後のヌクレオチド以外の位置である内部位置に最初のホスホロチオエートヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、これらの位置がカセットの２番目のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間に位置しない限り、かつセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて少なくとも６番目、８番目または１０番目のヌクレオチドである最初のホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、これらの位置がカセットの外側に位置する限り、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて少なくとも６番目、８番目または１０番目のヌクレオチドである最初のホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、これらの位置がカセットの少なくとも２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチド外側に位置する限り、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて少なくとも６番目、８番目または１０番目のヌクレオチドである最初のホスホロチオエートヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、これらの位置がカセットの少なくとも６ヌクレオチド、８ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチド外側に位置する限り、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端および／または５’末端から数えて少なくとも６番目、８番目または１０番目のヌクレオチドである最初のホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
【0025】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に少なくとも２個の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含む。
【0026】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一のカセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド（すなわち、保護されたヌクレオチド）を含み、かつ各鎖の内部位置にある少なくとも２つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、前記カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、前記カセットはコーディング配列を含む。
【0027】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、かつ各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、前記カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、前記カセットはコーディング配列を含む。
【0028】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ヌクレアーゼ消化に耐性であるか、またはヌクレアーゼ消化に対する耐性が改善もしくは増強されていてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はエキソヌクレアーゼ消化に耐性であるか、またはエキソヌクレアーゼ消化に対する耐性が改善もしくは増強されていてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’－末端ヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）および／または５’－末端ヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ）による消化に対して耐性であるか、または改善もしくは増強された耐性を有し得る。酵素消化に対する耐性についての用語“改善された”または“増強された”とは、本明細書に記載の方法によって製造されなかったＤＮＡ産物と比較したとき、酵素消化に対するより高い耐性を意味する。例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチドのような保護ヌクレオチドを含まない産物と比較したとき、酵素消化耐性が改善または増強されている。
【0029】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの上流に（すなわち、ＤＮＡ産物のセンス鎖の５’末端方向に）位置するようなものであってもよい。
【0030】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域に存在していてもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域に存在していてもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
【0031】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの下流に（すなわち、ＤＮＡ産物のセンス鎖の３’末端方向に）位置するようなものであってもよい。
【0032】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域に存在していてもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域に存在していてもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
【0033】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの上流に位置するように（すなわち、ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖の５’末端方向に）位置するようなものであってもよい。
【0034】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域に存在していてもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域に存在していてもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
【0035】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、１以上のホスホロチオエートヌクレオチドがカセットの下流に（すなわち、ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖の３’末端方向に）位置するようなものであってもよい。
【0036】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域に存在していてもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域に存在していてもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
【0037】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、各鎖において、少なくとも１つのホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの下流に位置し、かつ少なくとも１つのホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの上流に位置するようなものであってもよい。
【0038】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において：
（ａ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’であり；
（ｂ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’であり；
（ｃ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’であり；および
（ｄ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
（ａ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’であり；
（ｂ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’であり；
（ｃ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’であり；および
（ｄ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
【0039】
本明細書で用いる用語“センス鎖の第１領域”とは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’末端とセンス鎖内のカセットの最初の５’ヌクレオチドとの間にある、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖の一部を包含することを意図する。例えば、センス鎖の配列：５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ－３’（配列番号１）において、カセットがヌクレオチド“Ｔ”から５’－３’方向に開始するとき、用語“センス鎖の第１領域”とは、５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡ－３’領域を意味する。
【0040】
用語“アンチセンス鎖の第１領域”とは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’末端とアンチセンス鎖内のカセットの最初の５’ヌクレオチドとの間にある、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖の一部を包含することを意図する。例えば、アンチセンス鎖の配列：５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ－３’（配列番号１）において、カセットがヌクレオチド“Ｔ”から５’－３’方向に開始するとき、用語“アンチセンス鎖の第１領域”とは、５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡ－３’領域を意味する。
【0041】
用語“センス鎖の第２領域”とは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’末端とセンス鎖内のカセットの最初の３’ヌクレオチドとの間にある、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖の一部を包含することを意図する。例えば、センス鎖の配列：５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ－３’（配列番号１）において、カセットがヌクレオチド“Ｔ”から３’－５’方向に開始するとき、用語“センス鎖の第２領域”とは、５’－ＡＡＡＡ－３’領域を意味する。
【0042】
用語“アンチセンス鎖の第２領域”とは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’末端とアンチセンス鎖内のカセットの最初の３’ヌクレオチドとの間にある、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖の一部を包含することを意図する。例えば、アンチセンス鎖の配列：５’－ＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ－３’（配列番号１）において、カセットがヌクレオチド“Ｔ”から３’－５’方向に開始するとき、用語“アンチセンス鎖の第２領域”とは、５’－ＡＡＡＡ－３’領域を意味する。
【0043】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットの上流側（すなわち、ＤＮＡ産物のセンス鎖の５’末端側）に複数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットの上流に少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、カセットの上流に少なくとも２個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。従って、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの上流に位置するような位置であり得る。
【0044】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか；または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか；または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
【0045】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットの下流側（すなわち、ＤＮＡ産物の３末端側）に複数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットの下流に少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよく、好ましくはカセットの下流に少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオチドを含んでいてもよい。従って、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの下流に位置するような位置であり得る。
【0046】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか；または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの３’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか；または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの３’である。
【0047】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチドがカセットの上流（すなわち、ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖の５’末端に向かって）に位置するようなものであってもよい。
【0048】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか；または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、アンチセンス鎖の第１領域に存在し、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか；または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、アンチセンス鎖の第１領域に存在し、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’である。
【0049】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの下流に（すなわち、ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖の３’末端に向かって）位置するようなものであってもよい。
【0050】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか；または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチドは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか；または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチドは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
【0051】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各鎖は、複数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、カセットの上流および下流に少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方におけるホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置は、各鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの下流に位置し、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドがカセットの上流に位置するようなものであってもよい。
【0052】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物において、
（ａ）センス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第１領域に存在してもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’である；
（ｂ）センス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第２領域に存在してもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’である；
（ｃ）アンチセンス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の第１領域に存在してもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’である；および
（ｄ）アンチセンス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の第２領域に存在してもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
（ａ）センス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第１領域に存在してもよく、ここで、センス鎖の第１領域は、カセットの５’である；
（ｂ）センス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、センス鎖の第２領域に存在してもよく、ここで、センス鎖の第２領域は、カセットの３’である；
（ｃ）アンチセンス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の第１領域に存在してもよく、ここで、アンチセンス鎖の第１領域は、カセットの５’である；および
（ｄ）アンチセンス鎖において、
ｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであってもよく、かつ少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２領域にあってもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’であるか、または、
ｉｉ．少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の第２領域に存在してもよく、ここで、アンチセンス鎖の第２領域は、カセットの３’である。
【0053】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ヌクレアーゼ消化に耐性であるか、またはヌクレアーゼ消化に対する耐性が改善もしくは増強されていてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’末端エキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる）および／または５’末端エキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩによる）に対して耐性であり得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、５’末端または５’末端領域に保護されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を含んでいてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、要すれば、各鎖において、５’末端または５’末端領域にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の５’末端または５’末端領域にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。ほとんどのエキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩは、ポリヌクレオチド鎖の３’－末端からヌクレオチドを除去するため、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’－末端または３’－末端領域に保護ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖において、要すれば、３’末端または３’末端領域にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’末端または３’末端領域に少なくとも１つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、かつ５’末端または５’末端領域に少なくとも１つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の３’末端または３’末端領域および５’末端または５’末端領域にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【0054】
ホスホロチオエート化ヌクレオチドは別のタイプであってもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’末端または３’末端領域に１以上のα－Ｓ－ｄＡＴＰ（すなわち、２’－デオキシアデノシン－５’－（α－チオ）－三リン酸）を含み、かつ５’末端または５’末端領域に１以上のα－Ｓ－ｄＧＴＰ（すなわち、２’－デオキシグアノシン－５’－（α－チオ）－三リン酸）を含み得る。あるいは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物内のすべてのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、サンプルタイプのものであってもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、３’末端または３’末端領域に１以上のα－Ｓ－ｄＡＴＰを含み、かつ５’末端または５’末端領域に１以上のα－Ｓ－ｄＡＴＰを含み得る。
【0055】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、少なくとも１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１０００塩基対、２０００塩基対、３０００塩基対、４０００塩基対、５０００塩基対、６０００塩基対、７０００塩基対、８０００塩基対、９０００塩基対、１００００塩基対、１１０００塩基対、１２０００塩基対、１３０００塩基対、１４０００塩基対または１５０００塩基対の長さであってもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は少なくとも５００塩基対、または少なくとも１０００塩基対の長さである。
【0056】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に複数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に少なくとも２個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個または５００個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に少なくとも２個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。
【0057】
各鎖の内部位置にあるホスホロチオエート化ヌクレオチドの量は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の長さに依存して変わり得る。従って、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率が少なくとも０．０００１、少なくとも０．００２５、少なくとも０．０１、少なくとも０．０２５、少なくとも０．０５、少なくとも０．０７５、少なくとも０．１０、少なくとも０．１２、少なくとも０．１５、少なくとも０．２５、少なくとも０．３５、少なくとも０．５、または少なくとも０．７５であるホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率が１未満、０．９未満、０．８未満、０．６５未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満、０．０７５未満、または０．０５未満のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率が０．０００１～１、０．００２５～０．７５、０．０２５～０．６５、０．０２５～０．１５、または０．２５～０．５０であるホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は０．０２５～０．１５である。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率が０．００５～０．３、０．００７５～０．２、０．０１～０．１５、０．０１～０．１０、０．０２～０．０８、０．０３～０．０７、０．０４～０．０６または０．０５～０．０７５であるホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比は０．０１～０．１０である。好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比は、約０．０２、約０．０２５、約０．０５、約０．０７５、約０．０８、約０．１０、約０．１２、約０．１５、または約０．２５である。さらに好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は約０．０２５または約０．０５である。実施例に示すように、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は約０．０２５で十分であり、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性が増強される。実施例に示されるように、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比が約０．０５または約０．０７５であることは、エキソヌクレアーゼ消化に対する増強された耐性を提供するのに特に効果的である（発現レベルによって示される；実施例７および８を参照のこと）。さらに、実施例に示されるように、約０．０５の比率は、目的遺伝子のインビボでの発現に特に適している（実施例１０参照のこと）。
【0058】
各鎖の内部位置にあるホスホロチオエートヌクレオチドの量は異なり得る。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が合計１０００個のヌクレオチドを含み、かつ全ヌクレオチドに対するホスホロチオエートヌクレオチドの比率が０．１であるとき、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は１００個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、そのうち７５個はＤＮＡ産物のセンス鎖に位置し、２５個はアンチセンス鎖に位置し得る。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの１００％がセンス鎖に位置していてもよい。あるいは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの１００％がアンチセンス鎖に位置していてもよい。センス鎖は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの総数の少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％を含んでいてもよい。アンチセンス鎖は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの総数の少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％を含んでいてもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は、同数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの総数の５０％を含む。
【0059】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はオーバーハングを含んでいてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、１つまたは複数の平滑末端を含み得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、１つの５’オーバーハングおよび１つの平滑末端、２つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングおよび１つの平滑末端、２つの３’オーバーハング、または１つの５’オーバーハングおよび１つの３’オーバーハングを含み得る。
【0060】
オーバーハングは少なくとも３ヌクレオチド（好ましくは、４から８ヌクレオチド）を有し得る。オーバーハングは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖に存在し得る。
【0061】
センス鎖は、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、２～８ヌクレオチド、２～７ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、２～４ヌクレオチド、２～３ヌクレオチド、３～８ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、３～６ヌクレオチド、３～５ヌクレオチド、３～４ヌクレオチド、４～８ヌクレオチド、４～７ヌクレオチド、４～６ヌクレオチド、４～５ヌクレオチド、５～８ヌクレオチド、６～８ヌクレオチド、６～７ヌクレオチド、または７～８ヌクレオチドの３’－オーバーハングを有し得る。好ましくは、センス鎖は４～８ヌクレオチドの３’－オーバーハングを有する。
【0062】
センス鎖は、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、２～８ヌクレオチド、２～７ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、２～４ヌクレオチド、２～３ヌクレオチド、３～８ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、３～６ヌクレオチド、３～５ヌクレオチド、３～４ヌクレオチド、４～８ヌクレオチド、４～７ヌクレオチド、４～６ヌクレオチド、４～５ヌクレオチド、５～８ヌクレオチド、６～８ヌクレオチド、６～７ヌクレオチド、または７～８ヌクレオチドの５’－オーバーハングを有し得る。好ましくは、センス鎖は４～８ヌクレオチドの５’－オーバーハングを有する。
【0063】
アンチセンス鎖は、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、２～８ヌクレオチド、２～７ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、２～４ヌクレオチド、２～３ヌクレオチド、３～８ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、３～６ヌクレオチド、３～５ヌクレオチド、３～４ヌクレオチド、４～８ヌクレオチド、４～７ヌクレオチド、４～６ヌクレオチド、４～５ヌクレオチド、５～８ヌクレオチド、６～８ヌクレオチド、６～７ヌクレオチド、または７～８ヌクレオチドの３’－オーバーハングを有し得る。好ましくは、アンチセンス鎖は４～８ヌクレオチドの３’－オーバーハングを有する。
【0064】
アンチセンス鎖は、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、２～８ヌクレオチド、２～７ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、２～４ヌクレオチド、２～３ヌクレオチド、３～８ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、３～６ヌクレオチド、３～５ヌクレオチド、３～４ヌクレオチド、４～８ヌクレオチド、４～７ヌクレオチド、４～６ヌクレオチド、４～５ヌクレオチド、５～８ヌクレオチド、６～８ヌクレオチド、６～７ヌクレオチド、または７～８ヌクレオチドの５’－オーバーハングを有し得る。好ましくは、アンチセンス鎖は４～８ヌクレオチドの５’－オーバーハングを有する。
【0065】
当業者であれば、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハングは、上記のオーバーハングの長さの何れかの組合せであり得ることを理解し得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のオーバーハングは同じ長さである必要はない。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のオーバーハングは同じ長さであってもよい。
【0066】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各オーバーハングおよび／または平滑末端は、１以上の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を含んでいてもよい。センス鎖のオーバーハングおよび／または平滑末端は、１以上の保護ヌクレオチドを含んでいてもよい。アンチセンス鎖のオーバーハングおよび／または平滑末端は、１以上の保護ヌクレオチドを含んでいてもよい。各鎖の５’オーバーハング、３’オーバーハングおよび／または平滑末端は、１以上の保護ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、５’オーバーハングは１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、３’オーバーハングは１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、５’オーバーハング、３’オーバーハングおよび／または平滑末端は、１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。より好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各オーバーハングおよび／または平滑末端は、１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各オーバーハングおよび／または平滑末端は、少なくとも２つの保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。センス鎖のオーバーハングおよび／または平滑末端は、少なくとも２つの保護されたヌクレオチドを含んでいてもよい。アンチセンス鎖のオーバーハングおよび／または平滑末端は、少なくとも２つの保護されたヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の各オーバーハングおよび／または平滑末端は、少なくとも３個、４個または５個の保護された（例えば、ホスホロチオエート化された）ヌクレオチドを含んでいてもよい。センス鎖のオーバーハングおよび／または平滑末端は、少なくとも３個、４個、または５個の保護ヌクレオチドを含んでいてもよい。アンチセンス鎖のオーバーハングおよび／または平滑末端は、少なくとも３個、４個または５個の保護ヌクレオチドを含んでいてもよい。５’オーバーハング、および／または３’オーバーハングは、少なくとも２個、３個、４個または５個の保護ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、５’オーバーハングおよび／または３’オーバーハングは、ホスホロチオエート化ヌクレオチドのような少なくとも２個の保護ヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、各オーバーハングおよび／または平滑末端は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドのような、少なくとも２個の保護ヌクレオチドを含む。
【0067】
本明細書で用いる用語“ホスホロチオエート化ヌクレオチド”とは、リン酸骨格が変化したヌクレオチドを意味し、ここで、糖部分はホスホロチオエート結合によって連結されている。オリゴヌクレオチド配列のリン酸骨格において、ホスホロチオエート結合は非架橋酸素原子の代わりに硫黄原子を含む。この修飾により、ヌクレオチド間の結合はヌクレアーゼによる分解を受けにくくなる。
【0068】
本明細書で用いる用語“保護ヌクレオチド”または“ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド”とは、ヌクレアーゼ消化（特に、エキソヌクレアーゼ消化）に対する耐性を提供するか、または増強する何れかのタイプの分子を包含することを意図する。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、本明細書中、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含むものとして記載されることがほとんどであるが、当業者は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、代わりにヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化）に対する耐性を提供する何れかの分子を含み得ることを理解し得る。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド、すなわちヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ）に対する耐性を提供するか、または増加させる修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ）消化に対する耐性を提供するか、または増加させるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【0069】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置に少なくとも２つのＭＯＥヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのＭＯＥヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0070】
エキソヌクレアーゼ消化に耐性のあるヌクレオチド（すなわち、保護ヌクレオチド）は、少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドであり得る。例えば、少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、α－Ｓ－ｄＡＴＰ（すなわち、２’－デオキシアデノシン－５’－（α－チオ）－三リン酸）、α－Ｓ－ｄＣＴＰ（すなわち、２’－デオキシシチジン－５’－（α－チオ）－三リン酸）、α－Ｓ－ｄＧＴＰ（すなわち、２’－デオキシグアノシン－５’－（α－チオ）－三リン酸）、α－Ｓ－ｄＴＴＰ（すなわち、２’－デオキシチミジン－５’－（α－チオ）－三リン酸）、α－Ｓ－ｄＵＴＰ（すなわち、２’－デオキシウリジン－５’－（α－チオ）－三リン酸）、および／またはウリジン２’、３’－シクロホスホロチオエート、好ましくはα－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰまたはα－Ｓ－ｄＴＴＰである。
【0071】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、少なくとも２種のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、少なくとも２種のホスホロチオエートヌクレオチドは、α－Ｓ－ｄＡＴＰおよびα－Ｓ－ｄＣＴＰ、α－Ｓ－ｄＡＴＰおよびα－Ｓ－ｄＧＴＰ、α－Ｓ－ｄＡＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰおよびα－Ｓ－ｄＧＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ、またはα－Ｓ－ｄＧＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰである。
【0072】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、少なくとも３種のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、少なくとも３種のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰおよびα－Ｓ－ｄＧＴＰ；
（ｂ）α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ；
（ｃ）α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ；または
（ｄ）α－Ｓ－ｄＣＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ
である。
（ａ）α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰおよびα－Ｓ－ｄＧＴＰ；
（ｂ）α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ；
（ｃ）α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ；または
（ｄ）α－Ｓ－ｄＣＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰ
である。
【0073】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、少なくとも４種のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、少なくとも４種の保護ヌクレオチドは、α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰおよびα－Ｓ－ｄＴＴＰである。
【0074】
ホスホロチオエート化ヌクレオチドは、Ｓｐ－異性体、Ｒｐ－異性体、またはＳｐ－異性体およびＲｐ－異性体の両方の混合物であってもよい。
【0075】
エキソヌクレアーゼ消化に耐性のあるヌクレオチド（すなわち、保護ヌクレオチド）は、少なくとも１種、または少なくとも２種、３種または４種のＭＯＥヌクレオチドであってもよい。例えば、ＭＯＥヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシ－エチルグアノシン、２’－Ｏ－メトキシ－エチルシチジン、２’－Ｏ－メトキシ－エチルアデノシン、および／または２’－Ｏ－メトキシ－エチルチミジンであってもよい。
【0076】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中の保護ヌクレオチドの取込み量は、当技術分野で公知の方法に基づいて決定できる。例えば、プライマー伸長アッセイを行って、保護されたヌクレオチドと保護されていないヌクレオチドの導入率を評価できる。例えば、ポリメラーゼによるテンプレート／プライマー分子の一塩基伸長は、テンプレートの最初の塩基に対する保護された相補的ヌクレオチドおよび保護されていない相補的ヌクレオチドの濃度を増加させた存在下で評価できる。直鎖状（非飽和）条件下での取込効率は、天然の保護されていないヌクレオチドと比較して、保護されたヌクレオチドの取り込みの程度を決定するために使用できる。
【0077】
２．複合体分子
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、機能性部分をさらに含んでいてもよい。
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、機能性部分をさらに含んでいてもよい。
【0078】
本発明は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物および機能性部分を含む複合体分子を提供する。要すれば、機能性部分は結合分子またはプローブである。
【0079】
本発明は、以下を含む複合体分子を提供する：
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物；ならびに
（ｂ）機能性部分。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物；ならびに
（ｂ）機能性部分。
【0080】
好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
ｉ．カセットの５’末端ヌクレオチド；
ｉｉ．カセットの３’末端ヌクレオチド；および
ｉｉｉ．カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
ｉ．カセットの５’末端ヌクレオチド；
ｉｉ．カセットの３’末端ヌクレオチド；および
ｉｉｉ．カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0081】
本発明はまた、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
ｉ．カセットの５’末端ヌクレオチド；
ｉｉ．カセットの３’末端ヌクレオチド；および
ｉｉｉ．カセットの外側の１以上のヌクレオチド；
から選択され、ここで、該カセットはコーディング配列を含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物；および
（ｂ）機能性部分
を含む、複合体分子を提供する。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
ｉ．カセットの５’末端ヌクレオチド；
ｉｉ．カセットの３’末端ヌクレオチド；および
ｉｉｉ．カセットの外側の１以上のヌクレオチド；
から選択され、ここで、該カセットはコーディング配列を含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物；および
（ｂ）機能性部分
を含む、複合体分子を提供する。
【0082】
機能性部分は、ポリヌクレオチド鎖の３’末端および／または５’末端（または末端領域）にあってもよい。機能性部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’オーバーハング、３’オーバーハング、および／または平滑末端に接着または結合していてもよい。機能性部分は、共有結合もしくは非共有結合によって、または核酸ハイブリダイゼーションによって、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’オーバーハング、３’オーバーハングおよび／または平滑末端に結合または接着され得る。機能性部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に直接的または間接的に（例えば、リンカー分子を介して）結合または接着させることができる。機能性部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に結合することによって、および／または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に結合するリンカー分子に結合またはアニールされることによって、接着または結合され得る。リンカー分子は、バイオポリマー（例えば、核酸分子など）でも合成ポリマーでもよい。リンカー分子は、エチレングリコールおよび／またはポリ（エチレン）グリコール（例えば、ヘキサエチレングリコールまたはペンタエチレングリコール）の１つまたは複数の単位を含み得る。
【0083】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、２つの機能性部分；ポリヌクレオチド鎖の３’末端の第１の機能性部分、およびポリペプチド鎖の５’末端の第２の機能性部分、を含んでいてもよい。第１の機能性部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’オーバーハング、３’オーバーハング、および／または３’末端の平滑末端に接着または結合され得る。第２の機能性部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’オーバーハング、３’オーバーハング、および／または５’末端の平滑末端に接着または結合され得る。２つの機能性部分は同じでも異なっていてもよい。例えば、第１の機能性部分はＤＮＡ産物の検出および／または配列決定を容易にするためのバーコードであってもよく、第２の機能性部分は核標的配列であってもよい。
【0084】
機能性部分はプローブであってもよい。本明細書で用いる用語“プローブ”とは、プローブ中の配列に相補的な標的ヌクレオチド配列の存在を検出するために用いられる、可変長（例えば、３～１０００塩基長）のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラのフラグメントを意味する。通常、プローブは、プローブと標的の間の相補性により、プローブ－標的の塩基対形成が可能な塩基配列の一本鎖核酸にハイブリダイズする。従って、機能性部分はＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ配列であってもよい。本明細書で用いる用語“相補的”とは、ワトソン／クリック対形成ルールに従ってヌクレオチド配列が対形成されることを意味する。例えば、配列５’－ＧＣＧＧＴＣＣＣＡ－３’は、５’－ＴＧＧＧＡＣＣＧＣ－３’の相補配列を有する。相補配列は、ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列でもあり得る。
【0085】
機能性部分は結合分子であってもよい。用語“結合分子”とは、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に結合できる、および／またはさらなる分子もしくは標的に結合できる何れかの分子を意味する。結合分子はタンパク質、ポリペプチド、ペプチドであり得る。結合分子は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの抗体であってもよい。結合分子は抗体フラグメントであってもよい。
【0086】
機能性部分は、捕捉分子（例えば、タンパク質－タンパク質相互作用によって結合した捕捉抗体）と結合することによって、ＤＮＡ産物の検出を促進できる。機能性部分は、細胞標的、例えば細胞受容体に結合し得る。
【0087】
機能性部分は標識であってもよい。従って、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のセンス鎖は、検出のために５’末端または３’末端に標識を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のアンチセンス鎖は、検出のために５’末端または３’末端に標識を含んでいてもよい。“標識”は、物理的、化学的および／または生物学的手段によって二本鎖核酸分子の検出を可能にする何れかの化学物質であり得る。標識は発色団、フルオロフォアおよび／または放射性分子であり得る。
【0088】
機能性部分はターゲティング配列であってもよい。ターゲティング配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントであり、その長さは様々であり、ＤＮＡ産物を細胞内の特定の場所にターゲティングするために用いられる。ターゲティング配列は、ＤＮＡ産物の核内取り込みを促進することによって、非ウイルス性遺伝子導入のトランスフェクション効率を高めるために使用できる。例えば、ターゲティング配列は、ＳＶ４０エンハンサー配列（好ましくはカセットより下流側）のようなＤＮＡ核ターゲティング配列（すなわち、内在性ＤＮＡ結合タンパク質の認識配列）であり得る。
【0089】
ＤＮＡ産物の検出および／または定量を容易にするために、機能性部分は、フルオロフォア、放射性化合物またはバーコードを含んでいてもよい。
【0090】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の存在、不存在および／またはレベルに対応するシグナルは、バーコードを用いて測定できる。バーコードは、バーコード部分に連結された少なくとも１つの結合部分を含んでいてもよく、ここで、バーコード部分は、少なくとも１つのヌクレオチドを含み（すなわち、前記バーコード部分は、少なくとも１つのヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む）、かつ、結合部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’オーバーハング、５’オーバーハングまたは平滑末端に結合できる。結合部位は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’末端および／または５’末端に結合できる。シグナルは、バーコード部分の有無および／またはレベルを決定することによって測定できる（例えば、配列決定またはＰＣＲによって）。バーコード化部分は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のヌクレオチドを含み得る。バーコードは、少なくとも２つの結合部分（例えば、第１の結合部分および第２の結合部分）を含んでいてもよい。例えば、第１のバーコード部分に連結された第１の結合部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’末端に結合でき、第２のバーコード部分に連結された第２の結合部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’末端に結合できる。３’末端および５’末端は、３’オーバーハング、５’オーバーハング、または平滑末端を含み得る。
【0091】
ＤＮＡ産物の存在、不存在および／またはレベルに対応するシグナルは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’オーバーハング、５’オーバーハング、または平滑末端に接着または結合したフルオロフォア（すなわち、蛍光標識分子）を用いて測定できる。シグナルは、フローサイトメトリーおよび／または蛍光活性化セルソーティングによって測定できる。
【0092】
機能性部分は、ＤＮＡの配列決定を容易にすることもできる。例えば、機能性部分は配列決定アダプターであってもよい。用語“配列決定アダプター”とは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ(登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）よび／またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）シーケンシングシステム）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮシーケンシングシステム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンシングシステムなど）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩシーケンシングシステム）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシングシステム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシーケンシングシステム）、またはその他の目的の配列決定プラットフォームによって提供される配列決定プラットフォームなど、目的の配列決定プラットフォームによって利用される核酸配列（またはその相補体）の少なくとも一部を含む１以上の核酸ドメインを包含することを意図する。
【0093】
３．送達粒子
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子の何れかまたは全てを、ナノ粒子などの送達粒子を介して細胞に送達できる。
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子の何れかまたは全てを、ナノ粒子などの送達粒子を介して細胞に送達できる。
【0094】
本発明は、遺伝子治療での使用に特に適したナノ粒子（またはナノ粒子のライブラリー）を提供する。本発明は、遺伝子治療に用いる直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーを提供する。
【0095】
ナノ粒子（またはナノ粒子のライブラリー）は、治療用タンパク質をコードするＤＮＡ産物を送達することによって、あるいは遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムの遺伝子）に有用なＤＮＡ産物を送達することによって、疾患の処置に用いることができる。従って、ナノ粒子はさまざまな用途の送達システムとして機能し得る。投与はインビトロでもインビボでも可能である。
【0096】
治療用遺伝子の効果的な細胞内への取り込みは、遺伝子導入用ナノ粒子の臨床応用を成功させるために重要なプロセスである。従って、本発明は細胞内在化のためのナノ粒子（またはナノ粒子のライブラリー）を提供する。
【0097】
本発明は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、またはライブラリーを含むナノ粒子を提供する。従って、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むナノ粒子を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0098】
本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むナノ粒子を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0099】
本発明はまた、ナノ粒子のライブラリーを提供し、ここで、各ナノ粒子は直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含み、かつ直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は低分散性を有する。ナノ粒子（またはナノ粒子のライブラリー）について用語“低分散性”とは、実質的に同じサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を包含することを意図する。すなわち、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ナノ粒子のライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、３０％未満、２０％未満または１０％未満、好ましくは５％未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基の数）が異なっていてもよい。これらのＤＮＡ産物は、均一なナノ粒子または均一なナノ粒子の集合体（すなわちライブラリー）を形成する。逆に、多分散ＤＮＡ産物（例えば、米国特許ＵＳ１０３５０３０７Ｂ２に記載されている方法で製造されたもの）からなるナノ粒子は、サイズおよび形状が異なり得る（すなわち、分散性が高い）。ナノ粒子の均一性（および／または、低分散性）は、形質転換および／またはトランスフェクションに特に有益であり、内在化および薬物放出プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【0100】
本発明はまた、本明細書に記載のような直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを含むナノ粒子のライブラリーもまた提供する。
【0101】
ナノ粒子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも１コピーを含んでいてもよい。ナノ粒子は、少なくとも２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー、１０コピーの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリー中の各ナノ粒子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも１つのコピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー、１０コピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の同量のコピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３コピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の４つのコピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリー中の各ナノ粒子は、１０コピーを超える直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んではならない。ナノ粒子ライブラリーの各ナノ粒子は、連結したＤＮＡ産物を含んではならない。ナノ粒子のライブラリーに含まれる各ナノ粒子は、複数のカセットを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んではならない。
【0102】
ナノ粒子は、少なくとも１コピーの複合体分子を含んでいてもよい。ナノ粒子は、少なくとも２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー、１０コピーの複合体分子を含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、複合体分子の少なくとも１つのコピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、複合体分子の少なくとも２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー、１０コピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリー中の各ナノ粒子は、複合体分子の同量のコピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、複合体分子の３コピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーの各ナノ粒子は、複合体分子の４コピーを含んでいてもよい。ナノ粒子のライブラリーに含まれる各ナノ粒子は、１０コピーを超える複合体分子を含んではならない。
【0103】
ライブラリーは、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、１０１５個、１０１６個、または１０１７個のナノ粒子を含んでいてもよい。例えば、ライブラリーは、１ｍＬ当たり、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、１０１５個、１０１６個、または１０１７個のナノ粒子を含んでいてもよい。
【0104】
ナノ粒子は自己組織化ナノ粒子であってもよい。好ましくは、ナノ粒子はマイクロ流体デバイス上で製造できる粒子である。好ましくは、ナノ粒子は、静電相互作用、例えば、負に荷電したＤＮＡ分子および正に荷電したカチオン性脂質またはペプチドとの間の静電相互作用に基づいて集合する。例えば、ナノ粒子は自己組織化生体接着性ポリマーをベースとでき、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の経口送達、静脈内送達、経鼻送達に適用できる。例えば、ナノ粒子はＤＮＡ産物を癌細胞に送達し、腫瘍増殖を止めることができる。
【0105】
ナノ粒子は、当技術分野で知られている方法で製造できる。例えば、ナノ粒子は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または本明細書に記載の複合体分子を、二重エマルジョン溶媒蒸発法によってポリ（乳酸－コ－グリコール酸）ナノ粒子に封入することによって製造できる。ナノ粒子は、例えば生体適合性のキトサンまたはシクロデキストリンなどのカチオン性成分でさらに修飾できる。
【0106】
ナノ粒子は、エタノール負荷形成プロセスによって製造できる。この工程では、エタノールに溶解した脂質を、酸性ｐＨ（好ましくはｐＨ＝４）の水性緩衝液中で、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または本明細書に記載の複合体分子と共に迅速に混合する。この自己組織化プロセスでは、静電相互作用によって、ＤＮＡ産物または複合体分子を含むか、あるいは本質的にＤＮＡ産物または複合体分子からなる逆ミセルの形成が促進される。
【0107】
ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、ＬＮＰ（脂質ナノ粒子）、ポリマーナノ粒子、ＰＥＩベースのナノ粒子、リポポリプレックスナノ粒子（ポリマーおよび脂質の混合物）、または固体ナノ粒子（金ナノ粒子など）であってもよい。
【0108】
好ましくは、ナノ粒子（または、ナノ粒子のライブラリー）は、本明細書に記載のように細胞をトランスフェクションできる。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【0109】
本明細書に記載のナノ粒子（またはナノ粒子のライブラリー）は、遺伝子治療に用いるのに適している。例えば、ナノ粒子（またはナノ粒子のライブラリー）は、制御された遺伝子導入プロセスに使用できる。ナノ粒子は、金ナノ粒子、ナノダイヤモンド、または多孔性シリコンナノ粒子である。遺伝子治療に適したナノ粒子は、安定性がよく、表面機能化が容易で、サイズ制御が容易なものであれば、どのようなタイプのものでもよい。金ナノ粒子は無毒性であるため、特に適している。ナノ粒子は脂質ベースのナノ粒子であってもよい。
【0110】
脂質ベースのナノ粒子は、生体適合性が高く、脂質膜によく似ているため、遺伝子導入に特に適している。脂質ベースのナノ粒子は、他の既知のナノ粒子と比較して、一般的に細胞への浸透性が向上している。ナノ粒子は、大きな一枚膜小胞ナノ粒子であってもよい。例えば、ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡを肝臓に送達するのに高度に効果的であることが示されており（Tabernero et al., Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470）、従って、本明細書に記載のＤＮＡ産物および複合体分子を肝臓に送達するために企図される。
【0111】
米国特許出願第２０１１０２９３７０３号は、ポリヌクレオチドの投与に有用なリピドイド（lipidoid）化合物に関し、これは本発明のＤＮＡ産物および複合体分子の送達に適用できる。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物は、細胞または対象に送達される薬剤と結合して、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。微粒子、ナノ粒子、リポソームまたはミセルによって送達される薬剤は、気体、液体または固体の形態であってもよく、薬剤はポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチドまたは低分子であってもよい。アミノアルコール脂質化合物は、ナノ粒子を形成するために、他のアミノアルコール脂質化合物、ポリマー、界面活性剤、コレステロール、タンパク質、脂質などと組み合わせることができる。これらのナノ粒子は、要すれば医薬賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成できる。
【0112】
球状核酸（ＳＮＡ）構築物および他のナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）もまた、ＤＮＡ産物および／または複合体分子を意図した標的に送達する手段として適している。AuraSense Therapeuticsの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物は、核酸で機能化された金ナノ粒子をベースにしており、以下のような複数の重要な成功要因に基づいて、代替プラットフォームよりも優れていることが顕著なデータによって示されている：１）高いインビボ安定性（高密度充填のため、カーゴの大部分（ＤＮＡ産物または複合体分子）は細胞内でコンストラクトに結合したままであり、核酸の安定性および酵素分解に対する抵抗性をもたらす）；２）送達性（試験されたすべての細胞タイプ（例えば、神経細胞、腫瘍細胞株など）に対して）、構築物は、担体またはトランスフェクション剤を必要とせず、９９％のトランスフェクション効率を示す；３）治療標的化（構築物のユニークな標的結合親和性および特異性により、一致した標的配列に対する高い特異性が得られる；４）優れた有効性；５）低毒性；６）有意な免疫反応がない；ならびに、７）化学的耐用性（chemical tailorability）。
【0113】
Ａｒｇ－ＧＩｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドでＰＥＧ化され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したポリエチレンイミン（ＰＥｌ）を用いて、ＤＮＡ産物または複合体分子を有する自己組織化ナノ粒子を構築できる。ナノプレックスは、カチオン性ポリマーおよび核酸の等容量の水溶液を混合し、リン酸（核酸）に対するイオン化可能窒素（ポリマー）の正味モル過剰が２から６の範囲になるように調製できる。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電的相互作用により、平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成される可能性があるため、本明細書中はナノプレックスと呼ぶ。
【0114】
ナノ粒子は、生体適合性ナノ担体を含んでいてもよい。例えば、ナノ粒子は、ポリ（β－アミノエステル）、低分子量ポリエチレンイミン、ポリホスホエステル、ジスルフィド結合ポリマー、ポリアミドアミンを含み得る。これらのナノ担体は、従来の遺伝子導入機序よりもナノ粒子製剤の安定性および安全性が向上している。
【0115】
ナノ粒子は、さらに別の成分と結合していてもよい。例えば、遺伝子治療におけるナノ粒子の特異性および選択性を確保するために、追加的な成分が必要になり得る。例えば、ナノ粒子はペプチドと結合させることができる。ペプチドは、ナノ粒子の標的化能力を向上させ、生物学的毒性を軽減し、処置効果を向上させ得る。ナノ粒子はリポソーム、好ましくは融合性リポソームに結合させることができる。ナノ粒子は、追加的または代替的にホーミングペプチドの外側の鞘部分に接着させることができる。
【0116】
ナノ粒子は磁性ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はペプチドベースのナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、遺伝子治療に適したナノ材料の一部であってもよい。例えば、ナノ材料は低分子、ナノ粒子、ポリマーを含み得る。
【0117】
ナノ粒子は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んでいてもよく、このＤＮＡ産物は機能性部分に接着または結合している。従って、ナノ粒子は、本明細書に記載の複合体分子を含み得る。複合体分子の機能性部分は、ナノ粒子の検出を容易にし得る。検出はインビボまたはインビトロで行うことができる。例えば、機能性部分は蛍光標識であってもよく、これはインビボで追跡されたり、インビトロで画像化されたりする。
【0118】
機能的部分はプローブまたはターゲティング配列であってもよい。ターゲティング配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントであってもよく、その長さは様々であり、ＤＮＡ産物を細胞内の特定の場所に標的化するために用いられる。ターゲティング配列は、ＤＮＡ産物の核内取り込みを促進することによって、非ウイルス性遺伝子導入のトランスフェクション効率を高めるために使用できる。
【0119】
機能性部分は結合分子であってもよい。機能性部分は、タンパク質またはペプチドであってもよい。機能性部分は抗体であっても酵素であってもよい。機能性部分は、捕捉分子（例えば、タンパク質－タンパク質相互作用によって結合した捕捉抗体）と結合することによって、ナノ粒子の検出を促進できる。機能性部分は、細胞標的、例えば細胞受容体に結合する。
【0120】
ナノ粒子の検出および／または定量を容易にするために、機能性部分は、蛍光体、放射性化合物、またはバーコードを含んでいてもよい。
【0121】
ナノ粒子中の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の存在、不存在および／またはレベルに対応するシグナルは、バーコードを用いて測定できる。バーコードは、バーコード部分に連結された少なくとも１つの結合部分を含んでいてもよく、ここで、バーコード部分は、少なくとも１つのヌクレオチドを含み（すなわち、ここで、バーコード部分は、少なくとも１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む）、かつ結合部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’オーバーハング、５’オーバーハングまたは平滑末端に結合できる。結合部位は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’末端および／または５’末端に結合できる。シグナルは、バーコード部分の存在、不存在および／またはレベルを決定することによって測定できる（例えば、配列決定またはＰＣＲによって）。バーコード化部分は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のヌクレオチドを含み得る。バーコードは、少なくとも２つの結合部分（例えば、第１の結合部分および第２の結合部分）を含んでいてもよい。例えば、第１のバーコード部分に連結された第１の結合部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’末端に結合でき、第２のバーコード部分に連結された第２の結合部分は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の５’末端に結合できる。３’末端および５’末端は、３’オーバーハング、５’オーバーハング、または平滑末端を含み得る。
【0122】
ナノ粒子中のＤＮＡ産物の存在、不存在および／またはレベルに対応するシグナルは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の３’オーバーハング、５’オーバーハング、または平滑末端に接着または結合したフルオロフォア（すなわち、蛍光標識分子）を用いて測定できる。シグナルは、フローサイトメトリーおよび／または蛍光活性化セルソーティングによって測定できる。
【0123】
４．ライブラリー
本発明は、少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または本明細書に記載の少なくとも２つの複合体分子を含むライブラリーを提供する。従って、本発明は、少なくとも２本の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーを提供し、その各々はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
本発明は、少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または本明細書に記載の少なくとも２つの複合体分子を含むライブラリーを提供する。従って、本発明は、少なくとも２本の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーを提供し、その各々はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0124】
本発明は、少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーを提供し、その各々はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0125】
ライブラリーは、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、１０１５個、１０１６個、または１０１７個の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んでいてもよい。例えば、ライブラリーは、１ｍＬ当たり、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、１０１５個、１０１６個、または１０１７個の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んでいてもよい。好ましくは、ライブラリーは少なくとも１０１０個の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物（または分子）を含む。例えば、ライブラリーは１ｍＬあたり少なくとも１０１０個の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物（または分子）を含む。ライブラリーは、１０６～１０１６の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、好ましくは１０１３～１０１６の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含み得る。ライブラリーは、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、１０１５個、１０１６個、または１０１７個の複合体分子を含んでいてもよい。例えば、ライブラリーは、１ｍＬ当たり、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個、１０１５個、１０１６個、または１０１７個の複合体分子を含んでいてもよい。好ましくは、ライブラリーは少なくとも１０１０個の複合体分子を含む。例えば、ライブラリーは１ｍＬあたり少なくとも１０１０個の複合体分子を含む。ライブラリーは、１０６～１０１６個の複合体分子、好ましくは１０１３～１０１６個の複合体分子を含み得る。各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子は、異なる目的の遺伝子または同じ目的の遺伝子（または、同じ目的の遺伝子の集合）をコードしていてもよい。
【0126】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子のライブラリーは、単分散であってもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子のライブラリーは分散性が低くてもよい。ライブラリーにおける用語“単分散”および用語“低分散性”とは、実質的に同じサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を包含することを意図する。ＤＮＡ産物または複合体分子の単分散ライブラリー（または分散性の低いライブラリー）は、例えば、ナノ粒子の形成に用いることができる。これは、出発物質（すなわち、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子）の分散度が低いほど、生成されるナノ粒子の分散度も低くなる（均一性が高い）ためである。
【0127】
ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、３０％未満、２０％未満または１０％未満、好ましくは５％未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基の数）が異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、サイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基の数）が３０％未満、２０％未満または１０％未満異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、サイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基の数）が５％未満異なる。
【0128】
ライブラリーにおいて、各複合体分子のサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）は、ライブラリー中の他の複合体分子と３０％未満、２０％未満、または１０％未満、好ましくは５％未満異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各複合体分子のサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の複合体分子と３０％未満、２０％未満、または１０％未満異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリーにおいて、各複合体分子のサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の複合体分子と５％未満異なる。
【0129】
ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、または５０ヌクレオチド未満、好ましくは５０ヌクレオチド未満だけ、サイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、５００ヌクレオチド未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基数）が異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、２５０ヌクレオチド未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基の数）が異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、１００ヌクレオチド未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基数）が異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、５０ヌクレオチド未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基の数）が異なる。
【0130】
ライブラリーにおいて、各複合体分子のサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）は、ライブラリー中の他の複合体分子と、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満または５０ヌクレオチド未満、好ましくは５０ヌクレオチド未満だけ異なっていてもよい。ライブラリーでは、各複合体分子のサイズ（すなわちポリヌクレオチド鎖の塩基数）は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の複合体分子と、５００ヌクレオチド未満異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各複合体分子は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の複合体分子と、２５０ヌクレオチド未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各複合体分子は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の複合体分子と、１００ヌクレオチド未満の差でサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリーにおいて、各複合体分子は、ライブラリー中の少なくとも１０１０個の他の複合体分子と５０ヌクレオチド未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なる。
【0131】
ライブラリーに含まれる直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子のほとんどは、実質的に同じサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）を有する。すなわち、ライブラリーは、実質的に同じサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％含み得る。例えば、１０１０個の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーにおいて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも９０％（すなわち、少なくとも１０９個）は、実質的に同じサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）であってもよい。ライブラリーは、実質的に同じサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）の複合体分子を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％含んでいてもよい。例えば、１０１０個の複合体分子のライブラリーでは、複合体分子の少なくとも９０％（すなわち、少なくとも１０９個）が実質的に同じサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）である。
【0132】
ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、３０％未満、２０％未満または１０％未満、好ましくは５％未満だけ、サイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも９０％が、１０％未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリーにおいて、各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも９０％が、サイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が５％未満異なる。
【0133】
ライブラリーにおいて、各複合体分子は、ライブラリー中の他の複合体分子の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、３０％未満、２０％未満、または１０％未満、好ましくは５％未満サイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なっていてもよい。ライブラリーにおいて、各複合体分子は、ライブラリー中の他の複合体分子の少なくとも９０％が、１０％未満だけサイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリーにおいて、各複合体分子は、ライブラリー中の他の複合体分子の少なくとも９０％が、５％未満のみサイズ（すなわちポリヌクレオチド鎖の塩基数）が異なる。
【0134】
ライブラリーの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子は、実質的に同一であってもよい。すなわち、ライブラリー中の各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子は、実質的に同じであり、すなわち同じか、または実質的に同じポリヌクレオチド配列を含む。例えば、ライブラリーは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含み得る。例えば、ライブラリーは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有する複合体分子を含み得る。例えば、ライブラリーは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含み得る。例えば、ライブラリーは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する複合体分子を含み得る。好ましくは、ライブラリーは少なくとも９５％の配列類似性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む。さらに好ましくは、ライブラリーは少なくとも９５％の配列同一性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む。好ましくは、ライブラリーは少なくとも９５％の配列類似性を有する複合体分子を含む。さらに好ましくは、ライブラリーは少なくとも９５％の配列同一性を有する複合体分子を含む。
【0135】
ライブラリー中の各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子は実質的に同じ（すなわち、同じか、または実質的に同じポリヌクレオチド配列を含み得る）であってもよいが、ライブラリー中のいくつかの（または、全ての）直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子における保護ヌクレオチドの位置および／または分布（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド）は異なっていてもよい。
【0136】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーにおいて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の分布が異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリー中の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも９９％は、保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の分布が異なる。すなわち、ライブラリー中の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の分布が、ライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物と同じでなくてもよい。好ましくは、ライブラリー中の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも９９％は、ライブラリー中の他のどの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物とも同じ分布の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を有さない。
【0137】
複合体分子のライブラリーにおいて、複合体分子の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の分布が異なっていてもよい。好ましくは、ライブラリー中の複合体分子の少なくとも９９％は、保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の分布が異なる。すなわち、ライブラリー中の複合体分子の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、ライブラリー中の他の複合体分子と同じ分布の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を有していなくてもよい。好ましくは、ライブラリー中の少なくとも９９％の複合体分子は、保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の分布が、ライブラリー中の他の複合体分子と同じではない。
【0138】
本明細書で用いる表現“保護ヌクレオチドの分布が異なる”とは、すべての保護ヌクレオチドの分布が同一でない直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を包含することを意味する。例えば、２、３、７および８の位置で保護されたヌクレオチドを含む分子は、２、３、７および９の位置で保護されたヌクレオチドを含む分子とは保護ヌクレオチドの分布が異なる。
【0139】
ライブラリー中の各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、少なくとも１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１０００塩基対、２０００塩基対、３０００塩基対、４０００塩基対、５０００塩基対、６０００塩基対、７０００塩基対、８０００塩基対、９０００塩基対、１００００塩基対、１１０００塩基対、１２０００塩基対、１３０００塩基対、１４０００塩基対または１５０００塩基対の長さであってもよい。好ましくは、ライブラリー中の各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、少なくとも５００塩基対、または少なくとも１０００塩基対の長さである。
【0140】
ライブラリー中の各複合体分子の長さは、少なくとも１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１０００塩基対、２０００塩基対、３０００塩基対、４０００塩基対、５０００塩基対、６０００塩基対、７０００塩基対、８０００塩基対、９０００塩基対、１００００塩基対、１１０００塩基対、１２０００塩基対、１３０００塩基対、１４０００塩基対または１５０００塩基対の長さである。好ましくは、ライブラリー中の各複合体分子の長さは少なくとも５００塩基対、または少なくとも１０００塩基対の長さである。
【0141】
ライブラリー中の複合体分子の機能性部分は、同じでも異なっていてもよい。例えば、ライブラリーは、異なる機能性部分を有し、複合体分子の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物部分の配列に関して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性を有する複合体分子を含み得る。
【0142】
本発明のライブラリーは、疾患だけでなく、細胞プロセスにおける遺伝子機能のスクリーニングにも有用であり得る。このライブラリーは遺伝子配列決定に有用であり得る。
【0143】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって産生されたトランスフェクト細胞の集団を含むライブラリーも提供する。細胞は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または本発明の複合体分子を含んでいてもよい。例えば、細胞は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んでいてもよく、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエートヌクレオチドを含む。
【0144】
細胞は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含んでいてもよく、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0145】
５．組成物
本発明はさらに、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーを含む組成物を提供する。組成物は医薬組成物であってもよい。組成物または医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含んでもよい。
本発明はさらに、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーを含む組成物を提供する。組成物は医薬組成物であってもよい。組成物または医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含んでもよい。
【0146】
本発明は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む組成物を提供する。従って、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む組成物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0147】
本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む組成物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0148】
薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水、緩衝液（例えば、緩衝水溶液）または他の賦形剤であってもよい。
【0149】
例えば、組成物は、１以上の薬学的に許容される固形担体と組み合わせた錠剤、タブレット、またはカプセルとして、あるいは１以上の薬学的に許容される溶媒中の溶液として、あるいは１以上の薬学的に許容される溶媒または担体中の乳濁液、懸濁液または分散液として製剤化できる。製剤はまた、安定化剤、酸化防止剤、結合剤、着色剤、乳化剤または味覚調整剤（taste-modifying agent）、徐放製剤などの薬学的に許容される他の賦形剤を含んでいてもよい。
【0150】
組成物は、経口、局所、非経腸、経皮または吸入により投与できる。本組成物は、適切な滅菌溶液を用いて、注射または静脈内注入により投与できる。局所投与剤形は、クリーム、軟膏、パッチまたは経皮および局所投与剤形に適した同様のビークルであり得る。
【0151】
組成物は、液体ビークルに溶解または懸濁させるか、または顆粒（小さな粒子または粒）、ペレット（賦形剤の有無にかかわらず、顆粒の形成または圧縮成形により製造された高度に精製された組成物からなる小さな無菌固体塊）、またはペレットコーティング徐放剤（組成物自体が、様々な量のコーティングが施された顆粒の形態であり、従来の剤形として提示される組成物と比較して投与回数の減少を可能にするような方法で組成物を放出する固形剤形）として製剤され得る。
【0152】
他の形態としては、錠剤（経口投与を意図した、組成物を含有する小型で丸い固形剤形）、粉末（乾燥し、細かく分割された組成物と１種以上の薬学的に許容される添加物との緻密な(intimate)混合物であり、内用または外用を意図できる）、エリキシル（溶解した組成物を含む、透明で、風味のよい、甘味のあるヒドロアルコール液体であり、経口用である）、チューインガム（咀嚼すると組成物が口腔内に放出される、様々な形状の甘く風味のある不溶性プラスチック材料）、シロップ（組成物および高濃度のスクロースまたは他の糖類を含む経口溶液。この用語は、経口懸濁液を含む、甘く粘性のあるビークルで調製された他のあらゆる液体剤形を含むものとして使用されてきた）、錠剤（適切な希釈剤を含む、または含まない組成物を含む固形剤形）、錠剤チュアブル（適切な希釈剤を含むかまたは含まない、組成物を含む固形剤形であって、咀嚼することを意図し、口腔内に快い味の残留物を生じ、容易に嚥下され、苦味または不快な後味を残さない、固形剤形）、錠剤コーティングまたは錠剤遅延放出、錠剤分散性、錠剤発泡性、錠剤徐放性、錠剤フィルムコーティング、または錠剤フィルムコーティング徐放剤などが挙げられ、錠剤は、摂取後の長期間にわたって含有組成物を利用できるように製剤される。
【0153】
他の形態では、溶液用錠剤、懸濁用錠剤、錠剤多層、錠剤多層徐放が提供され得て、ここで、錠剤は、従来の剤形として提示される組成物と比較して、少なくとも投与回数の減少を可能にするような方法で製剤される。錠剤口腔内崩壊型、錠剤口腔内崩壊型遅延放出型、錠剤可溶型、錠剤糖衣型、浸透圧型なども好適である。
【0154】
経口剤形組成物は、組成物に加えて、希釈剤、可溶化剤、アルコール類、結合剤、放出制御ポリマー、腸溶性ポリマー、崩壊剤、賦形剤、着色剤、香味剤、甘味剤、酸化防止剤、保存剤、顔料、添加剤、充填剤、懸濁化剤、界面活性剤（例えば、陰イオン性、陽イオン性、両性および非イオン性）などの１以上の不活性医薬成分を含んでいてもよい。ＦＤＡが承認したさまざまな局所用不活性成分は、ＦＤＡの“The Inactive Ingredients Database”で見出すことができる。
【0155】
本明細書で用いる、注射剤および注入剤の剤形としては、リポソーム（通常、組成物をカプセル化するために用いられるリン脂質から構成される脂質二重層小胞）からなるか、またはリポソームを形成するリポソーム注射剤；非経腸使用を意図した無菌製剤を含む注射剤；非経腸投与を意図した無菌のパイロジェンフリーの製剤からなる乳剤を含む乳化注射剤；あるいは、脂質複合体注射剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0156】
例えば、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーは、鼓膜内注射（例えば、中耳への注射）および／または外耳、中耳および／または内耳への注射によって投与できる。このような方法は、例えばヒトの耳にステロイドおよび抗生物質を投与する場合など、当技術分野で常套的に用いられている。例えば、耳の正円窓から、あるいは蝸牛嚢（cochiear capsule）から注入できる。
【0157】
他の形態としては、非経腸使用のための溶液を形成するための再構成を意図した無菌製剤である溶液注射用粉末；非経腸使用のための懸濁液を形成するための再構成を意図した無菌製剤である懸濁注射用粉末；リポソーム懸濁注射用凍結乾燥粉末であって、非経腸使用のための再構成を意図した無菌凍結乾燥製剤であり、再構成時にリポソーム（通常、リン脂質から構成され、脂質二重層内または水性空間内に組成物を封入するために用いられる脂質二重層小胞）が形成されるように製剤されたもの；または、溶液注射用に凍結乾燥された粉末（ここで、凍結乾燥（lyophilization (“freeze drying”)）とは、凍結状態の製品から極めて低い圧力で水分を除去するプロセスである）が挙げられる。
【0158】
懸濁注射液は、粒子が溶解しない液相全体に分散した固体粒子からなる注射に適した液体製剤を含み、水相全体に分散した油相、またはその逆も可能である。懸濁リポソーム注射液は、注射に適した液体製剤であり、リポソーム（通常、リン脂質からなる脂質二重層小胞で、脂質二重層内または水性空間内に組成物を封入するために用いられる）が形成されるように水相全体に分散された油相からなる。超音波処理した懸濁注射剤（suspension sonicated injection）は、注射に適した液体製剤を含み、粒子が溶解しない液相全体に分散した固形粒子からなる。さらに、懸濁液にガスをバブリングしながら製品を超音波処理することで、固形粒子が微小球を形成する。
【0159】
別の投与方法では、組成物は、カテーテルまたはポンプを介して、インサイチュウで投与できる。カテーテルまたはポンプは、例えば、組成物を標的部位に導くことができる。
【0160】
非経腸担体システムは、溶媒および共溶媒、可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤、増粘剤、乳化剤、キレート剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、還元剤、抗菌保存剤、増量剤、保護剤、強壮調整剤、および特殊添加剤のような、１以上の薬学的に適切な賦形剤を含む。非経腸投与に適した製剤は、好ましくはレシピエントの血液と等張である組成物の無菌油性または水性製剤を含むのが便利であるが、これは必須ではない。
【0161】
本明細書で用いる、吸入剤形としては、エアロゾル（加圧下でパッケージされ、皮膚への局所適用ならびに鼻（鼻エアロゾル）、口（舌および舌下エアロゾル）または肺（吸入エアロゾル）への局所適用を意図した適切なバルブシステムの作動時に放出される組成物を含む製品）が挙げられるが、これらに限定されない。泡沫エアロゾルは、組成物、界面活性剤、水性または非水性液体、および推進剤（propellant）を含む剤形であり、これにより、推進剤が内相（不連続相）（すなわち、水中油型のもの）にある場合は、安定な泡が吐出され、推進剤が外相（連続相）（すなわち、油中水型のもの）にある場合は、噴霧または速破泡が吐出される。定量型エアロゾルは、作動のたびに均一な量の噴霧を可能にする定量バルブからなる加圧式剤形である。粉末型エアゾールは、加圧下でパッケージされ、適切なバルブシステムの作動により放出される粉末の形態で、組成物を含む製品である。エアゾールスプレーは、製品を湿潤スプレーとして排出するのに必要な力を提供するために、推進剤として圧縮ガスを利用するエアゾール製品であり、水性溶媒中の組成物の溶液に適用可能である。
【0162】
本明細書で用いる、経皮剤形としては、パッチ（通常、身体の外部部位に適用される粘着性バッキングを含むことが多い薬物送達システムであり、それによって成分（組成物を含む）がパッチの一部から受動的に拡散するか、または能動的に輸送され、それによってパッチによって成分（組成物を含む）が身体の外表面に送達されるか、または体内に送達される）が挙げられるが、これらに限定されない。マトリックス、リザーバーなど、さまざまなタイプの経皮パッチが当技術分野で知られている。
【0163】
本明細書で用いる、局所剤形としては、ローション（エマルジョン、液体剤形であって、この剤形は一般に皮膚への外用剤形であるもの）、ローション増強剤（組成物の送達を増強するローション剤形であって、増強は剤形中の組成物の強度を意味しないローション剤形）、ゲル（溶液またはコロイド分散液に剛性を与えるためのゲル化組成物を含む半固形剤形であって、ゲルが懸濁粒子を含み得る半固形剤形）および軟膏（ビークルとして通常２０％未満の水および揮発性物質、および５０％以上の炭化水素、ワックス、またはポリオールを含有する半固形剤形であって、この剤形は一般に皮膚または粘膜への外部適用用である、半固形剤形）などの、当技術分野で公知の種々の剤形が挙げられる。さらなる態様には、軟膏増強剤（組成物の送達を増強する軟膏剤形であって、増強は剤形中の組成物の強度を意味しない、軟膏剤形）、クリーム（通常２０％以上の水および揮発性物質および／または５０％未満の炭化水素、ワックスまたはポリオールを含むエマルジョン、半固形剤形もビークルとして使用でき、それによってこの剤形は一般に皮膚または粘膜に外用される）およびクリーム増強剤（組成物の送達を増強するクリーム剤形であって、増強は剤形中の組成物の強度を意味しない、クリーム剤形）が含まれる。本明細書において、“エマルジョン”とは、少なくとも２つの非混和性液体からなる二相系からなる剤形を意味し、その一方は、液滴、内相または分散相として、他方の液体、外相または連続相内に分散しており、一般に１以上の乳化剤で安定化されている。さらなる態様には、懸濁液（液体ビークル中に分散した固体粒子を含む液体剤形）、懸濁液徐放、ペースト（脂肪性ビークル中に微細に分散した固形分を２０～５０％と多く含む半固形剤形であり、この剤形は一般に皮膚または粘膜に外用される）、溶液（溶媒または互いに混和可能な溶媒の混合物に溶解した１以上の化学物質を含む、透明かつ均質な液体剤形）、および粉末が含まれる。
【0164】
局所剤形組成物は、組成物および、賦形剤、着色剤、顔料、添加剤、充填剤、エモリエント剤、界面活性剤（例えば、アニオン性、カチオン性、両性および非イオン性）、浸透促進剤（アルコール類、脂肪アルコール類、脂肪酸、脂肪酸エステル、ポリオールなど）等の１以上の不活性医薬成分を含有する。ＦＤＡが承認したさまざまな局所用不活性成分は、ＦＤＡの“The Inactive Ingredients Database”で見出すことができる。
【0165】
６．細胞トランスフェクション
本発明は、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を含む細胞トランスフェクション組成物を提供する。
本発明は、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を含む細胞トランスフェクション組成物を提供する。
【0166】
本発明は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む細胞トランスフェクション組成物を提供する。従って、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む細胞トランスフェクション組成物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエートヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0167】
本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含む細胞トランスフェクション組成物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0168】
細胞トランスフェクション組成物は、担体、例えば薬剤または製剤を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、担体は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子の標的部位への蓄積を促進し、および／または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を生物学的環境成分との望ましくない相互作用から保護し、および／または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を代謝および／または分解から保護する。
【0169】
本発明はさらに、トランスフェクションされる細胞を、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーと接触させること（インビトロで）を含む、細胞トランスフェクション方法を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーは、細胞の細胞質にトランスフェクションされる。
【0170】
細胞は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーと、薬剤または製剤などの担体の存在下または不存在下で接触させることができる。好ましくは、担体は、標的部位における直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーの蓄積を促進し、および／または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーを生物学的環境成分との望ましくない相互作用から保護し、および／または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーを代謝および／または分解から保護する。
【0171】
トランスフェクションされる細胞は、細胞培養培地（例えば、ペトリ皿、培養容器またはウェルなど）中で提供できる。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリー分子は、細胞培養培地に直接添加されてもよいし、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーを含む生理食塩水、緩衝液、細胞培養培地などの溶液に細胞を添加してもよい。
【0172】
担体はウイルス性担体でも非ウイルス性担体でもよい。ウイルス担体には、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を送達するためのレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターが含まれる。非ウイルス性担体（またはベクター）には、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を、カチオン性細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）；カチオン性ポリマーまたはデンドリマー、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリ－Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）；および／または、カチオン性脂質（例えば、リポフェクトアミン）などのカチオン性薬剤と複合化することが含まれる。
【0173】
担体は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子に結合する低分子（例えば、コレステロール、胆汁酸、および／または脂質）、ポリマー、タンパク質（例えば、抗体）、および／またはアプタマー（例えば、ＲＮＡ）であってもよい。担体は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子をカプセル化するために用いられるナノ粒子製剤であってもよい。
【0174】
担体は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を標的化リガンド（例えば、抗体）、ペプチド、低分子（例えば、葉酸および／またはビオチン）、または細胞外マトリックスに存在するポリマー（例えば、ヒアルロン酸および／またはコンドロイチン硫酸）で修飾したもの、または二本鎖核酸分子を（例えば、コレステロールおよび／またはα－トコフェロールを用いて）疎水性修飾したものであってもよい。
【0175】
細胞トランスフェクション組成物は、光増感剤および／またはラジカル開始剤、例えば光重合開始剤から選択される薬剤を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、この薬剤は、標的部位における直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子の機能を改善し、および／または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子を代謝および／または分解から保護する。
【0176】
本発明はさらに、本発明の方法によって得られる細胞を提供する。従って、細胞は、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーを含み得る。
【0177】
本発明はさらに、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーでトランスフェクトされた細胞を提供する。
【0178】
細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、真菌細胞、微生物細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）、植物細胞などの動物細胞であってもよい。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【0179】
細胞を直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーと接触させる工程は、インビボで行ってもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーは、それを必要とする生物（例えば、対象）に投与できる。生物（例えば、対象）は、哺乳動物（例えば、ヒト）などの動物、真菌、微生物または植物であってもよい。
【0180】
本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子の何れかまたは全てを、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、マクロベシクル、ウイルス性または非ウイルス性ベクターなどの送達粒子を介して細胞に送達できる。本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子の何れかまたは全てを、遺伝子銃を用いて細胞に送達できる。本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または複合体分子は、担体なしで細胞に送達できる。
【0181】
７．用途および適用
本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、当技術分野で知られている増幅産物と比較して多くの利点を有する。例えば、目的の遺伝子の転写に通常用いられるプラスミドＤＮＡとは異なり、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物には細菌骨格、抗生物質耐性遺伝子、細菌汚染物質が含まれていない。さらに、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は無細胞系で大量に生産でき、製造工程を大幅に迅速化できる。重要なことは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、コーディング配列を含み得る単一カセットを含んでいてもよい。これは、生成された生成物が低い分散性（または、実質的に単分散）で、すなわち実質的に同じ長さおよび大きさであることを意味し、ナノ粒子、ウイルスまたは非ウイルス送達システム、ワクチンの製造において顕著に有益である。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はまた、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性が向上し、産物の半減期が長くなり得る（および、インビボでの発現が長くなり得る）。上記の理由から、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は多くの用途に適しており、そのいくつかは本明細書で説明する。
本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、当技術分野で知られている増幅産物と比較して多くの利点を有する。例えば、目的の遺伝子の転写に通常用いられるプラスミドＤＮＡとは異なり、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物には細菌骨格、抗生物質耐性遺伝子、細菌汚染物質が含まれていない。さらに、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は無細胞系で大量に生産でき、製造工程を大幅に迅速化できる。重要なことは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、コーディング配列を含み得る単一カセットを含んでいてもよい。これは、生成された生成物が低い分散性（または、実質的に単分散）で、すなわち実質的に同じ長さおよび大きさであることを意味し、ナノ粒子、ウイルスまたは非ウイルス送達システム、ワクチンの製造において顕著に有益である。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はまた、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性が向上し、産物の半減期が長くなり得る（および、インビボでの発現が長くなり得る）。上記の理由から、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は多くの用途に適しており、そのいくつかは本明細書で説明する。
【0182】
本明細書に記載の保護ヌクレオチドを含む生成物の使用は、インビボでの使用またはインビトロでの使用であり得る。
【0183】
ＲＮＡおよびタンパク質の産生
本発明は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の生産における、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーの使用を提供する。
本発明は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の生産における、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、またはライブラリーの使用を提供する。
【0184】
本発明は、
（ａ）本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を産生する工程
を含む、インビトロ転写のための方法を提供する。
（ａ）本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を産生する工程
を含む、インビトロ転写のための方法を提供する。
【0185】
本発明は、インビトロ転写のための方法であって、（ａ）本明細書に記載の複合体分子をポリメラーゼと接触させる工程；および、（ｂ）転写産物を産生する工程、を含む方法を提供する。本発明は、インビトロ転写のための方法であって、（ａ）本明細書に記載のナノ粒子をポリメラーゼと接触させる工程；および、（ｂ）転写産物を産生する工程、を含む方法を提供する。本発明はまた、インビトロ転写のための方法であって、（ａ）本明細書に記載のライブラリーをポリメラーゼと接触させる工程；および、（ｂ）転写産物を産生する工程、を含む方法を提供する。
【0186】
本発明はまた、（ａ）本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を細胞内でポリメラーゼと接触させる工程；および、（ｂ）細胞内で転写産物を産生する工程、を含む、インビボ転写のための方法を提供する。
【0187】
細胞は動物細胞であってもよく、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【0188】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットを含み得る。カセットは、コーディング配列を含んでいてもよい。カセットはプロモーターおよびコーディング配列を含み得る。コーディング配列は、所望のタンパク質をコードしていてもよい。従って、転写産物は所望のタンパク質のｍＲＮＡ配列を含み得る。
【0189】
転写は、ポリメラーゼの使用を含み得る。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼであり得る。
【0190】
転写は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドのような保護ヌクレオチドを組み込む工程を含み得る。
【0191】
インビトロ転写は、無細胞発現系で行うことができる。無細胞発現系は、原核細胞由来でも真核細胞由来でもよい。例えば、無細胞発現系はウサギ網状赤血球、小麦胚芽または大腸菌に由来していてもよい。
【0192】
この転写産物は、ウイルスＲＮＡ合成およびトランスフェクションに使用できる。例えば、転写産物は複製を開始するために使用され得る。転写産物はインビトロおよび／またはインビボのｍＲＮＡ合成に使用できる。この転写産物はＲＮＡ構造研究に利用できる。この転写産物は、例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）のためのＲＮＡアプタマー合成に使用できる。転写産物は、例えばＲＮＡｉ技術のためのｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ合成に使用できる。転写産物は、例えばＲＮＰを介した遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ合成に使用できる。この転写産物は、リボプローブ合成、例えばノーザンブロッティングやインサイチュウハイブリダイゼーションに使用できる。転写産物はＲＮＡ増幅に使用できる。転写産物はｍｉＲＮＡ合成に使用され得る。転写産物はアンチセンスＲＮＡ合成に使用され得る。
【0193】
本発明は、タンパク質発現のための方法を提供し、この方法は、所望のＲＮＡまたはタンパク質を生成するために、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を原核細胞または真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入することを含む。
【0194】
本発明はまた、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物からタンパク質を無細胞発現系で発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビトロで産生する方法を提供する。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物からタンパク質を無細胞発現系で発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビトロで産生する方法を提供する。
【0195】
無細胞発現系は、原核細胞由来でも真核細胞由来でもよい。例えば、無細胞発現系はウサギ網状赤血球、小麦胚芽または大腸菌に由来する。
【0196】
本発明はまた、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）細胞内で直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物からタンパク質を発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビボで産生する方法を提供する。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）細胞内で直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物からタンパク質を発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビボで産生する方法を提供する。
【0197】
細胞は動物細胞であってもよく、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【0198】
目的のタンパク質は単一カセットによってコードされている可能性がある。本発明はまた、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）カセットからタンパク質を無細胞発現系で発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビトロで産生する方法を提供する。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）カセットからタンパク質を無細胞発現系で発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビトロで産生する方法を提供する。
【0199】
本発明はまた、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）細胞内でカセットからタンパク質を発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビボで産生する方法を提供する。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、工程；および
（ｂ）細胞内でカセットからタンパク質を発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビボで産生する方法を提供する。
【0200】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に少なくとも２個のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。
【0201】
本発明はまた、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ｉ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｉｉ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、該カセットは、コーディング配列を含む、工程；および
（ｂ）カセットからタンパク質を無細胞発現系で発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビトロで産生する方法を提供する。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ｉ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｉｉ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、該カセットは、コーディング配列を含む、工程；および
（ｂ）カセットからタンパク質を無細胞発現系で発現させる工程
を含む、所望のタンパク質をインビトロで産生する方法を提供する。
【0202】
本発明はまた、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ｉ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｉｉ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、該カセットはコーディング配列を含む、工程；および
（ｂ）細胞内でカセットからタンパク質を発現させる工程
を含む、インビボで所望のタンパク質を生産する方法を提供する。
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する工程であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ｉ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｉｉ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、該カセットはコーディング配列を含む、工程；および
（ｂ）細胞内でカセットからタンパク質を発現させる工程
を含む、インビボで所望のタンパク質を生産する方法を提供する。
【0203】
本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のインビボ転写および翻訳方法を提供する。本発明はまた、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のインビトロ転写および翻訳の方法もまた提供する。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化に対する耐性が改善または増強されていてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化に対して耐性であってもよい。従って、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性が増強されたＤＮＡ産物を用いる、本明細書に記載の発現（すなわち、転写および／または翻訳）方法は、細胞内（または無細胞系）での目的遺伝子の長期発現を可能にする。
【0204】
ナノ粒子またはナノ粒子ライブラリーの製造
本発明は、ナノ粒子またはナノ粒子のライブラリーの製造における、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーの使用を提供する。
本発明は、ナノ粒子またはナノ粒子のライブラリーの製造における、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーの使用を提供する。
【0205】
ウイルスベクター
ＡＶＶベクターなどのウイルスベクターを製造する方法は、当技術分野で知られている。最も広く用いられている方法は、ＨＥＫ２９３に３つの細菌プラスミドを共導入することである。第１のプラスミドは、ＲｅｐおよびＣａｐエレメントをコードし、第２のプラスミドはヘルパープラスミドであり、一方、第３のプラスミドは逆末端反復（ＩＴＲ）を有する目的の遺伝子ペイロードをコードする。ウイルス調製（例えば、ＡＶＶ）にプラスミドを用いるとき、いくつかの問題がある：すなわち、１）プラスミドの生産には時間を要し、コストがかかる；２）大腸菌におけるＩＴＲ配列の増殖には困難が伴う；３）プラスミド骨格をウイルス・キャプシド（例えば、ＡＶＶキャプシド）に組み込むことは困難である（例えば、抗生物質耐性マーカーの問題がある）。これらがウイルスベクター生産（例えば、ＡＶＶ生産など）の主なボトルネックとなっている。従って、本発明は、ウイルスベクターの製造に用いるのに適した直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、プラスミドベクターの上記の問題を克服する。
ＡＶＶベクターなどのウイルスベクターを製造する方法は、当技術分野で知られている。最も広く用いられている方法は、ＨＥＫ２９３に３つの細菌プラスミドを共導入することである。第１のプラスミドは、ＲｅｐおよびＣａｐエレメントをコードし、第２のプラスミドはヘルパープラスミドであり、一方、第３のプラスミドは逆末端反復（ＩＴＲ）を有する目的の遺伝子ペイロードをコードする。ウイルス調製（例えば、ＡＶＶ）にプラスミドを用いるとき、いくつかの問題がある：すなわち、１）プラスミドの生産には時間を要し、コストがかかる；２）大腸菌におけるＩＴＲ配列の増殖には困難が伴う；３）プラスミド骨格をウイルス・キャプシド（例えば、ＡＶＶキャプシド）に組み込むことは困難である（例えば、抗生物質耐性マーカーの問題がある）。これらがウイルスベクター生産（例えば、ＡＶＶ生産など）の主なボトルネックとなっている。従って、本発明は、ウイルスベクターの製造に用いるのに適した直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、プラスミドベクターの上記の問題を克服する。
【0206】
本発明は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーの、ウイルスベクターの製造における使用を提供する。
【0207】
本発明は、ウイルスベクターの産生における、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供する。従って、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ウイルスベクターの製造において、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0208】
本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットは、ウイルスベクターの製造において、コーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットは、ウイルスベクターの製造において、コーディング配列を含む。
【0209】
本発明は、ウイルスベクターを産生する方法を提供し、この方法は、ウイルスベクターが産生されるような条件下で、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーを細胞に導入することを含む。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーは、ウイルスベクターの産生に必要な少なくとも１つのエレメントをコードしていてもよい。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ライブラリーは、Ｒｅｐおよび／またはＣａｐエレメントをコードしていてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーは、ヘルパープラスミドエレメントをコードしていてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーは、Ｒｅｐ、Ｃａｐおよびヘルパープラスミドエレメントをコードできる。この方法は、インビボ法でもインビトロ法でもよい。細胞は動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ－Ｔ、ＣＨＯ）であってもよい。細胞は、組織培養細胞株でインビトロで培養した細胞であってもよい。
【0210】
好ましくは、ベクターはＡＶＶベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【0211】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって産生されたウイルスベクターを細胞に接触させることを含む、ウイルスベクターを細胞に送達する方法を提供する。細胞は動物細胞であってもよく、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【0212】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる細胞を提供する。
【0213】
非ウイルス性ベクター
非ウイルス性ベクターの製造方法は当技術分野で知られている。ウイルスベクターよりも非ウイルスベクターの方が、非免疫原性による反復投与の機会、無制限のパッケージング能、および関連毒性の低さなど、いくつかの利点がある。非ウイルス性ベクターを製造するほとんどの方法はプラスミドＤＮＡを用いる。従って、本発明は、非ウイルス性ベクターの産生に用いるのに適した直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、非ウイルスベクター調製においてプラスミドベクターを使用する際の問題点を克服する。例えば、本発明の直鎖二本鎖ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡとは異なり、細菌骨格を構成しないので、ＤＮＡ１ｍｇ当たりにより多くの導入遺伝子コピーを可能にする。さらに、本発明は抗生物質耐性遺伝子や細菌汚染物質を含まない。さらに、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、（エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドの存在により）導入遺伝子の発現を延長し、かつ非ウイルスベクター産生のより費用効果の高いプロセスを提供する。
非ウイルス性ベクターの製造方法は当技術分野で知られている。ウイルスベクターよりも非ウイルスベクターの方が、非免疫原性による反復投与の機会、無制限のパッケージング能、および関連毒性の低さなど、いくつかの利点がある。非ウイルス性ベクターを製造するほとんどの方法はプラスミドＤＮＡを用いる。従って、本発明は、非ウイルス性ベクターの産生に用いるのに適した直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、非ウイルスベクター調製においてプラスミドベクターを使用する際の問題点を克服する。例えば、本発明の直鎖二本鎖ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡとは異なり、細菌骨格を構成しないので、ＤＮＡ１ｍｇ当たりにより多くの導入遺伝子コピーを可能にする。さらに、本発明は抗生物質耐性遺伝子や細菌汚染物質を含まない。さらに、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、（エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドの存在により）導入遺伝子の発現を延長し、かつ非ウイルスベクター産生のより費用効果の高いプロセスを提供する。
【0214】
本発明は、非ウイルス性ベクターの製造における、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供する。本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、非ウイルスベクターの製造において、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0215】
本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、非ウイルス性ベクターの製造において、前記カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、非ウイルス性ベクターの製造において、前記カセットはコーディング配列を含む。
【0216】
本発明はまた、非ウイルス性ベクターの産生における、本明細書に記載の複合体分子の使用もまた提供する。
【0217】
本発明は、非ウイルス性ベクターを細胞に送達する方法であって、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ライブラリーまたは組成物を含む非ウイルス性ベクターを細胞に接触させることを含む方法を提供する。細胞は動物細胞であってもよく、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
【0218】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる細胞を提供する。
【0219】
一般的な治療用途および診断用途
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、治療における使用に特に適している。これらの分子は、治療用タンパク質の配列、ワクチンの一部、あるいは対象の疾患または感染症の処置に用いられる遺伝子工学的メカニズムの要素をコードしていていてもよい。
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、治療における使用に特に適している。これらの分子は、治療用タンパク質の配列、ワクチンの一部、あるいは対象の疾患または感染症の処置に用いられる遺伝子工学的メカニズムの要素をコードしていていてもよい。
【0220】
本発明は、治療における直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの使用を提供する。
【0221】
本発明は、治療における本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供する。従って、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、治療において、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0222】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットは治療に使用するためのコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットは治療に使用するためのコーディング配列を含む。
【0223】
本発明はさらに、医薬品として使用するための直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーを提供する。本発明はまた、疾患を治療するための医薬の製造における、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの使用も提供する。
【0224】
本発明はさらに、疾患の治療に使用するための直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーを提供する。
【0225】
本発明はまた、本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーを対象に投与することを含む、前記対象の疾患を治療する方法を提供する。好ましくは、対象に投与される直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの量は、治療有効量である。
【0226】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、あらゆる疾患または障害の処置に用い得る。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、遺伝子疾患（例えば、単一遺伝子疾患）、癌、ＨＩＶ、他のウイルス感染症（例えば、コロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）による感染症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウイルス２型、インフルエンザ、麻疹、および／または呼吸器合胞体から選択される疾患および／または障害の１つ以上を治療するために使用され得る。コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９など）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウイルス２型、インフルエンザ、麻疹および／またはＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）による感染症）、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病および／またはハンチントン病などのポリグルタミン病）、眼の疾患（例えば、黄斑変性症）および肝不全から選択される１以上の疾患および／または障害の処置に用いられ得る。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、遺伝性疾患の処置に用いられる。さらに好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、単一遺伝子疾患の処置に用いられる。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症、ハンチントン病およびデュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病Ａ型、α１－アンチトリプシン欠損症、原発性毛様体ジスキネジア、または未熟児呼吸窮迫症候群の処置に用いられ得る。
【0227】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーで処置される対象は、障害の処置に一般的に用いられる薬物による処置を含む、前記障害に対する他の処置形態と組み合わせて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーを受容することができる。薬剤は１回または複数回に分けて投与される。当業者（例えば、医師）は、対象の特定の状況に応じて、対象のための適切な投与レジメンを決定することが十分に可能である。
【0228】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、好ましくは、本明細書に記載の組成物または医薬組成物として対象に投与される。
【0229】
本明細書で用いる“投与する”とは、上記でより詳細に記載したように、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーを対象の体内に導入することを意味する（「組成物」欄参照）。例えば、経口剤、局所剤、経頬剤、舌下剤、経肺剤、経皮剤、経粘膜剤、ならびに皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射および筋肉内注射、または消化管（alimentary canal）を介した液剤もしくは固形剤の形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【0230】
本明細書で用いる用語“治療上有効な量”とは、疾患を処置するために対象に投与されたとき、該疾患のそのような処置を効果的に行うのに十分な、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの量を意味する。“治療上有効な量”は、例えば、用いる特定の製品、対象の疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康状態、投与経路および投与形態などの要因によって異なる。このような因子に基づいて、特定の対象に対して適切な治療上有効な量を決定することは、当業者（例えば、担当医）にとって日常的なことである。本明細書に記載の疾患の処置とは、疾患の１以上の症状の改善を意味すると理解されるべきである。
【0231】
本発明はまた、疾患および／または障害を診断する方法における、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの使用を提供する。
【0232】
本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの、疾患の“インビトロ”診断における使用を提供する。
【0233】
本発明はまた、疾患の“インビボ”診断方法に使用するための直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーを提供する。
【0234】
この方法は、何れかの疾患および／または障害の診断に用いることができる。例えば、疾患および／または障害は、遺伝性障害（例えば、単一遺伝子障害）、癌、ＨＩＶ、他のウイルス感染（例えば、コロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウイルス２型、インフルエンザ、麻疹および／またはＲＳウイルスによる感染）、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病および／またはハンチントン病などのポリグルタミン病）、眼疾患（例えば、黄斑変性症）および肝不全から選択され得る。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、遺伝子疾患の診断に用いられる。さらに好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、単一遺伝子疾患の診断に用いられる。例えば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーは、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症、ハンチントン病、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病Ａ、α１－アンチトリプシン欠損症、原発性毛様体ジスキネジアまたは未熟児呼吸窮迫症候群の診断に使用できる。
【0235】
本明細書に記載の診断法および処置方法は、インビトロ法であってもインビボ法であってもよい。
【0236】
診断方法は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの検出および／または定量に依存して変わり得る。
【0237】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の検出および／または定量を容易にするために、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、機能性部分に接着または結合させることができる。機能性部分は、本明細書に記載されている何れかの機能性部分であってもよい。例えば、機能性部分はプローブであってもよい。機能性部分は、蛍光体、放射性化合物、またはバーコードを含み得る。機能性部分はタンパク質、例えば抗体であってもよい。
【0238】
診断は、ＤＮＡ産物の存在、不存在および／またはレベルに対応するシグナルの検出に依存して変わり得る。例えば、シグナルは、蛍光プローブに結合した直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のフローサイトメトリーおよび／または蛍光活性化セルソーティングによって測定できる。
【0239】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、例えばラテラルフローアッセイにおいて、捕捉部位に結合させることによって検出できる。この例では、機能性部分はタンパク質、例えば捕捉部分に特異的な抗体である。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物に結合した抗体が捕捉されると、視覚的シグナル（例えば、異なる色のバンド）が生じ得る。
【0240】
本発明はまた、疾患の診断と疾患の処置を組み合わせた方法を提供する。
【0241】
細胞療法
上記のように、本発明の産物はプラスミドＤＮＡよりも実質的に汚染を少なくし得る。加えて、本発明の産物は本質的にとても単純であり（例えば、バクテリアの骨格を有さない）、これは一般的に作業が容易であることを意味する。少なくとも、本発明の産物は目的の遺伝子を含むため、反応体積あたり（または最終産物の質量あたり）より多くの目的の遺伝子のコピーを得ることができる。本明細書に記載された製品の純粋かつ単純な性質は、細胞治療に使用するのに特に適している。例えば、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物およびライブラリーを含む細胞を、患者に注射またはその他の方法で移植し、所望の効果を引き起こすことができる。細胞（または複数の細胞）は、例えば免疫療法の過程で細胞媒介免疫を介して、癌細胞と闘うことができる。細胞（または複数の細胞）は、病変組織を再生するために移植され得る。
上記のように、本発明の産物はプラスミドＤＮＡよりも実質的に汚染を少なくし得る。加えて、本発明の産物は本質的にとても単純であり（例えば、バクテリアの骨格を有さない）、これは一般的に作業が容易であることを意味する。少なくとも、本発明の産物は目的の遺伝子を含むため、反応体積あたり（または最終産物の質量あたり）より多くの目的の遺伝子のコピーを得ることができる。本明細書に記載された製品の純粋かつ単純な性質は、細胞治療に使用するのに特に適している。例えば、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物およびライブラリーを含む細胞を、患者に注射またはその他の方法で移植し、所望の効果を引き起こすことができる。細胞（または複数の細胞）は、例えば免疫療法の過程で細胞媒介免疫を介して、癌細胞と闘うことができる。細胞（または複数の細胞）は、病変組織を再生するために移植され得る。
【0242】
本発明は、細胞治療に用いるための、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーを提供する。
【0243】
本発明は、細胞治療に使用するために、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。従って、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、細胞治療に使用するために、単一カセットおよび各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエートヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0244】
本発明はまた、細胞治療に使用するために、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供し、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0245】
本発明はまた、細胞治療の実施における直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの使用を提供する。本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、ライブラリー、ウイルスもしくは非ウイルスベクター、または組成物を細胞と接触させることを含む、細胞療法を提供する。好ましくは、細胞療法はエクスビボ細胞療法である。細胞は動物細胞であってもよく、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【0246】
本発明はまた、本明細書に記載の何れかの方法によって得られる細胞を提供する。例えば、細胞は細胞療法に使用するのに適している。
【0247】
ワクチン
本発明の製品は、ワクチン製造に特に適している。ワクチンは、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーを含み得る。あるいは、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーを用いて、ワクチン、好ましくはｍＲＮＡベースのワクチンを製造することもできる。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に対するBioNTechおよびModernaのｍＲＮＡワクチンなどである。
本発明の製品は、ワクチン製造に特に適している。ワクチンは、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーを含み得る。あるいは、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子またはライブラリーを用いて、ワクチン、好ましくはｍＲＮＡベースのワクチンを製造することもできる。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に対するBioNTechおよびModernaのｍＲＮＡワクチンなどである。
【0248】
従って、本発明は、ワクチンの製造における、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの使用を提供する。
【0249】
本発明は、ワクチンの製造における、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供する。本発明は、ワクチンの製造における、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、各鎖の内部位置に、単一カセットおよび１以上の保護されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上の保護されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）は、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0250】
本発明はまた、ワクチンの製造における、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む。
【0251】
好ましくは、ワクチンはｍＲＮＡワクチンである。
【0252】
本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むワクチンを提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）を含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上の保護されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）は、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0253】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むワクチンであって、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ｄ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｅ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｆ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択される、ここで、カセットはコーディング配列を含む、ワクチンを提供する。
（ｄ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｅ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｆ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択される、ここで、カセットはコーディング配列を含む、ワクチンを提供する。
【0254】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は抗原をコードしていてもよく、この抗原は対象に免疫応答を引き起こし得る。対象はヒトであり得る。好ましくは、抗原はカセットにコードされている。
【0255】
ＣＡＲ－Ｔ細胞
本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生における、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの使用を提供する。
本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生における、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーの使用を提供する。
【0256】
本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生産における、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供する。本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生における、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。好ましくは、各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され得る。
【0257】
本発明はまた、ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生における、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用を提供し、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットは、コーディング配列を含む。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットは、コーディング配列を含む。
【0258】
本発明は、（ａ）本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、組成物またはライブラリーをＴ細胞に導入する工程；および、（ｂ）目的の遺伝子を発現させる工程、を含む、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法を提供する。好ましくは、目的の遺伝子は腫瘍特異的ＣＡＲである。
【0259】
本発明は、（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が単一カセットおよび各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエートヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をＴ細胞に導入する工程；および、（ｂ）目的の遺伝子を発現させる工程、を含む、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法を提供する。好ましくは、目的の遺伝子は腫瘍特異的ＣＡＲである。
【0260】
この方法は、工程（ａ）の前に、患者から単核球を除去する工程をさらに含んでいてもよい。好ましくは、除去する工程は、白血球療法を用いて行われる。好ましくは、単核球はＴ細胞である。本方法は、工程（ｂ）の後、遺伝子改変された細胞を患者に戻す工程をさらに含み得る。
【0261】
本発明はまた、本明細書に記載の何れかの方法によって得られる改変されたＴ細胞も提供する。改変されたＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用するのに適し得る。
【0262】
ＣＲＩＳＰＲ送達
本発明の製品は、例えば細胞治療またはインビボ治療において、細胞への送達のためにＣＲＩＳＰＲシステムを使用するのに特に適している。
本発明の製品は、例えば細胞治療またはインビボ治療において、細胞への送達のためにＣＲＩＳＰＲシステムを使用するのに特に適している。
【0263】
ＣＲＩＳＰＲシステムでは、物理的導入法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション）、ウイルス導入法（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；全長アデノウイルスおよびレンチウイルス）、非ウイルス導入法（例えば、リポソーム；ポリプレックス；金粒子）など、様々な異なるカーゴおよび導入ビークルが一般的に使用されている。上記のように、本発明は分散性の低い直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を提供する。従って、直鎖状二本鎖ＤＮＡを含むナノ粒子（またはナノ粒子のライブラリー）、またはウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターは分散性が低く（すなわち均一性が高く）、細胞送達の効率が向上する。
【0264】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＣＲＩＰＳＲシステムの任意の構成要素をコードする遺伝子配列を含んでいてもよい。直鎖の二本鎖ＤＮＡ産物は、ＣＲＩＰＳＲシステムのすべての構成要素をコードしている可能性がある。
【0265】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、修復テンプレート（または、編集テンプレート）を含んでいてもよい（またはコードしていてもよい）。修復テンプレート（または、編集テンプレート）は、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてゲノムを編集するためのものであり得る。修復テンプレート（または、編集テンプレート）は、所望のＤＮＡ領域（すなわち、標的分子）と相同性のある相同性領域（例えば、相同性アーム）を含むか、またはそれらからなる。修復テンプレート（または、編集テンプレート）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを介した相同組換え修復（homology directed repair；ＨＤＲ）に使用するためのものであり得る。修復テンプレート（または、編集テンプレート）は、鎖切断（一本鎖切断または二本鎖切断など）を有する標的分子を修復するために使用され得る。鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１またはＭＡＤ７）によって生じ得る。修復テンプレート（または、編集テンプレート）は、所望のＤＮＡ領域（すなわち、標的分子）に少なくとも１つの変異（例えば、挿入、欠失および／または置換）を導入できる。修復テンプレート（または編集テンプレート）は、少なくとも１０塩基対、２０塩基対、３０塩基対、４０塩基対、５０塩基対、１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１０００塩基対、１５００塩基対、２０００塩基対、２５００塩基対、３０００塩基対、３５００塩基対、４０００塩基対、４５００塩基対、５０００塩基対、５５００塩基対、６０００塩基対、６５００塩基対、７０００塩基対、７５００塩基対、８０００塩基対、８５００塩基対、９０００塩基対、９５００塩基対または１００００塩基対の長さである。修復テンプレートをコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ナノ粒子、非ウイルス性ベクターまたはウイルス性ベクターによって、あるいは何れの担体も介さずに細胞に送達され得る。
【0266】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１またはＭＡＤ７）をコードする遺伝子配列、および／またはガイドＲＮＡを含み得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＭＡＤ７）をコードする遺伝子配列を含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ガイドＲＮＡをコードする遺伝子配列を含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＭＡＤ７）をコードする遺伝子配列、およびガイドＲＮＡを含み得る。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、改変されるゲノム標的をコードする遺伝子配列（例えば、スペーサー）を含んでいてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をベクターにライゲーションすることもできる。ベクターは、ＣＲＩＰＳＲシステムのいくつかの構成要素の配列を含んでいてもよい。ベクターは、ガイドＲＮＡの配列またはガイドＲＮＡの一部の配列を含んでいてもよい。ベクターがガイドＲＮＡの一部の塩基配列を含むとき、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はガイドＲＮＡの欠失した塩基配列部分を含んでいてもよい、ライゲーションにより、ライゲーションされたベクターはガイドＲＮＡの全塩基配列を含む。ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、単一ベクター上にコードされていてもよいか、または２つの異なるベクター上にコードされていてもよい。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードしていてもよい。一方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼをコードし、他方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はガイドＲＮＡをコードしていてもよい。
【0267】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、組換え、相同性指向性修復、または非相同末端結合によるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ仲介修復に使用できる。
【0268】
ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡが異なる直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物によってコードされているとき、それらは異なるまたは同じ送達機構の一部であってもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼをコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、第１のナノ粒子、非ウイルス性ベクターまたはウイルス性ベクターによって細胞に送達され、一方、ガイドＲＮＡをコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、第２のナノ粒子、非ウイルス性ベクターまたはウイルス性ベクターによって細胞に送達され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼをコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物およびガイドＲＮＡをコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、同じナノ粒子、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって細胞に送達され得る。
【0269】
ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡが同じ直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物（または、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を構成するベクター）によってコードされているとき、それらは同じ送達機構の一部であってもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物（または、ベクター）は、ナノ粒子、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって細胞に送達され得る。
【0270】
従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムの細胞への送達に使用するための直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、組成物、ライブラリーまたはナノ粒子を提供する。本発明は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、ライブラリーまたは組成物を細胞に接触させることを含む、ＣＲＩＳＰＲシステムを細胞に送達する方法を提供する。
【0271】
細胞は動物細胞であってもよく、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【0272】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる細胞を提供する。この細胞は、特に細胞療法および／またはインビボ療法に適している。
【0273】
本発明の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子またはライブラリーは、インビトロまたはインビボでＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを産生するために転写に用いられ得る。
【0274】
８．直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法およびそのライブラリー
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーは、何れの増幅プロセスの産物であってもよい。増幅プロセスは、インビトロまたはインビボ増幅プロセスであってもよい。好ましくは、増幅プロセスは、インビトロ増幅プロセスである。例えば、増幅プロセスは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ＭＡＬＢＡＣ法、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）によって実施され得る。好ましくは、増幅プロセスはローリングサークル増幅によって行われる。好ましくは、二本鎖ＤＮＡ産物はローリングサークル増幅の産物である。二本鎖ＤＮＡ産物は、直線的ＲＣＡ（linear RCA）、指数関数的ＲＣＡ（exponential RCA）、またはマルチプライマーＲＣＡによって産生される。ローリングサークル増幅は、プライマーなしで行ってもよいし、プライマーまたは複数のプライマーの存在下で行ってもよい。例えば、プライマーは合成プライマーであってもよい。プライマーはランダムプライマーであってもよい。ローリングサークル増幅は、プライマーゼの存在下で行ってもよい。プリマーゼはTthPrimPolであってもよい。好ましくは、ローリングサークル増幅がプライマーなしで行われるとき、TthPrimPolのようなプライマーゼの存在下で行われる。同様に、増幅反応中にプライマーを用いるとき、プライマーゼは使用しない。二本鎖ＤＮＡ産物は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのような適切な核酸ポリメラーゼを用いて、等温条件下でローリングサークル増幅によりインビトロで生成される。ローリングサークル増幅は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドのような保護されたヌクレオチドの存在下で行うことができる。
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーは、何れの増幅プロセスの産物であってもよい。増幅プロセスは、インビトロまたはインビボ増幅プロセスであってもよい。好ましくは、増幅プロセスは、インビトロ増幅プロセスである。例えば、増幅プロセスは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ＭＡＬＢＡＣ法、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）によって実施され得る。好ましくは、増幅プロセスはローリングサークル増幅によって行われる。好ましくは、二本鎖ＤＮＡ産物はローリングサークル増幅の産物である。二本鎖ＤＮＡ産物は、直線的ＲＣＡ（linear RCA）、指数関数的ＲＣＡ（exponential RCA）、またはマルチプライマーＲＣＡによって産生される。ローリングサークル増幅は、プライマーなしで行ってもよいし、プライマーまたは複数のプライマーの存在下で行ってもよい。例えば、プライマーは合成プライマーであってもよい。プライマーはランダムプライマーであってもよい。ローリングサークル増幅は、プライマーゼの存在下で行ってもよい。プリマーゼはTthPrimPolであってもよい。好ましくは、ローリングサークル増幅がプライマーなしで行われるとき、TthPrimPolのようなプライマーゼの存在下で行われる。同様に、増幅反応中にプライマーを用いるとき、プライマーゼは使用しない。二本鎖ＤＮＡ産物は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのような適切な核酸ポリメラーゼを用いて、等温条件下でローリングサークル増幅によりインビトロで生成される。ローリングサークル増幅は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドのような保護されたヌクレオチドの存在下で行うことができる。
【0275】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、ローリングサークル増幅の産物を切断して、単一の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物中にカセット（目的の遺伝子を含んでいてもよい）の単一コピーのみが存在するようにする方法を見出した。単一のＤＮＡ産物につきカセットが１コピーであるため、既知の増幅産物に比べて多くの利点がある。例えば、１つのＤＮＡ産物につき１コピーのカセットを用いることで、ＤＮＡ産物を可能な限り小さくでき、これは例えば細胞送達方法および／または細胞送達システムの有効性において重要な役割を果たす。
【0276】
本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーは、増幅産物の切断によって作製できる。切断は酵素的切断、例えば、制限酵素消化のようなエンドヌクレアーゼ消化であってもよい。切断後、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一のカセット（例えば、単一のコーディング配列を含むカセット）を含み得る。すなわち、切断後の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、複数のタンデムリピート配列、すなわちコンカテメリックＤＮＡを含まないか、または含んでいてもよい。切断後、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、例えば米国特許ＵＳ１０３５０３０７ Ｂ２に記載のような公知の方法によって産生される連結型ＤＮＡを含むか、またはそれから構成され得る。切断後、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、目的のＤＮＡ配列の単一コピー、例えば、コード配列の単一コピーを含み得る。
【0277】
従って、本発明は、
（ａ）少なくとも１つの切断可能な配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で増幅させ、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素と接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含む、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーの製造方法を提供する。
（ａ）少なくとも１つの切断可能な配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で増幅させ、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素と接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含む、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーの製造方法を提供する。
【0278】
増幅法は、ローリングサークル増幅法を採用できる。従って、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーの製造方法は、
（ａ）少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種の切断可能な配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素と接触させ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
（ａ）少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種の切断可能な配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素と接触させ、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
【0279】
切断可能な配列は、酵素によって切断される配列であってもよい。好ましくは、切断可能な配列は、制限エンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって切断される配列である。本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーの製造方法は、
（ａ）少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅して、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素と接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
（ａ）少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅して、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素と接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
【0280】
好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はエキソヌクレアーゼ消化、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化に耐性である。従って、この方法は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドまたはＭＯＥヌクレオチドのような、エキソヌクレアーゼ消化に対する保護を提供するヌクレオチドを使用できる。従って、本発明は、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーの製造方法であって、
（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅して二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程
を含む方法を提供する。
（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅して二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程
を含む方法を提供する。
【0281】
本明細書に記載の通り、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物はカセットを含んでいてもよい。従って、エキソヌクレアーゼに対する耐性を増大させた直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーをインビトロで生産するための方法は、
（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅し、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程であって、ここで、該二本鎖ＤＮＡ産物は、単一のカセットを含む、工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、単一カセットを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、またはかかる二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを生成する工程
を含み得る。
（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅し、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程であって、ここで、該二本鎖ＤＮＡ産物は、単一のカセットを含む、工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、単一カセットを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、またはかかる二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを生成する工程
を含み得る。
【0282】
本明細書に記載の方法で用いられる全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は、少なくとも０．０００１、少なくとも０．００２５、少なくとも０．０１、少なくとも０．０２５、少なくとも０．０５、少なくとも０．０７５、少なくとも０．１０、少なくとも０．１２、少なくとも０．１５、少なくとも０．２５、少なくとも０．３５、少なくとも０．５、または少なくとも０．７５であり得る。本明細書に記載の方法で用いられる全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比は、１未満、０．９未満、０．８未満、０．６５未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満、０．０７５未満、または０．０５未満であり得る。全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は、０．０００１～１、０．００２５～０．７５、０．０２５～０．６５、０．０２５～０．１５、または０．２５～０．５０の間であってもよい。好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は、０．０２５～０．１５である。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率が、０．００５～０．３、０．００７５～０．２、０．０１～０．１５、０．０１～０．１０、０．０２～０．０８、０．０３～０．０７、０．０４～０．０６または０．０５～０．０７５の間であるホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比は、０．０１～０．１０の間である。好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比は、約０．０２５、約０．０５、約０．０７５、約０．１０、約０．１２、約０．１５または約０．２５である。さらに好ましくは、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は約０．０２５または約０．０５である。実施例に示すように、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比率は約０．０２５で十分であり、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性が増強される。実施例に示されるように、全ヌクレオチドに対するホスホロチオエート化ヌクレオチドの比が約０．０５または約０．０７５であることは、エキソヌクレアーゼ消化に対する増強された耐性を提供するのに特に効果的である（発現レベルによって示される；実施例７および８を参照のこと）。さらに、実施例で示したとおり、約０．０５の比率は、目的遺伝子のインビボ発現に特に適している（実施例１０参照のこと）。
【0283】
本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーの製造方法は、
（ａ）少なくとも１種のＭＯＥヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅して二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がエキソヌクレアーゼに対して増強された耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
（ａ）少なくとも１種のＭＯＥヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅して二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がエキソヌクレアーゼに対して増強された耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
【0284】
エキソヌクレアーゼ消化に対する保護を提供するには、少なくとも１種の保護ヌクレオチドで十分であるが、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドのような、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種の異なるホスホロチオエート化ヌクレオチドのような保護ヌクレオチドを用いてもよい。
【0285】
本明細書に記載の方法において、ＤＮＡテンプレート分子は少なくとも１つの切断可能な配列を含んでいてもよい。切断可能な配列は、エンドヌクレアーゼ標的配列であってもよい。従って、ＤＮＡテンプレート分子は少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ標的配列を含んでいてもよい。好ましくは、ＤＮＡテンプレート分子は少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ標的配列を含む。エンドヌクレアーゼの標的配列は同じであっても、異なっていてもよい。好ましくは、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ標的配列は制限エンドヌクレアーゼ標的配列である。異なる制限エンドヌクレアーゼ標的配列は当業者に公知であり得る。例えば、制限エンドヌクレアーゼ標的配列は、ＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＮｓｉＩおよび／またはＸｂａＩ標的配列であり得る。少なくとも１つの切断可能な配列（例えば、エンドヌクレアーゼ標的配列）は、天然の切断可能な配列（すなわち、テンプレート分子中に存在する切断可能な配列）であってもよい。あるいは、少なくとも１つの切断可能な配列（例えば、エンドヌクレアーゼ標的配列）は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を産生する前にＤＮＡテンプレート分子に導入されてもよい。
【0286】
従って、本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーの製造方法は、
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つの切断可能な配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ標的配列）を導入する工程；
（ｂ）少なくとも１つの切断可能な配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の存在下で増幅（例えば、ローリングサークル増幅）させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）と接触させて、好ましくは直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がヌクレアーゼ(例えば、エキソヌレアーゼＩＩＩ)に対して増強された耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つの切断可能な配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ標的配列）を導入する工程；
（ｂ）少なくとも１つの切断可能な配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）の存在下で増幅（例えば、ローリングサークル増幅）させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程；および
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）と接触させて、好ましくは直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がヌクレアーゼ(例えば、エキソヌレアーゼＩＩＩ)に対して増強された耐性を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程
を含み得る。
【0287】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、切断可能な配列を切断できる酵素は、二本鎖ＤＮＡ産物の切断可能な配列に少なくとも１つの保護されたヌクレオチドが組み込まれていると、切断効率が大幅に低下することを見出した。換言すれば、切断可能な配列の実質的に完全な消化（すなわち、実質的にすべての直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の放出）を達成するために、少なくとも１種の保護されたヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ産物の切断可能な配列に組み込まれてはならない。従って、本発明の方法で用いる少なくとも１種の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）は、切断可能な配列の一部を形成しないように選択される。例えば、ＳｍａＩ制限酵素は切断可能な配列：５’－ＣＣＣＧＧＧ－３’（および、相補配列３’－ＧＧＧＣＣＣ－５’）を認識する。従って、好ましくは、本発明の方法で用いられる少なくとも１種の保護ヌクレオチドは、例えば、α－Ｓ－ｄＡＴＰであり得る。この例では、保護ヌクレオチドとしてα－Ｓ－ｄＡＴＰのみを用いることにより、切断可能な配列が保護されたヌクレオチドを含まないことが保証される。しかしながら、切断可能な配列の種類によっては、少なくとも４種のヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、ＢｓａＩ制限酵素は５’－ＧＧＴＣＴＣ（Ｎ）－３’および相補配列３’－ＣＣＡＧＡＧ（Ｎ）－５’を認識する。本発明の発明者らはさらに、全ヌクレオチドに対する保護ヌクレオチドの比率が０．５未満である限り、何れのタイプの保護ヌクレオチドも使用できることを見出した。好ましくは、用いられる全ヌクレオチドに対する保護された（例えば、ホスホロチオエート化）ヌクレオチドの比率は、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、または０．１未満であり、より好ましくは０．３未満である。
【0288】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を放出できる。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーを生成する工程は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物またはそのライブラリーの少なくとも９０％を放出する。
【0289】
放出された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、好ましくは、単一カセットおよび／または単一の目的の遺伝子を含む。従って、本方法は、
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つの切断可能な配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ標的配列）を導入する工程；
（ｂ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種の切断可能な配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ標的配列）を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程であって、ここで、該二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットを含む、工程；および
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）と接触させて、単一カセットを含む直鎖二本鎖ＤＮＡ産物またはかかる直鎖二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを生成する工程
を含み得る。
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つの切断可能な配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ標的配列）を導入する工程；
（ｂ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種の切断可能な配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ標的配列）を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程であって、ここで、該二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットを含む、工程；および
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つの酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）と接触させて、単一カセットを含む直鎖二本鎖ＤＮＡ産物またはかかる直鎖二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを生成する工程
を含み得る。
【0290】
単一カセットを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を放出できる。好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成するステップは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の少なくとも９０％を放出する。好ましくは、放出された直鎖二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセット（または、目的の遺伝子）を含む。
【0291】
切断後、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーは分散性が低くてもよい（すなわち、実質的に単分散であってもよい）。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物について本明細書で用いる用語“低分散性”および“単分散性”とは、実質的に同じサイズ、すなわちポリヌクレオチド鎖の同じ長さの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のコピーの集合体を包含することを意図する。すなわち、ライブラリー中の各直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、ライブラリー中の他の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、サイズ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の塩基の数）が１０％未満、好ましくは５％未満異なり得る。このことは、サイズが一定しない、すなわちポリヌクレオチド鎖の長さが一定しないＤＮＡ産物のコピーの集まりを意味する、多分散線状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーとは対照的である。
【0292】
本発明の発明者らは、好ましくはエキソヌクレアーゼ消化に耐性である直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の実質的に単分散ライブラリーの製造方法を見出した。本明細書に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーは、実質的に単分散であるため、ナノ粒子およびウイルスまたは非ウイルスベクターの生産に適しているという点で、既知のＤＮＡ産物と比較して利点がある。製造されたナノ粒子、ウイルス性ベクターおよび／または非ウイルス性ベクターは、形質転換および／またはトランスフェクションを容易にする実質的に均一なサイズを有し、内在化および薬物放出プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【0293】
本明細書に記載の方法で用いるＤＮＡテンプレート分子は、一本鎖でも二本鎖でもよい。好ましくは、ＤＮＡテンプレート分子は二本鎖である。ＤＮＡテンプレート分子は天然の環状ＤＮＡ分子であってもよい。例えば、ＤＮＡテンプレート分子は、（ｉ）プラスミド、（ｉｉ）ミニサークル、（ｉｉｉ）コスミド、または（ｉｖ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）であり得る。ＤＮＡテンプレート分子は、酵素的に産生された環状ＤＮＡ分子であってもよい。例えば、ＤＮＡテンプレート分子は、（ｉ）リコンビナーゼ反応、好ましくはＣｒｅリコンビナーゼ反応から得られた環状ＤＮＡ分子、または（ｉｉ）リガーゼ反応、好ましくはゴールデンゲートアセンブリーを用いて得られた環状ＤＮＡ分子であり得る。ＤＮＡテンプレート分子は、酵素的に産生された共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡ分子であってもよい。例えば、ＤＮＡテンプレート分子は、（ｉ）ＴｅｌＮプロテロメラーゼで処理されたＤＮＡ分子、または（ｉｉ）ＤＮＡ末端とアダプターとのライゲーションによって生成されたＤＮＡ分子であり得る。ＤＮＡテンプレート分子は、二本鎖のエレメントおよび一本鎖のエレメントを含んでいてもよい。例えば、テンプレートＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ヘアピンループを含んでいてもよい。
【0294】
ＤＮＡテンプレート分子は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補性である。好ましくは、ＤＮＡテンプレートは直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物と少なくとも９９％相補性である。
【0295】
ＤＮＡテンプレート分子は直鎖状であってもよい。ＤＮＡテンプレート分子が直鎖状であるとき、増幅（例えば、ローリングサークル増幅）の前に、ＤＮＡテンプレート分子を環状化させて、本明細書に記載の方法での使用に適したＤＮＡテンプレート分子を作製してもよい。
【0296】
テンプレートＤＮＡ分子は、カセットを含んでいてもよい。カセットは哺乳動物発現カセットであってもよい。カセットはさらにプロモーターを含んでいてもよい。プロモーターはＣＭＶプロモーターであってもよい。カセットは、エンハンサーをさらに含んでいてもよい。カセットは、ｅＧＦＰレポーター遺伝子またはルシフェラーゼレポーター遺伝子などのレポーター遺伝子をさらに含んでいてもよい。カセットは、ホモポリマー配列をさらに含んでいてもよい。カセットはさらにＬｏｘＰ配列、好ましくは２つのＬｏｘＰ配列を含んでいてもよい。
【0297】
ＤＮＡテンプレート分子は、５’末端もしくは３’末端、または５’末端および３’
末端の両方にホモポリマー配列を含んでいてもよい。ホモポリマー配列は、環状化の前にＤＮＡテンプレート分子に付加できる。ホモポリマー配列は、ｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙＣ、ｐｏｌｙＧ、またはｐｏｌｙＴ配列であってもよい。ホモポリマー配列の長さは３～２００ヌクレオチドである。ホモポリマー配列は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の精製を容易にするために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは４－１２ヌクレオチドの間、または５－１０ヌクレオチドの間であってもよい。ホモポリマー配列はｍＲＮＡの発現を改善するために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは１０－２００ヌクレオチドの間、好ましくは８０－１５０ヌクレオチドの間であってもよい。ホモポリマー配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチドまたは２００ヌクレオチドである。好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。さらに好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。例えば、ホモポリマー配列は、少なくとも１２０ヌクレオチドのポリＡ配列を含み得る。
末端の両方にホモポリマー配列を含んでいてもよい。ホモポリマー配列は、環状化の前にＤＮＡテンプレート分子に付加できる。ホモポリマー配列は、ｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙＣ、ｐｏｌｙＧ、またはｐｏｌｙＴ配列であってもよい。ホモポリマー配列の長さは３～２００ヌクレオチドである。ホモポリマー配列は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の精製を容易にするために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは４－１２ヌクレオチドの間、または５－１０ヌクレオチドの間であってもよい。ホモポリマー配列はｍＲＮＡの発現を改善するために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは１０－２００ヌクレオチドの間、好ましくは８０－１５０ヌクレオチドの間であってもよい。ホモポリマー配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチドまたは２００ヌクレオチドである。好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。さらに好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。例えば、ホモポリマー配列は、少なくとも１２０ヌクレオチドのポリＡ配列を含み得る。
【0298】
本明細書に記載の方法において、用いられる保護ヌクレオチドのタイプ（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）は、ＤＮＡテンプレート分子のホモポリマー配列の少なくとも１つのヌクレオチドに相補的であっても、または同一であってもよい。好ましくは、保護されたヌクレオチドはホモポリマー配列のヌクレオチドと相補的である。例えば、ホモポリマー配列がｐｏｌｙＡ配列であるとき、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエート化ヌクレオチドはα－Ｓ－ｄＴＴＰであってもよい。ホモポリマー配列がポリＣ配列であるとき、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエート化ヌクレオチドはα－Ｓ－ｄＧＴＰであり得る。ホモポリマー配列がポリＧ配列であるとき、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエート化ヌクレオチドは、α－Ｓ－ｄＣＴＰであってもよい。ホモポリマー配列がポリＴ配列であるとき、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエート化ヌクレオチドは、α－Ｓ－ｄＡＴＰであってもよい。本明細書に記載の方法は、単一の反応において異なるタイプの保護されたヌクレオチドを使用できる。従って、例えば、ホモポリマー配列はｐｏｌｙＡ配列であるが、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるタイプの保護されたヌクレオチドが本方法において用いられ得る。好ましくは、α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰ、およびα－Ｓ－ｄＴＴＰの４つすべてがこの方法で用いられる。
【0299】
ＤＮＡテンプレートは、２つの異なるホモポリマー配列を含み得る。例えば、ＤＮＡテンプレートを環状化する前に、ＤＮＡテンプレートは鎖の各末端に異なるホモポリマー配列を含んでいてもよい。例えば、ＤＮＡテンプレートの３’末端はポリＡ配列を含み、ＤＮＡテンプレートの５’末端はポリＴ配列を含んでいてもよい。
【0300】
本明細書に記載の通り、本明細書に記載の方法によって生成される直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、単一カセットおよび各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含んでいてもよく、ここで、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドは、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１つ以上のヌクレオチド
から選択される。
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１つ以上のヌクレオチド
から選択される。
【0301】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、本明細書で提供される方法のいずれかによって得ることができる。
【0302】
本発明は、末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、またはそのような直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを製造する方法を提供する。この方法は、
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つのホモポリマー配列を付加する工程、
（ｂ）少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ標的配列および少なくとも１つのホモポリマー配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、および
（ｄ）直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をエキソヌクレアーゼと接触させて、末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、またはそのような直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを生成する工程
を含む。
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つのホモポリマー配列を付加する工程、
（ｂ）少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ標的配列および少なくとも１つのホモポリマー配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、および
（ｄ）直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をエキソヌクレアーゼと接触させて、末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、またはそのような直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを生成する工程
を含む。
【0303】
本明細書に記載のＤＮＡテンプレート分子はいずれも、末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を製造する方法での使用に適している。
【0304】
ＤＮＡテンプレート分子への少なくとも１つのホモポリマー配列の付加は、ＤＮＡテンプレート分子が環状化される前に行われてもよい。好ましくは、２つのホモポリマー配列がＤＮＡテンプレート分子に付加される。２つのホモポリマー配列は異なっていても同じでもよい。ホモポリマー配列は、ＤＮＡテンプレート分子の５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に付加できる。ホモポリマー配列は、ｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙＣ、ｐｏｌｙＧ、またはｐｏｌｙＴ配列であってもよい。例えば、ＤＮＡテンプレートを環状化する前に、２つの異なるホモポリマー配列をＤＮＡテンプレート分子に付加できる。例えば、ＤＮＡテンプレートの３’末端にポリＣ配列を付加し、ＤＮＡテンプレート分子の５’末端にポリＧ配列を付加できる。
【0305】
ホモポリマー配列の長さは３～２００ヌクレオチドである。ホモポリマー配列は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の精製を容易にするために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは４－１２ヌクレオチドの間、または５－１０ヌクレオチドの間であってもよい。ホモポリマー配列はｍＲＮＡの発現を改善するために用いてもよく、その場合、ホモポリマー配列の長さは１０－２００ヌクレオチドの間、好ましくは８０－１５０ヌクレオチドの間であってもよい。ホモポリマー配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチドまたは２００ヌクレオチドであり得る。好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。さらに好ましくは、ホモポリマー配列の長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。例えば、ホモポリマー配列は、少なくとも１２０ヌクレオチドのポリＡ配列を含み得る。
【0306】
ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つのホモポリマー配列を付加する工程は、当技術分野で知られている何れかの従来の方法によって行うことができる。例えば、ＤＮＡリガーゼ酵素を用いてホモポリマー配列をＤＮＡテンプレート分子にライゲーションできる。ホモポリマー配列は、制限酵素を用いてＤＮＡテンプレート分子に結合させることができる。ホモポリマー配列は、何れかの合成生物学的方法、例えば逐次ハイブリダイゼーションアセンブリング（ＳＨＡ）を用いてＤＮＡテンプレート分子に結合させることができる。
【0307】
好ましくは、増幅はローリングサークル増幅である。ローリングサークル増幅には通常、環状型のテンプレート分子が必要である。従って、ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つのホモポリマー配列を付加する工程の後、この方法はＤＮＡテンプレート分子を環状化する工程をさらに含んでいてもよい。環状化は、当技術分野で知られている何れかの方法で行うことができる。例えば、環状ＤＮＡテンプレート分子は、リコンビナーゼ反応、好ましくはＣｒｅリコンビナーゼ反応、またはリガーゼ反応、好ましくはゴールデンゲートアセンブリーを用いて得ることができる。環状ＤＮＡテンプレート分子は、直鎖状ＤＮＡ分子を共有結合で閉じることによって得ることができる。例えば、ＤＮＡテンプレート分子は、ＴｅｌＮプロテロメラーゼで処理されたＤＮＡ分子、あるいはＤＮＡ末端とアダプターとのライゲーションによって生成されたＤＮＡ分子であってもよい。
【0308】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をエキソヌクレアーゼと接触させて、末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程では、エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用できる。エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の５’末端または３’末端のいずれかから、保護されていないヌクレオチドを切断する。従って、エキソヌクレアーゼは、鎖中の保護されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）に遭遇する時点まで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を消化できる。エキソヌクレアーゼは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の末端がさらなるエキソヌクレアーゼ消化、好ましくはエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化から保護された時点で、反応から除去できる。従って、この方法は、エキソヌクレアーゼを除去するさらなる工程を含んでいてもよい。
【0309】
好ましくは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、少なくとも一方の鎖、好ましくは両方の鎖の内部位置に１以上の保護ヌクレオチドをさらに含む。
【0310】
用いられる少なくとも１種の保護ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート化ヌクレオチド）は、ＤＮＡテンプレート分子のホモポリマー配列の少なくとも１種のヌクレオチドと相補性であっても、同一であってもよい。好ましくは、保護されたヌクレオチドはホモポリマー配列のヌクレオチドと相補性である。好ましくは、保護されたヌクレオチドはホスホロチオエート化ヌクレオチドである。例えば、ホモポリマー配列がｐｏｌｙＡ配列である場合、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエート化ヌクレオチドはα－Ｓ－ｄＴＴＰであり得る。ホモポリマー配列がポリＣ配列である場合、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエートヌクレオチドはα－Ｓ－ｄＧＴＰであり得る。ホモポリマー配列がポリＧ配列である場合、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエートヌクレオチドは、α－Ｓ－ｄＣＴＰであり得る。ホモポリマー配列がポリＴ配列である場合、本方法で用いられ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ産物に組み込まれるホスホロチオエートヌクレオチドは、α－Ｓ－ｄＡＴＰであり得る。この方法では、１回の反応で異なるタイプの保護されたヌクレオチドを使用できる。従って、例えば、ホモポリマー配列はｐｏｌｙＡ配列であるが、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるタイプの保護されたヌクレオチドがこの方法において使用され得る。好ましくは、α－Ｓ－ｄＡＴＰ、α－Ｓ－ｄＣＴＰ、α－Ｓ－ｄＧＴＰ、およびα－Ｓ－ｄＴＴＰの４つすべてがこの方法で使用される。
【0311】
ホモポリマー配列をテンプレートＤＮＡ分子に付加することで、ＤＮＡ産物の相補鎖に保護されたヌクレオチドが１つ付加されることになる。例えば、ポリＴ配列がテンプレートＤＮＡ分子に組み込まれ、すべてのｄＡＴＰが保護されたα－Ｓ－ｄＡＴＰで置換され、増幅中に用いられるとき、得られる産物は保護されたポリ－α－Ｓ－ｄＡＴＰ末端を含み得る。同様に、８ヌクレオチドのポリＡ配列がテンプレートＤＮＡ分子に組み込まれ、全ｄＴＴＰの２５％が保護されたα－Ｓ－ｄＴＴＰで置換され、増幅中に用いられるとき、得られる産物は、ＤＮＡ産物の末端領域に平均して２つのα－Ｓ－ｄＴＴＰを含み得る。
【0312】
ＤＮＡ産物の５’－末端の保護は、本明細書に記載の何れかの方法によって達成できる。同様に、ＤＮＡ産物の３’－末端の保護は、本明細書に記載の方法によって達成できる。しかしながら、３’末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を製造する方法は、テンプレートＤＮＡ分子にホモポリマー配列を組み込むことを必要としない。例えば、ＤＮＡテンプレート分子の増幅は、二本鎖ＤＮＡ産物を生成するために、保護ヌクレオチドの不存在下で実施できる。二本鎖ＤＮＡ産物を消化して、目的のＤＮＡカセットの単一ユニットを作製することもできる。ＤＮＡカセットは、３’末端に保護ヌクレオチドを組み込むように酵素的に修飾できる。
【0313】
従って、一例において、本方法は、（１）３’劣性末端を生成する制限酵素による二本鎖ＤＮＡ産物の消化、および（２）保護されたヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント）によって３’陥凹末端（recessive end）に組み込み、保護された３’末端を有する二本鎖ＤＮＡ産物を生成すること、を含み得る。
【0314】
別の例では、この方法は、（１）二本鎖ＤＮＡ産物を制限酵素で消化し、平滑末端を生成すること、および（２）保護されたヌクレオチドを用いて、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）により３’平滑末端を伸長すること、を含み得る。
【0315】
末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物のライブラリーを作製する方法は、本明細書に記載の方法の組み合わせに依拠し得る。例えば、５’末端の保護は、テンプレート分子中のホモポリマー配列を用いることにより達成され、一方、３’末端の保護は、ＤＮＡポリメラーゼにより（制限酵素消化後）保護されたヌクレオチドを３’陥凹末端に組み込むことにより達成され得る。
【0316】
直鎖状ＤＮＡを生産するための従来の細胞ベースの方法は、コストが高く、発酵槽で無菌条件下で培養された大量の細菌培養物を使用する必要があるため、かなりの生産拠点を有する。増幅されたＤＮＡをバクテリアから得るには細胞溶解が必要であり、哺乳動物細胞にとって有毒なエンドトキシンを放出する。そのため、特に治療薬として用いるときには、ＤＮＡ産物を精製してこれらの細菌汚染物質を除去しなければならない。宿主細菌細胞の複雑な生化学的環境は、ＤＮＡの収量および品質にばらつきがあるなど、バッチ間の再現性の問題につながり得る。従って、本発明は、ヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼ消化）に対する耐性が改善された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を製造する改善された方法を提供する。記載された製造工程は無細胞であってもよく、工程に時間がかからず、かつ経済的である。
【図面の簡単な説明】
【0317】
図面の簡単な説明
本発明は、そのさらなる目的および利点とともに、添付の図面を以下の説明とともに参照することにより最もよく理解され得る。
本発明は、そのさらなる目的および利点とともに、添付の図面を以下の説明とともに参照することにより最もよく理解され得る。
【図1】図１は、２’－デオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）およびホスホロチオ化ヌクレオチド（２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸；またはα－Ｓ－ｄＮＴＰ）の異なる組み合わせの存在下でのＰｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ重合活性を示す。試験したＰｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌの２つの型（野生型およびＱｕａｌｉＰｈｉキメラ）は、提供されたテンプレート（配列番号３）に従って、デオキシヌクレオチドを重合することにより、プライマー分子（配列番号２）を異なる効率で伸長した。条件：２．５ｎＭ ＤＮＡ、３０ｎＭ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ ｄＮＴＰ、３０℃で５分間。
【図2】図２は、ローリングサークル増幅を用いた直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の例示的な製造方法を示す。目的のＤＮＡを同じ方向に挟む２つのＬｏｘＰ配列（配列番号４）を含む基質上のＣｒｅ組換え酵素の作用により生成された環状ＤＮＡテンプレートのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）中に、２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸を付加することにより、保護された直鎖状ＤＮＡ分子を得るワークフロー。Ｃｒｅ反応条件：反応量５０μｌ、制限酵素消化後アガロースゲル電気泳動で精製した目的ＤＮＡ（１００ｎｇ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＮＥＢ、４ユニット）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分、８０℃で２０分。次いで、増幅工程の前に残存する非環状ＤＮＡ分子を除去するため、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ、２０ユニット）およびＩＩＩ（ＮＥＢ、１００ユニット）を添加し、３７℃で３０分、８０℃で２０分反応させた。増幅の前に、まず２．５μｌの緩衝液Ｄ（４００ｍＭ ＫＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、室温で３分間インキュベートすることにより、環状化ＤＮＡサンプルを変性させた。その後、２．５μｌの緩衝液Ｎ（４００ｍＭ ＨＣｌ、６００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５）を加えてサンプルを中和した。ローリングサークル増幅条件５０μｌの反応液、５μｌのＴｒｕｅＰｒｉｍｅ ＷＧＡ反応バッファー１０ｘ（4basebio）、７．５μｌの変性ＤＮＡサンプル、５μｌのＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ（１μＭ）または５μｌのランダム合成ヘキサマー（５００μＭ）、０．８μｌ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ（１２，５μＭ）、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸を各場合に指示した割合で添加。培養時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【図3】図３は、本明細書に記載の方法で用いられる例示的なテンプレートＤＮＡ分子を示す。哺乳動物発現カセットは、ＣＭＶプロモーター（配列番号５）およびエンハンサー（配列番号６）、ｅＧＦＰレポーター遺伝子（配列番号７）およびＳＶ４０ポリＡシグナル（配列番号８）によって形成される。発現カセットは、同じ向きを有する２つのＬｏｘＰ配列（配列番号４）に隣接している。
【図4】図４は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下および不存在下での増幅収率を示す。具体的には、この図は、保護されていない２’－デオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）を２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸（ｄＮＴＰ＊Ｓ）で置換したＣｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅収率のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【図5】図５は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下および不存在下での増幅収率を示す。具体的には、この図は、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅収率を、非相補的な対の天然の保護されていない２’－デオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）をホスホロチオエート化した対応物に置き換えたピコグリーンで定量したものである。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【図6】図６は、ランダムプライマーで得られた増幅ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（０．８％）による消化分析を示す。増幅されたＤＮＡを、発現カセットに１つの制限部位しかない幾つかの制限酵素（すなわち、ＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＳｍａＩおよびＸｂａＩ）で消化した。従って、カセットの長さ（約２ｋｂ）を反映した単一のバンドがゲル中に見られるはずである。消化条件：反応液量２５μｌ、２．５μｌ反応バッファーＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、４００ｎｇ ＤＮＡ、２０ユニット ＢｓａＩ－ＨＦｖ２（ＮＥＢ）、２０ユニット ＮｄｅＩ（ＮＥＢ）、２０ユニット ＳｍａＩ（ＮＥＢ）、２０ユニット ＸｂａＩ（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：２５℃（ＳｍａＩ）または３７℃（ＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ）で６０分（ＢｓａＩ）または１５分（ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ）。
【図7】図７は、異なる割合の非修飾ヌクレオチドおよびホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下での増幅収率を示す。具体的には、この図は、４つのヌクレオチドのそれぞれについて、修飾されていない２’－デオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）および保護された２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸（ｄＮＴＰ＊Ｓ）の異なる割合を用いて、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅収率のピコグリーン定量を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【0318】
【図8】図８（図８Ａおよび８Ｂ）は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌと異なる割合の天然ヌクレオチドおよび保護ヌクレオチドを用いて得られた増幅ＤＮＡの、アガロースゲル電気泳動（０．８％）による消化分析を示す。増幅されたＤＮＡを、発現カセットに１つの制限部位しかない幾つかの制限酵素（すなわち、ＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＳｍａＩおよびＸｂａＩ）で消化した。従って、カセットの長さ（約２ｋｂ）を反映した単一のバンドがゲル中に見られるはずである。消化条件：反応液量２５μｌ、２．５μｌ反応バッファーＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、４００ｎｇ ＤＮＡ、２０ユニットＢｓａＩ－ＨＦｖ２（ＮＥＢ）、２０ユニットＮｄｅＩ（ＮＥＢ）、２０ユニットＳｍａＩ（ＮＥＢ）、２０ユニットＸｂａＩ（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：２５℃（ＳｍａＩ）または３７℃（ＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ）で６０分（ＢｓａＩ）または１５分（ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ）。
【図9】図９は、未修飾ヌクレオチドおよび保護ヌクレオチドの割合が異なる増幅および消化ＤＮＡからの大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩの作用に対する保護分析を示す。最初に、増幅したＤＮＡをＢｓａＩで消化した。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）とさらにインキュベートし、保護されていないＤＮＡ対照で観察されたように、ＤＮＡ分解を促進した。エキソヌクレアーゼのインキュベーション時間および温度：３７℃で３０分、８０℃で２０分。
【図10】図１０（図１０Ａ－Ｄ）は、高レベルのホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下での増幅収率を示している。具体的には、この図は、４つのヌクレオチドそれぞれについて５０％から１００％の範囲のｄＮＴＰ＊Ｓ濃度を用いて、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅収率のＰｉｃｏｇｒｅｅｎ定量を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【図11】図１１は、ホスホロチオエート化ヌクレオチド（ｄＮＴＰ＊Ｓ）濃度が５０％から１００％の範囲で得られた増幅ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動による消化分析を示す。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。
【図12】図１２は、ホスホロチオエート化ヌクレオチド（ｄＡＴＰ＊ＳおよびｄＣＴＰ＊Ｓ）濃度が５０％から１００％の範囲で得られた増幅されたＤＮＡおよび消化されたＤＮＡからの大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウシＤＮＡｓｅ Ｉの作用に対する保護分析を示す。最初に、増幅したＤＮＡをＢｓａＩで消化した。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡを、５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）またはウシＤＮＡｓｅ Ｉ（０．００２５ユニット、Ａｍｂｉｏｎ）とインキュベートした。培養時間と温度３７℃で３０分。
【図13】図１３は、ホスホロチオエート化ヌクレオチド（ｄＧＴＰ＊ＳおよびｄＴＴＰ＊Ｓ）濃度が５０％から１００％の範囲で得られた増幅および消化ＤＮＡからの大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウシＤＮＡｓｅ Ｉの作用に対する保護分析を示す。最初に、増幅したＤＮＡをＢｓａＩで消化した。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡを、５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）またはウシＤＮＡｓｅ Ｉ（０．００２５ユニット、Ａｍｂｉｏｎ）と共にインキュベートした。培養時間および温度：３７℃で３０分。
【図14】図１４は、等モルレベルのホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下での増幅収率を示す。具体的には、この図は、２．５％から５０％の範囲の濃度の４つのｄＮＴＰ＊Ｓの等モル混合物を用いた、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅収率のＰｉｃｏｇｒｅｅｎ定量を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【図15】図１５は、２．５％から５０％の範囲の濃度の４つのｄＮＴＰ＊Ｓの等モル混合物で得られた増幅および消化されたＤＮＡからの大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウシＤＮＡｓｅ Ｉの作用に対する保護分析を示す。最初に、増幅したＤＮＡをＢｓａＩで消化した。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡを、５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）またはウシＤＮＡｓｅ Ｉ（０．００２５ユニット、Ambion）と共にインキュベートした。培養時間および温度：３７℃で３０分。
【図16】図１６は、本明細書に記載の方法で用いる例示的なテンプレートＤＮＡ分子を示す。プラスミドＤＮＡを構成する要素を基質として用いて、保護された２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸を含むＤＮＡがインビトロで転写されることを評価した。発現カセットは、Ｔ７プロモーター（配列番号９）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子（配列番号１０）によって形成される。発現カセットはＮｓｉＩ制限部位に隣接している。
【図17】図１７は、異なる割合のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下での増幅収率を示す。具体的には、この図は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰについて、修飾されていない２’－デオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）および保護された２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸（ｄＮＴＰ＊Ｓ）の異なる割合を用いて、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅収率のピコグリーン定量を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【0319】
【図18】図１８は、アガロースゲル電気泳動（０．８％）による増幅ＤＮＡの消化分析を示す。増幅されたＤＮＡを、発現カセットに隣接する２つの制限部位を有するＮｓｉＩで消化した。目的のフラグメント（１．７ｋｂ）に対応する単一のバンドは、２回目の消化が必要な５０％ｄＡＴＰ＊Ｓ（パートＢ）を除けば、すべての場合（パートＡ）で観察された。消化条件：反応液量５００μｌ、反応バッファー５０μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ５０μｇ、ＮｓｉＩ ３１２ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で６０分、８０℃で２０分。
【図19】図１９は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写で生成したｍＲＮＡ、および生成したＤＮＡ産物のＱｕｂｉｔ定量を示す（図１７および図１８参照）。反応条件：反応液量２０μｌ、２μｌ反応バッファー Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌ 反応緩衝液１０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ１μｇ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ１００（ＮＥＢ）、２ｍＭ ＮＴＰ、インキュベーション時間および温度：３７℃で１２０分間。その後、ＤＮＡｓｅ Ｉ（４Ｕ、Ambion）を加えてテンプレートＤＮＡを除去し、３７℃で１５分間インキュベートした。
【図20】図２０は、様々なレベルのホスホロチオエート化を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡをカプセル化したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現および中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＧＦＰ発現はトランスフェクション後４８時間、７２時間、９６時間で測定した。すべての実験で、ｎ＝３、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．。
【図21】図２１は、市販のトランスフェクション試薬ＰｏｌｙＰｌｕｓ－ｊｅｔＯＰＴＩＭＵＳでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞でのＧＦＰ発現を示しており、様々なレベルのホスホロチオエート化－２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％のｄＮＴＰαＳでＤＮＡを封入している。ＧＦＰ発現はトランスフェクション後４８時間で測定した。すべての実験で、ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ。
【図22】図２２は、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す。ルシフェラーゼ発現はトランスフェクション後４８時間で測定した。すべての実験でｎ＝３。
【図23】図２３は、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした、様々なＤＮＡテンプレート由来のｍＲＮＡサンプルのタンパク質ｍｇあたりのルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示す。具体的には、この図はホスホロチオエート化ヌクレオチドを０％から５０％含むＤＮＡテンプレートをインビトロ転写テンプレートとして用いた場合の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0320】
本明細書で定義される各局面または各態様は、明確に否定されない限り、他の局面（複数可）または態様（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された何れかの特徴は、好ましいまたは有利であると示された他の特徴（複数可）と組み合わせることができる。
【0321】
上記の詳細な説明は、説明および例示のために提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に例示した現在好ましい態様における多くの変形は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内であり得る。
【0322】
本発明はさらに以下の項に記載される：
保護ヌクレオチドを含む製品
１．センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
２．単一カセットをさらに含む、項１に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
３．単一カセットがコーディング配列を含む、項１または２に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４．カセットがプロモーターおよびコーディング配列を含む、項１から３のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
５．カセットが、プロモーター、コーディング配列、リボソーム結合部位および翻訳終結配列を含む、項１から４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
６．カセットが哺乳動物発現カセットである、項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
７．カセットが目的の遺伝子の単一コピーを含む、項１から６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
８．カセットが目的の遺伝子の単一コピーを含む、項１から７のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
９．各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側のヌクレオチド
から選択され得る、項２から８のいずれか一項に記載の直鎖二本鎖ＤＮＡ産物。
１０．各鎖の内部位置に少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、項２から９のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、各鎖の内部位置の少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択される、直鎖二本鎖ＤＮＡ産物。
１１．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり；そして／または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうち１つは、センス鎖の第１の領域にあり、ここで、センス鎖の第１の領域はカセットの５’である、
項１０に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
１２．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり；そして／または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、ここで、センス鎖の第２の領域はカセットの３’である、
項１０または１１に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
１３．（ａ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１の領域にあり、ここで、センス鎖の第１の領域は、カセットの５’であり；
（ｂ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、ここで、センス鎖の第２の領域は、カセットの３’であり；
（ｃ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第１の領域は、カセットの５’であり；ならびに、
（ｄ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第２の領域は、カセットの３’である
項１０に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
保護ヌクレオチドを含む製品
１．センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、各鎖の内部位置に１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
２．単一カセットをさらに含む、項１に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
３．単一カセットがコーディング配列を含む、項１または２に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４．カセットがプロモーターおよびコーディング配列を含む、項１から３のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
５．カセットが、プロモーター、コーディング配列、リボソーム結合部位および翻訳終結配列を含む、項１から４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
６．カセットが哺乳動物発現カセットである、項１から５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
７．カセットが目的の遺伝子の単一コピーを含む、項１から６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
８．カセットが目的の遺伝子の単一コピーを含む、項１から７のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
９．各鎖の内部位置にある１以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側のヌクレオチド
から選択され得る、項２から８のいずれか一項に記載の直鎖二本鎖ＤＮＡ産物。
１０．各鎖の内部位置に少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、項２から９のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、各鎖の内部位置の少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択される、直鎖二本鎖ＤＮＡ産物。
１１．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり；そして／または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうち１つは、センス鎖の第１の領域にあり、ここで、センス鎖の第１の領域はカセットの５’である、
項１０に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
１２．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり；そして／または、
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、ここで、センス鎖の第２の領域はカセットの３’である、
項１０または１１に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
１３．（ａ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１の領域にあり、ここで、センス鎖の第１の領域は、カセットの５’であり；
（ｂ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、ここで、センス鎖の第２の領域は、カセットの３’であり；
（ｃ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第１の領域は、カセットの５’であり；ならびに、
（ｄ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第２の領域は、カセットの３’である
項１０に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
【0323】
１４．直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がオーバーハングを含み、要すれば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、
（ａ）５’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｂ）２つの５’オーバーハング；
（ｃ）３’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｄ）２つの３’オーバーハング；および／または
（ｅ）５’オーバーハングおよび３’オーバーハング
を含んでいてもよい、項１から１３のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
１５．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物および機能性部分を含む複合体分子であって、要すれば、該機能性部分が結合分子またはプローブである、複合体分子。
１６．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または項１５に記載の複合体分子を含む、ナノ粒子。
１７．少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーであって、各二本鎖ＤＮＡ産物が、項１から１４のいずれか一項に定義される通りである、ライブラリー。
１８．少なくとも２つの複合体分子を含むライブラリーであって、各複合体分子が項１５項に定義される通りである、ライブラリー。
１９．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子または項１７もしくは１８に記載のライブラリーを含む、組成物。
２０．項１９に記載の組成物および薬学的に許容される希釈剤を含む、医薬組成物。
２１．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子または項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物を含む、細胞。
（ａ）５’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｂ）２つの５’オーバーハング；
（ｃ）３’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｄ）２つの３’オーバーハング；および／または
（ｅ）５’オーバーハングおよび３’オーバーハング
を含んでいてもよい、項１から１３のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
１５．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物および機能性部分を含む複合体分子であって、要すれば、該機能性部分が結合分子またはプローブである、複合体分子。
１６．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または項１５に記載の複合体分子を含む、ナノ粒子。
１７．少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーであって、各二本鎖ＤＮＡ産物が、項１から１４のいずれか一項に定義される通りである、ライブラリー。
１８．少なくとも２つの複合体分子を含むライブラリーであって、各複合体分子が項１５項に定義される通りである、ライブラリー。
１９．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子または項１７もしくは１８に記載のライブラリーを含む、組成物。
２０．項１９に記載の組成物および薬学的に許容される希釈剤を含む、医薬組成物。
２１．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子または項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物を含む、細胞。
【0324】
保護ヌクレオチドを含む生成物の使用
２２．治療に用いるための、項１～１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物。
２３．ＲＮＡの産生における、項１～１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２４．ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡである、項２２に記載の使用。
２５．ナノ粒子の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２６．ワクチンの製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２７．ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２８．非ウイルス送達系の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２９．ウイルス送達システムの製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
３０．ウイルス送達系がウイルスベクター、要すればＡＶＶベクターまたはレンチウイルスベクターである、項２８の使用。
３１．非ウイルス送達系の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
３２．ＣＲＩＳＰＲ送達系の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
３３．細胞治療に用いるための、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物。
３４．遺伝子治療に用いるための、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物。
２２．治療に用いるための、項１～１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物。
２３．ＲＮＡの産生における、項１～１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２４．ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡである、項２２に記載の使用。
２５．ナノ粒子の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２６．ワクチンの製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２７．ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２８．非ウイルス送達系の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
２９．ウイルス送達システムの製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
３０．ウイルス送達系がウイルスベクター、要すればＡＶＶベクターまたはレンチウイルスベクターである、項２８の使用。
３１．非ウイルス送達系の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
３２．ＣＲＩＳＰＲ送達系の製造における、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物の使用。
３３．細胞治療に用いるための、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物。
３４．遺伝子治療に用いるための、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物。
【0325】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の使用方法
３５．（ａ）項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を生産する工程
を含む、インビトロ転写のための方法。
３６．（ａ）項１５に記載の複合体分子をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を生産する工程
を含む、インビトロ転写のための方法。
３７．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を、原核細胞、真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入して、所望のＲＮＡまたはタンパク質を生成する工程を含む、タンパク質の発現方法。
３８．項１５に記載の複合体分子を、原核細胞、真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入し、所望のＲＮＡまたはタンパク質を産生する工程を含む、タンパク質の発現方法。
３９．トランスフェクションされる細胞を、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物と接触させることを含む、細胞トランスフェクション方法であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、ライブラリー、組成物または医薬組成物が細胞の細胞質にトランスフェクトされる、細胞トランスフェクション方法。
３５．（ａ）項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を生産する工程
を含む、インビトロ転写のための方法。
３６．（ａ）項１５に記載の複合体分子をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を生産する工程
を含む、インビトロ転写のための方法。
３７．項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を、原核細胞、真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入して、所望のＲＮＡまたはタンパク質を生成する工程を含む、タンパク質の発現方法。
３８．項１５に記載の複合体分子を、原核細胞、真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入し、所望のＲＮＡまたはタンパク質を産生する工程を含む、タンパク質の発現方法。
３９．トランスフェクションされる細胞を、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項１５に記載の複合体分子、項１６に記載のナノ粒子、項１７もしくは１８に記載のライブラリー、項１９に記載の組成物、または項２０に記載の医薬組成物と接触させることを含む、細胞トランスフェクション方法であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、複合体分子、ナノ粒子、ライブラリー、組成物または医薬組成物が細胞の細胞質にトランスフェクトされる、細胞トランスフェクション方法。
【0326】
直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法
４０．（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程であって、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、エキソヌクレアーゼに対して増大した耐性を有する、工程
を含む、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法。
４１．末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を製造する方法であって、
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つのホモポリマー配列を付加する工程、
（ｂ）少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ標的配列および少なくとも１つのホモポリマー配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、および
（ｄ）直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をエキソヌクレアーゼと接触させ、末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程
を含む、製造方法。
４０．（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程であって、ここで、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、エキソヌクレアーゼに対して増大した耐性を有する、工程
を含む、項１から１４のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法。
４１．末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を製造する方法であって、
（ａ）ＤＮＡテンプレート分子に少なくとも１つのホモポリマー配列を付加する工程、
（ｂ）少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ標的配列および少なくとも１つのホモポリマー配列を含むＤＮＡテンプレート分子を、少なくとも１種の保護ヌクレオチドの存在下で増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、および
（ｄ）直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をエキソヌクレアーゼと接触させ、末端が保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程
を含む、製造方法。
【0327】
さらなる製品、方法、用途
４２．センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置に少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４３．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり；そして／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドの１つは、センス鎖の第１の領域にあり、センス鎖の第１の領域はカセットの５’である、
項４２に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４４．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり；そして／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、センス鎖の第２の領域はカセットの３’である、
項４２または４３に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４５．（ａ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１の領域にあり、ここで、センス鎖の第１の領域は、カセットの５’である；
（ｂ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、ここで、センス鎖の第２の領域は、カセットの３’である；
（ｃ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第１の領域は、カセットの５’である；および、
（ｄ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第２の領域は、カセットの３’である、
項４２に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４６．直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がオーバーハングを含み、要すれば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、
（ａ）５’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｂ）２つの５’オーバーハング；
（ｃ）３’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｄ）２つの３’オーバーハング；および／または
（ｅ）５’オーバーハングおよび３’オーバーハング
を含んでいてもよい、項４２から４５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４７．項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物および機能性部分を含む複合体分子であって、要すれば、機能性部分が結合分子またはプローブであってもよい、複合体分子。
４８．項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または項４７に記載の複合体分子を含む、ナノ粒子。
４９．少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーであって、各二本鎖ＤＮＡ産物が項４２から４６のいずれか一項に定義されるものである、ライブラリー。
５０．治療に使用するための、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項４７に記載の複合体分子、項４８に記載のナノ粒子または項４９に記載のライブラリー。
５１．ＲＮＡの産生における、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項４７に記載の複合体分子、項４８に記載のナノ粒子、または項４９に記載のライブラリーの使用であって、要すれば、ＲＮＡがｍＲＮＡであってもよい、使用。
５２．ナノ粒子の製造における、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項４７に記載の複合体分子、項４８に記載のナノ粒子、または項４９に記載のライブラリーの使用。
５３．インビトロ転写のための方法であって、
（ａ）項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を生産する工程
を含む、方法。
５４．タンパク質の発現方法であって、
項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を、原核細胞、真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入し、所望のＲＮＡまたはタンパク質を生成する工程を含む、方法。
５５．（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成し、ここで、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がエキソヌクレアーゼに対して増大した耐性を有する、工程
を含む、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法。
４２．センス鎖およびアンチセンス鎖を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物であって、該直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、単一カセットおよび各鎖の内部位置に少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含み、各鎖の内部位置にある少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドが、
（ａ）カセットの５’末端ヌクレオチド；
（ｂ）カセットの３’末端ヌクレオチド；および
（ｃ）カセットの外側の１以上のヌクレオチド
から選択され、ここで、カセットはコーディング配列を含む、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４３．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり；そして／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドの１つは、センス鎖の第１の領域にあり、センス鎖の第１の領域はカセットの５’である、
項４２に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４４．センス鎖において、
（ａ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり；そして／または
（ｂ）少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、センス鎖の第２の領域はカセットの３’である、
項４２または４３に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４５．（ａ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第１の領域にあり、ここで、センス鎖の第１の領域は、カセットの５’である；
（ｂ）センス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、センス鎖の第２の領域にあり、ここで、センス鎖の第２の領域は、カセットの３’である；
（ｃ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの５’末端ヌクレオチドであり、および／または少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第１の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第１の領域は、カセットの５’である；および、
（ｄ）アンチセンス鎖において、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、カセットの３’末端ヌクレオチドであり、および／または、少なくとも２つのホスホロチオエート化ヌクレオチドのうちの１つは、アンチセンス鎖の第２の領域にあり、ここで、アンチセンス鎖の第２の領域は、カセットの３’である、
項４２に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４６．直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がオーバーハングを含み、要すれば、直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物が、
（ａ）５’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｂ）２つの５’オーバーハング；
（ｃ）３’オーバーハングおよび平滑末端；
（ｄ）２つの３’オーバーハング；および／または
（ｅ）５’オーバーハングおよび３’オーバーハング
を含んでいてもよい、項４２から４５のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物。
４７．項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物および機能性部分を含む複合体分子であって、要すれば、機能性部分が結合分子またはプローブであってもよい、複合体分子。
４８．項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、または項４７に記載の複合体分子を含む、ナノ粒子。
４９．少なくとも２つの直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を含むライブラリーであって、各二本鎖ＤＮＡ産物が項４２から４６のいずれか一項に定義されるものである、ライブラリー。
５０．治療に使用するための、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項４７に記載の複合体分子、項４８に記載のナノ粒子または項４９に記載のライブラリー。
５１．ＲＮＡの産生における、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項４７に記載の複合体分子、項４８に記載のナノ粒子、または項４９に記載のライブラリーの使用であって、要すれば、ＲＮＡがｍＲＮＡであってもよい、使用。
５２．ナノ粒子の製造における、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物、項４７に記載の複合体分子、項４８に記載のナノ粒子、または項４９に記載のライブラリーの使用。
５３．インビトロ転写のための方法であって、
（ａ）項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をポリメラーゼと接触させる工程；および、
（ｂ）転写産物を生産する工程
を含む、方法。
５４．タンパク質の発現方法であって、
項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を、原核細胞、真核細胞または無細胞タンパク質発現系に導入し、所望のＲＮＡまたはタンパク質を生成する工程を含む、方法。
５５．（ａ）少なくとも１種のホスホロチオエート化ヌクレオチドの存在下で、少なくとも１種のエンドヌクレアーゼ標的配列を含むＤＮＡテンプレート分子をローリングサークル増幅させて、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する工程、
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ産物を少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させて、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物を生成し、ここで、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物がエキソヌクレアーゼに対して増大した耐性を有する、工程
を含む、項４２から４６のいずれか一項に記載の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の製造方法。
【実施例】
【0328】
実施例
以下の限定されない実施例は、本発明をさらに説明するものである。
以下の限定されない実施例は、本発明をさらに説明するものである。
【0329】
実施例１：Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸を効率的に使用する
図１に示すのは、２’－デオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびαリン酸の酸素原子が硫黄原子に置換されたヌクレオチド（２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸：ｄＮＴＰ＊Ｓ）の異なる組み合わせの存在下での、野生型およびキメラＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ）によるテンプレート／プライマー分子の伸長である。この改変は、３’→５’または５’→３’核酸分解活性を有する酵素によるＤＮＡ分解を防ぐ。なぜなら、形成されたホスホジエステル結合は、ｄＮＴＰ＊ＳがＤＮＡプライマーに組み込まれる際に酵素によって切断されなくなるからである。
図１に示すのは、２’－デオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびαリン酸の酸素原子が硫黄原子に置換されたヌクレオチド（２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸：ｄＮＴＰ＊Ｓ）の異なる組み合わせの存在下での、野生型およびキメラＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ）によるテンプレート／プライマー分子の伸長である。この改変は、３’→５’または５’→３’核酸分解活性を有する酵素によるＤＮＡ分解を防ぐ。なぜなら、形成されたホスホジエステル結合は、ｄＮＴＰ＊ＳがＤＮＡプライマーに組み込まれる際に酵素によって切断されなくなるからである。
【0330】
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼキメラ（“QualiPhi”； de Vega et al. “Improvement of φ29 DNA polymerase amplification performance by fusion of DNA binding motifs.” Proceedings of the National Academy of Sciences 107.38 (2010): 16506-16511）は、ｄＮＴＰとｄＮＴＰ＊Ｓの異なる組み合わせの存在下で、常に最大１２個のデオキシヌクレオチドを重合して、テンプレート／プライマー分子を伸長することができた。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、例えば２’－デオキシグアノシン－５’－（α－チオ）－三リン酸（ｄＧＴＰ＊Ｓ）を用いたときにも、ＤＮＡ基質の完全な伸長を示すことができた。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼキメラは、対応する野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも、テンプレート／プライマー分子を伸長するのにより有効であった。
反応条件２．５ｎＭ ＤＮＡ、３０ｎＭ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ ｄＮＴＰｓ、３０℃で５分間。反応を８Ｍ尿素存在下、２０％ポリアクリルアミドゲル上で行った。
反応条件２．５ｎＭ ＤＮＡ、３０ｎＭ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ ｄＮＴＰｓ、３０℃で５分間。反応を８Ｍ尿素存在下、２０％ポリアクリルアミドゲル上で行った。
【0331】
実施例２：異なる２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－トリホスフェートの存在下でのテンプレートＤＮＡ分子のローリングサークル増幅は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたはランダム合成プライマーによって誘発され得る
ローリングサークル増幅は、ランダム合成プライマー（Dean et al. “Rapid amplification of plasmid and phage DNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification.” Genome research 11.6 (2001): 1095-1099）または増幅反応中にＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのプライマーを合成するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのようなＤＮＡプライマーゼ（Picher et al. “TruePrime is a novel method for whole-genome amplification from single cells based on Tth PrimPol.” Nature communications 7.1 (2016): 1-16）によって開始できる。
ローリングサークル増幅は、ランダム合成プライマー（Dean et al. “Rapid amplification of plasmid and phage DNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification.” Genome research 11.6 (2001): 1095-1099）または増幅反応中にＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのプライマーを合成するＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌのようなＤＮＡプライマーゼ（Picher et al. “TruePrime is a novel method for whole-genome amplification from single cells based on Tth PrimPol.” Nature communications 7.1 (2016): 1-16）によって開始できる。
【0332】
図４は、保護されていないヌクレオチドをｄＮＴＰ＊Ｓに置換したＣｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子（テンプレートＤＮＡ分子）から得られた増幅率を示す。１つのｄＮＴＰをその保護された対応物に完全に置換すると、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたはランダムプライマーを使用した場合の両方で、増幅率の有意な減少を引き起こした。この効果は、特にｄＡＴＰおよびｄＴＴＰの場合、２つの相補的ｄＮＴＰをホスホロチオエート化したものに置き換えると、さらに増強された。４つのｄＮＴＰ＊Ｓを同時に使用したとき、いずれの場合も増幅は観察されなかった。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【0333】
図５は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたはランダムプライマーを用いて、非相補的なｄＮＴＰ＊Ｓペアの存在下で得られた増幅率を示す。ランダムプライマーの場合、観察された増幅率は、試験したすべての組み合わせで同様であった。一方、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌ反応は、ｄＴＴＰ＊Ｓがペアに存在すると完全に阻害された（図４および５参照）。ｄＴＴＰ＊Ｓなしで試験した他のペアも同様の増幅レベルを示した（図４および図５参照）。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【0334】
増幅されたＤＮＡは、発現カセットに１つの制限部位しかないいくつかの制限酵素（すなわちＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＳｍａＩおよびＸｂａＩ）で消化した。従って、カセットの長さ（約２ｋｂ）を反映した単一のバンドがゲル中に見られるはずである。消化条件：反応液量２５μｌ、２．５μｌの反応バッファーＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、４００ｎｇ ＤＮＡ、２０ユニットのＢｓａＩ－ＨＦｖ２（ＮＥＢ）、２０ユニットのＮｄｅＩ（ＮＥＢ）、２０ユニットのＳｍａＩ（ＮＥＢ）、２０ユニットのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：２５℃（ＳｍａＩ）または３７℃（ＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ）で６０分（ＢｓａＩ）または１５分（ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ）。図６は、ランダムプライマーで得られた増幅ＤＮＡを複数の制限酵素で消化し、１ユニットサイズの発現カセットを遊離させたアガロースゲル電気泳動分析を示す（図３参照）。１つのｄＮＴＰをその保護された対応物に完全に置換すると、増幅されたＤＮＡの長さが著しく減少し、発現カセットに１つの制限部位しか有さないいくつかの酵素で消化した後、単一のＤＮＡバンドを放出できなくなった。未修飾ｄＮＴＰｓで得られた対照ＤＮＡは、すべてのケースで期待通りの結果（２ｋｂの単一ＤＮＡバンド）を示した。
【0335】
実施例３：異なる濃度の２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸の存在下でのテンプレートＤＮＡ分子のローリングサークル増幅は、制限エンドヌクレアーゼでの消化後の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物の産生を可能にする
図７は、４つのヌクレオチドのそれぞれについて、未修飾ｄＮＴＰおよび保護ｄＮＴＰの異なる割合を用いて、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅率を示す。この４つのケースでは、保護ヌクレオチドの濃度が高いほど、増幅収率は低くなった。２５％のｄＡＴＰ＊Ｓおよび２５％のｄＴＴＰ＊Ｓは、未修飾のｄＮＴＰｓのみで行った対照と比較して減少を生じず、２５％のｄＧＴＰ＊Ｓおよび２５％のｄＣＴＰ＊Ｓは、対照と比較してわずかな減少しか生じなかった。従って、ヌクレオチドの２５％をホスホロチオエート化ヌクレオチドに置換しても、増幅収率に支障はない。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットのＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
図７は、４つのヌクレオチドのそれぞれについて、未修飾ｄＮＴＰおよび保護ｄＮＴＰの異なる割合を用いて、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅率を示す。この４つのケースでは、保護ヌクレオチドの濃度が高いほど、増幅収率は低くなった。２５％のｄＡＴＰ＊Ｓおよび２５％のｄＴＴＰ＊Ｓは、未修飾のｄＮＴＰｓのみで行った対照と比較して減少を生じず、２５％のｄＧＴＰ＊Ｓおよび２５％のｄＣＴＰ＊Ｓは、対照と比較してわずかな減少しか生じなかった。従って、ヌクレオチドの２５％をホスホロチオエート化ヌクレオチドに置換しても、増幅収率に支障はない。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットのＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。
【0336】
増幅されたＤＮＡを、発現カセットに１つの制限部位しかないいくつかの制限酵素（すなわちＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＳｍａＩおよびＸｂａＩ）で消化した。従って、カセットの長さ（約２ｋｂ）を反映した単一のバンドがゲル中に見られるはずである。消化条件：反応液量２５μｌ、２．５μｌ反応バッファーＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、４００ｎｇ ＤＮＡ、２０ユニットのＢｓａＩ－ＨＦｖ２（ＮＥＢ）、２０ユニットのＮｄｅＩ（ＮＥＢ）、２０ユニットのＳｍａＩ（ＮＥＢ）、２０ユニットのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：２５℃（ＳｍａＩ）または３７℃（ＢｓａＩ、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ）で６０分（ＢｓａＩ）または１５分（ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ）。図８は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌと異なる濃度のｄＮＴＰ＊Ｓを用いて得られた増幅ＤＮＡを、発現カセットを遊離させるためにいくつかの制限酵素で消化した後のアガロースゲル電気泳動分析である。ランダムプライマーで以前に観察されたように（図６を参照）、１つのｄＮＴＰをその保護された対応物に完全に置換すると、増幅されたＤＮＡの長さが著しく減少し、いくつかの制限酵素で消化した後に単一のＤＮＡバンドを効率的に放出できなくなった。逆に、濃度を２５％または５０％に下げると、ほとんどすべてのケースで目的のＤＮＡが得られやすくなった。ある種の酵素によるＤＮＡサンプルの非効率的な消化は、それらの酵素が、保護されたｄＮＴＰが組み込まれる可能性のある位置で核分解作用を行い、消化が起こらないという事実によって説明できる。
【0337】
実施例４：異なる濃度の２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸の存在下での鋳型ＤＮＡ分子のローリングサークル増幅は、エキソヌクレアーゼからの保護を可能にする。
図９は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌと異なる濃度のｄＮＴＰ＊Ｓを用いて得られた増幅および消化ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。増幅ＤＮＡをまずＢｓａＩで消化し、次に大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ（二本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ）と共にインキュベートした。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）と共にさらにインキュベートし、保護されていないＤＮＡ対照で観察されたように、ＤＮＡ分解を促進した。エキソヌクレアーゼのインキュベーション時間および温度：３７℃で３０分、８０℃で２０分。
図９は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌと異なる濃度のｄＮＴＰ＊Ｓを用いて得られた増幅および消化ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。増幅ＤＮＡをまずＢｓａＩで消化し、次に大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ（二本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ）と共にインキュベートした。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）と共にさらにインキュベートし、保護されていないＤＮＡ対照で観察されたように、ＤＮＡ分解を促進した。エキソヌクレアーゼのインキュベーション時間および温度：３７℃で３０分、８０℃で２０分。
【0338】
２５％または５０％のｄＡＴＰ＊Ｓ、ｄＧＴＰ＊ＳまたはｄＴＴＰ＊Ｓの存在は、ｄＮＴＰ＊Ｓ（対照ＤＮＡ）の不存在下で観察されたＤＮＡ分解を妨げた。ｄＣＴＰ＊Ｓは５０％でいくらかの保護をもたらした。
【0339】
図１０は、５０％から１００％の範囲のｄＮＴＰ＊Ｓ濃度を用いてＣｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅率を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。図７ですでに観察されたように、増幅率は４つの場合でｄＮＴＰ＊Ｓの量に反比例した。
【0340】
図１１は、ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌおよびｄＮＴＰ＊Ｓの濃度が５０％から１００％の範囲で得られた増幅および消化ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。ｄＮＴＰ＊Ｓ濃度が５０％以上になると、目的の分子を得る能力が著しく低下した。ＧＴＰ＊ＳおよびｄＴＴＰ＊Ｓは増幅されたＤＮＡの長さの減少を引き起こし、標的分子の生成を妨げた。一方、ｄＡＴＰ＊ＳおよびｄＣＴＰ＊Ｓは、発現カセットの単一ユニットを遊離するＢｓａＩの能力を低下させた。こうして、標的ＤＮＡ分子の二量体、三量体および四量体がアガロースゲルに現れた。したがって、ｄＮＴＰ＊Ｓの濃度は５０％以下が好ましい。
【0341】
図１２および図１３は、ｄＮＴＰ＊Ｓ濃度が５０％から１００％の範囲で得られたＤＮＡの、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウシＤＮＡｓｅ Ｉによる分解に対する保護結果を示す。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡを、５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）またはウシＤＮＡｓｅ Ｉ（０．００２５ユニット、Ａｍｂｉｏｎ）と共にインキュベートした。培養時間および温度：３７℃で３０分。ｄＡＴＰ＊ＳおよびｄＣＴＰ＊Ｓを用いて産生された標的分子の単体、ならびに二量体、三量体および四量体は、エキソヌクレアーゼＩＩＩの作用から完全に保護される（図１２参照）。ｄＧＴＰ＊ＳおよびｄＴＴＰ＊Ｓで観察された単一ユニットもまた、エキソヌクレアーゼＩＩＩから完全に保護される（図１３参照）。しかしながら、どのサンプルもＤＮＡｓｅ Ｉに対する保護作用を示さず、試験したｄＮＴＰ＊Ｓおよびその濃度とは無関係に、同じ分解パターンを示した。
【0342】
実施例５：４つの２’－デオキシヌクレオチド－５’－（α－チオ）－三リン酸の等モル混合物の存在下でのテンプレートＤＮＡ分子のローリングサークル増幅は、エキソヌクレアーゼからの保護も可能にする。
図１４は、２．５％から５０％の範囲の濃度の４つのｄＮＴＰ＊Ｓの等モル混合物(blend)を用いた、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅率を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。単一ｄＮＴＰ＊Ｓの濃度が高くなるにつれて既に観察されたように、増幅率は用いた４つのｄＮＴＰ＊Ｓの総量に反比例した。
図１４は、２．５％から５０％の範囲の濃度の４つのｄＮＴＰ＊Ｓの等モル混合物(blend)を用いた、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅率を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。単一ｄＮＴＰ＊Ｓの濃度が高くなるにつれて既に観察されたように、増幅率は用いた４つのｄＮＴＰ＊Ｓの総量に反比例した。
【0343】
図１５は、２．５％から５０％の範囲の濃度の４つのｄＮＴＰ＊Ｓの等モル混合物で得られたＤＮＡの、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウシＤＮＡｓｅ Ｉによる分解に対する保護結果を示す。消化条件：反応液量５０μｌ、反応バッファー５μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ ２μｇ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２ ４０ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で３０分。次に、４８０ｎｇのＢｓａＩ消化ＤＮＡを、５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したエキソヌクレアーゼＩＩＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）またはウシＤＮＡｓｅ Ｉ（０．００２５ユニット、Ａｍｂｉｏｎ）と共にインキュベートした。培養時間および温度：３７℃で３０分。試験した最低濃度（２．５％）でさえ、エキソヌクレアーゼＩＩＩの作用に対して一定の保護効果を示した。高濃度でも完全な保護を示したが、二量体、三量体、四量体が出現し、ｄＮＴＰ＊Ｓの濃度に比例して増加した。単一のｄＮＴＰ＊Ｓですでに観察されたように、どのサンプルもＤＮＡｓｅ Ｉに対する保護作用を示さず、ブレンドの濃度とは無関係に同じ分解パターンを示した。
【0344】
実施例６：保護されたＤＮＡはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで適切に転写される
図１７は、異なる割合の非修飾およびホスホロチオエート化ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）を用いて、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅率を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。テンプレートＤＮＡには、Ｔ７プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子で形成された発現カセットが含まれていた（図１６参照）。異なる発現カセットを用いた図７で既に観察されたように、保護ヌクレオチドの濃度が高いほど、観察される増幅収率は低くなる。増幅収率の減少は、各濃度で試験した３つのｄＮＴＰｓで同様であった。
図１７は、異なる割合の非修飾およびホスホロチオエート化ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）を用いて、Ｃｒｅ由来の環状ＤＮＡ分子から得られた増幅率を示す。増幅条件：反応量５０μｌ、変性ＤＮＡサンプル（７．５μｌ）、１００ｎＭ ＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌまたは５０μＭランダム合成ヘキサマー、２００ｎＭ ＱｕａｌｉＰｈｉ Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌ、２．５ユニットＰＰａｓｅ（Thermo）、１ｍＭ ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ＊Ｓ、インキュベーション時間および温度：３０℃で２０時間、６５℃で１０分。テンプレートＤＮＡには、Ｔ７プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子で形成された発現カセットが含まれていた（図１６参照）。異なる発現カセットを用いた図７で既に観察されたように、保護ヌクレオチドの濃度が高いほど、観察される増幅収率は低くなる。増幅収率の減少は、各濃度で試験した３つのｄＮＴＰｓで同様であった。
【0345】
図１８は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写を行うのに適した分子を遊離させるために、ＮｓｉＩで消化した後の増幅ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。消化条件：反応液量５００μｌ、反応バッファー５０μｌ ＣｕｔＳｍａｒｔ １０ｘ（ＮＥＢ）、ＤＮＡ ５０μｇ、ＮｓｉＩ ３１２ユニット（ＮＥＢ）、インキュベーション時間および温度：３７℃で６０分、８０℃で２０分。目的のフラグメント（１．７ｋｂ）に対応する単一のバンドは、５０％ｄＡＴＰ＊Ｓを除いて、すべての場合で観察された（パートＡ）。消化されたＤＮＡは精製され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応のテンプレートとして用いた。
【0346】
図１９は、各ＤＮＡ分子で得られた転写率を示す。反応条件：反応液量２０μｌ、反応バッファー２μｌ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌ反応緩衝液 １０ｘ （ＮＥＢ）、ＤＮＡ １μｇ、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ１００（ＮＥＢ）、ＮＴＰ ２ｍＭ、インキュベーション時間および温度：３７℃で１２０分間。その後、ＤＮＡｓｅ Ｉ（４Ｕ、Ａｍｂｉｏｎ）を加えてテンプレートＤＮＡを除去し、３７℃で１５分間インキュベートした。用いた保護ｄＮＴＰおよびその濃度に関係なく、どのＤＮＡ分子も１５～２０μｇの範囲で同程度のｍＲＮＡを産生した。従って、保護されたＤＮＡは転写プロセスのテンプレートとして適している。
【0347】
実施例７：ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション－ＧＦＰ
ＨＥＫ２９３細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco、カタログ番号：１１９６５０８４）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、カタログ番号：１６１４０－０７１）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号：１５０７０－０６３）を加えて培養した。
ＨＥＫ２９３細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco、カタログ番号：１１９６５０８４）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、カタログ番号：１６１４０－０７１）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号：１５０７０－０６３）を加えて培養した。
【0348】
ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションは、リポフェクトアミン２０００（ThermoFisherのカタログ番号：１１６６８０１９）およびＪｅｔＯＰＴＩＭＵＳ（PolyPlusカタログ番号：１０１０００００６）などの市販のトランスフェクション試薬を用いて行った。
【0349】
トランスフェクションは９６ウェルプレートで、トランスフェクションの１日前に播種したウェルあたり２５ｘ１０３細胞の密度で行った。
【0350】
リポフェクトアミンのトランスフェクションは以下のように行った：ウェルあたり２００ｎｇのＤＮＡを５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、０．５ｕｌのリポフェクトアミン２０００を５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した。各成分を別々に５分間インキュベートした後、十分に混合し、さらに２５分間インキュベートした後、１００ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭをウェルに添加した。
【0351】
ＪｅｔＯｐｔｉｍｕｓによるトランスフェクションは以下のように行った：ウェルあたり０．１３ｕｇのＤＮＡを０．１３ｕｌのＪｅｔＯｐｔｉｍｕｓ試薬と混合し、１２．５ｕｌのＪｅｔＯｐｔｉｍｕｓバッファーに入れた。ウェルに添加する前に、混合液を室温で１０分間インキュベートした。
【0352】
すべての条件はトリプリケートで行った。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で４時間培養した後、無血清培地から増殖培地に交換した。トランスフェクション後４８時間、細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（Corning，カタログ番号：２５－０５２－ＣＶ）でインキュベートし、細胞を剥離した。トランスフェクション後４８時間、細胞をＰＢＳに再懸濁し、Ａｌｉｇｅｎｔ Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーで解析した。
【0353】
図２０は、様々なレベルのｄＮＴＰαＳ ０％、１２．５％のｄＡＴＰαＳおよびｄＴＴＰαＳ、２５％のｄＡＴＰαＳを含む直鎖二本鎖ＤＮＡ産物をカプセル化したリポフェクトアミン２０００でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現および蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、先の実施例（例えば、実施例２参照）に記載した方法で製造した。２５％ｄＡＴＰαＳを用いたＧＦＰコンストラクトは、最も高いＧＦＰ発現を示し、１日目に５０．７３％の細胞がＧＦＰを発現し、３日目には７８．２６％まで増加し、ＭＦＩはそれぞれ１．８Ｅ＋０６および２．５Ｅ＋０６であった。ｄＮＴＰαＳを０％添加したコンストラクトはＧＦＰ発現が最も低く、１日目には３３％の細胞がＧＦＰを発現し、３日目には６５％まで増加した。ＭＦＩ値も低く、１日目は７Ｅ＋０５、３日目は１．５Ｅ＋０６であった。
【0354】
図２１は、２．５％、５％、７．５％、１０％および１２．５％のホスホロチオエート化ｄＮＴＰαＳを添加したＰｏｌｙＰｌｕｓ－ＪｅｔＯＰＴＩＭＵＳカプセル化ＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現を示す。最も高いＧＦＰ発現を示したのは、５％のｄＮＴＰαＳを用いたＧＦＰコンストラクトで３５．３４％の細胞がＧＦＰを発現し、次いで７．５％のｄＮＴＰαＳを用いたＧＦＰコンストラクトで３４．４６％の細胞がＧＦＰを発現した。１２．５％のｄＮＴＰαＳを含むＤＮＡコンストラクトはＧＦＰ発現が最も低く、２２．１８％の細胞がＧＦＰを発現した。
【0355】
実施例８：ＨＥＫ細胞のトランスフェクション－ルシフェラーゼ
ＨＥＫ２９３細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco、カタログ番号：１１９６５０８４）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、カタログ番号：１６１４０－０７１）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号：１５０７０－０６３）を加えて培養した。
ＨＥＫ２９３細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco、カタログ番号：１１９６５０８４）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、カタログ番号：１６１４０－０７１）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号：１５０７０－０６３）を加えて培養した。
【0356】
ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションは、リポフェクトアミン２０００（ThermoFisher、カタログ番号：１１６６８０１９）およびＪｅｔＯＰＴＩＭＵＳ（PolyPlus カタログ番号：１０１０００００６）などの市販のトランスフェクション試薬を用いて行った。
【0357】
トランスフェクションは９６ウェルプレートで、トランスフェクションの１日前に播種したウェルあたり２５ｘ１０３細胞の密度で行った。
【0358】
リポフェクトアミンのトランスフェクションは以下のように行った：ウェルあたり２００ｎｇのＤＮＡを５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、一方で０．５ｕｌのリポフェクトアミン２０００を５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した。各成分を別々に５分間インキュベートした後、十分に混合し、さらに２５分間インキュベートした後、１００ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭをウェルに添加した。
【0359】
ＪｅｔＯｐｔｉｍｕｓによるトランスフェクションは以下のように行った：ウェルあたり０．１３ｕｇのＤＮＡを０．１３ｕｌのＪｅｔＯｐｔｉｍｕｓ試薬と混合し、１２．５ｕｌのＪｅｔＯｐｔｉｍｕｓバッファーに入れた。ウェルに添加する前に、混合液を室温で１０分間インキュベートした。
【0360】
すべての条件はトリプリケートで行った。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で４時間培養した後、無血清培地から増殖培地に交換した。トランスフェクション後４８時間、細胞をＰＢＳで洗浄した後、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）に再懸濁した。プレートは４℃で２０分間インキュベートした後、－８０℃で４０分間インキュベートした。解凍後、ルシフェラーゼ活性をクラリオスタープラスプレートリーダー（BMG Labtech, Aylesbury, UK）でルシフェラーゼアッセイ基質を注入して測定した。ルシフェラーゼ発現は、Pierce BCA Protein Assayを用いてタンパク質含量で標準化し、吸光度は５６２ｎｍで測定した。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質１ｍｇあたりの相対発光単位（ＲＬＵ／ｍｇ）で表した。
【0361】
図２２は、市販のトランスフェクション試薬であるリポフェクトアミン２０００でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼ発現を示しており、０％、７．５％および１０％のｄＮＴＰαＳで直鎖二本鎖ＤＮＡ産物を封入している。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、上記の実施例（例えば、実施例２参照）に記載した方法で製造した。ルシフェラーゼ発現はトランスフェクション後４８時間で測定した。図２２に示すように、最も高いルシフェラーゼ発現を示したサンプルは、７．５％のｄＮＴＰαＳを添加したＤＮＡで、３Ｅ＋０７ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質であった。１０％ｄＮＴＰαＳは、２．３Ｅ＋０７ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質のルシフェラーゼ発現を記録した。０％のｄＮＴＰαＳＤＮＡは、４Ｅ＋６ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質という最も低いルシフェラーゼ発現を示した。
【0362】
図２３は、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした、様々なＤＮＡテンプレート由来のｍＲＮＡサンプルのタンパク質ｍｇあたりのルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示す。具体的には、この図は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを０％から５０％含む直鎖二本鎖ＤＮＡ産物をインビトロ転写テンプレートとして用いた場合の影響を示す。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、上記の実施例（例えば。実施例２参照）に記載した方法で製造した。ルシフェラーゼ発現は、細胞処理４時間後に測定した。市販の試薬リポフェクトアミン２０００を用いて、３００ｎｇ／ウェルのサンプルを３回に分けてトランスフェクトした。表示されているルシフェラーゼ発現は、３連ウェルの平均結果である。エラーバーはトリプリケートでのウェル間の標準偏差である。この図は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物と直鎖化プラスミド由来のｍＲＮＡサンプルの間でルシフェラーゼ発現が同等であることを示しており、ホスホロチオエート化ＤＮＡテンプレートがｍＲＮＡのインビトロでの使用に適していることを示す。
【0363】
実施例９：インビトロでの転写
サンプルあたり１μｇの入力ＤＮＡテンプレートを用い、次に２μＬの１０ＸＴ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標)転写緩衝液（CellScript）、９ｍＭ ＡＴＰ、９ｍＭ ＣＴＰ（CellScript）、９ｍＭ Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰ（TriLink）、８ｍＭ ＡＲＣＡ キャップ構造類縁体（ＮＥＢ）、９ｍＭ ＧＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ（CellScript）、０．２Ｕ 無機ピロホスファターゼ（Thermo Scientific）、２０Ｕ ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ(商標) ＲＮａｓｅインヒビター、２μＬ Ｔ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標)酵素溶液（CellScript）を用いた。培養時間および温度：３７℃で１．５時間。以下のＤＮａｓｅ Ｉ（CellScript）処理を１Ｕで行った：３７℃で１５分間。
サンプルあたり１μｇの入力ＤＮＡテンプレートを用い、次に２μＬの１０ＸＴ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標)転写緩衝液（CellScript）、９ｍＭ ＡＴＰ、９ｍＭ ＣＴＰ（CellScript）、９ｍＭ Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰ（TriLink）、８ｍＭ ＡＲＣＡ キャップ構造類縁体（ＮＥＢ）、９ｍＭ ＧＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ（CellScript）、０．２Ｕ 無機ピロホスファターゼ（Thermo Scientific）、２０Ｕ ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ(商標) ＲＮａｓｅインヒビター、２μＬ Ｔ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標)酵素溶液（CellScript）を用いた。培養時間および温度：３７℃で１．５時間。以下のＤＮａｓｅ Ｉ（CellScript）処理を１Ｕで行った：３７℃で１５分間。
【0364】
図２４は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび異なるＤＮＡテンプレートを用いてインビトロで転写されたｍＲＮＡから生成された収量を示す。具体的には、この図は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドの割合が異なる直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をインビトロ転写テンプレートとして用いた場合のｍＲＮＡ収量への影響を示す。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、上記の実施例（例えば、実施例２参照）に記載した方法で製造した。比較のために、従来のＤＮＡ直鎖化プラスミドテンプレートを用いた。反応条件：最終反応容量２０μＬ、２μＬ １０Ｘ Ｔ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標)転写緩衝液（CellScript）、９ｍＭ ＮＴＰｓ（CellScript）、８ｍＭ ＡＲＣＡ キャップ構造類縁体（ＮＥＢ）、１０ｍＭ ＤＴＴ（CellScript）、０．２Ｕ 無機ピロホスファターゼ（Thermo Scientific）、２０Ｕ ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ(商標) ＲＮａｓｅインヒビター、２μＬ Ｔ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標)酵素溶液（CellScript）。培養時間および温度：３７℃で１．５時間。以下のＤＮａｓｅ Ｉ処理を１Ｕで行った（CellScript）：３７℃で１５分間。ｍＲＮＡ収量は、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ ｋｉｔ（Invitrogen）を用いたＱｕｂｉｔ定量（ｎ＝３）を用いて測定した。
【0365】
図２４は、様々な割合のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物をインビトロ転写テンプレートとして用いた場合の影響を示す。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、上記の実施例（例えば、実施例２参照）に記載した方法で製造した。さまざまな割合のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から、最低１８０μｇの収量が得られ、すべてのＤＮＡテンプレートで平均２０９．１μｇのｍＲＮＡ収量が得られた。用いたｄＮＴＰの割合に関係なく、どのＤＮＡテンプレートも同レベルのｍＲＮＡを産生した。したがって、保護された直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は転写プロセスに適している。反応条件：最終反応容量２０μＬ、２μＬの１０Ｘ Ｔ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標) 転写緩衝液（CellScript）、９ｍＭ ＮＴＰｓ（CellScript）、８ｍＭ ＡＲＣＡ キャップ構造類縁体（ＮＥＢ）、１０ｍＭ ＤＴＴ（CellScript）、０．２Ｕ 無機ピロホスファターゼ（Thermo Scientific）、２０Ｕ ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ(商標)ＲＮａｓｅインヒビター、２μＬ Ｔ７－ＦｌａｓｈＳｃｒｉｂｅ(商標)酵素溶液（CellScript）。培養時間および温度：３７℃で１．５時間。以下のＤＮａｓｅ Ｉ処理を１Ｕで行った（CellScript）：３７℃で１５分間。
【0366】
図２５は、ネイティブ０．８％アガロースゲル電気泳動によって画像化されたインビトロ転写ｍＲＮＡサンプルを示す。ｍＲＮＡサンプルは、ｄＧＴＰ＊Ｓ保護が０％から５０％の範囲の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から転写された。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、上記の実施例（例えば、実施例２参照）に記載した方法で製造した。サンプルは２５０ｎｇの等質量になるように負荷(load)されている。同じ配列を有する従来の直鎖化プラスミド由来のｍＲＮＡを比較として負荷した。１．７ｋｂまでの目的のバンドはすべてのサンプルで観察できる。用いたｄＮＴＰ＊Ｓの割合とは無関係に、テンプレートとして用いたすべての直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、同様のバンド強度および純度を示した。２つ目の高分子量バンドも観察され、これは天然条件下でのｍＲＮＡの自然な二次構造折り畳みに対応する。
【0367】
図２６は、変性０．８％アガロースゲル電気泳動で画像化したインビトロ転写ｍＲＮＡサンプルを示す。ｍＲＮＡサンプルは、ｄＧＴＰ＊Ｓ保護が０％から５０％の範囲の直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物から転写された。直鎖状二本鎖ＤＮＡ産物は、上記の実施例（例えば、実施例２参照）に記載した方法で製造した。サンプルは２５０ｎｇの等質量になるようにロードされている。比較として、同じ配列でホスホロチオエート化ヌクレオチドが０％の従来の直鎖化プラスミド由来のｍＲＮＡをロードした。すべてのサンプルを６５℃で３分間熱変性させ、ゲルに加える前にホルムアルデヒドで処理した。ホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動は以下のように行った。０．８％アガロースゲルを０．７％ホルムアルデヒドで調製した。サンプルはホルムアルデヒドロード色素（Invitrogen）を用いて調製し、ウェルに添加する前に６５℃で５分間熱変性させた。サンプルは、画像化前に８０Ｖで７０分間作動させた。図２６では、全サンプルで～１．７ｋｂの主バンドが観察され、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む直鎖状二本鎖ＤＮＡが転写プロセスに適していることが実証された。
【0368】
実施例１０－マウスにおける直鎖状二本鎖ＤＮＡからのインビボルシフェラーゼ発現
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードする５μｇのスーパーコイルドプラスミド、または０％、５％もしくは１０％のｄＮＴＰαＳを含む等モル量（３．２μｇ）の直鎖状二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーションした。対照として未処置マウスを用いた。Ｎ＝５。ＥＰ条件は以下の通りである：１１０Ｖ、８パルス、２０ｍ秒の長さ、１２０ミリ秒の間隔。ＥＰの１週間後、イソフルラン麻酔下でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステムを用いて光学的生物発光を観察する１０分前に、マウスにＤ－ルシフェリンを腹腔内注射した。対照として無処置のマウスを用いた。Ｎ＝５。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードする５μｇのスーパーコイルドプラスミド、または０％、５％もしくは１０％のｄＮＴＰαＳを含む等モル量（３．２μｇ）の直鎖状二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーションした。対照として未処置マウスを用いた。Ｎ＝５。ＥＰ条件は以下の通りである：１１０Ｖ、８パルス、２０ｍ秒の長さ、１２０ミリ秒の間隔。ＥＰの１週間後、イソフルラン麻酔下でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステムを用いて光学的生物発光を観察する１０分前に、マウスにＤ－ルシフェリンを腹腔内注射した。対照として無処置のマウスを用いた。Ｎ＝５。
【0369】
図２７は、ルシフェラーゼをコードする５ｕｇのプラスミドＤＮＡ、または０％、５％もしくは１０％のｄＮＴＰαＳを含む等モル量（３．２ｕｇ）の直鎖状二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーションしたマウスにおけるインビボルシフェラーゼ発現である。エレクトロポレーションから１週間後、イソフルラン麻酔下でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステムを用いて光学的生物発光を観察する１０分前に、マウスにＤ－ルシフェリンを腹腔内注射した。５％のｄＮＴＰαＳを組み込んだ直鎖状二本鎖ＤＮＡで処理したマウスは、０％または１０％のｄＮＴＰαＳを組み込んだ直鎖状二本鎖ＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ対照で処理したマウスと比較して、ルシフェラーゼの発現が最も高かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】