特表 2024-516326 去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるポラプレジンクの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-12

(54)【発明の名称】去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるポラプレジンクの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 33/30 20060101AFI20240405BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 31/58 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 31/4164 20060101ALI20240405BHJP

【ＦＩ】

A61K33/30

A61P35/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K31/58

A61K31/4164

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568658

(86)(22)【出願日】2021-07-26

(85)【翻訳文提出日】2023-12-28

(86)【国際出願番号】 CN2021108355

(87)【国際公開番号】W WO2022236963

(87)【国際公開日】2022-11-17

(31)【優先権主張番号】202110501971.4

(32)【優先日】2021-05-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514262886

【氏名又は名称】江南大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】王栄

(72)【発明者】

【氏名】陳永泉

(72)【発明者】

【氏名】朱升龍

(72)【発明者】

【氏名】王小英

(72)【発明者】

【氏名】糜遠源

(72)【発明者】

【氏名】呉升

(72)【発明者】

【氏名】孫健

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC422

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC38

4C086DA12

4C086HA03

4C086HA28

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA16

4C086MA23

4C086MA24

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA41

4C086MA44

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるポラプレジンクの使用を開示し、生物医学の技術分野に属する。本発明は、Ｐｏｌａとアンドロゲン受容体拮抗薬を組み合わせＣＲＰＣの治療薬を調製するための新たな戦略を初めて提案し、多角的且つ多段階の検証研究を行うものである。本発明のポラプレジンクとアンドロゲン受容体を組み合わせた医薬組成物は去勢抵抗性前立腺がんの治療に使用でき、去勢抵抗性前立腺がんに対するエンザルタミドの阻害効果を顕著に向上させることができ、古い薬剤の新たな使用が実現され、創薬から臨床転換までの時間を大幅に短縮することができ、臨床治療上に重要な意義がある。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるポラプレジンクの使用。

【請求項2】

前記使用は、ポラプレジンクとアンドロゲン受容体拮抗薬を組み合わせて去勢抵抗性前立腺がんの治療薬を調製することを含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記組成物はポラプレジンクとアンドロゲン受容体拮抗薬を含むことを特徴とする去勢抵抗性前立腺がんを治療するための医薬組成物。

【請求項4】

アンドロゲン受容体拮抗薬とポラプレジンクとの質量比は（１～５）：１であることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

アンドロゲン受容体拮抗薬は、エンザルタミド、ＥＰＩ、アビラテロン、オラパリブのいずれか１種以上を含むことを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記医薬組成物は医薬賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記医薬賦形剤は、溶剤、噴射剤、可溶化剤、助溶剤、乳化剤、着色剤、接着剤、崩壊剤、充填剤、潤滑剤、湿潤剤、浸透圧調整剤、安定剤、流動助剤、矯味剤、防腐剤、懸濁助剤、コーティング材、香味剤、接着防止剤、統合剤、浸透促進剤、ｐＨ値調整剤、緩衝剤、可塑剤、界面活性剤、発泡剤、消泡剤、増粘剤、包接剤、保湿剤、吸収剤、希釈剤、凝集剤及び解膠剤、濾過助剤及び放出阻害剤を含むことを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記医薬組成物は医薬担体をさらに含んでもよいことを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記医薬担体はマイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子及びリポソームを含むことを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記医薬組成物の剤型は、注射液、注射用凍結乾燥粉末剤、徐放性注射剤、リポソーム注射剤、懸濁剤、植込剤、塞栓剤、カプセル剤、錠剤、丸剤及び経口液剤を含むことを特徴とする請求項３～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は生物医学の技術分野に属し、具体的には、去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるポラプレジンクの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

アンドロゲン除去療法が進行前立腺がんの標準治療方法であるが、患者は平均１～３年の治療後に最終的に去勢抵抗性前立腺がん（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＰＣ）を発症する。２０１４年、ＣＵＡマニュアルによれば、ＣＲＰＣとは、最初の連続的なアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）の後に疾患が依然として進行する前立腺がんを指す。（１）血清テストステロンが去勢レベル（＜５０ｎｇ／ｄＬ又は１．７ｎｍｏｌ／Ｌ）に維持されている条件と、（２）生化学的進行について、１週間おきに３回連続して検出されたＰＳＡ値が最低値の５０％以上超え、増加の絶対値が＞２ｎｇ／ｍｌであり、又はＸ線撮影による進行について、骨シンチグラフィで２つ以上の新たな病巣が発見し、又はＲＥＣＩＳＴで評価すると軟組織の病巣が大きくなるという条件と、を同時に満たす必要がる。現在、症状の進行だけで、ＣＲＰＣを診断するのに十分ではないと考えられている。

【0003】

以前では、ＣＲＰＣ患者に効果的な治療方法がなく、いくつかの緩和治療のみを受けることができ、２００４年に、ドセタキセルが転移性去勢抵抗前立腺がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ、 ｍＣＲＰＣ）患者の全生存期間を延長できることが証明されて以来、アビラテロン酢酸エステル、エンザルタミド、カバジタキセル等のｍＣＲＰＣ疾患段階に対する薬剤が出現し、これらの患者の治療状況を変えたが、ＣＲＰＣを完全に回復させることは困難である。従って、効果的な併用治療戦略を見つけることはＣＲＰＣ治療における別の研究のホットスポットとなる。

【0004】

最近、多くの学者は新たな腫瘍細胞薬剤耐性機序－持続細胞（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ ｃｅｌｌ）、つまり腫瘍細胞可塑性（ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）、微小残存病変（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、又は薬剤耐性持続（ｄｒｕｇ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｐｅｒｓｉｓｔｅｒｓ、 ＤＴＰ）等を提案している。この機序の特徴は、薬剤耐性状態で腫瘍細胞が薬剤標的経路に依存せずに、他の経路で生存するが、標的遺伝子に任意の突然変異が発生せず、一定の時間退薬した後に薬剤感受性が回復することである。現在、この機序を作成する３つの仮説が提案されている。（１）少数の薬剤耐性細胞（ｄｒｕｇ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｃｅｌｌｓ）が元々存在し、薬剤処置後にダーウィンの進化論によって増加し、（２）少数の薬剤抵抗性細胞が小さい部分のがん細胞によってエピジェネティックに改変されて薬剤耐性細胞を生成し、残存病巣と共存し、（３）腫瘍細胞は様々な薬剤耐性遺伝子を動的に発現し、薬剤処置時にこれらの薬剤耐性遺伝子を高発現させて、薬剤耐性発現系をさらに再構築し、薬剤耐性細胞を生成する。近年、細胞可塑性は標的診断回避モデルとして出現しており、多くのがん症薬剤耐性の共通性である。新たな薬剤耐性経路をブロックするとｐｅｒｓｉｓｔｅｒ ｃｅｌｌを効果的に阻害でき、例えば、ＧＰＸ４脂質過酸化経路は、多くのｐｅｒｓｉｓｔｅｒ ｃｅｌｌ状態で高度に発現する効果的な標的である。これまでのところ、ＣＲＰＣ腫瘍にｐｅｒｓｉｓｔｅｒ ｃｅｌｌがあるか否か、及び新たな効果的な標的を見つけることができるか否かは分かっていない。従って、この研究は、ＥＰＩ－００１及びＥｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅによって生成された前立腺がんＬＮＣａＰ－ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ ｃｅｌｌから出発して、ＣＲＰＣを治療するための効果的な併用薬剤を見つけることに焦点を当てている。

【0005】

ＥＰＩ－００１（ＥＰＩ）は、臨床開発が待たれている、ＣＲＰＣの治療に用いられる可能性があるＡＲ及びＡＲ－スプライス変異体（ＡＲ－Ｖｓ）の阻害剤である。ＣＲＰＣに対するＥＰＩの標的は主にＮ－末端ドメイン（ＮＴＤ）である。エンザルタミド（Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ、Ｅｎｚａ）は最初の承認された第２世代ＡＲアンタゴニストであり、従来の抗アンドロゲンに比べてＡＲに対する親和性が５～８倍高い。２０１２年に、米国ＦＤＡはこれに基づきＣＲＰＣ患者向けたＥｎｚａを承認した。しかし、ＥＰＩであれＥｎｚａであれ、ＣＲＰＣの治療に対する薬剤耐性は通常１８カ月前後に出現する。従って薬剤耐性を克服し、ＣＲＰＣを遅らせるための他の方法は緊急に必要とされている。

【0006】

ポラプレジンク（Ｐｏｌａｐｒｅｚｉｎｃ、Ｐｏｌａ）は亜鉛とＬ－カルノシンのキレート化形態である。これは日本で初めて承認された亜鉛関連薬剤であり、胃潰瘍の治療に臨床使用されている。この結果は、Ｐｏｌａは圧迫性潰瘍の治療に有効である可能性があることを示している。２０１３年の研究は、Ｐｏｌａを併用すると、アスピリンの長期使用による小腸粘膜損傷に有効である可能性があることを示している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする技術的課題は、上記従来の薬剤に存在する薬剤耐性を克服し、ＥｎｚａとＰｏｌａを併用することによりＣＲＰＣの治療効果を顕著に向上させ、優れた相乗効果を発揮する効果的なＣＲＰＣ治療薬を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１の目的は去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるポラプレジンク（Polaprezinc）の使用を提供することである。

【0009】

本発明の一実施形態では、前記使用は、ポラプレジンクとアンドロゲン受容体拮抗薬を組み合わせて去勢抵抗性前立腺がんの治療薬を調製することを含む。

【0010】

本発明の第２の目的は、ポラプレジンクとアンドロゲン受容体拮抗薬を含む、去勢抵抗性前立腺がんを治療するための医薬組成物を提供することである。

【0011】

本発明の一実施形態では、アンドロゲン受容体拮抗薬とポラプレジンクとの質量比は（１～５）：１である。好ましくは、ＥｎｚａとＰｏｌａの質量比は１～２：１である。

【0012】

本発明の一実施形態では、アンドロゲン受容体拮抗薬は、エンザルタミド（Ｅｎｚａ）、ＥＰＩ－００１（ＥＰＩ）、アビラテロン、オラパリブのいずれか１種以上を含む。

【0013】

本発明の一実施形態では、前記医薬組成物は医薬賦形剤をさらに含む。

【0014】

本発明の一実施形態では、前記医薬賦形剤は、溶剤、噴射剤、可溶化剤、助溶剤、乳化剤、着色剤、接着剤、崩壊剤、充填剤、潤滑剤、湿潤剤、浸透圧調整剤、安定剤、流動助剤、矯味剤、防腐剤、懸濁助剤、コーティング材、香味剤、接着防止剤、統合剤、浸透促進剤、ｐＨ値調整剤、緩衝剤、可塑剤、界面活性剤、発泡剤、消泡剤、増粘剤、包接剤、保湿剤、吸収剤、希釈剤、凝集剤及び解膠剤、濾過助剤及び放出阻害剤を含む。

【0015】

本発明の一実施形態では、前記製剤の剤型は、注射液、注射用凍結乾燥粉末剤、徐放性注射剤、リポソーム注射剤、懸濁剤、植込剤、塞栓剤、カプセル剤、錠剤、丸剤及び経口液剤を含む。

【0016】

本発明の一実施形態では、前記医薬組成物は医薬担体をさらに含んでもよい。

【0017】

本発明の一実施形態では、前記医薬担体はマイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子及びリポソームを含む。

【0018】

本発明の一実施形態では、大量の研究と探索を行ったところ、本発明は、ＣＲＰＣ治療薬、すなわちＥｎｚａとＰｏｌａの併用を見出した。研究結果から分かるように、ＥＰＩ、Ｅｎｚａに対して耐性のある前立腺がんＬＮＣａＰ－ｄｒｕｇ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｐｅｒｓｉｓｔｅｒｓ（Ｌ－ＤＴＰ）細胞株を作成することにより、ＬＮＣａＰ細胞はＥＰＩ、Ｅｎｚａに対して回復可能な薬剤耐性を獲得し、ＥｎｚａとＰｏｌａを併用すると細胞成長を顕著に阻害でき、薬剤併用効果がＣＣＫ８細胞増殖解析により検証され、その相乗作用がＣＩ値により判定される。同時に、Ｃ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルを構築し、動物でのＣＲＰＣの治療に対するＥｎｚａとＰｏｌａの単独使用と併用の効果の差を比較し、薬剤の併用による相乗作用はＣＲＰＣに対する単独のＥｎｚａ薬剤の阻害効果を大幅に向上させ、両者の相乗作用はｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで検証されている。

【0019】

本発明の一実施形態では、本発明は、Ｌ－ＤＴＰ回復可能な薬剤耐性細胞株を作成し、ＣＣＫ８方法及びＣａｌｃｕｓｙｎソフトウェアでＣＩ値を計算した結果、この細胞株では、Ｅｎｚａ又はＰｏｌａの単独使用に比べて、ＥｎｚａとＰｏｌａのｉｎ ｖｉｔｒｏ併用がＣＲＰＣに対して相乗効果を有することが示された。Ｃ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルを確立することにより、Ｅｎｚａを長期間投与し薬剤耐性が発生するモデルで、動物におけるＥｎｚａとＰｏｌａの併用群は、単剤群に比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでより顕著な抗ＣＲＰＣモデル効果を有することは判明した。

【発明の効果】

【0020】

本発明は以下の有益な効果を有する。

【0021】

本発明は、Ｐｏｌａを利用したＣＲＰＣ治療薬の調製、及びＥｎｚａとＰｏｌａの薬剤併用に基づく新たな戦略を初めて提案し、且つその作用機序を記述しており、前立腺がんの臨床治療におけるＥｎｚａとＰｏｌａの使用を促進するものであり、重要な意義がある。薬剤研究は、化合物分子から臨床使用まで平均８～１０年かかり、且つ多くの人的及び物的支援が必要となり、時間コスト及び経済的コストが非常に大きい。本発明の解決手段は、「古い薬剤の新たな使用」を実現し、創薬から臨床転換までの時間を大幅に短縮することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、退薬後のＤＴＰ（ｄｒｕｇ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｐｅｒｓｉｓｔｅｒｓ）の回復可能特性の説明図であり、図１ＡはＤＴＰ及び退薬後の細胞回復のプロセスを示し、図１ＢはＤＴＰ－ＥＰＩを３世代、ＤＴＰ－Ｅｎｚａを３世代退薬した後の、対応する薬剤に対する感受性の回復特性を示す。

【図2】図２はＤＴＰ及び退薬（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｃｅｌｌ）細胞におけるＡＲ関連遺伝子の発現変化の特徴を示し、図２ＡはＷＢによって検出されたタンパク質発現の変化を示し、図２Ｂはｑ－ＰＣＲによって検出された転写産物発現の変化を示す。

【図3】図３はＬ－ＤＴＰ細胞における、ＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＰｏｌａとの併用によるｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効図であり、図３ＡはＬ－ＤＴＰ－ＥＰＩ、Ｌ－ＤＴＰ－Ｅｎｚａ細胞における薬剤併用細胞の相対生存率の棒グラフであり、図３ＢはＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＰｏｌａとの併用による、Ｌ－ＤＴＰ－ＥＰＩ、Ｌ－ＤＴＰ－Ｅｎｚａ細胞のそれぞれにおけるＣＩ値の棒グラフである。

【図4】図４はＣ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルにおける、Ｅｎｚａを連続的に投与し薬剤耐性が発生した後のＥｎｚａ、Ｐｏｌａ及びその併用による前立腺の重量の変化の効果図であり、図４Ａは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの前立腺の重量の変化図であり、図４Ｂは各群のマウスの前立腺を摘出し写真を撮影した比較写真であり、図４Ｃは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの体重の変化図である。

【図5】図５はＣ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルにおける、Ｅｎｚａを連続的に投与し薬剤耐性が発生した後のＥｎｚａ、Ｐｏｌａ及びその併用による効果図であり、図５Ａは各群のマウスの前立腺組織切片のＨＥ染色写真であり、図５Ｂは各群のマウスの前立腺組織切片のＰＲＤＸ５、ＡＲ免疫組織化学写真及び陽性細胞の定量化の棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、明細書の図面及び具体的な実施例を組み合わせて本発明をさらに説明したが、実施例はいかなる形式で本発明を限定するものではない。特に説明しない限り、本発明に用いられる試薬、方法及び装置は本技術分野の従来の試薬、方法及び装置である。

【0024】

特に説明しない限り、以下の実施例で用いられる試薬及び材料は全て市販されている。

【0025】

実施例１ ＥＰＩ、Ｅｎｚａを使用して前立腺がんＬＮＣａＰ細胞でＤＴＰを生成するプロセス
ＥＰＩ、Ｅｎｚａに耐性がある前立腺がんＬ－ＤＴＰ細胞株Ｌ－ＤＴＰ－ＥＰＩ、Ｌ－ＤＴＰ－Ｅｎｚａは回復可能特性を有する。

【0026】

１、実験方法：
１×１０６個のＬＮＣａＰ細胞を１０ｃｍ細胞培養皿に播種し、翌日接着後、ＥＰＩ、Ｅｎｚａをそれぞれ添加して９日間処置し、この期間、薬剤を含む新鮮な培地を３日ごとに交換し、９日後に退薬し、新鮮な培地に交換してインキュベータで細胞を通常通り培養し、６日目、１２日目、１７日目にそれぞれ継代し、ＤＴＰ（９日目）、Ｒ５（退薬の５日目）、Ｒ１０、Ｒ２０の細胞形態の写真を倒立顕微鏡で撮影した。ＤＴＰ及びクローン化ＤＴＰ細胞を生成した後、細胞を消化して計数し、Ｌ－ｐａｒｅｎｔ細胞全体におけるＤＴＰ細胞の割合を算出した。Ｌ－ｐａｒｅｎｔ細胞及び退薬後の３世代（Ｒ２０）の細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに分けて播種し、一晩接着させた後、高濃度から低濃度まで一連のＥＰＩ、Ｅｎｚａを調製し、対照群をウェルに添加し、各濃度で３つの重複ウェルを設置し、細胞インキュベータで４８ｈインキュベートした後にＣＣＫ８を添加し、４ｈ後に全波長多機能マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長の細胞ＯＤ値を検出し、生存率を計数して生存曲線を描いた。

【0027】

２、その結果は図１及び表１に示される。図１において、図１ＡはＤＴＰ及び退薬後の細胞回復のプロセスを示し、図１ＢはＤＴＰ－ＥＰＩを３世代、ＤＴＰ－Ｅｎｚａを３世代退薬した後の、対応する薬剤の感受性の回復特性を示す。

その結果は、ＥＰＩ、Ｅｎｚａによって生成されるＬＮＣａＰ－ＤＴＰ細胞の数が非常に少なく、これらの薬剤耐性細胞が全てＥＰＩ、Ｅｎｚａに対して薬剤耐性を有するが、３世代退薬した後に細胞形態が回復でき、薬剤に対する感受性も回復することを示している。

【0028】

実施例２ ＤＴＰ及び退薬（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｃｅｌｌ）細胞におけるＡＲ関連遺伝子の発現変化の特徴の確立
ＤＴＰ細胞の３世代退薬した後の細胞形態は回復し、このときの細胞のＡＲ関連遺伝子の発現変化も回復できる。

【0029】

１、実験方法：
ＬＮＣａＰ細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、一晩接着させた後、ＥＰＩ、Ｅｎｚａをそれぞれ添加し９日間細胞を処置した後に細胞を回収し、この期間、薬剤を添加した新鮮な培地を３日ごとに交換し、残りのＤＴＰ細胞に対して、退薬してから２０日後に同様に細胞を回収した。ＤＭＳＯで９日間処置したＬＮＣａＰ細胞をＮＣ対照群とし、ＥＰＩ、Ｅｎｚａを添加して９日間処置しＬ－ＤＴＰ－ＥＰＩ、Ｌ－ＤＴＰ－Ｅｎｚａを生成した薬剤耐性細胞を処置群とし、退薬してから２０日後のこの処置群の細胞を回復群とし、この３群の細胞に対して、細胞分解、タンパク質の抽出と定量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動、膜転写、ブロッキング、一次抗体のインキュベーション、二次抗体のインキュベーション、造影を行った後にＡＲ－ＦＬ及びその関連する標的タンパク質、ＡＲ－Ｖｓ及びその関連する標的タンパク質の発現変化を観察した。同時に、この３群の細胞に対してｑ－ＲＴＰＣＲ測定を行い、ＡＲ－ＦＬ及びその関連する標的遺伝子、ＡＲ－Ｖｓ及びその関連する標的遺伝子の発現変化を検出した。

【0030】

２、結果は図２に示された。図２において、図２ＡはＷＢによって検出されたタンパク質発現の変化を示し、図２Ｂはｑ－ＲＴＰＣＲによって検出された転写産物発現の変化を示す。

【0031】

その結果は、ＡＲ及びその関連する標的タンパク質ＰＳＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＡＲ－Ｖｓ及びその関連する標的タンパク質ＵＢＥ２Ｃ、ＣＤＣ２０の発現は全てＤＴＰ段階で異なる程度で減少したが、退薬Ｒ２０後に発現が回復し、同様に、ＡＲ－Ｖｓ及びその関連する標的遺伝子、ＡＲ－Ｖｓ及びその関連する標的遺伝子、及び成長ｍａｒｋｅｒ：ＡＫＴ１、Ｃ－ＭＹＣの発現もＤＴＰ段階で減少し、Ｒ２０の発現が異なる程度で回復することを示している。

【0032】

実施例３ ＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＰｏｌａ薬剤との併用。

【0033】

さらにＣＣＫ８を用いて、薬剤耐性Ｌ－ＤＴＰ細胞にそれぞれ単独使用したり、併用したりすることによる、薬剤耐性Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）及びＬ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）細胞におけるＰｏｌａ薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果を説明した。

【0034】

１、実験方法
薬剤耐性細胞Ｌ－ＤＴＰ（Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）及びＬ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）を含む）を９６ウェルプレートに播種し、接着させた後に、高濃度から低濃度まで一連のＰｏｌａ薬剤を調製することにより、最適なＰｏｌａ薬剤濃度を見つけ、続いて、この濃度で、単独使用（Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）－Ｐｏｌａ）、併用［Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＥＰＩ＋Ｐｏｌａ）］、［Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（Ｅｎｚａ＋Ｐｏｌａ）］のそれぞれによる、薬剤耐性細胞Ｌ－ＤＴＰにおける生存率を測定した。最終的に、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェアを利用して、Ｌ－ＤＴＰ細胞でＣＩ値を計算した。

【0035】

２、結果は図３に示された。図３において、図３ＡはＬ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）、Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）薬剤耐性細胞における薬剤併用細胞の相対生存率の棒グラフであり、図３ＢはＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＰｏｌａとの併用による、Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）、Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚ）薬剤耐性細胞のそれぞれにおけるＣＩ値の棒グラフである。

【0036】

その結果は以下を示している。ＥＰＩを９日間連続的に投与し薬剤耐性が発生したＬ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）細胞において、ＥＰＩを継続投与しても有意な阻害効果が見つけられておらず、Ｐｏｌａを単独で投与しても有意な阻害率もないが、併用（ＥＰＩ＋Ｐｏｌａ）の場合に５５．７４％の阻害率に達することができる。同様に、Ｅｎｚａを９日間連続的に投与し薬剤耐性が発生したＬ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）細胞において、Ｅｎｚａを継続投与しても有意な阻害効果が見つけられておらず、Ｐｏｌａを単独で投与しても有意な阻害率もないが、併用（Ｅｎｚａ＋Ｐｏｌａ）の場合に、６０．７６５％の阻害率に達することができる。ＣＩ値を計算したところ、ＰｏｌａはＬ－ＤＴＰ－ＥＰＩ細胞において０．５２５の高い相乗作用に達することができ、Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）細胞において０．６９５の高い相乗作用に達することができる。

【0037】

実施例４ Ｃ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルにおける、Ｅｎｚａを連続的に投与し薬剤耐性が発生した後のＥｎｚａとＰｏｌａの併用による効果
さらに、前立腺がんマウスモデルにおいて、化学的去勢（すなわち、Ｅｎｚａを連続的に投与した）後に再発したマウスに対するＥｎｚａとＰｏｌａの併用の効果を説明した。

【0038】

１、実験方法
Ｃ－ＭＹＣ（Ｈｉ－Ｍｙｃ）を過剰発現する自然発生前立腺がんマウスモデルを構築し、４ヵ月で、マウスはｍＰＩＮ／Ｃａｎｃｅｒ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎに発症し、このとき、ＮＣ対照群（溶媒の胃内投与）、Ｅｎｚａ投与群にランダムに分け、その後、３日ごとに１回胃内投与し、Ｅｎｚａが１０ｍｇ／Ｋｇであり、合計３０日間投与し、その後、数匹のマウスの首を切断し、前立腺がんの写真を撮影して、重量を測定し、Ｅｎｚａが症状を有意に軽減でき、ＮＣ対照群に対して前立腺の重量が半分に減少したことが分かり、その後、上記方法で残りのマウスに３０日間継続投与し、Ｅｎｚａ群に再発があることが分かり、その後（すなわち、ラットが生後６ヶ月の時）、ＮＣ対照群（常に溶媒を胃内投与）、Ｅｎｚａ単剤群、Ｐｏｌａ単剤群、及びＥｎｚａとＰｏｌａ併用群にランダムに分け、対応する投与処置を行い、全て、３日ごとに１回胃内投与し、毎回Ｅｎｚａが１０ｍｇ／Ｋｇであり、Ｐｏｌａが２０ｍｇ／Ｋｇであり、合計３０日間投与した。その後、マウスの首を切断し、その前立腺がんに対して写真撮影、重量測定、及び免疫組織化学等の実験を行った。

【0039】

２、結果は図４及び図５に示された。図４において、図４Ａは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの前立腺の重量の変化図であり、図４Ｂは各群のマウスの前立腺を摘出し写真を撮影した比較写真であり、図４Ｃは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの体重の変化図である。図５において、図５Ａは各群のマウスの前立腺組織切片のＨＥ染色写真であり、図５Ｂは各群のマウスの前立腺組織切片のＡＲ、ＰＲＤＸ５免疫組織化学写真及び陽性細胞の定量化の棒グラフである。

【0040】

Ｅｎｚａを３０日間連続的に投与したマウスの前立腺の重量の平均値は４１．２ｍｇであり、このときＮＣ対照群の平均値は８５．３ｍｇであり、６０日間継続投与したところ、Ｅｎｚａ群のマウスの前立腺の重量の平均値は７８．４ｍｇになり、このときＮＣ対照群の平均値は９５．６ｍｇであり、薬剤耐性再発が発生し、ＣＲＰＣが引き起こされたのを示し、このとき、すぐに群別に投与し薬剤併用の効果を説明した。

【0041】

群別併用及び単独使用の結果は表２に示され。

図４及び表２を組み合わせて分かるように、Ｅｎｚａの単独使用及びＰｏｌａの単独使用に比べてＥｎｚａとＰｏｌａの併用は非常に顕著な効果があり、前立腺の重量は約５３．１４ｍｇに減少することができ、それと同時に、Ｐｏｌａの単独使用の効果はＥｎｚａの単独使用の効果とほぼ同等であり、Ｐｏｌａの単独使用は薬剤耐性のあるＣＲＰＣに対して顕著な効果がないことを示している。

【0042】

組織切片のＨＥ染色結果（図５）から、併用治療後に、ＣＲＰＣの前立腺腫瘍は有意な変形及び線維化が見られることが分かる。免疫組織化学から、ＥｎｚａとＰｏｌａの併用は、Ｅｎｚａの単独使用及びＰｏｌａの単独使用に比べて、ＡＲ及びＰＲＤＸ５の発現が顕著に減少したことが分かる。併用の効果が顕著であることを証明する。

【0043】

群別併用及び単独使用の結果は表３に示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】