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特表2024-516408３次元細胞凝集体を培養するための細胞培養装置及びこれを用いた細胞培養方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-15
(54)【発明の名称】３次元細胞凝集体を培養するための細胞培養装置及びこれを用いた細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20240408BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240408BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240408BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20240408BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240408BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 Z
C12N5/071
C12N5/0775
C12N5/09
C12N5/077
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023566416
(86)(22)【出願日】2022-04-27
(85)【翻訳文提出日】2023-12-20
(86)【国際出願番号】 KR2022006037
(87)【国際公開番号】W WO2022231310
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】10-2021-0054529
(32)【優先日】2021-04-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523405074
【氏名又は名称】セルロイド カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＯＩＤ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】５０９ｈｏ，８７，Ｃｈｅｏｎｇａｍ－ｒｏ，Ｎａｍ－ｇｕ，Ｐｏｈａｎｇ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｓａｎｇｂｕｋ－ｄｏ ３７６７３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】キム、ドン ソン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ソン ジン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒョン ウ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ド ヒ
(72)【発明者】
【氏名】オム、ソン ス
(72)【発明者】
【氏名】ユン、ジェ スン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029BB11
4B029DA03
4B029DF05
4B029DG06
4B029GA03
4B029GB09
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AC17
4B065BC25
4B065BC42
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
３次元細胞凝集体を培養するための培養装置及び培養方法に関し、具体的には、多孔質のマイクロウェル及びメンブレン、並びにその他の付加的な構成要素を含む培養装置を用いて３次元細胞凝集体を効率よく培養する技術の全般に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
開口部、多孔質メンブレン、及び培養液を収容する細胞培養空間を備える多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバと、前記上部チャンバが内部に配置される空間を備える下部チャンバと、
を含み、
前記上部チャンバの上部に流入した流体は、前記上部チャンバから多孔質マイクロウェルを透過して前記下部チャンバに流入し、
下部チャンバの流体は排出されて流体が流動される
ことを特徴とする３次元細胞凝集体の培養装置。
【請求項2】
前記下部チャンバの流体は、下部チャンバに設けられる流体出口を介して排出されるか、または、上部チャンバと下部チャンバとの間の間隙領域を介して排出される請求項１に記載の３次元細胞凝集体の培養装置。
【請求項3】
前記下部チャンバと同一平面上に配置され、下部チャンバの排出口と流体連通されている培養液貯留槽をさらに含み、前記培養液貯留槽内の培養液の水位は、下部チャンバ内の培養液の水位に相応するように設定される請求項２に記載の３次元細胞凝集体の培養装置。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の３次元細胞培養装置を用いて、上部チャンバの多孔質メンブレン上に細胞を播種する段階と、細胞培養液を上部チャンバの上部へ開口部を介して投入する段階と、
上部チャンバから多孔質マイクロウェルを透過して下部チャンバに流入した細胞培養液を下部チャンバから排出する段階と、
を含む
３次元細胞凝集体の培養方法。
【請求項5】
前記細胞は、誘導多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）および間葉由来の幹細胞、（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を含む幹細胞と、
筋芽細胞（Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）、胎仔線維芽細胞（Ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、静脈内皮細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、肝癌細胞（ＨｅｐＧ２－２細胞）、および表皮細胞（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ）を含む細胞株と、
肝、膵臓または小腸から得られた１次細胞と、からなる群から選択される少なくとも１種以上である
請求項４に記載の３次元細胞凝集体の培養方法。
【請求項6】
前記細胞培養液を下部チャンバに投入する段階をさらに含む請求項４に記載の３次元細胞凝集体の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、３次元細胞凝集体を培養するための培養装置及び培養方法に関し、具体的には、多孔質のマイクロウェル及びメンブレン、並びにその他の付加的な構成要素を含む培養装置を用いて３次元細胞凝集体を効率よく培養する技術の全般に関する。
【背景技術】
【0002】
実際に、体内の細胞は３次元の形状であり、かかる細胞は、細胞の微小環境とも３次元的に相互作用する。一方、細胞培養時、従来の技術のように体外で細胞を３次元構造ではなく、２次元の単層（Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）で培養する場合、体内の細胞と形態的な面で非常に類似性が乏しく、３次元培養する場合、薬物スクリーニング（Ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）および細胞治療剤（Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）として活用する際に実際の生体内現象に一層類似した現象を確認することができる。
【0003】
このように、前記のような２次元の単層細胞培養の限界を克服するために、３次元細胞凝集体（３Ｄ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の培養および分化が可能なマイクロウェルプラットフォームへの要求が世界的に増加しつつある。
【0004】
なお、従来のマイクロウェルは、多孔質構造を持たないか、プラスチックなどを用いたため、３次元細胞凝集体の形成に限界があったし、３次元細胞凝集体が形成されたとしても、マイクロウェルプラットフォームから脱着させる過程が容易ではないという問題があり、かつ、従来提案されてきた培養環境は、培養時に発生する老廃物の排出及び栄養分の供給を受動的拡散のみに依存していたため、３次元細胞凝集体の成長及び成熟を制限するという問題があった。
【0005】
本発明は、前記のような限界及び問題点に鑑みて案出されたもので、３次元細胞凝集体を従来に比して効率よく培養することができる培養装置及びそれを用いた培養方法に関する。
【0006】
また、本発明の前記した技術的問題点を解消することに加えて、本技術分野における通常の知識を持つ者が容易に発明することができない更なる技術要素を提供するために発明された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、３次元細胞凝集体、より正確には、３次元細胞スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）の形成が可能な環境を提供することを目的とする。
【0008】
また、本発明は、細胞培養温度では３次元細胞凝集体の形成を誘導し、培養し易い特性をそのまま維持するが、室温では大量の３次元細胞凝集体が同時にマイクロウェルプレートから脱着自在にすることを目的とする。
【0009】
さらに、本発明は、安定した３次元細胞の培養と、細胞培養時の老廃物を効率よく排出するとともに、細胞の下部まで栄養分を円滑に供給することができるように、多孔質マイクロウェルの下端部に流動調整を可能にすることにその目的がある。
【0010】
また、本発明は、従来広く使用されてきている、繰り返し細胞培養液の入れ替えのために、マイクロウェルの上面である細胞培養面に対するピペッティングによって生じる細胞及び３次元細胞凝集体の消失等を最小化するとともに、持続的に均一な細胞凝集体の周辺環境を提供することができる環境を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記のような問題点を解決するために、本発明による３次元細胞培養装置は、開口部、多孔質メンブレン、及び培養液を収容する細胞培養空間を備える多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバと、前記上部チャンバが内部に配置される空間を備える下部チャンバと、を含み、前記上部チャンバの上部に流入した流体は、前記上部チャンバから多孔質マイクロウェルを透過して前記下部チャンバに流入し、下部チャンバの流体は排出されて流体が流動されることを特徴とする、３次元細胞凝集体の培養装置を提供する。
【0012】
本発明の他の実施形態による３次元細胞凝集体培養方法は、前記３次元細胞凝集体の培養装置を用いて、上部チャンバの多孔質メンブレン上に細胞を播種する段階と、細胞培養液を上部チャンバに投入する段階と、上部チャンバから多孔質マイクロウェルを透過して下部チャンバに流入した細胞培養液を下部チャンバから排出する段階と、を含むことができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、３次元細胞凝縮体、または細胞スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）が効率よく形成できる環境が提供されることにより、一定領域内に安着した細胞がより円滑に３次元的に増殖及び分化できる。
【0014】
また、本発明によれば、温度変化を通じて細胞の培養及び収穫にそれぞれ容易な表面粗さを有する表面構造のマイクロウェルプレートを具現することができ、これによって、３次元細胞凝集体の大量生産及び収穫が可能になるという効果がある。
【0015】
また、本発明によれば、細胞培養時の細胞の安着、増殖及び分化に悪影響を及ぼすことなく、且つ、細胞培養時に形成される老廃物を効率よく除去するとともに３次元細胞の下部まで営養分を円滑に供給することができる培養環境を具現可能になる。
【0016】
また、本発明によれば、細胞を培養する過程中に、細胞および細胞凝集体の消失の可能性を顕著に減少させることができるだけでなく、持続的に均一な細胞凝集体の周辺の微小環境を提供することができる。さらに、培養液貯留槽の高さは、下部チャンバ内の培養液の水位に相応するように設定することで、培養過程で培養物の高さを一定に維持することができる。
【0017】
また、透水係数（Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）に非常に優れた多孔質マイクロウェルを使用して多孔質のマイクロウェル及びその内部で培養中の３次元細胞凝集体に印加される水圧を最小化して流体の流れ以外の無駄な刺激を最小化することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図11】図１１Ａは、本発明のまた他の実施形態によって製造された細胞培養容器の上部チャンバを上から見たイメージを示す図である。図１１Ｂは、図１１Ａの多数の多孔質マイクロウェルの中で一つを拡大して示した図である。
【図14】図１４Ａは、３次元細胞凝集体を培養する過程で撮影したイメージを示す図である。図１４Ｂは、ウェルプレートから脱着された細胞凝集体を示す図である。図１４Ｃは、細胞凝集体が脱着された後のウェルプレートを撮影した図である。
【図15】図１５ａは、本発明の一実施形態による３次元細胞培養装置の例示図であり、図１５ｂは、本発明の３次元細胞培養装置の上部チャンバにおいて、多孔質マイクロウェルの隣接した部分に貫通部が形成されている場合の例示図であり、図１５ｃは、３次元細胞培養装置の実際のイメージを示す図である。
【図16】図１６ａは、本発明の実施例２及び比較例２で測定されたアルブミンの発現量を比較したものであり、図１６ｂは、本発明の実施例３及び比較例４で測定されたＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎの濃度を比較したものである。
【図19】図１９は、本発明のまた他の実施形態による細胞培養装置を示したものであって、図１９ａは、細胞培養装置の全体的な形態を示し、図１９ｂは、一つの上部チャンバと下部チャンバとの組み合わせを拡大して示したものであり、図１９ｃは、排出口と連結された培養液貯留槽を含む細胞培養装置の断面図を示す図である。
【図21】図２１は、多孔質メンブレンが凹部を具備する形態で構成された多孔質マイクロウェルの顕微鏡写真を示す図である。図２１ａは４倍、図２１ｂは２２０倍の倍率で拡大したイメージである。図２１ｃは、多孔質メンブレンが凹部を具備するまた他の形態の多孔質マイクロウェルの写真を示す図であり、図２１ｃのａ）は、ＤＳＬＲカメラ、図２１ｃのｂ）及び図２１ｃのｃ）は、それぞれ４倍と２０倍の倍率で拡大した顕微鏡イメージである。
【図22】図２２は、電気放射時間による多孔質メンブレンのナノファイバネットワークの構造及び特性変化を示す図である。一般的な商用多孔質メンブレンである８μｍ空隙サイズのＴｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、米国）製品のメンブレンを参照のために一緒に添付した（最左側、ＴＷ）。図２２ａは、商用メンブレン、電気放射時間の変化による各ナノファイバネットワーク構造を２０倍の倍率で拡大した顕微鏡イメージである。図２２ｂ、図２２ｃ及び図２２ｄは、商用メンブレンと電気放射時間による各ナノファイバネットワーク構造の空隙率（Ｐｏｒｏｓｉｔｙ）（図２２ｂ）、透水係数（Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）（図２２ｃ））、及び水圧（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（図２２ｄ）を示す図である。
【図23】図２３は、本発明による細胞培養装置を使用する場合の細胞凝集体の消失度と、従来のピペッティングによる細胞培養液の入れ替え方法によって細胞を培養する場合の細胞凝集体の消失度とを比較した実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
【0020】
【0021】
細胞培養容器は、図１及び図２に示されているように、本体１０とメンブレン２０とを含むことができ、追加的にプレート３０をさらに含むことができる。以下では説明の便宜上、プレート３０について前もって説明した後、本体１０及びメンブレン２０について順次に説明することにする。
【0022】
プレート３０は、開口形状である一つ以上の開口部３１を備えているものであって、該開口部３１には本体１０が挿着できる。開口部３１は、図３ａに示したように、下部が閉塞され、上部が開口された開放形態であってもよく、図３ｂに示したように、プレート３０を貫通する貫通形態であってもよい。開口部３１が貫通形態である場合、細胞培養容器は上部が開口された収容空間を有することができ、収容空間は、プレート３０を装着するカバー容器をさらに含むことができる。
【0023】
プレート３０に複数個の開口部３１が具備された場合、これらの各開口部３１が互いに離間して配列されることができ、これによって、細胞培養時には各開口部３１のサンプル同士間の影響を遮断することができ、その結果、複数の独立した実験データを一つのプレート３０を用いて導出することができる。
【0024】
本体１０は、図１及び図２に示したように、スペーサＳＰと、他端に形成された入口部１１と、スペーサと入口部１１を貫通する貫通部と、をそれぞれ含む。ここで、スペーサは、本体１０の側面乃至側壁にあたる部分を指すもので、図面上では符号ＳＰと表示した。図面からも見られるように、スペーサの外面は開口部３１の内側面と対向しており、スペーサと開口部の内側面との間には所定の間隔又は空間が存在することを確認することができる。
【0025】
本体１０のスペーサＳＰは、プレート３０の開口部３１に挿入されることができる。この時、本体１０は一つの挿入部を含んでもよく、複数個の挿入部を含んでもよい。すなわち、一つの挿入部を含む場合、本体１０は該当の挿入部が一つの開口部３１に挿入されることができる。また、複数の挿入部を含む場合、本体１０は各挿入部が多数の開口部３１に対応して挿入されることができる。この時、複数個の挿入部を含む場合、本体１０は各挿入部が互いに連結された構造を有し、各挿入部が各開口部３１に対応して挿入されることができる。
【0026】
【0027】
本体１０のスペーサが開口部３１に挿入される時、本体１０のスペーサは下部に位置し、本体１０の入口部１１は上部に位置する。本体１０のスペーサは、一端から他端まで幅が一様である垂直型であってもよく、一端から他端まで幅が徐々に広くなる漏斗型であってもよく、垂直型と漏斗型とが複合された形態であってもよい。本体１０の貫通部は、その断面が円形、多角形など多様な形状に形成されることができ、そのサイズも多様に形成され得る。
【0028】
図４は、一つの開口部３１の周辺を拡大した示す図である。特に、本体１０のスペーサがプレート３０の開口部３１に装着される時、本体１０のスペーサの一端が細胞培養容器の底面から一定間隔だけ離れるように位置するように、本体１０の入口部１１は、図４に示されたように、本体１０のスペーサ及び開口部３１の入口よりも広い断面を有することが好ましい。これによって、本体１０のスペーサと細胞培養容器の底面との間の空間には細胞に供給するための営養分を有する流体の通路が形成されることができる。この時、細胞培養容器の底面は、開放型プレートの場合は、その開口部の底面であることができ、貫通型プレートの場合は、カバー容器の底面であることができる。
【0029】
メンブレン２０は、細胞が培養される細胞培養面を提供する層であって、本体１０のスペーサ側の貫通部に採用される。例えば、メンブレン２０は、電気放射法によって形成されて本体１０のスペーサの一端を覆う形態で形成されることができる。この時、メンブレン２０は、複数個の高分子ナノファイバがランダムに絡み合ってなるか、高分子合成樹脂が成形されてなることができる。例えば、各高分子ナノファイバは、１ｎｍ以上～１０００ｎｍ未満の直径を有することができる。複数個の高分子ナノファイバからなることによって、メンブレン２０は生体内の基底膜に類似した構造を持つことによって生体内における血液流動環境を提供することができる。
【0030】
例えば、高分子ナノファイバまたは高分子合成樹脂は、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂弾性重合体及び生体高分子の中で少なくとも一つ以上を含むことができる。例えば、高分子ナノファイバまたは高分子合成樹脂は、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ポリフッ化ビニリデン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）のうちの少なくとも一つ以上を含むことができる。
【0031】
メンブレン２０は、多孔質のマイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）２１、連結部２２、及び固定部２３を含むことができる。この時、マイクロウェル２１、連結部２２、及び固定部２３は、複数個の高分子ナノファイバが絡み合うことで互いに連結された構造を持つ。
【0032】
マイクロウェル２１は、細胞培養面として働く領域であって、下向きに凹んで形成される。このような凹み形状によって細胞はマイクロウェル２１内に安着しやすくなり、流体の移動と関係なくマイクロウェル２１内で安定に増殖し得るようになる。この時、マイクロウェル２１は、少なくとも一つが本体１０の貫通部が成す領域内に位置する。すなわち、上部または下部から見る時、マイクロウェル２１は本体１０の貫通部よりも大きさが小さく、貫通部が成す領域内に含まれる。
【0033】
細胞培養面であるマイクロウェル２１が凹み形状に形成されることによって、メンブレン２０は、細胞を細胞培養面に一層集中して安定的に付着させ、細胞培養面の面積を増加させることができることから、細胞の付着効率を向上させることができる。また、通常フラット形状の細胞培養面を具備する従来の細胞培養容器と異なり、本発明による細胞培養容器の本体１０は、立体的な３次元形状の細胞培養面を具備し、これによって、生体内のように３次元構造環境で細胞を培養することができ、３次元細胞スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成することができる。複数個のマイクロウェル２１が本体１０の貫通部が成す領域内に位置する場合、本体１０のスペーサが多数の細胞培養面を持って細胞付着効率をさらに向上させることができる。
【0034】
連結部２２は、任意のマイクロウェル２１とその周辺に形成されてマイクロウェル２１の間を連結する領域であって、フラット形状を有することができる。また、連結部２２は、マイクロウェル２１よりもその厚さが厚くてもよい。これは、後述するエンボス（ｅｍｂｏｓｓｉｎｇ）工程によって、マイクロウェル２１がメンブレン２０内において下部の凹み形状に伸びる領域に該当し、元より薄くなることに対し、連結部２２は伸びない 領域に該当し、元の厚さを維持するからである。
【0035】
固定部２３は、本体１０のスペーサの一端の縁に固定されている領域である。また、固定部２３は、連結部２２よりも厚さが薄く密度が低い。これは、メンブレン２０が電解質溶液を利用した電気放射法によって形成されることができるからである。すなわち、マイクロウェル２１及び連結部２２は、電気放射時に電解質溶液が入った位置で生成される領域にあたるので、固定部２３よりも多くの高分子ナノファイバが形成されるため、固定部２３に比べて密度が大きく厚さが厚く形成されることができる。
【0036】
【0037】
一方、メンブレン２０は、高分子ナノファイバの間の領域に形成された多数の空隙（ｈｏｌｅ）を含む。この時、空隙は数μｍ～数十μｍの寸法を持つことができる。メンブレン２０は、空隙によって単一細胞は透過させないながら他の物質は選択的に透過させる選択的透過膜として働くことができ、これによって、物質移動障壁及び通路の役割が果たすことができる。
【0038】
マイクロウェル２１に形成された第１空隙が成す第１空隙率と、連結部２２に形成された第２空隙が成す第２空隙率とは相異なることができる。この時、空隙率は、単位面積内に存在する空隙面積の割合である。特に、第１空隙率が第２空隙率よりも大きい。これは、メンブレン２０の中でマイクロウェル２１にあたる領域がエムボス工程によって下方の凹み形状に伸びながら、当該領域の中で絡み合った高分子ナノファイバによって詰まっていた多数の部分が開口するか、既に開口した部分の面積が広がる現象が発生するからである。ただし、第１空隙率と第２空隙率との差があることを説明するために、これらの２種の空隙率について説明しているが、本発明がこれらの２種の空隙率だけを有するものに限定されない。すなわち、本発明は第１空隙率及び第２空隙率の以外に多様な空隙率を有してもよい。
【0039】
このような空隙率の差によって、図５に示したように、マイクロウェル２１の周辺領域で流体集中現象が発生し、これに伴い、マイクロウェル２１における細胞増殖が一層活発に行われることができる。これは空隙率が高い領域であればあるほどダルシーの式（Ｄａｒｃｙ’ｓ ｅｑｕａｔｉｏｎ）によって物質透過性がより高いからである。
【0040】
細胞培養のために、プレート３０の開口部３１には流体（例えば、細胞培養液、蒸溜水、ＰＢＳ溶液などの混合物）が満たされるが、かかる流体は、スポイト（ｓｐｕｉｔ）などを利用して周期的に入れ替えなければならない。この時、流体の入れ替えは、例えば、本体１０の外側で流体が吸引排出（ｓｕｃｔｉｏｎ）されると同時に、本体１０の内側に新しい流体が供給される方法で行われることができる。これは、本体１０の内側で流体の吸引排出が行われる場合、マイクロウェル２１に安着して増殖及び分化中の細胞に悪影響を与えるか、当該細胞が一緒に排出されるリスクがあるからである。
【0041】
前述した流体入れ替え過程において、マイクロウェル２１を収容する収容空間に満たされる流体は、マイクロウェル２１及び連結部２２の上方から下方に通過するようになる。この時、マイクロウェル２１は連結部２２よりも空隙率が大きいので、図５に示されたように、連結部２２よりも多くの流体を透過させる。これによって、マイクロウェル２１の周辺では、連結部２２の周辺よりも流体がさらに集中的に移動する現象、すなわち流体集中現象が発生する。
【0042】
このような流体集中現象が発生する場合、マイクロウェル２１内で増殖及び分化中の細胞に、より円滑に流体に含まれた酸素及び栄養素を供給することができ、これにより、細胞増殖及び分化が一層促進されることができる。また、このような流体集中現象によって、マイクロウェル２１の内部へ細胞が集まるようになる現象も発生する。すなわち、空隙率の差を有する多数の領域を具備し、当該領域の中で細胞培養面であるマイクロウェル２１が連結部２２よりも高い空隙率を有するように形成されることで、メンブレン２０はマイクロウェル２１での細胞の増殖及び分化の効率を増加させることができる。
【0043】
プレート３０に複数個の開口部３１が具備された場合、本発明による細胞培養容器は、生体内と同様な３次元構造環境下で実験した複数の独立した実験データを、一つのプレート３０を利用して導出することができる。
【0044】
図６は、本発明の他の一実施形態による細胞培養容器の本体１０及び締結部４０を示す。
【0045】
一方、本発明の他の一実施形態による細胞培養容器は、図６に示されているように、一端と他端が貫通して本体１０のスペーサの一端に締結される締結部４０をさらに含むことができる。
【0046】
この時、締結部４０は一つの貫通部を含んでもよく、複数個の貫通部を含んでもよい。すなわち、一つの貫通部を含む場合、締結部４０は本体１０の各スペーサに締結され、リング形状に形成される。また、複数個の貫通部を含む場合、締結部４０は各貫通部が本体１０の各スペーサに対応して締結される。図６は、締結部４０が一つの貫通部を含む場合に対して示しているが、本発明がこれに限定されるものではなく、本発明の内容は締結部４０が複数個の貫通部を含む場合にも当然適用可能である。
【0047】
締結部４０がさらに含まれる場合、本体１０のスペーサの一端にメンブレン２０が具備されないで締結部４０の一端にメンブレン２０が具備されるか、本体１０のスペーサの一端及び締結部４０の一端ともメンブレン２０が具備されることができる。本体１０のスペーサに締結部４０が締結されれば締結部４０の貫通部と本体１０の貫通部とは互いに連結される。
【0048】
締結部４０は、本体１０のスペーサの一端に着脱（装着及び分離）可能な形態で設けられることができる。例えば、締結部４０の内部または外部にねじ山が形成されており、本体の一端の外部または内部に締結部４０のねじ山に対応するねじ山が形成されてもよい。また、締結部４０は、図６ｂに示したように、本体１０のスペーサの一端の貫通部の内周面に嵌合されてもよく、図６ｃに示したように、本体１０のスペーサの一端の外周に嵌合されてもよい。
【0049】
締結部４０の一端に設けられるメンブレン２０は、前述した本体１０のスペーサの一端に設けられるメンブレン２０において、本体１０のスペーサを締結部４０に代替することを除き、同様である。すなわち、締結部４０の一端に設けられるメンブレン２０は、その位置が本体１０のスペーサの一端から、締結部４０の一端に変わっただけである。したがって、締結部４０の一端に設けられるメンブレン２０に対する詳細な説明は、以下省略し、前述した本体１０のスペーサの一端に設けられるメンブレン２０に対する説明に代えることにする。
【0050】
以下、本発明の一実施形態による細胞培養容器の製造方法について説明する。このような細胞培養容器の製造方法は、マイクロウェル２１またはメンブレン２０の製造方法を含む。
【0051】
図７は、本発明による細胞培養容器の製造方法の手順を示す。
【0052】
本発明の一実施形態による細胞培養容器の製造方法は、図７に示されているように、準備段階Ｓ１０、Ｓ１００及び形成段階Ｓ２０、Ｓ２００を含む。この時、Ｓ１０及びＳ２０は、前述した本体１０及びメンブレン２０の製造方法であり、Ｓ１００及びＳ２００は前述した本体１０、メンブレン２０及び締結部４０の製造方法である。
【0053】
Ｓ１０は、本体１０及びメンブレン２０を用意する段階である。また、Ｓ１００は、本体１０、メンブレン２０及び締結部４０を用意する段階である。この時、本体１０、メンブレン２０及び締結部４０は、図１～図６に基づいて前述した内容と同一なので、これらに対する説明は以下省略する。ただし、メンブレン２０は、電解質溶液を利用した電気放射法によって形成されることができ、次に電解質溶液を利用した電気放射法について説明する。
【0054】
図８は、本発明の他の一実施形態による細胞培養容器の製造方法のＳ１０またはＳ１００に対する一例を示す。
【0055】
電解質溶液を利用した電気放射法は、本体１０のスペーサまたは締結部４０の一端を覆うようにメンブレン２０を形成するものであって、チャンバ内で行われることができる。チャンバは、作業が行われる空間であって、メンブレン２０が形成される時に高分子溶液の外部への漏出を防止することができる。今後、本体１０のスペーサの一端にメンブレン２０を形成する電解質溶液を利用した電気放射法を「第１電気放射法」と呼び、締結部４０の一端にメンブレン２０を形成する電解質溶液を利用した電気放射法を「第２電気放射法」と呼ぶ。まず、第１電気放射法について説明する。
【0056】
第１電気放射法は、電解質充填段階、電圧印加段階及びメンブレン形成段階を順次含むことができる。
【0057】
電解質充填段階は、図８ａに示されているように、一端と他端とが貫通するように形成されている本体１０のスペーサに電解質溶液５０を満たす段階である。この時、本体１０はスペーサの一端が上向きに配置され、他端が遮られる。以後、本体１０のスペーサの一端に電解質溶液５０が満たされる。この時、本体１０の入口部１１を塞ぐための蓋が設けられるが、該蓋には電解質溶液５０に電圧を印加するための電極が具備されることができる。すなわち、電極は蓋を貫通するように形成され、本体１０のスペーサに満たされる電解質溶液５０と連結されることができる。
【0058】
もしくは、電解質充填段階では、図８ｂに示されているように、電解質溶液５０が満たされた電解質容器６０に本体１０のスペーサを配置し、本体１０のスペーサの一端を上向きに配置することで、本体１０の貫通部に電解質溶液５０を充填してもよい。本体１０のスペーサが電解質容器６０の収容空間に配置されると、電解質溶液５０の表面に本体１０のスペーサが触れながら電解質溶液５０の表面を押圧する圧力が生じて、その圧力によって本体１０のスペーサへ電解質溶液５０が満たされるようになる。この時、電解質溶液５０表面の圧力がより生成され易くするために、電解質容器６０の収容空間は本体１０のスペーサの形状に一致するように形成されることができる。
【0059】
電解質溶液５０は、導電性を有するので、電圧印加段階で電圧が印加されれば負（－）電荷を帯びるようになって、正（＋）電荷を有する粒子を電気的引力で引っ張り、これによって、正（＋）電荷を有する粒子は、電解質の上部に集積されることができる。電解質溶液５０は、解離の程度によって強電解質と弱電解質とに分けられる。解離の程度は溶媒によって異なる。
【0060】
例えば、電解質溶液５０としては、塩化カリウムと蒸溜水を３％ｍｏｌ割合で混合した溶液を使うことができる。また、水または有機溶媒（エタノール、メタノール）に溶けて１ｍＳ／ｃｍよりも高い電気伝導度を帯びる物質及び濃度の全てを電解質溶液５０として使うことができる。また、水に溶けて相対誘電率が８０Ｆ／ｍよりも高い値を有する物質及び濃度の全てを電解質溶液５０として使うことができる。
【0061】
電圧印加段階は、図８ｃに示されているように、電解質溶液５０と、電気放射器７０の金属針（ｎｅｅｄｌｅ）７１との間に電圧を印加する段階である。この時、電圧は電源供給機を介して供給されるが、印加電圧の強さの変化によって形成されるメンブレン形成段階で形成されるメンブレン２０の構造に変化が生じる可能性がある。
【0062】
電解質溶液５０と電気放射器７０の金属針７１との間には電場が形成され、この際に形成される電場の強さがあまり低すぎる場合、高分子水溶液が連続的に吐出されず均一な厚さの高分子ナノファイバを製造しにくいのみならず、製造された高分子ナノファイバが電解質溶液５０上に円滑に集束され難い恐れがある。逆に、電場の強さがあまり高すぎる場合、高分子ファイバが電解質溶液５０の上面に正確に安着されないことから、正常な形態を持ち難いことがある。これらのことに鑑み、電解質溶液５０及び電気放射器７０の金属針７１に印加される電圧の強さは、５ｋＶ～３０ｋＶであることができる。
【0063】
電解質溶液５０には、負（－）の電圧を印加し、金属針７１には正（＋）の電圧を印加することができる。これによって、電解質溶液５０は、負（－）の電荷を帯びるようになり、メンブレン形成段階で放射される高分子溶液は、正（＋）の電荷を帯びるようになる。
【0064】
メンブレン形成段階は、図８ｃに示されているように、電圧が印加された状態で電気放射器７０を介して本体１０のスペーサへ高分子溶液を放射してメンブレン２０を形成する段階である。この時、メンブレン２０は、電解質溶液５０の高い自由度によって複数個の高分子ナノファイバがランダムに絡み合った網状に形成される。
【0065】
一方、電気放射器７０は、高分子溶液を供給するデバイスである。すなわち、電気放射器７０は、高分子溶液を電気放射が可能な適切な粘度を有するように貯留した後、金属針７１を介して高分子溶液を吐出することができる。この時、吐出された高分子溶液は、飛散と同時に硬化されて高分子ナノファイバを形成することができる。
【0066】
金属針７１は、高分子溶液を吐出する構成である。金属材質からなることにより、金属針７１は電源供給機と連結しやすく、電源供給機から電圧が印加される際に吐出される高分子溶液の電荷帯電効率を向上させることができる。特に、金属針７１は、本体１０のスペーサと離間した上部に位置し、その吐出端部が本体１０のスペーサに向けるように配置された状態で高分子溶液を放射することができる。
【0067】
例えば、電気放射器７０は、注射器、注射器ポンプ、及び金属針７１で構成されることができる。すなわち、高分子溶液を注射器に入れて注射器ポンプの動力によって金属針７１で高分子溶液を空気中に吐出することができる。この時、金属針７１は、２３ゲージ針（Ｇａｕｇｅ ｎｅｅｄｌｅ）を用いることができるが、高分子溶液によってそのサイズが異なることができる。特に、電解質溶液５０の表面形状を維持しながら電解質溶液５０の表面に高分子ファイバが載置されるように、高分子溶液は０．０１ｍｌ／ｈ～３ｍｌ／ｈの吐出速度で放射されることができる。
【0068】
前述した電圧印加範囲（５ｋＶ～３０ｋＶ）及び吐出速度の範囲（０．０１ｍｌ／ｈ～３ｍｌ／ｈ）で高分子溶液を放射すると、高分子ナノファイバはその直径が１０ｎｍ～９００ｎｍで形成されることができる。
【0069】
高分子溶液としては、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）とメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）を１：１の質量比で混合した溶液に、ポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）を混合した５％～２５％濃度の溶液を用いることができる。また、アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）とジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を３：７の体積比で混合した後、ポリフッ化ビニリデン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）を混合した２５％～３０％濃度の溶液を高分子溶液として用いることができる。そのほかにも、ポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｒｅｎｅ）、ポリカーボネート（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、コラーゲンとポリカーボネートとの混合溶液（ｃｏｌｌａｇｅｎ／Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｌｅｎｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ゼラチンなどを用いて高分子溶液を製造することができる。
【0070】
メンブレン形成段階で、電解質溶液５０が充填された本体１０のスペーサ側の貫通部と高分子溶液との間で発生する電気的引力は一定であり、本体１０のスペーサの縁と高分子溶液との間で発生する電気的引力に比べてより大きいことができる。これによって、電解質溶液５０が充填された本体１０のスペーサ側の貫通部に集積されるメンブレン２０の領域（以下、「貫通部領域」という）は一定であり、比較的大きい密度及び厚さを有する。
【0071】
これに対し、本体１０のスペーサの縁と高分子溶液との間で発生する電気的引力の大きさは、本体１０のスペーサの貫通部と高分子溶液との間に発生する電気的引力の大きさに比べて小さく、本体１０のスペーサの貫通部から遠ざかるほど次第に小さくなる。これによって、本体１０のスペーサの縁に集積されるメンブレン２０である固定部２３は一定ではないが、比較的小さい密度及び厚さを有する。
【0072】
メンブレン形成段階は、電気放射器７０の放射時間を調節して本体１０のスペーサの一端に形成されるメンブレン２０の厚さ、空隙率及び透明度のうちのいずれか一つ以上を調節する段階をさらに含むことができる。すなわち、電気放射器７０の放射時間が長くなるほど集積される高分子ナノファイバの量が多くなる。これによって、本体１０のスペーサの一端に形成されるメンブレン２０はその厚さが厚くなるとともに、その空隙率及び透明度が小さくなるようになる。
【0073】
また、メンブレン形成段階は、高分子溶液の濃度を調節して形成されるメンブレン２０の高分子ナノファイバの直径を調節する段階をさらに含むことができる。すなわち、高分子溶液の濃度が高くなると、その粘性度が大きくなるので、本体１０のスペーサの一端に形成されるメンブレン２０の高分子ナノファイバの直径は大きくなるようになる。
【0074】
次に、第２電気放射法について説明する。
【0075】
第２電気放射法は、第１電気放射法と同様に、電解質充填段階と、電圧印加段階と、メンブレン形成段階とを含み、追加で締結部締結段階をさらに含むことができる。この時、電解質充填段階、電圧印加段階、及びメンブレン形成段階は、前述した第１電気放射法における本体１０のスペーサを締結部４０に代替することを除き、同一である。よって、第２電気放射法の電解質充填段階、電圧印加段階、及びメンブレン形成段階に対する詳細な説明は以下省略し、前述した第１電解質電気放射法の電解質充填段階、電圧印加段階、及びメンブレン形成段階に対する説明に代える。
【0076】
第２電気放射法では電解質充填段階、電圧印加段階、及びメンブレン形成段階を通じて締結部４０の一端にメンブレン２０を形成することができる。その後、締結部締結段階は、一端と他端とが貫通するように形成された本体１０のスペーサの一端に、メンブレン２０が形成された締結部４０を締結する段階である。例えば、締結部締結段階は、本体１０のスペーサまたは締結部４０を移送して本体１０のスペーサと締結部４０とを締結する移送装置によって行われることができる。
【0077】
ただ、第１電気放射法及び第２電気放射法は、メンブレン２０を形成した後、本体１０のスペーサまたは締結部４０の形状に合わせて形成されたメンブレン２０を切削する段階をさらに含むことができる。
【0078】
図９は、本発明の他の一実施形態による細胞培養容器の製造方法のＳ２０またはＳ２００に対する一例を示す。
【0079】
Ｓ２０は、本体１０のスペーサに形成されたメンブレン２０にエンボス工程を行う段階である。また、Ｓ２００は、締結部４０に形成されたメンブレン２０にエンボス工程を行う段階である。
【0080】
すなわち、Ｓ２０またはＳ２００では、図９に示されているように、マイクロウェル２１のパターンが形成されたモールドＭを利用してＳ１０またはＳ１００で用意したメンブレン２０にエンボス工程を行う。この時、エンボス工程は、モールドＭでメンブレン２０を加圧し、モールドＭのパターンに対応するパターンをメンブレン２０に形成する工程である。すなわち、エンボス工程の結果、メンブレン２０にはマイクロウェル２１及び連結部２２が形成されることができる。
【0081】
エンボス工程は、加熱されたモールドＭでメンブレン２０を加圧するホットエンボス（ｈｏｔ ｅｍｂｏｓｓｉｎｇ）工程であってもよいが、これに限定されるものではない。ホットエンボス工程を用いる場合に、より早くＳ２０の結果を導出することができる。
【0082】
モールドＭは、マイクロウェル２１のパターンによって下部が突出した第１モールドＭ１と、マイクロウェル２１のパターンによって上部が凹んでいる第２モールドＭ２と、を含むことができる。すなわち、第１モールドＭ１と第２モールドＭ２との間にメンブレン２０を設け、第１モールドＭ１及び第２モールドＭ２を加圧して合体した後に分離することでメンブレン２０にマイクロウェル２１及び連結部２２を形成することができる。合体時、第１モールドＭ１の突出した部分がメンブレン２０の一面に接触し、第２モールドＭ２の凹部がメンブレン２０の他面に接触する。
【0083】
ホットエンボス工程の場合、合体の前に、第１モールドＭ１及び第２モールドＭ２のいずれか一つが加熱されてもよく、第１モールドＭ１及び第２モールドＭ２がいずれも加熱されてもよい。ただし、第１モールドＭ１の突出した形状がマイクロウェル２１形成により一層多くの影響を及ぼすので、第１モールドＭ１だけを加熱して使用することが好ましい。また、加熱された第１モールドＭ１または第２モールドＭ２の温度は、メンブレン２０を成す高分子ナノファイバの融点よりも低い方が好ましい。
【0084】
図１０は、本発明の一実施形態による細胞培養容器の製造方法で形成したメンブレン２０の写真を示す。この時、図１０ｃは、メンブレン２０の平面写真を示し、図１０ｄは、図１０ｃを拡大して示したマイクロウェル２１及び連結部２２の平面図を示す。また、図１０ａは、マイクロウェル２１の拡大写真を示し、図１０ｂは、図１０ａのマイクロウェル２１に形成された第１空隙を示す。また、図１０ｅは、連結部２２の拡大写真を示し、図１０ｆは、図１０ｅの連結部２２に形成された第２空隙を示す。
【0085】
本発明の一実施形態による細胞培養容器の製造方法で形成したメンブレン２０は、図１０ａ及び図１０ｅに示されているように、複数個の高分子ナノファイバが絡み合った網状に形成されていることを確認することができる。また、図１０ｂ及び図１０ｆを参照すれば、本発明の一実施形態による細胞培養容器の製造方法で形成したメンブレン２０において、マイクロウェル２１に形成された第１空隙は、連結部２２に形成された第２空隙よりも個数が多いことを確認することができる。この時、第１空隙率は第２空隙率に比べて約１０倍以上増加したことを確認することができる。
【0086】
図１～図１０を参照して細胞培養容器及びその製造方法について説明した。ここで、前記した図１～図１０を参照した実施例では、マイクロウェル、または連結部などのようにメンブレンを構成する一部分の空隙率が如何なる条件を持たなければならないかについても一部言及したが、本発明による細胞培養容器は、流体または物質が通過できる程度の空隙だけ形成されていればよく、空隙率は如何なる制約条件なしに任意の数値を有することができる。すなわち、本詳細な説明で言及されるすべての実施例において、空隙の存在は当然認められるが、空隙率の差は細胞培養容器を具現するに際して必須な限定事項ではないことを理解すべきである。
【0087】
【0088】
まず、図１に対する説明では多孔質マイクロウェル２１及びプレート３０について説明したが、また他の実施形態では前記多孔質マイクロウェル２１上に温度による表面構造変化を有するコーティング組成物をコーティングして、温度による表面構造が変わる細胞培養層が含まれた細胞培養容器を具現することができる。
【0089】
温度による表面構造変化を有する細胞培養層は、前記多孔質マイクロウェル２１の上面に３２℃超過～４０℃以下では細胞に対する付着力が高くて細胞の培養に好適な表面構造を持ち、０℃以上～３２℃未満では細胞の脱着に好適な表面構造を持って細胞を回収するのに適した形態に形成されることができる。
【0090】
前記細胞培養層は、ポリイソピルアクリルアミド（Ｐｏｌｙ（Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ＰＮＩＰＡＡｍ）を含むことができ、３２℃超過～４０℃以下で表面粗さが４～３７ｎｍであり、望ましくは、２０～３２ｎｍであり、０℃以上～３２℃未満で表面粗さが４μｍ以上である、温度による表面粗さ変化特性を有することができる。この時、前記表面粗さは、３００ｋＨｚの振動数を使用するＰＰＰ－ＮＣＨＲ片持ち梁または２５ｋＨｚの振動数を使用するＢＬ－ＡＣ４０ＴＳ片持ち梁を利用した非接触方式の原子間力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｐａｒｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、韓国）で測定されたものを意味する。
【0091】
前記細胞培養層は細胞培養層の総重量を基準として、１～５重量％の架橋剤を含むことができ、望ましくは、１重量％超過～３重量％未満を含むことができる。前記架橋剤の含有量が１重量％未満である場合は、細胞培養層に細胞が付着しにくい問題が生じることができ、５重量％を超える場合は、ＬＣＳＴ（下限臨界共溶温度、ｌｏｗｅｒ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）未満の温度で細胞スフェロイドの脱着がよく行われないという問題が生じることができる。
【0092】
さらに、前記多孔質マイクロウェル２１は、流体に対する透過性を有する反面、これを除いた部分は流体に対する透過性を有していない。この時、前記多孔質マイクロウェル２１の空隙は、平均直径１００ｎｍ～２０μｍの気孔サイズを持つことができ、望ましくは、１００ｎｍ～５μｍの気孔サイズを持つことができる。このような気孔サイズによって、前記多孔質マイクロウェルは、単一細胞は透過させないながらも他の物質は選択的に透過させる選択的透過膜として働くことができ、これによって、物質移動障壁及び通路の役割を果たすことができる。
【0093】
また、前記のように多孔質マイクロウェル２１とその周辺部との透過率の差によって、前記多孔質マイクロウェル２１及び細胞培養層を通過して流体が流れる場合、前記多孔質マイクロウェルで流体集中現象が発生することができる。このような流体集中現象が発生する場合、多孔質マイクロウェルで増殖及び分化中の細胞に、流体に含まれた酸素及び栄養素を円滑に供給することができ、これによって、細胞増殖及び分化がさらに促進されることができる。また、このような流体集中現象によって多孔質マイクロウェル内に細胞が集まるようになる現象も発生して細胞凝集体、またはスフェロイドの形成が容易である。
【0094】
また、本発明の細胞培養容器は、図１に示されているように、上部チャンバ１００及び下部チャンバ２００を含むことができる。前記下部チャンバ２００は、上部チャンバ１００が配置または装着されて細胞培養液などが流れることができるチャンバであることができる。さらに、本発明は多くの細胞を同時に培養し得るように、複数個の上部チャンバが配置されている下部チャンバを使用でき、前記上部チャンバの数は、当業界で通用される個数であれば制限なしに使用可能である。
【0095】
以下では、３次元細胞培養容器を製造する方法について説明する。具体的に、前記方法は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体、架橋剤、及び残部の水を含み、前記架橋剤は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体及び水の混合物１００重量部を基準として１重量部以上～５重量部未満のコーティング水溶液を提供する段階と、下部に多孔質マイクロウェルを含むウェルプレートチャンバの多孔質マイクロウェルの上面に前記コーティング水溶液を利用してコーティング層を形成する段階と、前記コーティング層にＵＶを照射して細胞培養層を形成する段階と、を含むことができる。
【0096】
本実施形態は、前記架橋剤の含有量を調節することで細胞培養用支持体の温度変化による細胞の脱着率を調節することができ、前述のように前記架橋剤は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体及び水の混合物１００重量部を基準として、１重量部以上～５重量部未満、望ましくは、１重量部超過～３重量部未満であることができる。前記架橋剤の含有量が、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体及び水の混合物１００重量部を基準として１重量部未満である場合は、細胞培養用支持体に細胞が付着しにくいという問題が生じることができ、５重量部以上である場合は、ＬＣＳＴ未満の温度で細胞の脱着が行われ難いという問題が生じることができる。
【0097】
一方、前記架橋剤は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体をポリイソピルアクリルアミドで重合させる役割をするものであって、ポリイソピルアクリルアミドの製造に使われる通常の方法、すなわち、単独重合（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、共重合ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ及び３元共重合（ｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、架橋重合（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）などに用いられることができる架橋剤であれば、制限なしに使用可能であり、望ましくは、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（Ｎ，Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ；ＭＢＡＡｍ）及びテトラメチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、ＴＥＭＥＤ）またはこれらの混合が架橋剤として用いられることができる。
【0098】
前記コーティング水溶液中で単量体がＵＶによって架橋結合を行うことができるように、前記コーティング水溶液は、光開始剤をさらに含むことができる。この時、前記光開始剤は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体及び水の混合物１００重量部を基準として、０．０１～０．１重量部であることができ、望ましくは、０．０１～０．０５重量部であることができる。前記光開始剤の含有量が、０．０１重量部未満である場合は、ＵＶによる架橋結合が行われないという問題が生じることができ、０．０５重量部を超える場合は、架橋結合剤それ自体の毒性に起因して、後で後細胞培養に際して細胞が前記毒性によって死んでしまうという問題が生じることができる。
【0099】
一方、前記光開始剤は、ＵＶを通じて架橋結合を開始することができるものであれば、制限なしに使用でき、例えば、２－ヒドロキシ－１－１［４－（ヒドロキシエトキシ］フェニル］－２－メチル－１プロパノンを使用することができる。
【0100】
前記コーティング層を形成する段階は、前記コーティング水溶液によるコーティング層が前記多孔質マイクロウェルへ流体が透過される程度に形成されるものであれば、特に制限がなく、例えば、前記コーティング層を形成する段階は、スピンコート法またはバーコート法を用いて前記コーティング層を形成することができる。さらに、前記コーティング層によって形成された細胞培養層は、ヒドロゲルのような形態で形成されるので、溶液の移動が円滑であるので、多孔質マイクロウェルとヒドロゲルを通過して流体が流れることができる。
【0101】
前記コーティング層にＵＶを照射して細胞培養層を形成する段階は、単量体を重合する段階であって、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドの重合体（ポリイソピルアクリルアミド）が形成されることができる程度に遂行されるようにＵＶを照射するものであれば特に制限がなく、例えば、ＵＶを１８００ｗで１０分間照射して遂行されることができる。
【0102】
一方、培養される細胞の脱着のために、３次元細胞凝集体の培養方法は、３２℃超過～４０℃以下の温度で３次元細胞凝集体を細胞培養層に付着させて培養させ、０℃以上～３２℃未満の温度で３次元細胞凝集体を細胞培養層から脱着させる段階を含むことができ、前記細胞は、筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）、胚線維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、またはヒト表皮細胞（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0103】
＜実施例１＞
【0104】
実施例１では、下部に多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバを製造した。具体的に、ポリメタクリル酸メチル（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ、ＰＭＭＡ）に一定した大きさの穴を穿孔して接着剤とともに高分子ナノファイバを穴が空いたＰＭＭＡと結合して、多孔質マイクロウェルを製造した。
【0105】
次に、高濃度のＮ－イソプロピルアクリルアミド単量体を含む溶液内で現われる相分離現象を利用して、高い含有量の割合のＮ－イソプロピルアクリルアミド水溶液と、低い含有量の割合のＮ－イソプロピルアクリルアミド水溶液を製造した。製造された多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバの多孔質マイクロウェルの上面に、前記コーティング水溶液を利用して多孔質マイクロウェルの上面に３２℃超過～４０℃以下では細胞が付着し、０℃以上～３２℃未満では細胞が脱着される細胞培養層が形成される、細胞培養容器を製造した。
【0106】
具体的に、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体と蒸溜水とを１：１質量比で混合して、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体が蒸溜水に十分に溶けることができるように５分間攪拌した。時間が経過するにつれ、低い濃度のＮ－イソプロピルアクリルアミド水溶液と高い濃度のＮ－イソプロピルアクリルアミド水溶液とは、安定的に分けられるようになり、最終的に、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド水溶液が安定的に分離された時、ピペッティングを利用してそれぞれの溶液をバイアルに移してＮ－イソプロピルアクリルアミド：水の質量比が８７：１３である高い含有量の割合のＮ－イソプロピルアクリルアミド水溶液５ｍｌを得た。
【0107】
次に、紫外線照射処理を行う時紫外線に反応させるための架橋剤であるＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（Ｎ，Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、ＭＢＡＡｍ）０．０５ｇ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体及び水の混合物１００重量部：１重量部）と、光開始剤である２－ヒドロキシ１－１［４－（ヒドロキシエトキシ）フェニル］－２－メチル－１－プロパノン０．００５ｇ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド単量体及び水の混合物１００重量部：０．０１重量部）を得たそれぞれのＮ－イソプロピルアクリルアミド水溶液に添加した。
【0108】
Ｎ－イソプロピルアクリルアミド水溶液に架橋剤及び光開始剤を添加して製造された組成物をバーコートを利用して前記高分子ナノファイバ上に薄く塗布した後、ＵＶ光源を１０分間照射して多孔質マイクロウェルの上面に３２℃超過～４０℃以下では細胞が付着し、０℃以上～３２℃未満では細胞が脱着される細胞培養層が形成される、細胞培養容器を製造した。
【0109】
【0110】
＜実験例１＞
【0111】
表面粗さの変化を測定するために、実施例１の細胞培養層の温度及び時間による表面粗さの変化を原子間力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＰａｒｋＳｙｓｔｅｍｓ社製、韓国）で測定した結果、図１２に示した。
【0112】
図１２に示したように、ＬＳＣＴを超える温度である３７℃では、実施例１の細胞培養層の表面粗さの変化がほとんどないことに対し、ＬＳＣＴ未満の温度である２０℃では、実施例１の細胞培養層の表面粗さの変化が急激に発生することを確認することができた。
【0113】
＜実験例２＞
【0114】
実施例１で製造された細胞培養容器において、３２℃超過～４０℃以下では細胞が付着し、０℃以上～３２℃未満では細胞が脱着される細胞培養層の形態的な差を確認するために、走査電子顕微鏡を活用して表面形状を比較した。
【0115】
図１３Ａは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドを含む組成物を高分子ナノファイバにコーティングする前を示し、図１３Ｂは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドを含む組成物が高分子ナノファイバにコーティングされた後の細胞培養層を示す。前記細胞培養層は、高分子ナノファイバとヒドロゲルとが結合された形態である。
【0116】
＜実験例３＞
【0117】
３６℃で実施例１の細胞培養容器にヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して３日後に３次元細胞凝集体を培養した。培養された３次元ヒト肝癌細胞株凝集体を収穫するために３次元ヒト肝癌細胞株凝集体を含む上部チャンバを２０℃の環境に移動した。
【0118】
図１４Ａは、細胞を培養中の細胞培養容器を撮影したイメージであり、図１４Ｂは、培養された細胞を撮影したイメージを示す。また、図１４Ｃは、培養された細胞を脱着させた細胞培養容器を撮影したイメージを示す。図５Ｃに示したように、本発明の細胞培養容器で培養された細胞は脱着され易いことを確認することができた。
【0119】
【0120】
本実施例は、細胞培養時に生成される老廃物を容易に除去して３次元細胞の下部まで営養分を円滑に供給することができる３次元細胞培養装置に関する。具体的に、本発明は、開口部及び多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバ１００と、前記上部チャンバが配置され、多孔質マイクロウェルの下端において、流体の流動が可能な下部チャンバ２００をと、含む３次元細胞培養装置に関する。
【0121】
図１５を参照する時、前記上部チャンバ１００は、開口部１１及び多孔質マイクロウェル２１を含むウェル形態のチャンバがプレートを貫通して嵌められている形態を意味することができる。なお、前記多孔質マイクロウェル２１の下端は、多孔質マイクロウェルの下部領域を意味するもので、下部チャンバ２００内の領域を意味する。
【0122】
前記上部チャンバ１００には、下部チャンバ２００の流体が外部と接触するように貫通部が形成されることができ、この時、前記貫通部は、上部チャンバ１００の多孔質マイクロウェル２１の隣接した部分に形成されてもよく、前記上部チャンバ１００の任意の位置に貫通部が形成されてもよい。前記のように流体が外部と接触される場合、流体の流れによって形成された物理的な力によって多孔質メンブレンの形態が変形されることを防止し得るものであれば、前記貫通部の位置は特に限定されない。
【0123】
前記下部チャンバ２００は、流体が流動することができる流体流入口３１０及び流体排出口３３０をさらに具備することができ、これによって、前記下部チャンバ２００の流体が流動することができる。さらに、前記流体流入口３１０及び流体排出口３３０は、流動を引き起こすことができる装置がさらに連結されてもよく、例えば、前記下部チャンバ２００は、流体が多孔質マイクロウェル２１の水平方向に流れるようにする流体の流れを誘導する装置と連結されることができる。この時、前記流体の流れを誘導する装置として、ポンプなどを使用することができるが、前記流体の流動を引き起こすことができるものであれば特に限定されない。
【0124】
このように、前記３次元細胞培養装置は、前記下部チャンバ２００を流れる流体が多孔質マイクロウェル２１の下端に流れるようにする流体流動誘導装置によって前記下部チャンバ２００の流体が安定に流れるようにし、前記多孔質マイクロウェル２１の空隙の透過性によって、前記のような流れを有する流体が３次元細胞培養時に形成される老廃物を多孔質メンブレンの上面から下部チャンバ２００へ排出させることができ、３次元細胞の下部まで営養分を円滑に供給することができる。ひいては、下部チャンバ２００から３次元細胞培養装置の外部へ老廃物を排出させることができる。例えば、前記流体流動誘導装置は、シリンジポンプ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｐｕｍｐ）、ペリスタポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）または攪拌機などを使用することができる。
【0125】
また、前記３次元細胞培養装置は、３次元細胞培養時、多孔質マイクロウェルに印加される圧力を分散させるとともに、形成される老廃物及び営養分を効率よく除去及び供給し得るように、前記上部チャンバ１００は、下部チャンバ２００の流体の表面が外部と接触するように貫通部４００が形成されることができる。
【0126】
前記貫通部４００は、下部チャンバ２００の流体の表面が外部と接触可能な構造を提供することで、前記のような構造によって流体の流れ時に上部チャンバ１００に圧力がかかって多孔質マイクロウェル２１が変形され、これにより、３次元細胞培養時細胞の安着、増殖及び分化に悪影響を及ぼすという問題を解決することができる。
【0127】
一方、本発明は本発明の３次元細胞培養装置を利用して多孔質マイクロウェルに細胞培養液及び細胞を投入して細胞を培養する段階を含む３次元細胞培養方法を提供し、前記細胞は筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）、胚線維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞）またはヒト表皮細胞（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0128】
以下、具体的な実施例によって本発明をより具体的に説明する。下記実施例は本発明の理解を助けるための例示に過ぎず、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
【0129】
＜実施例２＞
【0130】
図１５ａのような形態の多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバ１００と、下部チャンバ２００とを含む３次元細胞培養装置において、多孔質マイクロウェル２１にＨｅｐＧ２細胞及びＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉａ、ＦＢＳ１０％）培養液と一緒に注入した後、これを３７℃で４８時間安定化させて３次元スフェロイドを形成した。その後、下部チャンバに流動を与えて９日間培養した。
【0131】
＜比較例２＞
【0132】
前記実施例２で下端流動を与えないことを除き、実施例２と同様に３次元のＨｅｐＧ２スフェロイドを培養した。
【0133】
前記実施例２及び比較例２において、前記培養期間中、６日目及び９日目でＨｅｐＧ２スフェロイドのアルブミン発現量を測定した。測定されたアルブミン発現量を図１６ａに示し、図１６ａに示したように、比較例２で培養されたＨｅｐＧ２スフェロイドのアルブミン発現量は、６日目に１１８２．６４ｍｇ／ｍｌ、９日目に２９６６．５０５ｍｇ／ｍｌである一方、実施例２で培養されたＨｅｐＧ２スフェロイドのアルブミン発現量は、６日目に４８１３．９９ｍｇ／ｍｌ、９日目に６６４４．５５ｍｇ／ｍｌであることを確認することができた。すなわち、下端流動のある３次元細胞培養装置で培養させたＨｅｐＧ２スフェロイドのアルブミン発現量が大きいことが分かったし、これから、下端流動によって３次元ＨｅｐＧ２スフェロイドの機能性の向上を確認することができた。
【0134】
＜実施例３＞
【0135】
下端流動による本発明の３次元細胞培養装置において、老廃物が効率的に除去されることができることを確認するために、図１５ａのような形態の３次元細胞培養装置の多孔質マイクロウェルにＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ ２０ｋＤａを２００μｇ／ｍｌを入れ、下端流動を３時間の間行った後、多孔質マイクロウェルに残っているＦＩＴＣ Ｄｅｘｔｒａｎの濃度を測定した。
【0136】
＜比較例３＞
【0137】
前記実施例３で下端流動を与えないことを除き、実施例３と同様に、ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎを入れて３時間後に多孔質マイクロウェルに残っているＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎの濃度を測定した。
【0138】
実施例３にて老廃物が蓄積された程度を肉眼で観察した結果を、図１７に示したし、前記実施例３及び比較例３で測定されたＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎの濃度を図１６ｂに示した。図１６ｂに示されているように、下端流動のある実施例４の場合、多孔質マイクロウェルに残っているＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎの濃度は、５５．６１９９±３．３４２９ｍｇ／ｍｌであることに対し、比較例３の場合、多孔質マイクロウェルに残っているＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎの濃度は、１３１．４３５±７．８０２４５ｍｇ／ｍｌであることを確認することができた。
【0139】
すなわち、下端流動がある時、多孔質マイクロウェルに残っているＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎの濃度は、下端流動がない場合に比べて著しく低く、同量の培養液であっても下端流動のあった時の方が、多孔質マイクロウェルに残っている細胞の老廃物を効率よく除去できることを確認することができた。これは、図１８ａのように、下部チャンバにおいて、流体流動誘導装置及び多孔質マイクロウェルによって多孔質マイクロウェルの上面の老廃物が除去されることを確認することができた。図１８ａは、培養液の下端流動があるときに、多孔質マイクロウェル内に存在していた老廃物が空隙を通過して除去される様子、言い換えれば、老廃物が流体の流れに沿って空隙を通過するようになることで、マイクロウェルの内部から除去される様子を示したものである。一方、図１８ｂは、培養液が下部チャンバ内において、下端流動される時に培養液が自然にマイクロウェルの内部へ拡散される現象を示したもので、培養液の下端流動がある時にメンブレンの空隙を介して老廃物が除去されることができるのみならず、培養液の拡散も同時に起きることができることを説明するための図である。図１８ａ及び図１８ｂを参照するとき、老廃物が空隙を通過する方向と培養液が空隙を通過する方向とは、互いに反対の方向になることは言うまでもない。
【0140】
【0141】
本実施例によれば、細胞を培養する過程において、マイクロウェルの上部でピペッティングを介して使用済みの細胞培養液を除去し、新しい細胞培養液を注入する既存の細胞培養液の入れ替え法を用いる場合、ピペッティングによる培養液流動によって細胞及び細胞凝集体の消失が発生することができるという問題を解決することができる。また、持続的に多孔質マイクロウェルを透過して誘導される細胞凝集体の周辺の流動によって営養分のような均一な細胞微小環境の具現が可能である。したがって、本発明によれば、培養過程で前記のような細胞の消失を最小化することができるとともに、持続的に均一な細胞凝集体の周辺の微小環境を誘導し、２次元培養に比べて生体内における現象と一層類似した現象を示す３次元の細胞凝集体を培養することができるようになる。
【0142】
図１９を参照する時、本実施例による細胞培養装置は、開口部、多孔質メンブレン、及び培養液を収容する細胞培養空間を有する多孔質マイクロウェル２１を備える上部チャンバ１１０を含む。また、前記上部チャンバ１１０が内部に配置される空間を具備する下部チャンバ２１０を含み、前記上部チャンバ１１０の上部に流入した流体は、前記上部チャンバ１１０から多孔質マイクロウェル２１を透過して前記下部チャンバ２１０に流入し、下部チャンバ２１０の流体は排出されて流体を流動させるように具現される。
【0143】
また、本詳細な説明では、図１９の細胞培養装置を利用して、上部チャンバ１１０の多孔質メンブレン上に細胞を播種する段階と、細胞培養液を上部チャンバ１１０の上部へ流入口３１１または開口部を介して投入する段階と、上部チャンバ１１０から多孔質マイクロウェルを透過して下部チャンバ２１０に流入した細胞培養液を、下部チャンバ２１０から排出する段階と、を含む３次元細胞凝集体培養方法について言及することにする。また、前記３次元細胞凝集体培養方法は、下部チャンバ２１０から排出される細胞培養液によって細胞培養液が流動するようになり、ひいては、前記細胞培養液を下部チャンバ２１０へ投入する段階をさらに含むこともできる。
【0144】
本発明の一実施形態による３次元細胞培養装置は、上部チャンバ１１０の上部に流入した流体が前記上部チャンバ１１０から多孔質マイクロウェル２１を透過して前記下部チャンバ２１０に流入し、ひいては、下部チャンバ２１０の流体は排出されて流体を流動させ、この時、前記下部チャンバ２１０の流体は、下部チャンバ２１０に具備された流体排出口を介して排出されるか、または上部チャンバ１１０と下部チャンバ２１０との間の間隙領域を介して排出されるものであってもよく、例えば、前記間隙領域の上部を介して排出されるものであってもよい。
【0145】
前記流体排出口は、下部チャンバ２１０の如何なる位置でも形成でき、例えば、図１ｃのように下部チャンバ２１０下端に設けられてもよいが、これに限定されるものではない。一方、下部チャンバ２１０にこのような流体排出口が具備されていない場合、図２９ａ～図２９ｃのように、上部チャンバ１１０と下部チャンバ２１０との間の間隙領域を介して流体を排出させて流体の流れを形成することができる。この時、上部チャンバ１１０と下部チャンバ２１０との間の間隙領域が存在するために、上部チャンバ１１０と下部チャンバ２１０の各側面の壁との間に間隙が存在するように、各チャンバのサイズを調節することができ、これらの間の間隙領域で空気と接する界面の上部から流体を排出させることができる。
【0146】
つまり、本発明による３次元細胞培養装置は、下部チャンバ２１０から流体を排出するように排出構造を具備することができ、この時、排出構造は下部チャンバ２１０に流体排出口３３１を介して流体を流動させる構造、または上部チャンバ１１０と下部チャンバ２１０との間の間隙領域、言い換えれば上部チャンバ１１０と下部チャンバ２１０との間に存在する間隙を通じて排出させることで流体を流動させる構造からなることができる。
【0147】
一方、本詳細な説明において具体的に言及されていないその他の排出構造が存在することができるが、細胞培養液を含む流体の流れが上部チャンバ１１０から下部チャンバ２１０につながる下方の流れを維持することができる限り、排出構造の具体的な詳細条件には限定がないと言える。
【0148】
ここで、本実施例において前記多孔質メンブレンは、ナノファイバネットワークからなるもので、空隙率が２０％～６０％の多孔質メンブレンであってもよく、例えば、空隙率が３０％～５０％の多孔質メンブレンであることができる。前記空隙率が２０％未満である場合は、透水係数が低くなり、これによって、多孔質メンブレンに加えられる水圧が増加することで、多孔質メンブレン上に培養中の細胞凝集体の生存率が低下するという問題を招くことができる。
【0149】
また、前記多孔質メンブレンは、１０ｎｍ～１０μｍの平均空隙の粒径を有することができる。すなわち、前記多孔質メンブレンは、前記のような範囲の平均空隙の大きさを含むので、単一細胞は透過させないとともに細胞培養液内の営養分、成長因子などの他の物質は選択的に透過させる選択的透過膜として働くことができる。これにより、多孔質メンブレン上で単一細胞の凝集を誘導して３次元凝集体を形成させることができ、凝集体形成後には物質移動障壁及び通路の役割を果たすことができる。
【0150】
多孔質メンブレンは、前述した本発明の空隙率及び平均空隙の粒径のサイズの範囲内で高い透水係数の特性を保持することができる。また、前記多孔質メンブレンは、１～２０μｍｓ－１の透水係数（Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を有することができる。前記透水係数が１μｍｓ－１未満の場合は、多孔質メンブレンに高い水圧を招き、１０００Ｐａ以上の水圧が多孔質メンブレン及び培養中の細胞凝集体に印加されれば細胞の生存率を低下させるなどの悪影響があり得る。
【0151】
前記多孔質メンブレンは、細胞培養用ナノファイバネットワークであるものであって、その製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、電気放射によって形成される高分子ナノファイバからなるものであってもよい。
【0152】
前記ナノファイバネットワークの製造方法は、例えば、ポリカプロラクトンを４～１０ｗｔ％濃度になるようにクロロホルム／メタノール３／１ｖｏｌ／ｖｏｌ混合物の溶媒に溶解した溶液を電気放射する段階を含むことができる。前記電気放射は、１０～３０ｋＶ電圧下で０．１～２．０ｍｌｈｒ－１の高分子溶液の吐出速度で行われることが好ましく、電圧が前記範囲未満の場合には、均一なナノファイバの製造に問題があり、前記範囲を超える場合は、ナノファイバの積層が不均一になるなど、安定したナノファイバの製造に問題があり得る。
【0153】
前記多孔質マイクロウェルは、下向きに凹んで形成された凹部の全体または一部が多孔質メンブレンであってもよく、望ましくは、多孔質マイクロウェル、すなわち、上部チャンバの開口部を上向きに配置する場合、底を形成する面が多孔質メンブレンで形成される。
【0154】
一方、前記本発明の上部チャンバ１１０の下面を成す多孔質メンブレンは、凸部及び／または凹部を具備するように形成されることができる。例えば、図２８のように多孔質メンブレンを利用して凹部を形成するとか、もしくは、図２６のように、多孔質メンブレン上に凹部に相応する区画を画成することができる側壁または凸部をさらに付け加えて凹部を形成することができ、この時、側壁または凸部の材質は、多孔質であってもよく、または多孔質ではなくてもよく、特に制限されない。望ましくは、凹部の下面は、多孔質メンブレンであり、側壁または凸部は多孔質でも多孔質ではなくてもよい。例えば、図２１ａ及び図２１ｂは、貫通孔が形成された更なる層を積層することで、凹部の側壁が多孔質材質ではない場合の形態を示した例示であり、図２１ｃは、多孔質メンブレンそれ自体に凹部が形成されているもので、凹部及び凹部ではない部分が全体的にいずれも多孔質である材質である場合である。
【0155】
多孔質マイクロウェルは、例えば図２６に示したように、電気放射により作製された多孔質メンブレンをスルーホール（Ｔｈｒｕ－ｈｏｌｅ）の配列と結合して製造することができるが、これに限定されない。一方、図２１ｃのように、多孔質材質の凹部及び凸部の形成は、例えば、図２８のようにモールドを活用した圧縮工程を用いて行われることができる。
【0156】
前記多孔質マイクロウェルの多孔質メンブレンの上面は、細胞培養層として働く領域であって、前述した如く、多孔質メンブレンが凸部及び凹部を具備する場合には、形成された凹部に細胞がより容易に安着するようになり、前記多孔質マイクロウェル内で単一細胞の凝集を誘導して３次元細胞凝集体が安定に形成された後、培養されることができるようになる。より望ましくは、本発明の多孔質メンブレンは凸部及び凹部を具備し、すべての面が多孔質メンブレンからなる。
【0157】
一方、前記下部チャンバ２１０は、上部チャンバ１１０が内部に配置される空間を具備し、下部チャンバ２１０に流体排出口が具備される場合、このように流体が排出されることができる流体排出口３３１を介して前記上部チャンバ１１０が内部に配置された状態で培養液が入っている下部チャンバ２１０の流体が下部チャンバの外部へ排出されながら培養液が流動することができる。このために、前記上部及び／または下部チャンバ２１０には流動を引き起こすことができる装置がさらに連結されることができるし、例えば、前記上部チャンバ１１０に細胞培養液を一定した流速で注入する装置が追加されてもよく、前記下部チャンバ２１０は、前記上部チャンバ１１０に流入した流体を、前記上部チャンバ１１０の多孔質メンブレンを透過して前記下部チャンバ２１０へ流れながら一定した流速で排出させる、流体の流れを制御する装置と連結されることができ、これは、例えば培養液貯留槽であることができる。この時、前記流体の流動を引き起こすことができるものであれば、流体の流れを誘導する装置は特に制限がなく、例えば、前記流体流動誘導装置はシリンジポンプ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｐｕｍｐ）、ペリスタポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）または攪拌機などを用いることができる。
【0158】
本発明による３次元細胞培養装置は、前記下部チャンバ２１０と同一平面上に配置されて、下部チャンバ２１０と流体連通されている培養液貯留槽６５をさらに含むことができ、前記培養液貯留槽６５内の培養液の高さは、下部チャンバ２１０内の培養液の水位に相応するように設定されることができる。
【0159】
前記下部チャンバ２１０内の培養液の水位は、上部チャンバ１１０下端の多孔質メンブレンを基準に上向きに１～２０ｍｍの高さであることであることができ、例えば、１～１９ｍｍ、望ましくは、１～１８ｍｍ、例えば、１～８ｍｍである。培養液の水位が前記望ましい範囲未満の場合、培養中の細胞凝集体に円滑な営養分供給ができなくなる恐れがあり、前記望ましい範囲を超える場合、培養液の氾濫及び過用をもたらすことができる。
【0160】
また、前記上部チャンバ１１０下端の多孔質メンブレンと下部チャンバ２１０の底との間隔は、０．１～８ｍｍであることができ、例えば、０．２～７ｍｍ、望ましくは、１～５ｍｍである。間隔が前記望ましい範囲未満の場合、細胞培養液の流動が制限されて排出口を介した排出ができない恐れがある。また、前記望ましい範囲を超える場合、培養液の過用をもたらすことができる。
【0161】
この時、前記流体、すなわち細胞培養液は一定した速度を維持しながら流動することができる。このために、前記流体の流入と排出を一定した速度で調節することができる。この時、例えば、前記流体は０．０００１～１ｍｌｈｒ－１、例えば、０．００１～１ｍｌｈｒ－１の速度で、望ましくは０．０１～１ｍｌｈｒ－１の速度で流動することができる。前記流体の流動速度が０．０００１ｍｌｈｒ－１未満の場合は、細胞凝集体が必要とする量の細胞培養液が供給されないという問題が生じることができ、１ｍｌｈｒ－１を超える場合は、細胞凝集体に流動による過度な剪断応力が作用して細胞凝集体に悪影響を及ぼす可能性がある。細胞に悪影響を及ぼさない剪断応力、例えば、０．００１～１０ｄｙｎｅｃｍ－２の剪断応力は細胞に分化及び増殖に肯定的な影響を及ぼすことができる。
【0162】
一方、前記細胞培養液は、１０００Ｐａ未満の水圧で前記多孔質メンブレンに印加することが好ましく、圧力が少ないほどより好ましく、例えば、１Ｐａ～１００Ｐａであることができる。尚、１０００Ｐａを超える場合、細胞生存率が低下するという問題がある。
【0163】
本発明の３次元細胞凝集体培養装置及び前記装置を利用した３次院細胞凝集体培養方法では、細胞株、例えば、筋芽細胞（Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）、胚線維芽細胞（Ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、臍帯静脈内皮細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、肝癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、表皮細胞（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ）またはこれらのうち少なくとも一種以上の混合などを使用することができる。また、細胞株だけではなく、肝、膵膓、小腸などの１次細胞も使用され得る。最後に、幹細胞、例えば、誘導多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）またはこれらのうち少なくとも一種以上の混合などの細胞を培養することができるが、これらに限定されるものではなく、３次元細胞凝集体であるスフェロイドまたはオルガノイドを培養することができる。
【0164】
なお、本実施例による３次元細胞凝集体培養方法は、前記本発明の３次元細胞培養装置を利用して、上部チャンバ１１０の多孔質メンブレン上に細胞を播種する段階と、細胞培養液を上部チャンバ１１０の上部へ流入口３１１または開口部を介して投入する段階と、を含むものであっておよい。
【0165】
前記細胞は、前記多孔質メンブレン上に播種されて培養されることができ、前記播種は、前記上部チャンバ１１０に流体を流入する段階に先立って、培養する細胞を前記多孔質メンブレン上に播種することで行われることができる。これによって、細胞は前記の３次元細胞培養装置に適用可能であり、前記細胞を播種する方法は、当業界で使われる方法によって行われることができ、例えば、マイクロピペッティングを利用して播種することができる。
【0166】
前記方法に播種された細胞は、数時間から数日内に３次元細胞凝集体を形成する。細胞凝集体形成後に、開発された装置による細胞培養液の流動が印加されることができる。
【0167】
次に、具体的な実施例を通じて本発明をより具体的に説明する。下記実施例は本発明の理解を助けるための例示に過ぎなく、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
【実施例】
【0168】
１．多孔質メンブレンの製造
【0169】
ポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ；Ｍｎ＝８０，０００ｇｍｏｌ－１）、クロロホルム及びメタノールはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）から購入した。電気放射のためのＰＣＬ溶液は、７．５ｗｔ％濃度のクロロホルム／メタノール３／１ｖｏｌ／ｖｏｌの混合物にＰＣＬを溶解して用意した。用意したＰＣＬ溶液を５ｍｌ精密注射器（ガスタイトシリンジ（Ｇａｓｔｉｇｈｔ ｓｙｒｉｎｇｅ）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ社製）に入れて商用電気放射器（ＥＳ－ｒｏｂｏｔ、ＮａｎｏＮＣ社製、韓国）を用いて直径５ｃｍの環状の電極上に１０ｃｍ距離を置いて配置された２３ゲージの金属針を介して１ｍｌｈ－１の流速で吐出した。金属針と環状の電極との間に前記商用電気放射器を活用して１５ｋＶの高電圧を加えて電気放射を遂行した。電気放射されたＰＣＬナノファイバ（Ａｓ－ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ ｎａｎｏｆｉｂｅｒ）は、環状の電極との間に蒸着されて気体及び質量透過性ナノファイバメンブレンを生成した。電気放射は、相対湿度５０～６０％、温度２０～２５℃で実施した。ナノファイバネットワークの製造時に放射時間による顕微鏡写真を図２２に示したし、ナノファイバの直径は約８００～１０００ｎｍであることを確認し、放射時間の増加につれ平均空隙の大きさ及び空隙率（Ｐｏｒｏｓｉｔｉｙ）は減少し、逆に平均厚さは増加した。
【0170】
前記ナノファイバネットワーク製造時に放射時間によるナノファイバネットワークの構造の変化（図２２ａ）、空隙率の変化（図２２ｂ）、多孔質メンブレンの透水係数（Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）（図２２ｃ）、及び水圧（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（図２２ｄ）を、それぞれ図２２に示した。
【0171】
この時、空隙率の計算方法は、拡大された顕微鏡イメージを二進イメージ（Ｂｉｎａｒｙ ｉｍａｇｅ）に変換した後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ社、米国）を用いてナノファイバネットワーク面積対比ナノファイバネットワークによって生成された空隙の面積分率を計算して示したものである。
【0172】
２．多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバの製造
【0173】
前記１．にて得られた多孔質メンブレン及び培養液を収容する細胞培養空間を具備する多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバを製造するために、一連の工程を遂行したし、これを図２６に示した。詳しく、上部チャンバの下端の多孔質メンブレン領域は、５００μｍ厚さのポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）プレート（Ａｃｒｙｌ Ｃｈｏｉｋａ社製、韓国）に接着剤を塗布した後、レーザーカッター（ＭＬ－７０５０Ａ、Ｍａｃｈｉｎｅｓｈｏｐ社製、韓国）を用いて接着剤が塗布されたＰＭＭＡプレートにスルーホールの配列を穿孔したし、塗布された接着剤を活用してスルーホールと多孔質メンブレンとを結合することで、最終的に図２１のように底面が多孔質メンブレンからなる凹部を形成して完成した。
【0174】
また他の形態の上部チャンバ下端の多孔質メンブレン領域を製作するための一連の工程を図２８に示した。より詳しく、前記１．にて得られたフラットな多孔質メンブレンを凸モールド及び凹モールドを活用した圧縮工程によって、すべての面が多孔質メンブレンからなる凸部及び凹部が形成されている多孔質メンブレンを具備する上部チャンバの下端を完成した。この時、凹モールドは、１０ｍｍ厚さのポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）プレート（Ａｃｒｙｌ Ｃｈｏｉｋａ社製、韓国）に機械加工装備（ＥＧＸ－３５０、Ｒｏｌａｎｄ社製、米国）を活用して穿孔によって製作し、ポリジメチルシロキサン（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ、ＰＤＭＳ）で構成された凸モールドを製作するために、１０：１の重量比でＰＤＭＳと硬化剤の混合物（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、米国）を凹モールドに注いで５５℃で１２時間の間硬化して完成した。
【0175】
上部チャンバの中で開口部の形態を持つ残りの側面部分は、射出成型機（ＳＥ５０Ｄ、住友社、日本国）を活用して製作した。このように得られた前記側面部分と前記で得られた上部チャンバの下端とを接着剤を活用して結合して多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバを完成した。
【0176】
３．３次元細胞凝集体培養装置の製造
【0177】
ポリジメチルシロキサン（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ、ＰＤＭＳ）で構成された下部チャンバとその蓋を製作するために、１０：１の重量比でＰＤＭＳと硬化剤との混合物（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、米国）をモールドに注いで５５℃で１２時間の間硬化した。下部チャンバ及び蓋のモールドは、２０ｍｍ厚さのＰＭＭＡプレートを機械加工装備（ＥＧＸ－３５０、Ｒｏｌａｎｄ社製、米国）を活用して製作した。下部チャンバは、３０ｍｍ×３０ｍｍ×３０ｍｍの大きさに製作され、この時、上面に２ｍｍ深さの溝を設計して（図２７ａ）下部チャンバの底面から前記２．で製作された多孔質マイクロウェルの多孔質メンブレンまでの距離間隔は８ｍｍに設定した（図２７ｂ）。下部チャンバの底面及び蓋の中央にＢｉｏｐｓｙ ｐｕｎｃｈ（Ｍｉｌｔｅｘ社製、米国）を活用して１ｍｍ大きさに穿孔して排出口を形成した。
【0178】
開口部の蓋の穿孔を介してチューブ（Ｂｉｏｋｏｎｖｉｓｉｏｎ社製、韓国）が連結されシリンジポンプ（ＫＤＳ２００、ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、米国）は、前記チューブを介して０．０６２ｍｌｈ－１の流速（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）で細胞培養液を注入した。下部チャンバの底面の穿孔も、チューブと連結されて細胞培養液を培養液貯留槽に移送させるようにした。また、前記培養液貯留槽の下部にＺステージ（ｓｔａｇｅ）（Ｓｃｉｅｎｃｅｔｏｗｎ社製、韓国）を具備し、貯留槽の高さは下部チャンバ内の培養液の水位に相応するように設定し、培養過程でシリンジポンプから持続的に培養液が流入するにも拘わらず、下部チャンバの培養液の水位を一定に維持するように設計された。
【0179】
４．凝集体培養装置を利用した細胞培養
【0180】
＜実施例４＞
【0181】
前記１で製造された多孔質マイクロウェルを備える上部チャンバ及び下部チャンバに加えて排出された培養液を貯留することができる培養液貯留槽を含む３次元細胞培養装置を図１９のように設けた。この時、培養液貯留槽の高さは、下部チャンバの底面から下部チャンバの水位が１２ｍｍに相応するように設定した。このように得られた細胞培養装置と関しては、「本発明の細胞培養装置」及び「実施例４の細胞培養装置」を相互互換的に指称することにする。
【0182】
前記３次元細胞培養装置において、多孔質マイクロウェルに肝細胞（ＨｅｐＧ２）及びＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉａ、ＦＢＳ１０％）培養液を一緒に注入した後、これを３７℃で４８時間の間流動を印加しないで静的な環境下で３次元ＨｅｐＧ２凝集体、すなわち、ＨｅｐＧ２スフェロイドを形成した。その後、シリンジポンプを利用して一定した流速である０．０６２ｍｌｈｒ－１で上部チャンバに細胞培養液を持続的に注入した。その後、前記注入された流量位流体を排出するために、下向きに流体排出口３３１が形成された下部チャンバを介して培養液貯留槽へ排出させて８日間ＨｅｐＧ２スフェロイドを培養した。
【0183】
＜比較例４＞
【0184】
多孔質メンブレンではない不透過性のＰＭＭＡプレートの底面で構成された不透過性のマイクロウェルを用いたことと、シリンジポンプ、培養液貯留槽などの細胞培養液の流動を印加する装置を用いることなくピペッティングを利用した細胞培養液の入れ替えを遂行したことを除き、前記実施例４と同様にＨｅｐＧ２スフェロイドを培養した。
【実験例】
【0185】
（１）時間の経過による３次元細胞培養装置内の流体の入れ替えの確認
【0186】
実施例４の３次元細胞培養装置において、上部チャンバへ新しく流体が０．０６２ｍｌｈｒ－１の流速で注入される際に、３次元細胞培養装置内の流動変化（流体の入れ替えの確認）を確認するための実験を進行した。
【0187】
図２５に示したように、細胞培養凝集体の内部に既存に存在していた青い溶液が、新たに注入される透明な色の溶液に漸進的に入れ替えられることを確認することができた（黒白の図面では図２５の左側から右側に時間が経過するほど暗い色の溶液が徐々に明るい色に変わって行くことを確認することができる）。また、この過程で下部チャンバの水位は一定に維持されることを確認することができた。
【0188】
（２）実施例４における細胞培養液の流れの解釈
【0189】
本発明の３次元細胞培養装置における細胞培養液の流れを測定するための電算流体解釈方法を適用するために、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０、米国）を通じて実施例４の３次元細胞培養装置における流速（Ｓｕｒｆａｃｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ：０ｍｓ－１～８．１１ｅ－６ｍｓ－１）、流動方向（黒色のコーン状）、流線（白色線）にあたる内容を解釈及び計算した。
【0190】
その結果、図２０に示しているように、本発明の３次元細胞培養装置で、細胞培養液は上部チャンバから下部チャンバに円滑に流れることを確認することができた。
【0191】
（３）細胞培養時細胞が消失される程度の比較
【0192】
実施例４及び比較例４において２日間隔で肝細胞スフェロイドの消失程度を比較し、その結果を図２３に示した。
【0193】
図２３に示したように、実施例４では幹細胞のスフェロイドの消失が全くなかったが、比較例４では持続的にスフェロイドが消失されて、８日目には約１５％ほどのＨｅｐＧ２細胞スフェロイドの消失が発生することを確認することができた。
【0194】
（４）時間の経過による３次元細胞凝集体の周辺の営養分の濃度の比較
【0195】
実施例４及び比較例４において、時間の経過によるＨｅｐＧ２スフェロイドの周辺の営養分（Ｇｌｕｃｏｓｅ）の濃度を測定して、比較分析のために、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０、米国）を活用した。この過程で活用された数値は、下記表１に示した。
【0196】
【表1】
【0197】
図２４に示すように、実施例４の細胞培養装置では３６時間後、均一な営養分濃度がＨｅｐＧ２細胞凝集体の周辺に誘導されることが数値予測されたが、比較例４ではピペッティング間隔前後で営養分濃度の変化がひどく、細胞凝集体の周辺に不均一な営養分の濃度が誘導されることが数値予測された。
【0198】
（５）実施例４の３次元細胞培養装置における多孔質メンブレンの透水係数及び水圧の測定
【0199】
上部チャンバで新しく流体が０．０６２ｍｌｈｒ－１の流速で注入される時、３次元細胞培養装置内の多孔質メンブレンに印加される水圧（Ａｐｐｌｉｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を確認するための実験を進めた。これを確認するために、事前に透水係数の測定は、発明された装置の外部で、下記のように変水位法（Ｆａｌｌｉｎｇ－ｈｅａｄ ｍｅｔｈｏｄ）を活用して進行した。
【0200】
具体的に、初期圧力水頭（Ｉｎｉｔｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｅａｄ、ｈｉ）を有する水が多孔質メンブレンを透過して最終圧力水頭（Ｆｉｎａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｅａｄ、ｈｆ）に至るまでの時間を確認してダルシーの法則（Ｄａｒｃｙ’ｓ ｌａｗ）に基づく式によって透水係数を測定した。
【0201】
【数1】
【0202】
ここで、Ｋは多孔質メンブレンの透水係数、Ｌは多孔質メンブレンの厚さ、ｔはｈｉでｈｆまで至る時間であり、本実験ではそれぞれ１００ｍｍと１０ｍｍのｈｉ及びｈｆを活用した。計算された透水係数に基づいて多孔質メンブレンの透過度（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を次のような式２を活用して計算した。
【0203】
【数2】
【0204】
ここで、ｋは現在多孔質メンブレンの透過度、μは細胞培養液の粘度、ρは細胞培養液の密度、ｇは重力加速度である。
【0205】
０．０６２ｍｌｈｒ－１の流速で多孔質メンブレンを透過する細胞培養液、測定された透水係数と計算された透過度に基づいて次のような式（コゼニー・カルマンの式（Ｋｏｚｅｎｙ－Ｃａｒｍａｎｅ ｑｕａｔｉｏｎ））を活用して多孔質メンブレンに印加される水圧を計算した。
【0206】
【数3】
【0207】
ここでは、現在多孔質メンブレンを透過する流体の流速ｋは現在多孔質メンブレンの透過性、μは細胞培養液の粘度、Ｌは多孔質メンブレンの厚さであり、ｐは多孔質メンブレンに印加される水圧である。
【0208】
図２２に示したように、多孔質メンブレンに印加される水圧、すなわち、水力反発力は多孔質メンブレンを構成するナノファイバのネットワークが疎であるほど、つまり、電気放射の遂行時間が短いほど、すなわち空隙率及び透水係数が高いほど低いことを確認した。これを本発明の多孔質メンブレンではない商用多孔質メンブレンと比較分析した時、本発明の多孔質メンブレンに遥かに低い水力反発力が印加されることを確認することができたし、ナノファイバネットワークで構成された多孔質メンブレンが本発明の装置にさらに好適であることを確認することができた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18a】
【図18b】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【国際調査報告】