特表 2024-516418 Ｂ系統細胞を分化及び増大させるための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-15

(54)【発明の名称】Ｂ系統細胞を分化及び増大させるための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0781 20100101AFI20240408BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0781

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566753

(86)(22)【出願日】2022-04-29

(85)【翻訳文提出日】2023-12-13

(86)【国際出願番号】 CA2022050662

(87)【国際公開番号】W WO2022226659

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/182,054

(32)【優先日】2021-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518393115

【氏名又は名称】ステムセル テクノロジーズ カナダ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】タバタベイ－ザヴァレー，ヌーシン

(72)【発明者】

【氏名】ブラワー，パトリック

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA92X

4B065BA06

4B065BB19

4B065CA60

(57)【要約】

細胞をＢ細胞系統へと指向性分化させるための培地、キット、及び方法が開示される。開示される分化手法は、１つ以上の段階特異的培地調合物を使用して、１つ以上の中間細胞集団を介して初代細胞または多能性幹細胞由来細胞を取り、Ｂ系統細胞をもたらすことができる。したがって、指向性分化ワークフローを実行するための培地及びサプリメントは、１つ以上の基礎培地と、それに添加される１つ以上のサプリメントとを含むキットに含まれ得る。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ細胞前駆体の集団を調製する方法であって、
ＣＤ３４^＋造血幹または始原細胞（ＨＳＰＣ）の集団を、基礎培地と、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む、誘導培地と接触させること、ならびに、
前記誘導培地中の前記ＨＳＰＣの集団を無血清条件下で培養してＢ細胞前駆体の集団を取得すること
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記ＨＳＰＣの集団を、臍帯血もしくは骨髄から濃縮するか、または多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化させる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記Ｂ細胞前駆体の集団が、ＣＤ１０またはＣＤ１９の一方または両方を発現する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記誘導培地が、ＳＣＦまたはＴＰＯのいずれかを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｂ細胞前駆体の集団を分化培地と接触させること、及び前記分化培地中の前記Ｂ細胞前駆体の集団を無血清条件下で培養することをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団を取得することをさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記誘導培地中の前記ＨＳＰＣの集団を培養した後よりも多くのＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞を取得することをさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の少なくとも一部が、ＩｇＭ^＋細胞である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記分化培地が、基礎培地と、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの少なくとも１つと、前記少なくとも１つの他のサイトカインとを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

前記ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団を下流分化培地と接触させること、及び前記下流分化培地中の前記ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団を無血清条件下で培養することをさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項11】

前記分化培地中の前記Ｂ細胞前駆体の集団を培養した後よりも多くのＩｇＭ^＋細胞を取得することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＩｇＭ^＋細胞の少なくとも一部が、抗体分泌細胞である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記下流分化培地が、基礎培地、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び前記少なくとも１つの他のサイトカインを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

Ｂ系統細胞の集団を調製する方法であって、
Ｂ細胞前駆体の集団を、基礎培地と、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３Ｌのうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む、分化培地と接触させること、ならびに、
前記分化培地中の前記Ｂ細胞前駆体の集団を無血清条件下で培養してＢ系統細胞の集団を取得すること
を含む、前記方法。

【請求項15】

前記Ｂ細胞前駆体の集団が、ＣＤ１０またはＣＤ１９の一方または両方を発現する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｂ細胞前駆体の集団が、臍帯血もしくは骨髄から濃縮されたか、または多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化したかのいずれかである、ＣＤ３４^＋造血幹または始原細胞（ＨＳＰＣ）の集団に由来する、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記Ｂ系統細胞の集団が、ＣＤ１９を発現し、前記Ｂ系統細胞の集団が、誘導培地中の前記ＨＳＰＣの集団を培養して前記Ｂ細胞前駆体の集団を得た後よりも多くのＣＤ１９^＋細胞を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の少なくとも一部が、ＩｇＭ^＋細胞である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記Ｂ系統細胞の集団を下流分化培地と接触させること、及び下流分化培地中の前記Ｂ系統細胞の集団を無血清条件下で培養することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項20】

前記分化培地中の前記Ｂ細胞前駆体の集団を培養した後よりも多くのＩｇＭ^＋細胞を取得することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ＩｇＭ^＋細胞の少なくとも一部が、抗体分泌細胞である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記下流分化培地が、基礎培地、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び前記少なくとも１つの他のサイトカインを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記誘導培地が、無血清である、請求項１７に記載の方法。

【請求項24】

前記誘導培地が、基礎培地と、少なくとも１つのサイトカインと、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの１つ以上とを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記少なくとも１つの他のサイトカインが、ＩＬ－３、ＩＬ－６、またはＩＬ－７のうちの１つ以上である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記少なくとも１つの他のサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２１のうちの１つ以上である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記方法が、フィーダー細胞不含条件下で行われる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

フィーダー細胞不含条件が、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記細胞外マトリックスタンパク質または前記細胞接着分子が、可溶化されているかまたは培養容器の表面上にコーティングされている、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記細胞外マトリックスタンパク質または前記細胞接着分子が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＥＣＭ１、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、血管細胞接着分子、固定化ＳＣＦタンパク質、または前述のもののいずれかの組み合わせである、請求項２８または２９に記載の方法。

【請求項31】

フィーダー細胞不含条件が、可溶化されているかまたは培養容器の表面上にコーティングされている細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の非存在下である、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

Ｂ系統細胞の指向性分化のためのキットであって、
基礎培地と、
幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つ、ならびに少なくとも１つの他のサイトカインを含む、少なくとも１つのサプリメントと
を含む、前記キット。

【請求項33】

第２のサプリメントをさらに含む、請求項３２に記載のキット。

【請求項34】

前記第２のサプリメントが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つ、ならびに少なくとも１つの他のサイトカインを含む、請求項３３に記載のキット。

【請求項35】

前記少なくとも１つのサプリメントの調合物が、前記第２のサプリメントとは異なる、請求項３３または３４に記載のキット。

【請求項36】

第３のサプリメントをさらに含む、請求項３２～３５のいずれか１項に記載のキット。

【請求項37】

前記第３のサプリメントが、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び少なくとも１つの他のサイトカインを含む、請求項３６に記載のキット。

【請求項38】

前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２１のうちの１つ以上である、請求項３２～３７のいずれか１項に記載のキット。

【請求項39】

基礎培地と、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む、Ｂ細胞前駆体の誘導のための培地。

【請求項40】

基礎培地と、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む、Ｂ系統細胞の分化のための培地。

【請求項41】

基礎培地、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び少なくとも１つの他のサイトカインを含む、Ｂ系統細胞の下流分化のための培地。

【請求項42】

前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２１のうちの１つ以上である、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の培地。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１８２，０５４号の優先権の利益を主張し、その全内容の全体を参照により本明細書に援用するものである。

【0002】

本開示は、細胞培養用途に関し、より具体的には、造血細胞を使用した細胞培養用途に関し、さらにより具体的には、Ｂ細胞の１つ以上の集団（複数可）に関連する細胞培養用途に関する。

【背景技術】

【0003】

哺乳動物の血液は、リンパ球、血小板、赤血球、ならびにその直接的及び間接的な前駆体を含む様々な細胞型から構成される。白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）は白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）と呼ばれることがあり、これらは宿主の免疫系で機能する。白血球はさらに、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、及び好中球に細分することができる。このような白血球は各々、宿主の免疫系において特定の機能を果たす。

【0004】

Ｂ細胞は、他の血球と同様に、自己再生及び各血球系統への分化が可能な造血幹／始原細胞（ＨＳＰＣ）に由来する。Ｂ細胞は、液性免疫の中心成分であり、抗原に（その表面に発現されたＢ細胞受容体を介して）結合すると抗体を分泌する。

【0005】

ｉｎ ｖｉｖｏでは、哺乳動物Ｂ細胞が骨髄で発生し、ＨＳＰＣから始まって、プロＢ細胞、プレＢ細胞、及び未成熟Ｂ細胞を含む様々な発達段階を進行する。未成熟Ｂ細胞は、第２のリンパ系臓器（例えば、脾臓、胸腺など）でメモリーＢ細胞に成熟し、第２のリンパ系臓器または骨髄のいずれかで形質芽球及び形質細胞（すなわち、抗体産生細胞）に成熟する。これらの発達ステップをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで再現することは、限られた成功しか達成していない。特に、組織由来細胞または多能性幹細胞（「ＰＳＣ」）を起源物質として使用する無血清かつフィーダー細胞不含の培養システムでは、これらの発達ステップを再現することは不可能であった。

【0006】

初代組織由来細胞とＰＳＣとの両方が、特に、臨床応用に適切なＢ系統細胞の同種のカスタマイズ可能な大規模集団を作出する機会をもたらす。分化ＰＳＣにより、疾患モデリングまたは細胞療法の応用を容易にする遺伝子エンジニアリング法も可能になる。

【0007】

Ｂ細胞は、環境中の抗原の感知に関与していること、そして、刺激に応じて大量の抗体を分泌して標的を中和することを考慮すると、精力的な研究及び治療上の関心対象である。したがって、ＰＳＣに由来するものか、臍帯血または骨髄から単離された適切な前駆体に由来するものかを問わず、前駆体集団から培養下の未成熟及び成熟型のＢ系統細胞を取得する効率的な手段が必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、培地組成物及び／または培地に添加されるサプリメント、ならびに造血幹／始原細胞（ＨＳＰＣ）の培養／分化のための方法に関する。より具体的には、本開示は、段階特異的培地及び／または基礎培地に添加されるサプリメントを使用して、ＨＳＰＣを様々なＢ細胞系統に段階的に分化させる方法に関する。

【0009】

本開示の一態様では、ＣＤ３４^＋造血幹または始原細胞（ＨＳＰＣ）の集団を、基礎培地と、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む、誘導培地と接触させること、ならびに、誘導培地中のＨＳＰＣの集団を無血清条件下で培養してＢ細胞前駆体の集団を取得することを含む、Ｂ細胞前駆体の集団を調製するための指向性分化方法が提供される。

【0010】

一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－６、またはＩＬ－７のうちの１つ以上である。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２１のうちの１つ以上である。

【0011】

一実施形態において、ＨＳＰＣの集団を、臍帯血もしくは骨髄から濃縮するか、または多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化させる。

【0012】

一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団は、ＣＤ１０またはＣＤ１９の一方または両方を発現する。

【0013】

一実施形態において、誘導培地は、ＳＣＦまたはＴＰＯのいずれかを含む。

【0014】

一実施形態において、本方法は、Ｂ細胞前駆体の集団を分化培地と接触させること、及び分化培地中のＢ細胞前駆体の集団を無血清条件下で培養することをさらに含み得る。一実施形態において、本方法は、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団を取得することをさらに含み得る。

【0015】

一実施形態において、本方法は、誘導培地中のＨＳＰＣの集団を培養した後よりも多くのＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞を取得することをさらに含み得る。

【0016】

一実施形態において、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の少なくとも一部は、ＩｇＭ^＋細胞である。

【0017】

一実施形態において、分化培地は、基礎培地と、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む。

【0018】

一実施形態において、本方法は、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団を下流分化培地と接触させること、及び下流分化培地中のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団を無血清条件下で培養することをさらに含み得る。一実施形態において、本方法は、分化培地中のＢ細胞前駆体の集団を培養した後よりも多くのＩｇＭ^＋細胞を取得することをさらに含み得る。

【0019】

一実施形態において、ＩｇＭ^＋細胞の少なくとも一部は、抗体分泌細胞である。

【0020】

一実施形態において、下流分化培地は、基礎培地、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び少なくとも１つの他のサイトカインを含む。

【0021】

一実施形態において、本方法は、フィーダー細胞不含条件下で行われる。一実施形態において、フィーダー細胞不含条件は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子を含む。一実施形態において、フィーダー細胞不含条件は、可溶化されているかまたは培養容器の表面上にコーティングされている細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の非存在下である。

【0022】

一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子は、可溶化されているかまたは培養容器の表面上にコーティングされている。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＥＣＭ１、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、血管細胞接着分子、固定化ＳＣＦタンパク質、または前述のもののいずれかの組み合わせである。

【0023】

本開示の別の態様では、Ｂ細胞前駆体の集団を、基礎培地と、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３Ｌのうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む、分化培地と接触させること、ならびに、分化培地中のＢ細胞前駆体の集団を無血清条件下で培養してＢ系統細胞の集団を取得することを含む、Ｂ系統細胞の集団を調製するための指向性分化方法が提供される。

【0024】

一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－６、またはＩＬ－７のうちの１つ以上である。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２１のうちの１つ以上である。

【0025】

一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団は、ＣＤ１０またはＣＤ１９の一方または両方を発現する。

【0026】

一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団は、臍帯血もしくは骨髄から濃縮されたか、または多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化したかのいずれかである、ＣＤ３４^＋造血幹または始原細胞（ＨＳＰＣ）の集団に由来する。

【0027】

一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、ＣＤ１９を発現する。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、誘導培地中のＨＳＰＣの集団を培養してＢ細胞前駆体の集団を得た後よりも多くのＣＤ１９^＋細胞を含む。

【0028】

一実施形態において、誘導培地は、無血清である。一実施形態において、誘導培地は、基礎培地と、少なくとも１つのサイトカインと、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの１つ以上とを含む。

【0029】

一実施形態において、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の少なくとも一部は、ＩｇＭ^＋細胞である。

【0030】

一実施形態において、本方法は、Ｂ系統細胞の集団を下流分化培地と接触させること、及び下流分化培地中のＢ系統細胞の集団を無血清条件下で培養することをさらに含み得る。一実施形態において、本方法は、分化培地中のＢ細胞前駆体の集団を培養した後よりも多くのＩｇＭ^＋細胞を取得することをさらに含み得る。

【0031】

一実施形態において、ＩｇＭ^＋細胞の少なくとも一部は、抗体分泌細胞である。

【0032】

一実施形態において、下流分化培地は、基礎培地、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び少なくとも１つの他のサイトカインを含む。

【0033】

一実施形態において、本方法は、フィーダー細胞不含条件下で行われる。一実施形態において、フィーダー細胞不含条件は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子を含む。一実施形態において、フィーダー細胞不含条件は、可溶化されているかまたは培養容器の表面上にコーティングされている細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の非存在下である。

【0034】

一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子は、可溶化されているかまたは培養容器の表面上にコーティングされている。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＥＣＭ１、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、血管細胞接着分子、固定化ＳＣＦタンパク質、または前述のもののいずれかの組み合わせである。

【0035】

本開示の別の態様では、Ｂ系統細胞の指向性分化のためのキットであって、基礎培地と、少なくとも１つのサプリメントとを含む、キットが提供される。一実施形態において、少なくとも１つのサプリメントは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つ、ならびに少なくとも１つの他のサイトカインを含む。

【0036】

一実施形態において、キットは、第２のサプリメントをさらに含む。

【0037】

一実施形態において、第２のサプリメントは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つ、ならびに少なくとも１つの他のサイトカインを含む。

【0038】

一実施形態において、少なくとも１つのサプリメントの調合物は、第２のサプリメントとは異なる。

【0039】

一実施形態において、キットは、第３のサプリメントをさらに含む。一実施形態において、第３のサプリメントは、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び少なくとも１つの他のサイトカインを含む。

【0040】

一実施形態において、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２１のうちの１つ以上である。

【0041】

本開示の他の態様では、Ｂ細胞前駆体、またはＢ系統細胞、またはＢ系統細胞の下流の細胞、例えばＩｇＭ^＋細胞及び／または抗体分泌細胞の指向性分化のための培地が提供される。

【0042】

本開示の一態様では、Ｂ細胞前駆体の誘導のための培地が提供される。一実施形態において、誘導培地は、基礎培地と、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む。

【0043】

本開示の一態様では、Ｂ系統細胞の分化のための培地が提供される。一実施形態において、分化培地は、基礎培地と、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つと、少なくとも１つの他のサイトカインとを含む。

【0044】

本開示の一態様では、Ｂ系統細胞の下流の細胞の下流分化のための培地が提供される。一実施形態において、下流分化培地は、基礎培地、ヒトＣＤ４０のリガンド、及び少なくとも１つの他のサイトカインを含む。

【0045】

一実施形態において、本開示の培地に含まれる少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、またはＩＬ－２１のうちの１つ以上である。

【0046】

本明細書に記載される様々な実施形態がより良く理解されるように、またこれらの様々な実施形態がどのように実行され得るかをより明確に示すために、少なくとも１つの実施形態例を示す添付図面を例として参照し、これより、添付図面について説明する。図面は、本明細書に記載される教示の範囲を限定することを意図したものではない。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】単一のヒト臍帯血ドナーサンプルから濃縮されたＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ＣＤ３４^＋細胞の濃縮集団（すなわち「バルク」）を染色し、次いでＬｉｎ^－について選別した（Ｌｉｎには、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、及びＣＤ６６ｂが含まれた）（Ａ）。（Ａ）の細胞をさらに選別して、Ｂ細胞運命の推定上の始原細胞の２つのより特殊化された集団、すなわち（Ｂ）のＬｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{－／ｌｏ／ｍｉｄ}ＣＤ１０^－細胞（「集団１」または「ｐｏｐ１」）、及び（Ｂ）のＬｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｍｉｄＣＤ１０^＋細胞（「集団２」または「ｐｏｐ２」）を得た。Ｐｏｐ１細胞は、顆粒球、単球、リンパ系、及び赤血球の子孫に対する多分化能を有するが、ｐｏｐ２細胞はリンパ系系統に制限される。

【図2】ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団からのＢ細胞前駆体の誘導の結果をまとめた棒グラフを示す。Ｐｏｐ２細胞を種々の誘導培地調合物（「ＳＵＰＰＬＣＴＬ」ベースライン培地、及び示されているサイトカイン／成長因子を欠く調合物）中で１４日間培養し、選択された成長因子またはサイトカインの非存在の効果を試験した。１４日後に、ＣＤ１９^＋を発現する細胞（Ｂ）のＢ細胞前駆体（Ａ）の存在比率及び収量を判定した。示された結果は、１～３つの独立した実験の平均である。

【図3】ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団からのＢ細胞前駆体の誘導の結果をまとめた棒グラフを示す。Ｐｏｐ１細胞及びｐｏｐ２細胞を、ＴＰＯを除くが図示のサイトカインを単独または組み合わせでさらに含む誘導培地中で、１４日間別々に培養した。ｐｏｐ２由来細胞については、棒グラフは、全体的な増大倍率（Ａ）、Ｂ細胞前駆体の存在比率及び収量（Ｂ）、ＣＤ１９^＋を発現する細胞の存在比率及び収量（Ｃ）、ならびにＣＤ１０及びＣＤ１９の発現を分析するサンプルフロープロット（Ｄ）を示す。ｐｏｐ１由来細胞については、棒グラフは、全体的な増大倍率（Ｅ）、Ｂ細胞前駆体の存在比率及び収量（Ｆ）、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の存在比率及び収量（Ｇ）、ならびにＣＤ１０及びＣＤ１９の発現を分析するサンプルフロープロット（Ｈ）を示す。示された結果は、２～８つの独立した実験の平均である。

【図4】ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ由来Ｂ細胞前駆体の集団からのＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の分化の結果をまとめた棒グラフを示す。Ｐｏｐ２細胞を図２のコントロール調合物中でまず１４日間培養し、次いで、図示のとおり個々の因子及び因子の組み合わせを除いた様々な分化培地調合物（「ＤｉＭ」）に移して、さらに１４日間おいた。２８日間の培養後に、産出細胞のうちのＢ細胞前駆体（Ａ）、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞（Ｂ）、及びＩｇＭ^＋細胞（Ｃ）の存在比率及び収量を判定した。示された結果は、１～３つの独立した実験の平均である。

【図5】本開示の培地におけるＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの分化効率を比較する棒グラフを示す。Ｐｏｐ１細胞及びｐｏｐ２細胞を２つのバージョンの誘導培地で１４日間別々に培養し、次いで図４の分化培地調合物に移して、さらに１４日間おいた。ｐｏｐ２由来細胞については、棒グラフは、Ｂ細胞前駆体の存在比率及び収量（Ａ）、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の存在比率及び収量（Ｂ）、ならびにＣＤ１９^＋細胞画分に応じたＩｇＭ^＋細胞の存在比率及び収量（Ｃ）を示す。ｐｏｐ１細胞については、棒グラフは、Ｂ細胞前駆体の存在比率及び収量（Ｄ）、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の存在比率及び収量（Ｅ）、ならびにＣＤ１９^＋細胞画分に応じたＩｇＭ^＋細胞の存在比率及び収量（Ｆ）を示す。示された結果は、４つの独立した実験の平均である。

【図6】ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ由来Ｂ細胞前駆体の集団からのＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の分化の結果をまとめた棒グラフを示す。Ｐｏｐ１細胞をまず、図２に示される（ただし図３～５で使用されたものとは異なる）誘導培地調合物中で１４日間培養した。得られたＢ細胞前駆体を、本開示の分化培地に移して、さらに１４日間おいた。２８日後に、Ｂ細胞前駆体（Ａ）及びＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞（Ｂ）の存在比率及び収量を判定した。示された結果は、１～５つの独立した実験の平均±標準誤差である。

【図7】Ｂ系統細胞の分化に対する拡大培養の効果を比較した棒グラフを示す。Ｐｏｐ１細胞をまず誘導培地中で１４日間培養し、次いで分化培地に移して、さらに１４日間または２８日間おいた。棒グラフは、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の存在比率及び収量（Ａ）、ならびにＣＤ１９^＋細胞画分に応じたＩｇＭ^＋細胞の存在比率及び収量（Ｂ）を示す。示された結果は、４つの独立した実験の平均±標準誤差である。

【図8】バルクＣＤ３４^＋細胞、ｐｏｐ１ ＣＤ３４^＋細胞、またはｐｏｐ２ ＣＤ３４^＋細胞のいずれかから出発して、本開示の培地調合物及び方法を使用して分化させた、２８日目のＣＤ１９^＋細胞の存在比率及び収量をまとめた棒グラフを示す。バーは、少なくとも２３個の独立したデータ点の平均を表す。

【図9】ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞からのＩｇＭ^＋細胞の分化効率を最適化する実験の結果を示す。Ｐｏｐ１細胞またはバルク細胞を誘導培地中で１４日間別々に培養し、分化培地に移して、さらに１４日間おいた。その後、２８日目の細胞を、様々な下流分化培地（「ＤＤＭ」）調合物、すなわち、ネガティブコントロール、ならびにヒトＣＤ４０のリガンド及び様々なサイトカイン／成長因子を含む２つの調合物で、別々に培養した。３５日目のｐｏｐ１由来細胞を、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞（Ａ）及びＣＤ１９^＋細胞画分に応じたＩｇＭ^＋細胞（Ｂ）の存在比率及び収量について分析した。示された結果は、少なくとも４つの独立した実験の平均である。３５日目のｐｏｐ１由来細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＩｇＭ（赤／灰色）及びＩｇＧ（青／黒）の分泌についても試験した。コントロール細胞（Ｃｉ）及び図示の下流分化培地中で培養した細胞（Ｃｉｉ及びＣｉｉｉ）について、産出された抗体分泌細胞の数と共に代表的な画像が示されている。３５日目のバルク由来細胞を、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞（Ｄ）及びＣＤ１９^＋細胞画分に応じたＩｇＭ^＋細胞（Ｅ）の存在比率及び収量について分析した。示された結果は、少なくとも３つの独立した実験の平均である。

【図10】ヒトＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団からＢ細胞前駆体を誘導した結果を示す。図示のように、異なるコーティング材料の非存在下または存在下のいずれかで、ＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを本開示の誘導培地中で１４日間培養した。示された結果は、少なくとも２つの独立した実験の平均である（Ａ）。様々なコーティング材料の非存在下または存在下で培養した２８日目の細胞集団を、ＣＤ１０及びＣＤ１９の発現についてフローサイトメトリーによって分析した（Ｂ）。ＰＳＣ由来または臍帯血由来のバルク細胞を、本明細書に記載される誘導／分化プロトコルの図示された時点におけるＥＢＦ１（Ｃ）及びＰＡＸ５（Ｄ）の発現についてｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した。２８日目の細胞集団を、ＣＤ１０及びＣＤ１９の発現ならびにＣＤ１９及びＣＤ２０の発現についてフローサイトメトリーによって分析した（Ｅ）。バーは、少なくとも１つの実験の平均±標準誤差を表す。

【図11】臍帯血由来ＣＤ３４^＋細胞の誘導／分化に対する様々なコーティングの効果をまとめた棒グラフを示す。Ｐｏｐ１細胞を図示されたコーティング上の誘導培地中で１４日間培養し、Ｂ細胞前駆体（Ａ）及びＣＤ１９を発現する細胞（Ｂ）の存在比率及び収量を判定した。１４日目の細胞を、図示されたコーティング上の分化培地中でさらに１４日間培養し、２８日目のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の存在比率及び収量（Ｃ）ならびにＣＤ１９^＋細胞画分に応じたＩｇＭ^＋細胞の存在比率（Ｄ）を判定した。示された結果は、少なくとも２つの独立した実験の平均である。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本開示は、培地組成物及び／または培地に添加されるサプリメント、ならびにＨＳＰＣの培養／分化のための方法に関する。より具体的には、本開示は、段階特異的培地及び／または基礎培地に添加されるサプリメントを使用して、ＨＳＰＣを様々なＢ細胞系統に分化させることに関する。

【0049】

本明細書で使用される場合、「造血幹または始原細胞」または「ＨＳＰＣ」という用語は、自己複製及び／または造血系統のより特殊化された細胞への分化が可能な造血系統の細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＨＳＰＣは、細胞集団に含まれていてもよく、ＨＳＰＣの集団は、純度５０％超、純度６０％超、純度７０％超、純度８０％超、または純度９０％超であり得る。ＨＳＰＣは、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、胚から成体の末梢血（ＰＢ）、胸腺、末梢リンパ節、胃腸管、扁桃、妊娠子宮、肝臓、脾臓、胎盤、またはＨＳＰＣの局部的集団を有する任意の他の組織から取得され得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＰＣ（またはＨＳＰＣの集団）は、ＨＳＰＣを含む組織源または別の細胞集団から、例えば免疫磁気分離または蛍光活性化細胞選別により濃縮される。ＨＳＰＣはまた、例えば人工多能性幹細胞、胚幹細胞、ナイーブ幹細胞、伸長幹細胞などの多能性幹細胞から分化し得る。ＨＳＰＣの顕著な特徴は、膜貫通リン糖タンパク質ＣＤ３４を発現することであり、ゆえに、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４^＋細胞と呼ばれることもある。ヒトＨＳＰＣは、ＣＤ４５及びＣＤ３４の発現によってさらに定義され、かつ、ＨＳＰＣ亜集団を区別するために使用され得るＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２０１、及びインテグリン－α３などのマーカーの組み合わせによってさらに定義される場合がある。ＨＳＰＣは、グリコフォリンＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ５６などのマーカーを発現しないか、またはそれらを少ししか発現しないことがあり、そのようなマーカーは、より成熟した血球を特徴付ける場合がある。

【0050】

本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」という用語は、自己複製及び／または３つの胚性胚葉のいずれかの任意の細胞型への分化が可能な細胞を指す。胚幹細胞などのＰＳＣは、胚盤胞から単離され、維持または分化細胞培養条件に供される場合がある。人工多能性幹細胞などのＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４などの特定の多能性遺伝子の強制発現によって任意の細胞型から誘導される場合がある。多能性遺伝子の発現は、それらのコード領域を安定的にもしくは一過性に宿主細胞へ導入することによって、またはそのような遺伝子の内因性コピーを活性化する因子を導入することによって強制的に行われ得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞前駆体（Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」または「Ｂ細胞前駆体（Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）」という用語は、ＨＳＰＣよりもさらに特殊化されているが、Ｂ細胞などの１つ以上のリンパ球系細胞型にさらに分化することが可能な細胞型を指す。Ｂ細胞前駆体は、組織由来かＰＳＣ由来かを問わず、ＨＳＰＣの直接的な子孫である場合もあれば、またはＨＳＰＣからさらに離れている場合もある。さらに、Ｂ細胞前駆体は、Ｂ細胞などの下流のリンパ球系細胞型に直接分化する場合もあれば、または１つ以上のさらなる分化ステップを経た後にＢ細胞になる場合もある。Ｂ細胞前駆体の一例は、表現型マーカーＣＤ１０またはＣＤ１９のうちの１つに対して陽性な細胞である。一例では、ＣＤ１０^＋Ｂ細胞前駆体は、ＣＤ１９に対して陰性であり、このような細胞は、Ｂ系統にコミットしない場合がある。一例では、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞前駆体は、ＣＤ１０に対して陰性であり、このような細胞は、Ｂ系統にコミットする場合がある。Ｂ細胞前駆体によって発現されることがある他の表現型マーカーとしては、ＣＤ２０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１６１、ＣＤ１２２、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、及び／またはインテグリンβ７が挙げられる。さらに、Ｂ細胞前駆体によって発現されないことがある表現型マーカーの例としては、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１６１、ＣＤ１２２、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、及び／またはインテグリンβ７が挙げられる。本明細書において、明言しない限り、Ｂ細胞前駆体の集団は、１つ以上の下流細胞型に分化することが可能な同種の細胞の集団または異種の細胞の集団を指す場合がある。一実施形態において、Ｂ細胞前駆体は、任意の型のＢ系統細胞に分化することが可能であり得る。一実施形態において、Ｂ細胞前駆体は、例えばダブルポジティブＣＤ１０^＋ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞にのみ分化するように、その分化能力においてさらに制限されていてもよい。

【0052】

本明細書で使用される場合、「Ｂ系統細胞」という用語は、組織由来かＰＳＣ由来かを問わず、ＨＳＰＣから分化することができ、Ｂ細胞前駆体よりも特殊化／コミットしている、造血系統のリンパ球の一種を指す。より具体的には、Ｂ系統細胞は、多リンパ球系始原細胞（ＭＬＰ）またはリンパ球系共通始原細胞（ＣＬＰ）から誘導され得る。初期のＢ系統細胞は、ＣＤ１０及びＣＤ１９の両方の表面マーカーの発現によって特徴付けられる場合があり、より成熟したナイーブＢ細胞は、ＣＤ１９を発現するが、ＣＤ１０を発現しない。いくつかの実施形態では、Ｂ系統細胞は、ＣＤ１９を発現する（そしてＣＤ１０は発現しない）場合があるが、それでも１つ以上の他のマーカーに基づいてＢ細胞前駆体と区別可能であり得る。一実施形態において、ダブルポジティブＣＤ１０^＋ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞は、一方または他方のマーカーの発現を失う可能性があるが、それでもＢ系統にコミットし続けることができる。一実施形態において、本開示に従ってＢ細胞前駆体を誘導した後、その中にいくつかのＣＤ１９^＋細胞が含まれる場合があり、そのようなＣＤ１９^＋細胞は、Ｂ系統細胞の場合もあれば、より原始的な細胞の亜集団の場合もある。しかしながら、誘導培地への曝露後に取得されたこれらの細胞を分化培地に曝露すると、Ｂ系統細胞の存在比率が増加する。言い換えれば、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団と比較して、ＣＤ１９を発現する細胞の存在比率が高いことによって特徴付けられ得る。

【0053】

本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞（Ｂ ｃｅｌｌ）」または「Ｂ細胞（Ｂ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、Ｂ系統細胞から分化する細胞型を指す。Ｂ細胞は、典型的には、Ｔ特異的マーカー、ＮＫ特異的マーカー、及び赤骨髄系（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｌｏｉｄ）特異的マーカーの非存在；ＣＤ１９、ＣＤ２０、Ｂ細胞受容体（すなわち、表面ＩｇＭ）、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＣＤ１３８のうちの１つ以上の発現；及びそれらのエフェクター機能によって特徴付けられる。より具体的には、Ｂ細胞のエフェクター機能は、抗体の産生を含み得る。Ｂ細胞の種類である形質細胞及び形質芽球は、抗体を分泌し、ＣＤ１３８（形質細胞）、ＣＤ３８及びＣＤ２７の発現によって特徴付けられる。ＰＳＣまたはＨＳＰＣからのＢ細胞の分化は、通常、ＰＳＣ由来の中胚葉前駆体及び／またはリンパ球系始原細胞（例えば、ＰＳＣ由来のリンパ球系始原細胞）などの１つ以上の始原細胞集団によって媒介される。

【0054】

培地及び方法
本開示の方法は、組織またはＰＳＣのいずれかに由来する造血始原細胞を、１つ以上の中間細胞集団を介して未成熟または成熟型のＢ細胞に分化させるステップを包含する。ＨＳＰＣ及び他の誘導される下流細胞型を分化させるための本明細書で開示される方法は、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。以下に開示される本開示の培地は、本開示の方法を行うために使用することができ、したがって、本開示の独立した態様である。

【0055】

本開示の指向性分化方法は、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団を誘導培地と接触させること、及びＢ細胞前駆体の集団を誘導するのに十分な時間にわたって誘導培地中のＨＳＰＣの集団を培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、この段階の間に、Ｂ系統細胞への限定的な分化も起こり得る。

【0056】

一実施形態において、本開示の指向性分化方法は、Ｂ細胞前駆体の集団を誘導する。一実施形態において、本開示の指向性分化方法は、Ｂ系統細胞の集団を誘導する。一実施形態において、本開示の指向性分化方法は、ＩｇＭ^＋及び／または抗体分泌細胞の集団を誘導する。

【0057】

誘導培地は、ＨＳＰＣをＢ細胞前駆体集団に分化させるために使用することができる任意の培地である。好ましい実施形態において、誘導培地は、無血清である。誘導培地が無血清である場合、そのような培地に、ＢＩＴ ９５００ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９５００）、または他の市販の血清代替溶液などの血清代替サプリメントを含める必要がある場合がある。あるいは、本開示の任意の細胞を培養または分化するために必要である、血清中に通常存在する成分が、許容可能な濃度で誘導培地に個別に添加されてもよい。一実施形態において、血清中に通常存在する成分は、アルブミンである。アルブミンが誘導培地中に（血清の代わりに）含まれる場合、これは任意の種に由来し得るが、典型的にはウシまたはヒトのいずれかのものである。いくつかの実施形態では、アルブミンは組換え型であり得る。

【0058】

代替的に「ＳＵＰＰＬＣＴＬ」培地とも呼ばれる本開示の誘導培地には、ＨＳＰＣを培養し、Ｂ細胞前駆体の誘導を支持するために適切に調合された基礎培地が含まれる。したがって、好適な基礎培地は、造血系統の細胞、特にＢ細胞前駆体及び／またはＢ系統細胞及び／またはＩｇＭ^＋細胞の培養を支持する任意の基礎培地である。例示的な基礎培地は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１００－１７１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０５３１１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）２ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０５２７０）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＡＯＦ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１００－０１３０）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ＆ＳＦＥＭ ＩＩ、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９６５０、０９６５５、１０９８１）、または目的にかなった任意の他の市販の基礎培地を含むが、これらに限定されない。基礎培地を調合する一般的な成分は、塩、バッファー、脂質、アミノ酸、微量元素、特定のタンパク質、ビタミン、ミネラル、還元剤などを含み得る。一実施形態において、基礎培地は、ＨＳＰＣの分化及びそこからのＢ細胞前駆体（複数可）の誘導を支持するように最適化される。

【0059】

一実施形態において、誘導培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態において、誘導培地は、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌのうち２つ以上を含む。一実施形態において、誘導培地は、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌの各々を含む。一実施形態において、誘導培地は、ＳＣＦまたはＴＰＯのいずれかを含む。一実施形態において、誘導培地は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの１つ、２つ、または各々を含まない。一実施形態において、誘導培地は、ＴＰＯ及びＳＣＦの一方または両方を含まない。一実施形態において、誘導培地は、ＴＰＯを含まない。一実施形態において、誘導培地は、ＳＣＦを含まない。

【0060】

ＳＣＦが誘導培地に含まれる場合、その中のＳＣＦの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0061】

ＦＬＴ３Ｌが誘導培地に含まれる場合、その中のＦＬＴ３Ｌの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0062】

ＴＰＯが誘導培地に含まれる場合、その中のＴＰＯの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0063】

一実施形態において、誘導培地は、少なくとも１つの他のサイトカインをさらに含む。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、１つ以上のインターロイキンである。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上である。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－６、もしくはＩＬ－７、またはそれらのいずれかの組み合わせである。

【0064】

誘導培地に含まれる少なくとも１つの他のサイトカインの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0065】

一実施形態において、誘導培地は、ＨＳＰＣ集団からのＢ細胞前駆体集団の誘導をさらに増進するために、１つ以上の追加のサイトカインもしくは成長因子、または小分子をさらに含む。誘導培地に含まれ得る１つ以上の追加のサイトカインまたは成長因子の非限定的な例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ－１）及びインスリン成長因子２（ＩＧＦ－２）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、ならびにインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）が挙げられる。

【0066】

誘導培地に含まれる１つ以上の追加の成長因子の濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0067】

一実施形態において、誘導培地は、完全培地として調合され得る。一実施形態において、誘導培地は、使用前に新たに調製することができ、したがって、基礎培地は、基礎培地に添加される１つ以上のサプリメントとは別々に貯蔵することができる。一例では、誘導／分化方法において完全な誘導培地を使用する直前に、成長因子及びサイトカインを１つ以上のサプリメントに組み合わせて基礎培地に添加することができる。

【0068】

誘導培地に含まれる成長因子及びサイトカインは、様々な商業的供給者から調達することができ、また、組換え型であってもよい。

【0069】

本開示の誘導培地は、ＨＳＰＣの集団の培養を支持するための基質との相乗作用を示し得る。一実施形態において、間質細胞またはフィーダー細胞が、本開示の細胞培養培地と共に使用され得る。そのような細胞の非網羅的な例としては、胚性肝臓細胞株ＥＬ０８．１Ｄ２、ＡＦＴ０２４細胞、ＯＰ９細胞、ＭＳ－５またはＭ２－１０Ｂ４細胞、胚性大動脈－生殖腺中腎（ＡＧＭ）由来のマウス胚性線維芽細胞または間質細胞が挙げられる。

【0070】

一実施形態において、ＨＳＰＣの集団の培養は、フィーダー細胞不含及び／または間質細胞不含の条件下で行われる。そのような手法は、間質／フィーダー細胞によって事前にコンディショニングした培地を利用してもよく、またはそのようなシステムは、間質／フィーダー細胞代替物を利用してもよい。間質／フィーダー細胞代替物は、適切なシグナルまたは接触部位を培養中の細胞に提供する１つ以上の既定の成分を含む場合がある。このような成分は、誘導培地に含まれる（例えば可溶化される）か、または培養容器の内部培養物表面に、もしくは細胞培養培地中に懸濁した固体表面上に、例えば粒子、ビーズ、マイクロキャリアなどの上に適用されるコーティングとして用いられてもよい。このような成分の非網羅的な例は、フィブロネクチンコーティング、ゼラチンコーティング、コラーゲンコーティング、固定化されたＮｏｔｃｈリガンド、またはＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９９２５）もしくはＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などのコーティングを含み得る。

【0071】

一実施形態において、ＨＳＰＣの集団の培養は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の存在下で（そしてフィーダー細胞及び／または間質細胞担体の非存在下で）行われる。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子は、誘導培地中に可溶化されているか、または誘導培地と接触する表面上にコーティングされている。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＥＣＭ１、ＳＰＡＲＣ、またはオステオポンチンである。一実施形態において、細胞接着分子は、血管細胞接着分子（例えばＶＣＡＭ－１）または固定化ＳＣＦタンパク質（例えばＳＣＦ－Ｆｃ）である。

【0072】

一実施形態において、前述のタンパク質の異なる組み合わせが使用され得る。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質の組み合わせが使用される。一実施形態において、細胞接着分子の組み合わせが使用される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質（複数可）及び細胞接着分子（複数可）の組み合わせが使用される。

【0073】

使用される場合、誘導培地との相乗作用を示す細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の濃度は、約０．１～１００μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．０３～３０μｇ／ウェル）、約０．２～５０μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．０６～１５μｇ／ウェル）、または約０．５～２０μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．１５～６μｇ／ウェル）の範囲である。

【0074】

一実施形態において、本開示の培地は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子と併せた使用に依存しない。

【0075】

誘導培地中でＨＳＰＣの集団を培養することは、それらの生存能力または下流系統へ分化する能力に影響を与えない任意の期間にわたって行われ得る。一実施形態において、ＨＳＰＣの集団からＢ細胞前駆体の集団を誘導するための指向性分化方法は、誘導培地中のＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団を約１～２８日間、約３～２５日間、約５～２１日間、または約７～１４日間培養することを含む。一実施形態において、ＨＳＰＣの集団からＢ細胞前駆体の集団を誘導するための指向性分化方法は、誘導培地中のＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団を約３～１４日間培養することを含む。

【0076】

一実施形態において、誘導細胞の１％以上がＢ細胞前駆体である（例えばＣＤ１０を発現する）。一実施形態において、誘導細胞の５％以上がＢ細胞前駆体である。一実施形態において、誘導細胞の１０％以上がＢ細胞前駆体である。一実施形態において、誘導細胞の２０％以上がＢ細胞前駆体である。一実施形態において、誘導細胞の３０％以上がＢ細胞前駆体である。一実施形態において、誘導細胞の４０％以上がＢ細胞前駆体である。一実施形態において、誘導細胞の５０％以上がＢ細胞前駆体である。さらに、一実施形態において、誘導培地を使用して誘導された細胞の１％以上がＣＤ１９を発現する。一実施形態において、誘導培地を使用して誘導された細胞の５％以上がＣＤ１９を発現する。一実施形態において、誘導培地を使用して誘導された細胞の１０％以上がＣＤ１９を発現する。一実施形態において、誘導培地を使用して誘導された細胞の２０％以上がＣＤ１９を発現する。一実施形態において、誘導培地を使用して誘導された細胞の３０％以上がＣＤ１９を発現する。一実施形態において、誘導培地を使用して誘導された細胞の４０％以上がＣＤ１９を発現する。

【0077】

一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の（誘導培地を使用した）誘導時に出現し得るＣＤ１９^＋細胞は、Ｂ系統細胞であり得る。一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の（誘導培地を使用した）誘導時に出現し得るＣＤ１９^＋細胞は、Ｂ系統細胞ではなく、より原始的な細胞またはその始原細胞であり得る。一実施形態において、前述の細胞型の両方が、誘導培地中での培養後に取得される細胞に含まれ得る。

【0078】

一実施形態において、誘導培地を使用したＢ細胞前駆体の誘導は、投入細胞当たり１個以上のＣＤ１０^＋細胞、投入細胞当たり５個以上のＣＤ１０^＋細胞、投入細胞当たり１０個以上のＣＤ１０^＋細胞、投入細胞当たり２０個以上のＣＤ１０^＋細胞、投入細胞当たり５０個以上のＣＤ１０^＋細胞、または投入細胞当たり１００個以上のＣＤ１０^＋細胞をもたらす。さらに、一実施形態において、誘導培地を使用したＢ細胞前駆体の誘導は、投入細胞当たり１個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり５個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり１０個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり２０個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり５０個以上のＣＤ１９^＋細胞、または投入細胞当たり１００個以上のＣＤ１９^＋細胞をもたらす。

【0079】

別の態様では、本開示の指向性分化方法は、Ｂ細胞前駆体の集団を分化培地と接触させること、及びＢ系統細胞を取得するのに十分な時間にわたって分化培地中のＢ細胞前駆体の集団を培養することをさらに含む。

【0080】

一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団は、ＣＤ１０またはＣＤ１９の一方または両方を発現する。

【0081】

一実施形態において、Ｂ系統細胞は、ＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、Ｂ系統細胞は、ダブルポジティブＣＤ１０^＋ＣＤ１９^＋である。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、誘導培地中のＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団を培養した後（すなわち、誘導培地を使用したＢ細胞前駆体の集団の誘導の後）よりも多くのＣＤ１９^＋細胞を含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団の誘導後よりも２倍以上のＣＤ１９^＋細胞を含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団の誘導後よりも３倍以上のＣＤ１９^＋細胞を含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団の誘導後よりも４倍以上のＣＤ１９^＋細胞を含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団の誘導後よりも５倍以上のＣＤ１９^＋細胞を含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団の誘導後よりも１０倍以上のＣＤ１９^＋細胞を含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団の誘導後よりも２０倍以上のＣＤ１９^＋細胞を含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、Ｂ細胞前駆体の集団の誘導後よりも５０倍以上のＣＤ１９^＋細胞を含む。

【0082】

分化培地は、Ｂ細胞前駆体集団を（Ｂ系統細胞集団に）分化させるために使用することができる任意の培地である。好ましい実施形態において、分化培地は、無血清である。分化培地が無血清である場合、そのような培地に、ＢＩＴ ９５００ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９５００）、または他の市販の血清代替溶液などの血清代替サプリメントを含める必要がある場合がある。あるいは、本開示の任意の細胞を培養または分化するために必要である、血清中に通常存在する成分が、許容可能な濃度で分化培地に個別に添加されてもよい。一実施形態において、血清中に通常存在する成分は、アルブミンである。アルブミンが分化培地中に（血清の代わりに）含まれる場合、これは任意の種に由来し得るが、典型的にはウシまたはヒトのいずれかのものである。いくつかの実施形態では、アルブミンは組換え型であり得る。

【0083】

代替的に「ＤｉＭ」培地とも呼ばれる本開示の分化培地には、ＨＳＰＣ及び／またはＢ細胞前駆体及び／またはＢ系統細胞及び／またはＩｇＭ^＋細胞を培養するのに適切に調合された基礎培地が含まれる。したがって、好適な基礎培地は、造血系統の細胞、特にＢ系統細胞の培養を支持する任意の基礎培地である。例示的な基礎培地は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１００－１７１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０５３１１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）２ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０５２７０）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＡＯＦ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１００－０１３０）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ＆ＳＦＥＭ ＩＩ、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９６５０、０９６５５、１０９８１）、または目的にかなった任意の他の市販の基礎培地を含むが、これらに限定されない。そのような基礎培地を調合するために使用される一般的な成分は、塩、バッファー、脂質、アミノ酸、微量元素、特定のタンパク質、ビタミン、ミネラル、還元剤などを含み得る。一実施形態において、基礎培地は、ＨＳＰＣの分化及びそこからのＢ細胞前駆体（複数可）の誘導、そしてＢ系統細胞のさらなる分化を支持するように最適化される。

【0084】

一実施形態において、分化培地は、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＳＣＦのうちの少なくとも１つを含む。一実施形態において、分化培地は、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＳＣＦのうちの２つ以上を含む。一実施形態において、分化培地は、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＳＣＦの各々を含む。一実施形態において、分化培地は、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＳＣＦの各々、ならびに少なくとも１つの他のサイトカインを含む。一実施形態において、分化培地は、ＳＣＦまたはＴＰＯのいずれかを含む。一実施形態において、分化培地は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの１つまたは各々を含まない。一実施形態において、分化培地は、ＴＰＯ及びＳＣＦの一方または両方を含まない。一実施形態において、分化培地は、ＴＰＯを含まない。一実施形態において、分化培地は、ＳＣＦを含まない。

【0085】

ＳＣＦが分化培地に含まれる場合、その中のＳＣＦの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0086】

ＦＬＴ３Ｌが分化培地に含まれる場合、その中のＦＬＴ３Ｌの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0087】

ＴＰＯが分化培地に含まれる場合、その中のＴＰＯの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0088】

一実施形態において、分化培地は、少なくとも１つの他のサイトカインをさらに含む。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、１つ以上のインターロイキンである。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上である。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－６、もしくはＩＬ－７、またはそれらのいずれかの組み合わせである。

【0089】

分化培地中の少なくとも１つの他のサイトカインの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0090】

一実施形態において、分化培地は、Ｂ細胞前駆体集団からのＢ系統細胞の分化をさらに増進するために、１つ以上の追加のサイトカインもしくは成長因子、または小分子をさらに含む。分化培地に含まれ得る１つ以上の追加のサイトカインまたは成長因子の非限定的な例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ－１）及びインスリン成長因子２（ＩＧＦ－２）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、ならびにインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）が挙げられる。

【0091】

分化培地に含まれる１つ以上の追加のサイトカインまたは成長因子の濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0092】

一実施形態において、分化培地は、完全培地として調合され得る。一実施形態において、分化培地は、使用前に新たに調製することができ、したがって、基礎培地は、基礎培地に添加される１つ以上のサプリメントとは別々に貯蔵することができる。一例では、誘導／分化方法において完全な分化培地を使用する直前に、成長因子及びサイトカインをサプリメントに組み合わせて基礎培地に添加することができる。

【0093】

分化培地に含まれる成長因子及びサイトカインは、様々な商業的供給者から調達することができ、また、組換え型であってもよい。

【0094】

本開示の分化培地は、Ｂ細胞前駆体の集団の培養を支持するための基質との相乗作用を示し得る（Ｂ系統細胞の分化のため）。一実施形態において、間質細胞またはフィーダー細胞が、本開示の細胞培養培地と共に使用され得る。そのような細胞の非網羅的な例としては、胚性肝臓細胞株ＥＬ０８．１Ｄ２、ＡＦＴ０２４細胞、ＯＰ９細胞、ＭＳ－５またはＭ２－１０Ｂ４細胞、胚性大動脈－生殖腺中腎由来のマウス胚性線維芽細胞または間質細胞が挙げられる。

【0095】

一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団の培養は、フィーダー細胞不含及び／または間質細胞不含の条件下で行われる。そのような手法は、間質／フィーダー細胞によって事前にコンディショニングした培地を利用してもよく、またはそのようなシステムは、間質／フィーダー細胞代替物を利用してもよい。間質／フィーダー細胞代替物は、適切なシグナルまたは結合部位を培養中の細胞に提供する１つ以上の既定の成分を含む場合がある。このような成分は、分化培地に含まれるか、または培養容器の内部培養物表面に、もしくは細胞培養培地中に懸濁した固体表面上に、例えば粒子、ビーズ、マイクロキャリアなどの上に適用されるコーティングとして用いられてもよい。そのような成分の非網羅的な例は、フィブロネクチンコーティング、ゼラチンコーティング、コラーゲンコーティング、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含み得る。

【0096】

一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団の培養は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の存在下で（そしてフィーダー細胞及び／または間質細胞担体の非存在下で）行われる。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子は、分化培地中に可溶化されているか、または分化培地と接触する表面上にコーティングされている。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＥＣＭ１、ＳＰＡＲＣ、またはオステオポンチンである。一実施形態において、細胞接着分子は、血管細胞接着分子（例えばＶＣＡＭ－１）または固定化ＳＣＦタンパク質（例えばＳＣＦ－Ｆｃ）である。

【0097】

一実施形態において、前述のタンパク質の異なる組み合わせが使用され得る。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質の組み合わせが使用される。一実施形態において、細胞接着分子の組み合わせが使用される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質（複数可）及び細胞接着分子（複数可）の組み合わせが使用される。

【0098】

含まれる場合、分化培地との相乗作用を示す細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の濃度は、約０．１～１００μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．０３～３０μｇ／ウェル）、約０．２～５０μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．０６～１５μｇ／ウェル）、または約０．５～２０μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．１５～６μｇ／ウェル）の範囲である。

【0099】

一実施形態において、本開示の培地は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子と併せた使用に依存しない。

【0100】

分化培地中でＢ細胞前駆体の集団を培養することは、それらの生存能力または下流系統へ分化する能力に影響を与えない任意の期間にわたって行われ得る。一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団をＢ系統細胞の集団に分化させる方法は、分化培地中のＢ細胞前駆体の集団を約１～２８日間、約３～２５日間、約５～２１日間、または約７～１４日間培養することを含む。一実施形態において、Ｂ細胞前駆体の集団をＢ系統細胞の集団に分化させる方法は、分化培地中のＢ細胞前駆体の集団を約３～１４日間培養することを含む。

【0101】

一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の１％以上がＢ系統細胞である（例えば、ＣＤ１９を発現する）。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の５％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の１０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の２０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の３０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の４０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の５０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の６０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の７０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の８０％以上がＢ系統細胞である。一実施形態において、分化培地を使用して分化させた細胞の９０％以上がＢ系統細胞である。

【0102】

一実施形態において、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞（分化培地を使用して分化させたもの）の少なくとも一部は、ＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、約１％以上のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が、ＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、約２％以上のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が、ＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、約３％以上のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が、ＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、約４％以上のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が、ＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、約５％以上のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が、ＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、約１０％以上のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が、ＩｇＭ^＋細胞である。

【0103】

一実施形態において、分化培地を使用したＢ系統細胞の分化は、投入細胞当たり１０個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり２５個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり５０個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり１００個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり２５０個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり５００個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり１０００個以上のＣＤ１９^＋細胞、または投入細胞当たり２０００個以上のＣＤ１９^＋細胞をもたらす。さらに、一実施形態において、分化培地を使用したＢ系統細胞の分化は、投入細胞当たり１個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり５個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり１０個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり２０個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり５０個以上のＩｇＭ^＋細胞、または投入細胞当たり１００個以上のＩｇＭ^＋細胞をもたらす。

【0104】

別の態様では、本開示の指向性分化方法は、Ｂ系統細胞の集団を下流分化培地と接触させること、ならびに、ＩｇＭ^＋細胞（及び／または抗体分泌細胞）を取得する及び／または増大させるのに十分な時間にわたって下流分化培地中のＢ系統細胞の集団を培養することを含む。

【0105】

一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団は、ダブルポジティブＣＤ１０^＋ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞またはシングルポジティブＣＤ１９^＋細胞などのＣＤ１９^＋細胞を含むか、またはそれらの集団である。

【0106】

一実施形態において、本方法は、本開示の分化培地中での培養後に産出される細胞（例えばＢ系統細胞の集団）の中に、またはＣＤ１９^＋細胞（例えばダブルポジティブＣＤ１０^＋ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞）の集団の中に含まれるよりも多くの、下流分化培地中での培養後のＩｇＭ^＋細胞を取得することをさらに含む。

【0107】

下流分化培地（ＩｇＭ^＋細胞の分化及び増大用の培地とみなすこともできる）は、Ｂ系統細胞の集団を（ＩｇＭ^＋細胞の集団に）分化させるために、またはＩｇＭ^＋細胞を増大させるために使用され得る、任意の培地である。好ましい実施形態において、下流分化培地は、無血清である。下流分化培地が無血清である場合、そのような培地に、ＢＩＴ ９５００ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９５００）、または他の市販の血清代替溶液などの血清代替サプリメントを含める必要がある場合がある。あるいは、本開示の任意の細胞を培養または分化するために必要である、血清中に通常存在する成分が、許容可能な濃度で下流分化培地に個別に添加されてもよい。一実施形態において、血清中に通常存在する成分は、アルブミンである。アルブミンが下流分化培地中に（血清の代わりに）含まれる場合、これは任意の種に由来し得るが、典型的にはウシまたはヒトのいずれかのものである。いくつかの実施形態では、アルブミンは組換え型であり得る。

【0108】

代替的に「ＤＤＭ」培地とも呼ばれる本開示の下流分化培地には、ＨＳＰＣを培養し、Ｂ細胞前駆体の誘導、ＩｇＭ^＋細胞を含むＢ系統細胞の分化を支持するために適切に調合された基礎培地が含まれる。したがって、好適な基礎培地は、造血系統の細胞、特にＢ系統細胞の培養を支持する任意の基礎培地である。例示的な基礎培地は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１００－１７１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０５３１１）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）２ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０５２７０）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＡＯＦ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１００－０１３０）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ＆ＳＦＥＭ ＩＩ、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９６５０、０９６５５、１０９８１）、または目的にかなった任意の他の市販の基礎培地を含むが、これらに限定されない。そのような基礎培地を調合するために使用される一般的な成分は、塩、バッファー、脂質、アミノ酸、微量元素、特定のタンパク質、ビタミン、ミネラル、還元剤などを含み得る。一実施形態において、基礎培地は、ＨＳＰＣをＢ系統細胞（そこからのＩｇＭ^＋細胞を含む）に分化させることを最適に支持するように調合される。

【0109】

一実施形態において、下流分化培地は、ヒトＣＤ４０のリガンドを含む。ヒトＣＤ４０のリガンドは、天然形態で単離及び／または使用することができる。あるいは、ヒトＣＤ４０のリガンドは、増加した活性及び／または半減期及び／または安定性のためにエンジニアリングされ得る。ＣＤ４０のリガンドは、天然のものであってもエンジニアリングされたものであっても、商業的供給者から入手することができ、また、組換え型であってもよい。

【0110】

含まれる場合、下流分化におけるＣＤ４０のリガンドは、約１０ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し得る。

【0111】

一実施形態において、下流分化培地は、少なくとも１つの他のサイトカインをさらに含む。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、１つ以上のインターロイキンである。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上である。一実施形態において、少なくとも１つの他のサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、もしくはＩＬ－２１のうちの１つ以上、またはそれらのいずれかの組み合わせである。

【0112】

下流分化培地中の少なくとも１つの他のサイトカイン（または少なくとも１つの他のサイトカインの各々）の濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0113】

一実施形態において、下流分化培地は、Ｂ系統細胞集団からのＩｇＭ^＋細胞及び抗体分泌細胞の分化をさらに増進するために、１つ以上の追加のサイトカインもしくは成長因子、または小分子をさらに含み得る。分化培地に含まれ得る１つ以上の追加のサイトカインまたは成長因子の非限定的な例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン成長因子２（ＩＧＦ－２）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）が挙げられる。

【0114】

下流分化培地に含まれる１つ以上の追加の成長因子の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0115】

一実施形態において、下流分化培地中に含まれる１つ以上の追加の成長因子は、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの１つ以上から選択することができる。一実施形態において、下流分化培地は、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌのうちの２つ以上を含み得る。一実施形態において、下流分化培地は、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌの各々を含んでもよいし、いずれも含まなくてもよい。一実施形態において、下流分化培地は、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌの一方または両方を含まない。一実施形態において、下流分化培地は、ＴＰＯを含まず、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌの一方または両方を含まない。

【0116】

ＳＣＦが下流分化培地に含まれる場合、その中のＳＣＦの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0117】

ＦＬＴ３Ｌが下流分化培地に含まれる場合、その中のＦＬＴ３Ｌの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0118】

ＴＰＯが下流分化培地に含まれる場合、その中のＴＰＯの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0119】

一実施形態において、下流分化培地は、基礎培地、ならびにＣＤ４０のリガンド及び少なくとも１つの他のサイトカインの一方または両方を含む。一実施形態において、下流分化培地は、基礎培地、ならびにＣＤ４０のリガンド、少なくとも１つの他のサイトカイン、及び少なくとも１つの追加のサイトカインのうちの１つ以上を含む。一実施形態において、下流分化培地は、基礎培地、ＣＤ４０のリガンド及び少なくとも１つの追加のサイトカインの一方または両方を含む。

【0120】

一実施形態において、下流分化培地は、完全培地として調合され得る。一実施形態において、下流分化培地は、使用前に新たに調製することができ、したがって、基礎培地は、基礎培地に添加される１つ以上のサプリメントとは別々に貯蔵することができる。一例では、誘導／分化方法において完全な下流分化培地を使用する直前に、成長因子及びサイトカインをサプリメントに組み合わせて基礎培地に添加することができる。

【0121】

下流分化培地に含まれる成長因子及びサイトカインは、様々な商業的供給者から調達することができ、また、組換え型であってもよい。

【0122】

本開示の下流分化培地は、Ｂ系統細胞の集団の培養を支持するための基質との相乗作用を示し得る。一実施形態において、間質細胞またはフィーダー細胞が、本開示の細胞培養培地と共に使用され得る。そのような細胞の非網羅的な例としては、胚性肝臓細胞株ＥＬ０８．１Ｄ２、ＡＦＴ０２４細胞、ＯＰ９細胞、ＭＳ－５またはＭ２－１０Ｂ４細胞、胚性大動脈－生殖腺中腎（ＡＧＭ）由来のマウス胚性線維芽細胞または間質細胞が挙げられる。

【0123】

一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団の培養は、フィーダー細胞不含及び／または間質細胞不含の条件下で行われる。そのような手法は、間質／フィーダー細胞によって事前にコンディショニングした培地を利用してもよく、またはそのようなシステムは、間質／フィーダー細胞代替物を利用してもよい。間質／フィーダー細胞代替物は、適切なシグナルまたは結合部位を培養中の細胞に提供する１つ以上の既定の成分を含む場合がある。このような成分は、下流分化培地に含まれるか、または培養容器の内部培養物表面に、もしくは細胞培養培地中に懸濁した固体表面上に、例えば粒子、ビーズ、マイクロキャリアなどの上に適用されるコーティングとして用いられてもよい。そのような成分の非網羅的な例は、フィブロネクチンコーティング、ゼラチンコーティング、コラーゲンコーティング、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含み得る。

【0124】

一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団の培養は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の存在下で（そしてフィーダー細胞及び／または間質細胞担体の非存在下で）行われる。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子は、下流分化培地中に可溶化されているか、または下流分化培地と接触する表面上にコーティングされている。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＥＣＭ１、ＳＰＡＲＣ、またはオステオポンチンである。一実施形態において、細胞接着分子は、血管細胞接着分子（例えばＶＣＡＭ－１）または固定化ＳＣＦタンパク質（例えばＳＣＦ－Ｆｃ）である。

【0125】

一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質及び細胞接着分子の組み合わせが使用される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質の組み合わせが使用される。一実施形態において、細胞接着分子の組み合わせが使用される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質（複数可）及び細胞接着分子（複数可）の組み合わせが使用される。

【0126】

含まれる場合、下流分化培地との相乗作用を示す細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子の濃度は、約０．１～１００μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．０３～３０μｇ／ウェル）、約０．２～５０μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．０６～１５μｇ／ウェル）、または約０．５～２０μｇ／ｍＬ（または９６ウェルプレートで０．１５～６μｇ／ウェル）の範囲である。

【0127】

一実施形態において、本開示の培地は、細胞外マトリックスタンパク質または細胞接着分子と併せた使用に依存しない。

【0128】

下流分化培地中でＢ系統細胞の集団を培養することは、それらの生存能力または下流系統へ分化する能力に影響を与えない任意の期間にわたって行われ得る。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団をＩｇＭ^＋細胞及び／または抗体分泌細胞の集団に分化させる方法は、下流分化培地中のＢ系統細胞の集団を約１～２８日間、約３～２５日間、約５～２１日間、または約７～１４日間培養することを含む。一実施形態において、Ｂ系統細胞の集団をＩｇＭ^＋細胞の集団に分化させる方法は、下流分化培地中のＢ系統細胞の集団を約３～２１日間培養することを含む。

【0129】

一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の１０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の２０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の３０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の４０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の５０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の６０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の７０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の８０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後の細胞の９０％以上がＣＤ１９^＋細胞である。

【0130】

一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の１％がＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の２％がＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の３％がＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の４％がＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の５％以上がＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の１０％以上がＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の１５％以上がＩｇＭ^＋細胞である。一実施形態において、下流分化培地中でＢ系統細胞を培養した後のＣＤ１９^＋細胞の２０％以上がＩｇＭ^＋細胞である。

【0131】

一実施形態において、下流分化培地を使用したＢ系統細胞の下流分化は、投入細胞当たり５０個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり１００個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり２５０個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり５００個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり１０００個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり２０００個以上のＣＤ１９^＋細胞、投入細胞当たり３０００個以上のＣＤ１９^＋細胞、または投入細胞当たり４０００個以上のＣＤ１９^＋細胞をもたらす。さらに、一実施形態において、下流分化培地を使用したＢ系統細胞の下流分化は、投入細胞当たり１０個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり２５個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり５０個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり１００個以上のＩｇＭ^＋細胞、投入細胞当たり１５０個以上のＩｇＭ^＋細胞、または投入細胞当たり２００個以上のＩｇＭ^＋細胞をもたらす。

【0132】

一実施形態において、下流分化培地中での培養後、産出細胞の約０．５％以上が抗体分泌細胞である。一実施形態において、産出細胞の約１％以上が抗体分泌細胞である。一実施形態において、産出細胞の約２％以上が抗体分泌細胞である。一実施形態において、産出細胞の約３％以上が抗体分泌細胞である。一実施形態において、産出細胞の約４％以上が抗体分泌細胞である。一実施形態において、産出細胞の約５％以上が抗体分泌細胞である。一実施形態において、産出細胞の約１０％以上が抗体分泌細胞である。

【0133】

一実施形態において、抗体分泌細胞は、ＣＤ１９^＋である。一実施形態において、抗体分泌細胞は、ＣＤ１９－であり、このような抗体分泌細胞集団は、ＣＤ１３８^＋であり得る。一実施形態において、抗体分泌細胞は、ＩｇＭ^－である。一実施形態において、抗体分泌細胞は、ＩｇＭまたはＩｇＧのいずれかを分泌する。

【0134】

ＨＳＰＣがＰＳＣ由来である、本明細書で開示される方法の実施形態では、ＰＳＣは、無血清条件下で培養され得る。同じかまたは異なる実施形態では、ＰＳＣは、間質細胞不含条件及び／またはフィーダー不含条件下で培養され得る。ＰＳＣからのＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの分化は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍなどの市販のキットを、ＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ及びＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と併せて使用することによって行われ得る。このステップでは、または本明細書で開示される本方法の任意のステップでは、方法の次のステップに進む前に目的の細胞を精製／濃縮することが望ましい場合がある。細胞を精製／濃縮する方法は、免疫磁気細胞分離または蛍光活性化細胞選別などによるものが知られている。

【0135】

ＩｇＭ^＋Ｂ細胞は、ＩｇＭ^＋ＩｇＤ^＋ナイーブＢ細胞へと（ＩｇＭ^＋ＩｇＤ^＋移行Ｂ細胞期を介して）、ＩｇＭ抗体分泌細胞へと、またはアイソタイプスイッチに応じてＩｇＧ^＋、ＩｇＥ^＋、もしくはＩｇＡ^＋メモリーＢ細胞もしくは形質細胞のいずれかへと、さらに成熟し得る。そのようなメモリーＢ細胞は、抗体分泌細胞（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＡを分泌することができる）に分化する場合もある。

【0136】

一実施形態において、ＰＳＣ由来ＨＳＰＣの集団からＢ細胞前駆体の集団を誘導する方法は、上述のようにＰＳＣをＨＳＰＣに分化させる前にＰＳＣを凝集体に形成し、次いでそのようなＰＳＣ由来ＨＳＰＣを誘導培地条件に供することを含み得る。

【0137】

ＰＳＣは、任意の公知の手法を使用して凝集体に形成することができる。例えば、ＰＳＣの凝集体は、細胞培養プレートのチューブまたはウェルの底に所望の数のＰＳＣを堆積させることによって形成され得る。あるいは、凝集体は、確実にＰＳＣの均一なサイズの凝集体を効率的かつ再現可能に形成するために、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）マイクロウェルデバイス（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のウェル中に所望の数のＰＳＣを堆積させることによって形成され得る。

【0138】

一実施形態において、凝集体を形成するために使用されるＰＳＣの数は、約１～１００，０００である。一実施形態において、凝集体を形成するために使用されるＰＳＣの数は、約１０～１０，０００である。一実施形態において、凝集体を形成するために使用されるＰＳＣの数は、約１００～１，０００である。

【0139】

したがって、一実施形態において、ＰＳＣの凝集体は、マイクロウェルデバイス中で形成され得る。一実施形態において、ＰＳＣの凝集体は、約１０００個の細胞または約５００個の細胞から形成される。

【0140】

ｉ）ＨＳＰＣを濃縮する、ｉｉ）ＰＳＣを中胚葉前駆体に分化させる、ｉｉｉ）ＰＳＣ由来か組織由来かを問わずＨＳＰＣからＢ細胞前駆体の集団を誘導する、ｉｖ）Ｂ細胞前駆体からＢ系統細胞を分化させる、ｖ）Ｂ系統細胞からＩｇＭ^＋及び／またはＩｇＭ分泌細胞を分化させる、あるいはｖｉ）Ｂ系統細胞またはより後期の細胞型からＩｇＧ^＋及び／またはＩｇＧ分泌細胞を分化させるための培地ならびにこれらの方法を開示することに加えて、本明細書で開示される様々な培地が、無血清及び／またはフィーダー細胞不含もしくは間質細胞不含の条件下か否かを問わず、ＰＳＣまたは組織由来ＨＳＰＣから未成熟または成熟型のＢ細胞への段階的分化のためのシステムまたはキットに含まれ得る。

【0141】

いくつかの実施形態では、システム全体が、無血清及び／またはフィーダー細胞不含もしくは間質細胞不含の条件下で行われる。いくつかの実施形態では、システムの特定の態様のみが、無血清及び／またはフィーダー細胞不含もしくは間質細胞不含の条件下で行われる。例えば、前述の内容の普遍性を限定するものではないが、ＰＳＣから中胚葉前駆体、ＰＳＣ由来中胚葉前駆体から造血始原細胞、ＰＳＣ由来造血始原細胞からリンパ球系始原細胞（例えば、Ｂ細胞前駆体の集団）への分化、Ｂ細胞前駆体からＢ系統細胞への分化、ならびにＢ系統細胞からＩｇＭ発現細胞（及び／またはＩｇＭ分泌細胞）及び／またはＩｇＧ発現細胞（及び／またはＩｇＧ分泌細胞）のいずれかへの分化が、無血清及び／またはフィーダー細胞不含もしくは間質細胞不含の条件下で行われるのに対し、さらなる下流段階は、この条件下で行われても行われなくてもよい。逆に、システムの後期段階が、無血清及び／または間質不含の条件下で行われるのに対し、初期段階は、無血清及び／またはフィーダー細胞不含もしくは間質細胞不含の条件下で行われても行われなくてもよい。

【0142】

一実施形態において、このようなシステムまたはキットは、ＰＳＣワークフローとの関連において、ＰＳＣを中胚葉前駆体に分化させるための第１の培養システム；ＰＳＣ由来中胚葉前駆体を造血始原細胞に分化させるための第２の培養システム；ＰＳＣ由来造血始原細胞をリンパ球系始原細胞の１つ以上の亜集団に分化させるための第３の培養システム；ＰＳＣ由来リンパ球系始原細胞（例えばＢ細胞前駆体の集団）を分化させるための第４の培養システム；ＰＳＣ由来リンパ球系始原細胞（例えばＢ細胞前駆体の集団）をＢ系統細胞の集団に分化させるための第５の培養システム；Ｂ系統細胞の集団をＩｇＭ発現細胞（及び／またはＩｇＭ分泌細胞）及び／またはＩｇＧ発現細胞（及び／またはＩｇＧ分泌細胞）に分化させるための第６の培養システム；コーティング基質；ＨＳＰＣの集団を正または負に濃縮するための第１のキット；Ｂ細胞前駆体の集団を正または負に濃縮するための第２のキット；Ｂ系統細胞の集団を正または負に濃縮するための第３のキット；未成熟Ｂ細胞の集団を正または負に濃縮するための第４のキット；ならびに成熟Ｂ細胞の集団を正または負に濃縮するための第５のキットのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上の構成要素を含み得る。

【0143】

一実施形態において、このようなシステムまたはキットは、初代ＣＤ３４^＋細胞または組織由来ＣＤ３４^＋細胞ワークフローとの関連において、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの集団からＢ細胞前駆体を誘導するための第１の培養システム；Ｂ細胞前駆体の集団からＢ系統細胞を分化させるための第２の培養システム；Ｂ系統細胞の集団からＩｇＭ^＋またはＩｇＭ分泌細胞をさらに分化させるための第３の培養システム；コーティング基質；ＨＳＰＣの集団を正または負に濃縮するための第１のキット；Ｂ細胞前駆体の集団を正または負に濃縮するための第２のキット；Ｂ系統細胞の集団を正または負に濃縮するための第３のキット；未成熟Ｂ細胞の集団を正または負に濃縮するための第４のキット；ならびに成熟Ｂ細胞の集団を正または負に濃縮するための第５のキットのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上の構成要素を含み得る。

【0144】

本明細書で開示される培地を用いて、または本明細書で開示される方法によって取得された細胞は、任意の下流のアッセイまたは目的のために使用することができる。一実施形態において、本開示の細胞（Ｂ細胞前駆体の集団か、ＣＤ１９^＋もしくはＣＤ１０^＋ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団か、またはＩｇＭ^＋もしくはＩｇＭ分泌細胞かを問わない）は、Ｂ細胞発生、またはがんなどのＢ細胞疾患の生物学を調べるための研究用途で使用され得る。

【0145】

一実施形態において、本開示の細胞は、造血（例えばＢ細胞）障害に罹患している患者など、必要のある患者への移植目的で使用され得る。このような実施形態では、必要のある患者に移植される細胞は、Ｂ細胞前駆体の集団、ＣＤ１９^＋もしくはＣＤ１０^＋ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の集団、あるいはＩｇＭ^＋細胞、あるいはＩｇＭ及び／またはＩｇＧのようなＩｇを分泌する細胞であり得る。このような細胞は、１つ以上の導入遺伝子を導入するか、１つ以上のＤＮＡ断片を除去するか、または１つ以上のハイポモルフもしくはハイパーモルフ突然変異を作出するために、公知の遺伝子編集技術を使用して編集され得る。一実施形態において、移植される細胞はＰＳＣ由来であり、したがって同種異系細胞の普遍的な供給源である可能性がある。一実施形態において、移植される細胞は組織由来であり、したがって自己細胞の供給源である可能性がある。

【0146】

一実施形態において、本開示の細胞は、毒性研究または薬物スクリーンなどの試験条件に対する細胞の応答性を評価するために使用され得る。そのような実施形態では、起源細胞は、非疾患状態または疾患状態に対応し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術などによって１つまたは複数の出発細胞に疾患状態を導入することができる。

【0147】

以下の非限定的な実施例は、本開示を例示するものである。

【実施例】

【0148】

実施例１：ドナーサンプルからのＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの濃縮
商業的供給者から臍帯血ユニットを入手し、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを濃縮し、次いで１０％ＤＭＳＯを含む血清中で凍結したか、または新鮮な状態で使用した。続いて、ＣＤ３４^＋細胞を染色し、次いで、Ｌｉｎ^－（Ｌｉｎには、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、及びＣＤ６６ｂが含まれた）、「ｐｏｐ１」と呼ばれるＣＤ３４^＋ＣＤ３８^{－／ｍｉｄ／ｌｏｗ}ＣＤ１０^－細胞について選別した（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）。コントロールとして使用された、より決定的な第２の選別集団は、「ｐｏｐ２」と呼ばれるＬｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ｍｉｄＣＤ１０^＋であった（図１）。

【0149】

実施例２：フローサイトメトリーならびに細胞数及び収量の判定
本開示で概説する指向性分化プロトコルの任意の段階で、サンプルを回収することができ、その表現型をフローサイトメトリーによって評価することができる。以下の概略的プロトコルは、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＩｇＭの測定に等しく適用される。

【0150】

簡単に述べると、細胞サンプルを遠心分離によって回収し、適切に洗浄した。続いて、選択された抗原に対抗する蛍光体結合抗体で細胞サンプルを染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。死細胞を、光散乱プロファイル及びＤＲＡＱ７染色によって除外した。

【0151】

ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ２５０（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して、製造業者の推奨に従って総生存細胞数を得た。細胞を必要に応じて希釈した後に、アクリジンオレンジ及びＤＡＰＩ（ＡＯ／ＤＡＰＩ）の混合物によって染色した。本混合物では、ＡＯは、細胞膜を標識し、ＤＡＰＩは、死／瀕死細胞の核酸を標識し、これらを一緒に用いることで、サンプル中の生存細胞と非生存細胞との写真による識別が可能になる。次にＮＣ２５０ソフトウエアによって、得られた画像を分析し、生存細胞濃度を含む細胞数を記録した。投入細胞当たりの特定の細胞の収量を計算するために、総生存可能数に所定の細胞型の存在比率％を乗じた。例えば、投入ＣＤ３４^＋細胞当たりのＣＤ１０^＋細胞の収量を計算するために、まず生存細胞数に、フローサイトメトリーによって取得したＣＤ１０^＋の％を乗ずる。次に、この数を、投入細胞の数で除算して（投入ＣＤ３４^＋細胞の場合）、最終の値を得る。１つのウェルで培養された総細胞に細胞分離後のＣＤ３４^＋細胞の存在比率を乗ずることによって、投入ＣＤ３４^＋細胞数を得た。

【0152】

実施例３：臍帯血由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣからのＢ細胞前駆体の誘導
実施例１の濃縮されたＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを、誘導培地中でＢ細胞前駆体に分化させた。誘導培地は、典型的には、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番０９６５５）などの基礎培地、ならびに多様な段階特異的サイトカイン及び成長因子を含んでいた。誘導培地の最初の複製物はＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、及びＩＬ－７を含むものとし、このような因子の様々な組み合わせを試験する実験を実行した（図２、３及び６）。

【0153】

簡単に述べると、本質的に実施例１に記載したようなＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの濃縮集団からｐｏｐ２細胞を選別し、試験した誘導培地調合物中に、２４ウェルプレートのウェル当たり５０００個の細胞を播種した。様々な培地調合物中で１４日間の培養後、ＣＤ１０^＋（図２Ａ）及びＣＤ１９^＋（図２Ｂ）の細胞の存在比率及び収量について、フローサイトメトリーによって産出細胞を分析した。

【0154】

ＴＰＯは、臍帯血由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣからＢ細胞前駆体を誘導するための誘導培地において必須ではないことが観察された。ＴＰＯが誘導培地において必須ではないことを特定したので、このような誘導培地中に添加される他のサイトカイン（例えばＩＬ－３及び／またはＩＬ－６）の効果を試験した。

【0155】

簡単に述べると、ｐｏｐ２細胞をＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの濃縮集団から選別し、本質的に上述のように播種し、培養した。様々な培地調合物中で１４日間の培養後、総増大倍率（図３Ａ）、ＣＤ１０^＋細胞の存在比率及び収量（図３Ｂ）、ならびにＣＤ１９^＋細胞の存在比率及び収量（図３Ｃ）について、フローサイトメトリーによって産出細胞を分析した。フローサイトメトリーによって分析された１４日目の細胞の例示的なプロットを図３Ｄに示す。

【0156】

ＩＬ－３またはＩＬ－６を組み合わせずに単独で誘導培地に含めることでｐｏｐ２細胞からのＣＤ１０^＋細胞の収量が向上したこと、そしてＩＬ－３が単独でｐｏｐ２細胞からのＣＤ１９^＋細胞の収量を向上させたことが観察された。

【0157】

実施例１に記載のように濃縮され、選別され、播種されたｐｏｐ１細胞を使用して、上記で実行及び報告されたものと同様の実験を行った。様々な培地調合物中で１４日間の培養後、総増大倍率（図３Ｅ）、ＣＤ１０^＋細胞の存在比率及び収量（図３Ｆ）、ならびにＣＤ１９^＋細胞の存在比率及び収量（図３Ｇ）について、フローサイトメトリーによって産出細胞を分析した。フローサイトメトリーによって分析された１４日目の細胞の例示的なプロットを図３Ｈに示す。

【0158】

ＩＬ－３またはＩＬ－６を単独または組み合わせで含めることで、誘導培地中で１４日後にｐｏｐ１細胞からのＣＤ１０^＋細胞の収量が向上したことが観察された。

【0159】

実施例４：臍帯血由来Ｂ細胞前駆体からのＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の分化
本質的に実施例３に記載したようなＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ（すなわちｐｏｐ２細胞）からＢ細胞前駆体を誘導し、後述するようにＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞へと分化させた。

【0160】

最初の実験では、コントロール誘導培地（例えばＳＵＰＰＬＣＴＬ）中でｐｏｐ２細胞を１４日間培養した。１４日後、細胞を様々な分化培地調合物に移し、さらに１４日間培養した。試験した分化培地条件は、図４に示すように、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－７、またはＦＬＴ３Ｌのうちの１つ以上が欠如するように調合した。２８日目の細胞を、フローサイトメトリーによって、ＣＤ１０^＋細胞（図４Ａ）、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞（図４Ｂ）、及びＣＤ１９^＋細胞に応じたＩｇＭ^＋細胞（図４Ｃ）の存在比率及び収量について分析した。

【0161】

すべての分化培地調合物が、分析された各細胞集団において相当の存在比率及び収量をもたらしたことが観察された。

【0162】

追跡実験では、実施例３に記載したような誘導培地を１４日間使用して、ｐｏｐ２細胞からＢ細胞前駆体を誘導した。１４日後、産出細胞を回収し、計数し、フローサイトメトリーによりＣＤ１０及びＣＤ１９の発現を分析し、２４ウェルプレートのウェル当たり１～２×１０^５個の細胞を、上記の段落に記載したような分化培地に再播種した。２週間の培養後、すべての条件を回収し、計数し、ＣＤ１０、ＣＤ１９及びＩｇＭの発現についてフローサイトメトリーにより分析した（データは示さない）。ＩＬ－６を誘導培地に含めることによって分化培地との相乗作用が生じ、最も多い数のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が得られることが観察された（データは示さない）。

【0163】

上記の所見を確認するために、ｐｏｐ２細胞を誘導培地調合物（実施例３及び本実施例に記載するとおり）で１４日間培養し、次いで産出細胞を回収し、計数し、フローサイトメトリーによってＣＤ１０及びＣＤ１９などのマーカーの発現について分析した。１４日目の細胞を分化培地調合物（本実施例で上述のとおり）でさらに１４日間培養し、次いで回収し、計数し、ＣＤ１０（図５Ａ）、ＣＤ１９（図５Ｂ）、及びＩｇＭ（図５Ｃ）の発現（ならびに存在比率及び収量）についてフローサイトメトリーにより分析した。Ｐｏｐ１細胞を同様に培養し、フローサイトメトリーによってＣＤ１０（図５Ｄ）、ＣＤ１９（図５Ｅ）、及びＩｇＭ（図５Ｆ）の発現（ならびに存在比率及び収量）について分析した。

【0164】

ｐｏｐ２細胞については、開発された誘導及び分化のプロトコルにより、投入細胞当たりおよそ１５０個のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞のロバストな収量を生成することができた。さらに、投入細胞当たりおよそ１０個のＩｇＭ^＋細胞を生成することができた。濃縮されたＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの５％のみがｐｏｐ２細胞に相当することを考慮すると、無血清かつフィーダー細胞不含の条件でのこれらの効率は特筆に値する。ｐｏｐ１細胞から出発したが、ｐｏｐ２細胞との関連で観察されたように、開発された誘導及び分化のプロトコルにより、投入細胞当たりおよそ３００個のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞のロバストな収量を生成することができた（図５Ｅ）。さらに、投入細胞当たり５個を超えるＩｇＭ^＋細胞を生成することができた（図５Ｆ）。

【0165】

本実施例において上記のように実行及び報告された実験と同様に、実施例１に記載のようにｐｏｐ１細胞を濃縮及び単離し、次いで、ＳＣＦを欠いているがＩＬ－３またはＩＬ－６のいずれかを単独または組み合わせで含む誘導培地調合物に、２４ウェルプレートのウェル当たり５０００個の細胞を播種した。１４日後、産出細胞を回収し、計数し、フローサイトメトリーによりＣＤ１０及びＣＤ１９の発現を分析し、１～２×１０^５個の細胞／ウェルを分化培地（本実施例で上述のとおり）に再播種した。１４日間の培養後、すべての条件を回収し、計数し、ＣＤ１０、ＣＤ１９及びＩｇＭの発現についてフローサイトメトリーにより分析した（データは示さない）。上記のように、２８日目の細胞を回収し、計数し、ＣＤ１０（図６Ａ）及びＣＤ１９（図６Ｂ）の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。

【0166】

この場合にはｐｏｐ１細胞から出発したが、ｐｏｐ２細胞との関連で観察されたように、ＩＬ－６を様々な誘導培地調合物に含めることで分化培地との相乗作用が生じ、最も高い存在比率及び収量のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞が得られた。

【0167】

ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞及びＩｇＭ^＋細胞の存在比率及び収量を増加させるために、分化培地中での培養期間を１４日から２８日に延長した。４２日間のプロトコル（誘導培地で１４日間、分化培地で２８日間）の後、ｐｏｐ１由来ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の存在比率及び収量（図７Ａ）ならびにＣＤ１９＋細胞中のＩｇＭ^＋細胞の存在比率（図７Ｂ）は著しく増加した。ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの濃縮集団中でｐｏｐ１細胞がｐｏｐ２細胞よりも豊富であるとはいえ、無血清かつフィーダー細胞不含の条件を使用して達成された結果は特筆に値する。

【0168】

各出発細胞集団（バルクＣＤ３４^＋、ｐｏｐ１及びｐｏｐ２）について、ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の存在比率及び収量の全体的概要を図８に示す。各細胞集団を別々に実施例３及び本実施例に記載のとおりの誘導培地条件に１４日間供し、次いで本実施例に記載のように分化培地条件に移して１４日間おいた。ＣＤ３４^＋細胞の出発集団に関係なく、本培地を使用し、本開示の方法を実施することにより、ＣＤ１９＋細胞の顕著な存在比率及び収量を達成できることが明らかである。

【0169】

実施例５：臍帯血由来ＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞からＩｇＭ^＋細胞への下流分化の最適化
分化培地中での培養期間を延長することにより、ＩｇＭ^＋細胞の産出を向上させることができたが、ＩｇＭ^＋細胞の産出を増進する他の方法を探索した。具体的には、ＩｇＭ^＋細胞の産出を増進するために、培養培地添加物の効果を調べた。

【0170】

簡単に述べると、２４ウェルプレートの各ウェルで５０００個のｐｏｐ２細胞を誘導培地調合物（図３参照）に播種し、１４日間の培養後、産出細胞を２４ウェルプレートのウェル当たり細胞１～２×１０^５個で分化培地（図４及び５参照）に再播種して、さらに１４日間おいた。２８日間の培養後、産出細胞を２４ウェルプレートのウェル当たり細胞１～２×１０^５個で再播種し、様々な下流分化培地、すなわち、サイトカインまたは成長因子を含まない基礎ＳＦＥＭ ＩＩ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（「－ＤＤＭ」）、ＣＤ４０Ｌ及び組み合わせのサイトカインを補充したＳＦＥＭＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）基礎培地（「ＤＤＭａ」）、ならびにＣＤ４０Ｌ及び組み合わせのサイトカインを補充した分化培地（「ＤＤＭｂ」）において、７日間培養した。３５日間のプロトコルの後、産出細胞を回収し、計数し、ＣＤ１９（図９Ａ）及びＩｇＭ（図９Ｂ）の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。３５日目の産出細胞によるＩｇＭ及びＩｇＧの分泌が、ＥＬＩＳＰＯＴ（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ／ＩｇＧ－Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｃｏｌｏｒ ＥＬＩＳＰＯＴキット）によって確認された。ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭＩＩ基礎培地コントロールと比較すると（図９Ｃｉ）、ＣＤ４０Ｌを補充した下流分化培地中で、増加した数のＩｇＭ（赤／灰色のドット）及びＩｇＧ（青／黒のドット）の両方が検出された（図９Ｃｉｉ及び９Ｃｉｉｉ）。実際、ＣＤ１９発現細胞及びＩｇＭ発現細胞の産出が（収量に関して）、ＣＤ４０Ｌ含有条件において達成された。

【0171】

ｐｏｐ２細胞に関しては、バルク細胞から出発してＩｇＭ^＋細胞を分化させるための培養培地添加物の効果を調査した。ｐｏｐ２細胞について記載したように、バルク細胞を播種し、培養し、分析した（図９Ｄ及び９Ｅ）。ｐｏｐ２細胞で観察されたように、ＣＤ４０Ｌを含有する下流分化培地調合物中のバルク細胞は、コントロール条件と比較して、ＣＤ１９発現細胞及びＩｇＭ発現細胞の産出における（収量に関する）顕著な増加を示した。

【0172】

実施例６：ＰＳＣの維持
Ｂ細胞前駆体を誘導するためにｈＰＳＣを使用した場合、これらを、ｍＴｅＳＲ（商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で、製造業者の推奨に従って６～８日間、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたプレート上に維持した。必要に応じて完全培地交換を行った。ＰＳＣコロニーを、維持培養中に、新たにコーティングしたＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）プレート上で凝集塊にして継代した。ＰＳＣを下流アッセイに使用した場合、単一細胞懸濁液を得るために、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者の推奨プロトコルに従ってコロニーを解離した。

【0173】

実施例７：ＰＳＣ凝集体の形成及び分化
実施例６に従って単一細胞懸濁液を得ることに先立って、２４ウェルまたは６ウェルのＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００プレート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の推奨に従って準備し、その際、抗粘着洗浄液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してマイクロウェルデバイスへの細胞の接着を低減させた。推奨されるインキュベーションの後に、抗粘着洗浄液を廃棄し、１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む等量のＤＭＥＭ－Ｆ１２で各ウェルを１回すすいだ。

【0174】

マイクロウェルデバイスを準備した後、実施例６に従って解離したｈＰＳＣを、マイクロウェルデバイスの１つ以上のウェルにおいて、ＥＢ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）及び１０μＭのＹ－２７６３２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中に播種した。６ウェル方式のマイクロウェルデバイスを使用する実施形態では、２．５ｍＬのＥＢ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍをマイクロウェルデバイスのウェルに添加した。次に、さらに２．５ｍＬの細胞懸濁液（約１．４×１０^６細胞／ｍＬ）を含むＥＢ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍをウェルに添加し、マイクロウェルデバイスを短時間遠心分離し、３７℃でインキュベートした。２４ウェル方式のマイクロウェルデバイスを使用する場合、その分、ウェル当たりの容量を２ｍＬ／ウェルに縮小する必要がある。マイクロウェルデバイスの各ウェルにおける最終細胞濃度は、約３×１０^５細胞／ｍｌ、もしくは２４ウェルプレートで６×１０^５細胞／ウェル、または７×１０^５細胞／ｍＬ、もしくは６ウェルプレートで３．５×１０^６細胞／ウェルにする必要がある。

【0175】

実施例８：凝集体から造血始原細胞への分化
実施例７に記載のように凝集体を調製し、凝集体形成後２日目に、凝集体を崩すことなく、マイクロウェルデバイスの各ウェル中の２．５ｍＬの培地を慎重に取り出して廃棄した。２．５ｍＬ容量の新鮮なＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ａ（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を各ウェルに添加し、マイクロウェルデバイスを３７℃でインキュベートした。

【0176】

中胚葉中間体（例えば、中胚葉前駆体）が形成された３日目に、凝集体を崩すことなく、マイクロウェルデバイスの各ウェル中の２．５ｍＬの培地を慎重に取り出して廃棄した。ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した２．５ｍＬ容量の新鮮なＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂ（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ＥＢ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を各ウェルに添加し、３７℃でインキュベートして、中胚葉前駆体細胞を造血始原細胞に分化させた。

【0177】

５日目に、凝集体をマイクロウェルデバイスの各ウェルから回収し、３７μｍリバーシブルフィルタ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に通して、その表面上で凝集体を単離した。新鮮なチューブの上方でフィルタを反転させ、２．５ｍＬ／ウェルの新鮮なＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂをメッシュに対して誘導することにより、新鮮なチューブに凝集体の濾液を堆積させた（２４ウェル形式のマイクロウェルデバイスで１ｍＬ／ウェルを使用した）。このようにして得た凝集体を緩やかに再懸濁させた後に、総容量を非組織培養処理プレートに添加し、その後、３７℃でインキュベートした。７日目に、６ウェルプレートの各ウェルに新鮮なＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂを２．５ｍＬ（または２４ウェルプレートで１ｍＬ／ウェル）ずつ足し、次に、３７℃でインキュベートした。１０日目に、凝集体を崩さないように注意を払いながら新鮮なＥＢ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂで半分培地交換を行い、続いて３７℃でさらに２日間インキュベートした。

【0178】

実施例９：造血始原細胞の濃縮
実施例８の凝集体を各ウェルから回収し、個々の１５ｍＬチューブへ移した。チューブを３００×ｇで５～１０分間遠心分離した。上澄液を吸引し、１ｍＬのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ－２５００Ｕ／ｍＬ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（型番０７４１８）を各チューブに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、３ｍＬのＴｒｙＰＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓを加え、各チューブをさらに２０分間インキュベートした。

【0179】

インキュベーション後、各チューブにＤＭＥＭ／Ｆ１２を６ｍＬずつ足し、３７μｍフィルタに通して濾過した。溶出液を３００×ｇで５～１０分間遠心分離し、上澄液を廃棄した。ペレット化した細胞をＣＤ３４^＋濃縮プロトコル（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に供した。ＣＤ３４^＋濃縮に関しては、磁気分離の回数を４から２に減らしたことを除いては製造業者の推奨に従った。Ｈ１、Ｈ９、ＷＬＳ－１Ｃ、ＳＴｉＰＳ－Ｍ００１、及びＳＴｉＰＳ－Ｆ０１６ ＰＳＣ株は、ＣＤ３４^＋造血始原細胞に効率的に分化した。

【0180】

実施例１０：ｈＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣからのＢ細胞前駆体の誘導
実施例９の濃縮されたＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを、２４ウェルプレートのウェル当たり細胞２．５×１０^４個の密度で播種し、誘導培地中で、かつ細胞外マトリックスタンパク質もしくは細胞接着分子の様々なコーティングまたはＭＳ－５間質細胞の存在下で１４日間培養した。誘導培地は、典型的には、実施例３及び４のように、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの基礎培地、ならびに多様な段階特異的サイトカイン及び成長因子を含んでいた。誘導培地の最初の複製物は上述のものにＩＧＦ－１をさらに含めて調合し、１４日後に産出されたＨ９由来細胞をＣＤ１０及びＣＤ１９の発現について分析した。

【0181】

最も高い存在比率のＢ細胞前駆体は、フィブロネクチンまたはコラーゲン１のいずれかでコーティングされたウェルでｈＰＳＣを培養した際に生成され、これらは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングなどのより従来の手法（図１０Ａ）またはＭＳ－５間質細胞上（データは示さない）よりも優れた性能を示した。細胞外マトリックスでコーティングされていないか、またはＶＣＡＭ－１及びＳＣＦ－Ｆｃの一方もしくは両方でコーティングされたウェルにおいてｈＰＳＣを培養した際、相当の存在比率のＢ細胞前駆体が生成されたことも観察された（図１０Ｂ）。

【0182】

Ｂ系統細胞に分化するＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ細胞の能力について、かかる細胞におけるマーカー転写因子の発現を臍帯血由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ細胞中の発現レベルと比較することによって調査した。ＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣと臍帯血由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ細胞との両方において、Ｂ細胞特異化転写因子ＥＢＦ１の相対的な発現変化倍率が経時的に減少したことが観察された（図１０Ｃ）。Ｂ細胞コミットメント因子ＰＡＸ５の発現変化倍率は、ＰＳＣ由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣと臍帯血由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ細胞との両方で、分化プロトコル中に増加し（図１０Ｄ）、このことは、ＰＳＣ由来の分化細胞が、対応する臍帯血由来物と同様の転写プログラムを有することを示唆している。

【0183】

実施例１１：ｈＰＳＣ由来Ｂ細胞前駆体からのＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の分化
ＶＣＡＭ－１及び／またはＳＣＦ－Ｆｃでコーティングされた、あるいはコーティングされていないプレートにおいて、実施例１０に記載したように生成されたＢ細胞前駆体を、２４ウェルプレートのウェル当たり細胞５．０×１０^４個でＶＣＡＭ－１コーティングプレート上に再播種し、本質的に実施例４に記載のとおりだがＩＧＦ－１をさらに含む分化培地中で１４日間培養した。２８日目のＨ９由来細胞を回収し、ＣＤ１０及びＣＤ１９の発現（図１０Ｅ）ならびにＣＤ１９及びＣＤ２０の発現（図１０Ｅ）についてフローサイトメトリーによって分析した。

【0184】

ＣＤ１９を発現するＨ９由来細胞の集団はＣＤ２０も発現しており、このことは、記載された無血清かつフィーダー細胞不含の条件がＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞を生成し得ることを示唆している。

【0185】

実施例１２：コーティングの存在下での臍帯血由来ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣからのＢ細胞前駆体及びＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の生成
Ｂ細胞前駆体の誘導、及びｐｏｐ１細胞からのＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞へのＢ細胞前駆体の分化との関連で、細胞外マトリックスタンパク質コーティングまたは細胞接着分子コーティングの（コーティングなしと比較した）効果についても試験した。

【0186】

簡単に述べると、実施例１に記載したようにｐｏｐ１細胞を選別し、２４ウェルプレートのウェル当たり細胞５０００個の密度で、本質的に実施例３に記載したように、ＴＰＯ不含誘導培地に播種した（図２）。誘導培地において様々なコーティングの存在下で１４日間培養した後、各産出細胞集団を回収し、ＣＤ１０^＋（図１１Ａ）及びＣＤ１９^＋（図１１Ｂ）の存在比率及び収量について、フローサイトメトリーによって分析した。次に、１４日目の細胞を、２４ウェルプレートの対応するコーティングが施されたウェルに、ウェル当たり細胞１～１．５×１０^５個で再播種し、本質的に実施例４に記載したように、分化培地の存在下で培養した。２８日目の細胞を回収し、ＣＤ１９^＋細胞の存在比率及び収量（図１１Ｃ）ならびにＣＤ１９^＋細胞中のＩｇＭ^＋細胞の存在比率（図１１Ｄ）についてフローサイトメトリーによって分析した。

【0187】

試験したコーティングは、１４日目のＢ細胞前駆体の誘導に著しい影響を与えたようには見受けられず、１４日目のＣＤ１９発現細胞の生成に正の影響を与えなかった。興味深いことに、試験したコーティングのうち特定のものは、１４日目のＣＤ１９発現細胞の生成に対して有害であり得るように見受けられた。２８日目のＣＤ１９^＋Ｂ系統細胞の生成及び２８日目のＩｇＭ発現細胞の生成についても、同じ全体的結論が導き出され得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】