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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-16
(54)【発明の名称】ｍｉＲＮＡ、組成物およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20240409BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240409BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALI20240409BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20240409BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240409BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240409BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240409BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240409BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240409BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240409BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240409BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6837 Z
C12Q1/6806 Z
C12M1/00 A
C12N15/09 200
C12N15/09 Z
C12N15/113 Z
A61K45/00
A61P29/00
A61P37/02
G01N33/50 P
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557766
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(85)【翻訳文提出日】2023-09-20
(86)【国際出願番号】 JP2022013311
(87)【国際公開番号】W WO2022202854
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/165,508
(32)【優先日】2021-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＭｙＳＱＬ
３．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519035643
【氏名又は名称】Ｃｒａｉｆ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100174252
【弁理士】
【氏名又は名称】赤津 豪
(72)【発明者】
【氏名】山口 裕樹
【テーマコード（参考）】
2G045
4B029
4B063
4C084
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB03
2G045CB07
2G045CB30
2G045FB02
4B029AA23
4B029BB11
4B029FA05
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QX01
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB071
4C084ZB111
4C084ZB151
(57)【要約】
患者を全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法は、ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして、または健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして、患者を同定するステップとを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍｉＲＮＡを検出するための方法であって、（ａ）サンプルを得るステップと、
（ｂ）前記サンプルから細胞外小胞を捕捉または単離するステップと、
（ｃ）前記細胞外小胞を破砕するステップと、
（ｄ）前記サンプル中に存在する前記ｍｉＲＮＡを検出するステップと
を備える方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法であって、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号１～４８４またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるリボヌクレオチド配列である、方法。
【請求項3】
請求項１または２に記載の方法であって、前記細胞外小胞の前記単離は、前記細胞外小胞をナノワイヤ上に捕捉するステップを含む、方法。
【請求項4】
患者を全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法であって、（ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記得られたサンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
（ｃ）
（ｉ）前記患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥと相関する前記マーカーを有するものとして、または
（ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関する前記マーカーを有しないものとして、
前記患者を同定するステップと
を備える方法。
【請求項5】
患者をＳＬＥ重症度と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法であって、（ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
（ｃ）
（ｉ）前記患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合には中等度ＳＬＥと相関する前記マーカーを有するものとして、または
（ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合には中等度ＳＬＥと相関する前記マーカーを有しないものとして、
前記患者を同定するステップと
を備える方法。
【請求項6】
患者をＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法であって、（ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記得られたサンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
（ｃ）
（ｉ）前記患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥの併存症と相関する前記マーカーを有するものとして、または
（ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥの併存症と相関する前記マーカーを有しないものとして、
前記患者を同定するステップと
を備える方法。
【請求項7】
請求項４～６のいずれか１項に記載の方法であって、前記分析するステップは、（ａ）前記サンプルをナノワイヤを含む流体デバイスに導入するステップと、
（ｂ）前記サンプル中の細胞外小胞を前記ナノワイヤ上に捕捉するステップと、
（ｃ）前記捕捉された細胞外小胞を破砕するステップと、
（ｄ）前記破砕された細胞外小胞から少なくとも１つのｍｉＲＮＡを抽出するステップと、
（ｅ）前記抽出されたｍｉＲＮＡを検出するステップと、
（ｆ）前記検出されたｍｉＲＮＡを分析するステップと
を含む前記サンプルからｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップを備える、方法。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルは体液である、方法。
【請求項9】
請求項８に記載の方法であって、前記体液は、血液、尿、血漿、唾液、腹水、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、またはそれらの組み合わせである、方法。
【請求項10】
請求項４～７のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、前記サンプルから前記細胞外小胞を単離するステップをさらに含む、方法。
【請求項11】
請求項１０に記載の方法であって、前記細胞外小胞は、分画超遠心分離、密度勾配遠心分離、免疫親和性、限外ろ過、ポリマーベース沈殿、サイズ排除クロマトグラフィ、またはこれらの組み合わせにより単離される、方法。
【請求項12】
請求項４～１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記患者サンプルにおいて健常個体から得られたサンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出されることは、前記患者が全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）を有することを示す、方法。
【請求項13】
請求項４～１２のいずれか１項に記載の方法であって、健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関する前記マーカーを有しないものとして、方法。
【請求項14】
請求項４～１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤは、ＺｎＯ、ＳｉＯ２、Ｌｉ２Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、ＣａＯ、ＴｉＯ２、Ｍｎ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、Ｇａ２Ｏ３、ＳｒＯ、ｌｎ２Ｏ３、ＳｎＯ２、Ｓｍ２Ｏ３、ＥｕＯ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの正に帯電した表面を備える、方法。
【請求項15】
請求項４～１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤは、多孔性、磁性、または多孔性および磁性の両方である、方法。
【請求項16】
請求項４～１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００ナノメートル（ｎｍ）でありうる、方法。
【請求項17】
請求項４～１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤの長さは、約１～５００ｎｍ、１００～５００ｎｍ、２００～４００ｎｍ、２５０～５００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２～２００ｎｍ、３００～５００ｎｍ、４００～５００ｎｍ、１５０～４５０ｎｍ、２５０～３００ｎｍ、１０～５０ｎｍ、１００～３５０ｎｍ、３５０～５００ｎｍ、または２００～３００ｎｍの間である、方法。
【請求項18】
請求項４～１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤの断面は、実質的に円形、楕円形、正多角形、多角形、中空体である、方法。
【請求項19】
請求項４～１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤの外形は、実質的に円筒形、楕円形または多角形でありうる、方法。
【請求項20】
請求項４～１９のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤは、中空もしくは中空体であり、または実質的に材料が詰まった構造体であってもよい、方法。
【請求項21】
請求項４～２０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤは１つの材料または複数の材料で作製される、方法。
【請求項22】
請求項４～２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記ナノワイヤはその表面が被覆材料で被覆される、方法。
【請求項23】
請求項４～２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞外小胞は、細胞溶解バッファーによって破砕される、方法。
【請求項24】
請求項４～２３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ｍｉＲＮＡを抽出するステップは、ｉｎ ｓｉｔｕで行われる、方法。
【請求項25】
請求項４～２４のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体、またはそれらの組み合わせである、方法。
【請求項26】
請求項４～２５のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、（ａ）（ｂ）と流体連通するサンプル入力部
（ｂ）（ｃ）または（ｄ）と流体連通する分離手段、任意に膜、フィルタ、少なくとも１つのナノワイヤ、またはそれらの組み合わせ、
（ｃ）廃棄物チャンバまたは
（ｄ）廃棄物出力部
を含むデバイス、任意にマイクロ流体デバイスに導入される、方法。
【請求項27】
請求項４～２６のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、複数のウェルを含む固体基材であって、各ウェルは少なくとも１つのナノワイヤを含む、固体基材を含むデバイスに導入される、方法。
【請求項28】
請求項４～２７のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、任意に互いに流体連通する複数のチャンバを含む固体基材であって、各チャンバは少なくとも１つのナノワイヤを含む、固体基材を備えるデバイスに導入される、方法。
【請求項29】
請求項４～２８のいずれか１項に記載の方法であって、前記デバイスは、カバー、任意に取り外し可能なカバーを備える、方法。
【請求項30】
請求項４～２９のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＳＬＥは、がん、がんのより高いリスク、心血管疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、リウマチ性疾患、神経疾患、甲状腺機能低下症、精神病、貧血、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される併存症に関連する、方法。
【請求項31】
請求項３０に記載の方法であって、配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少がある場合には、前記併存症は、がん、がんのより高いリスク、心血管疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、リウマチ性疾患、神経疾患、甲状腺機能低下症、精神病、貧血、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項32】
ＳＬＥを治療する方法であって、請求項４～３１のいずれか１項に記載の患者をＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして同定する前記ステップと、
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、免疫抑制剤、および抗ＢＬｙＳ抗体からなる群より選択される有効量の化合物を患者に投与するステップとを備える、
方法。
【請求項33】
配列番号１～４８４またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるリボヌクレオチド配列を備える、単離されたｍｉＲＮＡ配列。
【請求項34】
配列番号１～４８４のリボヌクレオチド配列またはそれらの組み合わせを備える単離されたｍｉＲＮＡ配列を含む組成物。
【請求項35】
配列番号１～４８４またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるｍｉＲＮＡリボヌクレオチド配列にハイブリダイズする複数のヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項36】
請求項７に記載の方法であって、前記検出するステップは、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ、次世代ＲＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）、および／またはマルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリングによって行われる、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）を診断するための方法およびＳＬＥに関連するｍｉＲＮＡを検出するための系を提供する。
【背景技術】
【0002】
全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）は、複数の臓器が関与し、多様な臨床兆候をもつ慢性自己免疫障害である。これはリウマチ性疾患の中で最も死亡率が高いものの１つであり、ループスの最も一般的な形態である。ＳＬＥの臨床的特徴は、皮膚および関節の軽度の病変から、感染症ならびに腎臓、心血管および中枢神経系の問題など、より後のステージでの重度の衰弱性合併症までにわたり、これらがかなりの罹患率および死亡率の原因となる。自己免疫疾患であるＳＬＥは、自己抗原に対する抗体の存在により特徴付けられる。組織における自己抗体および免疫複合体の沈着が、身体の様々な臓器系の炎症性損傷をもたらす。ＣＤＣウェブサイト「全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ（ＳＬＥ））」（２０２０年）。ＳＬＥを診断するための迅速かつ効率的な方法が当技術分野において必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
一態様では、本開示は、
（ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
（ｂ）得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
（ｃ）（ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして、または（ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして、患者を同定するステップとを含む、患者を全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法に関する。
（ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
（ｂ）得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
（ｃ）（ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして、または（ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして、患者を同定するステップとを含む、患者を全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法に関する。
【0004】
別の態様では、分析するステップは、
（ａ）得られた体液サンプルを、ナノワイヤを含む流体デバイスに導入するステップと、
（ｂ）体液サンプル中の細胞外小胞をナノワイヤ上に捕捉するステップと、
（ｃ）捕捉された細胞外小胞を破砕するステップと、
（ｄ）破砕された細胞外小胞からｍｉＲＮＡを抽出するステップと、
（ｅ）抽出されたｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡアレイにハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）アレイへのｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションを測定するステップとを含む、体液サンプルからｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップを含んでいてもよい。
（ａ）得られた体液サンプルを、ナノワイヤを含む流体デバイスに導入するステップと、
（ｂ）体液サンプル中の細胞外小胞をナノワイヤ上に捕捉するステップと、
（ｃ）捕捉された細胞外小胞を破砕するステップと、
（ｄ）破砕された細胞外小胞からｍｉＲＮＡを抽出するステップと、
（ｅ）抽出されたｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡアレイにハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）アレイへのｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションを測定するステップとを含む、体液サンプルからｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップを含んでいてもよい。
【0005】
別の態様では、本開示の方法は、ＳＬＥを有すると疑われる患者から得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を、健常個体から得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現と比較するステップを更に含んでいてもよい。
【0006】
別の態様では、体液は、血液、尿、唾液、腹水、気管支肺胞洗浄液、血漿、脳脊髄液、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【0007】
別の態様では、ナノワイヤは、ＺｎＯ、ＳｉＯ２、Ｌｉ２Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、ＣａＯ、ＴｉＯ２、Ｍｎ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、Ｇａ２Ｏ３、ＳｒＯ、ｌｎ２Ｏ３、ＳｎＯ２、Ｓｍ２Ｏ３、ＥｕＯ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの正に帯電した表面であってもよい。
【0008】
別の態様では、ナノワイヤは、多孔性および／または磁性であってもよい。
【0009】
別の態様では、捕捉された細胞外小胞は、細胞溶解バッファーの使用によって破砕されてもよい。細胞外小胞は、アルカリ／デタージェントの前処理、約１～１０日、任意に約７日間の、約－２５℃での保存、またはそれらの組み合わせによって破砕されてもよい。
【0010】
別の態様では、ｍｉＲＮＡを抽出するステップを、ｉｎ ｓｉｔｕで行ってもよい。
【0011】
一態様では、本開示は、
ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
ｂ）得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
ｃ）ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合には中等度ＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして、または
ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合には中等度ＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして、患者を同定するステップとを含む、患者をＳＬＥ重症度と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法に関する。
ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
ｂ）得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
ｃ）ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合には中等度ＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして、または
ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合には中等度ＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして、患者を同定するステップとを含む、患者をＳＬＥ重症度と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法に関する。
【0012】
一態様では、本開示は、
ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
ｂ）得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
ｂ）ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有するものとして、またはｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有しないものとして、患者を同定するステップとを含む、患者をＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法に関する。
ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
ｂ）得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
ｂ）ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有するものとして、またはｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有しないものとして、患者を同定するステップとを含む、患者をＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有するものとして同定するための方法に関する。
【0013】
別の態様では、配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少がある場合には、併存症はＡであってもよい。
【0014】
別の態様では、配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少がある場合には、併存症はＢであってもよい。
【0015】
別の態様では、配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少がある場合には、併存症はＣであってもよい。
【0016】
別の態様では、配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少がある場合には、併存症はＤでありうる。
【0017】
一態様では、本開示は、患者をＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして同定するステップと、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ：ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ‐ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ）、免疫抑制剤、および抗ＢＬｙＳ抗体からなる群より選択される有効量の化合物を患者に投与するステップとを含む、ＳＬＥを治療する方法に関する。
【0018】
一態様では、本開示は、患者を中等度ＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして同定するステップと、ヒステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、免疫抑制剤、および抗ＢＬｙＳ抗体からなる群より選択される有効量の化合物を患者に投与するステップとを含む、ＳＬＥを治療する方法に関する。
【0019】
一態様では、本開示は、患者をＳＬＥ併存症Ａと相関するマーカーを有するものとして同定するステップと、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、免疫抑制剤、および抗ＢＬｙＳ抗体からなる群より選択される有効量の化合物を患者に投与するステップとを含む、ＳＬＥを治療する方法に関する。
【0020】
一態様では、本開示は、患者をＳＬＥ併存症Ｂと相関するマーカーを有するものとして同定するステップと、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、免疫抑制剤、および抗ＢＬｙＳ抗体からなる群より選択される有効量の化合物を患者に投与するステップとを含む、ＳＬＥを治療する方法に関する。
【0021】
一態様では、本開示は、患者をＳＬＥ併存症Ｃと相関するマーカーを有するものとして同定するステップと、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、免疫抑制剤、および抗ＢＬｙＳ抗体からなる群より選択される有効量の化合物を患者に投与するステップとを含む、ＳＬＥを治療する方法に関する。
【0022】
一態様では、本開示は、患者をＳＬＥ併存症Ｄと相関するマーカーを有するものとして同定するステップと、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、免疫抑制剤、および抗ＢＬｙＳ抗体からなる群より選択される有効量の化合物を患者に投与するステップとを含む、ＳＬＥを治療する方法に関する。
【0023】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。
カラーの図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請および必要な料金の支払いに応じて事務局により提供されるであろう。
カラーの図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請および必要な料金の支払いに応じて事務局により提供されるであろう。
【0024】
本発明の利点および特徴は、添付の図面と併せて解釈される以下のより詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ｍｉＲＮＡ分析の例示的な手順を示す。
【0026】
【図2】本開示の一実施形態によるＳＬＥ患者および健常なドナーからの各ｍｉＲＮＡシグナルを比較することによって行われる差次的発現分析を示す。ｍｉＲＮＡごとにコホート間のＦｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ（倍率変化）をｔ検定のｐ値に対してプロットし、統計的に有意なｍｉＲＮＡ（ｐ値＜０．０５）をバイオマーカー候補として選択した。
【0027】
【0028】
【0029】
【図4】本開示の一実施形態による各ｍｉＲＮＡの発現レベルのＳＬＥ重症度との相関を示す。各ｍｉＲＮＡのｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅの散布図は、ｘ軸：ＳＬＥ対非ＳＬＥ、およびｙ軸：中等度ＳＬＥ対軽度ＳＬＥを示す）。
【0030】
【図5A】軽度ＳＬＥ患者（軽度）、中等度ＳＬＥ患者（中等度）、および健常個体（なし）における上位１０個のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルの箱ひげ図を描く。
【0031】
【図5B】軽度ＳＬＥ患者（軽度）、中等度ＳＬＥ患者（中等度）、および健常個体（なし）における上位１０個のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルの箱ひげ図を示す。
【0032】
【図6】本開示の一実施形態による併存症ＡがあるまたはないＳＬＥ患者におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの比較を示す。ｔ検定でｐ＜０．０５のｍｉＲＮＡがバイオマーカーとして選択された。
【0033】
【図7】本開示の一実施形態による併存症ＢがあるまたはないＳＬＥ患者におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの比較を示す。ｔ検定でｐ＜０．０５のｍｉＲＮＡがバイオマーカーとして選択された。
【0034】
【図8】本開示の一実施形態による併存症ＣがあるまたはないＳＬＥ患者におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの比較を示す。ｔ検定でｐ＜０．０５のｍｉＲＮＡがバイオマーカーとして選択された。
【0035】
【図9】本開示の一実施形態による併存症ＤがあるまたはないＳＬＥ患者におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの比較を示す。ｔ検定でｐ＜０．０５のｍｉＲＮＡがバイオマーカーとして選択された。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本開示がさらに説明される前に、本開示は以下に記載される本開示の特定の実施形態に限定されず、特定の実施形態が変化させられ、なお添付の特許請求の範囲内でありうることが理解されねばならない。また、採用される用語は特定の実施形態を説明するためのものであり、限定することを意図しないことも理解されねばならない。代わりに、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立される。
定義
定義
【0037】
別段の指示がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者にとっての場合と同じ意味を有する。
【0038】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈による別段の明示がない限り複数の参照物を含む。別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術の通常の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0039】
本明細書で使用される「約」は、所与の数値の最大５％の変動を広く指す。
【0040】
本明細書で使用される「アレイ」は、空間的に判別可能な様式で表面に付着されうるｍｉＲＮＡなどの標的の集団を広く指す。アレイの個々の特徴部は、ｍｉＲＮＡなどの標的の単一のコピー、または複数のｍｉＲＮＡなどの標的の集団をアレイの個々の特徴部に含むことができる。各特徴部のｍｉＲＮＡの集団は通常は同種であり、特定の標的の単一の種を有する。しかし、いくつかの実施形態では、異種のｍｉＲＮＡの集団が特徴部に存在しうる。したがって、特徴部は単一のｍｉＲＮＡのみを含む必要はなく、代わりに複数の異なるｍｉＲＮＡを含むことができる。
【0041】
本明細書で使用される「体液」は、動物の体内に見られる様々なタイプの流体のいずれかを広く指す。体液は、液体状態または固体状態、例えば凍結状態であってもよい。溶液は、生体分子などの収集対象物質を含んでもよく、または収集対象物質を含まなくてもよく、収集対象物質を測定するための物質を含む。体液は、動物の体液であってもよい。動物は爬虫類、哺乳類、両生類であってもよい。哺乳類は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、マウス、リス、およびサル、ゴリラ、チンパンジー、ヒトであってもよい。体液は、リンパ液、間質液、細胞間液、間質液などの組織液であってもよく、体腔液、漿膜液、胸水、腹水、嚢液、脳脊髄液（脳脊髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）であってもよい。体液は、唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液などの消化液であってもよく、汗、涙、鼻水、尿、精液、膣液、羊水、乳汁などであってもよい。体液は、侵襲的に収集、抽出、収集など（以下では単に収集という）されてもよく、または非侵襲的に収集されてもよい。
【0042】
本明細書で使用される「分類器」は、サポートベクトルマシン（単数または複数）、ＡｄａＢｏｏｓｔ分類器（単数または複数）、ペナルティ付きロジスティック回帰、エラスティックネット、回帰木系（単数または複数）、勾配木ブースティング系（単数または複数）、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器（単数または複数）、ニューラルネット、ベイジアンニューラルネット、ｋ近傍法分類器（単数または複数）、深層学習系、およびランダムフォレストなどの機械学習アルゴリズムを広く指す。本発明は、列挙された分類器のいずれかを使用する方法、ならびに複数の分類器を組み合わせた使用を企図する。
【0043】
本明細書で使用される「分類および回帰木（ＣＡＲＴ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ）」は、何らかの指標、通常はモデル性能を最適化するためにデータ空間を再帰的に分割することに基づいて決定木を作成する方法を広く指す。
【0044】
本明細書で使用される「分類系」は、少なくとも１つの分類器を実行する機械学習系を広く指す。
【0045】
本明細書で使用される「デバイス」は、溶液から溶質を分離および収集するために使用されるデバイスを広く指す。いくつかの実施形態では、「デバイス」は、溶液中の物質を分析するために使用されるデバイスであってもよい。いくつかの実施形態では、「デバイス」は、溶液から有機分子を分離するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、「デバイス」は、溶液から生体分子を分離するために使用されてもよい。「デバイス」は、流体デバイス、流路デバイス、それらの組み合わせ、またはそれらのいずれかを含むデバイスであってもよい。
【0046】
本明細書で使用される「エラスティックネット」は、回帰係数のベクトルのＬ１ノルムおよびＬ２ノルムの線形結合を含む制約付きの線形回帰を行うための方法を広く指す。
【0047】
本明細書で使用される「細胞外小胞（ＥＶ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）」は、アポトーシスの間に細胞から放出されるもの、および健常細胞から放出されるものを含む、細胞から放出される小胞を広く指す。ファン・ニール・Ｇ（ｖａｎ Ｎｉｅｌ Ｇ）ら、「細胞外小胞の細胞生物学の解明（Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）」ネイチャーレビューズモルキュラーセルバイオロジー（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ）（２０１８年）１９（４）：２１３～２２８。細胞外小胞は、サイズおよび表面マーカーに応じてエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＭＶ）、およびアポトティック小体（アポトーシス小体）に広く分けられてもよい。エクソソームは通常、４０～１２０ナノメートルの直径を有し、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびｆｌｏｔｉｌｌｉｎからなる群より選択される１つ以上または全ての分子を発現することが可能であってもよい。エクソソームは、タンパク質およびｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡなどの核酸を含みうる。マイクロベシクルは通常、５０～１，０００ナノメートルの直径を有し、インテグリン、セレクチン、およびＣＤ４０からなる群より選択される１つ以上または全ての分子を発現してもよい。マイクロベシクルは、タンパク質およびｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡなどの核酸を含みうる。アポトティック小体は通常、５００～２，０００ｎｍの直径を有し、アネキシンＶおよびホスファチジルセリンからなる群より選択される１つ以上の分子を発現することが可能であってもよい。アポトティック小体は断片化された核および細胞小器官を含んでいてもよい。
【0048】
本明細書で使用される「有効量」は、治療効果でありうる所望の効果を生じるのに十分な本明細書に記載される組成物の量を指す。有効量に必要な組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、治療される状態の重症度、使用される特定の組成物、その投与様式、治療の期間、任意の同時治療の性質、使用される薬学的に許容される担体、ならびに当業者の知識および専門性の中の同様のファクターに応じて対象ごとに変動する。したがって、本発明の組成物ごとの正確な量を特定することはできない。しかし、有効量は、本明細書の教示を前提にルーチンの実験のみを用いて、関連のテキストおよび文献を参照しておよび／またはルーチンの実験を用いて、個々の場合に通常の当業者により決定されうる。（例えばレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：薬学の科学と実践（Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版ｓｕｐ．ｓｔ（２００５年）、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ペンシルベニア州フィラデルフィアを参照）。
【0049】
本明細書で使用される「偽陽性（ＦＰ：Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」および「偽陽性同定」は、ある疾患が実際には不存在であるときにアルゴリズムのテスト結果がその疾患の存在を示すエラーを広く指す。
【0050】
本明細書で使用される「偽陰性（ＦＮ：Ｆａｌｓｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ）」は、ある疾患が実際には存在するときにアルゴリズムのテスト結果がその疾患の不存在を示すエラーを広く指す。
【0051】
本明細書で使用される「遊離」は、細胞外小胞に封入されておらず、細胞外小胞と関連しない状態で存在する、体液中に存在する生体分子を広く指す。例えば、細胞外小胞に封入されておらず、細胞外小胞と関連しない状態で存在する尿または尿抽出物中のｍｉＲＮＡ。
【0052】
本明細書で使用される「相同」は、２つのアミノ酸配列すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度（上記の一致度を参照）を広く指す。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することによって決定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いてアライメントを作成することによって計算されうる。一般に入手可能な配列分析ソフトウェア、特にＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたは他のツールが公開データベースによって提供される。
【0053】
使用される「配列相同性」および「配列同一性」は、互換可能に使用されてもよく、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の配列相同性または配列同一性のパーセンテージを広く指す。配列は、最適な比較目的のために当技術分野で知られるコンピュータを用いた方法でアライメントされてもよい。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入されてもよい。このようなアライメントは、比較される配列の全長にわたって行われうる。あるいは、アライメントは、より短い長さにわたって、例えば約５、約１０、約２０、約５０、約１００またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸にわたって行われてもよい。配列同一性は、報告されたアライメント領域にわたる２つの配列間の同一マッチのパーセンテージである。
【0054】
２つの配列間の配列の比較および配列間の配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。技術者は、２つの配列をアライメントし、２つの配列間の同一性を決定するためにいくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であることを認識するであろう（クラスカル（Ｋｒｕｓｋａｌ）Ｊ．Ｂ．（１９８３年）配列比較の概要（Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、Ｄ．サンコフ（Ｓａｎｋｏｆｆ）およびＪ．Ｂ．クラスカル（Ｋｒｕｓｋａｌ）（編）、タイムワープ、列編集と高分子：配列比較の理論と実際（Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、アディソンウェスリー（Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ））。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の配列一致度は、２つの配列のアライメントのためのニードルマン‐ブンシュアルゴリズムを使用して決定されてもよい。（ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）Ｓ．Ｂ．およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）Ｃ．Ｄ．（１９７０年）ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．）４８、４４３‐４５３）。このアルゴリズムによってアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の両方がアライメントされうる。ニードルマン‐ブンシュアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以降、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート）（２０００年）ライス（Ｒｉｃｅ）、ロンジェン（Ｌｏｎｇｄｅｎ）およびブリーズビー（Ｂｌｅａｓｂｙ）、遺伝学のトレンド（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１６、（６）２７６‐２７７、ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。アミノ酸配列の場合には、置換マトリックスにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列の場合には、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティである。技術者は、これら全ての異なるパラメータによりわずかに異なる結果がもたらされるが、２つの配列の全体的な一致度は異なるアルゴリズムを使用しても大きく変わらないことを認識するであろう。
【0055】
上述のようなプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメントの後、クエリ配列と本発明の配列との間の配列同一性のパーセンテージが以下のように計算される：両配列で同一のアミノ酸または同一のヌクレオチドを示すアライメントにおける対応する位置の数を、アライメントにおけるギャップの総数を減算した後のアライメントの全長で除算する。本明細書で定義される同一性は、ＮＥＥＤＬＥからＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用して得られ、プログラムの出力において「最長同一性」としてラベル付けされる。本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために配列データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用されうる。このような検索は、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３‐１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行われうる。本発明のポリヌクレオチドに相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２によりＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が行われうる。本発明のポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によりＢＬＡＳＴタンパク質検索が行われうる。比較目的のためにギャップ付きアライメントを得るために、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年）ヌクレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２５（１７）：３３８９‐３４０２に記載されるようにギャップ付きＢＬＡＳＴが利用されうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用するときには、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されうる。
【0056】
本明細書で使用される「内包物」は、細胞外小胞に取り込まれた生体分子の形態を広く指す。例えば、細胞外小胞に取り込まれたマイクロＲＮＡ（完全または部分的内包のいずれか）。
【0057】
本明細書で使用される「ｉｎ ｓｉｔｕ抽出」は、ナノワイヤが組み込まれたマイクロ流体デバイスを使用してナノワイヤ上に捕捉されたＥＶを破砕して低分子ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）をｉｎ ｓｉｔｕで抽出すること、またはナノワイヤ上に捕捉された低分子ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）をナノワイヤから溶液に抽出することを広く指す。
【0058】
本明細書で使用される「ＬＡＳＳＯ」は、回帰係数のベクトルのＬ１ノルムに制約を付けて線形回帰を行うための方法を広く指す。
【0059】
本明細書で使用される「Ｌ１ノルム」は、ベクトルの要素の絶対値の和である。
【0060】
本明細書で使用される「Ｌ２ノルム」は、ベクトルの要素の二乗和の平方根である。
【0061】
本明細書で使用される「陰性的中率（ＮＰＶ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ）」は、真陰性（ＴＮ）の数を、真陰性（ＴＮ）の数と偽陰性（ＦＰ）の数との合計で除算したもの、ＴＰ／（ＴＮ＋ＦＮ）である。
【0062】
本明細書で使用される「ニューラルネット」は、パーセプトロン様オブジェクトを連鎖させて分類器を作成する分類方法を広く指す。
【0063】
本明細書で使用される「パフォーマンススコア」は、訓練データの予測値と実際の値との間の距離を広く指す。これは０～１００％の間の数で表され、値が高いほど予測値が実際の値に近いことを示す。通常は、スコアが高いほどモデルの性能がより良好であることを意味する。
【0064】
「陽性的中率（ＰＰＶ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ）」は、真陽性（ＴＰ）の数を、真陽性（ＴＰ）の数と偽陽性（ＦＰ）の数との合計で除算したもの、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）である。
【0065】
本明細書で使用される「ランダムフォレスト」は、モデルが訓練されるデータセットからのサンプルに基づいてＣＡＲＴを適合させるバギング方法を広く指す。
【0066】
本明細書で使用される「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために使用されうる任意の原子または分子を広く指す。標識は、二次試薬などの目的の分子に取り付けられうる。標識は、蛍光、放射能、比色、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性、およびそれらの組み合わせなどの非限定的な技法によって検出可能なシグナルを提供してもよい。
【0067】
本明細書で使用される「ナノワイヤ」は、ナノメートルオーダーの断面形状または直径（例えば１～数百ナノメートルの直径）などのサイズを有する棒状、ワイヤ状の構造体を広く指す。
【0068】
本明細書で使用される「自己免疫疾患」は、自己の免疫系が自己の健常細胞および組織と反応して発症する疾患を指す。自己免疫疾患の例は、ＳＬＥ、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、尋常性白斑、ベーチェット病、膠原病、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性肝臓疾患（例えば自己免疫性肝炎）、自己免疫性胃炎、自己免疫性甲状腺疾患、天疱瘡、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、およびＨＴＬＶ‐１関連脊髄症などの疾患が含んでいてもよい。
【0069】
本明細書で使用される「軽度ＳＬＥ」は、発疹、口腔潰瘍、および関節炎として一般的に存在する軽度から中等度のフレアを広く指す。これらのフレアは、多くの場合皮膚および関節に限定されてもよく、発熱および倦怠感も伴うことがあってもよい。軽度のフレア（例えば頬部発疹、倦怠感および関節痛）のための治療オプションは、抗マラリア薬（ヒドロキシクロロキン２００～４００ｍｇなど）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）および低用量ステロイドを含んでいてもよい。
【0070】
本明細書で使用される「中等度ＳＬＥ」は、中等度のフレア（例えばより重度の皮膚、発疹、脱毛症）を広く指し、中程度の用量のステロイドが使用されてもよい。症状を制御するためにプレドニゾン＞１０ｍｇ／日を要した患者の「ステロイド節約」効果のために、メトトレキサートまたはアザチオプリンなどの免疫抑制剤が加えられてもよい。中等度のフレアのための抗マラリア薬調整オプションは、ヒドロキシクロロキンの最大化、キナクリンの追加もしくは代用、またはクロロキンへの切り替えを含んでいてもよい。これらの薬は症状を軽減し、疾患の兆候を改善し、時には寛解を誘発するのに役立ちうるが、これらは重大なマイナスの副作用も有しうる。特にステロイドは、一般に不眠症、骨粗鬆症、筋力低下、他にも多くのものを引き起こす。可溶型Ｂリンパ球生存因子に対するモノクローナル抗体のベリムマブ（ベンリスタ）、例えばベリムマブが、このカテゴリーの患者のために近年承認されている。
【0071】
本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ」（「ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は、タンパク質をコードしないと考えられるノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の一種を広く指す。マイクロＲＮＡは、それらの前駆体から成熟体にプロセシングされる。成熟マイクロＲＮＡは、２０～２５塩基オーダーの長さを有することが知られている。ヒトのマイクロＲＮＡは、ｈｓａと名付けられる。前駆体にはｍｉｒが付され、成熟体にはｍｉＲが付される。同定される配列は、同定される順に番号付けされ、類似の配列では番号の後に小文字のアルファベットが続く。５’末端由来の前駆体と３’末端由来の前駆体がある場合には、５’末端由来のマイクロＲＮＡは５ｐで標識され、３’末端由来のマイクロＲＮＡは３ｐで標識される。これらの記号および数字はハイフンで結ばれる。成熟マイクロＲＮＡは２本鎖であってもよい。ｍｉＲＮＡは、細胞の増殖、分化、およびアポトーシスの重要な調節因子であってもよく、したがって正常な発生および生理機能に重要であってもよい。
【0072】
本明細書で使用される「リッジ回帰」は、回帰係数のベクトルのＬ２ノルムに制約を付けて線形回帰を行うための方法を広く指す。
【0073】
本明細書で使用される「重度のＳＬＥ」は、重大な腎臓疾患、脳疾患、非常に低い血小板もしくは赤血球数、血管炎などの生命または臓器を脅かす疾患を指す重度のフレアを広く指す。このようなＳＬＥの重度の兆候では、治療は通常、ソルメドロールパルス（１グラム／日ＩＶで３日間）から始まり、その後１日あたり１～２ｍｇ／ｋｇの高用量プレドニゾンが続く。ＩＶシクロホスファミド（シトキサン）、ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト）、アザチオプリン（イムラン）、またはベンリスタおよびリツキシマブ（ＲＴＸ）（商品名リツキサン）のような最近開発された生物療法などのより強力な免疫抑制剤が加えられてもよい。
【0074】
本明細書で使用される「ＳＬＥ併存症」は、ＳＬＥに関連する併存症を広く指す。ＳＬＥは、がんのより高いリスク、心血管疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、リウマチ性疾患および神経疾患、ならびに甲状腺機能低下症、精神病、および貧血に関連してもよい。併存症の発症は、ＳＬＥ診断から最初の２年間で最も高頻度であってもよい。血管疾患は、ＳＬＥに関連する多数の併存症の中で最も一般的なものの１つであってもよい。心血管疾患に加えて、ＳＬＥの患者は、骨粗鬆症、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、自己免疫性甲状腺疾患、悪性病変、関節リウマチ、全身性硬化症、筋炎、血管炎、自己免疫性肝炎、および感染症を含むいくつかの他の併存症を有していてもよい。
【0075】
本明細書で使用される「対象」は、ＳＬＥにかかりやすい任意の動物を広く指す。そのような対象は一般に、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、モルモット、ヤギ、乳牛、畜牛、ウマなどを含むがこれらに限定されない哺乳類の対象である。したがっていくつかの実施形態では、対象はＳＬＥの動物モデルを含む任意の家畜、商業的または臨床的に価値のある動物でありうる。対象は雄または雌であってもよく、新生期、幼体期、幼若期、青年期、成体期、および老年期のオブジェクトを含む任意の年齢であってもよい。特定の実施形態では、対象はヒトである。「対象」および「患者」という用語は、互換可能に使用される。
【0076】
本明細書で使用される「偏差標準（ＳＤ：Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）」は、単一の測定の不確実性を反映する個々のデータポイントの（すなわちレプリケート群の）広がりである。
【0077】
本明細書で使用される「部分集合」は、真部分集合を広く指し、「上位集合」は真上位集合である。
【0078】
本明細書で使用される「それを必要とする対象」は、ＳＬＥを有することが知られているかもしくは疑われる、または発症するリスクが高い対象を広く指す。本発明の対象は、以前にはＳＬＥを有することが知られていなかったかもしくは疑われていなかった、またはＳＬＥの治療を必要としなかった対象も含みうる。本開示の対象は、ＳＬＥを有することが知られているかまたは発症するリスクがあると考えられる対象でもある。ＳＬＥを発症するリスクがあるものとして本明細書に記載される対象は、家族歴、遺伝分析、環境曝露および／または本明細書に記載される疾患もしくは障害に関連する初期症状の発現によって同定される。
【0079】
本明細書で使用される「分離」および「濃縮」は、細胞培養培地または体液からのＥＶの高い純度および品質での分離のための方法を広く指す。分離は、材料（条件培地、生物流体、組織）の他の非ＥＶ成分からのＥＶのおよび異なるタイプのＥＶの互いからの精製または単離を指してもよい。濃縮は、分離の有無にかかわらず単位体積あたりのＥＶの数を増やすための手段であってもよい。ＥＶの分離および濃縮は、ＥＶのサイズまたは表面マーカーの発現に基づく複数の技術によって達成されうる。これらの技法は、分画超遠心分離、密度勾配遠心分離、免疫親和性（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｎｉｔｙ）、限外ろ過、ポリマーベース沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィが含んでいてもよい。
【0080】
本明細書で使用される「実質的に含まない」は、１％未満、好ましくは０．１％または０．０１％未満の量での特定の成分の存在を広く指す。より好ましくは、「実質的に含まない」という用語は、０．００１％未満の量での特定の成分の存在を広く指す。量は、組成物に応じてｗ／ｗまたはｗ／ｖとして表されてもよい。
【0081】
本明細書で使用される「固体支持体」、「支持体」、および「基材」は、滑らかな支持体（例えば金属、ガラス、プラスチック、シリコン、およびセラミック表面）ならびに凹凸および多孔性材料を含むがこれらに限定されない、別の材料を取り付けることができる固体または半固体構造体を提供する任意の材料を広く指す。基材材料には、アクリル、カーボン（例えばグラファイト、カーボンファイバー、ナノチューブ）、セラミック、制御細孔ガラス、架橋多糖類（例えばアガロースまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））、ゲル、ガラス（例えば改質または機能化ガラス）、グラファイト、無機ガラス、無機ポリマー、金属酸化物（例えばＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ステンレス鋼）、ナノ材料（例えば高配向性熱分解グラファイト（ＨＯＰＧ：ｈｉｇｈｌｙ ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｐｙｒｏｌｉｔｉｃ ｇｒａｐｈｉｔｅ）ナノシート）、有機ポリマー、プラスチック、ポリアクリロイルモルホリド（ｐｏｌａｃｒｙｌｏｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｄｅ）、ポリ（４‐メチルルブテン）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルブチレート）、ポリブチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）、ポリエチレン、ポリホルムアルデヒド、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、樹脂、シリカ、シリコン（例えば表面酸化シリコン）、またはこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【0082】
本明細書で使用される「表面」は、試薬、ビーズまたは分析物と接触するためにアクセス可能である支持構造体（例えば基材）の一部を広く指す。表面は、実質的に平坦または平面でありうる。あるいは、表面は丸みまたは輪郭が付けられうる。表面上に含めることができる例示的な輪郭は、ウェル、窪み、ピラー、リッジ、チャネルである。「表面」および「基材」という用語は、本明細書において互換可能に使用される。
【0083】
本明細書で使用される「訓練セット」は、本明細書に記載される方法および系で使用されるアルゴリズムなどの機械学習系を訓練および開発するために使用されるサンプルのセットである。
【0084】
本明細書で使用される「治療」は、疾患または傷害状態の徴候および／または症状を和らげることを広く指す。治療は、疾患もしくは傷害状態の徴候および／もしくは症状の発症を少なくするために治療組成物が徴候および／もしくは症状の発症または疾患もしくは傷害状態への曝露の前に投与される、予防措置を包含してもよい。
【0085】
本明細書で使用される「真陰性（ＴＮ：Ｔｒｕｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ）」は、あるｍｉＲＮＡが実際にはＳＬＥと関連するときにアルゴリズムのテスト結果がそのｍｉＲＮＡがＳＬＥと関連しないことを示すことである。
【0086】
本明細書で使用される「真陽性（ＴＰ：Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」は、ＳＬＥが実際にはＳＬＥと関連するときにアルゴリズムのテスト結果がｍｉＲＮＡがＳＬＥと関連することを示すことである。
【0087】
本明細書で使用される「切断」は、ポリヌクレオチドのときは５’末端および／または３’末端が短縮された、ポリペプチドのときはＮ‐および／またはＣ‐末端が短縮された配列を広く指す。
【0088】
本明細書で使用される「尿抽出物」は、ある成分、特にマイクロＲＮＡの濃度が抽出前の尿よりも高い、尿から抽出される生成物を広く指す。
【0089】
本明細書で使用される「検証セット」は、盲検化され、本明細書に記載される方法および系において使用されるアルゴリズムの機能を確認するために使用されるサンプルのセットを広く指す。これは盲検セットとしても知られる。
全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）
全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）
【0090】
全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）は、複数の臓器に原因不明に影響する原型の慢性自己免疫疾患である。ＳＬＥに関するかなりの研究にもかかわらず、ＳＬＥにおける有効な標的療法はほとんどない。症状を緩和し、疾患の進行を制御するための既存の治療オプションには、疾患を制御下に保つために非特異的免疫抑制を提供する薬物、例えば非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）およびヒドロキシクロロキン、コルチコステロイド、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびミコフェノール酸モフェチルなどの免疫抑制剤が含まれる。ベリムマブは、既に標準治療を受けている活性な自己抗体陽性疾患のＳＬＥ患者の治療のための史上初の標的生物製剤である。ベリムマブは、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）に対する完全ヒトＩｇＧ１λ組換えモノクローナル抗体である。ベリムマブと可溶型ＢＬｙＳとの特異的結合がＢＬｙｓとその３つの受容体との相互作用を妨げ、Ｂ細胞の生存および自己抗体の産生を間接的に減少させる。
【0091】
ＳＬＥの症状には、関節の痛み／関節痛、１００°Ｆ／３８℃を超える発熱、関節炎／関節の腫れ、長期または極度の倦怠感、皮膚の発疹、貧血、腎臓の病変、深呼吸時の胸痛／胸膜炎、頬および鼻の蝶形の発疹、日光または光過敏症／光線過敏症、脱毛、血液凝固の問題、レイノー現象／寒さで指が白および／または青くなる、発作、口または鼻の潰瘍、ならびにこれらの任意の組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【0092】
ＳＬＥの状態は、患者が発疹、口腔潰瘍、および関節炎として一般的に存在する軽度から中等度のフレアを患う軽度ＳＬＥであってもよい。これらのフレアは、多くは皮膚および関節に限定されてもよく、発熱および倦怠感も伴うことがあってもよい。軽度のフレア（例えば頬部発疹、倦怠感および関節痛）のための治療オプションは、抗マラリア薬（ヒドロキシクロロキン２００～４００ｍｇなど）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）および低用量ステロイドを含んでいてもよい。
【0093】
ＳＬＥの状態は、患者が中等度のフレア（例えばより重度の皮膚、発疹、脱毛症）を患う中等度ＳＬＥであってもよく、中程度の用量のステロイドが使用されてもよい。症状を制御するためにプレドニゾン＞１０ｍｇ／日を要した患者の「ステロイド節約」効果のために、メトトレキサートまたはアザチオプリンなどの免疫抑制剤が加えられうる。中等度のフレアのための抗マラリア薬調整オプションには、ヒドロキシクロロキンの最大化、キナクリンの追加もしくは代用、またはクロロキンへの切り替えが含まれてもよい。これらの薬は症状を軽減し、疾患の兆候を改善し、時には寛解を誘発するのに役立ちうるが、これらは重大なマイナスの副作用も有しうる。特にステロイドは、一般に不眠症、骨粗鬆症、筋力低下、他にも多くのものを引き起こす。可溶型Ｂリンパ球生存因子に対するモノクローナル抗体のベリムマブ（ベンリスタ）、例えばベリムマブが、このカテゴリーの患者のために近年承認されている。
【0094】
ＳＬＥの状態は、患者が重大な腎臓疾患、脳疾患、非常に低い血小板または赤血球数、血管炎などの生命または臓器を脅かす疾患を指す重度のフレアを患う重度のＳＬＥであってもよい。このようなＳＬＥの重度の兆候では、治療は通常、ソルメドロールパルス（１グラム／日ＩＶで３日間）から始まり、その後１日あたり１～２ｍｇ／ｋｇの高用量プレドニゾンが続く。ＩＶシクロホスファミド（シトキサン）、ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト）、アザチオプリン（イムラン）、またはベンリスタおよびリツキシマブ（ＲＴＸ）（商品名リツキサン）のような最近開発された生物療法などのより強力な免疫抑制剤が加えられてもよい。
【0095】
ＳＬＥは、「ＳＬＥ併存症」と呼ばれる他の状態に関連していてもよい。ＳＬＥは、がん、がんのより高いリスク、心血管疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、リウマチ性疾患および神経疾患、ならびに甲状腺機能低下症、精神病、および貧血に関連していてもよい。併存症の発症は、ＳＬＥ診断から最初の２年間で最も高頻度であってもよい。血管疾患は、ＳＬＥに関連する多数の併存症の中で最も一般的なものの１つであってもよい。心血管疾患に加えて、ＳＬＥの患者は、骨粗鬆症、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、自己免疫性甲状腺疾患、悪性病変、関節リウマチ、全身性硬化症、筋炎、血管炎、自己免疫性肝炎、および感染症を含むいくつかの他の併存症を有していてもよい。
【0096】
本明細書に記載されるように、およそ２２，０００個のタンパク質コード転写産物ｍＲＮＡ（およびその部分集合）を使用して、ＳＬＥ患者が健常対照から区別されてもよい。マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの発現を微調整する、構造プロセスとは対照に純粋な調節プロセスを表す。ヌクレオチドの相補性のコンビナトリアルな性質により、個々のｍｉＲＮＡがそのコグネイトメッセンジャーＲＮＡの転写後修飾によって数百の遺伝子の発現を調節することができる。
【0097】
成熟マイクロＲＮＡは２本鎖であってもよい。ｍｉＲＮＡは、細胞の増殖、分化、およびアポトーシスの重要な調節因子であってもよく、したがって正常な発生および生理機能に重要であってもよい。その結果、ｍｉＲＮＡ機能の調節不全は、がん、免疫疾患、およびウイルス感染症などのヒト疾患につながる場合がある。ｍｉＲＮＡの差次的発現は、ＳＬＥの診断／治療において有用であってもよい。
【0098】
ｍｉＲＮＡの発現は、メッセンジャーＲＮＡのプロファイリングよりも疾患の病因の豊富な情報源であってもよく、したがって予防、予測、個別化および参加型医療（「Ｐ４医療」）のための機序に基づく分子バイオマーカーとして実用化されることが期待できる。例えばフローレス（Ｆｌｏｒｅｓ）ら、「Ｐ４医療：システム医学がいかに医療部門と社会を変革するか（Ｐ４ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｈｏｗ ｓｙｓｔｅｍｓ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｗｉｌｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｓｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｓｏｃｉｅｔｙ）」パーソナライズドメディシン（Ｐｅｒ Ｍｅｄ．）（２０１３年）１０（６）：５６５‐５７６を参照されたい。
【0099】
本開示の実施形態は、バイオマーカーを使用したＳＬＥ患者の同定、およびそのような同定に基づくＳＬＥ患者の治療を含む。例えば、本明細書に記載される方法は、ｍｉＲＮＡおよび発現レベルのデータセットからｍｉＲＮＡを同定、例えばＳＬＥに関連するｍｉＲＮＡおよび／またはそれらの発現レベルを同定するために分類器を利用してもよい。一実施形態では、本明細書に記載されるかまたは当技術分野において記載されたｍｉＲＮＡの発現レベルを検出する方法から入手されたｍｉＲＮＡデータがデータベースに集められ、ＳＬＥを示すものまたは示さないものとしてのｍｉＲＮＡおよびそれらの発現レベルの分類に分類器によって処理される。例えば米国特許出願公開第２０２０／０２５５９０６号を参照されたい。
ｍｉＲＮＡの検出方法
ｍｉＲＮＡの検出方法
【0100】
本明細書に記載される方法は、サンプルを得るステップと、サンプル中のｍｉＲＮＡ含有量を分析するステップとを含んでいてもよい。
【0101】
サンプルは体液であってもよい。体液は、血液、尿、血漿、唾液、腹水、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、またはそれらの組み合わせであってもよい。体液を含むサンプルは、当技術分野で知られる任意の手段によって収集されてもよい。対象から溶液を抽出、収集、および収集するために、シリンジなどの抽出器が使用されてもよい。
【0102】
体液を含むサンプルは、特定の疾患をもつ対象を含む対象から採取されてもよく、または特定の疾患を患っていると疑われる対象もしくは特定の疾患を患っていることを検査予定の対象の体液であってもよい。いくつかの実施形態では、疾患はＳＬＥなどの免疫疾患であってもよい。
【0103】
サンプルは、尿抽出物であってもよく、水溶液（溶液または懸濁物）であってもよく、または尿サンプルを乾燥することにより得られる固体であってもよい。尿抽出物では、尿中の細胞外小胞および核酸以外の成分が実質的に除去されている抽出物は尿精製物と呼ばれてもよい。尿抽出物は、界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。尿抽出物は、デタージェントおよび細胞外小胞の破片（例えばエクソソームおよび／またはマイクロベシクル）を含んでいてもよい。尿抽出物は、デタージェントおよび細胞外小胞の破片（例えばエクソソームおよび／またはマイクロベシクル）からなる群より選択される１つ以上を含まないかまたは実質的に含まなくてもよい。尿抽出物は、安定化剤（例えば核酸安定化剤）および／またはｐＨ調整剤（例えば緩衝剤）をさらに含んでいてもよい。尿抽出物は、塩を含んでいてもよい。尿抽出物は、尿成分、例えば尿素、クレアチニン、尿酸、アンモニア、ウロビリン、リボフラビン、尿タンパク質、糖および尿中ホルモン（例えば絨毛性ゴナドトロピン）からなる群より選択される１つ以上の尿成分を含んでいてもよい。尿抽出物のｐＨは、２、３、４、または５などの値以上であるかまたはそれらの値より大きくてもよい。尿抽出物のｐＨは、１０、９、８、７、６、または５などの値以下であるかまたはそれらの値より小さくてもよい。尿抽出物はマイクロＲＮＡを含む。本開示において、尿抽出物は、富化／濃縮されたマイクロＲＮＡまたはその群を含んでいてもよい。本開示において、尿抽出物は、本明細書に記載される抽出方法によって抽出されたマイクロＲＮＡを含んでいてもよい。
【0104】
本明細書に記載される方法は、
（ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
（ｂ）得られたサンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
（ｃ）患者を
（ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有するものとして、または
（ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有しないものとして
同定するステップと
を含んでいてもよい。
（ａ）ＳＬＥを有すると疑われる患者から体液サンプルを得るステップと、
（ｂ）得られたサンプル中のｍｉＲＮＡ発現を分析するステップと、
（ｃ）患者を
（ｉ）患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出される場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有するものとして、または
（ｉｉ）健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥの併存症と相関するマーカーを有しないものとして
同定するステップと
を含んでいてもよい。
【0105】
本明細書に記載される方法は、
（ａ）得られた体液サンプルを、ナノワイヤを含む流体デバイスに導入するステップと、
（ｂ）体液サンプル中の細胞外小胞をナノワイヤ上に捕捉するステップと、
（ｃ）捕捉された細胞外小胞を破砕するステップと、
（ｄ）破砕された細胞外小胞から少なくとも１つのｍｉＲＮＡを抽出するステップと、
（ｅ）抽出されたｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡアレイにハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）アレイへのｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションを測定するステップと
を含む、サンプルからｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップを含む、分析するステップを含みうる。
（ａ）得られた体液サンプルを、ナノワイヤを含む流体デバイスに導入するステップと、
（ｂ）体液サンプル中の細胞外小胞をナノワイヤ上に捕捉するステップと、
（ｃ）捕捉された細胞外小胞を破砕するステップと、
（ｄ）破砕された細胞外小胞から少なくとも１つのｍｉＲＮＡを抽出するステップと、
（ｅ）抽出されたｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡアレイにハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）アレイへのｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションを測定するステップと
を含む、サンプルからｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップを含む、分析するステップを含みうる。
【0106】
細胞外小胞は、サイズおよび表面マーカーに応じてエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＭＶ）、およびアポトティック小体（アポトーシス小体）に広く分類されてもよい。エクソソームは通常、４０～１２０ナノメートルの直径を有し、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびｆｌｏｔｉｌｌｉｎからなる群より選択される１つ以上または全ての分子を発現することが可能であってもよい。エクソソームは、タンパク質およびｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡなどの核酸を含みうる。マイクロベシクルは通常、５０～１，０００ナノメートルの直径を有し、インテグリン、セレクチン、およびＣＤ４０からなる群より選択される１つ以上または全ての分子を発現することが可能であってもよい。マイクロベシクルは、タンパク質およびｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡなどの核酸を含みうる。アポトティック小体は通常、５００～２，０００ｎｍの直径を有し、アネキシンＶおよびホスファチジルセリンからなる群より選択される１つ以上の分子を発現することが可能であってもよい。アポトティック小体は断片化された核および細胞小器官を含んでいてもよい。
【0107】
細胞外小胞（ＥＶ）の分離および濃縮は、ＥＶのサイズまたは表面マーカーの発現に基づく複数の技術によって達成されうる。これらの技法には、分画超遠心分離、密度勾配遠心分離、免疫親和性、限外ろ過、ポリマーベース沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィが含まれていてもよい。分画遠心分離は、ＥＶ分離のための一般的なアプローチであってもよい。簡潔にいうと、サンプルが最初に低速で遠心分離されて細胞が除去されてもよい（５００×ｇ）。その後、２５００×ｇでの遠心分離後に細胞片が除去されてもよい。上清が収集されてもよく、それから１０，０００×ｇで遠心分離が行われて、マイクロベシクルなどの大きなＥＶがペレット化されてもよい。
それから最終的な上清が１００，０００×ｇで超遠心分離されて、エクソソームに対応しうる小さなＥＶがペレット化されてもよい。それから最終的なペレットが大量のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄されて混在タンパク質が除去され、それから最後に１回１００，０００×ｇで遠心分離されてもよい。ＥＶまたはＥＶサブタイプ分離のより良好な特異性を達成するために、１つ以上の追加の技法が使用されてもよい。密度勾配遠心分離（速度または浮上）によって、ＥＶの純度がさらに向上しうる。エクソソームは、スクロース溶液またはイオジキサノールクッションの不連続な勾配を用いて浮遊密度において精製されてもよい。免疫親和性によってもさらなる精製が達成されうる。抗体（ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）は、磁気ビーズとコンジュゲートされ、ＥＶ含有サンプルとインキュベートされてもよい。限外ろ過によってＥＶがそのサイズに基づいて分離されうる。一般的なフィルタ孔径は０．８μｍおよび０．２２μｍであってもよい。一部の商用製品は、ＥＶを分離するための沈殿のためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）を使用することもできる。サイズ排除クロマトグラフィは、ＥＶ粒子をそのサイズによって分離しうる。分離されたＥＶの純度を確認するために、電子顕微鏡法、ナノ粒子トレーシング分析法（ＮＴＡ：ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）、およびウェスタンブロッティングが行われて、ＥＶの形状、サイズ、およびバイオマーカー発現が特徴付けされされてもよい。ＥＶを定義するために、少なくとも３つの陽性タンパク質マーカー（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１など）および陰性タンパク質マーカー（カルネキシンなど）が必要であされてもよい。単一のＥＶが２つの異なる補完的な技法：顕微鏡法（走査型プローブ顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、または超解像顕微鏡法など）または単一粒子分析器（ＮＴＡ：ｓｉｎｇｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎａｌｙｚｅｒ、高精度フローサイトメトリ、および動的光散乱）によって特徴付けされうる。ＥＶの分離および分析のためのマイクロ流体チップ
それから最終的な上清が１００，０００×ｇで超遠心分離されて、エクソソームに対応しうる小さなＥＶがペレット化されてもよい。それから最終的なペレットが大量のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄されて混在タンパク質が除去され、それから最後に１回１００，０００×ｇで遠心分離されてもよい。ＥＶまたはＥＶサブタイプ分離のより良好な特異性を達成するために、１つ以上の追加の技法が使用されてもよい。密度勾配遠心分離（速度または浮上）によって、ＥＶの純度がさらに向上しうる。エクソソームは、スクロース溶液またはイオジキサノールクッションの不連続な勾配を用いて浮遊密度において精製されてもよい。免疫親和性によってもさらなる精製が達成されうる。抗体（ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）は、磁気ビーズとコンジュゲートされ、ＥＶ含有サンプルとインキュベートされてもよい。限外ろ過によってＥＶがそのサイズに基づいて分離されうる。一般的なフィルタ孔径は０．８μｍおよび０．２２μｍであってもよい。一部の商用製品は、ＥＶを分離するための沈殿のためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）を使用することもできる。サイズ排除クロマトグラフィは、ＥＶ粒子をそのサイズによって分離しうる。分離されたＥＶの純度を確認するために、電子顕微鏡法、ナノ粒子トレーシング分析法（ＮＴＡ：ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）、およびウェスタンブロッティングが行われて、ＥＶの形状、サイズ、およびバイオマーカー発現が特徴付けされされてもよい。ＥＶを定義するために、少なくとも３つの陽性タンパク質マーカー（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１など）および陰性タンパク質マーカー（カルネキシンなど）が必要であされてもよい。単一のＥＶが２つの異なる補完的な技法：顕微鏡法（走査型プローブ顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、または超解像顕微鏡法など）または単一粒子分析器（ＮＴＡ：ｓｉｎｇｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎａｌｙｚｅｒ、高精度フローサイトメトリ、および動的光散乱）によって特徴付けされうる。ＥＶの分離および分析のためのマイクロ流体チップ
【0108】
マイクロ流体デバイス上のＥＶの捕捉効率を高めるために、ナノ構造体、例えばナノワイヤがチップ上に設計されて、捕捉抗体の直接取り込みを可能にしうる、より大きな表面積が提供されてもよい。ナノワイヤは、直径または特徴的サイズが定義されない限り、セクションの最大、最小、平均、または他の特徴的サイズがナノメートル、サブナノメートル、１０ナノメートル、１００ナノメートル、またはサブマイクロメートルレベルでありうる構造体であってもよい。
【0109】
ナノワイヤの長さは、縦方向に定義されたサイズであってもよく、ナノメートルレベル～１０ナノメートルレベル、１００ナノメートルレベル、またはサブマイクロメートルレベルであってもよい。一態様では、本明細書に記載されるナノワイヤの長さは、約０．１ナノメートル～約５００ナノメートル、約１ナノメートル～約２５０ナノメートル、約１ナノメートル～約１００ナノメートル、または約５ナノメートル～約５０ナノメートルであってもよい。ナノワイヤの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ナノメートル（ｎｍ）であってもよい。ナノワイヤの長さは、約１～５００ｎｍ、１００～５００ｎｍ、２００～４００ｎｍ、２５０～５００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２～２００ｎｍ、３００～５００ｎｍ、４００～５００ｎｍ、１５０～４５０ｎｍ、２５０～３００ｎｍ、１０～５０ｎｍ、１００～３５０ｎｍ、３５０～５００ｎｍ、または２００～３００ｎｍの間であってもよい。
【0110】
ナノワイヤの長さは、例えば５００ｎｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１７μｍ、２０μｍなどの値より大きくてもよいがこれらに限定されない。ナノワイヤの長さは、例えば１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１７μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、または２００μｍ以下であってもよいがこれらに限定されない。
【0111】
ナノワイヤの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００μｍであってもよい。ナノワイヤの長さは、約１～１００μｍ、１００～２００μｍ、１２０～１４０μｍ、１５０～１７５μｍ、５～２５μｍ、１０～１０μｍ、２～２０μｍ、３０～１００μｍ、１５～１２５μｍ、１０～４５μｍ、２５～１８０μｍ、６０～７５μｍ、１～１５０μｍ、３５～２００μｍ、または２～１８０μｍの間であってもよい。
【0112】
ナノワイヤの直径（または厚み方向のサイズ）は、例えば５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍなど以上でああってもよい。ナノワイヤの直径（または厚み方向のサイズ）は、例えば１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ以下でああってもよい。
【0113】
ナノワイヤの直径は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ナノメートル（ｎｍ）でああってもよい。ナノワイヤの長さは、約１～５００ｎｍ、１００～５００ｎｍ、２００～４００ｎｍ、２５０～５００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、１０～１００ｎｍ、２～２００ｎｍ、３００～５００ｎｍ、４００～５００ｎｍ、１５０～４５０ｎｍ、２５０～３００ｎｍ、１０～５０ｎｍ、１００～３５０ｎｍ、３５０～５００ｎｍ、または２００～３００ｎｍの間でああってもよい。
【0114】
ナノワイヤの断面は、実質的に円形、楕円形、正多角形、多角形、中空体であってもよい。ナノワイヤの外形は、実質的に円筒形、楕円形または多角形であってもよい。ナノワイヤは、中空もしくは中空体であってもよく、または実質的に材料が詰まった構造体であってもよい。ナノワイヤは１つの材料または複数の材料で作製されてもよい。ナノワイヤはその表面が被覆材料で被覆されてもよい。
【0115】
ナノワイヤの材料は、無機材料または有機材料であってもよい。ナノワイヤは、金属、非金属、半導体、それらの混合物もしくは合金、またはそれらの酸化物もしくは窒化物であってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。ナノワイヤの材料は、ポリマー材料であってもよく、またはポリマー材料を含んでいてもよい。ナノワイヤは、ワイヤ、ウィスカ、繊維、それらの混合物または複合材であってもよい。ナノワイヤの材料に使用される金属は、典型金属（アルカリ金属：Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、アルカリ土類金属：Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ）、マグネシウム族元素：Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、アルミニウム族元素：Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、希土類元素：Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、スズ族元素：Ｔｉ、Ｚｒ、Ｓｎ、Ｈｆ、Ｐｂ、Ｔｈ、鉄族元素：Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、土酸元素：Ｖ Ｎｂ、Ｔａ、クロム族元素：Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ａｕ、Ｃｕ、銅族元素．Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、天然放射性元素：ＵおよびＴｈを母体とする放射能壊変産物：Ｕ、Ｔｈ、Ｒａ、Ｒｎ、アクチノイド、超ウラン元素：Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏなど、ウラン以降の元素、またはそれらの合金を含んでいてもよいがこれらに限定されない。ナノワイヤは、上記の金属もしくは合金のいずれか１つ、または合金もしくは混合物の酸化物であってもよく、酸化物を含んでもよい。ナノワイヤの材料、または少なくともナノワイヤの表面、例えばクラッディングは、限定はされないが例えばＺｎＯ、ＳｉＯ２、Ｌｉ２Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、ＣａＯ、ＴｉＯ２、Ｍｎ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、Ｇａ２Ｏ３、ＳｒＯ、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｎＯ２、Ｓｍ２Ｏ３、およびＥｕＯであってもよい。ナノワイヤは帯電していてもよい。ナノワイヤは、収集または抽出される材料のものとは反対の電荷を有してもよい。それにより、非限定的な例として、細胞外小胞、核酸などの荷電をもつ生体分子が効率的に引き付けられ吸着されうる。
【0116】
基材は、半導体、金属、絶縁体、有機材料、ポリマー材料などを例示的に含んでいてもよいがこれらに限定されない。一態様では、基材は、任意の形状の構造、例えば主表面が互いに平行でありうる平面構造、主表面が互いに平行でなくてもよい湾曲構造、またはそれらの組み合わせを有していてもよい。基材は、三次元構造を有していてもよい。基材は、触媒層が上に積層されうる材料、例えばシリコンなどの半導体材料、石英ガラス、Ｐｙｒｅｘ（登録商標）ガラスなどのガラス材料、セラミックス、プラスチックを含むポリマー材料などで形成されてもよく、そのようなものが用いられてもよい。いくつかの実施形態では、基材は実質的に可撓性であってもよく、伸長可能であってもよい。いくつかの実施形態では、基材は実質的に非可撓性であってもよい。基材の材料は、特にこれらに限定されないが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ｓｔｙｒｅｎｅ、アクリロニトリルブタジエンスチレン）樹脂、ＡＳ（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ ｓｔｙｒｅｎｅ、アクリロニトリルスチレン）樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）などの熱可塑性樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、ポリイミド、シリコーンゴム、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ：ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、およびポリカーボネート（ＰＣ：ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）より選択される材料であってもよい。
【0117】
基材（ナノワイヤ基材とも呼ばれる）上にナノワイヤが配置されてもよく、「カバー」または「カバー部材」は、ナノワイヤが上に配置された基材とは異なる基材であって、ナノワイヤ基材に結合され、流体チャンバまたは流路を形成するために使用される部材を意味するために使用されてもよい。
【0118】
ナノワイヤは、基材に取り付けられてもよい。ナノワイヤは、チャンバまたはウェル内に置かれてもよい。
【0119】
本明細書に記載される系および方法で使用されるアレイのための基材は、滑らかな支持体（例えば金属、ガラス、プラスチック、シリコン、およびセラミック表面）ならびに凹凸および多孔性材料を含むがこれらに限定されない、別の材料を取り付けることができる固体または半固体構造体を提供する任意の材料でありうる。基材材料には、アクリル、カーボン（例えばグラファイト、カーボンファイバー、ナノチューブ）、セラミック、制御細孔ガラス、架橋多糖類（例えばアガロースまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））、ゲル、ガラス（例えば改質または機能化ガラス）、グラファイト、無機ガラス、無機ポリマー、金属酸化物（例えばＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ステンレス鋼）、ナノ材料（例えば高配向性熱分解グラファイト（ＨＯＰＧ）ナノシート）、有機ポリマー、プラスチック、ポリアクリロイルモルホリド（ｐｏｌａｃｒｙｌｏｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｄｅ）、ポリ（４‐メチルルブテン）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルブチレート）、ポリブチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレン、ポリホルムアルデヒド、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、樹脂、シリカ、シリコン（例えば表面酸化シリコン）が含まれるがこれらに限定されない。
【0120】
基材は平坦である必要はなく、球形状（例えばビーズ）または円筒形状（例えば繊維）を含む任意のタイプの形状を含みうる。固体支持体に取り付けられるナノワイヤは、固体支持体の任意の部分に取り付けられてもよい（例えば多孔性固体支持体の内部部分に取り付けられてもよい）。
【0121】
基材は、基材に取り付けられたナノワイヤがパターンで設けられるようにパターン化されうる。ナノワイヤが基材上にパターンで設けられことができるように、パターン、例えばストライプ、渦、線、三角形、長方形、円、円弧、チェック、格子縞、斜線、矢印、正方形、またはクロスハッチが、基材上にエッチング、印刷、処理、スケッチ、切断、彫刻、刻印、インプリント、固定、スタンプ、被覆、エンボス、埋め込み、または層状化されてもよい。
【0122】
ナノワイヤの表面は、正に帯電していてもよい。したがって、例えば負に帯電した細胞外小胞は、効率的に収集されうる。例えばナノワイヤは、ＺｎＯ、酸化ニッケルなどの正帯電材料で形成されていてもよく、またはナノワイヤはそのような材料で被覆されてもよい。
デバイス
デバイス
【0123】
サンプル、例えば血液、血漿、または尿から細胞外小胞を分離するためにデバイスが使用されうる。
【0124】
本明細書に記載される方法とともに使用されうる本明細書に記載されたデバイスは、
（ａ）（ｂ）と流体連通するサンプル入力部
（ｂ）（ｃ）または（ｄ）と流体連通する分離手段、任意に膜、フィルタ、少なくとも１つのナノワイヤ、またはそれらの組み合わせ、
（ｃ）廃棄物チャンバ、または
（ｄ）廃棄物出力部
を含むマイクロ流体デバイスであってもよい。
（ａ）（ｂ）と流体連通するサンプル入力部
（ｂ）（ｃ）または（ｄ）と流体連通する分離手段、任意に膜、フィルタ、少なくとも１つのナノワイヤ、またはそれらの組み合わせ、
（ｃ）廃棄物チャンバ、または
（ｄ）廃棄物出力部
を含むマイクロ流体デバイスであってもよい。
【0125】
本明細書に記載される方法とともに使用されうる本明細書に記載されたデバイスは、複数のウェルを含む固体基材であって、各ウェルは少なくとも１つのナノワイヤ、任意にナノワイヤを含むアレイを含む、固体基材であってもよい。
【0126】
本明細書に記載される方法とともに使用されうる本明細書に記載されたデバイスは、任意に互いに流体連通する複数のチャンバを含む固体基材であって、各チャンバは少なくとも１つのナノワイヤ、任意にナノワイヤを含むアレイを含む、固体基材であってもよい。
【0127】
本明細書に記載されるデバイスは、ウェルまたはチャンバの上のカバー、任意に、取り外し可能でありうるカバーを含んでいてもよい。
【0128】
サンプルは、例えばシリンジ、シリンジポンプによってサンプル入力部に導入されてもよい。サンプル入力部は、細胞外小胞の捕捉を可能にする膜、フィルタ、少なくともナノワイヤ、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない分離手段に流体連結される。サンプルを分離手段に通過させた後、細胞外小胞が膜、フィルタ、ナノワイヤ、またはそれらの組み合わせと接触し、膜、フィルタ、ナノワイヤ、またはそれらの組み合わせ上に細胞外小胞が捕捉される。捕捉された細胞外小胞は、顕微鏡法および／または画像化手段などによって調べられてもよい。
【0129】
サンプルが導入された後、ナノワイヤをバッファーで洗浄して、未反応の細胞外小胞および他の物質を除去してもよい。ナノワイヤに吸着された細胞外小胞は分析されうる。
【0130】
デバイスのナノワイヤ上に吸着されたサンプルを光学顕微鏡または電子顕微鏡で観察するときに、カバーは、基材から剥がされてもよい。基材とカバー部材とが接着剤で密着しているときには、カバー部材は、例えばブレードで切断することによって除去されてもよい。顕微鏡観察により、例えば捕捉されたサンプルのサイズおよび数が決定されうる。また、例えば蛍光標識などの光標識をサンプルに結合することにより、捕捉されたサンプルの表面タンパク質の定量分析が行われうる。
【0131】
例えば、尿を、正帯電表面を有するナノワイヤ（例えばＺｎＯ、ＳｉＯ２、Ｌｉ２Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、ＣａＯ、ＴｉＯ２、Ｍｎ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、Ｇａ２Ｏ３、ＳｒＯ、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｎＯ２、Ｓｍ２Ｏ３、ＥｕＯ、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの表面を有するナノワイヤ）と尿のｐＨ環境で接触させ、それから非イオン性界面活性剤を含むバッファーで（任意に）洗浄し、尿抽出物を抽出して尿抽出物を産出することにより、尿抽出物が得られてもよい。尿は、ナノワイヤの尿との接触時、接触前、接触後、または接触中にナノワイヤの表面電荷が正になるようにｐＨ調整されてもよい。
細胞外小胞（ＥＶ）の検出
細胞外小胞（ＥＶ）の検出
【0132】
ナノワイヤを含むデバイスにＥＶを導入した後、細胞外小胞を含むナノワイヤをバッファーで洗浄して、ナノワイヤによって捕捉されていない細胞外小胞および他の任意の異物（単数または複数）を除去してもよい。
【0133】
バッファーは、任意の等張液であってもよく、例えば正常塩溶液、緩衝塩溶液、乳酸リンゲル溶液、５％ぶどう糖液（Ｄ５Ｗ）、リンゲル溶液、または０．９％塩溶液であってもよい。バッファーは、ミネラルバッファー、平衡塩溶液（ＢＳＳ：ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、トリスバッファー溶液（ＴＢＳ：ＴＲＩＳ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、有機バッファー、ホウ酸塩バッファー溶液、炭酸塩バッファー溶液、炭酸塩緩衝溶液、クエン酸塩バッファー溶液、グリシンバッファー溶液、トリス緩衝塩溶液、ダルベッコリン酸塩バッファー（ＤＰＢＳ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ）、ダルベッコイーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔｓ ａｎｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、タイロード平衡塩類溶液（ＴＢＳＳ：Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔｓ ａｎｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、最小必須培地、イーグル基礎培地（ＥＢＭ：Ｅａｇｌｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ：Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、パク塩溶液、クレブス‐リンゲル重炭酸塩バッファー、クレブス‐ヘンゼライトバッファー、ゲイ平衡塩溶液（ＧＢＳＳ：Ｇｅｙ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、グッドバッファー、ＡＣＥＳバッファー、ＢＥＳバッファー、ビシンバッファー、ビス‐トリスバッファー、ＣＡＰＳバッファー、ＣＡＰＳＯバッファー、ＣＨＥＳバッファー、グリシル‐グリシルバッファー、ＭＥＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、イミダゾールバッファー、コハク酸バッファー、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【0134】
バッファーで洗浄した後、ブロッキング剤を含むバッファー（本明細書に記載されるものを含む）を導入し、約１～６０分間インキュベートさせてもよい。ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、脱脂粉乳（ＮＦＤＭ：ｎｏｎ‐ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋ）、魚ゼラチン、全血清、または、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）を含むがこれらに限定されないポリマーであってもよい。ブロッキング剤は、約０．１％～１０％、例えば１％または４％の濃度で使用されてもよい。
【0135】
例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むバッファーを含むブロッキング溶液が導入され、約１５分間インキュベートされあってもよい。デバイスを、ブロッキング剤を含むバッファーを用いて、約－２０℃～２５℃の間の温度でインキュベートしてもよい。ブロッキング剤を含むバッファーでのインキュベーションに続いて、デバイスをバッファーで洗浄し、細胞外小胞に結合する抗体を用いてインキュベートしあってもよい。この一次抗体は、当技術分野で知られる方法を使用して二次抗体を用いて可視化されてもよい。
【0136】
例えば、デバイスをＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識マウス抗ヒトＣＤ６３モノクローナル抗体（１０μｍｇ／ｍｌ）またはマウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体（１０μｍｇ／ｍｌ）をデバイスに導入し、１５分間静置してもよい。ＣＤ８１を検出するために、デバイスを洗浄し、それからＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を二次抗体としてデバイスに導入し、それから１５分間静置してもよい。最後に、デバイスをＰＢＳで洗浄してもよく、蛍光顕微鏡下で蛍光強度を観察してもよい。ＥＶサンプルの代わりにＰＢＳを使用して、バックグラウンド値を得てもよい。９６ウェルプレートを使用した検出では、ＥＶサンプルをプレートの穴に注入し、６時間静置してもよく、その後、穴をＰＢＳで洗浄してもよい。１％ＢＳＡ溶液をプレートの穴に導入し、９０分間静置してもよい。それからウェルをＰＢＳで洗浄してもよく、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識マウス抗ヒトＣＤ６３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはマウス抗ヒトＣＤ８１抗体（１０μｇ／ｍｌ）をプレートのウェルに導入し、４５分間静置してもよい。ＣＤ８１検出のために、これに加えてプレートの穴をＰＢＳで洗浄してもよく、それからＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）を二次抗体としてプレートの穴に導入し、それから４５分間静置してもよい。最後に、プレートの穴をＰＢＳで洗浄してもよく、プレートリーダーを使用して蛍光強度を観察してもよい。ＥＶサンプルの代わりにＰＢＳを使用して、バックグラウンド値を得てもよい。
ｍｉＲＮＡ検出
ｍｉＲＮＡ検出
【0137】
マイクロＲＮＡの検出は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ｍｉＲＮＡ検出用マイクロアレイ、ＲＮＡ‐Ｓｅｑ（例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））、およびマルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリングなどの当業者に知られるｍｉＲＮＡ検出方法を用いて行われうる。尿または尿抽出物を含むサンプルは、例えば５００種以上のｍｉＲＮＡを含んでいてもよい。したがって、これら全てのｍｉＲＮＡの発現を確認するために、例えばｍｉＲＮＡ検出用マイクロアレイ、ＲＮＡ‐Ｓｅｑ法、マルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリング法が用いられうる。定量ＰＣＲに基づく方法、マルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリング法は、尿または尿抽出物中の１つ以上の特定のｍｉＲＮＡを検出するためにも使用されうる。
【0138】
本明細書に記載される方法では、対象における本開示のｍｉＲＮＡマーカーの検出および定量は、当技術分野で周知の方法にしたがって行われうる。例えば、ＲＮＡを含みうる対象からの任意の適切なサンプルからＲＮＡを得てもよく、それから本開示の方法にしたがってｍｉＲＮＡ（単数または複数）の存在および／または同定のために十分に確立されたプロトコルにしたがってＲＮＡを調製および分析してもよい。
【0139】
精製されたｍｉＲＮＡは、当技術分野で知られる方法を用いて標識されてもよい。
したがって例えば、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ標識キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））およびアミン反応性色素を製造者が推奨するように使用して標識が行われうる。アミン修飾されたｍｉＲＮＡをクリーンアップし、ＮＨＳエステル修飾Ｃｙ５またはＣｙ３色素に結合しうる（アマルシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。ＳＬＥサンプルをＣｙ５で標識してもよく、健常対照をＣｙ３で標識する。取り込まれていない色素を除去し、当業者に知られる方法にしたがってサンプルをデュプリケートでハイブリダイズさせてもよい。したがって例えば、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡバイオアレイ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））キットが製造者の指示にしたがって使用されうる。
したがって例えば、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ標識キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））およびアミン反応性色素を製造者が推奨するように使用して標識が行われうる。アミン修飾されたｍｉＲＮＡをクリーンアップし、ＮＨＳエステル修飾Ｃｙ５またはＣｙ３色素に結合しうる（アマルシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。ＳＬＥサンプルをＣｙ５で標識してもよく、健常対照をＣｙ３で標識する。取り込まれていない色素を除去し、当業者に知られる方法にしたがってサンプルをデュプリケートでハイブリダイズさせてもよい。したがって例えば、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡバイオアレイ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））キットが製造者の指示にしたがって使用されうる。
【0140】
ストリンジェントな条件下で、例えば約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるフィルタに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約５０～６５℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける１回以上の洗浄、例えば約４５℃での６×ＳＳＣにおけるフィルタに結合した核酸へのハイブリダイゼーション、続いて約６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにおける１回以上の洗浄、または当業者に知られる他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ配列（配列番号１～４８４）の１つをコードするものに相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列。例えば、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９年、分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．Ｉ、グリーンパブリッシングアソシエイツ社（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）およびジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、ページ６．３．１‐６．３．６および２．１０．３を参照されたい。
【0141】
マイクロアレイによるｍｉＲＮＡの検出および分析は、ｍｉＲＮＡを（例えば蛍光標識を標識として使用して）標識するステップと、ハイブリダイゼーションのための溶液を調製するステップと、サンプル中のｍｉＲＮＡをマイクロアレイ上の核酸などのｍｉＲＮＡ検出試薬とハイブリダイズさせるステップと、マイクロアレイを洗浄するステップと、それから標識の量（例えば蛍光の量）を測定するステップとを含みうる。抽出されたＲＮＡサンプルの品質は、例えば当業者に周知の方法または市販の機器およびキット（例えばアジレントテクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）のＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザおよびＲＮＡＬａｂＣｈｉｐ）を使用して、２０～３０ヌクレオチドの間のサイズのピークの出現を指標として確認されうる。ｍｉＲＮＡの標識は、例えば当業者に周知の方法および市販のキット（例えば３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（商標）ｍｉＲＮＡ標識キット（東レ株式会社（Ｔｏｒａｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行われうる。また、例えばマイクロアレイによるｍｉＲＮＡ分析は、東レ株式会社（Ｔｏｒａｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製の３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（商標）Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ／４ａｎｉｍａｌ ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｃｏ ｃｈｉｐ‐４ｐｌｅｘを使用して、製品の製造者の指示にしたがって行われうる。
【0142】
マイクロＲＮＡを検出するためのマイクロアレイは、ＳＬＥを有することが疑われる１人、２人、または３人の患者において、１人、２人、または３人の健常個体のいずれよりも高い発現を示すマイクロＲＮＡの群より選択される１つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイでありうる。マイクロアレイは、ＳＬＥ患者において健常個体においてよりも高い発現を示す（例えば１．０１倍以上、１．０２倍以上、１．０３倍以上、１．０４倍以上、１．０５倍以上、１．０６倍以上、１．０７倍以上、１．０８倍以上、１．０９倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、または１０倍以上）マイクロＲＮＡの群のうちの１つ以上に対するプローブを含んでいてもよい。マイクロアレイは、ＳＬＥ患者において健常個体においてよりも低い発現を示す（例えば０．９９倍以下、０．９８倍以下、０．９７倍以下、０．９６倍以下、０．９５倍以下、０．９４倍以下、０．９３倍以下、０．９２倍以下、０．９１倍以下、０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、０．６倍以下、０．５倍以下、０．４倍以下、０．３倍以下、０．２倍以下、０．１倍以下、０．０９倍以下、０．０８倍以下、０．０７倍以下、０．０６倍以下、０．０５倍以下、０．０４倍以下、０．０３倍以下、０．０２倍以下、または０．０１倍以下）マイクロＲＮＡの群のうちの１つ以上に対するプローブを含んでいてもよい。
【0143】
一態様では、検出されるマイクロＲＮＡの種（すなわちマイクロアレイに搭載されるプローブの種類）は、例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上、２５００以上、または３０００以上でありうる。
【0144】
別の態様では、検出されるマイクロＲＮＡの種（すなわちマイクロアレイに搭載されるプローブの種類）は、例えば３０００以下、２５００以下、２０００以下、１９００以下、１８００以下、１７００以下、１６００以下、１５００以下、１４００以下、１３００以下、１２００以下、１１００以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、または１０以下でありうる。
【0145】
マイクロアレイ中のマイクロＲＮＡに対するプローブは、マイクロＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸およびその誘導体であり得、当業者によって適切に設計されうる。例えばＳＬＥを示すｍｉＲＮＡに対するプローブは、配列番号１～４８４のリボヌクレオチド配列のｍｉＲＮＡにハイブリダイズするリボヌクレオチド配列およびそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【0146】
細胞外小胞に含まれるｍｉＲＮＡの検出の前に、細胞外小胞は細胞溶解バッファーでのインキュベーション、アルカリ／デタージェントの前処理、１～１０日間、好ましくは約７日間の、約－２５℃での保存、またはそれらの組み合わせによって破砕されてもよい。さらに細胞外小胞は、ワン（Ｗａｎｇ）らメソッズインモレキュラーバイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．）（２０１７年）１６６０：３６７‐３７６に記載される電界誘起破砕を用いて破砕されてもよい。
【0147】
例えば、アルカリ／デタージェントの前処理は、サンプルを０．４Ｎ ＮａＯＨで０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐３０５と一緒に約２０分間処理すること、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）で１０分間インキュベートしてＥＶ膜を破砕することを含んでいてもよい。
分類系
分類系
【0148】
医学的状態の発生を診断および予測する際に使用される例示的な分類系は、米国特許第７，３２１，８８１号；７，４６７，１１９号；７，５０５，９４８号；７，６１７，１６３号；７，６７６，４４２号；７，７０２，５９８号；７，７０７，１３４号；７，７４７，５４７号；および９，９５２，２２０号に記載されるものを含んでいてもよく、これらはそれぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0149】
本発明は、とりわけ、ＳＬＥの様々な重症度を含む健常者およびＳＬＥ患者からの実験ｍｉＲＮＡ発現データセットを含むデータに基づくｍｉＲＮＡの特徴付けに関する。ｍｉＲＮＡ発現データセットは、専有のもの（ｐｒｏｐｒｉｅｔｙ）であってもよく、または公開利用可能なデータベースからアクセスされてもよい。
【0150】
本明細書で使用される分類系は、コンピュータ実行可能ソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。例えば分類系は、プロセッサおよびサポートデータストレージへの言及を含んでいてもよい。さらに、分類系は、互いにローカルまたはリモートの複数のデバイスまたは他のコンポーネントにわたって実装されてもよい。分類系は、集中系において、または追加のスケーラビリティのための分散系として実装されてもよい。さらに、ソフトウェアへの言及には、コンピュータ上で実行されたときにコンピュータに一連のステップを行わせる非一時的コンピュータ可読媒体が含まれてもよい。
【0151】
本明細書に記載される分類系は、ネットワークアクセス可能ストレージ、ローカルストレージ、リモートストレージ、またはそれらの組み合わせなどのデータストレージを含んでいてもよい。データストレージは、リダンダントアレイオブインエクスペンシブディスクズ（「ＲＡＩＤ：ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ａｒｒａｙ ｏｆ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｄｉｓｋｓ」）、テープ、ディスク、ストレージエリアネットワーク（「ＳＡＮ：ｓｔｏｒａｇｅ ａｒｅａ ｎｅｔｗｏｒｋ」）、インターネットスモールコンピュータシステムインターフェイス（「ｉＳＣＳＩ：ｉｎｔｅｒｎｅｔ ｓｍａｌｌ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ」）ＳＡＮ、ファイバチャネルＳＡＮ、共通インターネットファイルシステム（「ＣＩＦＳ：ｃｏｍｍｏｎ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ Ｆｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ」）、ネットワークアタッチドストレージ（「ＮＡＳ：ｎｅｔｗｏｒｋ ａｔｔａｃｈｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ」）、ネットワークファイルシステム（「ＮＦＳ：ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｉｌｅ ｓｙｓｔｅｍ」）、または他のコンピュータアクセス可能ストレージを利用してもよい。データストレージは、Ｏｒａｃｌｅデータベース、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＳＱＬ Ｓｅｒｖｅｒデータベース、ＤＢ２データベース、ＭｙＳＱＬデータベース、Ｓｙｂａｓｅデータベース、オブジェクト指向データベース、階層型データベース、クラウドベースのデータベース、公開データベース、または他のデータベースなどのデータベースであってもよい。データストレージは、データの記憶のためにフラットファイル構造を利用してもよい。例示的な実施形態は、深層学習アルゴリズムを訓練するために、４９９２個のＣＵＤＡコアおよび大量のＧＢのメモリ（例えば１１ＧＢ超）をそれぞれ備えた２つのＴｅｓｌａ Ｋ８０ ＮＶＩＤＩＡ ＧＰＵを使用した。
【0152】
第１ステップで、分類器を使用して既定のデータのセットが記述される。これが「学習ステップ」であり、「訓練」データに対して実施される。
【0153】
訓練データベースは、それぞれのｍｉＲＮＡがＳＬＥおよび／またはＳＬＥ重症度に関して分類された複数のｍｉＲＮＡについての複数のｍｉＲＮＡ発現データを反映するコンピュータ実装データストアである。ｍｉＲＮＡ発現データは、ｍｉＲＮＡ発現データ、予測ｍｉＲＮＡ発現データ、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。記憶されたデータのフォーマットは、フラットファイル、データベース、テーブル、または当技術分野で知られる他の任意の検索可能なデータストレージフォーマットであってもよい。テストデータは複数のベクトルとして記憶されてもよく、各ベクトルは個々のｍｉＲＮＡに対応し、各ベクトルは複数のｍｉＲＮＡ発現データについての複数のｍｉＲＮＡ発現データ尺度をｍｉＲＮＡのＳＬＥおよび／またはＳＬＥ重症度特徴付けに関する分類と一緒に含む。ベクトルは、複数の実験ｍｉＲＮＡ発現データについてのｍｉＲＮＡ発現データ尺度を、ｍｉＲＮＡのＳＬＥおよび／またはＳＬＥ重症度特徴付けに関する分類と一緒にさらに含んでいてもよい。通常、各ベクトルは、複数のｍｉＲＮＡ発現データ尺度の中の各ｍｉＲＮＡ発現データ尺度のエントリを含む。エントリは、異なる体液データにおけるｍｉＲＮＡの存在または不存在をさらに含んでいてもよい。訓練データベースは、その内容が権限ある主体（例えば人間のユーザまたはコンピュータプログラム）によってリモートで検索されうるように、インターネットなどのネットワークにリンクされてもよい。あるいは、訓練データベースは、ネットワーク隔離されたコンピュータに位置してもよい。さらに、訓練データベースは、ＳＬＥの診断において有用なｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ発現データ（例えば実験、予測、およびそれらの組み合わせ）を含む専有データベースおよび公開データベースを含むクラウドベースであってもよい。
【0154】
任意の第２ステップで、分類器が「検証」データベースにおいて適用され、感度および特異度を含む様々な精度の尺度が観察される。例示的実施形態では、訓練データベースの一部のみが学習ステップのために使用され、訓練データベースの残りの部分が検証データベースとして使用される。第３ステップで、対象からのｍｉＲＮＡ発現データ尺度が分類系に送られ、分類系は、対象についての計算された分類（例えばＳＬＥおよび／またはＳＬＥ重症度に関連するものとしてのｍｉＲＮＡの特徴付け）を出力する。加えて、異なる体液データにおけるｍｉＲＮＡの存在または不存在も使用されてもよい。
【0155】
データに使用されうる多数の考えられる分類器がある。ＡｄａＢｏｏｓｔ、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ：Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ）学習アルゴリズム、ベイジアン信念ネットワーク、ベイジアン分類器、ベイジアンニューラルネットワーク、ブースト木、事例ベース推論、分類木、畳み込みニューラルネットワーク、決定木、深層学習、エラスティックネット、全層畳み込みネットワーク（ＦＣＮ：Ｆｕｌｌｙ Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、遺伝的アルゴリズム、勾配ブースティング木、ｋ近傍法分類器、ＬＡＳＳＯ、線形分類器、単純ベイズ分類器、ニューラルネット、ペナルティ付きロジスティック回帰、ロジスティック回帰モデル、ランダムフォレスト、リッジ回帰、サポートベクトルマシン、またはそれらのアンサンブルを含むがこれらに限定されない機械および深層学習分類器が、データを分類するために使用されうる。例えばハン（Ｈａｎ）＆カンバー（Ｋａｍｂｅｒ）（２００６年）第６章、データマイニング、構想と技術（Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２版、エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダムを参照されたい。本明細書に記載されるように、任意の分類器または分類器の組み合わせ（例えばアンサンブル）が分類系において使用されてもよい。本明細書で論じられるように、データは、分類器を訓練するためにデータが使用されてもよい。当技術分野で知られる他の分類器および機械学習系も使用されてもよい。例えば、Ｐｙｔｈｏｎコンピュータ言語の機械学習系であるｓｃｉｋｉｔ‐ｌｅａｍが使用されてもよい。
【0156】
Ｓｃｉｋｉｔ‐ｌｅａｒｎ（ｓｋｌｅａｒｎとしても知られる）は、Ｐｙｔｈｏｎプログラミング言語のための機械学習ライブラリである。
【0157】
Ｓｃｉｋｉｔ‐ｌｅａｒｎは、サポートベクトルマシン、ランダムフォレスト、勾配ブースティング、ｋ平均法およびノイズあり適用の密度準拠空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ：Ｄｅｎｓｉｔｙ‐ｂａｓｅｄ ｓｐａｔｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｎｏｉｓｅ）を含む分類、回帰、およびクラスタリングアルゴリズムを使用し、Ｐｙｔｈｏｎの数値および科学ライブラリＮｕｍＰｙおよびＳｃｉＰｙと相互運用するように設計される。
【0158】
好ましい分類器は、以下の式を用いるロジスティック回帰モデルである。
【0159】
（真陽性＋真陰性）／真陽性＋真陰性＋偽陽性＋偽陰性）。
【0160】
本明細書に記載される分類器は、以下のようにロジスティック回帰モデルによる分類器を用いて構築されてもよい。
Ｙは予測目的変数、ｘは各ｍｉＲＮＡ種の蛍光強度、ｂは各ｍｉＲＮＡ種の重み係数、ａは切片であった。このモデルにおいて、ｂおよびａは、教師あり機械学習によってナノワイヤで抽出された尿中ｍｉＲＮＡ種の各蛍光強度から推定された。Ｙの値は、０．５未満が非がん対象として、０．５以上のＹの値ががん対象として定義された。分類器は、ロジスティック回帰分類器をフィッティングする際に最小二乗誤差項およびＬ１正則化項の最適化問題を同時に解き、ｌが２項間のアジャスターとして作用した。ｌ＝１を用いたとき、より高いＡＵＣ、感度、および特異度の値が示された。
訓練データ
訓練データ
【0161】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、ライブラリまたはデータベース内のデータの合計１００％のデータのうち約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の訓練と、残りのパーセンテージのテストとを含む。一態様では、データの約７０％～約９０％が訓練され、残りの約１０％～約３０％のデータがテストされ、データの約８０％～約９５％が訓練され、残りの約５％～約２０％のデータがテストされ、またはデータの約９０％～が訓練され、残りの約１０％のデータがテストされる。一態様では、データベースまたはライブラリは、約２０超、約５０、約１００超、約１５０超、約２００超、または約３００超のｍｉＲＮＡの分析からのデータを含む。さらなる態様では、ライブラリまたはデータベースは、例えばｍｉＲＮＡ発現法からの検証済み実験データのみを含む。さらに別の態様では、ライブラリまたはデータベースは、患者サンプルを分析することによりｍｉＲＮＡの存在または出現率を決定することなく理論的に調製されたｍｉＲＮＡ発現データを含まない。訓練データは、ｍｉＲＮＡ発現レベル、体液中のｍｉＲＮＡの存在もしくは不存在、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
分類系（単数または複数）を使用したデータの分類方法
分類系（単数または複数）を使用したデータの分類方法
【0162】
本発明は、個体から得られたデータ（テストデータ、例えばｍｉＲＮＡ発現レベル、体液中のｍｉＲＮＡの存在もしくは不存在、またはそれらの組み合わせ）を分類する方法を提供する。これらの方法は、訓練データを準備するかまたは得るステップ、ならびに本明細書に記載される少なくとも１つの分類器を含む分類系の１つを使用して個体から得られたテストデータを（訓練データと比較して）評価するステップを含む。好ましい分類系は、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ：ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅｓ）、ＡｄａＢｏｏｓｔ、ペナルティ付きロジスティック回帰、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器、分類木、ｋ近傍法分類器、深層学習分類器、ニューラルネット、ランダムフォレスト、全層畳み込みネットワーク（ＦＣＮ）、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、および／またはそれらのアンサンブルなどであるがこれらに限定されない分類器を使用する。Ｓｃｉｋｉｔ‐ｌｅａｒｎは、サポートベクトルマシン、ランダムフォレスト、勾配ブースティング、ｋ平均法およびノイズあり適用の密度準拠空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）を含む分類、回帰、およびクラスタアルゴリズムのアンサンブルを含む好ましい機械学習ライブラリである。分類系は、テストデータ、例えばｍｉＲＮＡ発現レベル、体液中の存在、またはそれらの組み合わせに基づいて、ｍｉＲＮＡの分類を出力する。
【0163】
本発明に特に好ましいのは、複数の分級器を組み合わせる、分類系に対して用いられるアンサンブル法である。例えば、アンサンブル法は、ｍｉＲＮＡ発現のＳＬＥおよび／またはＳＬＥ重症度との相関に関する予測を行うために、ＳＶＭ、ＡｄａＢｏｏｓｔ、ペナルティ付きロジスティック回帰、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器、分類木、ｋ近傍法分分類器、ニューラルネット、全層畳み込みネットワーク（ＦＣＮ）、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、ランダムフォレスト、深層学習、またはそれらの任意のアンサンブルを含んでいてもよい。アンサンブル法は、各分類器、および各ｍｉＲＮＡ発現データのレプリケート測定によって提供される利点を活用するために開発された。
【0164】
テストデータを分類する方法であって、テストデータはｍｉＲＮＡの発現データを含み、
（ａ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルまたはｋタプルは個々のｍｉＲＮＡを表し、各レプリケートでのそれぞれのｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、訓練データベクトルは、それぞれのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ特徴付けに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）本明細書に記載される分類器または分類器のアンサンブルの電子表現を電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して訓練するステップと、
（ｃ）複数のｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）本明細書に記載される分類器および／または分類器のアンサンブルの電子表現を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいてｍｉＲＮＡの分類を出力するステップとを含む、方法。
テストデータは、体液中のｍｉＲＮＡの存在または不存在に関するデータをさらに含んでいてもよい。
（ａ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルまたはｋタプルは個々のｍｉＲＮＡを表し、各レプリケートでのそれぞれのｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、訓練データベクトルは、それぞれのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ特徴付けに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）本明細書に記載される分類器または分類器のアンサンブルの電子表現を電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して訓練するステップと、
（ｃ）複数のｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）本明細書に記載される分類器および／または分類器のアンサンブルの電子表現を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいてｍｉＲＮＡの分類を出力するステップとを含む、方法。
テストデータは、体液中のｍｉＲＮＡの存在または不存在に関するデータをさらに含んでいてもよい。
【0165】
別の実施形態では、本発明は、テストデータを分類する方法であって、テストデータはｍｉＲＮＡ発現データを含み、
（ａ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルまたはｋタプルは個々のヒトを表し、各レプリケートでのそれぞれのヒトについてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、訓練データは、それぞれのｍｉＲＮＡのＳＬＥとの相関に関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して、分類器および／または分類器のアンサンブルを構築するステップと、
（ｃ）ヒトテスト対象について複数のｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）分類器（単数または複数）を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいてヒトテスト対象の分類を出力するステップとを含む、方法を提供する。
あるいは、全てのレプリケート（または任意の組み合わせ）が平均化されて、各対象の各ｍｉＲＮＡ発現データの単一の値が生成されてもよい。本発明による出力するステップは、ヒトテスト対象の分類に関する情報を電子ディスプレイに人間が読める形式で表示するステップを含む。ｍｉＲＮＡデータは、ｍｉＲＮＡ発現データ、体液中のｍｉＲＮＡの存在もしくは不存在、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
（ａ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルまたはｋタプルは個々のヒトを表し、各レプリケートでのそれぞれのヒトについてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、訓練データは、それぞれのｍｉＲＮＡのＳＬＥとの相関に関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して、分類器および／または分類器のアンサンブルを構築するステップと、
（ｃ）ヒトテスト対象について複数のｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）分類器（単数または複数）を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいてヒトテスト対象の分類を出力するステップとを含む、方法を提供する。
あるいは、全てのレプリケート（または任意の組み合わせ）が平均化されて、各対象の各ｍｉＲＮＡ発現データの単一の値が生成されてもよい。本発明による出力するステップは、ヒトテスト対象の分類に関する情報を電子ディスプレイに人間が読める形式で表示するステップを含む。ｍｉＲＮＡデータは、ｍｉＲＮＡ発現データ、体液中のｍｉＲＮＡの存在もしくは不存在、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【0166】
訓練ベクトルのセットは、少なくとも２０、２５、３０、３５、５０、７５、１００、１２５、１５０、またはそれ以上のベクトルを含んでいてもよい。
【0167】
テストデータは、体液中のｍｉＲＮＡの存在もしくは不存在、ｍｉＲＮＡ発現データ、またはそれらの組み合わせなどの任意の情報尺度であってもよい。
【0168】
機械学習系を訓練するために使用されるデータは、少なくとも５、１０、１５、２０、または２５の異なる症状を含むＳＬＥ患者からのデータ、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、もしくは４５の正常組織を含む正常組織からのデータ、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。加えて、機械学習系を訓練するために使用されるデータ、例えばＳｃｉｋｉｔ‐ｌｅａｒｎ。
【0169】
データを分類する方法は、本明細書に記載される方法のいずれにおいて使用されてもよいことが理解されよう。特に、本明細書に記載されるデータを分類する方法は、診断および治療方法で用いるためのＳＬＥおよび／またはＳＬＥの重症度に関連するｍｉＲＮＡを同定するための方法において使用されてもよい。
【0170】
本発明に特に好ましいのは、複数の分級器を組み合わせる、分類系に対して用いられるアンサンブル法である。例えば、アンサンブル法は、ｍｉＲＮＡのＳＬＥおよび／またはＳＬＥの重症度との関連に関する予測を行うために、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、ＡｄａＢｏｏｓｔ、ペナルティ付きロジスティック回帰、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器、分類木、ｋ近傍法分類器、ニューラルネット、深層学習系、ランダムフォレスト、またはそれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。加えて、アンサンブルは、ｍｉＲＮＡとＳＬＥのタイプとの関連に関する予測を行うために使用されてもよい。アンサンブルアプローチは、各分類器、および各ｍｉＲＮＡのレプリケート測定によって提供される利点を活用する。
【0171】
一態様では、本開示は、テストデータを分類する方法であって、テストデータはｍｉＲＮＡ発現データを含み、
（ａ）少なくとも１つのプロセッサで、ｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、分類系の電子表現である分類器を使用してテストデータを評価するステップであって、各前記分類器は電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して訓練され、各訓練データベクトルは個々のｍｉＲＮＡを表し、ｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、各訓練データベクトルは、ｍｉＲＮＡがＳＬＥを示すか否かに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｃ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、評価するステップに基づいてｍｉＲＮＡがＳＬＥを示すか否かの尤度に関してｍｉＲＮＡ発現データからのサンプルの分類を出力するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
（ａ）少なくとも１つのプロセッサで、ｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、分類系の電子表現である分類器を使用してテストデータを評価するステップであって、各前記分類器は電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して訓練され、各訓練データベクトルは個々のｍｉＲＮＡを表し、ｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、各訓練データベクトルは、ｍｉＲＮＡがＳＬＥを示すか否かに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｃ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、評価するステップに基づいてｍｉＲＮＡがＳＬＥを示すか否かの尤度に関してｍｉＲＮＡ発現データからのサンプルの分類を出力するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
【0172】
別の態様では、本開示は、テストデータを分類する方法であって、テストデータはｍｉＲＮＡ発現データを含み、
（ａ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルは個々の患者を表し、それぞれの患者についてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、各訓練データベクトルはｍｉＲＮＡ発現がＳＬＥと関連するか否かに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して、分類系の電子表現を訓練するステップと、
（ｃ）少なくとも１つのプロセッサで、ｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、分類系の電子表現を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいて、ｍｉＲＮＡ発現がＳＬＥと関連するか否かに関してテストデータの分類を出力するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
（ａ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルは個々の患者を表し、それぞれの患者についてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、各訓練データベクトルはｍｉＲＮＡ発現がＳＬＥと関連するか否かに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して、分類系の電子表現を訓練するステップと、
（ｃ）少なくとも１つのプロセッサで、ｍｉＲＮＡ発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、分類系の電子表現を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいて、ｍｉＲＮＡ発現がＳＬＥと関連するか否かに関してテストデータの分類を出力するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
【0173】
別の態様では、本開示は、テストデータを分類する方法であって、テストデータはｍｉＲＮＡ発現データを含み、
（ａ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルはＳＬＥの重症度を表し、ＳＬＥのそれぞれの重症度についてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、各訓練データベクトルはｍｉＲＮＡがＳＬＥの重症度と関連するか否かに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して、分類系の電子表現を訓練するステップと、
（ｃ）少なくとも１つのプロセッサで、ｍｉＲＮＡの発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、分類系の電子表現を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいて、ｍｉＲＮＡがＳＬＥの重症度に関連するか否かに関してテストデータの分類を出力するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
（ａ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、電子的に記憶された訓練データベクトルのセットにアクセスするステップであって、各訓練データベクトルはＳＬＥの重症度を表し、ＳＬＥのそれぞれの重症度についてのｍｉＲＮＡ発現データを含み、各訓練データベクトルはｍｉＲＮＡがＳＬＥの重症度と関連するか否かに関する分類をさらに含む、ステップと、
（ｂ）電子的に記憶された訓練データベクトルのセットを使用して、分類系の電子表現を訓練するステップと、
（ｃ）少なくとも１つのプロセッサで、ｍｉＲＮＡの発現データを含むテストデータを受け取るステップと、
（ｄ）少なくとも１つのプロセッサを使用して、分類系の電子表現を使用してテストデータを評価するステップと、
（ｅ）評価するステップに基づいて、ｍｉＲＮＡがＳＬＥの重症度に関連するか否かに関してテストデータの分類を出力するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
【0174】
別の態様では、本開示は、テストデータを分類する方法であって、
（ａ）個体からサンプルを得るステップと、
（ｂ）サンプル中のｍｉＲＮＡの発現データを入手するステップと、
（ｃ）実験ｍｉＲＮＡ発現データをデータベース内に位置するｍｉＲＮＡ発現データと比較するステップと、
（ｄ）実験ｍｉＲＮＡ発現データとデータベース内に位置するｍｉＲＮＡ発現データとの間のマッチを作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、またはそれらの組み合わせに基づいてマッチしたｍｉＲＮＡのデータセットを産出するステップと、
（ｇ）分類系を使用してｍｉＲＮＡのデータセットを評価して、ＳＬＥを示すｍｉＲＮＡ発現プロファイルを作成するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
（ａ）個体からサンプルを得るステップと、
（ｂ）サンプル中のｍｉＲＮＡの発現データを入手するステップと、
（ｃ）実験ｍｉＲＮＡ発現データをデータベース内に位置するｍｉＲＮＡ発現データと比較するステップと、
（ｄ）実験ｍｉＲＮＡ発現データとデータベース内に位置するｍｉＲＮＡ発現データとの間のマッチを作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、またはそれらの組み合わせに基づいてマッチしたｍｉＲＮＡのデータセットを産出するステップと、
（ｇ）分類系を使用してｍｉＲＮＡのデータセットを評価して、ＳＬＥを示すｍｉＲＮＡ発現プロファイルを作成するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
【0175】
別の態様では、本開示は、テストデータを分類する方法であって、
（ａ）患者からの少なくとも１つのサンプルと健常個体から対応するサンプルとを得るステップと、
（ｂ）サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを同定するステップと、
（ｃ）サンプルから実験ｍｉＲＮＡ発現データを作成するステップと、
（ｅ）実験ｍｉＲＮＡ発現データをデータベース内のｍｉＲＮＡ発現データ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔｅ）と比較するステップと、
（ｆ）実験ｍｉＲＮＡ発現データとデータベース内に位置するｍｉＲＮＡ発現データとの間のマッチを作成するステップと、
（ｇ）ｍｉＲＮＡ発現データのスペクトルライブラリを産出するステップと、
（ｈ）分類系を使用してｍｉＲＮＡ発現のスペクトルライブラリを評価して、ｍｉＲＮＡ発現予測モデルを作成するステップと、
（ｉ）予測モデルを使用して、ＳＬＥに関連する予測ｍｉＲＮＡ発現パターンを作成するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
（ａ）患者からの少なくとも１つのサンプルと健常個体から対応するサンプルとを得るステップと、
（ｂ）サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを同定するステップと、
（ｃ）サンプルから実験ｍｉＲＮＡ発現データを作成するステップと、
（ｅ）実験ｍｉＲＮＡ発現データをデータベース内のｍｉＲＮＡ発現データ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔｅ）と比較するステップと、
（ｆ）実験ｍｉＲＮＡ発現データとデータベース内に位置するｍｉＲＮＡ発現データとの間のマッチを作成するステップと、
（ｇ）ｍｉＲＮＡ発現データのスペクトルライブラリを産出するステップと、
（ｈ）分類系を使用してｍｉＲＮＡ発現のスペクトルライブラリを評価して、ｍｉＲＮＡ発現予測モデルを作成するステップと、
（ｉ）予測モデルを使用して、ＳＬＥに関連する予測ｍｉＲＮＡ発現パターンを作成するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
【0176】
別の態様では、本開示は、ＳＬＥに関連するｍｉＲＮＡを同定するためにテストデータを分類する方法であって、
（ａ）患者からの少なくとも１つのサンプルと健常個体からの対応するサンプルとを得るステップと、
（ｂ）サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを同定して、実験ｍｉＲＮＡ発現データを産出するステップと、
（ｃ）実験ｍｉＲＮＡ発現データをデータベース内のｍｉＲＮＡ発現データと比較するステップと、
（ｄ）偽発見率（ＦＤＲ：ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）の推定と、
（ｅ）実験ｍｉＲＮＡ発現データとデータベース内のｍｉＲＮＡ発現データとのマッチの作成と、
（ｆ）比較により作成されたデータを分類系に入力して、ｍｉＲＮＡ発現予測モデルを訓練するステップと、
（ｇ）予測ｍｉＲＮＡ発現パターンを開発するステップと、
（ｈ）ｍｉＲＮＡ発現パターンを、ＳＬＥを示すものとして同定するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
（ａ）患者からの少なくとも１つのサンプルと健常個体からの対応するサンプルとを得るステップと、
（ｂ）サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを同定して、実験ｍｉＲＮＡ発現データを産出するステップと、
（ｃ）実験ｍｉＲＮＡ発現データをデータベース内のｍｉＲＮＡ発現データと比較するステップと、
（ｄ）偽発見率（ＦＤＲ：ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）の推定と、
（ｅ）実験ｍｉＲＮＡ発現データとデータベース内のｍｉＲＮＡ発現データとのマッチの作成と、
（ｆ）比較により作成されたデータを分類系に入力して、ｍｉＲＮＡ発現予測モデルを訓練するステップと、
（ｇ）予測ｍｉＲＮＡ発現パターンを開発するステップと、
（ｈ）ｍｉＲＮＡ発現パターンを、ＳＬＥを示すものとして同定するステップとを含む方法を含んでいてもよい。
【0177】
別の態様では、データベースは、公開データベース、非公開データベース、またはそれらの組み合わせであってもよい。別の態様では、ｍｉＲＮＡ発現データは、実験ｍｉＲＮＡ発現データ、予測ｍｉＲＮＡ発現データ、またはそれらの組み合わせであってもよい。別の態様では、ｍｉＲＮＡ発現データは実験ｍｉＲＮＡ発現データである。別の態様では、テストデータは、体液中のｍｉＲＮＡの存在または不存在に関するデータをさらに含んでいてもよい。別の態様では、ｍｉＲＮＡ発現は、マイクロアレイ分析、またはその組み合わせを使用して同定されてもよい。
【0178】
別の態様では、分類系は、ＡｄａＢｏｏｓｔ、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）学習アルゴリズム、ベイジアン信念ネットワーク、ベイジアン分類器、ベイジアンニューラルネットワーク、ブースト木、事例ベース推論、分類木、畳み込みニューラルネットワーク、決定木、ロジスティック回帰モデル、深層学習、エラスティックネット、全層畳み込みネットワーク（ＦＣＮ）、遺伝的アルゴリズム、勾配ブースティング木、ｋ近傍法分類器、ＬＡＳＳＯ、線形分類器、単純ベイズ、ニューラルネット、ペナルティ付きロジスティック回帰、ランダムフォレスト、リッジ回帰、サポートベクトルマシン、またはそれらのアンサンブルであってもよい。別の態様では、分類系は、分類系のアンサンブルであってもよい。
【0179】
別の態様では、ライブラリまたはデータベースは、約７０％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、または１００％のｍｉＲＮＡ発現データを含んでいてもよい。別の態様では、ｍｉＲＮＡは、実験的に決定されたｍｉＲＮＡ発現データの実際の技術的変動に対して約２％～約１５％以内の同定相関を有する予測ｍｉＲＮＡ発現データによって同定されてもよい。別の態様では、本方法は、ＳＬＥを有すると疑われる患者から得られたサンプル中のｍｉＲＮＡ発現を、健常個体から得られた体液サンプル中のｍｉＲＮＡ発現と比較するステップをさらに含んでいてもよい。
ＳＬＥの診断
ＳＬＥの診断
【0180】
対象は、当技術分野で周知の診断パラメータにしたがってＳＬＥを有するものとして同定されてもよく、当技術分野でやはり知られる診断および／または臨床パラメータにしたがって予後が良好または不良でありうる。予後は、全生存期間の予測、スコア（ＳＬＥＤＡＩ、ＳＬＡＭ、ＢＩＬＡＧなど）の改善または維持、免疫抑制剤などの薬物の減少、変形性関節症などの併存症の減少または改善、および／またはクオリティオブライフの改善を含んでいてもよい。例えば、予後が良好であるものとして同定されると考えられるＳＬＥの対象は、症状が軽度もしくは中等度である、および／または標準治療プロトコルに反応する（すなわち改善が見られる）などの対象であってもよい。予後が不良であるものとして同定されると考えられるＳＬＥの対象は、症状が重度である、および／または標準治療プロトコルにわずかしか反応しないかもしくは無反応である（すなわち改善がわずかしか見られない、もしくは見られない）対象であってもよい。本開示の方法にしたがって、予後良好および不良と対象のｍｉＲＮＡマーカーとの間の相関付けがなされることができ、これにより臨床医は対象に最も有効な治療計画を決定することができる。したがって、ＳＬＥの予後不良または予後良好は、通常の当業者によって同定されるであろう。
【0181】
したがって、ＳＬＥを有し予後不良である対象、すなわち症状が重度である、および／または標準治療プロトコルにわずかしか反応しないかもしくは無反応である（すなわち改善がわずかしか見られない、もしくは見られない）対象の集団における１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を検出するステップと、検出された１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を、ＳＬＥを有し予後不良である対象の集団の予後不良と関連付けるステップとによって、予後不良の尤度と１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少との間の関連付けがなされてもよい。
【0182】
同様に、ＳＬＥを有し予後不良である対象、すなわち症状が重度である、および／または標準治療プロトコルにわずかしか反応しないかもしくは無反応である（すなわち改善がわずかしか見られない、もしくは見られない）対象の集団における１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を検出するステップと、１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少の検出からｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップと、ｍｉＲＮＡプロファイルをＳＬＥを有し予後不良である対象の集団の予後不良と関連付けるステップとによって、予後不良の尤度と特定のｍｉＲＮＡプロファイルとの間の関連付けがなされてもよい。
【0183】
あるいは、ＳＬＥを有し予後良好である患者、すなわち症状が軽度もしくは中等度である、および／または標準治療プロトコルに反応する（すなわち改善が見られる）対象の集団における１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を検出するステップと、検出された１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を、ＳＬＥを有し予後良好である対象の集団の予後良好と関連付けるステップとによって、予後良好の尤度と１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少との間の関連付けがなされてもよい。
【0184】
さらに、ＳＬＥを有し予後良好である対象、すなわち症状が軽度もしくは中等度である、および／または標準治療プロトコルに反応する（すなわち改善が見られる）対象の集団における１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を検出するステップと、１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少の検出からｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップと、ｍｉＲＮＡプロファイルを、ＳＬＥを有し予後良好である対象の集団の予後良好と関連付けるステップとによって、予後良好の尤度と特定のｍｉＲＮＡプロファイルとの間の関連付けがなされてもよい。
【0185】
本開示の一態様は、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少を検出した場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして患者を同定するステップ、または、
健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
【0186】
別の態様では、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少を検出した場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして患者を同定するステップ、または、健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
【0187】
別の態様では、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少を検出した場合には中等度ＳＬＥと相関するマーカーを有するものとして患者を同定するステップ、または、健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
【0188】
別の態様では、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少を検出した場合にはＳＬＥ併存症Ａと相関するマーカーを有するものとして患者を同定するステップ、または、健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥ併存症Ａと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
【0189】
別の態様では、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少を検出した場合にはＳＬＥ併存症Ｂと相関するマーカーを有するものとして患者を同定するステップ、または、健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥ併存症Ｂと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
【0190】
別の態様では、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少を検出した場合にはＳＬＥ併存症Ｃと相関するマーカーを有するものとして患者を同定するステップ、または、健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥ併存症Ｃと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
【0191】
別の態様では、患者サンプルにおいて健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少を検出した場合にはＳＬＥ併存症Ｄと相関するマーカーを有するものとして患者を同定するステップ、または、健常個体から得られた体液サンプルと比較して配列番号１～１６０および２４３～４０２より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、ならびに／もしくは配列番号１６１～２４２および４０３～４８４より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の減少が検出できない場合にはＳＬＥ併存症Ｄと相関するマーカーを有しないものとして患者を同定するステップを含む、対象から得られた体液サンプルを使用してＳＬＥを診断する方法を提供する。
【0192】
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡの５’および／または３’末端は切断されてもよい。例えば、ｍｉＲＮＡの５’および／または３’末端のいずれかから約１～約１０個のリボヌクレオチドが欠失してもよい。
医薬組成物
医薬組成物
【0193】
本開示のｍｉＲＮＡおよび／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、直接、または疾患、例えばＳＬＥを治療するための他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。本開示は、安全な有効量の本開示のｍｉＲＮＡおよび／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含有しうる医薬組成物も提供してもよい。このような担体は、塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせを含んでいてもよい（がこれらに限定されない）。医薬製剤は、投与様式に合わせられうる。本開示の医薬組成物は、従来の方法によって調製されたグルコースおよび他の補助剤を含む生理塩溶液または水溶液などの注入可能な形態として生産されうる。注入可能組成物および溶液などの医薬組成物は、滅菌条件下で製造されてもよい。医薬組成物の治療有効量は、例えば体重１ｋｇあたり約０．１μｇ～約１０ｍｇの、投与される医薬組成物の有効成分の有効量であってもよい。
【0194】
医薬組成物中の本開示のｍｉＲＮＡおよび／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、少なくとも体重１ｋｇあたり約０．１μｇ、大抵の場合には体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ以下、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．１μｇ～約１００μｇの安全な有効量で対象、例えばＳＬＥ患者に投与されてもよい。特定の投与量は、投与経路および患者の状態に基づいて決定されてもよいが、これらは全て技術のある医師の熟練の範囲内である。
治療
治療
【0195】
ＳＬＥのための治療計画の例は、当技術分野で知られており、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、ヒドロキシクロロキン、コルチコステロイド、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、およびタクロリムスなどの免疫抑制薬、ならびにベリムマブ、リツキシマブ、ＴＮＦアルファ阻害剤、およびインターフェロン阻害剤などの生物剤の投与を含んでいてもよいがこれらに限定されない。
【0196】
本明細書に提供される方法にしたがって、特定の治療プロトコルに良好に反応する患者を、特有のｍｉＲＮＡプロファイル（例えばＳＬＥに関連する１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少）について分析することができ、相関を確立することができる。あるいは、特定の治療計画に対する反応が不良である患者を、特有のｍｉＲＮＡプロファイル（例えばＳＬＥに関連する１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少）を分析することもでき、その反応不良と相関づけてもよい。それから、ＳＬＥの治療の候補である対象者を、適切なｍｉＲＮＡプロファイルの存在について評価することができ、最も適切な治療計画を提供することができる。
【0197】
したがって、ＳＬＥを有する、ＳＬＥのための有効な治療計画が特定されている対象の集団における１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を検出するステップと、検出された１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少をＳＬＥのための有効な治療計画と関連付けるステップとによって、有効な治療計画と１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少との間の関連付けがなされる。
【0198】
同様に、ＳＬＥを有する、ＳＬＥのための有効な治療計画が特定されている対象の集団における１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少を検出するステップと、１つ以上のｍｉＲＮＡの量の増加または減少の検出からｍｉＲＮＡプロファイルを作成するステップと、作成されたｍｉＲＮＡプロファイルをＳＬＥのための有効な治療計画と関連付けるステップとによって、有効な治療計画と特定のｍｉＲＮＡプロファイルとの間の関連付けがなされてもよい。
【0199】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡプロファイルを治療計画と相関付ける方法は、コンピュータデータベースを使用して実施されうる。したがって本開示は、ＳＬＥのための提案される治療を特定するコンピュータ支援方法を提供してもよい。この方法は、
（ａ）複数の患者についての生物学的データのデータベースを記憶するステップであって、記憶される生物学的データは、前記複数の患者の各々についての（ｉ）治療タイプ、（ｉｉ）量の増加または減少がＳＬＥに関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、（ｉｉｉ）治効を判断できるＳＬＥの少なくとも１つの疾患進行尺度を含む、ステップと、それから
（ｂ）データベースをクエリして、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの量の前記増加または減少に対するＳＬＥを治療する際の治療タイプの有効性の依存性を判断し、それによってＳＬＥと相関するｍｉＲＮＡプロファイルを有する対象のための有効な治療として提案される治療を特定するステップとを含んでいてもよい。
（ａ）複数の患者についての生物学的データのデータベースを記憶するステップであって、記憶される生物学的データは、前記複数の患者の各々についての（ｉ）治療タイプ、（ｉｉ）量の増加または減少がＳＬＥに関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、（ｉｉｉ）治効を判断できるＳＬＥの少なくとも１つの疾患進行尺度を含む、ステップと、それから
（ｂ）データベースをクエリして、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの量の前記増加または減少に対するＳＬＥを治療する際の治療タイプの有効性の依存性を判断し、それによってＳＬＥと相関するｍｉＲＮＡプロファイルを有する対象のための有効な治療として提案される治療を特定するステップとを含んでいてもよい。
【0200】
一実施形態では、患者の治療情報が（ウィンドウまたはテキストインタフェースなどの任意の適切な手段を通じて）データベースに入力されてもよく、その患者のｍｉＲＮＡ情報（例えばｍｉＲＮＡプロファイル）がデータベースに入力され、疾患進行情報がデータベースに入力される。そして、これらのステップは、所望の数の患者がデータベースに入力されるまで繰り返されうる。それからデータベースがクエリされて、特定の治療が特定のｍｉＲＮＡプロファイルを有する患者に有効であるか、特定のｍｉＲＮＡプロファイルを有する患者に有効でないかなどが判断されうる。このようなクエリは、任意の適切な手段によってデータベース上で予めまたは遡及的に実施することができるが、通常は本明細書に記載されるように既知の技法にしたがって統計分析によって行われる。
【0201】
小さなリボ核酸、例えばｍｉＲＮＡ、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、非毒性の不活性な薬学的に許容される水性担体媒体中に処方されることができ、そのｐＨは約５～８、好ましくは約６～８のｐＨでありうるが、ｐＨは小さなリボ核酸、例えばｍｉＲＮＡ、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストの特性に応じて変動してもよく、また治療される疾患状態の変化によっても変動ししてもよい。医薬組成物は、筋肉内、静脈内、または皮下投与を含む（がこれらに限定されない）従来の経路を通じて投与されてもよい。
【0202】
対象、例えばＳＬＥ患者への本開示のｍｉＲＮＡおよび／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストの投与の結果、ｍｉＲＮＡの量の増加および／または発現の増加がもたらされてもよく、それにより、ＳＬＥの病因において重要な役割を果たしうるそのようなｍｉＲＮＡの量の減少および／または発現の減少に関連する疾患、例えばインターフェロン経路の異常活性化に関係する疾患が予防または治療される。
【0203】
一態様では、本開示は、配列番号１～１６０および２４３～４０２からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる１つ以上のｍｉＲＮＡのアンタゴニスト、例えば１つ以上の配列番号１～１６０および２４３～４０２のアンチセンス分子を含む組成物をＳＬＥ患者に投与するステップ、または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる１つ以上のｍｉＲＮＡのアゴニスト、例えば１つ以上の配列番号１６１～２４２および４０３～４８４の分子を含む組成物をＳＬＥ患者に投与するステップを含む、ＳＬＥを治療する方法を提供する。
【0204】
別の態様では、本開示は、配列番号１～１６０および２４３～４０２からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる１つ以上のｍｉＲＮＡのアンチセンス分子を含む組成物ならびに／または配列番号１６１～２４２および４０３～４８４からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる１つ以上のｍｉＲＮＡを含む組成物をＳＬＥ患者に投与するステップを含む、中等度ＳＬＥを治療する方法を提供する。
キット
キット
【0205】
本開示は、ＳＬＥの対象のスクリーニング、診断および同定において使用するためのキットを提供しうることがさらに企図される。キットは、本開示の医薬組成物、例えばｍｉＲＮＡ（配列番号１～４８４）を含んでいてもよい。当技術分野で周知のように、本開示のキットは、キットの試薬（例えば核酸など）を保持するための１つ以上の容器および／またはレセプタクルを、適切なバッファーおよび／または希釈剤および／または他の溶液ならびにキットを使用するための指示とともに含みうることは、通常の当業者に十分に理解されよう。このようなキットは、当技術分野で周知のアジュバントおよび／または他の免疫刺激剤または免疫調節剤をさらに含みうる。
実施例
実施例１：ナノワイヤが組み込まれたマイクロ流体デバイスを使用した尿中ＥＶに含まれるｍｉＲＮＡのＩｎ Ｓｉｔｕ抽出
実施例
実施例１：ナノワイヤが組み込まれたマイクロ流体デバイスを使用した尿中ＥＶに含まれるｍｉＲＮＡのＩｎ Ｓｉｔｕ抽出
【0206】
本明細書に記載されるｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析を用いて、年齢および性別がマッチした健常正常対照と比較してＳＬＥ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）において特定のｍｉＲＮＡが差次的に発現されることが実証された。ＳＬＥと健常サンプルとの間で３倍の差次的ｍｉＲＮＡ発現レベルの厳格な基準を使用して、変化したｍｉＲＮＡ発現の固有のパターンを特定した。このようなパターンは、ＳＬＥの診断、予後、および／または治療反応の予測のための分子バイオマーカーとして役立ちうる複雑なフィンガープリントを提供する。
【0207】
表１
【0208】
表１に示すＳＬＥ患者および健常個体から得られた尿サンプルを、使用前に遠心分離（１５ｍｍ、４℃、３０００ｇ）してアポトティック小体を除去した。その後、シリンジポンプ（ＫＤＳ‐２００、ＫＤサイエンティフィック社（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．））を流速５０μｌ／分で使用して、１ｍｌの尿サンプルをナノワイヤが組み込まれたデバイスに導入した。シリンジポンプを流速５０μｌ／分で使用して細胞溶解バッファーＭ［２０ｍＭ トリス‐ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５ｗ／ｖ％ＮＰ‐４０；（和光純薬工業株式会社（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．））をナノワイヤが組み込まれたデバイスに導入することによって、ナノワイヤ上に収集されたＥＶからのｍｉＲＮＡの抽出を行った（図１）。
ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析
ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析
【0209】
Ｔｏｒａｙ ３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（東レ（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））のヒトｍｉＲＮＡチップを使用してｍｉＲＮＡ発現プロファイルを得た。ＳｅｒａＭｉｒ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｋｉｔ（システムバイオサイエンス社（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．））を製造者の指示にしたがって使用して、溶解バッファーで抽出されたｍｉＲＮＡを精製した。３Ｄ‐Ｇｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ｖｅｒ．２１（東レ（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））を使用して、１５μｌの精製されたｍｉＲＮＡを２，６３２個のｍｉＲＮＡプロファイリングのために分析した。
ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析では、各シグナル強度が１種のｍｉＲＮＡに対応する。各ｍｉＲＮＡの発現レベルは、バックグラウンドを差し引いた各マイクロアレイ中の全ｍｉＲＮＡのシグナル強度として表される。全体で標準化された強度について散布図を作成し、強度１０以上につき示す。したがって、散布図上の各点は標準化された強度である。シグナル強度をｌｏｇ２変換した。ＳＬＥ患者と健常ドナーの尿サンプルとの間でのｍｉＲＮＡの比較のために、サンプル全体で正規化された強度をｌｏｇ２変換した。（図１）
ＳＬＥのバイオマーカーとしての尿中ｍｉＲＮＡの同定
ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析では、各シグナル強度が１種のｍｉＲＮＡに対応する。各ｍｉＲＮＡの発現レベルは、バックグラウンドを差し引いた各マイクロアレイ中の全ｍｉＲＮＡのシグナル強度として表される。全体で標準化された強度について散布図を作成し、強度１０以上につき示す。したがって、散布図上の各点は標準化された強度である。シグナル強度をｌｏｇ２変換した。ＳＬＥ患者と健常ドナーの尿サンプルとの間でのｍｉＲＮＡの比較のために、サンプル全体で正規化された強度をｌｏｇ２変換した。（図１）
ＳＬＥのバイオマーカーとしての尿中ｍｉＲＮＡの同定
【0210】
Ｚスコア１．９６（９５％信頼水準および５％有意水準）および東レにより提供されたｌｏｇ２（強度）に対するばらつき（ＣＶ）（特定の値をもたない）との関係にしたがって、（平均）士１．９６×（平均×ＣＶ／１００）を用いて９５％信頼区間を計算した。ｌｏｇ２（強度）＝３との関係でＣＶにＸ％を使用すると、信頼区間の上限は８＋０．１６Ｘであった。ｌｏｇ２（強度）＝５または６でのＣＶ値は、その関係にしたがって０．７Ｘ％および０．５Ｘ％であった。５％有意水準を考慮すると、各ケースのＣＶは４０および７１％未満であった。
【0211】
図２は、ＳＬＥ患者において健常個体と比較して１６０個のｍｉＲＮＡ（表２）が有意にアップレギュレーションされ、８２個のｍｉＲＮＡ（表３）が有意にダウンレギュレーションされた２４２個のｍｉＲＮＡが差次的に発現されたことを示すボルケーノプロットである。（ｔ検定でｐ＜０．０５）。コホート間の８２個のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡは、１６０個のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡよりもｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅが大きいようである。これらの２４２個のｍｉＲＮＡは、ＳＬＥのバイオマーカー候補を表す。
【0212】
表２．ＳＬＥに関連する１６０個のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡ
【0213】
表３．ＳＬＥに関連する８２個のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡ
【0214】
図３Ａは、健常ドナー（明色箱）のものと比較したＳＬＥ患者（暗色箱）における（表２に示した１６０個のｍｉＲＮＡの中から）上位１０個のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。これらの結果は、これら１０個のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションがＳＬＥと相関しうること、したがってＳＬＥのバイオマーカーとして役立ちうることを示唆する。
【0215】
図３Ｂは、健常ドナー（明色箱）のものと比較したＳＬＥ患者（暗色箱）における（表３に示した８２個のｍｉＲＮＡの中から）上位１０個のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。これらの結果は、これら１０個のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションがＳＬＥと相関しうること、したがってこれらもＳＬＥのバイオマーカーとして役立ちうることを示唆する。ＳＬＥ重症度のバイオマーカーとしての尿中ｍｉＲＮＡの同定
【0216】
図４は、各ｍｉＲＮＡの発現レベルとＳＬＥ重症度、例えば中等度ＳＬＥ対軽度ＳＬＥとの相関を示す。結果は、上位のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡ（円で示す）が中等度ＳＬＥ（Ｑ４）と相関すると思われることを示す。これに対し、上位のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡ（円で示す）は、中等度ＳＬＥ（Ｑ１）および軽度ＳＬＥ（Ｑ２）の両方に関連するように見えるため、ＳＬＥ重症度と無関係であると思われる。
【0217】
図５Ａは、中等度ＳＬＥ患者（暗色箱）、軽度ＳＬＥ患者（薄暗色箱）、および健常ドナー（明色箱）に関連する上位１０個のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。上位１０個のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルは、中等度ＳＬＥ患者において軽度ＳＬＥ患者のものよりも有意に高いようである。したがって、これらのｍｉＲＮＡのアップレギュレーションは、特に中等度ＳＬＥでのＳＬＥ重症度のバイオマーカーとして役立つ場合がある。
【0218】
図５Ｂは、中等度ＳＬＥ患者（暗色箱）、軽度ＳＬＥ患者（薄暗色箱）、および健常ドナー（明色箱）における上位１０個のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。上位１０個のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡの発現レベルは、中等度ＳＬＥ患者において軽度ＳＬＥ患者のものよりも有意に低いようである。したがって、これらのｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションは、特に中等度ＳＬＥでのＳＬＥ重症度のバイオマーカーとして役立つ場合がある。
ＳＬＥ併存症のバイオマーカーとしての尿中ｍｉＲＮＡの同定
ＳＬＥ併存症のバイオマーカーとしての尿中ｍｉＲＮＡの同定
【0219】
図６は、４個のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションおよび３個のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションが、併存症ＡがないＳＬＥ患者（桃色箱）と比較して併存症ＡがあるＳＬＥ患者（赤色箱）と相関することを示す。（ｎ＝６）
【0220】
図７は、１０個のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションおよび１０個のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションが、併存症ＢがないＳＬＥ患者（桃色箱）と比較して併存症ＢがあるＳＬＥ患者（赤色箱）と相関することを示す。（ｎ＝４）
【0221】
図８は、１０個のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションおよび１０個のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションが、併存症ＣがないＳＬＥ患者（桃色箱）と比較して併存症ＣがあるＳＬＥ患者（赤色箱）と相関することを示す。（ｎ＝８）
【0222】
図９は、６個のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションおよび１０個のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションが、併存症ＤがないＳＬＥ患者（桃色箱）と比較して併存症ＤがあるＳＬＥ患者（赤色箱）と相関することを示す。（ｎ＝４）
【0223】
本開示の利点には、ＳＬＥ、ＳＬＥ重症度、およびＳＬＥ併存症の診断のために分析されるｍｉＲＮＡの単離のための非侵襲サンプル、例えば体液の収集が含まれてもよい。ＳＬＥを有することが疑われる個体において、その個体のｍｉＲＮＡ発現プロファイルに基づいてＳＬＥの存在または不存在が判断されてもよい。ＳＬＥ陽性の個体では、その個体のｍｉＲＮＡ発現プロファイルによりＳＬＥ重症度およびＳＬＥ関連併存症を確認してもよい。本発明者らが驚いたことに、ＳＬＥの診断のための体液の使用およびｍｉＲＮＡの検出は、当技術分野で既知の方法と比較して異例であることが分かった。それから、これらの分析に基づいて治療プランをパーソナライズ化してもよい。
実施例２：分類器の開発
実施例２：分類器の開発
【0224】
本発明者らは、個々のｍｉＲＮＡの値、例えば発現レベルを比較することによって、サンプルを、ＳＬＥを示すものまたはＳＬＥがないものとして分類するための分類器を開発した。本発明者らは、４８４個のｍｉＲＮＡ配列、配列番号１～４８４を同定した。発明者らは、６０個のサンプルのｍｉＲＮＡ発現レベルの中央値を「カットオフ」として使用し、値がカットオフよりも高い／低い場合に、患者を、ＳＬＥを有するものまたは有しないものとして分類した。精度、感度、特異度、ＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ、曲線下面積）を一般的指標から採用して、単純なカットオフに基づく分類器を評価する。
【0225】
２４２個のｍｉＲＮＡが有意に差次的に発現された（アップレギュレーション１６０個、ダウンレギュレーション８２個）［ｐ＜０．０５ Ｔ検定］。ダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡは、コホート間でｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅがより大きい傾向が見られた。図２を参照されたい。２４２個のうち１６０個のｍｉＲＮＡで、有意に差次的に発現されたｍｉＲＮＡが見られた。２つの群からの各ｍｉＲＮＡシグナルを比較することによって差次的発現分析を行った。ｍｉＲＮＡごとにコホート間のＦｏｌｄ ｃｈａｎｇｅをｔ検定のｐ値に対してプロットし、統計的に有意なｍｉＲＮＡ（ｐ値＜０．０５）をバイオマーカー候補として選択した。
【0226】
各ｍｉＲＮＡの発現レベルをＳＬＥ疾患重症度と比較した。図４で、各ｍｉＲＮＡの発現レベルをＳＬＥ重症度と比較した。各ｍｉＲＮＡのｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅの散布図（ｘ軸：ＳＬＥ対非ＳＬＥ、ｙ軸 中等度ＳＬＥ対軽度）。無疾患、軽度ＳＬＥ、および中等度ＳＬＥにより比較して、図５Ａは上位１０個のアップレギュレーションされたｍｉＲＮＡを示し、図５Ｂは上位１０個のダウンレギュレーションされたｍｉＲＮＡを示す。
【0227】
併存症があるＳＬＥ患者と併存症がないＳＬＥ患者との間で発現レベルを比較した。ｔ検定でｐ＜０．０５のｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして選択した。
ＳＬＥ発現
ＳＬＥ発現
【0228】
ロジスティック回帰モデルの分類に基づいて以下の式（真陽性＋真陰性）／（真陽性＋真陰性＋偽陽性＋偽陰性）により精度を計算した。サンプルがＳＬＥからのものであるか否かを推定するロジスティック回帰モデル。ｍｉＲＮＡごとに独立してモデルを開発し、各サンプルのｍｉＲＮＡの発現レベルを特徴量として使用した。ｐｙｔｈｏｎ ｓｋｌｅａｒｎ（ｌ１正則化、ｃ＝１、１つ抜き交差検証）に基づいてモデルを開発した。分類器を開発するために、本発明者らは２４２個のｍｉＲＮＡのセットから５～２０個のランダムなｍｉＲＮＡを選択し、分類器を複数回開発し、スコアを評価した。ｍｉＲＮＡは、発現中の２４２個のｍｉＲＮＡからランダムに選択する。選択されたｍｉＲＮＡの発現レベルを使用して、ロジスティック回帰モデルを開発した。ｍｉＲＮＡの選択ごとに、分類を２０回繰り返した。精度、感度および特異度、ＡＵＣが、選択された５～２０個のｍｉＲＮＡを使用してロジスティック回帰モデルを開発することによって達成されるそれぞれの結果である。ｍｉＲＮＡ発現レベルの生の値に基づいて受信者動作特性（ＲＯＣ：Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線をプロットし、これが分類器の性能を表す。
【0229】
本明細書において引用された全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。任意の参考文献の引用は、出願日より前のその開示についてのものであり、先行発明により本開示がそのような参照に先行する権利がないことを認めるものと解釈されてはならない。
【0230】
上述の要素の各々、または２つ以上が一緒になったものは、上述のタイプとは異なる他のタイプの方法においても有用な用途を見出しうることが理解されよう。さらなる分析をせずとも、以上は本開示の要旨を非常に完全に明らかにするであろうことから、他者は現在の知識を応用することによって、添付の特許請求の範囲に記載される、先行技術から見て本開示の一般的態様または特定の態様の本質的特性を適正に構成する特徴を省かずに、これを様々な用途に容易に適合させることができる。前述の実施形態は、例として提示されるにすぎず、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】