特表 2024-516534 試料の核酸同定のための装置および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-16

(54)【発明の名称】試料の核酸同定のための装置および方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240409BHJP

   G01N 1/00 20060101ALI20240409BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240409BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240409BHJP

   C12Q 1/25 20060101ALI20240409BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240409BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20240409BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20240409BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

G01N1/00 101F

G01N33/53 M

C12M1/34 B

C12Q1/25

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6876 Z

C12Q1/48

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560978

(86)(22)【出願日】2022-03-31

(85)【翻訳文提出日】2023-11-02

(86)【国際出願番号】 US2022022781

(87)【国際公開番号】W WO2022212674

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】63/200,884

(32)【優先日】2021-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．テフロン

(71)【出願人】

【識別番号】523373588

【氏名又は名称】ケムリング、センサーズ、アンド、エレクトロニック、システムズ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｅｍｒｉｎｇ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100107582

【弁理士】

【氏名又は名称】関根 毅

(74)【代理人】

【識別番号】100118843

【弁理士】

【氏名又は名称】赤岡 明

(74)【代理人】

【識別番号】100124372

【弁理士】

【氏名又は名称】山ノ井 傑

(72)【発明者】

【氏名】ニール、ジー．サタリー

(72)【発明者】

【氏名】ケビン、ピー．ピューファー

【テーマコード（参考）】

2G052

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G052AB20

2G052CA07

2G052DA05

2G052EB11

2G052EB13

2G052ED14

2G052GA11

4B029AA07

4B029BB20

4B029FA15

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

試料の物質の核酸同定のための、装置、方法、および命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、可動カートリッジを含むマイクロ流体力学システムと、熱源とを含む。可動カートリッジアセンブリは、少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットと、表面に堆積したＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットとを含む。さらに、少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分を含む。ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットは、少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分、鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素、ベタイン添加剤、テトロン系添加剤、配列特異的プローブ、ｄＮＴＰ、およびプライマーミックスを含む。プライマーミックスは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な順方向内側プライマーおよび逆方向内側プライマーの両方を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料の物質の核酸同定のための装置であって、
マイクロ流体力学システム；および
熱源を備え；
前記マイクロ流体力学システムは、可動カートリッジアセンブリを備え；
前記可動カートリッジアセンブリは、
前記試料を受容するように構成された表面；
標的位置で前記表面に堆積した少なくとも１つの標的特異的試薬成分セット；
ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で前記表面に堆積した少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットを備え；
前記少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットは、
少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分；
少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分；および
少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含み；
前記少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットは、
少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分；
鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素；
ベタイン添加剤；
テトロン系添加剤；
配列特異的プローブ；
ｄＮＴＰ；および
プライマーミックスを含み；
前記プライマーミックスは、
前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な順方向内側プライマー；および
前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の前記骨格に特異的な逆方向内側プライマーを含む、
装置。

【請求項2】

前記可動カートリッジアセンブリが、
第２の標的位置で前記可動カートリッジアセンブリに堆積された少なくとも第２の標的特異的試薬成分セットをさらに備え；
前記第２の標的特異的試薬成分セットが、
第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分；
前記少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分；および
前記少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含み；
前記第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分が、前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の前記骨格を含む、
請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記リガーゼ酵素成分が、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ酵素成分であり；
前記リガーゼ緩衝成分のセットが、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである、
請求項２に記載の装置。

【請求項4】

前記リガーゼ酵素成分が、ＲＮＡリガーゼ酵素成分であり；
前記リガーゼ緩衝成分のセットが、ＲＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである、
請求項２に記載の装置。

【請求項5】

前記マイクロ流体力学システムが、デジタルマイクロ流体力学システムである、
請求項２に記載の装置。

【請求項6】

前記配列特異的プローブが、オリゴヌクレオチド鎖置換プローブであり；
前記少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分が、Ｂｓｔ３ポリメラーゼ緩衝成分であり；
鎖置換活性を有する前記少なくとも少なくとも１つのポリメラーゼ酵素が、Ｂｓｔ３ポリメラーゼ酵素である、
請求項２に記載の装置。

【請求項7】

放射線源からの励起放射に応答して前記標的位置および前記第２の標的位置から発せられる蛍光を監視するためのカメラシステムをさらに備える、
請求項６に記載の装置。

【請求項8】

前記標的位置で加熱された流体を冷却し、前記第２の標的位置で加熱された流体を冷却するためのシステムをさらに備え；
前記熱源が、少なくとも前記標的位置に配置された流体、および少なくとも前記第２の標的位置に配置された流体を、約９５℃に加熱するように構成され；
前記熱源が、少なくとも前記標的位置に配置された流体、および少なくとも前記第２の標的位置に配置された流体を、約６５℃に加熱するようにさらに構成される、
請求項２に記載の装置。

【請求項9】

前記可動カートリッジアセンブリが、消耗型カートリッジである、
請求項２に記載の装置。

【請求項10】

前記標的位置で前記表面に堆積した前記少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットが、前記標的位置で印刷され；
前記第２の標的位置で前記表面に堆積した前記第２の標的特異的試薬成分セットが、前記第２の標的位置で印刷される、
請求項２に記載の装置。

【請求項11】

前記マイクロ流体力学システムが、前記表面上に受容された前記試料のアリコートを前記標的位置に輸送するように構成され、前記表面上に受容された前記試料の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するようにさらに構成され；
前記マイクロ流体力学システムが、前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するようにさらに構成され、前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するようにさらに構成される、
請求項２に記載の装置。

【請求項12】

前記ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で前記表面に堆積した前記少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットが、乾燥形態で堆積しており；
前記マイクロ流体力学システムが、前記表面上の水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するようにさらに構成され、前記表面上の水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するようにさらに構成される、
請求項１１に記載の装置。

【請求項13】

試料の物質の核酸同定のための方法であって、
マイクロ流体力学システムを設けるステップであって；
前記マイクロ流体力学システムが、可動カートリッジアセンブリを含み；
前記可動カートリッジアセンブリが、
前記試料を受容するように構成された表面；
標的位置で前記表面に堆積した少なくとも１つの標的特異的試薬成分セット；
ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で前記表面に堆積した少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットを備え；
前記少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットが、
少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分；
少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分；および
少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含み；
前記少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットが、
少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分；
鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素；
ベタイン添加剤；
テトロン系添加剤；
配列特異的プローブ；
ｄＮＴＰ；および
プライマーミックスを含み；
前記プライマーミックスが、
前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な順方向内側プライマー；および
前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の前記骨格に特異的な逆方向内側プライマーを含む、
設けるステップ；
前記表面上に受容された前記試料のアリコートを前記標的位置に輸送するステップ；
前記標的位置に熱を加えるステップ；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップ；および
前記標的位置に熱を加えるステップ、
を備える方法。

【請求項14】

前記可動カートリッジアセンブリが、
第２の標的位置で前記可動カートリッジに堆積された少なくとも第２の標的特異的試薬成分セットをさらに備え；
前記第２の標的特異的試薬成分セットが、
第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分；
前記少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分；および
前記少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含み；
前記第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分が、前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の前記骨格を含み、
前記方法が、
前記表面上に受容された前記試料の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップ；
前記第２の標的位置に熱を加えるステップ；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップ；および
前記第２の標的位置に熱を加えるステップ、をさらに備える、
請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記リガーゼ酵素成分が、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ酵素成分であり；
前記リガーゼ緩衝成分のセットが、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである、
請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記リガーゼ酵素成分が、ＲＮＡリガーゼ酵素成分であり；
前記リガーゼ緩衝成分のセットが、ＲＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである、
請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記マイクロ流体力学システムが、デジタルマイクロ流体力学システムである、
請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記配列特異的プローブが、オリゴヌクレオチド鎖置換プローブであり；
前記少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分が、Ｂｓｔ３ポリメラーゼ緩衝成分であり；
鎖置換活性を有する前記少なくとも少なくとも１つのポリメラーゼ酵素が、Ｂｓｔ３ポリメラーゼ酵素である、
請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

励起放射を前記標的位置に供給するステップ、および
前記励起放射に応答して前記標的位置および前記第２の標的位置から発せられる蛍光を監視するためのカメラシステムを設けるステップ、
をさらに備える、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップの前に、前記標的位置で加熱された流体を冷却するステップ；および
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップの前に、前記第２の標的位置で加熱された流体を冷却するステップをさらに備え；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップの前に、前記標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記標的位置に位置する流体を約９５℃に加熱するステップを含み；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップの前に、前記第２の標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記第２の標的位置に位置する流体を約９５℃に加熱するステップを含み；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップの後に、前記標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記標的位置に位置する流体を約６５℃に加熱するステップを含み；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップの後に前記第２の標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記第２の標的位置に位置する流体を約６５℃に加熱するステップを含む、
請求項１４に記載の方法。

【請求項21】

前記可動カートリッジが、消耗型カートリッジである、
請求項１４に記載の方法。

【請求項22】

前記標的位置で前記表面に堆積した前記少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットが、前記標的位置で印刷され；
前記第２の標的位置で前記表面に堆積した前記第２の標的特異的試薬成分セットが、前記第２の標的位置で印刷される、
請求項１４に記載の方法。

【請求項23】

前記ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で前記表面に堆積した前記少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットが、乾燥形態で堆積しており、前記方法が、
前記ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分を水和するステップをさらに備え；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップが、前記表面上の水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップを備え；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップが、前記表面上の水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップを備える、
請求項１４に記載の方法。

【請求項24】

デジタルマイクロ流体力学システムによって実行されると、前記デジタルマイクロ流体力学システムに試料の物質の核酸同定のための方法を実行させる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記デジタルマイクロ流体力学システムが、熱源を含み、前記方法は、
表面に受容された前記試料のアリコートを標的位置に輸送するステップ；
前記標的位置に熱を加えるステップ；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップ；および
前記標的位置に熱を加えるステップ、を備え、
前記デジタルマイクロ流体力学システムは、可動カートリッジアセンブリを含み；
前記可動カートリッジアセンブリは、
前記試料を受容するように構成された前記表面；
前記標的位置で前記表面に堆積した少なくとも１つの標的特異的試薬成分セット；
ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で前記表面に堆積したＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分を備え；
前記少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットは、
少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分；
少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分；および
少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含み；
前記ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分は、
少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分；
鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素；
ベタイン添加剤；
テトロン系添加剤；
配列特異的プローブ；
ｄＮＴＰ；および
プライマーミックスを含み；
前記プライマーミックスは、
前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な順方向内側プライマー；および
前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の前記骨格に特異的な逆方向内側プライマーを含む、
非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項25】

前記可動カートリッジアセンブリが、
第２の標的位置で前記可動カートリッジに堆積された少なくとも第２の標的特異的試薬成分セットをさらに備え；
前記第２の標的特異的試薬成分セットが、
第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分；
前記少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分；および
前記少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含み；
前記第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分が、前記少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の前記骨格を含み、
前記方法が、
前記表面上に受容された前記試料の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップ；
前記第２の標的位置に熱を加えるステップ；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップ；および
前記第２の標的位置に熱を加えるステップ、をさらに備える、
請求項２４に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項26】

前記リガーゼ酵素成分が、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ酵素成分であり；
前記リガーゼ緩衝成分のセットが、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項27】

前記リガーゼ酵素成分が、ＲＮＡリガーゼ酵素成分であり；
前記リガーゼ緩衝成分のセットが、ＲＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項28】

前記配列特異的プローブが、オリゴヌクレオチド鎖置換プローブであり；
前記少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分が、Ｂｓｔ３ポリメラーゼ緩衝成分であり；
鎖置換活性を有する前記少なくとも少なくとも１つのポリメラーゼ酵素が、Ｂｓｔ３ポリメラーゼ酵素である、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項29】

前記デジタルマイクロ流体力学システムが、カメラシステムおよび励起放射源をさらに備え、前記カメラシステムが、前記励起放射源からの励起放射に応答して前記標的位置および前記第２の標的位置から発する蛍光を監視することができ、前記方法が、
前記励起放射を前記標的位置に供給するステップをさらに備える、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項30】

前記デジタルマイクロ流体力学システムが、冷却するための供給源をさらに備え、前記方法が、
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップの前に、前記標的位置で加熱された流体を冷却するステップ；および
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップの前に、前記第２の標的位置で加熱された流体を冷却するステップをさらに備え；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップの前に、前記標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記標的位置に位置する流体を約９５℃に加熱するステップを含み；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップの前に、前記第２の標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記第２の標的位置に位置する流体を約９５℃に加熱するステップを含み；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップの後に、前記標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記標的位置に位置する流体を約６５℃に加熱するステップを含み；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップの後に、前記第２の標的位置に熱を加えるステップが、少なくとも前記第２の標的位置に位置する流体を約６５℃に加熱するステップを含む、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項31】

前記可動カートリッジが、消耗型カートリッジである、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項32】

前記標的位置で前記表面に堆積した前記少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットが、前記標的位置で印刷され；
前記第２の標的位置で前記表面に堆積した前記第２の標的特異的試薬成分セットが、前記第２の標的位置で印刷される、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項33】

前記ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で前記表面に堆積した前記ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分が、乾燥形態で堆積しており、前記方法が、
前記ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分を水和するステップをさらに備え；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップが、前記表面上の水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを前記標的位置に輸送するステップを備え；
前記表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップが、前記表面上の水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを前記第２の標的位置に輸送するステップを備える、
請求項２５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年４月１日に出願された米国仮出願第６３／２００，８８４号の優先権および利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、試料に存在し得る遺伝物質を増幅および同定するための、装置、方法、および命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体に関する。

【背景技術】

【0003】

生物の存在を同定するために使用される主要な方法の１つは、その遺伝物質の一部または全部の質量の増幅である。最初に開発されたとき、増幅反応は、標的生物の遺伝物質を増幅する（すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応、「ＰＣＲ」）ために、特定のポリメラーゼの熱サイクリング（加熱および冷却の反復）に依存していた。熱サイクリングには、専用の実験装置と、検出される各標的に固有のプライマーセットが必要である。また、比較的遅く、高価である。

【0004】

熱サイクリング増幅の開発以来、遺伝物質の増幅の速度および感度を高め、そのコストを削減し、実行を容易にするための努力がなされてきた。パドロックプローブを用いたローリングサークル増幅（「ＲＣＡ」）は、そのような反応の１つである。３０年近く使用されており、特定の生物の遺伝物質を検出できる等温法（すなわち、熱サイクリングを必要としない）であるため有利である。また、パドロックプローブ骨格を認識する試薬のユニバーサルセットを使用するため、それほどのアッセイ開発時間を必要としない。

【0005】

ループ媒介増幅（「ＬＡＭＰ」）は、さらに最近に開発された生化学反応である。等温反応であり、比較的速い（５～２０分）ため、広く使用されている。速度の観点では有利であるが、これは、開発の観点では不利である。典型的なスタンドアロンＬＡＭＰ反応は、最低６つのプライマーセットを必要とし得る。これらのセットは、開発に時間がかかる可能性があり、多くの異なる標的を分析する必要がある場合、その時間は圧倒されるほどであり得る。

【発明の概要】

【0006】

本明細書では、ＲＣＡおよびＬＡＭＰの両方の利点を保持しながら、それらの欠点を除去する遺伝子試料の増幅および同定のための、装置、方法、および命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体が開示される。

【0007】

本開示の例示的な実施形態によれば、試料の物質の核酸同定のための装置は、マイクロ流体力学システム（microfluidics system）および熱源を含み、マイクロ流体力学システムは可動カートリッジアセンブリをさらに含む。実施形態では、可動カートリッジアセンブリは、試料の位置で試料を受容するように構成された表面と、標的位置で表面に堆積した少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットと、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で表面に堆積した少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットとを含む。さらに、実施形態では、少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分(target specific padlock probe reagent component)、少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分、および少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含む。実施形態では、少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットは、少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分、鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素、ベタイン添加剤、テトロン系添加剤、配列特異的プローブ、ｄＮＴＰ、およびプライマーミックスを含む。さらにまた、実施形態では、プライマーミックスは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な順方向内側プライマー（forward inside primer）と、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な逆方向内側プライマー（backward inside primer）とを含む。

【0008】

本開示の別の例示的な実施形態によれば、試料の生物学的同定のための装置は、前の実施形態の装置を含み、第２の標的位置で表面に堆積した第２の標的特異的試薬成分セットをさらに含む。さらに、実施形態では、第２の標的特異的試薬成分セットは、第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分、少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分、および少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含む。さらにまた、実施形態では、第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分は、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格を含む。

【0009】

さらなる例示的な実施形態によれば、試料の物質の核酸同定のための方法は、マイクロ流体力学システムを設けることを含み、マイクロ流体力学システムは可動カートリッジアセンブリを含む。実施形態では、可動カートリッジアセンブリは、試料の位置で試料を受容するように構成された表面と、標的位置で表面に堆積した少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットと、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で表面に堆積した少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットとを含む。さらに、実施形態では、少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分、少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分、および少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含む。実施形態では、少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットは、少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分、鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素、ベタイン添加剤、テトロン系添加剤、配列特異的プローブ、ｄＮＴＰ、およびプライマーミックスを含む。さらにまた、実施形態では、プライマーミックスは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な順方向内側プライマーと、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な逆方向内側プライマーとを含む。実施形態では、方法は、表面上に受容された試料のアリコートを標的位置に輸送するステップと、標的位置に熱を加えるステップと、表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを標的位置に輸送するステップと、標的位置に熱を加えるステップとをさらに含む。

【0010】

別の例示的な実施形態によれば、試料の物質の核酸同定のための方法は、前の実施形態の方法を含み、可動カートリッジアセンブリは、第２の標的位置で表面に堆積した第２の標的特異的試薬成分セットをさらに含む。さらに、実施形態では、第２の標的特異的試薬成分セットは、第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分、少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分、および少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含む。さらにまた、実施形態では、第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分は、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格を含む。実施形態では、方法は、表面上に受容された試料の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するステップと、第２の標的位置に熱を加えるステップと、表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するステップと、第２の標的位置に熱を加えるステップとをさらに含む。

【0011】

さらなる例示的な実施形態によれば、デジタルマイクロ流体力学システムによって実行されるとき、デジタルマイクロ流体力学システムに試料の物質の核酸同定のための方法を実行させる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体で、デジタルマイクロ流体力学システムは、熱源を含み、方法は、表面上に受容された試料のアリコートを標的位置に輸送するステップと、標的位置に熱を加えるステップと、表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを標的位置に輸送するステップと、標的位置に熱を加えるステップとを含む。実施形態では、デジタルマイクロ流体力学システムは、可動カートリッジアセンブリを含む。実施形態では、可動カートリッジアセンブリは、試料の位置で試料を受容するように構成された表面と、標的位置で表面に堆積した少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットと、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で表面に堆積した少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットとをさらに含む。さらに、実施形態では、少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分、少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分、および少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含む。実施形態では、少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットは、少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分、鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素、ベタイン添加剤、テトロン系添加剤、配列特異的プローブ、ｄＮＴＰ、およびプライマーミックスを含む。さらにまた、実施形態では、プライマーミックスは、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な順方向内側プライマーと、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格に特異的な逆方向内側プライマーとを含む。

【0012】

別の例示的な実施形態によれば、デジタルマイクロ流体力学システムによって実行されるとき、デジタルマイクロ流体力学システムに試料の物質の核酸同定のための方法を実行させる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、前の実施形態の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含み、可動カートリッジアセンブリは、第２の標的位置で表面に堆積した第２の標的特異的試薬成分セットをさらに含む。さらに、実施形態では、第２の標的特異的試薬成分セットは、第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分、少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ酵素成分、および少なくとも１つの標的プローブ関連リガーゼ緩衝成分のセットを含む。さらにまた、実施形態では、第２の標的特異的パドロックプローブ試薬成分は、少なくとも１つの標的特異的パドロックプローブ試薬成分の骨格を含む。実施形態では、方法は、表面上に受容された試料の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するステップと、第２の標的位置に熱を加えるステップと、表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するステップと、第２の標的位置に熱を加えるステップとをさらに含む。

【0013】

さらなる例示的な実施形態によれば、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、前の実施形態のいずれかであり得、（ａ）リガーゼ酵素成分は、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ酵素成分である；および／または（ｂ）リガーゼ緩衝成分のセットは、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである。あるいは、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、前の実施形態のいずれかであり得、（ａ）リガーゼ酵素成分は、ＲＮＡリガーゼ酵素成分である；および／または（ｂ）リガーゼ緩衝成分のセットは、ＲＮＡリガーゼ緩衝成分のセットである。

【0014】

さらなる例示的な実施形態によれば、本開示と一致する装置または方法は、マイクロ流体力学システムがデジタルマイクロ流体力学システムである前の実施形態のいずれかであり得る。

【0015】

さらにまた、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、前の実施形態のいずれかであり得、（ａ）配列特異的プローブは、オリゴヌクレオチド鎖置換プローブであり；（ｂ）少なくとも１つのポリメラーゼ緩衝成分がＢｓｔ３ポリメラーゼ緩衝成分であり；および／または（ｃ）鎖置換活性を有する少なくとも１つのポリメラーゼ酵素がＢｓｔ３ポリメラーゼ酵素である。

【0016】

さらに、実施形態では、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、熱源が第１および／または第２の標的位置に位置する流体を約９５℃まで、また冷却後に約６５℃まで加熱するように構成することができる前の実施形態のいずれかであり得る。

【0017】

さらなる実施形態では、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、可動カートリッジアセンブリが、消耗型カートリッジ、例えば－ただし、これに限定されない－「使い捨て」カートリッジである前の実施形態のいずれかであり得る。

【0018】

さらに、実施形態では、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、励起放射源、および／または可動カートリッジアセンブリの表面から発する、可能な蛍光を監視するためのカメラシステムをさらに含む、前の実施形態のいずれかであり得る。さらにまた、励起放射源は、４９５ｎｍ（または任意の他の適切な励起波長）で発光するように構成されたＬＥＤであってもよい。

【0019】

さらなる実施形態では、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、マイクロ流体力学システムが、表面上に受容された試料のアリコートを標的位置に輸送するように構成され、表面上に受容された試料の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するようにさらに構成される、前の実施形態のいずれかであり得る。さらにまた、マイクロ流体力学システムは、表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを標的位置に輸送するようにさらに構成することができ、表面上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するようにさらに構成される。

【0020】

さらなる実施形態では、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、標的位置で表面に堆積した少なくとも１つの標的特異的試薬成分セットが標的位置で印刷される、および／または第２の標的位置で表面に堆積した第２の標的特異的試薬成分セットが第２の標的位置で印刷される、前の実施形態のいずれかであり得る。さらにまた、本開示と一致する装置、方法、または命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置で表面に堆積された少なくとも１つのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のセットが乾燥形態で堆積される、前の実施形態のいずれかであり得る。そのような実施形態は、乾燥したＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分を水和させる手段またはステップをさらに含むことができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本開示の様々な実施形態と一致する試料の物質の核酸同定のための例示的な装置を示す。

【図2】例示的な可動カートリッジアセンブリを含まない、図１の装置の異なる斜視図を示す。

【図3】本開示と一致する例示的な可動カートリッジアセンブリの上面図を示す。

【図4】図３の例示的な可動カートリッジアセンブリの分解断面図を示す。

【図5】図３および図４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図6】図３および図４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図7】図３および図４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図8】図３および図４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図9】図３および図４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図10】図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図11】図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図12】図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図13】本開示と一致するさらに例示的な可動カートリッジアセンブリの上面図を示す。

【図14】図１３の例示的な可動カートリッジアセンブリの分解断面図を示す。

【図15】図１３および図１４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図16】図１３および図１４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図17】図１３および図１４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図18】図１３および図１４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図19】図１３および図１４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示す。

【図20】図１３および図１４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図21】図１３および図１４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図22】図１３および図１４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図23】本開示と一致する試料の混合および評価のための例示的なデータ処理システムの概略図である。

【図24】試料が供給された図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリと一致するＤＭＦ基板の上面図を示す。

【図25】試料アリコートの動きを示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリと一致するＤＭＦ基板の表面の上面図を示す。

【図26】試料アリコートの移動を示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリと一致するデジタルマイクロ流体力学システムの一部の断面図を示す。

【図27】アリコートの移動、混合、および加熱を示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図28】アリコートの移動、混合、および加熱を示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図29】水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分のアリコートの動きを示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリと一致するＤＭＦ基板の表面の上面図を示す。

【図30】ＤＭＦ基板の表面上の混合物、励起放射、および可能な蛍光を示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリと一致するＤＭＦ基板の表面の上面図を示す。

【図31】アリコートの移動、混合、および加熱を示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図32】アリコートの移動、混合、および加熱を示す、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【図33】ＤＭＦ基板の表面上の混合物、励起放射、および可能な蛍光を示す、図３２と一致する別の断面図を示す。

【図34】本開示と一致する、試料の物質の核酸同定のための例示的な方法のフローチャートを示す。

【図35】本開示と一致する、試料の物質の核酸同定のための例示的な方法のフローチャートを示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

例示的な実施形態は、添付の図面を参照して説明される。必ずしも原寸に比例して描かれていない図では、参照符号の最も左の桁は、参照符号が最初に現れる図を特定する。便宜上、同じまたは同様の部分を指すために図面全体を通して同じ参照符号が使用されている。開示された原理の例および特徴が本明細書に記載されているが、開示された実施形態の精神および範囲から逸脱することなく、修正、適合、および他の実装が可能である。また、「備える(comprising)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、および「含む(including)」という単語、ならびに他の同様の形態は、意味において同等であり、これらの単語のいずれか１つに続く１つまたは複数の項目が、そのような１つまたは複数の項目を網羅する列挙であることを意味するものではなく、列挙された１つまたは複数の項目のみに限定されることを意味するものではないという点で、オープンエンドであることを意図している。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示していない限り、複数あることの言及を含むことにも留意されたい。

【0023】

本開示の実施形態は、一般に、ＲＣＡおよびＬＡＭＰの態様を組み合わせることによって試料に存在し得る遺伝物質を増幅および同定するための、装置、方法、および命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体に関する。実施形態では、パドロックプローブ（ＲＣＡの一態様）は、一本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの線状片である。その５’および３’のアームは標的の遺伝子配列に相補的であり、ユニバーサルプライマー／プローブ結合部位がアーム間に構築される。実施形態では、標的の存在下で、パドロックプローブアームは、アームの端部が隣接するように（パドロックプローブが円形を形成するように）標的遺伝物質にアニーリングする。この円形形状が形成されると、パドロックプローブアームをリガーゼ酵素と共有結合させることができる。これにより、線状ストランドから環状ストランドに変換される。パドロックプローブが環状コンフォメーションになると、２つのＬＡＭＰプライマー（順方向内側プライマー「ＦＩＰ」および逆方向内側プライマー「ＢＩＰ」）がそれに結合し、最初に超分岐ＲＣＡ反応を促進する相補的な鎖の生成を開始することができる。超分岐ＲＣＡ反応の最初の成分が産生されると、ＦＩＰおよびＢＩＰはＲＣＡ反応から迅速なＬＡＭＰ反応に移行し、その産生物は２５分未満で検出できる。本開示と一致する装置、方法、および命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、ＲＣＡおよびＬＡＭＰをデジタルマイクロ流体力学（「ＤＭＦ」）システムなどのマイクロ流体装置と結合する。当業者は、本開示と一致する装置、方法、および命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体は、圧力ベース、電気泳動ベース、重力ベース、遠心ベース、毛細管ベース、熱ベース、磁気泳動、音響ベース、およびエレクトロウェッティングを含むがこれらに限定されない他の種類のマイクロ流体流に基づくプラットフォームを使用して実施することもできることを理解する。

【0024】

本開示の実施形態によれば、デジタルマイクロ流体力学システムなどのマイクロ流体力学システムと、熱源とを有する装置が提供され得る。

【0025】

図１は、本開示と一致する例示的な装置１００を示す。装置１００は、ＤＭＦプロセッサシステム１１０を含むことができる。ＤＭＦプロセッサシステム１１０に接続されているのは、ＤＭＦ輸送グリッドカプラ１１５、組合せディスプレイ１２５およびユーザインターフェース１２７へのカプラ１２８、ランプ１７０へのカプラ１７８、カメラシステム１８０へのカプラ１８８、ならびに加熱／冷却装置１９０へのカプラ１９８である。装置１００はまた、可動カートリッジアセンブリ１５０を収容するように構成されたスロット１５２を含む。代替的または追加的に、スロット１５２は、可動カートリッジアセンブリ１６０を収容するように構成することができる。

【0026】

可動カートリッジアセンブリ１５０は、ＤＭＦ輸送グリッドカプラ１１５と結合するように構成されたＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５を含む。同様に、可動カートリッジアセンブリ１６０は、ＤＭＦ輸送グリッドカプラ１１５と結合するように構成されたＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５を含む。ＤＭＦシステムに関連する当業者は、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５およびＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５がＰＣＢ基板エッジコネクタと一致し得ることを理解するであろう。同様に、ＤＭＦシステムに関連する当業者は、ＤＭＦ輸送グリッドカプラ１１５がＰＣＢ基板エッジコネクタソケットと一致し得ることを理解するであろう。

【0027】

図２は、可動カートリッジアセンブリ１５０および可動カートリッジアセンブリ１６０がない図１の装置の代替の斜視図を提示する。本開示と一致して、ランプ１７０、カメラシステム１８０、および加熱／冷却装置１９０は、スロット１５２の片側に配置することができる。さらに、本開示と一致して、加熱／冷却装置１９０は、スロット１５２の下に配置することができ、ランプ１７０およびカメラシステム１８０は、スロット１５２の上であるが装置１００のハウジング内部に配置することができる。本開示の実施形態と一致して、可動カートリッジ１５０または可動カートリッジ１６０のいずれかがスロット１５２（図２には示されていない）内部に位置するとき、ランプ１７０およびカメラシステム１８０は、好ましい実施形態では、可動カートリッジ１５０または可動カートリッジ１６０の一部を形成する透明プレート（以下でさらに説明する）の上方に位置することができる。実施形態では、カメラシステム１８０は、限定することなく、適宜、フィルタを含む追加の光学素子を組み込むことができる。

【0028】

図３は、例示的な可動カートリッジアセンブリ１５０の上面図を示す。また、図３には、斜視インジケータを有する断面位置１０Ａ～Ｂ、斜視インジケータを有する断面位置１１Ｃ～Ｄ、および斜視インジケータを有する断面位置１２Ｅ～Ｆも示されている。これらの位置および視点に関連する可動カートリッジアセンブリ１５０の断面は、それぞれ図１０、図１１、および図１２に示されている。図３はまた、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５、上部フレーム３５２、ならびに組立締結具用の開口部３１１、３１２、３１３および３１４を示す。また、図３には、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置への上部フレーム３５２の開口部３６６、試料の位置への上部フレーム３５２の開口部３６８、輸送および反応領域への上部フレーム３５２の開口部３７０は、が示されている。

【0029】

図４は、図３の可動カートリッジアセンブリ１５０の分解断面図を示す。また、図４には、斜視インジケータを有する断面位置１０Ａ～Ｂ、斜視インジケータを有する断面位置１１Ｃ～Ｄ、および斜視インジケータを有する断面位置１２Ｅ～Ｆも示されている。（上述のように、これらの位置および視点に関連する可動カートリッジアセンブリ１５０の断面は、それぞれ図１０、図１１、および図１２に示されている。）図４はまた、（例示的な順序で）上部フレーム３５２、透明プレート４９０、スペーサ４９２、ＤＭＦ基板４５０、および後部フレーム４５８を示す。ここでも、ＤＭＦ基板４５０の一部として、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５が示されている。図４に示すように、組立締結具のための上部フレーム３５２の開口部３１１、３１２、３１３、および３１４は、後部フレーム４５８の開口部４１１、４１２、４１３、４１４（それぞれ）と整列している。本開示と一致して、組立締結具用の開口部３１１、３１２、３１３および３１４ならびに組立締結具用の開口部４１１、４１２、４１３および４１４は、可動カートリッジアセンブリ１５０を、図４に示す相対的な順序で構造的に維持するための締結具（例えば、限定されないが、ボルト）を収容することができる。

【0030】

図５～図９は、図４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示し、図５～図９の各々は、断面の位置１０Ａ～Ｂ、１１Ｃ～Ｄ、および１２Ｅ～Ｆを含む。

【0031】

図５は、上部フレーム３５２の上面図を示す。本開示と一致して、上部フレーム３５２は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置への開口部３６６と、試料の位置への開口部３６８と、輸送および反応領域への開口部３７０とを含む。好ましい実施形態では、上部フレーム３５２は、（同様の材料で構成される、後部フレーム４５８に固定されたときに）可動カートリッジアセンブリ１５０の構成要素の相対的な順序および構成要素間の任意の必要なギャップを構造的に維持するＦＲ－４などの剛性材料で構成することができるが、これに限定されない。一実施形態では、開口部３７０は、約５６ｍｍ×２５ｍｍとすることができ、開口部３６８は、約９ｍｍ×３９ｍｍとすることができ、開口部３６６は、約４５ｍｍ×９ｍｍとすることができ、上部フレーム３５２の全体構造は、約１００ｍｍ×５７ｍｍとすることができる長方形の内部にある。実施形態では、上部フレーム３５２は、ミリメートル（すなわち、比較的平坦な場合は約１ｍｍ、または透明プレート４９０、スペーサ４９２、およびＤＭＦ基板４５０用の成形ハウジングを設けるなど、包み込むように成形されている場合は約２ｍｍ（図示せず）である）程度の厚さを有することができる。スペーサ４９２が導体である好ましい実施形態では、上部フレーム３５２は、一般に非導電性材料で構成することができる。

【0032】

図６は、透明プレート４９０の上面図を示す。実施形態では、透明プレート４９０は、透明および導電性の両方を付与するために、（図６の視点から）「底」の側にインジウムスズ酸化物の薄層を有するガラス板から形成することができる。一般に、実施形態では、透明プレート４９０は、任意の透明導電性材料から構成することができる。本明細書で使用される場合、「透明」とは、入射放射の感知可能な散乱（または遮断）なしに入射放射を透過することを意味し、入射放射は、（以下でさらに説明するように）対象である厳密な調査、励起、および／または蛍光放射を含むことができる。実施形態では、例えば、透明材料は、関連する入射放射の約６０％以上の透過を設けることができ、好ましい実施形態では、高度に透明な材料は、関連する入射放射の約７５％または約８５％以上の透過を設けることができる。導電性に関して、実施形態では、透明プレート４９０のシート抵抗は、約１Ω／スクエア（「オーム／スクエア」）～約２００Ω／スクエアの範囲内とすることができる。透明プレート４９０は、ミリメートル範囲の厚さを有することができ、好ましい実施形態では、約１．１ミリメートルの厚さを有することができる。当業者は、マイクロ流体流に関連する輸送および反応領域内で、任意の薄い導電性コーティングの下の透明プレート４９０の底面に疎水性コーティングを設けることができることを理解するであろう。実施形態では、透明プレート４９０の疎水性コーティングは、疎水性コーティングの厚さが約１００～１万ナノメートルであるように、スプレー、スピン、ディップまたはブロット法を介して均一な方法で塗布されたテフロン、サイトニックスフルオロペル１１０１Ｖ－ＦＳ、またはＣｙｔｏｐ ＣＴ Ｌ ８０９Ｍを含むことができる。当業者はまた、透明プレート４９０の底面がマイクロ流体流に関連する輸送および反応領域から離れており、透明プレート４９０がマイクロ流体流の制御を担うデジタルマイクロ流体力学システムの回路の一部である導体と（例えば、透明プレート４９０が後述するスペーサ４９２と直接電気的に接触するように構成されている選択領域において）接触するように構成されている場合、透明プレート４９０の薄い導電層が導体と直接接触することができるように透明プレート４９０の底面をマスキングして除去することができ、それによって透明プレート４９０がデジタルマイクロ流体力学システムの回路の一部であることを確実にすることを理解するであろう。

【0033】

図７は、スペーサ４９２の上面図を示す。実施形態では、スペーサ４９２は、ステンレス鋼および銅を含むがこれらに限定されない導電性材料から製造することができる。さらに、マイクロ流体流（後述）に関連するＤＭＦ基板４５０の輸送および反応領域の導電性電極が約２．６ｍｍ×２．６ｍｍの正方形である実施形態では、スペーサ４９２は、ＤＭＦ基板４５０の「上部」表面と透明プレート４９０の「底部」表面との間に適切なギャップを設定するために、約２１０から２７０マイクロメートルの厚さとすることができる。好ましい実施形態では、スペーサ４９２は、約２３０マイクロメートルの厚さになるように構成することができる。当業者は、スペーサ４９２の厚さ（したがって、ＤＭＦ基板４５０の「上面」と透明プレート４９０の「下面」との間のギャップの厚さ）が、マイクロ流体流に関連するＤＭＦ基板４５０の輸送および反応領域のほぼ正方形の導電性電極のサイズに比例することを理解するであろう。

【0034】

図８は、ＤＭＦ基板４５０の上面図を示す。本開示と一致して、ＤＭＦ基板４５０はＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５を含む。図８には、ＤＭＦ電極の位置８０５も示されている。上述したように、実施形態では、電極の位置８０５における電極のサイズは、約２．６ｍｍ×２．６ｍｍの正方形であり得る。試料の位置８８０およびＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５５などのＤＭＦ基板４５０の表面上の特定の「リザーバ」の位置の電極は、一般に、ベースの正方形の電極サイズで構成されるより大きな多角形であり得ることが、当業者は理解されよう。さらに、ＤＭＦシステムに関連する当業者は、位置８０５がＤＭＦ基板４５０の表面上のグリッド状位置を表し、流体部分が、ＤＭＦ基板４５０の電子機器および接続されたＤＭＦプロセッサシステム１１０によってサポートされる任意のプログラミングロジックに従って、可動カートリッジアセンブリ１５０内部を移動するように操作され得ることを理解するであろう。透明プレート４９０の「底」と同様に、当業者は、輸送および反応領域、ならびに上述の「リザーバ」領域におけるＤＭＦ基板４５０の「上部」表面に疎水性コーティングを設けることができることを理解するであろう。実施形態では、ＤＭＦ基板４５０の疎水性コーティングは、疎水性コーティングの厚さが約１００～１万ナノメートルであるように、スプレー、スピン、ディップまたはブロット法を介して均一な方法で塗布されたテフロン、サイトニックスフルオロペル１１０１Ｖ－ＦＳ、またはＣｙｔｏｐ ＣＴ Ｌ ８０９Ｍを含むことができる。

【0035】

図８には、第１の標的位置８１０、第２の標的位置８２０、第３の標的位置８３０、および第４の標的位置８４０も示されている。第１の標的位置８１０の電極の位置８０５の近くまたは上に位置するのは、第１の標的特異的試薬成分セット８１５である。同様に、第２の標的位置８２０の電極の位置８０５の近くまたは上に位置するのは、第２の標的特異的試薬成分セット８２５である。第３の標的位置８３０の電極の位置８０５の近くまたは上に位置するのは、第３の標的特異的試薬成分セット８３５である。同様に、第４の標的位置８４０の電極の位置８０５の近くまたは上に位置するのは、第４の標的特異的試薬成分セット８４５である。

【0036】

本開示と一致する一実施形態では、第１の標的特異的試薬成分セット８１５、第２の標的特異的試薬成分セット８２５、第３の標的特異的試薬成分セット８３５、および第４の標的特異的試薬成分セット８４５は、疎水性コーティング上のＤＭＦ基板４５０の表面上に堆積される。好ましくは、実施形態では、第１の標的特異的試薬成分セット８１５、第２の標的特異的試薬成分セット８２５、第３の標的特異的試薬成分セット８３５、および第４の標的特異的試薬成分セット８４５は、乾燥状態でＤＭＦ基板４５０の表面上に堆積（および好ましくは印刷）される。本開示と一致して、当業者は、標的核酸に基づいて、第１の標的位置８１０、第２の標的位置８２０、第３の標的位置８３０、および第４の標的位置８４０（パドロックプローブである）に堆積または印刷される試薬成分を選択することができる。標的化核酸に基づく試薬の選択は、例えば、限定されないが、Padlock Probe Assay for Detection and Subtyping of Seasonal Influenza’by F.Neumann,et al.Clinical Chemistry,vol.64,no.12,pp.1704-1712（２０１８年１２月１日）という論文に開示されているように当技術分野において周知であり、ここで、標的特異的試薬成分は、インフルエンザ陽性試料を同定するためのパドロック－プローブベースの方法において選択される。実施形態では、例えば、第１の標的特異的試薬成分セット８１５が第１の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第１の標的核酸に基づいて第１の標的特異的試薬成分セット８１５が選択される。同様に、実施形態では、第２の標的特異的試薬成分セット８２５が第２の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第２の標的特異的試薬成分セット８２５は、第２の標的核酸（第１の標的核酸とは異なり得る）に基づいて選択される。同様に、実施形態では、第３の標的特異的試薬成分セット８３５が第３の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第３の標的核酸（第１の標的核酸および第２の標的核酸の両方と異なり得る）に基づいて、第３の標的特異的試薬成分セット８３５が選択される。さらにまた、実施形態では、第４の標的特異的試薬成分セット８４５が第４の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第４の標的核酸（第１、第２および第３の標的核酸と異なっていてもよい）に基づいて第４の標的特異的試薬成分セット８４５が選択される。

【0037】

図８はまた、試料の位置８８０およびＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０を示す。実施形態では、疎水性コーティング上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０の電極の位置８０５に位置するのは、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分８５５である。さらに、本開示と一致する実施形態では、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分８５５は、乾燥状態でＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０に堆積される。本開示と一致して、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分８５５は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分８５５中の試薬が、標的核酸にかかわらず、第１の標的特異的試薬成分セット８１５、第２の標的特異的試薬成分セット８２５、第３の標的特異的試薬成分セット８３５、および第４の標的特異的試薬成分セット８４５の各々と機能するように選択され、標的特異的試薬成分セット（本開示における８１５、８２５、８３５、８４５）の各々が、パドロックプローブ技術を使用して同定するように特に選択されるという意味で、「汎用」の試薬である。ＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分８５５の「汎用」の試薬には、（アスタリスク「＊」が付された試薬は、標的特異的試薬成分セット中のパドロックプローブ骨格と直接会合する試薬）リガーゼ緩衝液；リガーゼ酵素＊；ＲＣＡ－ＬＡＭＰ緩衝液；テトロニクス；ベタイン；オリゴヌクレオチド鎖置換（ＯＳＤ）プローブ＊；デオキシヌクレオチドデトリホスフェート（ｄＮＴＰ）；順方向内側プライマー＊（ＦＩＰ）；逆方向内側プライマー＊（ＢＩＰ）；およびＢｓｔ３＊（鎖置換活性を有するポリメラーゼ）が含まれる。

【0038】

本開示と一致して、試料の位置８８０におけるＤＭＦ基板４５０の表面は、スペーサ４９２の開口部およびトップカバー３５２の開口部３６８の両方を通してアクセス可能である。これにより、可動カートリッジアセンブリ１５０の上部を通って試料の位置８８０のＤＭＦ基板４５０の表面上に試料を提供することが可能になる。同様に、本開示と一致して、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ試料の位置８５０のＤＭＦ基板４５０の表面上の乾燥したＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分８５５は、スペーサ４９２の開口部およびトップカバー３５２の開口部３６６を通してアクセス可能である。これにより、任意の乾燥したＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分８５５を水和させるために、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０で可動カートリッジアセンブリ１５０の上部を通してＤＭＦ基板４５０の表面に流体を供給することができる。図８にはまた、電極コネクタ８０１が示されており、これは、本明細書の実施形態と一致して、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５を介して電気的「グランド」に接続することができ、スペーサ４９２（導電性である）と接触することもでき、次に、透明プレート４９０の底部の、疎水性コーティングが施されていない部分（例えばマスキングを介して）と接触することができ、それによって透明プレート４９０の導電層部分が電気的「グランド」に接続される。

【0039】

図９は、後部フレーム４５８の上面図を示す。また、図９には、図４に関連して先に論じた開口部４１１、４１２、４１３および４１４も示されている。好ましい実施形態では、後部フレーム４５８は、（上述のように上部フレーム３５２に固定されたときに）可動カートリッジアセンブリ１５０の構成要素の相対的な順序、および構成要素間の任意の必要なギャップを構造的に維持するＦＲ－４などであるがこれらに限定されない剛性材料から、構成することができる。一実施形態では、後部フレーム４５８の全体構造は、約１００ｍｍ×６０ｍｍの長方形内部にある。実施形態では、後部フレーム４５８は、ミリメートル（すなわち、比較的平坦であれば約１ｍｍ）程度の厚さを有することができる。スペーサ４９２が導体である好ましい実施形態では、後部フレーム４５８は、一般に非導電性材料で構成することができる。

【0040】

図１０～図１２は、図３および図４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【0041】

図１０は、第１の標的位置８１０内のＤＭＦ基板４５０の断面図を含む、位置１０Ａ～Ｂにおける断面図を示す。その結果、図１０は、疎水性コーティング１０７０上の第１の標的特異的試薬成分セット８１５の図を含む。ＤＭＦ基板４５０は、誘電体１０６０、基板１０５０、電極１００５および電極コネクタ１００７（電極コネクタ１００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ４９２、ならびにガラス層１０９５、導電層１０９０、および疎水性コーティング１０８０を含むことができる透明プレート４９０が示されている。誘電体１０６０は、パリレン－Ｃなどであるがこれに限定されない材料を含むことができ、約２～２０ミクロンの厚さを有する層に形成することができる。

【0042】

図１１は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０内部のＤＭＦ基板４５０の断面図を含む、位置１１Ｃ～Ｄにおける断面図を示す。その結果、図１１は、疎水性コーティング１０７０のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分８５５の図を含む。図１０に示すように、ＤＭＦ基板４５０は、誘電体１０６０、基板１０５０、電極１００５および電極コネクタ１００７（電極コネクタ１００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ４９２、ならびにガラス層１０９５、導電層１０９０、および疎水性コーティング１０８０を含む透明プレート４９０が示されている。

【0043】

図１２は、試料の位置８８０内部のＤＭＦ基板４５０の断面図を含む、位置１２Ｅ～Ｆにおける断面図を示す。図１０および図１１に示すように、ＤＭＦ基板４５０は、誘電体１０６０、基板１０５０、電極１００５および電極コネクタ１００７（電極コネクタ１００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ４９２、ならびにガラス層１０９５、導電層１０９０、および疎水性コーティング１０８０を含む透明プレート４９０が示されている。

【0044】

図１３は、例示的な可動カートリッジアセンブリ１６０の上面図を示す。また、図１３には、斜視インジケータを有する断面位置２０Ａ～Ｂ、斜視インジケータを有する断面位置２１Ｃ～Ｄ、および斜視インジケータを有する断面位置２２Ｅ～Ｆも示されている。これらの位置および視点に関連する可動カートリッジアセンブリ１６０の断面は、それぞれ図２０、図２１、および図２２に示されている。図１３はまた、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５、上部フレーム１３５２、および組立締結具用の開口部１３１１、１３１２、１３１３、および１３１４を示す。また、図１３には、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置への上部フレーム１３５２の開口部１３６６、試料の位置への上部フレーム１３５２の開口部１３６８、輸送および反応領域への上部フレーム１３５２の開口部１３７０は、が示されている。

【0045】

図１４は、図１３の可動カートリッジアセンブリ１６０の分解断面図を示す。また、図１４には、斜視インジケータを有する断面位置２０Ａ～Ｂ、斜視インジケータを有する断面位置２１Ｃ～Ｄ、および斜視インジケータを有する断面位置２２Ｅ～Ｆも示されている。（上述のように、これらの位置および視点に関連する可動カートリッジアセンブリ１６０の断面は、それぞれ図２０、図２１、および図２２に示されている。）図１４はまた、（例示的な順序で）上部フレーム１３５２、透明プレート１４９０、スペーサ１４９２、ＤＭＦ基板１４５０、および後部フレーム１４５８を示す。ここでも、ＤＭＦ基板１４５０の一部として、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５が示されている。図１４に示すように、組立締結具用の上部フレーム１３５２の開口部１３１１、１３１２、１３１３、および１３１４は、後部フレーム１４５８の開口部１４１１、１４１２、１４１３、および１４１４（それぞれ）と整列する。本開示と一致して、組立締結具用の開口部１３１１、１３１２、１３１３および１３１４ならびに組立締結具用の開口部１４１１、１４１２、１４１３および１４１４は、可動カートリッジアセンブリ１６０を、図１４に示す相対的な順序で構造的に維持するための締結具（例えば、限定されないが、ボルト）を収容することができる。

【0046】

図１５～図１９は、図１４の可動カートリッジアセンブリの構成要素の上面図を示し、図１５～図１９の各々は、断面の位置２０Ａ～Ｂ、２１Ｃ～Ｄ、および２２Ｅ～Ｆを含む。

【0047】

図１５は、上部フレーム１３５２の上面図を示す。本開示と一致して、上部フレーム１３５２は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置への開口部１３６６と、試料の位置への開口部１３６８と、輸送および反応領域への開口部１３７０とを含む。好ましい実施形態では、上部フレーム１３５２は、（同様の材料で構成される、後部フレーム１４５８に固定されたときに）可動カートリッジアセンブリ１６０の構成要素の相対的な順序および構成要素間の任意の必要なギャップを構造的に維持するＦＲ－４などの剛性材料で構成することができるが、これに限定されない。一実施形態では、開口部１３７０は、約５６ｍｍ×２５ｍｍとすることができ、開口部１３６８は、約９ｍｍ×９ｍｍとすることができ、開口部１３６６は、約９ｍｍ×９ｍｍとすることができ、上部フレーム１３５２の全体構造は、約１００ｍｍ×５７ｍｍとすることができる長方形の内部にある。実施形態では、上部フレーム１３５２は、ミリメートル（すなわち、比較的平坦な場合は約１ｍｍ、または透明プレート１４９０、スペーサ１４９２、およびＤＭＦ基板１４５０用の成形ハウジングを設けるなど、包み込むように成形されている場合は約２ｍｍ（図示せず））程度の厚さを有することができる。スペーサ１４９２が導体である好ましい実施形態では、上部フレーム１３５２は、一般に非導電性材料で構成することができる。

【0048】

図１６は、透明プレート１４９０の上面図を示す。実施形態では、透明プレート１４９０は、透明および導電性の両方を付与するために、（図１６の視点から）「底」の側にインジウムスズ酸化物の薄層を有するガラス板から形成することができる。一般に、実施形態では、透明プレート１４９０は、任意の透明導電性材料から構成することができる。実施形態では、例えば、透明材料は、関連する入射放射の約６０％以上の透過を設けることができ、好ましい実施形態では、高度に透明な材料は、関連する入射放射の約７５％または約８５％以上の透過を設けることができる。導電性に関して、実施形態では、透明プレート１４９０のシート抵抗は、約１Ω／スクエア～約２００Ω／スクエアの範囲内とすることができる。透明プレート１４９０は、ミリメートル範囲の厚さを有することができ、好ましい実施形態では、約１．１ミリメートルの厚さを有することができる。当業者は、マイクロ流体流に関連する輸送および反応領域内で、任意の薄い導電性コーティングの下の透明プレート１４９０の底面に疎水性コーティングを設けることができることを理解するであろう。実施形態では、透明プレート１４９０の疎水性コーティングは、疎水性コーティングの厚さが約１００～１万ナノメートルであるように、スプレー、スピン、ディップまたはブロット法を介して均一な方法で塗布されたテフロン、サイトニックスフルオロペル１１０１Ｖ－ＦＳ、またはＣｙｔｏｐ ＣＴ Ｌ ８０９Ｍを含むことができる。当業者はまた、透明プレート１４９０の底面がマイクロ流体流に関連する輸送および反応領域から離れており、透明プレート１４９０がマイクロ流体流の制御を担うデジタルマイクロ流体力学システムの回路の一部である導体と（例えば、透明プレート１４９０が後述するスペーサ１４９２と直接電気的に接触するように構成されている選択領域において）接触するように構成されている場合、透明プレート１４９０の薄い導電層が導体と直接接触することができるように透明プレート１４９０の底面をマスキングして除去することができ、それによって透明プレート１４９０がデジタルマイクロ流体力学システムの回路の一部であることを確実にすることを理解するであろう。

【0049】

図１７は、スペーサ１４９２の上面図を示す。実施形態では、スペーサ１４９２は、ステンレス鋼および銅を含むがこれらに限定されない導電性材料から製造することができる。さらに、マイクロ流体流（後述）に関連するＤＭＦ基板１４５０の輸送および反応領域の導電性電極が約２．６ｍｍ×２．６ｍｍの正方形である実施形態では、スペーサ１４９２は、ＤＭＦ基板１４５０の「上部」表面と透明プレート１４９０の「底部」表面との間に適切なギャップを設定するために、約２１０から２７０マイクロメートルの厚さとすることができる。好ましい実施形態では、スペーサ１４９２は、約２３０マイクロメートルの厚さになるように構成することができる。当業者は、スペーサ１４９２の厚さ（したがって、ＤＭＦ基板１４５０の「上面」と透明プレート１４９０の「下面」との間のギャップの厚さ）が、マイクロ流体流に関連するＤＭＦ基板１４５０の輸送および反応領域のほぼ正方形の導電性電極のサイズに比例することを理解するであろう。

【0050】

図１８は、ＤＭＦ基板１４５０の上面図を示す。本開示と一致して、ＤＭＦ基板１４５０はＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５を含む。図８には、ＤＭＦ電極の位置１８０５も示されている。上述したように、実施形態では、電極の位置１８０５における電極のサイズは、約２．６ｍｍ×２．６ｍｍの正方形であり得る。試料の位置１８８０およびＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５５などのＤＭＦ基板１４５０の表面上の特定の「リザーバ」の位置の電極は、一般に、ベースの正方形の電極サイズで構成されるより大きな多角形であり得ることが、当業者は理解されよう。さらに、ＤＭＦシステムに関連する当業者は、位置１８０５がＤＭＦ基板１４５０の表面上のグリッド状位置を表し、流体部分が、ＤＭＦ基板１４５０の電子機器および接続されたＤＭＦプロセッサシステム１１０によってサポートされる任意のプログラミングロジックに従って、可動カートリッジアセンブリ１６０内部を移動するように操作され得ることを理解するであろう。透明プレート１４９０の「底」と同様に、当業者は、輸送および反応領域、ならびに上述の「リザーバ」領域におけるＤＭＦ基板１４５０の「上部」表面に疎水性コーティングを設けることができることを理解するであろう。実施形態では、ＤＭＦ基板１４５０の疎水性コーティングは、疎水性コーティングの厚さが約１００～１万ナノメートルであるように、スプレー、スピン、ディップまたはブロット法を介して均一な方法で塗布されたテフロン、サイトニックスフルオロペル１１０１Ｖ－ＦＳ、またはＣｙｔｏｐ ＣＴ Ｌ ８０９Ｍを含むことができる。

【0051】

図１８には、第１の標的位置１８１０、第２の標的位置１８２０、第３の標的位置１８３０、および第４の標的位置１８４０も示されている。第１の標的位置１８１０の電極の位置１８０５の近くまたは上に位置するのは、第１の標的特異的試薬成分セット１８１５である。同様に、第２の標的位置１８２０の電極の位置１８０５の近くまたは上に位置するのは、第２の標的特異的試薬成分セット１８２５である。第３の標的位置１８３０の電極の位置１８０５の近くまたは上に位置するのは、第３の標的特異的試薬成分セット１８３５である。同様に、第４の標的位置１８４０の電極の位置１８０５の近くまたは上に位置するのは、第４の標的特異的試薬成分セット１８４５である。

【0052】

本開示と一致する一実施形態では、第１の標的特異的試薬成分セット１８１５、第２の標的特異的試薬成分セット１８２５、第３の標的特異的試薬成分セット１８３５、および第４の標的特異的試薬成分セット１８４５は、疎水性コーティング上のＤＭＦ基板１４５０の表面上に堆積される。好ましくは、実施形態では、第１の標的特異的試薬成分セット１８１５、第２の標的特異的試薬成分セット１８２５、第３の標的特異的試薬成分セット１８３５、および第４の標的特異的試薬成分セット１８４５は、乾燥状態でＤＭＦ基板１４５０の表面上に堆積（および好ましくは印刷）される。本開示と一致して、当業者は、標的核酸に基づいて、第１の標的位置１８１０、第２の標的位置１８２０、第３の標的位置１８３０、および第４の標的位置１８４０（パドロックプローブである）に堆積または印刷される試薬成分を選択することができる。標的化核酸に基づく試薬の選択は、例えば、限定されないが、Padlock Probe Assay for Detection and Subtyping of Seasonal Influenza’by F.Neumann,et al.Clinical Chemistry,vol.64,no.12,pp.1704-1712（２０１８年１２月１日）という先に引用した論文に開示されているように当技術分野において周知であり、ここで、標的特異的試薬成分は、インフルエンザ陽性試料を同定するためのパドロック－プローブベースの方法において選択される。実施形態では、例えば、第１の標的特異的試薬成分セット１８１５が第１の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第１の標的核酸に基づいて第１の標的特異的試薬成分セット１８１５が選択される。同様に、実施形態では、第２の標的特異的試薬成分セット１８２５が第２の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第２の標的特異的試薬成分セット１８２５は、第２の標的核酸（第１の標的核酸とは異なり得る）に基づいて選択される。同様に、実施形態では、第３の標的特異的試薬成分セット１８３５が第３の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第３の標的核酸（第１の標的核酸および第２の標的核酸の両方とは異なり得る）に基づいて第３の標的特異的試薬成分セット１８３５が選択される。さらにまた、実施形態では、第４の標的特異的試薬成分セット１８４５が第４の標的核酸に適切なパドロックプローブ標的配列を含むように、第４の標的核酸（第１、第２および第３の標的核酸とは異なっていてもよい）に基づいて第４の標的特異的試薬成分セット１８４５が選択される。

【0053】

図１８はまた、試料の位置１８８０およびＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５０を示す。実施形態では、疎水性コーティング上のＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５０の電極の位置１８０５に位置するのは、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分１８５５である。さらに、本開示と一致する実施形態では、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分１８５５は、乾燥状態でＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５０に堆積される。本開示と一致して、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分１８５５は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分１８５５中の試薬が、標的核酸にかかわらず、第１の標的特異的試薬成分セット１８１５、第２の標的特異的試薬成分セット１８２５、第３の標的特異的試薬成分セット１８３５、および第４の標的特異的試薬成分セット１８４５の各々と機能するように選択され、標的特異的試薬成分セット（本開示における１８１５、１８２５、１８３５、１８４５）の各々が、パドロックプローブ技術を使用して同定するように特に選択されるという意味で、「汎用」の試薬である。ＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分１８５５の「汎用」の試薬には、（アスタリスク「＊」が付された試薬は、標的特異的試薬成分セット中のパドロックプローブ骨格と直接会合する試薬）リガーゼ緩衝液；リガーゼ酵素＊；ＲＣＡ－ＬＡＭＰ緩衝液；テトロニクス；ベタイン；オリゴヌクレオチド鎖置換（ＯＳＤ）プローブ＊；デオキシヌクレオチドデトリホスフェート（ｄＮＴＰ）；順方向内側プライマー＊（ＦＩＰ）；逆方向内側プライマー＊（ＢＩＰ）；およびＢｓｔ３＊（鎖置換活性を有するポリメラーゼ）が含まれる。

【0054】

本開示と一致して、試料の位置１８８０におけるＤＭＦ基板１４５０の表面は、スペーサ１４９２の開口部およびトップカバー１３５２の開口部１３６８の両方を通してアクセス可能である。これにより、可動カートリッジアセンブリ１６０の上部を通って試料の位置１８８０のＤＭＦ基板１４５０の表面上に試料を提供することが可能になる。同様に、本開示と一致して、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ試料の位置１８５０のＤＭＦ基板１４５０の表面上の乾燥したＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分１８５５は、スペーサ１４９２の開口部およびトップカバー１３５２の開口部１３６６を通してアクセス可能である。これにより、任意の乾燥したＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分１８５５を水和させるために、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５０で可動カートリッジアセンブリ１６０の上部を通してＤＭＦ基板１４５０の表面に流体を供給することができる。図１８にはまた、電極コネクタ１８０１が示されており、これは、本明細書の実施形態と一致して、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５を介して電気的「グランド」に接続することができ、スペーサ１４９２（導電性である）と接触することもでき、次に、透明プレート１４９０の底部の、疎水性コーティングが施されていない部分（例えばマスキングを介して）と接触することができ、それによって透明プレート１４９０の導電層部分が電気的「グランド」に接続される。

【0055】

図１９は、後部フレーム１４５８の上面図を示す。図１９には、図１４に関連して先に論じた開口部１４１１、１４１２、１４１３、および１４１４も示されている。好ましい実施形態では、後部フレーム１４５８は、（上述のように上部フレーム１３５２に固定されたときに）可動カートリッジアセンブリ１６０の構成要素の相対的な順序、および構成要素間の任意の必要なギャップを構造的に維持するＦＲ－４などであるがこれらに限定されない剛性材料から、構成することができる。一実施形態では、後部フレーム１４５８の全体構造は、約１００ｍｍ×６０ｍｍの長方形内部にある。実施形態では、後部フレーム１４５８は、ミリメートル（すなわち、比較的平坦であれば約１ｍｍ）程度の厚さを有することができる。スペーサ１４９２が導体である好ましい実施形態では、後部フレーム１４５８は、一般に非導電性材料で構成することができる。

【0056】

図２０～２２は、図１３および図１４の例示的な可動カートリッジアセンブリの一部の断面図を示す。

【0057】

図２０は、第１の標的位置１８１０内のＤＭＦ基板１４５０の断面図を含む、位置２０Ａ～Ｂにおける断面図を示す。その結果、図２０は、疎水性コーティング２０７０上の第１の標的特異的試薬成分セット１８１５の図を含む。ＤＭＦ基板１４５０は、誘電体２０６０、基板２０５０、電極２００５および電極コネクタ２００７（電極コネクタ２００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ１４９２、ならびにガラス層２０９５、導電層２０９０、および疎水性コーティング２０８０を含むことができる透明プレート１４９０が示されている。誘電体２０６０は、パリレン－Ｃなどであるがこれに限定されない材料を含むことができ、約２～２０ミクロンの厚さを有する層に形成することができる。

【0058】

図２１は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５０内部のＤＭＦ基板１４５０の断面図を含む、位置２１Ｃ～Ｄにおける断面図を示す。その結果、図２１は、疎水性コーティング２０７０のＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分１８５５の図を含む。図２０に示すように、ＤＭＦ基板１４５０は、誘電体２０６０、基板２０５０、電極２００５および電極コネクタ２００７（電極コネクタ２００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ１４９２、ならびにガラス層２０９５、導電層２０９０、および疎水性コーティング２０８０を含む透明プレート１４９０が示されている。

【0059】

図２２は、試料の位置１８８０内部のＤＭＦ基板１４５０の断面図を含む、位置２２Ｅ～Ｆにおける断面図を示す。図２０および図２１に示すように、ＤＭＦ基板１４５０は、誘電体２０６０、基板２０５０、電極２００５および電極コネクタ２００７（電極コネクタ２００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１６５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ１４９２、ならびにガラス層２０９５、導電層２０９０、および疎水性コーティング２０８０を含む透明プレート１４９０が示されている。

【0060】

図２３は、試料の混合および評価を管理するためのデータ処理システム２３００の概略図である。システム２３００は、プロセッサ２３１０、メモリモジュール２３１５、記憶装置２３２０、入力インターフェース１２７、ディスプレイ装置１２５、マイクロ流体水和および輸送モジュール２３４０、標的プローブ試薬反応モジュール２３６０、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応モジュール２３６５、および励起／蛍光モジュール２３７０を含むことができる。システム２３００はまた、水和輸送グリッドインターフェース２３４２、加熱／冷却インターフェース２３６２、ならびにランプ／カメラインターフェース２３７２を含むことができる。システム２３００は、上に列挙したもの以外、追加の、より少ない、および／または異なる構成要素を含むことができる。列挙された装置の種類および数は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

【0061】

プロセッサ２３１０は、中央処理装置（「ＣＰＵ」）またはグラフィック処理装置（「ＧＰＵ」）とすることができる。プロセッサ２３１０は、以下でより詳細に説明される様々なプロセスを実行するためにコンピュータプログラム命令のシーケンスを実行することができる。メモリモジュール２３１５は、とりわけ、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）および読み出し専用メモリ（「ＲＯＭ」）を含むことができる。一般に、メモリモジュール２３１５は、非一時的コンピュータ可読媒体とすることができる。コンピュータプログラム命令は、ＲＯＭまたは任意の他の適切なメモリ位置からアクセスして読み取り、プロセッサ２３１０による実行のためにＲＡＭにロードすることができる。プロセッサ２３１０は、１つまたは複数のプリント回路基板および／またはマイクロプロセッサチップを含むことができる。

【0062】

記憶装置２３２０は、情報を記憶するのに適した任意のタイプの大容量記憶装置を含むことができる。例えば、記憶装置２３２０は、１つまたは複数のハードディスク装置、光ディスク装置、またはデータ記憶空間を設ける任意の他の記憶装置を含むことができる。例えば、記憶装置２３２０は、カメラシステム１８０から受信したデータの処理などのデータ処理プロセスに関連するデータ、およびデータ処理プロセス中に作成された任意の中間データを記憶することができる。記憶装置２３２０はまた、そこに含まれるデータおよび／または情報を分析および編成するための分析および編成ツールを含むことができる。

【0063】

実施形態では、水和および輸送グリッドインターフェース２３４２は、ＤＭＦ基板４５０、ＤＭＦ基板１４５０、透明プレート４９０、および透明プレート１４９０（必要に応じて）に電気インパルス（またはインパルスのための命令）を供給して、ＤＭＦ基板４５０の表面と透明プレート４９０の底部との間、またはＤＭＦ基板１４５０の表面と透明プレート１４９０の底部との間の間隙にマイクロ流体流を発生させるように構成される（必要に応じて）。別の実施形態では、水和および輸送グリッドインターフェース２３４２は、ＤＭＦ基板４５０、ＤＭＦ基板１４５０、装置１００、およびシステム２３００の間の双方向通信用に構成することができる。例えば、一実施形態と一致して、水和および輸送グリッドインターフェース２３４２は、ＤＭＦ基板４５０（またはＤＭＦ基板１４５０）および／または装置１００からデータを受信し、そのデータを記憶装置２３２０に記憶するように構成することができる。上述したように、水和および輸送グリッドインターフェース２３４２は、制御命令をＤＭＦ基板４５０（またはＤＭＦ基板１４５０）に送信して、ＤＭＦ基板４５０（またはＤＭＦ基板１４５０）上の流体アリコートの移動を開始および終了するようにさらに構成することができる。水和および輸送グリッドインターフェース２３４２は、ＤＭＦ基板４５０（またはＤＭＦ基板１４５０）および／または装置１００に制御命令を送信して水和動作を開始および終了するようにさらに構成することができる。例えば、装置１００は、水和および輸送グリッドインターフェース２３４２に結合された流体リザーバ（図示せず）を含むことができ、流体リザーバは、水和および輸送グリッドインターフェース２３４２から制御命令を受信すると、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０（またはＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５０）に流体を供給するように構成される。実施形態では、デジタルマイクロ流体水和および輸送モジュール２３４０は、ＤＭＦ基板４５０、ＤＭＦ基板１４５０上の流体アリコートの輸送に関連し、ＤＭＦ基板４５０およびＤＭＦ基板１４５０に堆積または印刷することができる水和乾燥成分に関連するデータおよび処理命令を管理するように構成することができる。ＤＭＦ基板４５０の表面と透明プレート４９０の底部との間、またはＤＭＦ基板１４５０の表面と透明プレート１４９０の底部との間の間隙におけるマイクロ流体流を制御するための本開示の一実施形態と一致するソフトウェア（必要に応じて）、ならびに本開示の一実施形態と一致するハードウェアの部分は、ＧＡＵＤＩＬＡＢＳからプラットフォーム名ＯＰＥＮＤＲＯＰでhttps://gaudishop.ch/index.php/product/opendrop-v4-digital-microfluidics-platform/で入手可能である。

【0064】

実施形態では、加熱／冷却インターフェース２３６２はまた、ＤＭＦ基板４５０、ＤＭＦ基板１４５０、加熱／冷却装置１９０、およびシステム２３００の間の双方向通信のために構成することができる。一実施形態に一致して、加熱／冷却インターフェース２３６２は、ＤＭＦ基板４５０（またはＤＭＦ基板１４５０）（またはＤＭＦ基板４５０および／またはＤＭＦ基板１４５０に隣接するセンサ）および／または加熱／冷却装置１９０からデータを受信し、データを記憶装置２３２０に記憶するように構成することができる。加熱／冷却インターフェース２３６２は、加熱および冷却動作を開始および終了するために加熱／冷却装置１９０に制御命令を送信するようにさらに構成することができる。

【0065】

実施形態では、標的プローブ試薬反応モジュール２３６０は、標的特異的試薬成分セットおよび試料のアリコートのアニーリングおよびライゲーションに関連するデータおよび処理命令を管理するように構成することができる。さらにまた、実施形態では、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応モジュール２３６５は、の標的位置でのＲＣＡ－ＬＡＭＰプロセスに関連するデータおよび処理命令を管理するように構成することができる。

【0066】

本開示と一致して、ランプ／カメラインターフェース２３７２は、カメラシステム１８０とシステム２３００との間の双方向通信のために構成することができる。一実施形態によれば、ランプ／カメラインターフェース２３７２は、カメラシステム１８０からデータを受信し、そのデータを記憶装置２３２０に記憶するように構成することができる。ランプ／カメラインターフェース２３７２は、励起放射を開始および終了し、蛍光を監視するためのカメラ動作を開始および停止するために、ランプ１７０およびカメラシステム１８０に制御命令を送信するようにさらに構成することができる。

【0067】

実施形態では、励起／蛍光モジュール２３７０は、励起放射の供給および標的位置からの蛍光の監視に関連するデータおよび処理命令を管理するように構成することができる。

【0068】

システム２３００は、入力インターフェース１２７を使用してユーザによってアクセスおよび制御することができる。入力インターフェース１２７は、ユーザがデータ処理システム２３００に情報を入力するために利用可能とすることができ、例えば、キー基板、マウス、タッチスクリーン、および／または光学もしくは無線コンピュータ入力装置を含むことができる。ユーザは、入力インターフェース１２７を介して制御命令を入力して、ＤＭＦ処理システム１１０、加熱／冷却装置１９０、ランプ１７０、および／またはカメラシステム１８０の動作を制御することができる。

【0069】

システム２３００はまた、ディスプレイ１２５を介して視覚化された情報をユーザに提供することができる。例えば、ディスプレイ１２５は、コンピュータ画面を含み、グラフィカルユーザインターフェース（「ＧＵＩ」）をユーザに利用可能にすることができる。ディスプレイ１２５は、ＲＣＡ－ＬＡＭＰプロセス中にＤＭＦ基板４５０（またはＤＭＦ基板１４５０）の標的位置の画像を表示することができる。別の実施形態と一致して、ディスプレイ１２５はまた、提供された試料で識別された生物学的物品の特定の特性を示す簡略化された検査レポートまたは単純なインジケータをユーザに表示することもできる。

【0070】

図２４は、可動カートリッジアセンブリ１５０を有する装置１００の例示的な動作と一致するＤＭＦ基板４５０の上面図を示す。（可動カートリッジアセンブリ１５０を有する装置１００の動作の説明は、図２４～図３３で以下に提示されるが、当業者は、可動カートリッジアセンブリ１６０を有する装置１００の動作を直ちに理解し、認識するべきである）

【0071】

図２４は、先に図８に示したＤＭＦ基板４５０の図を示す。しかし、図２４では、試料２４１０はＤＭＦ基板４５０の表面２４５０に導入されている。本開示と一致して、上述のように、試料２４１０は、可動カートリッジアセンブリ１５０の上部から開口部３６８を通してＤＭＦ基板４５０の表面２４５０に導入されてもよい。

【0072】

本開示と一致して、試料２４１０は液体である。一実施形態では、試料２４１０は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの水と混和しない疎水性油または同様の流体を５～２０体積％添加することができる。当業者は、そのような疎水性油の５～２０体積％の添加が、加熱中の試料液滴の蒸発を最小限に抑えることができることを理解するであろう。

【0073】

図２５は、表面２４５０の図を示し、いかに試料２４１０の単一のアリコート（または一連のアリコート）が、デジタルマイクロ流体力学を使用して表面２４５０を横切って輸送され、標的位置に到達するかを示す。例えば、矢印２５１５は、第１の標的位置８１０へのアリコート２５１０の可能な経路を示す。矢印２５２５は、第２の標的位置８２０へのアリコート２５１０の可能な経路を示す。矢印２５３５は、第３の標的位置８３０へのアリコート２５１０の可能な経路を示す。矢印２５４５は、アリコート２５１０の第４の標的位置８４０への可能な経路を示す。

【0074】

図２６は、デジタルマイクロ流体力学システム２６００の断面図を提示し、矢印２５１５によるアリコート２５１０の移動を示す。図２６に示すように、電極１００５には（電気的「グランド」に対して）電荷が供給されない。しかしながら、電極２６０５には、その関連する電極コネクタ１００７を介して電荷が供給される。電極２６０５に電荷が存在すると、アリコート２５１０が電極２６０５の方向に移動する。ＤＭＦ処理システムと一致して、アリコート２５１０が電極２６０５の上にきた後、その電極を「グランド」に戻すことができ、矢印２５１５の方向の次の後続の電極には「グランド」に対する電荷が供給される。このようにして、アリコート２５１０は、図２５の表面２４５０を横切って輸送される。

【0075】

図２７は、第１の標的位置８１０内部のＤＭＦ基板４５０の断面図を含む位置１０Ａ～Ｂにおける断面図を示し、疎水性コーティング１０７０第１の標的特異的試薬成分セット８１５にわたり輸送されているアリコート２５１０も示す。すでに示したように、ＤＭＦ基板４５０は、誘電体１０６０、基板１０５０、電極１００５および電極コネクタ１００７（電極コネクタ１００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ４９２、ならびにガラス層１０９５、導電層１０９０、および疎水性コーティング１０８０を含む透明プレート４９０が示されている。さらに、加熱／冷却装置１９０は、第１の標的位置８１０の下方に位置するように示されている。

【0076】

図２７に示すように、本開示と一致して、電極１００５には（電気的「グランド」に対して）電荷が供給されない。しかしながら、電極２６０５には、その関連する電極コネクタ１００７を介して電荷が供給される。電極２６０５に電荷が存在すると、アリコート２５１０は、疎水性コーティング１０７０の第１の標的特異的試薬成分セット８１５の上で電極２６０５の方向に移動する。このようにして、アリコート２５１０が電極２６０５の上にある場合、その電極を（図２８に示す）「グランド」に戻すことができ、図２７からのアリコート２５１０は、図２７からの第１の標的特異的試薬成分セット８１５と混合して、図２８に示す第１の混合物２８１５を形成する。

【0077】

本開示と一致して、図２７および図２８に示すように、試料２４１０のアリコート２５１０は、第１の標的位置８１０に位置する予め指定された電極上に輸送されており、第１の標的特異的試薬成分セット８１５は、堆積または印刷されている（標的特異的パドロックプローブ、ライゲーション酵素、およびライゲーション反応を進行させるのに必要な緩衝成分を含む）。

【0078】

アリコート２５１０が第１の標的位置８１０に到達すると、アリコート２５１０は堆積（または印刷）された試薬８１５を吸収し、それにより、それらは液体試料２８１５の一部になる。

【0079】

本開示と一致して、加熱／冷却装置１９０は、第１の混合物２８１５が約９５℃の温度に達するまで、第１の混合物２８１５に熱２８９２を供給する。これにより、パドロックプローブは試料２４１０の核酸配列にアクセスすることができる。次いで、第１の混合物２８１５を冷却し（または冷却を可能にし）、試料の核酸配列がパドロックプローブの標的特異的相補配列と一致する場合、パドロックプローブは円形の証拠を形成する。次いで、リガーゼは、円形の証拠が永続的になるように、２つのパドロックプローブ標的特異的アームを共有結合で連結する。本開示と一致して、試料２４１０が標的遺伝物質を含有しない場合、パドロックプローブのライゲーションは起こらない。

【0080】

図２９は、表面２４５０の図を示し、いかにして水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分２９５５の単一のアリコート２９５１（または一連のアリコート２９５２、２９５３および／または２９５４）が、デジタルマイクロ流体力学を使用して表面２４５０を横切って輸送され、標的位置に到達し得るかを示す。例えば、矢印２９１６は、第１の標的位置８１０への第１のアリコート２９５１の可能な経路を示す。矢印２９２６は、第２の標的位置８２０へのアリコート２９５２の可能な経路を示す。矢印２９３６は、第３の標的位置８３０へのアリコート２９５３の可能な経路を示す。矢印２９４６は、アリコート２９５４の第４の標的位置８４０への可能な経路を示す。本開示と一致して、第１のアリコート２９５１、第２のアリコート２９５２、第３のアリコート２９５３および第４のアリコート２９５４は、１０マイクロリットル未満の水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分２９５５からなり得る。

【0081】

さらにまた、本開示と一致して、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分８５５が乾燥形態で堆積される場合、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分８５５は、図２９に示す操作の前に、ＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０でＤＭＦ基板４５０の表面２４５０に導入された流体の導入によって水和され得る。本開示と一致して、上述のように、流体は、可動カートリッジアセンブリ１５０の上部から開口部３６６を通ってＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置８５０でＤＭＦ基板４５０の表面２４５０に導入され得る。ＲＣＡ－ＬＡＭＰ成分８５５を水和させる目的のそのような流体は、試料２４１０が導入されるとき、またはその後に、導入することができる。さらに、装置１００は、まさにこの目的のために、マイクロ流体水和および輸送モジュール２３４０に結合され、その制御下にある流体リザーバを含むことができる。

【0082】

第１のアリコート２９５１、第２のアリコート２９５２、第３のアリコート２９５３、および第４のアリコート２９５４が、デジタルマイクロ流体力学システム２６００を使用して（それぞれ）第１の標的位置８１０、第２の標的位置８２０、第３の標的位置８３０、および第４の標的位置８４０に輸送された後、各アリコートは、各標的位置にすでに存在する流体と混合する。図２９に示すように、これらの以前に存在していた混合物は、第１の混合物２８１５、第２の混合物２９２５、第３の混合物２９３５、および第４の混合物２９４５を含む。

【0083】

本開示と一致して、標的位置の各々の流体混合物は、再び加熱されるが、約６５℃までしか加熱されない。これらの混合物は、図３０に示す第１の混合物３０１５となる、第１の標的位置８１０における第１のアリコート２９５１と第１の混合物２８１５との混合物；図３０に示す第２の混合物３０２５となる、第２の標的位置８２０における第２のアリコート２９５２と第２の混合物２９２５との混合物；図３０に示す第３の混合物３０３５となる、第３の標的位置８３０における第３のアリコート２９５３と第３の混合物２９３５との混合物；および図３０に示される第４の混合物３０４５となる、第４の標的位置８４０における第４のアリコート２９５４および第４の混合物２９４５の混合物を含む。この温度で、パドロックプローブ骨格に特異的なＬＡＭＰプライマー（すべての標的特異的パドロックプローブに共通）およびポリメラーゼがライゲーションされたパドロックプローブに結合し、ＬＡＭＰ反応を開始する。反応が進行するにつれて、オリゴヌクレオチド鎖置換（ＯＳＤ）プローブがＬＡＭＰ産生物のループ領域に結合する。これにより、ＯＳＤクエンチャーがプローブから除去され、ＯＳＤプローブに結合したフルオロフォアからの消光されていない蛍光が可能になる。より多くのＬＡＭＰ増幅が起こるにつれて、より多くのＬＡＭＰループ産生物が作製され、より多くのＯＳＤプローブが結合し、より多くの蛍光を生成する。

【0084】

図３０は、表面２４５０のビューを示し、蛍光３０６５が生成されたかどうかを判定するために、標的位置８１０、８２０、８３０、および８４０（それぞれ）における最終混合物３０１５、３０２５、３０３５、および３０４５が、ランプ１７０からの励起放射３０１０によってどのように照射され得るかを示す。図３０の混合物の蛍光は、カメラシステム１８０を用いてリアルタイムで監視することができ、カメラシステム１８０は適切なフィルタを含むことができる。やはり、試料２４１０が標的遺伝物質を含有しない場合、パドロックプローブのライゲーションは起こらない。したがって、ＬＡＭＰ反応は、ライゲーションパドロックプローブの非存在下で開始することができず、標的遺伝物質を含まない試料２４１０は蛍光を発することができない。

【0085】

図３１は、第１の標的位置８１０内部のＤＭＦ基板４５０の断面図を含む位置１０Ａ～Ｂにおける断面図を示し、疎水性コーティング１０７０の第１の混合物２８１５と混合するために輸送される第１のアリコート２９５１も示す。すでに示したように、ＤＭＦ基板４５０は、誘電体１０６０、基板１０５０、電極１００５および電極コネクタ１００７（電極コネクタ１００７は、次に、ＤＭＦ輸送グリッドインターフェース１５５に接続し、ＤＭＦプロセッサシステム１１０の制御下にある）をさらに含む。スペーサ４９２、ならびにガラス層１０９５、導電層１０９０、および疎水性コーティング１０８０を含む透明プレート４９０が示されている。さらに、加熱／冷却装置１９０は、第１の標的位置８１０の下方に位置するように示されている。

【0086】

図３１に示すように、本開示と一致して、電極１００５には（電気的「グランド」に対して）電荷が供給されない。しかしながら、電極２６０５には、その関連する電極コネクタ１００７を介して電荷が供給される。電極２６０５に電荷が存在すると、アリコート２９５１が電極２６０５の方向に移動して、第１の混合物２８１５と混合する。このようにして、アリコート２９５１が電極２６０５の上にある場合、その電極を（図２８に示す）「グランド」に戻すことができ、図３０からのアリコート２９５１は、図３０からの第１の混合物２８１５と混合して、図３２に示す第１の混合物３０１５を形成する。

【0087】

本開示と一致して、図３１および図３２に示すように、加熱／冷却装置１９０は、第１の混合物３０１５が約６５℃の温度に達するまで、第１の混合物３０１５に熱３２９２を供給する。図３２はまた、図３３に示すビュー３３Ａに関連する斜視図を示す。

【0088】

図３３は、ＤＭＦ基板４５０の一部の断面図を示し、蛍光３０６５が生成されるかどうかを決定するために、第１の標的位置８１０における第１の混合物３０１５がランプ１７０からの励起放射３０１０によってどのように照射され得るかを示す。

【0089】

本開示と一致して、異なるパドロックプローブが第１の標的位置８１０、第２の標的位置８２０、第３の標的位置８３０、および第４の標的位置８４０のそれぞれに位置する空間多重化により、単一の試料２４１０を異なる標的について分析することができる。同様に、異なる試料は、同じプラットフォームの異なる位置で（同じまたは異なる標的について）独立して分析することができる。当業者は、可動カートリッジアセンブリ１６０が、例えば、追加の試料を収容することができる試料の位置１８８０およびＲＣＡ－ＬＡＭＰ位置１８５０に加えてリザーバ位置を設けることを理解するであろう。この空間多重化は、デジタルマイクロ流体力学を介した試料および反応物質の輸送によって可能になる。蛍光をもたらす上記の配列特異的プローブは、本開示と一致するＬＡＭＰ検出の１つの方法である。本開示と一致する別の実施形態では、最終混合物（３０１５、３０２５、３０３５、３０４５）が形成されるときに存在するように、マグネシウム、カルシウムまたはマンガンなどの二価金属イオンを添加することができる。この代替実施形態では、これらのイオンは、ＬＡＭＰが進行するにつれて沈殿するＬＡＭＰ副産物（ピロリン酸塩）と錯体を形成することができる。沈殿物のこの濁度を測定または観察して、ＬＡＭＰ反応が起こったかどうかを判定し、それによって標的核酸の同定を確認することができる。さらに、別の実施形態では、ＬＡＭＰ検出の方法は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ、ベルベリンなどのＤＮＡインターカレート色素の使用を含むことができる。

【0090】

本開示と一致して、実施形態では、パドロックプローブ骨格は、１）配列特異的プローブ結合部位；２）Ｂ１プライマー結合部位、Ｂ２プライマー結合部位；３）Ｆ１プライマー結合部位に対する補体配列、Ｆ２プライマー結合部位に対する補体配列、およびループプライマー結合部位に対する補体配列を含み得る。

【0091】

図３４および図３５は、本明細書に開示される試料の物質の核酸同定のための方法と一致するフローチャートを示す。

【0092】

図３４および図３５は、可動カートリッジアセンブリを有するマイクロ流体力学システムを設けるステップ３４０５を含む。本開示と一致して、そのようなマイクロ流体力学システムは、可動カートリッジアセンブリ１５０および／または可動カートリッジアセンブリ１６０を有するデジタルマイクロ流体力学システム２６００を含むことができる。次に、図３４および図３５は、可動カートリッジアセンブリ上に試料を分配し（ステップ３４１０）、続いて表面上に受容された試料のアリコートを標的位置に輸送する（ステップ３４１５および／またはステップ３５１５）ことを示す。本開示と一致して、図３４および図３５は次に、試料のアリコート（例えば、試料２４１０）および第１の標的位置で第１の標的特異的試薬成分セット（例えば、成分８１５）を混合するステップ（ステップ３４２０および／またはステップ３５２０）を示す。試料のアリコートが第１の標的位置（例えば、第１の標的位置８１０）で第１の標的特異的試薬成分セットと混合された後、図３４および図３５は、混合物を約９５℃に加熱し、続いて冷却することによって、試料のアリコートと混合された第１の標的特異的試薬成分セットをアニーリングおよびライゲーションするステップ（ステップ３４４５および／またはステップ３５４５）を示す。

【0093】

本開示と一致して、図３４および図３５の方法はまた、可動カートリッジアセンブリのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分を水和させるステップ（ステップ３４５０）を含むことができる。当業者は、ステップ３４５０がステップ３４４５（またはステップ３５４５）に続く必要はないが、ステップ３４１０の前など、より早く行われ得ることを理解するであろう。

【0094】

本開示と一致して、図３４および図３５の方法は、可動カートリッジアセンブリの水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを第１の標的位置に輸送するステップ（ステップ３４５５および／またはステップ３５５５）を含む。ステップ３４６０（および／またはステップ３５６０）は、水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分のアリコートを、ステップ３４４５（および／またはステップ３５４５）によって予め設けられた、第１の標的位置に存在する混合物と混合することを含む。

【0095】

本開示と一致するステップ３４８５（および／またはステップ３５８５）は、第１の標的位置の流体を約６５℃に加熱することを備える。

【0096】

実施形態はまた、第１の標的位置に励起放射を供給すること（ステップ３４９０および／またはステップ３５９０）と、第１の標的位置からの蛍光を監視すること（ステップ３４９５および／またはステップ３５９５）とを含み得る。

【0097】

さらなる実施形態と一致して、図３５は、表面上に受容された試料の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するさらなるステップ（ステップ３５２５）を含む。図３５は、試料の第２のアリコート（例えば、試料２４１０）と、第２の標的位置での第２の標的特異的試薬成分セット（例えば、成分８２５）とを混合するステップ（ステップ３５３０）をさらに示す。試料のアリコートがそれぞれの位置でそれぞれの標的特異的試薬成分セットと混合された後、図３５は、試料の第１のアリコートと混合された第１の標的特異的試薬成分セットをアニーリングおよびライゲーションし、各混合物を約９５℃に加熱し、続いて冷却することによって、試料の第１第２と混合された第２の標的特異的試薬成分セットをアニーリングおよびライゲーションするステップ（ステップ３５４５）を示す。

【0098】

本開示と一致して、図３５の方法はまた、可動カートリッジアセンブリのＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分を水和させるステップ（ステップ３４５０）を含むことができる。当業者は、ステップ３４５０は、ステップ３５４５に続く必要はないが、ステップ３４１０の前など、より早く行われ得ることを理解するであろう。

【0099】

本開示と一致して、図３５の方法は、可動カートリッジアセンブリの水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを第２の標的位置に輸送するさらなるステップ（ステップ３５６５）を含む。ステップ３５７０は、水和されたＲＣＡ－ＬＡＭＰ反応成分の第２のアリコートを、ステップ３５４５によって予め設けられた第２の標的位置に存在する混合物と混合することを含む。

【0100】

本開示と一致するステップ３５８５は、第２の標的位置の流体を約６５℃に加熱することを備える。

【0101】

実施形態はまた、第１の標的位置に励起放射を供給すること（ステップ３５９０）と、第２の標的位置からの蛍光を監視することステップ３５９６）とを含み得る。

【0102】

当業者は、本明細書に開示される実施形態が、ＰＯＣ診断、集団スクリーニング、緊急対応状況、生物／化学的防御、食品試験、環境試験、および無重力環境での生物学的試験を含むがこれらに限定されない任意の試料タイプ（一旦精製されている）を使用して生物学的標的を同定するために、多くの環境で使用され得ることを理解するであろう。

【0103】

上記の説明は、例示を目的として提示されている。これは網羅しているものではなく、開示された正確な形態または実施形態に限定されていない。実施形態を変更および適合させることは、開示された実施形態の明細書および実施を考慮することから明白である。特定の構成要素が互いに結合されるものとして説明されてきたが、そのような構成要素は、互いに統合されてもよく、または任意の適切な方法で分配されてもよい。

【0104】

さらに、例示的な実施形態が本明細書に記載されているが、範囲は、本開示に基づく同等の要素、修正、省略、組合せ（例えば、様々な実施形態にわたる態様の）、適合および／または変更を有するありとあらゆる実施形態を含む。特許請求の範囲の要素は、特許請求の範囲で使用される文言に基づいて広く解釈されるべきであり、本明細書に記載された例または出願の審査中の例に限定されず、その例は非排他的であると解釈されるべきである。さらに、開示された方法のステップは、ステップの並べ替えおよび／またはステップの挿入もしくは削除を含む任意の方法で修正することができる。

【0105】

本開示の特徴および利点は、詳細な明細書から明らかであり、したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の真の精神および範囲の中に入るすべてのシステム、方法、および非一時的コンピュータ可読媒体を包含することが意図されている。本明細書で使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、「１つまたは複数」を意味する。同様に、複数の用語を使用することは、所与の文脈において明確でない限り、必ずしも複数あることを示すものではない。「および」または「または」などの単語は、特に他に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、本開示を検討することから多数の修正および変形が容易に生じるので、本開示を、図示および説明された正確な構造および動作に限定することは望ましくなく、したがって、すべての適切な修正および等価物に頼ることができ、それらは本開示の範囲の中に含まれる。

【0106】

他の実施形態は、本明細書の考察および本明細書に開示される実施形態の実施から明らかであろう。本明細書および実施例は、例としてのみ考慮されることが意図され、開示された実施形態の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって示される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【国際調査報告】