特表 2024-516548 腎機能低下の診断及び予測の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-16

(54)【発明の名称】腎機能低下の診断及び予測の方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240409BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20240409BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 38/55 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240409BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240409BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240409BHJP

   C07K 14/50 20060101ALN20240409BHJP

   C07K 14/525 20060101ALN20240409BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240409BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20240409BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240409BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

C07K17/00

A61P13/12

A61K38/16

A61K38/18

A61K38/19

A61K38/55

A61K38/43

A61K48/00

A61K31/7088

G01N33/53 D

G01N33/543 545A

C07K14/50

C07K14/525

C12N15/12

C07K16/24

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023561715

(86)(22)【出願日】2022-04-08

(85)【翻訳文提出日】2023-11-29

(86)【国際出願番号】 US2022071640

(87)【国際公開番号】W WO2022217283

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】63/172,541

(32)【優先日】2021-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/215,150

(32)【優先日】2021-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506199905

【氏名又は名称】ジョスリン ダイアビーティス センター インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クロレフスキー，アンジェイ

【テーマコード（参考）】

2G045

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB03

2G045CB07

2G045CB11

2G045CB12

2G045CB14

2G045CB15

2G045CB26

2G045CB30

2G045FA40

2G045FB01

2G045FB03

2G045FB05

2G045FB06

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084DA01

4C084DB52

4C084DB54

4C084DC01

4C084DC32

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA81

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA81

4H045AA10

4H045AA30

4H045AA40

4H045BA60

4H045DA01

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA50

(57)【要約】

本開示は、対象からのサンプル中の防御タンパク質（複数可）のレベル（複数可）を調べることにより、進行性腎機能低下を発症するリスクを持つヒト対象を識別する方法を提供する。本開示で識別されるタンパク質（複数可）のレベル（複数可）は、進行性腎不全及び末期腎臓病（ＥＳＫＤ）からの防御に関連付けられる。そのような防御タンパク質の例は、ＦＧＦ２０、ＡＮＧＰＴ１、及びＴＮＦＳＦ１２を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

進行性腎機能低下を発症するリスクを持つヒト対象を識別する方法であって、
それを必要とする対象からのサンプル（複数可）中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを検出することであって、前記防御タンパク質が、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、アンジオポエチン－２（ＡＮＧＰＴ１）、及び腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）からなる群から選択される、前記検出すること、
前記防御タンパク質の前記レベルを前記防御タンパク質の参照レベルと比較することであって、前記参照レベルが、非進行者ヒト対象における前記防御タンパク質のレベルである、前記比較すること
を含み、
前記非進行者の参照レベルと比較して低い前記防御タンパク質のレベルは、前記ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持つことを示すか、または、
前記参照レベルと比較して同等のまたはより高い前記防御タンパク質のレベルは、前記ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持たないことを示す、前記方法。

【請求項2】

防御タンパク質の組み合わせのレベルが検出され、
防御タンパク質の前記組み合わせが、ＦＧＦ２０及びＴＮＦＳＦ１２、ＦＧＦ２０及びＡＮＧＰＴ１、ならびにＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１からなる群から選択されるか、または、
防御タンパク質の前記組み合わせが、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及びＡＮＧＰＴ１を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

進行性腎機能低下を発症するリスクを持つヒト対象を識別する方法であって、
それを必要とする対象からのサンプル（複数可）中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを検出することであって、前記防御タンパク質が、
Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、アミロイドベータＡ４タンパク質（ＡＰＰ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、及びＡＮＧＰＴ１からなる群から選択される防御タンパク質の第１の群からの防御タンパク質、
ＤＮＡＪＣ１９及びＴＮＦＳＦ１２からなる群から選択される防御タンパク質の第２の群からの防御タンパク質、ならびに
ＦＧＦ２０からなる群から選択される、前記検出すること、
前記防御タンパク質の前記レベルを前記防御タンパク質の参照レベルと比較することであって、前記参照レベルが、非進行者ヒト対象における前記防御タンパク質のレベルである、前記比較すること
を含み、
前記参照レベルと比較して低い前記防御タンパク質のレベルは、前記ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持つことを示すか、または、
前記参照レベルと比較して同等のまたはより高い前記防御タンパク質のレベルは、前記ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持たないことを示す、前記方法。

【請求項4】

防御タンパク質の組み合わせのレベルが検出され、防御タンパク質の前記組み合わせが、ＦＧＦ２０及び第１群の防御タンパク質、ＦＧＦ２０及び第２群の防御タンパク質、第１群の防御タンパク質及び第２群の防御タンパク質、ならびに、ＦＧＦ２０、第１群の防御タンパク質、及び第２群の防御タンパク質からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記非進行者が、非糖尿病性ヒト対象である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、腎機能を改善させる療法を施与することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、前記対象に、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２０の活性断片、ＦＧＦ２０模倣物、またはＦＧＦ２０をコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、前記対象に、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ１の活性断片、ＡＮＧＰＴ１模倣物、またはＡＮＧＰＴ１をコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、前記対象に、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１２の活性断片、ＴＮＦＳＦ１２模倣物、またはＴＮＦＳＦ１２をコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、前記対象に、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＡＲＣの活性断片、ＳＰＡＲＣの模倣物、またはＳＰＡＲＣをコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ヒト対象が、腎機能異常、糖尿病、またはその両方を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ヒト対象が非糖尿病性である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記サンプルが血漿サンプルである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記防御タンパク質の前記レベルが、イムノアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分画、ＳＯＭＡｓｃａｍ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅプラットフォーム、または電気化学発光検出を使用して判定される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記イムノアッセイが、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記質量分析が、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）、オフセットトリガ型マルチプレックス正確質量高分解能絶対定量法（ＴＯＭＡＨＡＱ）、リアルタイム直接分析法質量分析（ＤＡＲＴ－ＭＳ）、または二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）である、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、リンパサンプル、尿サンプル、唾液サンプル、涙液サンプル、汗液サンプル、精液サンプル、膣サンプル、気管支サンプル、粘膜サンプル、または脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

ヒト対象の進行性腎機能低下を識別またはモニタリングするためのタンパク質アレイであって、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２及びヒトＡＮＧＰＴ１に特異的な抗体またはその抗原結合断片を含む、前記タンパク質アレイ。

【請求項20】

ヒト対象の進行性腎機能低下を識別またはモニタリングするためのタンパク質アレイであって、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２、ヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２、ヒトＳＰＡＲＣ、ヒトＣＣＬ５、ヒトＡＰＰ、ヒトＰＦ４、ヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＤＮＡＪＣ１９、ヒトＴＮＦＳＦ１２、またはそれらの組み合わせに特異的な抗体またはその抗原結合断片を含む、前記タンパク質アレイ。

【請求項21】

タンパク質バイオマーカーに特異的に結合するための複数のプローブを含むアレイであって、前記タンパク質バイオマーカーが、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２、及びヒトＡＮＧＰＴ１のうちの少なくとも１つ以上である、前記アレイ。

【請求項22】

タンパク質バイオマーカーに特異的に結合するための複数のプローブを含むアレイであって、前記タンパク質バイオマーカーが、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２、ヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２、ヒトＳＰＡＲＣ、ヒトＣＣＬ５、ヒトＡＰＰ、ヒトＰＦ４、ヒトＤＮＡＪＣ１９、及びヒトＴＮＦＳＦ１２のうちの少なくとも１つ以上である、前記アレイ。

【請求項23】

請求項１９～２２のいずれか１項に記載のタンパク質アレイを含む検査パネル。

【請求項24】

請求項２３に記載の検査パネルを含むキットまたはアッセイデバイス。

【請求項25】

ヒト対象における進行性腎機能低下の進行を阻害する方法であって、
有効量の少なくとも１つの防御タンパク質及び／または防御タンパク質の少なくとも１つのアゴニストを対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項26】

ヒト対象における腎機能低下を防止する方法であって、
有効量の少なくとも１つの防御タンパク質及び／または防御タンパク質の少なくとも１つのアゴニストを対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項27】

ヒト対象における腎機能低下を処置する方法であって、
治療有効量の少なくとも１つの防御タンパク質及び／または少なくとも１つの防御タンパク質のアゴニストを対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項28】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、及びＤＮＡＪＣ１９のうちの１つ以上である、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２０の活性断片、ＦＧＦ２０模倣物、またはＦＧＦ２０をコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳ１２の活性断片、ＴＮＦＳＦ１２模倣物、またはＴＮＦＳＦ１２をコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ１の活性断片、ＡＮＧＰＴ１模倣物、またはＡＮＧＰＴ１をコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＡＲＣの活性断片、ＳＰＡＲＣ模倣物、またはＳＰＡＲＣをコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＣＣＬ５、ＣＣＬ５の活性断片、ＣＣＬ５模倣物、またはＣＣＬ５をコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項34】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＡＰＰ、ＡＰＰの活性断片、ＡＰＰ模倣物、またはＡＰＰをコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項35】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＰＦ４、ＰＦ４の活性断片、ＰＦ４模倣物、またはＰＦ４をコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項36】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＤＮＡＪＣ１９、ＤＮＡＪＣ１９の活性断片、ＤＮＡＪＣ１９模倣物、またはＤＮＡＪＣ１９をコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項37】

前記少なくとも１つの防御タンパク質が、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２の活性断片、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２模倣物、またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２をコードする核酸、もしくはその活性断片である、請求項２８に記載の方法。

【請求項38】

前記核酸がベクター中にある、請求項２８～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ヒト対象が、進行性腎機能低下を発症するリスクを持つ進行者として以前に識別されたものである、請求項２５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

定義された期間内のヒト対象における腎機能低下のおおよそのリスクを判定する方法であって、
ａ）前記ヒト対象から生物学的サンプルを取得すること、
ｂ）前記生物学的サンプル中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを検出することであって、前記少なくとも１つの防御タンパク質が、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、及びＤＮＡＪＣ１９からなる群から選択される、前記検出すること、
ｃ）前記防御タンパク質の前記レベルに関するデータを、前記ヒト対象の臨床データ特徴（ｅＧＦＲ、ｕＡＣＲ、臨床化学検査測定値、バイタルサイン、患者人口構成など）と組み合わせること、ならびに
ｄ）機械学習または統計的モデルリングによる予後リスクスコアアルゴリズム（例えばＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｌＸ検査プラットフォーム）を使用した判定による、前記ヒト対象についての腎機能低下（ＲＤ）の前記おおよそのリスクを判定することを含む、前記方法。

【請求項41】

前記生物学的サンプル中の前記少なくとも１つの防御タンパク質の前記レベルを、非進行者コントロールレベルまたは正常アルブミン尿性コントロールレベルと比較することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記生物学的サンプルが、第１の時点及び第２の時点で前記ヒト対象から取得される、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

前記第２の時点が、前記第１の時点の約６か月後、約１２か月後、約１８か月後、約２４か月後、約３年後、約４年後、約５年後、約１０年後、または約１５年後の前記ヒト対象から取得される、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

第１の時点の前記ヒト対象から取得された前記生物学的サンプル中の前記少なくとも１つの防御タンパク質の前記レベルを、第２の時点の前記ヒト対象から取得された前記生物学的サンプルと比較することをさらに含む、請求項４２または４３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願
本願は、２０２１年４月８日に提出された米国仮出願第６３／１７２，５４１号に対する優先権を主張し、２０２１年６月２５日に提出された米国仮出願第６３／２１５，１５０号に対する優先権を主張する。前述の優先権出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

米国政府の利益
本発明は、米国立衛生研究所から与えられた助成金ＤＫ０４１５２６－２７による米国政府の援助を受けてなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。

【0003】

配列表
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表が含まれ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年４月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｊ１０３０２１＿１０９０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２４，７９８バイトである。

【0004】

慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、患者の生涯の何年にもわたる、ゆっくりとした進行性の腎機能喪失である。進行性腎機能低下の転帰は永続的腎不全であり、最終的には末期腎疾患（ＥＳＲＤ；末期腎臓病ＥＳＫＤとも呼ばれる）に至る。

【0005】

慢性腎臓病は広範囲に広がっており、高血圧または糖尿病など、患者が有する他の病態と関連していることが多い。残念ながら、腎機能低下（ＲＤ）は、疾患がかなり進行するまで検出されず、診断されないことがよくある。腎不全が進行するにつれて、腎臓の機能が著しく損なわれ、その結果、有毒なレベルの老廃物が患者の体内に蓄積する。慢性腎臓病の処置は、疾患の進行の停止または緩徐化を目的としている。慢性腎機能低下は、患者に深刻な影響を与えることがあり、最終的には透析及び腎臓移植を必要とするＥＳＫＤにつながり得る。腎機能低下のリスクを持つ患者を識別することで、早期処置が改善され、この深刻な疾患の進行が緩徐化するであろう。

【発明の概要】

【0006】

慢性腎臓病の進行性及びその重篤度を考慮すると、進行性腎機能低下のリスクを持つ患者を識別することは有益であろう。

【0007】

本開示は、末期腎臓病（ＥＳＫＤ；本明細書では末期腎疾患またはＥＳＲＤともいう）に進行する患者／対象及び防御される者を識別するためにそのレベルが使用され得る特定の防御タンパク質の発見に少なくとも部分的に基づいている。

【0008】

第１の態様において、本開示は、進行性腎機能低下を発症するリスクを持つヒト対象を識別する方法であって、それを必要とする対象からのサンプル（複数可）中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを検出するステップであって、防御タンパク質が、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、アンジオポエチン－２（ＡＮＧＰＴ１）、及び腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）からなる群から選択される、検出するステップと、防御タンパク質のレベルを防御タンパク質の参照レベルと比較するステップであって、参照レベルが、非進行者ヒト対象における防御タンパク質のレベルである、比較するステップとを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、防御タンパク質は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２である。いくつかの実施形態では、参照レベルと比較して低い防御タンパク質のレベルは、ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持つことを示すか、または、参照レベルと比較して同等のもしくはより高い防御タンパク質のレベルは、ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持たないことを示す。

【0009】

前述の態様のいくつかの実施形態では、防御タンパク質の組み合わせのレベルが検出され、防御タンパク質の組み合わせは、ＦＧＦ２０及びＴＮＦＳＦ１２、ＦＧＦ２０及びＡＮＧＰＴ１、ならびにＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１からなる群から選択されるか、または、防御タンパク質の組み合わせは、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及びＡＮＧＰＴ１を含む。特定の実施形態では、検出される防御タンパク質の組み合わせは、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２を含む。

【0010】

別の態様では、本開示は、進行性腎機能低下を発症するリスクを持つヒト対象を識別する方法であって、それを必要とする対象からのサンプル（複数可）中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを検出するステップであって、防御タンパク質が、（ｉ）酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、アミロイドベータＡ４タンパク質（ＡＰＰ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、及びＡＮＧＰＴ１からなる群から選択される防御タンパク質の第１の群からの防御タンパク質、及び／または（ｉｉ）ＤＮＡＪＣ１９及びＴＮＦＳＦ１２からなる群から選択される防御タンパク質の第２の群からの防御タンパク質、ならびにＦＧＦ２０からなる群から選択される、検出するステップと、防御タンパク質のレベルを防御タンパク質の参照レベルと比較するステップであって、参照レベルが、非進行者ヒト対象における防御タンパク質のレベルである、比較するステップとを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、防御タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上の防御タンパク質と組み合わせたＴｅｓｔｉｃａｎ－２である。いくつかの実施形態では、参照レベルと比較して低い防御タンパク質のレベルは、ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持つことを示すか、または、参照レベルと比較して同等のもしくはより高い防御タンパク質のレベルは、ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持たないことを示す。

【0011】

前述の態様のいくつかの実施形態では、防御タンパク質の組み合わせのレベルが検出され、防御タンパク質の組み合わせは、ＦＧＦ２０及び第１群の防御タンパク質、ＦＧＦ２０及び第２群の防御タンパク質、第１群の防御タンパク質及び第２群の防御タンパク質、ならびに、ＦＧＦ２０、第１群の防御タンパク質、及び第２群の防御タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態では、防御タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上の防御タンパク質と組み合わせたＴｅｓｔｉｃａｎ－２である。特定の実施形態では、非進行者は、非糖尿病性ヒト対象である。

【0012】

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、当該方法は、対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、腎機能を改善させる療法を施与することをさらに含む。一実施形態において、患者がリスクを持つものとして識別された場合、ＳＧＬＴ２阻害剤が患者に投与される。いくつかの実施形態では、療法は、ＦＧＦ２０（例えば組換えＦＧＦ２０）を含む。いくつかの実施形態では、療法は、対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、対象に、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２０の活性断片、ＦＧＦ２０模倣物、またはＦＧＦ２０をコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することを含む。他の実施形態では、療法は、ＴＮＦＳＦ１２（例えば組換えＴＮＦＳＦ１２）を含む。いくつかの実施形態では、療法は、対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、対象に、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１２の活性断片、ＴＮＦＳＦ１２模倣物、またはＴＮＦＳＦ１２をコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することを含む。さらに他の実施形態では、療法は、ＡＮＧＰＴ１（例えば組換えＡＮＧＰＴ１）を含む。いくつかの実施形態では、療法は、対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、対象に、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ１の活性断片、ＡＮＧＰＴ１模倣物、またはＡＮＧＰＴ１をコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することを含む。いくつかの実施形態では、療法は、対象が進行性腎機能低下のリスクを有するものとして識別された場合、対象に、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２の活性断片、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２模倣物、またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２をコードする核酸、もしくはその活性断片を投与することを含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、ヒト対象は、腎機能異常、糖尿病、またはその両方を有する。特定の実施形態では、糖尿病は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である。他の実施形態では、ヒト対象は非糖尿病性である。

【0014】

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。いくつかの実施形態では、防御タンパク質のレベルは、イムノアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分画、ＳＯＭＡｓｃａｍ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅプラットフォーム、または電気化学発光検出を使用して判定される。いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析である。いくつかの実施形態では、質量分析は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）、オフセットトリガ型マルチプレックス正確質量高分解能絶対定量法（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ－ｂｙ－ｏｆｆｓｅｔ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ－ｍａｓｓ，ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＴＯＭＡＨＡＱ）、リアルタイム直接分析法質量分析（ＤＡＲＴ－ＭＳ）、または二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、リンパサンプル、尿サンプル、唾液サンプル、涙液サンプル、汗液サンプル、精液サンプル、膣サンプル、気管支サンプル、粘膜サンプル、または脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルである。

【0015】

別の態様では、本開示は、ヒト対象の進行性腎機能低下を識別またはモニタリングするためのタンパク質アレイであって、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２及びヒトＡＮＧＰＴ１に特異的な抗体またはその抗原結合断片を含む、タンパク質アレイを提供する。

【0016】

さらに別の態様において本明細書で提供されるのは、ヒト対象の進行性腎機能低下を識別またはモニタリングするためのタンパク質アレイであって、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２及びヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＳＰＡＲＣ、ヒトＣＣＬ５、ヒトＡＰＰ、ヒトＰＦ４、ヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＤＮＡＪＣ１９、ヒトＴＮＦＳＦ１２、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、またはそれらの組み合わせに特異的な抗体またはその抗原結合断片を含む、タンパク質アレイである。

【0017】

別の態様において本明細書で提供されるのは、タンパク質バイオマーカーに特異的に結合するための複数のプローブを含むアレイであって、タンパク質バイオマーカーが、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２、及びヒトＡＮＧＰＴ１のうちの少なくとも１つ以上である、アレイである。

【0018】

さらに別の態様において本明細書で提供されるのは、タンパク質バイオマーカーに特異的に結合するための複数のプローブを含むアレイであって、タンパク質バイオマーカーが、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２及びヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＳＰＡＲＣ、ヒトＣＣＬ５、ヒトＡＰＰ、ヒトＰＦ４、ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２、ならびにヒトＤＮＡＪＣ１９のうちの少なくとも１つ以上である、アレイである。

【0019】

別の態様では、本開示は、本明細書で開示されるようなタンパク質アレイを含む検査パネルを提供する。

【0020】

別の態様では、本開示は、本明細書で開示されるような検査パネルを含むキットまたはアッセイデバイスを提供する。

【0021】

別の態様では、本開示は、ヒト対象における進行性腎機能低下の進行を阻害する方法を提供し、前記方法は、有効量の少なくとも１つの防御タンパク質及び／または防御タンパク質の少なくとも１つのアゴニストを対象に投与することを含む。

【0022】

別の態様では、本開示は、ヒト対象における腎機能低下を防止する方法を提供し、前記方法は、有効量の少なくとも１つの防御タンパク質のアゴニスト及び／または防御タンパク質の少なくとも１つのアゴニストを対象に投与することを含む。

【0023】

別の態様では、本開示は、ヒト対象における腎機能低下を処置する方法を提供し、前記方法は、治療有効量の少なくとも１つの防御タンパク質のアゴニスト及び／または少なくとも１つの防御タンパク質のアゴニストを対象に投与することを含む。

【0024】

別の態様において本明細書で提供されるのは、ヒト対象が進行性腎疾患を発症する増加したリスクを有するかどうかを判定する方法であって、そのリスクを持つヒト対象からサンプルを取得すること、対象サンプル中の少なくとも１つの防御タンパク質の存在を検出し、そのレベルを測定すること、防御タンパク質の対象レベルを防御タンパク質の参照レベルと比較すること、対象レベルと参照レベルとの比較に基づいて、対象が進行性腎疾患を発症する増加したリスクの増加したリスクを有するかどうかを判定することであって、参照レベルより有意に低いレベルにおける対象サンプル中の防御タンパク質の存在が、対象が進行性腎疾患を発症する増加したリスクを有することを示す、判定すること、ならびに、進行性腎疾患を発症するリスクを有するものとして識別された対象に療法を施与することを含む、方法である。当該方法は、識別された対象における防御タンパク質の増加をモニタリングすることをさらに含み得る。

【0025】

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、及びＤＮＡＪＣ１９のうちの１つ以上である。他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２０の活性断片、ＦＧＦ２０模倣物、またはＦＧＦ２０をコードする核酸、もしくはその活性断片である。様々な他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳ１２の活性断片、ＴＮＦＳＦ１２模倣物、またはＴＮＦＳＦ１２をコードする核酸、もしくはその活性断片である。特定の他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ１の活性断片、ＡＮＧＰＴ１模倣物、またはＡＮＧＰＴ１をコードする核酸、もしくはその活性断片である。他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＡＲＣの活性断片、ＳＰＡＲＣ模倣物、またはＳＰＡＲＣをコードする核酸、もしくはその活性断片である。他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＣＣＬ５、ＣＣＬ５の活性断片、ＣＣＬ５模倣物、またはＣＣＬ５をコードする核酸、もしくはその活性断片である。特定の他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＡＰＰ、ＡＰＰの活性断片、ＡＰＰ模倣物、またはＡＰＰをコードする核酸、もしくはその活性断片である。他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＰＦ４、ＰＦ４の活性断片、ＰＦ４模倣物、またはＰＦ４をコードする核酸、もしくはその活性断片である。他の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、ＤＮＡＪＣ１９、ＤＮＡＪＣ１９の活性断片、ＤＮＡＪＣ１９模倣物、またはＤＮＡＪＣ１９をコードする核酸、もしくはその活性断片である。特定の実施形態では、少なくとも１つの防御タンパク質は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２の活性断片、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２模倣物、またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２をコードする核酸、もしくはその活性断片である。

【0026】

さらに他の実施形態では、核酸はベクター中にある。他の実施形態では、ヒト対象は、進行性腎機能低下を発症するリスクを持つ進行者として以前に識別されたものである。

【0027】

別の態様では、本開示は、定義された期間内のヒト対象における腎機能低下のおおよそのリスクを判定する方法であって、ａ）ヒト対象から生物学的サンプルを取得すること、ｂ）生物学的サンプル中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを検出することであって、少なくとも１つの防御タンパク質が、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、及びＤＮＡＪＣ１９からなる群から選択される、検出すること、ｃ）防御タンパク質のレベルに関するデータを、ヒト対象の臨床データ特徴（ｅＧＦＲ、ｕＡＣＲ、臨床化学検査測定値、バイタルサイン、患者人口構成など）と組み合わせること、ならびにｄ）機械学習または統計的モデリングによる予後リスクスコアアルゴリズム（例えばＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｌＸ検査プラットフォーム）を使用した判定による、ヒト対象についての腎機能低下（ＲＤ）のおおよそのリスクを判定することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、ヒト対象からのサンプルを、防御タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させ、防御タンパク質に対する抗体の結合を測定して、防御タンパク質と抗体との間の結合のレベルを判定する。

【0028】

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、当該方法は、生物学的サンプル中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを、非進行者コントロールレベルまたは正常アルブミン尿性コントロールレベルと比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、第１の時点及び第２の時点でヒト対象から取得される。他の実施形態では、第２の時点は、第１の時点の約６か月後、約１２か月後、約１８か月後、約２４か月後、約３年後、約４年後、約５年後、約１０年後、または約１５年後のヒト対象から取得される。特定の他の実施形態では、当該方法は、第１の時点のヒト対象から取得された生物学的サンプル中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを、第２の時点のヒト対象から取得された生物学的サンプルと比較することをさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】Ａ及びＢは、ｌｏｇ１０変換後の上位３つの防御タンパク質候補であるＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及びＡＮＧＰＴ１の分布を示すヒストグラムを提供する。Ａは、複合されたＴ１Ｄ発見コホート及びＴ２Ｄ複製コホートにおけるｌｏｇ１０変換後のＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及びＡＮＧＰＴ１の分布を示すヒストグラムを提供する。Ｂは、Ｔ１Ｄ検証コホートにおけるｌｏｇ１０変換後のＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及びＡＮＧＰＴ１の分布を示すヒストグラムを提供する。

【図2】Ｔ１Ｄ及びＴ２ＤのＪｏｓｌｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ ＳｔｕｄｙコホートにおけるｅＧＦＲの傾き（ｍｌ／分／１．７３ｍ^２／年）の分布を示すグラフである。低速低下者（ｓｌｏｗ ｄｅｃｌｉｎｅｒ）は、ｅＧＦＲ損失＜３．０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２／年と定義され、高速低下者（ｆａｓｔ ｄｅｃｌｉｎｅｒ）は、ｅＧＦＲ損失≧３．０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２／年またはＥＳＫＤ進行者と定義された。各コホートにおいて、研究参加後の最初の１０年間に発症したＥＳＫＤ症例のみが本研究で考慮された。破線は、ｅＧＦＲ損失が３．０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２／年に等しいことを示す。

【図3】探索パネル及び複製パネルの研究参加者、ならびに候補防御タンパク質がどのように選択されたかを示す、研究デザインの概略表現である。

【図4A】急速進行性腎機能低下からの防御に関連する候補循環タンパク質を示すグラフを提供する。Ｔ１Ｄ（Ｎ＝２１４）及びＴ２Ｄ（Ｎ＝１４４）のＪｏｓｌｉｎコホートにおける１９種の血漿タンパク質のベースライン濃度とｅＧＦＲの傾きとの間のスピアマンの順位相関係数（ｒ_Ｓ）を示すグラフである。陰影付きのバーは、効果サイズのグラフ表現である。対応する両側Ｐ値が提供されている。^＊使用された有意性の閾値：Ｔ１Ｄ探索コホートではＦＤＲ調整済みＰ＜０．００５、Ｔ２Ｄ複製コホートでは公称Ｐ＜０．０５。

【図4B】急速進行性腎機能低下からの防御に関連する候補循環タンパク質を示すグラフを提供する。単変量モデル及び調整済みロジスティック回帰モデルでの、Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄの複合コホートにおける１９種の候補防御タンパク質及び急速進行性腎機能低下（ｅＧＦＲ損失≧３．０ｍｌ／分／年）についてのオッズ比（９５％ＣＩ）を示すグラフである。効果は、特定のタンパク質の循環ベースライン濃度の１四分位増加ごとのオッズ比（９５％ＣＩ）として示されている。最終モデルは、糖尿病の種類ごとに層別化して、ベースラインｅＧＦＲ、ＨｂＡ１ｃ及びＡＣＲに合わせて調整された。選択された８種のマーカーは赤色で示されている。分析に含まれたＰＫＭ２は、以前の公表文献に基づいている。

【図5A】８種の確認済み防御タンパク質と、臨床的共変量との関連性、及び急速進行性腎機能低下のリスクとの関連性を示すグラフを提供する。糖尿病の種類に合わせて調整された２つのコホートにおける、ＴＮＦ－Ｒ１を含む８種の候補防御タンパク質と重要な臨床的共変量との間のスピアマンの順位相関行列を示すグラフである。相関係数（ｒ_ｓ）は、効果サイズの大きさに対応する、赤（正；＃で表示）及び青（負；＃＃で表示）の色合いとして提示されている。急速進行性腎機能低下に対するｅＧＦＲ及びＨｂＡ１ｃの効果は、それぞれ、１０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２増加当たり、及び１％増加当たりで推定されている。急速進行性腎機能低下に対するＡＣＲの効果は、ｌｏｇ_１０ＡＣＲの１単位の増加として推定されている。各タンパク質の効果は、該当するタンパク質の循環ベースライン濃度の１四分位増加ごとのオッズ比（９５％ＣＩ）として示されている。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし。

【図5B】８種の確認済み防御タンパク質と、臨床的共変量との関連性、及び急速進行性腎機能低下のリスクとの関連性を示すグラフを提供する。複合Ｊｏｓｌｉｎコホートにおける階層的クラスター分析を示すグラフである。急速進行性腎機能低下に対するｅＧＦＲ及びＨｂＡ１ｃの効果は、それぞれ、１０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２増加当たり、及び１％増加当たりで推定されている。急速進行性腎機能低下に対するＡＣＲの効果は、ｌｏｇ_１０ＡＣＲの１単位の増加として推定されている。各タンパク質の効果は、該当するタンパク質の循環ベースライン濃度の１四分位増加ごとのオッズ比（９５％ＣＩ）として示されている。

【図5C】８種の確認済み防御タンパク質と、臨床的共変量との関連性、及び急速進行性腎機能低下のリスクとの関連性を示すグラフを提供する。有意性基準α＝０．１を使用して共変量の後向き選択から選択された共変量のオッズ比（９５％ＣＩ）を示すグラフである。急速進行性腎機能低下に対するｅＧＦＲ及びＨｂＡ１ｃの効果は、それぞれ、１０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２増加当たり、及び１％増加当たりで推定されている。急速進行性腎機能低下に対するＡＣＲの効果は、ｌｏｇ_１０ＡＣＲの１単位の増加として推定されている。各タンパク質の効果は、該当するタンパク質の循環ベースライン濃度の１四分位増加ごとのオッズ比（９５％ＣＩ）として示されている。

【図6】糖尿病の種類に合わせて調整されたＡＣＲと１１種の候補防御タンパク質の間のスピアマンの順位相関行列のグラフである。相関係数（ｒ_ｓ）は、効果サイズの大きさに対応する、赤（正）及び青（負；＃で表示）の色合いとして提示されている。

【図7A】急速進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行のリスクに対する防御タンパク質（ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１）の複合効果を示すグラフを提供する。両種類の糖尿病及び腎機能（「腎臓機能」ともいう）の異常を有する探索及び複製の複合コホート（Ｎ＝３５８）における離散共変量とみなされる防御指数に応じた、急速進行性腎機能低下のオッズ比を示すグラフである。防御指数：各タンパク質の中央値を超える値は１としてスコア付けし、中央値未満の値は０としてスコア付けした；これらのスコアを合計することにより、対象は、０（中央値未満のすべてのタンパク質）から３（中央値を超えるすべてのタンパク質）の間で変動する総合防御指数を有し得る。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし。

【図7B】急速進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行のリスクに対する防御タンパク質（ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１）の複合効果を示すグラフを提供する。探索及び複製の複合コホートにおける防御指数の離散値に応じた、ＥＳＫＤの累積発生率（％）を示すグラフである。防御指数：各タンパク質の中央値を超える値は１としてスコア付けし、中央値未満の値は０としてスコア付けした；これらのスコアを合計することにより、対象は、０（中央値未満のすべてのタンパク質）から３（中央値を超えるすべてのタンパク質）の間で変動する総合防御指数を有し得る。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし。

【図7C】急速進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行のリスクに対する防御タンパク質（ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１）の複合効果を示すグラフを提供する。正常な腎機能を有するＴ１Ｄ対象の検証コホート（Ｎ＝２９４）における離散共変量とみなされる防御指数に応じた、急速進行性腎機能低下のオッズ比を示すグラフである。防御指数：各タンパク質の中央値を超える値は１としてスコア付けし、中央値未満の値は０としてスコア付けした；これらのスコアを合計することにより、対象は、０（中央値未満のすべてのタンパク質）から３（中央値を超えるすべてのタンパク質）の間で変動する総合防御指数を有し得る。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし。

【図7D】急速進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行のリスクに対する防御タンパク質（ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１）の複合効果を示すグラフを提供する。検証コホートにおける防御指数の離散値に応じた、ＥＳＫＤの累積発生率（％）を示すグラフである。防御指数：各タンパク質の中央値を超える値は１としてスコア付けし、中央値未満の値は０としてスコア付けした；これらのスコアを合計することにより、対象は、０（中央値未満のすべてのタンパク質）から３（中央値を超えるすべてのタンパク質）の間で変動する総合防御指数を有し得る。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし。

【図8】ＦＧＦ２０トリプシンペプチドＧＧＰＧＡＡＱＬＡＨＬＨＧＩＬＲ（配列番号９）（アミノ酸５０～６５）の抽出イオンクロマトグラムである。組換えＦＧＦ２０の存在下（上）または非存在下（下）でのＦＧＦ２０ ＳＯＭＡｍｅｒ血漿プルダウン。

【図9】非糖尿病者と比較した、非進行者及び進行者に関する、複合Ｊｏｓｌｉｎコホートにおける例示的な防御タンパク質ＡＮＧＰＴ１（左パネル）、ＴＮＦＳＦ１２（中央パネル）、ＦＧＦ２０（右パネル）の血漿濃度を示すグラフを提供する。バーは、平均±標準偏差を示す。一元配置ＡＮＯＶＡとダンの多重比較検定。^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし。

【図10】非ＥＳＫＤ進行者とＥＳＫＤ進行者との間のＴｅｓｔｉｃａｎ－２（ＳＰＯＣＫ２）血漿レベル（ＲＦＵ）の比較のデータを示すヒストグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0030】

Ｉ．定義
本発明を詳細に記述する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供する。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0031】

「対象」または「患者」という用語は、本明細書では同義に使用され、ヒトを指す。

【0032】

本明細書で使用される「サンプル」という用語は、対象から取得された血漿、血清、細胞、または組織を指す。組織または細胞サンプルの供給源は、固形組織（新鮮な、凍結された、及び／または保存された臓器もしくは組織サンプルまたは生検もしくは吸引物からのもの）、全血もしくは任意の血液成分、または血清、血漿、尿、唾液、汗液、もしくは滑液などの体液であり得る。一実施形態において、サンプルは、ヒト対象から取得された血漿サンプルである。

【0033】

本明細書で使用されるバイオマーカーの「レベル」または「量」という用語は、バイオマーカーの測定可能な量、例えばバイオマーカーのタンパク質レベルを指す。この量は、（ａ）単位体積もしくは細胞当たりの分子、モルもしくは重量で測定される絶対量、または（ｂ）例えば濃度測定分析によって測定される相対量のいずれでもよい。

【0034】

本明細書で使用される場合、「既知の標準レベル」、「参照レベル」または「コントロールレベル」という用語は、同義に使用され、患者のサンプルに由来するバイオマーカーレベルを比較するために使用されるバイオマーカーの許容されるまたは既定のレベルを指す。一実施形態において、特定のバイオマーカー（防御タンパク質）の参照レベルと比較した場合、参照レベルからの偏差は、概して、病状または将来の病状の改善または悪化のいずれかを示す。一実施形態において、防御タンパク質の参照レベルと比較した場合、参照レベルからの偏差は、概して、対象における疾患進行の可能性の増加または減少を示す。参照レベルは、健康な（例えば、非糖尿病性）個人、またはＥＳＫＤの素因を有することが知られている個人から採取されたサンプルから生成され得る。一実施形態において、本明細書に記載される防御タンパク質の参照レベルは、非糖尿病性対象におけるタンパク質のレベルである。

【0035】

本明細書で使用される場合、「同等のレベル」という用語は、別のバイオマーカーのレベル、例えばコントロールレベルと実質的に類似している、あるバイオマーカーのレベルを指す。一実施形態において、バイオマーカーのレベルがコントロールバイオマーカーレベルの１標準偏差以内にある場合、２つのバイオマーカーは同等のレベルを有する。別の実施形態では、バイオマーカーのレベルがコントロールバイオマーカーレベルのレベルの２０％以下である場合、２つのバイオマーカーは同等のレベルを有する。

【0036】

本明細書で使用される場合、「推定糸球体濾過率」または「ｅＧＦＲ」という用語は、腎機能を推定するための手段を指す。一実施形態において、ｅＧＦＲは、血清クレアチニンレベルの測定に基づいて判定され得る。別の実施形態では、ｅＧＦＲは、血清シスタチンＣレベルの測定に基づいて判定され得る。さらに別の実施形態では、ｅＧＦＲは、ＣＫＤ－ＥＰＩクレアチニン方程式を使用して判定され得る。

【0037】

本明細書で使用される場合、「慢性腎臓病に関連する障害」または「慢性腎疾患に関連する障害」という用語は、経時的に腎臓の損傷を引き起こし得る腎機能異常に関連する疾患または病態を指す。慢性腎臓病に関連する障害の例は、１型糖尿病、２型糖尿病、高血圧、糸球体腎炎、間質性腎炎、多嚢胞性腎臓病、尿路の長期閉塞（例えば、前立腺肥大、腎臓結石、及び一部のがんなどの病態による）、膀胱尿管逆流、及び再発性腎臓感染症を含むが、これらに限定されない。慢性腎臓病及びそのステージ（ＣＫＤ １～５）は、通常、腎臓損傷（アルブミン尿）または推定糸球体濾過率の異常（腎臓損傷の有無にかかわらず、ＧＦＲ＜６０［ｍｌ／分／１．７３ｍ^２］）のいずれかの存在に基づくなど、相応に特性評価または分類され得る。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ＥＳＫＤ進行者」、「進行者」または「急速進行者」という用語は、ＥＳＫＤ（本明細書ではＥＳＲＤともいいう）を発症するリスクが高いものとして識別されている、慢性腎臓病に関連する障害を有する対象を指す。ＥＳＫＤ進行者は、対象をＥＳＫＤ発症リスクにさらし得る慢性腎臓病に関連する障害を有するが、この用語は、慢性腎臓病に関連する障害に通常関連付けられるリスクを超えて上昇したリスクが確認されている対象を含むことを意図する。一実施形態において、進行者は、非進行者コントロールレベルまたは正常アルブミン尿性コントロールよりも統計的に有意に低い、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、及び／またはＤＮＡＪＣ１９のうちのいずれか１つ以上のレベルを有し、したがって、ＥＳＫＤを発症する増加したリスクを有する。別の実施形態では、進行者は、非進行者コントロールレベルまたは正常アルブミン尿性コントロールよりも統計的に有意に低い、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及び／またはＡＮＧＰＴ１のうちのいずれか１つ以上のレベルを有し、したがって、ＥＳＫＤを発症する増加したリスクを有する。

【0039】

本明細書で使用される場合、「非進行者」という用語は、ＥＳＫＤを発症する低減したリスクを有する、慢性腎臓病に関連する障害を有する対象を指す。一実施形態において、非進行者は、ＣＫＤ（慢性腎臓病）のステージ１または２にあるが、防御タンパク質のレベルが（例えば、正常アルブミン尿性コントロールと比較して）上昇しているまたは同等であることに少なくとも部分的に起因して、ＥＳＫＤに進行するリスクがより低い、慢性腎臓病に関連する障害を有する対象である。一実施形態において、非進行者は、進行者コントロールレベルよりも統計的に有意に高い、または正常アルブミン尿性コントロールよりも高いもしくはそれと同等である、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、及び／またはＤＮＡＪＣ１９のうちのいずれか１つ以上のレベルを有する対象と定義される。別の実施形態では、非進行者は、進行者コントロールレベルよりも統計的に有意に高い、または正常アルブミン尿性コントロールよりも高いもしくはそれと同等である、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及び／またはＡＮＧＰＴ１のうちのいずれか１つ以上のレベルを有する対象と定義される。別の実施形態では、非進行者は、進行者コントロールレベルよりも統計的に有意に高い、または正常アルブミン尿性コントロールよりも高いもしくはそれと同等である、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２のレベルを有する対象と定義される。一実施形態において、非進行者は、非糖尿病性ヒト対象である。非糖尿病性とは、糖尿病（ＩＩ型）と診断されていない人物を指す。

【0040】

本明細書で使用される場合、「防御タンパク質」という用語は、ヒト対象におけるレベルが、腎機能低下、及び／またはＥＳＫＤに進行するリスクの増加もしくは減少と関連付けられる、タンパク質を指す。本明細書で使用される防御タンパク質は、その存在またはレベルの上昇が進行性腎機能低下からの明らかな防御をもたらすタンパク質である。防御タンパク質の例としては、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２、及び／またはＤＮＡＪＣ１９が挙げられる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「腎機能低下（ｒｅｎａｌ ｄｅｃｌｉｎｅ）」または「ＲＤ」という用語（本明細書では「腎臓機能低下（ｋｉｄｎｅｙ ｄｅｃｌｉｎｅ）」（ＫＤ）ともいう）は、腎機能異常に関連する病態を指す。一実施形態において、腎機能低下は、推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の少なくとも－３ｍｌ／分／年の変化（すなわち、ｅＧＦＲ損失≧３．０ｍｌ／分／年）と定義される。一実施形態において、腎機能低下は、推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の少なくとも－５ｍｌ／分／年の変化（すなわち、ｅＧＦＲ損失≧５．０ｍｌ／分／年）と定義される。一実施形態において、腎機能低下は、ｅＧＦＲにおけるベースラインからの（少なくとも３か月にわたって確認された）≧４０％の持続的な低下と定義される。

【0042】

「治療有効量」または「有効量」という用語は、生きている対象に投与された場合に、生きている対象に対する所望の効果を達成する量を指す。正確な量は処置の目的に依存し、当業者が公知の技術を使用することで確認可能である。当技術分野では公知のように、全身送達か局所送達か、年齢、体重、全体的健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び病態の重篤度に合わせた調整が必要な場合があり、これは当業者が定型的な実験を用いることで確認可能である。例えば、生きている対象に投与される、本明細書に記載される薬剤の有効量は、ＥＳＫＤを防止及び／または処置する量である。例えば、腎保護剤の場合、治療有効量は、慢性腎臓病のベースラインの臨床的に観察可能な徴候及び症状と比較して、観察可能な治療的有用性をもたらすことが示されている量であり得る。

【0043】

本明細書で使用する場合、「腎保護剤」という用語は、中程度に増加したアルブミン尿または糖尿病性腎症を有する対象における腎症の進行を防止し得るまたは遅延させ得る薬剤を指す。腎保護剤の例は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及びアンジオテンシン－ＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、腎保護剤は、本明細書に記載される防御タンパク質、またはその均等物、例えば活性断片である。

【0044】

ＩＩ．防御タンパク質
本開示は、ＥＳＫＤ（本明細書ではＥＳＲＤともいう）に進行する対象／患者及び防御される者を識別するためにタンパク質レベルが使用され得る特定のバイオマーカーの発見に少なくとも部分的に基づいている。

【0045】

本明細書では、ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持つかどうかを識別する方法が開示される。当該方法は、それを必要とする対象からのサンプル（複数可）中の少なくとも１つの防御タンパク質のレベルを検出することを含む。酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、アミロイドベータＡ４タンパク質（ＡＰＰ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、ＤＮＡＪＣ１９、アンジオポエチン－２（ＡＮＧＰＴ１）、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２（ＳＰＯＣＫ２）は、本明細書における研究により、そのレベルが腎臓病の非進行と相関する防御タンパク質として識別された。これらのレベルは、進行性疾患を示す、これらのタンパク質のレベルがより低い患者よりも高い。

【0046】

対象からの１つまたは複数のサンプルにおける１つまたは複数の防御タンパク質のレベルは、患者が進行性腎機能低下そして最終的にＥＳＫＤ（本明細書ではＥＳＲＤともいう）を発症するリスクを判定するために、防御タンパク質の参照レベルを持つ１つまたは複数の防御タンパク質のレベルと比較され得る。

【0047】

本明細書で開示される方法では、防御タンパク質の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または８つすべてのレベルが使用され得る。

【0048】

一実施形態において、患者が進行性腎機能低下を発症または継続するリスクを判定するために、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、アンジオポエチン－２（ＡＮＧＰＴ１）、及び腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）の各々、またはそれらの組み合わせのレベルが参照レベルと比較される。一実施形態において、患者が進行性腎機能低下を発症または継続するリスクを判定するために、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２のレベルが参照レベルと比較される。別の実施形態では、ＦＧＦ２０及びＴＮＦＳＦ１２；ＦＧＦ２０及びＡＮＧＰＴ１；ＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１；ならびにＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、及びＡＮＧＰＴ１、ＦＧＦ２０及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２；ＡＮＧＰＴ１及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２；ＴＮＦＳＦ１２及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２；ＦＧＦ２０、ＡＮＧＰＴ１、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２；ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２；ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２；またはＦＧＦ２０、ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２の各々のレベルが、本明細書で開示される方法において使用される。

【0049】

一実施形態において、患者が進行性腎機能低下を発症または継続するリスクを判定するために、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）；ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４及びＡＮＧＰＴ１を含む防御タンパク質の第１の群（第１群の防御タンパク質）からの防御タンパク質；ＤＮＡＪＣ１９及びＴＮＦＳＦ１２を含む防御タンパク質の第２の群（第２群の防御タンパク質）からの防御タンパク質の各々、またはそれらの組み合わせ、例えば、第１群及び第２群の防御タンパク質、またはＦＧＦ２０及び第１群もしくは第２群のいずれかの防御タンパク質のレベルが参照レベルと比較される。

【0050】

本明細書で識別される９種の防御タンパク質について記載する表を以下に提供する。

【表1】

【0051】

対象からのサンプル中で防御タンパク質レベルが検出されたら、そのレベルが進行者プロファイル（リスク）または非進行者（防御）と一致するかどうかを判定するために、そのレベルが参照レベルと比較される。

【0052】

進行性腎機能低下の発生は、患者が正常な腎機能を有し、それがほぼ直線的にＥＳＫＤに進行するときに始まるが、推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の傾きとして表される低下速度は、－７２～３．０ｍｌ／分／年の範囲で個人ごとに異なる。

【0053】

一実施形態において、防御タンパク質の参照レベルは、非糖尿病性ヒト対象のレベルであり、参照レベルと比較して低い防御タンパク質のレベルは、ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持つことを示す。あるいは、参照レベルと比較して同等のまたはより高い防御タンパク質のレベルは、ヒト対象が進行性腎機能低下を発症するリスクを持たないことを示す。

【0054】

一実施形態において、検査用のサンプルを提供するヒト対象は、糖尿病または高血圧など、進行性腎機能低下に関連する病態を有する対象である。別の実施形態では、対象は、腎機能異常を有する場合があり、腎破壊を軽減するために、さらなる腎機能低下のリスクを判定することが望ましい。一実施形態において、対象は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を有する。

【0055】

糖尿病を有する対象については、過去２０年間にわたるＤＫＤの防止及び処置のための血糖コントロールの改善及び腎保護療法の進歩にもかかわらず、慢性腎臓病及びＥＳＫＤのリスクは依然として比較的高い（Ｒｏｓｏｌｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２２：５４５－５５３（２０１１）、ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ３０５：２５３２－２５３９（２０１１））。３０００名を超える糖尿病対象の縦断的研究であるＪｏｓｌｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｔｕｄｙからの所見は、進行性腎機能低下が、ＥＳＫＤへの進行の根底にあるＤＫＤの主要な臨床兆候であることを実証している（Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：２２８５－２２９３（２００３）、Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １８：１３５３－１３６１（２００７）、Ｋｒｏｌｅｗｓｋｉ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ３８，９５４－９６２（２０１５）、Ｋｒｏｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ９１：１３００－１３１１（２０１７））。

【0056】

血糖コントロールが改善され、ほぼ例外なく実施されている腎保護療法が進歩しているにもかかわらず、糖尿病患者におけるＥＳＫＤの発生率は増加し続けている。

【0057】

糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）と、その重要な臨床兆候であり、末期腎臓病（ＥＳＫＤ；本明細書ではＥＳＲＤともいう）につながる進行性腎機能低下とは、糖尿病を有する対象にとって大きな健康上の負担である。進行性腎機能低下の根底にある疾患プロセスには、進行性腎機能低下を防ぐ因子／経路だけでなく、この転帰のリスクを増加させる因子／経路も含まれる。７～１５年間追跡された長期にわたる１型及び２型糖尿病ならびに様々なステージのＤＫＤを有する３つの独立コホートの対象からの循環タンパク質のノンターゲットプロテオミクスプロファイリングを使用することで、進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行からの防御に関連付けられる、上昇した３つの血漿タンパク質、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０；ＯＲ＝０．６９；９５％ＣＩ：０．５４－０．８８）、アンジオポエチン－１（ＡＮＧＰＴ１；ＯＲ＝０．７２；９５％ＣＩ：０．５７－０．９１）、及び腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２；ＯＲ＝０．７５；９５％ＣＩ：０．５９－０．９５）が識別された。これら３つの防御タンパク質の複合効果は、フォローアップの開始時にこれらのタンパク質の濃度が低い（中央値を下回る）対象ではＥＳＫＤの累積リスクが高かったのに対し、３つすべてのタンパク質のベースライン濃度が高い（中央値を上回る）対象におけるＥＳＫＤの累積リスクが非常に低かったことにより、十分に実証された。この防御効果は、循環炎症性タンパク質及び重要な臨床的共変量とは無関係に強く現れ、正常な腎機能を持つ糖尿病対象の独立コホートで確認された。３つの防御タンパク質は、ＥＳＫＤへの進行のリスクに応じて糖尿病対象を層別化するためのバイオマーカーとして役立ち得る。

【0058】

一実施形態において、対象からの検査サンプルは血漿サンプルである。１つ以上の防御タンパク質の検査には複数のサンプルが使用され得る。あるいは、１つのサンプルを使用して１つ以上の防御タンパク質を検査することもできる。

【0059】

防御タンパク質の検出は、標準的なイムノアッセイに従って判定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたは電気化学発光検出（例えばＭｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））。

【0060】

本明細書には、ヒト対象の進行性腎機能低下を識別またはモニタリングするためのタンパク質アレイも含まれる。一実施形態において、前記タンパク質アレイは、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２、ヒトＡＮＧＰＴ１、及び／またはヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２に特異的な抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0061】

別の実施形態では、本開示は、ヒト対象の進行性腎機能低下を識別またはモニタリングするためのタンパク質アレイを提供し、前記タンパク質アレイは、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２及びヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＳＰＡＲＣ、ヒトＣＣＬ５、ヒトＡＰＰ、ヒトＰＦ４、ヒトＤＮＡＪＣ１９、ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２、またはそれらの組み合わせに特異的な抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0062】

一実施形態において、アレイは、タンパク質バイオマーカーに特異的に結合するための複数のプローブを含み、当該タンパク質バイオマーカーは、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２、及びヒトＡＮＧＰＴ１のうちの少なくとも１つ以上である。

【0063】

一実施形態において、アレイは、タンパク質バイオマーカーに特異的に結合するための複数のプローブを含み、当該タンパク質バイオマーカーは、ヒトＦＧＦ２０、ヒトＴＮＦＳＦ１２、ヒトＡＮＧＰＴ１、ヒトＳＰＡＲＣ、ヒトＣＣＬ５、ヒトＡＰＰ、ヒトＰＦ４、ヒトＤＮＡＪＣ１９、ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちの少なくとも１つ以上である。

【0064】

本明細書に記載される研究では、サンプル中のレベルに応じて、ＥＳＫＤを発症する、もしくはＥＳＫＤにつながる継続的な進行性腎臓病を有する可能性が高い患者、またはＥＳＫＤへの進行から防御される患者を識別するために使用され得る、９つの防御タンパク質（すなわち、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、アミロイドベータＡ４タンパク質（ＡＰＰ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、ＤＮＡＪＣ１９、アンジオポエチン－２（ＡＮＧＰＴ１）、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２が識別される。

【0065】

ＳＰＡＲＣ
本開示の防御タンパク質の１つは、酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）である。

【0066】

「酸性システインリッチ分泌タンパク質」遺伝子、または「ＳＰＡＲＣ」遺伝子という用語は、「オステオネクチン」、「ＯＮＴ」、「基底膜タンパク質４０」、「ＢＭ－４０」及び「ＯＩ１７」としても知られ、形態形成、リモデリング、及び創傷修復が行われている組織において高レベルで発現される遺伝子を指す。ＳＰＡＲＣ遺伝子は、ＳＰＡＲＣと呼ばれるタンパク質をコードする。ＳＰＡＲＣは、モジュール構成が系統発生的に保存されている３２～３５ｋＤのＣａ２＋結合マトリクス細胞糖タンパク質である（Ｍａｒｔｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ． Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ．２１２：１２４－１３３）。ＳＰＡＲＣは、細胞外空間のＩ型コラーゲンに結合する（Ｍｅｎｄｏｚｏ－Ｌｏｎｄｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１５ Ｊｕｎ ４；９６（６）：９７９－９８５）。生化学的研究は、ＳＰＡＲＣが、ネットワーク形成コラーゲンＩＶとのＣａ２＋依存性相互作用を含め、いくつかのコラーゲン性及び非コラーゲン性ＥＣＭ分子に結合することを示している。ＳＰＡＲＣタンパク質は、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｎ様ドメイン、Ｋａｚａｌ様ドメイン、及びＥＦハンドドメインの３つのドメインを含み、２つのカルシウム結合部位を含む。Ｆｏｌｌｉｓｔｉｎ様酸性ドメインは、低い親和性で５～８つのＣａ^２＋に結合し、ＥＦハンドループは、高い親和性でＣａ^２＋イオンに結合する。骨において、ＳＰＡＲＣは骨芽細胞によって発現される。ＳＰＡＲＣヌルマウスは、骨形成の欠陥により進行性骨粗鬆症を発症する（Ｄｅｌａｎｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０５：９１５－９２３）。

【0067】

ＳＰＡＲＣ多型、特に３’ＵＴＲの多型は、骨におけるＳＰＡＲＣの蓄積に影響を及ぼし、骨形成のばらつき、骨質量のばらつきに関連しており、成人における骨粗鬆症の発病に関与している可能性がある（Ｄｅｌａｎｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ． Ｉｎｔ．２００８；１９：９６９－９７８、Ｄｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．２０１５；３０：７２３－７３２）。ＳＰＡＲＣのホモ接合性変異は、ヒトにおける重篤な骨脆弱性を引き起こす可能性がある（Ｍｅｎｄｏｚｏ－Ｌｏｎｄｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１５ Ｊｕｎ ４；９６（６）：９７９－９８５）。

【0068】

ＳＰＡＲＣ遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ３８またはＧＲＣｈ３８ともいう）で確認することができる。ＳＰＡＲＣ遺伝子を保有するヒト第５染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第５染色体のヌクレオチド１５１，６６１，０９６～１５１，６８６，９７５に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００５．１０でも確認することができる。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコードする３つの転写物バリアントが見出されている。ＳＰＡＲＣの例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３１１８．４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＰＡＲＣ転写物バリアント１）で確認することができる。ヒトＳＰＡＲＣ転写物バリアント１のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡＡＰＱＱＥＡＬＰＤＥＴＥＶＶＥＥＴＶＡＥＶＴＥＶＳＶＧＡＮＰＶＱＶＥＶＧＥＦＤＤＧＡＥＥＴＥＥＥＶＶＡＥＮＰＣＱＮＨＨＣＫＨＧＫＶＣＥＬＤＥＮＮＴＰＭＣＶＣＱＤＰＴＳＣＰＡＰＩＧＥＦＥＫＶＣＳＮＤＮＫＴＦＤＳＳＣＨＦＦＡＴＫＣＴＬＥＧＴＫＫＧＨＫＬＨＬＤＹＩＧＰＣＫＹＩＰＰＣＬＤＳＥＬＴＥＦＰＬＲＭＲＤＷＬＫＮＶＬＶＴＬＹＥＲＤＥＤＮＮＬＬＴＥＫＱＫＬＲＶＫＫＩＨＥＮＥＫＲＬＥＡＧＤＨＰＶＥＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹＮＭＹＩＦＰＶＨＷＱＦＧＱＬＤＱＨＰＩＤＧＹＬＳＨＴＥＬＡＰＬＲＡＰＬＩＰＭＥＨＣＴＴＲＦＦＥＴＣＤＬＤＮＤＫＹＩＡＬＤＥＷＡＧＣＦＧＩＫＱＫＤＩＤＫＤＬＶＩ（配列番号１）

【0069】

ＳＰＡＲＣ配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｐ０９４８６）で確認することができる。ＳＰＡＲＣに関する追加情報は、例えば、遺伝子６６７８に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＳＰＡＲＣという用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿００３１１８．４という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＳＰＡＲＣ遺伝子のバリエーションも指す。

【0070】

ＣＣＬ５
本開示の防御タンパク質の１つは、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）である。

【0071】

「Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド５」遺伝子、または「ＣＣＬ５」遺伝子という用語は、「ＲＡＮＴＥＳ」、「ＳＣＹＡ５」、「ＳＩＳｄ」、「ＥｏＣＰ」及び「Ｄ１７Ｓ１３６Ｅ」としても知られ、白血球を炎症部位に動員する際に活発に機能する、Ｔ細胞、好酸球、及び好塩基球の走化因子であるＣＣＬ５タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＣＣＬ５タンパク質は、単一のドメインを持つ８ｋＤタンパク質である。ＣＣＬ５は、血液単球、メモリーＴヘルパー細胞、及び好酸球の走化性因子である。ＣＣＬ５は、好塩基球からのヒスタミンの放出を引き起こし、好酸球を活性化し、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、及びＣＣＲ５を含むいくつかのケモカイン受容体を活性化することが知られている。ＣＣＬ５及びその同族受容体の１つであるＣＣＲ５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生される主要なＨＩＶ抑制因子の１つとして最もよく知られており、組換えＣＣＬ５タンパク質は、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の様々な株の用量依存性阻害を誘導する。ＣＣＬ５は、高濃度ではチロシンキナーゼ経路を通してＴ細胞を活性化し（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：３０９－３１４（１９９８）、Ｂａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１７２７－１７３０（１９９５））、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生をもたらし（Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：１１７３－１１８２（２０００））、樹状細胞の成熟を誘導すると考えられている（Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：１６３７－１６４３（２００１））。滑液ＣＤ８＋Ｔ細胞では高レベルのＣＣＬ５タンパク質が示されており、Ｔ細胞受容体トリガリングによって滑液ＣＤ８＋Ｔ細胞からＣＣＬ５タンパク質が急速に放出される（Ｐｈａｒｏａｈ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ８（２）：Ｒ５０（２００６））。ＣＣＬ５は、がん細胞に直接シグナルを伝達して、生存、浸潤、及び幹細胞の再生を促進する。乳癌では、ＭＳＣによって発現されたＣＣＬ５が乳癌細胞に作用して、浸潤及び転移を促進する（Ｋａｒｎｏｕｂ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４４９（７１６２）：５５７－６３（２００７））。

【0072】

ＣＣＬ５遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。ＣＣＬ５遺伝子は、第１７染色体のｑ腕にクラスターを形成するいくつかのケモカイン遺伝子のうちの１つである。ＣＣＬ５遺伝子を保有するヒト第１７染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第１７染色体のヌクレオチド３５８７１４９１～３５８８０３６０に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１７．１１でも確認することができる。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコードする４つの転写物バリアントが見出されている。ＣＣＬ５の例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２９８５．３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＣＣＬ５転写物バリアント１）で確認することができる。ヒトＣＣＬ５転写物バリアント１のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＫＶＳＡＡＡＬＡＶＩＬＩＡＴＡＬＣＡＰＡＳＡＳＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ（配列番号２）

【0073】

ＣＣＬ５配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｐ１３５０１）で確認することができる。ＣＣＬ５に関する追加情報は、例えば、遺伝子６３５２に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＣＣＬ５という用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿００２９８５．３という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＣＣＬ５遺伝子のバリエーションも指す。

【0074】

ＡＰＰ
別の本開示の防御タンパク質は、アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）である。

【0075】

「アミロイドベータ前駆体タンパク質」遺伝子、または「ＡＰＰ」遺伝子という用語は、「ＡＢＰＰ」、「Ａ４」、「ＡＤ１」、「ペプチダーゼネキシン－ＩＩ」及び「ＰｒｅＡ４」としても知られ、アミロイドベータＡ４タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＡＰＰは、短い細胞質尾部と、そのＥ１及びＥ２ドメインに銅結合部位を含む大きな細胞外ドメインとを有するＩ型膜貫通タンパク質である（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ３７（３）：２６９－７９（２００８）、Ｄａｈｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４１６（３）：４３８－５２（２０１２））。ＡＰＰタンパク質は、アルツハイマー病の発病において中心的な役割を果たす（Ｍａｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ １２９（Ｐｔ １１）：２８２３－３９（２００６））。ＡＰＰは、細胞表面受容体としての細胞間シナプス接着、神経突起成長、ニューロン接着、軸索形成、シナプス形成、細胞移動の促進、及びタンパク質間相互作用を介した転写制御を含むシナプスプロセスにも不可欠である（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ２（２）：ａ００６２８８（２０１２））。Ａｐｐは、銅イオンの還元を通じて銅の恒常性／酸化ストレスに関与している。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、銅金属酸化ＡＰＰがニューロンの死を直接誘導するか、またはＣｕ^２＋媒介性の低密度リポタンパク質の酸化によって強化される（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９（２１）：９１７０－９（１９９９）、Ｍａｙｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（４７）：４４６７０－６（２００２））。ＡＰＰノックアウトマウスは認知障害を示し、シナプス前またはシナプス後コンパートメントのいずれかにおけるＡＰＬＰ２ノックアウトバックグラウンドでのＡＰＰの不活性化により、神経筋シナプスの欠陥が引き起こされた（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ２（２）：ａ００６２８８（２０１２））。

【0076】

ＡＰＰ遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。ＡＰＰ遺伝子を保有するヒト第２１染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第２１染色体のヌクレオチド２５８８０５５０～２６１７１１２８に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００２１．９でも確認することができる。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコードする複数の転写物バリアントが見出されている。ＡＰＰの例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４８４．４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＰＰ転写物バリアント１）で確認することができる。ヒトＡＰＰ転写物バリアント１のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡＬＥＶＰＴＤＧＮＡＧＬＬＡＥＰＱＩＡＭＦＣＧＲＬＮＭＨＭＮＶＱＮＧＫＷＤＳＤＰＳＧＴＫＴＣＩＤＴＫＥＧＩＬＱＹＣＱＥＶＹＰＥＬＱＩＴＮＶＶＥＡＮＱＰＶＴＩＱＮＷＣＫＲＧＲＫＱＣＫＴＨＰＨＦＶＩＰＹＲＣＬＶＧＥＦＶＳＤＡＬＬＶＰＤＫＣＫＦＬＨＱＥＲＭＤＶＣＥＴＨＬＨＷＨＴＶＡＫＥＴＣＳＥＫＳＴＮＬＨＤＹＧＭＬＬＰＣＧＩＤＫＦＲＧＶＥＦＶＣＣＰＬＡＥＥＳＤＮＶＤＳＡＤＡＥＥＤＤＳＤＶＷＷＧＧＡＤＴＤＹＡＤＧＳＥＤＫＶＶＥＶＡＥＥＥＥＶＡＥＶＥＥＥＥＡＤＤＤＥＤＤＥＤＧＤＥＶＥＥＥＡＥＥＰＹＥＥＡＴＥＲＴＴＳＩＡＴＴＴＴＴＴＴＥＳＶＥＥＶＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥＴＧＰＣＲＡＭＩＳＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦＦＹＧＧＣＧＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡＭＳＱＳＬＬＫＴＴＱＥＰＬＡＲＤＰＶＫＬＰＴＴＡＡＳＴＰＤＡＶＤＫＹＬＥＴＰＧＤＥＮＥＨＡＨＦＱＫＡＫＥＲＬＥＡＫＨＲＥＲＭＳＱＶＭＲＥＷＥＥＡＥＲＱＡＫＮＬＰＫＡＤＫＫＡＶＩＱＨＦＱＥＫＶＥＳＬＥＱＥＡＡＮＥＲＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲＶＥＡＭＬＮＤＲＲＲＬＡＬＥＮＹＩＴＡＬＱＡＶＰＰＲＰＲＨＶＦＮＭＬＫＫＹＶＲＡＥＱＫＤＲＱＨＴＬＫＨＦＥＨＶＲＭＶＤＰＫＫＡＡＱＩＲＳＱＶＭＴＨＬＲＶＩＹＥＲＭＮＱＳＬＳＬＬＹＮＶＰＡＶＡＥＥＩＱＤＥＶＤＥＬＬＱＫＥＱＮＹＳＤＤＶＬＡＮＭＩＳＥＰＲＩＳＹＧＮＤＡＬＭＰＳＬＴＥＴＫＴＴＶＥＬＬＰＶＮＧＥＦＳＬＤＤＬＱＰＷＨＳＦＧＡＤＳＶＰＡＮＴＥＮＥＶＥＰＶＤＡＲＰＡＡＤＲＧＬＴＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧＶＶＥＶＤＡＡＶＴＰＥＥＲＨＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥＱＭＱＮ（配列番号３）

【0077】

ＡＰＰ配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｐ０５０６７）で確認することができる。ＡＰＰに関する追加情報は、例えば、遺伝子３５１に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＡＰＰという用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿０００４８４．４という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＡＰＰ遺伝子のバリエーションも指す。

【0078】

ＰＦ４
本開示の防御タンパク質の１つは、血小板第４因子（ＰＦ４）である。

【0079】

「血小板第４因子」遺伝子、または「ＰＦ４」遺伝子という用語は、「ＣＸＣＬ４」、「ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド４」、「オンコスタチン－Ａ」、「ＳＣＹＢ４」及び「Ｉｒｏｐｌａｃｔ」としても知られ、ＰＦ４タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＰＦ４は、ヘパリンに対して高い親和性を有するホモ四量体の形態で活性化血小板のアルファ顆粒から主に放出されるケモカインであり、血小板凝集に関与している。ＰＦ４は、種々の免疫細胞によって分泌されることが知られている（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１（２）：３２４－８（１９７６）、Ｂｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７０（５）：４３３－４３（２０１４））。ＰＦ４は、多数の他の細胞型に対して走化性があり、造血、血管新生、及びＴ細胞機能の阻害剤としても機能する。このタンパク質は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに対する抗菌活性も呈する。ＰＦ４は、骨髄異形成症候群、マラリア、ＨＩＶ－１、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、及び関節リウマチを含む種々の炎症性疾患の病理にも関係するとされている（Ａｆｆａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４８（３）：５２２－５３１（２０１８）、Ｙｅｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ７５（４）：７６３－７１（２０１６））。

【0080】

ＡＰＰ遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。ＰＦ４遺伝子を保有するヒト第４染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第４染色体のヌクレオチド７３，９８０，８１１～７３，９８２，０２７に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００４．１２でも確認することができる。この遺伝子については１つの転写物が識別されている。ＰＦ４の例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２６１９．４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＰＦ４転写物バリアント１）で確認することができる。ヒトＰＦ４転写物バリアント１のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＳＳＡＡＧＦＣＡＳＲＰＧＬＬＦＬＧＬＬＬＬＰＬＶＶＡＦＡＳＡＥＡＥＥＤＧＤＬＱＣＬＣＶＫＴＴＳＱＶＲＰＲＨＩＴＳＬＥＶＩＫＡＧＰＨＣＰＴＡＱＬＩＡＴＬＫＮＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号４）

【0081】

ＰＦ４配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｐ０２７７６）で確認することができる。ＰＦ４に関する追加情報は、例えば、遺伝子５１９６に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＰＦ４という用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿００２６１９．４という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＰＦ４遺伝子のバリエーションも指す。

【0082】

ＤＮＡＪＣ１９
本開示の防御タンパク質の１つは、ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＣ１９（ＤＮＡＪＣ１９）である。

【0083】

「ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＣ１９」遺伝子、または「ＤＮＡＪＣ１９」遺伝子という用語は、「ＴＩＭＭ１４」、「ＴＩＭ１４」、「ＰＡＭ１８」、及び「ミトコンドリア輸入内膜トランスロカーゼサブユニットＴＩＭ１４」としても知られ、ＤＮＡＪＣ１９タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＤＮＡＪＣ１９タンパク質は、ＤＮＡＪタンパク質ファミリーの残りと比較して異常な構造を有する５９個のアミノ酸で構成される６．２９ｋＤａのタンパク質である。ＤＮＡＪＣ１９のＤＮＡＪドメインは、Ｎ末端ではなくＣ末端に位置しており、その膜貫通ドメインはＤＮＡＪＣ１９への膜結合局在性を付与するが、他のＤＮＡＪタンパク質はサイトゾル性である（Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１３（９）：１０４３－５３）。ＤＮＡＪＣ１９は、ミトコンドリアマトリクス内へのミトコンドリアプレタンパク質のＡＴＰ依存性輸入に必要である。ＤＮＡＪＣ１９のＪ－ドメインは、この輸送を駆動するためにｍｔＨｓｐ７０ ＡＴＰａｓｅ活性を刺激する（Ｍｏｋｒａｎｊａｃ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２２（１９）：４９４５－５６）。ＤＮＡＪＣ１９の欠陥は、運動失調を伴う拡張型心筋症（ＤＣＭＡ）、成長不全、小球性貧血、及び男性生殖器の異常と関連付けられている。ＤＮＡＪＣ１９は、血族のフッタライト集団に関する研究で初めてＤＣＭＡに関係していることが示され、これはその後、他の欧州系集団でも確認されている（Ｏｊａｌａ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７２（４）：４３２－７）。臨床において、ＤＮＡＪＣ１９変異は、３－メチルグルタコン酸レベルの上昇、ミトコンドリアの窮迫、拡張型心筋症、心電図におけるＱＴ間隔の延長、及び小脳失調のスクリーニングによって検出された（Ｏｊａｌａ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７２（４）：４３２－７、Ｋｏｕｔｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：１９１）。

【0084】

ＤＮＡＪＣ１９遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。ＤＮＡＪＣ１９遺伝子を保有するヒト第３染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第３染色体のヌクレオチド１８０９８３７０９～１８０９８９８３８に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．１２でも確認することができる。ＤＮＡＪＣ１９の例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５２６１．４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＣ１９（ＤＮＡＪＣ１９）転写物バリアント１）で確認することができる。ヒトＤＮＡＪＣ１９のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＡＳＴＶＶＡＶＧＬＴＩＡＡＡＧＦＡＧＲＹＶＬＱＡＭＫＨＭＥＰＱＶＫＱＶＦＱＳＬＰＫＳＡＦＳＧＧＹＹＲＧＧＦＥＰＫＭＴＫＲＥＡＡＬＩＬＧＶＳＰＴＡＮＫＧＫＩＲＤＡＨＲＲＩＭＬＬＮＨＰＤＫＧＧＳＰＹＩＡＡＫＩＮＥＡＫＤＬＬＥＧＱＡＫＫ（配列番号５）

【0085】

ＤＮＡＪＣ１９配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｑ９６ＤＡ６）で確認することができる。ＤＮＡＪＣ１９に関する追加情報は、例えば、遺伝子１３１１１８に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＤＮＡＪＣ１９という用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿１４５２６１．４という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＤＮＡＪＣ１９遺伝子のバリエーションも指す。

【0086】

ＡＮＧＰＴ１
本開示の防御タンパク質の１つは、アンジオポエチン１（ＡＮＧＰＴ１）である。

【0087】

「アンジオポエチン１」遺伝子、または「ＡＮＧＰＴ１」遺伝子という用語は、「ＫＩＡＡ０００３」、「ＡＮＧ－１」、「ＡＧＰ１」、及び「ＡＧＰＴ」としても知られ、ＡＮＧＰＴ１タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＡＮＧＰＴ１は、分泌型７０ｋＤａ糖タンパク質であり、成長因子のアンジオポエチンファミリーのメンバーである。ＡＮＧＰＴ１は、主に内皮細胞に見られるチロシンキナーゼ受容体Ｔｅｋの主要なアゴニストである。ＡＮＧＰＴ１は、血管支持細胞ならびに腎臓の有足細胞及び肝臓のＩＴＯ細胞などの特殊化された周皮細胞によって産生される（Ｓａｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １３（２）：５４４－５５０（２００２））。ＡＮＧＰＴ１は、血管新生の制御、内皮細胞の生存、増殖、遊走、接着及び細胞の拡散、アクチン細胞骨格の再構成、ならびに血管静止状態の維持において重要な役割を果たす（Ｊｅａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２１（６）：２２７８－２２８９（２０１１））。従来のＡＮＧＰＴ１またはＴｅｋノックアウトマウスは、同様の異常な血管表現型及び心臓肉柱形成の喪失を伴い、Ｅ９．５からＥ１２．５の間の致死率を呈するため、ＡＮＧＰＴ１／Ｔｅｋ経路は正常な発達にとって重要である（Ｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８７（７）：１１７１－８０（１９９６）、Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５（１１）：４６９３－７０２ （２００５））。

【0088】

ＡＮＧＰＴ１遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。ＡＮＧＰＴ１遺伝子を保有するヒト第８染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第８染色体のヌクレオチド１０７２４９４８２～１０７４９７９１８に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００８．１１でも確認することができる。ＡＮＧＰＴ１の例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１４６．５（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアンジオポエチン１（ＡＮＧＰＴ１）、転写物バリアント１）で確認することができる。ヒトＡＮＧＰＴ１のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＴＶＦＬＳＦＡＦＬＡＡＩＬＴＨＩＧＣＳＮＱＲＲＳＰＥＮＳＧＲＲＹＮＲＩＱＨＧＱＣＡＹＴＦＩＬＰＥＨＤＧＮＣＲＥＳＴＴＤＱＹＮＴＮＡＬＱＲＤＡＰＨＶＥＰＤＦＳＳＱＫＬＱＨＬＥＨＶＭＥＮＹＴＱＷＬＱＫＬＥＮＹＩＶＥＮＭＫＳＥＭＡＱＩＱＱＮＡＶＱＮＨＴＡＴＭＬＥＩＧＴＳＬＬＳＱＴＡＥＱＴＲＫＬＴＤＶＥＴＱＶＬＮＱＴＳＲＬＥＩＱＬＬＥＮＳＬＳＴＹＫＬＥＫＱＬＬＱＱＴＮＥＩＬＫＩＨＥＫＮＳＬＬＥＨＫＩＬＥＭＥＧＫＨＫＥＥＬＤＴＬＫＥＥＫＥＮＬＱＧＬＶＴＲＱＴＹＩＩＱＥＬＥＫＱＬＮＲＡＴＴＮＮＳＶＬＱＫＱＱＬＥＬＭＤＴＶＨＮＬＶＮＬＣＴＫＥＧＶＬＬＫＧＧＫＲＥＥＥＫＰＦＲＤＣＡＤＶＹＱＡＧＦＮＫＳＧＩＹＴＩＹＩＮＮＭＰＥＰＫＫＶＦＣＮＭＤＶＮＧＧＧＷＴＶＩＱＨＲＥＤＧＳＬＤＦＱＲＧＷＫＥＹＫＭＧＦＧＮＰＳＧＥＹＷＬＧＮＥＦＩＦＡＩＴＳＱＲＱＹＭＬＲＩＥＬＭＤＷＥＧＮＲＡＹＳＱＹＤＲＦＨＩＧＮＥＫＱＮＹＲＬＹＬＫＧＨＴＧＴＡＧＫＱＳＳＬＩＬＨＧＡＤＦＳＴＫＤＡＤＮＤＮＣＭＣＫＣＡＬＭＬＴＧＧＷＷＦＤＡＣＧＰＳＮＬＮＧＭＦＹＴＡＧＱＮＨＧＫＬＮＧＩＫＷＨＹＦＫＧＰＳＹＳＬＲＳＴＴＭＭＩＲＰＬＤＦ（配列番号６）

【0089】

ＡＮＧＰＴ１配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｑ１５３８９）で確認することができる。ＡＮＧＰＴ１に関する追加情報は、例えば、遺伝子２８４に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＡＮＧＰＴ１という用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿００１１４６．５という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＡＮＧＰＴ１遺伝子のバリエーションも指す。

【0090】

ＴＮＦＳＦ１２
本開示の防御タンパク質の１つは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）である。

【0091】

「腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１２」遺伝子、または「ＴＮＦＳＦ１２」遺伝子という用語は、「ＡＰＯ３Ｌ」、「ＤＲ３ＬＧ」、「ＴＷＥＡＫ」、及び「ＴＮＬＧ４Ａ」としても知られ、ＴＮＦＳＦ１２タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＴＮＦＳＦ１２は、免疫系の制御において重要な役割を果たすタンパク質の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーである。ＴＮＦＳＦ１２は、多くの組織で広く発現され、いくつかの細胞株でインターロイキン－８合成を誘導する（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２７２（５１）：３２４０１－３２４１０（１９９７））。ヒト腺癌細胞株ＨＴ２９は、ＴＮＦＳＦ１２及びインターフェロンγの両方の存在下でアポトーシスを起こした。白血球は、ヒトの休止単球及び活性化単球、樹状細胞ならびにナチュラルキラー細胞を含むＴＮＦＳＦ１２の主な供給源である（Ｍａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １２３（５）：９３１－４４）。ＴＮＦＳＦ１２は、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１２の産生を抑制し、先天性応答及びその適応ＴＨ１免疫への移行を抑える。ＴＮＦＳＦ１２はまた、内皮細胞の増殖及び遊走を促進し、血管新生の制御因子として作用する。

【0092】

ＴＮＦＳＦ１２遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。ＴＮＦＳＦ１２遺伝子を保有するヒト第１７染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第１７染色体のヌクレオチド７５４９０５８～７５５７８８１に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１７．１１でも確認することができる。ＴＮＦＳＦ１２の例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３８０９．３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）、転写物バリアント１）で確認することができる。ヒトＴＮＦＳＦ１２のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＡＡＲＲＳＱＲＲＲＧＲＲＧＥＰＧＴＡＬＬＶＰＬＡＬＧＬＧＬＡＬＡＣＬＧＬＬＬＡＶＶＳＬＧＳＲＡＳＬＳＡＱＥＰＡＱＥＥＬＶＡＥＥＤＱＤＰＳＥＬＮＰＱＴＥＥＳＱＤＰＡＰＦＬＮＲＬＶＲＰＲＲＳＡＰＫＧＲＫＴＲＡＲＲＡＩＡＡＨＹＥＶＨＰＲＰＧＱＤＧＡＱＡＧＶＤＧＴＶＳＧＷＥＥＡＲＩＮＳＳＳＰＬＲＹＮＲＱＩＧＥＦＩＶＴＲＡＧＬＹＹＬＹＣＱＶＨＦＤＥＧＫＡＶＹＬＫＬＤＬＬＶＤＧＶＬＡＬＲＣＬＥＥＦＳＡＴＡＡＳＳＬＧＰＱＬＲＬＣＱＶＳＧＬＬＡＬＲＰＧＳＳＬＲＩＲＴＬＰＷＡＨＬＫＡＡＰＦＬＴＹＦＧＬＦＱＶＨ（配列番号７）

【0093】

ＴＮＦＳＦ１２配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｏ４３５０８）で確認することができる。ＴＮＦＳＦ１２に関する追加情報は、例えば、遺伝子８７４２に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＴＮＦＳＦ１２という用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿００３８０９．３という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＴＮＦＳＦ１２遺伝子のバリエーションも指す。

【0094】

ＦＧＦ２０
別の本開示の防御タンパク質は、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）である。

【0095】

「線維芽細胞成長因子２０」遺伝子、または「ＦＧＦ２０」遺伝子という用語は、「ＲＨＤＡ２」としても知られ、ＦＧＦ２０タンパク質をコードする遺伝子を指す。ＦＧＦ２０は、主に正常な脳、特に小脳で発現する。ラットホモログは脳で優先的に発現され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を向上させることができる。ＦＧＦ２０は、広範な分裂促進活性及び細胞生存活性を有し、細胞成長、形態形成、組織修復、腫瘍成長、浸潤、及び胚発生を含む種々の生物学的プロセスに関与している線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーである（Ｋｏｇａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２６１（３）：７５６－６５）。ＦＧＦ２０の遺伝子多型は、パーキンソン病に関係するとされている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ３７（７）：１１１９－２６（２０１６）、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ３５（１２）（２０１４））。

【0096】

ＦＧＦ２０遺伝子を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。ＦＧＦ２０遺伝子を保有するヒト第８染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第８染色体のヌクレオチド１６９９２１８１～１７００２３４５に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００８．１１でも確認することができる。ＦＧＦ２０の例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１９８５１．３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０））で確認することができる。ヒトＦＧＦ２０のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＡＰＬＡＥＶＧＧＦＬＧＧＬＥＧＬＧＱＱＶＧＳＨＦＬＬＰＰＡＧＥＲＰＰＬＬＧＥＲＲＳＡＡＥＲＳＡＲＧＧＰＧＡＡＱＬＡＨＬＨＧＩＬＲＲＲＱＬＹＣＲＴＧＦＨＬＱＩＬＰＤＧＳＶＱＧＴＲＱＤＨＳＬＦＧＩＬＥＦＩＳＶＡＶＧＬＶＳＩＲＧＶＤＳＧＬＹＬＧＭＮＤＫＧＥＬＹＧＳＥＫＬＴＳＥＣＩＦＲＥＱＦＥＥＮＷＹＮＴＹＳＳＮＩＹＫＨＧＤＴＧＲＲＹＦＶＡＬＮＫＤＧＴＰＲＤＧＡＲＳＫＲＨＱＫＦＴＨＦＬＰＲＰＶＤＰＥＲＶＰＥＬＹＫＤＬＬＭＹＴ（配列番号８）

【0097】

ＦＧＦ２０配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｑ９ＮＰ９５）で確認することができる。ＦＧＦ２０に関する追加情報は、例えば、遺伝子２６２８１に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＦＧＦ２０という用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿０１９８５１．３という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＦＧＦ２０遺伝子のバリエーションも指す。

【0098】

Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２
本明細書に記載される方法及び組成物においてマーカーとして使用され得る別の防御タンパク質は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２である。

【0099】

ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２タンパク質は、ＴＩＣＮ２またはＫＩＡＡ０２７５としても知られるＳＰＯＣＫ２遺伝子によってコードされている。Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２は、グリコサミノグリカンと結合して細胞外マトリクスの一部を形成する。このタンパク質は、チログロブリン１型ドメイン、フォリスタチン様ドメイン、及びカルシウム結合ドメインを含有し、酸性Ｃ末端領域にグリコサミノグリカン付着部位を有する。ＳＰＯＣＫ（ＳＰＡＲＣ／オステオネクチンＣＷＣＶ及びＫａｚａｌ様ドメイン）は、分泌型プロテオグリカンをコードし、３つの既知のホモログ、ＳＰＯＣＫ１、ＳＰＯＣＫ２、及びＳＰＯＣＫ３を有する。ＳＰＯＣＫは初めは精漿ＧＡＧ含有ペプチドの前駆形態として特性評価され、後にクローニングされ、コンドロイチン／ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）として識別された。ＳＰＯＣＫ１及びＳＰＯＣＫ２のプロテオグリカンは、神経細胞の付着及び神経突起の伸長を阻害する。さらに、ＳＰＯＣＫ２の多型は、未熟児によく見られる慢性呼吸器疾患である気管支肺異形成への易罹患性に関係する遺伝形質であることが最近判明し（Ｈａｄｃｈｏｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，２０１１，１８４（１０）：１１６４－７０）、肺上皮細胞のウイルス感染に対する防御バリアとして機能する（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，２０１９，９３（２０）：ｅ００６６２－１９）。

【0100】

Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２遺伝子（ＳＰＯＣＫ２）を保有するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８で確認することができる。Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２遺伝子を保有するヒト第１０染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト第１０染色体のヌクレオチド７２０５９０３４～７２０９５３１３に対応する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１０．１１でも確認することができる。Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２の例示的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２４４９５０．２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、ｃｗｃｖ及びｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン２（ＳＰＯＣＫ２）、転写物バリアント３）で確認することができる。ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ－２（アイソフォーム２前駆体）のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＲＡＰＧＣＧＲＬＶＬＰＬＬＬＬＡＡＡＡＬＡＥＧＤＡＫＧＬＫＥＧＥＴＰＧＮＦＭＥＤＥＱＷＬＳＳＩＳＱＹＳＧＫＩＫＨＷＮＲＦＲＤＥＶＥＤＤＹＩＫＳＷＥＤＮＱＱＧＤＥＡＬＤＴＴＫＤＰＣＱＫＶＫＣＳＲＨＫＶＣＩＡＱＧＹＱＲＡＭＣＩＳＲＫＫＬＥＨＲＩＫＱＰＴＶＫＬＨＧＮＫＤＳＩＣＫＰＣＨＭＡＱＬＡＳＶＣＧＳＤＧＨＴＹＳＳＶＣＫＬＥＱＱＡＣＬＳＳＫＱＬＡＶＲＣＥＧＰＣＰＣＰＴＥＱＡＡＴＳＴＡＤＧＫＰＥＴＣＴＧＱＤＬＡＤＬＧＤＲＬＲＤＷＦＱＬＬＨＥＮＳＫＱＮＧＳＡＳＳＶＡＧＰＡＳＧＬＤＫＳＬＧＡＳＣＫＤＳＩＧＷＭＦＳＫＬＤＴＳＡＤＬＦＬＤＱＴＥＬＡＡＩＮＬＤＫＹＥＶＣＩＲＰＦＦＮＳＣＤＴＹＫＤＧＲＶＳＴＡＥＷＣＦＣＦＷＲＥＫＰＰＣＬＡＥＬＥＲＩＱＩＱＥＡＡＫＫＫＰＧＩＦＩＰＳＣＤＥＤＧＹＹＲＫＭＱＣＤＱＳＳＧＤＣＷＣＶＤＱＬＧＬＥＬＴＧＴＲＴＨＧＳＰＤＣＤＤＩＶＧＦＳＧＤＦＧＳＧＶＧＷＥＤＥＥＥＫＥＴＥＥＡＧＥＥＡＥＥＥＥＧＥＡＧＥＡＤＤＧＧＹＩＷ（配列番号１１）

【0101】

Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２配列は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、及びＵｎｉＰｒｏｔ（Ｑ９２５６３）でも確認することができる。Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２（ＳＰＯＣＫ２）に関する追加情報は、例えば、遺伝子９８０６に言及するＮＣＢＩウェブサイトで確認することができる。本明細書で使用されるＴｅｓｔｉｃａｎ－２という用語は、臨床バリアントデータベースにおいて、例えば、ＮＭ＿００１２４４９５０．２という用語に言及するＮＣＢＩ臨床バリアントウェブサイトで提供されているバリアントを含むＳＰＯＣＫ２遺伝子のバリエーションも指す。

【0102】

前述のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号及び遺伝子データベース番号の各々の内容全体は、本願の出願日の時点で参照により本明細書に組み込まれる。

【0103】

ＩＩＩ．防御タンパク質に基づいてＲＤ及びＥＳＲＤのリスクを判定するための方法及び組成物
本開示は、進行性腎臓病または末期腎臓病への進行のリスクを持つヒト対象を識別するために特定の防御タンパク質のレベルが使用され得るという発見に少なくとも部分的に基づいている。進行性腎不全を有しない人物と比べて、本明細書で識別される防御タンパク質のレベルが低いことは、末期腎臓病への進行から防御される者と、そうでない者を示す。本明細書に記載される別の実施形態は、ＥＳＫＤのリスクを持つものとして識別されたヒト患者の処置であり、例えば、防御タンパク質またはその組み合わせの投与により、患者の進行性腎臓病のリスクが減少する。

【0104】

本明細書に記載される方法及び組成物で使用され得る防御タンパク質の例は、本明細書で提供されている。本明細書に記載されるように、防御タンパク質という用語は、防御タンパク質及びその機能的断片を含むよう意図されている。機能的断片は、例えば、対応する完全長（または非断片）の均等物に帰する能力を保持する。

【0105】

１つ以上の防御タンパク質の発現レベルが、対象に由来する生物学的サンプルにおいて判定され得る。対象に由来するサンプルとは、対象を起源とし、対象から取得されるものである。そのようなサンプルは、対象から取得された後にさらに処理され得る。例えば、タンパク質がサンプルから単離され得る。一実施形態において、サンプルから単離されるタンパク質も、対象に由来するサンプルである。タンパク質の発現は全身の細胞、組織、及び体液で報告されているため、１つ以上の防御タンパク質のレベルを判定するのに有用な生物学的サンプルは、本質的にあらゆる供給源から取得され得る。しかし、本開示の一態様では、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する対象、あるいは腎機能低下を有する及び／またはＥＳＫＤを発症するリスクを持つ対象を示す、１つ以上の防御タンパク質のレベルは、対象から非侵襲的に取得されたサンプル中で検出され得る。

【0106】

特定の実施形態では、１つ以上の防御タンパク質のレベルを判定するために使用される生物学的サンプルは、循環タンパク質バイオマーカーを含有するサンプルである。細胞外タンパク質バイオマーカーは、循環系からの流体などの体液、例えば、血液サンプルもしくはリンパサンプル、または脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿もしくは唾液などの別の体液を含む、広範囲の生物学的物質中を自由に循環する。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の防御タンパク質のレベルを判定するために使用される生物学的サンプルは、体液、例えば、血液、その画分、血清、血漿、尿、唾液、涙液、汗液、精液、膣分泌物、リンパ液、気管支分泌物、ＣＳＦなどである。いくつかの実施形態では、サンプルは、非侵襲的に取得されたサンプルである。１つの特定の実施形態において、サンプルは尿サンプルである。別の実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。別の実施形態では、サンプルは血清サンプルである。

【0107】

いくつかの実施形態では、１つ以上の防御タンパク質のレベルを判定するために使用される生物学的サンプルは、細胞を含有し得る。他の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞を含まない、または実質的に含まないものであり得る（例えば血清サンプル）。いくつかの実施形態では、循環タンパク質バイオマーカーを含有するサンプルは、血液由来サンプルである。例示的な血液由来サンプルの種類には、例えば血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプルなどが含まれる。他の実施形態では、循環タンパク質バイオマーカーを含有するサンプルは、リンパサンプルである。循環タンパク質バイオマーカーは尿及び唾液にも見られ、これらの供給源に由来する生物学的サンプルも同様に、１つ以上の防御タンパク質のレベルを判定するために好適である。

【0108】

防御タンパク質レベルを判定するための組成物
本明細書では、本明細書に記載される方法を行うための、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちのいずれか１つ以上に特異的な抗体またはその抗原結合断片を含むアレイ（例えばタンパク質アレイ）または組成物も開示される。そのようなアレイには、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちのいずれか１つ以上に特異的な抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれか１つ以上を付着させるための担体または基質が含まれ得る。そのような担体及び基質は、当技術分野では公知であり、共有結合及び非共有結合の相互作用を含む。例えば、適用されたタンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）がヒドロゲルなどの多孔質表面に拡散することで、ヒドロゲル構造内の未修飾タンパク質の非共有結合が可能になる。共有結合法は、安定な結合をもたらし、様々なタンパク質に適用され得る。タンパク質（例えばバイオマーカー）上のタグ（例えばヘキサヒスチジン（配列番号１０）／Ｎｉ－ＮＴＡまたはビオチン／アビジン）と、基質の表面上に固定化されたパートナー試薬とを利用する生物学的捕捉法は、安定な結合をもたらし、タンパク質（例えばバイオマーカー）に特異的かつ再現可能な配向で結合する。

【0109】

一実施形態において、本明細書に記載されるＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちのいずれか１つ以上に特異的な抗体またはその抗原結合断片は、化学的に誘導体化されたガラス、またはニトロセルロースなどだがこれに限定されないタンパク質結合剤でコーティングされたガラスプレートなどの担体または基質上にコーティングされるか、またはスポッティングされる。

【0110】

別の実施形態では、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちのいずれか１つ以上に特異的な抗体またはその抗原結合断片は、マイクロアレイなどのアレイの形態で提供される。タンパク質マイクロアレイは、当技術分野では公知であり、例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ １２８：１６１－１６７及びＳｔｏｅｖｅｓａｎｄｔ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６：１４５－１５７によって概説されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。マイクロアレイは、接触スポッターまたは非接触マイクロアレイアーを使用して、処理済みの顕微鏡スライドなどの基質上に精製抗原を固定化することによって調製され得る。マイクロアレイは、対応するＤＮＡアレイから直接、ｉｎ ｓｉｔｕ無細胞合成によって生成することもできる。マイクロアレイは、本明細書で開示される方法を行うための検査パネルに含まれ得る。マイクロアレイの生成は、特定の状況では、抗原の三次元形状を維持するように設計された市販のプリンティングバッファーを用いて行われる。一実施形態において、マイクロアレイの基質は、ニトロセルロースでコーティングされたスライドガラスである。

【0111】

アッセイは、当技術分野で公知の方法によって行われ、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちのいずれか１つ以上に特異的な１つ以上の抗体またはその抗原結合断片と、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちのいずれか１つ以上との免疫複合体を形成させて免疫複合体の検出を可能にする条件下で、抗体を生物学的サンプルと接触させる。免疫複合体の存在及び量は、標識に基づく検出及び標識を用いない検出を含む、当技術分野で公知の方法によって検出され得る。例えば、標識に基づく検出法には、シグナル生成化合物を含む指示試薬に結合した二次抗体の添加が含まれる。二次抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体であり得る。指示試薬には、発色剤、酵素コンジュゲートなどの触媒、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム、ルテニウム、及びルミノールなどの化学発光化合物、放射性元素、直接可視標識、ならびに補因子、阻害剤、及び磁性粒子が含まれる。酵素コンジュゲートの例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びベータ－ガラクトシダーゼが挙げられる。標識を用いない検出の方法には、表面プラズモン共鳴、カーボンナノチューブ及びナノワイヤ、ならびに干渉分光法が含まれる。標識に基づく検出法及び標識を用いない検出法は、当技術分野では公知であり、例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）及びＲａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０：７３１－７４８によって開示されている。検出は、当技術分野で公知、かつ使用される標識に適切なスキャン方法、及び関連する分析ソフトウェアによって達成され得る。

【0112】

本明細書に記載されるように、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを示す防御タンパク質、及び／または、腎機能低下の増加したリスク及び／またはＥＳＫＤへの進行の増加したリスクを示す防御タンパク質が開示される。したがって、検査対象（例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する疑いのある対象、あるいは腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する増加したリスクを持つ対象）が腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有するかどうか、あるいは検査対象が腎機能低下の増加したリスク及び／またはＥＳＫＤへの進行の増加したリスクを持つかどうかを判定するために、検査対象などの対象からのサンプルから、防御タンパク質のレベルがアッセイされ得ることが企図される。特定の実施形態では、例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症した対象からのサンプル、あるいは腎機能低下及びＥＳＫＤへの急速な進行のリスクがあった糖尿病（Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ）を有する対象からのサンプル中の、特定のタンパク質（例えば循環タンパク質）のレベルを、例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症しなかった対象からのサンプル、あるいは安定な腎機能を有すると判定された（すなわち、非進行者であった）糖尿病（Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ）を有する対象からのサンプル、あるいは健康なコントロール対象からのサンプル、あるいは標準のコントロールレベルまたは参照レベルからのサンプル中の、特定のタンパク質（例えば循環タンパク質）のレベルと比較して、比較することにより、防御タンパク質が識別された。他の実施形態では、例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症した対象からのサンプル、あるいは腎機能低下及びＥＳＫＤへの急速な進行のリスクがあった糖尿病（Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ）を有する対象からのサンプル中の、特定のタンパク質（例えば循環タンパク質）のレベルを、例えばプロテオミクスプラットフォーム（例えばＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォーム、及び／またはＯＬＩＮＫプラットフォーム）によって分かったまたは測定されたタンパク質（例えば循環タンパク質または血漿タンパク質）の既知のベースライン濃度と比較して比較することにより、防御タンパク質が識別された。ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２を含むがこれらに限定されない、いくつかの差示的に存在するタンパク質バイオマーカーがこの様式で識別され、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する対象を示し、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤへの進行の増加したリスクを示すものであると判定された。

【0113】

本明細書で識別される防御タンパク質は、Ｔ１ＤまたはＴ２Ｄを有し、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症するリスクが以前に不明であった対象などの対象が、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有するかどうか、またはその発症リスクを持つかどうかを判定するために使用され得る。これは、対象に由来する生物学的サンプル中の、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２、ＡＮＧＰＴ１、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせのレベルを判定することによって達成され得る。正常な対象に由来する生物学的サンプル中のレベル（すなわち、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有しないことが知られている対象、あるいは正常アルブミン尿性コントロールレベル、あるいは健康なコントロールレベル、あるいは標準のコントロールレベル）と比較した、これらの防御タンパク質のうちの１つ以上のレベルにおける差は、対象が腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症するリスクを有するかどうかに関する予測能を有し得る。

【0114】

生物学的サンプル中の１つ以上の防御タンパク質のレベルは、任意の好適な方法によって判定され得る。サンプル中のタンパク質のレベルまたは量を測定または検出するための任意の信頼できる方法を使用することができる。したがって、本明細書で開示される方法の実施には、分子生物学の分野における定型的な技術が利用され得る。本開示における一般的な使用方法を開示する基本的な文書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４））が含まれる。

【0115】

本開示は、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤの存在の検出、発症リスクの評価、診断、予後判定、及び／または進行のモニタリング、及び／または処置の有効性のモニタリングのための手段として、対象の細胞、組織、またはサンプル（例えば血漿サンプルまたは血清サンプル）中で見られる特定のタンパク質レベルの量を測定または検出する方法（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ法）に関する。したがって、特定の実施形態では、本開示の方法（例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤの診断、予後判定、及び／またはモニタリングのために、特定の識別されたバイオマーカーを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ法）を実施する第１のステップは、検査対象から細胞、組織またはサンプル（例えば、尿サンプルまたは血漿サンプルまたは血清サンプル）を取得し、サンプルからタンパク質を抽出することである。

【0116】

サンプルは、当技術分野で公知の方法に従って調製され得る。対象からの細胞、組織または血液サンプル（例えば、血漿サンプルまたは血清サンプル）は、本開示に好適であり、よく知られている方法を使用して、かつ本明細書に記載されるように取得され得る。特定の本開示の実施形態では、血漿サンプルが好ましいサンプルの種類である。他の本開示の実施形態では、血清サンプルが好ましいサンプルの種類である。

【0117】

いくつかの実施形態では、生物学的サンプル（例えば細胞、組織、血漿サンプル、または血清サンプル）は、本明細書に記載されるように腎機能低下及び／またはＥＳＫＤについて検査またはモニタリングされる対象から取得される。同じ種類の生物学的サンプルは、検査対象（例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する疑いのある対象、及び／または、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症するリスクを持つ対象）と、コントロール対象（例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを患っていない対象；例えば、正常アルブミン尿性コントロール対象もしくは健康なコントロール対象からのサンプル、または既知／標準のコントロールレベルのもの））との両方から採取されるべきである。検査対象などの対象からの生物学的サンプルの収集は、病院または診療所が一般的に従う標準プロトコルに従って行われ得る。適切な量の生物学的サンプル（例えば細胞、組織または血漿サンプル）が収集され、さらなる調製の前に標準的手順に従って保管され得る。

【0118】

本明細書で開示される方法に従った、対象（例えば検査対象）の生物学的サンプルに見られる、本明細書に記載される特定の防御タンパク質の分析は、特定の実施形態では、例えば細胞、組織、尿サンプル、血漿サンプル、または血清サンプルを使用して行われ得る。タンパク質抽出のために生物学的サンプルを調製する方法は、当業者の間ではよく知られている。例えば、対象（例えば検査対象）の細胞集団または組織サンプルは、まず、細胞内に含有されたタンパク質を放出させるために、細胞膜を破壊するように処理されるべきである。

【0119】

本明細書で開示される特定の防御タンパク質の存在を検出する目的では、あるいは検査対象が腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有するかどうか、またはその発症リスクを持つかどうかを評価する目的では、生物学的サンプルを対象から収集することができ、本明細書で開示される特定の防御タンパク質のレベルを測定した後、これらの同じ特定の防御タンパク質の正常レベルと比較する（例えば、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤの発生前の対象における同じ種類の生物学的サンプル中の、本明細書で開示される特定の防御タンパク質のレベルと比較する、及び／または、健康なコントロール対象（例えば、Ｔ１ＤもしくはＴ２Ｄを有しない対象）からの同じ種類の生物学的サンプル中の、本明細書で開示される特定の防御タンパク質のレベルと比較する、及び／または、本明細書で開示される特定の防御タンパク質のベースラインレベルの既知のコントロール標準と比較する）ことができる。本明細書で開示される１つ以上の特定の防御タンパク質のレベルが、本明細書で開示される１つ以上の特定の防御タンパク質の正常レベルと比較して統計的に有意に低ければ、検査対象は、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有するか、あるいは腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症する増加したリスクを有するとみなされる。疾患の進行をモニタリングする目的では、あるいは腎機能低下及び／またはＥＳＫＤ患者における治療効果を評価する目的では、本明細書で開示される特定の防御タンパク質のレベルを経時的に測定すること（すなわち、連続的検査）により、疾患の状態を示す情報が提供され得るように、検査対象からの生物学的サンプルを異なる時点で採取することができる。例えば、検査対象からの本明細書で開示される特定の防御タンパク質のレベルが、経時的に正常レベルまで上昇するまたは安定化する全般的傾向を示す場合、検査対象の腎機能低下及び／またはＥＳＲＤの重篤度が改善または安定化しているとみなされるか、あるいは患者が受けている療法が効果的であるとみなされる。検査対象からの本明細書で開示される特定の防御タンパク質のレベルが上昇もしくは安定化しない場合、または検査対象からの本明細書で開示される特定の防御タンパク質のレベルが継続的に低下する傾向にある場合は、病態の悪化及び患者に与えられた療法の無効性を示す。概して、検査対象において見られる本明細書で開示される特定の防御タンパク質の比較的低いレベルは、検査対象が腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有すること、及び／または、検査対象の腎機能低下及び／またはＥＳＫＤの状態が悪化していること、あるいは腎機能低下及び／またはＥＳＫＤが進行していることを示す。

【0120】

本明細書で開示されるような防御タンパク質（複数可）など、特定の固有性を持つタンパク質は、種々の免疫学的アッセイを使用して検出することができる。いくつかの実施形態では、防御タンパク質（複数可）に対する特異的結合親和性を有する抗体（複数可）を用いて検査サンプルから防御タンパク質（複数可）を捕捉することにより、サンドイッチアッセイを行うことができる。その後、例えば、防御タンパク質（複数可）に対する特異的結合親和性を有する標識抗体を使用して、防御タンパク質（複数可）を検出することができる。一般的な検出法の１つは、放射性同位体（例えば^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ、^９９ｍＴｃなど）で標識された放射標識検出剤（例えば、放射標識された抗防御タンパク質特異的抗体）を使用することによるオートラジオグラフィーの使用である。放射性同位体の選択は、選択された同位体の合成の容易さ、安定性、及び半減期により、研究における優先傾向に依存する。検出剤の標識のために（例えば抗バイオマーカー特異的抗体の標識のために）使用され得る他の標識には、フルオロフォア、化学発光剤、フルオロフォア、及び酵素（例えばＨＲＰ）で標識された抗リガンドまたは抗体に結合する化合物（例えばビオチン及びジゴキシゲニン）が含まれる。そのような免疫学的アッセイは、マイクロアレイプロテインチップなどのマイクロ流体デバイスを使用して実行することができる。目的タンパク質（例えば、本明細書で開示されるような防御タンパク質（複数可））は、ゲル電気泳動（２次元ゲル電気泳動など）、及び特異的抗体（例えば抗防御タンパク質特異的抗体）を使用したウエスタンブロット分析によって検出することもできる。いくつかの実施形態では、適切な抗体（複数可）、例えば抗防御タンパク質特異的抗体を使用して、所定のタンパク質（例えば、本明細書で開示されるような防御タンパク質）を検出するために、標準的なＥＬＩＳＡ技術が使用され得る。他の実施形態では、適切な抗体を使用して、所定のタンパク質（例えば、本明細書で開示されるような防御タンパク質）を検出するために、標準的なウエスタンブロット分析技術が使用され得る。あるいは、適切な抗体（複数可）、例えば抗防御タンパク質特異的抗体を使用して、所定の防御タンパク質を検出するために、標準的な免疫組織化学的（ＩＨＣ）技術が使用され得る。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体（所望の結合特異性を持つ抗体断片を含む）の両方が、防御タンパク質（複数可）の特異的検出のために使用され得る。特定のタンパク質（例えば、本明細書で開示されるような防御タンパク質（複数可））に対する特異的結合親和性を有する、そのような抗体及びそれらの結合断片は、公知技術によって生成され得る。

【0121】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような防御タンパク質は、抗防御タンパク質特異的抗体、またはその抗原結合断片など、防御タンパク質に結合する抗体を用いて検出され得る（例えば、検出アッセイで検出され得る）。特定の実施形態では、抗防御タンパク質特異的抗体は、本明細書で開示されるような防御タンパク質（複数可）に結合し、防御タンパク質（複数可）（例えば生物学的サンプル由来）を検出する、例えば検出アッセイ（例えばウエスタンブロット分析、免疫組織化学分析、オートラジオグラフィー分析、及び／またはＥＬＩＳＡ）において防御タンパク質（複数可）を検出する、検出抗体などの検出剤として使用される。特定の実施形態では、抗防御タンパク質特異的抗体は、防御タンパク質に結合し、防御タンパク質（例えば生物学的サンプル由来）を検出する、例えば検出アッセイ（例えばウエスタンブロット分析、免疫組織化学分析、オートラジオグラフィー分析、及び／またはＥＬＩＳＡ）で防御タンパク質を検出する、捕捉剤として使用される。いくつかの実施形態では、抗防御タンパク質特異的抗体、またはその抗原結合断片は、検出を容易にするために標識される。いくつかの実施形態では、抗防御タンパク質特異的抗体、またはその抗原結合断片は、放射標識される（例えば放射性同位体で標識される、例えば^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ、^９９ｍＴｃなどで標識される）、酵素的に標識される（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素で標識される）、蛍光標識される（例えばフルオロフォアで標識される）、化学発光剤で標識される、及び／または化合物（例えばビオチン及びジゴキシゲニン）で標識される。

【0122】

本開示を実施する際は、本明細書で開示されるような防御タンパク質のレベルを測定または検出するために、他の方法を用いてもよい。例えば、多数のサンプル中でも標的タンパク質を迅速かつ正確に定量するために、質量分析技術に基づいて種々の方法が開発されている。これらの方法には、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）技術を使用した三連四重極型（トリプルＱ）機器、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化法飛行時間型タンデム質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ）、選択的イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードを使用したイオン捕捉機器、及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ベースのＱＴＯＰ質量分析計など、高度に洗練された機器が用いられる。例えば、Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２００９ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；８（２）：７８７－７９７を参照されたい。

【0123】

他の実施形態では、本明細書で開示されるような防御タンパク質を評価することにより、本明細書で開示されるような防御タンパク質の発現が評価される。いくつかの実施形態では、抗防御タンパク質特異的抗体、またはその断片が、防御タンパク質を評価するために使用され得る。そのような方法には、ＩＨＣ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、オートラジオグラフィー、または抗体アレイの使用が含まれ得る。特定の実施形態では、防御タンパク質はＩＨＣを使用して評価される。ＩＨＣの使用は、防御タンパク質の定量化及び特性評価を可能にし得る。ＩＨＣは、防御タンパク質の発現が判定されるサンプルの免疫反応性スコアも可能にし得る。「免疫反応性スコア」（ＩＲＳ）という用語は、陽性細胞のパーセンテージを反映するスケール（１～４のスケールで、０＝０％、１＝＜１０％、２＝１０％～５０％、３＝５０％～８０％、４＝＞８０％）に染色の強度（１～３のスケールで、１＝弱、２＝中、３＝強）を乗じたものに基づいて計算される数を指す。ＩＲＳは０～１２の範囲をとり得る。

【0124】

特定の他の実施形態では、本明細書で開示されるような防御タンパク質のレベルを判定するために、アプタマーベースのプロテオミクスプラットフォームであるＳＯＭＡｓｃａｎが使用され得る。このプラットフォーム技術は、アプタマーといわれるＤＮＡ及びＲＮＡの固有の一本鎖配列が、折り畳まれたタンパク質エピトープを高い親和性及び特異性で認識できるという認識に基づいている。この特性は、ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームを使用してタンパク質の濃度をアッセイする（タンパク質ごとに１つのアプタマーを使用する）ことでさらに進歩した。このプラットフォームは、再現性及び感度を備えたハイスループット機能（１つのサンプルで１０００を超えるタンパク質）を特徴とする。

【0125】

特定の他の実施形態では、本明細書で開示されるような防御タンパク質（複数可）のレベルを判定するために、ＯＬＩＮＫ－Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ａｓｓａｙベースのプロテオミクスプラットフォームが使用され得る。ＯＬＩＮＫ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ａｓｓａｙは、抗体ベースのイムノアッセイをＰＣＲ及び定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の強力な特性と併合する分子技術であり、わずか１μＬの血漿／血清を使用することで多数の防御タンパク質を同時に定量できる多重化可能かつ高度に特異的な方法（例えば、タンパク質ごとに２つの抗体を使用する）をもたらす。これらのアッセイは十分に検証され、特定の疾患または生物学的プロセスに焦点を当てるように設計されたパネルとしてグループ化され、臨床サンプル中の標的タンパク質濃度の予想されるダイナミックレンジに合わせて最適化された。

【0126】

本明細書に記載されるように、推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）は、腎機能を推定するための手段を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、ヒト対象の推定糸球体機能率（ｅＧＦＲ）の傾きを測定することと、ヒト対象のｅＧＦＲの傾きが、ヒト対象が腎機能低下を有することまたはその発症リスクを持つことを示すかどうかを判定することとを含む。いくつかの実施形態では、ｅＧＦＲは、血清クレアチニンレベルの測定に基づいて判定される。他の実施形態では、ｅＧＦＲは、血清シスタチンＣレベルの測定に基づいて判定される。他の実施形態では、ｅＧＦＲは、入手可能で少なくとも６か月間隔で測定された少なくとも３つの血清クレアチニン値を用いて線形回帰を仮定する通常の最小二乗法を使用して判定される。他の実施形態では、ｅＧＦＲは、入手可能で少なくとも１年間隔で測定された少なくとも３つの血清クレアチニン値を用いて線形回帰を仮定する通常の最小二乗法を使用して判定される。さらに他の実施形態では、ｅＧＦＲは、入手可能で少なくとも２年以上の間隔で測定された少なくとも３つの血清クレアチニン値を用いて線形回帰を仮定する通常の最小二乗法を使用して判定される。他の実施形態では、ｅＧＦＲは、目視検査によって推定される。

【0127】

いくつかの実施形態では、少なくとも＜－３ｍｌ／分／年のｅＧＦＲの傾き（すなわち、ｅＧＦＲ損失≧３．０ｍｌ／分／年）は、ヒト対象が腎機能低下を有するまたはその発症リスクを持つことを示す。他の実施形態では、少なくとも＜－５ｍｌ／分／年のｅＧＦＲの傾きは、ヒト対象が腎機能低下を有するまたはその発症リスクを持つことを示す。さらに他の実施形態では、少なくとも＜－１０ｍｌ／分／年のｅＧＦＲの傾きは、ヒト対象が腎機能低下を有するまたはその発症リスクを持つことを示す。さらに別の実施形態では、少なくとも＜－１５ｍｌ／分／年のｅＧＦＲの傾きは、ヒト対象が腎機能低下を有するまたはその発症リスクを持つことを示す。他の実施形態では、ｅＧＦＲにおけるベースラインからの（少なくとも３か月にわたって確認された）≧４０％の持続的な低下は、ヒト対象が腎機能低下を有するまたはその発症リスクを持つことを示す。

【0128】

さらに別の実施形態では、ｅＧＦＲは、ＣＫＤ－ＥＰＩクレアチニン方程式を使用して判定され得る。いくつかの実施形態では、ＧＦＲの傾きの推定は、対象の人種、性別、及び血清クレアチニンレベルに依存し得る。例えば、一実施形態において、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が≦６２（≦０．７）のアフリカ系女性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１６６×（Ｓｃｒ／０．７）^{－０．３２９}×（０．９９３）^Ａｇｅ。別の実施形態では、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が＞６２（＞０．７）のアフリカ系女性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１６６×（Ｓｃｒ／０．７）^{－１．２０９}×（０．９９３）^Ａｇｅ。別の実施形態では、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が≦８０（≦０．９）のアフリカ系男性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１６３×（Ｓｃｒ／０．９）^{－０．４１１}×（０．９９３）^Ａｇｅ。別の実施形態では、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が＞８０（＞０．９）のアフリカ系男性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１６３×（Ｓｃｒ／０．９）^{－１．２０９}×（０．９９３）^Ａｇｅ。別の実施形態では、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が≦６２（≦０．７）の非アフリカ系女性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１４４×（Ｓｃｒ／０．７）^{－０．３２９}×（０．９９３）^Ａｇｅ。別の実施形態では、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が＞６２（＞０．７）の非アフリカ系女性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１４４×（Ｓｃｒ／０．７）^{－１．２０９}×（０．９９３）^Ａｇｅ。別の実施形態では、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が≦８０（≦０．９）の非アフリカ系男性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１４１×（Ｓｃｒ／０．９）^{－０．４１１}×（０．９９３）^Ａｇｅ。別の実施形態では、血清クレアチニン濃度（μｍｏｌ／ｄＬ）が＞８０（＞０．９）のアフリカ系男性のｅＧＦＲの傾きは、次式を使用して判定される：ＧＦＲ＝１４１×（Ｓｃｒ／０．９）^{－１．２０９}×（０．９９３）^Ａｇｅ。

【0129】

推定糸球体濾過率を判定するための追加の方法は、当業者の間では公知である。

【0130】

本明細書に記載される方法は、進行性腎臓機能低下の正確なリスク予測を可能にするためのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断として機械学習による予後リスクスコアアッセイを使用することにより、電子健康記録（ＥＨＲ）とバイオマーカー（例えば、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２、ＦＧＦ２０、及びＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちの１つ以上）とを組み合わせることをさらに含み得る。

【0131】

いくつかの実施形態では、機械学習による予後リスクスコアアッセイは、ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸ（商標）である。そのために、ランダムフォレストモデルを訓練することができ、性能（例えば曲線下面積（ＡＵＣ）、正及び負の予測値（ＰＰＶ／ＮＰＶ）、ならびに正味再分類指数（ＮＲＩ））を、推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）低下≧５ｍｌ／分／年、≧４０％の持続的低下、または５年以内の腎不全の複合転帰を予測するための臨床モデル及びＫＤＩＧＯカテゴリと比較することができる。いくつかの実施形態では、蔓延している糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）を有する患者／２つのＨＥＲ関連バイオバンクからのバンク血漿の観察コホート研究を使用することができる。ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸ（商標）は、ＫＤＩＧＯ（Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｇｌｏｂａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ）ガイドライン及び初期ステージのＤＫＤを有する個人の臨床モデルよりも改善された腎臓転帰の予測を行うことができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１８０３０号（公開番号ＷＯ／２０２１／１６３６１９；その方法及び組成物は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような機械学習モデルが、本明細書に記載される方法において使用される。

【0132】

８種の防御タンパク質バイオマーカーは、パターン化されたアレイと組み合わせた電気化学発光検出法を用いてアッセイの多重化を可能にするＭｅｓｏｓｃａｌｅプラットフォーム（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を使用して、独占権下にある分析的に検証された多重形式で測定され得る。各サンプルは、各プレートで既知の低濃度、中濃度、及び高濃度の各バイオマーカーを含むクオリティコントロールサンプルと共に、二連で実行することができる。アッセイ精度は、測定範囲にわたる参照サンプルのパネルを使用して評価することができる。Ｌｅｖｅｙ－Ｊｅｎｎｉｎｇｓプロットを用いることができ、サンプルの再実行にはＷｅｓｔｇｕａｒｄルールに従うことができる。バイオマーカーアッセイを行う研究室職員は、すべての臨床情報に対して盲検化され得る。

【0133】

ｅＧＦＲは、例えばＬｅｖｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １５０（９）：６０４－６１２２１（２００９））に記載されているように、ＣＫＤ－ＥＰＩクレアチニン方程式を使用して判定することができる。例えば、Ｌｅｆｆｏｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３０（８）：１２３７－１２４３（２０１５））に記載されているように、線形混合モデルを非構造化分散共分散行列と共に用いることができ、ランダム切片／傾きを各個人について使用して、ｅＧＦＲの傾きを推定することができる。主要な複合転帰である腎機能の進行性低下には、以下が含まれ得る：ｅＧＦＲの傾きの≧５ｍｌ／分／１．７３ｍ^２／年の低下と定義されるＲＫＦＤ；ｅＧＦＲにおけるベースラインからの持続的な（少なくとも３か月後に確認された）≧４０％の低下；または少なくとも３０日後に確認されたｅＧＦＲ＜１５ｍｌ／分／１．７３ｍ^２の持続によって定義される「腎不全」；または長期維持透析の受容、もしくは腎臓移植の受容（ＫＤＩＧＯ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ Ｓｕｐｐｌ ３：１－１６３（２０１２）、Ｌｅｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ６４（６）：８２１－８３５（２０１４））。さらに、腎臓専門医（ＳＣ／ＧＮＮ）を採用して、すべての転帰を独立的に判断し、各個の患者を長期的な経過にわたって調べ、ｅＧＦＲの変化（年換算で≧５ｍｌ／分の低下または≧４０％の持続的減少を確実にする）、対応するＩＣＤ／ＣＰＴコード及び薬物治療を考慮して、転帰が状況に依存した（例えば薬物治療／入院による）一時的な変化ではなく真の低下を表すものであったことを確実にすることができる。フォローアップ期間は、フォローアップ不能になった後、複合腎臓エンドポイントの非傾き成分が満たされた日以降、またはベースラインから５年後に打ち切ることができる。

【0134】

データセットは導出セット（６０％）及び検証セット（４０％）にランダム化することができる。検証データセットは完全に盲検化し、導出データセット全体から隔離することができる。導出セットのみを使用することで、組み合わせたバイオマーカー及びすべての構造化ＥＨＲ特徴に対する教師ありランダムフォレストアルゴリズムを、事前の特徴選択なしで評価することができ、候補特徴セットを識別することができる。次に、導出セットを二次訓練セットと検査セットにランダムに分割して、７０％～３０％のスピッティング及びＡＵＣの１０分割交差検証によるモデルの最適化を行うことができる。バイオマーカーの生の値及び比率の両方が考慮され得る。欠損しているｕＡＣＲ値は１０ｍｇ／ｇを代入することができ（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ（２０１９））、欠損している血圧（ＢＰ）値は複数の予測子（年齢、性別、人種、及び降圧薬）を使用して代入することができ（Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｏｌ １７（１）：１１４（２０１７））、欠損が３０％未満であった場合には他の特徴に中央値を使用することができる。

【0135】

モデルのさらなるイテレーションは、個々のハイパーパラメータのチューニングによって実行することができる。ハイパーパラメータは、訓練中に重み（変数の重みなど）が学習されるパラメータとは対照的に、学習プロセスをコントロールするために使用されるパラメータ（ＲＦツリーの数など）である。ハイパーパラメータのチューニングとは、理想的な性能を達成するためにパラメータの重みを設定した後の、モデルアーキテクチャのイテレーションを指す。ハイパーパラメータの最適化は、グリッド検索アプローチを使用して行うことができる。ハイパーパラメータのすべての可能な組み合わせについて、Ｋ分割交差検証ベースのＡＵＣを評価することができる。モデル構築のためにＡＵＣを最適化するハイパーパラメータの組み合わせを選択することができる。最適化には次のハイパーパラメータが考慮され得る：ノードを分割する候補としてランダムに選択された変数の数；フォレストの終端ノード内の固有のケース（データポイント）の平均数；ツリーを成長させるべき最大深度。

【0136】

さらに、再現性及び透明性を改善させるために、ハイパーパラメータ最適化のコードをｇｉｔｈｕｂリポジトリ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｇｉｒｉｓｈ－ｎａｄｋａｒｎｉ／ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｌＸ＿ｈｙｐｅｒｐａｒａｍｅｔｅｒ＿ｔｕｎｉｎｇ）にデポジットすることができる。ＡＵＣ性能に基づいて最終モデルを選択することができる。

【0137】

５～１００の連続スコアに合わせて５ずつ増分してスケーリングされた、導出セットの最終モデルを使用して、複合腎臓エンドポイントのリスク確率を生成することができ、このスコアを検証セットに適用することができる。リスクカットオフは、導出セットにおいて、上位１５％を高リスク群（スコア９０～１００）、下位４５％を低リスク群（スコア５～４５）、中間の４０％を中リスク群（スコア５０～８５）として包含するように選択することができる。一次性能基準は、既定のカットオフでのＡＵＣ、高リスク群の正の予測値、及び低リスク群の負の予測値（それぞれ、ＰＰＶ及びＮＰＶ）であり得る。次に、選択されたモデル及び関連するカットオフが、隔離された検証コホート内で独立した生物統計学者（ＭＫ）によって検証され得る。

【0138】

これらの従来の検査統計量に加えて、観察された転帰のみに対するＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸスコアの観察された転帰と期待される転帰のプロットの傾きを調べることによって、キャリブレーションが評価され得る。また、Ｃｏｘ比例ハザード法を使用したハザード比を用い、４０％低下及び腎不全の時間依存性転帰について、カプランマイヤー曲線を構築することができる。ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸモデルの判別能（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）は、最近検証された包括的臨床モデルと比較することができ、この包括的臨床モデルは、年齢、性別、人種、ｅＧＦＲ、心血管疾患、喫煙、高血圧、ＢＭＩ、ＵＡＣＲ、インスリン、糖尿病治療薬、及びＨｂＡ１ｃを含み、Ｔ２ＤにおけるｅＧＦＲの４０％のｅＧＦＲ低下を予測するために開発されたものである（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ（２０１９））。ユーティリティメトリック（ＰＰＶ、ＮＰＶ）を包括的臨床モデル及びＫＤＩＧＯリスク層の両方と比較することができる。

【0139】

最後に、ＫＤＩＧＯリスク層と比較したイベント及び非イベントの正味再分類指数（ＮＲＩ）を計算することができる（Ｐｅｎｃｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ２７（２）：１５７－１７２（２００８）、Ｐｅｎｃｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ３０（１）：１１－２１（２０１０））。事前の有意水準はすべて＜０．０５であり得る。すべての仮説検定は両側検定であり得る。９５％信頼区間はブートストラップによって計算することができる。すべての分析は、Ｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）、ｄｐｌｙｒパッケージ、ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔＳＲＣ、及びＣＡＲＥＴパッケージ（Ｈａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｐｌｙｒ：Ａ Ｇｒａｍｍａｒ ｏｆ Ｄａｔａ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｒ Ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．７．６．ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｄｐｌｙｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌから入手可能）；Ｈｅｍａｎｔ Ｉｓｈｗａｒａｎ ＵＢＫ（２０２０）ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔＳＲＣ：Ｆａｓｔ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＦ－ＳＲＣ）． ｃｒａｎ．ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔＳＲＣ／ｉｎｄｅｘから入手可能）を用いて行うことができる。

【0140】

２つのバイオバンクからのＴ２Ｄ患者の血漿サンプル及び関連するＥＨＲデータを利用して、ＲＫＦＤ、ｅＧＦＲの持続的な４０％の低下、及び５年間の腎不全からなる複合腎臓転帰である進行性腎機能低下を予測するためのランダムフォレストアルゴリズムにより、臨床データ及び血漿バイオマーカーを組み合わせたリスクスコアを策定し、検証することができる。ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸは、ＫＤＩＧＯリスクカテゴリ（ＫＤＩＧＯ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ Ｓｕｐｐｌ ３：１－１６３（２０１２））を含む標準的な臨床変数のみを使用したモデルよりも優れた性能を示すことが実証され得る。ＡＵＣ、ＮＲＩ、及びＫＤＩＧＯリスクカテゴリと比較したＰＰＶの改善によって測定されるように、判別能において臨床モデルに勝る顕著な改善を見ることができる。さらに、ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸは、イベントを経験している患者をＫＤＩＧＯリスク層よりも４０％超多く正確に識別することができる。最後に、ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸは、ｅＧＦＲの持続的な４０％の低下または腎不全という承認済みＦＤＡエンドポイントに関して、この臨床的かつ客観的なエンドポイントの高リスク層と低リスク層との間で１５倍のリスク差がある、優れたリスク層別化を提供することができる。

【0141】

ＤＫＤは、ますます複雑になり、現代の医療システムを脅かす一般的な問題となっている。実際の診療では、特に腎機能が保たれている初期疾患の場合、ＤＫＤ進行の予測は困難であり、したがって、改善された予後検査の実施が非常に重要である。統合リスクスコアは、特に臨床意思決定支援（ＣＤＳ）及び組み込まれたケアパスウェイと関連付けた場合、短期的な臨床的意義を有する。臨床リスク層別化の現行基準（ＫＤＩＧＯリスク層）（ＫＤＩＧＯ ＫＤＩＧＯ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ Ｓｕｐｐｌ ３：１－１６３（２０１２））は、ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸ研究に含めることができるＤＫＤ患者集団と重複する３つのリスク層を有する。３つのリスク層（低、中、及び高）によるリスクスコアは、ＫＤＩＧＯ分類コンポーネント（ｅＧＦＲ及びｕＡＣＲ）を組み込むこと、ならびに他の臨床変数及び３つの血液ベースのバイオマーカーを追加することによって作成され得る。このようにして、ＤＫＤ患者を正確にリスク層別化する能力を強化することができ、それによって患者管理の改善が可能になる。

【0142】

ＤＫＤの低リスク患者のケアは、再検査、臨床状態の変化、または専門医への紹介に関する地域の取り決めによる別段の指示がない限り、現行のＰＣＰまたは糖尿病専門医によって継続され、強度の低い処置を必要とし得る。高リスクスコアを持つ者については、監督には、腎臓内科へのさらなる紹介（Ｓｍａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗｓ（６）：ＣＤ００７３３３（２０１４）、Ｓｍａｒｔ ａｎｄ Ｔｉｔｕｓ，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ １２４（１１）：１０７３－１０８０ ｅ１０７２（２０１１））、モニタリング間隔の増加、腎臓の健康に対する意識の向上、栄養士への紹介、レニンアンジオテンシンアルドステロン系のアンタゴニストの使用の強化、ならびに進行を緩徐化するためのＳＧＬＴ２阻害剤及びＧＬＰ－１受容体アゴニストを含む最近承認された薬剤を開始する動機付けの増加が含まれ得る（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ７（１０）：７７６－７８５（２０１９）、Ｓａｒａｆｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３４（２）：２０８－２３０（２０１９））。これらの新しい療法の採用は、標準的な基準で「低リスク」と考えられる患者において特に遅れており、治療費及び有害事象の存在が制限要因となっている。腎臓専門医と早期に連携することで、より積極的な処置がＤＫＤの進行を最終的に防止できない場合の患者中心の腎置換オプションとしての在宅透析及び先制的または早期の腎臓移植について、患者にアドバイス及び教育を与えるためのより多くの時間を確保できる可能性がある。将来のＲＣＴにおける登録プロセスの一部としてリスクスコアを使用すると、イベントの可能性が高い試験参加者が増加して第二種過誤の確率が低減するか、または処置対コントロールの統計的有意差を検出するために必要なサンプルサイズが最小限に抑えられる可能性がある。ＤＫＤ進行を防止または緩徐化し、患者中心の腎置換モダリティを推進する介入は、米国保健福祉省のＡｄｖａｎｃｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｈｅａｌｔｈイニシアチブの目標をサポートする（Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １４（１２）：１７８８（２０１９））。

【0143】

ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸには、ＤＫＤ患者を含む、いくつかの環境で調べられたバイオマーカーからの入力が含まれた。可溶性ＴＮＦＲ１及び２ならびに血漿ＫＩＭ－１は、腎機能低下及びＥＳＫＤの信頼できる独立した予後シグナルを示している（Ｎｉｅｗｃｚａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２３（３）：５０７－５１５（２０１２）、Ｃｏｃａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２８（９）：２７８６－２７９３（２０１７）、Ｎａｄｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ９３（６）：１４０９－１４１６（２０１８）、Ｔｕｍｍａｌａｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２５（６）：４８０－４８６（２０１６）、Ｇｏｈｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２３（３）：５１６－５２４（２０１２）、Ｋｒｏｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｃａｒｅ ３７（１）：２２６－２３４（２０１４）、Ｂｈａｔｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２９（１１）：２７１３－２７２１（２０１８））。過去のある研究では、単一施設でのＥＨＲから得られた臨床データにバイオマーカーを含めることで、臨床モデル単独よりも予測性能が向上することが判明した（Ｃｈａｕｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ３６０（２０２０））。しかし、この研究には、蔓延しているＣＫＤを有する患者がほとんど含まれていなかった（Ｔ２Ｄのコホートではおおよそ１／３がＣＫＤを有し、ＡＰＯＬ１高リスクコホートでは１／４がＣＫＤを有していた）。しかし、本明細書で上述した方法では、バイオマーカー濃度及びＥＨＲデータを機械学習アルゴリズムに組み込むことにより、ＤＫＤ患者のリスクの多次元的表現を提供することができ、将来の進行に関する改善された予後推定値を生成することができる（Ｔａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ ３１５（２）：１６４－１７４（２０１６）、Ｔａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ ３０５（１５）：１５５３－１５５９（２０１１））。複数の血漿バイオマーカーと限られた臨床データ特徴とを組み込んだ他の複合検査は、Ｔ２Ｄを有する個人における偶発性ＣＫＤを正確に予測することが示されているが、腎機能の進行性低下の予測は継続的な課題である（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ ９（１０）（２０２０）、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔ ３３（１２）（２０１９））。しかし、ＫＩＤＮＥＹＩＮＴＥＬＸ検査の目標は、確定したＤＫＤを有する患者のうち、腎不全による腎機能の進行性低下のリスクが最も高い者と、経時的に進行する可能性が低いＣＫＤを有する者とを判定することである。

【0144】

したがって、血漿バイオマーカーとＥＨＲデータとを組み合わせた機械学習モデルは、大規模な学術医療センターのＴ２ ＤＫＤ患者における標準的な臨床モデルと比べて、腎機能の進行性低下の予測を大幅に改善させることができる。

【0145】

本開示の方法で使用するための機械学習による予後リスクスコアアッセイは、例えば、米国特許出願第６２／９７６，７６７号、米国特許出願第６２／９７６，７６１号、及び米国特許出願第６３／０１６，８６８号（これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているように使用することができる。

【0146】

ＩＶ．処置または防止の方法
腎機能低下及び／またはＥＳＫＤ（本明細書ではＥＳＲＤともいう）の処置または防止を、それを必要とする対象において行うための方法及び組成物もまた、本開示の特徴である。一実施形態において、本開示は、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する対象、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する疑いのある対象、あるいは腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを発症するリスクを持つ対象を処置する方法を提供する。他の実施形態では、腎機能低下及び／またはＥＳＫＤに関連する障害を有する対象は、本開示の予測方法によって識別されることなく、本明細書に記載される方法を使用して処置され得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される処置の方法は、そのような対象の腎機能（本明細書では「腎臓機能」ともいう）を改善させる。

【0147】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、本開示の療法を対象に施与することを含む。本開示の療法は、本明細書で上述した１つ以上の防御タンパク質の発現及び／または機能を増加させる、治療有効量のタンパク質または核酸分子を含み得る。例えば、本開示の療法は、治療有効量の１つ以上の防御タンパク質（例えば、治療有効量の組換えＳＰＡＲＣ、組換えＣＣＬ５、組換えＡＰＰ、組換えＰＦ４、組換えＤＮＡＪＣ１９、組換えＡＮＧＰＴ１、組換えＴＮＦＳＦ１２、組換えＦＧＦ２０、及び／または組換えＴｅｓｔｉｃａｎ－２）を含み得る。あるいは、本開示の療法は、治療有効量の１つ以上の防御タンパク質のアナログ（例えば、治療有効量のＳＰＡＲＣアナログ、ＣＣＬ５アナログ、ＡＰＰアナログ、ＰＦ４アナログ、ＤＮＡＪＣ１９アナログ、ＡＮＧＰＴ１アナログ、ＴＮＦＳＦ１２アナログ、ＦＧＦ２０アナログ、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２アナログ）を含み得る。防御タンパク質のアナログは、変異型ポリペプチド（例えば、変異型ＳＰＡＲＣポリペプチド、変異型ＣＣＬ５ポリペプチド、変異型ＡＰＰポリペプチド、変異型ＰＦ４ポリペプチド、変異型ＤＮＡＪＣ１９ポリペプチド、変異型ＡＮＧＰＴ１ポリペプチド、変異型ＴＮＦＳＦ１２ポリペプチド、変異型ＦＧＦ２０ポリペプチド、及び／または変異型Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２ポリペプチド）であり得る。あるいは、防御タンパク質のアナログは、防御タンパク質（例えば、ＳＰＡＲＣポリペプチド、ＣＣＬ５ポリペプチド、ＡＰＰポリペプチド、ＰＦ４ポリペプチド、ＤＮＡＪＣ１９ポリペプチド、ＡＮＧＰＴ１ポリペプチド、ＴＮＦＳＦ１２ポリペプチド、ＦＧＦ２０ポリペプチド、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２ポリペプチド）と、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などの融合タンパク質でもよい。あるいは、防御タンパク質のアナログは、１つ以上の防御タンパク質の模倣薬（例えば非ペプチド模倣薬）（例えば、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２、ＦＧＦ２０、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２の模倣薬）でもよい。他の場合には、防御タンパク質のアナログは、１つ以上の防御タンパク質のアゴニスト（例えば、ＳＰＡＲＣアゴニスト、ＣＣＬ５アゴニスト、ＡＰＰアゴニスト、ＰＦ４アゴニスト、ＤＮＡＪＣ１９アゴニスト、ＡＮＧＰＴ１アゴニスト、ＴＮＦＳＦ１２アゴニスト、ＦＧＦ２０アゴニスト、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２アゴニスト）であり得る。本開示で使用するためのアゴニストは、防御タンパク質の受容体に対する抗体などのアゴニスト抗体（例えば、アゴニストＳＰＡＲＣ受容体抗体、アゴニストＣＣＬ５受容体抗体、アゴニストＡＰＰ受容体抗体、アゴニストＰＦ４受容体抗体、アゴニストＤＮＡＪＣ１９受容体抗体、アゴニストＡＮＧＰＴ１受容体抗体、アゴニストＴＮＦＳＦ１２受容体抗体、アゴニストＦＧＦ２０受容体抗体、及び／またはアゴニストＴｅｓｔｉｃａｎ－２受容体抗体であり得る。さらに他の実施形態では、本開示の療法は、治療有効量の、１つ以上のタンパク質タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２、ＦＧＦ２０、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２のうちの１つ以上をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を含み得る。

【0148】

ＡＮＧＰＴ１
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＡＮＧＰＴ１の発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＡＮＧＰＴ１の治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＡＮＧＰＴ１（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＡＮＧＰＴ１アナログ（例えば、変異型ＡＮＧＰＴ１ポリペプチド、あるいは、ＡＮＧＰＴ１ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＡＮＧＰＴ１融合タンパク質）、ＡＮＧＰＴ１模倣薬（例えば、ＡＮＧＰＴ１の非ペプチド模倣薬）、ＡＮＧＰＴ１アゴニスト（例えば、アゴニストＡＮＧＰＴ１受容体抗体）、及び／またはＡＮＧＰＴ１をコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0149】

ＡＮＧＰＴ１のそのような治療的使用は、例えばＷＯ２０１８０６７９９１Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０１８０６７９９１Ａ１は、ＡＮＧＰＴ１などのアンジオポエチンまたはアンジオポエチン様タンパク質の発現、活性及び／または機能を促進する１つまたは複数の調節剤と機能不全Ｔ細胞を接触させることにより、がん及び慢性感染症などの病態を処置するために使用される、Ｔ細胞機能不全を調節する方法を記載している。

【0150】

あるいは、ＡＮＧＰＴ１の治療的使用は、例えばＵＳ２００９０３０４６８０Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＵＳ２００９０３０４６８０Ａ１は、個人における川崎病の処置、防止または診断のための医薬組成物を記載しており、この組成物は、ＡＮＧＰＴ１またはその調節因子を含む分子を含む。

【0151】

ＴＮＦＳＦ１２
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＴＮＦＳＦ１２の発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＴＮＦＳＦ１２またはＴＷＥＡＫの治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＴＮＦＳＦ１２（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＴＮＦＳＦ１２アナログ（例えば、変異型ＴＮＦＳＦ１２ポリペプチド、あるいは、ＴＮＦＳＦ１２ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＴＮＦＳＦ１２融合タンパク質）、ＴＮＦＳＦ１２模倣薬（例えば、ＴＮＦＳＦ１２の非ペプチド模倣薬）、ＴＮＦＳＦ１２アゴニスト（例えば、アゴニストＴＮＦＳＦ１２受容体抗体）、及び／またはＴＮＦＳＦ１２をコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0152】

ＴＮＦＳＦ１２のそのような治療的使用は、例えばＷＯ２０１００８８５３４Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０１００８８５３４Ａ１に記載されているように、ＴＮＦＳＦ１２は、ヒト及び齧歯類の膵臓細胞の集団を増大させ、膵臓における内分泌系譜に傾倒した前駆細胞の出現を誘導することができる。したがって、ＴＮＦＳＦ１２受容体（ＴＮＦＳＦ１２－Ｒ）のアゴニストは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで膵臓組織を再生し、膵臓細胞の集団を増大させるための方法で使用することができる。これらの方法は、細胞置換療法のために膵臓前駆細胞の増強が望ましい、糖尿病などを含む疾患または病態、及び膵臓の全部または一部の喪失をもたらす病態を処置するために使用することができる。そのような方法で使用する場合、ＴＮＦＳＦ１２－Ｒアゴニストは、ＴＮＦＳＦ１２（例えば、ヒトまたはマウス起源のＴＮＦＳＦ１２ポリペプチド）、ＴＮＦＳＦ１２アナログ（例えば、変異型ＴＮＦＳＦ１２ポリペプチド、あるいは、ＴＮＦＳＦ１２ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＴＮＦＳＦ１２融合タンパク質）、ＴＮＦＳＦ１２模倣薬（例えば、ＴＮＦＳＦ１２の非ペプチド模倣薬）、及びアゴニストＴＮＦＳＦ１２－Ｒ抗体であり得る。

【0153】

あるいは、ＴＮＦＳＦ１２の治療的使用は、例えばＷＯ２００１０８５１９３Ａ２に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２００１０８５１９３Ａ２は、新血管形成を促進するために血管新生活性を増強する方法における、相乗的に有効な量のＴＮＦＳＦ１２アゴニスト及び血管新生因子の使用を記載している。そのようなＴＮＦＳＦ１２アゴニストとしては、可溶性組換えＴＮＦＳＦ１２タンパク質ならびにＷＯ９８／０５７８３、ＷＯ９８／３５０６１及びＷＯ９９／１９４９０で教示されているＴＮＦＳＦ１２アゴニストが挙げられる。

【0154】

ＦＧＦ２０
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＦＧＦ２０の発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＦＧＦ２０の治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＦＧＦ２０（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＦＧＦ２０アナログ（例えば、変異型ＦＧＦ２０ポリペプチド、あるいは、ＦＧＦ２０ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＦＧＦ２０融合タンパク質）、ＦＧＦ２０模倣薬（例えば、ＦＧＦ２０の非ペプチド模倣薬）、ＦＧＦ２０アゴニスト（例えば、アゴニストＦＧＦ２０受容体抗体）、及び／またはＦＧＦ２０をコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0155】

ＦＧＦ２０のそのような治療的使用は、例えばＷＯ２００５０１９４２７Ａ２に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２００５０１９４２７Ａ２は、治療有効量の単離ＦＧＦ２０ポリペプチド（例えば、ＦＧＦ２０ポリペプチドに増加した安定性を付与する変異を有するＦＧＦ２０ポリペプチド）を投与することによって高リン酸血症状態を処置する方法を記載している。ＷＯ２００５０１９４２７Ａ２には、ＦＧＦ２０ポリペプチドのレベルを上昇させる治療有効量の試薬を投与することによって高リン酸血症状態を処置する方法も記載されている。ＷＯ２００５０１９４２７Ａ２には、治療有効量のＦＧＦ２０またはＦＧＦ２０ポリペプチドのレベルを上昇させる試薬を対象に投与することによって、対象の動脈または軟部組織中のカルシウム及びリン酸塩の沈着を伴う病態を処置する方法も記載されている。

【0156】

あるいは、ＦＧＦ２０の治療的使用は、例えばＷＯ２０２０１６０４６８Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０２０１６０４６８Ａ１は、ＦＧＦ２０を含む群から選択される２つ以上のタンパク質の発現及び／または活性を集合的に増加させる１つ以上の薬剤を患者に提供することによって、神経認知障害（ＮＣＤ）を有すると診断された患者を処置する方法を記載している。

【0157】

ＳＰＡＲＣ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＳＰＡＲＣの発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＳＰＡＲＣの治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＳＰＡＲＣ（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＳＰＡＲＣアナログ（例えば、変異型ＳＰＡＲＣポリペプチド、あるいは、ＳＰＡＲＣポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＳＰＡＲＣ融合タンパク質）、ＳＰＡＲＣ模倣薬（例えば、ＳＰＡＲＣの非ペプチド模倣薬）、ＳＰＡＲＣアゴニスト（例えば、アゴニストＳＰＡＲＣ受容体抗体）、及び／またはＳＰＡＲＣをコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0158】

ＳＰＡＲＣのそのような治療的使用は、例えばＷＯ２００８１２８１６９Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２００８１２８１６９Ａ１は、血管新生阻害剤の非存在下または存在下で、治療有効量のＳＰＡＲＣポリペプチド及び治療有効量の疎水性化学療法剤（例えば、タキサンなどの微小管阻害剤）を含む、哺乳動物の腫瘍を処置するための組成物を記載している。ＷＯ２００８１２８１６９Ａ１の組成物で使用されるＳＰＡＲＣポリペプチドは、外因性野生型ＳＰＡＲＣまたは外因性変異体ＳＰＡＲＣ（ヒトＳＰＡＲＣタンパク質の成熟型における第３のグルタミンの欠失に対応する変異を有する）のいずれかである。

【0159】

ＳＰＡＲＣの治療的使用は、例えばＷＯ２０１３１７０３６５Ａ１に記載されているような治療的使用も含み得る。ＷＯ２０１３１７０３６５Ａ１は、ＳＰＡＲＣポリペプチド及びＧＲＰ７８の投与による、がん細胞の感作の方法を開示している。ＷＯ２０１３１７０３６５Ａ１の方法で使用されるＳＰＡＲＣポリペプチドは、完全長３０３アミノ酸ＳＰＡＲＣタンパク質配列、及び、当技術分野で公知である、化学感作活性を保持するその任意の断片またはバリアントを指し、これには、Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＬＯＳ ＯＮＥ １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２６３９０ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ：１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１１）に記載されているいくつかのＳＰＡＲＣポリペプチド、及びＷＯ／２００８／００００７９で試験されたＳＰＡＲＣ断片が含まれる。

【0160】

あるいは、ＳＰＡＲＣの治療的使用は、例えば、Ｃｈｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９：１３８（２０１０））に記載されているような治療的使用を含み得る。Ｃｈｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌは、タンパク質のフォリスタチンドメイン（ＦＳ－Ｅ）に対応するＳＰＡＲＣペプチド、特に、ＦＳ－ＥのＣ末端ループに対応するペプチドＦＳＥＣが、神経芽細胞腫において強力な抗血管新生作用及び抗腫瘍形成作用を有することを記載している。

【0161】

ＣＣＬ５
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＣＣＬ５の発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＣＣＬ５の治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＣＣＬ５（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＣＣＬ５アナログ（例えば、変異型ＣＣＬ５ポリペプチド、あるいは、ＣＣＬ５ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＣＣＬ５融合タンパク質）、ＣＣＬ５模倣薬（例えば、ＣＣＬ５の非ペプチド模倣薬）、ＣＣＬ５アゴニスト（例えば、アゴニストＣＣＬ５受容体抗体）、及び／またはＣＣＬ５をコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0162】

ＣＣＬ５のそのような治療的使用は、例えば、Ｂｈａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１：１８４９（２０２０））及び／またはＸｉｅ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ １１８（９）ｅ２０１７２８２１１８（２０２１））に記載されているような治療的使用を含み得る。Ｂｈａｔ ｅｔ ａｌは、アレナウイルスリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）処置後の強力なＣＣＬ５産生について記載している。Ｘｉｅ ｅｔ ａｌは、毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）遺伝子療法後のケモカインＣＣＬ５の広範な発現を示している。

【0163】

あるいは、ＣＣＬ５の治療的使用は、例えばＷＯ２０２００６８２６１Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０２００６８２６１Ａ１は、免疫調節性ドメインに作動可能に連結されたコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節性融合タンパク質であって、免疫調節性ドメインがＣＣＬ５などの１つ以上のケモカインを含む、免疫調節性融合タンパク質、及び、それを例えばがんを処置するために使用する方法を記載している。

【0164】

他の場合には、ＣＣＬ５の治療的使用は、例えばＷＯ２０２０１４６８５７Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０２０１４６８５７Ａ１は、ケモカイン部分に融合したプロペプチド部分を含むプロケモカイン部分（ここで、ケモカイン部分は、Ｎ末端及びＣ末端を含み、ケモカイン部分は、ＣＣＬ５との少なくとも９０％の類似性を有するケモカインアミノ酸配列を含む）と、プロケモカイン部分に連結されたターゲティング部分（ここで、ターゲティング部分は、腫瘍、線維症またはアルツハイマー病に関連する抗原または受容体への結合特異性を有する）とを含む、プロテアーゼ放出型ケモカインタンパク質（ＰＡＲＫ）を記載している。

【0165】

ＡＰＰ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＡＰＰの発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＡＰＰの治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＡＰＰ（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＡＰＰアナログ（例えば、変異型ＡＰＰポリペプチド、あるいは、ＡＰＰポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＡＰＰ融合タンパク質）、ＡＰＰ模倣薬（例えば、ＡＰＰの非ペプチド模倣薬）、ＡＰＰアゴニスト（例えば、アゴニストＡＰＰ受容体抗体）、及び／またはＡＰＰをコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0166】

ＡＰＰのそのような治療的使用は、例えばＷＯ２０２０２０１４７１Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０２０２０１４７１Ａ１は、肝疾患の処置または防止に使用するための化合物を記載しており、この化合物は、アミロイドベータ関連タンパク質であり、アミロイドベータ関連タンパク質は、アミロイドベータタンパク質、それに由来するアミロイドベータペプチド、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＡＰＰからのアミロイドベータペプチドの生成に関与する化合物、またはアミロイドベータタンパク質もしくはそれに由来するアミロイドペプチドの分解を阻害する化合物からなる群から選択される。アミロイド前駆体タンパク質または「ＡＰＰ」は、多くの組織で発現され、ニューロンのシナプスに集中する内在性膜タンパク質を指す。ＡＰＰは、タンパク分解によってベータアミロイド（Ａｂ）を生成する前駆体分子として知られている。特に、アミロイドベータタンパク質に由来するアミロイドベータペプチドは、アミロイドベータ４０、アミロイドベータ４２、及びアミロイドベータ３８からなる群から選択される。さらに、ＡＰＰからのアミロイドベータペプチドの生成に関与する化合物は、アルファ－セクレターゼ、ベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）、ガンマ－セクレターゼ、好ましくはプレセニリンから選択される酵素であり得る。

【0167】

あるいは、ＡＰＰの治療的使用は、例えばＷＯ２０２０１６０４６８Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０２０１６０４６８Ａ１は、ＡＰＰを含む群から選択される２つ以上のタンパク質の発現及び／または活性を集合的に増加させる１つ以上の薬剤を患者に提供することによって、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び／または前頭側頭葉型認知症などの神経認知障害を有するまたはその発症リスクを持つ患者を処置するための組成物及び方法を記載している。ＡＰＰ及びアミロイドベータＡ４タンパク質には、ＡＰＰ遺伝子またはタンパク質の野生型形態、ならびに野生型ＡＰＰタンパク質のバリアント（例えば、とりわけ、スプライスバリアント、トランケーション、コンカテマー、及び融合構築物）及びそれをコードする核酸が含まれる。

【0168】

ＰＦ４
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＰＦ４の発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＰＦ４の治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＰＦ４（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＰＦ４アナログ（例えば、変異型ＰＦ４ポリペプチド、あるいは、ＰＦ４ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＰＦ４融合タンパク質）、ＰＦ４模倣薬（例えば、ＰＦ４の非ペプチド模倣薬）、ＰＦ４アゴニスト（例えば、アゴニストＰＦ４受容体抗体）、及び／またはＰＦ４をコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0169】

ＰＦ４のそのような治療的使用は、例えばＷＯ２００９１１７７１０Ａ２に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２００９１１７７１０Ａ２は、（ｉ）ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４へのＭＩＦの結合、及び／または（ｉｉ）ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４のＭＩＦ活性化；（ｉｉｉ）ホモ多量体を形成するＭＩＦの能力；またはそれらの組み合わせを阻害する活性剤を対象に投与することにより、ＭＩＦ媒介性障害を処置する方法を記載しており、この活性剤は、組換えＰＦ４であり得る。

【0170】

あるいは、ＰＦ４の治療的使用は、例えばＷＯ１９９４０１３３２１Ａ１に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ１９９４０１３３２１Ａ１は、骨髄系細胞を抑制するケモカインの相乗的組み合わせを投与することによって骨髄系細胞を抑制するプロセスを記載しており、この相乗的組み合わせは、ＰＦ４からなる群から選択される少なくとも１つのケモカインを含む。ＷＯ１９９４０１３３２１Ａ１の方法及び組成物で使用されるＰＦ４は、天然のヒトＰＦ４である。

【0171】

ＤＮＡＪＣ１９
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、ＤＮＡＪＣ１９の発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、ＤＮＡＪＣ１９の治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＤＮＡＪＣ１９（例えば、ヒトまたはマウス起源のもの）、ＤＮＡＪＣ１９アナログ（例えば、変異型ＤＮＡＪＣ１９ポリペプチド、あるいは、ＤＮＡＪＣ１９ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＤＮＡＪＣ１９融合タンパク質）、ＤＮＡＪＣ１９模倣薬（例えば、ＤＮＡＪＣ１９の非ペプチド模倣薬）、ＤＮＡＪＣ１９アゴニスト（例えば、アゴニストＤＮＡＪＣ１９受容体抗体）、及び／またはＤＮＡＪＣ１９をコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0172】

ＤＮＡＪＣ１９のそのような治療的使用は、例えばＷＯ２０１６１７０３４８Ａ２に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０１６１７０３４８Ａ２は、治療目的で標的遺伝子の発現を調節するための低分子活性化ＲＮＡについて記載しており、この標的遺伝子はＤＮＡＪＣ１９であり得る。

【0173】

あるいは、ＤＮＡＪＣ１９の治療的使用は、例えばＷＯ２０１７１９１２７４Ａ２に記載されているような治療的使用を含み得る。ＷＯ２０１７１９１２７４Ａ２は、代謝障害もしくは内分泌障害、がん、感染性疾患または免疫不全などの疾患、障害または病態における遺伝子療法において使用される医薬として使用される組成物を調製するのに有用な、コード配列を含むＲＮＡを記載しており、ここで、コードされるペプチドまたはタンパク質は、限定されるものではないがＤＮＡＪＣ１９を含む群から選択される治療用タンパク質またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0174】

Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２である、あるいはＴｅｓｔｉｃａｎ－２の発現及び／または機能を増加させる治療有効量のタンパク質または核酸分子を対象に投与することなど、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２の治療的使用を含む。例えば、本明細書に記載される処置の方法は、治療有効量の組換えＴｅｓｔｉｃａｎ－２、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２アナログ（例えば、変異型Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２ポリペプチド、あるいは、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２ポリペプチドと、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、及び／または取り込み／投与を向上させる１つ以上のポリペプチド部分とを含有するキメラタンパク質などのＴｅｓｔｉｃａｎ－２融合タンパク質）、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２模倣薬（例えば、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２の非ペプチド模倣薬）、Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２アゴニスト（例えば、アゴニストＴｅｓｔｉｃａｎ－２受容体抗体）、及び／またはＴｅｓｔｉｃａｎ－２をコードする核酸分子を対象に投与することを含み得る。

【0175】

特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物は、進行性腎機能低下を発症するリスクを持つヒト対象を識別するために使用され（対象は腎機能低下を既に有している可能性があり、その場合、リスクはさらなる進行に関して評価される）、リスクを持つものとして識別されたヒト対象に、腎機能を改善させる（すなわち、腎臓病の進行を緩徐化する）ための療法が施与される。療法の例は、体重減少、高血圧をコントロールする薬剤、及び／または高コレステロールレベルをコントロールする薬剤を含むが、これらに限定されない。このような薬剤は、進行性腎臓病を引き起こし得る問題、及びその結果として起こり得る合併症、例えば高血圧を処置するために使用され得る。本明細書で開示される方法は、特定の実施形態では、追加の薬剤、例えば抗線維症剤を対象に投与することも含む。例示的な薬剤は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）及びアンジオテンシンＩＩ受容体１型遮断薬（ＡＲＢ）、レニン阻害剤（アリスキレン、エナルキレン、ザルキレン）、ミネラルコルチコイド受容体遮断薬（スピロノラクトン、エプレレノン）、バソペプチダーゼ阻害剤（例えばＡＶＥ７６８８、オマパトリラト）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、アトルバスタチンまたはシンバスタチンなどのスタチンが、ヒト対象のコレステロールレベルを低下させるために投与される。

【0176】

さらに、本明細書に記載される治療方法において有用な核酸分子（例えばＤＮＡ及び／またはｍＲＮＡ核酸分子）は、合成されたものでもよい。「合成」という用語は、核酸分子が単離されており、内因性前駆体ｍＲＮＡ分子などの天然に存在する核酸分子と配列（配列全体）及び／または化学構造において同一ではないことを意味する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は天然に存在する核酸の配列と同一の配列全体を有しないが、そのような分子は天然に存在する配列の全部または一部を包含し得る。しかし、細胞に投与された合成核酸は、その後、その構造または配列が、成熟ｍＲＮＡ配列などの非合成核酸または天然に存在する核酸と同じになるように、細胞内で修飾または変更され得ることが企図される。例えば、合成核酸は、前駆体ｍＲＮＡの配列とは異なる配列を有し得るが、その配列は細胞に入ると変更されて、内因性のプロセシングされたｍＲＮＡと同じになり得る。「単離された」という用語は、本開示の核酸分子が（配列または構造の点で）異なる望まれない核酸分子から最初に分離され、それにより、単離された核酸の集団が少なくとも約９０％均質になり、他のポリヌクレオチド分子に関して少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９、または１００％均質になり得ることを意味する。本開示の多くの実施形態において、核酸は、細胞内の内因性核酸とは別にｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたことにより単離されている。しかし、単離された核酸はその後、一緒に混合またはプールされ得ることが理解されるであろう。

【0177】

核酸は、例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など、当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。

【0178】

核酸合成は、標準的な方法に従って行われる。例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ（１９８０）を参照されたい。さらに、米国特許第４，７０４，３６２号、米国特許第５，２２１，６１９号、及び米国特許第５，５８３，０１３号は各々、合成核酸を調製する様々な方法を記載している。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例には、参照により本明細書に組み込まれているＥＰ２６６，０３２に記載されているような、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホラミダイト化学及び固相技術を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成によって、または各々参照により本明細書に組み込まれているＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．．，１９８６及び米国特許第５，７０５，６２９号に記載されているような、デオキシヌクレオシドＨ－ホスホネート中間体を介して作製された核酸が含まれる。本発明の方法では、１つ以上のオリゴヌクレオチドが使用され得る。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成メカニズムが、例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、同第４，８１６，５７１号、同第５，１４１，８１３号、同第５，２６４，５６６号、同第４，９５９，４６３号、同第５，４２８，１４８号、同第５，５５４，７４４号、同第５，５７４，１４６号、同第５，６０２，２４４号で開示されており、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0179】

酵素的に生成された核酸の非限定的な例には、ＰＣＲなどの増幅反応で酵素によって生成されたもの（例えば、各々参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，６８２，１９５号を参照されたい）、または参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６４５，８９７号に記載されているオリゴヌクレオチドの合成によって生成されたものが含まれる。

【0180】

オリゴヌクレオチド合成は、当業者にはよく知られている。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成メカニズムが、例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、同第４，８１６，５７１号、同第５，１４１，８１３号、同第５，２６４，５６６号、同第４，９５９，４６３号、同第５，４２８，１４８号、同第５，５５４，７４４号、同第５，５７４，１４６号、同第５，６０２，２４４号で開示されており、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0181】

細胞内で核酸を産生させる組換え方法は、当業者にはよく知られている。これらには、標的細胞または単に宿主細胞であってもよい細胞に（所望のＲＮＡ分子を大量に産生させるために）核酸を送達するためのベクター、プラスミド、コスミド、及び他のビヒクルの使用が含まれる。あるいは、そのようなビヒクルは、ＲＮＡ分子を生成するための試薬が存在する限り、無細胞系の環境で使用してもよい。そのような方法には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００３、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００１、及びＳａｍｂｒｏｏｋ，１９８９に記載されているものが含まれ、これらは参照により本明細書に組み込まれている。

【0182】

特定の実施形態では、本開示の核酸分子は、合成されたものではない。いくつかの実施形態では、核酸分子は、天然に存在する核酸の化学構造及び天然に存在する核酸の配列を有する。このような非合成核酸は、組換え技術の使用に加えて、オリゴヌクレオチドの作出に使用される技術を利用することなどにより、化学的に生成することもできる。

【0183】

本開示に係る治療剤（例えば、防御タンパク質）の投与または送達は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の経路を介するものであり得る。例えば、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内もしくは静脈内注射、または標的組織（例えば、心臓組織）への直接注射によるものであり得る。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物を含む医薬組成物は、治療剤を心臓に送達するためのカテーテルシステムまたは冠循環を隔離するシステムによって投与することもできる。治療剤を心臓及び冠血管系に送達するための様々なカテーテルシステムが当技術分野では公知である。本発明での使用に好適なカテーテルベースの送達方法または冠血管隔離方法のいくつかの非限定的な例が、米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６，９５３，４６６号、ＷＯ２００５／０８２４４０、ＷＯ２００６／０８９３４０、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、及び米国特許公開第２００７／００６０９０７号で開示されており、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0184】

治療剤（例えば、防御タンパク質）は、非経口投与しても腹腔内投与してもよい。例として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としてのコンジュゲートの溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、また油中で分散液を調製してもよい。通常の保管条件及び使用条件下では、これらの調製物は概して、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。

【0185】

注射用途またはカテーテル送達に好適な治療剤（例えば、防御タンパク質）には、例えば、無菌の水溶液または分散液及び無菌の注射可能な溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が含まれる。概して、これらの調製物は無菌であり、容易に注射できる程度の流動性を持つ。調製物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（複数可）、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物中に使用することによってもたらされ得る。

【0186】

本開示を以下の実施例によってさらに説明するが、これは限定と解釈されるべきではない。

【実施例】

【0187】

本明細書では、進行性腎機能低下及び／またはＥＳＫＤを有する対象、あるいはその疑いのある対象、あるいはそれを発症する可能性のある対象の診断、予後判定、及び識別に有用なバイオマーカーを識別する研究について説明する。以下の実施例は例示を目的として含まれるものに過ぎず、限定を意図するものではない。

【0188】

過去数十年にわたり、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有するヒトにおける糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）のメカニズムを理解するために、かなりの研究努力が払われてきた。その研究において、主要な焦点は、ＤＫＤの様々な兆候を発現する高いリスクに関連する因子及びマーカーに当てられていた（Ｐａｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ． Ｉｎ：Ｂｒｅｎｎｅｒ ＢＭ，ｅｄ．Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｒｅｃｔｏｒ’ｓ Ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ．７ｔｈ ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ． （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００４）、ＪＡＭＡ ２９０：２１５９－２１６７（２００３）、Ｌａｎｃｅｔ ３５２：８３７－８５３（１９９８）、Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ９３：１１９８－１２０６（２０１８）、Ｎｉｅｗｃｚａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５：８０５－８１３（２０１９）、Ａｈｌｕｗａｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）１０：６４９（２０１９））。最近では、ＤＫＤからの防御に関連する因子及びバイオマーカーの探索に関心が集まっている。糖尿病の期間が長いにもかかわらず後期合併症を起こさなかった対象、いわゆる糖尿病長期罹患生存者は、そのような防御因子／バイオマーカーを豊富に持つ可能性があるという仮説が立てられている。このアプローチは、ＤＫＤに関する新しい仮説の発展をもたらしただけでなく、ＤＫＤを防止するための新しい治療標的としてのピルビン酸キナーゼＭ２（ＰＫＭ２）の識別にもつながる所見を既に提供している（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：７５３－７６２（２０１７））。

【0189】

材料及び方法
本明細書に記載される研究の対象は、Ｊｏｓｌｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｔｕｄｙ（ＪＫＳ）の参加者の中から選択された。Ｔｈｅ Ｊｏｓｌｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓは、両種類の糖尿病における腎機能低下の決定因子及び自然経過を調査する縦断的観察研究であるＪＫＳのインフォームドコンセント、リクルート及び検査プロトコルを承認した。

【0190】

Ｊｏｓｌｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｔｕｄｙ（ＪＫＳ）
簡潔に述べると、ＪＫＳは、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の２つのコンポーネントを含む。Ｔ１Ｄコンポーネントの対象は、１９９１年から２００９年の間にＪｏｓｌｉｎクリニックに通院したＴ１Ｄを有する１８～６４歳の成人３，５００名の中から継続的にリクルートされた。登録（ベースライン調査）前の２年間に取得されたＡＣＲの中央値に従って、マクロアルブミン尿（ＡＣＲ≧３００μｇ／ｍｇ）、ミクロアルブミン尿（３０≦ＡＣＲ＜３００μｇ／ｍｇ）、及び正常アルブミン尿（ＡＣＲ＜３０μｇ／ｍｇ）の３つのサブグループに対象が分類された。その目的は、マクロアルブミン尿対象及びミクロアルブミン尿対象の全員、ならびに同様の数の正常アルブミン尿対象をＪＫＳにリクルートすることであった。マクロアルブミン尿対象５２６名、ミクロアルブミン尿対象５６３名、及び正常アルブミン尿対象７９５名の計１８８４名が登録された。

【0191】

Ｔ２Ｄコホートの対象は、２００３年から２００９年の間にＪｏｓｌｉｎクリニックに通院したＴ２Ｄを有する３５～６４歳の成人４５００名の中から継続的にリクルートされた。登録（ベースライン調査）前の２年間に取得されたＡＣＲの中央値に従って、Ｔ１Ｄについて上述したように３つのサブグループに対象が分類された。その目的は、マクロアルブミン尿対象及びミクロアルブミン尿対象全員、ならびに同様の数の正常アルブミン尿対象をＪＫＳにリクルートすることであった。マクロアルブミン尿対象２６１名、ミクロアルブミン尿対象４８２名、及び正常アルブミン尿対象７３３名の計１，４７６名が登録された。

【0192】

ＪＫＳに登録されたすべての対象は、定期的な診療所訪問中に年２回の調査を受けるか、または特別訪問に招待されるか、または自宅で調査を受けた。これらの調査は、対象が末期腎臓病（ＥＳＫＤ）を発症するか、死亡するか、フォローアップ不能になるか、または２０１５年のフォローアップ終了まで実施された。調査で取得された生物検体は－８５℃で保管された。ベースラインでの腎機能及びフォローアップ訪問中のその変化を判定するために、血清クレアチニンが使用された。血清クレアチニン測定値は、Ｓｋｕｐｉｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ８２：５８９－５９７（２０１２））によって説明されたプロトコルを使用して経時的に較正された。糸球体濾過率（ＧＦＲ）の推定値は、Ｌｅｖｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １５０：６０４－６１２（２００９））によって説明されたＣｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎの式を使用して取得された。

【0193】

フォローアップ中の腎機能変化の径路のパターンを分類するための第１のステップは、それらが線形であるか非線形であるかを判定することであった。ほとんどの推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）径路は検査時に線形に見えたが、この印象は、線形モデルとスプラインモデルとの両方を各患者の腎機能の径路に当てはめることによって統計的に検証された。Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １４１：２８７－２９０（１９８４））によって説明され、Ｓｈａｈ ａｎｄ Ｌｅｖｅｙ（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２：１１８６－１１９１（１９９２））によって使用されたアプローチを適用することで、フォローアップ中の個人の連続的な腎機能変化が調べられた。この研究の参加者は、７～１５年間のフォローアップ中に５回以上のｅＧＦＲ判定を受けた。この方法は、各参加者の腎機能の径路を、単純な線形モデルとして、また、個別に判定された点で接続された線形セグメントを含むスプラインモデルとして表す。線形モデル及びスプラインモデルが比較され、線形モデルは、０．０５の名目上の有意性、及びスプラインセグメントの数によって決定される自由度（ｎ－１）で棄却された。大部分は線形の傾きを有していた。ｅＧＦＲ低下の傾きを判定するために、各個人の径路の線形成分を抽出することで、フォローアップ中の全体的なｅＧＦＲ変化の傾きの分布が生成された。このアプローチの詳細は以下に記載されており、Ｓｋｕｐｉｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ８２：５８９－５９７（２０１２））にも記載されている。

【0194】

ＪＫＳに含まれた全対象を２年毎にＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＳＲＤＳ）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｅａｔｈ Ｉｎｄｅｘ（ＮＤＩ）の名簿と照合することで、ＥＳＫＤを発症した患者または死亡した患者が確認された。最後の照会は２０１５年に実施された。ＵＳＲＤＳは、透析及び移植の日付を含む、腎置換療法を受けている米国の患者の名簿を管理している。

【0195】

探索、複製、及び検証コホート
本研究は、３つのＪＫＳコホートを含む。Ｔ１Ｄ対象２１４名の探索コホート及びＴ２Ｄ対象１４４名の複製コホートは、Ｔ１Ｄ及びＴ２ＤにおけるＥＳＫＤの発症を予測するための血清ＴＮＦ－Ｒ１濃度のカットポイント値を判定するための我々の研究に以前に参加していた（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ９２：２５８－２６６（２０１７））。慢性腎臓病（ＣＫＤ）ステージ３及び４の対象を含んでいた以前の研究とは異なり、本研究には、ベースライン調査時にＣＫＤステージ３を有していたＪＫＳの対象が含まれた。検証コホートは、ベースラインでＣＫＤステージ１及び２を有していたＴ１Ｄ対象２９４名からなり、初期ステージのＤＫＤ対象の後期糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）コホートで観察される３つの例示的な防御タンパク質の重要性を調べるために使用された。主な目的は、腎機能異常を有するＴ１Ｄ患者だけでなく、ＤＫＤのステージを問わないあらゆる糖尿病患者における、進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行に対する防御タンパク質を探索することであった。したがって、所見のロバスト性を実証するために、Ｔ１Ｄ探索コホート（後期ステージのＤＫＤを有するＴ１Ｄ患者）、Ｔ２Ｄ複製コホート（後期ステージのＤＫＤを有するＴ２Ｄ患者）、及びＴ１Ｄ検証コホート（初期ステージのＤＫＤを有するＴ１Ｄ患者）という、異なるベースライン特性を持つ３つの非常に異なるコホートを選択した。

【0196】

Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄを有する対象は、マクロアルブミン尿（ＡＣＲ≧３００μｇ／ｍｇ）及びミクロアルブミン尿（ＡＣＲ≧３０μｇ／ｍｇ）を有していた。これらの対象は、ｅＧＦＲ低下の速度（ｅＧＦＲの傾き）を判定し、ＥＳＫＤの発生を確認するために、７～１５年間追跡された。これらの対象からの臨床データ及び血漿検体のすべてが本研究に利用可能であった。これらのコホートの詳細な説明、臨床的特徴の測定値、血清クレアチニンの連続的測定からのｅＧＦＲの傾きの判定、及びＥＳＫＤの発生の確認については、例えば、Ｎｉｅｗｃｚａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５：８０５－８１３（２０１９））及びＹａｍａｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ９２：２５８－２６６（２０１７））に記載されている。３つすべてのコホートにおいて、進行性腎機能低下が低速の者（非進行者）または高速の者（進行者）を定義するための閾値として、ｅＧＦＲ損失＜３．０ｍｌ／分／年が選択された。そのような閾値の理論的根拠は、以前の公表文献で十分に立証され、使用されており（Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １８：１３５３－１３６１（２００７）、Ｋｒｏｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ３７：２２６－２３４（２０１４））、一般集団における年間腎機能喪失の分布の２．５パーセンタイルに対応する（Ｌｉｎｄｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ ３３：２７８－２８５（１９８５））。

【0197】

Ｔ１Ｄ対象の健康な非糖尿病性の親
Ｊｏｓｌｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｔｕｄｙでは、Ｔ１Ｄを有する対象の生きている親も調べられた。Ｔ１Ｄ対象の非糖尿病性親の群は、Ｔ１ＤにおけるＤＫＤの決定因子に関する遺伝的研究から導出された。親のベースライン調査は、ＪＫＳの全参加者と同じプロトコルに従って行われた。調査で取得された生物検体は－８５℃で保管された。本試験では、ベースライン調査時の年齢が５０～６９歳であった白人非糖尿病性親７９名を非糖尿病性コントロールとして使用するために選択した。４０名の親には、糖尿病の期間が長いにもかかわらず腎臓の合併症を起こさなかった子どもがおり、３９名の親には、進行したＤＫＤ（腎機能異常またはＥＳＫＤ）を有する子どもがいた。非糖尿病性親のＴ１Ｄ子孫の臨床表現型は、正常アルブミン尿（ｎ＝４０）、またはＥＳＫＤもしくはタンパク尿（ｎ＝３９）のいずれかである。ベースライン調査で取得された血漿検体をＳＯＭＡｓｃａｎ分析に供した。

【0198】

ＳＯＭＡｓｃａｎプロテオミクス分析
ＳＯＭＡｓｃａｎプロテオミクスプラットフォームは、わずか５０μｌの血漿、血清、または同様に少量の他の様々な生物学的マトリクスで１１２９種のタンパク質の濃度を測定する一本鎖ＤＮＡアプタマーを使用する。タンパク質の完全なリストを表１に示す。ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームは、過去２０年間に開発されたアプタマー技術を利用する新世代のＳＯＭＡＭＥＲ（Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ－ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ）試薬を役立てるものである（Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５－５１０（１９９０）、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８－８２２（１９９０））。ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、天然の折り畳まれた立体構造にあるタンパク質に対して選択されており、折り畳まれたタンパク質に、したがって線形ペプチド配列ではなく三次元形状エピトープに結合する。ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームは非常にダイナミックなレンジを提供し、この大きなダイナミックレンジは、目的のサンプルの３つの連続希釈物と組み合わせた各ＳＯＭＡＭＥＲ試薬の検出範囲に起因する。希釈物は、４０％（存在量の最も少ないタンパク質を検出するための最も濃度の高いサンプル：１００％サンプル中でｆＭ～ｐＭ）、１％（中域）、及び０．００５％（存在量の最も多いタンパク質を検出するための最も濃度の低いサンプル設計：１００％サンプル中で約μＭ）の３つのプールに分けられる。アッセイの読み取り値は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で報告され、元のサンプル中の標的タンパク質量に正比例する。ＳＯＭＡｓｃａｎプロテオミクスプラットフォームの詳細については、他の箇所に記載されている（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１５００４（２０１０）、Ｈａｔｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：７１５３－７１５８（２０１５））。

【0199】

プロテオミクスプロファイリングは、ＳｏｍａＬｏｇｉｃ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）に拠点を置くＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームを使用して行った。製造元が推奨するプロトコルに従って、較正サンプル及び正規化サンプルのセットを備えたＨｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ ＳＯＭＡｓｃａｎ １．１ｋキットを使用した。データの標準化は、ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームのデータクオリティコントロールプロトコルに従って行った。ＳＯＭＡｓｃａｎアッセイ結果を標準化するために、まず、生のＳＯＭＡｓｃａｎアッセイデータを正規化して、ラン内のハイブリダイゼーションのばらつきを除去し（ハイブリダイゼーション正規化）、その後、全サンプルのシグナル中央値正規化によってラン内の他のアッセイの偏りを除去し、最後にラン間のアッセイ差を除去するために較正した。ハイブリダイゼーション及びシグナル中央値正規化のスケール因子の許容基準は０．４～２．５の範囲であると予想される。較正スケール因子の中央値は１．０から±０．２以内であると予想され、全アレイにおける個々のＳＯＭＡｍｅｒ試薬の最低９５％は中央値から±０．４以内である必要がある。すべてのサンプルのＳＯＭＡｓｃａｎデータはクオリティコントロール基準に合格し、分析に適していた。

【0200】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＳＯＭＡｍｅｒ特異性の技術的検証
ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームの特異性を系統的に評価するために、ＳＯＭＡｍｅｒを使用したプロトコルを開発して、無傷タンパク質の親和性プルダウン後のペプチド消化及び非標的質量分析による分析を行った。ＦＧＦ２０ ＳＯＭＡｍｅｒ試薬を解凍し、ボルテックスして２分間スピンダウンし、ＰＣＲ機で１００℃まで５分間加熱し、その後２５℃の水浴でゆっくり冷却した。ＦＧＦ２０ ＳＯＭＡｍｅｒを５０ｍＭ ＡＢバッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．５）に希釈した後、水浴で２５℃まで２０分間冷却した。ストレプトアビジンアガロースビーズを５０ｍＭから７．５％に希釈し、次いで１０００×ｇで２分間スピンした。７．５％ストレプトアビジンアガロースビーズをＡＢバッファーで洗浄し、ボルテックスし、１０００×ｇで２分間遠心分離した。液体を真空引きし、洗浄をもう一度繰り返して合計２回とした。ＳＯＭＡｍｅｒをビーズに加え、２５℃で振盪しながら２０分間インキュベートした。チューブを１０００×ｇで２分間スピンし、液体を真空によって除去した。ビーズを０－Ｗバッファーで２回洗浄し、その後ＡＢバッファーで２回洗浄した。ＡＢバッファー、血漿及び血清サンプル、ならびに組換えタンパク質を、３０μｌのＳＯＭＡｍｅｒ結合ビーズと共に適切なチューブに加えた。これらのチューブを室温で１．５時間振盪した。インキュベーションが完了した後、チューブを１分間スピンダウンし、液体を除去した。サンプルを１－Ｂ遮断薬で１回洗浄し、８００ｒｐｍで５分間振盪し、液体を除去した。サンプルをＡＢバッファーで６回洗浄した後、－８０℃で凍結した。サンプル量の４倍の－２０℃のアセトンを各チューブに加えた。チューブを素早くボルテックスし、－２０℃で１時間インキュベートした。チューブを１３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を真空引きした。

【0201】

洗浄したビーズの各セットに、等量の０．５Ｍ炭酸アンモニウムｐＨ１０．５を加えた。次いで、９７．５％アセトニトリル中の２％（ｖ／ｖ）ヨードエタノール及び０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルホスフィンからなる別の等量の還元／アルキル化カクテルを各サンプルに加えた。溶液に蓋をし、３７℃で１時間インキュベートし、その後、乾燥するまで高速真空引きした。次いで、得られたペレットをトリプシン溶液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭＳ－Ｇｒａｄｅ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中、ｐＨ８．０）に再溶解した。消化を３７℃で一晩行い、その後、μＣ１８ ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して溶液を脱塩した。Ｔｈｅｒｍｏ ＥＡＳＹ－ｎＬＣ ＨＰＬＣシステムを使用して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計により、消化後のサンプルを分析した。７５μｍ×１５ｃｍのＴｈｅｒｍｏ ＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ Ｃ１８カラムを用いて分離を行った。完全高解像度ＭＳスキャンとそれに続く上位１０個の最も強度の高い前駆イオン（３５０～２０００ｍ／ｚの質量範囲内）のＭＳ／ＭＳスキャンを用いるデータ依存取得モードでＭＳデータを収集した。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

【表2-14】

【表2-15】

【表2-16】

【表2-17】

【表2-18】

【表2-19】

【表2-20】

【表2-21】

【表2-22】

【表2-23】

【表2-24】

【表2-25】

【表2-26】

【表2-27】

【表2-28】

【表2-29】

【表2-30】

【表2-31】

【表2-32】

【表2-33】

【表2-34】

【表2-35】

【表2-36】

【表2-37】

【表2-38】

【表2-39】

【表2-40】

【表2-41】

【表2-42】

【表2-43】

【表2-44】

【表2-45】

【表2-46】

【表2-47】

【0202】

統計分析
すべての統計分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ版ＳＡＳバージョン９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して行った。すべてのデータは、該当する場合、平均値及び標準偏差、中央値（２５パーセンタイル及び７５パーセンタイル）、またはカウント（割合）の測度のいずれかとして提示した。スピアマンの順位相関（ｒ_ｓ）を使用して、循環血漿濃度とｅＧＦＲの傾き、ＴＮＦ－Ｒ１、及び臨床共変量との相関関係を評価した。階層的クラスター分析（Ｗａｒｄ法）を使用して防御タンパク質のクラスターを識別した。ベースラインタンパク質ＲＦＵ濃度（ｎ＝１，１２９）を自然対数変換した後、関連性検定の前にその分布の四分位に分類した。発見及び複製の複合コホートならびに検証コホートにおける自然対数変換後の上位３つの防御タンパク質の分布を図１Ａ～１Ｂに示す。単変量及び多変量ロジスティック回帰モデルを使用して、ベースラインで測定された該当する循環血漿タンパク質と転帰測度（ｅＧＦＲ損失≧３．０ｍｌ／分／年またはＥＳＫＤへの進行の場合は進行者）との関連性を検定し、対応する９５％信頼区間と共に該当するタンパク質の循環血漿濃度の１四分位増加ごとのオッズ比として表した。３つの例示的な防御タンパク質の複合効果である防御指数に応じたＥＳＫＤの累積発生率を、ＳＡＳソフトウェアのＰＲＯＣ ＬＩＦＥＴＥＳＴを使用して分析した。非糖尿病者、非進行者、及び進行者における血漿タンパク質濃度間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡとダンの多重比較検定を使用して調べた。有意性は、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１と定義した。

【0203】

実施例１．Ｊｏｓｌｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｔｕｄｙの探索及び複製コホートの特徴
本明細書で開示される研究には、現在進行中のＪｏｓｌｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｔｕｄｙに参加している対象が含まれた。糖尿病及び腎機能異常（ＣＫＤステージ３）を有する対象の２つの独立コホート、すなわちＴ１Ｄ対象２１４名の探索Ｊｏｓｌｉｎコホート及びＴ２Ｄ対象１４４名の複製Ｊｏｓｌｉｎコホートが構成された。これらのコホートは、ｅＧＦＲの傾きを判定し、ＥＳＫＤの発生時期を確認するために、７～１５年間追跡された。これらのコホートの臨床的特徴を表２に示す。Ｊｏｓｌｉｎ Ｔ１Ｄコホートに含まれたすべての研究参加者及びＴ２Ｄコホートに含まれた研究参加者の９２％が白人であった。ベースラインでは、Ｔ１Ｄ対象と比較して、Ｔ２Ｄ対象は年齢が高く、糖尿病の期間が短く、体格指数（ＢＭＩ）が高く、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が低く、尿中アルブミン対クレアチニン比（ＡＣＲ）が低いが、ｅＧＦＲには同様の異常があった。

【0204】

７～１５年間のフォローアップ中、両コホートの対象の大多数が進行性腎機能低下を有していた。しかし、ｅＧＦＲの傾きは対象間で大きく異なり、Ｔ１Ｄ対象の傾きはＴ２Ｄ対象よりもわずかに急勾配であった。Ｔ１Ｄ及びＴ２ＤのＪｏｓｌｉｎコホートにおけるｅＧＦＲの傾きの分布を図２に示す。ｅＧＦＲ損失＜３．０ｍｌ／分／年と定義された低速低下者（非進行者という）の数は、Ｔ１Ｄ探索コホート及びＴ２Ｄ複製コホートでそれぞれ７１（３３％）及び６９（４８％）であった（表２）。この研究の焦点であるこれらの非進行者は、非常に浅いｅＧＦＲの傾きを有しており、中央値（２５パーセンタイル、７５パーセンタイル）は、Ｔ１Ｄコホート及びＴ２Ｄコホートでそれぞれ－１．６ｍｌ／分／年（－２．３、－１．０）及び－０．９ｍｌ／分／年（－２．０、０．４）であった。７～１５年間のフォローアップ中、これらの対象はいずれもＥＳＫＤに進行しなかった。これに対し、表２に示すように、ｅＧＦＲ損失≧３．０ｍｌ／分／年と定義された高速低下者（進行者という）の大部分（複合コホートの６１％）が、１０年間のフォローアップ中にＥＳＫＤに進行した。

【表3】

【0205】

実施例２．進行性腎機能低下を防ぐ血漿タンパク質のプロファイリング
ＳＯＭＡｓｃａｎプロテオミクスプラットフォームを使用して、上記の表１に示した１１２９種の血漿タンパク質を測定した。これらの血漿タンパク質を、ベースラインの非進行者における濃度の上昇について調べた。本研究の概略表現を図３にまとめる。Ｊｏｓｌｉｎ探索Ｔ１Ｄコホートでは、７３種のタンパク質のベースライン血漿濃度が、偽発見率（ＦＤＲ）調整済みＰ＜０．００５でｅＧＦＲの傾きと正に、かつ有意に相関しており（表３）、したがって、これらのタンパク質のベースライン濃度の上昇は、フォローアップ中の低速または最小限の腎機能低下に関連付けられた。これらのタンパク質は、進行性腎機能低下に対する候補防御因子／バイオマーカーと考えることができる。ｅＧＦＲの傾きと負に相関したタンパク質は、進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行のリスクを増加させる候補因子／バイオマーカーと考えられ得る。それどころか、別個の研究は、同じＳＯＭＡｓｃａｎプロテオミクスプラットフォームを使用して、１９４種の炎症性循環タンパク質と、これら２つのＪｏｓｌｉｎコホートにおけるＥＳＫＤへの進行のリスクとの関連性を発表している（Ｎｉｅｗｃｚａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５：８０５－８１３（２０１９））。

【0206】

Ｔ１Ｄ対象におけるｅＧＦＲの傾きと正に相関する７３種の血漿タンパク質を、Ｔ２Ｄ対象の複製コホートでさらに分析した。１８種のタンパク質は、公称Ｐ＜０．０５でｅＧＦＲの傾きと正に相関していることが分かった（表３）。本明細書に記述するように、腎組織及び血漿におけるＰＫＭ２の濃度上昇は、Ｔ１Ｄの期間が長い対象のＤＫＤを防ぐ新規のバイオマーカー及び潜在的な治療標的であることが最近実証された（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：７５３－７６２（２０１７））。このタンパク質が、腎機能異常を有する対象における進行性腎機能低下からの防御にも関与しているかどうかを判定するために、ＰＫＭ２はＴ２Ｄ対象のｅＧＦＲの傾きと有意に相関していないが、ＰＫＭ２を１８種の候補タンパク質と共にさらなる分析に含めた。１９種の血漿タンパク質の名称、相関係数、ならびにＴ１Ｄ及びＴ２ＤコホートでそれぞれｅＧＦＲの傾きと正に相関した各タンパク質のＰ値を、図４Ａに提示する。Ｔ２Ｄ群では、相関は概してわずかに弱かったが、１８種すべてのタンパク質が、ｅＧＦＲの傾きと正に、かつ有意に相関した。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0207】

実施例３．進行性腎機能低下を防ぐ血漿タンパク質
両方のＪｏｓｌｉｎコホートがベースラインで腎機能異常（ＣＫＤステージ３）を有し、ｅＧＦＲの傾きとの均一な強さの関連性を有していたため、両コホートのＳＯＭＡｓｃａｎ結果を統合した。ロジスティック回帰分析を使用して、１９種のタンパク質の各々のベースライン血漿濃度と進行性腎機能低下の速度との関連性を分析した。複合Ｊｏｓｌｉｎコホートの対象を、（１）進行者という、高速の腎機能低下（ｅＧＦＲ損失≧３．０ｍｌ／分／年）もしくはＥＳＫＤへの進行を有する対象、または（２）非進行者という、低速もしくは最小限の腎機能低下（ｅＧＦＲ損失＜３．０ｍｌ／分／年）を有する対象の群に分けた。進行性腎機能低下に関連する臨床的特徴及びリスク因子からの防御効果の統計的独立性を評価するために、まず単変量ロジスティックモデル、次にベースライン臨床共変量に対して調整された多変量ロジスティックモデルを行った。潜在的な交絡因子のリストには、年齢、性別、民族性／人種、糖尿病の期間、インスリン処置、腎保護処置、ＢＭＩ、収縮期血圧及び拡張期血圧、ＨｂＡ１ｃ、ｅＧＦＲならびにＡＣＲが含まれた。ＨｂＡ１ｃ、ｅＧＦＲ、及びＡＣＲからなる主要な共変量を最終的なロジスティックモデルに含めた。ロジスティックモデルに入れる共変量の選択に関する情報を表４に示す。単変量分析及び多変量分析の結果を図４Ｂに示す。すべてのモデルは糖尿病の種類に合わせて調整した。効果は、特定のタンパク質のベースライン血漿濃度の１四分位増加ごとのオッズ比（ＯＲ）として９５％信頼区間（９５％ＣＩ）と共に示されている。単変量モデルでは、ＰＫＭ２（図４Ｂ－＃＃で表示）を含む１９種すべてのタンパク質が進行性腎機能低下を防いだ（ＯＲ＜１．０であった）。ｅＧＦＲ、ＨｂＡ１ｃ、ＡＣＲ、及び糖尿病の種類を含むベースライン臨床共変量について調整された最終モデルでは、８種のタンパク質の血漿濃度の上昇が、進行性腎機能低下からの防御と依然として関連していた（図４Ｂ及び表５）。これら８種の血漿タンパク質を「確認済み」防御タンパク質といい、これらはＴＮＦＳＦ１２、ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＤＮＡＪＣ１９、ＡＮＧＰＴ１及びＦＧＦ２０（図４Ｂ－＃で表示）を含んでいた。ＰＫＭ２のベースライン濃度は、臨床共変量によるさらなる調整の後、進行性腎機能低下からの防御に関連していなかった。ＰＫＭ２の効果は、単変量分析では有意（Ｐ＜０．０５）であったが、臨床共変量の調整後には統計的に有意でなくなった。

【表5】

【表6】

【0208】

どの確認済み防御タンパク質が進行性腎機能低下からの防御に独立的に寄与したかを調べるために、まず、スピアマンの順位相関を使用して、８種のタンパク質及び重要な臨床共変量の間のベースラインでの関係を分析した。図５Ａに示す相関行列は、ベースラインＨｂＡ１ｃにおける変動が８種の防御タンパク質の変動に影響しない一方で、ベースラインｅＧＦＲの変動はＴＮＦＳＦ１２及びＦＧＦ２０と弱く相関したことを示す。これに対し、ベースラインＡＣＲは、ＦＧＦ２０を除くすべてのタンパク質と弱く相関した（図５Ａ及び図６）。さらに、防御タンパク質のすべてが、ＥＳＫＤへの進行のリスク増加に関連する循環炎症性タンパク質の１つとして我々が以前に報告した（Ｎｉｅｗｃｚａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５：８０５－８１３（２０１９））、血漿中の腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦ－Ｒ１）の濃度と負に相関し、防御タンパク質の濃度上昇に伴う血漿ＴＮＦ－Ｒ１濃度の低下を示している。確認済み防御タンパク質を互いとの相関係数に従って３つのサブグループに分けた（図５Ａ）。サブグループ（Ａ）には、相互相関性が極めて高い５つのタンパク質であるＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４及びＡＮＧＰＴ１が含まれた。サブグループ（Ｂ）には、ＤＮＡＪＣ１９及びＴＮＦＳＦ１２の２つのタンパク質が含まれ、これらは、互いと、かつサブグループ（Ａ）のタンパク質と中程度に相関していた。サブグループ（Ｃ）には、ＴＮＦＳＦ１２との中程度の相関を除いて他のタンパク質のいずれとも相関しないタンパク質であるＦＧＦ２０が含まれた。このタンパク質の群分けのパターンは、図５Ｂに示すように、階層的クラスター分析で維持され、確認された。この所見は、これら３つのサブグループのタンパク質の血漿濃度が異なるメカニズムによって制御されていることを示唆している。これは、それらが同じメカニズムによって制御されているという仮説が立てられ得るほど強い相互相関性を示したサブグループ（Ａ）の５つのタンパク質とは対照的である。

【0209】

これら８種のタンパク質（３つのサブグループ）のうちのどれが進行性腎機能低下からの防御に独立的に寄与したかをさらに検査するために、効果がないまたは弱い（α＞０．１）タンパク質及び臨床共変量の後方削除を用いる多変数ロジスティック回帰分析を行った（表６）。すべての関連する臨床的特徴及び８種の確認済み防御タンパク質を分析に含めた。最終モデルでは、３つのベースライン臨床変数、ｅＧＦＲ、ＨｂＡ１ｃ、及びＡＣＲが進行性腎機能低下のリスクを有意に増加させ、３つのベースライン血漿タンパク質、ＡＮＧＰＴ１（サブグループＡの例）、ＴＮＦＳＦ１２（サブグループＢの例）、及びＦＧＦ２０（サブグループＣ）が、進行性腎機能低下を有意に防いだ。臨床共変量及び例示的な防御タンパク質について多変数ロジスティック回帰分析から取得されたオッズ比（９５％ＣＩ）を図５Ｃに示す。

【表7】

【0210】

実施例４．３つの例示的な防御タンパク質の複合効果
進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行のリスクに対する３つの例示的な防御タンパク質の複合効果を推定するために、「防御指数」を策定した。３つの例示的な防御タンパク質（ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２、及びＦＧＦ２０）の血漿濃度を各対象で評価した。各タンパク質の中央値を超える値は１としてスコア付けし、中央値未満の値は０としてスコア付けした；これらのスコアを合計することにより、対象は、０（中央値未満のすべてのタンパク質）から３（中央値を超えるすべてのタンパク質）の間で変動する総合防御指数を有し得る。防御指数と進行性腎機能低下との間の関連性を図７Ａに示す。進行性腎機能低下のオッズ比（９５％ＣＩ）は、総合防御指数が１、２及び３の対象では、防御指数値０の対象と比較して、それぞれ０．６９（０．２８、１．６９）、０．３４（０．１４、０．８３）及び０．１９（０．１、０．５２）であった。３つの防御タンパク質の複合効果を可視化するために、ＥＳＫＤへの進行の累積リスクを防御指数に従って複合研究コホートで分析した。図７Ｂは、防御指数の値に応じた、７．５年間のフォローアップ中のＥＳＫＤの累積発生率を示す。３つすべての防御タンパク質の値が中央値を超える対象はＥＳＫＤを発症するリスクが非常に低く、７．５年間のフォローアップ中の累積発生率は１６％であった。これに対し、防御指数値０、例えば３つすべての防御タンパク質の値が中央値未満であった対象は、ＥＳＫＤの累積発生率が８０％と非常に高かった。統計的有意性の高いＰ値（Ｐ＝２．７×１０^－１０）は、４つのサブグループ間でＥＳＫＤの累積発生率に有意差があることの強い証拠を示している。

【0211】

図７Ａに示した結果が、炎症性循環タンパク質（例えば、高いＴＮＦ－Ｒ１血漿濃度）または臨床共変量によって交絡された可能性があるかどうかを調べるために、複合Ｊｏｓｌｉｎコホート（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄ）でロジスティック回帰分析を行った。この分析では、防御指数を図７Ａのような離散変数ではなく連続変数とみなした。表７に示すように、防御指数の効果は非常に有意であり（Ｐ＜０．０００１）、オッズ比は０．４７であった（９５％ＣＩ：０．３２－０．６０）。我々が以前に報告した（５）、１つの炎症性タンパク質ＴＮＦ－Ｒ１をモデルに含めることにより、指数の防御効果が減弱され、オッズ比は０．６０に増加したが（９５％ＣＩ：０．４５－０．７８）、依然として統計的有意性は高かった（Ｐ＜０．０００２）。多くの臨床共変量をモデルに加えても、防御指数のオッズ比が実質的に変化しなかったことは有意義である。

【表8】

【0212】

実施例５．初期ＣＫＤにおける３つの例示的な防御タンパク質の検証
所見のロバスト性を実証するため、ベースラインでアルブミン尿はあったものの腎機能は正常であったＴ１Ｄ対象２９４名の独立したＪｏｓｌｉｎコホートで検証研究を実施した。このコホートは、ｅＧＦＲの傾きを判定し、ＥＳＫＤの発生時期を確認するために、７～１５年間追跡された。２９４名のＴ１Ｄ対象の検証研究からの血漿サンプルに、同じＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームを使用した目的タンパク質のプロファイリングを行った。ベースラインで腎機能異常（ＣＫＤステージ３）を有していた探索コホート及び複製コホートとは異なり、検証コホートは、ベースラインで正常な腎機能（ＣＫＤステージ１及び２；ｅＧＦＲ中央値（２５パーセンタイル、７５パーセンタイル）：１００（８２、１１４）ｍｌ／分／１．７３ｍ^２）を有していた。検証コホートの臨床的特徴を表８に示す。

【表9】

【0213】

３つの例示的な防御タンパク質（ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２、及びＦＧＦ２０）の血漿濃度を各対象で評価し、防御指数を策定した。防御指数と進行性腎機能低下との間の関連性を図７Ｃに示す。進行性腎機能低下のオッズ比（９５％ＣＩ）は、総合防御指数が１、２及び３の対象では、防御指数値０の対象と比較して、それぞれ０．４８（０．２４、０．９５）、０．４６（０．２４、０．８９）及び０．１１（０．０５、０．２７）であった。ＥＳＫＤへの進行の累積リスクも防御指数に従って検証コホートで分析した。図７Ｄは、防御指数の値に応じた、７．５年間のフォローアップ中のＥＳＫＤの累積発生率を示す。３つすべての防御タンパク質の値が中央値を超えた対象で、７．５年間のフォローアップ中にＥＳＫＤに進行した者はいなかった。防御指数値が０であり、７．５年間のフォローアップ中の累積発生率が３３％である対象と比較すると、防御指数値１及び２の対象については、それぞれ１４％及び１１％と低いＥＳＫＤの累積発生率が観察された。統計的有意性の高いＰ値（Ｐ＝１．７×１０^－５）は、４つのサブグループ間でＥＳＫＤの累積発生率に有意差があることの強い証拠を示唆している。

【0214】

さらに、３つの例示的な防御タンパク質のうちの２つ（ＡＮＧＰＴ１及びＦＧＦ２０）について、異なるプラットフォームを使用して検証した。ＡＮＧＰＴ１測定値については、製造元のプロトコルに従ってＨｕｍａｎ Ａｎｇ－１ ＭＳＤ Ｒ－Ｐｌｅｘアッセイ（Ｆ２１ＹＱ－３、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、サンプルのサブセット（ｎ＝３２）で検証した。簡潔に述べると、ＭＳＤ ＧＯＬＤ Ｓｍａｌｌ Ｓｐｏｔ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎプレートを、コーティング希釈剤１００中で１００μｌのビオチン化Ａｎｇ－１捕捉抗体でコーティングし、１時間室温でインキュベートした。プレートを１５０μｌ／ウェルの洗浄バッファー（１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄し、１００，０００ｐｇから２４ｐｇ／ｍｌまでの２５μｌの連続的に希釈された標準物質の複製物と、我々の研究からの３２の血漿サンプルとをすべて同じプレートにロードした。室温で振盪しながら１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、５０μｌの結合検出抗体（ＭＳＤ ＧＯＬＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標））と共に１時間室温でインキュベートし、その後洗浄し、最後に１５０μｌ／ウェルの読み取りバッファーをプレートに加えた。プレートをＭＳＤ機器にロードし、プレート電極に電圧を印加して発光の強度を測定し、サンプル中の分析物の定量的測定を行った。

【0215】

抗体ベース（ＭＳＤ）の測定値とアプタマーベース（ＳＯＭＡｓｃａｎ）の結果との間の相関は極めて良好であった。ＳＯＭＡｓｃａｎとＭＳＤ ＡＮＧＰＴ１測定値との間のスピアマンの順位相関係数はｒ_ｓ＝０．７６、Ｐ＜０．０００１であった。ＳＯＭＡｍｅｒ特異性を分析的に検証するために、無傷タンパク質のＤＮＡベースの親和性プルダウンを質量分析と統合するプロトコルを策定した。組換えＦＧＦ２０を添加したＦＧＦ２０ ＳＯＭＡｍｅｒ血漿プルダウンでは、ＦＧＦ２０タンパク質配列のアミノ酸（ａ．ａ．）５０～２１１にわたる１４個のＦＧＦ２０トリプシンペプチドが識別されたが、組換えＦＧＦ２０を添加しなかったＦＧＦ２０ ＳＯＭＡｍｅｒ血漿プルダウンでは、ＦＧＦ２０ペプチドが識別されなかった。ＦＧＦ２０トリプシンペプチドＧＧＰＧＡＡＱＬＡＨＬＨＧＩＬＲ（ａ．ａ．５０～６５；配列番号９）の抽出イオンクロマトグラムの一例を図８に示す。このＦＧＦ２０ペプチドは、組換えＦＧＦ２０を添加した血漿プルダウンでは識別されたが、組換えＦＧＦ２０を添加しなかった血漿プルダウンでは検出されず、これにより、ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームでのＦＧＦ２０ ＳＯＭＡｍｅｒの特異性が確認された。

【0216】

実施例６．非糖尿病性対象及び糖尿病対象における防御タンパク質の血漿濃度
研究参加時に進行性腎機能低下のリスクがあった者と比較した、非進行者における防御タンパク質の濃度上昇をどのように説明するかについては、２つの可能性が存在する。第１の可能性は、糖尿病及び関連する腎臓の損傷が、推定上の防御タンパク質の血漿濃度の低下を引き起こし得るというものである。結果として、進行者は、根底にあるより高度の腎臓の損傷のために、非進行者よりも低いタンパク質濃度を有することになるが、これは、臨床共変量によって認識されず、多変数モデルでは考慮されなかった。これが正しければ、低下速度の低い糖尿病者と比較して、非糖尿病者では防御タンパク質がさらに上昇するという仮説が立てられる。第２の可能性は、糖尿病が推定上の防御タンパク質の濃度の決定因子ではない可能性があるが、ベースラインでのこれらのタンパク質の濃度上昇が進行性腎機能低下を防ぎ得るというものである。したがって、これらのタンパク質の血漿濃度が上昇している対象が主に非進行者を構成するのに対し、これらのタンパク質の濃度が低い者は進行性腎機能低下のリスクを持つことになる。これが正しければ、非糖尿病者と比較すると、非進行者では推定上の防御タンパク質の濃度がより高いはずであり、進行者では、タンパク質濃度がコントロールより低いかまたはそれと同等になるという仮説が立てられる。

【0217】

上述の２つの可能性を区別するために、同じアプタマーベースのＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームを使用して、Ｔ１Ｄ対象の健康な非糖尿病性親、非進行者、ならびにＴ１Ｄ及びＴ２Ｄを有する進行者の間で防御タンパク質の血漿濃度を比較した。３つの研究サブグループ間のベースライン臨床的特徴及び防御タンパク質のベースライン値を表９に示す。非糖尿病者は、糖尿病対象と比較して年齢が高く、正常なＨｂＡ１ｃ、正常なＡＣＲ、及びほぼ正常なｅＧＦＲを有していた。設計上、非進行者及び進行者はベースラインで同様の腎機能異常を有していたが、７～１５年間のフォローアップ中のｅＧＦＲの傾きは劇的に異なっていた。８種の確認済み防御タンパク質に関して、最も低いベースライン濃度は非糖尿病者で観察され、最高値は非進行者で観察されたが、進行者の濃度は２つの他のサブグループの間に収まった。３つのサブグループ間の３つの例示的な防御タンパク質の比較が図９に示されており、主に進行性腎機能低下に対するこれらの防御タンパク質の役割を裏付けている。

【表10】

【0218】

防御タンパク質の血漿濃度が糖尿病状態及び早期腎機能低下の発症に先行したかどうかを調べるために、正常アルブミン尿またはＥＳＫＤ（またはタンパク尿症）の２つのカテゴリのＴ１Ｄ発端者の非糖尿病性親における３つの例示的な防御タンパク質（ＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２及びＦＧＦ２０）の血漿濃度について比較分析を行った。２つのカテゴリのＴ１Ｄ発端者の非糖尿病性親におけるベースライン特徴及び３つの防御タンパク質のベースライン値を表１０に示す。興味深いことに、表１０に示すように、腎臓の合併症（ＥＳＫＤまたはタンパク尿症）を有する子どもの親は、糖尿病の期間が長いにもかかわらず腎臓の合併症を起こさなかった子どもの親よりも有意に低い循環ＦＧＦ２０濃度を有していた。

【表11】

【0219】

実施例１～６の考察
上記実施例で説明した本研究は、偏りのないプロテオミクスプロファイリングにより、糖尿病及び中程度の腎機能異常を有する対象の２つの独立コホートにおいて、進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行からの防御に特異的に関連する循環血漿タンパク質を識別した。ベースラインｅＧＦＲ、ＨｂＡ１ｃ、ＡＣＲ、及び糖尿病の種類などの臨床共変量とは無関係に進行性腎機能低下からの防御効果を有する８種の循環タンパク質が識別された。これらのタンパク質は、（Ａ）ＳＰＡＲＣ、ＣＣＬ５、ＡＰＰ、ＰＦ４、ＡＮＧＰＴ１、（Ｂ）ＤＮＡＪＣ１９、ＴＮＦＳＦ１２、及び（Ｃ）ＦＧＦ２０の３つのサブグループに分類できた。８種の確認済み防御タンパク質をまとめて検討すると、各サブグループを代表する３つのタンパク質、例えばＡＮＧＰＴ１、ＴＮＦＳＦ１２及びＦＧＦ２０のみが、進行性腎機能低下に対して強く独立した防御効果を示したことに留意することは有意義である。これら３つの例示的な防御タンパク質の複合効果は、フォローアップの開始時に３つすべてのタンパク質について中央値を超える値を有していた対象におけるＥＳＫＤの非常に低い累積リスクによって良好に実証された。さらに、非進行者では非糖尿病者よりもこれらの防御タンパク質の濃度がはるかに高かったという事実は、これらのタンパク質またはそれらが表す経路が進行性腎機能低下からの防御に因果的に関与していることの強い証拠を提供する。これら３つの例示的な防御タンパク質の重要性は、１０年間にわたって前向きに追跡されたＴ１Ｄ及びＴ２Ｄという異なる種類の糖尿病ならびにＤＫＤの初期ステージ及び後期ステージという異なるステージのＤＫＤを有する研究参加者の３つの独立コホートで確認されたため、これらの研究所見は非常に一般化しやすい。

【0220】

アンジオポエチン（ＡＮＧＰＴ）は、血管新生及び血管炎症に関与する成長因子である。ＡＮＧＰＴファミリーのメンバーの中で、アンジオポエチン－１（ＡＮＧＰＴ１）及びアンジオポエチン－２（ＡＮＧＰＴ２）は両方ともＴｉｅ－２受容体のリガンドである（Ｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８７：１１７１－１１８０（１９９６）、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：５５－６０（１９９７））。ＡＮＧＰＴ１は、Ｔｉｅ－２受容体の主要なリガンド及び活性化因子であり、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ／タンパク質キナーゼＢ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）経路の活性化によって血管の完全性を維持し（Ｂｒｉｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９８：１０１４－１０２３（２００６））、したがって、成長因子及びサイトカインによる過剰な活性化から内皮を防御する（Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５２－５５８（２００６））。一方、ＡＮＧＰＴ２は、Ｔｉｅ－２受容体へのＡＮＧＰＴ１の結合を防止し、その結果ＡＮＧＰＴ１／Ｔｉｅ－２経路の活性化を低減させ、血管壁の不安定化及び血管漏出を促進することにより、ＡＮＧＰＴ１の天然のアンタゴニストであると考えられている（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：５５－６０（１９９７）、Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５２－５５８（２００６））。ＡＮＧＰＴ１及びＡＮＧＰＴ２は互いとＴｉｅ－２受容体を競合し、反対の作用を有するため、ＡＮＧＰＴ１とＡＮＧＰＴ２との間の平衡の（例えばＡＮＧＰＴ２に有利な）乱れが、糖尿病によるアンジオポエチンの不均衡、例えば血管壁の不安定化をもたらし、炎症及び線維症を促進するような、進行中の血管新生プロセスの平衡を評価するために、両方のアンジオポエチンを測定することがおそらく有益である（Ｇｎｕｄｉ，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５９：１６１６－１６２０（２０１６））。ＡＮＧＰＴ２がＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォームで測定され、その結果が本研究に利用可能であったため、ＡＮＧＰＴ１の防御効果を、ＡＮＧＰＴ２のリスク効果、及び進行性腎機能低下のリスクに対するＡＮＧＰＴ１／ＡＮＧＰＴ２の（ＡＮＧＰＴ１に有利な）比の効果と比較した。残念ながら、これらの分析の所見は、ＡＮＧＰＴ１単独の防御効果と比較して強い、２つのアンジオポエチンの比の防御効果を示さず（表１１）、２つのアンジオポエチンの比ではなく、進行性腎機能低下に対するＡＮＧＰＴ１単独の防御的役割を裏付けている。

【表12】

【0221】

ＡＮＧＰＴ１の防御効果に関しては、さらなる研究が行われている。ＡＮＧＰＴ１は、抗炎症効果を発揮し、炎症因子から内皮細胞の透過性を防御することが示されている（Ｐｉｚｕｒｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３９：３２９－３３６（２００３））。軟骨オリゴマー基質タンパク質アンジオポエチン－１（ＣＯＭＰ－Ａｎｇ１）として知られているＡＮＧＰＴ１のバリアントが、片側尿管閉塞誘発性腎線維症及び糖尿病性腎症の動物モデルにおけるＣＯＭＰ－Ａｎｇ１の防御効果を調査するために開発された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １７：２４７４－２４８３（２００６）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２２：３９６－４０８（２００７））。ＣＯＭＰ－Ａｎｇ１で処置された糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスでは、アルブミン尿及び空腹時血中グルコース濃度が低減し、メサンギウム拡大が減少し、糸球体基底膜の肥厚及び有足細胞の足突起の拡大が認められた（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２２：３９６－４０８（２００７））。遺伝子改変マウスを使用した研究において、糖尿病性糸球体疾患におけるＡＮＧＰＴ１発現濃度の重要性がさらに確認された。糖尿病マウスの特に糸球体におけるＡＮＧＰＴ１の過剰発現または過多は、糖尿病誘発性ネフリンリン酸化の減少を伴うアルブミン排泄の低減をもたらし（Ｄｅｓｓａｐｔ－Ｂａｒａｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２５：３３－４２（２０１４））、その結果、低減したネフリン分解及び有足細胞の足突起の拡大が生じ、より安定で機能的な糸球体濾過バリアがもたらされた（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ７３：５５６－５６６（２００８））。これらの観察のすべてを、上昇した血漿ＡＮＧＰＴ１濃度が進行性腎機能低下を防いだことを示すヒトにおける我々の強固な所見と合わせて考慮すると、ＡＮＧＰＴ１が糖尿病における進行性腎機能低下の防止またはリスク低減のための潜在的な治療標的であり得ることは非常に明らかである。

【0222】

本研究は、ＡＮＧＰＴ１が他の４つの確認済み防御タンパク質（ＰＦ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＰＰ及びＣＣＬ５）と有意かつ高度に相関していることを実証し、これらのタンパク質が同様の生理学的意義を有する可能性、共通の経路の一部である可能性、または同じ遺伝的制御下にある可能性があることを示唆している。これらのタンパク質の５つすべてが発現及び分泌される共通経路は、血小板機能と関連する。トロンビンは、血管修復中に血管内皮細胞の安定化を助けるために血小板からのＡＮＧＰＴ１の放出を誘導することが知られている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：２０４－２０６（２００１））。血小板第４因子（ＰＦ４）は、活性化された血小板のアルファ顆粒から放出され、ヘパリンに高い親和性で結合する。これは、好中球、線維芽細胞、及び単球の強力な走化性因子である（Ｌｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２：４０５４－４０６３（２０１７））。酸性システインリッチ分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）もまた、ヒト血小板のアルファ顆粒成分であり、血小板活性化中に分泌される。これはさらに、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、及び脂肪細胞によっても産生される。ＳＰＡＲＣは、細胞増殖、組織損傷の修復、コラーゲン基質形成、及び骨芽細胞の分化に関与している（Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１６：９０６０１４３（２０１６））。血小板は、血液循環におけるアミロイドベータＡ４タンパク質（ＡＰＰ）の主な供給源である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：１３３－１４２（１９９４））。ＲＡＮＴＥＳとしても知られるＣ－Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ－５）も、活性化された血小板アルファ顆粒によって放出され、炎症を起こした内皮に沈着し、活性化された内皮への単球の遊出を媒介する。低い血漿ＣＣＬ－５濃度は、冠動脈造影に紹介される患者における心臓死亡率の独立した予測子である（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２１：４３７－４４３（２０００））。これまでの研究では、活性化血小板が糖尿病性腎症の発症に関与することが報告されている（Ｏｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ ８１：２７１－２７７（１９９９）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２９：２６７１－２６９５（２０１８））。本研究の結果は、糖尿病性腎症の進行における血小板分泌タンパク質の重要性をさらに指摘している。血小板活性化タンパク質の分泌は、白血球輸送に関連する血管損傷を防ぐことよって、糖尿病性腎症の急速な進行を防ぐ可能性がある。進行性腎機能低下からの防御に関するこれらのタンパク質の関連性については、さらに調査する必要がある。

【0223】

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）は、ＴＷＥＡＫとしても知られ、リガンド及び受容体の大きなＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：３２４０１－３２４１０（１９９７））。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルからの所見は、ＴＮＦＳＦ１２を投与すると、腎尿細管細胞における炎症性サイトカイン産生が増加する、例えば単球走化性タンパク質－１及びインターロイキン－６（ＩＬ－６）のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現が増加するのに対し、ＴＮＦＳＦ１２を遮断すると、マウスにおける尿細管ケモカイン及びＩＬ－６発現、間質炎症ならびにマクロファージ浸潤が防止されることを示している（Ｓａｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９：６９５－７０３（２００８））。ＤＫＤの発症／進行におけるＴＮＦＳＦ１２の役割は、依然として不明である。これまでのところ、このトピックに特化した文献は乏しく、いくつかの横断的研究では、循環ＴＮＦＳＦ１２濃度とＤＫＤとの間の関係が調査されている。ある研究では、Ｔ２Ｄ及びＥＳＫＤ対象における循環ＴＮＦＳＦ１２濃度の低下が報告された（Ｋｒａｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９：４４０－４４４（２００８））。他の腎臓病及び他の形態の糖尿病におけるＴＮＦＳＦ１２の作用も報告されている（Ｓａｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３：３３２９－３３４２（２００９）、Ｄｅｒｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １４：ｅ０２１６７２８（２０１９）、Ｂｅｒｎａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）：１３３，１１４５－１１６６（２０１９））。実験的な葉酸誘発性急性腎傷害では、ＴＮＦＳＦ１２欠損により腎臓のアポトーシス及び炎症が低減し、腎機能が改善した。妊娠真性糖尿病（ＧＢＭ）を有する女性及びＧＢＭを有しない女性を対象としたケースコントロール研究では、ＧＢＭを有しない妊娠中のボランティアと比較した、ＧＢＭを有する女性におけるＴＮＦＳＦ１２濃度の低下が報告された。本研究は、前述の研究における所見とは異なり、非常にロバストな所見によってＴＮＦＳＦ１２が進行性腎機能低下に対する防御タンパク質であることが示された唯一のフォローアップ観察である。この所見はヒト及び動物の研究でさらに調査される必要がある。

【0224】

線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）は、分泌型のシグナル伝達タンパク質及び細胞内の非シグナル伝達タンパク質からなる７つのサブファミリーを含む２２種の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の大きなファミリーのメンバーである（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １４９：１２１－１３０（２０１１））。２２種のうち１７種のＦＧＦがＳＯＭＡｓｃａｎプロテオミクスプラットフォームで測定され、ＦＧＦ２０のみが進行性腎機能低下からの防御とロバストに関連していた。ＦＧＦ２０は、元々ラットの脳で識別された新規の神経栄養因子であり、ドーパミン作動性ニューロンの発達において重要な役割を果たすことが示唆されている（Ｏｈｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７７：３５５－３６０（２０００）、Ｃｏｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏａｎａｔ １：４（２００７）、Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ １０７：４４７－４５４（２００９））。さらに、いくつかの研究では、ＦＧＦ２０とパーキンソン病との関連性の証拠は報告されていないが、多数の研究により、様々な民族におけるパーキンソン病易罹患性とＦＧＦ２０遺伝子多型との相関が報告されている（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ Ｒｅｌａｔ Ｄｉｓｏｒｄ １８：６２９－６３１（２０１２）、Ｓａｄｈｕｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ６７５：６８－７３（２０１８）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７４：１１２１－１１２７（２００４）、Ｃｌａｒｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｌ ５：１１（２００５）、Ｗｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ ２４：４５５－４５９（２００９））。興味深いことに、過去のある研究では、ヒト及びマウスの両方においてネフロン前駆細胞の幹細胞性を維持することにより、腎臓の発達におけるＦＧＦ２０／Ｆｇｆ２０の本質的な役割が実証された（Ｂａｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ２２：１１９１－１２０７（２０１２））。ＦＧＦ２０は腎臓のネフロン前駆細胞にのみ発現していた。ヒト及びマウスにおけるＦＧＦ２０／Ｆｇｆ２０の喪失は、胎児の腎臓の一方または両方が発達できない故に新生児の腎臓の一方または両方が欠損する状態である腎臓無形成をもたらした。

【0225】

ＦＧＦ２０は、２００１年にＪｅｆｆｅｒｓらがヒトの悪性腫瘍の処置の潜在的標的となり得る新規の癌遺伝子としてＦＧＦ２０を識別した際に初めて発見された（Ｊｅｆｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：３１３１－３１３８（２００１））。その後、同著者らは、ＦＧＦ－２０（ＣＧ５３１３５－０５）が実験的な腸管炎症を処置する治療活性を有することを実証し（Ｊｅｆｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３：１１５１－１１６２（２００２））、別の研究は、潜在的に致死性の全身放射能の前にマウスにＦＧＦ２０を単回投与すると、急性放射線曝露の致死効果が低減し、全生存率の実質的増加につながるように、ＦＧＦ２０が新規の放射線保護剤であることを報告した（Ｍａｃｌａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ ８１：５６７－５７９（２００５））。これらの所見に基づいて、ＣＧ５３１３５－０５（ベラフェルミンに改名された）は、化学療法の副作用である口腔粘膜炎の発症に対する防御薬として、がん患者のフェーズＩＩ臨床試験で評価された（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｃａｒｅ Ｃａｎｃｅｒ １６：４７７－４８３（２００８））。この試験の結果、ベラフェルミンは良好な安全性及び忍容性プロファイルを有することが示されたが、口腔粘膜炎の処置に追加した場合には十分な有効性を示さなかった。

【0226】

本研究は、ＦＧＦ２０が、Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄの複合コホートにおける進行性腎機能低下及びＥＳＫＤへの進行からの防御と最も強く関連している確認済み防御タンパク質の１つであることを実証している。この関連性は、循環炎症性タンパク質及び該当する臨床共変量とは無関係である。ベースラインでのＦＧＦ２０の高い血漿濃度は、７～１５年間のフォローアップ中の腎機能低下が少ないことを予測した。この関連性は、ＦＧＦ２０の関与、ならびに進行性腎機能低下及びＥＳＫＤの発症を遅延させるまたはそのリスクを減少させる独立した役割を指摘している。したがって、ＦＧＦ２０は、糖尿病における進行性腎機能低下及びＥＳＫＤの発生を防止または遅延させるための有用な標的であり得る。我々の研究で得られた別の興味深い所見は、正常アルブミン尿またはＥＳＫＤ／タンパク尿症のいずれかの２つのカテゴリのＴ１Ｄ発端者の非糖尿病性親の血漿プロファイルで観察された。驚くべきことに、ＥＳＫＤ／タンパク尿症を有するＴ１Ｄ子孫の非糖尿病性親は、腎臓合併症のないＴ１Ｄ子孫を持つ親よりも有意に低いＦＧＦ２０の血漿濃度を有していた。これらの所見は、子孫において、親から受け継がれた遺伝的素因または成分が、対応するタンパク質濃度を調節し得るかどうかという疑問及び／または推測を促し、より大規模な研究で確認されれば、Ｔ１Ｄ（及びＴ２Ｄ）における進行性腎機能低下の決定因子に関する将来の研究において深い意味を持つ可能性がある。

【0227】

ＤＫＤを含む後期糖尿病合併症に対する防御因子の研究における最近の関心は、Ｊｏｓｌｉｎ Ｍｅｄａｌｉｓｔ Ｓｔｕｄｙによって開始された。この横断的研究には、Ｔ１Ｄを有しながら少なくとも５０年間生存した国中の対象が登録された。後期糖尿病合併症を起こさなかった者が、生物検体の様々なオミクスプロファイルを含む多数の特徴に関して、非糖尿病性配偶者及び糖尿病の経過の非常に後期で合併症を発症した者と比較された。３つのサブグループの対象から取得された腎組織のプロテオミクスプロファイルを比較すると、糖尿病の期間が極めて長いにもかかわらずＤＫＤを起こさなかった者の間で非常に高い、ＰＫＭ２を含むいくつかのグルコース代謝酵素／タンパク質が糸球体において識別された。この所見の後に一連の機能研究を行うことにより、著者らは、ＰＫＭ２の上方制御がＤＫＤの発症を防止する一手段となり得ると結論付けた（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：７５３－７６２（２０１７））。

【0228】

本研究は防御因子の探索も行ったが、Ｍｅｄａｌｉｓｔ研究とは大きく異なっていた。後者は横断的であり、細胞研究及び動物研究で調査するための候補防御タンパク質を探索したが、本研究は、進行性腎機能低下を防いだベースライン循環血漿タンパク質と７～１５年間のフォローアップ中のＥＳＫＤへの急速進行との間の関連性を調査したＪｏｓｌｉｎクリニック集団ベースの前向き観察であった。さらに、２つの研究は２つの異なる前提に基づいていた。Ｍｅｄａｌｉｓｔ研究は、後期糖尿病合併症の発生／発症に対する防御タンパク質を見出すことを目的としていたのに対し、本研究は、既に存在する軽度腎障害を有する対象における進行性腎機能低下に対する防御タンパク質を識別することを目的としていた。これが、Ｊｏｓｌｉｎ Ｍｅｄａｌｉｓｔ研究で得られたＰＫＭ２の所見を我々が統計的有意性を持って確認できなかった理由である可能性が高い。

【0229】

本研究の強みには、その前向き設計、３つの独立した研究コホートの長期フォローアップ観察、Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄにおけるデータの一貫性、ならびにすべてのＪｏｓｌｉｎコホートにおけるタンパク質濃度を測定するためのＳＯＭＡｓｃａｎプロテオミクスプラットフォームの使用が含まれる。さらに、本研究では、主要な潜在的交絡因子及び糖尿病の種類に関する所見を調整した。しかし、あらゆる研究に当てはまるように、本研究も潜在的な限界を踏まえて検討する必要がある。第１に、これは観察研究であり、これらのタンパク質は、腎機能低下の進行を直接防ぐ可能性があるが、代替的に防御プロセスの間接的なレポーターである可能性もある。それらに直接的な防御能があることを確認するためには、我々の所見の因果的説明を動物モデル及び臨床試験によって確立する必要がある。第２に、これらの所見は、慢性腎臓病及び腎機能異常を有する白人の糖尿病者に限定されており、したがって、これらの結果は、他の集団内の個人及び他の腎臓病を有する個人には一般化できない可能性がある。第３に、ベースライン血漿サンプルは糖尿病発生時に採取されたものではないため、進行性腎機能低下が低速か高速かは、採血時に関連するものであり、疾患の発生に関連するものではない。本研究には、２０００年代にＪＫＳに登録され、２０１２年～２０１３年まで追跡された参加者のサブセットが含まれる。登録前、これらの個人は長年にわたってＪｏｓｌｉｎクリニックでケアを受けており（糖尿病発生の最初期にこれらの個人を追跡することは現実的ではなかった）、我々の前向き研究に彼らを含めることは、後続のフォローアップにおける彼らの未知の将来の転帰とは無関係であった。したがって、これらの研究所見は、糖尿病を有する個人におけるＣＫＤの偏りのない同時期の自然な経過及びＥＳＫＤの発症を反映している。前述の内容にかかわらず、ＥＳＫＤ及びＥＳＫＤへの進行に関する防御タンパク質の識別は注目に値し、あらゆる患者にとって深刻な診断に対処するための診断及び療法の両方に対する豊富な機会を提供する。

【0230】

実施例７．Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２の循環レベルは、Ｔ１Ｄ患者におけるＥＳＫＤからの防御と独立的に関連している
我々は、Ｔ１Ｄを有する小さなＪｏｓｌｉｎコホートにおいてＳＯＭＡｓｃａｎを使用して、追加の防御タンパク質を探索した。１０年間のフォローアップ中にＥＳＫＤに進行した患者及びＥＳＫＤを起こさなかった患者の特徴を表１２に示す。Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２（ＳＰＯＣＫ２）の循環レベルは、進行者よりも非進行者において有意に高かった。この差異は図１０に示されている。上記の実施例に記載したように、ＦＧＦ２０、ＴＮＦＳＦ１２及びＡＮＧＰＴ１の３つの防御タンパク質についても同様の差異が観察された。

【表13】

【0231】

ＥＳＫＤへの進行に対する循環ＳＰＯＣＫ２（Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２）の防御効果を検査するために、ロジスティック回帰分析を行った。その結果を以下の表１３に示す。単変量ロジスティック回帰（モデル１）では、すべての防御タンパク質が、ＥＳＫＤへの進行に対する強い防御効果を有していた（１未満のＯＲは防御効果を示す）。多変数ロジスティック回帰分析（モデル２）において、関連する臨床変数及びすべての防御タンパク質を一緒に分析した際、ＳＰＯＣＫ２（Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２）の防御効果も見られた。

【0232】

結論として、ＳＰＯＣＫ２（Ｔｅｓｔｉｃａｎ－２）の循環レベルは、ＥＳＫＤからの防御と独立的に関連しており、いわゆる「防御指数」を策定するために、以前に報告されている３つの防御タンパク質（ＦＧＦ２０、ＡＮＧ１及びＴＮＦＳＦ１２）と共に使用され得る。

【表14】

【表15-1】

【表15-2】

【0233】

参照による組み込み
本願を通して引用されるすべての参考文献、特許、及び公開特許出願の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】