特表 2024-516655 原発性高シュウ酸尿症１型の治療のためのｉｎ ｖｉｖｏレンチウイルス遺伝子療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-16

(54)【発明の名称】原発性高シュウ酸尿症１型の治療のためのｉｎ ｖｉｖｏレンチウイルス遺伝子療法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20240409BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240409BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240409BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240409BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240409BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240409BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 38/13 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240409BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20240409BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/54

C12N15/113 Z

C12N15/11 Z

C12N5/10

A61P3/00

A61K48/00

A61K38/45

A61K35/76

A61P43/00 121

A61K38/13

A61K31/573

A61K31/436

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565998

(86)(22)【出願日】2022-04-26

(85)【翻訳文提出日】2023-12-25

(86)【国際出願番号】 EP2022061107

(87)【国際公開番号】W WO2022229223

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】21382363.6

(32)【優先日】2021-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522289264

【氏名又は名称】セントロ デ インベスティガシオネス エネルゲティカス メディオ アムビエンタレス イ テクノロジカス オー．エー．，エム．ピー．

(71)【出願人】

【識別番号】522289275

【氏名又は名称】コンソルシオ セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド （セイベエエレ）

(71)【出願人】

【識別番号】518158123

【氏名又は名称】フンダシオン インスティチュート デ インベスティガシオン サニタリア フンダシオン ヒメネス ディアス

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】セゴヴィア サンス ホセ カルロス

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア ブラヴォ マリア

(72)【発明者】

【氏名】モリノス ヴィセンテ アンドレア

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア トッラルバ アイーダ

(72)【発明者】

【氏名】ニエト ロメロ ヴィルヒニア

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084BA24

4C084DC25

4C084NA14

4C084ZC211

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4C086DA10

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZC21

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZC21

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、核酸を含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）に関し、核酸は、５’から３’に肝細胞特異的プロモーター、好ましくはＥＴプロモーター、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼタンパク質（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）をコードするヌクレオチド配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、好ましくは突然変異ＷＰＲＥ、及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピー、好ましくはｍｉＲＮＡ－１４２を含む転写単位を含む。本発明のレンチウイルスベクターは、ＬＶがその機能を実行するために必要なバックボーンエレメントを更に含み、バックボーンエレメントは、以下の：５’長末端反復（５’ＬＴＲ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、ｐｓｉパッケージングシグナル、野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及びＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）のうちの少なくとも１つ、並びに３’長末端反復（３’ＬＴＲ）、又はそれらの任意の組み合わせである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸を含むレンチウイルスベクターであって、前記核酸が、以下の：
配列番号１６の全長にわたって少なくとも９８％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）についてコードするヌクレオチド配列であって、前記ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質が、配列番号５２の全長にわたって少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する、ヌクレオチド配列と、
配列番号２１の全長にわたって少なくとも９８％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
を含み、
前記遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーター、前記ＷＰＲＥ及び前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーが、前記ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質に作動可能に連結され、前記ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質の発現を調節する、レンチウイルスベクター。

【請求項2】

前記アラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）のアミノ酸配列が配列番号５２のみからなる、請求項１に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項3】

前記遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターのヌクレオチド配列が配列番号１６のみからなる、請求項１又は２に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項4】

前記突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のヌクレオチド配列が配列番号２１のみからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項5】

前記最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質についてコードするヌクレオチド配列が配列番号２９のみからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項6】

前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーが、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる、請求項１～５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項7】

前記核酸が、以下の：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項8】

前記レンチウイルスベクター中に含まれる前記ヌクレオチドが、
ｈ）ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｉ）ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項9】

前記レンチウイルスの全長ヌクレオチドが、配列番号３０（ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ）と少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項10】

配列番号３０との配列同一性が１００％である、請求項９に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターで形質導入した実質的に純粋な細胞集団。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、又は請求項１１に記載の実質的に純粋な細胞集団と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む薬学的組成物。

【請求項13】

医薬として使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、請求項１１に記載の実質的に純粋な細胞集団、又は請求項１２に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

原発性高シュウ酸尿症の治療を必要とする被験体の治療に使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、請求項１１に記載の実質的に純粋な細胞集団、又は請求項１２に記載の薬学的組成物であって、該方法が、前記レンチウイルスベクター、前記細胞集団、又は前記薬学的組成物を前記被験体に投与することを含む、レンチウイルスベクター、実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物。

【請求項15】

前記原発性高シュウ酸尿症が１型である、請求項１４に記載の使用のためのレンチウイルスベクター、実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物。

【請求項16】

前記使用が、免疫応答抑制剤、好ましくはデキサメタゾン、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＨ及び／又はラパマイシン、又はそれらの任意の組み合わせと組み合わされる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター、実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子療法の分野、特に原発性高シュウ酸尿症１型の治療に含めることができる。具体的には、本発明は、原発性高シュウ酸尿症１型を治療することができる遺伝子療法用のレンチウイルスベクターに関する。

【背景技術】

【0002】

原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）（ＯＭＩＭ番号２５９９００）は、遺伝性の稀な常染色体劣性代謝疾患である。ＰＨ１は、ＡＧＸＴ遺伝子によってコードされるアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ、ＥＣ２．６．１．４４）酵素の欠損により引き起こされる。ヒトでは、ＡＧＴ活性は肝ペルオキシソームに限定されている。この酵素は細胞内でのみ活性であり、細胞外空間には分泌されない。ＰＨ１は、肝臓におけるシュウ酸塩の過剰産生を特徴とする。シュウ酸塩は哺乳動物における代謝の最終産物であり、通常は尿によって排出される。大量に産生されると、尿腔（尿路結石症）及び腎組織（腎石灰化症）に形成されるシュウ酸カルシウム（ＣａＯｘ）の凝集により最初に影響を受ける臓器は腎臓であり、間質性線維症及び腎不全を引き起こす。腎損傷の結果として、糸球体濾過率（ＧＦＲ）が低下し、慢性腎疾患が増加する。最終的に、ＰＨ１患者の約６０％が４０歳までに末期腎疾患に進行する。その後の、シュウ酸症と呼ばれる広範なＣａＯｘ沈着を伴う全身性病変は、ＰＨ１患者の生命を危険にさらす（非特許文献１、非特許文献２）。欧州高シュウ酸尿症コンソーシアム（European Consortium of Hyperoxaluria）（http://www.oxaleurope.com/）が提供しているＰＨ１患者に対する現行のガイドラインでは、腎機能が既に損傷している場合、全身性シュウ酸症が現れる前に予防的臓器移植を推奨している。したがって、理想的には、疾患が診断された直後に可能な限り早く適用できる新規の治療アプローチが必要とされている。腎機能の低下を予測する正確な検査及び利用可能な遺伝子診断が存在しないため、シュウ酸塩レベルを低下させ、腎機能を維持することを目的とした、疾患の初期段階での新規の治療を導入すべきである。

【0003】

遺伝子療法は、ＡＧＸＴ遺伝子の機能コピーの送達によってＡＧＴ活性を回復させることにより、１回の投与で治癒させる可能性を有する。現在、遺伝性代謝性肝疾患に対する遺伝子療法は、ほとんどがｉｎ ｖｉｖｏアプローチに基づいている。肝類洞内皮細胞は有窓構造を有し、肝細胞へのアクセス及び遺伝子導入を促進する（非特許文献３）。ＡＡＶベクターは、前臨床モデル及び臨床試験で示された顕著な安全性及び有効性プロファイルを考慮して、ｉｎ ｖｉｖｏ肝臓指向遺伝子療法に広く採用されている。凝固障害血友病の治療のための凝固因子の肝臓へのＡＡＶベクターに基づく遺伝子導入は、遺伝子療法の最も成功した用途の１つである（非特許文献４、非特許文献５）。ＰＨ１の特定のケースでは、機能細胞が欠損細胞からのシュウ酸塩過剰産生を補うことができない自律細胞疾患であるため、高シュウ酸尿症の表現型を戻し、疾患を修正するために、治療後に達成されるべき修正細胞のパーセンテージは高いものであると考えられる（非特許文献６）。ＰＨ１マウスにおけるアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターを使用して、遺伝子療法の有効性の概念の前臨床証明が提供されている（非特許文献７、非特許文献８）。この成功にもかかわらず、ＡＡＶベクターの非組込み性は、導入遺伝子が肝臓の成長中に希釈され、免疫応答により目下効果的な再投与が妨げられることから、小児患者への適用の課題となっている。さらに、ＡＡＶカプシドに対する広範な既存の免疫は、適格患者の割合を減少させる。ＰＨ１患者の約３０％が乳児発症型であるため（非特許文献９、非特許文献１０）、小児患者への単回投与後に生涯持続する可能性を有する遺伝子療法戦略を開発することが非常に重要となる。

【0004】

レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、標的細胞のゲノムに安定して組み込まれる能力及びヒトにおけるベクター成分に対する既存の免疫の低い有病率により、肝臓遺伝子療法にとって魅力的なビヒクルである。近年、血友病Ｂの治療のためのＬＶ保持ＦＩＸの使用は、マウス、イヌ及び非ヒト霊長類において有望な結果を示している（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。本発明において、血友病Ｂの治療に使用されるベクターに基づくＬＶが使用される。これらのＬＶは、転写（合成肝臓特異的プロモーター）と転写後の制御（肝臓及び脾臓の抗原提示細胞で異所性に発現するベクターからの任意のｍＲＮＡの分解に関与する、造血細胞に特異的なマイクロＲＮＡ１４２標的配列）との組み合わせによって、肝細胞への導入遺伝子発現を標的とするように設計されている（非特許文献１１）。さらに、提案されたＬＶには、タンパク質により高い安定性を付与するＡＧＸＴの強化バージョンが含まれている（非特許文献１４）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Cochat et al., 2012

【非特許文献2】Sas et al., 2020

【非特許文献3】Piccolo & Brunetti-Pierri, 2015

【非特許文献4】George et al., 2017

【非特許文献5】Pasi et al., 2020

【非特許文献6】Danpure, 2009

【非特許文献7】Salido et al., 2006

【非特許文献8】Salido et al., 2011

【非特許文献9】Sas et al., 2019

【非特許文献10】Mandrile et al., 2014

【非特許文献11】Annoni et al., 2013

【非特許文献12】Cantore et al., 2015

【非特許文献13】Milani et al., 2019

【非特許文献14】Mesa-Torres et al., 2014

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】レンチウイルスベクターコンストラクトを示す図である。Ａ． レポーターレンチウイルスベクター：ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ。開発したレポーターレンチウイルスベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を体系化するｅＧＦＰ遺伝子を発現する。この導入遺伝子の肝細胞特異的発現は、２つの異なる転写制御エレメントである、合成エンハンサー、マウスＴＴＲエンハンサー及びマウスＴＴＲプロモーターの一部からなる特異的肝プロモーター（ＴＴＲ）、並びに抗原提示細胞（ＡＰＣ）における導入遺伝子発現、したがって、免疫応答の発生をブロックするための、造血特異的ｍｉＲＮＡ－１４２－３の４つの標的配列の存在により達成される。Ｂ． 治療用レンチウイルスベクター：ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ。レポーターレンチウイルスベクターと同じレンチウイルスベクター構造から開発され、レポーターＬＶと同様にＡＧＴタンパク質のより活性型を体系化する、５つのアミノ酸変化を有するＡＧＸＴ遺伝子の改善バージョンであるＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭを発現し、治療用導入遺伝子の肝細胞特異的発現は、２つの異なる転写制御エレメントである、特異的肝プロモーター（ＴＴＲ）及び造血特異的ｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つの反復の存在により達成される。

【図2】遺伝子療法アプローチ有効性研究のｉｎ ｖｉｖｏ試験プロトコルを示す図である。提案した戦略の有効性を研究するために、２種類の実験を実施した。Ａ． Ｃ５７ＢＬ／６成体雄マウスに単回用量のレポーターレンチウイルスベクターを静脈内注射し、４週間後に屠殺した。その後、標的組織である肝臓において、組み込まれたレンチウイルスベクターのゲノムコピー数、及び形質導入細胞のパーセンテージを分析して、形質導入有効性を決定した。さらに、脾臓、肺、骨髄、リンパ節、胸腺、脳、睾丸、膵臓、及び腎臓におけるベクターコピー数（ＶＣＮ）の分析により、手順のセキュリティーを決定するために生体内分布研究を実施した。Ｂ． ＰＨ１のマウスモデルにおけるＡＧＸＴ発現レンチウイルスベクター治療効果の分析のために、以下のプロトコルを実施した。成体Ａｇｘｔ１^－／－雄マウスに異なる用量の治療用レンチウイルスベクターを静脈内注射した。さらに、３つの異なる対照群を含め、そのうちの２群はレポーターレンチウイルスベクターを非注射又は注射したＡｇｘｔ１^－／－マウスで構成し、他の１群は非注射Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスで構成した。治療の３週間後、全てのマウス群にエチレングリコール負荷試験を行い、シュウ酸塩産生における過負荷を誘発するために、飲料水において０．５％エチレングリコールを補充させた。負荷試験中に、２つの異なるＰＨ１エンドポイントである尿シュウ酸塩濃度及び体重を測定した。治療後、マウスを屠殺し、腎臓損傷を特定した。屠殺後、治療用レンチウイルスベクターの形質導入有効性を、肝臓におけるＶＣＮ及びＡＧＸＴ発現により分析した。レポーターレンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスにおいて、形質導入細胞のパーセンテージも分析して、治療用レンチウイルスベクターで得られた結果を完成させた。

【図3】レンチウイルスベクター注射マウスの標的組織に組み込まれたウイルスゲノムの数を示す図である。標的組織である肝臓におけるレンチウイルスベクターの組込みは、レンチウイルスベクター注射の４週間後に、ｑＰＣＲによるＶＣＮの定量によって分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＡｇｘｔ１^－／－で実施した実験のデータを示す。非注射対照マウス（ｎ＝３）は、どのマウス系統においてもレンチウイルスベクター組込みを示さなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した実験に関しては、２つの異なるレポーターレンチウイルスベクター用量（１×１０^８ＴＵ／マウス及び２．５×１０^８ＴＵ／マウス）（ｎ＝３）を試験した。低用量では二倍体ゲノム当たり０．５５（０．３４～０．５６）のレンチウイルスベクターコピーが観察されたが、高用量では二倍体ゲノム当たり１．０３（０．９４～１．５６）のレンチウイルスベクターコピーが得られた。さらに、Ａｇｘｔ１^－／－マウスに２つの異なる用量のＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴを静脈内注射した結果、１．４×１０^８ＴＵ／マウスを注射したマウスの肝臓で０．１１（０．０９～０．４９）のＶＣＮ（ｎ＝４）、５×１０^８ＴＵ／マウスを注射したマウスで０．８４（０．７３～１．５８）のＶＣＮ（ｎ＝５）となり、３つの異なる用量のＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ（２．５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝６）、５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝１０）及び１×１０^９ＴＵ／マウス（ｎ＝６））では、それぞれ０．６１５（０．３９～１．４６）、０．７６５（０．４５～１．１９）及び１．１６５（０．８５～０．３２）のＶＣＮとなる。

【図4】ｉｎ ｖｉｖｏレンチウイルスベクター治療後のＡｇｘｔ１^－／－注射マウスの肝臓におけるＡＧＸＴ発現分析を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおける生理的マウスＡｇｘｔ発現との比較。治療用レンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスにおけるＡＧＸＴ発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。ＡＧＸＴ発現表現は、ハウスキーピング遺伝子を参照した。異なる発現レベルを有する２つの異なるハウスキーピング遺伝子をこの分析に使用して（低レベルの発現であるｍｓＴｂｐ、及び高レベルの発現であるｍｓＡｃｔｂ）、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法戦略後のレンチウイルスベクター組込みによって誘導されたＡＧＸＴ発現（より低い発現レベル）と比較した野生型マウスにおける生理的Ａｇｘｔ発現（より高い発現レベル）の間の差を決定した。Ａ． ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ注射Ａｇｘｔ１^－／－マウス及び非注射野生型マウスの肝臓におけるｍｓＴｂｐ発現を参照したＡＧＸＴ発現。２．５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝６）、５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝１０）及び１×１０^９ＴＵ／マウス（ｎ＝６）の用量を投与した治療用レンチウイルス注射マウスは、それぞれ、ｍｓＴｂｐ発現の％として表される１０．８８（５．６２～１６．７９）、１２．１１（４．３８～１４．４８）及び１９．８８（１８．５２～２８．５５）のＡＧＸＴ発現となり、これは投与した用量と相関する。非注射Ａｇｘｔ１^－／－マウス（ｎ＝８）はＡＧＸＴ発現を示さなかった。さらに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）は、Ａｇｘｔ１^－／－治療マウスにおいて達成されたものより有意に高い、ｍｓＴｂｐ発現の８５６３％のＡｇｘｔ発現（６９９６％～８９３９％）を示した。Ｂ． ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ注射Ａｇｘｔ１^－／－マウス及び非注射野生型マウスの肝臓におけるｍｓＡｃｔｂ発現を参照したＡＧＸＴ発現。ｍｓＡｃｔｂハウスキーピング遺伝子発現の％として表されるＡＧＸＴ発現は、２．５×１０^８ＴＵ／マウスの治療用レンチウイルスベクター用量を投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスで０．１０４１（０．０６００７～０．２４５２）（ｎ＝６）、５×１０^８ＴＵ／マウスで注射したマウスで０．１８５７（０．０８８７８～０．２９６６）（ｎ＝１０）、１×１０^９ＴＵ／マウスで注射したマウスで０．３０８８（０．１７０７～０．４４１８）（ｎ＝６）であった。ｍｓＡｃｔｂを参照したＡｇｘｔの生理的発現は３４０．５％（１４１％～３７４．５％）であった。Ａｇｘｔ発現レベルの差はハウスキーピング遺伝子に依存するが、群間の差は維持された。

【図5】レポーターレンチウイルスベクターＣ５７ＢＬ／６及びＡｇｘｔ１^－／－注射マウスにおける形質導入細胞のパーセンテージを示す図である。レポーターレンチウイルスベクター注射野生型Ｃ５７ＢＬ／６及びＡｇｘｔ１^－／－マウスの肝臓切片におけるｅＧＦＰ発現肝細胞のパーセンテージを、免疫染色及びその後のＱｕＰａｔｈ（商標）ソフトウェアによる画像分析によって特定した。Ａ～Ｅ． 全てのマウス群の肝臓切片におけるｅＧＦＰに対する免疫染色の代表的な画像。緑色：ｅＧＦＰ、青色：ＤＡＰＩで染色された核。Ｆ～Ｈ． Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓切片におけるｅＧＦＰ及び肝細胞特異的マーカーであるマウスアルブミンの二重免疫染色の代表的な画像。赤色：ｅＧＦＰ、緑色：マウスアルブミン、青色：ＤＡＰＩで染色された核。Ｉ． 形質導入肝細胞のパーセンテージ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した実験に関しては、２つの異なるレポーターレンチウイルスベクター用量（１×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝３）及び２．５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝３））を試験した。これは、それぞれ１．７５１％（１．１３２％～５．５５６％）の陽性肝細胞及び１２．９２％（１０．７２％～１３．８１％）の陽性肝細胞に対応する。さらに、Ａｇｘｔ１^－／－において、２つの異なる用量を試験し（１．４×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝４）及び５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝５））、それぞれ１．７７７％（０．３９９％～４．５７２％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞及び５．５０５９％（２．１０９％～８．７５４％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞となった。

【図6】生体内分布分析を示す図である。提案した治療戦略の安全性を決定するために、２つの異なる用量のレポーターレンチウイルスベクターを注射したＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにおけるレンチウイルスベクター組込みゲノムの数を分析した。注射野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの異なる組織に組み込まれたＬＶゲノムコピー数をｑＰＣＲによって分析した。レポーターレンチウイルスベクターゲノムの組込みは、標的組織である肝臓、並びに肺、脾臓、及び骨髄でのみ観察された。１×１０^８ＴＵ／マウスを注射したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）は、肺で２．７２（２．３３～６．２）、脾臓で０．２１（０．１４～０．３２）、骨髄で０．０５（０．０４～０．０９）のＶＣＮ値を有するオフターゲット形質導入を示したが、より高用量の２．５×１０^８ＴＵ／マウスを注射したマウス（ｎ＝３）は、肺で４．９４（０．１８５～７．７９）、脾臓で０．３５（０．２５～０．５５）、骨髄で０．１３（０．０９～０．１８）のＶＣＮ値を示した。

【図7】ＰＨ１エンドポイント。エチレングリコール負荷試験中のシュウ酸塩尿濃度を示す図である。基礎時点並びにエチレングリコール負荷試験の３日目及び７日目での尿シュウ酸塩の定量（μｍｏｌ／２４時間）。示した全てのマウスに、０．５％のエチレングリコールを飲料水に添加した７日間のエチレングリコール負荷試験を行った。２つの異なる陰性対照群を示すと、一方はＡｇｘｔ１^－／－非注射マウス（ｎ＝８）で構成され、もう一方は、２つの異なる用量のＬＶ．ＥＴ．ＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（１．４×１０^８ＴＵ／マウス及び５×１０^８ＴＵ／マウス）にて注射したＡｇｘｔ１^－／－マウス（ｎ＝９）で構成される。野生型Ｃ５７ＢＬ／６非注射マウス（ｎ＝５）で構成される陽性対照群も含まれる。治療用レンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスを、投与した用量（２．５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝６）、５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝１０）又は１０×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝６））に従って３つの異なる群に分ける。基礎データは、野生型マウスと比較して、治療及び非治療Ａｇｘｔ１^－／－マウスでより高いシュウ酸塩濃度を示す。エチレングリコール負荷試験中、尿シュウ酸塩レベルの増加が全ての群で観察されたが、この増加は、異なる用量のＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ（２．５×１０^８ＴＵ／マウス、５×１０^８ＴＵ／マウス又は１０×１０^８ＴＵ／マウス）でのＡｇｘｔ１^－／－治療マウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス群と比較して、非治療Ａｇｘｔ１^－／－マウス（非注射及びＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ注射Ａｇｘｔ１^－／－マウス）の場合に大きかった。この差は、エチレングリコール負荷試験の７日目に５×１０^８ＴＵ／マウスのＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスの場合に、未治療群と比較してはるかに大きかった。さらに、エチレングリコール治療の７日目に、５×１０^８ＴＵ／マウスの治療用ＬＶで治療したＡｇｘｔ１^－／－と野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスとの間に有意差は認められなかった。

【図8】ＰＨ１エンドポイント：エチレングリコール負荷試験中の体重変化を示す図である。エチレングリコール負荷試験中の体重経過を分析した。動物の体重は、負荷試験前の基礎時点並びに負荷試験の３日目及び７日目にて測定した。この図では、各動物の基礎体重に対する体重の増減を示している。２つの異なる陰性対照群を示すと、一方はＡｇｘｔ１^－／－非注射マウスで構成され、もう一方は、２つの異なる用量のＬＶ．ＥＴ．ＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（１．４×１０^８ＴＵ／マウス及び５×１０^８ＴＵ／マウス）にて注射したＡｇｘｔ１^－／－マウスで構成される。野生型Ｃ５７ＢＬ／６非注射マウスで構成される陽性対照群も含まれる。治療用レンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスを、投与した用量（２．５×１０^８ＴＵ／マウス、５×１０^８ＴＵ／マウス又は１０×１０^８ＴＵ／マウス）に従って３つの異なる群に分ける。治療用レンチウイルスベクター治療マウスの場合、負荷試験の７日目に体重の減少は観察されず、増加が観察されたが、未治療マウス（非注射又はレポーターレンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウス）の場合、負荷試験中に重量喪失が見られた。さらに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと５×１０^８ＴＵ／マウス又は１０×１０^８ＴＵ／マウスの用量にて治療用レンチウイルスベクターを注射したＡｇｘｔ１^－／－マウスとの間には有意差は認められなかったが、一方、これらの群と非治療マウスとの間には有意差が認められた。

【図9】ＰＨ１エンドポイント。腎臓損傷スコア。エチレングリコール負荷試験後の腎臓損傷発症を示す図である。エチレングリコール負荷試験を行った治療マウス及び非治療マウスの腎臓損傷を決定するために、腎臓の組織試料を「腎臓損傷スコア」に従って以下に分類した。０：損傷なし、１：構造は正常だが、拡張した管等の幾つかの損傷徴候がある、２：構造が部分的に影響を受け、拡張した管の存在が増加する、３：組織構造が大きな影響を受け、腎石灰化症の段階を示すシュウ酸カルシウム結晶の存在が観察できる。Ａ． 各マウス群のヘマトキシリン－エオシン腎臓切片の代表的な画像。各群からの腎臓損傷スコアが０～１の試料の代表的な画像（腎臓損傷なし又は軽度の腎臓損傷を示す）、及び腎臓損傷スコアが２～３の試料の代表的な画像（中程度又は重度の腎臓損傷を示す）である。各群のマウスの総数に対する、そのレベルの腎臓損傷を発症したマウスの数を各画像に明記する。異なるマウス群に従って、２つの異なる陰性対照群を示すと、一方はＡｇｘｔ１^－／－非注射マウス（ｎ＝８）で構成され、もう一方は、２つの異なる用量のＬＶ．ＥＴ．ＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（１．４×１０^８ＴＵ／マウス及び５×１０^８ＴＵ／マウス）にて注射したＡｇｘｔ１^－／－マウス（ｎ＝９）で構成される。野生型Ｃ５７ＢＬ／６非注射マウス（ｎ＝５）で構成される陽性対照群も含まれる。治療用レンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスを、投与した用量（２．５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝６）、５×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝１０）又は１０×１０^８ＴＵ／マウス（ｎ＝６））に従って３つの異なる群に分ける。Ｂ． 各動物の腎臓損傷段階を表した。灰色のバンドは腎石灰化症の発症を表す。異なる治療Ａｇｘｔ１^－／－マウス間で、中間用量の治療用レンチウイルスベクターを注射したマウスはいずれも腎石灰化症を発症しなかった。

【図10】形質導入促進剤：シクロスポリンＨは、ＨｅｐＧ２細胞株におけるレポーターレンチウイルスベクター形質導入を増加させることを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる投与レジメンのＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ及びシクロスポリンＨ（ＣｓＨ）の組み合わせで形質導入した。ＣｓＨ無しのレポーターレンチウイルスベクター形質導入細胞と比較した、異なるＣｓＨ処理条件との間のｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージの増加倍数を表す。第１の形質導入プロトコルにおいて、レンチウイルスベクター形質導入中に、ＨｅｐＧ２細胞を異なる濃度のＣｓＨ（４μＭ、８μＭ又は１６μＭ）に曝した。細胞を０．３のレンチウイルスベクターＭＯＩで形質導入した。各条件の３回の技術的反復を実施した。基礎形質導入レベルは３６．６７％であり、異なるＣｓＨ処理試料では、４μＭ、８μＭ及び１６μＭのＣｓＨ条件で３７．６７％、４４．３％及び５１．５％の形質導入パーセンテージが認められ、これは、それぞれ１．０３倍、１．２倍及び１．４倍の増加を意味する。さらに、別のＣｓＨ投与レジメンを試験した。ＨｅｐＧ２細胞を形質導入前に１６時間ＣｓＨで前処理し、レンチウイルス形質導入中にＣｓＨをＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴと共に添加した。試験したＣｓＨ濃度は１６μＭのみであった。このＣｓＨ投与レジメンにおいて、対照群に対して２．３５倍のｅＧＦＰ陽性細胞の増加が認められた。細胞を０．３のＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴのＭＯＩで形質導入すると、達成された形質導入細胞のパーセンテージは、対照群で１３．２％、ＣｓＨ処理細胞で３１．０３％であった。同じＭＯＩでの形質導入レベルで観察された差は、おそらく使用したウイルスストックの違いによるものである。

【図11】ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴコンストラクトを示す図である。

【図12】ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴコンストラクトを示す図である。

【図13】ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ形質導入有効性の比較を示す図である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入有効性を決定するために、ＨｅｐＧ２細胞を異なる感染多重度（ＭＯＩ）にてＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴで形質導入した。形質導入の３日後に、ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。約１のＭＯＩを使用すると、５０％の形質導入パーセンテージが達成されたが、より高いＭＯＩでは１００％の形質導入が達成された。ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入有効性を決定するために、成体Ｃ５７ＢＬ／６（黒丸）又はＡｇｘｔ１^－／－マウス（白丸）に異なる用量（１×１０^８ＴＵ／マウス、１．４×１０^８ＴＵ／マウス、２×１０^８ＴＵ／マウス及び５×１０^８ＴＵ／マウス）にてＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴを静脈内注射した。対応するＭＯＩは、以前に記載されているように、これらのマウスの肝臓における肝細胞の推定数に従ってのみ計算した（Park et al., 2000、Schmitt et al., 2010）。したがって、マウスに以下のＭＯＩ：０．８、１．１、２、及び４で注射した。形質導入肝細胞のパーセンテージは、４週間後に肝臓の組織試料において決定した。

【図14】デキサメタゾン処理がｉｎ ｖｉｖｏレポーターレンチウイルスベクター治療Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における形質導入有効性を改善することを示す図である。提案した戦略との関係において、形質導入促進剤としてのデキサメタゾンの使用を試験するために、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施した。Ａ． Ｃ５７ＢＬ／６成体雄マウスに単回用量のＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（５×１０^８ＴＵ／マウス）を、デキサメタゾン（Ｆｏｒｔｅｃｏｒｔｉｎ（商標））と組み合わせて、又は組み合わせずに静脈内注射によって静脈内注射した。デキサメタゾンは、レンチウイルスベクター注射の１２時間前及び２時間前、並びに４時間後の３回の逐次的投与で、５ｍｇ／体重１ｋｇの用量にて腹腔内注射によって投与した。４週間後にマウスを屠殺した。その後、標的組織である肝臓において、組み込まれたレンチウイルスベクターのゲノムコピー数、及び形質導入細胞のパーセンテージを分析して、形質導入有効性を決定した。Ｂ． 肝臓におけるレンチウイルスベクターの組込みを、ｑＰＣＲによるＶＣＮの定量によって分析した。２つの異なるマウス治療群を示すと、一方はレンチウイルスベクターのみで治療を受けた群（ｎ＝５）、もう一方は併用治療を受けた群（ｎ＝５）である。レポーターレンチウイルスベクターのみで治療したマウスでは、二倍体ゲノム当たり１．４８（１．２～１．７６）のコピーが認められたが、デキサメタゾンでも治療したマウスでは、二倍体ゲノム当たり０．９２（０．３８～１．４）のコピーが検出され、レンチウイルスベクターのみで治療したマウスと比較して有意に減少した（ｐ＜０．０５）。Ｃ． 肝臓切片におけるｅＧＦＰ陽性肝細胞のパーセンテージは、免疫染色及びその後のＱｕＰａｔｈ（商標）ソフトウェアによる画像分析によって特定した。レポーターレンチウイルスベクターのみで治療したマウスでは、４．４３４％（２．１６７％～７．５５％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞が観察されたが、レンチウイルスベクター及びデキサメタゾンの組み合わせで治療したマウスでは、１８．１１％（６．３８１％～１９．７９％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞が得られ、レンチウイルスベクターのみで治療したマウスに対して有意に増加した（ｐ＜０．０５）。Ｄ及びＥ． 全てのマウス群の肝臓切片におけるｅＧＦＰに対する免疫染色の代表的な画像。

【発明を実施するための形態】

【0007】

第１の態様において、本発明は、核酸を含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）を提供し、核酸は転写単位を含み、転写単位は、本明細書において、５’から３’に肝細胞特異的プロモーター、好ましくはＥＴプロモーター、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭと称する）タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（以下、ＷＰＲＥと称する）、好ましくは突然変異ＷＰＲＥ、及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーを含むものとして定義され、肝細胞特異的プロモーター、ＷＰＲＥ及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭに作動可能に連結され、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭの発現を調節する。

【0008】

好ましくは、核酸は、以下の：
配列番号１６の全長にわたって少なくとも９８％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）についてコードするヌクレオチド配列であって、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質が、配列番号５２の全長にわたって少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する、ヌクレオチド配列と、
配列番号２１の全長にわたって少なくとも９８％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
を含み、
遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーター、ＷＰＲＥ及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーが、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質に作動可能に連結され、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質の発現を調節する。好ましくは、アラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）のアミノ酸配列は、配列番号５２のみからなる。好ましくは、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１６のみからなる。好ましくは、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のヌクレオチド配列は、配列番号２１のみからなる。好ましくは、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質についてコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９のみからなる。好ましくは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0009】

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる核酸は、好ましくは、５’から３’に以下の：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を更に含み、
好ましくは、ヌクレオチドは、ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域とを更に含む。

【0010】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、配列番号１６、配列番号２９、及び配列番号２１に対するｇ）、ｈ）、ｉ）の配列同一性は、それぞれ１００％である。

【0011】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、ｊ）の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0012】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドは、
ｌ）ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む。

【0013】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれる５’長末端反復は、配列番号４の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0014】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれるプライマー結合部位は、配列番号９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0015】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれるｐｓｉパッケージングシグナルは、配列番号１０の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0016】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれるステムループ４（ＳＬ４）は、配列番号１１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0017】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれるＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）は、配列番号１３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0018】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれるＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）は、配列番号１５の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0019】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれる３’長末端反復は、配列番号２３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0020】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれるＤｅｎｖＲＦ１は、配列番号１２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0021】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスベクターのヌクレオチドに含まれるＤｅｎｖＲＦ２は、配列番号１４の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0022】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、上記レンチウイルスの全長ヌクレオチドは、配列番号３０（ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ）と少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0023】

第２の態様において、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義されるレンチウイルスベクターを含む（例えば、形質導入された）宿主細胞又は実質的に純粋な細胞集団に関する。第２の態様の一実施形態において、宿主細胞又は実質的に純粋な細胞集団は肝細胞である。

【0024】

第３の態様において、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義されるレンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドを含む単離された核酸に関する。

【0025】

第４の態様において、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義されるレンチウイルス、第２の態様又はその実施形態のいずれかによる宿主細胞又は実質的に純粋な細胞集団、及び／又は第３の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義される核酸と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。

【0026】

第５の態様において、本発明は、医薬として使用される、第１の態様若しくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様若しくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、第３の態様若しくはその実施形態のいずれかによる単離された核酸、又は第４の態様若しくはその実施形態のいずれかの薬学的組成物を提供する。

【0027】

第６の態様において、本発明は、原発性高シュウ酸尿症、好ましくは原発性高シュウ酸尿症１型の治療に使用される、第１の態様若しくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様若しくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、第３の態様若しくはその実施形態のいずれかによる単離された核酸、又は第４の態様若しくはその実施形態のいずれかの薬学的組成物であって、上記レンチウイルス、上記宿主細胞若しくは細胞集団、又は上記組成物を被験体に投与することを含む使用を提供する。

【0028】

好ましくは、第５の態様及び第６の態様による使用は、免疫応答抑制剤、好ましくはデキサメタゾン、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＨ及び／又はラパマイシン、又はそれらの任意の組み合わせと組み合わされる。

【0029】

一般的な定義
本明細書において使用される場合に、単数形（"a", "an", and "the"）は、文脈上特段の明示がない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。さらに、特段の指示がない限り、一連の要素に先立つ「少なくとも」という用語は、一連の中の全ての要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、日常の実験を使用するだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、又は把握することができるであろう。そのような均等物は、本発明により包含されることが意図される。

【0030】

本明細書において、「約」という用語は、概ね、おおよそ、前後、又はほぼを意味するものとして使用される。「約」という用語が数値の範囲と共に使用される場合、それは、記載された数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、本明細書において、明記された値の上下の数値を上下（高低）１０％の変動によって変更するために使用される。

【0031】

本明細書において使用される場合、多数の列挙された要素間の接続語「及び／又は」は、個別の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」により接続されている場合、１つ目の選択肢は１つ目の要素を２つ目の要素を除いて適用可能であることを指す。２つ目の選択肢は２つ目の要素を１つ目の要素を除いて適用可能であることを指す。３つ目の選択肢は１つ目の要素と２つ目の要素とを一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のいずれか１つがその意味の範囲内に含まれ、したがって本明細書において使用される「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。２つ以上の選択肢を同時に適用可能であることもその意味の範囲内に含まれ、したがって「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。

【0032】

本明細書及び添付の特許請求の範囲全体を通じて、文脈上特段の必要がない限り、「～を含む（comprise）」という語、並びに「～を含む（comprises）」及び「～を含む（comprising）」等の別形は、指定された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、あらゆる他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群も除外しないことを意味するものと理解されるであろう。本明細書において使用される場合、「～を含む（comprising）」という用語を、「～を含有する（containing）」若しくは「～を含む（including）」という用語で置き換えることができ、又は本明細書において使用される場合、時には「～を有する（having）」という用語で置き換えることができる。上述の用語（～を含む（comprising）、～を含有する（containing）、～を含む（including）、～を有する（having））のいずれも、本発明の態様又は実施形態の文脈において本明細書において使用されるときはいつでも、「～のみからなる（consisting of）」という用語で置き換えることができるが、これはあまり好ましくない。

【0033】

本明細書において使用される場合、「～のみからなる（consisting of）」は、クレームの要素に特定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外する。

【0034】

タンパク質又はヌクレオチド「から本質的になる」タンパク質又はヌクレオチドは、特定のタンパク質又はヌクレオチドと相当に同一のアミノ酸又はヌクレオチド配列を有するタンパク質又はヌクレオチドである。

【0035】

タンパク質又はヌクレオチドとそれぞれ「本質的に同一のアミノ酸又はヌクレオチド配列」を有するタンパク質又はヌクレオチドは、典型的には、このタンパク質又はヌクレオチドと９０％超のアミノ酸又はヌクレオチド同一性を有する。この定義には保存的アミノ酸置換が含まれる。

【0036】

本発明の目的における「単離された」という用語は、その元の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生体物質（細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はそれらの断片、変異体、若しくは誘導体）を指す。例えば、植物又は動物において天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然に存在する隣接核酸から分離された同一のポリヌクレオチドは「単離された」と考えられる。

【0037】

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、区別なく使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形、又は、一本鎖形、若しくは二本鎖ヘリックスの形の任意のそれらのリン酸エステル類似体、例えばホスホロチオエート及びチオエステルを指す。核酸分子、特にＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子という用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、いかなる特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語には、とりわけ、線状又は環状のＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡ及び染色体に見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。

【0038】

「コード領域」又は「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。

【0039】

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。或る特定の実施形態において、下流のヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。

【0040】

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。或る特定の実施形態において、上流のヌクレオチド配列は、コード領域又は転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。

【0041】

本明細書において使用される場合、「遺伝子調節領域」又は「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５’配列）、その中、又は下流（３’配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を含むことができる。コード領域が真核細胞における発現を意図している場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列はコード配列の３’側に通常位置する。

【0042】

「転写後調節エレメント」という用語は、転写されるとタンパク質の発現を増強又は抑制する三次構造を生成するＤＮＡ配列を指す。

【0043】

「転写制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を指す。

【0044】

「プロモーター」という用語は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが結合できるＤＮＡ配列を指す。この配列は、転写因子等の転写を調節する種々のタンパク質の結合部位を更に含み得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ配列に密接に局在し、リンカー又はスペーサーによって分離され得る異なるプロモーター断片（異なる断片又は同じ断片のいずれか）から構成され得る。そのようなプロモーターはキメラプロモーターと呼ばれる。

【0045】

本出願において使用される「治療」及び「療法」という用語は、疾患及び／又は症状を治癒及び／又は緩和する目的と共に健康上の問題の改善を目標として使用される一連の衛生的手段、薬理学的手段、外科的手段及び／又は物理的手段を指す。「治療」及び「療法」という用語には、予防法及び治癒法が含まれる。それというのも、両者とも個体又は動物の健康の維持及び／又は回復に向けられるからである。症状、疾患及び廃疾の原因にかかわらず、健康上の問題を軽減及び／又は治癒するために適した医薬の投与は、本出願の文脈内の治療又は療法の形として解釈されるべきである。

【0046】

「治療有効量」という用語は、治療効果を有し、ＰＨ１を治療することが可能な物質の量を指す。

【0047】

「個体」、「患者」又は「被験体」という用語は、本出願において区別なく使用され、決して限定することを意図するものではない。「個体」、「患者」又は「被験体」は、任意の年齢、性別及び身体状態であってもよい。

【0048】

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な希釈剤」は、薬学的投与と適合可能な任意の全ての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を意味する。薬学的活性物質用のそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本発明の範囲を限定するものではないが、追加の緩衝剤、保存剤、共溶媒、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、ポリエステル類等の生分解性ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸及びトレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（myoinisitose）、ミオイニシトール（myoinisitol）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の有機糖類又は糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質、並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーが挙げられる。

【0049】

本明細書において使用される場合、「それを必要とする被験体」という語句には、例えば、止血を向上させるために、本明細書において提供される核酸分子、ポリペプチド、又はベクターの投与から利益を受けるであろう哺乳動物被験体等の被験体が含まれる。

【0050】

本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列に関して「最適化された」という用語は、ポリヌクレオチド配列がそのポリヌクレオチド配列の特性を高めるために突然変異されている、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。

【0051】

「レンチウイルス」（ＬＶ）という用語は、ヒト及び他の哺乳動物種において、長い潜伏期間を特徴とする慢性及び致死的な疾患を引き起こすレトロウイルスの属を指す。「ベクター」とは、外来遺伝物質を人工的に細胞内に運ぶために使用できる任意のビヒクルである。したがって、「レンチウイルスベクター」は、核酸を細胞内に運ぶ組換えレンチウイルスを指す。

【0052】

本明細書において使用される「転写単位」とは、５’から３’に肝細胞特異的プロモーター、好ましくはＥＴプロモーターと、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、好ましくは突然変異ＷＰＲＥと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーとを含む、本発明のＬＶベクター中に含まれるヌクレオチド配列を意味し、肝細胞特異的プロモーター、ＷＰＲＥ及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭに作動可能に連結され、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭの発現を調節する。

【0053】

説明
レンチウイルスベクターは遺伝子送達のための魅力的なツールであるが、形質導入の効率は、所望の治療効果を得るために十分な細胞が遺伝学的に修正されることを確実にする鍵である。残念ながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察される形質導入の速度はｉｎ ｖｉｖｏで達成される形質導入効率に対応しないことが一般的に見出されており、これは、ベクターが、遺伝子修正が所望される組織に直接送達されないか、又は送達できない（例えば、肝臓特異的疾患の場合）が、ベクターが血流に取り込まれ、宿主の免疫応答によって標的とされる非経口経路等の他の経路によって送達される場合に特に強調される。本発明の著者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ＨｅｐＧ２細胞中）及びｉｎ ｖｉｖｏ（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）で使用した同じレンチウイルスベクターの形質導入効率を図１３に示し、ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏの状況にあるときに形質導入細胞のパーセンテージにおいて大幅な減少があることを示している。さらに、形質導入効率は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ、又は局所送達と全身送達とで異なるだけでなく、使用されるレンチウイルスの種類、及び細胞を形質導入し、宿主細胞ゲノムに組み込む能力によっても異なる。特に、標的細胞を形質導入する能力は、明らかにレンチウイルスバックボーンの影響を受ける（Johnson et al., 2021, Mol Therapy）。多くの場合、レンチウイルスバックボーンにおける小さな変化が、その形質導入効率における大きな変化に変換される。この全てを考慮すると、目的の遺伝子（導入遺伝子）を含む特定のレンチウイルスベクターが特定の疾患に対してｉｎ ｖｉｖｏで効率的に作用するかどうかを決定することは困難であると断言できる。

【0054】

さらに、血友病（例えば、血友病Ａ）等の幾つかの疾患は、レンチウイルスベクターの形質導入効率がｉｎ ｖｉｖｏで細胞の１０％にも達しないにもかかわらず、レンチウイルスベクターで治療することができる。これは、これらの場合では、５％という低いｉｎ ｖｉｖｏ形質導入有効性で、疾患の表現型を戻すのに十分な治療効果を得ることが十分にできるからである。しかしながら、ＰＨ１の特定の場合では、少なくとも部分的にＰＨ１表現型を戻すためには、肝細胞の少なくとも４０％を修正する必要があり、すなわち、ＡＧＸＴタンパク質を効率的に産生する必要があるということが広く受け入れられている。Castelloらは、肝細胞移植戦略が成功する可能性は低く、ＰＨ１の修正には多数の生着肝細胞が必要とされ、この手順の能力を超える可能性が高いためであることを以前に明らかにしている（Castello et al. 2015. doi: 10.1038/gt.2015.107）。さらに、Jiang及び同僚らは、臨床的治癒を達成するためには、過剰産生する突然変異肝細胞質量の少なくとも７５％を野生型肝細胞に置換しなければならないことを一部の専門家が推定していることも明らかにしている（Jiang et al. 2008. DOI: 10.1097/TP.0b013e31816de49e）。しかしながら、本発明の著者らは、図７～図９に示すように、肝細胞におけるＡＧＸＴタンパク質の発現における欠損を修正することができ、シュウ酸塩蓄積の減少を引き起こし、したがってＰＨ１表現型を部分的に戻すレンチウイルスベクターを開発した。驚くべきことに、本明細書に記載のレンチウイルスベクターによってもたらされるこの効果は、図５に示すように、上記レンチウイルスベクターがｉｎ ｖｉｖｏで細胞の約５％しか形質導入できなかったという事実にもかかわらず達成された。

【0055】

したがって、本発明は、肝細胞への形質導入により、ＡＧＸＴタンパク質の細胞内レベルを増加させ、ＰＨ１を治療するための優れた治療有効性をもたらす、コドン最適化ＡＧＸＴ配列を含むレンチウイルスベクターを提供することによって、当該技術分野における重要なニーズを満たす。本明細書において提供されるレンチウイルスベクター中に含まれる核酸配列の概略図を図１２に示す。

【0056】

したがって、第１の態様において、本発明は、核酸を含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）を提供し、核酸は転写単位を含み、転写単位は、本明細書において、５’から３’に肝細胞特異的プロモーター、好ましくはＥＴプロモーターと、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭと称する）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（以下、ＷＰＲＥと称する）、好ましくは突然変異ＷＰＲＥと、及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーとを含むものとして定義され、肝細胞特異的プロモーター、ＷＰＲＥ及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭに作動可能に連結され、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭの発現を調節する。コード配列及び遺伝子発現制御配列は、それらが、コード配列の発現又は転写及び／又は翻訳を遺伝子発現制御配列の影響下又は制御下に置くような方法で連結されている場合に、作動可能に連結されていると言われる。例えば、肝細胞特異的プロモーター、ＷＰＲＥ及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーは、ＡＧＸＴの発現レベルがプロモーター及びＷＰＲＥによって調節されるように、最適化されたＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

【0057】

一実施形態において、第１の態様によるＬＶベクター中に含まれる核酸は、ＬＶがその機能（細胞に感染し、ウイルスゲノムに組み込まれて細胞内で存続する）を実行するために必要なタンパク質についてコードする核酸、及びＬＶがその機能を実行するために必要な調節配列についてコードする核酸として定義される、１つ以上のレンチウイルスバックボーンエレメントを更に含む。

【0058】

したがって、第１の態様のＬＶベクターは核酸を含み、この核酸は、１）転写単位と、２）１つ以上のＬＶベクターバックボーンエレメントとを含む。転写単位及びＬＶベクターバックボーンに含まれる全ての核酸を組み合わせることができることに留意されたい。これらの２つの成分のそれぞれについて、以下に詳細に説明する。

【0059】

１）転写単位
上記で定義されているように、本明細書において、転写単位とは、本発明のＬＶベクター中に含まれる核酸配列であって、５’から３’に肝細胞特異的プロモーターと、最適化されたＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ＷＰＲＥエレメントと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーとを含む、核酸配列を指し、肝細胞特異的プロモーター、ＷＰＲＥ及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭに作動可能に連結され、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭの発現を調節する。

【0060】

肝細胞特異的プロモーター
肝細胞特異的プロモーターは、標的細胞へのレンチウイルスベクターゲノム組込み後にＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ発現を導く。

【0061】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる核酸配列は、少なくとも１つの組織特異的プロモーター、すなわち、特定の組織又は細胞型における最適化されたＡＧＸＴタンパク質の発現を調節するであろうプロモーターを含む。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中の組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞における最適化されたＡＧＸＴタンパク質の発現を選択的に増強する。幾つかの実施形態において、標的肝臓細胞は、肝細胞又はその前駆細胞である。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる単離された核酸分子は、標的細胞又は標的組織のゲノム、例えば、肝細胞のゲノムに安定に組み込まれる。

【0062】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子発現のための肝細胞特異的プロモーターを含む。一実施形態において、肝細胞特異的プロモーターを含むヌクレオチドは、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターである。幾つかの実施形態において、標的肝臓細胞における最適化されたＡＧＸＴタンパク質の発現を選択的に増強する組織特異的プロモーターは、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲｐ）を含む。一実施形態において、肝細胞特異的プロモーターはキメラプロモーターである。幾つかの実施形態において、キメラ肝細胞特異的プロモーターは、合成エンハンサー、トランスチレチンエンハンサー（以下、ＴＴＲエンハンサーと称する）、トランスチレチンプロモーター（以下、ＴＴＲｐと称する）、及びトランスチレチン５’ＵＴ（以下、ｍＴＴＲ ５’ＵＴと称する）のみからなるＥＴプロモーターである。

【0063】

好ましい実施形態において、ＥＴプロモーターの合成エンハンサーは、配列番号１７又は配列番号１７の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＥＴプロモーターの合成エンハンサーは、配列番号１７又は配列番号１７の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＥＴプロモーターの合成エンハンサーは、配列番号１７又は配列番号１７の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0064】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＥＴプロモーターの合成エンハンサーのヌクレオチド配列は、配列番号１７を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0065】

好ましい実施形態において、ＥＴプロモーターのＴＴＲエンハンサーはマウスＴＴＲエンハンサー（ｍＴＴＲエンハンサー）であり、配列番号１８又は配列番号１８の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＥＴプロモーターのｍＴＴＲエンハンサーは、配列番号１８又は配列番号１８の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＥＴプロモーターのｍＴＴＲエンハンサーは、配列番号１８又は配列番号１８の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0066】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＥＴプロモーターのｍＴＴＲエンハンサーのヌクレオチド配列は、配列番号１８を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0067】

好ましい実施形態において、ＥＴプロモーターのトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲｐ）はマウスＴＴＲｐ（ｍＴＴＲｐ）であり、配列番号１９又は配列番号１９の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＥＴプロモーターのｍＴＴＲｐは、配列番号１９又は配列番号１９の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＥＴプロモーターのｍＴＴＲｐは、配列番号１９又は配列番号１９の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0068】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＥＴプロモーターのｍＴＴＲｐのヌクレオチド配列は、配列番号１９を含むか、それのみからなるか、又はそれ本質的にのみからなる。

【0069】

好ましい実施形態において、ＥＴプロモーターのトランスチレチン５’ＵＴ（ＴＴＲ ５’ＵＴ）はマウスＴＴＲ ５’ＵＴ（ｍＴＴＲ ５’ＵＴ）であり、配列番号２０又は配列番号２０の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＥＴプロモーターのｍＴＴＲ ５’ＵＴは、配列番号２０又は配列番号２０の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＥＴプロモーターのｍＴＴＲ ５’ＵＴは、配列番号２０又は配列番号２０の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0070】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＥＴプロモーターのｍＴＴＲ ５’ＵＴのヌクレオチド配列は、配列番号２０を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0071】

２つの配列間の配列同一性は、従来の方法によって決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., 1990. J Mol Biol. 215(3): 403-10）等の当該技術分野において既知の標準的なアラインメント対数を使用することによる。好ましい実施形態において、２つの配列間の配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して決定される。

【0072】

好ましい実施形態において、肝細胞特異的プロモーターは、配列番号１７の合成エンハンサー、配列番号１８のｍＴＴＲエンハンサー、配列番号１９のｍＴＴＲｐ、及び配列番号２０のｍＴＴＲ ５’ＵＴ、又は配列番号１７、１８、１９、若しくは２０の全長にわたってそれぞれ少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列のみからなるＥＴプロモーターである。

【0073】

好ましい実施形態において、肝細胞特異的ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１６又は配列番号１６の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、肝細胞特異的ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１６又は配列番号１６の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、肝細胞特異的ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１６又は配列番号１６の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0074】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれ、標的肝臓細胞における最適化されたＡＧＸＴタンパク質の発現を選択的に増強する肝臓特異的プロモーターであるヌクレオチド配列は、配列番号１６のＥＴプロモーターを含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0075】

最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質についてコードするヌクレオチド配列
本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、最適化されたＡＧＸＴタンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、コドン最適化ポリヌクレオチドＡＧＸＴは、プロモーター及び転写後エレメントを含む少なくとも１つの、好ましくは２つの発現制御配列に作動可能に連結されている。幾つかの実施形態において、本発明は、ＡＧＸＴと同様の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供する。一実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれ、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭについてコードするヌクレオチド配列は、細胞のペルオキシソームにおいて新たに合成されたタンパク質を配置するシグナルペプチドをコードする。

【0076】

好ましい実施形態において、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭについてコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９又は配列番号２９の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭについてコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９又は配列番号２９の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭについてコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９又は配列番号２９の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0077】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれ、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭについてコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0078】

好ましい実施形態において、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭのアミノ酸配列は、配列番号５２又は配列番号５２の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭのアミノ酸配列は、配列番号５２又は配列番号５２の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭのアミノ酸配列は、配列番号５２又は配列番号５２の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0079】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質は、配列番号５２を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0080】

ＷＨＶ（ウッドチャック肝炎ウイルス）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）
本明細書において提供されるレンチウイルスベクターはまた、最適化されたＡＧＸＴについてコードするヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの転写後調節エレメントを含む。一実施形態において、上記転写後調節エレメントは、ＷＨＶ（ウッドチャック肝炎ウイルス）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。一実施形態において、転写後調節エレメントは、ベクターの安全性を高めるために突然変異されている。好ましい実施形態において、突然変異ＷＰＲＥは、遺伝子Ｘフレームに突然変異を含む。

【0081】

好ましい実施形態において、突然変異ＷＰＲＥを含むヌクレオチド配列は、配列番号２１又は配列番号２１の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、突然変異ＷＰＲＥを含むヌクレオチド配列は、配列番号２１又は配列番号２１の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、突然変異ＷＰＲＥを含むヌクレオチド配列は、配列番号２１又は配列番号２１の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0082】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチド配列ＷＰＲＥは、配列番号２１を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0083】

少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピー
本発明はまた、最適化されたＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーを提供する。システムの効率を高めるために、ｍｉＲＮＡ標的配列の２つ以上のコピーを転写単位に含めることができる。１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、同一であっても異なっていてもよい。一実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる転写単位は、同一であるか又は異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つのコピーを含む。

【0084】

一実施形態において、標的配列はｍｉＲＮＡ－１４２－３標的である。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子産物への免疫応答を低減するために、ｍｉＲＮＡ－１４２－３についての１つ以上の標的配列を含む。１つの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｍｉＲＮＡ－１４２－３標的配列の１つ、２つ、３つ、好ましくは４つ、５つ、６つ、７つ又は８つの反復又はコピーを含む。幾つかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ－１４２－３についての１つ以上の標的配列を本発明のレンチウイルスの転写単位に組み込むことにより、所望の導入遺伝子発現プロファイル及び／又は免疫原性の低減が可能となる。特に、ｍｉＲＮＡ－１４２－３についての１つ以上の標的配列を組み込むと、血管内及び血管外の造血系統における導入遺伝子発現を抑制することができるが、導入遺伝子発現は非造血細胞において維持される。或る特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ－１４２－３等の造血特異的マイクロＲＮＡの相補的配列は、レンチウイルスベクターの３’非翻訳領域に組み込まれ、導入遺伝子コード転写産物をｍｉＲＮＡ媒介下方制御に対して感受性にする。

【0085】

標的配列は、ｍｉＲＮＡに対して完全に又は部分的に相補的であり得る。「完全に相補的」という用語は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。一実施形態において、転写単位に含まれる核酸配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つの反復を含む。

【0086】

好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ－１４２－３を含むヌクレオチド配列は、配列番号２２又は配列番号２２の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ｍｉＲＮＡ－１４２－３を含むヌクレオチド配列は、配列番号２２又は配列番号２２の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ｍｉＲＮＡ－１４２－３を含むヌクレオチド配列は、配列番号２２又は配列番号２２の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0087】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるｍｉＲＮＡ－１４２－３のヌクレオチド配列は、配列番号２２を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0088】

幾つかの実施形態において、標的配列はｍｉＲ－１８１標的である。幾つかの実施形態において、標的配列はｍｉＲ－２２３標的である。幾つかの実施形態において、標的配列はｍｉＲ－１２２標的である。幾つかの実施形態において、標的配列はｍｉＲ－３０ｂ標的である。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される。

【0089】

転写単位（肝細胞特異的プロモーター、最適化されたＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＷＰＲＥエレメント、及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピー）の異なる要素についての上記の全ての実施形態は、互いに組み合わせることができることを理解されたい。好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターの核酸に含まれる転写単位は、
ａ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｂ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
を含むか又はそれらのみからなり、
ａ）、ｃ）及びｄ）は、ｂ）に作動可能に連結され、ｂ）の発現を調節する。更に好ましい実施形態において、ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、好ましくは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0090】

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターの核酸に含まれる転写単位は、
ａ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｂ）最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質は、配列番号５２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する、ヌクレオチド配列と、
ｃ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
を含むか又はそれらのみからなり、
ａ）、ｃ）及びｄ）は、ｂ）に作動可能に連結され、ｂ）の発現を調節する。更に好ましい実施形態において、ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、好ましくは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0091】

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターの核酸に含まれる転写単位は、
ａ）配列番号１６のみからなる遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｂ）最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質は配列番号５２のみからなる、ヌクレオチド配列と、
ｃ）配列番号２１のみからなる突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
を含むか又はそれらのみからなり、
ａ）、ｃ）及びｄ）は、ｂ）に作動可能に連結され、ｂ）の発現を調節する。更に好ましい実施形態において、ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、好ましくは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0092】

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターの核酸に含まれる転写単位は、
ａ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｂ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
を含むか又はそれらのみからなり、
ａ）、ｃ）及びｄ）は、ｂ）に作動可能に連結され、ｂ）の発現を調節する。更に好ましい実施形態において、ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、好ましくは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0093】

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターの核酸に含まれる転写単位は、
ａ）配列番号１６のみからなる遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｂ）配列番号２９のみからなる最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）配列番号２１のみからなる突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
を含むか又はそれらのみからなり、
ａ）、ｃ）及びｄ）は、ｂ）に作動可能に連結され、ｂ）の発現を調節する。更に好ましい実施形態において、ｄ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、好ましくは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0094】

２）レンチウイルスベクターバックボーンエレメント
上記で定義されているように、レンチウイルスベクターバックボーンエレメントは、ＬＶがその機能（細胞に感染し、ウイルスゲノムに組み込まれて細胞内で存続する）を実行するために必要な核酸配列として定義される。

【0095】

レンチウイルスには、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、ヒツジヤギレンチウイルス群、及び霊長類レンチウイルス群に属するものが含まれる。

【0096】

幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、「第３世代」レンチウイルスベクターである。本明細書において使用される場合、「第３世代」レンチウイルスベクターという用語は、第２世代ベクターシステムの特徴を有し、機能的ｔａｔ遺伝子を更に欠いているレンチウイルスパッケージングシステム、例えばｔａｔ遺伝子が欠失しているか又は不活性化されているものを指す。典型的に、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現コンストラクト上に提供される。本明細書において使用される場合、「第２世代」レンチウイルスベクターシステムは、機能的アクセサリー遺伝子を欠いているレンチウイルスパッケージングシステム、例えばアクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆが欠失しているか又は不活性化されているものを指す。本明細書において使用される場合、「パッケージングシステム」は、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスコンストラクトのセットを指す。典型的に、パッケージングシステムのコンストラクトは、最終的にパッケージング細胞に組み込まれる。

【0097】

幾つかの実施形態において、本明細書において提供される第３世代レンチウイルスベクターは、自己不活性化レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ．Ｇ偽型レンチウイルスベクターである。

【0098】

或る特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスのベクターである。或る特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、肝臓細胞（例えば、肝細胞）に感染することができる組換えレンチウイルスのベクターである。レンチウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは、典型的に、レトロウイルスに見られる３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを有し、これらには２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が隣接する。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、カプシド及びヌクレオカプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼ及びインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進する役割を果たす。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他の全てのシス作用配列を含む。幾つかの実施形態において、レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｔ及びｖｐｘ（ＨＩＶ－Ｉ、ＨＩＶ－２及び／又はＳＩＶにおける）を含む追加の遺伝子を有する。

【0099】

或る特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するベクターの能力を損なうことなく、ＨＩＶ病原性遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆが欠失している。

【0100】

５’ＬＴＲに隣接しているのは、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）及び粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なカプシド形成（Ｐｓｉ部位）に必要な配列である。カプシド形成（又は感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠落し得る場合、シス欠陥（cis defect）はゲノムＲＮＡのカプシド形成を阻止する。しかしながら、得られた突然変異体は、全てのビリオンタンパク質の合成を指示することが可能なままである。

【0101】

したがって、上記で定義されているように、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は転写単位を含む。さらに、別の実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる上記核酸は、上記で定義される転写単位の上流、すなわち、５’領域にて、５’から３’の順に、以下：ａ）５’長末端反復（５’ＬＴＲ）、ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）、ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナル、ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域、ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及びｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）のうちの少なくとも１つ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。好ましい実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる上記核酸は、上記で定義される転写単位の上流、すなわち、５’領域にて、ｌ）ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域、及びｍ）ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。これらのヌクレオチドのそれぞれを以下で更に定義する。

【0102】

別の実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる上記核酸は、上記で定義される転写単位の下流、すなわち、３’領域にて、ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）を更に含む。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、５’ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含む。５’ＬＴＲのＵ３領域の欠失は、完全欠失又は部分的欠失であり得る。

【0103】

ヌクレオチドａ）～ｆ）及びｊ）～ｋ）の間で可能な任意の組み合わせが、本発明において、及び上記セクションに記載されている転写単位と組み合わせて含まれることを理解されたい。ヌクレオチドａ）～ｆ）及びｊ）～ｋ）のそれぞれ並びにそれらの好ましい実施形態を以下で更に定義する。

【0104】

さらに、別の実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる上記核酸は、好ましくは、上記で定義される転写単位の上流に（すなわち、５’領域にて）、好ましくは５’から３’の順に、以下：ａ）５’長末端反復（５’ＬＴＲ）、ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）、ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナル、ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域、ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及びｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）のうちの少なくとも１つ、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。好ましい実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる上記核酸は、好ましくは、上記で定義される転写単位の上流に（すなわち、５’領域にて）、ｈ）ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域、及びｉ）ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。更に好ましい実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる核酸は、好ましくは、上記で定義される転写単位の下流に（すなわち、３’領域にて）、ｇ）３’長末端反復（ＬＴＲ）を更に含む。上記と同様に、ヌクレオチドａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）及びｉ）並びにｇ）の間で可能な任意の組み合わせが、本発明において、及び上記セクションに記載されている転写単位と組み合わせて含まれることを理解されたい。

【0105】

好ましい実施形態において、５’ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号４又は配列番号４の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、５’ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号４又は配列番号４の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、５’ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号４又は配列番号４の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0106】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる５’ＬＴＲのヌクレオチド配列は、配列番号４を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0107】

一実施形態において、５’ＬＴＲ領域は、ＣＭＶプロモーター、好ましくはキメラＣＭＶプロモーター、及び／又はＲＵ５エレメントを含む。一実施形態において、キメラＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー及びＣＭＶプロモーターを含むか又はそれのみからなる。好ましい実施形態において、５’ＬＴＲ領域は、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＲＵ５エレメント、及び／又はそれらの任意の組み合わせを含むか又はそれのみからなる。

【0108】

好ましい実施形態において、キメラＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号５又は配列番号５の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、キメラＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号５又は配列番号５の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、キメラＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号５又は配列番号５の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0109】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるキメラＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号５を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0110】

好ましい実施形態において、ＣＭＶエンハンサーを含むヌクレオチド配列は、配列番号６又は配列番号６の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＣＭＶエンハンサーを含むヌクレオチド配列は、配列番号６又は配列番号６の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＣＭＶエンハンサーを含むヌクレオチド配列は、配列番号６又は配列番号６の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0111】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＣＭＶエンハンサーのヌクレオチド配列は、配列番号６を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0112】

好ましい実施形態において、ＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号７又は配列番号７の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号７又は配列番号７の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号７又は配列番号７の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0113】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号７を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0114】

好ましい実施形態において、ＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号８又は配列番号８の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号８又は配列番号８の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号８又は配列番号８の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0115】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＲＵ５エレメントのヌクレオチド配列は、配列番号８を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0116】

一実施形態において、５’ＬＴＲに隣接しているのは、ゲノムの逆転写に必要な配列であり、これはｔＲＮＡプライマー結合部位（以下、ＰＢＳ又はＰＢＳ ＳＬ２３と称する）である。

【0117】

好ましい実施形態において、ＰＢＳ ＳＬ２３を含むヌクレオチド配列は、配列番号９又は配列番号９の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＰＢＳ ＳＬ２３を含むヌクレオチド配列は、配列番号９又は配列番号９の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＰＢＳ ＳＬ２３を含むヌクレオチド配列は、配列番号９又は配列番号９の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0118】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＰＢＳ ＳＬ２３のヌクレオチド配列は、配列番号９を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0119】

幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なカプセル化のために、少なくともｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル（ｐｓｉ部位とも呼ばれる）を含む。

【0120】

好ましい実施形態において、ｐｓｉパッケージングシグナルを含むヌクレオチド配列は、配列番号１０又は配列番号１０の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ｐｓｉパッケージングシグナルを含むヌクレオチド配列は、配列番号１０又は配列番号１０の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ｐｓｉパッケージングシグナルを含むヌクレオチド配列は、配列番号１０又は配列番号１０の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0121】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるｐｓｉパッケージングシグナルのヌクレオチド配列は、配列番号１０を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。一実施形態において、ＰＳＩパッケージングシグナルのヌクレオチドは、ＰＢＳ ＳＬ２３及び以下で定義される野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と部分的に重複する。

【0122】

或る特定の実施形態において、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質、ＤｅｎｖＲＦ１、Ｒｅｖ応答エレメント（以下、ＲＲＥと称する）、ＤｅｎｖＲＦ２、セントラルポリプリントラック（central polypurine track）（以下、ｃＰＰＴと称する）についてコードする１つ以上のヌクレオチド配列、及び／又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。

【0123】

幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、少なくとも野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域（以下、ＳＬ４ｍｇａｇと称する）を含む。

【0124】

好ましい実施形態において、ＳＬ４ｍｇａｇを含むヌクレオチド配列は、配列番号１１又は配列番号１１の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＳＬ４ｍｇａｇを含むヌクレオチド配列は、配列番号１１又は配列番号１１の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＳＬ４ｍｇａｇを含むヌクレオチド配列は、配列番号１１又は配列番号１１の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0125】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＳＬ４ｍｇａｇのヌクレオチド配列は、配列番号１１を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0126】

幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、少なくともＤｅｎｖＲＦ１エレメントを含む。

【0127】

好ましい実施形態において、ＤｅｎｖＲＦ１を含むヌクレオチド配列は、配列番号１２又は配列番号１２の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＤｅｎｖＲＦ１を含むヌクレオチド配列は、配列番号１２又は配列番号１２の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＤｅｎｖＲＦ１を含むヌクレオチド配列は、配列番号１２又は配列番号１２の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0128】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＤｅｎｖＲＦ１のヌクレオチド配列は、配列番号１２を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。一実施形態において、ＤｅｎｖＲＦ１のヌクレオチドは、上記で定義されたＳＬ４ｍｇａｇのヌクレオチド及び以下で定義されるＲＲＥのヌクレオチドと部分的に重複する。

【0129】

好ましい実施形態において、ＲＲＥを含むヌクレオチド配列は、配列番号１３又は配列番号１３の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＲＲＥを含むヌクレオチド配列は、配列番号１３又は配列番号１３の全長にわたって少なくとも７５％、７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＲＲＥを含むヌクレオチド配列は、配列番号１３又は配列番号１３の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0130】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＲＲＥのヌクレオチド配列は、配列番号１３を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0131】

幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、少なくともＤｅｎｖＲＦ２エレメントを含む。

【0132】

好ましい実施形態において、ＤｅｎｖＲＦ２を含むヌクレオチド配列は、配列番号１４又は配列番号１４の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＤｅｎｖＲＦ２を含むヌクレオチド配列は、配列番号１４又は配列番号１４の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＤｅｎｖＲＦ２を含むヌクレオチド配列は、配列番号１４又は配列番号１４の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0133】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＤｅｎｖＲＦ２のヌクレオチド配列は、配列番号１４を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0134】

好ましい実施形態において、ｃＰＰＴを含むヌクレオチド配列は、配列番号１５又は配列番号１５の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ｃＰＰＴを含むヌクレオチド配列は、配列番号１５又は配列番号１５の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ｃＰＰＴを含むヌクレオチド配列は、配列番号１５又は配列番号１５の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0135】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるｃＰＰＴのヌクレオチド配列は、配列番号１５を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0136】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は３’長末端反復（以下、３’ＬＴＲと称する）を含む。３’ＬＴＲは、レンチウイルスベクター生産中のｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。

【0137】

好ましい実施形態において、３’ＬＴＲは、３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含む。３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失は、完全欠失又は部分的欠失であり得る。

【0138】

好ましい実施形態において、３’ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号２３又は配列番号２３の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、３’ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号２３又は配列番号２３の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、３’ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号２３又は配列番号２３の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0139】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれる３’ＬＴＲのヌクレオチド配列は、配列番号２３を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0140】

好ましい実施形態において、３’ＬＴＲは、自己不活性化レンチウイルスベクターである野生型ＨＩＶ－１由来の切断されたＵ３エレメント（以下、ΔＵ３と称する）と、エレメントＲ及びＵ５（以下、ＲＵ５と称する）とから構成される。

【0141】

好ましい実施形態において、ΔＵ３を含むヌクレオチド配列は、配列番号２４又は配列番号２４の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ΔＵ３を含むヌクレオチド配列は、配列番号２４又は配列番号２４の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ΔＵ３を含むヌクレオチド配列は、配列番号２４又は配列番号２４の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0142】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるΔＵ３のヌクレオチド配列は、配列番号２４を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0143】

好ましい実施形態において、ＲＵ５を含むヌクレオチド配列は、配列番号２５又は配列番号２５の全長にわたって少なくとも９８％同一である配列を含む。好ましくは、ＲＵ５を含むヌクレオチド配列は、配列番号２５又は配列番号２５の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列を含む。より好ましくは、ＲＵ５を含むヌクレオチド配列は、配列番号２５又は配列番号２５の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である配列である。

【0144】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクター中に含まれるＲＵ５のヌクレオチド配列は、配列番号２５を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0145】

一実施形態において、ＲＵ５ヌクレオチドは、キメラＣＭＶプロモーターとＰＢＳ ＳＬ１２３ヌクレオチドとの間に位置する。一実施形態において、ＰＢＳ ＳＬ１２３ヌクレオチドは、５’ＬＴＲヌクレオチドとＰｓｉパッケージングシグナルとの間に位置する。一実施形態において、Ｐｓｉパッケージングシグナルヌクレオチドは、ＰＢＳ ＳＬ１２３ヌクレオチドと野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域のヌクレオチドとの間に位置する。一実施形態において、ＤｅｎｖＲＦ１ヌクレオチドは、ＳＬ４ｍｇａｇヌクレオチドとＲＲＥヌクレオチドとの間に位置する。一実施形態において、ＤｅｎｖＲＦ２ヌクレオチドは、ＲＲＥヌクレオチドとｃＰＰＴヌクレオチドとの間に位置する。一実施形態において、ｃＰＰＴヌクレオチドは、ＲＲＥヌクレオチドとＥＴプロモーターヌクレオチドとの間に位置する。一実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーは、突然変異ＷＰＲＥヌクレオチドと３’ＬＴＲヌクレオチドとの間に位置する。

【0146】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの更に好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、ｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つの反復のみからなる。

【0147】

幾つかの実施形態において、上記レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドは、
ｌ）ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域とｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）とｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む。

【0148】

第１の態様又はその実施形態のいずれかの最も好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）配列番号５の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）配列番号９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）配列番号１０の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）配列番号１１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）配列番号１３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）配列番号１５の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーと、
ｋ）配列番号３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つの反復のみからなる。

【0149】

幾つかの実施形態において、上記レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドは、
ｌ）配列番号１２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有し、ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域とｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）配列番号１４の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有し、ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）とｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む。

【0150】

第１の態様の更に好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーと、
ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｌ）ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、ｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つの反復のみからなる。

【0151】

第１の態様の更に好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）配列番号５の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）配列番号９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）配列番号１０の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）配列番号１１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）配列番号１３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）配列番号１５の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーと、
ｋ）配列番号３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｌ）配列番号１２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有し、ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）配列番号１４の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有し、ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つの反復のみからなる。

【0152】

別の実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーと、
ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。

【0153】

幾つかの実施形態において、上記レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドは、
ｌ）ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域とｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）とｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む。

【0154】

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は、好ましくは、５’から３’に以下の：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質は、配列番号５２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する、ヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。更に好ましい実施形態において、ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、好ましくは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0155】

幾つかの実施形態において、上記レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドは、
ｌ）ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域とｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）とｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む。

【0156】

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は、好ましくは、５’から３’に以下の：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６のみからなる遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、タンパク質は配列番号５２のみからなる、ヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１のみからなる突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。更に好ましい実施形態において、ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、好ましくは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる。

【0157】

幾つかの実施形態において、上記レンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドは、
ｌ）ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域とｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）とｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む。

【0158】

第１の態様の更に好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは核酸を含み、核酸は、好ましくは、５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）配列番号５の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）配列番号９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）配列番号１０の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）配列番号１１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）配列番号１３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）配列番号１５の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭタンパク質は、配列番号５２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する、ヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーであって、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１４２－３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、又はｍｉＲ－３０ｂからなる群より選択される、少なくとも１種のｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１つのコピーと、
ｋ）配列番号３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有する、３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｌ）配列番号１２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有し、ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）配列番号１４の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有し、ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を含み、
ａ）及びｋ）の長末端反復領域は、ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する。好ましい実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーは、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、より好ましくは１００％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つの反復のみからなる。

【0159】

好ましい実施形態において、本明細書において提供されるレンチウイルスに含まれる全長ヌクレオチドは、配列番号３０（ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ）の全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。別の好ましい実施形態において、提供されるレンチウイルスに含まれる全長ヌクレオチドは、配列番号３０を含むか、それのみからなるか、又は本質的にそれのみからなる。

【0160】

一実施形態において、ウイルス粒子の脂質コートは、宿主細胞の表面に以前に存在していた膜結合ポリペプチドを含むことができる。

【0161】

幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、その表面に、ヒト被験体への投与後にレンチウイルスベクターへの免疫応答を抑制する、１つ以上のポリペプチドの改変された発現を有する。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターの表面は、１つ以上のＣＤ４７分子を含む。ＣＤ４７は「自己タンパク質のマーカーであり、ヒト細胞上に遍在的に発現される。ＣＤ４７の表面発現は、ＣＤ４７及びマクロファージ発現ＳＩＲＰａの相互作用を介して、内因性細胞のマクロファージ誘導食作用を抑制する。高レベルのＣＤ４７を発現する細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトマクロファージによって標的化され、破壊される可能性が低い。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、その表面に高濃度のＣＤ４７ポリペプチド分子を含む。幾つかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７の高発現レベルを有する細胞株において生産される。或る特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは細胞株において生産され、細胞株は細胞膜上にＣＤ４７の高発現を有する。特定の実施形態において、レンチウイルスベクターはＣＤ４７ｈｉｇｈ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生産され、ＨＥＫ２９３Ｔは細胞膜上にＣＤ４７の高発現を有するものである。幾つかの実施形態において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、未改変のＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較してＣＤ４７の増加した発現を有するように改変されている。或る特定の実施形態において、ＣＤ４７はヒトＣＤ４７である。一実施形態において、レンチウイルスベクターの表面は、１つ以上のクラスＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣＩ）の発現を欠いているか、又はその発現が低下している。或る特定の実施形態において、ＭＨＣＩはヒトＭＨＣＩである。

【0162】

第２の態様において、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義されるレンチウイルスベクターを含む（例えば、形質導入された）宿主細胞（例えば、肝細胞）又は実質的に純粋な細胞集団に関する。第２の態様の一実施形態において、宿主細胞又は実質的に純粋な細胞集団は肝細胞である。

【0163】

第３の態様において、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義されるレンチウイルスベクター中に含まれるヌクレオチドを含む単離された核酸に関する。

【0164】

薬学的組成物
第４の態様において、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義されるレンチウイルス、第２の態様又はその実施形態のいずれかによる宿主細胞又は実質的に純粋な細胞集団、及び／又は第３の態様又はその実施形態のいずれかにおいて定義される核酸と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。

【0165】

幾つかの実施形態において、第２の態様若しくはその実施形態のいずれかによる実質的に純粋な細胞集団、又は第４の態様若しくはその実施形態のいずれかの薬学的組成物の投与のための組成物は、第１の態様又はその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターにより、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで接触又は形質導入される。

【0166】

本明細書に記載の薬学的組成物は、他の物質を含むこともできる。これらの物質には、抗凍結剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、増量剤、酸化防止剤、及び安定化剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は凍結乾燥されてもよい。

【0167】

本明細書において使用される「抗凍結剤」という用語には、レンチウイルスベクターの表面から優先的に排除されることにより、凍結誘発ストレスに対してレンチウイルスベクターに安定性を提供する薬剤が含まれる。抗凍結剤はまた、一次及び二次乾燥中並びに製品の長期保存中に保護を提供することができる。抗凍結剤の非限定的な例としては、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノース、及びラクトース等の糖、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びポリエチレングリコール等のポリマー、ポリソルベート（例えば、ＰＳ－２０又はＰＳ－８０）等の界面活性剤、並びにグリシン、アルギニン、ロイシン、及びセリン等のアミノ酸が挙げられる。生物学的システムにおいて低毒性を示す抗凍結剤が一般に使用される。

【0168】

１つの実施形態において、凍結乾燥保護剤が本明細書に記載の薬学的組成物に添加される。本明細書において使用される「凍結乾燥保護剤」という用語には、非晶質ガラス状マトリックスを提供し、水素結合を介してレンチウイルスベクターの表面と結合し、乾燥プロセス中に除去される水分子を置き換えることによって、凍結乾燥又は脱水プロセス（一次及び二次凍結乾燥サイクル）中にレンチウイルスベクターに安定性を提供する薬剤が含まれる。これにより、凍結乾燥サイクル中の製品劣化が最小限に抑えられ、製品の長期安定性が向上する。凍結乾燥保護剤の非限定的な例としては、スクロース又はトレハロース等の糖、グルタミン酸ナトリウム、非結晶性グリシン又はヒスチジン等のアミノ酸、ベタイン等のメチルアミン、硫酸マグネシウム等のリオトロピック塩、３価以上の糖アルコール等のポリオール（例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プルロニック（登録商標）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的組成物に添加される凍結乾燥保護剤の量は、一般に、薬学的組成物が凍結乾燥されるときに、株の許容できない量の分解を引き起こさない量である。

【0169】

幾つかの実施形態において、増量剤が薬学的組成物中に含まれる。本明細書において使用される「増量剤」という用語には、薬学的製品と直接相互作用することなく、凍結乾燥製品の構造を提供する薬剤が含まれる。薬学的にエレガントなケーキを提供することに加えて、増量剤はまた、崩壊温度を変更し、凍結融解保護を提供し、長期保存にわたる株安定性を高めることに関して有用な性質を付与することができる。増量剤の非限定的な例としては、マンニトール、グリシン、ラクトース、及びスクロースが挙げられる。増量剤は結晶性（例えばグリシン、マンニトール、又は塩化ナトリウム）又は非晶質（例えばデキストラン、ヒドロキシエチルデンプン）であってもよく、一般に、０．５％～１０％の量で配合物において使用される。

【0170】

Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されているもののような、他の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤もまた、薬学的組成物の所望の特性に悪影響を及ぼさない限り、本明細書に記載の薬学的組成物中に含まれてもよい。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」とは、薬学的投与と適合可能な任意の全ての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤を意味する。薬学的活性物質へのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、追加の緩衝剤、保存剤、共溶媒、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）、ポリエステル等の生分解性ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、及びトレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の有機糖又は糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質、並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーを含む。

【0171】

薬学的組成物は、経口、舌下、頬側、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、結膜、直腸、経皮、髄腔内、局所及び／又は吸入媒介投与用に調製することができる。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、静脈内、筋肉内、結膜、経皮、腹腔内及び／又は皮下投与に好適な溶液であってもよい。別の実施形態において、薬学的組成物は、舌下、頬側及び／又は吸入媒介投与経路に好適な溶液であってもよい。代替的な実施形態において、薬学的組成物は、髄腔内投与に好適なゲル又は溶液であってもよい。代替的な実施形態において、薬学的組成物は、吸入媒介投与に好適なエアロゾルであってもよい。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、髄腔内投与用に調製することができる。

【0172】

薬学的組成物は、当該技術分野において知られている一般的な賦形剤及び担体を更に含んでもよい。固体薬学的組成物の場合、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む従来の非毒性固体担体を使用してもよい。注射用溶液の場合、薬学的組成物は、抗凍結剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、増量剤、酸化防止剤、安定化剤及び薬学的に許容可能な担体を更に含んでもよい。エアロゾル投与の場合、薬学的組成物は、一般に、界面活性剤及び噴射剤と共に微粉形態で供給される。界面活性剤は当然のことながら非毒性でなければならず、一般に噴射剤に可溶性である。そのような薬剤の代表的なものは、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（olesteric acid）及びオレイン酸等の６個～２２個の炭素原子を含む脂肪酸と、脂肪族多価アルコール又はその環状無水物とのエステル又は部分エステルである。混合又は天然グリセリド等の混合エステルを用いてもよい。担体を、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンと同様に、所望する通りに含むこともできる。坐薬の場合、従来の結合剤及び担体は、例えば、ポリアルカレン（polyalkalene）グリコール又はトリグリセリドを含んでもよい。

【0173】

したがって、注射用の好適な薬学的組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意に安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含むことができる。しかしながら、本明細書の教示と適合する他の実施形態において、レンチウイルスベクターを有害な細胞集団の部位、すなわち肝細胞に直接的に送達し、それによって、罹患組織の治療剤への曝露を増加させることができる。

【0174】

本明細書において提供されるレンチウイルスベクターは、任意に、治療（例えば、予防的又は治療的）を必要とする障害又は状態の治療において有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。補助療法と併用又は組み合わせた本明細書において提供されるレンチウイルスベクターの投与は、療法及び開示されるポリペプチドの逐次的、同時、同一の広がりを持つ、同時発生的、併存する、又は同時発生的投与又は適用を意味する。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、トリヨードサイロニンホルモン、ヒトインターロイキン６、及び／又はそれらの誘導体等のこれらに限定されない、肝細胞増殖を誘導することができる他の薬剤と組み合わせて投与される。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、デキサメタゾン、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＨ、ラパマイシン、及び／又はそれらの誘導体等のこれらに限定されない、レンチウイルスベクターに対する免疫応答を抑制することができる他の薬剤と組み合わせて投与される。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、スタチン、鉄キレート剤、及び／又はそれらの誘導体等のこれらに限定されない、ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスの標的細胞における特異的受容体の数を増加させることができる他の薬剤と組み合わせて投与される。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、酸化防止剤、例えばＮ－アセチルシステイン、及び／又はそれらの誘導体等のこれらに限定されない、形質導入肝細胞におけるアポトーシスをブロックすることができる他の薬剤と組み合わせて投与される。

【0175】

特定の実施形態において、第１の態様又はその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターは、形質導入促進剤として作用するシクロスポリンＨ（ＣｓＨ）と組み合わせて投与される。好ましい実施形態において、ＣｓＨは、２０ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、又は５ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。一実施形態において、ＣｓＨは、レンチウイルスの投与の前、同時に、又は後に投与される。上記範囲における中間の用量もまた、本発明の範囲内であることが意図されている。幾つかの実施形態において、ＣｓＨは１回投与される。他の実施形態において、ＣｓＨは、２回以上、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、又は少なくとも１０回投与される。ＣｓＨの反復投与は、同日に行ってもよいし、時間を区切って行ってもよい。一実施形態において、ＣｓＨの単回投与の間隔は、毎日、毎週、毎月又は毎年であり得る。

【0176】

医療用途並びに投与のスケジュール、経路及び用量
第５の態様において、本発明は、医薬として使用される、第１の態様若しくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様若しくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、第３の態様若しくはその実施形態のいずれかによる単離された核酸、又は第４の態様若しくはその実施形態のいずれかの薬学的組成物を提供する。第６の態様において、本発明は、原発性高シュウ酸尿症、好ましくは原発性高シュウ酸尿症１型の治療に使用される、第１の態様若しくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様若しくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、第３の態様若しくはその実施形態のいずれかによる単離された核酸、又は第４の態様若しくはその実施形態のいずれかの薬学的組成物であって、上記レンチウイルス、上記宿主細胞若しくは細胞集団、又は上記組成物を被験体に投与することを含む使用を提供する。

【0177】

好ましくは、第５の態様及び第６の態様の使用は、免疫応答抑制剤、好ましくはデキサメタゾン、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＨ及び／又はラパマイシン、又はそれらの任意の組み合わせと組み合わされる。

【0178】

本発明はまた、ＰＨ１障害を治療、予防、又は回復を必要とする被験体におけるＰＨ１障害を治療、予防、又は回復する方法を提供し、この方法は、治療的有効量の第１の態様若しくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様若しくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、第３の態様若しくはその実施形態のいずれかの単離された核酸、又は第４の態様若しくはその実施形態のいずれかの薬学的組成物を被験体に投与することを含む。

【0179】

別の実施形態において、本明細書において提供される、レンチウイルスベクター、宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は組成物の投与は、被験体において免疫応答を誘導しないか、又は上記被験体において非常に低い免疫応答を誘導する。

【0180】

幾つかの実施形態において、本発明のレンチウイルスベクター、宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は組成物は、単回用量又は複数回用量として投与される。幾つかの実施形態において、本発明のレンチウイルスベクター、宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は組成物の用量は、一度に投与されるか、又は複数回の部分用量（sub-dose）、例えば、２つの部分用量、３つの部分用量、４つの部分用量、５つの部分用量、６つの部分用量、若しくは６を超える部分用量に分割される。幾つかの実施形態において、２つ以上のレンチウイルスベクターが投与される。最も好ましくは、本発明のレンチウイルスベクター、宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は組成物は、単回用量として投与される。

【0181】

幾つかの実施形態において、本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物の用量は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、又は少なくとも１０回反復して投与される。

【0182】

本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物は、局所的又は全身に投与することができる。１つの実施形態において、レンチウイルスベクターの投与経路は非経口である。本明細書において使用される非経口という用語には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣内投与が含まれる。一実施形態において、上記レンチウイルスベクターは、静脈内、皮下、筋肉内に、又は任意の粘膜表面を介して、例えば、経口、舌下、頬側、舌下、経鼻、直腸、経膣により、若しくは肺経路を介して投与することができる。非経口投与の静脈内形態が好ましい。一実施形態において、投与形態は、注射用の溶液、特に静脈内又は動脈内注射又は点滴用の溶液であろう。

【0183】

ＰＨ１の治療のための本明細書において提供される組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、被験体の生理的状態、被験体がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の薬剤、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかを含む、多くの異なる因子に応じて異なる。通常、被験体はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。安全性及び有効性を最適化するために、当業者に知られているルーチン手法を使用して、治療投与量を設定することができる。１つの実施形態において、被験体としては、ＰＨ１を有する個体が挙げられるが、これに限定されない。幾つかの実施形態において、被験体は小児被験体であるが、他の態様において、被験体は成人被験体である。

【0184】

本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物は、単回用量又は複数回用量として投与することができ、複数回用量は連続的に、又は特定の時間間隔にて投与することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて、投与の最適な用量範囲及び／又はスケジュールを決定することができる。さらに、有効用量は、動物モデルから得られた用量反応曲線から推定することができる。

【0185】

好ましい実施形態において、本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物は、少なくとも１×１０^９ベクターゲノム／体重１ｋｇ、好ましくは１×１０^１０ベクターゲノム／体重１ｋｇ、１×１０^１１ベクターゲノム／体重１ｋｇ又は１×１０^１２ベクターゲノム／体重１ｋｇの用量にて投与される。より好ましくは、少なくとも又は約４．６×１０^１２ベクターゲノム／体重１ｋｇが投与される。

【0186】

一実施形態において、レンチウイルスの用量は、少なくとも５×１０^２形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）、５×１０^３ＴＵ／ｋｇ、５×１０^４ＴＵ／ｋｇ、５×１０^５ＴＵ／ｋｇ、５×１０^６ＴＵ／ｋｇ、５×１０^７ＴＵ／ｋｇ、５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１１ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１２ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１３ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１４ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１５ＴＵ／ｋｇである。一実施形態において、レンチウイルスの用量は、５×１０^２形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）～５×１０^３ＴＵ／ｋｇ、５×１０^３ＴＵ／ｋｇ～５×１０^４ＴＵ／ｋｇ、５×１０^４ＴＵ／ｋｇ～５×１０^５ＴＵ／ｋｇ、５×１０^５ＴＵ／ｋｇ～５×１０^６ＴＵ／ｋｇ、５×１０^６ＴＵ／ｋｇ～５×１０^７ＴＵ／ｋｇ、５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１１ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１１ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１２ＴＵ／ｋｇである。一実施形態において、レンチウイルスの用量は、約１×１０^２形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）、１×１０^３ＴＵ／ｋｇ、１×１０^４ＴＵ／ｋｇ、１×１０^５ＴＵ／ｋｇ、１×１０^６ＴＵ／ｋｇ、１×１０^７ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^１１ＴＵ／ｋｇ、１×１０^１２ＴＵ／ｋｇ、１×１０^１３ＴＵ／ｋｇ、１×１０^１４ＴＵ／ｋｇ、１×１０^１５ＴＵ／ｋｇ、又は約５×１０^２形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）、５×１０^３ＴＵ／ｋｇ、５×１０^４ＴＵ／ｋｇ、５×１０^５ＴＵ／ｋｇ、５×１０^６ＴＵ／ｋｇ、５×１０^７ＴＵ／ｋｇ、５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１１ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１２ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１３ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１４ＴＵ／ｋｇ、５×１０^１５ＴＵ／ｋｇ、又は約７．５×１０^２形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）、７．５×１０^３ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^４ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^５ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^６ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^７ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^１１ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^１２ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^１３ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^１４ＴＵ／ｋｇ、７．５×１０^１５ＴＵ／ｋｇである。

【0187】

上記範囲における中間の用量もまた、本発明の範囲内であることが意図されている。

【0188】

本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は本明細書において提供される薬学的組成物は、複数回の機会に投与することができる。単回投与の間隔は、毎日、毎週、毎月又は毎年であり得る。疾患の進行又は上記レンチウイルスの治癒効果に応じて、間隔が不規則になることもあり得る。

【0189】

本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞若しくは実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物の投与の投与量及び頻度は、治療が予防的であるか又は治療的であるかに応じて異なり得る。予防的用途において、本明細書において提供されるレンチウイルスベクターを含む組成物は、被験体の抵抗性を高めるか、又は疾患の影響を最小限に抑えるために、疾患状態にまだない被験体に投与される。そのような量は、「予防的有効用量」として定義される。長期間にわたって比較的低い頻度の間隔にて、比較的低い投与量が投与される。一部の被験体は、生涯にわたって治療を受け続ける可能性がある。

【0190】

項目
本発明は、以下の項目を更に提供する。

【0191】

１．レンチウイルスベクターであって、前記レンチウイルスベクターが核酸を含み、前記核酸が５’から３’に以下のヌクレオチド：
ａ）５’長末端反復（ＬＴＲ）と、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナルと、
ｄ）野生型ＨＩＶウイルスのステムループ４（ＳＬ４）領域と、
ｅ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｆ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、
ｇ）配列番号１６の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターと、
ｈ）配列番号２９の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、最適化されたアラニン－グリオキシル酸及びセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉ）配列番号２１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、突然変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｊ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーと、
ｋ）３’長末端反復（ＬＴＲ）と、
を含み、
ａ）及びｋ）の前記長末端反復領域は、前記ＬＴＲのＵ３領域における全欠失又は部分的欠失により、実質的に転写的に不活性化されており、ｇ）、ｉ）及びｊ）は、ｈ）に作動可能に連結され、ｈ）の発現を調節する、レンチウイルスベクター。

【0192】

２．配列番号１６、配列番号２９、及び配列番号２１に対するｇ）、ｈ）、ｉ）の配列同一性が、それぞれ１００％である、項目１に記載のレンチウイルスベクター。

【0193】

３．ｊ）の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列の少なくともコピーが、配列番号２２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡ－１４２－３の標的配列の４つのコピーのみからなる、項目１及び２のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【0194】

４．前記レンチウイルスベクター中に含まれる前記ヌクレオチドが、
ｌ）ｄ）とｅ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ１領域と、
ｍ）ｅ）とｆ）との間に位置するＤｅｎｖＲＦ２領域と、
を更に含む、項目１～３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【0195】

５．前記レンチウイルスの全長ヌクレオチドが、配列番号３０（ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ）と少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、項目１～４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。

【0196】

６．配列番号３０との配列同一性が１００％である、項目５に記載のレンチウイルスベクター。

【0197】

７．項目１～６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターで形質導入した実質的に純粋な細胞集団。

【0198】

８．項目１～６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、又は項目７に記載の実質的に純粋な細胞集団と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む薬学的組成物。

【0199】

９．医薬として使用される、項目１～６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、項目７に記載の実質的に純粋な細胞集団、又は請求項８に記載の薬学的組成物。

【0200】

１０．原発性高シュウ酸尿症の治療を必要とする被験体の治療に使用される、項目１～６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、項目７に記載の実質的に純粋な細胞集団、又は請求項８に記載の薬学的組成物であって、該方法が、前記レンチウイルスベクター、前記細胞集団、又は前記薬学的組成物を前記被験体に投与することを含む、レンチウイルスベクター、実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物。

【0201】

１１．前記原発性高シュウ酸尿症が１型である、項目１０に記載の使用のためのレンチウイルスベクター、実質的に純粋な細胞集団、又は薬学的組成物。

【実施例】

【0202】

実施例１：材料、方法及び配列
１．１ レンチウイルスベクター構築
緑色蛍光タンパク質の強化バージョン（ｅＧＦＰ）を発現するレポーターレンチウイルスベクター（ＬＶ）コンストラクトは、Naldini及びCantoreのグループによって以前に記載されたＬＶコンストラクト（ＬＶ．ＥＴ．ＦＩＸ．１４２－３ｐＴ）（Brown et al., 2007）から開発された。ｅＧＦＰ発現ＬＶは、古典的なクローニング技術によって開発された。ＬＶ．ＥＴ．ＦＩＸ．１４２－３ｐＴをＮｈｅＩ及びＳａｌＩ制限酵素（New England Biolabs（商標））によって消化して、ＦＩＸ配列を除去した。ＮｈｅＩ及びＳａｌＩの標的配列はそれぞれＦＩＸ遺伝子の５’及び３’末端にある。両酵素によるプラスミドの消化後、電気泳動及びバンド精製によりＬＶ構造を単離した。

【0203】

さらに、本発明者らは、＃２４１．ｐＣＣＬ．ｓｉｎ．ＰＰＴ．ＴＴＲ．ＧＦＰ．ＷｐｒｅプラスミドからｅＧＦＰ配列をＰＣＲによって増幅した。プライマーは、ＮｈｅＩ（配列番号１ Ｆｗ：５’－ＡＴＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ－３’）及びＳａｌＩ（配列番号２ Ｒｖ：５’－ＣＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ－３’）制限酵素標的配列をそれぞれ５’及び３’末端にて付加するように設計した。最後に、両配列を連結し、ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴを得た。

【0204】

ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴの発現カセットは、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーター（強化トランスチレチン、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＹ６６１２６５から改変）と、抗原提示細胞におけるオフターゲットの導入遺伝子発現を回避すること、したがって、形質導入細胞に対する免疫応答の発生を回避することを目的として、造血系統特異的マイクロＲＮＡ１４２についての標的配列（成熟ヒトマイクロＲＮＡ１４２ 配列番号３－ｍｉＲＮＡ－１４２－３ｐ：ＵＧＵＡＧＵＧＵＵＵＣＣＵＡＣＵＵＵＡＵＧＧＡ）とを含む。

【0205】

ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ配列：
５’ＬＴＲ（配列番号４）：５’ＬＴＲは、レンチウイルスベクター生産中のプロウイルス転写に関与する。このレンチウイルスベクターコンストラクトにおいて、５’ＬＴＲは、ＣＭＶプロモーターのキメラ型及び野生型ＨＩＶ－１ ５’ＬＴＲの一部であるＲＵ５から構成される。野生型５’ＬＴＲのＵ３配列の欠如は、このレンチウイルスベクターコンストラクトがＴａｔ非依存性であり、したがって、それが第３世代で生産されることを含む。
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcag

【0206】

キメラＣＭＶプロモーター（配列番号５）：この配列はレンチウイルスベクター生産中にプロウイルスの転写を導く。キメラＣＭＶプロモーターは２つの異なる配列から構成されており、１つはエンハンサー活性を有し、もう１つはプロモーター活性を有する。
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaacc

【0207】

ＣＭＶエンハンサー（配列番号６）：
gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg

【0208】

ＣＭＶプロモーター（配列番号７）：
gtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagct

【0209】

ＲＵ５（配列番号８）：ＲＵ３を含まない切断された５’ＬＴＲ。この配列は、形質導入細胞へのプロウイルスゲノムの逆転写（retrotranscription）及び組込みに必要である。
gggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcag

【0210】

ＰＢＳ ＳＬ２３ ＳＬ１２３（プライマー結合部位）（配列番号９）：ｔＲＮＡは、標的細胞形質導入後、及び細胞ゲノムへの組込み前に、プロウイルスゲノムの逆転写中にＰＢＳ ＳＬ２３エレメントに結合される。
tggcgcccgaacagggacTtgaaagcgaaagggaaaccagagGAGctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagag

【0211】

Ψ（パッケージングシグナル）（配列番号１０）：このエレメントは、レンチウイルスベクター粒子の二量体化及びパッケージングに関与する。
ctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtc

【0212】

ＳＬ４ｍｇａｇ（配列番号１１）：このエレメントは、プロウイルスのパッケージングに関与する野生型ｍｇａｇ ＨＩＶ－１遺伝子の一部である。
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgat

【0213】

ＤｅｎｖＲＦ１（配列番号１２）：
tcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaata

【0214】

ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号１３）：Ｒｅｖは、レンチウイルスベクターの転写産物中でこの配列に結合して、レンチウイルスベクター生産中のプロウイルスの核外輸送を助ける。
aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcGtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct

【0215】

ＤｅｎｖＲＦ２（配列番号１４）：
gggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatc

【0216】

ｃＰＰＴ（セントラルポリプリントラクト）（配列番号１５）：このエレメントは、標的細胞の形質導入後のレンチウイルスベクターの逆転写中に、陽性ＤＮＡ鎖転写のプライマーとして作用する。また、プロウイルスＤＮＡ核内移行を増加させ、したがって、レンチウイルスベクター形質導入有効性を増加させる。さらに、レンチウイルスベクターのタイトルを増加させる。
ttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaatttt

【0217】

ＥＴプロモーター（配列番号１６）：ＥＴプロモーターは、遺伝子操作された肝細胞特異的プロモーターである。この配列は、標的細胞へのレンチウイルスベクターゲノム組込み後に導入遺伝子発現を導く。ＥＴプロモーターは、合成エンハンサー、ｍＴＴＲエンハンサー、及びｍＴＴＲプロモーターから構成されるキメラプロモーターである（強化トランスチレチン、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＹ６６１２６５）。
cgcgagttaataattaccagcgcgggccaaataaataatccgcgaggggcaggtgacgtttgcccagcgcgcgctggtaattattaacctcgcgaatattgattcgaggccgcgattgccgcaatcgcgaggggcaggtgacctttgcccagcgcgcgttcgccccgccccggacggtatcgataagcttaggagcttgggctgcaggtcgagggcactgggaggatgttgagtaagatggaaaactactgatgacccttgcagagacagagtattaggacatgtttgaacaggggccgggcgatcagcaggtagctctagaggatccccgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctg

【0218】

ＥＴプロモーターの成分：
合成エンハンサー（配列番号１７）：
cgcgagttaataattaccagcgcgggccaaataaataatccgcgaggggcaggtgacgtttgcccagcgcgcgctggtaattattaacctcgcgaatattgattcgaggccgcgattgccgcaatcgcgaggggcaggtgacctttgcccagcgcgcg

【0219】

ｍＴＴＲエンハンサー（配列番号１８）：
cactgggaggatgttgagtaagatggaaaactactgatgacccttgcagagacagagtattaggacatgtttgaacaggggccgggcgatcagcaggtag

【0220】

ｍＴＴＲプロモーター（配列番号１９）：
gtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtc

【0221】

ｍＴＴＲ ５’ ＵＴ（配列番号２０）：acacagatccacaagctcctg

【0222】

ｅＧＦＰ配列（配列番号５１）：この配列は、緑色蛍光タンパク質遺伝子の強化バージョンを体系化する。
tggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaa

【0223】

突然変異ＷＰＲＥ（ＷＨＶ（ウッドチャック肝炎ウイルス）転写後調節エレメント）（配列番号２１）：突然変異ＷＰＲＥは、ポリアデニル化、核からのＲＮＡ輸送及びタンパク質合成の改善により、形質導入細胞における導入遺伝子発現を増加させる。突然変異ＷＰＲＥは、セキュリティーを高めるために遺伝子Ｘフレームに突然変異を含む。
caacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgc

【0224】

１４２－３ｐＴ（配列番号２２）：造血細胞において特異的に発現する１４２－３マイクロＲＮＡの標的配列。このエレメントは、転写制御エレメントである形質導入細胞における導入遺伝子の発現特異性を高める。
tccataaagtaggaaacactaca

【0225】

３’ＬＴＲ：ＤＲ３ＲＵ５（配列番号２３）：３’ＬＴＲは、レンチウイルスベクター生産中のｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。この場合、３’ＬＴＲは、自己不活性化レンチウイルスベクターである野生型ＨＩＶ－１由来の切断されたＵ３エレメントと、エレメントＲ及びＵ５とから構成される。組み込まれたウイルスゲノムは、ウイルスプロモーター領域（Ｕ３）の欠失を含み、形質導入細胞における潜在的にパッキング可能なウイルスゲノムの転写不活性化をもたらす。
tggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca

【0226】

ΔＵ３（配列番号２４）：
tggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtact

【0227】

ＲＵ５（配列番号２５）：
gggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcag

【0228】

ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ配列（配列番号２６）：
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgatcgaggtcaattcacgcgagttaataattaccagcgcgggccaaataaataatccgcgaggggcaggtgacgtttgcccagcgcgcgctggtaattattaacctcgcgaatattgattcgaggccgcgattgccgcaatcgcgaggggcaggtgacctttgcccagcgcgcgttcgccccgccccggacggtatcgataagcttaggagcttgggctgcaggtcgagggcactgggaggatgttgagtaagatggaaaactactgatgacccttgcagagacagagtattaggacatgtttgaacaggggccgggcgatcagcaggtagctctagaggatccccgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggcctcgacgggcccgcggaatttcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattcgagctccaccgcggtggcggccgctctagagtcgactccataaagtaggaaacactacacgattccataaagtaggaaacactacaaccggttccataaagtaggaaacactacatcactccataaagtaggaaacactacactcgagggggggcccggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca

【0229】

ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴマップ：ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴコンストラクト。前述の種々のエレメントを図１１に示す。

【0230】

同時に、本発明者らは、ＡＧＸＴ遺伝子の改善バージョン（ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ）を発現する治療用ＬＶを開発した。本発明者らは、上記で説明したように得られたＬＶ．ＥＴ．ＦＩＸ．１４２－３ｐＴの単離された構造を使用した。本発明者らは、Eduardo Salidoのグループから快くご提供いただいたＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ配列（非特許文献１４）をＰＣＲによって増幅した。プライマーは、クローニングに使用するために、ＮｈｅＩ（配列番号２７ Ｆｗ：５’ ＣＴＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＴ ３’）及びＳａｌＩ（配列番号２８ Ｒｖ：５’ ＣＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＧＣ ３’）標的配列をそれぞれ５’及び３’末端に付加するように設計した。最後に、ＬＶ．ＥＴ．ＦＩＸ．１４２－３ｐＴ構造及びＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ配列を連結し、ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴベクターを得た。

【0231】

ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ＰＴ配列：
ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ配列は、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭコード配列で置換されたｅＧＦＰを除き、ＬＶ．ＥＧ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴと同じエレメントを含む。

【0232】

ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ（配列番号２９）：Eduardo Salidoのグループによって開発されたこの配列（非特許文献１４）は、タンパク質の安定性及び半減期を増加させるために、５つのアミノ酸変化を有するＡＧＸＴ遺伝子の改善バージョンを体系化する。
ATGGCCTCTCACAAGCTGCTGGTGACCCCCCCCAAGGCCCTGCTCAAGCCCCTCTCCATCCCCAACCGTCTCCTGCTGGGGCCTGGTCCTTCCAACCTGCCTCCTCGCATCATGGCAGCCGGGGGGCTGCAGATGATCGGGCACATGAGCAAGGAAATGTACCAGATCATGGACGAGATCAAGGAAGGCATCCAGTACGTGTTCCAGACCAGGAACCCACTCACACTGGTCATCTCCGGCTCGGGACACTGTGCCCTGGAGGCCGCCCTGGTCAATGTGCTGGAGCCTGGGGACTCCTTCCTGGTTGGGGCCAATGGCATTTGGGGGCAGCGAGCCGCGGACATCGGGGAGCGCATAGGAGCCCGAGTGCACCCGATGACCAAGGACCCCGGAGGCCACTACACACTGCAGGAGGTGGAGGAGGGCCTGGCCCAGCACAAGCCAGTGCTGCTGTTCTTAACCCACGGGGAGTCGTCCACCGGCGTGCTGCAGCCCCTTGATGGCTTCGGGGAACTCTGCCACAGGTACAAGTGCCTGCTCCTGGTGGATTCGGTGGCATCCCTGGGCGGGACCCCCCTTTACATGGACCGGCAAGGCATCGACATCCTGTACTCGGGCTCCCAGAAGGCCCTGAACGCCCCTCCAGGGACCTCGCTCATCTCCTTCAGTGACAAGGCCAAAAAGAAGATGTACTCCCGCAAGACGAAGCCCTTCTCCTTCTACCTGGACATCAAGTGGCTGGCCAACTTCTGGGGCTGTGACGACCAGCCCAGGATGTACCATCACACAATCCCCGTCATCAGCCTGTACAGCCTGAGAGAGAGCCTGGCCCTCATTGCGGAACAGGGCCTGGAGAACAGCTGGCGCCAGCACCGCGAGGCCGCGGCGTATCTGCATGGGCGCCTGCAGGCACTGGGGCTGCAGCTCTTCGTGAAGGACCCGGCGCTCCGGCTTCCCACAGTCACCACTGTGGCTGTACCCGCTGGCTATGACTGGAGAGACATCGTCAGCTACGTCATGGACCACTTCGACATTGAGATCATGGGTGGCCTTGGGCCCTCCACGGGGAAGGTGCTGCGGATCGGCCTGCTGGGCTGCAATGCCACCCGCGAGAATGTGGACCGCGTGACGGAGGCCCTGAGGGCGGCCCTGCAGCACTGCCCCAAGAAGAAGCTGTGA

【0233】

ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ（配列番号３０）：
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacTtgaaagcgaaagggaaaccagagGAGctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcGtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagcacgcgagttaataattaccagcgcgggccaaataaataatccgcgaggggcaggtgacgtttgcccagcgcgcgctggtaattattaacctcgcgaatattgattcgaggccgcgattgccgcaatcgcgaggggcaggtgacctttgcccagcgcgcgttcgccccgccccggacggtatcgataagcttaggagcttgggctgcaggtcgagggcactgggaggatgttgagtaagatggaaaactactgatgacccttgcagagacagagtattaggacatgtttgaacaggggccgggcgatcagcaggtagctctagaggatccccgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctggCTAGCTAGCATGGCCTCTCACAAGCTGCTGGTGACCCCCCCCAAGGCCCTGCTCAAGCCCCTCTCCATCCCCAACCGTCTCCTGCTGGGGCCTGGTCCTTCCAACCTGCCTCCTCGCATCATGGCAGCCGGGGGGCTGCAGATGATCGGGCACATGAGCAAGGAAATGTACCAGATCATGGACGAGATCAAGGAAGGCATCCAGTACGTGTTCCAGACCAGGAACCCACTCACACTGGTCATCTCCGGCTCGGGACACTGTGCCCTGGAGGCCGCCCTGGTCAATGTGCTGGAGCCTGGGGACTCCTTCCTGGTTGGGGCCAATGGCATTTGGGGGCAGCGAGCCGCGGACATCGGGGAGCGCATAGGAGCCCGAGTGCACCCGATGACCAAGGACCCCGGAGGCCACTACACACTGCAGGAGGTGGAGGAGGGCCTGGCCCAGCACAAGCCAGTGCTGCTGTTCTTAACCCACGGGGAGTCGTCCACCGGCGTGCTGCAGCCCCTTGATGGCTTCGGGGAACTCTGCCACAGGTACAAGTGCCTGCTCCTGGTGGATTCGGTGGCATCCCTGGGCGGGACCCCCCTTTACATGGACCGGCAAGGCATCGACATCCTGTACTCGGGCTCCCAGAAGGCCCTGAACGCCCCTCCAGGGACCTCGCTCATCTCCTTCAGTGACAAGGCCAAAAAGAAGATGTACTCCCGCAAGACGAAGCCCTTCTCCTTCTACCTGGACATCAAGTGGCTGGCCAACTTCTGGGGCTGTGACGACCAGCCCAGGATGTACCATCACACAATCCCCGTCATCAGCCTGTACAGCCTGAGAGAGAGCCTGGCCCTCATTGCGGAACAGGGCCTGGAGAACAGCTGGCGCCAGCACCGCGAGGCCGCGGCGTATCTGCATGGGCGCCTGCAGGCACTGGGGCTGCAGCTCTTCGTGAAGGACCCGGCGCTCCGGCTTCCCACAGTCACCACTGTGGCTGTACCCGCTGGCTATGACTGGAGAGACATCGTCAGCTACGTCATGGACCACTTCGACATTGAGATCATGGGTGGCCTTGGGCCCTCCACGGGGAAGGTGCTGCGGATCGGCCTGCTGGGCTGCAATGCCACCCGCGAGAATGTGGACCGCGTGACGGAGGCCCTGAGGGCGGCCCTGCAGCACTGCCCCAAGAAGAAGCTGTGAGtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctagataatccataaagtaggaaacactacacgattccataaagtaggaaacactacaaccggttccataaagtaggaaacactacatcactccataaagtaggaaacactacacccggtcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca

【0234】

ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴマップ。ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴコンストラクト。前述の種々のエレメントを図１２に示す。

【0235】

ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ。アミノ酸配列。配列番号５２
MASHKLLVTPPKALLKPLSIPNRLLLGPGPSNLPPRIMAAGGLQMIGHMSKEMYQIMDEIKEGIQYVFQTRNPLTLVISGSGHCALEAALVNVLEPGDSFLVGANGIWGQRAADIGERIGARVHPMTKDPGGHYTLQEVEEGLAQHKPVLLFLTHGESSTGVLQPLDGFGELCHRYKCLLLVDSVASLGGTPLYMDRQGIDILYSGSQKALNAPPGTSLISFSDKAKKKMYSRKTKPFSFYLDIKWLANFWGCDDQPRMYHHTIPVISLYSLRESLALIAEQGLENSWRQHREAAAYLHGRLQALGLQLFVKDPALRLPTVTTVAVPAGYDWRDIVSYVMDHFDIEIMGGLGPSTGKVLRIGLLGCNATRENVDRVTEALRAALQHCPKKKL*

【0236】

１．２ ＬＶ生産
実験室グレードのＶＳＶ．Ｇ偽型第３世代ＳＩＮ ＬＶを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのリン酸カルシウム一過性トランスフェクションにより作製した。１０００万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１５０ｃｍ^２の細胞培養皿当たりに播種し、２４時間後に、ＬＶゲノム転写プラスミド（ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ又はＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ）並びにパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ．Ｒｅｖ、及びｐＭＤ２．ＶＳＶ．Ｇの混合物を含む溶液で細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後に培地を交換し、２日後に上清を採取した。通常、２回目の採取は、１回目の採取の２４時間後に実施した。採取した上清を濾過（０．２２μｍ ＰＥＳ）により清澄化し、２００００ｇにて１６℃で１２０分間、遠心分離により濃縮した。ＬＶペレットを適切な量の塩化ナトリウム０．９％に再懸濁させ、－８０℃で保存した。

【0237】

１．３ ＬＶ用量設定
ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ用量設定は、この戦略における標的組織の特異性のために、肝細胞株であるＨｅｐＧ２において実施した。ＬＶ用量設定のために、２×１０^５細胞を２４ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、培養培地中のＬＶの段階希釈液で細胞を形質導入し、０日目の細胞数を決定した。形質導入の５日後に細胞を採取し、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）組織キット（Macherey Nagel（商標））を使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。

【0238】

形質導入細胞に組み込まれたレンチウイルスベクターゲノムの数（ＶＣＮ）をｑＰＣＲによって決定した。レンチウイルスベクターゲノムのコピーを分析するために、本発明者らは、レンチウイルスベクターのΨ配列に対して設計されたプライマー（配列番号３１ Ｆｗ：５’ ＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧ ３’、配列番号３２ Ｒｖ：５’ ＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧ ３’）及びプローブ（配列番号３３ ５’－ＣＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧ－３’）（Ｔａｑｍａｎ（商標）、Thermo Fisher Scientific）を使用した。内因性ＤＮＡの量を決定するために、本発明者らは、ヒトアルブミン遺伝子に対するプライマー（配列番号３４ Ｆｗ：５’ ＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＧ ３’、配列番号３５ Ｒｖ：５’ ＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣ ３’）及びプローブ（配列番号３６ ５’ ＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣ ３’）（Ｔａｑｍａｎ（商標）、Thermo Fisher Scientific）を使用した。また、本発明者らは、標準曲線を使用して、試料当たりのΨＬＶ特異的配列のコピー数及び二倍体ゲノム数を決定し、これにより、細胞当たりのＬＶコピー数（ＶＣＮ＝Ψコピー数／二倍体ゲノム数）を計算することが可能となる。最後に、このパラメータに基づいて、本発明者らは、１ミリリットル当たりの形質導入単位数として定義されるＬＶタイトルを、以下の式：
タイトル（ＴＵ／ｍＬ）＝０日目の細胞数×二倍体ゲノム当たりのＶＣＮ／ＬＶ体積（ｍＬ）
を用いて計算した。

【0239】

ｑＰＣＲデータを推定するための標準曲線は、Ψ及びヒトアルブミン配列を含むＤＮＡ断片の段階希釈液を使用して作成した。全ての反応は、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems（商標））で２回繰り返して実施した。

【0240】

ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ用量設定のために、本発明者らは、上記と同様にＨｅｐＧ２も形質導入した。しかしながら、形質導入後３日目に、ＧＦＰ発現陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。このパラメータは、以下の式：
タイトル（ＴＵ／ｍＬ）＝（０日目の細胞数×蛍光％／１００）×（希釈係数／ＬＶ体積（ｍｌ））
を用いてＬＶタイトルを計算するために使用した。

【0241】

１．４ 実験動物
Ａｇｘｔ１^－／－マウス（Ｂ６．１２９ＳｖＡｇｘｔ^{ｔｍ１Ｕｌｌ}）は、胚性幹細胞における標的突然変異誘発によって開発された（非特許文献７）。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Jackson Laboratory（商標）から購入した。

【0242】

１．５ 動物の処置
ＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ又はＬＶ．ＥＴ．ＧＦＰ．１４２－３ｐＴを、成体雄マウス（１２週齢～１４週齢）に尾静脈注射により投与した。Ａｇｘｔ１^－／－マウスで実施した実験によれば、マウスに単回用量のＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴ（２．５×１０^８ＴＵ／マウス、５×１０^８ＴＵ／マウス、１×１０^９ＴＵ／マウス）又はＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（１．４×１０^８ＴＵ／マウス、５×１０^８ＴＵ／マウス）を投与した。ＬＶを２００μｌ／マウスの総量で注射した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回用量のＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（１×１０^８ＴＵ／マウス、２．５×１０^８ＴＵ／マウス）を投与した。ＬＶを２００μｌ／マウスの総量で注射した。

【0243】

ＬＶ注射の３週間後、Ａｇｘｔ１^－／－マウスにエチレングリコール負荷試験を行った。このマウスモデルにおいて原発性高シュウ酸尿症１型の臨床徴候を発現するには、シュウ酸塩の過負荷が必要であることが報告されている。このため、０．５％のエチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（商標）、Sigma-Aldrich、ＲＥＦ １０２４６６）（グリオキシル酸代謝の前駆体）を飲料水において７日間投与した。エチレングリコール負荷試験中、マウスを代謝ケージに隔離し、２４時間尿を採取した。さらに、治療全体にわたって動物の体重をモニターした。

【0244】

Ａｇｘｔ１^－／－マウスの場合はエチレングリコール負荷試験の開始の７日後、又は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの場合はＬＶ注射の４週間後に、マウスを屠殺した。

【0245】

剖検のために、マウスをケタミン（２．５ｍｇ／マウス２０ｇ）＋メデトミジン（０．２ｍｇ／マウス２０ｇ）で麻酔した。意識を失った時点で、マウスを横隔膜破壊により屠殺し、したがって、以下の分析を容易にするために、２０ｍｌのＰＢＳ（１×）を注入して、組織から血液を除去した。屠殺した動物において、種々の組織を採取した（肝臓、脾臓、肺、骨髄、リンパ節、胸腺、脳、睾丸、膵臓、及び腎臓）。

【0246】

Ａｇｘｔ１^－／－マウスが関与した全ての動物の処置は、パンプローナのCIMA（Centro de Investigacion Medica Aplicada）にて実施された。全ての実験の処置は、欧州理事会ガイドラインに従って、ナバラ大学の倫理委員会及びナバラ公衆衛生研究所によって承認された。動物モデルを使用した全ての実験は、関連する全ての倫理規定に適合していた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが関与した全ての動物の処置は、マドリードのCIEMAT（Centro de Investigaciones Energeticas y Medioambientales y Tecnologicas）にて実施された。全ての実験の処置は、Direccion General de Medio Ambiente of Comunidad de MadridによってＰＲＯＥＸ １６５－１８において承認された。

【0247】

１．６ ＬＶ注射マウスにおけるＶＣＮの決定
動物の屠殺後、種々の組織を採取し（肝臓、脾臓、肺、骨髄、リンパ節、胸腺、脳、睾丸、膵臓、及び腎臓）、－８０℃で保存した。これらの組織に組み込まれたＬＶゲノムの決定のために、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）組織キット（Macherey Nagel）でゲノムＤＮＡを抽出した。

【0248】

注射マウス組織における組み込まれたレンチウイルスベクターゲノムの数（ＶＣＮ）をｑＰＣＲによって決定した。レンチウイルスベクターゲノムの数を分析するために、本発明者らは、レンチウイルスベクターのΨ配列に対して設計されたプライマー（配列番号３７ Ｆｗ：５’ ＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧ ３’、配列番号３８ Ｒｖ：５’ ＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧ ３’）及びプローブ（配列番号３９ ５’－ＣＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧ－３’）（Ｔａｑｍａｎ（商標）、Thermo Fisher Scientific）を使用した。内因性ＤＮＡの量を決定するために、本発明者らは、マウスタイチン遺伝子に対するプライマー（配列番号４０ Ｆｗ：５’ ＡＡＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＡＧＣ ３’、配列番号４１ Ｒｖ：５’ ＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＣ ３’）及びプローブ（配列番号４２ ５’－ＴＧＣＡＣＧＧＡＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＣ－３’）を使用した。試料当たりのＬＶコピー数及び二倍体ゲノム数を決定したら、ＶＣＮを計算した（ＶＣＮ＝Ψコピー数／二倍体ゲノム数）。

【0249】

標準曲線は、Ψ及びタイチン配列を含むＤＮＡ断片の段階希釈液を使用して作成した。全ての反応は、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems（商標））で２回繰り返して実施した。

【0250】

１．７ ＡＧＸＴ発現の決定
注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスにおける治療用レンチウイルスベクターの機能性を分析するために、本発明者らは、これらのマウスの肝臓における導入遺伝子発現を決定した。このパラメータを特定するために、肝臓からＲＮＡをトリゾールプロトコルによって抽出した。要約すると、肝臓断片をトリゾール中でホモジナイズし、その後クロロホルムを添加して水相を分離した。ＲＮＡをイソプロパノール及びグリコーゲンで沈殿させ、エタノール７０％で洗浄し、最後にヌクレアーゼフリー水に再懸濁させた。ＲＮＡ試料中にゲノムＤＮＡが含まれていないことを保証するために、製造業者の使用説明書に従ってＤＮａｓｅ Ｍａｘ（商標）キット（Qiagen）を使用してＤＮａｓｅで試料を消化した。ＲＮＡ試料を－８０℃で維持した。

【0251】

その後、ＲＴ－ＰＣＲ技術を実施し、製造業者の使用説明書に従ってＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（商標）キット（Ambion（米国））によってＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成した。

【0252】

導入遺伝子発現はｑＰＣＲによって決定した。本発明者らは、ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ（配列番号４３ Ｒｖ：５’ ＧＴＣＴＴＧＣＧＧＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＴ ３’、配列番号４４ Ｆｗ：５’ ＣＡＡＧＧＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＴＡ ３’）並びに２つのハウスキーピング遺伝子であるマウスＴｂｐ（配列番号４５ Ｒｖ：５’ ＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡ ３’、配列番号４６ Ｆｗ：５’ ＧＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡ ３’）及びマウスＡｃｔｂ（配列番号４７ Ｒｖ：５’ ＣＴＡ ＡＧＧ ＣＣＡ ＡＣＣ ＧＴＧ ＡＡＡ ＡＧ ３’、配列番号４８ Ｆｗ：５’ ＡＣＣ ＡＧＡ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＡ ３’）に対するプライマーを設計した。全ての反応は、Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems（商標））で２回繰り返して実施した。導入遺伝子の相対発現の定量は、２つのハウスキーピング遺伝子であるマウスＴｂｐ及びマウスβ－アクチンを別々に参照したΔΔＣｔ分析（Schefe et al., 2006）によって実施した。

【0253】

本発明者らはまた、非注射Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるマウスＡｇｘｔの生理的発現を分析した。非注射野生型マウスの肝臓試料からＲＮＡを抽出し、上記で説明したようにＲＴ－ＰＣＲを実施した。遺伝子発現を分析するために、マウスＡｇｘｔ遺伝子に対するプライマーを設計した（配列番号４９ Ｒｖ：５’ ＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣ ３’、配列番号５０ Ｆｗ：５’ ＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＡＡ ３’）。発現分析のために、マウスＴｂｐ及びマウスＡｃｔｂもまた、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。全ての反応は、Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems（商標））で２回繰り返して実施した。導入遺伝子の相対発現の定量は、２つのハウスキーピング遺伝子であるマウスＴｂｐ及びマウスＡｃｔｂを別々に参照したΔΔＣｔ分析（Schefe et al., 2006）によって実施した。

【0254】

１．８ 免疫染色による形質導入細胞のパーセンテージの決定
標的組織における形質導入細胞のパーセンテージを分析するために、本発明者らは、免疫染色アッセイを実施して、ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ注射マウスの肝臓におけるｅＧＦＰ陽性細胞を検出した。

【0255】

パラフィン切片からの試料をキシレン中でインキュベートし、エタノール希釈を減少させることによって脱パラフィンした。その後、試料をブロッキング溶液（ＰＢＳ（１×）中１０％のロバ血清）中で１時間、及び一晩、ブロッキング溶液中のヤギ－αｅＧＦＰ（ａｂ６６７３ abcam（商標））１：１００及びウサギ－αｍｓＡＬＢ（ＡＨＰ１４７８）１：５００と共にインキュベートした。翌日、試料をブロッキング溶液中で二次抗体（ロバ－αヤギ ＡＦ（商標）４８８（Ａ１１０５５ invitrogen（商標））、ロバ－αウサギ ＡＦ（商標）４８８（Ａ２１２０６ invitrogen（商標））、ロバ－αヤギ ＡＦ（商標）５９４（Ａ１１０５８ invitrogen（商標）））１：１０００及びＤＡＰＩ １：１０００と共に１時間インキュベートした。続いて、試料をＭｏｗｉｏｌ（商標）でマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ顕微鏡で可視化した。各試料の画像を取得した。

【0256】

肝臓免疫染色試料におけるｅＧＦＰ陽性細胞の決定は、ＱｕＰａｔｈ（商標）ソフトウェアによって実施した。各画像における肝細胞の合計に対するｅＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを決定した。試料当たり少なくとも１０の異なる視野を分析した（４００倍の倍率）。

【0257】

１．９ 尿シュウ酸塩の決定
マウスから２４時間尿を採取して、この期間中に生物体から除去されたシュウ酸塩の総量を測定した。個々の２４時間の尿を５０μｌの５Ｎ ＨＣｌ中に採取し、その量を測定した。尿試料を活性炭で清澄化し、製造業者の使用説明書に従ってシュウ酸塩キット（Trinity Biotech、ＲＥＦ ５９１－Ｄ）を使用してシュウ酸塩酸化による酵素的定量によってシュウ酸塩を測定した。各試料中のシュウ酸塩の濃度（μｍｏｌ）を決定するために、既知の濃度のシュウ酸塩の参照曲線を作成した（シュウ酸塩標準０．５ｍｍｏｌ／ｌ ＲＥＦ ５９１－３ Trinity Biotech）。最後に、シュウ酸塩濃度及び尿量を使用してシュウ酸塩の定量（μｍｏｌ／２４時間）を計算した。

【0258】

１．１０ 腎臓損傷の決定：腎臓損傷スコア
動物の屠殺後、腎臓をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。次に、５μｍの切片を得て、ヘマトキシリン－エオシンで染色した。生じた損傷を決定するために、本発明者らは、各試料の段階を、観察された特徴に従って４つの異なる段階に分類した「腎臓損傷スコア」を開発した。
０：損傷なし
１：構造は正常だが、拡張した管等の幾つかの損傷徴候がある。
２：構造が部分的に影響を受け、拡張した管の存在が増加する。
３：組織構造が大きな影響を受け、腎石灰化症の段階を示すシュウ酸カルシウム結晶の存在が観察できる。

【0259】

１．１１ 形質導入促進剤：シクロスポリンＨのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
開発したレンチウイルスベクターによる治療後のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入有効性を増加させるために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入プロトコル中の形質導入促進剤であるシクロスポリンＨ（ＣｓＨ）の効果を試験した。ＣｓＨの２つの異なるレジメンを試験した。標的組織起源の重要な関連性のため、肝細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を使用した。

【0260】

第１のＣｓＨレジメンのために、２×１０^５個の細胞を２４ウェルプレートに播種した。１日後、細胞を、０．３のＭＯＩでのＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ及びＣｓＨを含む培養培地溶液で形質導入した。異なるＣｓＨ濃度を試験した（４μＭ、８μＭ、及び１６μＭ）。形質導入の３日後に、ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。全ての条件を３回の実験反復として実施した。

【0261】

第２のＣｓＨレジメンのために、２×１０^５個の細胞を２４ウェルプレートに播種した。１日後、培養培地を交換し、細胞を１６μＭのＣｓＨを追加した培養培地でプレインキュベートした。１６時間後、細胞を、０．３のＭＯＩでのＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ及び１６μＭのＣｓＨを含む溶液で形質導入した。形質導入の３日後に、ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。全ての条件を３回の実験反復として実施した。

【0262】

１．１２ 統計分析
群間の有意差は、ガウス分布を使用せずに２つの独立群を比較するために使用されるノンパラメトリック検定であるマン・ホイットニー検定によって決定した。分析はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアで実施した。ｐ＜０．０５の場合に有意な値とみなした。

【0263】

１．１３ 形質導入促進剤：デキサメタゾンのｉｎ ｖｉｖｏ試験
本発明のレンチウイルスベクターの形質導入有効性を高めるために、本発明者らは、レンチウイルスベクター投与と自然免疫応答の抑制剤であるデキサメタゾンとの組み合わせを試験した。分析はＣ５７ＢＬ／６雄成体マウスで実施した。

【0264】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回用量のＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（５×１０^８ＴＵ／マウス）を尾静脈注射により投与した。さらに、マウスを５ｍｇ／体重１ｋｇのデキサメタゾン（Ｆｏｒｔｅｃｏｒｔｉｎ（商標））で治療し、レンチウイルスベクター注射の１２時間前及び２時間前、並びに４時間後の３回の逐次的投与で腹腔内注射した。レンチウイルスベクターのみを注射した対照群も実験に含めた。

【0265】

４週間後にマウスを屠殺し、形質導入有効性分析（二倍体ゲノム当たりのレンチウイルスベクターの組込み及び肝臓におけるｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ）を実施した。

【0266】

実施例２：レンチウイルスベクターは、静脈内注射後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＡｇｘｔ１^－／－マウスモデルにおいて肝臓を効率的に形質導入する
最初に、開発した遺伝子療法ツールの実現可能性を研究し、形質導入パーセンテージ及び生体内分布分析を実施するための概念実証として、本発明者らは、成体Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに単回用量のＬＶ．ＥＴ．ＧＦＰ．１４２－３ｐＴを注射したｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施した（図１ａ、図２ａ）。本発明者らは、２つの異なる用量（１×１０^８ＴＵ／マウス、２．５×１０^８ＴＵ／マウス）を試験した。本発明者らは、１×１０^８ＴＵ／マウスの用量で注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、二倍体ゲノム当たり０．５５（０．３４～０．５６）のレンチウイルスベクターコピーを観察したが、これに対して、２．５×１０^８ＴＵ／マウスの用量で注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、二倍体ゲノム当たり１．０３（０．９４～１．５６）のレンチウイルスベクターコピーが得られた（図３）。免疫染色分析により、これは低用量及び高用量でそれぞれ１．７５１％（１．１３％～５．５５％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞及び１２．９２％（１０．７２％～１３．８１％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞に対応することが明らかである（図５）。これらのマウスの代表的な画像は、図５（Ａ～Ｃ、Ｆ～Ｈ）において観察することができる。

【0267】

次に、レンチウイルスベクターＬＶ．ＥＴ．ＧＦＰ．１４２－３ｐＴのｉｎ ｖｉｖｏ形質導入効率を更に特徴付け、同じレンチウイルスベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏの形質導入効率と比較するために、ＨｅｐＧ２細胞を異なる感染多重度（ＭＯＩ）でのＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴで形質導入した。形質導入の３日後に、ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。約１のＭＯＩを使用すると、５０％の形質導入パーセンテージが達成されたが、より高いＭＯＩではｉｎ ｖｉｔｒｏで１００％の形質導入が達成された。ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入有効性の決定のために、成体Ｃ５７ＢＬ／６（図１３、黒丸）又はＡｇｘｔ１^－／－マウス（図１３、白丸）に異なる用量（１×１０^８ＴＵ／マウス、１．４×１０^８ＴＵ／マウス、２×１０^８ＴＵ／マウス及び５×１０^８ＴＵ／マウス）にてＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴを静脈内注射した。対応するＭＯＩは、以前に記載されているように、これらのマウスの肝臓における肝細胞の推定数に従ってのみ計算した（Park et al., 2000、Schmitt et al., 2010）。したがって、マウスに以下のＭＯＩ：０．８、１．１、２、及び４で注射した。形質導入肝細胞のパーセンテージは、４週間後に肝臓の組織試料において決定した。図１３に示した結果は、このレンチウイルスベクターをｉｎ ｖｉｖｏで使用した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と比較して、その形質導入効率が大幅に低下することを示している。

【0268】

したがって、原発性高シュウ酸尿症１型を治療するための遺伝子療法戦略としての治療用レンチウイルスベクターのｉｎ ｖｉｖｏ投与の実現可能性を試験するために、成体雄Ａｇｘｔ１^－／－マウスに単回用量のＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴレンチウイルスベクターを静脈内注射した（図１Ｂ）。３つの異なるレンチウイルスベクター用量（２．５×１０^８ＴＵ／マウス、５×１０^８ＴＵ／マウス、１×１０^９ＴＵ／マウス）を試験した。注射の３週間後、マウスに７日間エチレングリコール負荷試験を行い（図２Ｂ）、その後屠殺した。

【0269】

肝臓に組み込まれたゲノムレンチウイルスベクターのコピー数を屠殺時に決定した。肝臓形質導入に用量関連の有効性が認められた。３つの異なる群で達成された肝臓ＶＣＮは、２．５×１０^８ＴＵ／マウスを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスで０．６１５（０．３９～１．４６）、５×１０^８ＴＵ／マウスを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスで０．７６５（０．４５～１．１９）、１０×１０^８ＴＵ／マウスを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスで１．１６５（０．８５～０．３２）であった（図３）。本発明者らはまた、非注射マウスでこのパラメータを分析したが、予想通り、これらの動物でレンチウイルスベクターゲノムのいずれのコピーも検出されなかった。

【0270】

対照群として、本発明者らはまた、Ａｇｘｔ１^－／－マウスにレポーターレンチウイルスベクターを注射した。２つの異なるＬＶ用量を試験した（１．４×１０^８ＴＵ／マウス、５×１０^８ＴＵ／マウス）。本発明者らはまた、用量関連の肝臓の形質導入有効性を観察した。低用量注射マウスでは、０．１１（０．０９～０．４９）の肝臓のＶＣＮが観察され、一方で、高用量では、０．８４（０．７３～１．５８）の肝臓ＶＣＮが観察された（図３）。さらに、レポーターＬＶ形質導入有効性は、Ａｇｘｔ１^－／－マウスにおいて治療用レンチウイルスベクターで達成された有効性と同等であった。

【0271】

レンチウイルスベクター注射後に達成された形質導入細胞のパーセンテージを特定することを意図して、本発明者らはまた、ＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ Ａｇｘｔ１^－／－注射マウスの肝臓切片における陽性細胞のパーセンテージを分析した（図５）。１．４×１０^８ＴＵ／マウスを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスでは、１．７７７％（０．３９９％～４．５７２％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞が観察されたが、５×１０^８ＴＵ／マウスを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスでは、５．５０５９％（２．１０９％～８．７５４％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞が観察された。これらのマウスの代表的な画像を図５（Ｄ、Ｅ）に示す。レポーターレンチウイルスベクター及び治療用レンチウイルスベクターは同様に機能すると思われるため、５×１０^８ＴＵ／マウスの治療用レンチウイルスベクターを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスでは、同用量のレポーターレンチウイルスベクターを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスで観察されたものと同様の形質導入パーセンテージが達成されたことが予想された。

【0272】

Ａｇｘｔ１^－／－と野生型Ｃ５７ＢＬ／６との注射マウス間の形質導入有効性に関しての差は、マウスの遺伝的背景又はＬＶラボグレードバッチのタイトル決定の変動性に起因する可能性がある。

【0273】

実施例３：治療用レンチウイルスベクターは、治療したＡｇｘｔ１^－／－マウス肝臓において効率的に発現する
本発明者らは、治療用レンチウイルスベクターＡｇｘｔ１^－／－注射マウスの標的組織における治療用レンチウイルスベクターの存在を確認したが、このコンストラクトが効率的に発現しているかどうかを試験したいと考えた。本発明者らは、治療したＡｇｘｔ１^－／－マウス肝臓における導入遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。参照として、２つの異なるハウスキーピング遺伝子をこの分析に使用して（ｍｓＴｂｐ及びｍｓＡｃｔｂ）、Ａｇｘｔ１^－／－マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法戦略後のレンチウイルスベクター組込みによって誘導されたＡＧＸＴ発現と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおける生理的マウスＡｇｘｔ１発現の間の差を適切に決定した。

【0274】

２．５×１０^８ＴＵ／マウスの用量を投与した治療用レンチウイルス注射マウスは、ｍｓＴｂｐ発現を参照した１０．８８％（５．６２％～１６．７９％）のＡＧＸＴ発現、及びｍｓＡｃｔｂを参照した０．１０４１％（０．０６００７％～０．２４５２％）のＡＧＸＴ発現を示した。５×１０^８ＴＵ／マウスの用量を投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスは、ｍｓＴｂｐを参照した１２．１１％（４．３８％～１４．４８％）のＡＧＸＴ発現、及びｍｓＡｃｔｂを参照した０．１８５７％（０．０８８７８％～０．２９６６％）のＡＧＸＴ発現となった。１×１０^９ＴＵ／マウスでのＡｇｘｔ１^－／－治療用レンチウイルスベクター注射マウスは、ｍｓＴｂｐを参照した１９．８８％（１８．５２％～２８．５５％）のＡＧＸＴ発現、及びｍｓＡｃｔｂを参照した０．３０８８％（０．１７０７％～０．４４１８％）のＡＧＸＴ発現を示した（図４）。したがって、異なる治療用レンチウイルスベクターＡｇｘｔ１^－／－注射マウス間のＡＧＸＴ発現レベルの差は、投与した用量と相関した。非注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスはＡＧＸＴ発現を示さなかった。

【0275】

さらに、治療用レンチウイルスベクター注射後に達成されたＡＧＸＴ発現と生理的マウスＡｇｘｔ１発現との間の差を研究するために、本発明者らは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるこの発現を分析した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ａｇｘｔ１^－／－治療マウスにおいて達成されたものより有意に高い、ｍｓＴｂｐを参照した８５６３（６９９６～８９３９）のマウスＡｇｘｔ１発現、及びｍｓＡｃｔｂを参照した３４０．５（１４１～３７４．５）のマウスＡｇｘｔ１発現を示した。

【0276】

実施例４：Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｉｎ ｖｉｖｏレンチウイルスベクター注射は、オフターゲット形質導入を減少させる
提案した治療戦略のセキュリティーを決定するために、２つの異なる用量のレポーターレンチウイルスベクターを注射したＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにおけるレンチウイルスベクター組込みゲノムの数を分析した。注射野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの異なる組織に組み込まれたＬＶゲノムコピー数をｑＰＣＲによって分析した。レポーターレンチウイルスベクターゲノムの組込みは、標的組織である肝臓、並びにこの戦略で使用した投与経路によって起こる可能性のあった肺、脾臓及び骨髄でのみ観察された。１×１０^８ＴＵ／マウスを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスは、肺で２．７２（２．３３～６．２）、脾臓で０．２１（０．１４～０．３２）、骨髄で０．０５（０．０４～０．０９）のＶＣＮを示した。より高用量の２．５×１０^８ＴＵ／マウスを注射したマウスは、肺で４．９４（０．１８５～７．７９）、脾臓で０．３５（０．２５～０．５５）、骨髄で０．１３（０．０９～０．１８）のＶＣＮ値を示した（図６）。これらの組織において組み込まれたベクターゲノムの存在は観察されたが、レポーター遺伝子発現は免疫蛍光分析では観察されず、オフターゲット形質導入に由来するリスクの低下を示している。さらに、腫瘍形成の徴候は観察されなかった。

【0277】

実施例５：治療用レンチウイルスベクター治療Ａｇｘｔ１^－／－マウスは尿シュウ酸塩レベルの低下が見られる
Ａｇｘｔ１^－／－マウスモデルにおける原発性高シュウ酸尿症１型病理学的表現型分析では、ヒトの表現型により近い表現型を得るためにエチレングリコール負荷試験が必要である。この負荷試験は、これらのマウスの病理学的表現型を分析するために必要なシュウ酸塩産生における過負荷を生じる。

【0278】

７日間のエチレングリコール負荷試験にわたって、マウスを２４時間で隔離し、２４時間尿を採取した。尿中のシュウ酸塩濃度を、治療開始前（基礎測定）並びに治療の３日目及び７日目の３つの異なる時点で測定した。

【0279】

病理学的表現型を分析するために、３つの異なる治療用レンチウイルスベクター用量の２．５×１０^８ＴＵ／マウス、５×１０^８ＴＵ／マウス及び１０×１０^８ＴＵ／マウスを使用した。さらに、３つの異なる対照群：ＰＢＳ又はレポーターレンチウイルスベクター（ＬＶ．ＥＴ．ＧＦＰ．１４２－３ｐＴ）を注射したＡｇｘｔ１^－／－マウスで構成される２つの陰性対照群、及びＣ５７ＢＬ／６野生型マウスで構成される陽性対照群を含めた。全てのマウス群にエチレングリコール負荷試験を行った。

【0280】

治療前、尿シュウ酸塩濃度は全ての条件で低かった。エチレングリコール負荷試験の開始後、シュウ酸塩尿濃度の増加が全ての群で観察された。しかしながら、観察された増加は、治療用レンチウイルスベクターで治療した群よりも未治療Ａｇｘｔ１^－／－群で大きかった。さらに、このマウスモデルの特異的特徴であるこの値に関連するデータの分散は、ＬＶ治療Ａｇｘｔ１^－／－マウスよりも未治療Ａｇｘｔ１^－／－マウスで大きかった。５×１０^８ＴＵ／マウスの治療用レンチウイルスベクターを投与したＡｇｘｔ１^－／－マウスの尿シュウ酸塩濃度は、未治療Ａｇｘｔ１^－／－マウス群の尿シュウ酸塩濃度よりも３日目及び７日目で有意に低かった。重要なことに、７日目にて、５×１０^８ＴＵ／マウスでの治療用ＬＶ注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスと野生型Ｃ５７ＢＬ／６群との間に有意差はなかった（図７）。

【0281】

実施例６：治療マウスはエチレングリコール負荷試験中に体重が増加する
Ａｇｘｔ１^－／－マウスの病理学的表現型を追跡するためのもう１つの重要なパラメータは、エチレングリコール負荷試験中の動物の体重の増減である。このパラメータに関して、本発明者らは、２つの参照時点での全てのマウスの体重動向を分析し、基礎時点での体重測定値と比較した。本発明者らは、未治療対照群の動物の体重の減少を観察した。この減少は、治療用ＬＶ治療群では観察されなかった。さらに、体重増加を達成した（図８）。エチレングリコール負荷試験の７日後に、５×１０^８ＴＵ／マウス及び１０×１０^８ＴＵ／マウスでの治療用ＬＶ注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスの体重増加は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスと有意差はなかった。

【0282】

実施例５及び実施例６は、修正細胞で観察されたＡＧＴ発現は正常肝細胞で観察されたものよりもはるかに低いが、治療動物で得られた表現型修正は予想外にはるかに高いことを示した。したがって、「治療効果を達成するためには４０％超の細胞を修正する必要がある」という仮説を考慮すると、予想外の表現型転換度が見出された。最も効率的な群では、形質導入のパーセンテージは２０％以下である（レポーターＬＶを用いた図５を参照）。

【0283】

実施例７：治療マウスにおける腎石灰化症の発症の減少が認められる
原発性高シュウ酸尿症１型患者の最も重要な臨床徴候の１つは、腎臓実質におけるシュウ酸カルシウム結晶形成による腎石灰化症の発症である。動物の腎臓における損傷を決定するために、本発明者らは、０は損傷なしを表し、１は腎臓実質における軽度損傷を表し、２は腎石灰化症の明らかな徴候を観察できる段階３に変わる可能性のある中程度の損害を表す腎臓損傷スコアを開発して、エチレングリコール処理によって生じた損傷を分類した。このスコアに関して各動物を分類した。この分類に関しては、治療群と比較して、非治療群で腎石灰化症を発症するマウスのパーセンテージが高かった。５×１０^８ＴＵ／マウスでの治療用ＬＶ注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスにおいて、腎石灰化症を発症するいかなるマウスも観察されなかった（図９Ａ）。

【0284】

このスコアを、腎臓損傷なし又は軽度の腎臓損傷（スコア０～１）、及びエチレングリコール負荷試験により腎臓損傷が進行しているマウスを表す中程度又は重度の腎臓損傷（スコア２～３）に単純化すると、未治療Ａｇｘｔ１^－／－マウスと比較して、腎臓損傷の進行が半数の場合の４分の１で発生し、２．５×１０^８ＴＵ／マウス又は１０×１０^８ＴＵ／マウスの用量での治療用レンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスでも腎臓損傷の進行が発生することが観察された。一方、５×１０^８ＴＵ／マウスでの治療用レンチウイルスベクター注射Ａｇｘｔ１^－／－マウスでは、治療マウス１０匹中１匹のみが腎臓損傷進行を発症し、中間用量（５×１０^８）で注射したマウスでは腎石灰化症を発症しなかった（図９Ｂ）。

【0285】

【表1】

【0286】

実施例８：レンチウイルス形質導入プロトコルにおけるシクロスポリンＨの使用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの肝細胞株における形質導入有効性を増加させる
以前の実験で観察されたように効果的でないウイルス用量の量を増加させずに修正肝細胞の量を増加させるために、本発明者らは、ＬＶ形質導入を最適化する潜在的形質導入促進剤を探した。数ある中でもシクロスポリンＨは、ＣｓＨの標的タンパク質であるＩＦＩＴＭ３が基礎条件下で高度に発現される造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＬＶ形質導入を促進することが記載されている。しかしながら、標的細胞としての肝細胞に関するデータは示唆されておらず、試験もされていなかった。この可能性を試験する目的で、肝ＨｅｐＧ２細胞を、２つの異なる投与レジメンのＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ及び異なるＣｓＨ濃度で形質導入した。

【0287】

第１の形質導入プロトコルにおいて、レンチウイルスベクター形質導入プロトコル中に、ＨｅｐＧ２細胞を異なる濃度のＣｓＨ（４μＭ、８μＭ、又は１６μＭ）に曝した。細胞を０．３のレンチウイルスベクターＭＯＩで形質導入した。各条件の３回の技術的反復を実施した。基礎形質導入レベルは３６．６７％であり、異なるＣｓＨ処理試料では、４μＭ、８μＭ、及び１６μＭのＣｓＨ条件で３７．６７％、４４．３％、及び５１．５％の形質導入パーセンテージが認められ、これは、対照試料のそれぞれ１．０３、１．２、及び１．４倍の増加を意味する（図１０）。

【0288】

第２のＣｓＨ投与レジメンにおいて、形質導入前にＨｅｐＧ２細胞を１６時間のＣｓＨ前処理に供し、ＣｓＨも含めた。試験したＣｓＨ濃度は１６μＭのみであった。このＣｓＨ投与レジメンにおいて、対照試料に対して２．３５倍のｅＧＦＰ陽性細胞の増加が認められた（図１０）。細胞を０．３のＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴのＭＯＩで形質導入すると、達成された形質導入細胞のパーセンテージは、対照条件で１３．２％、ＣｓＨ処理細胞で３１．０３％であった。

【0289】

同じＭＯＩでの対照条件間の形質導入レベルで観察された差は、解凍－凍結サイクルによるＬＶタイトルのおそらくは減少によるものである。２つの異なる投与レジメンは独立した実験であった。

【0290】

したがって、注目すべきことに、ＣｓＨ標的遺伝子であるＩＦＩＴＭ３が肝系統で発現していないと考えられているにもかかわらず、形質導入促進剤としてＣｓＨを添加すると、ＨｅｐＧ２等の肝細胞株における開発されたレンチウイルスベクターの形質導入効率（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）が増加する。

【0291】

実施例９：デキサメタゾン処理はｉｎ ｖｉｖｏレポーターレンチウイルスベクター治療Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓における形質導入有効性を改善する
追加の化合物の使用は、形質導入肝細胞の量を増加させるための有用なツールとなり得、それにより、本発明のレンチウイルスによる治療の治療有効性が改善されるであろう。さらに、レンチウイルスベクターが引き起こす可能性のある１型インターフェロン（ＩＦＮ－１）によって媒介される免疫応答もまた、形質導入有効性を妨害する可能性があり、したがって、上記免疫応答の抑制剤の使用はまた、レンチウイルスベクターのｉｎ ｖｉｖｏ投与後の潜在的な併用治療を表す。このため、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、レンチウイルスベクターと組み合わせたデキサメタゾン（Agudo et al. 2012, Molecular Therapy vol. 20 no. 12, 2257-2267に記載されているプロトコルに従う）で処理する実験を実施した。

【0292】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを尾静脈注射により単回用量のＬＶ．ＥＴ．ｅＧＦＰ．１４２－３ｐＴ（５×１０^８ＴＵ／マウス）で治療した。さらに、マウスに、レンチウイルスベクター注射の１２時間前及び２時間前、並びに４時間後の３回の逐次的投与で、５ｍｇ／体重１ｋｇのデキサメタゾン（Ｆｏｒｔｅｃｏｒｔｉｎ（商標））を腹腔内注射した。併用治療の４週間後にマウスを屠殺した（図１４Ａ）。

【0293】

デキサメタゾン及びレポーターレンチウイルスベクターの組み合わせで治療したマウスでは、二倍体ゲノム当たり０．９２（０．３８～１．４）の組込みコピーが認められたが、レンチウイルスベクターのみで治療したマウスでは、二倍体ゲノム当たり１．４８（１．２～１．７６）の組込みコピーが検出され、併用治療で治療したマウスと比較して有意に増加した（図１４Ｂ）。しかしながら、免疫染色分析は、併用治療で治療したマウスにおけるｅＧＦＰ陽性肝細胞のパーセンテージにおいて、レンチウイルスベクターのみで治療したマウスに対して４．０８倍の増加を明らかにしている（それぞれ１８．１１％（６．３８１％～１９．７９％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞及び４．４３４％（２．１６７％～７．５５％）のｅＧＦＰ陽性肝細胞である）。これらのマウスの代表的な画像は、図１４のＤ及びＥにおいて観察することができる。

【0294】

これらの結果は、Ａｇｘｔ１^－／－マウスとの関係において、デキサメタゾン及びＬＶ．ＥＴ．ＡＧＸＴ－ＲＨＥＡＭ．１４２－３ｐＴの組み合わせが、形質導入有効性、もっともらしくは、治療効果を改善するであろうことを示唆しており、ＰＨ１患者の治療のためのレンチウイルスベクターに基づくｉｎ ｖｉｖｏ戦略の実現可能性を裏付けるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】