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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-16
(54)【発明の名称】脳腫瘍治療のための生物学的実体物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240409BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240409BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240409BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20240409BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240409BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/13
C12N15/869 Z
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023568484
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-12-20
(86)【国際出願番号】 US2022027684
(87)【国際公開番号】W WO2022235810
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】63/183,945
(32)【優先日】2021-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523417413
【氏名又は名称】アリヴィッド エルエルシー
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＩＶＩＤ ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】６３ Ｒｉｄｇｅ Ｒｏａｄ， Ｒｕｍｓｏｎ， ＮＪ ０７７６０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】デイヴィッド テューキー
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
(57)【要約】
脳腫瘍、特に神経膠腫を治療するための生物学的実体物、およびその生物学的実体物を含むベクターが開示される。この生物学的実体物は、少なくとも１つのＧｌｕＡノックダウン剤、好ましくは少なくとも２つのＧｌｕＡノックダウン剤から構成される少なくとも抗腫瘍導入遺伝子を含むコンストラクトであり、好ましくは、融合性タンパク質と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ１２の免疫応答プロモーターをさらに含む。ベクターは野生型ＨＳＶ－１ウイルスを含み、生物学的実体物が野生型ＨＳＶ－１ウイルスのＩＣＰ３４．５遺伝子を置き換える。生物学的実体物で修飾された野生型ＨＳＶ－１ウイルスを含むベクターは、ニューロンに対してほとんどネガティブな効果を示さない一方で、ニューロン細胞と膠芽腫細胞とを別々に培養した場合と共培養した場合との両方において、ヒト膠芽腫細胞に対してポジティブな効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのＡＭＰＡ受容体干渉剤またはＧｌｕＡノックダウン剤から構成される少なくとも１つの抗腫瘍導入遺伝子を含む、ヒト膠芽腫細胞を死滅させるのに有効である生物学的実体物。
【請求項2】
少なくとも１つの抗腫瘍導入遺伝子が２つのＧｌｕＡノックダウン剤を含む、請求項１記載の生物学的実体物。
【請求項3】
前記２つのＧｌｕＡノックダウン剤が、ＧｌｕＲ１およびＧｌｕＲ２を含むＡＭＰＡ受容体サブユニットを標的とする、請求項２記載の生物学的実体物。
【請求項4】
前記生物学的実体物が、融合性タンパク質と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ１２コンストラクトの形態の免疫応答プロモーターとをさらに含む、請求項１記載の生物学的実体物。
【請求項5】
野生型ＨＳＶ－１ウイルスと、少なくとも１つのＧｌｕＡノックダウン剤から構成される少なくとも１つの抗腫瘍導入遺伝子とを含む、ヒト膠芽腫細胞を死滅させるのに有効であるベクター。
【請求項6】
前記少なくとも１つの抗腫瘍導入遺伝子が２つのＧｌｕＡノックダウン剤を含む、請求項５記載のベクター。
【請求項7】
前記２つのＧｌｕＡノックダウン剤が、ＧｌｕＲ１およびＧｌｕＲ２を含むＡＭＰＡ受容体サブユニットを標的とする、請求項６記載のベクター。
【請求項8】
前記抗腫瘍導入遺伝子が、融合性タンパク質と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ２の免疫応答プロモーターとをさらに含む、請求項５記載のベクター。
【請求項9】
前記ベクターが前記野生型ＨＳＶ－１ウイルスのＩＣＰ３４．５遺伝子を置き換える、請求項５記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．開示の分野
本開示は、脳腫瘍、特に神経膠腫を治療するための新規の生物学的実体物（biological entity）に関する。
本開示は、脳腫瘍、特に神経膠腫を治療するための新規の生物学的実体物（biological entity）に関する。
【0002】
２．背景技術の考察
神経膠腫の先行技術による治療
神経膠腫は、悪性脳腫瘍の最も一般的な形態であり、その最も悪性な形態である膠芽腫（ＧＢＭ）は、がんの中で最も致命的なものの１つである。ＧＢＭ患者の平均生存期間は、診断から１年強である。膠芽腫の一次治療における現在の標準療法であるテモダール（Temodar）は、テモダールのＦＤＡ全処方情報に記載されているように、放射線単独と比較して全生存期間を１２．１ヶ月から１４．６ヶ月まで延ばした（図１を参照）。
神経膠腫の先行技術による治療
神経膠腫は、悪性脳腫瘍の最も一般的な形態であり、その最も悪性な形態である膠芽腫（ＧＢＭ）は、がんの中で最も致命的なものの１つである。ＧＢＭ患者の平均生存期間は、診断から１年強である。膠芽腫の一次治療における現在の標準療法であるテモダール（Temodar）は、テモダールのＦＤＡ全処方情報に記載されているように、放射線単独と比較して全生存期間を１２．１ヶ月から１４．６ヶ月まで延ばした（図１を参照）。
【0003】
過去２０年間、神経膠腫における腫瘍溶解性ウイルスを研究する一連の小規模試験が行われてきた。当初の構想では、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、主に単純ヘルペス１型（ＨＳＶ－１）（このＨＳＶ－１は、非腫瘍細胞によって生成される免疫応答に耐える必要がある）のＩＣＰ３４．５遺伝子を欠失させることにより、腫瘍細胞には感染するが正常組織には感染しないように操作されたウイルスであった（Mineta, T. et al. “Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas.” Nature Medicine 1, no. 9 (September 1995): 938-943を参照）。腫瘍部位にＯＶを投与する必要があることから、ＯＶを用いた最初の主要な製薬的取り組みは皮膚がんであった。Biovex/Amgen社のＩｍｌｙｇｉｃは、ＨＳＶ－１ウイルスを操作したもので、２０１５年に皮膚がんに対して承認された。アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスなどを含む、他のウイルスも抗がん目的で操作されている。しかしながら、現在までのところ、ＨＳＶ－１をベースにしたウイルスだけが、このような治療に対する明確な臨床的な概念の実証を示している。
【0004】
神経膠腫では、腫瘍溶解性ウイルスのランダム化試験は実施されていない。しかしながら、一部の患者におけるＯＶの伝播によって引き起こされたと思われる腫瘍縮小および抗腫瘍免疫応答のエビデンスによって、臨床コミュニティは期待感を抱いている。定性的には、全研究に占める割合として、神経膠腫で実施されているＯＶ研究は、他の腫瘍と比較して多い。これには幾つかの理由があると考えられる：ｉ）血液脳関門が従来の薬理学的薬剤の全身送達に課題を課していること、ｉｉ）評価手順の侵襲性により、腫瘍内投与がより受け入れられやすくなっていること、およびｉｉｉ）予後の厳しさにより、実験的ウイルスの脳内投与を許容するリスク／便益計算が得られること。
【0005】
２０２１年４月にThe New England Journal of Medicine誌に１つの早期臨床試験が掲載された。アラバマ大学バーミンガム校の研究者らは、１９９５年に作製されたＯＶコンストラクトで患者を治療した。（Friedman et al. “Oncolytic HSV-1 G207 Immunotherapy for Pediatric High-Grade Gliomas”. N Engl. J Med 2021; 384:1613-1622を参照）（図２を参照）。
【0006】
一企業であるDNAtrix社は、早期臨床試験で少数の患者に奏効がみられたことに基づいて、膠芽腫でアデノウイルスＯＶを第３相に移行しようとしている（Lang et al. “Phase I Study of DNX-2401 (Delta-24-RGD) Oncolytic Adenovirus: Replication and Immunotherapeutic Effects in Recurrent Malignant Glioma.” Journal of Clinical Oncology 36, no. 14, 1419-1427 (May 2018)を参照）（図３を参照）。そして、２０２１年６月、日本の保健当局は、TodoおよびDaiichi Sankyo社が販売する腫瘍溶解性ウイルスであるＴｅｓｅｒｐａｔｕｒｅｖ（Ｇ４７Δ）を悪性神経膠腫の治療薬として承認した。
【0007】
２０２０年１１月、Ｉｍｌｙｇｉｃの発明者によって設立されたReplimune社が、次世代ＯＶであるＲＰ２の概念の実証臨床データを発表したとき、ＯＶ分野に画期的な進展がもたらされた。その第一世代候補であるＲＰ１は、免疫チェックポイント阻害剤との併用で皮膚がんにおける有効性を実証しているようにみえたが、単剤での有効性は実証されていなかった。ＲＰ２は、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に対するチェックポイント阻害抗体をそのコンストラクト内に含んでいる。したがって、ＲＰ２は、ＲＰ１よりも効力が高められているようにみえるが、「ロードされたＯＶ」、すなわち抗がん剤そのものでありながら、ウイルスを抗がん剤の送達剤として使用したＯＶである（Aroldi, F. et al. “Initial results of a phase 1 trial of RP2, a first in class, enhanced potency, anti-CTLA-4 antibody expressing, oncolytic HSV as single agent and combined with nivolumab in patients with solid tumors”. Poster presented 2020 Society for Immunotherapy of Cancer Annual Meetingを参照）（図４を参照）。Replimune (REPL)社のＲＰ－１概略図を図５に示す（Thomas, S. et al., “Development of a new fusion-enhanced oncolytic immunotherapy platform based on herpes simplex virus type 1.” Journal for ImmunoTherapy of Cancer 7, no. 1, 6-17 (December 2019) を参照）。
【0008】
公開会社であるOncorus社は、現在、ＯＮＣＲ－１７７と名付けられた５つの免疫刺激性導入遺伝子を持つＯＶを試験中である（図６を参照）。ＯＮＣＲ－１７７ペイロードは、新たに生産的抗腫瘍応答を刺激するように設計されていると言われている（Kennedy, E.M. et al., “Design of ONCR-177 base vector, a next generation oncolytic herpes simplex virus type-1, optimized for robust oncolysis, transgene expression and tumor-selective replication.” Poster presented at American Association for Cancer Research annual meeting 2019)を参照）。
【0009】
カルシウム透過性ＡＭＰＡ受容体（ＣＰＡＲ）
２０１９年、Venkataramaniらは、カルシウム透過性ＡＭＰＡ受容体（ＣＰＡＲ）が、腫瘍細胞の維持と、ニューロンのシナプスでの神経膠腫腫瘍細胞へのシグナル伝達を介する広がりとに寄与していることをNature誌に掲載した（Venkataramani, V. et al. “Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.”, Nature 573, 532-538 (2019) を参照）（図７）。ＣＰＡＲは、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体のサブタイプであり、脳内の変化プロセスの重要なドライバーとしてここ１０～１５年の間に浮上した。ＣＰＡＲは、学習・記憶過程に関与していることが最も多く、ＣＰＡＲは、海馬内の情報ストレージの物理的発現の一部であり、報酬駆動型行動に必要である。
２０１９年、Venkataramaniらは、カルシウム透過性ＡＭＰＡ受容体（ＣＰＡＲ）が、腫瘍細胞の維持と、ニューロンのシナプスでの神経膠腫腫瘍細胞へのシグナル伝達を介する広がりとに寄与していることをNature誌に掲載した（Venkataramani, V. et al. “Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.”, Nature 573, 532-538 (2019) を参照）（図７）。ＣＰＡＲは、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体のサブタイプであり、脳内の変化プロセスの重要なドライバーとしてここ１０～１５年の間に浮上した。ＣＰＡＲは、学習・記憶過程に関与していることが最も多く、ＣＰＡＲは、海馬内の情報ストレージの物理的発現の一部であり、報酬駆動型行動に必要である。
【0010】
本発明者は、ＣＰＡＲがニューロン細胞質からシナプスへと輸送される細胞内メカニズムの解明に貢献し（Tukey, D.S. et al., “Sucrose ingestion induces rapid AMPA receptor trafficking.” Journal of Neuroscience 33, No. 14, 6123-6132 (April 2013)を参照）（図８を参照）、そして、ＣＰＡＲがシナプスに取り込まれると、ＣＰＡＲ自体が変化のドライバーになり得ることを実証した（Tukey, D.S. and Ziff, E.B., “Ca2+-permeable AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) receptors and dopamine D1 receptors regulate GluA1 trafficking in striatal neurons”, Journal of Biological Chemistry 288, No. 49, 35297-35306 (December 2013)を参照）（図９を参照）。重要なことに、ＣＰＡＲは、ニューロンとグリア細胞との間のシナプスでの変化にも不可欠である（Ge, WP et al., “Long-term potentiation of neuron-glia synapses mediated by A2+-permeable AMPA receptors.” Science 312, No. 5779, 1533-1537 (June 2006) を参照）。グリア細胞は、遺伝子異常により神経膠腫を生じさせるニューロン支持細胞である。
【0011】
概要
本開示は、脳腫瘍、すなわち神経膠腫を治療するための新規の生物学的実体物である。本開示は、新規の腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）を用いてニューロンシナプス生物学を適用する。
本開示は、脳腫瘍、すなわち神経膠腫を治療するための新規の生物学的実体物である。本開示は、新規の腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）を用いてニューロンシナプス生物学を適用する。
【0012】
本開示は、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）である新規のＯＶを提供し、このＯＶは、ニューロン－腫瘍シナプスを遮断することによって脳腫瘍の広がりを防止するかまたは最低でも緩和するために、抗腫瘍免疫応答を刺激する導入遺伝子を発現しながら、腫瘍細胞に選択的に感染し複製するように操作される。新規のＯＶは、ＨＳＶ－１のＩＣＰ３４．５遺伝子を欠失させ、抗腫瘍導入遺伝子を含み得かつＩＣＰ４７遺伝子プロモーターによって駆動されるコンストラクトに置き換えたものである。
【0013】
この新規のＯＶは、腫瘍内注射によって投与されて、現在の標準療法／治療よりも良好な全奏効率ひいては同様に良好な全生存率を達成する。現在の標準療法はテモゾロミド単独であり、上で説明した神経膠腫に対して現在開発中の他のＯＶがある。全奏効率の向上により脳腫瘍の広がりを遅らせることは、患者の人生にとって計り知れない利益である。
【0014】
新規のＯＶは、好ましくは、神経膠腫細胞において、ＣＰＡＲを含むＡＭＰＡ受容体の主要サブユニットであるタンパク質ＧｌｕＡ１とＧｌｕＡ２との遺伝子的干渉を少なくとも含むことで、ＡＭＰＡ受容体の輸送ひいては神経膠腫細胞－ニューロンシナプスの輸送を妨げることによって腫瘍細胞の増殖を遅らせる。新規のＯＶは、局所的なシナプスＧｌｕＡ１およびＧｌｕＡ２ノックダウンを達成する効率的な方法でＧｌｕＡ１およびＧｌｕＡ２ノックダウン剤を送達して、神経膠腫におけるロードされた腫瘍溶解性コンストラクトの有効性を増強するように設計されている。
【図面の簡単な説明】
【0015】
本開示の更なる詳細、特徴、および利点は、図に示す例示的な実施形態の以下の説明から明らかになる。
【図1】放射線療法単独対放射線療法＋テモダールの全生存率のカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図2】１９９５年に作製されたＯＶコンストラクトＧ２０７を用いて治療された患者の全生存率のカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図3】DNAtrix社が開発したアデノウイルス腫瘍溶解性試剤が奏効した患者Ａ，Ｂ，Ｃの脳スキャンと、腫瘍サイズの経時的変化（％）を示すグラフと、をともに示す図である。
【図4】固形がんを有する患者におけるＲＰ２腫瘍溶解性ＨＳＶの単剤およびニボルマブとの併用における抗腫瘍活性および応答動態を示す図である。
【図5】ＲＰ－１のコンストラクトの概略図である。
【図6】コンストラクト内に５つの免疫刺激性導入遺伝子を含有するＨＳＶ－１であるＯＮＣＲ－１７７ベースベクターの設計を示す図である。
【図7】図７のａは、対照条件下（矢印、４匹のマウスで５回の独立した実験）対高用量イソフルラン条件下（４匹のマウスで４回の独立した実験）のＧＢ細胞（緑）および脳微小血管（赤）の代表的な時系列を示し、図７のｂは、ＧＢ細胞の浸潤速度（４匹のＳ２４ ＰＤＸマウスにおけるｎ＝２５４の対照細胞対ｎ＝１４３のイソフルラン細胞）を示し、図７のｃおよび図７のｄは、それぞれ非応答性および応答性のＳ２４ ＰＤＸ細胞（ニューロンＣｈＲ２刺激（赤線）；６匹のマウスにおける９回の独立した実験）（０時間後（赤の矢印）および５時間後（緑の矢印）に測定した細胞）の代表的な時系列を示し、図７のｅは、Ｓ２４ ＰＤＸ ＧＢ細胞の浸潤速度（非応答性（ＮＲ）、５匹のマウスでｎ＝１６４の細胞、応答性（Ｒ）、ｎ＝５３のマウス）を示し、図７のｆは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（矢印）とともにＧｌｕ－２Ａ－ＤＮ－ＧＦＰを発現する細胞の神経膠腫浸潤を、ｔｄＴｏｍａｔｏのみを発現する神経膠腫細胞と比較して示した代表的な時系列を示し、図７のｇは、ドミナントネガティブＧｌｕＲ２サブユニットが、悪性神経膠腫の動物モデルにおいて腫瘍浸潤速度を有意に遅らせることを示し、図７のｈは、Ｇｌｕ－２Ａ－ＤＮ－ＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏ（矢印）またはｔｄＴｏｍａｔｏのみを発現するＧＢ細胞を有するＳ２４異種移植片の０日目および１４日目の代表的な画像を示し、図７のｉは、１４日間にわたる細胞密度の変化（５匹のマウスでｎ＝１３の領域）を示し、図７のｊは、対照条件下およびＡＭＰＡＲアンタゴニストであるペランパネルによる治療後の０日目および１４日目の神経膠腫領域を示し、図７のｋは、２つの異なる細胞株Ｓ２４およびＢＧ５における、対照条件下対ペランパネル（ＰＥＲ）条件下での１４日目対０日目の細胞密度を示し、図７のｆおよびｇは、本開示の目的に関連すると考えられる先行技術を示す図である。
【図8】スクロース摂取による多段階ＧｌｕＡ１輸送の誘導を示す電子顕微鏡写真を示し、それによって、細胞内ＧｌｕＡ１輸送の防止がシナプスの強化を防止することを実証する図であり、図８のａでは、ＧｌｕＡ１をＰＥＧ標識し、粒子を５つのシナプス後領域：（１）スパイン内；（２）シナプス外膜または（３）ＰＳＤ（間隙、ＰＳＤ部、ＰＳＤ近傍）に分類し、図８のｂは、水、スクロース／水、スクロースの動物（試験群あたり３匹の動物）から調製した電子顕微鏡写真を示し、図８のｃ～ｆは、スクロースの反復摂取がスパイン内およびＰＳＤ ＧｌｕＡ１を上昇させる一方、急性スクロース摂取はシナプス外膜への急速なＧｌｕＡ１輸送を誘導することを示す（注：図８のｃ～ｅデータは、スパインあたりの粒子数の平均値として提示される）。
【図9】ＡＭＰＡ誘導性ＧｌｕＡ１輸送の遺伝子的遮断による確認を示し、ＣＰＡＲを有するシナプスにはフィードフォワードシナプス強化を誘導するメカニズムがあることを示唆する図である。
【図10】ヒトＧｌｕＲ１／２発現ウイルスの構築および検証を示す図であり、ヒトｇｌｕＲ１－Ｐ２Ａ－ｇｌｕＲ２を発現する腫瘍溶解性ＨＳＶ－１は、ＩＣＰ４７ ＨＳＶ－１プロモーターから導入遺伝子の発現を駆動することによって構築され、ｈＧｌｕｒ１／２を発現するＨＳＶ－１を構築するために、親ウイルスであるガンマ３４．５二重欠失ウイルスの感染性ウイルスＤＮＡを使用し、感染性ウイルスＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ（ＵＬ２６／２７フランキング配列とｇｌｕＲ１／２およびｅＧＦＰ発現導入遺伝子配列とを有する）を同時トランスフェクトしたＵ２０Ｓ細胞のライセートを４日後に採取し、新鮮な単層に感染させ、ｅＧＦＰ発現を使用して組換えプラークを可視化し、１０倍プラーク精製ウイルスプラークの精製ウイルスゲノムＤＮＡからのＰＣＲ（Ａ）は、５２８ｂｐの正しいバンドを示し、イムノブロッティング（Ｂ）は、感染したＳＦ－２９５膠芽腫細胞において発現されたｇｌｕＲ２タンパク質を示す。
【図11】本発明による好ましい生物学的実体物で修飾された野生型ＨＳＶ－１ウイルスを含むベクターの概略図であり、生物学的実体物は、野生型ＨＳＶ－１ウイルスのＩＣＰ３４．５遺伝子を置き換える。
【図13】以下の実験１で使用した生物学的実体物で修飾された野生型ＨＳＶ－１ウイルスを含む本発明の遺伝子マップを示す図である。
【図14】以下の実験１で使用したヒトｇｌｕＲ１／２発現ＨＳＶ－１の細胞傷害作用を視覚的に示す図であり、ＳＦ－２９５膠芽腫細胞を、本発明の野生型またはｇｌｕＲ１／２発現ＨＳＶ－１の１感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、ｈｇｌｕＲ１／２を発現するＨＳＶ－１は、ＳＦ－２９５細胞において広範な細胞傷害効果を引き起こす。
【0016】
好ましい実施形態の説明
上述したように、図１～図９は、様々なモデルおよび生物学的実体物を使用して神経膠腫を治療する先行技術の試みと、本発明に関連するＡＭＰＡ受容体輸送の説明とを示している。当業者であれば、これらの先行技術の試みの詳細および分析を知っている可能性が高いため、ここではそれらのいずれについても詳細な説明は提示しない。これらの先行技術の試みの詳細を知らない可能性がある当業者は、上記の発明の背景で特定された文献を調査することによって、図に記載された研究を容易に検討することができる。
上述したように、図１～図９は、様々なモデルおよび生物学的実体物を使用して神経膠腫を治療する先行技術の試みと、本発明に関連するＡＭＰＡ受容体輸送の説明とを示している。当業者であれば、これらの先行技術の試みの詳細および分析を知っている可能性が高いため、ここではそれらのいずれについても詳細な説明は提示しない。これらの先行技術の試みの詳細を知らない可能性がある当業者は、上記の発明の背景で特定された文献を調査することによって、図に記載された研究を容易に検討することができる。
【0017】
図１０は、ＨＳＶ－１ ＩＣＰ３４．５遺伝子が欠失され、ＧｌｕＲ１およびＧｌｕＲ２ ＡＭＰＡ受容体サブユニットのＣ末端から構成される生物学的実体物で置き換えられている、本発明の組成物を示している。図１０のａは、生物学的実体物がウイルス中でインタクトであることを示している。図１０のｂおよび図１０のｃは、ＡＭＰＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ２のＣ末端が本発明のウイルスによって特異的に発現されることを示している。
【0018】
図１１は、本発明による生物学的実体物で修飾された野生型ＨＳＶ－１ウイルスを含むベクターの概略図を示し、この生物学的実体物は、野生型ＨＳＶ－１ウイルスのＩＣＰ３４．５遺伝子を置き換える。野生型ＨＳＶ－１ウイルスのＩＣＰ３４．５遺伝子は欠失され、野生型ＨＳＶ－１ウイルスのＩＣＰ３４．５プロモーターによって駆動される抗腫瘍導入遺伝子を含む、図１１に従ったコンストラクトで置き換えられる。抗腫瘍導入遺伝子は、２つのＡＭＰＡ受容体サブユニット干渉剤またはＧｌｕＡノックダウン剤を含む。抗腫瘍導入遺伝子は、好ましくは、融合性（fusogenic）タンパク質、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ１２コンストラクトをさらに含む。第１のＡＭＰＡ受容体サブユニット干渉剤は、ＧｌｕＡ１のＣ末端断片を含み、ニューロンシナプスおよび／またはシナプス外膜へのＧｌｕＡ１の輸送を防止するように設計されている。第２のＧｌｕＡノックダウン剤は、ニューロンシナプスおよび／またはシナプス外膜へのＧｌｕＡ２の輸送を防止するように設計された、ＧｌｕＡ２のＣ末端断片を含み得るか、または腫瘍細胞溶解後に隣接細胞のＣＰＡＲシナプス伝達を遮断し得る、ＧｌｕＡ１に対するＮ末端抗体を含み得る。
【0019】
図１２は、本発明の好ましい生物学的実体物の各構成要素およびその一般的および詳細な説明を示している。図１２はまた、好ましいオプションを含む、各構成要素のバリエーションおよびオプションを示している。一般に、ＨＳＶ－１ウイルスが好ましいのは、それについてより多くのことが知られており、その菌株がReplimune社のＲＰ１－３製品で使用されているからである。ＲＰ１－３製品に使用されている菌株は、使用するのに好ましいウイルスである。上で述べたように、新規のＯＶは、ＧｌｕＡ１およびＧｌｕＡ２というタンパク質の遺伝子ノックダウンを少なくとも含有する。第１のＧｌｕＡノックダウン剤は、ＧｌｕＡ１のＣ末端断片を含み、ニューロンシナプスおよび／またはシナプス外膜へのＧｌｕＡ１の輸送を防止するように設計されている。第２のＧｌｕＡノックダウン剤は、ＧｌｕＡ２のＣ末端断片を含み、ニューロンシナプスおよび／またはシナプス外膜へのＧｌｕＡ２の輸送を防止するように設計されている。ニューロン保護については、ＩＣＰ３４．５遺伝子の両コピーの欠失は、ニューロンのような終末分化した細胞でのウイルスの複製を防止するように設計されている。感染性については、ＨＳＶ－１はすでに、オリゴデンドロサイトおよびそれらの前駆体を含む、ＧＢＭ細胞に最も類似した神経系細胞に対する顕著な指向性を示している。ＧＡＬＶ融合性タンパク質を組み込むと、感染性が高まる。好ましくは、２つのチェックポイント阻害剤である、抗ＰＤ－１抗体、好ましくはＰＤ－１ブロッカーをコードする配列（Oncorus社と同様）と、抗ＣＴＬＡ－４抗体、好ましくはＣＴＬＡ－４ブロッカーをコードする配列（Replimune社と同様）とが提供される。最後に、好ましくは、ＩＬ１２サイトカインをコードする配列を組み込んだ免疫刺激剤ＩＬ１２が組み込まれる。
【0020】
図１４は、プレーティングしたＳＦ－２９５ヒト膠芽腫細胞を、ビヒクル対照、野生型ＨＳＶ－１または本発明の生物学的実体物を含有するＨＳＶ－１のベクターのいずれかで処理した効果を視覚的に示している。
【0021】
【0022】
実施例
実験に使用するヒトＧｌｕＲ１／２発現ウイルスの構築および検証を以下のように行った。ヒトｇｌｕＲ１－Ｐ２Ａ－ｇｌｕＲ２を発現する腫瘍溶解性ＨＳＶ－１は、ＩＣＰ４７ ＨＳＶ－１プロモーターから導入遺伝子の発現を駆動することによって構築した（図１３を参照）。Ｇｌｕｒ１／２を発現するＨＳＶ－１を構築するために、親ウイルスであるガンマ３４．５二重欠失ウイルスの感染性ウイルスＤＮＡを使用した。感染性ウイルスＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ（ＵＬ２６／２７フランキング配列とｇｌｕＲ１／２およびｅＧＦＰ発現導入遺伝子配列とを有する）を同時トランスフェクトしたＵ２０Ｓ細胞のライセートを４日後に採取し、新鮮な単層に感染させ、ｅＧＦＰ発現を使用して組換えプラークを可視化した。１０倍プラーク精製ウイルスプラークの精製ウイルスゲノムＤＮＡからのＰＣＲは、５２８ｂｐの正しいバンドを示した。イムノブロッティングは、感染したＳＦ－２９５膠芽腫細胞において発現されたｇｌｕＲ２タンパク質を示した。ＧｌｕＲ－Ｐ２Ａ－ＧｌｕＲ２生物学的実体物全体の核酸配列は次のとおりである：
実験に使用するヒトＧｌｕＲ１／２発現ウイルスの構築および検証を以下のように行った。ヒトｇｌｕＲ１－Ｐ２Ａ－ｇｌｕＲ２を発現する腫瘍溶解性ＨＳＶ－１は、ＩＣＰ４７ ＨＳＶ－１プロモーターから導入遺伝子の発現を駆動することによって構築した（図１３を参照）。Ｇｌｕｒ１／２を発現するＨＳＶ－１を構築するために、親ウイルスであるガンマ３４．５二重欠失ウイルスの感染性ウイルスＤＮＡを使用した。感染性ウイルスＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ（ＵＬ２６／２７フランキング配列とｇｌｕＲ１／２およびｅＧＦＰ発現導入遺伝子配列とを有する）を同時トランスフェクトしたＵ２０Ｓ細胞のライセートを４日後に採取し、新鮮な単層に感染させ、ｅＧＦＰ発現を使用して組換えプラークを可視化した。１０倍プラーク精製ウイルスプラークの精製ウイルスゲノムＤＮＡからのＰＣＲは、５２８ｂｐの正しいバンドを示した。イムノブロッティングは、感染したＳＦ－２９５膠芽腫細胞において発現されたｇｌｕＲ２タンパク質を示した。ＧｌｕＲ－Ｐ２Ａ－ＧｌｕＲ２生物学的実体物全体の核酸配列は次のとおりである：
【化1】
【0023】
実験１
ＳＦ－２９５ヒト膠芽腫細胞を、支持培地として１０％ＦＢＳ添加高グルコースＤＭＥＭを使用してプレーティングした。この実験の期間は２日間であった。実験終了時、ＳＦ－２９５細胞は、非感染のプレーティング細胞と野生型ＨＳＶ－１ウイルスに感染した細胞との両方で大幅に増殖し、両者の間の細胞代謝に事実上差がないことが視覚的に示された（図１３を参照）。一方、本発明の生物学的実体物を含有するＨＳＶ－１のベクターに感染させたプレーティング細胞は、他の２つのプレーティング細胞と比較して細胞代謝の大幅な低下を示している。これらの視覚的結果は、ＩＣＰ３４．５遺伝子を含有する野生型ＨＳＶ－１または野生型ＨＳＶ－１のＩＣＰ３４．５遺伝子を置き換える本発明のＧｌｕＲ１／２を含有するＨＳＶ－１の効果を計算することによって確認され、これらの結果を棒グラフの形で提示した（図１５を参照）。
ＳＦ－２９５ヒト膠芽腫細胞を、支持培地として１０％ＦＢＳ添加高グルコースＤＭＥＭを使用してプレーティングした。この実験の期間は２日間であった。実験終了時、ＳＦ－２９５細胞は、非感染のプレーティング細胞と野生型ＨＳＶ－１ウイルスに感染した細胞との両方で大幅に増殖し、両者の間の細胞代謝に事実上差がないことが視覚的に示された（図１３を参照）。一方、本発明の生物学的実体物を含有するＨＳＶ－１のベクターに感染させたプレーティング細胞は、他の２つのプレーティング細胞と比較して細胞代謝の大幅な低下を示している。これらの視覚的結果は、ＩＣＰ３４．５遺伝子を含有する野生型ＨＳＶ－１または野生型ＨＳＶ－１のＩＣＰ３４．５遺伝子を置き換える本発明のＧｌｕＲ１／２を含有するＨＳＶ－１の効果を計算することによって確認され、これらの結果を棒グラフの形で提示した（図１５を参照）。
【0024】
実験２
ヒトニューロンを、適切な培地を使用して２枚のプレートにプレーティングする。一方のプレートには野生型ＨＳＶ－１ウイルスを加えてヒトニューロンを感染させ、他方のプレートには本発明の生物学的実体物を含有するＨＳＶ－１のベクターを加える。観察は、０、３、１０および２１日目に行う。２１日間が経過した時点では、両プレートにプレーティングされたヒトニューロンの生存率の間に視覚的な差はなかった。このことは、本発明の生物学的実体物が、ヒトニューロンに対して視覚的に検出可能な悪影響を及ぼさないことを示している。
ヒトニューロンを、適切な培地を使用して２枚のプレートにプレーティングする。一方のプレートには野生型ＨＳＶ－１ウイルスを加えてヒトニューロンを感染させ、他方のプレートには本発明の生物学的実体物を含有するＨＳＶ－１のベクターを加える。観察は、０、３、１０および２１日目に行う。２１日間が経過した時点では、両プレートにプレーティングされたヒトニューロンの生存率の間に視覚的な差はなかった。このことは、本発明の生物学的実体物が、ヒトニューロンに対して視覚的に検出可能な悪影響を及ぼさないことを示している。
【0025】
実験３
ラット生後１日目のニューロンを適切な培地で７日間成長させる。７日目に、ＳＦ－２９５ヒト膠芽腫細胞を、適切な培地を使用して１：１、１：２、１：５および１：１０（膠芽腫細胞：ラットニューロン）の比率でニューロンの上にプレーティングする。ＳＦ－２９５細胞の添加後７日目に、共培養物を、ビヒクル対照、野生型ＨＳＶ－１ウイルスまたは本発明の生物学的実体物を含有するＨＳＶ－１ウイルスのいずれかで処理する。感染２日後、本発明の生物学的実体物を含有するウイルスで処理した共培養物では、野生型ウイルスで処理した共培養物と比較して、ＳＦ－２９５の浸潤速度および細胞代謝が有意に減少し、本発明のウイルスで処理した共培養物では、野生型ウイルスと比較して、共焦点顕微鏡で測定した樹状突起スパインの数およびサイズが有意に減少する。
ラット生後１日目のニューロンを適切な培地で７日間成長させる。７日目に、ＳＦ－２９５ヒト膠芽腫細胞を、適切な培地を使用して１：１、１：２、１：５および１：１０（膠芽腫細胞：ラットニューロン）の比率でニューロンの上にプレーティングする。ＳＦ－２９５細胞の添加後７日目に、共培養物を、ビヒクル対照、野生型ＨＳＶ－１ウイルスまたは本発明の生物学的実体物を含有するＨＳＶ－１ウイルスのいずれかで処理する。感染２日後、本発明の生物学的実体物を含有するウイルスで処理した共培養物では、野生型ウイルスで処理した共培養物と比較して、ＳＦ－２９５の浸潤速度および細胞代謝が有意に減少し、本発明のウイルスで処理した共培養物では、野生型ウイルスと比較して、共焦点顕微鏡で測定した樹状突起スパインの数およびサイズが有意に減少する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】