特表 2024-516769 治療用結合分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-17

(54)【発明の名称】治療用結合分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240410BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240410BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240410BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240410BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240410BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20240410BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240410BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61P43/00 111

A61P1/04

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 105

A61P29/00

A61P1/16

G01N33/53 D

G01N33/48 M

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023556501

(86)(22)【出願日】2022-03-17

(85)【翻訳文提出日】2023-11-10

(86)【国際出願番号】 EP2022057029

(87)【国際公開番号】W WO2022195028

(87)【国際公開日】2022-09-22

(31)【優先権主張番号】63/162,603

(32)【優先日】2021-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508098350

【氏名又は名称】メドイミューン・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ

【住所又は居所原語表記】１ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃｒｉｃｋ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｍｐｕｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ２ ０ＡＡ， ＵＮＩＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】ニース，ジョスキン アルノー

(72)【発明者】

【氏名】ソム，アルバート ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】カリウク，ピーター

(72)【発明者】

【氏名】スコフィールド，ダレン ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】ライリー，エイダン

(72)【発明者】

【氏名】ハンティントン，キャサリン ユージェニー シャイラン

(72)【発明者】

【氏名】リース，デイビッド ガレス

(72)【発明者】

【氏名】アービング，ロレイン

(72)【発明者】

【氏名】ロビンソン，マシュー

【テーマコード（参考）】

2G045

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CB01

2G045DA36

2G045FA37

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB36

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ケモカイン受容体ＣＣＲ９に結合する抗体などの結合分子に関する。より具体的には、本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などのＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態の治療、及び本発明の結合分子を使用するＣＣＲ９の検出のための方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＣＲ９に結合し且つＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のセットを有する重鎖可変（ＶＨ）領域並びにＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、
（ａ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むか；
（ｂ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含むか；若しくは
（ｃ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２及び配列番号１５のＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１７のＬＣＤＲ２及び配列番号１８のＬＣＤＲ３を含むか；
又は前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のいずれか１つ以上が、前記配列と比較して１、２又は３個のアミノ酸置換を含む、結合分子。

【請求項2】

前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含み、且つ前記ＶＬ領域配列が、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３、並びに
（ａ）配列番号４；
（ｂ）配列番号１９；
（ｃ）配列番号２０；
（ｄ）配列番号２１；及び
（ｅ）配列番号２２
から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１を含む、請求項１に記載の結合分子。

【請求項3】

（ｉ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号５１、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含み且つ；前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号５２、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｉｉ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号５１、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含み且つ；前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号５３、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｉｉｉ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号５１、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含み且つ；前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号５４、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｉｖ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号５１、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含み；且つ前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号５５、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含むか；又は
（ｖ）前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号５６、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含み且つ；前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号５７、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１（ａ）又は請求項２に記載の結合分子。

【請求項4】

（ｉ）前記結合分子が、請求項１（ｂ）において定義されるとおりのＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号５８、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含み；且つ前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号５９、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含むか；又は
（ｉｉ）前記結合分子が、請求項１（ｃ）において定義されるとおりのＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、前記ＶＨ領域アミノ酸配列が、配列番号６０、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含み；且つ前記ＶＬ領域アミノ酸配列が、配列番号６１、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の結合分子。

【請求項5】

前記結合分子が、ＣＣＬ２５のＣＣＲ９への結合を阻害する、請求項１～３のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項6】

前記結合分子が、抗ＣＣＲ９抗体、又はその抗原結合断片である、請求項１～５のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項7】

前記抗ＣＣＲ９抗体又はその抗原結合断片が、ヒト化、キメラ、又は完全にヒトのものである、請求項６に記載の結合分子。

【請求項8】

（ａ）ＩｇＧ免疫グロブリン若しくはその断片；又は
（ｂ）ＩｇＧ１免疫グロブリン若しくはその断片
である、請求項６又は７に記載の結合分子。

【請求項9】

前記結合分子が、１種以上のＦｃ受容体に結合する能力を保持する免疫グロブリンＦｃドメイン、又はその断片を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項10】

前記免疫グロブリンＦｃドメイン又はその断片が、
（ａ）ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｃ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｄ）対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変が、１種以上のＦｃγ受容体に対する親和性の増大をもたらし；
（ｅ）対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変が、抗体依存性細胞傷害応答の増強をもたらし；且つ／又は
（ｆ）アミノ酸位置２９７で非フコシル化Ｎ結合グリカンを含む、
請求項９に記載の結合分子。

【請求項11】

前記結合分子が、
（ａ）非フコシル化されるか；
（ｂ）アミノ酸位置２９７で非フコシル化されるか；又は
（ｃ）前記結合分子の複数のコピーを含む組成物中に存在し、前記組成物中の前記結合分子の前記コピーの少なくとも５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％が、非フコシル化される、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項12】

前記結合分子が、
（ａ）ヒトＣＣＲ９に結合し；
（ｂ）ヒトＣＣＲ９Ａ及びヒトＣＣＲ９Ｂに結合し；
（ｃ）カニクイザルＣＣＲ９に結合し；且つ／又は
（ｅ）ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１又はＣＸＣＲ２に結合しない、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項13】

前記結合分子が、
（ａ）それが結合するＣＣＲ９発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害を媒介することができ；
（ｂ）それが結合するＣＣＲ９発現リンパ球に対する抗体依存性細胞傷害を媒介することができ；
（ｃ）ＦｃγＲによって結合されてもよく；
（ｄ）ＦｃγＩＩＩａによって結合されてもよく；
（ｅ）免疫エフェクター細胞をＣＣＲ９発現細胞に架橋することができ；
（ｆ）免疫エフェクター細胞をＣＣＲ９発現細胞に架橋することができ且つ前記エフェクター細胞によって抗体依存性細胞傷害を活性化することができ；
（ｇ）ＣＣＬ２５に誘導されるＣＣＲ９受容体内部移行を阻害することができ；
（ｈ）ＣＣＲ９発現Ｔ細胞の腸へのＣＣＬ２５に媒介される遊走を阻害することができ、
（ｉ）免疫エフェクター細胞をＣＣＲ９発現細胞に架橋することができ且つ前記エフェクター細胞によって抗体依存性細胞傷害を活性化することができ、それにより前記ＣＣＲ９発現細胞の溶解を引き起こすことができ；且つ／又は
（ｊ）ＣＣＲ９発現細胞及び免疫エフェクター細胞を含む細胞の集団においてＣＣＲ９発現細胞を枯渇させることができる、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項14】

前記結合分子が、約０．１ｎＭ、任意選択により、０．０９ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でヒトＣＣＲ９に結合することができる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項15】

ＣＣＲ９に結合する結合分子であって、前記結合分子が、ＣＣＲ９への結合に関して請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合分子と競合する、結合分子。

【請求項16】

前記結合分子が、
（ａ）非フコシル化されるか；
（ｂ）アミノ酸位置２９７で非フコシル化されるか；又は
（ｃ）前記結合分子の複数のコピーを含む組成物中に存在し、前記組成物中の前記結合分子の前記コピーの少なくとも５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％が、非フコシル化される、
請求項１５に記載の結合分子。

【請求項17】

前記免疫グロブリンＦｃドメイン又は断片が、
（ａ）ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｃ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｄ）対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変が、１種以上のＦｃγ受容体に対する親和性の増大をもたらし；
（ｅ）対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変が、抗体依存性細胞傷害応答の増強をもたらし；且つ／又は
（ｆ）アミノ酸位置２９７で非フコシル化Ｎ結合グリカンを含む、
請求項１５に記載の結合分子。

【請求項18】

ＣＣＲ９に結合する結合分子であって、前記結合分子が、ＣＣＲ９への結合に関して請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合分子と競合しない、結合分子。

【請求項19】

活性成分として抗ＣＣＲ９抗体を含む治療剤であって、前記抗ＣＣＲ９抗体が、ヒトＣＣＲ９への結合に関してＣＣＬ２５と競合する、治療剤。

【請求項20】

前記抗ＣＣＲ９抗体が、ＣＣＬ２５に媒介されるＣＣＲ９の内部移行を阻害する、請求項１９に記載の治療剤。

【請求項21】

前記抗ＣＣＲ９抗体が、ヒトＣＣＲ９Ａ及びＣＣＲ９Ｂへの結合に関してＣＣＬ２５と競合する、請求項１９又は２０の治療剤。

【請求項22】

前記抗ＣＣＲ９抗体が、ＣＣＲ９におけるエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、配列番号８０を含む配列内に配置される、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項23】

前記抗ＣＣＲ９抗体が、
（ａ）非フコシル化されるか；
（ｂ）アミノ酸位置２９７で非フコシル化されるか；又は
（ｃ）前記結合分子の複数のコピーを含む組成物中に存在し、前記組成物中の前記結合分子の前記コピーの少なくとも５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％が、非フコシル化される、
請求項１９～２１のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項24】

前記免疫グロブリンＦｃドメイン又は断片が、
（ａ）ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｃ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片であり；
（ｄ）対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変が、１種以上のＦｃγ受容体に対する親和性の増大をもたらし；
（ｅ）対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変が、抗体依存性細胞傷害応答の増強をもたらし；且つ／又は
（ｆ）アミノ酸位置２９７で非フコシル化Ｎ結合グリカンを含む、
請求項１９～２１のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項25】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合分子と接触されている試料中においてＣＣＲ９＋細胞の存在量を決定するための請求項１８に記載の結合分子の使用。

【請求項26】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の結合分子によってＣＣＲ９発現細胞の枯渇を評価する方法であって、
（ｉ）前記結合分子を細胞の集団であって、ＣＣＲ９発現細胞及び免疫エフェクター細胞を含む細胞の集団と前記エフェクター細胞により抗体依存性細胞傷害を可能にするのに好適な条件下で接触させること；
（ｉｉ）前記細胞の集団を、ＣＣＲ９に結合し且つＣＣＲ９への結合に関して工程（ｉ）の前記結合分子と競合しない結合分子と接触させること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の前記結合分子により結合される前記細胞の集団におけるＣＣＲ９発現細胞を検出すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において検出されるＣＣＲ９発現細胞の量を、工程（ｉ）において使用される元の細胞集団におけるＣＣＲ９発現細胞の量と比較し、それにより工程（ｉ）において枯渇されたＣＣＲ９発現細胞の量を決定することを含む方法。

【請求項27】

ＣＣＲ９への結合に関して請求項１～１７のいずれか一項に記載の結合分子と競合しない前記結合分子が、配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域アミノ酸配列、並びに配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ領域アミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の結合分子、請求項２４に記載の使用又は請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

請求項１～１７又は１８のいずれか一項に記載の結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項29】

（ａ）プロモーターと作動可能に結合された請求項２７に記載のポリヌクレオチド；又は
（ｂ）請求項１～３のいずれか一項において定義されるとおりのＶＨ領域をコードするポリヌクレオチド、及び請求項１～３のいずれか一項において定義されるとおりのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、１つ以上のプロモーターと作動可能に結合される、ベクター。

【請求項30】

請求項２７に記載のポリヌクレオチド又は請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項31】

宿主細胞において請求項２７に記載のポリヌクレオチド又は請求項２８に記載のベクターを発現させることを含む、請求項１～１７又は１８のいずれか一項に記載の結合分子を生成する方法。

【請求項32】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の結合分子、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項33】

医薬としての使用のための請求項３２に記載の医薬組成物。

【請求項34】

対象において疾患又は病態を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の結合分子、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の治療剤又は請求項３２に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項35】

対象において疾患又は病態を治療する方法であって、前記対象に有効量のＣＣＲ９に結合する結合分子を投与することを含み、
（ａ）前記結合分子が、それが結合するＣＣＲ９発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害を媒介することができ；
（ｂ）ＣＣＲ９への前記結合分子の結合が、ＣＣＲ９の内部移行を誘導せず、且つ／又は
（ｃ）前記結合分子が、ＣＣＲ９、任意選択によりヒトＣＣＲ９、任意選択によりヒトＣＣＲ９Ａ及びＣＣＲ９Ｂに結合するＣＣ２５と競合する、方法。

【請求項36】

前記疾患が、ＣＣＲ９に媒介される疾患であるか、又は前記疾患が、ＣＣＲ９発現細胞によって媒介される、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

前記疾患が、炎症性腸疾患である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記疾患が、クローン病、回腸／回腸結腸のクローン病、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項39】

前記疾患が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、黒色腫、固形腫瘍由来の循環細胞、肝線維症及び急性肝炎からなる群から選択される、請求項３３、３４又は３５に記載の方法。

【請求項40】

試料においてＣＣＲ９ポリペプチドの存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を請求項１～１７又は１８のいずれか一項に記載の結合分子と接触させて、結合分子－抗原複合体をもたらすこと；
（ｂ）前記結合分子－抗原複合体の存在又は非存在を検出すること；
（ｃ）前記結合分子－抗原複合体の存在が、ＣＣＲ９ポリペプチドの存在を確認すること
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ケモカイン受容体ＣＣＲ９に結合する抗体などの結合分子に関する。より具体的には、本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などのＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態の治療、及び本発明の結合分子を使用するＣＣＲ９の検出のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＩＢＤは、小腸炎及び上皮損傷によって病理学的に特徴付けられる胃腸管の慢性障害の一群である。ＩＢＤの２つの型であるクローン病及び潰瘍性大腸炎は、著しい病的状態と関連付けられ、個体の生活の質及びそれらの活動する能力に大きい影響を及ぼす可能性がある［１］。これらの病的状態は、ＩＢＤのための改善された療法の必要性を浮き彫りにしている。

【0003】

ＩＢＤのための治療的介入は、症候性の応答及び介入のその後の耐容能に対処するために適応させられる。既存の療法としては、アミノサリチル酸、コルチコステロイド及び抗体が挙げられる。しかしながら、これらの治療にもかかわらず、外科的介入が、生存期間にクローン病患者の最大３分の２において必要とされることが推定される［２］。クローン病の臨床管理は、ステロイド、免疫抑制剤（チオプリン及びメトトレキセート）、及び／又はアミノサリチル酸で始まるステップアップ・アプローチを歴史的に採用してきたが、後者の有効性に関する証拠は非常に限定的である［３］。患者の大部分において長続きする寛解を達成するライセンス化された療法はない。

【0004】

標的化抗ＣＣＲ９抗体は、癌の治療のための機構として提案されている。卵巣癌、前立腺癌、乳癌及び黒色腫における異常なＣＣＲ９発現は、インビトロでのＣＣＬ２５に応答した侵襲性と相関する。ＣＣＬ２５結合は、細胞の生存及びアポトーシスに対する抵抗性を高める。非特許文献１［４］及び特許文献１は、マウス抗ＣＣＲ９抗体９１Ｒ（マウス抗ヒトＣＣＲ９ ＩｇＧ２ｂ）及び９２Ｒ（マウス抗ヒトＣＣＲ９ ＩｇＧ２ａ）を記載している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１５０７５２６９Ａ１号パンフレット

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｏｍｏｖｉｌｌａ－Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ．２０１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、そのような障害を治療するか又は予防するための改善された医薬の必要性が存在する。本発明は、上記の問題の１つ以上を解決する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、ケモカイン受容体、ＣＣＲ９が、炎症性サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びＩＬ－１７を共発現するＩＢＤを有する患者の結腸及び回腸において高度に発現されることを見出した。本発明者らは、ＣＣＲ９発現細胞に結合し、ＣＣＲ９とその天然のリガンドＣＣＬ２５の間の相互作用を阻害し、ＣＣＬ２５に媒介されるＣＣＲ９内部移行を妨げる結合分子を首尾よく作製した。有利に、結合分子は、例えば、結合するＣＣＲ９発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することによって、結合するＣＣＲ９発現細胞の死滅を誘導することができる。ＣＣＬ２５のＣＣＲ９への結合を阻害し、結合するＣＣＲ９発現細胞の死亡を誘導する結合分子の開発は、ＩＢＤを有する対象のために特に有利である。

【0009】

したがって、本発明は、ＣＣＲ９に結合する結合分子に関する。本発明の結合分子は、好ましくは、ＣＣＲ９に対するＣＣＬ２５の結合を阻害する。本発明の結合分子は、好ましくは、結合するＣＣＲ９発現細胞の死滅を誘導することができる。例えば、結合分子は、結合する細胞に対してＡＤＣＣ応答を媒介することができる可能性がある。本発明の結合分子は、好ましくは、結合するＣＣＲ９発現細胞の遊走を妨げるか又は阻害することができる。例えば、結合分子は、ＣＣＬ２５に応答するＣＣＲ９発現細胞の遊走を妨げる可能性があるか、又は結合分子は、対象の末梢から腸へのＣＣＲ９発現細胞の遊走を妨げることができる可能性がある。

【0010】

一態様では、本発明は、ＣＣＲ９に結合し、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のセットを有する重鎖可変（ＶＨ）領域並びにＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む結合分子を提供し、（ａ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含み、且つＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号４のＬＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＬＶＨＸ_１ＮＸ_２ＮＴＹＬＨ、Ｘ_１及びＸ_２は任意のアミノ酸である）、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むか、（ｂ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含み、且つＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含むか；又は（ｃ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２及び配列番号１５のＨＣＤＲ３を含み、且つＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１７のＬＣＤＲ２及び配列番号１８のＬＣＤＲ３を含むか、又は前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のいずれか１つ以上は、前記配列と比較して１、２又は３個のアミノ酸置換を含む。

【0011】

本発明の結合分子は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域アミノ酸配列、並びに配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３、並びに配列番号４、配列番号１９（ＲＳＳＱＳＬＶＨＸ_１ＮＸ_２ＮＴＹＬＨ、配列番号１９のＸ_１は、Ｐ又はＳであり且つ配列番号１９のＸ_２は、Ｒ、Ｔ又はＧである）、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１を含むＶＬ領域アミノ酸配列を含み得る。

【0012】

本発明の結合分子は、好ましくは、１種以上のＦｃ受容体に結合する能力を保持する免疫グロブリンＦｃドメイン、又はその断片を含む。例えば、結合分子は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片を含み得る。本発明の結合分子は、好ましくは、非フコシル化される。例えば、結合分子は、アミノ酸位置２９７で非フコシル化され得る。本発明の結合分子は、前記結合分子の複数のコピーを含む組成物中に存在してもよく、組成物中の結合分子のコピーの少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％は、非フコシル化される。

【0013】

別の態様では、本発明は、ＣＣＲ９に結合する結合分子を提供し、結合分子は、ＣＣＲ９への結合に関して本発明の別の結合分子と競合せず、例えば、ＣＣＲ９への結合に関して上記のとおりの結合分子と競合せず、例えば、ＣＣＲ９への結合に関して療法における使用のための本明細書に記載されるとおりの結合分子と競合しない。この態様の結合分子は、本発明の結合分子と接触されている試料中のＣＣＲ９＋細胞の存在量を決定するために使用され得る。

【0014】

同様に、本発明は、本発明の結合分子によるＣＣＲ９発現細胞の枯渇を評価する方法であって、（ｉ）前記結合分子を、エフェクター細胞による抗体依存性細胞傷害を可能にするのに好適な条件下で細胞の集団（細胞の集団は、ＣＣＲ９発現細胞及び免疫エフェクター細胞を含む）と接触させること；（ｉｉ）前記細胞の集団を、ＣＣＲ９に結合し、且つＣＣＲ９への結合に関して工程（ｉ）の結合分子と競合しない結合分子と接触させること；（ｉｉｉ）（ｉｉ）の結合分子によって結合される細胞の集団においてＣＣＲ９発現細胞を検出すること；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において検出されるＣＣＲ９発現細胞の量を、工程（ｉ）において使用される元の細胞集団におけるＣＣＲ９発現細胞の量と比較し、それにより工程（ｉ）において枯渇されたＣＣＲ９発現細胞の量を決定することを含む方法を提供する。

【0015】

本発明はまた、本発明のいずれかの結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、プロモーターと作動可能に結合された本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。また、本発明の結合分子のＶＨ領域をコードするポリヌクレオチド、及び本発明の結合分子のＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供され、前記ポリヌクレオチドは、１つ以上のプロモーターと作動可能に結合される。

【0016】

本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。また、本発明の結合分子を生成する方法であって、宿主細胞において本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを発現することを含む方法も提供される。

【0017】

本発明は、本発明の結合分子、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

【0018】

本発明はまた、療法における使用のための本発明の結合分子など、医療において本発明の結合分子を使用することに関する。本発明は、有効量の本発明の結合分子、又は本発明の組成物を対象に投与することを含む方法によって、対象においてＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療することに関する。本発明はまた、ＣＣＲ９に結合する有効量の結合分子を対象に投与することを含む方法によって、対象においてＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療することに関し、前記結合分子は、（ｉ）ＣＣＲ９に対するＣＣＬ２５の結合を阻害することができ、且つ（ｉｉ）それが結合するＣＣＲ９発現細胞に対して抗体依存性細胞傷害を媒介することができる。

【0019】

本明細書に記載されるとおりの結合分子はまた、ＣＣＲ９を検出するために使用され得る。例えば、本発明は、試料中のＣＣＲ９ポリペプチドの存在を検出するための方法であって、（ａ）試料を、本発明のいずれかの結合分子又は本明細書に記載されるとおりの結合分子などのＣＣＲ９に結合する結合分子と接触させて、結合分子－抗原複合体をもたらすこと；（ｂ）前記結合分子－抗原複合体の存在又は非存在を検出すること；（ｃ）結合分子－抗原複合体の存在がＣＣＲ９ポリペプチドの存在を確認することを含む方法を提供する。

【0020】

本発明は、改善された抗ＣＣＲ９抗体及び炎症性腸疾患の治療におけるその使用に関する。本発明は、特に、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）に特異的に結合するヒト化非フコシル化モノクローナル抗体に関する。そのＦｃ受容体の機能性を介して、ＣＣＲ９受容体に対する抗体の結合は、ＣＣＲ９発現細胞集団の枯渇をもたらすＡＤＣＣ応答を惹起する。本発明の抗体は、ヒト化され、ＣＤＲ最適化される。抗体は、効力の消失を伴わずに非フコシル化される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】様々な細胞型におけるＣＣＲ９発現。図１Ａ：カニクイザル及びヒト細胞血液、腸間膜リンパ節（カニクイザルのみ）、結腸、回腸、及び胸腺由来のＣＤ４＋細胞におけるＣＣＲ９の発現；図１Ｂ：健康な患者及びＩＢＤ患者の回腸（左）及び結腸（右）におけるＢ細胞中のＣＣＲ９の発現；図１Ｃ：健康な患者又はＩＢＤ患者の結腸又は回腸由来のＴエフェクター細胞及びＴｒｅｇにおけるＣＣＲ９の発現。

【図2】ＣＤ４＋Ｔ細胞における炎症性サイトカインとＣＣＲ９の結合。図２Ａ： ＣＣＲ９^－及びＣＣＲ９^＋細胞におけるＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、及びＩＬ－１７発現；図２Ｂ：ＣＤ４＋ＣＣＤ９－細胞とＣＤ４＋ＣＣＲ９＋細胞の間での図２Ａにおいて評価されたサイトカインの発現レベルの倍率変化。

【図3】９種の抗ＣＣＲ９抗体の可変領域のアライメントされたアミノ酸配列図３Ａ：ＶＨ領域；図３Ｂ：ＶＬ領域。ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）の位置は、下線で示される。フレームワーク（ＦＷ）領域の位置もまた示される。

【図4】アライメントされた抗体ＡＢ１０２０２４３のＶＨ及びＶＬ領域、当該抗体のヒト化形態（ＡＢ１０２０２４３－ｆｇｌ）、並びに抗体の２つのＣＤＲ最適化形態（２４３ＬＯ０３２６及び２４３ＬＯ０３３１）

【図5】ＣＣＲ９を発現するか又は発現しない細胞に対する抗ＣＣＲ９抗体の結合図５Ａ：Ｍｏｌｔ ４細胞株に対する結合；図５Ｂ：Ｍｏｌｔ ４及びジャーカット細胞株に対する結合

【図6】ＨＥＫ細胞におけるＣＣＲ９の異なる形態に対するＡＢ１０２０２４３の結合対照として、結合は、ＣＣＲ９でトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞（親ＨＥＫ）において評価され、続いて結合はまた、ヒトＣＣＲ９Ａを過剰発現するＨＥＫ細胞（Ｈｕ Ａ ＨＥＫ）、ヒトＣＣＲ９Ｂを過剰発現するＨＥＫ細胞（Ｈｕ Ｂ ＨＥＫ）、カニクイザルＣＣＲ９を過剰発現するＨＥＫ細胞（Ｃｙｎｏ ＨＥＫ）、マウスＣＣＲ９を過剰発現するＨＥＫ細胞（マウスＨＥＫ）及びラットＣＣＲ９を過剰発現するＨＥＫ細胞（ラットＨＥＫ）においても評価された。

【図7】ＣＣＲ９Ａを発現するＨＥＫ細胞（上）又はＭｏｌｔ ４細胞（下）とプレインキュベートされた非フコシル化抗ＣＣＲ９抗体によるＮＫ細胞の活性化。

【図8】ＣＣＲ９＋ＣＤ４＋ＰＢＭＣの数に対する抗ＣＣＲ９抗体による治療の効果。

【図9】キメラ抗体ＡＢ１０２０２４３及びそのヒト化バージョンの様々なリガンドへの結合の比較。図９Ａ：ヒトＣＣＲ９Ｂ；図９Ｂ：カニクイザルＣＣＲ９；図９Ｂ：ＣＸＣＲ１；図９Ｄ：ＣＸＣＲ２；図９Ｅ：ＣＣＲ５；図９Ｆ：ＣＣＲ８；図９Ｇ：ＣＣＲ９でトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞。

【図10】ＡＢ１０２０２４３抗体とそのヒト化バージョンの比較図１０Ａ：Ｍｏｌｔ ４細胞株への結合後のＮＫ細胞活性化；図１０Ｂ：ヒト化及びキメラＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃ抗体の動力学的特性。

【図11】ＣＣＲ９への結合に関してＣＣＬ２５と競合する抗ＣＣＲ９抗体の能力。

【図12】リガンドへの２４３ＬＯ０３２６及びＡＢ１０２０２４３の結合図１２Ａ：ヒトＣＣＲ９Ａ；図１２Ｂ：ヒトＣＣＲ９Ｂ；図１２Ｃ：カニクイザルＣＣＲ９Ａ；図１２Ｄ：ＣＣＲ５；図１２Ｅ：ＣＣＲ８；図１２Ｆ：ＣＸＣＲ１；及び図１２Ｆ：ＣＸＣＲ２。

【図13】経時的な細胞表面で結合された抗体ＡＢ１０２０２４３又は抗体２４３ＬＯ０３２６の量経時的な細胞表面で結合された抗体ＡＢ１０２０２４３又は抗体２４３ＬＯ０３２６の量（図１３Ａ）並びに経時的な細胞表面でのＣＣＲ９受容体レベルに対する抗体又はＣＣＬ２５治療の効果（図１３Ｂ）。

【図14】Ｍｏｌｔ ４細胞を死滅させる際の抗ＣＣＲ９抗体の効果図１４Ａ：ＰＢＭＣ及びジャーカット細胞（図１４Ｂ）；並びにヒト又はカニクイザルＰＢＭＣ（図１４Ｃ）。

【図15】効力に対するフコシル化の影響図１５Ｂ：ＡＤＣＣに対する非フコシル化の効果。図１５Ａ：フコシル化添加試験における非フコシル化種に対するフコシル化種のＡＤＣＣ活性。ＲＰ：相対的な効力。

【図16】ＣＣＲ９＋Ｔ細胞の標的化されたインビボでの枯渇図１６Ａ：カニクイザルの血液中のＣＣＲ９＋メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の数に対する２４３ＬＯ０３２６の静脈内注射の効果。図１６Ｂ：高用量及び低用量の２４３ＬＯ０３２６は、２日以内にカニクイザルの末梢血液中のＣＤＲ４＋ＣＣＲ９＋細胞を減少させる。図１６Ｃ：高用量及び低用量の２４３ＬＯ０３２６は、ＦＡＣＳによって１５日目に測定されるとおり、カニクイザルの回腸中のＣＤＲ４＋ＣＣＲ９＋細胞を減少させる。図１６Ｄ：高用量及び低用量の２４３ＬＯ０３２６は、ＩＨＣによって１５日目に測定されるとおり、カニクイザルの腸粘膜中のＣＤＲ４＋ＣＣＲ９＋細胞を減少させる。

【図17】ＣＣＲ９＋腸リンパ球の選択的枯渇

【図18】ＩＢＤ患者から採取されたヒト腸外植片におけるＩＢＤマーカーに対する２４３ＬＯ０３２６の効果。 図１８Ａ：ＣＣＲ９レベル；図１８Ｂ：ＩＬ－６レベル；図１８Ｃ：ＧＭ－ＣＳＦレベル；図１８Ｄ：ＩＬ－２２レベル。

【図19】ＣＣＲ９内部移行の遮断２４３ＬＯ０３２６は、ＣＣＬ２５に誘導されるＣＣＲ９の内部移行を阻害した。

【図20】ＣＣＲ９Ａ及びＣＣＲ９Ｂアライメント

【発明を実施するための形態】

【0022】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同様の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

【0023】

本開示は、本明細書中で開示される例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書中に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において使用することができる。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。別段示されない限り、それぞれ任意の核酸配列は、５’から３’方向に左から右に記述され；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に記述される。

【0024】

本明細書中で提供される見出しは、本開示の種々の態様又は実施形態を限定するものではない。

【0025】

本明細書中では、アミノ酸は、アミノ酸の名称、３文字の略称、又は１文字の略称を用いて言及される。「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で互換的に使用される。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基に関する従来の１文字及び３文字のコードが使用され得る。ＩＵＰＡＣＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるようなアミノ酸に対する３文字コード。遺伝暗号の縮重に起因して、ポリペプチドは２つ以上のヌクレオチド配列によりコードされ得ることも理解されたい。

【0026】

用語の他の定義は、本明細書全体を通じて現れ得る。例示的な実施形態をより詳細に説明する前に、本開示は、説明される特定の実施形態に限定されず、したがって変動し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ規定されることから、本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないこともまた理解されたい。

【0027】

値の範囲が与えられる場合、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間の、下限値の１０分の１の単位までの各介在値もまた、具体的に開示されると理解される。記載された範囲内の記載されたいずれかの値又は介在値と、その記載された範囲内の記載された他のいずれかの値又は介在値との間の、より小さな範囲のそれぞれは、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、独立してその範囲に含まれても又は除外されてもよく、また、記載された範囲におけるいずれかの具体的に除外された限界値に従って、より小さな範囲にいずれかの限界値が含まれるか、どちらも含まれないか、又は両方とも含まれるそれぞれの範囲もまた、本開示内に包含される。記載された範囲が一方又は両方の限界値を含む場合、含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。

【0028】

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上別途明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、複数のそのような薬剤を含み、「薬剤（ｔｈｅ ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の薬剤及び当業者に知られるその均等物などへの言及を含む。

【0029】

「約」は、一般的に、測定法の性質又は精度を考慮すれば、測定される数量について許容される程度の誤差を意味してもよい。誤差の例示的な程度は、与えられた値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。好ましくは、「約」という用語は、本明細書では、使用されている数の数値の±（±）５％、好ましくは±４％、±３％、±２％、±１％、±０．５％、±０．１％として理解されるものとする。

【0030】

１つ以上の特徴を「含む」として本明細書に記載される実施形態はまた、そのような特徴「からなる」及び／又はそのような特徴「から本質的になる」対応する実施形態の開示とみなされ得る。

【0031】

用語「薬学的に許容される」は、本明細書で使用する場合、動物、より特定するとヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって認可されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に列記されていることを意味する。

【0032】

濃度、量、容量、パーセンテージ、及び他の数値は、範囲形式で本明細書において示されてもよい。そのような範囲形式は、単に便宜上及び簡潔さのために使用され、範囲の限界として明示的に列挙される数値を含むだけでなく、あたかもそれぞれの数値及び部分範囲が明示的に列挙されているかのように、その範囲内に包含される個々の数値又は部分範囲を全て含むと柔軟に解釈されるべきであることも理解されるべきである。

【0033】

用語「エピトープ」は、本発明の結合分子に結合可能な（例えばそれにより結合されている）標的タンパク質領域（例えば、ポリペプチド）を指す。

【0034】

「結合親和性」は一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば抗原）間の、非共有結合性の相互作用の全体の強度を指す。特に断りのない限り、本明細書の用法では、「結合親和性」は、結合対構成員（例えば抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する、固有結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、本明細書中に記載されるものを含む、当技術分野で知られる一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は一般に、抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向がある一方で、高親和性抗体は一般に、より迅速に抗原に結合し、結合状態をより長く維持する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法は当技術分野で知られており、本発明の目的のためにそのいずれかが使用され得る。

【0035】

結合分子の力価は、ＩＣ５０値として表され得る。ＩＣ５０は、結合分子の阻害濃度中央値である。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的反応をその最大値の５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は、当技術分野で知られるいくつもの手段によって計算され得る。

【0036】

結合分子の力価は、ＥＣ５０値として表され得る。機能アッセイにおいて、ＥＣ５０は、ベースラインと指定曝露時間後の最大値との間の反応中央値を誘導する濃度である。ＥＣ５０は、当技術分野で知られるいくつもの手段によって計算され得る。

【0037】

５．１ 結合分子
本発明は、ＣＣＲ９に結合する結合分子に関する。ケモカイン受容体９、ＣＣＲ９（ＣＤｗ１９９及びＧＰＲ－９－６としても知られる）は、ベータケモカイン受容体ファミリーのメンバーである。ＣＣＲ９は、Ｎ末端細胞外ドメイン（Ｎｔ）、７個の膜貫通ドメイン、３個の細胞内ドメイン、３個の細胞外ドメイン及び細胞内Ｃ末端ドメイン（Ｃｔ）に対応する１５個のドメインに構築される。ヒトにおいて、ＣＣＲ９は、２種類のアイソフォームであるＣＣＲ９Ａ及びＣＣＲ９Ｂにおいて存在する。アイソフォームＡは、追加の１２個のＮ末端アミノ酸を有し、アイソフォームＢと比較してリガンドＣＣＬ２５に対してより高い親和性を有する。アイソフォームＡ及びＢは、１０：１の比で共発現されると報告されている。以前に記載された抗ＣＣＲ９抗体９１Ｒ及び９２ＲはアイソフォームＣＣＲ９Ａのみに結合し、ＣＣＲ９Ｂに結合しない［４］。

【0038】

理論に束縛されるものではないが、ＣＣＲ９陰性ＣＤ４ Ｔリンパ球と比較して腸においてより高い割合のＣＣＲ９陽性ＣＤ４ Ｔリンパ球が炎症性サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びＩＬ－１７を共発現するという本発明者らの観察は、ＣＣＲ９がＩＢＤの病理発生に寄与するＣＤ４ Ｔリンパ球を同定することができることを示唆する。

【0039】

ＣＣＲ９のＲＮＡ、ＤＮＡ及びアミノ酸配列は当業者に知られており、多くのデータベース、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及びＵｎｉＰｒｏｔのデータベースで見出され得る。ＵｎｉＰｒｏｔで見出されるこれらの配列の例は、ヒトＣＣＲ９Ａに関してＰ５１６８６－１及びヒトＣＣＲ９Ｂに関してＰ５１６８６－２；カニクイザルＣＣＲ９に関してＱ０Ｈ７４１；マウスＣＣＲ９に関してＱ９ＷＵＴ７；及びラットＣＣＲ９に関してＱ８ＣＨ３３にある。

【0040】

いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトＣＣＲ９に結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、ヒトＣＣＲ９Ａ及び／又はヒトＣＣＲ９Ｂに結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、ヒトＣＣＲ９Ａに結合し、且つヒトＣＣＲ９Ｂに結合する。

【0041】

いくつかの実施形態では、結合分子は、非ヒト霊長類などの非ヒト哺乳動物種由来のＣＣＲ９に結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、カニクイザルＣＣＲ９に結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、ヒト及びカニクイザルＣＣＲ９に結合し、例えば、ヒトＣＣＲ９Ａ及びヒトＣＣＲ９Ｂ並びにカニクイザルＣＣＲ９に結合する。

【0042】

いくつかの実施形態では、結合分子は、マウス及び／又はラットＣＣＲ９に結合しない。いくつかの実施形態では、結合分子は、ヒト及びカニクイザルＣＣＲ９、例えば、ヒトＣＣＲ９Ａ及びヒトＣＣＲ９Ｂ並びにカニクイザルＣＣＲ９に結合するが、マウス又はラットＣＣＲ９に結合しない。

【0043】

いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ９に選択的に（また本明細書で特異的にと互換的に参照される）結合する。選択的結合によって、結合分子のＣＤＲはともにＣＣＲ９に結合し、いずれの他の分子に対しても著しい交差反応性を有しないことが理解されるであろう。特に、ＣＣＲ９に選択的に結合する結合分子は、いずれの他のサイトカイン受容体に対しても著しい交差反応性を有しない場合がある。ＣＣＲ９に選択的に結合する結合分子は、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２のいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ又は４つ全てに対して著しい交差反応性を有しない場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１又はＣＸＣＲ２に結合しない。

【0044】

いくつかの実施形態では、ヒトＣＣＲ９Ａ及び／又はヒトＣＣＲ９ＢなどのヒトＣＣＲ９に選択的に結合する結合分子は、マウス及び／又はラットＣＣＲ９などの別の種に由来するＣＣＲ９と著しい交差反応性を有しない場合がある。いくつかの実施形態では、ヒトＣＣＲ９に選択的に結合する結合分子は、カニクイザルＣＣＲ９などの密接に関係するＣＣＲ９分子と交差反応性を有する場合があるが、マウス及び／又はラットＣＣＲ９などのより遠縁のＣＣＲ９と著しい交差反応性を有しない場合がある。

【0045】

交差反応性は、任意の好適な方法によって評価され得る。例えば、結合は、目的の受容体を発現する過剰発現細胞株への結合分子の結合をアッセイすることによって測定され得る。結合はまた、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（分析物として組み換えＣＣＲ９及びリガンドとして結合分子、又はその逆を使用する）、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステム、又は当技術分野で知られる他の結合アッセイによって測定され得る。非限定的な例として、結合分子のＣＣＲ９以外の分子との交差反応性は、結合分子がＣＣＲ９に結合する強度の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％で他の分子に結合する場合、著しいとみなされ得る。ＣＣＲ９に選択的に結合する結合分子は、それがＣＣＲ９に結合する強度の９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満でＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１、及びＣＸＣＲ２のいずれか１つ、２つ、３つ又は４つ全てなどの異なるサイトカイン受容体などの別の分子に結合する場合がある。好ましくは、結合分子は、それがＣＣＲ９に結合する強度の２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満、２％未満又は１％未満で他の分子に結合する。本明細書で使用する場合、ＣＣＲ９は、好ましくは、ヒトＣＣＲ９Ａ及び／又はヒトＣＣＲ９ＢなどのヒトＣＣＲ９などの天然に存在するＣＣＲ９である。

【0046】

いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ９を発現する細胞に結合する。結合分子は、細胞の細胞膜中に存在するＣＣＲ９受容体に結合し得る。細胞は、ＣＣＲ９を天然に発現する細胞であり得るか、又は細胞は、ＣＣＲ９の発現を可能にする条件下でＣＣＲ９をコードする核酸を導入することなどによって、ＣＣＲ９を発現するように操作され得る。細胞は、操作された細胞株が操作されていない細胞に対応するものより高いレベルのＣＣＲ９を発現するように、ＣＣＲ９を過剰発現するように操作され得る。細胞は、ヒトＣＣＲ９Ａ又はヒトＣＣＲ９Ｂを発現し得る。

【0047】

細胞は、ヒトＣＣＲ９Ａ及び／又はヒトＣＣＲ９ＢなどのＣＣＲ９を発現するように操作されているＨＥＫ細胞株であり得る。

【0048】

Ｍｏｌｔ ４細胞株は、高レベルでＣＣＲ９を天然に発現する急性リンパ芽球性白血病由来のヒトＴリンパ球細胞株である。Ｍｏｌｔ ４細胞株は、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５８２から得ることができる。いくつかの実施形態では、結合分子は、Ｍｏｌｔ ４細胞に結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、前記Ｍｏｌｔ ４細胞の表面上のＣＣＲ９又は前記Ｍｏｌｔ ４細胞の細胞膜中に存在するＣＣＲ９に結合することによってＭｏｌｔ ４細胞に結合する。

【0049】

いくつかの実施形態では、結合分子は、ジャーカット細胞などのＣＣＲ９を発現しない細胞に結合しない。ジャーカット細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ、クローンＥ６．１としてＡＴＣＣから得ることができる。いくつかの実施形態では、結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．１ｎＭ、又は≦１０ｐＭの解離定数（ＫＤ）でＣＣＲ９（例えば、ヒトＣＣＲ９）に結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、約０．０１ｎＭと約０．４５ｎＭの間、約０．０２５ｎＭと約０．２５ｎＭの間、又は約０．０５ｎＭと約０．１ｎＭの間のＫＤでＣＣＲ９（例えば、Ｍｏｌｔ ４細胞上に存在するＣＣＲ９）に結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、約０．０９ｎＭのＫＤでＣＣＲ９（例えば、Ｍｏｌｔ ４細胞上に存在するＣＣＲ９）に結合する。

【0050】

いくつかの実施形態では、結合分子は、約２ｎＭと約５ｎＭの間、約２．５ｎＭと約４ｎＭの間、又は約３ｎＭと約３．５ｎＭの間のＫＤでＣＣＲ９（例えば、Ｍｏｌｔ ４細胞上に存在するＣＣＲ９）に結合する。いくつかの実施形態では、結合分子は、約３．４ｎＭのＫＤでＣＣＲ９（例えば、Ｍｏｌｔ ４細胞上に存在するＣＣＲ９）に結合する。

【0051】

ＫＤ測定（結合親和性）は、当技術分野で知られるいずれかの好適なアッセイによって実行され得る。適切なアッセイは、Ｌｉｇａｎｄ Ｔｒａｃｅｒシステム、ＫｉｎＥｘＡシステム（例えば、ＫｉｎＥｘＡ ３１００、ＫｉｎＥｘＡ ３２００又はＫｉｎＥｘＡ ４０００）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｄａｈｏ）、又はＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍを介して実施可能な親和性アッセイを含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ９アンタゴニストである。例えば、結合分子は、ＣＣＲ９の正常な機能を妨げ得るか又は阻害し得る。例えば、結合分子は、細胞上に存在するＣＣＲ９を弱めることによってＣＣＲ９発現細胞の遊走を妨げ得るか又は阻害し得る。

【0053】

いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ９に対するリガンドの結合を阻害する。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ９に結合し、ＣＣＲ９分子に対するリガンドの結合を遮断するか又は阻害する。これは、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で知られる一般的な方法によって評価され得る。

【0054】

結合分子は、ＣＣＲ９の競合的阻害剤であり得る。例えば、結合分子は、ＣＣＲ９への結合に関してＣＣＲ９のリガンドと競合し得る。競合的結合は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で知られる一般的な方法によって評価され得る。

【0055】

いくつかの実施形態では、ＣＣＲ９のリガンドは、ＣＣＬ２５である。ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫとしても知られる）は、ＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインである。ＣＣＬ２５のＲＮＡ、ＤＮＡ及びアミノ酸配列は当業者に知られており、多くのデータベース、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及びＵｎｉＰｒｏｔのデータベースで見出され得る。ＵｎｉＰｒｏｔで見出されるこれらの配列の例は、ヒトＣＣＬ２５に関してＯ１５４４４；マウスＣＣＬ２５に関してＯ３５９０３；ラットＣＣＬ２５に関してＱ３２ＰＸ４並びにカニクイザルＣＣＬ２５に関してＡ０Ａ２Ｋ５ＴＳＤ９及びＡ０Ａ２Ｋ５ＴＳＣ０にある。

【0056】

いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＬ２５のＣＣＲ９への結合を遮断するか又は阻害する。例えば、ＣＣＬ２５は、本発明の結合分子の存在下でＣＣＲ９に対する低減した結合を有し得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、細胞の表面又は膜上に存在するＣＣＲ９に結合することができ、且つ細胞上のＣＣＲ９に対するＣＣＬ２５の結合を阻害することができる。

【0057】

いくつかの実施形態では、結合分子は、それが結合するＣＣＲ９発現細胞の遊走を妨げることができるか又は阻害することができる。例えば、本発明の結合分子によって結合される細胞は、本発明の結合分子によって結合されない細胞より低い効率で刺激に応答して遊走し得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＬ２５に応答するＣＣＲ９発現細胞の遊走を妨げるか又は阻害する。いくつかの実施形態では、結合分子は、対象の末梢から腸へのＣＣＲ９発現細胞の遊走を妨げることができるか又は阻害することができる。

【0058】

いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、それが結合するＣＣＲ９発現細胞の死滅を誘導することができる。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、それが結合するＣＣＲ９発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することができる。いくつかの実施形態では、結合分子は、それが結合するＣＣＲ９発現リンパ球に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することができる。本明細書で使用する場合、「抗体依存性細胞傷害を媒介する」又は「ＡＤＣＣを媒介する」は、結合分子がＡＤＣＣを誘導することができることを意味する。

【0059】

ＡＤＣＣは、細胞に媒介される免疫防御の機構であり、それにより免疫エフェクター細胞を活性化して、膜表面抗原が結合分子によって結合された標的細胞を溶解させる。そのような免疫エフェクター細胞の例としては、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、好中球及び好酸球が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、結合分子は、そのような免疫エフェクター細胞の活性化を誘導することができる。例えば、本発明の結合分子は、結合分子がＣＣＲ９発現細胞に結合するとき、そのような免疫エフェクター細胞の活性化を誘導することができる可能性がある。

【0060】

いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＣＲ９発現細胞及び免疫エフェクター細胞を含む細胞の集団においてＣＣＲ９発現細胞を枯渇させることができる。

【0061】

結合するＣＣＲ９発現細胞の死を誘導するか、その細胞を枯渇させるか、又はその細胞に対するＡＤＣＣを媒介する結合分子の能力は、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して決定することができる。例えば、本発明の結合分子は、ＰＢＭＣとインキュベートされ、インキュベーション期間の最後に残存するＣＤ４＋ＣＣＲ９＋細胞のパーセンテージが、非競合ＣＣＲ９結合分子を使用して決定され得る。結合分子の濃度の変化は、結合分子の濃度依存的死滅作用を計算するために使用され得る。これから、結合分子のＥＣ５０が計算され得る。本明細書で使用する場合、ＥＣ５０は、ＣＤ４＋ＣＣＲ９＋細胞に対する本発明の結合分子の結合後のＰＢＭＣによるＣＤ４＋ＣＣＲ９＋細胞の死滅に基づいて計算され得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、本発明の結合分子のＥＣ５０（例えば、本明細書に記載されるとおりに測定される）は、１００ｎＭ未満、例えば、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は５ｎＭ未満である。ＥＣ５０は、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、又は２５０ｐＭ未満であり得る。ＥＣ５０は、約２ｐＭ～約２００ｐＭ、例えば、約３．５ｐＭ～約２００ｐＭであり得る。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は、約１ｐＭ～約５ｎＭ、例えば、約４ｐＭ～約３ｎＭである。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は、約２ｎＭ～約３ｎＭ、例えば、約２．５ｎＭ～約３ｎＭ、例えば、約２．６ｎＭである。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は、約０．２５ｎＭ～約２．５ｎＭ、例えば、約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、例えば、約０．５ｎＭである。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は、約５０ｐＭ～約２５０ｐＭ、例えば、約１５０ｐＭ～約２５０ｐＭ、例えば、約２００ｐＭである。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は、約３．５ｐＭ～約５０ｐＭ、例えば、約３．５ｐＭ～約２５ｐＭである。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は、約３．５ｐＭ～約５ｐＭ、又は約４ｐＭ～約１０ｐＭである。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は、約６ｐＭ～約６０ｐＭ、例えば、約２５ｐＭ～約６０ｐＭ、好ましくは、約２５ｐＭ～約３５ｐＭ、例えば、約３０ｐＭである。

【0063】

いくつかの実施形態では、結合分子がヒトＣＣＲ９に結合するときのＥＣ５０は、約３．５ｐＭ～約１０ｐＭ、例えば、約４ｐＭ～約５ｐＭである。いくつかの実施形態では、結合分子がカニクイザルＣＣＲ９に結合するときのＥＣ５０は、約６ｐＭ～約６０ｐＭ、例えば、約２５ｐＭ～約６０ｐＭ、好ましくは、約２５ｐＭ～約３５ｐＭ、例えば、約３０ｐＭである。

【0064】

ＡＤＣＣを惹起するために、結合分子は、免疫エフェクター細胞をＣＣＲ９発現細胞に架橋することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、免疫エフェクター細胞をＣＣＲ９発現細胞に架橋することができる。例えば、結合分子は、免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合することによって免疫エフェクター細胞をＣＣＲ９発現細胞に架橋することができる可能性がある。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エータ受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、異なる抗体クラスに特異的ないくつかのＦｃ受容体が存在する。したがって、いくつかの実施形態では、結合分子は、Ｆｃ受容体に結合することができる。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂから選択される受容体などのＦｃγＲに結合することができる。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＦｃγＲＩＩＩａに結合することができる。いくつかの実施形態では、結合分子は、免疫エフェクター細胞上に存在するＦｃ受容体に結合することができる。

【0065】

結合分子は、結合分子中に存在するＦｃドメインを介して免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体によって結合され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、上で定義されるとおりのＦｃ受容体などのＦｃ受容体に結合することができる領域を含む。いくつかの実施形態では、結合分子は、免疫グロブリンＦｃドメイン、又は上で定義されるとおりの１種以上のＦｃ受容体などの１種以上のＦｃ受容体に結合する能力を保持するその断片を含む。本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃドメイン」は、抗体のヒンジ領域中で始まり抗体のＣ末端で終わる単一の免疫グロブリン重鎖の一部を指す。したがって、完全なＦｃドメインは、ヒンジ（例えば、上部、中間、及び／又は下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含み得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、Ｆｃドメインのホモ二量体を含む。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ９に結合する領域を含み、そのような免疫グロブリンＦｃドメイン又はその断片をさらに含む。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＣＣＲ９に結合する抗原結合領域及び上で定義されるとおりの１種以上のＦｃ受容体に結合するＦｃ結合領域を含む免疫グロブリン分子又はその断片である。

【0066】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合領域、免疫グロブリンＦｃドメイン、又はその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃドメイン又はその断片などのＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合領域、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその断片は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合領域、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその断片は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン又はその断片などのヒト免疫グロブリンＦｃドメイン又はその断片である。いくつかの実施形態では、結合分子は、配列番号７８に記載されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号７８のアミノ酸１１１～３３０を含む。

【0067】

免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する本発明の結合分子の結合は、結合分子の抗原結合部分が結合される細胞と免疫エフェクター細胞を架橋することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、免疫エフェクター細胞活性化を誘導することができる。いくつかの実施形態では、結合分子による免疫エフェクター細胞のＣＣＲ９発現細胞への架橋は、エフェクター細胞によってＡＤＣＣを活性化する。

【0068】

免疫エフェクター細胞活性化は、インビトロでのＡＤＣＣバイオアッセイなどによって本明細書に記載される方法によって評価され得る。簡潔に述べると、免疫エフェクター細胞は、エフェクター機能の代理として作用するルシフェラーゼレポーターなどのレポーターを発現するように改変され得る。そのようなレポーターを含む免疫エフェクター細胞は、結合分子とプレインキュベートされた標的細胞に加えられる。エフェクター細胞及び標的細胞のインキュベーションの後、レポーター機能（例えば、発光）が定量化される。したがって、そのような方法は、免疫エフェクター細胞を活性化することができる結合分子を同定するために使用され得る。例えば、アッセイが結合分子の免疫エフェクター細胞を活性化する有効性を評価するためのものである場合、標的細胞は、ＣＣＲ９を発現することが知られる細胞であり得る。そのような方法は、ＣＣＲ９を発現する標的細胞を同定するために使用され得る。例えば、アッセイが、標的細胞がＣＣＲ９を発現するかどうかを評価するためのものである場合、結合分子は、本発明の結合分子などのＣＣＲ９に結合することが知られる結合分子であり得る。

【0069】

いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＣＲ９Ａを発現するＨＥＫ細胞株を使用して決定されるとおりの≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．５ｎＭなど、≦５ｎＭのＮＫ細胞活性化効力を有する。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、Ｍｏｌｔ ４細胞株を使用して決定されるとおり０．８ｎＭのＮＫ細胞活性化効力を有する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞による抗体依存性細胞傷害の活性化は、ＣＣＲ９発現細胞の溶解を引き起こす。

【0070】

結合するＣＣＲ９発現細胞に対するＡＤＣＣを媒介することができるとみなされることになる結合分子に関して、結合分子は、Ｍｏｌｔ ４細胞株を使用して決定されるとおりの｛≦２０ｎＭ、ＣＣＲ９Ａを発現するＨＥＫ細胞株を使用して決定されるとおりの≦３０ｎＭ及び／又は≦３ｎＭのＰＢＭＣ死滅ＥＣ５０のＮＫ細胞活性化効力などの免疫エフェクター細胞活性化効力を有するべきである。

【0071】

いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、結合分子の生物学的プロファイルにも影響を及ぼす変化したエフェクター機能を提供する。例えば、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインのグリコシル化プロファイルの改変は、改変された結合分子のＦｃ受容体結合を増大させることができる。他の場合、本発明と一致する定常領域修飾は、補体結合を緩和し得る。定常領域のさらに他の修飾を使用して、抗原特異性又は抗体可動性の向上による局在化の増進を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を除去することができる。同様に、本発明による定常領域に対する修飾は、十分に当業者の範囲内にあるよく知られた生化学的又は分子工学的手法を使用して容易に作製することができる。

【0072】

したがって、いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、免疫エフェクター細胞と相互作用する結合分子の能力を増大させる、例えば、結合分子によって結合されるＣＣＲ９発現細胞と免疫エフェクター細胞を架橋する結合分子の能力を増大させるか、又はＡＤＣＣを誘導する結合分子の能力を増大させる増強されたエフェクター機能を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される結合分子の免疫グロブリンＦｃドメインは、対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変は、１種以上のＦｃ受容体、好ましくは、１種以上のＦｃγ受容体に対する親和性の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、対応する野生型Ｆｃドメインと比較して改変され、前記改変は、抗体依存性細胞傷害応答の増強をもたらす。

【0073】

フコシル残基の量が減少した非フコシル化／低フコシル化結合分子又はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した結合分子などのグリコシル化の改変型を有する結合分子が作製され得る。このような改変されたグリコシル化プロファイルは、結合分子のＡＤＣＣ能を増大させることが実証されている。これらの改変は、本明細書の実施例の節に記載されるものなど、当技術分野における任意の既知の手段によって達成され得る。

【0074】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、非フコシル化され得る。結合分子は、フコースを含まなくてもよい。結合分子は、コアフコース糖単位を欠く少なくとも１つのＮ結合グリカンを含み得る。

【0075】

いくつかの実施形態では、結合分子は、位置Ｎ２９７としても本明細書で参照されるＥＵ位置２９７で非フコシル化される（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３（１）：７８－８５）。すなわち、位置Ｎ２９７のＮ結合グリカンは、存在しなくてもよいし、フコースを欠いてもよいし、コアフコース糖単位を欠いてもよい。アミノ酸位置Ｎ２９７のＮ結合グリカンは、配列番号７８における位置Ｎ１８０に対応する。いくつかの実施形態では、結合分子は、配列番号７８を含み、配列番号７８のＮ１８０は非フコシル化される。いくつかの実施形態では、結合分子は、配列番号７８のアミノ酸１１１～３３０を含むＦｃドメインを含み、配列番号７８のＮ１８０は非フコシル化される。

【0076】

本明細書に記載されるとおり、結合分子は、ｈＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片などのＦｃドメイン又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、非フコシル化ｈＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片などの非フコシル化Ｆｃドメイン又はその断片を含む。本明細書に記載されるとおりのＦｃドメイン又はＦｃドメイン断片のいずれかは、非フコシル化形態で存在し得る。Ｆｃドメイン又は断片は、フコースを含まなくてもよい。Ｆｃドメイン又は断片の少なくとも１つのＮ結合グリカンは、コアフコース糖単位を欠いてもよい。Ｆｃドメイン又は断片は、ＥＵ位置２９７で非フコシル化され得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、配列番号７８のアミノ酸１１１～３３０を含む非フコシル化Ｆｃドメインを含む。例えば、結合分子は、配列番号７８のアミノ酸１１１～３３０を含む非フコシル化Ｆｃドメインを含んでもよく、配列番号７８のＮ１８０は、非フコシル化される。いくつかの実施形態では、結合分子は、非フコシル化Ｆｃドメイン及び非フコシル化がないＦｃドメインを含む。例えば、結合分子は、配列番号７８のアミノ酸１１１～３３０を含む非フコシル化Ｆｃドメイン（配列番号７８のＮ１８０は、非フコシル化される）、及び配列番号７８のアミノ酸１１１～３３０を含む非フコシル化がないＦｃドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、完全に非フコシル化される。例えば、結合分子のＮ結合グリカンの全てが、非フコシル化されてもよい。いくつかの実施形態では、結合分子のＦｃドメインは、完全に非フコシル化される。例えば、ＦｃドメインのＮ結合グリカンの全てが、非フコシル化されてもよい。

【0077】

いくつかの実施形態では、結合分子は、前記結合分子の複数のコピーを含む組成物中で存在し、組成物中の結合分子のコピーの少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％が、非フコシル化され、例えば、本明細書に記載されるとおりフコースを欠き、少なくとも１つのＮ結合グリカンにおいてコアフコース糖単位を欠くか、又はＥＵ位置２９７で非フコシル化される。そのような組成物において、結合分子は、本明細書で開示されるとおりのアミノ酸配列を有するが、組成物中の結合分子のコピーは、それらのグリコシル化パターンにおいて変動してもよく、例えば、いくつかのコピーは、フコースを含んでもよく、いくつかのコピーは、フコースを欠いてもよく、例えば、本明細書に記載されるとおり、少なくとも１つのＮ結合グリカン中のコアフコース糖単位を欠くか、又はＥＵ位置２９７で非フコシル化される。

【0078】

本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、ＣＣＲ９発現細胞は、腸常在細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、ＣＣＲ９発現細胞は、末梢血液細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、ＣＣＲ９発現細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ６９及び／又はＣＤ１０３を発現する。本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、ＣＣＲ９発現細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２２、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＩＬ－４及び／又はＩＬ－１７を発現する。例えば、ＣＣＲ９発現細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ－４及び／又はＩＬ－１７を発現し得る。本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、ＣＣＲ９発現細胞は、リンパ球、例えば、腸常在リンパ球又は末梢血液リンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球などのＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｂリンパ球である。

【0079】

本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球又はその組み合わせである。本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。

【0080】

本発明の結合分子は、上で詳述される機能的特徴のいずれか１つ以上を有し得る。加えて又は代わりに、それは、下で詳述される構造的（例えば、配列）特徴のいずれか１つ以上を有し得る。

【0081】

図３及び図４は、例示される本発明の結合分子から選択される配列を示す。図３及び図４に示される結合分子は、抗体であり、抗体は、これらの図において示されるとおりの可変重ドメイン（ＶＨ）及び可変軽ドメイン（ＶＬ）領域配列を含む。本発明の結合分子は、図３又は図４に示されるいずれかの抗体のＶＨ及びＶＬを含み得る。本発明の結合分子は、図４に示されるいずれかの抗体のＶＨ及びＶＬを含み得る。

【0082】

表３は、例示的な本発明の結合分子のためのＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を提供し、表４は、例示的な本発明の結合分子のためのＣＤＲ配列を提供する。本発明の結合分子は、表３に示されるいずれかの結合分子のＶＨ及びＶＬを含み得る。本発明の結合分子は、表４に示されるいずれかの結合分子の６個のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）のセットを含み得る。

【0083】

本発明の結合分子は、図３又は図４に示されるとおりのいずれかの抗体のＣＤＲ配列を含み得る。例えば、結合分子は、図３又は図４に示される抗体のいずれか１つに関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含み得る。本発明の結合分子は、図４に示されるとおりのいずれかの抗体のＣＤＲ配列を含み得る。例えば、結合分子は、図４に示される抗体のいずれか１つに関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含み得る。本発明の結合分子は、表４に示されるとおりの６個のＣＤＲのセットを含み得る。例えば、結合分子は、表４に示される抗体のいずれか１つに関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含み得る。

【0084】

本発明の結合分子は、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のセットを有する重鎖可変（ＶＨ）領域並びにＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み得る。したがって、結合分子は、図３又は図４に示される抗体のいずれか１つに関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに図３又は図４に示される同じ抗体に関して示されるとおりのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。結合分子は、図４に示される抗体のいずれか１つに関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに図４に示される同じ抗体に関して示されるとおりのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。結合分子は、表４に示される抗体のいずれか１つに関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに表４に示される同じ抗体に関して示されるとおりのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。

【0085】

例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３（配列番号４のＸ_１及びＸ_２は、任意のアミノ酸である）；
ｂ）配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、配列番号９のＨＣＤＲ３、配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３；又は
ｃ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２、配列番号１５のＨＣＤＲ３、配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１７のＬＣＤＲ２及び配列番号１８のＬＣＤＲ３
を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３（配列番号４のＸ_１及びＸ_２は、任意のアミノ酸である）を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２及び配列番号９のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ領域；又は
ｃ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２及び配列番号１５のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１７のＬＣＤＲ２及び配列番号１８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ領域
を含む。

【0087】

結合分子は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号５のＬＣＤＲ２、配列番号６のＬＣＤＲ３並びに（ａ）配列番号４；（ｂ）配列番号１９；（ｃ）配列番号２０；（ｄ）配列番号２１；及び（ｅ）配列番号２２（配列番号４のＸ_１及びＸ２は、任意のアミノ酸であり、配列番号１９のＸ_１は、Ｐ又はＳであり、配列番号１９のＸ_２は、Ｒ、Ｔ又はＧである）から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３（配列番号４のＸ_１及びＸ_２は、任意のアミノ酸である）；
ｂ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３（配列番号１９のＸ_１は、Ｐ又はＳであり、配列番号１９のＸ_２は、Ｒ、Ｔ又はＧである）；
ｃ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３；
ｄ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号２１のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３；又は
ｅ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号２２のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３
を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３（配列番号４のＸ_１及びＸ_２は、任意のアミノ酸である）を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３（配列番号１９のＸ_１は、Ｐ又はＳであり、配列番号１９のＸ_２は、Ｒ、Ｔ又はＧである）を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ領域；
ｄ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号２１のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ領域；又は
ｅ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号２２のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ領域
を含む。

【0089】

本発明は、列挙されたＣＤＲ配列（参照結合分子）、及びその機能的バリアントを有する本明細書で定義される結合分子を包含する。機能的バリアントは、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性プロファイルを示す。例えば、機能的バリアントは、参照結合分子と同じ天然に存在するＣＣＲ９の形態に結合する場合があり、例えば、以下のリストからの分子の同じサブセットに結合する：ヒトＣＣＲ９Ａ、ヒトＣＣＲ９Ｂ、カニクイザルＣＣＲ９、ラットＣＣＲ９及びマウスＣＣＲ９。機能的バリアントは、参照結合分子と比較した場合、標的抗原に関して異なる親和性を有する場合があるが、実質的に同じ親和性が好ましい。

【0090】

いくつかの実施形態では、参照結合分子の機能的バリアントは、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１つ以上のＣＤＲでの配列多様性を示す。したがって、機能的結合分子バリアントは、ＣＤＲの機能的バリアントを含み得る。用語「機能的バリアント」がＣＤＲ配列の文脈において使用される場合、これは、ＣＤＲが、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１、２又は３個のアミノ酸の相違を有し、残りの５個のＣＤＲ（又はそのバリアント）と組み合わされる場合、バリアント結合分子が、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性プロファイルを示すことを可能にすることを意味する。

【0091】

いくつかの実施形態では、結合分子は、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１、２又は３個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ１；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１、２又は３個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ２；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１、２又は３個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ３；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１、２又は３個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ１；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１、２又は３個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ２；及び対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１、２又は３個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ３を含み；結合分子は、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性を示す。

【0092】

いくつかの実施形態では、結合分子は、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大２個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ１；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大２個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ２；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大２個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ３；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大２個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ１；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大２個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ２；及び対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大２個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ３を含み；結合分子は、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性プロファイルを示す。いくつかの実施形態では、結合分子は、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大２個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む。

【0093】

結合分子は、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大１個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ１；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大１個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ２；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大１個のアミノ酸の相違を有する軽鎖ＣＤＲ３；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大１個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ１；対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大１個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ２；及び対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大１個のアミノ酸の相違を有する重鎖ＣＤＲ３を含んでもよく；結合分子は、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性プロファイルを示す。

【0094】

いくつかの実施形態では、バリアント結合分子は、対応する参照結合分子と比較した場合、そのＣＤＲにおいて合計で最大５、４又は３個のアミノ酸の相違を有する場合があるが、ＣＤＲ当たり最大３、最大２又は最大１個のアミノ酸の相違が存在するものとする。好ましくは、バリアント結合分子は、対応する参照結合分子と比較した場合、そのＣＤＲにおいて合計で最大２個（好ましくは、最大１個）のアミノ酸の相違を有する場合があるが、ＣＤＲ当たり最大２個のアミノ酸の相違が存在するものとする。より好ましくは、バリアント結合分子は、対応する参照結合分子と比較した場合、そのＣＤＲにおいて合計で最大２個（より好ましくは、最大１個）のアミノ酸の相違を有する場合があるが、ＣＤＲ当たり最大１個のアミノ酸の相違が存在するものとする。

【0095】

例えば、そのような結合分子は、参照結合分子（図３又は図４又は表３に示される抗体のいずれか１つなど）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含んでもよく、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列のいずれか１つ以上は、参照結合分子のそれぞれのＣＤＲ配列と比較して、１、２又は３個のアミノ酸変化を含む。結合分子は、参照結合分子（図３又は図４に示される抗体のいずれか１つなど）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含んでもよいが、前記ＣＤＲ配列のいずれか１つにおいて１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を有することを除く。結合分子は、前記軽鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上及び／又は前記重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上において、１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を含んでもよい。結合分子は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のいずれか１つ以上において、１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を含んでもよい。結合分子は、ＬＣＤＲ１において、１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を含んでもよい。

【0096】

前述は、図３若しくは図４、若しくは表４に示される抗体のいずれか、又は本明細書に記載される結合分子のいずれかに適用することができ、アミノ酸の相違は、そのＣＤＲ配列と比較して定義され、バリアント結合分子は、前記結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、同じ抗原交差反応性を示す。したがって、本明細書の実施形態のいずれかにおける参照結合分子は、図３若しくは図４に示される抗体又は表３の結合分子又は図３若しくは図４若しくは表４に示される抗体のいずれかの６個のＣＤＲのセットを有する抗体のいずれかのＶＨ及びＶＬ配列を有する抗体であり得る。

【0097】

アミノ酸の相違は、アミノ酸置換、挿入又は欠失であり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸の相違は、本明細書に記載されるとおりの保存的アミノ酸置換である。

【0098】

いくつかの実施形態では、結合分子は、図３若しくは図４、若しくは表４で示されるか若しくは上で示されるとおりの抗体、又はそのいずれかの機能的バリアントのいずれか１つによって示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含む。例えば、そのような結合分子は、図３若しくは図４若しくは表４に示されるか又は上で示されるとおりの抗体のいずれか１つに関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含んでもよく、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列のいずれか１つ以上は、図３又は図４又は表４又は上で列挙されるとおりのそれぞれの配列と比較して、１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を含む。結合分子は、図３若しくは図４に示される抗体又は表３若しくは上で示されるとおりの結合分子のいずれか１つ以上に関して示されるとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列の６個全てを含んでもよいが、前記ＣＤＲ配列のいずれか１つにおいて１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を有することを除く。結合分子は、前記軽鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上及び／又は前記重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上において、１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を含んでもよい。結合分子は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のいずれか１つ以上において、１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を含んでもよい。結合分子は、ＬＣＤＲ１において、１、２又は３個のアミノ酸変化、例えば、置換を含んでもよい。

【0099】

本発明の結合分子は、図３若しくは図４に示されるとおりのいずれかの抗体又は表３の結合分子の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。

【0100】

例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５１を含むＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号５２を含むＶＬ領域アミノ酸配列；
ｂ）配列番号５１を含むＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号５３を含むＶＬ領域アミノ酸配列；
ｃ）配列番号５１を含むＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号５４を含むＶＬ領域アミノ酸配列；
ｄ）配列番号５１を含むＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号５５（ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＸ_１ＮＸ_２ＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＦＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ、（ａ）Ｘ_１及びＸ_２はそれぞれ、任意のアミノ酸であるか（配列番号７６）；又は（ｂ）Ｘ_１は、Ｐ又はＳであり且つＸ_２は、Ｒ、Ｔ又はＧである（配列番号７７））を含むＶＬ領域アミノ酸配列；又は
ｅ）配列番号５６を含むＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号５７を含むＶＬ領域アミノ酸配列
を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５８を含むＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号５９を含むＶＬ領域アミノ酸配列；又は
ｂ）配列番号６０を含むＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号６１を含むＶＬ領域アミノ酸配列
を含む。

【0102】

本発明は、列挙されるＶＨ及びＶＬ領域配列を含む本明細書に記載されるとおりの結合分子（参照結合分子）、並びにその機能的バリアントを包含する。機能的バリアントは、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性を示す。機能的バリアントは、参照結合分子と比較されるとき、標的抗原に対して異なる親和性を有してもよいが、実質的に同じ親和性が好ましい。

【0103】

結合分子のＶＨ領域配列は、参照結合分子の対応するＶＨ領域配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。結合分子のＶＬ領域配列は、参照結合分子の対応するＶＬ領域配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。

【0104】

いくつかの実施形態では、そのような結合分子のＣＤＲは、参照結合分子のＣＤＲと同一であり、それらのＣＤＲの外部にある全ての相違、例えば、結合分子と参照結合分子の間の相違は、ＶＨ及び／又はＶＬ配列のフレームワーク領域中にある。

【0105】

いくつかの実施形態では、そのような結合分子のＣＤＲは、上記のとおりの機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、そのような結合分子は、対応する参照結合分子のＶＨ及び／又はＶＬ配列と比較して、１つ以上のＣＤＲにおけるアミノ酸の相違及び１つ以上のフレームワーク領域におけるアミノ酸の相違を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、結合分子は、参照結合分子と同じフレームワーク配列を有する。別の実施形態では、結合分子は、最大２個、好ましくは、最大１個のアミノ酸の相違（対応する参照フレームワーク配列と比較した場合）を有するフレームワーク領域を含む。したがって、各フレームワーク領域は、（対応する参照フレームワーク配列と比較した場合）最大２個、好ましくは、最大１個のアミノ酸の相違を有し得る。

【0107】

いくつかの実施形態では、結合分子は、対応する参照結合分子と比較した場合、そのフレームワーク領域において合計で最大で５、４又は３個のアミノ酸の相違を有する場合があるが、フレームワーク領域当たり最大２個（好ましくは、最大１個）のアミノ酸の相違が存在するものとする。そのような結合分子は、対応する参照結合分子と比較した場合、そのフレームワーク領域において合計で最大２個（より好ましくは、最大１個）のアミノ酸の相違を有する場合があるが、フレームワーク領域当たり最大２個のアミノ酸の相違が存在するものとする。そのような結合分子は、対応する参照結合分子と比較した場合、そのフレームワーク領域において合計で最大２個（より好ましくは、最大１個）のアミノ酸の相違を有する場合があるが、フレームワーク領域当たり最大１個のアミノ酸の相違が存在するものとする。

【0108】

したがって、結合分子は、本明細書に記載されるとおりのＶＨ領域及びＶＬ領域を含む場合があり、ＶＨ領域は、本明細書の参照結合分子のＶＨ領域と比較した場合、最大１４個のアミノ酸の相違（各ＣＤＲにおいて最大２個のアミノ酸の相違及び各フレームワーク領域において最大２個のアミノ酸の相違）を有し；且つＶＬ領域は、本明細書の参照結合分子のＶＬ領域と比較した場合、最大１４個のアミノ酸の相違（各ＣＤＲにおいて最大２個のアミノ酸の相違及び各フレームワーク領域において最大２個のアミノ酸の相違）を有し；バリアント結合分子は、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性を示す。

【0109】

前記バリアントＶＨ又はＶＬ領域は、参照ＶＨ又はＶＬ領域の「機能的均等物」として参照され得る。

【0110】

いくつかの実施形態では、結合分子は、本明細書に記載されるとおりのＶＨ領域及びＶＬ領域を含む場合があり、ＶＨ領域は、本明細書の参照結合分子のＶＨ領域と比較した場合、最大７個のアミノ酸の相違（例えば、各ＣＤＲにおいて最大１個のアミノ酸の相違及び各フレームワーク領域において最大１個のアミノ酸の相違）を有し；且つＶＬ領域は、本明細書の参照結合分子のＶＬ領域と比較した場合、最大７個のアミノ酸の相違（例えば、各ＣＤＲにおいて最大１個のアミノ酸の相違及び各フレームワーク領域において最大１個のアミノ酸の相違）を有し；バリアント結合分子は、参照結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、参照結合分子と同じ抗原交差反応性を示す。

【0111】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列（（ｉ）配列番号５５のＸ_１及びＸ_２はそれぞれ、任意のアミノ酸であるか（配列番号７６）；又は（ｉｉ）配列番号５５のＸ_１は、Ｐ又はＳであり且つ配列番号５５のＸ_２は、Ｒ、Ｔ又はＧである（配列番号７７））を含むＶＬ領域を含む。

【0112】

例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。

【0113】

例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号７７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。
ｃ）いくつかの実施形態では、結合分子は、
ｄ）配列番号５１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号５７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５８のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号５９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号６０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号５１、５６、５８、６０、又はその機能的バリアントの参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号５２、５３、５４、５５、５７、５９、６１、又はその機能的バリアントの参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列（（ｉ）配列番号５５のＸ１及びＸ２はそれぞれ、任意のアミノ酸であるか（配列番号７６）；又は（ｉｉ）配列番号５５のＸ１は、Ｐ又はＳであり且つ配列番号５５のＸ２は、Ｒ、Ｔ又はＧである（配列番号７７））を含むＶＬ領域を含む。

【0120】

前述は、図３若しくは図４に示される抗体若しくは表３の結合分子のいずれか、又は本明細書に記載される結合分子のいずれかに適用することができ、アミノ酸の相違は、そのＶＨ及び／又はＶＬ配列と比較して定義され、結合分子は、前記結合分子と同じ標的抗原に結合し、好ましくは、同じ抗原交差反応性を示す。したがって、本明細書の実施形態のいずれかにおける参照結合分子は、図３若しくは図４に示される抗体又は表３の結合分子のいずれかのＶＨ及びＶＬ配列を有する抗体であり得る。

【0121】

アミノ酸の相違は、アミノ酸置換、挿入又は欠失であり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸の相違は、本明細書に記載されるとおりの保存的アミノ酸置換である。

【0122】

本発明の結合分子は、単離された形態で提供され得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、免疫グロブリン分子である。いくつかの実施形態では、結合分子は、抗体、又はその抗原結合断片である。

【0124】

特に、抗体は、少なくとも１つ又は２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記される）、及び少なくとも１つ又は２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記される）を含むタンパク質である。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができ、「フレームワーク領域」（ＦＷ）と呼ばれる、より保存されている領域が点在している。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、厳密に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１、及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７を参照のこと）。好ましくは、各ＶＨ及びＶＬ領域は、３つのＣＤＲ及び４つのＦＷで構成されており、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。

【0125】

抗体の重鎖又は軽鎖はさらに、重鎖又は軽鎖定常領域の全て又は一部を含み得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、配列番号７８の重鎖定常領域の全て又は一部及び配列番号７９の軽鎖定常領域の全て又は一部を含む。いくつかの実施形態では、結合分子は、表７に示されるとおりの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む。結合分子は、断片などの表７に示されるとおりの重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域の機能的断片を含んでもよく、結合分子は、本明細書に記載されるとおりの１種以上のＦｃ受容体に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、結合分子は、表７に示されるとおりの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含んでもよく、さらに本明細書で開示されるＶＨ領域及びＶＬ領域、例えば、図３若しくは図４に示される抗体又は表１の結合分子のいずれかのＶＨ及びＶＬ配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、結合分子は、２つの重免疫グロブリン鎖及び２つの軽免疫グロブリン鎖の四量体である抗体であり、重及び軽免疫グロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。いくつかの実施形態では、結合分子は、配列番号７８の重鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬから構成される。いくつかの実施形態では、結合分子は、配列番号７９の軽鎖定常領域を有する。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。

【0126】

「Ｋａｂａｔ付番方式」は一般に、可変領域内の残基（概ね、軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）を指す際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。

【0127】

Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される付番方式を指す。この付番方式を使用する場合、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又はそれへの挿入に対応するより少ないか又は追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含んでもよい。

【0128】

残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、相同性領域において抗体の配列を「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とアライメントすることにより決定され得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を用いて付番した場合のＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、当該ループの長さに応じてＨ３２～Ｈ３４の間で変化する（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂで挿入を置くためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、当該ループは３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、当該ループは３３で終わり、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、当該ループは３４で終わるからである）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間で妥協案を示し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。以下の表に、各系における抗体の可変領域を含むアミノ酸の位置を列挙する。

【0129】

【表1】

【0130】

ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）もまた、ＣＤＲを含む免疫グロブリン可変領域の付番方式を提供する。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７（２００３）を参照されたい。ＩＭＧＴ付番方式は、５，０００を超える配列のアライメント、構造データ及び超可変ループの特徴付けに基づいており、全ての種に対する可変領域及びＣＤＲ領域の容易な比較を可能にする。ＩＭＧＴ付番スキームに従えば、ＨＣＤＲ１は位置２６～３５であり、ＨＣＤＲ２は位置５１～５７であり、ＨＣＤＲ３は位置９３～１０２であり、ＬＣＤＲ１は位置２７～３２であり、ＬＣＤＲ２は位置５０～５２であり、ＬＣＤＲ３は位置８９～９７である。

【0131】

用語「抗体」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（並びにその亜型）のインタクトな免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型又はラムダ型のものであり得る。本発明の結合分子は、完全長抗体であってもよいし、それを含んでもよいし、その抗原結合断片であってもよいし、それを含んでもよい。抗原結合断片という用語は、本明細書で使用する場合、ＣＣＲ９に結合する抗体の一部、例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が全長ではないが、ＣＣＲ９に結合する分子を指す。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃ（Ｆｖ）２断片、ｄＡｂ断片、一本鎖抗体、又はその組み合わせから選択される１つ以上である。例えば、いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片である。いくつかの実施形態では、結合分子は、Ｆａｂドメインを含む。

【0132】

本発明の抗体又はその抗原結合断片は、任意の抗体形式を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、上記の「従来の」形式を有する。或いは、抗体は、いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片であり得る。本発明による抗体又は抗原結合断片はまた、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｖ ＮＡＲドメイン、ＩｇＮＡＲ、イントラボディ、ＩｇＧ ＣＨ２、ミニボディ、単一ドメイン抗体、Ｆｃａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２、ジ－ｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、ＤＶＤ－Ｉｇ、（ｓｃＦｖ）２、又はｍＡｂ２であり得る。

【0133】

いくつかの実施形態では、結合分子は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。いくつかの実施形態では、結合分子は、ポリクローナル抗体である。

【0134】

「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、様々な抗原決定基に対して向けられる様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体の両方並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、及びトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されないいくつかの方法で作製されるような抗体を指す。

【0135】

いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、多重特異性抗体、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗ヒト抗体応答、例えば、マウス抗ヒト抗体応答を誘導しない。

【0136】

本発明の抗体及びその抗原結合断片は、組み換えによる手段によって任意の種から導き出され得る。例えば、抗体又は抗原結合断片は、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヒト、又はそのキメラバージョンであり得る。ヒトへの投与における使用のために、非ヒト由来抗体又は抗原結合断片は、ヒト患者への投与時に抗原性が低くなるように遺伝的に又は構造的に改変され得る。

【0137】

ヒト又はヒト化抗体、特に、組み換えヒト又はヒト化抗体が特に好ましい。用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えばマウス）配列を含有するように操作された、非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ又はハムスター）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６）。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置き換えられる。

【0138】

ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性、及び／又は能力を洗練させ、最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域中及び／又は置き換えられた非ヒト残基中のいずれかのさらなる残基の置換によってさらに改変され得る。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する可変ドメインの少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つを実質的に全て含むことになるが、一方でＦＲ領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、典型的にヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体を作製するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書又は同第５，６３９，６４１号明細書に記載されている。

【0139】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、ヒトにおいて産生される抗体又は当技術分野において知られるいずれかの技術を使用して作製される、ヒトにおいて産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、インタクトな又は完全長の抗体、その断片、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などが含まれる。

【0140】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、キメラ抗体である。用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２種以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖両方の可変領域は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の一種に由来する、所望される特異性、親和性、及び能力を有する抗体の可変領域に対応する一方、定常領域は、別の種における免疫反応を誘発することを回避するために、その種（通常ヒト）に由来する抗体中の配列に相同である。

【0141】

ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭとして分類される重鎖定常領域の５つの主要なクラスが存在し、各々がアイソタイプによって指定される特徴的なエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４として知られる４つのサブクラスに分けられる。Ｉｇ分子は、複数のクラスの細胞受容体と相互作用する。例えば、ＩｇＧ分子は、抗体のＩｇＧクラスに特異的なＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の３つのクラス、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩと相互作用する。ＦｃγＲ受容体へのＩｇＧの結合のために重要な配列は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに位置すると報告されている。本発明の抗体又はその抗原結合断片は、任意のアイソタイプ、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、並びに四本鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）構造の合成多量体であり得る。好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧアイソタイプである。抗体又は抗原結合断片は、任意のＩｇＧサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプであり得る。好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２アイソタイプのものである。

【0142】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプの重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプのものである重鎖定常領域の一部を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ定常領域又はその一部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域である。好ましくは、ＩｇＧ定常領域又はその一部は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２定常領域である。抗体分子はまた、他の形式、例えば、ＹＴＥを有するＩｇＧ１（Ｄａｌｌ‘Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６９：５１７１－５１８０；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３３）：２３５１４－２４）及び／又はＦｃ領域におけるＴＭ変異（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６４：７００－４）を有してもよい。

【0143】

本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ラムダ軽鎖又はカッパ軽鎖を含み得る。操作された抗体及びその抗原結合断片は、改変がＶＨ領域及び／又はＶＬ領域内のフレームワーク残基になされているものを含む。そのような改変は、例えば、抗体の免疫原性を低減し且つ／又は抗体産生及び精製を改善するように抗体の特性を改善し得る。

【0144】

本発明の結合分子としては、本明細書で開示される結合分子のインタクトな形態及び改変された形態の両方を含む。例えば、本発明の結合分子は、１つ以上の他の分子実態、例えば、医薬品、検出薬剤、及び／又は別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）と本明細書で開示される結合分子の会合を媒介することができるタンパク質若しくはペプチドに機能的に連結され得る（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性の会合、又はその他）。検出薬剤の非限定的な例としては、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、アルファ－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ；色素；蛍光標識又は蛍光剤、例えば、フルオレセイン及びその誘導体、フルオロクロム、ローダミン化合物及び誘導体、ＧＦＰ（ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」を表す）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルデヒド、及びフルオレスカミン；フルオロフォア、例えば、ランタニドクリプテート及びキレート、例えば、ユーロピウムなど（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ及びＣｉｓ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；化学発光標識又は化学発光剤、例えば、イソルミノール、ルミノール及びジオキセタン；生物発光標識、例えば、ルシフェラーゼ及びルシフェリン；増感剤；補酵素；酵素基質；臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３（トリチウム）、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、リン３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレニウム７５、硫黄３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８及びイットリウム１９９を含むが、これらに限定されない放射性標識；粒子、例えば、ラテックス又は炭素粒子、金属ゾル、結晶子、リポソーム、色素、触媒若しくは他の検出可能な基でさらに標識され得る細胞など；分子、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン又は５－ブロモデオキシウリジン；毒素部分、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ又はその細胞傷害性断片若しくは変異体）、ジプテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素又はその細胞傷害性断片若しくは変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ若しくはＦ、リシン若しくはその細胞傷害性断片、例えば、リシンＡ、アブリン若しくはその細胞傷害性断片、サポリン若しくはその細胞傷害性断片、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルス毒素若しくはその細胞傷害性断片、及びブリオジン１若しくはその細胞傷害性断片の群から選択される毒素部分が挙げられる。

【0145】

本発明の結合分子はまた、共有結合が結合分子のその標的（例えば、エピトープ）への結合を妨げないか、又はそうでなければ結合分子の生物活性を損なわないように、（例えば、結合分子への結合のいずれかの種類の共有結合によって）改変されている誘導体を含む。好適な誘導体は、フコシル化、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、及びアミド化を含むがこれらに限定されない方法によって生成され得る。

【0146】

さらなる実施形態は、例えば、細胞傷害性小分子を伴う多重特異性結合分子（二重特異性、三重特異性など）及び他のコンジュゲートである。本発明の抗体を含む本発明の結合分子は、当業者に知られる従来の手法を使用して得ることができ、従来の結合試験（例示的な方法）によって確認されるそれらの有用性は、実施例３及び４に記載される。例として、簡便な結合アッセイは、抗原を発現する細胞を抗体とともにインキュベートするものである。抗体がフルオロフォアでタグ付けされる場合、抗原への抗体の結合は、ＦＡＣＳ分析により検出され得る。

【0147】

本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル又はウマを含む様々な動物において産生され得る。抗体は、個々の莢膜多糖、又は複数の莢膜多糖による免疫後に産生され得る。これらの動物から単離された血液は、ポリクローナル抗体（同じ抗原に結合する複数の抗体）を含有する。抗原はまた、卵黄中でポリクローナル抗体の産生のためにニワトリにも注射され得る。抗原の単一エピトープに特異的なモノクローナル抗体を得るために、抗体分泌リンパ球を動物から単離し、それらを癌細胞株と融合させることによって不死化させる。融合細胞はハイブリドーマと呼ばれ、培養物中で連続的に増殖し、抗体を分泌する。単一のハイブリドーマ細胞は、希釈クローニングによって単離され、全てが同じ抗体を産生する細胞クローンを生成させ、これらの抗体はモノクローナル抗体と呼ばれる。モノクローナル抗体を生成するための方法は、当業者に知られる従来の手法である（例えば、Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．ＧＣ Ｈｏｗａｒｄ．ＣＲＣ Ｂｏｏｋｓ．２００６．ＩＳＢＮ ０８４９３３５２８０を参照のこと）。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、プロテインＡ／Ｇ又は抗原アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されることが多い。

【0148】

本発明の抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗ＣＣＲ９抗体として調製されてもよく、これは、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載される方法などを使用して調製され得る。ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物が上記のとおり免疫され、免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生が誘発される。リンパ球はまた、インビトロで免疫され得る。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して好適な骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成し、続いて未融合のリンパ球及び骨髄腫細胞から選択除去し得る。次に、免疫沈降、免疫ブロット法によるか、又はインビトロ結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される場合に選択された抗原に対して特異的に向けられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準的な方法を使用するインビトロ培養（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）又は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次に、モノクローナル抗体は、既知の方法を使用して培地又は腹水から精製され得る。

【0149】

或いは、結合分子（例えば、モノクローナル抗体）はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるとおりの組み換えＤＮＡ法を使用して作製され得る。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、この抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲなどにより、成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離し、従来の手順を使用してそれらの配列を決定する。次に、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを好適な発現ベクター中にクローニングし、これを、通常であれば免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞により産生される。また、所望の種の組み換えモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されるとおりの所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離され得る。

【0150】

本発明の結合分子をコードするポリヌクレオチドはさらに、代替的な結合分子を生成する組み換えＤＮＡ技術を使用して、いくつかの異なる様式で改変され得る。いくつかの実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインが、（１）例えばヒト抗体のそれらの領域に置換されてキメラ抗体が作製され得るか、又は（２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換されて融合抗体が作製され得る。いくつかの実施形態では、定常領域が短縮されるか又は除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作製される。可変領域の部位特異的変異誘発又は高密度変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。

【0151】

いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当技術分野で知られる様々な技術を使用して、直接的に調製され得る。インビトロで免疫されたか、又は標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された、不死化ヒトＢリンパ球が作製され得る。例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６－９５（１９９１）；米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。

【0152】

いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ファージライブラリーから選択することができ、そのファージライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９－３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６１５７－６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）に記載されるとおりのヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリーの作製及び使用のための技術は、それぞれが参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；及び同第７，２６４，９６３号明細書；並びにＲｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２－１２００（２００８）にも記載されている。

【0153】

親和性成熟戦略及び鎖シャッフリング戦略が、当技術分野において知られており、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片を作製するために利用され得る。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。

【0154】

いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体）は、ヒト化抗体であり得る。非ヒト又はヒト抗体を操作するか、ヒト化するか、又はリサーフェシングするための方法も使用されてもよく、これらは当技術分野でよく知られている。ヒト化抗体、リサーフェシング抗体、又は同様に操作された抗体は、非ヒト、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物であるが限定されない供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「移入」残基と呼ばれる残基によって置換されており、これらの残基は通常、既知のヒト配列の「移入」可変ドメイン、定常ドメイン、又は他のドメインから取得される。このような移入された配列を使用して、免疫原性を低減することができるか、又は結合性、親和性、ｏｎ速度、ｏｆｆ速度、結合活性、特異性、半減期若しくは当技術分野で知られるとおりの任意の他の好適な特性を低減させるか、増強するか、若しくは改変することができる。好適には、ＣＤＲ残基は、ＣＣＲ９結合への影響に直接的に且つ最も実質的に関与し得る。したがって、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全てを維持することが好ましい一方で、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒト又は他のアミノ酸に置き換えることができる。

【0155】

抗体はまた、任意選択により、ヒト化されるか、リサーフェシングされるか、操作されるか、又はヒト抗体が操作されて、抗原ＣＣＲ９に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性が保持され得る。この目標を達成するために、任意選択により、ヒト化（又はヒト）又は操作された抗ＣＣＲ９抗体及びリサーフェシング抗体を、親配列、操作された配列、及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物及び操作された産物の分析プロセスによって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図示して表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがＣＣＲ９などのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＷ残基をコンセンサス配列及び移入配列から選択して組み合わせることができ、これにより所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が実現される。

【0156】

本発明の抗ＣＣＲ９抗体又はその抗原結合断片のヒト化、リサーフェシング又は操作は、任意の既知の方法、例えば、限定されるものではないが、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）；Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）；米国特許第 ５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書、同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１３３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット及び欧州特許第２２９２４６号明細書（各々が全体としてそこで引用される参考文献を含んで参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどを使用して実施され得る。

【0157】

抗ＣＣＲ９ヒト化抗体及びその抗原結合断片はまた、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全レパートリーを産生する能力を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいても作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。

【0158】

いくつかの実施形態では、抗体（例えば、抗ＣＣＲ９抗体）の断片（例えば、抗体断片）が提供される。様々な手法が、抗体断片の生成のために知られている。従来、これらの断片は、例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７－１１７（１９９３）及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）によって記載されるとおり、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して得られる。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ９抗体断片は、組み換えにより生成される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細胞中で発現させ、そこから分泌させることができ、これにより、これらの断片の大量生成が可能になる。そのような抗ＣＣＲ９抗体断片はまた、上で論じられた抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗ＣＣＲ９抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるとおりの線状抗体であり得る。抗体断片を作製するための他の技術は、当業者にとって明らかであろう。

【0159】

本発明によれば、技術は、ＣＣＲ９に特異的な一本鎖抗体の生成のために適合させることができる。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい。加えて、方法は、ＣＣＲ９に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片、又はその誘導体、断片、類似体若しくは相同体の迅速且つ有効な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリーの構築のために適合させることができる。例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）を参照されたい。抗体断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂ断片；抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片；又はＦｖ断片を含むが、これらに限定されない当技術分野で知られる手法によって生成され得る。

【0160】

改変された結合分子（例えば、本明細書で提供されるとおりの抗体又はその抗原結合断片）は、結合分子とＣＣＲ９との会合をもたらす任意の型の結合領域を含み得る。この点に関して、結合領域は、所望の抗原に対する体液性応答を開始し、免疫グロブリンを産生するように誘導され得るいずれかの種類の哺乳動物のものを含み得るか、又はそれに由来し得る可変領域であり得る。そのため、抗ＣＣＲ９抗体又はその抗原結合断片の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクなど）又はオオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）起源のものであり得る。いくつかの実施形態では、改変抗体又はその抗原結合断片の可変領域及び定常領域の両方がヒトである。いくつかの実施形態では、適合抗体（通常、非ヒト供給源に由来する）の可変領域は、分子の結合特性が向上するように又は免疫原性が低減するように操作され得るか、又は特異的に調整され得る。これに関して、本発明において有用な可変領域は、移入されたアミノ酸配列を含めることによってヒト化され得るか、又は他の形で改変され得る。

【0161】

いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、及び／又は部分的なフレームワーク領域の置換及び配列変更によって改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス又はさらには同じサブクラスの抗体に由来し得るが、異なるクラスの抗体に、またある特定の実施形態では異なる種の抗体に、ＣＤＲが由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すために、全てのＣＤＲをドナー可変領域の完全なＣＤＲに置き換える必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性の維持に必要な残基を移しさえすれば十分である。米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、及び同第５，６９３，７６２号明細書に記載される説明を考慮すれば、免疫原性が低減した機能的抗体を得るために通例の実験を実施することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。

【0162】

可変領域の改変にもかかわらず、当業者は、本発明の改変された抗体又はその抗原結合断片が、天然の又は改変されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に、ＡＤＣＣを誘導する能力の向上を含むエフェクター機能の増大などの所望の生化学的特徴がもたらされるように定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部分が欠失されているか、又は別途改変されている抗体（例えば、完全長抗体又はその抗原結合断片）を含み得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、改変された抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含むことになる。本発明と適合する定常領域に対する改変は、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含む。すなわち、本明細書で開示される改変された抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３）のうちの１つ以上及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する変更又は改変を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している改変された定常領域が企図される。いくつかの実施形態では、改変された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれたドメイン欠失コンストラクト又はバリアント（△ＣＨ２コンストラクト）を含むことになる。いくつかの実施形態では、除かれた定常領域ドメインは、通常はその欠けた定常領域によって付与されるある程度の分子可動性をもたらす、短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）によって置き換えられ得る。

【0163】

様々な配列アライメント方法のいずれかを使用して、同一性パーセントを決定することができ、これらとしては、包括的方法、局所的方法及び、例えば、セグメントアプローチ法などの複合型の方法が挙げられるがこれらに限定されない。同一性パーセントを決定するためのプロトコルは、当業者の範囲内の通例の手順である。包括的方法は、分子の始まりから終わりまで配列をアライメントし、個々の残基対のスコアを合計することにより、及びギャップペナルティを付与することにより、最良のアライメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（例えば、Ｊｕｌｉｅ Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｈｏｉｃｅ，２２（２２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６７３－４６８０（１９９４）を参照のこと）；及び反復改良法（例えば、Ｏｓａｍｕ Ｇｏｔｏｈ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｓ Ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，２６４（４）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．８２３－８３８（１９９６）を参照のこと）が挙げられる。局所的方法は、入力配列の全てによって共有される１つ以上の保存されたモチーフを同定することにより配列をアライメントする。非限定的な方法としては、例えば、Ｍａｔｃｈ－ｂｏｘ（例えばＥｒｉｃ Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ ａｎｄ Ｅｒｎｅｓｔ Ｆｅｙｔｍａｎｓ，Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ：Ａ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ Ｎｅｗ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，８（５）ＣＡＢＩＯＳ ５０１－５０９（１９９２）を参照のこと）；ギブスサンプリング（例えばＣ．Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｓｕｂｔｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｓ：Ａ Ｇｉｂｂｓ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，２６２（５１３１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８－２１４（１９９３）を参照のこと）；Ａｌｉｇｎ－Ｍ（例えばＩｖｏ Ｖａｎ ＷａＩＩｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｇｎ－Ｍ－Ａ Ｎｅｗ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，２０（９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：１４２８－１４３５（２００４）を参照のこと）が挙げられる。

【0164】

したがって、配列同一性パーセントは、従来の方法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３－１６，１９８６及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１９，１９９２を参照されたい。簡潔に述べると、１０のギャップオープニングペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、及び以下に示されるとおりのＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリクスを使用して、アライメントスコアを最適化するように２つのアミノ酸配列をアライメントする（アミノ酸は標準的な１文字コードによって示される）。

【0165】

２つ以上の核酸配列又はアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、配列によって共有される同一位置の数の関数である。したがって、同一性％は、同一ヌクレオチド／アミノ酸の数をヌクレオチド／アミノ酸の総数で割り、１００を掛けたものとして算出され得る。配列同一性パーセントの算出はまた、２つ以上の配列のアライメントを最適化するために導入する必要があるギャップ数、及び各ギャップの長さを考慮に入れ得る。２つ以上の配列間での配列比較及び同一性パーセントの決定は、当業者によく知られているＢＬＡＳＴなどの特定の数学的アルゴリズムを使用して実施され得る。

【0166】

本発明はさらに、本発明の結合分子（例えば、マウス、キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体、又はその抗原結合断片などの抗体）と実質的に相同なバリアント及び均等物を包含する。これらは、例えば、保存的置換変異、すなわち、１つ以上のアミノ酸の、同様のアミノ酸による置換を含有し得る。例えば、保存的置換は、アミノ酸を同じ一般クラス内の別のアミノ酸で置換すること、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸によって置換することなどを指す。保存的アミノ酸置換によって意図されるものは、当技術分野でよく知られている。

【0167】

実質的に相同なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を有することを特徴とする。これらの変化は好ましくは重要ではない性質のもの、すなわち、保存的アミノ酸置換（以下を参照）及びポリペプチドのフォールディング又は活性に著しく影響しない他の置換；小さな欠失、典型的には、１～約３０アミノ酸のもの；並びにアミノ末端又はカルボキシル末端の小さな伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約２０～２５残基の小さなリンカーペプチド又はアフィニティータグである。

【0168】

【表2】

【0169】

２０個の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、６－Ｎ－メチルリジン、２－アミノイソ酪酸、イソバリン及びα－メチルセリン）が、本発明の結合分子のアミノ酸残基と置換され得る。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸が、ポリペプチドアミノ酸残基と置換され得る。本発明の結合分子はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。

【0170】

天然に存在しないアミノ酸としては、トランス－３－メチルプロリン、２，４－メタノ－プロリン、シス－４－ヒドロキシプロリン、トランス－４－ヒドロキシ－プロリン、Ｎ－メチルグリシン、アロ－スレオニン、メチル－スレオニン、ヒドロキシ－エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ－システイン、ニトロ－グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ－ロイシン、ノルバリン、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニル－アラニン、４－アザフェニル－アラニン及び４－フルオロフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためのいくつかの方法が当技術分野で知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して、ナンセンス変異が抑制されるインビトロの系が使用され得る。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当技術分野で知られている。ナンセンス変異を含有するプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２７２２，１９９１；Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１，１９９１；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：８０６－９，１９９３；及びＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０１４５－９，１９９３）を参照されたい。第２の方法において、翻訳は、変異させられたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵細胞において行われる（Ｔｕｒｃａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９９９１－８，１９９６）。第３の方法内で、置き換えられることになる天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在下で、及び所望の天然に存在しないアミノ酸（例えば２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニルアラニン、４－アザフェニルアラニン又は４－フルオロフェニルアラニン）の存在下で、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を培養する。天然に存在しないアミノ酸は、その天然の対応物の代わりにポリペプチドに組み込まれる。Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７４７０－６，１９９４を参照されたい。インビトロでの化学修飾により、天然に存在するアミノ酸残基は、天然に存在しない種に変換され得る。化学修飾は、一連の置換をさらに拡大するために部位特異的変異誘発と組み合わせられ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：３９５－４０３，１９９３）。

【0171】

限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸が、本発明の結合分子のアミノ酸残基と置換され得る。

【0172】

本発明の結合分子中の必須アミノ酸は、当技術分野で知られる手順、例えば、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－５，１９８９）などに従って同定され得る。生物学的相互作用の部位はまた、推定接触部位のアミノ酸の変異と併せた、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性標識などの技術によって決定されるような構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－１２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４，１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９－６４，１９９２を参照されたい。必須アミノ酸の同一性はまた、本発明の結合分子の関連成分（例えば、トランスロケーション成分又はプロテアーゼ成分）との相同性の分析から推測され得る。

【0173】

複数のアミノ酸置換は、Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ及びＳａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－７，１９８８）又はＢｏｗｉｅ及びＳａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２－６，１９８９）により開示されるものなど、変異誘発及びスクリーニングの既知の方法を使用して、作製され、試験され得る。簡潔に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の２箇所以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、続いて変異誘発されたポリペプチドの配列を決定して、各位置における許容可能な置換の範囲を決定する方法について開示する。使用され得る他の方法としては、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２－７，１９９１；Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｈｕｓｅ，ＷＩＰＯ公開国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４６：１４５，１９８６；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ７：１２７，１９８８）が挙げられる。

【0174】

５．２ 組成物
また、本明細書では、本発明の結合分子を含む組成物が提供される。組成物は、本明細書に記載されるとおりのいずれかの結合分子を含み得る。組成物は、本明細書に記載されるとおりの２種以上の結合分子を含み得る。

【0175】

別の態様では、ＣＣＲ９に結合する結合分子を含む組成物が提供され、前記結合分子は、（ｉ）ＣＣＬ２５のＣＣＲ９への結合を阻害することができ、且つ（ｉｉ）それが結合するＣＣＲ９発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害を媒介することができる。

【0176】

本明細書に記載されるとおりの組成物は、本発明の結合分子を含み、且つ少なくとも１種の薬学的に許容される担体又は希釈剤をさらに含む組成物などの医薬組成物であり得る。用語「医薬組成物」は、活性成分の生物活性を有効にし、且つその組成物が投与される対象にとって許容されない毒性の追加の構成成分を含有しない製剤を指す。そのような組成物は無菌であってもよく、生理食塩水などの薬学的に許容される単体を含んでもよい。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール）、及びバイオアベイラビリティを促進する吸収促進剤の１つ以上、並びに／又は他の従来の可溶化剤又は分散剤を含み得る。

【0177】

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される無毒性の無菌担体、例えば、生理食塩水、無毒性緩衝液、保存剤などを含み得る。本明細書で開示される治療方法における使用のための好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄ．，Ｅｄ．Ｌｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．（２０１２）に記載される。

【0178】

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液、溶液、鼻腔エアロゾル、又はそれらの組み合わせから選択される１種以上の製剤内に含まれ得る。

【0179】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２種以上の本発明の結合分子を含む。例えば、医薬組成物は、抗体、抗原結合断片、又はその組み合わせから選択される２種以上を含み得る。

【0180】

結合分子の「薬学的に有効な量」という用語は、標的への有効な結合を達成するために及び利益を得るのに、例えば、疾患又は病態の症状を寛解させるか又は物質若しくは細胞を検出するのに十分な量を意味する。

【0181】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択により安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。

【0182】

好適には、本発明の結合分子は、結合分子が、ＣＣＲ９を標的化する際に治療剤又は診断試薬として有用であるように、十分な親和性を有してＣＣＲ９分子に結合する。

【0183】

５．３ 治療方法
本発明はまた、治療方法において本発明の結合分子及び組成物を使用することに関する。本発明は、そのような治療方法における使用のための本発明の結合分子、例えば、療法によってヒト又は動物の身体を治療する方法における使用のための本発明の結合分子を提供する。治療方法及び使用が、本発明の結合分子に対する参照とともに本明細書で記載される場合、結合分子が、本明細書に記載されるとおりの医薬組成物などの医薬組成物などの組成物中に存在する同じ方法及び使用も包含される。

【0184】

したがって、本発明は、ＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療する方法における使用のための上で定義される結合分子及び上で定義される医薬組成物を包含する。

【0185】

一態様では、ＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療する際の使用のための本発明の結合分子が提供される。また、ＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療する際の使用のための本発明の組成物、例えば、本発明の医薬組成物が提供される。ＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態の治療のための医薬の製造における本発明の結合分子の使用がさらに提供される。

【0186】

別の態様では、対象においてＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療する方法であって、対象に有効量の本発明の結合分子を投与することを含む方法が提供される。

【0187】

一態様では、対象においてＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療する際の使用のための結合分子が提供され、前記結合分子は、（ｉ）ＣＣＬ２５のＣＣＲ９への結合を阻害することができ、且つ（ｉｉ）それが結合するＣＣＲ９発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害を媒介することができる。

【0188】

一態様では、対象においてＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態を治療する方法であって、対象に有効量のＣＣＲ９に結合する結合分子を投与することを含む方法が提供され、前記結合分子は、（ｉ）ＣＣＲ９に対するＣＣＬ２５の結合を阻害することができ、且つ（ｉｉ）それが結合するＣＣＲ９発現細胞に対して抗体依存性細胞傷害を媒介することができる。

【0189】

治療の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療されるＣＣＲ９に媒介される疾患又は病態は、炎症性腸疾患である。

【0190】

いくつかの実施形態では、結合分子、対象において、例えば、対象の腸においてＣＣＲ９発現細胞を枯渇させることができる。理論に束縛されることなく、これは、ＣＣＲ９発現細胞の対象の末梢から腸への遊走を妨げる結合分子の能力及び／又は結合するＣＣＲ９発現細胞の死滅を誘導する結合分子の能力に起因し得る。

【0191】

したがって、一態様では、必要とする対象においてＣＣＲ９発現細胞を枯渇させる方法であって、対象に有効量の本発明の結合分子を投与することを含む方法が提供される。

【0192】

いくつかの実施形態では、ＣＣＲ９ポリペプチドは、ＣＣＲ９ポリペプチド配列、又はその断片内に含まれる。

【0193】

「ＣＣＲ９ポリペプチド」は、ＣＣＲ９の全長ポリペプチド配列を含み得るか、又は本発明の結合分子に結合し得る（例えば、それにより結合され得る）エピトープを含むＣＣＲ９の全長ポリペプチド配列の任意の長さのＣＣＲ９の断片（例えば、ＣＣＲ９の全長ポリペプチド配列の５％、１５％、２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９５％のポリペプチド配列を含む）を含み得る。

【0194】

結合分子は、ＣＣＲ９エピトープを検出するための方法、及び診断の関連する方法において有利に使用され得る。

【0195】

用語「治療する」又は「治療すること」は、本明細書で使用する場合、診断された病的状態又は障害を治癒し、それを減速させ、その症状を軽減し、且つ／又はその進行を止める療法的手段を包含する。したがって、治療が必要なものは、既に障害を有するものを含む。好ましくは、用語「治療する」又は「治療すること」は、本明細書で使用する場合、矯正治療を意味する。用語「治療する」又は「治療すること」は、炎症性腸疾患を治療すること、並びにその症状及びそれと関連する疾患／障害を治療することを包含する。いくつかの実施形態では、用語「治療する」又は「治療すること」は、腸における炎症、腹痛、下痢、血便などのＩＢＤの症状を指す。いくつかの実施形態では、対象は、患者が、例えば、ＣＣＲ９に媒介される疾患又は障害（例えば、炎症性腸疾患）と関連する症状の全体的、部分的、又は一過的な軽減又は消失を示す場合、本明細書で提供される方法に従って、ＣＣＲ９に媒介される疾患又は障害（例えば、炎症性腸疾患）に関して順調に「治療されている」。「治療する」又は「治療」はまた、予防的治療、例えば、ＩＢＤの発症を予防することなどの疾患の発症を予防することを含む。

【0196】

「予防する」とは、標的とする病的状態又は障害の発生を予防し且つ／又は遅らせる予防的又は防御的手段を指す。したがって、予防が必要なものは、障害を起こす傾向があるか又は障害を起こし易いものを含む。いくつかの実施形態では、患者が、一過的に又は永久に、本発明の方法に供されたことがない患者よりも、例えば、疾患若しくは障害と関連する症状の発症が少ないか若しくはその重症度が低い症状を発症するか、又は疾患若しくは障害に関連する症状が遅れて発症する場合、疾患又は障害（好ましく、炎症性腸疾患）は、本明細書で提供される方法に従って順調に予防されている。

【0197】

用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書では哺乳動物対象を指すために互換的に使用される。いくつかの実施形態では、「対象」は、ヒト、飼育動物、家畜、競技動物、及び動物園動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシなどである。いくつかの実施形態では、対象は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）である。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。本発明の方法において、対象は、以前に炎症性腸疾患と診断されていなくてもよい。或いは、対象は、炎症性腸疾患を有すると以前に診断されたことがあってもよい。対象はまた、疾患リスク因子を示す対象、又は炎症性腸疾患に対して無症候性である対象であってもよい。対象はまた、炎症性腸疾患に罹患している対象、又はそれを発症するリスクのある対象であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象において炎症性腸疾患の存在を確認するために使用され得る。例えば、対象は、代替的な手段により以前に炎症性腸疾患を有すると診断されたことがあってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、以前に炎症性腸疾患療法を施されたことがある。

【0198】

いくつかの実施形態では、本発明の治療の方法は、経口、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣、吸入、局所、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の投与工程を含む。

【0199】

いくつかの実施形態では、結合分子は、有害な細胞集団の部位に直接的に送達される（例えば、それにより治療剤への疾患組織の曝露を増加させる）。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、吸入又は鼻腔内投与による、気道への直接的なものである。

【0200】

いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、回腸又は回腸結腸のクローン病などのクローン病である。いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。

【0201】

５．４ 検出方法
さらなる態様では、ＣＣＲ９ポリペプチドの存在又は非存在を検出するための方法が提供される。本発明の結合分子がそのような方法において使用され得る。

【0202】

いくつかの実施形態では、ＣＣＲ９ポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法は、
ａ）試料を本発明の結合分子と接触させて、結合分子－抗原複合体をもたらすこと；
ｂ）前記結合分子－抗原複合体の存在又は非存在を検出すること；
ｃ）結合分子－抗原複合体の存在が、ＣＣＲ９ポリペプチドの存在を確認すること
を含む。

【0203】

いくつかの実施形態では、上の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかは、エクスビボ又はインビトロで実施される。いくつかの実施形態では、上の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）の全ては、エクスビボ又はインビトロで実施される。いくつかの実施形態では、上の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかは、インビボで実施される。

【0204】

結合分子は、本明細書に記載されるいずれかの結合分子、例えば、図３若しくは図４若しくは表４におけるいずれかの抗体に関して示されるとおりの６個のＣＤＲのセットを含む結合分子、又は図３若しくは図４におけるいずれかの抗体若しくは表３の結合分子に関して示されるとおりのＶＨ及びＶＬを含む結合分子であり得る。

【0205】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される検出方法は、インビトロで実行される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される検出方法は、エクスビボで実行される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される検出方法は、対象から以前に得られた試料などの、対象由来の試料に対して実行される。検出方法は、対象から試料を得る工程を含んでもよいし、含まなくてもよい。好適には、「試料」は、対象（例えば、生検）、細胞株、組織培養、又はＣＣＲ９を発現する可能性がある細胞の他の供給源から得られる試料である。いくつかの実施形態では、試料は、対象からの生検である。前記生検は、炎症性腸疾患に罹患している対象の腸、又は炎症性腸疾患に罹患するリスクのある対象の腸に由来するものであり得る。試料は、対象から単離された試料であり得る。

【0206】

本発明は、ＣＣＲ９ポリペプチド（例えば、ＣＣＲ９ポリペプチドエピトープ）を検出するための本発明の結合分子の対応する使用を包含する。

【0207】

いくつかの実施形態では、結合分子－抗原複合体の存在は、炎症性腸疾患の存在を示し、結合分子－抗原複合体の非存在は、炎症性腸疾患の非存在を示す。

【0208】

いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、ＣＣＲ９ポリペプチド（例えば、ＣＣＲ９ポリペプチドエピトープ）を発現する細胞を含む炎症性疾患である。

【0209】

したがって、本発明は、炎症性腸疾患を有する対象を診断する方法における本発明の結合分子の使用を包含し、好ましくは、前記炎症性腸疾患は、ＣＣＲ９発現細胞を含む。

【0210】

いくつかの実施形態では、検出の方法又は診断の方法は、対象由来の試料においてＣＣＲ９の発現レベルを測定すること、及び参照ＣＣＲ９レベルと測定されたＣＣＲ９発現レベルを比較することを含んでもよく、参照ＣＣＲ９レベルと比較した測定されたＣＣＲ９発現レベルの増大は、炎症性腸疾患の存在を示す。いくつかの実施形態では、前記参照ＣＣＲ９レベルは、同じ組織型のものなどの同じ型の非ＩＢＤ（例えば、正常）試料におけるＣＣＲ９の発現レベルである。

【0211】

「結合分子－抗原複合体」は、その対応する結合分子に結合される抗原、例えば、本発明の結合分子に結合されるＣＣＲ９を含む複合体（例えば、高分子複合体）を意味する。用語「結合分子－抗原複合体」は、用語「結合されたＣＣＲ９－結合分子複合体」及び「ＣＣＲ９に結合される結合分子」と同義的に使用され得る。

【0212】

結合分子－抗原複合体は、当業者に知られる任意の手段によって検出され得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、検出可能な標識により標識される。前記標識は、エピ蛍光標識であり得る。

【0213】

いくつかの実施形態では、結合分子－抗原複合体は、結合分子及び／又は結合分子複合体に結合する二次（例えば、検出）抗体によって検出される。

【0214】

好適には、前記二次抗体は、検出を助けるためのタグ／標識などの検出手段を含む。前記検出手段は、好ましくは二次抗体にコンジュゲートされる。好適な標識の例は、放射性標識又は蛍光又は呈色分子、酵素性マーカー又は発色性マーカー、例えば抗原への検出抗体の結合時の可視的な色の変化を提供する色素などの検出可能な標識を含む。一例として、標識は、フルオレセイン－イソチイオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ－フィコエリスリン、Ａｌｅｘａ ５３２、ＣＹ３又はジゴキシゲニンであり得る。標識はレポーター分子であってもよく、これは、その蛍光シグナルを検出することによるなど直接的に、又は写真又はＸ線フィルムへの標識の曝露により検出される。或いは、標識は、直接検出可能ではないが、例えば二相系で検出され得る。間接的な標識検出の例は、標識への抗体の結合である。

【0215】

いくつかの実施形態では、前記二次抗体は、蛍光タグを含み、結合分子－抗原複合体は、結合分子－抗原－二次抗体複合体から放射される蛍光により検出される。「結合分子－抗原－二次抗体複合体」は、結合分子に結合されている抗原（例えば、ＣＣＲ９）を含む複合体を意味し、前記複合体はさらに、前記結合分子及び／又は結合分子－抗原複合体に結合する二次抗体によって結合されている。

【0216】

好適には、結合分子－抗原複合体は、検出標識から放射されるシグナル（例えば、蛍光）が、結合分子（例えば、ＣＣＲ９に結合する結合分子）を含まない対照において検出されるシグナルより大きいときに検出される。前記対照は、或いは、ＣＣＲ９を含み得るが、試料は前記対照に適用されない。

【0217】

別の態様では、ＣＣＲ９に結合する第２の結合分子が提供され、前記第２の結合分子は、ＣＣＲ９への結合に関して第１の結合分子と競合しない。

【0218】

第１の結合分子は、ＣＣＲ９に結合する本明細書で開示されるとおりのいずれかの結合分子であり得る。好適な第１の結合分子は、図４に示されるとおりの結合分子であり得る。好適な第１の結合分子は、表３に示されるいずれかの結合分子のＶＨ及びＶＬを含むか、又は表４に示されるいずれかの結合分子の６個のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）のセットを含む結合分子であり得る。好適な第１の結合分子は、
ａ）図４に示されるとおりの抗体のＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のセットを有する重鎖可変（ＶＨ）領域及びＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含むか；
ｂ）図４に示される抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含むか；
ｃ）配列番号５１の重鎖可変（ＶＨ）領域配列及び配列番号５５の軽鎖可変（ＶＬ）領域配列（（ｉ）配列番号５５のＸ_１及びＸ_２はそれぞれ、任意のアミノ酸であるか（配列番号７６）；又は（ｉｉ）配列番号５５のＸ_１は、Ｐ又はＳであり且つ配列番号５５のＸ_２は、Ｒ、Ｔ又はＧである（配列番号７７））を含むか；又は
ｄ）配列番号５１の重鎖可変（ＶＨ）領域配列及び配列番号５２、５３若しくは５４の軽鎖可変（ＶＬ）領域配列を含むか：又は
ｅ）配列番号５６の重鎖可変（ＶＨ）領域配列及び配列番号５７の軽鎖可変（ＶＬ）領域配列を含む結合分子であり得る。

【0219】

有利には、本発明は、第１の結合分子と接触されている試料中のＣＣＲ９発現細胞の存在量を決定するための第２の結合分子（結合に関して第１の結合分子と競合しない）の使用を包含する。

【0220】

したがって、第１の結合分子によるＣＣＲ９発現細胞の枯渇を評価する方法であって、
ａ）前記第１の結合分子を細胞の集団（細胞の集団は、ＣＣＲ９発現細胞及び免疫エフェクター細胞を含む）とエフェクター細胞により抗体依存性細胞傷害を可能にするのに好適な条件下で接触させること；
ｂ）前記細胞の集団を、ＣＣＲ９に結合し且つＣＣＲ９への結合に関して工程（ｉ）の第１の結合分子と競合しない第２の結合分子と接触させること；
ｃ）（ｉｉ）の第２の結合分子により結合される細胞の集団におけるＣＣＲ９発現細胞を検出すること；
ｄ）工程（ｉｉｉ）において検出されるＣＣＲ９発現細胞の量を、工程（ｉ）において使用される元の細胞集団におけるＣＣＲ９発現細胞の量と比較し、それにより工程（ｉ）において枯渇されたＣＣＲ９発現細胞の量を決定することを含む方法が提供される。

【0221】

いくつかの実施形態では、第２の結合分子は、表６に示されるＶＨ及びＶＬ配列、又は表６に示される６個のＣＤＲのセットを含む。例えば、第１の結合分子は、表３に示されるいずれかの結合分子のＶＨ及びＶＬを含んでもよいし、表４に示されるいずれかの結合分子の６個のＣＤＲのセットを含んでもよく、第２の結合分子は、表６に示されるＶＨ及びＶＬ配列、又は表６に示される６個のＣＤＲのセットを含んでもよい。

【0222】

いくつかの実施形態では、第２の結合分子は、ＣＣＲ９に結合し且つ
ａ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、又はその機能的バリアント；
ｂ）配列番号４５のＨＣＤＲ２、又はその機能的バリアント；
ｃ）配列番号４６のＨＣＤＲ３、又はその機能的バリアント；
ｄ）配列番号４７のＬＣＤＲ１、又はその機能的バリアント；
配列番号５のＬＣＤＲ２、又はその機能的バリアント；及び
ｅ）配列番号４８のＬＣＤＲ３、又はその機能的バリアント（機能的バリアントは、本明細書で定義されるとおりである）を含む本明細書に記載されるとおりの結合分子である。

【0223】

いくつかの実施形態では、第２の結合分子は、ＣＣＲ９に結合し且つＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のセットを有する重鎖可変（ＶＨ）領域並びにＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む結合分子であり、ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含み、且つＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号４８のＬＣＤＲ３を含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、第２の結合分子は、ＣＣＲ９に結合し且つ
ａ）配列番号７２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域；及び
ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む結合分子である。

【0225】

５．５ ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本発明の結合分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。

【0226】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。

【0227】

いくつかの実施形態では、結合分子が、２種以上のポリペプチド鎖を含む場合（例えば、結合分子が、免疫グロブリン分子又は少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含むその断片である場合）、ポリヌクレオチドは、結合分子のポリペプチド鎖の１つ、いくつか、又は全てをコードする。例えば、ポリヌクレオチドは、結合分子の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、結合分子のＶＨ領域をコードする。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、結合分子のＶＬ領域をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、結合分子のＶＨ領域及びＶＬ領域をコードする。

【0228】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに、リーダー配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するために分泌配列として機能する）をコードする。

【0229】

上記のポリヌクレオチドのバリアントは、本発明により包含される。ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、又は両方に変更を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、又は欠失を生じさせるが、コードされるポリペプチドの特性又は活性を変化させない変更を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、遺伝暗号の縮重によるサイレント置換によって作製される。様々な理由で、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主により優先されるものに変化させる）ために、ポリヌクレオチドバリアントが作製され得る。

【0230】

別の態様では、プロモーターと作動可能に結合された本発明のポリヌクレオチドを含むか；又は本発明の結合分子及び本発明の結合分子のＶＨ領域をコードするポリヌクレオチド及び本発明の結合分子のＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド（前記ポリヌクレオチドは、１つ以上のプロモーターと作動可能に結合される）を含むベクターが提供される。本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の転写を駆動することによってポリヌクレオチド配列の発現を調節する任意の核酸配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「作動可能に結合される」及び「作動可能に連結される」は、プロモーターが、それが転写開始及び／又は当該配列の発現を制御するために調節するポリヌクレオチド配列に対して妥当な機能的位置及び／又は方向にあることを意味する。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域及びＶＬ領域をコードする核酸配列は、同じプロモーターと作動可能に結合される。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域及びＶＬ領域をコードする核酸配列はそれぞれ、別々のプロモーターと作動可能に結合される。いくつかの実施形態では、別々のプロモーターは、同じ型のプロモーターである。いくつかの実施形態では、別々のプロモーターは、異なる型のプロモーターである。

【0231】

ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。ベクターに構築されると、本発明のポリヌクレオチドは、所望の宿主におけるポリペプチドの発現に適切なプロモーターに作動可能に連結され得る。

【0232】

ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を制御する追加の核酸配列を含み得る。例えば、ベクターは、エンハンサー及びリプレッサー配列の１つ以上を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「エンハンサー」は、ポリヌクレオチドの転写活性化を増大させる１つ以上のタンパク質に結合する核酸配列を意味する。本明細書で使用する場合、用語「リプレッサー」は、ポリヌクレオチドの転写活性化を低減する１つ以上のタンパク質に結合する核酸配列を意味する。

【0233】

本明細書で提供される別の態様は、本発明のポリヌクレオチド若しくは本明細書で開示されるとおりのポリヌクレオチドを含む宿主細胞、又は本発明のベクター若しくは本明細書で開示されるとおりのベクターを含む宿主細胞であり、宿主細胞は、ポリヌクレオチド又はベクターによってコードされるポリペプチドを生成することができる。

【0234】

本明細書で提供される別の態様は、本発明の結合分子を生成する方法であって、宿主細胞において本発明のポリヌクレオチド又はベクターを発現することを含む方法である。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、宿主細胞中に存在するポリヌクレオチド又はベクターによってコードされる本発明の結合分子を生成するのに好適な条件下で宿主細胞を培養することを含む。

【0235】

本発明の結合分子の発現のための好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、昆虫、又はより高等な真核生物細胞（好ましくはポリヌクレオチドが適切なプロモーターの制御下にある）が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が挙げられる。より高等な真核細胞としては、本明細書中に記載の哺乳動物起源の樹立細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系も使用され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、結合分子のＦｃ領域をフコシル化しない細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＧＤＰ－Ｄ－ラムノースを生成するフコース経路を転用する酵素を発現する細胞である。

【0236】

５．６ 非フコシル化
抗体エフェクター機能は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗体の生成を介して改変され得る。例えば、フコシル残基の量が減少した非フコシル化／低フコシル化抗体、又はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの、変更された型のグリコシル化を有する抗体が作製され得る。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組み換え抗体を発現し、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、このような細胞株内で発現した抗体は低フコシル化を示す。ＰＣＴ公開国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結した糖に結合する能力が低下したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載し、それらはまた、その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化をもたらす（［５］も参照のこと）。ＰＣＴ公開国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、操作された細胞株内で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載する（［６］も参照のこと）。国際公開第２０１１／０３５８８４Ａ１号パンフレットは、それらの糖部分上でフコースを欠く分子を生成するためのプロセスを記載する。国際公開第２０１１／０３５８８４Ａ１号パンフレットは、特に、分子を生成するための細胞を記載し、細胞は、基質としてＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースを使用する少なくとも１つの酵素を含み、酵素は、基質をＧＤＰ－Ｄ－ラムノース、ＧＤＰ－Ｄ－ペロサミン、ＧＤＰ－デオキシ－Ｄ－タロース、ＧＤＰ－６－デオキシ－ダルトロース、又はＧＤＰ－４－ケト－３，６－ジデオキシ－Ｄ－マンノースに変換する

【0237】

５．７ キット及びさらなるアッセイ
一態様では、本発明の結合分子を含むキットが提供される。本発明の方法での前記キットの使用がさらに包含される。

【0238】

いくつかの実施形態では、キットはさらに、単離された（例えば、精製された）抗原又は抗原を発現する細胞を含む。例えば、キットはさらに、単離された（例えば、精製された）ＣＣＲ９、又はＣＣＲ９を発現する細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるとおりの検出アッセイを実施するのに必要及び／又は十分な構成成分の全てを含み、それには、全ての対照、アッセイを実施するための指示書、及び結果の分析及び提示のための任意の必要なソフトウェアが含まれる。

【0239】

本発明の結合分子は、当技術分野で知られる任意の方法による免疫特異的結合に関するアッセイにおいて使用され得る。使用され得るイムノアッセイとしては、限定はされないが、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合及び非競合アッセイ系が挙げられる。

【0240】

本発明の結合分子は、例えば、ＣＣＲ９又はその保存されたバリアント若しくはペプチド断片のインサイチュ検出のために、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法、又は非免疫学的アッセイの場合のように、組織学的に利用され得る。インサイチュ検出は、患者から組織標本を切除し、それに標識された本発明の結合分子をアプライすることにより（例えば、標識された本発明の結合分子を生体試料上に重ね合わせることによりアプライされる）達成され得る。そのような手順の使用により、ＣＣＲ９、又は保存されたバリアント若しくはペプチド断片の存在だけでなく、被験組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、そのようなインサイチュ検出を実現するために多種多様な組織学的方法（染色手順など）のいずれかが改変され得ることを容易に理解するであろう。

【0241】

【表3】

【0242】

【表4】

【0243】

【表5】

【0244】

【表6】

【実施例】

【0245】

５．８ 実施例１－様々な細胞及び組織におけるＣＣＲ９発現
細胞は、ヒトにおける様々な組織及びカニクイザルから単離された。ＣＣＲ９を発現した所与の組織及び／又は所与の細胞型由来の細胞の比率は、フローサイトメトリーを使用して決定された。

【0246】

図１Ａに示されるとおり、ＣＣＲ９及びＣＤ４の両方を発現する細胞は、ヒト及びカニクイザル組織の両方の結腸、回腸及び胸腺において見出され、カニクイザル組織における腸間膜リンパ節中でも見出された。対照的に、ＣＣＲ９＋ＣＤ４＋細胞は、血液中において低レベルでしか存在しなかった。ＣＣＲ９ ｍＲＮＡが、カニクイザル回腸のＣＤ３＋細胞と共発現されたことも見出された（データは示さず）。

【0247】

ＣＣＲ９発現は、ヒト組織において評価された。ＣＣＲ９発現細胞の最大の比率は、胸腺のＣＤ４＋細胞において見出され（ＣＣＲ９を発現する細胞の７６％）、高いレベルは、ＩＢＤ患者の回腸のＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＣＲ９を発現する細胞の４７％）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＣＲ９を発現する細胞の３７％）においても見られた。一部のＣＣＲ９発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＣＲ９を発現する細胞の９％）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＣＲ９を発現する細胞の１２％）であったＩＢＤ患者の結腸の細胞においても見られ、ＩＢＤ患者の血液中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＣＲ９発現細胞はごく少数であった（＜５％）。ＣＣＲ９発現は、血液中のＢ細胞の２８％において見られ、結腸及び回腸中のＢ細胞においてより低いレベルであった（それぞれ１１％及び１６％）。非常に少数の単球、樹状細胞（ＤＣ）及び形質細胞様の樹状細胞（ｐＤＣ）のみが、ＣＣＲ９を発現した（＜５％）。

【0248】

図１Ｂは、健康な患者及びＩＢＤ患者の回腸（左のチャート）及び結腸（右のチャート）におけるＣＣＲ９を発現するＢ細胞のパーセンテージを示す。各Ｂ細胞型（ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、血漿細胞）に関して、健康な対象からの結果は左に提供され、ＩＢＤ患者に関する結果は右に提供される。ＩＢＤにおいてＣＣＲ９を発現するＢ細胞の数の減少があり、メモリーＢ細胞において最大の減少が観察されたことが見出された。これは、ＩＢＤにおいて受容体内部移行を駆動する高いＣＣＲ９リガンド発現に起因する可能性があると仮定される。

【0249】

図１Ｃは、ＣＣＲ９を発現する健康な対象又はＩＢＤ患者の結腸又は回腸由来のＴエフェクター細胞及びＴｒｅｇのパーセンテージを示す。示される各組織型に関して、ＣＣＲ９を発現するＴエフェクター細胞の％は左に示され、ＣＣＲ９を発現するＴｒｅｇの％は右に示される。健康な患者とＩＢＤ患者の間で組織型におけるＴエフェクター／Ｔｒｅｇ比に明白な相違はないことが見出された。

【0250】

５．９ 実施例２－ＣＣＲ９と炎症性サイトカイン発現の関連
炎症性サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、及びＩＬ－１７の共発現は、フローサイトメトリーを使用してヒトＣＤ４＋ＣＣＲ９＋及びＣＤ４＋ＣＣＲ９－細胞において評価された。細胞は、ヒト結腸又は回腸から単離され、サイトカイン産生を刺激するためにＰＭＡ／イオノマイシン及びブレフェルジンＡ（タンパク質輸送阻害剤）で４時間処理された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋及びＣＤ８－であった単一の生存細胞に基づいてゲーティングすることによって同定された。ＣＤ４＋ＣＣＲ９＋細胞は、ＣＤ４＋ＣＣＲ９－細胞より高いレベルの炎症性サイトカインを発現することが見出された（図２Ａ）。ＣＤ４＋ＣＣＲ９－細胞とＣＤ４＋ＣＣＲ９＋細胞の間のレベルの相違は、ＩＬ－１７の発現に関して最大であったが（２倍～６倍の増加範囲）、相違の平均値は、ＩＬ－４及びＩＦＮ－γの両方に関しておよそ２～３倍のままであった（図２Ｂ）。

【0251】

５．１０ 実施例３－抗ＣＣＲ９抗体の作製
抗ＣＣＲ９抗体は、ヒトＣＣＲ９及びマウスＣＣＲ９過剰発現ＨＥＫ細胞株をＣＤ１マウスに交互に免疫した後、ハイブリドーマ技術を使用して作製された。３つの群のマウスが使用された。群１に関して、マウスは、ｈＣＣＲ９を過剰発現するＣＨＯ及びＨＥＫで交互に免疫された；群２のマウスは、ｈＣＣＲ９を過剰発現するＨＥＫ細胞及びｍＣＣＲ９を過剰発現するＨＥＫ細胞で交互に免疫された；群３のマウスは、ｍＣＣＲ９を過剰発現するＨＥＫ細胞で免疫された。組み換え細胞株は、ＰＢＳ中で希釈された１ｅ７細胞／１００μＬで投与され、等体積のフロイント完全アジュバントで乳化し、部位毎に１００μＬで２つの部位にてマウスに注射された。その後の３回の注射のために、細胞をフロイント不完全アジュバントで乳化し、上記のとおりに注射が実施された。最終の追加免疫は、ＰＢＳ中の２００μＬの細胞を腹腔内注射することによって２４日目に実行された。

【0252】

尾静脈出血が、免疫前、初回免疫後の１３日目、及び２回目の免疫後の２０日目にマウスから得られた。ヒトＣＣＲ９、マウスＣＣＲ９並びに親ＨＥＫ及びＣＨＯ細胞に対するＩｇＧ力価は、血清ＥＬＩＳＡによって決定された。最も高い抗原特異的力価を有する動物が、ハイブリドーマ作製に進められた。

【0253】

５．１０．１ ｈＣＣＲ９及びｍＣＣＲ９に対するマウス免疫応答の評価
ｈＣＣＲ９及びｍＣＣＲ９に対する個々のマウスの血清ＩｇＧ力価は、ＥＬＩＳＡによって決定された。親ＨＥＫ及びＣＨＯ細胞とともに、上記のｈＣＣＲ９及びｍＣＣＲ９ ＨＥＫ及びＣＨＯ細胞株が、４０，０００細胞／ウェルで９６ウェルポリ－Ｄ－リジンマイクロタイタープレート上に塗布され、ＣＯ_２インキュベーター中において３７℃で一晩培養された。一晩のインキュベーションの後、上清を除去し、細胞を、ホルムアルデヒド／ＰＢＳの３．７％溶液中において室温で５分間固定した。その後のすべてのインキュベーションは室温で実施した。ホルムアルデヒド溶液の除去の後、ウェルを、３％ ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳブロッキング緩衝液の添加によりブロッキングした。１時間後、ブロッキング緩衝液を除去し、ウェルをＰＢＳで再び洗浄し、血清試料を希釈系列（５０μＬ／ウェルで１：２００希釈から開始）で添加した。１時間インキュベートした後、ウェルを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したＰＢＳで３回洗浄した。次に、Ｄｌｆｉａアッセイ緩衝液中の１：５００のユーロピウム標識抗マウスＩｇＧ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、ウェル当たり５０μＬでウェルに加えた。さらに１時間のインキュベーション及び上のとおりの５回の洗浄の後、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、ウェル当たり５０ｕｌでウェルに加え、プレートをオービタルシェーカー上において室温で１０分間インキュベートした。次に、プレートを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３多標識プレートリーダーを使用して読み取った。

【0254】

ｈＣＣＲ９、ｍＣＣＲ９、並びに親ＨＥＫ及びＣＨＯ細胞に関する血清滴定曲線をプロットし、それぞれの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。

【0255】

５．１０．２ モノクローナルマウスＩｇＧ単離
最終の追加免疫の４日後、リンパ節を無菌的に採取し、細胞を機械的破壊によって単離し、計数した。これらの細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と混合し、電気融合装置を用いて融合した。得られた融合物をメチルセルロースに基づく半固形培地と混合し、ＯｍｎｉＴｒａｙプレートに蒔いた。半固形培地は、ＣｌｏｎｅＭａｔｒｉｘ及び２０％ＦＣＳ、１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及びＯＰＩ培地添加物、２％ヒポキサンチンアザセリン及びＦＩＴＣ結合型ヤギ抗マウスｇＧが添加されたＤＭＥＭを含んだ。半固形培地中の細胞は、５％ ＣＯ_２インキュベーター中において３７℃で１３日間培養した。このインキュベーション期間中、クローンコロニーが単一の前駆ハイブリドーマ細胞から形成される。これらのコロニーは、半固形培地中に存在するＦＩＴＣ結合型抗ＩｇＧによりコロニー近傍で捕捉されるＩｇＧを分泌する。結果的に生じる免疫複合体の形成は、ＣｌｏｎｅＰｉｘ ＦＬコロニーピッカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって可視化されるとき、蛍光「ハロー」として細胞周囲で認めることができる。次に、これらのハローを伴うコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに採取する。

【0256】

培養の３～５日後、採取されたコロニーの上清を収集し、ＣＣＲ９結合に関して選別した。

【0257】

５．１０．３ ＤＮＡシークエンシング及びマウスＩｇＧの精製
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をハイブリドーマ細胞から磁気オリゴ（ｄＴ）粒子を用いて抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。全てのマウスＩｇＧサブクラスに特異的なポリ－Ｃ及び定常領域ＶＨ又はＶＬプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。

【0258】

５．１０．４ マウスＩｇＧ精製
細胞は、２４ウェルプレート内で増殖し、ＨｙｐｅｒＺｅｒｏ及びグルタミンを添加した無血清ＨＬ－１培地中で過増殖した。１０日後、上清を９６ウェルマスターブロックに移し、全てのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３）のマウスＩｇＧを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｍｉｎｉｔｒａｃｋを使用してＰｒｏＰｌｕｓレジン（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）上で過増殖した細胞培養上清から精製した。捕捉されたマウスＩｇＧを、７５μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ３．０で溶出させ、続いて等体積の２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０で中和した。精製したＩｇＧを、ＵＶ－Ｓｔａｒ ３８４ウェルプレート内で２８０ｎｍでの吸光度読み取りを用いて定量化した。

【0259】

５．１０．５ マウスＩｇＧの再フォーマット
マウスハイブリドーマＩｇＧクローンは、以下の改変を有するＰｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ １９９７［７］によって基本的に記載されるとおり、各ハイブリドーマに関してマウスＶＨ及びＶＬドメイン並びに適切なマウスＩｇＧ定常ドメインを発現するコンストラクトを生成するように分子的に再フォーマットされた。ＣＨＯ一過性細胞との使用を容易にし、且つエピソーム複製を可能にするため、発現ベクターにＯｒｉＰ断片を含めた。マウス重鎖定常ドメイン及び調節エレメントを含有する適切なベクターにＶＨドメインをクローニングして、哺乳類細胞において全ＩｇＧ１重鎖を発現させた。同様に、適切なマウス軽鎖（ラムダ又はカッパ）定常ドメイン及び調節エレメントの発現のためのベクターにＶＬドメインをクローニングして、哺乳類細胞において全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。ＩｇＧを得るために、哺乳動物懸濁ＣＨＯ細胞を、重鎖及び軽鎖ＩｇＧベクターで一過的にトランスフェクトした。ＩｇＧを発現させて、培地に分泌させた。回収物を濾過した後に精製し、続いてプロテインＡクロマトグラフィーを用いてＩｇＧを精製した。培養上清を、適切なサイズのＣｅｒａｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｐａｌｌ ２００７８－０３６）のカラム上にロードし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。結合されたＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用してカラムから溶出させ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加によって中和した。溶出された材料を、Ｎａｐ１０カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｓｅｓ、１７－０８５４－０２）を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換した後、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用して、ＩｇＧの濃度を分光測光法により決定した［８］。精製されたＩｇＧを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して純度について分析した。精製されたＩｇＧを、ＨＥＫ細胞上でのヒトＣＣＲ９への結合に関して選別した。

【0260】

図３は、この選別において同定された９個の固有のヒットに関する可変重鎖（図３Ａ）及び可変軽鎖（図３Ｂ）配列のアミノ酸配列を示す。例えば、ＡＢ１０２０２４３のためのｃＤＮＡを、クローンＺＹ１０ＯＩ－Ａ０２から調製し、ＶＨ及びＶＬドメインに関する配列を決定した。ＦＷ＝フレームワーク領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔの割り当てによって指定されるとおりに下線が引かれる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。ヒト化ＡＢ１０２０２４３（ＡＢ１０２０２４３－ｆｇｌ）のＶＨ及びＶＬ配列は、図４に示され、それらは、元のキメラ配列とアライメントされる。

【0261】

ＡＢ１０２０２４３の効力及び有効性をさらに向上させるために、Ｈ及びＬ ＣＤＲの特異的なスキャニングによる変異誘発が実施された。ＣＤＲは、低多重度の偏ったヌクレオチド（ＮＮＣ）コドン混合物を有する哺乳動物発現ベクターの部位特異的変異誘発によって変異され、代替のアミノ酸（ａａ）の存在量を最大化するために設計された一方で、ライブラリーから望ましくないアミノ酸（Ｍｅｔ、Ｔｒｐ）を除去した。５６６種のＣＤＲバリアントが生成され、ヒト化ＡＢ１０２０２４３のＣＤＲ最適化バージョンが作製された。スクリーニングライブラリーを、２４ウェルディーププレートからＣＨＯ細胞中において発現させた後、バリアントのプロテインＡ精製を行った。改善されたバリアントの同定の後、ＣＤＲ内及びＣＤＲ間の組み換えを、部位特異的変異誘発によって実施して、有利なバリアントをａ－ｆｕｃ ｈｕＩｇＧ１としての最終的なリード抗体候補に合わせた。ＣＤＲ最適化抗体ＡＢ２４３ＬＯ０３３１及びＡＢ２４３ＬＯ０３２６のＶＨ及びＶＬ配列は、図４に示され、それらは、ＡＢ１０２０２４３由来の親配列、及びＡＢ１０２０２４３のヒト化形態とアライメントされる。改変されているＬＣＤＲ１残基は、太字で下線が引かれた文字で示される。

【0262】

５．１１ 実施例４－ＣＣＲ９結合及び効力の評価
５．１１．１ 細胞結合
ＣＣＲ９発現細胞に対する抗体の結合は、ヒトＣＣＲ９Ａを過剰発現するＨＥＫ細胞を使用するか、又はＭｏｌｔ４細胞を使用して評価された。Ｍｏｌｔ４細胞株は、ヒトＴ細胞から得られ、ＣＣＲ９を発現することが知られる［９］。試験抗体を、１％ウシ胎仔血清が補充されたＰＢＳ中において１０μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。抗体を、９６ウェルプレート上で８点にわたって３倍滴定を使用して単一の点として滴定し、細胞を４℃で２０分間染色した。細胞を洗浄し、無菌ＰＢＳ＋１％ ＦＢＳ血清中において２．５μｇ／ｍｌの二次ヤギ抗マウス又はヒトＩｇＧ ＰＥにより４℃で２０分間染色した。

【0263】

図５Ａは、少なくともＡＢ１０２０２４３、ＡＢ１０２０２２９、及びＡＢ１０２００１１がＭｏｌｔ４細胞に結合したことを示す。Ｍｏｌｔ４細胞に対する結合は、ヒトＣＣＲ９を発現しないジャーカット細胞に対する結合と比較された。図５Ｂに示されるとおり、Ｍｏｌｔ４細胞に対する結合は、図５Ａに見られるものと同様であったが、ジャーカット細胞に対する著しい結合は検出されなかった。

【0264】

抗体ＡＢ１０２０２４３（ハイブリドーマｍＩｇＧ）もまた、異なる形態のＣＣＲ９に対する結合に関して試験された。簡潔に述べると、試験抗体を、ハンクス平衡塩溶液（Ｓｉｇｍａ ＨＢ２６４）と０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａ９５７６）を含有するアッセイ緩衝液中において６０ｕｇ／ｍＬの濃度に希釈した。抗体は、試験抗体の最終体積がウェル当たり１０ｕＬであるように、３８４黒色透明底の非結合マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＮＢＳ（商標）３６５５）上で２４点にわたって単倍滴定を使用して二つ組で滴定された。二次検出抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０９－６６５－０８２）を、製造業者の指示書に従って調製し、上記のとおりのアッセイ緩衝液中で１：１０００に希釈した。二次検出抗体を、ウェル当たり１０ｕＬの体積でＭｕｔｉｄｒｏｐディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して試験抗体を含有するアッセイプレートに分注した。

【0265】

トランスフェクトされたＨＥＫ ＣＣＲ９過剰発現細胞株又はトランスフェクトされていない親対照細胞を、ｍｌ当たり１×１０^６細胞の濃度でアッセイ緩衝液中において懸濁させ、１０ｕＬの細胞を、Ｍｕｔｉｄｒｏｐディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して試験抗体及び二次抗体を含有するアッセイプレートに分注した。アッセイプレートを４℃で一晩インキュベートし、４８８ｎｍの励起及びＦＬ４チャンネル（６６７～６８５ｎｍ）を使用する発光を使用して、ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）（レーザースキャニング蛍光サイトメーター；ＴＴＰ－Ｌａｂｔｅｃｈ）上で読み取った。データを、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．０．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）においてプロットし、蛍光（ＦＬ４）カウントに対してＬｏｇ（ｍｇ／ｍＬ抗体）として表した。図６に示されるとおり、それは、ＣＣＲ９（ＣＣＲ９Ａ及びＣＣＲ９Ｂ）のヒト形態及びカニクイザルＣＣＲ９の両方に対してＡＢ１０２０２４３の良好な結合を示した。それは、マウス又はラットＣＣＲ９に対してはほとんど又は全く結合を示さなかった。

【0266】

５．１１．２ インビトロＡＤＣＣバイオアッセイ
抗体の効力及びエフェクター機能は、以下のとおりのＮＫ細胞活性化アッセイを使用して評価された： 全ての効力アッセイを、５：１のエフェクター（ＮＫ－９２ ＭＩ ＣＤ１６ａ ＮＦＡＴ細胞）と標的（Ｍｏｌｔ４；ＨＥＫ ＣＣＲ９過剰発現細胞又はジャーカット細胞）比で実行した。エフェクターＮＫ－９２細胞株は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６）を天然に発現しない。Ｆｃドメインへの結合が増大した高親和性（ｈａ）ＣＤ１６ Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ受容体を過剰発現するＮＫ－９２の改変形態を使用した（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１６ Ａｐｒ １６－２０；Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ）：ＡＡＣＲ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６；７６（１４ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ２３０２）。この受容体は、標的細胞に結合される抗体を介してＮＫ細胞を標的細胞に架橋させる。使用されるＮＫ－９２細胞もまた、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターを発現し、これがエフェクター機能のための代理として使用され得る。ＮＫ細胞に対する標的結合抗体の結合は、ＮＦＡＴ転写因子の活性化を誘導し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する。発光シグナルは、ＡＤＣＣ活性に比例する。

【0267】

標的細胞及びエフェクター細胞の両方が、１０％ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標）；１６２５０－０７８）とともに改良型ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ（商標）；１２６３３）を含有するアッセイ培地中で調製された。標的細胞を、ｍＬ当たり８×１０^５細胞の濃度で再懸濁させ、エフェクター細胞を、ｍＬ当たり８×１０^６細胞の濃度で再懸濁させた。試験抗体を、６０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、二つ組の４倍滴定を、３８４ウェルポリプロピレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；７８１２８０）上で１２点にわたって実施した。

【0268】

標的細胞を、ウェル当たり１２．５μＬの体積でＭｕｔｉｄｒｏｐディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３８４ウェル白色透明底組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３５６０）中に分注した。次に、試験抗体（ウェル当たり６．２５μＬ）を、Ｂｒａｖｏ自動リキッドハンドリングプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して標的細胞含有プレートに加えた。標的細胞及び抗体を、Ｏ_２／ＣＯ_２インキュベーター中において３７℃で３０分間プレインキュベートした。次に、エフェクター細胞を、ウェル当たり６．２５μＬの体積でＭｕｔｉｄｒｏｐディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して加えた。標的細胞、エフェクター細胞及び抗体を含有するアッセイプレートを、Ｏ_２／ＣＯ_２インキュベーター中において３７℃でさらに５時間インキュベートした。

【0269】

インキュベーション期間の最後に、ルシフェラーゼ検出試薬を、製造業者の指示書（Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２５２０）に従って調製し、２５μＬを、手動でのピペッティングを使用して各ウェルに分注した。アッセイプレートをホイルで覆い、プレート振盪機上で室温にて２０分間溶解を起こさせた。アッセイプレートを、超高感度発光モードを使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０５マルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。データを、反応ロジスティック方程式に対して４パラメーターｌｏｇ（アゴニスト）を使用してＷｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．０．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）において分析した。データは、反応（毎秒のカウント）に対するＬｏｇ（モル濃度）抗体濃度として表された。

【0270】

図７は、ＭＯＬＴ４／ＨＥＫ細胞に結合されるときの（非フコシル化）抗体によるＮＫ細胞活性化を示す。抗体の非フコシル化形態は、二重発現カセットから生成され、それにより重鎖ＩｇＧ発現が、ＣＨＯ細胞においてＲＭＤ酵素と共発現されて、非フコシル化タンパク質を生成した。ヒトＣＣＲ９Ａを発現するＨＥＫ細胞に結合されるときのＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃ抗体の効力は、０．５ｎＭとして測定された。Ｍｏｌｔ４細胞に結合されるときのヒト化ＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃ抗体の効力は、０．８ｎＭとして測定された。

【0271】

５．１１．３ ＰＢＭＣ死滅アッセイ
抗体を、８点にわたって１０μｇ／ｍＬの開始濃度で段階的に滴定（１０倍）した。抗体を、ｕ底９６ウェルプレート中の１×１０^６ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に加え、一晩インキュベートした。翌日、残存するＣＣＲ９発現ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを、非競合ＣＣＲ９抗体を使用してフローサイトメトリーによって測定した。非競合抗体のＶＨ／ＶＬ及びＣＤＲ配列は、表５及び表６に示される。図８に示されるとおり、抗体ＡＢ１０２０２４３、ＡＢ１０２０２２９及びＡＢ１０２００１１の全てが、ＣＣＲ９＋ＰＢＭＣの死滅を示した。ＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃに関するＥＣ５０（ｎ＝４）は、２．６ｎＭとして測定された。

【0272】

【表7】

【0273】

【表8】

【0274】

【表9】

【0275】

５．１２ 実施例５－ヒト化ＡＢ１０２０２４３の特性
ヒト化ＡＢ１０２０２４３を、実施例３の場合のように生成した。本明細書の上記の全ての実験において、ヒト化ＡＢ１０２０２４３は、二重発現カセットから生成された非フコシル化形態にあり、それによって重鎖ＩｇＧ発現が、ＣＨＯ細胞においてＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）と共発現されて、非フコシル化タンパク質を生成した。

【0276】

５．１２．１ ヒト化ＡＢ１０２０２４３のＣＣＲ９交差反応性
親ＡＢ１０２０２４３抗体（キメラ）の結合が、実施例４に記載される方法に基づいてヒト化バージョンのものと比較された。

【0277】

図９に示されるとおり、ヒト化抗体（「ヒト」）は、カニクイザルＣＣＲ９及びヒトＣＣＲ９Ｂを発現するＨＥＫ細胞に対して親ＡＢ１０２０２４３（「キメラ」）と同様の結合を保持した（図９Ａ及び図９Ｂ）。ＣＣＲ９を発現しない親ＨＥＫ ＪＩ細胞株に対しては著しい結合は見られなかった（図９Ｇ）。より高い濃度でさえ、ヒト化ＡＢ１０２０２４３は、ＣＸＣＲ１（図９Ｃ）、ＣＸＣＲ２（図９Ｄ）、ＣＣＲ５（図９Ｅ）又はＣＣＲ８（図９Ｆ）に対して著しいオフターゲット結合を示さなかった。

【0278】

５．１２．２ ヒト化ＡＢ１０２０２４３は高い効力を保持する
ＡＢ１０２０２４３のヒト化は、驚くべきことに、ＮＫ細胞活性化アッセイにおいて効力の著しい変化をもたらさなかった（図１０）。ＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃのキメラ及びヒト化形態は、ＭＯＬＴ４細胞を使用して上記のＮＫ－９２細胞株の同程度の活性化をもたらした。これは、効力の大きい低減がヒト化後に観察されたベンチマークの非フコシル化マウス抗ＣＣＲ９ ＩｇＧ１抗体（３Ｃ３、ＡＴＣＣ ＨＢ－１２６５３）と対照的である。同様に、ヒト化は、カニクイザルＣＣＲ９Ａを過剰発現するＨＥＫ細胞に結合されるＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃの効力を変化させなかった。

【0279】

ＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃ抗体の動力学的特性は、ヒト化によって著しく変化しないことも見出された。ＣＣＲ９＋生存細胞の測定は、Ｌｉｇａｎｄ Ｔｒａｃｅｒ技術を使用して、蛍光標識された抗体を使用してなされた。簡潔に述べると、細胞に対する親和性は、室温（約２２℃）で６３３ｎｍの蛍光検出器を使用してＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ機器（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で測定された。ヒトＩｇＧ１形式におけるＩｇＧは、ＩｇＧのＣＨ２領域上の操作されたシステイン残基に対してＤｙＬｉｇｈｔ ６５０マレイミドフルオロフォアで特異的に標識された。標識されたＩｇＧを、ＣＨＯ Ｋ１親（対照）及びＣＣＲ９発現ＣＨＯ Ｋ１細胞の予め付着された別々のスポットを有する環状Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄプレートに加えた。ＩｇＧ結合及び解離蛍光プロファイルが、その機器上で測定され、続いてＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒソフトウェア（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内の二価（１：２）型フィットモデルで分析された。ＡＢ１０２０２４３ ａｆｕｃのｏｆｆ速度（ｋ_ｄ）は、３．８５×１０^－５ｓ^－１として測定され、これはヒト化後も同様のままであり、４．３×１０^－５ｓ^１として測定された。これは、ヒト化時に効力の低減が観察されないことと一致する（図１０Ｂ）。

【0280】

５．１２．３ ＣＣＬ２５と競合する能力
ヒト化ＡＢ１０２０２４３は、ＨＴＲＦ ＩＰ－Ｏｎｅ Ｇｑアッセイ（Ｃｉｓ－Ｂｉｏ；６２ＩＰＡＰＥＢ）においてＣＣＬ２５と競合するその能力に関して試験された。ＩＰ－Ｏｎｅアッセイは、テルビウムクリプテート標識抗ＩＰ１ Ｍａｂ及びｄ２－標識ＩＰ１を使用する競合イムノアッセイである。ＩＰ１は、ＩＰカスケードの下流の代謝産物であり、Ｇｑ受容体の活性化後に細胞中に蓄積し、ＬｉＣｌの存在下で安定である。ＬｉＣｌを、細胞刺激緩衝液に加え、受容体活性化時にＩＰ１の蓄積を引き起こす。

【0281】

試験抗体を、ＩＰ－ｏｎｅ緩衝液（クレブス・リンゲル溶液＋ＬｉＣｌ）中に緩衝液交換し、３８４ウェルポリプロピレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；７８１２８０）上で１６点にわたってｏｎｅとｏｎｅ希釈系列を使用してＩＰ－ｏｎｅ緩衝液中の純粋なものから段階希釈し（三つ組）、３．５ｍＬの各抗体を、Ｂｒａｖｏ自動リキッドハンドリングプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して白色３８４底浅プレート（Ｃｏｓｔａｒ；４５１３）に加えた。ＭＯＬＴ ４細胞を収集し、ＩＰ－Ｏｎｅアッセイ緩衝液中において５．４×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させ、７．５μＬの細胞を、最終細胞濃度が４０，０００細胞／ウェルになるようにＭｕｔｉｄｒｏｐディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抗体含有プレートに分注した。抗体を、細胞と３０分間プレインキュベートした。組み換えヒトＣＣＬ２５／ＴＥＣＫタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；９０４６－ＴＫ）を、製造業者の指示書に従って２００ｎＭに再構成し、３．５ｕＬを、最終アッセイ濃度が５０ｎＭになるようにＭｕｔｉｄｒｏｐディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抗体及び細胞含有プレートに分注した。アッセイプレートを、３７℃で９０分間インキュベートした後、キットとともに提供される試薬を使用してＩＰ－Ｏｎｅ ＨＴＲＦプロトコルに従って処理した。図１１は、ヒト化ＡＢ１０２０２４３及びＣＤＲ最適化抗体２３４ＬＯ０３３１及び２４３ＬＯ０３２６が、親キメラＡＢ１０２０２４３抗体と同様のＣＣＬ２５と競合する能力を保持することを示す。したがって、本発明の抗体は、例えば、ＣＣＲ９＋ＭＯＬＴ－４細胞のＣＣＬ２５に誘導される遊走を阻害せず、且つＭＯＬＴ－４細胞への結合に関してＣＣＬ２５と部分的にさえ競合しない前に記載されたマウスＣＣＲ９抗体９２Ｒ及び９１Ｒと対照をなす［４］。

【0282】

５．１３ 実施例６－ＣＤＲ最適化抗体の特性
実施例３に記載されるとおり、ヒト化ＡＢ１０２０２４３のＣＤＲ最適化形態が生成された。本明細書に記載される全ての実験において、ＣＤＲ最適化抗体は、非フコシル化形態であった。ＣＤＲ最適化抗体をフォーマットして、ＬＣＤＲ１におけるＡｓｎ脱アミド化のリスクを低減した。

【0283】

５．１３．１ ＣＣＲ９結合
ＣＤＲ最適化ＡＢ１０２０２４３は、実施例４に記載される方法に基づいて、ＣＣＲ９の様々な形態及び様々な細胞型に結合するその能力に関して試験された。図１２に示されるとおり、２４３ＬＯ０３２６及び親抗体ＡＢ１０２０２４３は、ヒトアイソタイプＣＣＲ９Ａ及びＣＣＲ９Ｂの両方、並びにカニクイザルＣＣＲ９Ａに対して同様の結合を示した。２４３ＬＯ０３２６及び２４３ＬＯ０３３１の両方は、高濃度でさえマウス又はラットＣＣＲ９に対して著しい結合を示さなかった（データは示さず）。２４３ＬＯ０３２６及び親抗体ＡＢ１０２０２４３もまた、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１又はＣＸＣＲ２に対するいずれのオフターゲット受容体結合も示さなかった。

【0284】

５．１３．２ 親和性
図１３Ａに示されるとおり、２４３ＬＯ０３２６は、長時間にわたって膜に結合したままであり、大部分の抗体は、３７℃で５時間後に細胞表面上に残存した。それに対して、細胞表面に結合された親抗体ＡＢ１０２０２４３の量は、最初の１時間で著しく減少した。親和性（Ｋ_Ｄ）は、２４３ＬＯ０３２６に関して０．０９ｎＭ及びＡＢ１０２０２４３に関して３．４ｎＭとしてＬｉｇａｎｄ Ｔｒａｃｅｒを使用して測定された。簡潔に述べると、細胞に対する親和性は、室温（約２２℃）で６３３ｎｍの蛍光検出器を使用してＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ機器（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で測定された。ヒトＩｇＧ１形式におけるＩｇＧは、ＩｇＧのＣＨ２領域上の操作されたシステイン残基に対してＤｙＬｉｇｈｔ ６５０マレイミドフルオロフォアで特異的に標識された。標識されたＩｇＧを、ＣＨＯ Ｋ１親（対照）及びＣＣＲ９発現ＣＨＯ Ｋ１細胞の予め付着された別々のスポットを有する環状Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄプレートに加えた。ＩｇＧ結合及び解離蛍光プロファイルが、その機器上で測定され、続いてＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒソフトウェア（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内の二価（１：２）型フィットモデルで分析された。

【0285】

図１３Ｂに示されるとおり、抗体処理を伴う膜上で、ＣＣＲ９受容体レベルにおけるごくわずかな低減が見られた。比較のために、ＣＣＬ２５処理は、膜上のＣＣＲ９受容体の大幅な減少を誘導した。抗ＣＣＲ９抗体は、ＣＣＬ２５に誘導される内部移行を妨げることができることがさらに示された（図１９）。

【0286】

５．１３．３ 効力
ＣＤＲ最適化ＡＢ１０２０２４３は、実施例４に記載されるとおりにＮＫ細胞活性化及びＰＢＭＣ死滅を誘導するその能力に関して試験された。図１４Ａは、ＮＫ細胞活性化アッセイにおける抗体の効果を示す。２４３ＬＯ０３２６は、親抗体ＡＢ１０２０２４３より強力であることが見出された。図１４Ｂは、２４３ＬＯ０３２６及び親抗体ＡＢ１０２０２４３によるＰＢＭＣの死滅を示す。２４３ＬＯ０３２６は、向上した効力を示し、ＡＢ１０２０２４３に関する２００ｐＭのＥＣ５０と比較して、４ｐＭのＥＣ５０を有した。図１４Ｃは、２４３ＬＯ０３４６が、同様のヒト及びカニクイザルＣＤ４＋ＣＣＲ９＋ＰＢＭＣの両方の死滅を誘導する能力を有し、ヒトＰＢＭＣを使用して４～５ｐＭで測定されるＥＣ５０及びカニクイザルＰＢＭＣを使用して３０ｐＭのＥＣ５０を有した。

【0287】

５．１３．４ 非フコシル化
抗ＣＣＲ９抗体の非フコシル化は、ＡＤＣＣ ＮＫ細胞活性化アッセイに示されるとおり、細胞死滅を増強する（図１５Ａ）。抗体（２４３ＬＯ０３２６）の効力に対するフコシル化のレベルの影響は、インビトロＡＤＣＣバイオアッセイを使用してフコシル化添加試験において評価された（第５．１１．２節を参照のこと）。抗体のＡＤＣＣ効力は、最大約１０％のフコシル化に関して、１００％の非フコシル化分子と比較して保持された。許容される効力は、最大５０％のフコシル化に関して保持された（図１５Ｂ）。

【0288】

【表10】

【0289】

５．１４ 実施例７－インビトロ及びインビボ効果
５．１４．１ カニクイザルにおけるＣＣＲ９＋細胞の抗体枯渇
サルは、アイソタイプ対照抗体及び１０ｍｇ／ｋｇの２４３ＬＯ０３２６の単回投与により静脈内注射された。ＣＣＲ９＋メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは、様々な時点の血液中で評価された。図１６Ａは、１５日目の血液中に存在するＣＣＲ９＋細胞の減少があり、１０ｍｇ／ｋｇの２４３ＬＯ０３２６が、この時点でＣＣＲ９＋細胞を完全に消失させたことを示す。特に、高用量及び低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で、２４３ＬＯ０３２６は、末梢血液（図１６Ｂ）、回腸（図１６Ｃ）及び粘膜（図１６Ｄ）においてＣＣＲ９＋Ｔ細胞を枯渇させた。ＣＣＲ９＋Ｔ細胞の枯渇は、組織及び細胞特異的であった（図１７）。２４３ＬＯ０３２６は、ＣＣＲ９＋腸リンパ球を選択的に枯渇させ、腸外の集団を比較的残し、胸腺Ｔ細胞に影響を及ぼさなかった。

【0290】

５．１４．２ 腸外植片モデル
腸粘膜層の６ｍｍパンチ生検は、Ｖａｄｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ［１０］に記載されるとおり、健康なヒト対象及び炎症性腸疾患を有するヒト対象から採取された。外植片組織を、２４３ＬＯ０３２６の存在下又は非存在下で１２～８４時間培養した。ＣＣＲ９＋細胞のパーセンテージは、炎症の重要なメディエーター：ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－２２とともに評価された。図１８は、抗体による治療が、試験された外植片の各々においてＣＣＲ９＋ＣＤ４＋細胞を枯渇させ（図１８Ａ）、炎症性メディエーターを減少させた（図１８Ｂ～図１８Ｄ）ことを示す。健康な対象の１名に由来する外植片組織もまた、高レベルのＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－２２を示し、これは抗ＣＣＲ９治療時に減少させられた。

【0291】

５．１５ 実施例７－抗ＣＣＲ９抗体は、ＣＣＬ２５に誘導されるＣＣＲ９内部移行を遮断する
ＩＨＣデータは、驚くべきことに、炎症したクローン回腸におけるＣＣＲ９の量的に低い発現があることを示唆する。エクスビボ、ＣＣＲ９は、ＣＣＬ２５による活性化後に内部移行し、炎症したクローン回腸においてより高いレベルで発現される。これは、炎症した腸において、病原性のＴ細胞上のＣＣＲ９が、ＣＣＬ２５による活性化後に内部移行されることを示唆する。それにもかかわらず、クローン回腸においてＣＣＲ９を発現する細胞は、炎症促進性及び常在性のメモリー表現型を示す。

【0292】

ＣＣＲ９の内部移行を検出アッセイにおいて、ＣＤＲ最適化非フコシル化抗体２４３ＬＯ０３２６は、２ｎＭの濃度でＣＣＬ２５に誘導される内部移行を妨げることができた（図１９）。ＣＣＬ２５に誘導される内部移行は、ＦＡＣＳによって評価された。有利に、ＣＣＬ２５に誘導される内部移行の遮断によって、受容体の再利用を妨げる。したがって、本発明の抗体は、ＡＤＣＣを有利に誘導し、ＣＲＲ９受容体のＣＣＬ２５リガンドを遮断し、ＣＣＲ９発現Ｔ細胞に対するＣＣＬ２５に誘導されるＣＣＲ９受容体再利用を妨げる。

【0293】

５．１６ 結論
まとめると、これらのデータは、抗ＣＣＲ９治療が、ＩＢＤを有する患者のための実行可能な治療選択肢であることを示す。炎症性サイトカインを発現するＣＲＲ９＋Ｔ細胞は、炎症性腸疾患を有する患者の腸及び血液において発現される（図１及び図２）。上記の抗ＣＣＲ９抗体は、ＣＣＲ９発現Ｔ細胞上のヒトＣＣＲ９に結合する（図５及び図６）。これらの抗体の非フコシル化バージョンは、ＮＫ細胞を活性化して、ＡＤＣＣを促進して（図７及び図１５）、標的化された細胞死滅を引き起こす（図８）。抗体クローンのうちの１つのヒト化は、驚くべきことに、キメラ親抗体と比較してヒトＣＣＲ９に対する抗体の親和性を低減せず（図９）、ＮＫ細胞を活性化する能力を維持し（図１０Ａ）、ＣＣＬ２５と競合する能力を保持した（図１１）。

【0294】

ヒト化抗体のうちの１つのさらなるＣＤＲ最適化が実施された。これらのＣＤＲ最適化非フコシル化抗体（２４３ＬＯ０３２６及び２４３ＬＯ０３３１）は、親抗体と比較して長期間膜結合ＣＣＲ９に結合し、０．０９～３．４ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）を有した（図１３）。ＣＤＲ最適化抗体はさらに、ＮＫ細胞活性化及びＰＢＭＣ死滅を誘導することができた。２４３ＬＯ０３２６は、ＡＢ１０２０２４３より強力であった（図１４）。２４３ＬＯ０３２６はさらに、ＣＣＬ２５に誘導されるＣＣＲ９内部移行を阻害することができる（図１９）。２４３ＬＯ０３２６治療はまた、血液中のＣＣＲ９ Ｔ細胞を減少させる（図１６）。ＩＢＤ患者由来の腸外植片組織の２４３ＬＯ０３２６治療は、ＣＣＲ９＋ＣＤ４＋細胞を枯渇させ（図１６Ａ）、炎症性メディエーターを減少させる（図１６Ｂ及び図１６Ｄ）。したがって、２４３ＬＯ０３２６は、高度に強力であり、ＣＣＲ９に特異的である。細胞枯渇はＡＤＣＣを介して生じるが；ＮＫ細胞などのＡＤＣＣエフェクター細胞の非存在下で、２４３ＬＯ０３２６はまた、ＣＣＲ９とそのリガンドＣＣＬ２５の間で結合を遮断する。

【0295】

本明細書で開示されるＣＣＲ９抗体が、ｈＣＣＲ９、ＣＣＲ９Ａ及びＣＣＲＢの両方のアイソフォームに結合することができ、ＣＣＲ９に対する結合に関してＣＣＬ２５と競合することができることから、エピトープは、ＣＣＲ９Ｂの細胞外Ｎ末端内、すなわち、ＣＣＲ９Ａのアミノ酸位置１３～４８に対応するＣＣＲ９Ｂのアミノ酸位置１～３６：ＭＡＤＤＹＧＳＥＳＴＳＳＭＥＤＹＶＮＦＮＦＴＤＦＹＣＥＫＮＮＶＲＱＦＡＳ（配列番号８０）に配置されると予想される（表９、表１０、図２０）。

【0296】

【表11】

【0297】

【表12】

【0298】

本明細書で開示されるＣＣＲ９標的化抗体は、ＣＣＲ９に対するＣＣＬ２５の結合を遮断し、且つＣＣＲ９＋Ｔ細胞を枯渇させることができる。腸の炎症性自己免疫疾患において、本明細書で開示される抗体は、血液及び腸組織中でＣＣＲ９＋病原性Ｔ細胞を枯渇させ、且つＣＣＲ９に対するＣＣＬ２５の結合を遮断すると予想され、病原性Ｔ細胞は、完全には枯渇されない。この二重の作用機序は、持続的な治療効果をもたらすと予想される。ＣＣＲ９^＋腸向性エフェクターメモリーＴ細胞の特異的な枯渇は、永続的な寛解を誘導し、それを維持し、疾患修飾をもたらすことになる。

【0299】

参考文献
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［９］Ｊ．Ｍｉｎｏｗａｄａ，Ｔ．Ｏｈｎｕｍａ，ａｎｄ Ｇ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ，ＪＮＣＩ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ４９，８９１（１９７２）．
［１０］Ｋ．Ｖａｄｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ １１，ｅ０１５５３３５（２０１６）．

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

2024516769000001.app

【国際調査報告】