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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-17
(54)【発明の名称】ペプチド鎖加水分解試薬、その製造方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 1/12 20060101AFI20240410BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240410BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20240410BHJP
【ＦＩ】
C07K1/12
G01N27/62 V
G01N27/62 X
G01N33/48 A
G01N27/62 F
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023560489
(86)(22)【出願日】2021-10-20
(85)【翻訳文提出日】2023-09-28
(86)【国際出願番号】 CN2021124827
(87)【国際公開番号】W WO2022205839
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】202110360904.5
(32)【優先日】2021-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523371399
【氏名又は名称】安徽国▲タイ▼生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＮＨＵＩ ＧＵＯＴＡＩ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．２８－１，Ｌｉｕｘｉ Ｒｏａｄ，Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ，Ｌａｎｇｘｉ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｘｕａｎｃｈｅｎｇ，Ａｎｈｕｉ ２４２１００
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲ニー▼ 鋒
(72)【発明者】
【氏名】高 新昌
(72)【発明者】
【氏名】衣 大龍
(72)【発明者】
【氏名】張 恒
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041EA12
2G041FA12
2G041FA25
2G041GA09
2G041HA01
2G041JA02
2G041JA05
2G041KA01
2G041LA09
2G041MA05
2G045AA34
2G045BA11
2G045BB60
2G045DA36
2G045FA33
2G045FB06
2G045FB08
4H045AA20
4H045AA30
4H045EA50
4H045FA16
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は、ペプチド鎖加水分解試薬、その製造方法及びその使用を開示し、ポリペプチド又はアミノ酸を標識及び加水分解するのに有用なペプチド鎖加水分解試薬及びその製造方法を考案し、また、アミノ酸検出方法における上記ペプチド鎖加水分解試薬の使用を開示し、具体的には、ペプチド鎖加水分解試薬を用いてポリペプチド又はタンパク質を加水分解し、回転蒸発し、さらに水で溶解してｐＨを中性に調整し、金属キレート剤を添加した後、遠心分離して上清を採取し、上清の全イオンマスクロマトグラムを得て、イオンピークを抽出して選択イオンマスクロマトグラムを得、加水分解生成物の同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性に基づいて関係式を確立し、比を得て、ポリペプチド又はタンパク質中のグルタミン酸及びアスパラギン酸の合計含有量をそれぞれ得て、その比から実際含有量を算出することであり、ポリペプチド又はタンパク質中のグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸の４種類のアミノ酸を１０％未満の偏差で正確に定量化できるという利点がある。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
塩酸ジオキサン溶液、重水及び２価金属塩化物溶液からなり、前記塩酸ジオキサン溶液と前記重水と前記２価金属塩化物溶液とのモル比は、（２～４）：（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）である、ことを特徴とするペプチド鎖加水分解試薬。
【請求項2】
前記塩酸ジオキサン溶液中の前記塩酸の濃度が１．７～２．２ｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項１に記載のペプチド鎖加水分解試薬。
【請求項3】
前記２価金属塩化物溶液中の前記２価金属イオンがＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｎ２＋から選択され得る、ことを特徴とする請求項１に記載のペプチド鎖加水分解試薬。
【請求項4】
請求項１に記載のペプチド鎖加水分解試薬の製造方法であって、塩酸ジオキサン溶液と重水とを（２～４）：（３５～４０）のモル比で均一に混合して、塩酸ジオキサン重水溶液を得るステップａ）と、
前記塩酸ジオキサン塩溶液中の前記重水溶液と前記２価金属塩化物溶液とのモル比が（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）となるように、ステップａ）の前記塩酸ジオキサン重水溶液に、２価金属塩化物溶液を添加し、ペプチド鎖加水分解試薬を得るステップｂ）と、を含むことを特徴とするペプチド鎖加水分解試薬の製造方法。
【請求項5】
アミノ酸の検出分析における請求項１に記載のペプチド鎖加水分解試薬の使用であって、具体的な方法において、１）ポリペプチド又はタンパク質試料を計量し、前記ペプチド鎖加水分解試薬を添加し、凍結して真空吸引し、不活性ガス充填後、加熱して加水分解し、
２）十分に加水分解した後、回転蒸発して溶媒を除去し、さらに水で溶解して溶液のｐＨを６．５～７．５に調整し、
３）金属キレート剤を添加して２価金属塩化物中の２価金属イオンを除去し、遠心分離して、上清を得、
４）ステップ３）の前記上清を液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法にかけて、前記上清の全イオンマスクロマトグラムを得、
５）ステップ４）の前記全イオンマスクロマトグラム中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸加水分解生成物の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、前記加水分解生成物の同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性に基づいて関係式を確立し、前記関係式からポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミンとグルタミン酸の比、アスパラギンとアスパラギン酸の比を得、
６）ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸及びアスパラギン酸の合計含有量をそれぞれ得て、ステップ５）で得られた前記比から、ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン及びアスパラギン酸の実際含有量をそれぞれ算出する、ことを特徴とするアミノ酸の検出分析におけるペプチド鎖加水分解試薬の使用。
【請求項6】
ステップ１）の前記加水分解の温度が１１０℃であり、前記加水分解の時間が８～２４ｈである、ことを特徴とする請求項５に記載のアミノ酸の検出分析におけるペプチド鎖加水分解試薬の使用。
【請求項7】
ステップ３）の前記金属キレート剤と前記２価金属イオンとの質量比が１２～２４：１である、ことを特徴とする請求項５に記載のアミノ酸の検出分析におけるペプチド鎖加水分解試薬の使用。
【請求項8】
ステップ５）では、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸を除く各測定対象アミノ酸の様々な濃度の混合標準溶液を調製し、前記混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラムを得て、前記混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラム中の前記各測定対象アミノ酸の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、前記各測定対象アミノ酸の様々な濃度に対応するピーク面積を得て、前記各測定対象アミノ酸のピーク面積と濃度の検量線をそれぞれ作成し、前記各測定対象アミノ酸のピーク面積と濃度との線形関係式を得て、ポリペプチド又はタンパク質試料の全イオンマスクロマトグラムを測定し、ポリペプチド又はタンパク質試料の全イオンマスクロマトグラムに対応する混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラムのクロマトグラムのピーク位置から、ポリペプチド又はタンパク質試料中の測定対象アミノ酸に対応するピーク面積を得て、対応する前記各測定対象アミノ酸の線形関係式に代入して、ポリペプチド又はタンパク質試料中の測定対象アミノ酸の実際含有量を得る、ことを特徴とする請求項５に記載のアミノ酸の検出分析におけるペプチド鎖加水分解試薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミノ酸検出の分野に属し、特にペプチド鎖加水分解試薬、その製造方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質は人の代謝において重要な役割を果たしており、タンパク質の定量測定は食品、医学、生物学において重要な意義を持っている。アミノ酸は、アミド基（－ＮＨ２）とカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）の両方を含む有機化合物の総称で、タンパク質やポリペプチドが加水分解されたもので、タンパク質中のアミノ酸を定性的・定量的に分析することもタンパク質構造解析の基礎となる。
【0003】
現在、タンパク質中のアミノ酸の分析方法には、主に酸加水分解法、アルカリ加水分解法、及び酵素法がある。酸加水分解法はグルタミンとアスパラギンの分解を引き起こし、トリプトファンも破壊され、アルカリ加水分解は一般的にＮａＯＨ、ＫＯＨなどの強アルカリを採用しているが、この加水分解条件の下でグルタミン、アスパラギン、トレオニン、セリン、アルギニンやシステインはすべて破壊される（▲ゴン▼天理、劉付芳、王衛ら。食品中のアミノ酸テストの発展［Ｊ］．中国標準化，２０１８（Ｓ１）：１５６－１５９．）。酵素加水分解では、アミノ酸の加水分解はしばしば不十分で、反応時間が長く、しかも妨害を導入してしまう。
【0004】
現行のアミノ酸検出方法ＧＢ５００９．１２４－２０１６は、酸加水分解法を採用しており、ニニンヒドリンポストカラム誘導体化イオン交換クロマトグラフで食品中のアミノ酸の測定を行うことを以下のように規定している。食品中のタンパク質を塩酸で加水分解して遊離アミノ酸にし、イオン交換カラムで分離した後、ニンヒドリン溶液と色反応して、さらに可視分光光度検出器でアミノ酸の含有量を測定する。しかし、酸加水分解法でポリペプチドを処理する場合、グルタミンとアスパラギンという重要な栄養価と生理機能を持つ２種類のアミノ酸は、それぞれグルタミン酸（図１（ａ）に示す）とアスパラギン酸（図１（ｂ）に示す）に加水分解され、その結果、測定されたアスパラギン酸とグルタミン酸の実験結果の一部はアスパラギンとグルタミンに由来するため、試料中の本来のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、及びアスパラギン酸の４種類のアミノ酸の真の含有量を正確に検出することができなく、また、トリプトファンは酸性条件下で破壊されるため、現行の国家標準法では、アラニン、スレオニン、セリン、メチオニン、プロリン、グリシン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジンアミノ酸、及びアルギニン等の１５種類のアミノ酸しか測定できず、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸を含むポリペプチド又はタンパク質を同時に検出することができないため、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸を含むポリペプチド又はタンパク質を含む試料の検出には適用できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、新規なペプチド鎖加水分解試薬を製造することによって、ペプチド鎖を加水分解すると同時に加水分解生成物のアミノ酸をＯ１８同位体で標識し、さらに液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法による加水分解物の同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性を利用して、ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸を検出することができ、多種類のアミノ酸の同時測定及び正確な定量を実現する、ペプチド鎖加水分解試薬、その製造方法、及びアミノ酸検出方法における該ペプチド鎖加水分解試薬の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記の技術的課題を解決するために、本発明が採用する技術的解決手段は次の通りである。
【0007】
ペプチド鎖加水分解試薬であって、
塩酸ジオキサン溶液、重水及び２価金属塩化物溶液からなり、前記塩酸ジオキサン溶液と前記重水と前記２価金属塩化物溶液とのモル比は、（２～４）：（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）である。
塩酸ジオキサン溶液、重水及び２価金属塩化物溶液からなり、前記塩酸ジオキサン溶液と前記重水と前記２価金属塩化物溶液とのモル比は、（２～４）：（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）である。
【0008】
前記塩酸ジオキサン溶液中の前記塩酸の濃度が１．７～２．２ｍｏｌ／Ｌである。
【0009】
前記２価金属塩化物溶液中の前記２価金属イオンがＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｎ２＋から選択され得る。
【0010】
ペプチド鎖加水分解試薬の製造方法であって、
塩酸ジオキサン溶液と重水とを（２～４）：（３５～４０）のモル比で均一に混合して、塩酸ジオキサン重水溶液を得るステップａ）と、
前記塩酸ジオキサン塩溶液中の前記重水溶液と前記２価金属塩化物溶液とのモル比が（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）となるように、ステップａ）の前記塩酸ジオキサン重水溶液に、２価金属塩化物溶液を添加し、ペプチド鎖加水分解試薬を得るステップｂ）と、を含む。
塩酸ジオキサン溶液と重水とを（２～４）：（３５～４０）のモル比で均一に混合して、塩酸ジオキサン重水溶液を得るステップａ）と、
前記塩酸ジオキサン塩溶液中の前記重水溶液と前記２価金属塩化物溶液とのモル比が（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）となるように、ステップａ）の前記塩酸ジオキサン重水溶液に、２価金属塩化物溶液を添加し、ペプチド鎖加水分解試薬を得るステップｂ）と、を含む。
【0011】
アミノ酸の検出分析における上記ペプチド鎖加水分解試薬の使用であって、具体的な方法において、
１）ポリペプチド又はタンパク質試料を計量し、前記ペプチド鎖加水分解試薬を添加し、凍結して真空吸引し、不活性ガス充填後、加熱して加水分解し、
２）十分に加水分解した後、回転蒸発して溶媒を除去し、さらに水で溶解して溶液のｐＨを６．５～７．５に調整し、
３）金属キレート剤を添加して２価金属塩化物中の２価金属イオンを除去し、遠心分離して、上清を得、
４）ステップ３）の前記上清を液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法にかけて、前記上清の全イオンマスクロマトグラムを得、
５）ステップ４）の前記全イオンマスクロマトグラム中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸加水分解生成物の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、前記加水分解生成物の同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性に基づいて関係式を確立し、前記関係式からポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミンとグルタミン酸の比、アスパラギンとアスパラギン酸の比を得、
６）ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸及びアスパラギン酸の合計含有量をそれぞれ得て、ステップ５）で得られた前記比から、ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン及びアスパラギン酸の実際含有量をそれぞれ算出する。
１）ポリペプチド又はタンパク質試料を計量し、前記ペプチド鎖加水分解試薬を添加し、凍結して真空吸引し、不活性ガス充填後、加熱して加水分解し、
２）十分に加水分解した後、回転蒸発して溶媒を除去し、さらに水で溶解して溶液のｐＨを６．５～７．５に調整し、
３）金属キレート剤を添加して２価金属塩化物中の２価金属イオンを除去し、遠心分離して、上清を得、
４）ステップ３）の前記上清を液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法にかけて、前記上清の全イオンマスクロマトグラムを得、
５）ステップ４）の前記全イオンマスクロマトグラム中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸加水分解生成物の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、前記加水分解生成物の同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性に基づいて関係式を確立し、前記関係式からポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミンとグルタミン酸の比、アスパラギンとアスパラギン酸の比を得、
６）ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸及びアスパラギン酸の合計含有量をそれぞれ得て、ステップ５）で得られた前記比から、ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン及びアスパラギン酸の実際含有量をそれぞれ算出する。
【0012】
ステップ１）の前記加水分解の温度が１１０℃であり、前記加水分解の時間が８～２４ｈである。
【0013】
ステップ３）の前記金属キレート剤と前記２価金属イオンとの質量比が１２～２４：１である。
【0014】
ステップ５）では、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸を除く各測定対象アミノ酸の様々な濃度の混合標準溶液を調製し、前記混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラムを得て、前記混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラム中の各測定対象アミノ酸の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、前記各測定対象アミノ酸の様々な濃度に対応するピーク面積を得て、前記各測定対象アミノ酸のピーク面積と濃度の検量線をそれぞれ作成し、前記各測定対象アミノ酸のピーク面積と濃度との線形関係式を得て、
ポリペプチド又はタンパク質試料の全イオンマスクロマトグラムを測定し、ポリペプチド又はタンパク質試料の全イオンマスクロマトグラムに対応する混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラムのクロマトグラムのピーク位置から、ポリペプチド又はタンパク質試料中の測定対象アミノ酸に対応するピーク面積を得て、対応する前記各測定対象アミノ酸の線形関係式に代入して、ポリペプチド又はタンパク質試料中の測定対象アミノ酸の実際含有量を得る。
ポリペプチド又はタンパク質試料の全イオンマスクロマトグラムを測定し、ポリペプチド又はタンパク質試料の全イオンマスクロマトグラムに対応する混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラムのクロマトグラムのピーク位置から、ポリペプチド又はタンパク質試料中の測定対象アミノ酸に対応するピーク面積を得て、対応する前記各測定対象アミノ酸の線形関係式に代入して、ポリペプチド又はタンパク質試料中の測定対象アミノ酸の実際含有量を得る。
【発明の効果】
【0015】
従来技術と比較して、本発明の利点は以下にある。
【0016】
本発明では、グルタミン及びアスパラギンが強酸条件下でグルタミン酸及びアスパラギン酸に加水分解されるため、ポリペプチド及びタンパク質試料中のこれら４種類のアミノ酸を正確に検出することができないことに関して、新規なペプチド鎖加水分解試薬を考案し、特定のモル比の試薬を製造することにより、加水分解生成物のアミノ酸を標識しながらポリペプチド又はタンパク質を加水分解することができ、２価金属塩化物溶液を特定の割合で添加することにより、加水分解反応の特異性をより高め、その後の検出分離を容易にする。
【0017】
本発明では、考案された新規なペプチド鎖加水分解試薬を用いて、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法により、反応液中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸の加水分解後に生成する加水分解生成物の重水同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性に基づいて、グルタミン及びアスパラギンの加水分解により生成したＯ１８グルタミン酸とＯ１８アスパラギン酸を本来のアスパラギン酸及びグルタミン酸と区別することができ、同等モル質量のグルタミン及びアスパラギンがそれぞれ同等モル質量のＯ１８グルタミン酸及びＯ１８アスパラギン酸を生成し、グルタミン及びアスパラギンのペプチドセグメント中の位置が異なるため、生成されるグルタミン酸及びアスパラギン酸のＯ１８の個数が異なり、それによりグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸の４種類のアミノ酸を１０％未満の偏差で正確に定量することができる。
【0018】
本発明は、また、種々のポリペプチド及びタンパク質試料中の種々のアミノ酸を検出することができ、特にグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸を含有するポリペプチド及びタンパク質試料に好適である。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１（ａ）は、本発明におけるアスパラギンを酸分解条件でアスパラギン酸に加水分解する化学反応方程式であり、図１（ｂ）は、本発明のグルタミンを酸分解条件でグルタミン酸に加水分解する化学反応方程式である。
【図2】図２（ａ）は、本発明ではグルタミンがペプチド鎖のＮ末端に位置することを示し、図２（ｂ）は、本発明ではグルタミンがペプチド鎖の中間の任意の位置にあることを示し、図２（ｃ）は、本発明ではグルタミンがペプチド鎖のＣ末端に位置することを示す。
【図3】図３（ａ）は、本発明のペプチド鎖加水分解試薬によるペプチド鎖の非Ｃ末端に位置するグルタミンＧｌｎの加水分解の化学式であり、図３（ｂ）は、本発明のペプチド鎖加水分解試薬によるペプチド鎖のＣ末端に位置するグルタミンＧｌｎの加水分解の化学式である。
【図4】本発明のペプチド鎖加水分解試薬によるペプチド鎖の非Ｃ末端に位置するグルタミン酸Ｇｌｕの加水分解の化学式である。
【図5】本発明のグルタミン酸標準溶液のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルである。
【図6】本発明では、グルタミン中のアミド基が加水分解されて１つのＯ１８が生成されるときのグルタミン酸のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルである。
【図7】本発明では、グルタミン中のアミド基が加水分解されて２つのＯ１８が生成されるときのグルタミン酸のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルである。
【図8】本発明では、リジン、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、アラニン、グリシン、イソロイシン、アスパラギン、ロイシン、グルタミン酸、メチオニン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、スレオニン、システイン、及びトリプトファンなどの１８種類のアミノ酸標準液の全イオンマスクロマトグラムである。
【図9】本発明で抽出された個々のアミノ酸（ヒスチジン及びアルギニン）の選択イオンマスクロマトグラムである。
【図10】本発明における混合ペプチドセグメントの加水分解生成物の全イオンマスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、特定の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明は、記載された実施例に限定されるものではない。
【0021】
【表1】
【0022】
本発明では、グルタミン及びアスパラギンが強酸条件下でグルタミン酸及びアスパラギン酸に加水分解されるため、これら４種類のアミノ酸が正確に検出されることができなくなることに着目し、塩酸ジオキサン溶液、重水及び２価金属塩化物溶液からなり、塩酸ジオキサン溶液と重水と２価金属塩化物溶液とのモル比が、（２～４）：（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）である塩ペプチド鎖加水分解試薬を考案した。
【0023】
本発明は、また、ペプチド鎖加水分解試薬の製造方法であって、
塩酸ジオキサン溶液と重水とを（２～４）：（３５～４０）のモル比で均一に混合して、塩酸ジオキサン重水溶液を得るステップａ）と、
塩酸ジオキサン塩溶液中の重水溶液と２価金属塩化物溶液とのモル比が（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）となるように、ステップａ）の塩酸ジオキサン重水溶液に、２価金属塩化物溶液を添加し、ペプチド鎖加水分解試薬を得るステップｂ）と、を含むペプチド鎖加水分解試薬の製造方法を提供する。
塩酸ジオキサン溶液と重水とを（２～４）：（３５～４０）のモル比で均一に混合して、塩酸ジオキサン重水溶液を得るステップａ）と、
塩酸ジオキサン塩溶液中の重水溶液と２価金属塩化物溶液とのモル比が（３５～４０）：（０．００５～０．０１２）となるように、ステップａ）の塩酸ジオキサン重水溶液に、２価金属塩化物溶液を添加し、ペプチド鎖加水分解試薬を得るステップｂ）と、を含むペプチド鎖加水分解試薬の製造方法を提供する。
【0024】
本発明は、また、アミノ酸の検出分析における上記ペプチド鎖加水分解試薬の使用であって、具体的な方法において、
１）ポリペプチド又はタンパク質試料を計量し、前記ペプチド鎖加水分解試薬を添加し、凍結して真空吸引し、不活性ガス充填後、加熱して加水分解し、
２）十分に加水分解した後、回転蒸発して溶媒を除去し、さらに水で溶解して溶液のｐＨを６．５～７．５に調整し、
３）金属キレート剤を添加して２価金属塩化物中の２価金属イオンを除去し、遠心分離して、上清を得、
４）ステップ３）の前記上清を液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析にかけて、前記上清の全イオンマスクロマトグラムを得、
５）ステップ４）の前記全イオンマスクロマトグラム中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸加水分解生成物の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、前記加水分解生成物の同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性に基づいて関係式を確立し、前記関係式からポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミンとグルタミン酸の比、アスパラギンとアスパラギン酸の比を得、
６）ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸及びアスパラギン酸の合計含有量をそれぞれ得て、ステップ５）で得られた前記比から、ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン及びアスパラギン酸の実際含有量をそれぞれ算出する、アミノ酸の検出分析におけるペプチド鎖加水分解試薬の使用を提供する。
１）ポリペプチド又はタンパク質試料を計量し、前記ペプチド鎖加水分解試薬を添加し、凍結して真空吸引し、不活性ガス充填後、加熱して加水分解し、
２）十分に加水分解した後、回転蒸発して溶媒を除去し、さらに水で溶解して溶液のｐＨを６．５～７．５に調整し、
３）金属キレート剤を添加して２価金属塩化物中の２価金属イオンを除去し、遠心分離して、上清を得、
４）ステップ３）の前記上清を液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析にかけて、前記上清の全イオンマスクロマトグラムを得、
５）ステップ４）の前記全イオンマスクロマトグラム中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸加水分解生成物の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、前記加水分解生成物の同位体二次フラグメントイオンが等しくないという特性に基づいて関係式を確立し、前記関係式からポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミンとグルタミン酸の比、アスパラギンとアスパラギン酸の比を得、
６）ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸及びアスパラギン酸の合計含有量をそれぞれ得て、ステップ５）で得られた前記比から、ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン及びアスパラギン酸の実際含有量をそれぞれ算出する、アミノ酸の検出分析におけるペプチド鎖加水分解試薬の使用を提供する。
【0025】
本発明では、「重水」という用語は、酸素原子の同位体である酸素１８原子を含有する水分子である。
【0026】
本発明では、ペプチド鎖が酸分解されると、強酸によってアミド結合が切断され、それぞれα－アミノ基を有するアミノ酸とα－カルボキシル基を有する別のアミノ酸が生成され、例えば、グルタミンジペプチドが酸分解されると、アラニン及びグルタミン酸が生成される。
【0027】
ペプチド鎖は、通常、遊離α－アミノ酸及び遊離α－カルボキシル酸を含み、本発明では、「Ｎ末端」という用語は、ペプチド鎖中の遊離α－アミノ酸の一端であり、「Ｃ末端」という用語は、ペプチド鎖中の遊離α－カルボキシル酸の一端であり、一般に、ペプチド鎖のアミノ酸配列の順序は、ペプチド鎖のＮ末端で始まり、Ｃ末端で終わるように規定されている。したがって、１つのペプチド鎖中のアミノ酸の位置には、３つの場合が存在する可能性があり、例えば、ペプチド鎖中のグルタミンＧｌｎの位置には、図２に示すように、ペプチド鎖のＮ末端（図２（ａ）に示す）、ペプチド鎖の中間の任意の位置（図２（ｂ）に示す）、ペプチド鎖のＣ末端（図２（ｃ）に示す）という３つの場合が存在する可能性がある。
【0028】
本発明では、「非Ｃ末端」という用語は、アミノ酸がペプチド鎖のＮ末端にある場合又はペプチド鎖の中間の任意の位置にある場合のいずれかを意味する。ペプチド鎖が本発明のペプチド鎖加水分解試薬により加水分解された後、加水分解生成物のアミノ酸には２つの場合が存在する可能性がある。例えば、グルタミンＧｌｎがペプチド鎖の非Ｃ末端（α１）に位置する場合、カルボキシル基部位は外部からヒドロキシ基を得る必要があり、すなわち、ペプチド鎖加水分解試薬からヒドロキシ基を得る必要があり、本発明のペプチド鎖加水分解試薬はＯ１８を含むため、ペプチド鎖の非Ｃ末端に位置するグルタミンＧｌｎ（ａ１）は、Ｏ１８のカルボキシル基を有する２つのグルタミン酸（ａ２）を生成し、加水分解反応式は図３（ａ）に示すとおりである。グルタミンＧｌｎがペプチド鎖のＣ末端（ｂ１）に位置する場合、カルボキシル基部位にはヒドロキシ基を有し、外部からヒドロキシ基を得る必要がないため、ペプチド鎖のＣ末端に位置するグルタミン（ｂ１）はＯ１８のカルボキシル基を有するグルタミン酸（ｂ２）を１個のみ生成し、加水分解反応式は図３（ｂ）に示すとおりである。同様に、グルタミン酸Ｇｌｕが非Ｃ末端（ｃ１）に位置する場合にも、カルボキシル基部位は外部からヒドロキシ基を得て、Ｏ１８のカルボキシル基を有する１つのグルタミン酸（ｃ２）を生成し、加水分解反応式は図４に示すとおりである。したがって、グルタミンＧｌｎがペプチド鎖の非Ｃ末端（ａ１）に位置する場合、１次質量分析を行うと、その分子量がグルタミン酸Ｇｌｕの分子量より２Ｄａ多く、グルタミンＧｌｎがペプチド鎖のＣ末端（ｂ１）に位置する場合、その分子量がグルタミン酸Ｇｌｕと同等となり、グルタミンＧｌｎがペプチド鎖のＣ末端に位置する場合、その分子量が非Ｃ末端（ｃ１）に位置するグルタミン酸Ｇｌｕの分子量より２Ｄａ少なくなる。
【0029】
本発明では、「全イオンマスクロマトグラム」という用語は、クロマトグラムによって分離されて流出した画分が質量スペクトルに継続的に入ることを意味し、質量スペクトルは連続的に走査されてデータ収集を行い、各走査で１枚の質量スペクトルグラムが得られ、各質量スペクトルグラム中のすべてのイオン強度を加算すると、１つの合計イオン電流強度が得られ、イオン強度を縦軸、時間を横軸としてプロットしたグラフが全イオンマスクロマトグラムとなる。本発明における「選択イオンマスクロマトグラム」という用語は、あるイオンが抽出された又は選択されたマスクロマトグラムのピークと同時刻に重畳されたマスクロマトグラムを意味する。
【0030】
これに基づいて、本発明では、多重反応モニタリング法によって検出した結果、グルタミン酸のペプチド鎖のＣ末端のイオン対シグナルピークが１４８．０６０４３／１０２．０５５４０、グルタミン酸Ｇｌｕのペプチド鎖の非Ｃ末端（ｃ１）のイオン対シグナルピークが１５０．０６４８３／１０２．０５５４０、グルタミンＧｌｎのペプチド鎖のＣ末端（ｂ１）のイオン対シグナルピークが１５０．０６４８３／１０４．０５９６２、グルタミンのペプチド鎖の非Ｃ末端（ａ１）のイオン対シグナルピークが１５２．０６８９５／１０４．０５９５９であり、試料中のグルタミンからのシグナルがＣ末端のグルタミンと非Ｃ末端のグルタミンとの重畳シグナルであり、グルタミン酸からのシグナルがＣ末端のグルタミン酸と非Ｃ末端のグルタミン酸との重畳シグナルであり、イオン対間の関係式からペプチド鎖中のグルタミンＧｌｎとグルタミン酸Ｇｌｕの比が算出され得る。次に、国家標準法ＧＢ５００９．１２４－２０１６によってグルタミン酸Ｇｌｕの含有量が得られ、この含有量は、試料中のグルタミンＧｌｎ及びグルタミン酸Ｇｌｕの合計含有量であり、その比からグルタミンＧｌｎ及びグルタミン酸Ｇｌｕの実際含有量がそれぞれ得られ得る。同様に、試料中のアスパラギン及びアスパラギン酸の実際含有量も得られ得る。
【0031】
本発明の態様をさらに説明するために、以下では、図面及び実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、理解できるように、これらの説明は、本発明の特徴及び利点をさらに説明するためのものであって、本発明の保護範囲を限定するものと理解すべきではなく、本発明の権利の範囲は特許請求の範囲に準じる。
【0032】
主な試薬：重水（上海泰坦科技股▲ふん▼有限公司、９９．９％）、塩酸（ＣＡＳ番号：７６４７－０１－０；１，４－ジオキサン４Ｍ溶液、北京伊諾凱科技有限公司）；
６つのペプチド鎖のアミノ酸配列（３文字の略語で表される）は、それぞれ次のとおりであり、
Ｇｌｎ－Ｇｌｎ（９７．８％）（（１）と記載）
Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（９７．２％）（（２）と記載）
Ａｓｎ－Ａｓｎ（９９．８％）（（３）と記載）
Ａｓｐ－Ａｓｐ（９９．２％）（（４）と記載）
Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｉｌｅ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（９９．２％）（（５）と記載）
Ｍｅｔ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｔｒｐ（９９．５％）（（６）号と記載）
上記ペプチド鎖はすべて上海生工生物工程股▲ふん▼有限公司より購入し、塩化カルシウムＣａＣｌ２（上海泰坦科技股▲ふん▼有限公司、９９．８％）、塩化マグネシウムＭｇＣｌ２（上海アラジン試薬有限公司、９９．９％）、金属キレート剤Ｃｈｅｌｅｘ１００（ｓｉｇｍａ、１００～２００ｍｅｓｈ）、５％Ｃｈｅｌｅｘ－１００（ｗ／ｖ）配合：Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ５ｇを量り、滅菌純水１００ｍｌを加え、４℃で保存した。
主要な器械：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ四重極静電場オービトラップ高分解能質量分析システム、ＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉＭａｔｅ３０００高速液体クロマトグラフィーシステム（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
６つのペプチド鎖のアミノ酸配列（３文字の略語で表される）は、それぞれ次のとおりであり、
Ｇｌｎ－Ｇｌｎ（９７．８％）（（１）と記載）
Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（９７．２％）（（２）と記載）
Ａｓｎ－Ａｓｎ（９９．８％）（（３）と記載）
Ａｓｐ－Ａｓｐ（９９．２％）（（４）と記載）
Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｉｌｅ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（９９．２％）（（５）と記載）
Ｍｅｔ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｔｒｐ（９９．５％）（（６）号と記載）
上記ペプチド鎖はすべて上海生工生物工程股▲ふん▼有限公司より購入し、塩化カルシウムＣａＣｌ２（上海泰坦科技股▲ふん▼有限公司、９９．８％）、塩化マグネシウムＭｇＣｌ２（上海アラジン試薬有限公司、９９．９％）、金属キレート剤Ｃｈｅｌｅｘ１００（ｓｉｇｍａ、１００～２００ｍｅｓｈ）、５％Ｃｈｅｌｅｘ－１００（ｗ／ｖ）配合：Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ５ｇを量り、滅菌純水１００ｍｌを加え、４℃で保存した。
主要な器械：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ四重極静電場オービトラップ高分解能質量分析システム、ＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉＭａｔｅ３０００高速液体クロマトグラフィーシステム（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
【実施例1】
【0033】
ペプチド鎖加水分解試薬の製造
ａ）４Ｍ塩酸ジオキサン溶液３ｍＬと重水３ｍＬを均一に混合して、２Ｍの塩酸ジオキサン重水溶液を得、
ｂ）２Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液１．５ｍＬに、２価金属塩化カルシウム１ｍｇを添加して、ペプチド鎖加水分解試薬を得た。
ａ）４Ｍ塩酸ジオキサン溶液３ｍＬと重水３ｍＬを均一に混合して、２Ｍの塩酸ジオキサン重水溶液を得、
ｂ）２Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液１．５ｍＬに、２価金属塩化カルシウム１ｍｇを添加して、ペプチド鎖加水分解試薬を得た。
【0034】
混合ペプチド鎖の加水分解
ペプチド鎖（１）３ｍｇ、（２）２ｍｇ、（３）２．４８２ｍｇ、（４）２．４６２ｍｇ、（５）８．８８１ｍｇ、（６）１０．３９２ｍｇを正確に計量して、混合ペプチド鎖を得、１５ｍｌの加水分解チューブに添加し、さらに実施例１のペプチド鎖加水分解試薬を添加した。加水分解チューブをドライアイスに入れ、３ｍｉｎ～５ｍｉｎ凍結し、真空ポンプの吸引管に接続し、真空吸引し、その後、窒素ガスを充填し、真空吸引を繰り返し、窒素ガスを３回充填した後、窒素ガスを充填した状態で、開口を速やかにシーリングするか、又はスクリューキャップを締め付けた。
ペプチド鎖（１）３ｍｇ、（２）２ｍｇ、（３）２．４８２ｍｇ、（４）２．４６２ｍｇ、（５）８．８８１ｍｇ、（６）１０．３９２ｍｇを正確に計量して、混合ペプチド鎖を得、１５ｍｌの加水分解チューブに添加し、さらに実施例１のペプチド鎖加水分解試薬を添加した。加水分解チューブをドライアイスに入れ、３ｍｉｎ～５ｍｉｎ凍結し、真空ポンプの吸引管に接続し、真空吸引し、その後、窒素ガスを充填し、真空吸引を繰り返し、窒素ガスを３回充填した後、窒素ガスを充填した状態で、開口を速やかにシーリングするか、又はスクリューキャップを締め付けた。
【0035】
開口をシーリングした加水分解チューブを１１０℃のオーブンに置いて、２４ｈ加水分解後、反応を止めて、冷却後、すべての反応液を１５ｍＬ蒸発瓶内に移して、回転蒸発し、その後、水２ｍＬで溶解して、再び回転蒸発して完全に乾燥した。最後に少量の水を添加して溶解し、水酸化ナトリウム溶液で試料のｐＨを中性７．０に調整し、メスフラスコを使用して１０ｍＬまで定容し、１ｍｌの溶液を取り、５％金属キレート剤Ｃｈｅｌｅｘ １００を１ｍｌ添加して、１ｍｉｎ振とう混合した後、１２０００ＲＰＭ／ｍｉｎの高速で遠心分離で上清を取り、高分解能質量分析を行った。
【0036】
計器パラメータ
高速液体クロマトグラフィー条件：移動相Ａは、０．１％ギ酸と４ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムを含む水であり、Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルであり、グラジエント溶出：０～２ｍｉｎ、１０％～４０％Ｂ；２～９ｍｉｎ、４０％～８５％Ｂ；９～１２ｍｉｎ、８５％～１００％Ｂ；１２～１５ｍｉｎ、１００％～１０％Ｂ。試料注入量：５μＬ；流速：３００μＬ／ｍｉｎ；カラム温度：４０℃；ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ）。
高速液体クロマトグラフィー条件：移動相Ａは、０．１％ギ酸と４ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムを含む水であり、Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルであり、グラジエント溶出：０～２ｍｉｎ、１０％～４０％Ｂ；２～９ｍｉｎ、４０％～８５％Ｂ；９～１２ｍｉｎ、８５％～１００％Ｂ；１２～１５ｍｉｎ、１００％～１０％Ｂ。試料注入量：５μＬ；流速：３００μＬ／ｍｉｎ；カラム温度：４０℃；ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ）。
【0037】
質量分析パラメータ：ＨＥＳＩイオン化方式を採用；スプレー電圧３．５ｋＶ；毛細管温度３２５℃；ヒーター温度３５０℃；シースエア３０ユニット、補助気１０ユニット；スキャンモード Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎ／ｄｄＭＳ ２、収集範囲 １００～８００ｍ／ｚ、プラスイオン同時収集モード；解像度にはＭＳ Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎ ７００００ ＦＷＨＭ、ＭＳ／ＭＳ １７５００ ＦＷＨＭを採用し、ＮＣＥは３５ｅＶである。
【0038】
グルタミン酸標準溶液のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルの測定
グルタミン酸５ｍｇを正確に計量して水に溶解し、２５ｍｌのメスフラスコに定容し、２００ｕｇ／ｍｌのグルタミン酸標準溶液を得た。２００ｕｇ／ｍｌグルタミン酸標準溶液５０ｕｌを水９．９５ｍｌに添加して、１ｕｇ／ｍｌグルタミン酸標準溶液を得て、蠕動ポンプによって１０ｕＬ／ｍｌを質量分析に注入して分析した。図５に示すようなグルタミン酸標準溶液のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルが得られ、そのスペクトルから、１つの電荷を持つグルタミン酸の親イオンが１４８．０５０であり、特徴型フラグメントイオン１０２．０５６がグルタミン酸から１つのＣＯ２Ｈ２を脱離したものであることが分かり、したがって、Ｃ末端におけるグルタミン酸のイオン対特徴シグナルは１４８．０５０／１０２．０５６であった。
グルタミン酸５ｍｇを正確に計量して水に溶解し、２５ｍｌのメスフラスコに定容し、２００ｕｇ／ｍｌのグルタミン酸標準溶液を得た。２００ｕｇ／ｍｌグルタミン酸標準溶液５０ｕｌを水９．９５ｍｌに添加して、１ｕｇ／ｍｌグルタミン酸標準溶液を得て、蠕動ポンプによって１０ｕＬ／ｍｌを質量分析に注入して分析した。図５に示すようなグルタミン酸標準溶液のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルが得られ、そのスペクトルから、１つの電荷を持つグルタミン酸の親イオンが１４８．０５０であり、特徴型フラグメントイオン１０２．０５６がグルタミン酸から１つのＣＯ２Ｈ２を脱離したものであることが分かり、したがって、Ｃ末端におけるグルタミン酸のイオン対特徴シグナルは１４８．０５０／１０２．０５６であった。
【0039】
実験データ及びデータ分析
実施例１のペプチド鎖加水分解試薬で処理された混合ペプチドセグメント試料の上清を純水で１０００倍希釈した後、蠕動ポンプで１０ｕＬ／ｍｌを質量分析に注入して分析し、試料の全イオンマスクロマトグラムを得て、次に、分子量１５０．０６４８３の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、図６を得た。図６に示すように、グルタミンＧｌｎ中のアミド基が加水分解されて１つのＯ１８のグルタミン酸のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルが生成され、ここで、親イオン１５０．０６４８３は、ペプチド鎖の非Ｃ末端にあるＧｌｕ（ｃｌ）とペプチド鎖のＣ末端にあるＧｌｎ（ｂｌ）からそれぞれ生成された１つのＯ１８を持つＧｌｕ（ｂ２＋ｃ２）で構成されたが、この両方の場合に生成された脱ＣＯ２Ｈ２フラグメントは異なり、一方のフラグメントは１０２．０５５４０であり、他方のＯ１８含有フラグメントは１０４．０５９６２であり、この２つのフラグメントの比から、ペプチド鎖の非Ｃ末端にあるＧｌｕ（ｃｌ）と、ペプチド鎖のＣ末端にあるＧｌｎ（ｂｌ）との含有量の比を決定することができる。
実施例１のペプチド鎖加水分解試薬で処理された混合ペプチドセグメント試料の上清を純水で１０００倍希釈した後、蠕動ポンプで１０ｕＬ／ｍｌを質量分析に注入して分析し、試料の全イオンマスクロマトグラムを得て、次に、分子量１５０．０６４８３の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、図６を得た。図６に示すように、グルタミンＧｌｎ中のアミド基が加水分解されて１つのＯ１８のグルタミン酸のＭＳ／ＭＳ質量スペクトルが生成され、ここで、親イオン１５０．０６４８３は、ペプチド鎖の非Ｃ末端にあるＧｌｕ（ｃｌ）とペプチド鎖のＣ末端にあるＧｌｎ（ｂｌ）からそれぞれ生成された１つのＯ１８を持つＧｌｕ（ｂ２＋ｃ２）で構成されたが、この両方の場合に生成された脱ＣＯ２Ｈ２フラグメントは異なり、一方のフラグメントは１０２．０５５４０であり、他方のＯ１８含有フラグメントは１０４．０５９６２であり、この２つのフラグメントの比から、ペプチド鎖の非Ｃ末端にあるＧｌｕ（ｃｌ）と、ペプチド鎖のＣ末端にあるＧｌｎ（ｂｌ）との含有量の比を決定することができる。
【0040】
実施例１のペプチド鎖加水分解試薬で処理された試料の上清を純水で１０００倍希釈した後、蠕動ポンプで１０ｕＬ／ｍｌを質量分析に注入して分析し、試料の全イオンマスクロマトグラムを得て、次に、分子量１５２．０６８９５の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、図７を得た。図７に示すように、グルタミン中のアミド基が加水分解されて２つのＯ１８のグルタミン酸のＭＳ／ＭＳマススペクトルが生成され、フラグメントイオン１０４．０５９５９はペプチド鎖の非Ｃ末端のＧｌｎの濃度に比例していた。
【0041】
したがって、ペプチド鎖加水分解試薬でペプチドセグメントを加水分解する場合、ＧｌｎはペプチドセグメントのＣ末端と非Ｃ末端で生成する生成物が異なる。
【0042】
試料中のグルタミンＧｌｎのモル濃度をＸとし、ペプチドセグメントのＣ末端のグルタミン（ｂ１）のモル濃度をＸ１とすると、加水分解により生成されるグルタミン酸のｍ／ｚは１５０．０６４６８であり、ペプチドセグメントの非Ｃ末端（ａ１）のグルタミン濃度をＸ２モルとすると、加水分解により生成されるグルタミン酸のｍ／ｚは１５２．０６８９３である。
【0043】
同様に、試料中のグルタミン酸Ｇｌｕのモル濃度をＹとし、ペプチドセグメントの非Ｃ末端のグルタミン酸（ｃ１）のモル濃度をＹ１とすると、加水分解により生成されるグルタミン酸のｍ／ｚは１５０．０６４６８であり、ペプチドセグメントのＣ末端のグルタミン酸濃度をＹ２モルとすると、加水分解により生成されるグルタミン酸のｍ／ｚは１４８．０６０４３である。
【0044】
アミノ酸とＯ１８標識アミノ酸は、同じ衝突エネルギーでは、マススペクトルシグナルに差がなく、シグナル強度や積分面積（ｐｅａｋ ａｒｅａ）は濃度に比例していた。
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５０．０６４６８）∝（Ｘ１＋Ｙ１）
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５２．０６８９３）∝Ｘ２
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１４８．０６０４３）∝Ｙ２
ここで、「∝」は、二者が正比例の関係にあることを表している。
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５０．０６４６８）∝（Ｘ１＋Ｙ１）
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５２．０６８９３）∝Ｘ２
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１４８．０６０４３）∝Ｙ２
ここで、「∝」は、二者が正比例の関係にあることを表している。
【0045】
親イオン１５０．０６４８３は、ペプチド鎖の非Ｃ末端にあるＧｌｕ（ｃ１）とペプチド鎖のＣ末端にあるＧｌｎ（ｂ１）からそれぞれ生成された１つのＯ１８を持つＧｌｕ（ｂ２＋ｃ２）で構成され、どちらの場合も脱ＣＯ２Ｈ２は１０２．０５５４０と１０４．０５９６２のフラグメント分子量が得られたが、同一フラグメントに対応する断裂の位置が異なるため、フラグメント分子量が異なっていた。同じイオン化条件で、図６に示すように、ｂ１の左と右の脱カルボキシル化によれば、それぞれ１０２．０５５４０と１０４．０５９６２のフラグメントの分子量が得られ、フラグメントの強度の比率は５：４であり、この２つのフラグメントの比から、ペプチド鎖の非Ｃ末端にあるＧｌｕ（ｃ１）とペプチド鎖のＣ末端にあるＧｌｎ（ｂ１）の含有量の比を決定することができ、それによって以下の式１が導き出される。
【0046】
【数1】
【0047】
【表2】
【0048】
表２から、Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５０．０６４６８／１０２．０５４９５）／Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５０．０６４６８／１０４．０５９２０）＝２３００４５６：２２０１３４２＝２３：２２となり、式１に代入すると、Ｘ１とＹ１の比が３：２となることが得られる。
【0049】
式２：試料中のグルタミン／グルタミン酸＝Ｘ／Ｙ＝（Ｘ１＋Ｘ２）／（Ｙ１＋Ｙ２）
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５０．０６４６８）∝（Ｘ１＋Ｙ１）、Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５２．０６８９３）∝Ｘ２、Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１４８．０６０４３）∝Ｙ２、及びＸ１：Ｙ１＝３：２を式２に代入すると、
グルタミン／グルタミン酸＝（５２００６６７８＊０．６＋３０９１４５６８）／（５２００６６７８＊０．４＋１９２０１６９０）＝６２１１８５７４／４１９０６１２７＝１．０００：０．６４４０が得られる。
Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５０．０６４６８）∝（Ｘ１＋Ｙ１）、Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１５２．０６８９３）∝Ｘ２、Ｐｅａｋ ａｒｅａ（１４８．０６０４３）∝Ｙ２、及びＸ１：Ｙ１＝３：２を式２に代入すると、
グルタミン／グルタミン酸＝（５２００６６７８＊０．６＋３０９１４５６８）／（５２００６６７８＊０．４＋１９２０１６９０）＝６２１１８５７４／４１９０６１２７＝１．０００：０．６４４０が得られる。
【0050】
混合ペプチド鎖試料について、国家標準方法（ＧＢ ５００９．１２４－２０１６、食品中のアミノ酸の測定）を使用して、グルタミン酸の総含有量を得て、試料中のグルタミン酸の含有量が４．７９８ｍｇであることが得られ、この場合、試料中のグルタミンとグルタミン酸の比＝１．０００：０．６４４０から、グルタミンの含有量が２．９１８ｍｇであり、グルタミン酸の含有量が１．８８０ｍｇである、と算出できる。
【0051】
理論上の混合ペプチドセグメント試料中のグルタミンとグルタミン酸の比は（３＊０．９７８／２７４）：（２＊０．９７２／２７６）＝１．０００：０．６５８であり、グルタミン酸の理論含有量は３．１０４ｍｇ（グルタミンジペプチドのモル数＊２＊グルタミンの分子量）であり、グルタミン酸の理論含有量は２．０７１ｍｇ（グルタミン酸ジペプチドのモル数＊２＊グルタミン酸の分子量）である。偏差計算式として偏差（％）＝（理論含有量－検出含有量）／理論含有量＊１００％から計算した結果、グルタミンの偏差は５．９９％であり、グルタミン酸の偏差は９．２１％である、と算出できる。
【0052】
他のアミノ酸によるグルタミン／グルタミン酸、アスパラギン／アスパラギン酸の測定の干渉
本発明のペプチド鎖加水分解試薬でペプチドセグメントを加水分解して生成されたアミノ酸の可能な高分解能の質量電荷比により、グルタミン酸及びアスパラギン酸（Ｏ１８含有分子を含む）の分析に対する他のアミノ酸の干渉が極力排除され、実施例１のペプチド鎖加水分解試薬による加水分解での他のアミノ酸の質量電荷比と一部の同位体の存在量の表が表３に示される。
本発明のペプチド鎖加水分解試薬でペプチドセグメントを加水分解して生成されたアミノ酸の可能な高分解能の質量電荷比により、グルタミン酸及びアスパラギン酸（Ｏ１８含有分子を含む）の分析に対する他のアミノ酸の干渉が極力排除され、実施例１のペプチド鎖加水分解試薬による加水分解での他のアミノ酸の質量電荷比と一部の同位体の存在量の表が表３に示される。
【0053】
【表3】
【0054】
実験結論：表３から分かるように、他のアミノ酸はグルタミン／グルタミン酸、アスパラギン／アスパラギン酸の測定に明らかな干渉がなく、本発明のペプチド鎖加水分解試薬を用いて加水分解し、さらに多重反応モニタリング法を利用して、ポリペプチド又はタンパク質試料中のグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸を測定することができる。
【実施例2】
【0055】
ペプチド鎖加水分解試薬の製造
ａ）４Ｍ塩酸ジオキサン溶液４ｍＬと重水３．２ｍＬを均一に混合して、２．２Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液を得、
ｂ）２．２Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液１．５ｍＬに、２価金属塩化マグネシウム１．２ｍｇを添加して、ペプチド鎖加水分解試薬を得た。
ａ）４Ｍ塩酸ジオキサン溶液４ｍＬと重水３．２ｍＬを均一に混合して、２．２Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液を得、
ｂ）２．２Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液１．５ｍＬに、２価金属塩化マグネシウム１．２ｍｇを添加して、ペプチド鎖加水分解試薬を得た。
【0056】
ペプチド鎖を加水分解して「１１０℃のオーブンに置いて、２４ｈ加水分解後」を「１１０℃のオーブンに置いて、８ｈ加水分解後」に変更した。「水酸化ナトリウム溶液で試料のｐＨを中性７．０に調整する」を「水酸化ナトリウム溶液で試料のｐＨを中性７．５に調整する」に変更した。
【実施例3】
【0057】
ペプチド鎖加水分解試薬の製造
ａ）４Ｍ塩酸ジオキサン溶液２ｍＬと重水２．８ｍＬを均一に混合して、１．７Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液を得、
ｂ）１．７Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液１．５ｍＬに、２価金属塩化カルシウム０．６ｍｇを添加して、ペプチド鎖加水分解試薬を得た。
ａ）４Ｍ塩酸ジオキサン溶液２ｍＬと重水２．８ｍＬを均一に混合して、１．７Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液を得、
ｂ）１．７Ｍ塩酸ジオキサン重水溶液１．５ｍＬに、２価金属塩化カルシウム０．６ｍｇを添加して、ペプチド鎖加水分解試薬を得た。
【0058】
ペプチド鎖を加水分解して「１１０℃のオーブンに置いて、２４ｈ加水分解後」を「１１０℃のオーブンに置いて、１２ｈ加水分解後」に変更した。「水酸化ナトリウム溶液で試料のｐＨを中性７．０に調整する」を「水酸化ナトリウム溶液で試料のｐＨを中性６．５に調整する」に変更した以外、残りは実施例１と同様にした。
【0059】
実験結果
実施例１～３でグルタミン酸及びグルタミンの検出含有量をそれぞれ算出し、さらに３回分の平均値を算出した結果を表４に示す。
実施例１～３でグルタミン酸及びグルタミンの検出含有量をそれぞれ算出し、さらに３回分の平均値を算出した結果を表４に示す。
【0060】
【表4】
【0061】
ここで、偏差（％）＝（理論含有量－検出含有量）／理論含有量＊１００％
【実施例4】
【0062】
混合ペプチドセグメント中の１８種類のアミノ酸の含有量
器具パラメータ
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ四重極静電場オービトラップ高分解能質量分析システム、ＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００高速液体クロマトグラフィーシステム（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
スキャンモード Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎ、収集範囲 ７０～２５０ｍ／ｚ、プラスイオン同時収集モード；その他のパラメータは上記と同じである。
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ及び０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム３．５ｕｍ ２．１ｘ１５０ｍｍ
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ及び０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ。開始Ｂ相は０％、５分間維持、１０分かけて５％に上昇。
器具パラメータ
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ四重極静電場オービトラップ高分解能質量分析システム、ＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００高速液体クロマトグラフィーシステム（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
スキャンモード Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎ、収集範囲 ７０～２５０ｍ／ｚ、プラスイオン同時収集モード；その他のパラメータは上記と同じである。
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ及び０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム３．５ｕｍ ２．１ｘ１５０ｍｍ
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ及び０．１％（ｖ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ。開始Ｂ相は０％、５分間維持、１０分かけて５％に上昇。
【0063】
各種アミノ酸５ｍｇを正確に計量して水に溶解し、２５ｍｌのメスフラスコに定容し、２００ｕｇ／ｍｌのアミノ酸標準溶液を得た。２００ｕｇ／ｍｌのアミノ酸標準溶液を５０ｕｌずつ１０ｍｌのメスフラスコに入れ、１０ｍｌに定容し、１ｕｇ／ｍｌのアミノ酸混合標準溶液を得て、図８に示すような混合標準溶液の全イオンマスクロマトグラムを得た。図８は本発明のリジン、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、アラニン、グリシン、イソロイシン、アスパラギン、ロイシン、グルタミン酸、メチオニン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、スレオニン、システイン、トリプトファンなど１８種類のアミノ酸標準溶液の全イオンマスクロマトグラムである。
【0064】
ヒスチジンやアルギニンを抽出するなど、全イオンマスクロマトグラム中の各測定対象アミノ酸の選択イオンマスクロマトグラムを抽出し、得られた選択イオンマスクロマトグラムを図９に示す。各測定対象アミノ酸の様々な濃度に対応するピーク面積を得て、各測定対象アミノ酸のピーク面積と濃度との検量線をそれぞれ作成し、各測定対象アミノ酸の線形関係式を得た。
【0065】
図１０に示すように、実施例１の混合ペプチド鎖の加水分解について高分解能質量分析テストを行い、混合ペプチドセグメントの加水分解生成物の全イオンマスクロマトグラムを得た。
【0066】
図８及び図１０の全イオンマスクロマトグラム中の各アミノ酸に対応するピーク面積位置から、混合ペプチドセグメント中の各アミノ酸のピーク面積を得て、対応する各アミノ酸の線形関係式に代入することにより、混合ペプチドセグメント中の各測定対象アミノ酸の検出含有量を得た。
【0067】
実験を３回繰り返し、１８種類のアミノ酸の平均検出含有量をそれぞれ得て、結果を表５に示す。
【0068】
【表5】
【0069】
実験結果
表５から、トリプトファンが本発明のペプチド鎖加水分解試薬の作用により破壊され、検出含有量が得られないことを除いて、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、その他多くのアミノ酸の実際含有量は、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法により１０％未満の偏差で得られることが分かる。
表５から、トリプトファンが本発明のペプチド鎖加水分解試薬の作用により破壊され、検出含有量が得られないことを除いて、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、その他多くのアミノ酸の実際含有量は、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析法により１０％未満の偏差で得られることが分かる。
【0070】
なお、以上は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、当業者にとっては、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良及び修正が加えられてもよく、これらの改良及び修正も本発明の保護範囲とみなされる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】