特表 2024-516875 神経栄養因子をコードするＡＡＶビリオン及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-17

(54)【発明の名称】神経栄養因子をコードするＡＡＶビリオン及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/18 20060101AFI20240410BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240410BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240410BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 27/04 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240410BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240410BHJP

   C07K 14/48 20060101ALI20240410BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240410BHJP

   C12N 15/35 20060101ALN20240410BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20240410BHJP

【ＦＩ】

A61K38/18

A61K48/00

A61K35/76

A61P27/02

A61P27/04

A61P31/12

A61P43/00 105

C12N15/864 100Z

C12N15/12

C07K14/48

C12Q1/02

C12N15/35 ZNA

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568597

(86)(22)【出願日】2022-05-04

(85)【翻訳文提出日】2024-01-09

(86)【国際出願番号】 US2022027647

(87)【国際公開番号】W WO2022235780

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/185,889

(32)【優先日】2021-05-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517139152

【氏名又は名称】オイスター ポイント ファーマ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ナウ，ジェフリー アラン

(72)【発明者】

【氏名】カールソン，エリック シー．

【テーマコード（参考）】

4B063

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QR32

4B063QR59

4B063QS24

4B063QS38

4B063QS40

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084CA18

4C084DB59

4C084MA58

4C084MA66

4C084NA13

4C084ZA331

4C084ZA332

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA17

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA13

4C087ZA33

4C087ZB21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA21

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

提供されるのは、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン、眼疾患を治療する方法、医薬組成物、及び他の組成物及び方法であり、前記ｒＡＡＶビリオンは、神経成長因子（ＮＧＦ）又はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）など、神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む。治療の方法は涙腺への投与を含みうる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象の少なくとも１つの眼又は前記対象の前記眼の少なくとも１つの涙腺に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、
方法。

【請求項2】

前記ｒＡＡＶビリオンが、前記対象の涙腺に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記涙腺が、前記対象の主涙腺又はウォルフリング腺若しくはクラウス腺のいずれか１つである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記涙腺が主涙腺である、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記涙腺内の細胞が、前記ｒＡＡＶビリオンで形質導入される、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記涙腺内の前記形質導入細胞が、有効量の前記神経栄養因子を、前記対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＮＧＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＮＧＦタンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記ＮＧＦタンパク質が配列番号１を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記ＮＧＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＧＤＮＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＧＤＮＦタンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記ＧＤＮＦタンパク質が配列番号３を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記ＧＤＮＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号４を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記プロモーターがＣＡＧプロモーター（配列番号５）である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記眼疾患が、前記眼表面の化学熱傷、角膜創傷、角膜潰瘍、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／若しくは前記眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／若しくは前記眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、又は角膜神経の糖尿病合併症である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記眼疾患の１つ又は複数の症状が、前記ｒＡＡＶビリオンの投与前の前記眼疾患の前記症状と比較して軽減される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記眼疾患の１つ又は複数の症状が、未治療対照の対象における前記眼疾患の前記症状と比較して軽減される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記眼疾患の１つ又は複数の症状が、対側眼の前記眼疾患の前記症状と比較して軽減される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ＡＡＶカプシド及び発現カセットを含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
前記発現カセットが、プロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む、
組み換えｒＡＡＶビリオン。

【請求項24】

前記神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、請求項２３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項25】

前記ＮＧＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項26】

前記ＮＧＦタンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項27】

前記ＮＧＦタンパク質が配列番号１を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項28】

前記ＮＧＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２又は配列番号１７である、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項29】

前記神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、請求項２３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項30】

前記ＧＤＮＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項31】

前記ＧＤＮＦタンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項32】

前記ＧＤＮＦタンパク質が配列番号３を含む、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項33】

前記ＧＤＮＦタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号４又は配列番号１８である、請求項２９に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項34】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有するＶＰ３を含む、請求項２３～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項35】

前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター（配列番号５）又はＣＭＶプロモーター（配列番号１６）である、請求項２３～３４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項36】

前記発現カセットが、配列番号２３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、請求項２３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項37】

前記発現カセットが、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、請求項２３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項38】

前記発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、請求項２３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項39】

配列番号２５のポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。

【請求項40】

前記ｒＡＡＶがＡＡＶカプシドを含む、請求項３９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項41】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する、請求項４０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項42】

ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶカプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、前記発現カセットが、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物。

【請求項43】

ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶカプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、前記発現カセットが、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物。

【請求項44】

ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、前記発現カセットが、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物。

【請求項45】

ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、前記発現カセットが、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物。

【請求項46】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項47】

前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ２である、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ５である、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ９である、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ２カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、前記発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む、
組成物。

【請求項51】

ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ５カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、前記発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む、
組成物。

【請求項52】

ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、前記発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む、
組成物。

【請求項53】

請求項２３～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン、又は請求項４２～５２のいずれか一項に記載の組成物、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項54】

前記ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^７～約１×１０^１４ゲノムコピーを含む、請求項５３に記載の医薬組成物。

【請求項55】

前記ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^１２～約６．２×１０^１２ゲノムコピーを含む、請求項５３に記載の医薬組成物。

【請求項56】

前記涙腺への投与向けに製剤化される、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項57】

前記眼表面への投与向けに製剤化される、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項58】

眼の疾患、障害、又は病態の治療に使用するために、又は使用するのに適合可能に製剤化された、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項59】

それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、有効量の請求項５３～５８のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記対象の前記眼又は前記対象の眼分泌腺に投与することを含む、方法。

【請求項60】

前記ｒＡＡＶビリオンが前記対象の涙腺に投与される、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記涙腺内の細胞が前記ｒＡＡＶビリオンで形質導入される、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記涙腺内の前記形質導入細胞が、有効量の前記神経栄養因子を、前記対象の涙液層及び任意選択で前記眼表面に発現する、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記眼疾患が神経栄養性角膜炎である、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記眼疾患の１つ又は複数の症状が、前記ｒＡＡＶビリオンの投与前の前記眼疾患の前記症状と比較して軽減される、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記眼疾患の１つ又は複数の症状が、未治療対照の対象における前記眼疾患の前記症状と比較して軽減される、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記眼疾患の１つ又は複数の症状が、対側眼の前記眼疾患の前記症状と比較して軽減される、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法に使用するための、請求項２３～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項５３～５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項68】

請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法に使用するための医薬品の製造における、請求項２３～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン又は請求項４２～５２のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項69】

請求項２３～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項５３～５８のいずれか一項に記載の医薬組成物、及
び請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法に使用するための説明書を含む、キット。

【請求項70】

それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
前記方法は、前記対象の少なくとも１つの眼又は前記対象の前記眼の少なくとも１つの涙腺に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、
ｒＡＡＶビリオン。

【請求項71】

前記ｒＡＡＶビリオンが前記対象の涙腺に投与される、請求項７０に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【請求項72】

前記涙腺内の細胞が前記ｒＡＡＶビリオンで形質導入される、請求項７１に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【請求項73】

前記神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【請求項74】

前記神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【請求項75】

前記眼疾患が、前記眼表面の化学熱傷、角膜創傷、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／若しくは前記眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／若しくは前記眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、又は角膜神経の糖尿病合併症である、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互関連出願
本出願は、２０２１年５月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８５，８８９号の利益を主張する。その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その配列表は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記のＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年４月２９日に作成され、ＯＹＳＴ＿０１５＿０３ ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ ２５という名前を付けられ、サイズは７２，０１９バイトである。

【背景技術】

【0003】

神経栄養性角膜症；化学熱傷；角膜創傷；遷延性上皮欠損；ドライアイ疾患；三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症；三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症；並びに角膜神経の糖尿病合併症など、眼表面に影響を及ぼす眼疾患の医学的治療が知られている。くわえて、緑内障、老眼、近視、及び他の前房障害の医学的な治療も知られている。これらの医学的治療には、局所点眼剤、経口医薬品などが含まれる。

【0004】

利用可能な治療があるにもかかわらず、これらの眼疾患は眼科医にとって依然として課題であり、治療戦略は疾患の重症度に重点がおかれる。それほど重症でない場合の治療としては、バンデージコンタクトレンズ（ｂａｎｄａｇｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｌｅｎｓｅｓ）及び潤滑（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ）点眼剤を挙げることができる。より重症の症例の場合、羊膜移植、血清涙液中の特定濃度の血液誘導体、瞼板縫合、及び局所適用された自己血清点眼剤が広く使用されている（非特許文献１）。新たに出てきた治療戦略は自己血清点眼剤の有効性からきている。自家血清点眼液は、患者の血液から採取した血清を生理食塩水で希釈して調製する（非特許文献２）。調製は個人ベースで行われ、ＮＧＦやグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などの神経栄養因子を含む成長因子が存在するので、眼疾患を治療するのに有効であると考えられている。

【0005】

眼表面の治療のための神経栄養因子の送達は、現在、自己血清点眼剤又は精製組み換え神経栄養因子を含有する点眼剤を反復して適用することに依存している。患者間の血清組成の違い、点眼剤の調製中の異物混入の可能性、及び神経栄養因子の分解を最小限に抑えるために必要な特別な保存条件に起因して、自己血清点眼剤は様々でありうる。同様に、組み換え神経栄養因子を含有する点眼剤は、活性がある神経栄養因子をもたらす発現及び精製条件を必要とし、安定性が限られ、特別な保存条件を要する。さらに、ＮＧＦなどの組み換えヒト神経栄養因子は、治療効果を得るために、患者は１日６回、２時間間隔で８週間にわたって投与を受けなければならない。したがって、一部の患者にとって困難（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）又は不可能でありうる反復局所適用を必要とせずに、神経栄養因子を眼表面に送達する方法が必要である。

【0006】

眼表面の障害の医学的治療の向上が望まれることになる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第１０，３０８，９５７号明細書

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Di Zazzo et al. Ocul Surf. 17(4):619-623 (2019)

【非特許文献2】Bradley et al. Clin Exp Ophthalmol.36(8):717-20 (2008)

【非特許文献3】Petrs-Silva et al., Mol Ther.19:293-301 (2011)

【非特許文献4】Rodriques et al., Pharm Res. 36:29 (2019)

【非特許文献5】Lebherz et al. J Gene Med.; 10(4): 375-382 (2008)

【非特許文献6】Rocha et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 52:9567-9572 (2011)

【非特許文献7】Obata Cornea.; 25(10 Suppl 1):S82-9 (2006)

【非特許文献8】Conrady et al., J Ophthalmol. Article ID 7542929 (2016)

【非特許文献9】Micera et al., Exp Eye Res. 83:747-57 (2006)

【非特許文献10】Qi et al., Br J Ophthalmol. 92:1269-74 (2008)

【非特許文献11】Sacchetti et al.Clin Ophthalmol.; 8: 571-579 (2014)

【非特許文献12】Eslani et al. J Ophthalmol.; 2014:196827 (2014)

【非特許文献13】Wipperman et al. Am Fam Physician.; 87(2):114-120 (2013)

【非特許文献14】Zeev et al. Clin Ophthalmol.; 8: 581-590 (2014)

【非特許文献15】Azher et al. Clin Ophthalmol. 11: 185-191 (2017)

【非特許文献16】Shaikh et al. Am Fam Physician. 66(9):1723-1730 (2002)

【非特許文献17】Ljubimov et al. Vision Res.; 139: 138-152 (2017)

【非特許文献18】Conrady et al. J Ophthalmol.; 2016: 7542929 (2016)

【非特許文献19】Pan et al. Optom Vis Sci.; 95:27-31 (2018)

【非特許文献20】Bonini et al.125:1332-1343 (2018)

【非特許文献21】Gautier et al., AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification; bioRxiv, 2022

【発明の概要】

【0009】

本開示は、全体として、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用した眼における神経栄養因子の発現に関する。例えば、本開示は、神経成長因子（ＮＧＦ）又はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を発現するためのベクター、及びそれらの医学的使用を提供する。

【0010】

１つの態様では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、対象の眼又は対象の眼の涙腺に、ｒＡＡＶビリオンを投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対象の少なくとも１つの眼及び／又は涙腺に投与され、対象の少なくとも１つの眼及び／又は涙腺の細胞に形質導入する。少なくとも１つの眼及び／又は涙腺内の形質導入細胞は、神経栄養因子を発現する。少なくとも１つの眼及び／又は涙腺の形質導入細胞によって発現された神経栄養因子は、神経栄養因子を対象の涙液層及び／又は眼表面に発現する。発現される神経栄養因子は、例えば、ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質又はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質でありうる。遺伝子産物の発現は、対象の眼疾患に関連する症状の軽減をもたらす。

【0011】

いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、ｒＡＡＶビリオンが、対象の少なくとも１つの眼又は対象の眼の少なくとも１つの涙腺に投与され、それにより、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法を提供する。

【0012】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対象の少なくとも１つの涙腺に投与さ
れる。いくつかの実施形態では、涙腺は主涙腺である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの涙腺は、対象の主涙腺又はウォルフリング腺若しくはクラウス腺のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの涙腺内の細胞はｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの涙腺内の形質導入細胞は、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に、治療有効量の神経栄養因子を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの涙腺内の形質導入細胞は、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に、有効量の神経栄養因子を発現する。

【0013】

いくつかの実施形態では、神経栄養因子は神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（配列番号２）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、（配列番号１）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、神経栄養因子はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（配列番号４）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は、（配列番号３）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１、ＡＡＶ２ ＶＰ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９のカプシドと少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有するカプシドを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号５）である。

【0017】

いくつかの実施形態では、眼疾患は、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、並びに角膜神経の糖尿病合併症である。

【0018】

いくつかの実施形態では、眼疾患は、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、角膜潰瘍、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、並びに角膜神経の糖尿病合併症である。

【0019】

いくつかの実施形態では、眼疾患は、Ｍａｃｋｉｅの分類に基づいて定義される臨床徴候を特徴とする。

【0020】

いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、対側眼における眼疾患の症状と比較して軽減される。

【0021】

別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神
経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。

【0022】

いくつかの実施形態では、神経栄養因子は神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（配列番号２）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、（配列番号１）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（配列番号４）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は、（配列番号３）と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１、ＡＡＶ２ ＶＰ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９のカプシドと少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有するカプシドを含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーター（配列番号５）である。

【0026】

１つの態様では、本開示は、本明細書に開示のｒＡＡＶビリオン及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^９～約１×１０^１４ゲノムコピーを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^７～約１×１０^１４ゲノムコピーを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^１２～約６．２×１０^１２ゲノムコピーを含む。

【0027】

１つの態様では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法、治療有効量の本明細書に開示の医薬組成物を、対象の眼又は対象の眼分泌腺に投与することを含む方法に関する。１つの態様では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法、有効量の本明細書に開示の医薬組成物を、対象の眼又は対象の眼分泌腺に投与することを含む方法に関する。

【0028】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対象の少なくとも１つの眼及び／又は涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺内の細胞は、ｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺内の形質導入細胞は、対象の眼分泌腺対象の涙液層及び任意選択で眼表面に、治療有効量の神経栄養因子を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺内の形質導入細胞は、対象の眼分泌腺対象の涙液層及び任意選択で眼表面に、有効量の神経栄養因子を発現する。

【0029】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、腺が適切な量の標的（タンパク質、ペプチド、酵素など）を涙液層に分泌するのを確実にするように、対象の少なくとも１つの眼及び／又は涙腺に反復して投与することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺内の細胞は、ｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの
実施形態では、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺内の形質導入細胞は、治療有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺内の形質導入細胞は、有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する。

【0030】

いくつかの実施形態では、眼疾患は神経栄養性角膜炎である。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、対側眼における眼疾患の症状と比較して軽減される。

【0031】

さらに提供されるのは、眼疾患の治療用医薬品の調製に使用するための、本明細書に記載のｒＡＡＶビリオン及び医薬組成物である。

【0032】

いくつかの態様では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、対象の少なくとも１つの眼又は対象の眼の少なくとも１つの涙腺に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む方法を提供する。

【0033】

本明細書に記載の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは対象の涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、涙腺は、対象の主涙腺又はウォルフリング腺若しくはクラウス腺のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、涙腺は主涙腺である。

【0034】

本明細書に記載の実施形態では、涙腺内の細胞はｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、涙腺内の形質導入細胞は、有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する。いくつかの実施形態では、神経栄養因子は神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２を含む。

【0035】

本明細書に記載の実施形態では、神経栄養因子はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４を含む。

【0036】

本明細書に記載の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。

【0037】

本明細書に記載の実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーター（配列番号５）である。

【0038】

本明細書に記載の実施形態では、眼疾患は、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、角膜潰瘍、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／若しくは眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／若しくは眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、又は角膜神経の糖尿病合併症である。

【0039】

本明細書に記載の実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、対側眼における眼疾患の症状と比較して軽減される。

【0040】

いくつかの実施形態では、本開示は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、ＡＡＶカプシド及び発現カセットを含み、発現カセットが、プロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えｒＡＡＶビリオンを提供する。

【0041】

本明細書に記載の実施形態では、神経栄養因子は神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２又は配列番号１７である。

【0042】

本明細書に記載の実施形態では、神経栄養因子はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号１８である。

【0043】

本明細書に記載の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有するＶＰ３を含む。

【0044】

本明細書に記載の実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（配列番号５）又はＣＭＶプロモーター（配列番号１６）である。

【0045】

本明細書に記載の実施形態では、発現カセットは、配列番号２３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む。

【0046】

本明細書に記載の実施形態では、発現カセットは、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む。

【0047】

本明細書に記載の実施形態では、発現カセットは、配列番号２５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む
。

【0048】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２５のポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。

【0049】

本明細書に記載の実施形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶカプシドを含む。

【0050】

本明細書に記載の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。

【0051】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶカプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、発現カセットが、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物を提供する。

【0052】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶカプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、発現カセットが、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物を提供する。

【0053】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、発現カセットが、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物を提供する。

【0054】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、発現カセットが、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに連結された、
組成物を提供する。

【0055】

本明細書に記載の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ９である。

【0056】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ２カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む、
組成物を提供する。

【0057】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ５カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む、
組成物を提供する。

【0058】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが、
（ａ）ＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット、を含み、発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む、
組成物を提供する。

【0059】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶビリオン又は組成物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0060】

本明細書に記載の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^７～約１×１０^１４ゲノムコピーを含む。

【0061】

本明細書に記載の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^１２～約６．２×１０^１２ゲノムコピーを含む。

【0062】

本明細書に記載の実施形態では、組成物は、涙腺への投与向けに製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、眼表面への投与向けに製剤化される。

【0063】

本明細書に記載の実施形態では、組成物は、眼の疾患、障害、又は病態の治療に使用するために、又は使用するのに適合可能に製剤化される。

【0064】

いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を、対象の眼又は対象の眼分泌腺に投与することを含む方法を提供する。

【0065】

本明細書に記載の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは対象の涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、涙腺内の細胞はｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、涙腺内の形質導入細胞は、有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する。

【0066】

本明細書に記載の実施形態では、眼疾患は神経栄養性角膜炎である。

【0067】

本明細書に記載の実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又
は複数の症状は、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される。

【0068】

本明細書に記載の実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、対側眼における眼疾患の症状と比較して軽減される。

【0069】

いくつかの実施形態では、本開示は、前述の又は関連する態様のいずれか１つの方法に使用するための前述の又は関連する態様のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン、組成物、又は医薬組成物の使用を提供する。

【0070】

いくつかの実施形態では、本開示は、前述の又は関連する態様のいずれか１つの方法に使用するための医薬品（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の製造における前述の又は関連する態様のいずれかのｒＡＡＶ又は組成物の使用を提供する。

【0071】

いくつかの実施形態では、本開示は、前述の又は関連する態様のいずれかのｒＡＡＶビリオン、組成物、又は医薬組成物、及び前述の又は関連する態様のいずれか１つの方法に使用するための説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）を含むキットを提供する。

【0072】

いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、方法が組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを、対象の少なくとも１つの眼又は対象の眼の少なくとも１つの涙腺に投与することを含み、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。

【0073】

本明細書に記載の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは対象の涙腺に投与される。

【0074】

本明細書に記載の実施形態では、涙腺内の細胞はｒＡＡＶビリオンで形質導入される。

【0075】

本明細書に記載の実施形態では、神経栄養因子は神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、神経栄養因子はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である。

【0076】

本明細書に記載の実施形態では、眼疾患は、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／若しくは眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／若しくは眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、又は角膜神経の糖尿病合併症である。

【図面の簡単な説明】

【0077】

【図1A】図１Ａは、逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、及びグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）導入遺伝子ポリヌクレオチドエレメントをもつ本発明のｒＡＡＶ発現カセットを含有する例示的なプラスミドを示す。

【図1B】図１Ｂは、逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、及び神経成長因子（ＮＧＦ）導入遺伝子ポリヌクレオチドエレメントをもつ本発明のｒＡＡＶ発現カセットを含有する例示的なプラスミドを示す。

【図1C】図１Ｃは、逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、及び強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）導入遺伝子ポリヌクレオチドエレメントをもつ本発明のｒＡＡＶ発現カセットを含有する例示的なプラスミドを示す。

【図2A】図２Ａは、ヒト対象の涙腺へのウイルスベクターの送達の一例を示す。

【図2B】図２Ｂは、ヒト対象の涙腺へのウイルスベクターの送達の一例を示す。

【図3】図３は、対象が症状の重症度を記録するアイドライネス検査で使用されるビジュアルアナログスケールの一例を示す。

【図4】図４は、ＮＥＩ／Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐのスケールに基づく角膜表面の亀裂（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の採点評価図（ｇｒａｄｉｎｇ ｄｉａｇｒａｍ）である。

【図5】図５は、神経栄養性角膜炎のＭａｃｋｉｅ分類を示す。

【図6A】図６Ａは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6B】図６Ｂは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6C】図６Ｃは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6D】図６Ｄは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6E】図６Ｅは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6F】図６Ｆは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6G】図６Ｇは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6H】図６Ｈは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6I】図６Ｉは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6J】図６Ｊは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図6K】図６Ｋは、抗ｅＧＦＰ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｅＧＦＰ導入遺伝子をもつ発現カセットが入ったｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｅＧＦＰ抗体で染色し、ｅＧＦＰ発現を評価した。黒い矢印は、ｅＧＦＰの発現を示す染色を指し示す。

【図7A】図７Ａは、抗ｈＮＧＦ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｈＮＧＦ導入遺伝子をもつ発現カセットを送達するように遺伝子改変したｒＡＡＶビリオン（ＡＡＶ９血清型）を涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｈＮＧＦ抗体で染色し、ｈＮＧＦ発現を評価した。黒い矢印は、ｈＮＧＦの発現を示す染色を指し示す。

【図7B】図７Ｂは、抗ｈＮＧＦ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｈＮＧＦ導入遺伝子をもつ発現カセットを送達するように遺伝子改変したｒＡＡＶビリオン（ＡＡＶ９血清型）を涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｈＮＧＦ抗体で染色し、ｈＮＧＦ発現を評価した。黒い矢印は、ｈＮＧＦの発現を示す染色を指し示す。

【図7C】図７Ｃは、抗ｈＮＧＦ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｈＮＧＦ導入遺伝子をもつ発現カセットを送達するように遺伝子改変したｒＡＡＶビリオン（ＡＡＶ９血清型）を涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｈＮＧＦ抗体で染色し、ｈＮＧＦ発現を評価した。黒い矢印は、ｈＮＧＦの発現を示す染色を指し示す。

【図7D】図７Ｄは、抗ｈＮＧＦ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｈＮＧＦ導入遺伝子をもつ発現カセットを送達するように遺伝子改変したｒＡＡＶビリオン（ＡＡＶ９血清型）を涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｈＮＧＦ抗体で染色し、ｈＮＧＦ発現を評価した。黒い矢印は、ｈＮＧＦの発現を示す染色を指し示す。

【図7E】図７Ｅは、抗ｈＮＧＦ抗体で染色した涙腺組織の画像である。ｈＮＧＦ導入遺伝子をもつ発現カセットを送達するように遺伝子改変したｒＡＡＶビリオン（ＡＡＶ９血清型）を涙腺内注射で涙腺に投与した。涙腺組織を抗ｈＮＧＦ抗体で染色し、ｈＮＧＦ発現を評価した。黒い矢印は、ｈＮＧＦの発現を示す染色を指し示す。

【図8】図８は、ＡＡＶ．ｈＮＧＦを投与された動物の涙液層中のｈＮＧＦの濃度を示すプロットである。タンパク質濃度は、ＡＡＶ２．ｈＮＧＦ、ＡＡＶ５．ｈＮＧＦ、ＡＡＶ９．ｈＮＧＦ、又は対照（ＡＡＶの注射なし）を涙腺内投与した後、図に示す日数の後に、シルマー試験ストリップを使用しダッチベルテッドラビット（Ｄｕｔｃｈ－ｂｅｌｔｅｄ ｒａｂｂｉｔｓ）から涙液層を採取して測定した。

【図9】図９は、ＡＡＶプラスミドのＩＴＲ間のエレメントを示す概略図である。このプラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＮ末端に分泌シグナルを連結したＥＧＦＰ（「ｓｅｃＥＧＦＰ」）をコードする。ウッドチャック肝炎ウイルスの翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）は、導入遺伝子の発現を増加させる役割を果たし、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化（ｐＡ）シグナルに近接している。

【図10】図１０は、ＡＡＶ－ｓｅｃＥＧＦＰ（ＡＡＶ２又はＡＡＶ９血清型）の注射を受け、１０３日目に採取され、パラフィンで固定されたブタ涙腺の画像を示す。抗ＧＦＰ抗体及びＤＡＰＩ（核）対比染色を用いて、５μＭ切片のＩＨＣを行った。画像は、共焦点顕微鏡を使用して倍率１００×で撮影した。陰性対照動物は注射を受けなかった。

【図11】図１１は、ＡＡＶ９－ｓｅｃＥＧＦＰの注射を受け、１０３日目に採取され、パラフィンで固定されたブタ涙腺の画像を示す。抗ＧＦＰ抗体及びＤＡＰＩ（核）対比染色を用いて、５μＭ切片のＩＨＣを行った。涙腺腺房細胞にくわえて、延性（ｄｕｃｔｉｌｅ）上皮細胞もＡＡＶ９で形質導されるようである（白い矢印）。

【図12】図１２は、ＡＡＶの注射を受け、１０３日目に採取され、パラフィンで固定されたブタ涙腺の画像を示す。５μＭのパラフィン切片の１００×でのＨ＆Ｅ染色において、炎症性浸潤、マクロ又はミクロの異常は認められない。

【図13A】図１３Ａは、ブタの涙液層中のｈＮＦＧβの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すプロットである。ヒト神経成長因子をコードするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）（ＡＡＶ－ｈＮＧＦβ）による形質導入の後、７、１４、２１、２８、及び３５日目にブタ（ｎ＝４）の左眼から涙を採取した。ＡＡＶ２－ｈＮＧＦβは、形質導入の７日後に、ＭＳＤアッセイの標準曲線範囲内で検出可能なレベルのｈＮＧＦβを有した。

【図13B】図１３Ｂは、ブタの涙液層中のｈＮＦＧβの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すプロットである。ヒト神経成長因子をコードするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）（ＡＡＶ－ｈＮＧＦβ）による形質導入の後、７、１４、２１、２８、及び３５日目にブタ（ｎ＝４）の左眼から涙を採取した。ＡＡＶ５－ｈＮＧＦβは、形質導入の７日後に、ＭＳＤアッセイの標準曲線範囲内で検出可能なレベルのｈＮＧＦβを有した。

【図13C】図１３Ｃは、ブタの涙液層中のｈＮＦＧβの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すプロットである。ヒト神経成長因子をコードするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）（ＡＡＶ－ｈＮＧＦβ）による形質導入の後、７、１４、２１、２８、及び３５日目にブタ（ｎ＝４）の左眼から涙を採取した。ＡＡＶ９－ｈＮＧＦβは、形質導入の７日後に、ＭＳＤアッセイの上限の定量レベルを超えるｈＮＧＦβの涙液レベルを有した。

【図14】図１４は、逆位末端反復（ＩＴＲ）をもつ配列番号２５のｒＡＡＶ発現カセット、ＣＡＧプロモーター、及び神経成長因子（ＮＧＦ）導入遺伝子ポリヌクレオチドエレメントを含有する例示的なプラスミドを示す。

【発明を実施するための形態】

【0078】

概要
本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法を提供する。健康な対象では、神経栄養因子は角膜に対して維持と修復を行う。角膜上皮細胞は、可溶性神経栄養因子ＮＧＦ及びＧＤＮＦを眼表面に放出し、それぞれＴｒｋＡ及びＧＦＲα－１受容体の活性化を通して角膜細胞の生存及び治癒を促進する。ＮＧＦ及びＧＤＮＦは、涙液層に構成的に存在し、角膜への刺激又は損傷に対する応答の間に多量に増加する。

【0079】

本明細書に開示のように、ＡＡＶをベースとする眼への導入遺伝子の送達は、眼の障害を治療する方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンは、導入遺伝子の送達に関して明確な利点がある。ｒＡＡＶビリオンで送達された導入遺伝子は、形質導入細胞のゲノムに組み込まれる可能性が高く、導入遺伝子産物の長期発現が可能になる。くわえて、ｒＡＡＶビリオンは、アデノウイルスなどの他のウイルス送達ベクターほど免疫原性が高くない。後眼部の細胞を形質導入するための網膜下及び硝子体内注射を用いたＡＡＶベース送達ベクターが報告され、生体内での有効性が示されている（特許文献１；非特許文献３；非特許文献４）。

【0080】

ＡＡＶをベースとする眼への導入遺伝子の送達に使用されるＡＡＶ血清型としては、導入遺伝子を送達するのに使用されるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が挙げられる（非特許文献５）。ＡＡＶをベースとする涙腺への導入遺伝子の送達に使用されるＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５ｗ８、ＡＡＶ ｘ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１２、及びＢＡＡＶが挙げられる（非特許文献６）。

【0081】

涙腺への注射（すなわち、涙腺内送達、涙腺内注射、又は涙腺内投与）による、ウイルスベクターに基づいた、タンパク質産物をコードする導入遺伝子の送達は、眼の疾患及び症状を治療するのに有利でありうる。涙腺で産生され、対象の涙液に分泌されるタンパク質は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）（タンパク質の生合成に続く、共有結合的で一般に酵素的なタンパク質の修飾）により改善される可能性があり、これによって、タンパク質は、ｍＲＮＡをポリペプチド鎖に翻訳するリボソームによって合成され、次いで、ＰＴＭを受けて成熟タンパク質産物を形成することができる。ＰＴＭは、大腸菌（ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌で作られることが多い組み換えヒトタンパク質の局所送達では通常は存在しないような細胞シグナル伝達における重要な特性を付与しうる。くわえて、補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）、シャペロン、酵素、又は他のタンパク質を含有しうる天然の涙液層成分とともに分泌された場合、涙液を介した投与は、局所的に投与されたタンパク質だけでは達成できなかった生物活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を付与しうる。

【0082】

１つの態様では、ｒＡＡＶビリオンは、神経栄養因子の発現のために提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺の細胞は、本開示のｒＡＡＶビリオンで形質導入される。涙腺は、健康な眼表面の促進及び正常な視覚機能の維持を担う
涙液の主要な供給源である。主涙腺は眼瞼葉及び眼窩葉を含み、上眼瞼挙筋の腱膜の外側縁で互いに連続している。小葉には多くの腺房管及び小葉内管があり、結膜の円蓋に開口する導管を形成する。主涙腺は、腺房細胞、管細胞、及び／又は筋上皮細胞で構成される（非特許文献７）。主涙腺は、対象の眼の眼表面に涙液層の水層を分泌する。本明細書において使用される場合、「涙腺」という用語は、対象の主涙腺並びにウォルフリング腺及びクラウス腺を意味する。付属腺は、ウォルフリング腺及びクラウス腺として知られ、眼瞼に位置する。上眼瞼には、約２～５つのウォルフリング腺及び約４０のクラウス腺がある。下眼瞼には、約６～８つのクラウス腺がある。涙液機能単位（ｌａｃｒｉｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔ）の具体的な位置及び解剖学的構造はよく知られている（非特許文献８）。

【0083】

発現カセット
本開示のｒＡＡＶビリオンは発現カセットを含むことができる。本明細書において使用される場合、「発現カセット」という用語は、目的のタンパク質又は導入遺伝子、例えば神経栄養因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、逆位末端反復と隣接したポリヌクレオチドを意味する。発現カセットは、他のポリヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、調節エレメント（例えば、１つ又は複数のプロモーター又はエンハンサー）、翻訳開始配列、コード配列、及び終結配列をさらに含むことができる（図１Ａ～１Ｃ及び図１４）。調節エレメントは、導入遺伝子に動作可能に連結され、発現を促進することができる。

【0084】

いくつかの実施形態では、本開示の発現カセットは神経栄養因子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺における神経栄養因子の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、神経栄養因子の発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼における神経栄養因子の発現と比較して５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％増加しうる。本明細書において使用される場合、「対象」はいずれの哺乳動物も意味し、例えばマウス、ウサギ、ブタ、イヌ、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）及びヒトが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象はヒト又はＮＨＰである。さらに、「個体」又は「患者」は、「対象」と互換的に使用することができる。いくつかの実施形態では、神経栄養因子の発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼における神経栄養因子の発現と比較して１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍増加しうる。いくつかの実施形態では、神経栄養因子の発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼における神経栄養因子の発現と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％増加しうる。いくつかの実施形態では、神経栄養因子の発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼における神経栄養因子の発現と比較して１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍増加しうる。いくつかの実施形態では、治療された眼では、神経栄養因子は任意の検出可能なレベルで発現することができるのに対して、未治療対象、又は治療対象の対側眼では、神経栄養因子は発現しない可能性がある、又は検出不可能なレベルで発現する可能性がある。別の言い方をすると、ｒＡＡＶビリオンが投与される眼又は涙腺は、内在性（すなわち、ネイティブ）神経栄養因子の発現のみを有する眼若しくは涙腺、又は内在性（すなわち、ネイティブ）神経栄養因子の発現の分泌が低い、若しくは損なわれている眼に比べて、より多量に神経栄養因子を発現しうる。

【0085】

いくつかの実施形態では、神経栄養因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質又はその機能性バリアントである。本明細書において使用される場合、「ＮＧＦ」、「ＮＧＦβ」、又は「神経成長因子β」は、ホモ二量体化して神経成長刺激活性を発揮するタンパク質をコードする遺伝子である神経成長因子を意味する。ＮＧＦはまた、ニューロンの調節及び分化にも関与している。本明細書において使用される場合、「ＮＧＦタンパク質」と
いう用語は、任意の種に由来するＮＧＦタンパク質を意味する。「機能性バリアント」という用語は、配列置換、挿入、欠失、及び／又はＮ末端若しくはＣ末端の短縮を有するバリアントを意味し、機能性バリアントは参照タンパク質、例えばネイティブＮＧＦタンパク質の１つ又は複数の機能を保持する。ＮＧＦは、主に神経細胞の成長、維持、増殖及び生存に関与する２６ｋＤａのポリペプチドである。角膜において、ＮＧＦはその受容体ｔｒｋＡ^ＮＧＦＲ及びｐ７５^ＮＴＲに結合し、角膜と結膜の両方の治癒に関連するシグナル伝達経路を誘発する（非特許文献９）。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性をもつ配列を共有する。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドンが最適化される。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する配列によってコードされる。

【0086】

＞コドン最適化ＮＧＦ
atgagcatgctgttttacaccctgatcaccgccttcctgatcggcatccaggccgagccccacagcgagagcaacgtgcccgctggacacacaatccctcaggcccactggacaaaactgcagcatagcctggatacagccctgagaagggccagaagcgcccctgccgccgccatcgccgctagagtggccggccagacaagaaatatcaccgtggacccccggctgttcaagaaaagaagactgcggtctcctagagtgctcttttcaacacagcctcctcgggaagccgctgatacccaggacctggacttcgaggtgggaggcgccgctcctttcaatagaacccacagatccaagagaagctctagccaccctatcttccaccggggcgagttcagcgtgtgcgacagcgtttctgtgtgggtgggagataagaccaccgcaaccgatatcaagggcaaggaagtgatggtgctgggcgaagtgaacatcaacaacagcgtctttaagcagtacttcttcgagacaaagtgccgggacccaaaccccgtggacagcggctgcagaggcattgactccaagcactggaactcctactgcaccacaacacacaccttcgtgaaggccctgaccatggacggcaaacaagctgcctggcggttcatcagaatcgacaccgcctgtgtctgtgtgctgagcagaaaggccgtgcgccgggcctag（配列番号１７）

【0087】

いくつかの実施形態では、ＮＧＦタンパク質はヒトＮＧＦタンパク質である。

【0088】

いくつかの実施形態では、神経栄養因子はグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である。本明細書において使用される場合、「ＧＤＮＦタンパク質」という用語は、任意の種に由来するＧＤＮＦタンパク質を意味する。「機能性バリアント」という用語は、配列置換、挿入、欠失、及び／又はＮ末端若しくはＣ末端の短縮を有するバリアントを意味し、機能性バリアントは参照タンパク質、例えばネイティブＧＤＮＦタンパク質の１つ又は複数の機能を保持する。ＧＤＮＦは２１ｋＤａのタンパク質であり、その受容体ＧＦＲα－１に作用するＧＤＮＦによって多種多様な神経系の成長、維持、及び分化を助け
る（非特許文献１０）。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性をもつ配列を共有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質は、配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一な配列を共有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドンが最適化される。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する配列によってコードされる。

【0089】

＞コドン最適化ＧＤＮＦ
atgaactgtgggacgttgtggccgtgtgcctggtcctcctgcacaccgcctccgcctttccactgcctgctggaaagcggcctcctgaggcccctgctgaagatagaagcctgggcagaagaagagcccccttcgccctgagctctgatagcaacatgcctgaggactaccccgaccagttcgacgacgtgatggactttatccaggccaccatcaagagactgaaacggagccctgacaagcagatggccgtgctgcctagacgggaaagaaatagacaggccgcagctgccaaccccgagaacagcagaggcaaaggccggagaggccagaggggaaaaaacagaggatgtgtgctgaccgccatccatctgaacgtgacagatctgggcctgggctatgagaccaaggaagagctgatcttcagatactgcagcggcagctgcgacgccgccgagacaacctacgacaagatcctgaagaacctgtcccggaatcggcggctggtgtctgacaaggtgggccaagcttgctgcagaccaattgccttcgacgatgatctgtctttcctggatgacaacctggtgtaccacatcctgagaaagcacagcgccaagcgctgcggctgtatctag（配
列番号１８）

【0090】

いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦはヒトＧＤＮＦである。

【0091】

【表1】

【0092】

いくつかの実施形態では、本開示の発現カセットはプロモーターを含む。本明細書において使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導き、それによりＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち転写を導くのに十分な最小限の配列を意味する。プロモーターは、導入遺伝子、例えば神経栄養因子に動作可能に連結することができる。導入遺伝子の転写は、それが動作可能に連結されたプロモーターによって開始及び調節することができる。例えば、導入遺伝子に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、プロモーターでＲＮＡ合成が開始された場合に導入遺伝子を発現することになる。プロモーター及び対応するタンパク質又はポリペプチドの発現はユビキタ
スであり、つまり広範囲の細胞、組織及び種で強く活性を示すこともあれば、細胞型特異的、組織特異的、若しくは種特異的であることもある。プロモーターは「構成的」、つまり常に活性であることもあれば、「誘導性」、つまり生物的又は非生物的因子の存在又は不在によって活性化又は不活性化されうることもある。また、本発明の核酸コンストラクト又はベクターには、プロモーター配列と連続することもあり連続しないこともあるエンハンサー配列が含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼし、ネイティブ遺伝子の５’領域に位置することもあり、３’領域に位置することもある。

【0093】

プロモーター領域が、少なくとも１つの眼及び／又は涙腺におけるＮＧＦ又はＧＮＤＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を促進する限り、任意の好適なプロモーター領域又はそのなかのプロモーター配列を、対象となるポリヌクレオチドカセットに使用することができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の眼及び／又は涙腺における遺伝子の発現を促進する。いくつかの実施形態では、発現カセットは細胞型特異的プロモーターを含む。プロモーターは、眼の細胞及び／又は涙腺の細胞における転写を特異的に促進しうる。

【0094】

いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター配列（配列番号５）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する。

【0095】

＞ＣＡＧプロモーター
ataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctactcgaggccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagcgggatcagccaccgcggtggcggcctagagtcgacgaggaactgaaaaaccagaaagttaactg（配列番号５）

【0096】

いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは配列番号１６を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター配列（配列番号１６）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する。

【0097】

＞ＣＭＶプロモーター
ctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaat（配列番号１６）

【0098】

いくつかの実施形態では、発現カセットは、ポリアデニル化配列に動作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。好適なポリアデニル化配列としては、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ｂＧＨポリＡ）及びショートポリＡシグナルを挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は配列番号２１を含む。任意選択で、本開示のｒＡＡＶベクターはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは配列番号２２を含むＷＰＲＥを含む。

【0099】

＞ｂＧＨポリＡ配列
cgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg（配列番号２１）

【0100】

＞ＷＰＲＥ配列
tcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctccctatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtc（配列番号２２）

【0101】

いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号２３を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む。

【0102】

＞ＧＤＮＦをコードする配列を含む発現カセット
gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacggatctttacaaattcaagccaggtgatttcaacaaattttgctgacgatttaggcgcactatcccctaaactacaaattagaaaatagcgttccttgacactagtctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaataagctttctcaggggagatctcgtttagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgaggtgaggtgtggcaggcttgagatccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcattacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaagtttaaacgccgccgccatgaagctgtgggacgttgtggccgtgtgcctggtcctcctgcacaccgcctccgcctttccactgcctgctggaaagcggcctcctgaggcccctgctgaagatagaagcctgggcagaagaagagcccccttcgccctgagctctgatagcaacatgcctgaggactaccccgaccagttcgacgacgtgatggactttatccaggccaccatcaagagactgaaacggagccctga
caagcagatggccgtgctgcctagacgggaaagaaatagacaggccgcagctgccaaccccgagaacagcagaggcaaaggccggagaggccagaggggaaaaaacagaggatgtgtgctgaccgccatccatctgaacgtgacagatctgggcctgggctatgagaccaaggaagagctgatcttcagatactgcagcggcagctgcgacgccgccgagacaacctacgacaagatcctgaagaacctgtcccggaatcggcggctggtgtctgacaaggtgggccaagcttgctgcagaccaattgccttcgacgatgatctgtctttcctggatgacaacctggtgtaccacatcctgagaaagcacagcgccaagcgctgcggctgtatctagtcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctccctatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtccgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggagcgctggctagaattacctaccggcctccaccataccttcgatattcgcgcccactctcccattaatccgcacaagtggatgtgatgcgattgcccgctaagatagttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc（配列番号２３）

【0103】

いくつかの実施形態では、発現カセットは配列番号２４を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む。

【0104】

＞ＮＧＦをコードする配列を含む発現カセット
gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacggatctttacaaattcaagccaggtgatttcaacaaattttgctgacgatttaggcgcactatcccctaaactacaaattagaaaatagcgttccttgacactagtctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaataagctttctcaggggagatctcgtttagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgaggtgaggtgtggcaggcttgagatccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcattacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaagtttaaacgccgccgccatgagcatgctgttttacaccctgatcaccgccttcctgatcggcatccaggccgagccccacagcgagagcaacgtgcccgctggacacacaatccctcaggcccactggacaaaactgcagcatagcctggatacagccctgagaagggccagaagcgcccctgccgccgccatcgccgctagagtggccggccagacaagaaatatcaccgtggacccccggctgttcaagaaaagaagactgcggtctcctagagtgctcttttcaacacagcctcctcgggaagccgctgatacccaggacctggacttcgaggtgggaggcgccgctcctttcaatagaacccacagatccaagagaagctctagccaccctatcttccaccggggcgagttcagcgtgtgcgacagcgtttctgtgtgggtgggagataagaccaccgcaaccgatatcaagggcaaggaagtgatggtgctgggcgaagtgaacatcaacaacagcgtctttaagcagtacttcttcgagacaaagtgccgggacccaaaccccgtggaca
gcggctgcagaggcattgactccaagcactggaactcctactgcaccacaacacacaccttcgtgaaggccctgaccatggacggcaaacaagctgcctggcggttcatcagaatcgacaccgcctgtgtctgtgtgctgagcagaaaggccgtgcgccgggcctagtcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctccctatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtccgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggagcgctggctagaattacctaccggcctccaccataccttcgatattcgcgcccactctcccattaatccgcacaagtggatgtgatgcgattgcccgctaagatagttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc（配列番号２４）

【0105】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは配列番号２５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、図１４のプラスミドで示された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む。

【0106】

【表2】

【0107】

【表3】

【0108】

【表4】

【0109】

組み換えＡＡＶビリオン
本発明のいくつかの態様では、対象となる発現カセットは、例えば、眼の障害を治療するために、神経栄養因子を対象の少なくとも１つの眼及び／又は涙腺に送達するために使用される。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、対象の少なくとも１つの眼及び／又は涙腺おける神経栄養因子の発現を提供する組成物は、遺伝子送達ベクターであり、その遺伝子送達ベクターは本開示のポリヌクレオチドカセットを含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、遺伝子送達ベクターはｒＡＡＶビリオンである。そのような実施形態では、対象となる発現カセットはＡＡＶ逆位末端反復配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、は、機能性ＡＡＶ逆末端反復（ＩＴＲ）配列と５’末端及び３’末端で隣接している。「機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列」は、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングのために意図されたように機能することを意味する。したがって、本開示の遺伝子送達ベクターに使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失若しくは置換によって改変されることもあり、又はＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０のいずれかに由来することもある。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ１に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ３に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ４に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ５に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ６に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ７に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ９に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ１に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ１０に由来する。ある特定のｒＡＡＶビリオンは、野生型のＲＥＰ及びＣＡＰ遺伝子の全部又は一部が欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列は保持している。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００
％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性をもつ配列を共有する。

【0111】

＞例示的な５’ＩＴＲ配列
gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaac（配列番号１９
）

【0112】

いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは配列番号２０を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性をもつ配列を共有する。

【0113】

＞例示的な３’ＩＴＲ配列
gttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc（配列番号２０
）

【0114】

そのような実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の、又は将来的に発見されるアデノ随伴ウイルス血清型に由来するＡＡＶカプシドを含む。例えば、ＡＡＶカプシドは、野生型（又は「ネイティブ」）カプシドであることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ３由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ４由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ５由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ６由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ７由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ８由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ９由来のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１０由来のＡＡＶカプシドを含む。特に興味深いＡＡＶカプシドとしては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が挙げられる（表３）。

【0115】

しかし、ＩＴＲと同様に、カプシドは野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、むしろ、カプシドが眼及び／又は涙腺の細胞に形質導入できる限り、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変えることができる。別の言い方をすれば、ＡＡＶカプシドはバリアントＡＡＶカプシドであることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、あるＡＡＶのカプシド（ｃａｐ）遺伝子と、異なるＡＡＶのｒｅｐ遺伝子及びＩＴＲを使用することによって作成された「偽型の」ＡＡＶであり、例えば、ＡＡＶ２のｒｅｐと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９のｃａｐを、ＡＡＶ２に基づくベクターを含有するプラスミドと一緒に使用することによって作成された偽型ＡＡＶ２がある。例えば、ｒＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／３、ｒＡＡＶ２／４、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／６、ｒＡＡＶ２／７、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９などであることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／１である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／３である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは
ｒＡＡＶ２／４である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／５である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／６である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／７である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／８である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／９である。

【0116】

いくつかの実施態様では、ｒＡＡＶビリオンは独立してそのゲノムをさらに複製し、パッケージすることができないという点で、ｒＡＡＶは複製欠損である。例えば、眼及び／又は涙腺がｒＡＡＶビリオンで形質導入されたとき、遺伝子は形質導入された眼及び／又は涙腺で発現するが、形質導入された眼及び／又は涙腺はＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにアクセサリー機能遺伝子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）を欠いているという事実により、ｒＡＡＶは複製することができない。

【0117】

本発明に記載の発現カセットを封入する本開示のｒＡＡＶビリオンは、ヘルパーフリー作製を用いて作製することができる。ｒＡＡＶは複製欠損ウイルスであり、通常、感染性ｒＡＡＶビリオンをパッケージングするためには、宿主細胞内にアデノウイルスなどの生きたヘルパーウイルス由来の構成要素が必要である。ｒＡＡＶヘルパーフリー作製システムは、生きたヘルパーウイルスを使用せずに感染性ｒＡＡＶビリオンの作製を可能にする。ヘルパーフリーシステムでは、宿主パッケージング細胞株は３つのプラスミドでトランスフェクションされる。第１のプラスミドは、ｒＡＡＶビリオンのパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子産物（すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子）を含有する。第２のプラスミドは、必要なＡＡＶ遺伝子（すなわち、ＲＥＰ及びＣＡＰ遺伝子）を含有する。第３のプラスミドは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びＩＴＲと隣接したプロモーターを含有する。宿主パッケージング細胞株は、例えば、ＡＡＶ－２９３宿主細胞であることができる。好適な宿主細胞は、プラスミドによって供給されない、感染性ｒＡＡＶビリオンをパッケージングするのに必要な追加の構成要素を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＰ遺伝子は、例えば、本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは本明細書に記載のプロモーター配列である。いくつかの実施形態では、プロモーター配列はＣＡＧ配列である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は神経栄養因子である。いくつかの実施形態では、神経栄養因子はＮＧＦである。いくつかの実施形態では、神経栄養因子はＧＤＮＦである。

【0118】

眼及び／又は涙腺に感染することが示されているＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５ｗ８、及びＡＡＶ９が挙げられる（Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．、前出（ｓｕｐｒａ））。いくつかの実施形態では、眼及び／又は涙腺に感染させるために使用されるＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質（配列番号６）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ ＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２ ＶＰ３タンパク質（配列番号８）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ ＶＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号９を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ ＶＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、眼及び／又は涙腺に感染させるために使用されるＡＡＶ血清型はＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質（配列番号１０）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、眼及び／又は涙腺に感染させるために使用されるＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質（配列番号１２）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、眼及び／又は涙腺に感染させるために使用されるＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は配列番号１４を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する。

【0119】

【表5】

【0120】

【表6】

【0121】

【表7】

【0122】

【表8】

【0123】

【表9】

【0124】

【表10】

【0125】

【表11】

【0126】

例示的なｒＡＡＶ
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶは、神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、プロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びＣＡＧプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。

【0127】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結されたＮＧＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号１７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８
９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及びＣＡＧプロモーターに動作可能に連結されたＮＧＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及びプロモーターに動作可能に連結されたＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号１８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及びＣＡＧプロモーターに動作可能に連結されたＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド及びプロモーターに動作可能に連結されたＮＧＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド、及び配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド、及び配列番号１７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少な
くとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド、及び配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド、及びプロモーターに動作可能に連結されたＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド、及び配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド、及び配列番号１８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２カプシド、及び配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド及びプロモーターに動作可能に連結されたＮＧＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド、及び配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド、及び配列番号１７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド、及び配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少な
くとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド、及びプロモーターに動作可能に連結されたＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド、及び配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド、及び配列番号１８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ５カプシド、及び配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド及びプロモーターに動作可能に連結されたＮＧＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド、及び配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド、及び配列番号１７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド、及び配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド、及びプロモーターに動作可能に連結されたＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いく
つかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド、及び配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド、及び配列番号１８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシド、及び配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を含むＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがプロモーターに動作可能に連結された発現カセットを含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号２３を含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号２４を含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び配列番号２５を含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

【0138】

使用の方法
本明細書に記載の方法及び組成物は、眼疾患を治療し、眼疾患の関連症状を軽減することができる。本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、一般に、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に防ぐ、例えば対象において疾患若しくはその症状が発生する可能性を減らすという点では予防的であるうる、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する副作用の部分的若しくは完全な治癒という点では治療的でありうる。本明細書において使用される「治療」は、哺乳動物における疾患のいずれの治療も包含とし、次を含む：（ａ）疾患の進行を抑制すること；（ｂ）疾患の１つ又は複数の症状を緩和、軽減する、又はその増加を軽減すること；（ｃ）疾患の１つ又は複数の徴候を緩和、軽減、又はその増加を軽減すること；（ｄ）疾患の退行をもたらすこと。治療薬は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減する進行中の疾患の治療は、特に関心が高い。そのような治療は、患部組織の機能が完全に失われる前に行われることが望ましい。対象となる療法は、望ましくは疾患の症候期の間、場合によっては疾患の症候期後に投与されることになる。

【0139】

本明細書において使用される場合、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などは、薬理学的に有用である（例えば、対象の疾患、障害、又は病態を治療する）方法で対象に物質（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を与えることを意味する。

【0140】

本開示の方法及び組成物は、眼疾患をもつ対象の眼表面を補助（ｓｕｐｐｏｒｔ）、維持、及び／又は修復することができる。眼疾患は、例えば、神経栄養性角膜炎、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、並びに角膜神経の糖尿病合併症でありうる。いくつかの実施形態では、眼疾患は、神経栄養性角膜炎、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、角膜潰瘍、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、又は角膜神経の糖尿病合併症である。いくつかの実施形態では、眼疾患は神経栄養性角膜炎である。いくつかの実施形態では、眼疾患は眼表面の化学熱傷である。いくつかの実施形態では、眼疾患は角膜創傷である。いくつかの実施形態では、眼疾患は角膜潰瘍である。いくつかの実施形態では、眼疾患は遷延性上皮欠損である。いくつかの実施形態では、眼疾患はドライアイ疾患である。いくつかの実施形態では、眼疾患は、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、眼疾患は、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、眼疾患は角膜神経の糖尿病合併症である。

【0141】

神経栄養性角膜炎、又は神経栄養性角膜症は、角膜の上皮角膜症、潰瘍形成、及び穿孔を呈する。神経栄養性角膜炎は、角膜神経支配の障害に起因する角膜上皮の変性疾患である。症状としては、角膜知覚の低下又は完全な消失が挙げられる。神経栄養性角膜炎は、本明細書に記載の眼の検査、下眼瞼結膜のローズベンガル染色の組み合わせの観察、涙液粘度、涙液破壊時間、フルオレセイン染色、非治癒角膜欠損の観察、デスメ膜内の腫脹及び浮腫状実質、角膜潰瘍、角膜穿孔、並びに角膜実質融解のうちの１つ又は複数を用いて、診断及び病期分類される（非特許文献１１）。

【0142】

いくつかの実施形態では、本開示は、眼表面の化学熱傷をもつ対象の眼表面を維持及び／又は修復する方法を提供する。眼表面の化学熱傷は、典型的に、突然に発症する激痛、導涙性流涙（ｅｐｉｐｈｏｒｉａ）、及び眼瞼痙攣として現れる。眼表面の化学熱傷は眼科精密検査によって診断することができる。傷害の急性の眼周囲徴候としては、眼窩周囲の浮腫と紅斑、脱上皮化した（ｄｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚｅｄ）皮膚、並びに睫毛及び眉の脱毛が挙げられる。その他の徴候としては、角結膜上皮欠損、化学反応、結膜炎症、角膜縁虚血、角膜混濁、無菌性潰瘍、浮腫、及び時折の穿孔が挙げられる。高眼圧も症状の一つであり、線維柱帯の損傷及び／又は炎症の結果として生じうる（非特許文献１２）。

【0143】

いくつかの実施形態では、本開示は、角膜創傷をもつ対象の眼表面を維持及び／又は修復する方法を提供する。角膜創傷は典型的に、眼の疼痛、流涙、光過敏（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｌｉｇｈｔ）、及び異物感という症状を呈する。診断は、眼科検査、視力低下評価、角膜浸潤又は潰瘍の同定、前房蓄膿又は前房出血の同定、穿通性眼損傷の所見、瞳孔不整の同定、及び眼内容物の拡張のうちの１つ又は複数を用いて行われる。診断は、眼科検査、視力低下評価、角膜浸潤又は潰瘍の同定、前房蓄膿又は前房出血の同定、穿通性眼損傷の所見、いずれかの眼構造内の異物の有無、瞳孔不整の同定、及び眼内容物の拡張のうちの１つ又は複数を用いて行われる。さらに、フルオレセイン染色を用いて、なんらかの角膜擦過傷を同定するのに役立てることができる（非特許文献１３）。

【0144】

いくつかの実施形態では、本開示は、角膜潰瘍をもつ対象の眼表面を維持及び／又は修復する方法を提供する。角膜潰瘍は、眼表面に損傷を負った後、通常の２週間以内に角膜上皮が治癒しない場合に起こる。診断は、本明細書に記載の眼科検査を用いて行われる。

【0145】

遷延性上皮欠損は、眼表面に損傷を負った後、通常の２週間以内に角膜上皮が治癒しな
い場合に起こる。診断は、本明細書に記載の眼科検査を用いて行われる。

【0146】

いくつかの実施形態では、本開示は、ドライアイ疾患をもつ対象の眼表面を維持及び／又は修復する方法を提供する。ドライアイ疾患は、霧視、眼刺激、ゴロゴロ感又は異物感、灼熱感、流涙、羞明、刺すような痛み（ｓｔｉｎｇｉｎｇ）、又は間欠的な鋭い痛みを呈する。ドライアイ疾患は、本明細書に記載されているような眼の検査、涙液産生を評価するためのシルマー試験又は涙液機能指数分析（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ）、角膜上皮欠損を同定するためのフルオレセイン染色、ローズベンガル染色、リサミングリーン染色、涙液破壊時間、実用視力検査（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖｉｓｕａｌ ａｃｕｉｔｙ ｔｅｓｔ）、及び涙液メニスカス評価のうちの１つ又は複数を用いて診断することができる（非特許文献１４）。

【0147】

いくつかの実施形態では、本開示は、単純ヘルペスウイルス感染症をもつ対象の眼表面を維持及び／又は修復する方法を提供する。三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症は、単純ヘルペス角膜炎としても知られ、充血、眼脂、涙目、炎症、刺激、疼痛、羞明、及び／又は点状病変を形成する粗い粒状斑点（ｃｏａｒｓｅ ｇｒａｎｕｌａｒ
ｓｐｏｔｓ）を含む症状を呈する。診断は、本明細書に記載の眼科検査、細隙灯検査、リサミングリーン染色、ローズベンガル染色、ＰＣＲ、免疫蛍光抗体アッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイのうちの１つ又は複数を用いて行われる（非特許文献１５）。

【0148】

いくつかの実施形態では、本開示は、水痘帯状疱疹ウイルス感染症をもつ対象の眼表面を維持及び／又は修復する方法を提供する。三叉神経の水痘帯状疱疹ウイルス感染症（眼部帯状疱疹とも）は、様々な程度の視力低下、疼痛、及び光過敏を伴う角膜合併症を呈する。診断には、細隙灯検査、ローズベンガル染色、及びフルオレセイン染色を用いた、点状上皮角膜炎、樹状突起斑の増加（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）、粒状浸潤、又は他の異常の同定が含まれる（非特許文献１６）。

【0149】

いくつかの実施形態では、本開示は、角膜神経の糖尿病合併症をもつ対象の眼表面を維持及び／又は修復する方法を提供する。角膜神経の糖尿病合併症は、角膜厚の増加、上皮欠損、上皮脆弱性及び再発性びらん、潰瘍、浮腫、表在性点状角膜炎、創傷修復の遅延及び不全、内皮変化、低涙液分泌、ドライアイ症候群、なあ日に角膜知覚の低下などの角膜変化を呈する（非特許文献１７）。

【0150】

本明細書において、「対象」という用語は、類人猿及びヒトを含む、ヒト及びヒト以外の霊長類；哺乳類のスポーツ動物（ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌｓ）（例えば、ウマ）；哺乳類の農場動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳類のペット（イヌ、ネコなど）；並びにげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含むが、これらに限定されない哺乳動物を意味する。

【0151】

対象は、例えば、本明細書に記載の症状又は眼の障害のいずれかを有しうる。

【0152】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法により、結果として、眼疾患の１つ又は複数の症状は、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される。本明細書において使用される場合、「症状」には、本明細書に記載のものを含め、所与の眼疾患に関連する診断基準又は症状の任意のものが含まれる。いくつかの実施形態では、症状は、本開示の組成物及びｒＡＡＶの投与後に軽減されうる。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される。いくつかの実施形態では、眼疾患の１つ又は複数の症状は、対側眼における眼疾患の症状と比較して軽減される。「対側眼」とは、本開示による組成物で治療された眼とは反対側にある対象の眼を意味する。対象が、両側性疾患に罹患している限り、又はモデル
動物の場合には両眼の治療に至る実験プロトコールに供されている限り、対側眼は治療の対照として使用することができる。

【0153】

いくつかの実施形態では、ヒトＮＧＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＮＧＦの発現と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％増加する。いくつかの実施形態では、ヒトＮＧＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＮＧＦの発現と比較して１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍増加しうる。

【0154】

いくつかの実施形態では、ヒトＮＧＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＮＧＦの発現と比較して約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、又は１年間増加する。

【0155】

本明細書において使用される場合、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」又は「約（ａｂｏｕｔ）」は、１つ又は複数の対象となる値（ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に適用されるとき、記載の参照値に類似した値を意味する。ある特定の実施形態では、「約」は、特に記載がない限り、又は文脈から明らかな場合を除き、記載の参照値のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はより小さい範囲内に収まる値の範囲を意味する（そのような数が可能な値の１００％を超えることになる場合を除く）。

【0156】

いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載のヒトＮＧＦをコードするヌクレオチドを含むｒＡＡＶを投与され、その対象においてヒトＮＧＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＮＧＦの発現と比較して増加する。

【0157】

いくつかの実施形態では、本開示は、眼の疾患又は障害をもつ対象を治療する方法であって、その対象に、ヒトＮＧＦタンパク質をコードするヌクレオチドを含むｒＡＡＶを投与することを含み、その対象においてヒトＮＧＦの発現が、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＮＧＦの発現と比較して増加する方法を提供する。

【0158】

いくつかの実施形態では、ヒトＧＤＮＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＧＤＮＦの発現と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％増加する。いくつかの実施形態では、ヒトＧＤＮＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＧＤＮＦの発現と比較して１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍増加しうる。

【0159】

いくつかの実施形態では、ヒトＧＤＮＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＧＤＮＦの発現と比較して約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、又は１年間増加する。

【0160】

いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載のヒトＧＤＮＦをコードするヌクレオチドを含むｒＡＡＶを投与され、その対象においてヒトＧＤＮＦの発現は、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＧＤＮＦの発現と比較して増加する。

【0161】

いくつかの実施形態では、本開示は、眼の疾患又は障害をもつ対象を治療する方法であ
って、その対象にヒトＧＤＮＦタンパク質をコードするヌクレオチドを含むｒＡＡＶを投与することを含み、その対象においてヒトＧＤＮＦの発現が、未治療対象、又は治療対象の対側眼におけるヒトＧＤＮＦの発現と比較して増加する方法を提供する。

【0162】

いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用するためのｒＡＡＶビリオンであって、その方法は、対象の少なくとも１つの眼又は対象の眼の少なくとも１つの涙腺に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、使用のためのｒＡＡＶビリオンは、対象の涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、使用のためのｒＡＡＶビリオンは、ＮＧＦタンパク質をコードする発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、使用のためのｒＡＡＶビリオンは、ＧＤＮＦタンパク質をコードする発現カセットを含む。

【0163】

いくつかの実施形態では、本開示は、眼の疾患、障害、又は病態をもつ対象の治療に使用するための、又は使用するのに適合可能なｒＡＡＶビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、使用するための、又は使用するのに適合可能なｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用するためのｒＡＡＶビリオンであって、その方法が、本明細書に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを、対象の少なくとも１つの眼又は対象の目・眼の少なくとも１つの涙腺に投与することを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用するためのｒＡＡＶビリオンであって、その方法が、配列番号２５の核酸配列を含む発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを、対象の少なくとも１つの眼又は対象の目・眼の少なくとも１つの涙腺に投与することを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用するためのｒＡＡＶビリオンであって、その方法が、配列番号２４の核酸配列を含む発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを、対象の少なくとも１つの眼又は対象の目・眼の少なくとも１つの涙腺に投与することを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用するためのｒＡＡＶビリオンであって、その方法が、配列番号２３の核酸配列を含む発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを、対象の少なくとも１つの眼又は対象の目・眼の少なくとも１つの涙腺に投与することを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。

【0165】

投与のモード
いくつかの態様では、本開示は、対象の眼又は対象の眼の涙腺に、ｒＡＡＶビリオンを投与することを含む方法であって、ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む方法を提供する。

【0166】

上述のように、涙液機能単位は、主涙腺及び副涙腺、眼表面、並びに相互に接続している神経支配から構成される。各眼では、主涙腺は、前頭骨の涙腺窩内の眼窩において上側頭部に位置する。付属腺は、ウォルフリング腺及びクラウス腺として知られ、眼瞼に位置する。上眼瞼には、約２～５つのウォルフリング腺及び約４０個のクラウス腺がある。下眼瞼には、約６～８つのクラウス腺がある。涙液機能単位の具体的な位置及び解剖学的構造はよく知られている（非特許文献１８）。まとめると、涙腺は、涙管を通して眼表面に
涙液層を分泌する。涙腺はまた、トランスフォーミング増殖因子－βやレチノールなど、トランスフォーミング増殖因子－βやレチノールなど、角膜再生及び透明性促進に必要なタンパク質及び産物を発現し、涙液層に分泌する（非特許文献１８；非特許文献１９）。

【0167】

ウイルスベクターの涙腺への投与は、眼表面への局所投与、涙腺への直接注射、及び／又は涙腺への局所投与によって達成することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは局所投与によって涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは直接注射によって涙腺に投与される。涙腺は、手術又は眼瞼のマニピュレーション（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）によってアクセスされる場合がある。眼瞼をマニピュレーションすることにより（例えば、ウイルスベクターを含む医薬組成物で組織を洗浄することによって）、投与のための組織へのアクセスが局所的に得られる。涙腺への直接注射は、涙腺の上の皮膚を貫通することによって（図２Ａ）、又は眼瞼をマニピュレーションして涙腺にアクセスすることによって（図２Ｂ）行うことができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、図２Ａに示されるように、直接注射によって涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、図２Ｂに示されるように、眼瞼をマニピュレーションすることによって涙腺に投与される。

【0168】

いくつかの実施形態では、眼及び／又は涙腺内の細胞は、ｒＡＡＶビリオンで形質導入される。眼及び／又は涙腺内の細胞は、限定されないが、腺房細胞、導管細胞、及び／又は筋上皮細胞である。いくつかの実施形態では、腺房細胞、導管細胞、及び筋上皮細胞は、ｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、腺房細胞はｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、導管細胞はｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、筋上皮細胞はｒＡＡＶビリオンで形質導入される。いくつかの実施形態では、眼及び／又は涙腺内の形質導入細胞は、治療有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する。いくつかの実施形態では、眼及び／又は涙腺内の形質導入細胞は、有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する。本明細書において使用される場合、「有効量」は、本明細書に記載の眼疾患の症状及び／又は徴候を軽減するのに十分な、本明細書に記載のｒＡＡＶ、治療、又は組成物の量又は投与量を意味する。本明細書において使用される「量」という用語は、絶対量（例えば、タンパク質若しくはｒＡＡＶ粒子の絶対量）又は濃度（例えば、溶液中のタンパク質の濃度）を意味し、所与の例で言及される量が絶対量、濃度、又はその両方を意味するかどうかは、本明細書に示された文脈に基づいて当業者には明らかであろう。

【0169】

導入遺伝子を涙液層に発現させるためのｒＡＡＶビリオンの眼及び／又は涙腺への送達は、生体内で実証されている。１つの例では、マウスの主涙腺は、血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５ｗ８、ＡＡＶ ｘ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１２、及びウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）をもつ、ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするｒＡＡＶビリオンによる直接注射を受けた。ＡＡＶ９、ＡＡＶ５ｗ８、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ２はそれぞれ、涙腺の涙管細胞及び腺房細胞を形質導入することができる（非特許文献６）。

【0170】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは対象の涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、涙腺は主涙腺である。いくつかの実施形態では、涙腺は、対象のウォルフリング腺又はクラウス腺のいずれか１つである。

【0171】

本開示の組成物及びｒＡＡＶビリオンは、任意の好適な方法によって対象の涙腺に投与することができる。例えば、対象となる組成物は、直接注射によって主涙腺又は副涙腺に投与することができる。

【0172】

ヒト対象における涙腺へのアクセスは、例えば、上眼瞼を手動で持ち上げて（ｅｌｅｖ
ａｔｉｎｇ）涙腺の眼瞼葉（ｐａｌｐｅｂｒａｌ ｌｏｂｅ）を露出させ、例えば３０Ｇ針を付けた注射器を使用して治療薬を送達することによって達成することができる。

【0173】

本開示のウイルスベクターは一般に、医薬組成物として対象に送達される。医薬組成物は、薬学的に許容可能な溶媒（例えば水など）及び１つ又は複数の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ほぼ中性のｐＨ（ｐＨ５、６、７、８、又は９）のバッファーを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、ｐＨが約７のＰＢＳ）を含む。医薬組成物は、薬学的に許容される塩を含むことができる。塩の濃度は、医薬組成物が標的組織に対して等張又はほぼ等張になるように選択することができる。

【0174】

様々な実施形態では、本開示の医薬組成物は、約１×１０^８ゲノムコピー／ミリリットル（ＧＣ／ｍＬ）、約５×１０^８ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^９ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^１０ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１０ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１３ＧＣ／ｍＬ、又は約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬのウイルスベクター（例えばｒＡＡＶビリオン）を含む。様々な実施形態では、本開示の医薬組成物は、約１×１０^８ゲノムコピー／ミリリットル（ＧＣ／ｍＬ）、約５×１０^８ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^９ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１０ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^１０ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１０ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１０ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１１ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１１ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ、約１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１３ＧＣ／ｍＬ、又は約５×１０^１３ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬのウイルスベクター（例えばｒＡＡＶビリオン）を含む。様々なさらなる実施形態では、本開示の医薬組成物は、約５×１０^８ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^９ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１０ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１０ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１１ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１１ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ、又は約５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬのウイルスベクター（例えばｒＡＡＶビリオン）を含む。一層（ｙｅｔ）さらなる実施形態では、本開示の医薬組成物は、約５×１０^８ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１０ＧＣ／ｍＬ、約５×１０^１０ＧＣ／ｍＬ～約５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ、又は約５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬのウイルスベクター（例えばｒＡＡＶビリオン）を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、約１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ～約６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬのウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、約１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ又は約６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬのウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、総量が約１０μＬ、約２０μＬ、約３０μＬ、約４０μＬ、約５０μＬ、約６０μＬ、約７０μＬ、約８０μＬ、約９０μＬ、約１００μＬ、１１０μＬ、約１２０μＬ、約１３０μＬ、約１４０μＬ、約１５０μＬ、約１６０μＬ、約１７０μＬ、約１８０μＬ、約１９０μＬ、又は約２００μＬで投与される。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、総量が約１０μＬ～約２０μＬ、約２０μＬ～約３０μＬ、約３０μＬ～約４０μＬ、約４０μＬ～約５０μＬ、約５０μＬ～約６０μＬ、約６０μＬ～約７０μＬ、約７０μＬ～約８０μＬ、約８０μＬ～約９０μＬ、約９０μＬ～約１００μＬ、約１００μＬ～１１０μＬ、１１０μＬ～約１２０μＬ、約１２０μＬ～約１３０μＬ、約１３０μＬ～約１４０μＬ、約１４０μＬ～約１５０μＬ、約１５０μＬ～約１６０μＬ、約１６０μＬ～約１７０μＬ、約１７０μＬ～約１８０μＬ、約１８０μＬ～約１９０μＬ、又は約１９０μＬ～約２００μＬで
投与される。

【0177】

ミリリットルあたりのゲノムコピーは、ウイルスのポリヌクレオチドゲノムの濃度が既知の参照試料を用いて作成した標準曲線を使用して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｎｇｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ｑＰＣＲ）によって求めることができる。ＡＡＶの場合、使用される参照試料は、ｒＡＡＶビリオンの作製に使用されたトランスファープラスミドであることが多いが、他の参照試料も使用することができる。

【0178】

代替えとして、又は追加として、ウイルスベクターの濃度は、細胞株でベクターの力価を測定することによって決定することができる。ウイルス力価は、典型的に、単位体積あたりのウイルス粒子（ｖｐ）で表される（ｖｐ／ｍＬなど）。様々な実施形態では、本開示の医薬組成物は、約１×１０^８ウイルス粒子／ミリリットル（ｖｐ／ｍＬ）、約５×１０^８ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^９ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^９ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^１０ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^１０ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^１２ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^１２ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^１３ｖｐ／ｍＬ、又は約１×１０^１４ｖｐ／ｍＬのウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を含む。様々なさらなる実施形態では、本開示の医薬組成物は、約１×１０^８ウイルス粒子／ミリリットル（ｖｐ／ｍＬ）～約５×１０^８ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^８ｖｐ／ｍＬ～約１×１０^９ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^９ｖｐ／ｍＬ～約５×１０^９ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^９ｖｐ／ｍＬ～約１×１０^１０ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^１０ｖｐ／ｍＬ～約５×１０^１０ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^１０ｖｐ／ｍＬ～約１×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^１１ｖｐ／ｍＬ～約５×１０^１１ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^１１ｖｐ／ｍＬ～約１×１０^１２ｖｐ／ｍＬ、約１×１０^１２ｖｐ／ｍＬ～約５×１０^１２ｖｐ／ｍＬ、約５×１０^１２ｖｐ／ｍＬ～約５×１０^１３ｖｐ／ｍＬ、又は約５×１０^１３ｖｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｖｐ／ｍＬのウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）を含む。

【0179】

本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療前、治療中、及び治療後の対象の眼疾患を評価するために、様々な検査が利用可能である。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象に対する有効な治療は１つ又は複数の検査によって示され、例えば、ａ）ビジュアルアナログスケールでのアイドライネススコア（Ｅｙｅ Ｄｒｙｎｅｓｓ ｓｃｏｒｅ）検査、ｂ）シルマー試験、ｃ）角膜フルオレセイン染色検査、及びｄ）眼表面疾患指数（Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｅｘ ）検査であることができる。眼疾患の徴候及び症状を評価するための検査は、対象の検査スコアを得るために、標準化された条件又は再現可能な条件下で施行することができる。条件には、対象に悪い影響を与える（ａｄｖｅｒｓｅｌｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）ように人為的に作られた環境、又は環境（温度、湿度、気流）がモニターされ、注意深く制御されている環境に対象を曝露することが含まれる。

【0180】

次の項では、ビジュアルアナログスケールでのアイドライネススコア検査、シルマー試験、角膜染色検査、及び眼表面疾患指数検査についてさらなる詳細を示す。

【0181】

アイドライネススコア検査
ビジュアルアナログスケールでのアイドライネススコア検査を使用して、対象の眼疾患、流涙レベル、又は眼の不快感を評価することができる。この検査は、ビジュアルアナログスケールを使用するものであり、１００ｍｍの水平線を含み、一方の終点０が「不快感なし」、もう一方の終点１００が「最大不快感」と表示される。図３はビジュアルアナログスケールの一例を示している（実際の縮尺では示されていない）。対象は、不快感の程度を示す横線の上に縦に印を付けることによって、眼の乾燥による眼の症状を評価するよう求められる。次いで、対象の反応が１００ｍｍスケールのどこにあるかを特定すること
によってアイドライネススコアが算出される。

【0182】

ｍｍ単位で測定されるアイドライネススコアを使用して、眼の症状の重症度及び対象に対する特定の治療の有効性を評価することができる。この検査は、５分ごとという頻度で対象に施行でき、検査管理者（ｔｅｓｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ）が対象の症状の経時的変化を注意深く観察できるという利点がある。不快感の程度が相対的低いことを示す低い数値と比較して、高い数値は眼の症状に対する不快感が大きいことを示す。アイドライネススコアの減少は、治療が、眼疾患の治療、涙液産生の増加、又は眼の不快感の改善に有効である証拠となる。経時的なアイドライネススコアの減少は、眼の症状の軽減又は緩和の証拠であり、一般に対象の病態の改善を示す。

【0183】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、有効な治療は、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少によって示され、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、ｒＡＡＶビリオンの初回投与、又は任意選択で１回若しくは複数回の後続の投与、及び涙液産生を増加させる治療の初回投与、又は任意選択で１回若しくは複数回の後続の投与を対象に施した後に決定され、対象のアイドライネススコアは、ａ）ｒＡＡＶビリオンの初回投与、及び涙液産生を増加させる治療の初回投与を施す前の対象のアイドライネススコア；ｂ）対照を投与された対象のアイドライネススコア；ｃ）対照薬化合物を投与された対象のアイドライネススコア；又はｄ）対側眼のアイドライネススコアと比較される。

【0184】

本明細書において使用される場合、「統計的に有意」という用語は、２つ以上の群間で観察された差を評価するために、研究デザイン及び生成されたデータ型（ｄａｔａ ｔｙｐｅ）に基づいて当業者によって選択される解析の方法を意味し、解析は、差がランダムでないか、又は厳密に偶然に起因するかを決定する。

【0185】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアは、ｒＡＡＶビリオンの初回投与、及び涙液産生を増加させる治療の初回投与を行う前の対象のアイドライネススコアと比較される。

【0186】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアは、対照を投与された対象のアイドライネススコアと比較される。

【0187】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアは、対照薬化合物を投与された対象のアイドライネススコアと比較される。

【0188】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアは、対側眼のアイドライネススコアと比較される。

【0189】

いくつかの実施形態では、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められる。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。いくつかの実施形態では、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められ、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。

【0190】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、少なくとも３ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、少なくとも３０ｍｍ、少なくとも３５ｍｍ、少なくとも４０ｍｍ、少なくとも４５ｍｍ、又は少なくとも５０ｍｍである。いくつかの実施形態では、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められ、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、少なくとも３ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、少なくとも３０ｍｍ、少なくとも３５ｍｍ、少なくとも４０ｍｍ、少なくとも４５ｍｍ、又は少なくとも５０ｍｍである。

【0191】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、３ｍｍ～１０ｍｍ、３ｍｍ～２０ｍｍ、３ｍｍ～２５ｍｍ、３ｍｍ～３０ｍｍ、３ｍｍ～３５ｍｍ、３ｍｍ～４０ｍｍ、３ｍｍ～４５ｍｍ、３ｍｍ～５０ｍｍ、５ｍｍ～１０ｍｍ、５ｍｍ～２０ｍｍ、５ｍｍ～２５ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、５ｍｍ～３５ｍｍ、５ｍｍ～４０ｍｍ、５ｍｍ～４５ｍｍ、５ｍｍ～５０ｍｍ、１０ｍｍ～１５ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍ、１０ｍｍ～２５ｍｍ、１０ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～３５ｍｍ、１０ｍｍ～４０ｍｍ、１０ｍｍ～４５ｍｍ、１０ｍｍ～５０ｍｍ、１５ｍｍ～２０ｍｍ、２０ｍｍ～３０ｍｍ、２５ｍｍ～３５ｍｍ、３０ｍｍ～４０ｍｍ、３０ｍｍ～４５ｍｍ、又は３０ｍｍ～５０ｍｍである。

【0192】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、０．０５以下、０．０１以下、０．００５以下、又は０．００１以下のｐ値を特徴とする。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、０．０５以下のｐ値を特徴とする。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、０．０１以下のｐ値を特徴とする。

【0193】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、開示の方法又は組成物のいずれかによる治療の後、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、３か月以内、４か月以内、５か月以内又は６か月以内である。

【0194】

いくつかの実施形態では、対象のアイドライネススコアの減少は、本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療の後、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月、又は１年間持続する。

【0195】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のアイドライネススコアの統計的に有意な減少は、ｒＡＡＶビリオンの初回投与を施した後に決定された対象のアイドライネススコアに基づく。

【0196】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、統計的に有意な減少は、本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療の後に決定された対象のアイドライネススコアに基づく。

【0197】

シルマースコア試験
眼疾患は、涙液量及び涙液産生に影響を及ぼしうる。シルマー試験を用いて、涙液産生を評価し、対象におけるドライアイ疾患の重症度、涙液不足、又は眼の不快感を評価することができる。この試験では、各眼で産生される涙の量を測定する。この試験は典型的に
は、まず対象の１つ又は両方の眼に麻酔薬を入れることを含む。これらの点眼剤は、試験ストリップに反応して眼が潤む（ｗａｔｅｒｉｎｇ）のを防ぐ。次いで、１つ又は両方の下眼瞼の内側に濾紙を入れ、その人（ｔｈｅ ｐｅｒｓｏｎ）は目を閉じる。５分後、試験管理者は濾紙を取り除き、涙が濾紙上をどの程度移動したかを評価する。シルマー試験は１つ又は両方の眼に対して施行することができる。

【0198】

一般的に、紙の水分の量が少ないほど、その人が出した涙の量は少ない。健康な眼では、典型的には、各紙ストリップに１０ミリメートル超の水分が含まれる。シルマースコアが１０ミリメートル未満の水分は、本明細書に記載の眼疾患、異常に低い流涙、又は眼の不快感を含む１つ又は複数の状態を示唆しうる。

【0199】

シルマー試験を使用して、対象における特定の治療の有効性を評価することができ、対象の症状の重症度の変化を一定期間にわたってモニターするために複数回施行される場合がある。本明細書に記載の眼疾患、不十分な流涙、又は眼の不快感治療を受けている対象におけるシルマースコアの経時的な増加は、涙液量又は涙液産生の増加の証拠であり、一般に対象の病態の改善を示す。シルマースコアの経時的な増加は、治療が本明細書に記載の眼疾患の治療、涙液産生の増加、又は眼の不快感の改善に有効であることの証拠である。

【0200】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、有効な治療は対象のシルマースコアの統計的に有意な増加によって示され、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療後に判定され、対象のシルマースコアは、ａ）ｒＡＡＶビリオンの初回投与、及び涙液産生を増加させる治療の初回投与を施す前の対象のシルマースコア；ｂ）対照を投与された対象のシルマースコア；ｃ）対照薬化合物を投与された対象のシルマースコア；又はｄ）対側眼と比較される。

【0201】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアは、本明細書に記載の医薬組成物の投与前の対象のシルマースコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアは、対照を投与された対象のシルマースコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアは、対照薬化合物を投与された対象のシルマースコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアは、対側眼と比較される。

【0202】

いくつかの実施形態では、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められる。

【0203】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの増加は、少なくとも１００％、２００％、又は３００％である。いくつかの実施形態では、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められ、その対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。

【0204】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、少なくとも３ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、少なくとも３０ｍｍ、少なくとも３５ｍｍ
、少なくとも４０ｍｍ、少なくとも４５ｍｍ、又は少なくとも５０ｍｍである。

【0205】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、３ｍｍ～５ｍｍ、３ｍｍ～１０ｍｍ、３ｍｍ～１５ｍｍ、３ｍｍ～２０ｍｍ、３ｍｍ～２５ｍｍ、３ｍｍ～３０ｍｍ、５ｍｍ～１０ｍｍ、５ｍｍ～１５ｍｍ、５ｍｍ～２０ｍｍ、５ｍｍ～２５ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～１５ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍ、１０ｍｍ～２５ｍｍ、１０ｍｍ～３０ｍｍ、１５ｍｍ～２０ｍｍ、１５ｍｍ～２５ｍｍ、１５ｍｍ～３０ｍｍ、２０ｍｍ～２５ｍｍ、又は２０ｍｍ～３０ｍｍである。

【0206】

いくつかの実施形態では、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められ、その対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、少なくとも３ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、少なくとも３０ｍｍ、少なくとも３５ｍｍ、少なくとも４０ｍｍ、少なくとも４５ｍｍ、又は少なくとも５０ｍｍである。

【0207】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、０．０５以下、０．０１以下、０．００５以下、又は０．００１以下のｐ値を特徴とする。

【0208】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、本明細書に開示の方法又は組成物による治療の後、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、３か月以内、４か月以内、５か月以内又は６か月以内である。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、本明細書に開示の方法又は組成物による治療の後、短い時間で（ａｃｕｔｅｌｙ）測定した場合、１分以内、２分以内、５分以内であり、又は長期にわたって（ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ）測定した場合、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、３か月以内、４か月以内、５か月以内又は６か月以内である。

【0209】

いくつかの実施形態では、対象のシルマースコアの増加は、本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療の後、１分間、２分間、３分間又は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月、又は１年間持続する。

【0210】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のシルマースコアの統計的に有意な増加は、本明細書に開示の方法又は組成物による治療後に決定された対象のシルマースコアに基づく。

【0211】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、統計的に有意な増加は、本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療の後に決定された対象のシルマースコアに基づく。

【0212】

角膜染色検査
角膜表面の変化は、不十分な涙液流及び過度の乾燥、並びに本明細書に記載の眼疾患及び眼の不快感と関連する。角膜表面の変化には、表面上皮細胞を保護するムチンコーティングの破壊、及び／又は上皮細胞壁の損傷が含まれうる。

【0213】

フルオレセイン染色、リサミングリーン染色、及びローズベンガル染色を含む角膜染色検査は、角膜表面の健康状態を判定するための診断検査であり、角膜表面の損傷領域を示
すことができる。正常な角膜表面は涙液層に注入（ｉｎｓｔｉｌｌｅｄ）された水溶性色素を取り込まない。しかし、損傷した上皮細胞は、水溶性色素を表面細胞に拡散させてしまう。損傷した上皮細胞を染色する色素は、角膜表面で可視化され、角膜表面の損傷を示すことができる。

【0214】

角膜染色検査を行うには、染色色素は１つ又は両方の眼に適用される。色素は浸透し、表面細胞間の領域を染色する。この検査を用いて、壊死（Ｄｅｖｉｔａｌｉｚｅｄ）細胞及び壊死表面組織の繊維（フィラメント）を可視化することができる。次いで、検査管理者は、観察された損傷の重症度を評価するために開発された角膜表面採点システムを用いる。この採点システムは、時間をかけた眼疾患の治療に有用である。図４は、採点システムで使用されるＮＥＩ／Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｓｃａｌｅを示す。他の同等の標準化採点システムを用いることもできる。検査管理者は角膜表面の損傷部位を評価採点し、角膜表面の損傷の重症度を反映した角膜スコアを算出する。

【0215】

検査管理者は、角膜スコアを用いて対象における特定の治療の有効性を評価することができる。この検査を複数回実施して、一定期間にわたる対象の眼表面の重症度の変化をモニターすることができる。一般に、角膜表面の損傷が低いレベルであることを示す低い数値と比較して、高い数値は角膜表面の損傷が大きいことを示す。経時的な角膜スコアの減少は、角膜表面の損傷が減少した証拠である。角膜スコアの減少は、一般的に対象の病態の改善を示す。経時的な角膜スコアの減少はまた、ドライアイ疾患の治療、涙液産生の増加、又は眼の不快感の改善に治療が有効であることの証拠でもある。

【0216】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、有効な治療は対象の角膜スコアの統計的に有意な減少によって示され、対象の角膜スコアの統計的に有意な減少は、本明細書に記載の組成物の初回投与、又は任意選択で１つ又は複数の後続の投与を対象に施した後に判定され、対象の角膜スコアは、ａ）ｒＡＡＶビリオンの初回投与、及び涙液産生を増加させる治療の初回投与を施す前の対象の角膜スコア；ｂ）対照を投与された対象の角膜スコア；ｃ）対照薬化合物を投与された対象の角膜スコア；又はｄ）対側眼と比較される。

【0217】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象の角膜スコアは、本明細書に記載の方法に従った医薬組成物の投与の前の対象の角膜スコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象の角膜スコアは、対照を投与された対象の角膜スコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象の角膜スコアは、対照薬化合物を投与された対象の角膜スコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象の角膜スコアは、対側眼と比較される。

【0218】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象の角膜スコアを使用して、０．５ｍｍ未満のフルオレセイン染色又はフルオレセイン染色なし（ゼロ）として定義される角膜治癒の定義（ａ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｈｅａｌｉｎｇ）を測定することができる（非特許文献２０）。

【0219】

いくつかの実施形態では、対象の角膜治癒スコアの統計的に有意な減少は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められる。

【0220】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象の角膜治癒スコアの統計的に有意な減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。

【0221】

いくつかの実施形態では、対象の角膜治癒スコアの統計的に有意な減少は、対照と比較
して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められ、対象の角膜治癒スコアの統計的に有意な減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。

【0222】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象の角膜スコアの統計的に有意な減少は、０．０５以下、０．０１以下、０．００５以下、又は０．００１以下のｐ値を特徴とする。

【0223】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象の角膜スコアの統計的に有意な減少は、本明細書に開示の方法又は組成物による治療の後、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、３か月以内、４か月以内、５か月以内又は６か月以内である。

【0224】

いくつかの実施形態では、対象の角膜スコアの減少は、本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療の後、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月、又は１年間持続する。

【0225】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、統計的に有意な減少は、ｒＡＡＶビリオンの１回又は複数回の後続の投与、及び任意選択で、涙液産生を増加させる治療の初回又は１回若しくは複数回の後続の投与を施した後に決定された対象の角膜スコアに基づく。

【0226】

眼表面疾患指数検査
眼疾患及び関連する症状の治療を受けた対象は、質問票を通して、状態の診断及び症状の重症度の判定に使用される重要な情報を提供することができる。適切にデザインされた質問票は、再現性を検証することができ、反応の良い回答（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ａｎｓｗｅｒｓ）を引き出す適切な質問で構成されるべきである。質問票の一例として、眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ）があり、眼疾患をもつ対象に対する１２問の質問調査であり、症状の頻度を直接評価するための信頼できる有効な手段であることが示されている。評価対象となる眼症状には、灼熱感／刺痛、かゆみ、異物感、眼の不快感、眼の乾燥、羞明、及び疼痛が含まれるが、これらに限定されない。ほとんどの人は質問票に慣れており、医療提供者（ｈｅａｌｔｈ ｐｒｏｖｉｄｅｒ）が情報を収集するための効率的な方法であることを理解している。また、不注意にも（ｉｎａｄｖｅｒｔｅｎｔｌｙ）回答者に影響を与えるような口頭の又は視覚的な手がかりがないので、質問票はバイアスを減らす。検査管理者は、対象から回答を集め、質問に対する対象の回答に基づいてＯＳＤＩを算出する。

【0227】

ＯＳＤＩスコアを用いて、眼症状の重症度及び対象の特定の治療の有効性を評価することができる。数値が高いほど、眼疾患の重症度が高いことを示す。経時的なＯＳＤＩスコアの減少は、眼症状の軽減又は緩和の証拠であり、一般的に対象の病態の改善を示す。ＯＳＤＩスコアの減少はまた、治療が、眼疾患の治療及び症状の軽減に有効であることの証拠でもある。

【0228】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、有効な治療は対象のＯＳＤＩスコアの統計的に有意な減少によって示され、対象の角膜スコアの統計的に有意な減少は、ｒＡＡＶビリオンの初回投与、又は任意選択で１つ又は複数の後続の投与、及び涙液産生を増加させる治療の初回投与、又は任意選択で１つ又は複数の後続の投与を対象に施した後に判定され、対象のＯＳＤＩスコアは、ａ）ｒＡＡＶビリオンの初回投与、及び涙液産生を増加させる治療の初回投与を施す前の対象のＯＳＤＩスコア；ｂ）対照を投与された対象のＯＳ
ＤＩスコア；ｃ）対照薬化合物を投与された対象のＯＳＤＩスコア；又はｄ）対側眼と比較される。

【0229】

本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアは、本明細書に記載の開示方法に従った治療の前の対象のＯＳＤＩスコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアは、対照を投与された対象のＯＳＤＩスコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアは、対照薬化合物を投与された対象のＯＳＤＩスコアと比較される。本明細書に開示の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアは、対側眼のＯＳＤＩスコアと比較される。

【0230】

いくつかの実施形態では、対象のＯＳＤＩスコアの統計的に有意な減少は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められる。

【0231】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアの統計的に有意な減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。いくつかの実施形態では、対象のＯＳＤＩスコアの統計的に有意な減少は、対照と比較して本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを投与された対象において認められ、対象のＯＳＤＩスコアのその統計的に有意な減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又は３５０％である。

【0232】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアの統計的に有意な減少は、０．０５以下、０．０１以下、０．００５以下、又は０．００１以下のｐ値を特徴とする。

【0233】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアの統計的に有意な減少は、本明細書に開示の方法又は組成物による治療の後、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、３か月以内、４か月以内、５か月以内又は６か月以内である。

【0234】

いくつかの実施形態では、対象のＯＳＤＩスコアの減少は、本明細書に開示の方法又は組成物のいずれかによる治療の後、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月、又は１年間持続する。

【0235】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のＯＳＤＩスコアの統計的に有意な減少は、ｒＡＡＶビリオンの初回投与を施した後に決定された対象のＯＳＤＩスコアに基づく。

【0236】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、統計的に有意な減少は、本明細書に開示の方法又は組成物による治療の後に決定された対象のＯＳＤＩスコアに基づく。

【0237】

長期にわたる有効な治療の維持
本開示は、対象のスコアの統計的に有意な改善が維持される期間にわたる有効な治療を提供することができる。本開示において使用され、対象のスコア（ＥＤＳ、シルマー、角膜染色検査、又はＯＳＤＩ）の統計的に有意な改善の維持に関連する「維持された」という用語は、統計的に有意な改善が時間の経過とともに一定の閾値未満に減少しないことを意味する。統計的に有意な改善は、後の時点で対象のスコアが変化したとしても維持することできる。開示の方法による治療後の改善は、追加投与なしで維持することができる、
又は１回若しくは複数回の後続の投与後に維持することができる。

【0238】

例えば、角膜染色検査スコアが０．５ｍｍ又は０ｍｍであれば、角膜治癒と定義でき、治療の開始の３０日後又は６０日後の有意な改善を表す（非特許文献２０）。

【0239】

例えば、アイドライネススコアが「１０％以内に維持されている」とは、対象のアイドライネススコアの減少が特定の時間の間に１０％を超えて減少しないことを意味する。対象のアイドライネススコアのさらなる改善も、統計的に有意な改善の維持とみなされることになる（例えば、アイドライネススコアが特定の時間の間にさらに１５％改善した場合、これは「１０％以内に維持されている」とみなされることになる）。

【0240】

別の例では、本明細書に記載の方法による治療の３０日後に対象のアイドライネススコアに統計的に有意な減少（改善）があり、後の時点で対象のスコアが同じ又はより小さい（対象にとって有益であることを示す）、統計的に有意な改善は維持されているという。あるいは、後の時点で、対象のアイドライネススコアが、本明細書に記載の方法による治療の３０日後のアイドライネススコアよりも大きい場合、対象は依然として治療効果を得ている可能性があり、後に決定されたスコアは、初回投与の施行前又は治療前のベースラインスコアと比較して依然として統計的に有意な改善である可能性がある。

【0241】

別の例では、本明細書に記載の方法による治療の６０日後に対象のアイドライネススコアに統計的に有意な減少（改善）があり、後の時点で対象のスコアが同じ又はより小さい（対象にとって有益であることを示す）、統計的に有意な改善は維持されているという。あるいは、後の時点で、対象のアイドライネススコアが、本明細書に記載の方法による治療の６０日後のアイドライネススコアよりも大きい場合、対象は依然として治療効果を得ている可能性があり、後に決定されたスコアは、本明細書に記載の方法による治療の前と比較して、依然として統計的に有意な改善である可能性がある。

【0242】

何をもって改善とするかは、測定されるスコアによって異なることに注意されたい。例えば、アイドライネススコア、角膜スコア、及びＯＳＤＩスコアの改善は、スコアの数値の減少である。シルマー試験では、改善は典型的に、シルマースコアの数値の増加である。

【0243】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のスコア（例えば、ＥＤＳ、シルマー、角膜染色検査、又はＯＳＤＩ）の統計的に有意な改善の維持とは、統計的に有意な改善が、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％を超えて減少しないことを意味する。

【0244】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のスコアの統計的に有意な改善（例えば、ＥＤＳ、シルマー、角膜、又はＯＳＤＩ）は、少なくとも１週間、少なくとも１か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、又は少なくとも１２か月維持される。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のスコアの統計的に有意な改善は、本明細書に記載の方法に従った治療後少なくとも３０日間維持され、その統計的に有意な改善は３０％を超えて減少しない。いくつかの実施形態では、対象のスコアの統計的に有意な改善は、ｒＡＡＶビリオンの初回投与、及び任意選択で、涙液産生を増加させる治療の初回投与の施行から少なくとも１か月間維持され、その統計的に有意な改善は３０％を超えて減少しない。

【0245】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のスコアの統計的に有意な改善（例えば、ＥＤＳ、シルマー、角膜、又はＯＳＤＩ）は、本明細書に記載の方法に従った治療後少なくとも１週間、少なくとも１か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくと
も９か月、又は少なくとも１２か月維持され、その統計的に有意な改善は、本明細書に記載の方法に従った治療後６０日以内の対象のスコアと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％を超えて減少しない。

【0246】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、対象のスコアの統計的に有意な改善（例えば、ＥＤＳ、シルマー、角膜染色検査、又はＯＳＤＩ）は、本明細書に記載の方法に従った治療後少なくとも１週間、少なくとも１か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、又は少なくとも１２か月維持され、その統計的に有意な改善は、本明細書に記載の方法に従った治療後６０日以内の対象の対応するアイドライネススコア、角膜スコア、又はＯＳＤＩスコアと比較して２０％を超えて減少しない。

【0247】

投与のタイミング及び投与の方法
対象に施行される投与のスケジュールは、各投与の有効性の継続期間、ｒＡＡＶビリオンの形質導入効率、及び身体に対する投与の影響を含む様々な考慮事項に依存する。例えば、患者の病態が改善されない場合には医療提供者の裁量で、対象の眼疾患の症状を改善する、又はそうでなければ制御若しくは制限するために、本明細書に記載の眼疾患を治療する方法は、投与量を調整する、又は繰り返し投与することができる。例えば、１つ若しくは複数の投与の施行間の期間が延長される、又は対象が１つ又は複数の投与を施される日数の間の期間が延長される。非限定的な例として、１回又は複数回の投与の施行は、眼疾患の症状を測定した後に１回又は複数回の投与の施行に変更される。

【0248】

本明細書において使用される場合、「投与量」は、本開示の医薬組成物の投与量、又は眼疾患における症状を軽減する治療の投与量を意味することができる。

【0249】

本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、ｒＡＡＶビリオンの投与量は、発現カセットをもつｒＡＡＶビリオンの投与量である。そのような場合、遺伝子産物の適切な用量（例えば有効量）の送達は、一定期間にわたって治療有効量の遺伝子産物の発現を可能にする適切な量／力価のウイルスベクターを標的部位に投与することによって達成される。そのような場合、遺伝子産物の適切な用量（例えば有効量）の送達は、一定期間にわたって有効量の遺伝子産物の発現を可能にする適切な量／力価のウイルスベクターを標的部位に投与することによって達成される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはｒＡＡＶビリオンである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの投与は、一定期間（例えば、約１日、約２日、約４日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約９か月、約１２か月、又はより長く）、遺伝子産物の安定な産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約１週間の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約２週間の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約３週間の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約４週間の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約１か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約２か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約３か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約４か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約５か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約６か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約９か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、約１２か月の遺伝子産物の安定した産生をもたらす。

【0250】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは反復投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、又はより多い投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは２回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは３回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは４回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは５回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは６回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは７回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは８回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは９回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは１０回の投与で投与される。

【0251】

いくつかの実施形態では、本方法は、ｒＡＡＶを投与することによって有効量の遺伝子産物を送達することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ｒＡＡＶの初回投与及び１回又は複数回の後続の投与を送達することを含む。１回又は複数回の後続の投与は、初回投与の後一定期間後に施行される。いくつかの実施形態では、この初回投与と次の後続の投与との間の期間は、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも４か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、少なくとも１２か月である、又はより長い。いくつかの実施形態では、この初回投与と次の後続の投与との間の期間は、１～７日、１～４週間、２～６週間、４～８週間、１～３か月、２～４か月、３～６か月、４～１２か月、６～２４か月である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の後続の投与間の期間は、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも４か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、少なくとも１２か月である、又はより長い。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の後続の投与間の期間は、１～７日、１～４週間、２～６週間、４～８週間、１～３か月、２～４か月、３～６か月、４～１２か月、６～２４か月である。

【0252】

いくつかの実施形態では、投与は同じ濃度のｒＡＡＶである。いくつかの実施形態では、投与は異なる濃度のｒＡＡＶである。

【0253】

いくつかの実施形態では、反復投与は、同じ眼又は涙腺に投与される。いくつかの実施形態では、反復投与は、少なくとも１つの眼又は涙腺に投与される。

【0254】

医薬組成物及びキット
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のｒＡＡＶビリオン、及び薬学的に許容される担体、送達剤（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔ）、又は賦形剤を含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、本開示は、眼の疾患、障害、又は病態を治療するための医薬品の製造における本明細書に記載のｒＡＡＶビリオン又は医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、眼の疾患、障害、又は病態に使用するための、又は使用するのに適合可能な本明細書のｒＡＡＶビリオン又は医薬組成物の使用に関する。

【0256】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はリン酸緩衝生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、その意図される投与経路（例えば、涙腺内）に適合するように製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、涙腺への投与向けに製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、眼表面への投与向けに製剤化される。

【0257】

眼及び／又は涙腺の細胞を効果的に形質導入するのに適した任意の濃度のウイルス粒子を、インビトロ又は生体内で眼及び／又は涙腺の細胞と接触させるために調製することができる。例えば、ウイルス粒子は、１０^８ベクターゲノム／ｍｌ又はより大きい濃度、例えば、５×１０^８ベクターゲノム／ｍＬ；１０^９ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^９ベクターゲノム／ｍＬ、１０^１０ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１０ベクターゲノム／ｍＬ；１０^１１ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^１１ベクターゲノム／ｍＬ；１０^１２ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^１２ベクターゲノム／ｍＬ；１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；１．５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；３×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；７．５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；９×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；１×１０^１４ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１４ベクターゲノム／ｍＬ又はより大きい濃度、但し典型的には１×１０^１５ベクターゲノム／ｍＬ以下の濃度で製剤化することができる。同様に、所望の効果を付与する、又は疾患を治療するために眼及び／又は涙腺の細胞に適切な形質導入をもたらすのに適した任意の総数のウイルス粒子を、哺乳類又は霊長類の眼に投与することができる。様々な実施形態では、１つの眼につき、少なくとも１０^７；５×１０^７；１０^８；５×１０^８；１０^９；５×１０^９、１０^１０、５×１０^１０；１０^１１；５×１０^１１；１０^１２；５×１０^１２；１０^１３；１．５×１０^１３；３×１０^１３；５×１０^１３；７．５×１０^１３；９×１０^１３、１×１０^１４ウイルス粒子、又は５×１０^１４以上のウイルス粒子、但し典型的には１×１０^１５以下のウイルス粒子が注射される。様々な実施形態では、１つの眼につき、少なくとも１０^８；５×１０^８；１０^９；５×１０^９、１０^１０、５×１０^１０；１０^１１；５×１０^１１；１０^１２；５×１０^１２；１０^１３；１．５×１０^１３；３×１０^１３；５×１０^１３；７．５×１０^１３；９×１０^１３、１×１０^１４ウイルス粒子、又は５×１０^１４以上のウイルス粒子、但し典型的には１×１０^１５以下のウイルス粒子が注射される。哺乳類又は霊長類の眼へのベクターの投与は、任意の好適な回数行うことができる。１つの１実施形態では、本方法は単回の投与を含み、他の実施形態では、担当医（ａｔｔｅｎｄｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃｉａｎ）によって適切と判断された場合、複数回の投与が時間をかけて行われる。

【0258】

対象となるウイルスベクターは、限定されないが、１×１０^８ベクターゲノム以上、例えば、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、又は１×１０^１３ベクターゲノム以上、ある特定の例では、１×１０^１４ベクターゲノム、通常は４×１０^１５を超えないベクターゲノムを含む任意の好適な単位投与量に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、限定されないが、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、又は１×１０^１３ベクターゲノム以上を含む任意の好適な単位投与量に製剤化することができる。場合によっては、単位投与量は、多くとも約５×１０^１５ベクターゲノム、例えば、１×１０^１４ベクターゲノム以下、例えば１×１０^１３、１×１０^１２、１×１０^１１、１×１０^１０、又は１×１０^９ベクターゲノム以下、ある特定の例では、１×１０^８ベクターゲノム以下、典型的には１×１０^８ベクターゲノムより多い。場合によっては、単位投与量は、多くとも約５×１０^１５ベクターゲノム、例えば、１×１０^１４ベクターゲノム以下、例えば１×１０^１３、１×１０^１２、１×１０^１１、１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８、又は１×１０^７ベクターゲノム以下である。場合によっては、単位投与量は１×１０^１０～１×１０^１１ベクターゲノムである。場合によっては、単位投与量は１×１０^１０～３×１０^１２ベクターゲノムである。場合によっては、単位投与量は１×１０^９～３×１０^１３ベクターゲノムである。場合によっては、単位投与量は１×１０^８～３×１０^１４ベクターゲノムである。

【0259】

場合によっては、医薬組成物の単位投与量は、感染多重度（ＭＯＩ）を用いて測定することができる。ＭＯＩとは、核酸が送達されうる細胞に対するベクター又はウイルスゲノムの比（倍数）を意味する。場合によっては、ＭＯＩは１×１０^６でありうる。場合によ
っては、ＭＯＩは１×１０^５～１×１０^７でありうる。場合によっては、ＭＯＩは１×１０^４～１×１０^８でありうる。場合によっては、本開示の組み換えウイルスのＭＯＩは、少なくとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、及び１×１０^１８である。場合によっては、本開示の組み換えウイルスのＭＯＩは、１×１０^８～３×１０^１４である。場合によっては、本開示の組み換えウイルスのＭＯＩは、多くとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、及び１×１０^１８である。

【0260】

いくつかの実施形態では、医薬組成物の量は、約１×１０^８～約１×１０^１５の組み換えウイルス、約１×１０^９～約１×１０^１４の組み換えウイルス、約１×１０^１０～約１×１０^１３の組み換えウイルス、又は約１×１０^１１～約３×１０^１２の組み換えウイルスを含む。

【0261】

対象となるｒＡＡＶ組成物を調製する際には、ｒＡＡＶビリオンを産生するための任意の宿主細胞を使うことができ、例えば、哺乳類細胞（例えば２９３細胞）、昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）、微生物及び酵母が挙げられる。宿主細胞はまた、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が宿主細胞内で安定的に維持されるパッケージング細胞、又はｒＡＡＶビリオンゲノムが安定的に維持され、パッケージングされるプロデューサー細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ）であることができる。例示的なパッケージング細胞及びプロデューサー細胞は、ＳＦ－９、２９３、Ａ５４９又はＨｅＬａ細胞に由来する。ｒＡＡＶビリオンは、当該技術分野で公知の標準的な技術を用いて精製及び製剤化される。

【0262】

いくつかの実施形態では、本開示は、医薬品の製造における本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンの使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法に使用するための医薬品の製造における本明細書に記載のｒＡＡＶビリオンの使用を提供する。

【0263】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書のｒＡＡＶ、及び使用のための説明書を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットには、本明細書のｒＡＡＶ、キットを使用するための説明書を含む添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）が含まれる。いくつかの実施形態では、キットは、それを必要とする対象における本明細書に記載の疾患、障害、又は病態を治療する、又はその進行を遅らせるための、明細書のｒＡＡＶ、及び薬学的に許容される担体、又はｒＡＡＶを含む医薬組成物並びに説明書を含む。

【0264】

例示的な実施形態
本開示は以下の実施形態に関する。この項を通して、実施形態という用語は「Ｅ」と略され、その後に序数が続く。例えば、ＥＩ－１は実施形態Ｉ－１にあたる。

【0265】

実施形態Ｉ－１． それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、対象の少なくとも１つの眼又は対象の眼の少なくとも１つの涙腺に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンがＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む方法。

【0266】

実施形態Ｉ－２． ｒＡＡＶビリオンが対象の涙腺に投与される、実施形態Ｉ－１の方法。

【0267】

実施形態Ｉ－３． 涙腺が、対象の主涙腺又はウォルフリング腺若しくはクラウス腺のいずれか１つである実施形態Ｉ－２の方法。

【0268】

実施形態Ｉ－４． 涙腺が主涙腺である実施形態Ｉ－２の方法。

【0269】

実施形態Ｉ－５． 涙腺内の細胞がｒＡＡＶビリオンで形質導入される、実施形態Ｉ－２～Ｉ－４のいずれか１つの方法。

【0270】

実施形態Ｉ－６． 涙腺内の形質導入細胞が、有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する、実施形態Ｉ－５の方法。

【0271】

実施形態Ｉ－７． 神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－６のいずれか１つの方法。

【0272】

実施形態Ｉ－８． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－７の方法。

【0273】

実施形態Ｉ－９． ＮＧＦタンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－７の方法。

【0274】

実施形態Ｉ－１０． ＮＧＦタンパク質が配列番号１を含む、実施形態Ｉ－７の方法。

【0275】

実施形態Ｉ－１１． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２を含む、実施形態Ｉ－７の方法。

【0276】

実施形態Ｉ－１２． 神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－６のいずれか１つの方法。

【0277】

実施形態Ｉ－１３． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－１２の方法。

【0278】

実施形態Ｉ－１４． ＧＤＮＦタンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－１２の方法。

【0279】

実施形態Ｉ－１５． ＧＤＮＦタンパク質が配列番号３を含む、実施形態Ｉ－１２の方法。

【0280】

実施形態Ｉ－１６． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４を含む、実施形態Ｉ－１２の方法。

【0281】

実施形態Ｉ－１７． ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２
ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１６のいずれか１つの方法。

【0282】

実施形態Ｉ－１８． プロモーターがＣＡＧプロモーター（配列番号５）である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１７のいずれか１つの方法。

【0283】

実施形態Ｉ－１９． 眼疾患が、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、角膜潰瘍、遷延性上皮
欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、並びに角膜神経の糖尿病合併症である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１８のいずれか１つの方法。

【0284】

実施形態Ｉ－２０． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１９のいずれか１つの方法。

【0285】

実施形態Ｉ－２１． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２０のいずれか１つの方法。

【0286】

実施形態Ｉ－２２． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、対側眼の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２１のいずれか１つの方法。

【0287】

実施形態Ｉ－２３． 組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、ＡＡＶカプシド及び発現カセットを含み、発現カセットが、プロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えｒＡＡＶビリオン。

【0288】

実施形態Ｉ－２４． 神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、実施形態Ｉ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0289】

実施形態Ｉ－２５． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0290】

実施形態Ｉ－２６． ＮＧＦタンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0291】

実施形態Ｉ－２７． ＮＧＦタンパク質が配列番号１を含む、実施形態Ｉ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0292】

実施形態Ｉ－２８． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２又は配列番号１７である、実施形態Ｉ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0293】

実施形態Ｉ－２９． 神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、実施形態Ｉ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0294】

実施形態Ｉ－３０． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0295】

実施形態Ｉ－３１． ＧＤＮＦタンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0296】

実施形態Ｉ－３２． ＧＤＮＦタンパク質が配列番号３を含む、実施形態Ｉ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0297】

実施形態Ｉ－３３． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４又は配列番号１８である、実施形態Ｉ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0298】

実施形態Ｉ－３４． ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２
ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有するＶＰ３を含む、実施形態Ｉ－２３～Ｉ－３３のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン。

【0299】

実施形態Ｉ－３５． プロモーターが、ＣＡＧプロモーター（配列番号５）又はＣＭＶプロモーター（配列番号１６）である、実施形態Ｉ－２３～Ｉ－３４のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン。

【0300】

実施形態Ｉ－３６． 発現カセットが、配列番号２３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0301】

実施形態Ｉ－３７． 発現カセットが、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0302】

実施形態Ｉ－３８． 発現カセットが、配列番号２５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、実施形態Ｉ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0303】

実施形態Ｉ－３９． 配列番号２５のポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。

【0304】

実施形態Ｉ－４０． ｒＡＡＶがＡＡＶカプシドを含む、実施形態Ｉ－３９のｒＡＡＶ。

【0305】

実施形態Ｉ－４１． ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２
ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－４０のｒＡＡＶ。

【0306】

実施形態Ｉ－４２． ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが以下を含む組成物。
（ａ）ＡＡＶカプシド、及び
（ｂ）発現カセット（発現カセットは、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに連結される）

【0307】

実施形態Ｉ－４３． ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが以下を含む組成物。
（ａ）ＡＡＶカプシド、及び
（ｂ）発現カセット（発現カセットは、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに連結される）

【0308】

実施形態Ｉ－４４． ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが以下を含む組成物。
（ａ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット（発現カセットは、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに
連結される）

【0309】

実施形態Ｉ－４５． ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが以下を含む組成物。
（ａ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット（発現カセットは、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがプロモーターに連結される）

【0310】

実施形態Ｉ－４６． ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２
ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－４５のいずれか１つの組成物。

【0311】

実施形態Ｉ－４７． ＡＡＶカプシドがＡＡＶ２である、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－４５のいずれか１つの組成物。

【0312】

実施形態Ｉ－４８． ＡＡＶカプシドがＡＡＶ５である、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－４５のいずれか１つの組成物。

【0313】

実施形態Ｉ－４９． ＡＡＶカプシドがＡＡＶ９である、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－４５のいずれか１つの組成物。

【0314】

実施形態Ｉ－５０． ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが以下を含む組成物。
（ａ）ＡＡＶ２カプシド、及び
（ｂ）発現カセット（発現カセットは、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む）

【0315】

実施形態Ｉ－５１． ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが以下を含む組成物。
（ａ）ＡＡＶ５カプシド、及び
（ｂ）発現カセット（発現カセットは、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む）

【0316】

実施形態Ｉ－５２． ｒＡＡＶビリオンを含む組成物であって、ｒＡＡＶビリオンが以下を含む組成物。
（ａ）ＡＡＶ９カプシド、及び
（ｂ）発現カセット（発現カセットは、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む）

【0317】

実施形態Ｉ－５３． 実施形態Ｉ－２３～Ｉ－４１のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン、又は実施形態Ｉ－４２～Ｉ－５２のいずれか１つの組成物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【0318】

実施形態Ｉ－５４． ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^７～約１×１０^１４ゲノムコピーを含む、実施形態Ｉ－５３の医薬組成物。

【0319】

実施形態Ｉ－５５． ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^１２～約６．２×１０^１２ゲノムコピーを含む、実施形態Ｉ－５３の医薬組成物。

【0320】

実施形態Ｉ－５６． 涙腺への投与向けに製剤化される、実施形態Ｉ－５３～Ｉ－５５のいずれか１つの医薬組成物。

【0321】

実施形態Ｉ－５７． 眼表面への投与向けに製剤化される、実施形態Ｉ－５３～Ｉ－５５のいずれか１つの医薬組成物。

【0322】

実施形態Ｉ－５８． 眼の疾患、障害、又は病態の治療に使用するために、又は使用に適合可能に製剤化される実施形態Ｉ－５３～Ｉ－５７のいずれか１つの医薬組成物。

【0323】

実施形態Ｉ－５９． それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、有効量の実施形態Ｉ－５３～Ｉ－５８のいずれか１つの医薬組成物を、対象の眼又は対象の眼分泌腺に投与することを含む方法。

【0324】

実施形態Ｉ－６０． ｒＡＡＶビリオンが対象の涙腺に投与される、実施形態Ｉ－５９の方法。

【0325】

実施形態Ｉ－６１． 涙腺内の細胞がｒＡＡＶビリオンで形質導入される、実施形態Ｉ－６０の方法。

【0326】

実施形態Ｉ－６２． 涙腺内の形質導入細胞が、有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する、実施形態Ｉ－６１の方法。

【0327】

実施形態Ｉ－６３． 眼疾患が神経栄養性角膜炎である、実施形態Ｉ－５９～Ｉ－６２のいずれか１つの方法。

【0328】

実施形態Ｉ－６４． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態Ｉ－５９～Ｉ－６３のいずれか１つの方法。

【0329】

実施形態Ｉ－６５． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態Ｉ－５９～Ｉ－６４のいずれか１つの方法。

【0330】

実施形態Ｉ－６６． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、対側眼の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態Ｉ－５９～Ｉ－６５のいずれか１つの方法。

【0331】

実施形態Ｉ－６７． 実施形態Ｉ－１～Ｉ－２２のいずれか１つの方法に使用するための、実施形態Ｉ－２３～Ｉ－４１のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－５２のいずれか１つの組成物、又は実施形態Ｉ－５３～Ｉ－５８のいずれか１つの医薬組成物。

【0332】

実施形態Ｉ－６８． 実施形態Ｉ－１～Ｉ－２２のいずれか１つの方法に使用するための医薬品の製造における、実施形態Ｉ－２３～Ｉ－４１のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン又は実施形態Ｉ－４２～Ｉ－５２のいずれか１つの組成物の使用。

【0333】

実施形態Ｉ－６９． 実施形態Ｉ－１～Ｉ－２２のいずれか１つの方法に使用ための、実施形態Ｉ－２３～Ｉ－４１のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－５２のいずれか１つの組成物、又は実施形態Ｉ－５３～Ｉ－５８のいずれか１つの医薬組成物、及び説明書を含むキット。

【0334】

実施形態Ｉ－７０． それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法に使用する
ための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、その方法が、対象の少なくとも１つの眼又は対象の眼の少なくとも１つの涙腺に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むｒＡＡＶ。

【0335】

実施形態Ｉ－７１． ｒＡＡＶビリオンが対象の涙腺に投与される、実施形態Ｉ－７０の使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【0336】

実施形態Ｉ－７２． 涙腺内の細胞がｒＡＡＶビリオンで形質導入される、実施形態Ｉ－７１の使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【0337】

実施形態Ｉ－７３． 神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、実施形態Ｉ－７０～Ｉ－７２のいずれか１つの使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【0338】

実施形態Ｉ－７４． 神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、実施形態Ｉ－７０～Ｉ－７２のいずれか１つの使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【0339】

実施形態Ｉ－７５． 眼疾患が、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、及び角膜神経の糖尿病合併症から選択される、実施形態Ｉ－７０～Ｉ－７４のいずれか１つの使用のためのｒＡＡＶビリオン。

【0340】

本開示のいくつかの実施形態は、以下の実施形態ＩＩに関する。

【0341】

実施形態ＩＩ－１． それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、対象の少なくとも１つの眼又は対象の眼の少なくとも１つの涙腺に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンがＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む方法。

【0342】

実施形態ＩＩ－２． ｒＡＡＶビリオンが対象の涙腺に投与される、実施形態ＩＩ－１の方法。

【0343】

実施形態ＩＩ－３． 涙腺が主涙腺である、実施形態ＩＩ－２の方法。

【0344】

実施形態ＩＩ－４． 涙腺が、対象の主涙腺又はウォルフリング腺若しくはクラウス腺のいずれか１つである、実施形態ＩＩ－２の方法。

【0345】

実施形態ＩＩ－５． 涙腺内の細胞がｒＡＡＶビリオンで形質導入される、実施形態ＩＩ－２～ＩＩ－４のいずれか１つの方法。

【0346】

実施形態ＩＩ－６． 涙腺内の形質導入細胞が、治療有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する、実施形態ＩＩ－５の方法。

【0347】

実施形態ＩＩ－７． 神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－６のいずれか１つの方法。

【0348】

実施形態ＩＩ－８． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２
と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－７の方法。

【0349】

実施形態ＩＩ－９． ＮＧＦタンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－７の方法。

【0350】

実施形態ＩＩ－１０． ＮＧＦタンパク質が配列番号１を含む、実施形態ＩＩ－７の方法。

【0351】

実施形態ＩＩ－１１． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２を含む、実施形態ＩＩ－７の方法。

【0352】

実施形態ＩＩ－１２． 神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－６のいずれか１つの方法。

【0353】

実施形態ＩＩ－１３． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－１２の方法。

【0354】

実施形態ＩＩ－１４． ＧＤＮＦタンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－１２の方法。

【0355】

実施形態ＩＩ－１５． ＧＤＮＦタンパク質が配列番号３を含む、実施形態ＩＩ－１２の方法。

【0356】

実施形態ＩＩ－１６． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４を含む、実施形態ＩＩ－１２の方法。

【0357】

実施形態ＩＩ－１７． ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－６のいずれか１つの方法。

【0358】

実施形態ＩＩ－１８． プロモーターがＣＡＧプロモーター（配列番号５）である、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－１６のいずれか１つの方法。

【0359】

実施形態ＩＩ－１９． 眼疾患が、眼表面の化学熱傷、角膜創傷、角膜潰瘍、遷延性上皮欠損、ドライアイ疾患、神経栄養性角膜炎、三叉神経及び／又は眼の単純ヘルペスウイルス感染症、三叉神経及び／又は眼の水痘帯状疱疹ウイルス感染症、並びに角膜神経の糖尿病合併症である、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－１８のいずれか１つの方法。

【0360】

実施形態ＩＩ－２０． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－１９のいずれか１つの方法。

【0361】

実施形態ＩＩ－２１． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－２０のいずれか１つの方法。

【0362】

実施形態ＩＩ－２２． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、対側眼の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－２１のいずれか１つの方法。

【0363】

実施形態ＩＩ－２３． ＡＡＶカプシド及びプロモーターに動作可能に連結された神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。

【0364】

実施形態ＩＩ－２４． 神経栄養因子が神経成長因子（ＮＧＦ）タンパク質である、実施形態ＩＩ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0365】

実施形態ＩＩ－２５． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２又は配列番号１７と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0366】

実施形態ＩＩ－２６． ＮＧＦタンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0367】

実施形態ＩＩ－２７． ＮＧＦタンパク質が配列番号１を含む、実施形態ＩＩ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0368】

実施形態ＩＩ－２８． ＮＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２又は配列番号１７である、実施形態ＩＩ－２４のｒＡＡＶビリオン。

【0369】

実施形態ＩＩ－２９． 神経栄養因子がグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質である、実施形態ＩＩ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0370】

実施形態ＩＩ－３０． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４又は配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0371】

実施形態ＩＩ－３１． ＧＤＮＦタンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0372】

実施形態ＩＩ－３２． ＧＤＮＦタンパク質が配列番号３を含む、実施形態ＩＩ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0373】

実施形態ＩＩ－３３． ＧＤＮＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４又は配列番号１９である、実施形態ＩＩ－２９のｒＡＡＶビリオン。

【0374】

実施形態ＩＩ－３４． ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号６）、ＡＡＶ２ ＶＰ３（配列番号８）、ＡＡＶ５（配列番号１０）、ＡＡＶ８（配列番号１２）、又はＡＡＶ９（配列番号１４）と少なくとも９５％、９８％、又は１００％の同一性を共有するＶＰ３を含む、実施形態ＩＩ－２３～ＩＩ－３３のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン。

【0375】

実施形態ＩＩ－３５． プロモーターが、ＣＡＧプロモーター（配列番号５）又はＣＭＶプロモーター（配列番号１６）である、実施形態ＩＩ－２３～ＩＩ－３４のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン。

【0376】

実施形態ＩＩ－３６． 発現カセットが、配列番号２３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0377】

実施形態ＩＩ－３７． 発現カセットが、配列番号２４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する配列を含む、実施形態ＩＩ－２３のｒＡＡＶビリオン。

【0378】

実施形態ＩＩ－３８． 実施形態ＩＩ－２３～ＩＩ－３７のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【0379】

実施形態ＩＩ－３９． ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^９～約１×１０^１４ゲノムコピーを含む、実施形態ＩＩ－３８の医薬組成物。

【0380】

実施形態ＩＩ－４０． ｒＡＡＶビリオン１ミリリットルあたり約１×１０^１２～約６．２×１０^１２ゲノムコピーを含む、実施形態ＩＩ－３８の医薬組成物。

【0381】

実施形態ＩＩ－４１． それを必要とする対象における眼疾患を治療する方法であって、治療有効量の実施形態ＩＩ－３８～ＩＩ－４０のいずれか１つの医薬組成物を、対象の眼又は対象の眼分泌腺に投与することを含む方法。

【0382】

実施形態ＩＩ－４２． ｒＡＡＶビリオンが対象の涙腺に投与される、実施形態ＩＩ－４１の方法。

【0383】

実施形態ＩＩ－４３． 涙腺内の細胞がｒＡＡＶビリオンで形質導入される、実施形態ＩＩ－４２の方法。

【0384】

実施形態ＩＩ－４４． 涙腺内の形質導入細胞が、治療有効量の神経栄養因子を、対象の涙液層及び任意選択で眼表面に発現する、実施形態ＩＩ－４３の方法。

【0385】

実施形態ＩＩ－４５． 眼疾患が神経栄養性角膜炎である、実施形態ＩＩ－４１～ＩＩ－４４のいずれか１つの方法。

【0386】

実施形態ＩＩ－４６． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、ｒＡＡＶビリオンの投与前の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態ＩＩ－４１～ＩＩ－４５のいずれか１つの方法。

【0387】

実施形態ＩＩ－４７． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、未治療対照の対象における眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態ＩＩ－４１～ＩＩ－４６のいずれか１つの方法。

【0388】

実施形態ＩＩ－４８． 眼疾患の１つ又は複数の症状が、対側眼の眼疾患の症状と比較して軽減される、実施形態ＩＩ－４１～ＩＩ－４６のいずれか１つの方法。

【0389】

実施形態ＩＩ－４９． 実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－２２のいずれか１つの方法に使用するための、実施形態ＩＩ－２３～ＩＩ－３４のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン又は実施形態ＩＩ－３５～ＩＩ－３８のいずれか１つの医薬組成物。

【0390】

実施形態ＩＩ－５０． 実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－２２のいずれか１つの方法に使用するための医薬品の製造における実施形態ＩＩ－２３～ＩＩ－３７のいずれか１つのｒＡＡＶビリオンの使用。

【0391】

実施形態ＩＩ－５１． 実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－２２のいずれか１つの方法に使用するための、実施形態ＩＩ－２３～ＩＩ－３７のいずれか１つのｒＡＡＶビリオン又は実施
形態ＩＩ－３８～ＩＩ－４０のいずれか１つの医薬組成物、及び説明書を含むキット。

【実施例】

【0392】

以下の具体的な例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、いかなる形でも開示の残りの部分を限定するものではない。

【0393】

実施例１：涙腺内注射を介したｒＡＡＶによって送達されたＧＦＰ導入遺伝子の涙腺における発現
この例は、ダッチベルテッドラビットにｒＡＡＶビリオンを涙腺内注射で単回投与した９日間のパイロット試験を示す。涙腺への注射を介して１回投与されるｒＡＡＶビリオン実施形態のパネルの有効性及び忍容性が評価される。パネルの各ｒＡＡＶビリオン組成物を２つの濃度（１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ及び６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬ）で試験した。ｒＡＡＶビリオンのパネルは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９血清型を有するカプシドタンパク質を含む実施形態を含む。ｒＡＡＶビリオンによって送達される発現カセットは、ＣＭＶプロモーターに動作可能に連結された強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）導入遺伝子をコードする（図１Ｃに示されている通り）。このアプローチは、涙腺の細胞に導入遺伝子を送達し、細胞内の導入遺伝子の測定可能なＣＡＧプロモーターによる発現をもたらす、カプシドタンパク質血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９の実現可能性を評価した。

【0394】

動物実験は、チャールス・リバー・ラボラトリーズ（ＣＲＬ）の施設内で、ＣＲＬのスタッフ科学者（ｓｔａｆｆ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ）によって実施された。

【0395】

動物試験システム、ハズバンダリー、及び生存動物（Ｉｎ－ｌｉｆｅ）モニタリング
この研究で使用した動物は、４～５か月齢、体重１．３ｋｇ～２．３ｋｇの雄のダッチベルテッドラビットであった。動物を治療開始前に１０日間馴化させた。各動物を個別に収容し、通常の環境条件、給餌スケジュール、獣医学的ケアを含む標準的なケア（ｃａｒｅｇｉｖｉｎｇ）プロトコールを用いて管理した。

【0396】

ｒＡＡＶビリオン組成物及び製剤
この研究では、ＣＡＧプロモーターに動作可能に連結されたｅＧＦＰ導入遺伝子をコードする発現カセットを含有するｒＡＡＶビリオンを含む組成物のパネルを、表４の条件下で涙腺内注射に向けて用意する。各組成物には異なるＡＡＶカプシドタンパク質血清型をもつｒＡＡＶビリオンが含まれる。組成物をＯＣ－１００ａ～ｄと標識し、それぞれは、異なるＡＡＶカプシドタンパク質血清型に対応する。リン酸緩衝生理食塩水溶液で希釈することによって、以下の表４に記載の目標濃度で清潔な手順を用いて、涙腺内注射用の投与製剤を調製した。

【0397】

【表12】

【0398】

ｒＡＡＶ組成物の涙腺内注射
試験１日目に、動物に涙腺内注射によって投与を行った。試験した各組成物の製剤濃度、投与量、投与回数、並びに動物及び涙腺の数についてのまとめを表５に載せる。注射の前に、デクスメデトミジン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射によって動物に麻酔をかけ、続いて、必要に応じて麻酔を維持するためにマスクを通してイソフルラン／酸素混合物を投与した。投与施行後、それぞれの眼に局所抗生物質を与えた。

【0399】

【表13】

【0400】

生体分析
投与１日目に投与前に採血し、８日目及び９日目にもすべての動物の耳介血管から再度採血した。血漿が遠心分離で分離されるまで、血液試料を氷の上に置いた。血漿試料を２５０μＬのアリコートに分け、その後の分析のために－８０℃で凍結した。

【0401】

８日目及び９日目にシルマー涙液試験を行って、動物から眼水分を採取した。ストリップを下眼瞼の内側に約１分間留置した。その後の分析のために、紙を取り出して別のチューブに入れ、－８０℃で凍結した。

【0402】

血漿試料及びシルマー試験ストリップを、Ｓｙｎｅｏｓ分析研究所（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検証済みの手順を用いて、ｅＧＦＰ及びｅＧＦＰ ｍＲＮＡ濃度について分析した。血漿試料の分析では、ｅＧＦＰタンパク質もｅＧＦＰ ｍＲＮＡも検出されず、ｒＡＡＶの涙管内送達は細胞溶解を誘導しなかったことを示した
。この結果は、涙管投与経路がｒＡＡＶの送達に安全に使用できることを示唆する。

【0403】

涙腺組織の免疫組織化学
９日目に採血及び眼水分の採取後、ペントバルビタールナトリウムの静脈注射によって動物を安楽死させた。５つの左眼矢状切片及び左右の涙腺の切片を、チャールス・リバー研究所の標準操作手順に従って免疫組織化学（ＩＨＣ）用に調整した。涙腺ＩＨＣ試料をｅＧＦＰについて染色し、顕微鏡評価に供した。

【0404】

顕微鏡的評価を行って、ｒＡＡＶ組成物を生体内投与した涙腺組織におけるｅＧＦＰ発現の効率を判定した。ＩＨＣ試料中の単離陽性腺房細胞は、ＧＦＰ発現を示すピンクから赤の細胞質染色を有した（図６Ａ～図６Ｋ；黒い矢印で示されている例示的な染色）。６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬ（図６Ａ）でＡＡＶ２カプシドタンパク質（ＯＣ－１００ａ）を含有するｒＡＡＶ組成物、１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ（図６Ｂ）及び６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬ（図６Ｃ～図６Ｈ）でＡＡＶ５カプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶ組成物の両方、並び６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬ（図６Ｉ～６Ｋ）でＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶ組成物について、陽性のｅＧＦＰ発現が認められた。

【0405】

結論
この実施例のこれらの結果は、ｒＡＡＶビリオンを使用して、直接注入によって発現カセットを涙腺に送達できることを示している。結果はまた、少なくともＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ９血清型をもつカプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶビリオンを用いて、涙腺内の細胞に発現カセットを送達できることを示している。さらに、これらの結果は、ＣＡＧプロモーター配列に動作可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットの送達が、涙腺の細胞における導入遺伝子の発現をもたらすことを示している。

【0406】

実施例２
涙腺内注射を介してｒＡＡＶによって送達された涙腺における神経栄養因子の発現
この例は、ＡＡＶベクターを涙腺内注射で投与した後、ダッチベルテッドラビットに単回鼻腔内投与として投与したバレニクリンの７日間の単回投与試験を記載する。様々なＡＡＶベクターの忍容性及び有効性を、２つの投与量レベル（１００μＬ注射剤として１×１０^１２ＧＣ／ｍＬ又は６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬ）を涙腺内注射で投与し、それに続いてバレニクリン点鼻薬（５０μＬスプレーとして１．２ｍｇ／ｍｌ）を対象の各鼻孔に単回投与し、評価する。具体的には、本試験デザインの主要な目的は２点である。
（１）涙腺内注射で投与したヒト神経成長因子（ｈＮＧＦ）又はヒトグリア由来神経栄養因子（ｈＧＤＮＦ）のいずれかをコード化する発現カセットを含む血清型２、５、又は９（ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９）のアデノ随伴ウイルスベクターを使用して、涙腺の形質導入を評価すること。ｈＮＧＦ及びｈＧＤＮＦタンパク質は、角膜表面の維持及び健康に関与する好中栄養因子である。
（２）バレニクリン点鼻薬で涙液産生を刺激することによって、眼表面に存在するタンパク質の相対量の増加を評価すること。バレニクリンは以下の化合物である。

【0407】

【化1】

【0408】

本研究では、実験用ウイルスベクター又は対照ベクターをダッチベルテッドラビットの涙腺に投与する。ＡＡＶｘ．ｈＮＧＦ及びＡＡＶｘ．ｈＧＤＮＦ（ｘは２、５、又は９）ベクターは、それぞれｈＮＧＦ及びｈＧＤＮＦタンパク質をコード化する導入遺伝子を含む。ｈＮＧＦ及びｈＧＤＮＦは、ＡＡＶで送達された導入遺伝子の涙液内発現の実現可能性を実証する例示的な治療用タンパク質であり、その涙液層への分泌はバレニクリンなどの涙液誘導剤（ｔｅａｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて増加させることができる。ＡＡＶｘ．ｎＮＧＦ及びＡＡＶｘ．ｈＧＤＮＦは、６．２×１０^１１ＧＣ／ｍＬの投与量で投与される。ビヒクル対照を比較に使用する。

【0409】

７日目に青色光及び適切なフィルターを使用して、細隙灯生体顕微鏡法によって動物を麻酔下で評価する。この評価を細隙灯写真とともに記録する。

【0410】

８日目に、動物に１．２ｍｇ／ｍＬのバレニクリンの５０μＬ点鼻薬スプレーを各鼻孔に単回投与した。投与直後又は数分以内に、青色光及び適切なフィルターを使用して細隙灯生体顕微鏡法によって動物を麻酔下で評価する。この評価を細隙灯写真とともに記録する。

【0411】

方法
投与の施行（経路）：涙腺内注射、各涙腺に１００μＬ。投与頻度：各涙腺への単回注射。手順：麻酔下、約１００μＬの参照品１（ＰＢＳ＋０．００１％Ｆ６８）、ＡＡＶｘ．ｈＮＧＦ（６．２×１０^１１ＧＣ／ｍＬ）、又はＡＡＶｘ．ｈＮＧＦ（６．２×１０^１１ＧＣ／ｍＬ）を各涙腺に直接目で見ながら投与する。涙腺注射の手順は以下の通りである：（１）右（ＯＤ）上眼瞼の下を垂直切開する；（２）涙腺が見えるまで、上眼窩縁に鈍的切開を延ばす；（３）涙腺に０．１ｍＬの参照品１、ＡＡＶｘ．ｈＮＧＦ（６．２ｘ１０^１２ＧＣ／ｍＬ）、又はＡＡＶｘ．ｈＮＧＦ（６．２×１０^１２ＧＣ／ｍＬ）を、２７Ｇ×１／２インチの滅菌針を付けた１ｍＬ滅菌シリンジを用いて注射する；（４）切開部を縫合糸／シアノアクリレート接着剤で閉じる；そして（５）この手順を左（ＯＳ）涙腺に対して繰り返す。遺伝子療法の施行を表６にまとめる。

【0412】

【表14】

【0413】

点鼻薬涙液刺激
投与の施行（経路）：鼻腔内スプレー、両鼻孔。投与頻度：１回の単回投与；５０μＬを各鼻孔に１回スプレー；８日目。手順：バレニクリン溶液１．２ｍｇ／ｍｌを充填したアプター（Ａｐｔａｒ）製防腐剤不使用の鼻ポンプを使用して、動物に５０μＬのスプレーを各鼻孔に投与する。終了：８日目。点鼻薬涙液刺激を表７にまとめる。

【0414】

【表15】

【0415】

涙腺組織における導入遺伝子ｍＲＮＡの定量
涙腺の必要な切片（０．００５ｇから～０．０２５ｇ）を直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）に入れ（完全に浸漬させる）、室温で保存し、８時間以内に温度を４℃に保つよ
うに設定した冷蔵庫に移し、一晩保存した。翌日、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）を除去し、試料を－８０℃に保つように設定した冷凍庫で凍結保存した。ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて、試料をｈＮＧＦ発現について分析した。

【0416】

硬膜腺、視神経、三叉神経、上皮細胞擦過による鼻腔、瞬膜、外眼筋から０．００５ｇ～０．０１ｇの試料を右側から採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒに入れ（完全に浸漬）、室温で保存し、８時間以内に、温度を４℃に維持するよう設定した冷蔵庫に移し、一晩保存することになる。翌日、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）を除去し、ｖｇＤＮＡ及びｍＲＮＡ分析のため、試料を－８０℃に保つように設定した冷凍庫で凍結保存することになる。

【0417】

免疫組織化学（ＩＨＣ）の組織学
形態学的及び免疫組織化学的評価用に、左右の涙腺の適切な切片を採取した。試料を４％パラホルムアルデヒドに包埋し、７０％エタノールで固定した。パラフィンブロッキングの後、厚さ５μｍの切片を得て、スライドにマウントした。各試料につき１つの切片をＨ＆Ｅで染色し、免疫組織化学染色も行った。ｈＮＧＦの染色は抗ｈＮＧＦ抗体を使用して行った。スライドを観察し、顕微鏡で撮影した画像からｈＮＧＦタンパク質の発現を評価した。

【0418】

シルマー試験
７、１４、２１、２８、４１、及び４２日目に、シルマー涙液試験を行って動物から眼の水分を採取した。ストリップを下眼瞼の内側に約１分間入れた。紙を取り出して別個のチューブに入れ、後の分析のために－８０℃で凍結した。２１、２８、及び４１日目にバレニクリンを鼻腔内投与した後、シルマー試験ストリップを採取した。ストリップを下眼瞼の内側に約１分間入れた。紙を取り出して別個のチューブに入れ、後の分析のために－８０℃で凍結した。シルマー試験ストリップに吸収されたタンパク質含量を、ＥＬＩＳＡアッセイでｈＮＧＦの濃度について分析した。

【0419】

結果
涙腺組織における導入遺伝子ｍＲＮＡの定量を表８に示す。

【0420】

【表16】

【0421】

ビヒクル対照動物の組織はすべて、ｂＧＨ遺伝子発現が陰性であり、動物への投与、試料の採取、ＲＮＡ抽出、及びＲＴ－ｑＰＣＲ分析からの交差汚染が十分に抑えられていることを示した。注射したすべての涙腺組織で、ｒＡＡＶベクターに由来するｈＧＤＮＦ ｍＲＮＡを検出した。第３～６群では、注射した涙腺組織のなかには、トータルＲＮＡ１μｇあたりｓｓコピー数が１１５１～５８５，４０１のｈＮＧＦ又はｈＧＤＮＦ ｍＲＮＡを有するものがあったが、一方で検出可能なベクター由来のｍＲＮＡが有しないものもあった。

【0422】

免疫組織化学を用いて、涙腺組織をｈＮＧＦ発現についてさらに評価した（図７Ａ～７Ｅ）。涙液内注射後、動物を安楽死させ、注射した涙腺の切片を免疫組織化学（ＩＨＣ）用に調製した。涙腺ＩＨＣ試料をｈＮＧＦについて染色し、顕微鏡評価に供した。顕微鏡評価を行って、ｒＡＡＶ組成物を生体内で投与した涙腺組織におけるｈＮＧＦ発現の効率を決定した。図７Ａ及び図７Ｄ～７Ｅは、ＡＡＶ９血清型をもつｒＡＡＶを注射したウサギの涙腺におけるＩＨＣ染色の例示的な例を示す（例示的な染色を黒い矢印で示す）。ｈＮＧＦ染色組織は、ｈＮＧＦ導入遺伝子の強い発現を示す。陰性対照試料と比較することによって結果を確認し（図７Ｂ及び図７Ｃ）、その対照試料で染色がほとんどみられないので、バックグラウンドによる染色は除外する。これらの結果は、ｒＡＡＶの涙液内注射を使用して、神経栄養因子導入遺伝子、例えばｈＮＧＦを涙腺組織に送達及び発現できることを示している。

【0423】

ｒＡＡＶの投与後７及び１４日目に、シルマー涙液試験を行って動物から眼の水分を採取した。ストリップを下眼瞼の内側に約１分間入れた。紙を取り出して別個のチューブに入れ、後の分析のために－８０℃で凍結した。ストリップを下眼瞼の内側に約１分間入れた。紙を取り出して別個のチューブに入れ、後の分析のために－８０℃で凍結した。シルマー試験ストリップに吸収されたタンパク質量を、ＥＬＩＳＡアッセイでｈＮＧＦの濃度について分析した。

【0424】

シルマー試験ストリップを、採取した涙液層中のｈＮＧＦの濃度について分析した（図８）。涙液中の正常なＮＧＦ濃度は約５０ｐｇ／ｍＬと予想される。ｒＡＡＶ９．ｈＮＧＦ又はｒＡＡＶ２．ｈＮＧＦの涙腺内投与後、ｈＮＧＦ濃度は正常濃度の１００倍を超えていた。１４日目には、ｒＡＡＶ９.ｈＮＧＦを投与したウサギのｈＮＧＦの濃度は正常
濃度の１００倍を超えたままであり、ｒＡＡＶ２．ｈＮＧＦを投与したウサギのｈＮＧＦ濃度は低下したが、ｒＡＡＶなし対照群と比較してはるかに高いままであった。ｒＡＡＶ５．ｈＮＧＦを投与されたウサギでは、７日目にｈＮＧＦ濃度の増加が見られ、１４日目までに低下して対照レベルに戻った。

【0425】

まとめると、これらの結果が示しているのは、ｈＮＧＦやｈＧＤＮＦなどの神経栄養因子が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ９血清型を含むｒＡＡＶの涙腺内注射を介して送達されたとき、導入遺伝子として発現し、ＡＡＶ９血清型が最良の結果を示すということである。

【0426】

実施例３：涙腺内注射を介してｒＡＡＶによって送達されたＥＧＦＰ導入遺伝子のブタ涙腺における発現
本研究の目的は、涙腺がブタの目的のタンパク質で涙液層を改変又は濃縮する方法として活用できるかどうかを評価することであった。次に、生体内での研究を行って、ｅＧＦＰをコードするプラスミドからなるアデノウイルスベクターを送達した後に、ＥＧＦＰが涙腺の腺房細胞で産生され、涙液層に分泌されるかどうかを調べた。腺房細胞にＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡを得るために、発明人らの（ｏｕｒ）アプローチは分泌ＥＧＦＰ（ｓｅｃＥＧＦＰ）をコードするｃＤＮＡを含有したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を涙腺
に注射することになっている。ｓｅｃＥＧＦＰ用に２つの異なる血清型（２及び９）の各ＡＡＶを作るために、ｓｅｃＥＧＦＰ発現に必須な要素を逆位末端反復（ＩＴＲ）間に含有するＡＡＶトランスファープラスミドを作った。ＩＴＲ間のＤＮＡ配列を、作製したＡＡＶ（図９）にパッケージした。

【0427】

ＡＡＶの１１の血清型が同定されており、最もよく特徴がわかっているのはＡＡＶ２である。ＡＡＶシュードタイピングは、異なる血清型のカプシドとゲノムを混合して形質導入効率を向上させることであり、これらの血清型はスラッシュで示される。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５由来のカプシドにパッケージされた血清型２を含有するウイルスを示す。ＡＡＶ５及びＡＡＶ９は、マウスの涙腺にルシフェラーゼレポーター遺伝子を送達できることが報告されている（非特許文献６）。ＧＦＰ及びマウス神経成長因子（ｍＮＧＦ）によるマウス涙腺形質導入は、偽型ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／９で観察され、プレプリントサーバサイト（ｐｒｅ－ｐｒｉｎｔ ｓｅｒｖｅｒ ｓｉｔｅ）で最近報告された（非特許文献２１）。

【0428】

デザイン分析と方法論
分泌ＥＧＦＰ（血清型２及び９）の研究グレードＡＡＶはＳｉｒｉｏｎで合成され、５×１０^１２のストック濃度で供給された。作製されたＡＡＶは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＥＬＩＳＡを使用してＣＪソリューションズによってインビトロで検査され、そのＡＡＶが細胞を形質転換するであろうことを確認した。テキサスＡ＆Ｍ大学では、８頭の家畜ブタにＥＧＦＰの１回の涙腺内注射を行い、右（ＯＤ；右眼）腺に低投与量、左（ＯＳ；左眼）腺に高投与量を投与した。最初の注射の６週間後に、ＡＡＶ２及びＡＡＶ９高投与量の２回目の注射を行った。本試験では、３５日目にＥＧＦＰ発現を評価した。涙ＥＧＦＰレベルを確認した後、２回目の注射の８週間後に試験を終了して、涙腺におけるＥＧＦＰの有無を評価し、何らかの炎症の可能性又は腺の異常を評価した（表９及び１０）。この研究では、３～４週目に点鼻薬投与を施した（表１１）。

【0429】

【表17】

【0430】

【表18】

【0431】

【表19】

【0432】

２回目のＡＡＶ－ｓｅｃＥＧＦＰ注射後、８２日目にシルマー試験ストリップを介して各眼から涙を採取した。シルマー涙液試験ストリップを下結膜円蓋に入れ、２分間そのままにすることによって涙を採取した。シルマー涙液試験ストリップから涙タンパク質を抽出し、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）分析を行って、涙液中のＥＧＦＰタンパク質の存在を検出した。

【0433】

１０３日目に眼組織病理検査のために涙腺を採取し、ＥＧＦＰ免疫組織化学検査（ＩＨＣ）のために試料をＺｙａｇｅｎ社に送った。

【0434】

ＥＬＩＳＡの結果は、作製したＡＡＶ血清型はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入でき、インビトロで分泌ＥＧＦＰを産生したことを示した。涙液試料中のＥＧＦＰ発現は、ＡＡＶ形質導入の８２日後のＭＳＤ分析及びＩＨＣによって、若干＞４００ｐｇ／ｍＬのレベル（ｓｏｍｅ ｌｅｖｅｌｓ ＞４００ ｐｇ／ｍＬ）のｅＧＦＰが確認された（図１０）。ＩＨＣは、ＥＧＦＰ発現が腺房細胞内にあり、ＡＡＶ９と比較してＡＡＶ２で、より大きな腺房細胞感染性が観察されたことを示した。さらに、ＡＡＶ９を注射した涙腺で、延性（ｄｕｃｔｉｌｅ）上皮細胞の形質導入が観察された（図１１）。反復ＡＡＶ注入後のブタ涙腺のヘマトキシリン及びエオシン染色は、炎症性浸潤、萎縮又は浮腫を何ら示さなかった（図１２）。

【0435】

ＡＡＶ２－ｓｅｃＥＧＦＰ又はＡＡＶ９－ｓｅｃＥＧＦＰのいずれかを注射したブタ涙腺は、腺房細胞及び延性上皮細胞においてＥＧＦＰ導入遺伝子産物を発現した。涙腺に発現したＥＧＦＰは涙液層に分泌されることがわかった。さらに、いずれの動物でも、ＡＡＶ２又はＡＡＶ９の反復投与後に、初回注射の間に、低投与量を最初に受けたか、高投与量のＡＡＶを最初に受けたかにかかわらず、安全性シグナル（ｓａｆｅｔｙ ｓｉｇｎａｌｓ）も炎症性浸潤も観察されなかった。この研究の結果は、涙腺の腺房細胞が、涙液層を改変及び／又は濃縮する遺伝子療法アプローチの標的であることを示す。

【0436】

実施例４．形質導入後のブタ涙液におけるヒト神経成長因子βタンパク質の検出
アデノ随伴ウイルス血清型２（ｎ＝４）、５（ｎ＝４）、及び９（ｎ＝４）ベクターを利用し、ヒト神経成長因子（ＡＡＶ－ｈＮＧＦβ）をコードするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の単回投与（２ｅ１１ｖｇ／ｍＬ）を用いた（涙腺内注射による）涙腺の形質導入の７（７）、１４（１４）、２１（２１）、２８（２８）、及び３５（３５）日後に１２頭のブタ（スース・スクローファ・ドメスティクス（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））から涙液を採取した。涙液試料の採取は、７、１４、２１、２８、及び３５日目に、麻酔をかけた動物の右目（ＯＤ）と左目（ＯＳ）の両方の下眼瞼の下にそれぞれ約１２０秒間入れたシルマー涙液試験ストリップを用いて行った。２２～２７日目に、０．０３ｍｇのバレニクリン溶液を１日２回（ＢＩＤ）各鼻孔に投与した。２８日目の涙液採取では、０．０３ｍｇのバレニクリン溶液を、涙液採取の２分前に点鼻ポンプを介して各鼻孔に投与した。すべての採取日において、シルマー涙液試験ストリップを液体移動ライン（ｆｌｕｉｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｌｉｎｅ）のすぐ上で切り、試験ストリップの液体飽和部分を直ちに氷上のマイクロ遠心分離器に入れた。ドライアイス上で検査施設（ｔｅｓｔｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔｙ）に送る前に、採取した試料を－２０℃で保存した。

【0437】

左眼のシルマー涙液試験ストリップからタンパク質を抽出し、ヒト神経成長因子タンパク質（ｈＮＧＦβ）を検出するメソスケールディスカバリーアッセイを各試料に対して行った。ヒトＮＧＦのＭＳＤアッセイの標準曲線の最小値と最大値は、それぞれ０．１０４～４２７ｐｇ／ｍＬであった。（配列番号２５の発現カセットを含む；図１４に示される）の導入は、涙液中にｈＮＦＧβを生じた（それぞれ図１３Ａ～１３Ｃ）。ＡＡＶ９－ｈＮＧＦβ形質導入は、検出のために試料を１６～１２８倍に希釈しなければならないほど高い発現を生じた（表１２）。希釈試験から得られたＡＡＶ９－ｈＮＧＦβ形質導入ブタのｈＮＧＦβの涙液層レベルの平均計算値は５，６１２．８４ｐｇ／ｍＬである。様々なタンパク質をコードするＡＡＶベクターを利用した過去の研究から集めたｈＮＧＦ ＭＳＤデータに基づいて、ｈＮＧＦβは非形質導入ブタ涙液層で検出されなかったことに留意すべきである。したがって、シルマーストリップ涙液試料の抽出物から検出されたいずれのｈＮＧＦβタンパク質も、ＭＳＤアッセイの間に容易に同定され、ＡＡＶ‐ｈＮＧＦβコンストラクトによる涙腺の形質導入によるものであった。ＡＡＶ２－ｈＮＧＦβの２１日目に採取した試料（図１３Ａ）には、分析から省いた外れ値（グラブス検定で求めたｐ
＜０．０５）が含まれる。図１３（ｃ）に示されるように、ＡＡＶ９－ｈＮＧＦβについては、７～２８日目の間に有意な減少は認められなかった。さらに、２１日目（点鼻薬なし）、２８日目（点鼻薬投与）、及び３５日目（点鼻薬なし）に採取した、ＡＡＶ９－ｈＮＧＦβを投与した動物の試料間でｈＮＧＦタンパク質レベルを比較した。点鼻薬の投与は、ＡＡＶ投与単独と比較して、点鼻薬を投与した場合に涙液ｈＮＧＦβタンパク質濃度を増加させた（データは示されていない）。

【0438】

まとめると、このデータは、ｈＮＧＦβをコードするアデノウイルス随伴ベクターによるブタ涙腺の形質導入が、検出可能な量のｈＮＧＦβの発現、分泌、及び涙液層への輸送をもたらしたことを示している。発現は涙腺形質導入の７日以内に検出可能であり、発現レベルの有意なばらつきは、用いたＡＡＶ血清型に依存した。ＡＡＶ９は７日以内に最高レベルの発現を示し、ＡＡＶ２は最低レベルを示したが、依然としてヒト神経成長因子βタンパク質の検出に用いた分析アッセイの範囲内であった。涙液中のＡＡＶ２タンパク質レベルは２８日まで着実に増加したが、ＡＡＶ５は最初の７日の後から減少し、１４日目から２８日目で定常状態に達し、３５日目でさらに減少したようである。ＡＡＶ９を形質導入した動物では、７日目に涙液層中に有意なレベルのｈＮＧＦが検出され、それは３５日目まで一定のままであった。

【0439】

【表20】

【0440】

本発明の実施形態が本明細書に示され、説明されているが、当業者であれば、そのような実施形態は例としてのみ提供されていることを理解するであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更及び置換が可能であろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実行する際に使用されうることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を画定し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物は、それにより包含されることが意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図6J】

【図6K】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】