特表2024-516893寛容誘導構築物及び組成物並びに免疫障害の処置のためのそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-17
(54)【発明の名称】寛容誘導構築物及び組成物並びに免疫障害の処置のためのそれらの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240410BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240410BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240410BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240410BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240410BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240410BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240410BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240410BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240410BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240410BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240410BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240410BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240410BHJP
A61K 39/35 20060101ALI20240410BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240410BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20240410BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/62 Z
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61K48/00
A61P37/06
A61K47/68
A61K47/64
A61K39/35
C07K16/00
C07K14/78
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023569667
(86)(22)【出願日】2022-05-10
(85)【翻訳文提出日】2023-12-18
(86)【国際出願番号】 EP2022062629
(87)【国際公開番号】W WO2022238395
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】PA202170226
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(31)【優先権主張番号】PA202170365
(32)【優先日】2021-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512330710
【氏名又は名称】ナイコード セラピューティクス アルメン アクスイェ セルスカプ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(74)【代理人】
【識別番号】100123593
【弁理士】
【氏名又は名称】関根 宣夫
(74)【代理人】
【識別番号】100208225
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 修二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100217179
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 智史
(74)【代理人】
【識別番号】100227592
【弁理士】
【氏名又は名称】孔 詩麒
(72)【発明者】
【氏名】アグネーテ ブルンスビク フレードリクセン
(72)【発明者】
【氏名】ヘイディ ミュルセト
(72)【発明者】
【氏名】アウドゥン トリッゲ ハウゲン ベルサース
(72)【発明者】
【氏名】スティーネ グラヌム
(72)【発明者】
【氏名】ピエール ディラール
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG26
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4B065AA01X
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4C076AA95
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4C085AA03
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4C085DD62
4H045AA10
4H045AA11
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4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA86
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、寛容誘導構築物を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に標的化すること等によって、寛容を誘導するための寛容誘導構築物に関する。更に、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、医薬組成物及び当該寛容誘導構築物を含むキットが開示される。また、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、免疫障害の処置に使用するための、寛容誘導構築物及び組成物も開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
寛容誘導構築物であって、ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
前記抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）多量体タンパク質、例えばｉｉ）で定義される複数のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物。
【請求項2】
前記二量体タンパク質等の前記多量体タンパク質が、それらの接合領域を介して、好ましくはそれらのそれぞれの第１の接合領域を介して及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結された２つのポリペプチド等の複数のポリペプチドからなる、請求項１に記載の寛容誘導構築物。
【請求項3】
前記第１及び第２の接合領域が、柔軟性単位及び結合単位を含む、請求項１又は２に記載の寛容誘導構築物。
【請求項4】
前記第１及び／又は第２の接合領域が、非共有結合単位である結合単位を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項5】
前記非共有結合単位が、Ｔ４フィブリチンのＣ末端ドメイン等の三量体化単位、又は例えばヒトコラーゲン由来ＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン若しくはヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメイン等のコラーゲン由来三量体化単位、又はｐ５３に由来するドメイン等の四量体化単位を含むか、又はそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項6】
前記非共有結合単位が、二量体化単位、例えばヒンジ領域及び免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン定常ドメインを含む二量体化単位若しくはｄＨＬＸタンパク質を含む二量体化単位を含むか、又はそれからなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項7】
前記第１及び／又は第２の接合領域が、共有結合単位である結合単位を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項8】
前記第１及び／若しくは第２の接合領域が、天然に存在する配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項9】
前記第１及び／若しくは第２の接合領域が、人工配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項10】
前記第１及び第２の接合領域が、システイン残基、例えば少なくとも２つのシステイン残基を含む共有結合単位を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項11】
前記共有結合単位が、システインリッチ配列を含む、請求項１０に記載の寛容誘導構築物。
【請求項12】
前記第１の接合領域の前記共有結合単位が、前記第２の接合領域の前記共有結合単位とは異なる数のシステイン残基を含む、請求項１０又は１１に記載の寛容誘導構築物。
【請求項13】
前記第１の接合領域の前記共有結合単位に含まれる前記システイン残基が、前記第２の接合領域の前記共有結合単位に含まれる前記システイン残基とは異なって位置付けられ、例えば、前記第１の接合領域の前記共有結合単位の前記システイン残基間のアミノ酸残基の数が、前記第２の接合領域のものと異なる、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項14】
システイン残基の数が、前記抗原単位の長さに基づく、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項15】
前記共有結合単位のうちの少なくとも１つが、ＩｇＧ３のエクソンｈ４又はＩｇＧ１の中央ヒンジ等の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域等の免疫グロブリンに由来する、請求項７～１４のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項16】
前記共有結合単位のうちの少なくとも１つが、人工配列である、請求項７～１５のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項17】
前記第１及び第２の接合領域が、非共有結合単位を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項18】
前記非共有結合単位のうちの少なくとも１つが、天然に存在する配列である、請求項１７に記載の寛容誘導構築物。
【請求項19】
前記非共有結合単位のうちの少なくとも１つが、人工配列である、請求項１７に記載の寛容誘導構築物。
【請求項20】
前記非共有結合単位が、免疫グロブリンであるか若しくはそれを含むか、又はＩｇＧ３若しくはＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメイン等の免疫グロブリンに由来する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項21】
前記非共有結合単位が、ロイシンジッパーモチーフ、Ｊｕｎ／Ｆｏｓベースのロイシンジッパーであるか若しくはそれを含むか、又は配列番号５のアミノ酸配列等の真核生物転写因子のｂＺＩＰクラスに由来する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項22】
前記接合領域が、共有結合単位及び非共有結合単位を含む結合単位を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項23】
前記柔軟性単位のうちの少なくとも１つが、天然に存在するペプチド配列である、請求項３～２２のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項24】
前記柔軟性単位が、ＩｇＧ３のエクソンｈ１又はＩｇＧ１の下部ヒンジ等の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域等の免疫グロブリンに由来する、請求項３～２３のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項25】
前記柔軟性単位のうちの少なくとも１つが、人工配列である、請求項３～２４のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項26】
前記柔軟性単位が、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）等のグリシン－セリンリンカーである、請求項３～２２及び２５のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項27】
前記柔軟性単位が、プロテアーゼの標的ではない、請求項３～２６のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項28】
前記柔軟性単位が、最大２０アミノ酸、例えば最大１５アミノ酸、例えば１２アミノ酸又は１０アミノ酸からなる、請求項３～２７のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項29】
前記接合領域が、非免疫原性である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項30】
前記第１又は第２の標的化単位のうちの少なくとも１つが、抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分を含み、好ましくは、前記第１及び第２の標的化単位の両方が、前記抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項31】
前記表面分子が、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２又はＴＧＦβＲ３）、ＩＬ１０Ｒ、例えばＩＬ－１０ＲＡ及びＩＬ１０－ＲＢ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１１Ｒ及びＩＬ１３Ｒ、ＩＬ２７Ｒ、ＩＬ３５Ｒ、ＩＬ３７Ｒ、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＣＤ２０５、ＣＤ１０９、ＶＩＳＴＡ、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣＩＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８３、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＧＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ｂ、ＤＣＩＲ２、ランゲリン、ＭＲ、ＤＣ－Ｓｉｇｎ、Ｔｒｅｍｌ４、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、アリール炭化水素受容体及びビタミンＤ受容体からなる群から選択される、請求項３０に記載の寛容誘導構築物。
【請求項32】
前記標的化単位が、天然リガンド、抗体若しくはその一部、例えばｓｃＦｖ、又は合成リガンドである部分を含む、請求項３１に記載の寛容誘導構築物。
【請求項33】
前記天然リガンドが、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ２７、ＩＬ３５、ＩＬ３７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４としても知られる細胞間接着分子１）、ケラチン、ＶＳＩＧ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＴＬＡ－４、好ましくはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１の細胞外ドメイン、好ましくはＰＤ－１及びＢＴＬＡの細胞外ドメイン、好ましくはＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択される、請求項３３に記載の寛容誘導構築物。
【請求項34】
前記第１及び前記第２の標的化単位が同一である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項35】
前記第１及び第２の標的化単位が異なる、請求項１～３３のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項36】
前記表面分子が、同じ細胞上に存在する、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項37】
前記第１又は前記第２の標的化単位の結合が、前記構築物の内在化を引き起こす、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項38】
前記第１の標的化単位が、ＩＬ－１０若しくはＴＧＦβ、好ましくはヒトＩＬ－１０若しくはＴＧＦβ、又はヒトＩＬ－１０若しくはヒトＴＧＦβのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～３７のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項39】
前記構築物が、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含むポリヌクレオチドである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の寛容誘導構築物。
【請求項40】
前記２つのポリペプチド等の前記複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、請求項１～３９のいずれか一項に記載の二量体タンパク質等の多量体タンパク質。
【請求項41】
医薬組成物を調製する方法であって、ｃ）請求項１～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を提供することと、
ｄ）前記ポリヌクレオチド、前記ポリペプチド又は前記二量体タンパク質等の前記多量体タンパク質を、薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法。
【請求項42】
請求項１～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【請求項43】
医薬品として使用するための、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項44】
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態の処置における使用のための、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項45】
請求項１～３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項46】
請求項４５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項47】
ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を調製する方法であって、ａ）請求項４５に記載のベクター又は請求項１～３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）前記細胞を培養することであって、それによって前記細胞が前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）前記二量体タンパク質等の前記多量体タンパク質、及び／又は前記細胞によって発現された前記ポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法。
【請求項48】
ステップｃ）が、前記二量体タンパク質等の前記多量体タンパク質を含有する画分を精製するステップを含み、前記２つのポリペプチド等の複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態を処置するための方法であって、請求項１～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは二量体タンパク質等の多量体タンパク質、請求項４５に記載のベクター又は請求項４２～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項50】
前記対象が、ヒト等の哺乳動物である、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態の処置に使用するための構築物及び組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫応答は、疾患、例えばウイルス、細菌又は寄生虫のような病原体によって引き起こされる疾患に対する保護に必要である。しかし、望ましくない免疫活性化は、自分自身の組織の損傷又は破壊につながるプロセスを引き起こす可能性がある。望ましくない免疫活性化は、例えば、抗体及び／又はＴリンパ球が自己抗原と反応して、例えば組織損傷及び病理をもたらす自己免疫疾患において生じる。望ましくない免疫活性化はアレルギー反応においても生じ、アレルギー反応は、環境からの典型的には無害な物質に対する過度の免疫応答によって特徴付けられ、組織破壊につながる炎症応答をもたらす場合がある。更に、望まない免疫活性化は、移植片拒絶、例えば、宿主に存在する同種反応性Ｔ細胞によって有意に媒介される移植された器官又は組織の拒絶において生じ、Ｔ細胞はドナー同種抗原又は異種抗原を認識する。これは、移植された器官又は組織の破壊をもたらす。
【0003】
免疫寛容は、所与の生物において免疫応答を誘発する能力を有する物質又は組織に対する特異的免疫応答の後天的欠如である。
【0004】
典型的には、特異的抗原に対する寛容を誘導するために、抗原は、活性化シグナルの非存在下で抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって他の免疫細胞に提示されるべきであり、これは、抗原特異的エフェクターリンパ球の死若しくは機能的不活性化、又は寛容を維持する抗原特異的細胞の生成をもたらす。このプロセスは、全般に、自己抗原に対する寛容、又は自己寛容を説明する。免疫抑制薬は、例えば自己免疫疾患又は同種異系移植を有する患者の処置において、望ましくない免疫応答の防止又は低減に有用である。不要な免疫応答の免疫抑制を生じさせるための従来の戦略は、広く作用する免疫抑制薬に基づく。更に、免疫抑制を維持するために、免疫抑制薬療法は、生涯にわたる提案であることが多い。残念ながら、広く作用する免疫抑制薬の使用は、それらの大部分が非選択的に作用し、感染症に対する感受性の増加及び癌免疫監視の低下をもたらすため、免疫不全等の重篤な副作用のリスクを伴う。したがって、寛容抗原特異的を誘導する新しい化合物及び組成物が有益であろう。
【0005】
樹状細胞等の抗原提示細胞は、免疫応答の調節において重要な役割を果たし、樹状細胞の活性化状態及び微小環境（サイトカイン及び増殖因子）に応じて、抗原特異的Ｔ細胞シグナルを与えて、提示された抗原（推定病原体）と戦うか、又は提示された抗原（推定非病原性抗原）に対する反応をサイレンシングし、末梢寛容を誘導するかのいずれかである。寛容原性免疫療法の開発における課題は、炎症性免疫応答を誘因しない様式で、抗原をＡＰＣ／樹状細胞に効率的に送達することである。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、抗原単位と、樹状細胞等の抗原提示細胞上の表面分子と非炎症性又は寛容原性の様式で相互作用する第１及び第２の標的化単位と、を含み、炎症性活性化状態の非存在下で抗原の提示をもたらす、寛容誘導構築物に関する。
【0007】
本発明者らは、驚くべきことに、本開示の構築物が、構築物を内在化し、寛容を誘導する様式、例えば、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導並びにメモリー及びエフェクターＴ細胞応答の抑制で抗原を提示するＡＰＣ上の選択された表面受容体への結合及びそれを通したシグナル伝達を通して、選定された抗原特異的寛容原性応答の誘導に最適な方法で、疾患関連抗原を最適な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達できることを見出した。
【0008】
したがって、第１の態様では、本開示は、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
【0009】
別の態様では、本開示は、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
【0010】
したがって、別の態様では、本開示は、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
【0011】
複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、本明細書に記載の二量体タンパク質等の多量体タンパク質も本明細書で提供される。
【0012】
複数のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、本明細書に記載の多量体タンパク質も本明細書で提供される。
【0013】
２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、本明細書に記載の二量体タンパク質も本明細書において提供される。
【0014】
更なる態様では、本開示は、医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を、薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を、薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法を提供する。
【0015】
更なる態様では、本開示は、医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質を薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質を薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法を提供する。
【0016】
更なる態様では、本開示は、医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法を提供する。
【0017】
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドと、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【0018】
本明細書に記載のポリヌクレオチドと、ポリペプチド又は多量体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物も本明細書で提供される。
【0019】
本明細書に記載のポリヌクレオチドと、ポリペプチド又は二量体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物も本明細書で提供される。
【0020】
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0021】
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0022】
更なる態様では、本開示は、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を調製する方法であって、
ａ）本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）二量体タンパク質等の多量体タンパク質、及び／又は細胞によって発現されたポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）二量体タンパク質等の多量体タンパク質、及び／又は細胞によって発現されたポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法を提供する。
【0023】
更なる態様では、本開示は、ポリペプチド又は多量体タンパク質を調製する方法であって、
ａ）本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された多量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された多量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法を提供する。
【0024】
更なる態様では、本開示は、ポリペプチド又は二量体タンパク質を調製する方法であって、
ａ）本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された二量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法を提供する。
ａ）本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された二量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法を提供する。
【0025】
更なる態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態を処置するための方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは二量体タンパク質等の多量体タンパク質、本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0026】
更なる態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態を処置するための方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは多量体タンパク質、本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0027】
更なる態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態を処置するための方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは二量体タンパク質、本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】本開示による免疫療法構築物の概略図を示す。
【0029】
上の図は、ポリペプチドとしての構築物の実施形態を示す。下の図は、それぞれの第１及び第２の接合領域を介して連結された２つのポリペプチドによって形成された二量体タンパク質の実施形態を示す。
【0030】
Ａは、第１の標的化単位を示す。
Ｂは、第２の標的化単位を示す。
Ｃは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原単位を示す。
Ｄは、柔軟性単位の存在により標的化単位に与えられた柔軟性を示す。
Ａ．Ａは、第１の接合領域を示す。
Ｂ．Ａは、第２の接合領域を示す。
Ｂは、第２の標的化単位を示す。
Ｃは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原単位を示す。
Ｄは、柔軟性単位の存在により標的化単位に与えられた柔軟性を示す。
Ａ．Ａは、第１の接合領域を示す。
Ｂ．Ａは、第２の接合領域を示す。
【0031】
【図2】図は、接合領域の実施形態を示す。
【0032】
Ａは、２つのポリペプチド鎖の各々に含まれる共有結合単位の間に形成される３つの共有結合を示す。
【0033】
Ｂは、図１の矢印Ｄによって示されるように、柔軟性単位が結合単位と標的化単位との間にどのように位置し、標的化単位に柔軟性を提供するかを示す。
【0034】
【図3】図は、接合領域の別の実施形態を示す。
【0035】
Ａは、ポリペプチドの各々に含まれる非共有結合単位間の疎水性相互作用による２つのポリペプチド鎖の二量体化を示す。
【0036】
Ｂは、図１の矢印Ｄによって示されるように、柔軟性単位が結合単位と標的化単位との間にどのように位置し、標的化に柔軟性を提供するかを示す。
【0037】
【図4】図は、トランスフェクトされた細胞の上清におけるサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、検出抗体：ヤギ抗ネズミＩＬ－１０ビオチン化抗体、０．８μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出された、本開示のＭＯＧ及びＩＬ－１０コード寛容誘導構築物の発現及び分泌レベルを示す。
【0038】
Ａ）は、ＤＮＡベクターＶＢ５０４２、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０７２、ＶＢ５０７３、ＶＢ５０７４、及びＶＢ５０７５で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの結果を示す。
【0039】
Ｂ）は、ＤＮＡベクターＶＢ５０３８で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの結果を示す。
【0040】
全てのＭＯＧ及び ＩＬ－１０末端コード構築物は、高度に発現され、分泌された。（Ａ）の陰性対照は、トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清であり、（Ｂ）の陰性対照は、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＨＥＫ２９３細胞からの上清である。
【0041】
【図5】図は、ＤＮＡベクターＶＢ５０６７で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、検出抗体：ヤギ抗ネズミＣＴＬＡ－４ビオチン化抗体、０．８μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ４７６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出された、第２の標的化単位としてＣＴＬＡ－４を有するＭＯＧコード構築物（ＶＢ５０６７）のタンパク質発現及び分泌レベルを示す。陰性対照は、トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清である。
【0042】
【図6】図は、ＤＮＡベクターＶＢ５０７２及びＶＢ５０７３で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、検出抗体：ヤギ抗ＳＣＧＢ３Ａ２ビオチン化抗体、３．３μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ３４６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）による、第１の標的化単位としてのＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２並びに第２の標的化単位としてのＩＬ－１０（ＶＢ５０７２及びＶＢ５０７３）を有するＭＯＧコード構築物寛容誘導構築物のタンパク質発現及び分泌レベルを示す。陰性対照は、トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清である。
【0043】
【図7】図は、第１の標的化単位としてのＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２並びに第２の標的化単位としてのＩＬ－１０（ＶＢ５０７２及びＶＢ５０７３）を有するＭＯＧコード寛容誘導構築物が、ＤＮＡベクターＶＢ５０７２及びＶＢ５０７３で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：マウス抗マウスＩＬ－１０抗体、２μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、検出抗体：ヤギ抗マウスＳＣＧＢ３Ａ２、３．３μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ ３４６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって全長融合タンパク質として分泌されたことを示す。陰性対照は、トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清である。
【0044】
【図8】図は、ＤＮＡベクターＶＢ ５０３８で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清を用いた直接ＥＬＩＳＡによる、ｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５コード構築物のＤＥＣ２０５受容体への結合及び全長タンパク質の分泌を示す。ＥＬＩＳＡウェルを組換えＤＥＣ２０５受容体（ａａ ２１６～５０３）でコーティングし、ＭＯＧ又はネズミＩＬ－１０に対する抗体によって結合を検出した。陰性対照、すなわちトランスフェクション試薬リポフェクタミンで処理したＨＥＫ２９３細胞からの上清からのＯＤ４５０ｎｍシグナルを、グラフ化の前に差し引いた。
【0045】
【図9】図は、ＤＮＡベクターＶＢ５０３８で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清を用いた直接ＥＬＩＳＡによる、ＩＬ－１０含有構築物のＩＬ－１０受容体への結合を示す。ＥＬＩＳＡウェルを組換えＩＬ－１０受容体でコーティングし、結合をＭＯＧに対する抗体によって検出した。陰性対照、すなわちトランスフェクション試薬リポフェクタミンで処理したＨＥＫ２９３細胞からの上清からのＯＤ４５０ｎｍシグナルを、グラフ化の前に差し引いた。
【0046】
【図10】図は、ＤＮＡベクターＶＢ５０５１で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を用いた直接ＥＬＩＳＡ（検出抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、３．３μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によるＭＯＧ（２７～６３）ペプチドの分泌を示す。陰性対照は、トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清である。
【図11】Ａ．ＣＣＬ ３Ｌ１含有ベクターＶＢ５０５２で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：マウス抗ＭＯＧ抗体、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、検出抗体：ヤギ抗ヒトＣＣＬ ３ビオチン抗体、０．２μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出された、ＤＮＡベクターＶＢ５０５２によってコードされる炎症促進性対照構築物の発現及び分泌レベルを示す。融合タンパク質のＭＯＧ及びＣＣＬ３Ｌ１部分の両方の検出は、融合タンパク質の完全長分泌を示す。陰性対照は、トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清である。
【0047】
Ｂ．ＣＣＬ３Ｌ１含有ベクターＶＢ５００２ｂで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体：マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ３ドメイン）、１μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、１５３２７２、Ｂｉｏｒａｄ、検出抗体：ヤギ抗ヒトＣＣＬ３ビオチン抗体、０．２μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出された、ＤＮＡベクターＶＢ５００２ｂによってコードされる炎症促進性対照構築物の発現及び分泌レベルを示す。陰性対照は、トランスフェクション試薬リポフェクタミンのみで処理したＨＥＫ２９３細胞からの上清である。
【0048】
【図12】Ａ．は、ＶＢ５０３８によってコードされる寛容誘導タンパク質及びＶＢ５００２ｂによってコードされる炎症促進性対照の完全長分泌を用いたウェスタンブロットを示す。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの還元された上清試料（１０μＬをロード）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ８００。
【0049】
Ｂは、抗ネズミＩＬ－１０抗体で検出された、還元及び非還元条件下でのＶＢ５０３８によってコードされるタンパク質のウェスタンブロットを示す。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの還元された上清試料を左に示し、還元されていない上清試料を右に示す（１０μＬをロード）。一次抗体：ラット抗ネズミＩＬ１０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（ＳＡ５－１００６）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ４８８。特異的バンドが、非還元条件下でホモ二量体タンパク質に対応するサイズで検出された（黒い矢じりによって示される）。
【0050】
Ｃ．は、抗ＭＯＧ抗体によって検出された、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２及びＶＢ５０５０によってコードされるタンパク質の完全長分泌を用いたウェスタンブロットを示す（黒い矢じり）。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの還元された上清試料（３０μＬをロード）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び８００。
【0051】
Ｄは、抗ネズミＩＬ－１０抗体によって検出された、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２及びＶＢ５０５０によってコードされるタンパク質の完全長分泌を用いたウェスタンブロットを示す（黒い矢印）。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの還元された上清試料（３０μＬをロード）。一次抗体：ラット抗ネズミＩＬ１０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（ＳＡ５－１００２９）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０。
【0052】
Ｅ．は、タンパク質が非還元条件下で二量体化することを示す、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２及びＶＢ５０５０によってコードされるタンパク質のウェスタンブロットを示す（黒い矢じり）。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの非還元上清試料（３０μｌをロード）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ＳＣ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び８００。
【0053】
Ｆ．は、抗ＭＯＧによって検出された、ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５によってコードされる第１の標的化単位としてＶＳＩＧ－３を有するタンパク質の完全長分泌を用いたウェスタンブロットを示す。ＶＢ５０４２を陽性対照として含めた。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの還元された上清試料（２５μＬをロード）。一次抗体：マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０）。二次抗体：ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ ８００（ＳＡ５－１０１７２）。タンパク質標準をＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０において検出した（シグナルは示さず）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ８００。
【0054】
Ｇ．は、抗ネズミＩＬ－１０抗体によって検出された、ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５によってコードされる第１の標的化単位としてＶＳＩＧ－３を有するタンパク質の全長分泌を用いたウェスタンブロットを示す。ＶＢ５０４２を陽性対照として含めた。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの還元された上清試料（２５μＬをロード）。一次抗体：ラット抗ＩＬ １０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（ＳＡ５－１００２６）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（タンパク質標準用）及び４８８。
【0055】
【図13】図は、二色ＩＬ－１０／ＩＦＮγ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μｇの示されたＤＮＡベクターを１回（０日目）ワクチン接種し、ワクチン接種後７日目に脾臓を採取した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝５マウス／群）。＊＊（ｐ＜０．０１）、両側マン－ホイットニー検定。構築物ＩＤ番号をｘ軸上に示す。
【0056】
Ａ．は、ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌について試験したマウスの脾細胞（ＳＦＵ／１０６脾細胞）を、刺激していない脾細胞について二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて示す。
【0057】
Ｂ．は、ＭＯＧ（３５～５５）ペプチドで４４時間再刺激した後に、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いてＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌について試験したマウスの脾細胞（ＳＦＵ／１０６脾細胞）を示す。
【0058】
Ｃ．は、ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が、ＭＯＧ（３５～５５）再刺激脾細胞からの（Ｂ）のデータからプロットされることを示す。個々のマウス及び平均±範囲を示す。＊＊（ｐ＜０．０１）、両側マン－ホイットニー検定。
【0059】
【図14】図は、ＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞の検出を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μｇの示されたＤＮＡベクターを１回（０日目）ワクチン接種し、ワクチン接種後７日目に脾臓を採取した。Ｈ－２ Ｉａｂ／ＭＯＧ（３８～４９）四量体によって検出された脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージ。四量体染色をエクスビボで実行し、脾細胞をＭＯＧ（３５～５５）ペプチドで再刺激しなかった。データは、１群当たり５匹のマウスのプールから生成する（分析前に脾臓をプールした）。構築物ＩＤ番号をｘ軸上に示す。
【0060】
【図15】図は、二色ＩＬ－１０／ＩＦＮγ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μｇの示されたＤＮＡベクターを１回（０日目）ワクチン接種し、ワクチン接種後７日目に脾臓を採取した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝５マウス／群）。＊＊（ｐ＜０．０１）、両側マン－ホイットニー検定。構築物ＩＤ番号をｘ軸上に示す。
【0061】
Ａ．は、ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌について試験したマウスの脾細胞（ＳＦＵ／１０６脾細胞）を、刺激していない脾細胞について二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて示す。
【0062】
Ｂ．は、ＭＯＧ（３５～５５）ペプチドで４４時間再刺激した後に、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いてＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌について試験したマウスの脾細胞（ＳＦＵ／１０６脾細胞）を示す。
【0063】
Ｃ．は、ＭＯＧ（３５～５５）再刺激脾細胞からの（Ｂ）のデータからプロットしたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を示す。個々のマウス及び平均±範囲を示す。＊＊（ｐ＜０．０１）、両側マン－ホイットニー検定。
【0064】
【図16】図は、ＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞の検出を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μｇの示されたＤＮＡベクターを１回（０日目）ワクチン接種し、ワクチン接種後７日目に脾臓を採取した。Ｈ－２ Ｉａｂ／ＭＯＧ（３８～４９）四量体によって検出された脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージ。四量体染色をエクスビボで実行し、脾細胞をＭＯＧ（３５～５５）ペプチドで再刺激しなかった。データは、１群当たり５匹のマウスのプールから生成する（分析前に脾臓をプールした）。構築物ＩＤ番号をｘ軸上に示す。
【0065】
【図17】図は、二色ＩＬ－１０／ＩＦＮγ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μｇの示されたＤＮＡベクターを１回（０日目）ワクチン接種し、ワクチン接種後７日目に脾臓を採取した。個々のマウス及び平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝５マウス／群）。＊＊（ｐ＜０．０１）、両側マン－ホイットニー検定。構築物ＩＤ番号をｘ軸上に示す。
【0066】
Ａ．は、ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌について試験したマウスの脾細胞（ＳＦＵ／１０６脾細胞）を、刺激していない脾細胞について二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いて示す。
【0067】
Ｂ．は、ＭＯＧ（３５～５５）ペプチドで４４時間再刺激した後に、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いてＩＬ－１０及びＩＦＮ－γ分泌について試験したマウスの脾細胞（ＳＦＵ／１０６脾細胞）を示す。
【0068】
Ｃ．は、ＭＯＧ（３５～５５）再刺激脾細胞からの（Ｂ）のデータからプロットしたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を示す。個々のマウス及び平均±範囲を示す。＊（ｐ＜０．０５）、両側マン－ホイットニー検定。
【0069】
【図18】図は、ＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞の検出を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５０μｇの示されたＤＮＡベクターを１回（０日目）ワクチン接種し、ワクチン接種後７日目に脾臓を採取した。Ｈ－２ Ｉａｂ／ＭＯＧ（３８～４９）四量体によって検出された脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の頻度。四量体染色をエクスビボで実行し、脾細胞をＭＯＧ（３５～５５）ペプチドで再刺激しなかった。データは、１群当たり５匹のマウスのプールから生成する（分析前に脾臓をプールした）。構築物ＩＤ番号をｘ軸上に示す。
【0070】
【図19】図は、第２の標的化単位としてＩＬ－１０、ＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８を有するＭｅｔ ｅ １含有寛容誘導構築物の発現及び分泌レベルを示す。ＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清を有するサンドイッチＥＬＩＳＡ：捕捉抗体：抗ネズミＩＬ－１０抗体（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、検出抗体：抗ネズミＩＬ－１０ビオチン化抗体（ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。両方のＭｅｔ ｅ １含有構築物が高度に発現され、分泌された。陰性対照は、トランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅのみで処理したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清である。
【0071】
【図20】図は、Ｍｅｔ ｅ １含有ＤＮＡベクターＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８によってコードされるタンパク質の完全長分泌を用いたウェスタンブロットを示す（黒い矢じり）。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの還元された上清試料（３５μＬをロード）。一次抗体：ラット抗ＩＬ１０（ＭＡＢ４１７）。二次抗体：ロバ抗ラット、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（ＳＡ５－１００２９）。ＣｈｅｍｉｄｏｃチャネルＤｙｌｉｇｈｔ ６５０。
【発明を実施するための形態】
【0072】
第１の態様では、本開示は、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
【0073】
別の態様では、本開示は、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
【0074】
別の態様では、本開示は、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物を提供する。
【0075】
そのような構築物は、対象に投与されると、寛容を誘導する様式で抗原単位におけるエピトープの提示を可能にし、したがって、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶等の免疫疾患の予防的又は治療的処置としての使用に好適である。
【0076】
寛容誘導構築物は、問題の免疫疾患を引き起こす免疫系の疾患特異的細胞の下方制御を引き起こすので、全身免疫系を抑制しない。したがって、本開示の構築物による問題の免疫疾患の処置は、感染に対する感受性の増加及び癌免疫監視の減少をもたらさない。しかしながら、関連疾患抗原に特異的な免疫細胞のバイスタンダー抑制は、誘導された抗原特異的調節細胞との細胞間接触による短距離阻害性サイトカインの放出によると予想される。
【0077】
本開示の寛容誘導構築物は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶等の免疫疾患の予防的又は治療的処置における使用のための、本開示の構築物と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物の形態で投与されてもよい。
【0078】
「寛容誘導構築物」は、投与に好適な形態及び寛容を誘導するのに有効な量（すなわち、有効量）で対象に投与された場合に、炎症性免疫応答を誘発せず、むしろ抗原単位に含まれるＴ細胞エピトープに対する寛容を誘導するものである。
【0079】
本明細書で使用される「寛容」という用語は、自己抗原、アレルゲン又は同種抗原のような無害な抗原に対する炎症性免疫応答のレベルの低下、炎症性免疫応答の発症若しくは進行の遅延、及び／又は炎症性免疫応答の発症若しくは進行のリスクの低下を指す。
【0080】
「対象」は、動物、例えばマウス、又はヒト、好ましくはヒトである。対象は、治療的処置を必要とする患者、すなわち自己免疫疾患、アレルギー若しくは移植片拒絶のような免疫疾患に罹患しているヒトであってもよく、又は予防的処置を必要とする対象若しくは免疫疾患を有することが疑われる対象であってもよい。「対象」及び「個体」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【0081】
「疾患」は、疾患に罹患している対象における特定の徴候及び症状に典型的に関連する異常な医学的状態である。本明細書で使用される「免疫疾患」は、自己免疫疾患、アレルギー又は移植片拒絶、すなわち、宿主に移植された同じ（同種）又は異なる（異種）種由来の細胞、組織又は器官の宿主による拒絶等の同種移植片又は異種移植片の拒絶を含む、望まない免疫反応を伴う状態、障害又は疾患を指す。
【0082】
本明細書で使用される「同種抗原／アロ抗原」又は「同種移植抗原」という用語は、ドナーからレシピエントに移された場合に、レシピエントのＢ又はＴ細胞受容体の抗体によって認識及び結合され得る、細胞又は組織に由来する（そこから脱落した、及び／若しくはそこに存在する）抗原を指す。アロ抗原は、典型的には多型遺伝子の産物である。アロ抗原は、ドナーとレシピエント（同じ種に属する）との間で比較した場合に、わずかな構造的差異を示すタンパク質又はペプチドである。レシピエントの体内にそのようなドナー抗原が存在すると、レシピエントにおいて炎症性免疫応答を誘発することがある。そのようなアロ反応性免疫応答は、アロ抗原に特異的である。
【0083】
本明細書で使用される「異種抗原」という用語は、異なる種の個体に由来する抗原を指す。
【0084】
「処置」は、予防的処置又は治療的処置である。
【0085】
「予防的処置」は、免疫疾患の徴候若しくは症状を示さないか、又は免疫疾患の初期徴候若しくは症状のみを示す対象に施される処置であり、その結果、処置は、免疫疾患を防止するか、又は少なくともその発症リスクを減少させる目的のために施される。予防的処置は、免疫疾患に対する防止的処置として、又は免疫疾患及び／若しくはその関連症状の更なる発症若しくは増強を阻害若しくは低減する処置として機能する。「予防的処置」、「予防」及び「防止」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【0086】
「治療的処置」は、免疫疾患の症状又は徴候を示す対象に施される処置であり、処置は、それらの徴候若しくは症状を軽減若しくは排除する目的で、又は疾患の進行を遅延若しくは停止させる目的で対象に施される。
【0087】
「部分／一部」は、抗原の一部／断片、すなわち抗原のアミノ酸配列の一部／断片、又はそれをコードするヌクレオチド配列、例えばエピトープを指し；好ましくは、抗原の一部又は断片は、免疫原性である。これらの用語は、全体を通して互換的に使用される。
【0088】
本明細書で使用される「Ｔ細胞エピトープ」は、単一のＴ細胞エピトープ、又は複数のＴ細胞エピトープ、例えば複数の最小エピトープを含有する抗原の一部若しくは領域を指す。
【0089】
「最小エピトープ」という用語は、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに結合すると予測されるエピトープの部分配列を指す。言い換えれば、最小エピトープは、免疫原性であってもよく、すなわち、免疫応答を誘発することができる。したがって、最小エピトープという用語は、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに結合すると予測されるエピトープの短い部分配列を指す場合がある。したがって、２７ｍｅｒエピトープは、各々が２７のアミノ酸よりも短い長さを有し得、各々が免疫原性であるいくつかの最小エピトープを包含してもよい。例えば、最小エピトープは、それがＭＨＣ Ｉ若しくはＭＨＣ ＩＩに結合すると予測される限り、エピトープの最初の１４アミノ酸からなり得るか、又はこれらの配列がＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに結合すると予測される限り、それは、エピトープのアミノ酸９～１８若しくはアミノ酸７～２２からなり得る。
【0090】
「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチドからなる配列である。「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【0091】
「マウス」及び「ネズミ」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【0092】
「ワクチン接種」及び「投与」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【0093】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0094】
寛容誘導構築物
構築物のいくつかの実施形態の構造は、ポリペプチドと、それらのそれぞれの第１及び第２の接合領域を介して連結された２つのポリペプチドによって形成された二量体タンパク質とに基づいて、図１～図３に示される。ポリペプチド（図１、上）は、指定された順序で、第１の標的化単位（Ａ）、第１の接合領域（Ａ．Ａ）、本明細書に記載される抗原単位（Ｃ）、第２の接合領域（Ｂ．Ａ）及び第２の標的化単位（Ｂ）を含む。図１の下部は、第２の接合領域に含まれる柔軟性単位が第２の標的化単位に柔軟性をどのように提供するかを示す（矢印Ｄ）。
構築物のいくつかの実施形態の構造は、ポリペプチドと、それらのそれぞれの第１及び第２の接合領域を介して連結された２つのポリペプチドによって形成された二量体タンパク質とに基づいて、図１～図３に示される。ポリペプチド（図１、上）は、指定された順序で、第１の標的化単位（Ａ）、第１の接合領域（Ａ．Ａ）、本明細書に記載される抗原単位（Ｃ）、第２の接合領域（Ｂ．Ａ）及び第２の標的化単位（Ｂ）を含む。図１の下部は、第２の接合領域に含まれる柔軟性単位が第２の標的化単位に柔軟性をどのように提供するかを示す（矢印Ｄ）。
【0095】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び二量体タンパク質等の多量体タンパク質は、それらのそれぞれの第１及び第２の接合領域を介して連結された複数のポリペプチドによって形成される。ポリペプチドは、指定された順序で、第１の標的化単位、第１の接合領域、本明細書に記載の抗原単位、第２の接合領域及び第２の標的化単位を含む。第２の接合領域に含まれる柔軟性単位は、第２の標的化単位に柔軟性を提供する。
【0096】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び多量体タンパク質は、それらのそれぞれの第１及び第２の接合領域を介して連結された複数のポリペプチドによって形成される。ポリペプチドは、指定された順序で、第１の標的化単位、第１の接合領域、本明細書に記載の抗原単位、第２の接合領域及び第２の標的化単位を含む。第２の接合領域に含まれる柔軟性単位は、第２の標的化単位に柔軟性を提供する。
【0097】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び二量体タンパク質は、それぞれの第１及び第２の接合領域を介して連結された２つのポリペプチドによって形成される。ポリペプチドは、指定された順序で、第１の標的化単位、第１の接合領域、本明細書に記載の抗原単位、第２の接合領域及び第２の標的化単位を含む。第２の接合領域に含まれる柔軟性単位は、第２の標的化単位に柔軟性を提供する。
【0098】
以下の開示において、構築物の様々な単位が詳細に考察される。それらは、単位をコードする核酸配列としてポリヌクレオチドに含まれる一方で、アミノ酸配列としてポリペプチド又は多量体／二量体タンパク質に含まれる。読みやすさのために、以下の開示において、構築物の単位は、主にポリペプチド又は多量体／二量体タンパク質に関して、すなわち、それらのアミノ酸配列に基づいて説明される。
【0099】
接合領域
本開示のポリペプチドは、第１の接合領域及び第２の接合領域を含む。第１の接合領域及び第２の接合領域は、以下のいずれの領域であってもよい。
本開示のポリペプチドは、第１の接合領域及び第２の接合領域を含む。第１の接合領域及び第２の接合領域は、以下のいずれの領域であってもよい。
【0100】
第１の接合領域は、本明細書に記載の第１の標的化単位と本明細書に記載の抗原単位との間に位置する。
【0101】
いくつかの実施形態では、第２の接合領域は、本明細書に記載される抗原単位と本明細書に記載される第２の標的化単位との間に位置する。
【0102】
いくつかの実施形態では、本開示の二量体タンパク質等の多量体タンパク質は、複数のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドがそれらの接合領域を介して互いに連結されているものである。他の実施形態では、本開示の二量体タンパク質等の多量体タンパク質は、２つのポリペプチド等の複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されているものである。
【0103】
いくつかの実施形態では、本開示の多量体タンパク質は、複数のポリペプチドがそれらの接合領域を介して互いに連結されているものである。他の実施形態では、本開示の多量体タンパク質は、複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されているものである。
【0104】
いくつかの実施形態では、本開示の二量体タンパク質は、２つのポリペプチドがそれらの接合領域を介して互いに連結されているものである。他の実施形態では、本開示の二量体タンパク質は、２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されているものである。
【0105】
本明細書で使用される「接合領域」という用語は、抗原単位と標的化単位との間のアミノ酸配列を指す。複数のポリペプチドを接合することができる（多量体タンパク質に関する実施形態の場合）、例えば、２つのポリペプチドを接合することができる（二量体タンパク質に関する実施形態の場合）が、同時に、多量体又は二量体タンパク質に柔軟性及び適切なタンパク質立体構造を提供する、任意のアミノ酸配列が、好適な接合領域である。
【0106】
接合領域は、二量体タンパク質等の多量体タンパク質に柔軟性を提供し、その結果、標的化単位は、ＡＰＣ上の表面分子と、例えば同じＡＰＣ上の表面分子と、それらが可変距離に位置する場合であっても相互作用することができる。更に、接合領域は、複数の単量体ポリペプチドを接合して、二量体タンパク質等の多量体タンパク質にする。これらの要件のうちの１つ以上を満たす任意のアミノ酸配列が、好適な接合領域である。
【0107】
接合領域は、多量体タンパク質に柔軟性を提供し、その結果、標的化単位は、ＡＰＣ上の表面分子と、例えば、同じＡＰＣ上の表面分子と、それらが可変距離に位置する場合であっても相互作用することができる。更に、接合領域は、複数の単量体ポリペプチドを接合して多量体タンパク質にする。これらの要件のうちの１つ以上を満たす任意のアミノ酸配列が、好適な接合領域である。
【0108】
接合領域は、二量体タンパク質に柔軟性を提供し、その結果、標的化単位は、ＡＰＣ上の表面分子と、例えば同じＡＰＣ上の表面分子と、それらが可変距離に位置する場合であっても相互作用することができる。更に、接合領域は、２つの単量体ポリペプチドを接合して二量体タンパク質にする。これらの要件のうちの１つ以上を満たす任意のアミノ酸配列が、好適な接合領域である。
【0109】
好ましくは、接合領域は、柔軟性を提供する柔軟性単位、及び２つのポリペプチド等の複数のポリペプチドを接合して二量体等の多量体を形成する結合単位を含む。好ましい実施形態では、接合領域に含まれる柔軟性単位は標的化単位に最も近く、結合単位は抗原単位に最も近い。他の実施形態では、接合領域は、柔軟性を提供する柔軟性単位、及び複数のポリペプチドを接合して多量体タンパク質を形成する結合単位を含む。
【0110】
好ましくは、接合領域は、柔軟性を提供する柔軟性単位、及び複数のポリペプチドを接合して多量体を形成する結合単位を含む。好ましい実施形態では、接合領域に含まれる柔軟性単位は標的化単位に最も近く、結合単位は抗原単位に最も近い。他の実施形態では、接合領域は、柔軟性を提供する柔軟性単位、及び複数のポリペプチドを接合して多量体タンパク質を形成する結合単位を含む。好ましくは、接合領域は、柔軟性を提供する柔軟性単位、及び２つのポリペプチドを接合して二量体を形成する結合単位を含む。好ましい実施形態では、接合領域に含まれる柔軟性単位は標的化単位に最も近く、結合単位は抗原単位に最も近い。他の実施形態では、接合領域は、柔軟性を提供する柔軟性単位、及び２つのポリペプチドを接合して二量体タンパク質を形成する結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の接合領域の結合単位は異なる。
【0111】
いくつかの実施形態では、１つのポリペプチド分子の第１の接合領域に含まれる結合単位は、別のポリペプチド分子の第１の接合領域に含まれる結合単位に結合することができ、それによって、複数の分子は、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して連結される。同様に、１つのポリペプチド分子の第２の接合領域に含まれる結合単位は、別のポリペプチド分子の第２の接合領域に含まれる結合単位に結合することができ、それによって、複数の分子は、それらのそれぞれの第２の接合領域を介して連結される。したがって、複数のポリペプチド分子は、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されることによって、二量体タンパク質等の多量体タンパク質を形成する。
【0112】
いくつかの実施形態では、１つのポリペプチド分子の第１の接合領域に含まれる結合単位は、別のポリペプチド分子の第１の接合領域に含まれる結合単位に結合することができ、それによって、複数の分子は、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して連結される。同様に、１つのポリペプチド分子の第２の接合領域に含まれる結合単位は、別のポリペプチド分子の第２の接合領域に含まれる結合単位に結合することができ、それによって、複数の分子は、それらのそれぞれの第２の接合領域を介して連結される。したがって、複数のポリペプチド分子は、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されることによって多量体タンパク質を形成する。
【0113】
したがって、いくつかの実施形態では、１つのポリペプチド分子の第１の接合領域に含まれる結合単位は、別のポリペプチド分子の第１の接合領域に含まれる結合単位に結合することができ、それによって、２つの分子は、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して連結される。同様に、１つのポリペプチド分子の第２の接合領域に含まれる結合単位は、別のポリペプチド分子の第２の接合領域に含まれる結合単位に結合することができ、それによって、２つの分子は、それらのそれぞれの第２の接合領域を介して連結される。したがって、２つのポリペプチド分子は、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されることによって二量体タンパク質を形成する。
【0114】
他の実施形態では、第１の接合領域及び第２の接合領域は、同じである。
【0115】
したがって、いくつかの実施形態では、１つのポリペプチド分子の第１の接合領域に含まれる結合単位は、別のポリペプチド分子の第１の接合領域又は第２の接合領域のいずれかに含まれる結合単位に結合することができる。同じことが、第２の接合領域に含まれる結合単位にも当てはまる。
【0116】
第１及び第２の接合領域が同じである場合、第１及び第２の標的化単位のいずれかが異なるが、ＡＰＣ上の同じ表面分子と相互作用すること、又は第１及び第２の標的化単位は同一であることが好ましい。
【0117】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の接合領域のアミノ酸配列は、少なくとも１つの天然に存在する配列を含むか、又は天然に存在する配列からなる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の接合領域のアミノ酸配列は、少なくとも１つの人工配列を含むか、又は人工配列からなる。
【0118】
いくつかの実施形態は、結合単位は、共有結合単位であり、他の実施形態では、結合単位は、非共有結合単位である。
【0119】
好ましい実施形態では、接合領域のアミノ酸配列は、非免疫原性配列である。
【0120】
【0121】
図２に示される接合領域（接合領域１又は接合領域２）は、標的化単位に最も近い柔軟性単位（Ｂ）、及びそれに隣接し、抗原単位に最も近い共有結合単位を含む。図２の共有結合単位は、２つのポリペプチド鎖の間に形成された３つの共有結合（Ａ）を示す。
図３に示す接合領域（接合領域１又は接合領域２）は、標的化単位に最も近い柔軟性単位（Ｂ）、及びそれに隣接し、抗原単位に最も近い非共有結合単位を含む。図３の非共有結合単位は、例えば、疎水性相互作用（Ａ）による２つのポリペプチド鎖の二量体化を促進する。
図３に示す接合領域（接合領域１又は接合領域２）は、標的化単位に最も近い柔軟性単位（Ｂ）、及びそれに隣接し、抗原単位に最も近い非共有結合単位を含む。図３の非共有結合単位は、例えば、疎水性相互作用（Ａ）による２つのポリペプチド鎖の二量体化を促進する。
【0122】
柔軟性単位
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される接合領域は、柔軟性単位を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される接合領域は、柔軟性単位を含む。
【0123】
好ましい実施形態では、柔軟性単位のアミノ酸配列は、非免疫原性配列である。
【0124】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位のアミノ酸配列は、天然に存在するペプチド配列である。いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、免疫グロブリンに由来する。いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、免疫グロブリンのヒンジ領域であり、ヒンジ領域は、システイン残基を含まない。
【0125】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位のアミノ酸配列は、人工配列である。
【0126】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、小さい非極性（例えば、グリシン、アラニン若しくはロイシン）又は極性（例えば、セリン若しくはスレオニン）アミノ酸を含む。これらのアミノ酸の小さいサイズは、柔軟性を提供し、接続されたアミノ酸配列の可動性を可能にする。セリン又はスレオニンの取り込みは、水分子と水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの安定性を維持することができ、したがって、リンカーと抗原との間の好ましくない相互作用を低減する。いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、人工配列、例えば、セリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）リッチリンカー、すなわち、いくつかのセリン及び／又はいくつかのグリシン残基を含むリンカーである。好ましい例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号７６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号７７）、ＳＧＳＳＧＳ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号７９）又はその複数の変異体、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）、（ＧＧＧＧＳ）ｍ（配列番号８１）、（ＧＧＧＳＳ）ｍ（配列番号８２）、（ＧＧＧＳＧ）ｍ（配列番号８３）又は（ＳＧＳＳＧＳ）ｍ（配列番号８４）であり、ｍは１～５の整数、例えば、１、２、３、４又は５である。好ましい実施形態では、ｍは２である。他の好ましい実施形態では、セリン及び／又はグリシンリッチリンカーは、少なくとも１つのロイシン（Ｌ）残基、例えば少なくとも１つ又は少なくとも２つ又は少なくとも３つのロイシン残基、例えば、１、２、３又は４つのロイシン残基を更に含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＧＳ（配列番号８５）、ＧＬＧＧＳ（配列番号８６）、ＧＧＬＧＳ（配列番号８７）、ＧＧＧＬＳ（配列番号８８）若しくはＧＧＧＧＬ（配列番号８９）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＳＧ（配列番号９０）、ＧＬＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＧＬＳＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＬＧ（配列番号９３）若しくはＧＧＧＳＬ（配列番号９４）を含むか、又はそれからなる。更に他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＳＳ（配列番号９５）、ＧＬＧＳＳ（配列番号９６）若しくはＧＧＬＳＳ（配列番号９７）を含むか、又はそれからなる。
【0128】
他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＬＧＳ（配列番号９８）、ＧＬＧＬＳ（配列番号９９）、ＧＬＬＧＳ（配列番号１００）、ＬＧＧＬＳ（配列番号１０１）若しくはＧＬＧＧＬ （配列番号１０２）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＬＳＧ（配列番号１０３）、ＧＬＬＳＧ（配列番号１０４）、ＧＧＬＳＬ（配列番号１０５）、ＧＧＬＬＧ（配列番号１０６）若しくはＧＬＧＳＬ（配列番号１０７）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＬＳＳ（配列番号１０８）若しくはＧＧＬＬＳ（配列番号１０９）を含むか、又はそれからなる。
【0129】
他の実施形態では、柔軟性単位は、１０のアミノ酸の長さを有し、１つ又は２つのロイシン残基を含むセリン－グリシンリンカーである。
【0130】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＧＬＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１１）、ＧＧＬＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１２）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１３）若しくはＧＧＧＧＬＧＧＧＧＳ（配列番号１１４）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１５）、ＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１６）、ＧＧＬＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１７）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１８）若しくはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＧ（配列番号１１９）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２０）、ＧＬＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２１）、ＧＧＬＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２２）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２３）若しくはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＳ（配列番号１２４）を含むか、又はそれからなる。
【0131】
更なる実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＧＳＬＧＧＧＳ（配列番号１２５）、ＧＬＧＧＳＧＬＧＧＳ（配列番号１２６）、ＧＧＬＧＳＧＧＬＧＳ（配列番号１２７）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＬＳ（配列番号１２８）若しくはＧＧＧＧＬＧＧＧＧＬ（配列番号１２９）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＳＧＬＧＧＳＧ（配列番号１３０）、ＧＬＧＳＧＧＬＧＳＧ（配列番号１３１）、ＧＧＬＳＧＧＧＬＳＧ（配列番号１３２）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＬＧ（配列番号１３３）若しくはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＬ（配列番号１３４）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、ＬＧＧＳＳＬＧＧＳＳ（配列番号１３５）、ＧＬＧＳＳＧＬＧＳＳ（配列番号１３６）若しくはＧＧＬＳＳＧＧＬＳＳ（配列番号１３７）を含むか、又はそれからなる。
【0132】
他の実施形態では、柔軟性単位は、ＧＳＧＧＧＡ（配列番号１３８）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１３９）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１４０）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１４１）若しくはＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号１４２）を含むか、又はそれからなる。更に他の実施形態では、柔軟性単位は、ＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳ（配列番号１４３）、ＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧ（配列番号１４４）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１４６）、ＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号１４７、及び配列番号１のアミノ酸１２１～１３０）、ＧＧＧＳＳＳ（配列番号１４８）、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１４９）若しくはＧＬＧＧＬＡＡＡ（配列番号１５０）を含むか、又はそれからなる。
【0133】
他の実施形態では、柔軟性単位は、配列ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１５１）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、柔軟性単位は、配列ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１５２）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＡＡＹ若しくはＧＰＧＰＧ（配列番号１５３）を含むか、又はそれからなる。
【0134】
他の実施形態では、柔軟性単位は、ＧＳＡＴリンカー、すなわち、１つ以上のグリシン、セリン、アラニン及びスレオニン残基を含むリンカー、例えば、配列ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号１５４）を含むか、又はそれからなるリンカー若しくはＳＥＧリンカー、すなわち、１つ以上のセリン、グルタミン酸及びグリシン残基を含むリンカー、例えば、配列ＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１５５）又はＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号１９）を含むか、又はそれからなるリンカーを含むか、又はそれからなる。
【0135】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、プロテアーゼの標的ではない。
【0136】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、最大２０アミノ酸、例えば最大１５アミノ酸、例えば１４アミノ酸、例えば１３アミノ酸、例えば１２アミノ酸、例えば１１アミノ酸又は１０アミノ酸からなる。
【0137】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、配列番号１のアミノ酸配列１～１２に対して少なくとも５０％の配列同一性、例えば６０％又は例えば７０％又は例えば８０％若しくは例えば９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0138】
好ましい実施形態では、柔軟性単位は、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１である。
【0139】
好ましい実施形態では、柔軟性単位は、配列番号１のアミノ酸配列１～１２を含むか、又はそれからなる。
【0140】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、配列番号２のアミノ酸配列１６～２３に対して少なくとも５０％の配列同一性、例えば６０％若しくは例えば７０％若しくは例えば８０％若しくは例えば９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0141】
いくつかの実施形態では、柔軟性単位は、配列番号２のアミノ酸配列１６～２３を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に対して置換、欠失、又は挿入され、但し、５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失、又は挿入されている。
【0142】
他の実施形態では、柔軟性単位は、ＩｇＧ１の下部ヒンジ領域である。
【0143】
好ましい実施形態では、柔軟性単位は、配列番号２のアミノ酸配列１６～２３を含むか、又はそれからなる。
【0144】
共有結合単位
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される接合領域は、共有結合単位を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される接合領域は、共有結合単位を含む。
【0145】
好ましい実施形態では、共有結合単位は、１つ以上のシステイン残基を含み、本明細書に記載されるポリペプチドは、それぞれの第１及び第２の接合領域の共有結合単位に含まれるシステイン残基間に形成された１つ以上のジスルフィド結合を介して連結される。
【0146】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、システインリッチ配列からなるか、又はそれを含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、少なくとも２個のシステイン残基、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個のシステイン残基を含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、第１の接合領域の共有結合単位は、第２の接合領域の共有結合単位とは異なる数のシステイン残基を含む。
【0149】
いくつかの実施形態では、第１の接合領域の共有結合単位のシステイン残基は、第２の接合領域の共有結合単位のシステイン残基とは異なって位置付けられる。例えば、第１の接合領域の共有結合単位のシステイン残基間のアミノ酸残基の数は、第２の接合領域のものとは異なる。
【0150】
いくつかの実施形態は、システイン残基の数は、抗原単位の長さに基づく：抗原単位に含まれるアミノ酸残基が多いほど、共有結合単位中のシステイン残基の数は多くなる。
【0151】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号１５６；配列番号１のアミノ酸１３～２７に対応する）を含む。
【0152】
好ましい実施形態では、共有結合単位のアミノ酸配列は、非免疫原性配列である。
【0153】
いくつかの実施形態では、共有結合単位のアミノ酸配列は、人工配列である。
【0154】
いくつかの実施形態では、共有結合単位のアミノ酸配列は、天然に存在するペプチド配列である。
【0155】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、２～１００アミノ酸、例えば３～７０アミノ酸、例えば４～５０アミノ酸又は５～３０アミノ酸からなる。更なる実施形態では、共有結合単位は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸からなる。好ましい実施形態では、共有結合単位は、１５アミノ酸からなる。より好ましい実施形態では、共有結合単位は、１５アミノ酸からなり、そのうちの３つは、システイン残基である。
【0156】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、免疫グロブリンに由来する。
【0157】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、ＩｇＧ３のエクソンｈ４又はＩｇＧ１の中央ヒンジ領域等の、免疫グロブリンに由来するヒンジ領域である。ヒンジ領域は、Ｉｇ由来、例えばＩｇＧ由来、例えばＩｇＧ２又はＩｇＧ３に由来であってもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＭに由来し、例えば、配列番号１５７を有するヌクレオチド配列若しくは当該ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0158】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、配列番号１のアミノ酸配列１３～２７に対して少なくとも４０％の配列同一性、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0159】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、配列番号１のアミノ酸配列１３～２７を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に対して置換、欠失、又は挿入され、但し、６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失、又は挿入されている。
【0160】
好ましい実施形態では、共有結合単位は、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ４である。
【0161】
他の好ましい実施形態では、共有接合領域は、配列番号１のアミノ酸配列１３～２７からなる。
【0162】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、システイン残基が、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性でそれらの数及び位置において保持される限り、配列番号２のアミノ酸配列５～１５に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0163】
いくつかの実施形態では、共有結合単位は、配列番号２のアミノ酸配列５～１５を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に対して置換、欠失、又は挿入され、但し、５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失、又は挿入されている。
【0164】
好ましい実施形態では、共有結合単位は、ＩｇＧ１の中央ヒンジ領域である。
【0165】
他の実施形態では、共有結合単位は、配列番号２のアミノ酸配列５～１５からなるか、又はそれを含む。
【0166】
非共有結合単位
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される接合領域は、非共有結合単位を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される接合領域は、非共有結合単位を含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、非共有結合相互作用、例えば疎水性相互作用を通して二量体化等の多量体化に寄与する。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、非共有結合相互作用を介して、二量体等の多量体を形成する能力を有する。
【0168】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、非共有結合相互作用、例えば疎水性相互作用を通して多量体化に寄与する。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、非共有相互作用を介して、多量体を形成する能力を有する。
【0169】
非共有結合単位は、非共有相互作用、例えば疎水性相互作用を通して二量体化に寄与する。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、非共有結合相互作用を介して、二量体を形成する能力を有する。
【0170】
好ましい実施形態では、非共有結合単位のアミノ酸配列は、非免疫原性配列である。
【0171】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位のアミノ酸配列は、人工配列である。
【0172】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位のアミノ酸配列は、天然に存在する配列である。
【0173】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン定常ドメイン（Ｃドメイン）、例えばカルボキシ末端Ｃドメイン（すなわちＣＨ３ドメイン）、ＣＨ１ドメイン若しくはＣＨ２ドメイン、又はＣドメイン若しくはその変異体と実質的に同一である配列であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、ＩｇＧに由来する、例えばＩｇＧ３又はＩｇＧ１に由来する、好ましくはＩｇＧ１に由来するカルボキシ末端Ｃドメインである。
【0174】
１つの接合領域中の非共有結合単位がＣＨ３ドメインを含む場合、それは更にＣＨ２ドメインを含まず、逆もまた同様であることが好ましい。
【0175】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含むか、又はそれからなる。
【0176】
好ましい実施形態では、非共有結合単位は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％若しくは例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３由来のカルボキシ末端Ｃドメインを含むか、又はそれからなる。
【0177】
好ましい実施形態では、非共有結合単位は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含むか、又はそれからなる。
【0178】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に置換、欠失、又は挿入され、但し、２１以下のアミノ酸、例えば２０以下のアミノ酸、例えば１９以下のアミノ酸、例えば１８以下のアミノ酸、例えば１７以下のアミノ酸、例えば１６以下のアミノ酸、例えば１５以下のアミノ酸、例えば１４以下のアミノ酸、例えば１３以下のアミノ酸、例えば１２以下のアミノ酸、例えば１１以下のアミノ酸、例えば１０以下のアミノ酸、例えば９以下のアミノ酸、例えば８以下のアミノ酸、例えば７以下のアミノ酸、例えば６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失、又は挿入されている。
【0179】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる。
【0180】
いくつかの好ましい実施形態では、非共有結合単位は、配列番号４によるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％若しくは例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる。
【0181】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に置換、欠失、又は挿入され、但し、２１以下のアミノ酸、例えば２０以下のアミノ酸、例えば１９以下のアミノ酸、例えば１８以下のアミノ酸、例えば１７以下のアミノ酸、例えば１６以下のアミノ酸、例えば１５以下のアミノ酸、例えば１４以下のアミノ酸、例えば１３以下のアミノ酸、例えば１２以下のアミノ酸、例えば１１以下のアミノ酸、例えば１０以下のアミノ酸、例えば９以下のアミノ酸、例えば８以下のアミノ酸、例えば７以下のアミノ酸、例えば６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失、又は挿入されている。
【0182】
いくつかの好ましい実施形態では、非共有結合単位は、ＩｇＧ１のＣＨ３であるか、又はそれを含む。
【0183】
他の実施形態では、非共有結合単位は、ロイシンジッパーモチーフであるか、又はそれを含む。
【0184】
ロイシンジッパーは、タンパク質における一般的な三次元構造モチーフであり、１つのアルファヘリックス由来のロイシン側鎖が別のアルファヘリックス由来のロイシン側鎖と噛み合い、二量体化を促進する。
【0185】
ロイシンジッパーは、真核生物転写因子のｂＺＩＰ（塩基性領域ロイシンジッパー）クラスの二量体化モチーフである。ｂＺＩＰドメインは、６０～８０アミノ酸長であり、高度に保存されたＤＮＡ結合塩基性領域及びより多様なロイシンジッパー二量体化領域を有する。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、真核生物転写因子のｂＺＩＰクラスに由来するロイシンジッパーモチーフであるか、又はそれを含む。
【0186】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、Ｊｕｎ／Ｆｏｓベースのロイシンジッパーであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、ＡＴＦ６ベースのロイシンジッパーであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、ＰＡＲベースのロイシンジッパーであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、Ｃ／ＥＢＰａベースのロイシンジッパーであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、ＯＡＳＩＳベースのロイシンジッパーであるか、又はそれを含む。
【0187】
更に好ましい実施形態では、非共有結合単位は、ＣＲＥＢ転写因子（配列番号５）由来のロイシンジッパーモチーフ（アミノ酸３０８～３３６）であるか、又はそれを含む。
【0188】
更に好ましい実施形態では、非共有結合単位は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８１％若しくは少なくとも８１％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0189】
更に好ましい実施形態では、非共有結合単位は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、１２以下、例えば１１以下、例えば１０以下、例えば９以下、例えば８以下、例えば７以下、例えば６以下、例えば５以下、例えば４以下のアミノ酸、例えば ３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸の場合である。
【0190】
いくつかの実施形態では、接合領域は、柔軟性単位、及び共有結合単位又は非共有結合単位のいずれかである結合単位を含む。いくつかの実施形態では、接合領域は、共有結合単位及び非共有結合単位の両方を含む、結合単位を含む。
【0191】
他の実施形態では、接合領域は、柔軟性単位、共有結合単位及び非共有結合単位を含む。いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、抗原単位と共有結合単位との間に位置する。他の実施形態では、共有結合単位は、抗原単位と非共有結合単位との間に位置する。
【0192】
他の実施形態では、接合領域は、柔軟性単位及び非共有結合単位を含む。他の実施形態では、接合領域は、柔軟性単位及び共有結合単位を含む。好ましい実施形態では、柔軟性単位は標的化単位に最も近く、すなわち、標的化単位と共有結合単位との間及び／又は非共有結合単位との間に位置する。
【0193】
いくつかの実施形態では、接合領域は、リンカーを更に含む。更なる実施形態では、リンカーは、共有結合単位と非共有結合単位との間に位置する。
【0194】
３つ以上のポリペプチドの多量体化を促進する／連結する非共有結合単位
抗原単位及び標的化単位を連結することに加えて、非共有結合単位は、複数のポリペプチド、例えば２つ、３つ、４つ以上のポリペプチドの多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質、三量体タンパク質又は四量体タンパク質への多量体化／接合を促進する。
抗原単位及び標的化単位を連結することに加えて、非共有結合単位は、複数のポリペプチド、例えば２つ、３つ、４つ以上のポリペプチドの多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質、三量体タンパク質又は四量体タンパク質への多量体化／接合を促進する。
【0195】
いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、三量体化単位、例えばコラーゲン由来三量体化単位、例えばヒトコラーゲン由来三量体化ドメイン、例えばヒトコラーゲン由来ＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン（例えば、Ａ．Ａｌｖａｒｅｚ－Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６，２８６４３（２０１６）を参照されたい）又はヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメインであるか、又はそれを含む。したがって、一実施形態では、非共有結合単位は、配列番号１５８を有する核酸配列若しくは当該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる三量体化単位である。他の実施形態では、三量体化単位は、Ｔ４フィブリチンのＣ末端ドメインである。したがって、いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、配列番号１５９を有するアミノ酸配列若しくは当該核酸配列をコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる三量体化単位である。
【0196】
他の実施形態では、非共有結合単位は、ｐ５３に由来するドメイン等の四量体化単位であるか、又はそれを含み、任意選択で、以下に記載されるヒンジ領域を更に含む。したがって、いくつかの実施形態では、非共有結合単位は、配列番号１６０を有する核酸配列若しくは当該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、任意選択で、以下に記載されるヒンジ領域を更に含む、四量体化単位である。
【0197】
接合領域の特定の実施形態
好ましい実施形態では、接合領域は、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４を含む。更に好ましい実施形態では、接合領域は、配列中のシステイン残基が、例えば、少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性でそれらの数及び位置において保持される限り、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
好ましい実施形態では、接合領域は、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４を含む。更に好ましい実施形態では、接合領域は、配列中のシステイン残基が、例えば、少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性でそれらの数及び位置において保持される限り、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0198】
更に好ましい実施形態では、接合領域は、配列中のシステイン残基がそれらの数及び位置において保持される限り、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に置換、欠失、又は挿入され、但し、１６以下のアミノ酸、例えば１５以下のアミノ酸、例えば１４以下のアミノ酸、例えば１３以下のアミノ酸、例えば１２以下のアミノ酸、例えば１１以下のアミノ酸、例えば１０以下のアミノ酸、例えば９以下のアミノ酸、例えば８以下のアミノ酸、例えば７以下のアミノ酸、例えば６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失、又は挿入されている。
【0199】
いくつかの実施形態は、接合領域は、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４である。いくつかの実施形態では、接合領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【0200】
上記の接合領域が第２の接合領域である場合、当該接合領域は、ｈ４からｈ１の順序でヒンジエクソンを含み、すなわち、上記の配列は、柔軟性単位ｈ１が第２の標的化単位に最も近くなるように「反転」されている。
【0201】
他の好ましい実施形態では、接合領域は、ＩｇＧ１の中央及び下部ヒンジ領域を含む。更に好ましい実施形態では、接合領域は、配列中のシステイン残基が、例えば、少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性でそれらの数及び位置において保持される限り、配列番号２のアミノ酸配列５～２３に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0202】
更に好ましい実施形態では、接合領域は、配列中のシステイン残基がそれらの数及び位置において保持される限り、配列番号２のアミノ酸配列５～２３を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、１１以下のアミノ酸、例えば１０以下のアミノ酸、例えば９以下のアミノ酸、例えば８以下のアミノ酸、例えば７以下のアミノ酸、例えば６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失又は挿入されている。
【0203】
いくつかの実施形態では、接合領域は、ＩｇＧ１の中央及び下部ヒンジ領域である。他の好ましい実施形態では、接合領域は、配列番号２のアミノ酸配列５～２３からなるか、又はそれを含む。
【0204】
上記の接合領域が第１の接合領域である場合、当該接合領域は、下部ヒンジ領域から中間ヒンジ領域の順序でヒンジ領域を含み、すなわち、上記の配列は、柔軟性単位である下部ヒンジ領域が第１の標的化単位に最も近くなるように「反転」されている。
【0205】
いくつかの実施形態では、接合領域は、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１及びヒンジエクソンｈ４を含み、並びに／又はＩｇＧ１の中央及び下部ヒンジ領域を含む接合領域は、非共有接合領域、例えば、前述の非共有接合領域、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインを更に含んでもよい。
【0206】
標的化単位
本開示の寛容誘導構築物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とする第１及び第２の標的化単位を含む。
本開示の寛容誘導構築物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とする第１及び第２の標的化単位を含む。
【0207】
第１及び第２の標的化単位は、それぞれ、本明細書に記載されるように、第１及び第２の接合領域に接続される。
【0208】
本明細書で使用される「標的化単位」という用語は、本開示の構築物を抗原提示細胞に送達し、細胞の成熟を誘導することなく、ＡＰＣ上の表面分子と相互作用する、例えば、ＡＰＣ上の表面受容体に結合する、単位を指す。ＡＰＣは、構築物を内在化するものであり、ＭＨＣ上の抗原単位に含まれるＴ細胞エピトープを、抗炎症性の寛容原性様式で、例えば共刺激シグナルを上方制御しないことによって、及び／又は阻害性表面受容体を上方制御することによって、及び／又は阻害性サイトカインの分泌を促進することによって、その表面上に提示する。いくつかの実施形態では、標的化単位は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、及びＴＧＦβＲ３を含む）、ＩＬ－１０ＲＡ及びＩＬ１０－ＲＢ等のＩＬ１０Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１１Ｒ及びＩＬ１３Ｒ、ＩＬ２７Ｒ、ＩＬ３５Ｒ、ＩＬ３７Ｒ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＣＤ２０５、ＣＤ１０９、ＶＩＳＴＡ、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８３、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＧＬ／Ｃｌｅｃ１０Ａ、ＡＳＧＲ（ＡＳＧＲ１／ＡＳＧＲ２）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ｂ、ＤＣＩＲ２、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＲ、ＤＣ－Ｓｉｇｎ、Ｔｒｅｍｌ４、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６３、及びＣＤ１４１からなる群から選択されるＡＰＣ上の表面分子に結合する部分を含むか、又はそれからなる。
【0209】
好ましい実施形態では、標的化単位は、ｈＴＧＦβ受容体（ｈＴＧＦβＲ１、ｈＴＧＦβＲ２、及びｈＴＧＦβＲ３を含む）、ｈＩＬ－１０ＲＡ及びｈＩＬ－１０ＲＢ等のｈＩＬ－１０Ｒ、ｈＩＬ－２Ｒ、ｈＩＬ－４Ｒ、ｈＩＬ－６Ｒ、ｈＩＬ－１１Ｒ、ｈＩＬ－１３Ｒ、ｈＩＬ－２７Ｒ、ｈＩＬ－３５Ｒ、ｈＩＬ－３７Ｒ、ｈＧＭ－ＣＳＦＲ、ｈＦＬＴ３、ｈＣＣＲ７、ｈＣＤ１１ｂ、ｈＣＤ１１ｃ、ｈＣＤ１０３、ｈＣＤ１４、ｈＣＤ３６、ｈＣＤ２０５、ｈＣＤ１０９、ｈＶＩＳＴＡ、ｈＭＡＲＣＯ、ｈＭＨＣＩＩ、ｈＣＤ８３、ｈＳＩＧＬＥＣ、ｈＣｌｅｃ１０Ａ（ｈＭＧＬ）、ｈＡＳＧＲ（ｈＡＳＧＲ１／ｈＡＳＧＲ２）、ｈＣＤ８０、ｈＣＤ８６、ｈＣｌｅｃ９Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ａ、ｈＣｌｅｃ１２Ｂ、ｈＤＣＩＲ２、ｈＬａｎｇｅｒｉｎ、ｈＭＲ、ｈＤＣ－Ｓｉｇｎ、ｈＴｒｅｍｌ４、ｈＤｅｃｔｉｎ－１、ｈＰＤＬ１、ｈＰＤＬ２、ｈＨＶＥＭ、ｈＣＤ１６３及びｈＣＤ１４１からなる群から選択されるヒト（ｈ）ＡＰＣ上の表面分子に結合する部分を含むか、又はそれからなる。
【0210】
この部分は、天然リガンド、抗体若しくはその一部、例えばｓｃＦｖ、又は合成リガンドであってもよい。
【0211】
いくつかの実施形態では、この部分は、前述の受容体のいずれかに対する特異性を有する抗体又はその一部、例えばｓｃＦｖであり、その受容体への結合により、抗原単位に含まれるＴ細胞エピトープが抗炎症性寛容原性様式で提示される。
【0212】
他の実施形態では、この部分は、前述の受容体のいずれかに対する特異性を有する合成リガンドであり、その受容体への結合により、抗原単位に含まれるＴ細胞エピトープが抗炎症性寛容原性様式で提示される。タンパク質モデリングを使用して、そのような合成リガンドを設計してもよい。
【0213】
他の実施形態では、この部分は、天然リガンドである。
【0214】
いくつかの実施形態では、天然リガンドは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２又はＴＧＦβ３等のＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ２７、ＩＬ３５、ＩＬ３７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４としても知られる細胞間接着分子１）、ケラチン、ＶＳＩＧ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＴＬＡ－４、好ましくはＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン、ＰＤ－１、好ましくはＰＤ－１の細胞外ドメイン及びＢＴＬＡ、好ましくはＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択される。
【0215】
他の実施形態では、標的化単位は、ＩＬ－１０又はＴＧＦβ、好ましくはヒトＩＬ－１０又はヒトＴＧＦβであるか、又はそれを含む。
【0216】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＴＧＦβのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0217】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＴＧＦβのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0218】
他の実施形態では、標的化単位は、最大２２アミノ酸、例えば、最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＴＧＦβのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0219】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列（配列番号６６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0220】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0221】
他の実施形態では、標的化単位は、最大２２アミノ酸、例えば、最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0222】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列若しくはヒトＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。
【0223】
いくつかの実施形態では、標的化単位は、ＳＣＧＢ３Ａ２又はＶＳＩＧ－３、好ましくはヒトＶＳＩＧ－３又はヒトＳＣＧＢ３Ａ２であるか、又はそれを含む。
【0224】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0225】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0226】
他の実施形態では、標的化単位は、最大２２アミノ酸、例えば、最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0227】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列、又はヒトＳＣＧＢ３Ａ２をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。
【0228】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0229】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0230】
別の実施形態では、標的化単位は、最大２２アミノ酸、例えば、最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0231】
他の実施形態では、標的化単位は、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列若しくはヒトＶＳＩＧ－３をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。
【0232】
他の実施形態では、標的化単位は、ＣＤ２０５に対する特異性を有する抗体又はその一部、例えばｓｃＦｖであるか、又はそれを含む。
【0233】
抗原単位
本開示の寛容誘導構築物の抗原単位は、Ｔｒｅｇエピトープ又は阻害性ネオ抗原、アレルゲン、アロ抗原又は異種抗原を含むがこれらに限定されない、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
本開示の寛容誘導構築物の抗原単位は、Ｔｒｅｇエピトープ又は阻害性ネオ抗原、アレルゲン、アロ抗原又は異種抗原を含むがこれらに限定されない、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
【0234】
抗原単位は、本明細書に記載されるように、第１の接合領域と第２の接合領域との間に位置する。
【0235】
いくつかの実施形態では、抗原単位は、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち自己抗原の１つのＴ細胞エピトープ、又は自己抗原の２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち自己抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む。一実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは、同じ自己抗原のものであり、すなわち、同じ自己抗原に含まれる。別の実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは、複数の異なる自己抗原のものであり、すなわち、異なる自己抗原に含まれる。
【0236】
いくつかの実施形態では、抗原単位が２つ以上のＴ細胞エピトープを含む場合、抗原単位は、Ｔ細胞エピトープを分離する１つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、抗原単位は、複数の抗原、例えば、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含み、Ｔ細胞エピトープは、好ましくはリンカーによって分離されている。更に他の実施形態では、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含み、各Ｔ細胞エピトープは、リンカーによって他の抗原から分離されている。リンカーによる他のＴ細胞エピトープからの自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の各Ｔ細胞エピトープの分離を説明する代替方法は、末端Ｔ細胞エピトープ、すなわち、ポリペプチドのＮ末端開始又はポリペプチドのＣ末端（すなわち、二量体化単位に連結されていない抗原単位の末端に位置する）の抗原を除く全てがサブユニットに配置され、各サブユニットが本明細書に記載の抗原及びリンカーを含むか、又はそれからなるというものである。
【0237】
したがって、ｎ個の抗原を含む抗原単位は、ｎ－１個のサブユニットを含み、各サブユニットは、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原のＴ細胞エピトープ、及びリンカーを含み、末端Ｔ細胞エピトープを更に含む。いくつかの実施形態では、ｎは、１～５０、例えば、３～５０又は１５～４０又は１０～３０又は１０～２５又は１０～２０又は１５～３０又は１５～２５又は１５～２０の整数である。
【0238】
抗原単位中のリンカーは、その中に含まれる抗原、例えばエピトープを分離する。上記のように、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の全てのＴ細胞エピトープは、リンカーによって互いに分離され、サブユニットに配置されてもよい。
【0239】
いくつかの実施形態では、リンカーは、非免疫原性であるように設計される。それは、それが接続する２つのアミノ酸配列が互いに対して実質的に自由に移動することを可能にしないことを意味する、剛性リンカーであってもよい。あるいは、それは、柔軟性リンカー、すなわち、それが接続する２つのアミノ酸配列が互いに対して実質的に自由に移動することを可能にするリンカーであってもよい。
【0240】
リンカーによる抗原の分離により、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の各Ｔ細胞エピトープは、免疫系に最適な様式で提示される。
【0241】
例として、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン関連塩基性オリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＢＰ）は全て、多発性硬化症（ＭＳ）に関与する自己抗原として研究及び提案されており、抗原単位は、例えば、ＭＢＰの１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、ＭＢＰの１つのＴ細胞エピトープ又はＭＢＰの複数のＴ細胞エピトープを含んでもよい。更に、抗原単位は、例えばＭＯＧ及びＰＬＰの複数のＴ細胞エピトープ、例えばＭＯＧの１つ以上のＴ細胞エピトープ及びＰＬＰの１つ以上のＴ細胞エピトープを含んでもよい。
【0242】
他の実施形態では、抗原単位は、アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、アレルゲンの１つのＴ細胞エピトープ、又はアレルゲンの２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、アレルゲンの複数のＴ細胞エピトープを含む。一実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは、同じアレルゲンのものであり、すなわち、同じアレルゲンに含まれる。他の実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは、複数の異なるアレルゲンのものであり、すなわち、異なるアレルゲンに含まれる。
【0243】
例として、Ｆｅｌ ｄ１、Ｆｅｌ ｄ４及びＦｅｌ ｄ７は、最も顕著なネコアレルゲンのうちの３つであり、ヒトネコアレルギーの大部分を占め、抗原単位は、例えば、Ｆｅｌ ｄ１の１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、Ｆｅｌ ｄ１の１つのＴ細胞エピトープ又はＦｅｌ ｄ１の複数のＴ細胞エピトープを含んでもよい。更に、抗原単位は、例えばＦｅｌ ｄ４及びＦｅｌ ｄ７の複数のＴ細胞エピトープ、例えばＦｅｌ ｄ４の１つ以上のＴ細胞エピトープ及びＦｅｌ ｄ７の１つ以上のＴ細胞エピトープを含んでもよい。
【0244】
他の実施形態では、抗原単位は、同種抗原／異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、同種抗原／異種抗原の１つのＴ細胞エピトープ、又は同種抗原／異種抗原の２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち、同種抗原／異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは、同じ同種抗原／異種抗原のものであり、すなわち、同じ同種抗原／異種抗原に含まれる。他の実施形態では、複数のＴ細胞エピトープは、複数の異なる同種抗原／異種抗原のものであり、すなわち、異なる同種抗原／異種抗原に含まれる。
【0245】
いくつかの実施形態では、抗原単位は、１つのＴ細胞エピトープを含む。他の実施形態では、抗原単位は、２つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち複数のＴ細胞エピトープを含む。
【0246】
本開示の寛容誘導構築物は、個別化された処置であってもよく、すなわち、特定の対象／１人の患者のために設計されてもよい。他の実施形態では、本開示の寛容誘導構築物は、患者集団又は患者における一般的使用、すなわちすぐ使用可能な（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）処置のためのものである。
【0247】
個別化された寛容誘導構築物
個別化された寛容誘導構築物について、Ｔ細胞エピトープは、抗原単位に含めるために選択され、このＴ細胞エピトープは、構築物での処置を受ける患者について最適化される。これは、寛容誘導構築物を含むすぐ使用可能な処置と比較して、治療効果を増加させる。
個別化された寛容誘導構築物について、Ｔ細胞エピトープは、抗原単位に含めるために選択され、このＴ細胞エピトープは、構築物での処置を受ける患者について最適化される。これは、寛容誘導構築物を含むすぐ使用可能な処置と比較して、治療効果を増加させる。
【0248】
個別化された寛容誘導構築物の抗原単位は、ＭＳに罹患している患者について例示されるように、以下のように設計されてもよい：
１）患者のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子が決定される。
２）１つ以上の自己抗原（例えば、ＭＳに関与する自己抗原として研究及び提案されている自己抗原）に含まれるＴ細胞エピトープが同定される。
３）Ｔ細胞エピトープが、患者のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ対立遺伝子への予測される結合に基づいて選択される。
４）１つ以上の寛容誘導試験構築物が設計及び産生され、Ｔ細胞エピトープが、任意選択で、本出願に記載されるように構築物の抗原単位中に配置される。
１）患者のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子が決定される。
２）１つ以上の自己抗原（例えば、ＭＳに関与する自己抗原として研究及び提案されている自己抗原）に含まれるＴ細胞エピトープが同定される。
３）Ｔ細胞エピトープが、患者のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ対立遺伝子への予測される結合に基づいて選択される。
４）１つ以上の寛容誘導試験構築物が設計及び産生され、Ｔ細胞エピトープが、任意選択で、本出願に記載されるように構築物の抗原単位中に配置される。
【0249】
Ｔ細胞エピトープは、患者のＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合するそれらの予測される能力に基づいて上記の方法において選択される、すなわち、予測ＨＬＡ結合アルゴリズムを使用してインシリコで選択される。関連エピトープを同定した後、エピトープは、患者のＨＬＡクラスＩ／ＩＩ対立遺伝子に結合するそれらの能力に従ってランク付けされ、最もよく結合すると予測されるエピトープが、試験構築物の抗原単位に含まれるように選択される。
【0250】
任意の好適なＨＬＡ結合アルゴリズム、例えば、以下のうちの１つが使用されてもよい：
ペプチド－ＭＨＣ結合の利用可能なソフトウェア分析（ＩＥＤＢ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ及びＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ）は、以下のウェブサイトからオンラインでダウンロード又は使用されてもよい。
ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／
ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０
ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ－３．２
すぐ使用可能な寛容誘導構築物
すぐ使用可能な寛容誘導構築物の抗原単位は、好ましくは、最小Ｔ細胞エピトープのホットスポット、すなわち、広範の対象、例えば、民族集団又は更に世界人口を網羅するために異なるＨＬＡ対立遺伝子によって提示されると予測される複数の最小Ｔ細胞エピトープ（例えば、８～１５アミノ酸の長さを有する）を含有する抗原の１つ以上の領域を含む。
ペプチド－ＭＨＣ結合の利用可能なソフトウェア分析（ＩＥＤＢ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ及びＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ）は、以下のウェブサイトからオンラインでダウンロード又は使用されてもよい。
ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／
ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０
ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ－３．２
すぐ使用可能な寛容誘導構築物
すぐ使用可能な寛容誘導構築物の抗原単位は、好ましくは、最小Ｔ細胞エピトープのホットスポット、すなわち、広範の対象、例えば、民族集団又は更に世界人口を網羅するために異なるＨＬＡ対立遺伝子によって提示されると予測される複数の最小Ｔ細胞エピトープ（例えば、８～１５アミノ酸の長さを有する）を含有する抗原の１つ以上の領域を含む。
【0251】
そのようなホットスポットを含むことによって、構築物が広範囲の対象において寛容を誘導する可能性が最大化される。
【0252】
抗原単位の更なる説明
本開示の構築物の抗原単位に含まれるＴ細胞エピトープは、７～約２００アミノ酸の長さを有し、より長いＴ細胞エピトープは、場合により最小エピトープのホットスポットを含む。
本開示の構築物の抗原単位に含まれるＴ細胞エピトープは、７～約２００アミノ酸の長さを有し、より長いＴ細胞エピトープは、場合により最小エピトープのホットスポットを含む。
【0253】
いくつかの実施形態では、抗原単位は、７～１５０アミノ酸、好ましくは７～１００アミノ酸、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０アミノ酸等、約１０～約１００アミノ酸、又は約１５～約１００アミノ酸、又は約２０～約７５アミノ酸、又は約２５～約５０アミノ酸の長さを有するＴ細胞エピトープを含む。
【0254】
約６０～２００アミノ酸の長さを有するＴ細胞エピトープは、より短い配列に分割され、本明細書に記載されるリンカーによって分離された抗原単位に含まれてもよい。例として、１５０アミノ酸の長さを有するＴ細胞エピトープは、各々５０アミノ酸の３つの配列に分割され、３つの配列を互いに分離するリンカーと共に抗原単位に含まれてもよい。
【0255】
いくつかの実施形態では、１つのＴ細胞エピトープの長さは、タンパク質が正しく折り畳まれないような長さである。例えば、最も顕著なネコアレルゲンであるＦｅｌ ｄ １は、２つのヘテロ二量体によって形成されたタンパク質であり、各二量体は２つの鎖から構成され、鎖１は７０アミノ酸残基を含み、鎖２は９０又は９２残基を含む。両方の鎖の長いＴ細胞エピトープを抗原単位に含めることは、タンパク質の正しい折り畳みをもたらし得、対象の肥満細胞及び好塩基球上の２つ以上のＩｇＥが構築物の抗原単位に結合する場合、アレルギー反応を誘発する場合がある。
【0256】
より長いＴ細胞エピトープが抗原単位に含まれる場合、タンパク質折り畳みは、例えば、タンパク質に対する抗体（例えば、ネコアレルゲン）を使用し、抗体がＴ細胞エピトープに結合するかどうかを判定するＥＬＩＳＡによってインビトロで試験されてもよい。
【0257】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）による提示に好適な長さを有する。ＭＨＣ分子には２つの主要なクラス、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣ ＩＩがある。ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩという用語は、本明細書ではＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩと互換的に使用される。ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）は、ヒトにおける主要組織適合性複合体である。したがって、好ましい実施形態では、抗原単位は、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ上での特異的提示に好適な長さを有するＴ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ提示のために７～１１アミノ酸の長さを有する。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープ配列は、ＭＨＣクラスＩＩ提示のために、９～６０アミノ酸、例えば９～３０アミノ酸、例えば１５～６０アミノ酸、例えば１５～３０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ提示のために１５アミノ酸の長さを有する。
【0258】
抗原単位中のＴ細胞エピトープの数は変動してもよく、抗原単位中に含まれる他の要素、例えば本出願に記載されるＴ細胞エピトープリンカーの長さ及び数に応じて異なる。
【0259】
いくつかの実施形態では、抗原単位は、最大３５００アミノ酸、例えば６０～３５００アミノ酸、例えば約８０又は約１００又は約１５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、例えば約２００～約２５００アミノ酸、例えば約３００～約２０００アミノ酸又は約４００～約１５００アミノ酸又は約５００～約１０００アミノ酸を含む。
【0260】
いくつかの実施形態では、抗原単位は、１～１０個のＴ細胞エピトープ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９若しくは１０個のＴ細胞エピトープ、又は１１～２０個のＴ細胞エピトープ、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個のＴ細胞エピトープ、又は２１～３０個のＴ細胞エピトープ、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個のＴ細胞エピトープ、又は３１～４０個のＴ細胞エピトープ、例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０個のＴ細胞エピトープ、又は４１～５０個のＴ細胞エピトープ、例えば、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個のＴ細胞エピトープを含む。他の実施形態では、抗原単位は、１～３個のＴ細胞エピトープ、例えば１、２、３若しくは１～５個のＴ細胞エピトープ、例えば１、２、３、４、５若しくは３～６個のＴ細胞エピトープ、例えば３、４、５、６若しくは５～１５個のＴ細胞エピトープ、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５個のＴ細胞エピトープ、又は７～１７個のＴ細胞エピトープ、例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６若しくは１７個のＴ細胞エピトープ、又は９～１９個のＴ細胞エピトープ、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８若しくは１９個のＴ細胞エピトープを含む。
【0261】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、抗原単位中にランダムに配置される。他の実施形態では、抗原単位中にそれらを配置するための以下の方法のうちの１つ以上（on or more）が使用されてもよい。
【0262】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、多量体化／二量体化単位から抗原単位の末端への方向に、より抗原性の高いものからより抗原性の低いものの順序で配置される（図１を参照されたい）。あるいは、特に親水性／疎水性がＴ細胞エピトープ間で大きく変動する場合、最も疎水性のＴ細胞エピトープは、抗原単位の実質的に中央に位置付けられてもよく、最も親水性のＴ細胞エピトープは、多量体化／二量体化単位又は抗原単位の末端の最も近くに位置付けられる。
【0263】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、多量体化単位から抗原単位の末端への方向に、より抗原性の高いものからより抗原性の低いものの順序で配置される。あるいは、特に親水性／疎水性がＴ細胞エピトープ間で大きく変動する場合、最も疎水性のＴ細胞エピトープは、抗原単位の実質的に中央に位置付けられてもよく、最も親水性のＴ細胞エピトープは、多量体化単位又は抗原単位の末端に最も近く位置付けられる。
【0264】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、二量体化単位から抗原単位の末端への方向に、より抗原性の高いものからより抗原性の低いものの順序で配置される（図１を参照されたい）。あるいは、特に親水性／疎水性がＴ細胞エピトープ間で大きく変動する場合、最も疎水性のＴ細胞エピトープは、抗原単位の実質的に中央に位置付けられもよく、最も親水性のＴ細胞エピトープは、二量体化単位又は抗原単位の末端の最も近くに位置付けられる。
【0265】
抗原単位の中央への真の位置付けは、抗原単位が奇数のＴ細胞エピトープを含む場合にのみ可能であるため、この文脈における「実質的に」という用語は、偶数のＴ細胞エピトープを含む抗原単位を指し、最も疎水性のＴ細胞エピトープは、可能な限り中央に近接して位置付けられる。
【0266】
例として、抗原単位は、５つのＴ細胞エピトープを含み、これらは以下のように配置される：１－２－３＊－４－５；１、２、３＊、４及び５は各々異なるＴ細胞エピトープであり、－はＴ細胞エピトープリンカーであり、＊は抗原単位の中央に位置付けられる最も疎水性のＴ細胞エピトープを示す。
【0267】
別の例では、抗原単位は、６個のＴ細胞エピトープを含み、これらは以下のように配置される：１－２－３＊－４－５－６、あるいは以下のように配置される：１－２－４－３＊－５－６；１、２、３＊、４、５及び６は、各々Ｔ細胞エピトープであり、－はＴ細胞エピトープリンカーであり、＊は抗原単位の実質的に中央に位置付けられる最も疎水性のＴ細胞エピトープを示す。
【0268】
あるいは、Ｔ細胞エピトープは、親水性Ｔ細胞エピトープと疎水性Ｔ細胞エピトープとの間で交互に配置されてもよい。任意選択で、ＧＣリッチＴ細胞エピトープは、ＧＣクラスターが回避されるように配置される。好ましい実施形態では、ＧＣリッチＴ細胞エピトープは、それらの間に少なくとも１つの非ＧＣリッチＴ細胞エピトープが存在するように配置される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープをコードするＧＣリッチ配列は、それらの間に少なくとも１つの非ＧＣリッチＴ細胞配列が存在するように配置される。ＧＣリッチ配列は、６０％以上、例えば６５％以上、例えば７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上のＧＣ含量を有する配列である。
【0269】
抗原単位が複数のＴ細胞エピトープを含む場合、エピトープは、好ましくはＴ細胞エピトープリンカーによって分離される。これは、各Ｔ細胞エピトープが最適な方法で免疫系に提示されることを確実にする。抗原単位がｎ個のＴ細胞エピトープを含む場合、それは、好ましくは、各Ｔ細胞エピトープを１つ又は２つの他のＴ細胞エピトープから分離するｎ－１個のＴ細胞エピトープリンカーを含む。
【0270】
Ｔ細胞エピトープリンカーは、非免疫原性であるように設計され、好ましくはまた、抗原単位が多数のＴ細胞エピトープを含む場合であっても、最適な様式でＴ細胞エピトープを免疫系に提示することを可能にする柔軟性リンカーである。
【0271】
好ましくは、Ｔ細胞エピトープリンカーは、４～２０アミノ酸、例えば５～２０アミノ酸若しくは５～１５アミノ酸又は８～２０アミノ酸若しくは８～１５アミノ酸、例えば８、９、１０，１１、１２、１３、１４、若しくは１５アミノ酸、１０～１５アミノ酸又は８～１２アミノ酸、例えば８、９、１０、１１、若しくは１２アミノ酸からなるペプチドである。特定の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、１０アミノ酸からなる。
【0272】
抗原単位に含まれる全てのＴ細胞エピトープリンカーは、好ましくは同一である。しかしながら、Ｔ細胞エピトープのうちの１つ以上がリンカーの配列と類似の配列を含む場合、隣接するＴ細胞エピトープリンカーを異なる配列のリンカーで置換することが有利であり得る。また、Ｔ細胞エピトープ／リンカー接合部がそれ自体でエピトープを構成すると予測される場合、異なる配列のＴ細胞エピトープリンカーを使用することが好ましい。
【0273】
好ましくは、Ｔ細胞エピトープリンカーは、セリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）リッチリンカー、すなわち、いくつかのセリン及び／又はいくつかのグリシン残基を含むリンカーである。好ましい例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＳＧＳＳＧＳ（配列番号７８）、ＧＧＳＧＧ（配列番号７９）、又はその複数の変異体、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）、（ＧＧＧＧＳ）ｍ（配列番号８１）、（ＧＧＧＳＳ）ｍ（配列番号８２）、（ＧＧＳＧＧ）ｍ（配列番号１６１）、（ＧＧＧＳＧ）ｍ（配列番号８３）又は（ＳＧＳＳＧＳ）ｍ（配列番号８４）であり、ｍは１～５の整数、例えば、１、２、３、４又は５である。好ましい実施形態では、ｍは２である。他の好ましい実施形態では、セリン及び／又はグリシンリッチリンカーは、少なくとも１つのロイシン（Ｌ）残基、例えば少なくとも１つ又は少なくとも２つ又は少なくとも３つのロイシン残基、例えば、１、２、３又は４つのロイシン残基を更に含む。
【0274】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＧＳ（配列番号８５）、ＧＬＧＧＳ（配列番号８６）、ＧＧＬＧＳ（配列番号８７）、ＧＧＧＬＳ（配列番号８８）若しくはＧＧＧＧＬ（配列番号８９）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＧ（配列番号９０）、ＧＬＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＧＬＳＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＬＧ（配列番号９３）若しくはＧＧＧＳＬ（配列番号９４）を含むか、又はそれからなる。更に他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＳ（配列番号９５）、ＧＬＧＳＳ（配列番号９６）、若しくはＧＧＬＳＳ（配列番号９７）を含むか、又はそれからなる。
【0275】
他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＬＧＳ（配列番号９８）、ＧＬＧＬＳ（配列番号９９）、ＧＬＬＧＳ（配列番号１００）、ＬＧＧＬＳ（配列番号１０１）、ＧＬＧＧＬ（配列番号１０２）若しくは（ＧＬＧＧＬ）ｍ（配列番号１６２）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＬＳＧ（配列番号１０３）、ＧＬＬＳＧ（配列番号１０４）、ＧＧＬＳＬ（配列番号１０５）、ＧＧＬＬＧ（配列番号１０６）若しくはＧＬＧＳＬ（配列番号１０７）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＬＳＳ（配列番号１０８）若しくはＧＧＬＬＳ（配列番号１０９）を含むか、又はそれからなる。
【0276】
他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、１０アミノ酸の長さを有し、１つ又は２つのロイシン残基を含むセリン－グリシンリンカーである。
【0277】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＧＬＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１１）、ＧＧＬＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１２）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１３）若しくはＧＧＧＧＬＧＧＧＧＳ（配列番号１１４）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１５）、ＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１６）、ＧＧＬＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１７）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１８）若しくはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＧ（配列番号１１９）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２０）、ＧＬＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２１）、ＧＧＬＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２２）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＳＳ（配列番号１２３）若しくはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＳ（配列番号１２４）を含むか、又はそれからなる。
【0278】
更なる実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＧＳＬＧＧＧＳ（配列番号１２５）、ＧＬＧＧＳＧＬＧＧＳ（配列番号１２６）、ＧＧＬＧＳＧＧＬＧＳ（配列番号１２７）、ＧＧＧＬＳＧＧＧＬＳ（配列番号１２８）若しくはＧＧＧＧＬＧＧＧＧＬ（配列番号１２９）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＧＬＧＧＧＳＧ（配列番号１３０）、ＧＬＧＳＧＧＬＧＧＳＧ（配列番号１３１）、ＧＧＬＳＧＧＧＬＳＧ（配列番号１３２）、ＧＧＧＬＧＧＧＧＬＧ（配列番号１３３）若しくはＧＧＧＳＬＧＧＧＳＬ（配列番号１３４）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＬＧＧＳＳＬＧＧＳＳ（配列番号１３５）、ＧＬＧＳＳＧＬＧＳＳ（配列番号１３６）、ＧＧＬＳＳＧＧＬＳＳ（配列番号１３７）を含むか、又はそれからなる。
【0279】
他の実施形態では、Ｔ細胞性エピトープリンカーは、ＧＳＧＧＧＡ（配列番号１３８）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１４０）、ＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡＧＳＧＧＧＡ（配列番号１４１）若しくはＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２）を含むか、又はそれからなる。更に他の実施形態では、ＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳ（配列番号１４３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）、ＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧ（配列番号１４４）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１４６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１４７）、ＧＧＧＳＳＳ（配列番号１４８）、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳ（配列番号１４９）（配列番号）若しくはＧＬＧＧＬＡＡＡ（配列番号１５０）を含むか、又はそれからなる。
【0280】
他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、剛性リンカーである。そのような剛性リンカーは、（より大きな）抗原を効率的に分離し、それらの互いの干渉を防止するのに有用であり得る。一実施形態では、サブユニットリンカーは、ＫＰＥＰＫＰＡＰＡＰＫＰ（配列番号１６３）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１６４）、（ＥＡＡＡＫ）ｍＧＳ（配列番号１６５）、ＥＡＡＫ）ｍＧＳ（配列番号３９）、ＰＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥＰ（配列番号１６６）若しくはＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号１６７）を含むか、又はそれからなる。
【0281】
他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、配列ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１５１）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、配列ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＬＧＧＬ（配列番号１６８）を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＡＡＹ若しくはＧＰＧＰＧ（配列番号１５３）を含むか、又はそれからなる。
【0282】
他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、ＧＳＡＴリンカー、すなわち、１つ以上のグリシン、セリン、アラニン及びスレオニン残基を含むリンカー、例えば、配列ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号１５４）を含むか、又はそれからなるリンカー若しくはＳＥＧリンカー、すなわち、１つ以上のセリン、グルタミン酸及びグリシン残基を含むリンカー、例えば、配列ＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１５５）又はＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号１９）を含むか、又はそれからなるリンカーである。
【0283】
他の実施形態では、Ｔ細胞エピトープリンカーは、切断可能なリンカー、例えばエンドペプチダーゼ、例えばフューリン、カスパーゼ、カテプシン等のエンドペプチダーゼのための１つ以上の認識部位を含むリンカーである。切断可能なリンカーは、遊離の機能的タンパク質ドメイン（例えば、より大きな抗原によってコードされる）を放出するために導入されてもよく、これは、減少した生物活性、改変された生体内分布のようなそのようなドメイン間の立体障害、又はそのようなドメインの干渉による他の欠点を克服し得る。
【0284】
Ｔ細胞エピトープリンカーの例は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２０／１７６７９７（Ａ１）号の段落［００９８］～［００９９］及び列挙された配列（特に配列番号３７～６５及び配列番号６７～７６）、並びに参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１９／００２２２０２（Ａ１）号の段落［０１３５］～［０１３９］に開示されている。
【0285】
アレルゲン
本明細書に記載される寛容誘導構築物は、ある範囲の異なるタンパク質アレルゲン、例えば、翻訳後修飾を受けるタンパク質アレルゲンを含む、本開示の構築物のポリヌクレオチドに含まれる核酸配列によってコードされ得るアレルゲンに対する寛容を誘導するのに有用である。
本明細書に記載される寛容誘導構築物は、ある範囲の異なるタンパク質アレルゲン、例えば、翻訳後修飾を受けるタンパク質アレルゲンを含む、本開示の構築物のポリヌクレオチドに含まれる核酸配列によってコードされ得るアレルゲンに対する寛容を誘導するのに有用である。
【0286】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、食物アレルゲンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、甲殻類アレルゲンである。いくつかの実施形態、アレルゲンは、トロポミオシンであり、他の実施形態では、アレルゲンは、アルギニンキナーゼ、ミオシン軽鎖、筋小胞体カルシウム結合タンパク質、トロポニンＣ又はトリオースリン酸イソメラーゼ又はアクチンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、Ｐａｎ ｂ １である。いくつかの実施形態では、抗原単位は、Ｐａｎ ｂ １ Ｔ細胞エピトープ（２５１～２７０）である。
【0287】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、牛乳アレルゲンである。いくつかの実施形態では、牛乳アレルゲンは、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｂｏｓ ｄ ９、Ｂｏｓ ｄ １０、Ｂｏｓ ｄ １１又はＢｏｓ ｄ １２である。
【0288】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、卵アレルゲンである。いくつかの実施形態では、卵アレルゲンは、オボムコイドであり、他の実施形態では、卵アレルゲンは、オボアルブミン、オボトランスフェリン、コンアルブミン、Ｇａｌ ３ ３、卵リゾチーム（egg lyaozyme）、又はオボムチンである。
【0289】
当技術分野で既知であり、卵アレルギーに関連して研究されている１つのＴ細胞エピトープは、アミノ酸配列ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１６８）を有するＯＶＡ（２５７～２６４）である。
【0290】
いくつかの実施形態では、本開示による構築物の抗原単位は、Ｔ細胞エピトープＯＶＡ（２５７～２６４）を含む。当該Ｔエピトープを含む医薬組成物は、卵アレルギーの処置に使用されてもよい。
【0291】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、魚アレルゲンである。いくつかの実施形態では、魚アレルゲンは、パルブアルブミンである。他の実施形態では、魚アレルゲンは、エノラーゼ、アルドラーゼ又はビテロゲニンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、果実アレルゲンである。いくつかの実施形態では、果物アレルゲンは、病原（pathgenesis）関連プロテイン１０、プロフィリン、ｎｓＬＴＰ、タウマチン様プロテイン、ジベレリン調節プロテイン、イソフラボンレダクターゼ関連プロテイン、クラス１キチナーゼ、ベータ１，３グルカナーゼ、ゲルミン様プロテイン、アルカリセリン・プロテアーゼ、病原関連プロテイン１、アクチニジン、フィトシスタチン（phytocyctatin）、キウェリン、主要ラテックス・プロテイン、クシン、又は２Ｓアルブミンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、野菜アレルゲンである。いくつかの実施形態では、野菜アレルゲンは、病原（pathgenesis）関連プロテイン１０、プロフィリン、ｎｓＬＴＰ １型、ｎｓＬＴＰ ２型プロテイン、オスモチン様プロテイン、イソフラボンレダクターゼ様プロテイン、β－フルクトフラノシダーゼ、ＰＲプロテインＴＳＩ－１、シクロフィリン又はＦＡＤ含有オキシダーゼである。
【0292】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、小麦アレルゲンである。いくつかの実施形態では、小麦アレルゲンは、Ｔｒｉ ａ １２、Ｔｒｉ ａ １４、Ｔｒｉ ａ １５、Ｔｒｉ ａ １８、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２０、Ｔｒｉ ａ ２１、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｔｒｉ ａ ２７、Ｔｒｉ ａ ２８、Ｔｒｉ ａ ２９、Ｔｒｉ ａ ３０、Ｔｒｉ ａ ３１、Ｔｒｉ ａ ３２、Ｔｒｉ ａ ３３、Ｔｒｉ ａ ３４、Ｔｒｉ ａ ３５、Ｔｒｉ ａ ３６、Ｔｒｉ ａ ３７又はＴｒｉ ａ ３８である。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、大豆アレルゲンである。いくつかの実施形態では、大豆アレルゲンは、Ｇｌｙ ｍ １、Ｇｌｙ ｍ ２、Ｇｌｙ ｍ ３、Ｇｌｙ ｍ ４、Ｇｌｙ ｍ ５、Ｇｌｙ ｍ ６、Ｇｌｙ ｍ ７又はＧｌｙ ｍ ８である。他の実施形態では、大豆アレルゲンは、Ｇｌｙ ｍアグルチニン、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ２８Ｋ、Ｇｌｙ ｍ ３０ ｋＤ、Ｇｌｙ ｍ ＣＰＩ又はＧｌｙ ｍ ＴＩである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、ピーナッツアレルゲンである。いくつかの実施形態では、ピーナッツアレルゲンは、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ８、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ １０、Ａｒａ ｈ １１、Ａｒａ ｈ １２、Ａｒａ ｈ １３、Ａｒａ ｈ １４、Ａｒａ ｈ １５、Ａｒａ ｈ １６、又はＡｒａ ｈ １７である。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、木の実又は種子アレルゲンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、１１Ｓグロブリン、７Ｓグロブリン、２Ｓグロブリン、ＰＲ１０、ＰＲ－１４ ｎｓＬＴＰ、オレオシン又はプロフィリンである。
【0293】
他の実施形態では、食物アレルゲンは、ソバ、セロリ、着色添加物、ニンニク、グルテン、オート麦、豆果、トウモロコシ、からし、家禽、肉、米、ゴマである。
【0294】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、ハチ毒アレルゲンである。いくつかの実施形態では、ハチ毒アレルゲンは、ホスホリパーゼＡ２、ヒアルロニダーゼ、酸性ホスファターゼ、メリチン、アレルゲンＣ／ＤＰＰ、ＣＲＰ／ｌｃａｒａｐｉｎ又はビテロゲニンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、スズメバチアレルゲンである。いくつかの実施形態では、スズメバチアレルゲンは、ホスホリパーゼＡ１、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼ、ａｎｔｉｇｅｎ ５、ＤＰＰ ＩＶ又はビテロゲニンである。
【0295】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、ラテックスアレルゲンである。いくつかの実施形態では、ラテックスアレルゲンは、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｈｅｖ ｂ ７、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３、Ｈｅｖ ｂ １４、又はＨｅｖ ｂ １５である。
【0296】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、貯蔵庫ダニアレルゲンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、イエダニアレルゲンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、貯蔵庫ダストアレルゲンである。いくつかの実施形態では、イエダニアレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ ２１、又はＤｅｒ ｐ ２３である。いくつかの実施形態では、抗原単位は、Ｄｅｒ ｐ １ Ｔ細胞エピトープ（１１１～１３９）である。いくつかの実施形態では、イエダニアレルゲンは、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ ８又はＤｅｒ ｆ １０である。いくつかの実施形態では、イエダニアレルゲンは、Ｂｌｏｔ ｔ １、Ｂｌｏｔ ｔ ２、Ｂｌｏｔ ｔ ３、Ｂｌｏｔ ｔ ４、Ｂｌｏｔ ｔ ５、Ｂｌｏｔ ｔ ８、Ｂｌｏｔ ｔ １０、Ｂｌｏｔ ｔ １２又はＢｌｏｔ ｔ ２１である。
【0297】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、ゴキブリアレルゲンである。いくつかの実施形態では、ゴキブリアレルゲンは、Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２、Ｂｌａ ｇ ３、Ｂｌａ ｇ ４、Ｂｌａ ｇ ５、Ｂｌａ ｇ ６、Ｂｌａ ｇ ７、Ｂｌａ ｇ ８又はＢｌａ ｇ １１である。いくつかの実施形態では、ゴキブリアレルゲンは、Ｐｅｒ ａ １、Ｐｅｒ ａ ２、Ｐｅｒ ａ ３、Ｐｅｒ ａ ６、Ｐｅｒ ａ ７、Ｐｅｒ ａ ９又はＰｅｒ ａ １０である。
【0298】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、カビアレルゲンである。いくつかの実施形態では、カビアレルゲンは、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）アレルゲンである。いくつかの実施形態では、アスペルギルス・フミガーツスアレルゲンは、Ａｓｐ ｆ １、Ａｓｐ ｆ ２、Ａｓｐ ｆ ３、Ａｓｐ ｆ ４、Ａｓｐ ｆ ５、Ａｓｐ ｆ ６、Ａｓｐ ｆ ７、Ａｓｐ ｆ ８、Ａｓｐ ｆ ９、Ａｓｐ ｆ １０、Ａｓｐ ｆ １１、Ａｓｐ ｆ １２、Ａｓｐ ｆ １３、Ａｓｐ ｆ １４、Ａｓｐ ｆ １５、Ａｓｐ ｆ １６、Ａｓｐ ｆ １７、Ａｓｐ ｆ １８、Ａｓｐ ｆ ２２、Ａｓｐ ｆ ２３、Ａｓｐ ｆ ２７、Ａｓｐ ｆ ２８、Ａｓｐ ｆ ２９、又はＡｓｐ ｆ ３４である。
【0299】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、真菌アレルゲンである。いくつかの実施形態では、真菌アレルゲンは、マラセチアアレルゲンである。いくつかの実施形態では、マラセチアアレルゲンは、Ｍａｌａ ｆ １、Ｍａｌａ ｆ ２、Ｍａｌａ ｆ ３、Ｍａｌａ ｆ ４、Ｍａｌａ ｆ ５、Ｍａｌａ ｆ ６、Ｍａｌａ ｆ ７、Ｍａｌａ ｆ ８、Ｍａｌａ ｆ ９、Ｍａｌａ ｆ １０、Ｍａｌａ ｆ １１、Ｍａｌａ ｆ １２若しくはＭａｌａ ｆ １３又はＭＧＬ＿１２０４である。
【0300】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、毛皮獣アレルゲンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、イヌアレルゲンである。いくつかの実施形態では、イヌアレルゲンは、Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ４、Ｃａｎ ｆ ５、又はＣａｎ ｆ ６である。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、ウマアレルゲンである。いくつかの実施形態では、ウマアレルゲンは、Ｅｃｕ ｃ １、Ｅｃｕ ｃ ２、Ｅｃｕ ｃ ３又はＥｃｕ ｃ ４である。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、ネコアレルゲンである。いくつかの実施形態では、ネコアレルゲンは、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５、Ｆｅｌ ｄ ６、Ｆｅｌ ｄ ７、又はＦｅｌ ｄ ８である。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、実験動物アレルゲンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、リポカリン、尿中プレアルブミン、セクレトグロブリン又は血清アルブミンである。
【0301】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、草本花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態では、草本花粉アレルゲンは、オオアワガエリ、カモガヤ、ケンタッキーブルーグラス、ペレニアルライ麦、ハルガヤ、バヒエ、ジョンソングラス又はギョウギシバアレルゲンである。いくつかの実施形態では、草本花粉アレルゲンは、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ３、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２又はＰｈｌ ｐ １３である。
【0302】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、樹木花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態では、樹木花粉アレルゲンは、ハンノキ、カバノキ、シデ、ハシバミ、ヨーロッパホハシバミ、栗、ヨーロッパブナ、ホワイトオーク、灰、イボタノキ、オリーブ、ライラック、ヒノキ又はスギの花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態では、樹木花粉アレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １若しくはＡｌｎ ｇ ４、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６若しくはＢｅｔ ｖ ７、Ｃａｒ ｂ １、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ６、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０、Ｃｏｒ ａ １１、Ｃｏｒ ａ １２、Ｃｏｒ ａ １３、Ｃｏｒ ａ １４、Ｏｓｔ ｃ １、Ｃａｓ １、Ｃａｓ １５、Ｃａｓ １８、若しくはＣａｓ １９、Ｆａｇ ｓ １、Ｑｕｅ ａ １、Ｆｒａ ｅ １、Ｌｉｇ ｖ １、Ｏｌｅ ｅ １、Ｏｌｅ ｅ ２、Ｏｌｅ ｅ ３、Ｏｌｅ ｅ ４、Ｏｌｅ ｅ ５、Ｏｌｅ ｅ ６、Ｏｌｅ ｅ ７、Ｏｌｅ ｅ ８、Ｏｌｅ ｅ ９、Ｏｌｅ ｅ １０、Ｏｌｅ ｅ １１、若しくはＯｌｅ ｅ １２、Ｓｙｒ ｖ １、Ｃｈａ ｏ １、Ｃｈａ ｏ ２、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ ２、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ｓ ３、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ｏ ４、Ｊｕｎ ｖ １、Ｊｕｎ ｖ ３、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２若しくはＰｌａ ａ ３、又はＰｌａ若しくは１、Ｐｌａ若しくは２又はＰｌａ若しくは３である。いくつかの実施形態では、抗原単位は、Ｂｅｔ ｖ １ Ｔ細胞エピトープ（１３９～１５２）である。
【0303】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、雑草花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態では、雑草アレルゲンは、ブタクサ、ヨモギ、ヒマワリ、ナツシロギク、ペリトリー、ヘラオオバコ、一年生マーキュリー、アカザ、ロシアアザミ又はアマランス花粉アレルゲンである。いくつかの実施形態では、ブタクサ花粉アレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｍｂ ａ ４、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９、Ａｍｂ ａ １０、又はＡｍｂ ａ １１である。いくつかの実施形態では、ヨモギ花粉アレルゲンは、Ａｒｔ ｖ １、Ａｒｔ ｖ ３、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｒｔ ｖ ５、又はＡｒｔ ｖ ６である。いくつかの実施形態では、ヒマワリ花粉アレルゲンは、Ｈｅｌ ａ １又はＨｅｌ ａ ２である。いくつかの実施形態は、ペリトリー花粉アレルゲンは、Ｐａｒ ｊ １、Ｐａｒ ｊ ２、Ｐａｒ ｊ ３又はＰａｒ ｊ ４である。いくつかの実施形態では、ヘラオオバコ花粉アレルゲンは、Ｐｌａ ｌ １である。いくつかの実施形態では、一年生マーキュリー花粉アレルゲンは、Ｍｅｒ ａ １である。いくつかの実施形態では、アカザ花粉アレルゲンは、Ｃｈｅ ａ １、Ｃｈｅ ａ ２又はＣｈｅ ａ ３である。いくつかの実施形態では、ロシアアザミ花粉アレルゲンは、Ｓａｌ ｋ １、Ｓａｌ ｋ ４又はＳａｌ ｋ ５である。いくつかの実施形態では、アマランス花粉アレルゲンは、Ａｍａ ｒ ２である。
【0304】
更に他の実施形態では、アレルゲンは、昆虫、ゴキブリ、イエダニ又はカビ等の環境アレルゲンから選択される。
【0305】
いくつかの実施形態では、アレルギー性疾患は、アレルギー性鼻炎、ぜんそく、アトピー皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患、接触性皮膚炎、薬物アレルギー又はそれらの組み合わせである。
【0306】
薬物に対するアレルギーは、全般集団の７％超が罹患している。本開示の構築物は、そのような薬物中に存在する免疫原性エピトープに対する寛容を誘導し、それにより、罹患した患者が薬物による処置を継続し、薬物処置から利益を受けることを可能にする。
【0307】
したがって、いくつかの実施形態では、アレルゲンは、不要な免疫原性を有する薬物に含まれる。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、第ＶＩＩＩ因子である。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、インスリンである。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、療法に使用される１つ以上のモノクローナル抗体である。
【0308】
自己抗原
他の実施形態では、本寛容誘導構築物は、自己免疫疾患に関与する自己アレルゲンに含まれるＴ細胞エピトープを含有する。これは、概して免疫系を阻害することなく、自己免疫疾患の原因である免疫系の一部の抗原特異的下方制御を可能にする。
他の実施形態では、本寛容誘導構築物は、自己免疫疾患に関与する自己アレルゲンに含まれるＴ細胞エピトープを含有する。これは、概して免疫系を阻害することなく、自己免疫疾患の原因である免疫系の一部の抗原特異的下方制御を可能にする。
【0309】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である。他の実施形態では、自己抗原は、ＭＡＧ、ＭＯＢＰ、ＣＮＰａｓｅ、Ｓ１００ベータ又はトランスアルドラーゼである。いくつかの実施形態では、自己抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）である。
【0310】
実施例において、本発明者らは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）由来の短い（３５～５５アミノ酸）又はより長い（２７～６３アミノ酸）Ｔ細胞エピトープのいずれかを含む、多発性硬化症のための構築物を提供する。ＭＯＧは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、中枢神経系においてのみ発現される。ＭＯＧ（３５～５５）は、自己抗体産生及び再発寛解型神経疾患を誘導することができ、広範なプラーク様脱髄を引き起こす。ＭＯＧ（３５～５５）に対する自己抗体応答は、ＭＳ患者において観察されており、ＭＯＧ（３５～５５）誘導性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、Ｃ５７／ＢＬ６マウス及びＬｅｗｉｓラットにおいて観察されている。
【0311】
当技術分野で既知であり、研究されている他のＭＳ関連Ｔ細胞エピトープとしては、以下のものが挙げられる：
＊Ｔ細胞エピトープ誘導性ＥＡＥが観察された。
好ましい実施形態では、本開示の構築物の抗原単位は、ＭＯＧ（３５～５５）、ＭＯＧ（２７～６３）、ＰＬＰ（１３９～１５１）、ＰＬＰ（１３１～１５９）、ＰＬＰ（１７８～１９１）、ＰＬＰ（１７０～１９９）、ＭＢＰ（８４～１０４）及びＭＢＰ（７６～１１２）からなる群から選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。そのような構築物を含む医薬組成物は、ＭＳの処置において使用されてもよい。
【表1】
好ましい実施形態では、本開示の構築物の抗原単位は、ＭＯＧ（３５～５５）、ＭＯＧ（２７～６３）、ＰＬＰ（１３９～１５１）、ＰＬＰ（１３１～１５９）、ＰＬＰ（１７８～１９１）、ＰＬＰ（１７０～１９９）、ＭＢＰ（８４～１０４）及びＭＢＰ（７６～１１２）からなる群から選択される１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。そのような構築物を含む医薬組成物は、ＭＳの処置において使用されてもよい。
【0312】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５－キロダルトンアイソフォーム（ＧＡＤ６５）であり、これは、１型糖尿病に関与する自己抗原である。いくつかの他の実施形態では、自己抗原は、インスリン、ＩＡ－２又はＺｎＴ８である。更にいくつかの他の実施形態では、自己抗原は、ＩＧＲＰ、ＣｈｇＡ、ＩＡＰＰ、ペリフェリン、テトラスパニン－７、ＧＲＰ７８、ウロコルチン－３又はインスリン遺伝子エンハンサータンパク質ｉｓｌ－１である。
【0313】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、セリアック病である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、α－グリアジン、γ－グリアジン、ω－グリアジン、低分子量グルテニン、高分子量グルテニン、ホルデイン、セカリン、又はアベニンｂである。いくつかの実施形態では、抗原単位は、Ｔ細胞エピトープα－グリアジン（７６～９５）を含む。
【0314】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチである。いくつかの実施形態では、自己抗原は、コラーゲンである。いくつかの実施形態では、自己抗原は、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、Ｂａｎｄ ３である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、核内低分子リボ核タンパク質Ｄ１（ＳｍＤ１）である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）である。いくつかの実施形態では、自己抗原は、ミエリンタンパク質０（Ｐ０）である。
【0315】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、慢性炎症性脱髄性多発神経根ニューロパシー（ＣＩＤＰ）であり、自己抗原は、ニューロファシン１５５である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、橋本甲状腺炎（ＨＴ）であり、自己抗原は、甲状腺ペルオキシダーゼ及び／又はサイログロブリンである。他の実施形態では、自己免疫疾患は、葉状天疱瘡であり、自己抗原は、デスモソーム関連糖タンパク質である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、尋常性天疱瘡であり、自己抗原は、デスモグレイン３である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、甲状腺眼症（ＴＥＤ）であり、自己抗原は、カルシウム結合タンパク質（カルセケストリン）である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、バセドウ病であり、自己抗体は、甲状腺刺激ホルモン受容体である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）であり、自己抗体は、抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、リム様／膜（ＲＬ／Ｍ）及び／又は多核ドット（ＭＮＤ）である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、重症筋無力症であり、自己抗原は、アセチルコリン受容体である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、インスリン抵抗性糖尿病であり、自己抗原は、インスリン受容体である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、免疫介在性溶血性貧血であり、自己抗原は、赤血球である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、リウマチ性関節炎であり、自己抗原は、シトルリン化、ホモシトルリン化タンパク質及びＩｇＧのＦｃ部分である。他の実施形態では、自己免疫疾患は、乾癬であり、自己抗原は、カテリシジン（ＬＬ－３７）、ディスインテグリン様及びメタロプロテアーゼドメイン含有トロンボスポンジン１型モチーフ様５（ＡＤＡＭＴＳＬ５）、ホスホリパーゼＡ２群ＩＶＤ（ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰ－Ａ１）及びケラチン１７である。
【0316】
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、本開示の構築物は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含むポリヌクレオチドである。シグナルペプチドは、ポリペプチド中の標的化単位の配向に応じて、標的化単位のＮ末端又は標的化単位のＣ末端のいずれかに位置する（図１）。シグナルペプチドは、ポリヌクレオチドに含まれる核酸によってコードされるポリペプチドの分泌を、当該ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞において可能にするように設計される。
いくつかの実施形態では、本開示の構築物は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含むポリヌクレオチドである。シグナルペプチドは、ポリペプチド中の標的化単位の配向に応じて、標的化単位のＮ末端又は標的化単位のＣ末端のいずれかに位置する（図１）。シグナルペプチドは、ポリヌクレオチドに含まれる核酸によってコードされるポリペプチドの分泌を、当該ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞において可能にするように設計される。
【0317】
任意の好適なシグナルペプチドが使用されてもよい。好適なペプチドの例は、本明細書に記載される標的化単位のいずれかのＮ末端に天然に存在するヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチド又はシグナルペプチド、例えば、ヒトＩＬ－１０のヒトシグナルペプチド又はヒトＴＧＦβのヒトシグナルペプチドである。
【0318】
したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトＩＬ－１０シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、ヒトＩＬ－１０標的化単位をコードするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトＩｇ ＶＨシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくはｓｃＦｖ、例えばヒト抗ＤＥＣ２０５をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0319】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0320】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0321】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％を有するアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0322】
他の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0323】
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、シグナルペプチドのアミノ酸のいずれか１つは、別のアミノ酸に対して置換、欠失、又は挿入され、但し、５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失、又は挿入されている。
【0324】
配列同一性
配列同一性は、以下のように決定されてもよい：高レベルの配列同一性は、第２の配列が第１の配列に由来する可能性を示す。アミノ酸配列同一性は、２つの整列（アライメント）された配列間で同一のアミノ酸配列を必要とする。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメント後に、候補配列中のアミノ酸の７０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。同一性は、限定されるものではないが、ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＷ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）等のコンピューター分析、及びそこに提案されているデフォルトパラメータによって決定されてもよい。このプログラムをそのデフォルト設定で使用して、クエリー及び参照ポリペプチドの成熟（生物活性）部分を整列させる。完全に保存された残基の数を計数し、参照ポリペプチドの長さで割る。そうすることで、クエリー配列の一部を形成する任意のタグ又は融合タンパク質配列は、アラインメント及びその後の配列同一性の決定において無視される。
配列同一性は、以下のように決定されてもよい：高レベルの配列同一性は、第２の配列が第１の配列に由来する可能性を示す。アミノ酸配列同一性は、２つの整列（アライメント）された配列間で同一のアミノ酸配列を必要とする。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメント後に、候補配列中のアミノ酸の７０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。同一性は、限定されるものではないが、ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＷ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）等のコンピューター分析、及びそこに提案されているデフォルトパラメータによって決定されてもよい。このプログラムをそのデフォルト設定で使用して、クエリー及び参照ポリペプチドの成熟（生物活性）部分を整列させる。完全に保存された残基の数を計数し、参照ポリペプチドの長さで割る。そうすることで、クエリー配列の一部を形成する任意のタグ又は融合タンパク質配列は、アラインメント及びその後の配列同一性の決定において無視される。
【0325】
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、ヌクレオチド配列を整列させるために同様に使用されてもよい。配列同一性は、アミノ酸配列について示したのと同様の方法で計算されてもよい。
【0326】
配列の比較に利用される別の好ましい数学的アルゴリズムは、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡ配列アラインメントソフトウェアパッケージ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１３２：１８５－２１９）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。Ａｌｉｇｎは、グローバルアラインメントに基づいて配列同一性を計算する。Ａｌｉｇｎ０は、配列の末端におけるギャップにペナルティを課さない。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮ及びＡｌｉｇｎ０プログラムを利用する場合、ギャップ開口／伸長ペナルティが－１２／－２であるＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリックスが好ましくは使用される。
【0327】
アミノ酸配列変異体は、寛容誘導構築物をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されてもよい。そのような改変としては、例えば、アミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換が挙げられる。アミノ酸配列及び配列同一性に関して本明細書で使用される置換された／置換、欠失した／欠失及び挿入した／挿入という用語は、当業者に周知であり、明らかである。最終構築物が所望の特徴を有する限り、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達することができる。例えば、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換は、サイレント変化を生じ、機能的に等価なペプチド／ポリペプチドをもたらし得る。
【0328】
意図的なアミノ酸置換は、物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいてなされてもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジン及びアルギニンが挙げられ；同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
【0329】
本明細書に包含されるのは、保存的置換、すなわち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性等の同種置換、及び非保存的置換、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、あるいはオルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシン、オルニチン、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシン等の非天然アミノ酸を含めることを伴う置換である。なされ得る保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン（aaline）、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、スレオニン）、大アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン）及び小アミノ酸（グリシン、アラニン）の群内である。
【0330】
置換はまた、非天然アミノ酸によって行われてもよく、置換残基としては、アルファ＊及びアルファ－二置換＊アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ－ＣＩ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｂｒ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｉ－フェニルアラニン＊、Ｌ－アリルグリシン＊、β－アラニン＊、Ｌ－ａ－アミノ酪酸＊、Ｌ－ｙ－アミノ酪酸＊、Ｌ－ａ－アミノイソ酪酸＊、Ｌ－ｅ－アミノカプロン酸＊、７－アミノヘプタン酸＊、Ｌ－メチオニンスルホン＊、Ｌ－ノルロイシン＊、Ｌ－ノルバリン＊、ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン＊、Ｌ－ヒドロキシプロリン＊、Ｌ－チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４－メチル－Ｐｈｅ＊、ペンタメチル－Ｐｈｅ＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－アミノ）＃、Ｌ－Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－イソプロピル）＊、Ｌ－Ｔｉｃ（ｌ，２，３，４テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシル酸）＊、Ｌ－ジアミノプロピオン酸＊並びにＬ－Ｐｈｅ（４－ベンジル）＊が挙げられる。
【0331】
上の段落において、＊は置換残基の疎水性を示し、＃は置換残基の親水性を示し、＃＊は置換残基の両親媒性を示す。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ－アラニン残基等のアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基又はプロピル基等のアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入されてもよい好適なスペーサー基を含んでもよい。更なる変形形態は、ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を伴う。
【0332】
ポリヌクレオチド
本開示の寛容誘導構築物は、ポリヌクレオチドの形態であってもよい。
本開示の寛容誘導構築物は、ポリヌクレオチドの形態であってもよい。
【0333】
本開示の更なる態様は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであり、ポリペプチドは、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、
ｂ．第１の接合領域；
ｃ．抗原単位；
ｄ．第２の接合領域；及び
ｅ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
ａ．第１の標的化単位、
ｂ．第１の接合領域；
ｃ．抗原単位；
ｄ．第２の接合領域；及び
ｅ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
【0334】
ポリヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖のいずれかのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。好ましい実施形態では、構築物は、ＤＮＡプラスミドであり、すなわちポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。
【0335】
ポリヌクレオチドは、それが投与される種における使用のために最適化されることが好ましい。したがって、ヒトへの投与のためには、ポリヌクレオチド配列がヒトコドン最適化されていることが好ましい。
【0336】
ポリペプチド及び多量体／二量体タンパク質
本開示の寛容誘導構築物は、上記のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの形態であってもよい。
本開示の寛容誘導構築物は、上記のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの形態であってもよい。
【0337】
本開示の更なる態様は、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含むポリペプチドであり、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含むポリペプチドであり、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
【0338】
ポリペプチドは、寛容誘導構築物の産生のために、例えば、構築物を含む医薬組成物の産生のためにインビトロで発現されてもよく、又はポリペプチドは、上記のように、対象へのポリヌクレオチドの投与の結果としてインビボで発現されてもよい。多量体化／二量体化単位の存在により、多量体／二量体タンパク質は、ポリペプチドが発現される場合、すなわち、複数のポリペプチドをそれらのそれぞれの多量体化／二量体化単位を介して連結することによって、形成される。
【0339】
多量体タンパク質
本開示の更なる態様は、複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質であり、ポリペプチドの各々は、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
複数のポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている。
本開示の更なる態様は、複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質であり、ポリペプチドの各々は、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
複数のポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている。
【0340】
多量体タンパク質は、インビトロでのポリペプチドの発現によって調製されてもよい。
【0341】
したがって、本開示の更なる態様は、複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質を調製するための方法であり、ポリペプチドの各々は、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
複数のポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結され、方法は、
ａ．ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ．細胞を培養することと、
ｃ．細胞から多量体タンパク質を収集することと、
ｄ．多量体タンパク質の画分を単離及び精製することであって、複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、単離及び精製することと、を含む。
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
複数のポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結され、方法は、
ａ．ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ．細胞を培養することと、
ｃ．細胞から多量体タンパク質を収集することと、
ｄ．多量体タンパク質の画分を単離及び精製することであって、複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、単離及び精製することと、を含む。
【0342】
ステップｄ．における多量体タンパク質の単離及び任意選択の精製は、沈殿、示差的可溶化及びクロマトグラフィーを含む、当技術分野で既知の方法によって行うことができる。
【0343】
本開示の多量体タンパク質は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置のためのタンパク質ワクチンにおける活性成分として使用されてもよい。
【0344】
多量体／二量体タンパク質は、ホモ多量体又はヘテロ多量体であってもよく、例えばタンパク質が二量体タンパク質である場合、二量体タンパク質は、ホモ二量体、すなわち２つのポリペプチド鎖が同一であり、結果として同一の単位、したがって抗原配列を含む二量体タンパク質であってもよく、又は二量体タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であってもよく、ポリペプチド鎖１は、その抗原単位においてポリペプチド２とは異なる抗原配列を含む。後者は、抗原単位に含めるための抗原の数が抗原単位のサイズ上限を超える場合に関連し得る。二量体タンパク質は、ホモ二量体タンパク質であることが好ましい。
【0345】
二量体タンパク質
本開示の更なる態様は、２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質であり、ポリペプチドの各々は、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
２つのポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている。
本開示の更なる態様は、２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質であり、ポリペプチドの各々は、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
２つのポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている。
【0346】
二量体タンパク質は、インビトロでのポリペプチドの発現によって調製されてもよい。
【0347】
したがって、本開示の更なる態様は、２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質を調製するための方法であり、ポリペプチドの各々は、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
２つのポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されており、方法は、
ａ．ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ．細胞を培養することと、
ｃ．細胞から二量体タンパク質を収集することと、
ｄ．二量体タンパク質の画分を単離及び精製することであって、２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、単離及び精製することと、を含む。
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、
２つのポリペプチドは、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されており、方法は、
ａ．ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ．細胞を培養することと、
ｃ．細胞から二量体タンパク質を収集することと、
ｄ．二量体タンパク質の画分を単離及び精製することであって、２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、単離及び精製することと、を含む。
【0348】
ステップｄ）における二量体タンパク質の単離及び精製は、沈殿、示差的可溶化及びクロマトグラフィーを含む、当技術分野で既知の方法によって行うことができる。
【0349】
本開示の二量体タンパク質は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置のためのタンパク質ワクチンにおける活性成分として使用されてもよい。
【0350】
ベクター
寛容誘導構築物のポリヌクレオチド配列は、宿主細胞をトランスフェクトし、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド又は多量体／二量体タンパク質を発現させるのに好適なベクター、すなわち発現ベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチド、例えばＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドであってもよい。別の実施形態では、ベクターは、宿主細胞をトランスフェクトし、ポリペプチド又は多量体／二量体タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現させるのに好適である。
寛容誘導構築物のポリヌクレオチド配列は、宿主細胞をトランスフェクトし、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド又は多量体／二量体タンパク質を発現させるのに好適なベクター、すなわち発現ベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチド、例えばＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドであってもよい。別の実施形態では、ベクターは、宿主細胞をトランスフェクトし、ポリペプチド又は多量体／二量体タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現させるのに好適である。
【0351】
本発明のベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の外来核酸配列を細胞内に運ぶのに好適な任意の分子であってもよく、そこでそれらを発現させることができ、すなわち発現ベクターである。
【0352】
一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡプラスミド等のＤＮＡベクター、又はアデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス及びセンダイウイルスからなる群から選択されるＤＮＡウイルスベクター等のＤＮＡウイルスベクターである。
【0353】
別の実施形態では、ベクターは、ＲＮＡプラスミド等のＲＮＡベクター、又はレトロウイルスベクター、例えばアルファウイルス、レンチウイルス、モロニーネズミ白血病ウイルス及びラブドウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスベクター等のＲＮＡウイルスベクターである。
【0354】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターであり、より好ましくはＤＮＡプラスミドである。
【0355】
好ましくは、ベクターは、上記の様々な単位、特に個別化された寛容誘導構築物の場合には抗原単位の容易な交換を可能にする。
【0356】
したがって、本開示は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、ポリペプチドは、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位、を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位、を含み、抗原単位は、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
【0357】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ｐＡＬＤ－ＣＶ７７、又は対象に導入された場合に好ましくない方法で免疫応答を誘因することが知られている細菌ヌクレオチド配列を含まない任意の他のベクターであってもよい。抗原単位は、好都合な制限酵素によって制限された抗原単位カセット、例えば、５’部位がＧＬＧＧＬ（配列番号１０２）及び／又はＧＬＳＧＬ（配列番号４０）単位リンカーをコードするヌクレオチド配列に組み込まれ、３’部位がベクター中の終止コドンの後に含まれるＳｆｉＩ制限酵素カセットと交換されてもよい。
【0358】
好ましい実施形態では、ベクターはＤＮＡプラスミドであり、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【0359】
ＤＮＡプラスミド
プラスミドは、染色体ＤＮＡから物理的に分離され、独立して複製することができる細胞内の小さな染色体外ＤＮＡ分子である。プラスミドは、細菌において小さな環状の二本鎖ＤＮＡ分子として主に見出される。しかし、プラスミドは、場合により古細菌及び真核生物に存在する。人工プラスミドは、分子クローニングにおけるベクターとして広く使用され、宿主生物内での組換えＤＮＡ配列の送達のために、及びその高発現を確実にするために役立つ。プラスミドは、プラスミドを含む細胞の選択のための特徴、例えば、抗生物質耐性のための遺伝子、複製起点、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）及び挿入された目的の遺伝子の発現を駆動するためのプロモーター等を含む、いくつかの重要な特徴を含む。
プラスミドは、染色体ＤＮＡから物理的に分離され、独立して複製することができる細胞内の小さな染色体外ＤＮＡ分子である。プラスミドは、細菌において小さな環状の二本鎖ＤＮＡ分子として主に見出される。しかし、プラスミドは、場合により古細菌及び真核生物に存在する。人工プラスミドは、分子クローニングにおけるベクターとして広く使用され、宿主生物内での組換えＤＮＡ配列の送達のために、及びその高発現を確実にするために役立つ。プラスミドは、プラスミドを含む細胞の選択のための特徴、例えば、抗生物質耐性のための遺伝子、複製起点、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）及び挿入された目的の遺伝子の発現を駆動するためのプロモーター等を含む、いくつかの重要な特徴を含む。
【0360】
概して、プロモーターは、遺伝子が転写されるように、開始因子及びポリメラーゼをプロモーターに誘引することができる配列である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近く、ＤＮＡの上流に位置する。プロモーターは、約１００～１０００塩基対長であることができる。プロモーターの性質は、通常、遺伝子及び転写産物並びに部位に動員されるＲＮＡポリメラーゼのタイプ又はクラスに依存する。ＲＮＡポリメラーゼがプラスミドのＤＮＡを読み取ると、ＲＮＡ分子が転写される。プロセシング後、リボソームがｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する場合、ｍＲＮＡは何度も翻訳され得、したがって、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質の多くのコピーを生じる。概して、リボソームは、相補的ｔＲＮＡアンチコドン配列のｍＲＮＡコドンへの結合を誘導することによって、解読を促進する。ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡがリボソームを通過し、リボソームによって「読み取られる」際に一緒に連鎖してポリペプチドになる特定のアミノ酸を保有する。翻訳は、開始、伸長及び終結の３つの段階で進行する。翻訳プロセスに続いて、ポリペプチドは、折り畳まれて活性タンパク質になり、細胞中でその機能を果たすか、又は細胞から輸送され、場合によりかなりの数の翻訳後修飾の後に、他の場所でその機能を果たす。
【0361】
タンパク質が細胞外に輸送されることになっている場合、シグナルペプチドは、タンパク質を小胞体に向かわせ、そこでシグナルペプチドは、切断され、タンパク質は、翻訳が終了した後に細胞末梢に移される。
【0362】
本発明のＤＮＡプラスミドは、いかなる特定のプラスミドにも限定されず、当業者は、好適な骨格を有する任意のプラスミドが、本開示の要素及び単位を含むように、当技術分野で既知の方法によって選択及び操作できることを理解するであろう。
【0363】
宿主細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0364】
いくつかの実施形態では、本開示は、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ポリヌクレオチドを含むベクター、を含む宿主細胞を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ポリヌクレオチドを含むベクター、を含む宿主細胞を提供する。
【0365】
好適な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は高等真核生物細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞、好ましくは免疫疾患に罹患しており本開示の構築物による予防的又は治療的処置を必要とするヒト個体の細胞である。
【0366】
ポリシストロン性ベクター
いくつかの実施形態では、上記のベクターは、本開示のポリペプチドの発現、及び加えて、別個の分子としての１つ以上の免疫阻害性化合物の発現を可能にするポリシストロン性ベクターである。
いくつかの実施形態では、上記のベクターは、本開示のポリペプチドの発現、及び加えて、別個の分子としての１つ以上の免疫阻害性化合物の発現を可能にするポリシストロン性ベクターである。
【0367】
本開示の更なる態様は、
（Ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチドと、
（Ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の核酸配列と、を含むベクターであり、
ベクターは、ポリペプチドと１つ以上の免疫阻害化合物とを別々の分子として共発現させることを可能にする。
（Ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチドと、
（Ｂ）１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の核酸配列と、を含むベクターであり、
ベクターは、ポリペプチドと１つ以上の免疫阻害化合物とを別々の分子として共発現させることを可能にする。
【0368】
１つ以上の免疫阻害化合物は、寛容を誘導する様式で、又は例えば、寛容を維持する細胞の誘導に有利に働くか、又はそのような細胞を維持するのを助けることによって、抗原単位におけるエピトープの提示に有利に働く環境を生成又は促進するのを助ける。
【0369】
本開示のポリシストロニックベクターは、任意の好適なベクター、例えば、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターであってもよい。好ましい実施形態では、ベクターは、ポリシストロン性ＤＮＡプラスミドである。本開示のポリシストロン性ベクターは、ＤＮＡプラスミド（すなわち、本開示のポリシストロン性ＤＮＡプラスミド）を考察して示されるが、その考察は、他のベクター、例えばウイルスベクターにも当てはまることが理解される。
【0370】
ポリシストロン性プラスミドは、当技術分野で既知であり、したがって、当業者は、本開示のポリシストロン性プラスミドを設計及び構築することができる。
【0371】
好ましい実施形態では、本開示のポリシストロン性プラスミドは、１つ以上の共発現エレメント、すなわち、プラスミドからのポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害性化合物の別々の分子としての共発現を可能にする核酸配列を含む。
【0372】
本開示のいくつかの実施形態では、ポリシストロン性プラスミドは、ポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物が単一の転写物上で転写されるが、独立してポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害化合物に翻訳されることを引き起こす、共発現エレメントを含む。したがって、共発現エレメントの存在は、別個の翻訳産物の最終産生をもたらす。
【0373】
いくつかの実施形態では、そのような共発現エレメントは、ＩＲＥＳエレメント（内部リボソーム進入部位）である。他の実施形態では、そのような共発現エレメントは、２Ａ自己切断ペプチド（２Ａペプチド）である。両方の共発現エレメントは、当技術分野で既知である。
【0374】
２つ以上の免疫阻害性化合物が本開示のポリシストロン性プラスミドから発現される場合、ＩＲＥＳエレメント及び／又は２Ａペプチドは、プラスミド中に、例えば、免疫阻害性化合物をコードする各核酸配列の上流に存在する必要がある。
【0375】
他の実施形態では、ポリシストロン性プラスミドは、ポリペプチド及び１つ以上の免疫阻害性化合物が別個の転写物として転写されることを引き起こす共発現エレメントを含み、これは、別個の転写産物、したがって別個のタンパク質を生じさせる。
【0376】
いくつかの実施形態では、そのような共発現エレメントは、双方向性プロモーターである。
【0377】
他の実施形態では、そのような共発現エレメントは、様々なプロモーターであり、すなわち、ポリシストロン性プラスミドは、ポリペプチド又は１つ以上の免疫阻害化合物のいずれかをコードするヌクレオチド配列の各々についてのプロモーターを含む。両方の共発現エレメントは、当技術分野で既知である。
【0378】
上記の共発現エレメントは、任意の様式で組み合わせることができ、すなわち、本開示のポリシストロン性プラスミドは、そのような同じ又は異なる共発現エレメントのうちの１つ又はいくつかを含んでもよい。
【0379】
免疫阻害性化合物
本開示のポリシストロン性プラスミドは、１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の核酸配列を含む。
本開示のポリシストロン性プラスミドは、１つ以上の免疫阻害化合物をコードする１つ以上の核酸配列を含む。
【0380】
本開示のいくつかの実施形態では、免疫阻害性化合物は、免疫寛容を誘導、増加又は維持することが知られている化合物である。
【0381】
本開示のいくつかの実施形態では、免疫阻害化合物は、阻害性チェックポイント分子の細胞外部分である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイント分子は、ＣＬＴＡ－４（配列番号７２）、ＰＤ－１（配列番号７４）、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイント分子は、ＣＬＴＡ－４（配列番号７２）である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイント分子は、ＰＤ－１（配列番号７４）である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイント分子は、ＢＴＬＡである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイント分子は、ＴＩＭ－３である。本開示のいくつかの実施形態では、免疫阻害化合物は、ＩＬ－１０（配列番号６６）、ＴＧＦβ１（配列番号６０）、ＴＧＦβ２（配列番号６２）、ＴＧＦβ３（配列番号６４）、ＩＬ－２７、ＩＬ－２、ＩＬ－３７及びＩＬ－３５からなる群から選択されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１０（配列番号６６）である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＴＧＦβ１（配列番号６０）である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＴＧＦβ２（配列番号６２）である。いくつかの実施形態、サイトカインは、ＴＧＦβ３（配列番号６４）である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２７である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－３７である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－３５である。
【0382】
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、２、３、４、５、６、７又は８個の免疫阻害化合物をコードする核酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、２～６個の免疫阻害化合物、例えば２又は３又は４又は５又は６個の異なる免疫阻害化合物をコードする核酸配列を含む。免疫阻害化合物は、同じであっても異なっていてもよく、好ましくは異なっている。
【0383】
好ましい実施形態では、異なる免疫阻害化合物は、多くの異なるレベルで寛容誘導環境を生成又は促進する。例として、本開示のプラスミドは、３つの異なる免疫阻害化合物をコードする核酸配列を含んでもよく、第１のものは寛容を誘導し、第２のものは寛容を増加させ、第３のものは寛容を維持する。
【0384】
医薬組成物
本開示の構築物は、構築物、例えばポリヌクレオチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質の形態と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物として対象に投与されてもよい。
本開示の構築物は、構築物、例えばポリヌクレオチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質の形態と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物として対象に投与されてもよい。
【0385】
本開示の構築物は、構築物、例えば、ポリヌクレオチド又は多量体タンパク質の形態と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物として対象に投与されてもよい。
【0386】
本開示の構築物は、構築物、例えば、ポリヌクレオチド又は二量体タンパク質の形態と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物として対象に投与されてもよい。
【0387】
本開示の更なる態様は、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリペプチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物である。
ｉ）ポリペプチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリペプチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物である。
【0388】
本開示の更なる態様は、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリペプチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物である。
ｉ）ポリペプチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリペプチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物である。
【0389】
本開示の更なる態様は、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリペプチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物である。好適な薬学的に許容される担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、例えばＰＢＳ、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、滅菌等張水性緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
ｉ）ポリペプチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリペプチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物である。好適な薬学的に許容される担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、例えばＰＢＳ、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、滅菌等張水性緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0390】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体又は希釈剤は、水性緩衝液である。他の実施形態では、水性緩衝液は、タイロード緩衝液、例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ ７．４及び１０ｍＭグルコースを含むタイロード緩衝液である。
【0391】
好適なアジュバントとしては、デキサメタゾン、エンテロトキシンコレラ毒素（ＣＴＢ）のＢサブユニット、ＴＬＲ２リガンド、蠕虫由来排出／分泌（ＥＳ）産物、ラパマイシン、又はビタミンＤ３類似体及びアリール炭化水素受容体リガンドが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0392】
いくつかの特定の実施形態では、組成物は、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む薬学的に許容される両親媒性ブロックコポリマーを含んでもよい。
【0393】
本明細書で使用される「両親媒性ブロックコポリマー」は、ポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）のブロック及びポリ（プロピレンオキシド）（「ＰＰＯ」）のブロックを含むか、又はそれからなる直鎖状又は分岐状コポリマーである。有用なＰＥＯ－ＰＰＯ両親媒性ブロックコポリマーの典型的な例は、一般構造ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ（ポロキサマー）、ＰＰＯ ＰＥＯ ＰＰＯ、（ＰＥＯ ＰＰＯ－）４ＥＤ（ポロキサミン）、及び（ＰＰＯ ＰＥＯ－）４ＥＤ（逆ポロキサミン）を有し、式中、「ＥＤ」はエチレンジアミニル基である。
【0394】
「ポロキサマー」は、ＰＥＯの１つのブロックに結合したポリ（プロピレンオキシド）の１つのブロックに結合したポリ（エチレンオキシド）の１つのブロックによって構成される線状両親媒性ブロックコポリマー、すなわち、式ＥＯａ－ＰＯｂ－ＥＯａの構造であり、式中、ＥＯはエチレンオキシドであり、ＰＯはプロピレンオキシドであり、ａは２～１３０の整数であり、ｂは１５～６７の整数である。ポロキサマーは、通常、３桁の識別子を使用することによって命名され、最初の２桁に１００を掛けると、ＰＰＯ含量のおよその分子量が得られ、最後の桁に１０を掛けると、ＰＥＯ含量のおよそのパーセンテージが示される。例えば、「ポロキサマー１８８」は、約１８００の分子量のＰＰＯブロック（ｂが約３１ ＰＰＯであることに対応する）及び約８０％（ｗ／ｗ）のＰＥＯ（ａが約８２であることに対応する）を含むポリマーを指す。しかしながら、値はある程度変動することが知られており、研究グレードのＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８及び臨床グレードのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８等の市販製品は、製造者のデータシートによれば両方ともＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８であり、分子量の大きな変動（７，６８０～９，５１０）を示し、これらの特定の製品について提供されるａ及びｂの値は、それぞれ約７９及び２８であることが示されている。これは、ブロックコポリマーの不均一な性質を反映しており、ａ及びｂの値が最終配合物中に見出される平均であることを意味する。
【0395】
「ポロキサミン」又は「連続ポロキサミン」（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）の商品名で市販されている）は、ＰＥＯ－ＰＰＯアームに含まれる遊離ＯＨ基とエチレンジアミン部分中の第一級アミン基との間の結合を介して中心エチレンジアミン部分に接続された４つのＰＥＯ－ＰＰＯアームを有するＸ型ブロックコポリマーである。逆ポロキサミンも同様に、ＰＰＯ－ＰＥＯアームに含まれる遊離ＯＨ基とエチレンジアミン中の第一級アミン基との間の結合を介して中心エチレンジアミン部分に接続された４つのＰＰＯ－ＰＥＯアームを有するＸ型ブロックコポリマーである。
【0396】
好ましい両親媒性ブロックコポリマーは、ポロキサマー又はポロキサミンである。ポロキサマー４０７及び１８８が好ましく、特にポロキサマー１８８が好ましい。好ましいポロキサミンは、式（ＰＥＯ－ＰＰＯ）４－ＥＤの連続ポロキサミンである。特に好ましいポロキサミンは、それぞれ登録商標Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０４、７０４、及び３０４として市販されているものである。これらのポロキサミンの特性は以下の通りである：Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０４は、６７００の総平均分子量、４０２０のＰＰＯ単位の総平均重量、及び約４０％のＰＥＯパーセンテージを有する。Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）７０４は、５５００の総平均分子量、３３００のＰＰＯ単位の総平均重量、及び約４０％のＰＥＯパーセンテージを有する。Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）３０４は、１６５０の総平均分子量、９９０のＰＰＯ単位の総平均重量、及び約４０％のＰＥＯパーセンテージを有する。
【0397】
いくつかの実施形態では、組成物は、０．２％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～１０％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～８％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～６％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ～４％ｗ／ｖ、０．４％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．６％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖ、又は２％ｗ／ｖ～４％ｗ／ｖの量で両親媒性ブロックコポリマーを含む。特に好ましいのは、０．５％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖの範囲の量である。他の実施形態では、組成物は、２％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖ、例えば約３％ｗ／ｖの量で両親媒性ブロックコポリマーを含む。ポリヌクレオチドを含む医薬組成物について、組成物は、細胞のトランスフェクションを容易にする分子を更に含んでもよい。
【0398】
医薬組成物は、対象、例えば自己免疫疾患、アレルギー性疾患又は移植片拒絶に罹患しているか罹患している疑いのある患者への投与に好適な任意の方法で、例えば皮内又は筋肉内注射のために製剤化されてもよい。
【0399】
いくつかの実施形態では本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む医薬組成物、例えば、ポリシストロニックベクター等のベクターに含まれる医薬組成物は、皮内、筋肉内、若しくは皮下注射によって、又は鼻腔内若しくは経口投与等の粘膜若しくは上皮適用によって投与される等、対象への投与に好適な任意の方法で投与されてもよい。
【0400】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含み、例えばポリシストロニックベクター等のベクターに含まれ、筋肉内又は皮内注射によって投与される。
【0401】
本開示の医薬組成物は、典型的には、０．１μｇ～１０ｍｇの範囲、例えば、約０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ以上；例えば、０．１～１０ｍｇ、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９若しくは１ｍｇ、又は例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇのポリヌクレオチドを含む。本開示の医薬組成物は、典型的には、５μｇ～５ｍｇの範囲のポリペプチド／二量体タンパク質を含む。
【0402】
ポリヌクレオチド／ポリペプチド／多量体又は二量体タンパク質の量は、医薬組成物が予防的又は治療的処置のために投与されるかどうか、免疫疾患に罹患している個体における免疫疾患の重症度、並びに年齢、体重、性別、病歴及び既応症のようなパラメータに応じて変動してもよい。
【0403】
医薬組成物を調製するための方法
本開示による医薬組成物又はワクチンを調製するための好適な方法は、国際公開第２００４／０７６４８９（Ａ１）号、国際公開第２０１１／１６１２４４（Ａ１）号、国際公開第２０１３／０９２８７５（Ａ１）号及び国際公開第２０１７／１１８６９５（Ａ１）号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本開示による医薬組成物又はワクチンを調製するための好適な方法は、国際公開第２００４／０７６４８９（Ａ１）号、国際公開第２０１１／１６１２４４（Ａ１）号、国際公開第２０１３／０９２８７５（Ａ１）号及び国際公開第２０１７／１１８６９５（Ａ１）号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【0404】
一態様では、本開示は、ポリペプチドをインビトロで産生することによって、多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質、又は上記で定義したポリペプチド、を含む医薬組成物を調製するための方法に関する。ポリペプチド及びタンパク質のインビトロ合成は、当業者に既知の任意の好適な方法によって、例えば、ペプチド合成又は種々の発現系におけるポリペプチドの発現とそれに続く精製によって行われてもよい。
【0405】
したがって、本開示の更なる態様は、複数のポリペプチドからなる二量体タンパク質等の多量体タンパク質；又はポリペプチド、を含む医薬組成物を調製するための方法であって、
ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、トランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することと、
ｃ）二量体タンパク質等の多量体タンパク質、又は細胞から発現されたポリペプチドを収集及び精製することと、
ｄ）ステップｃ）から得られた二量体タンパク質等の多量体タンパク質又はポリペプチドを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法である。
ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、トランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することと、
ｃ）二量体タンパク質等の多量体タンパク質、又は細胞から発現されたポリペプチドを収集及び精製することと、
ｄ）ステップｃ）から得られた二量体タンパク質等の多量体タンパク質又はポリペプチドを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法である。
【0406】
したがって、本開示の更なる態様は、複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質；又はポリペプチド、を含む医薬組成物を調製するための方法であって、
ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、トランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することと、
ｃ）細胞から発現された多量体タンパク質又はポリペプチドを収集及び精製することと、
ｄ）ステップｃ）から得られた多量体タンパク質又はポリペプチドを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法である。
ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、トランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することと、
ｃ）細胞から発現された多量体タンパク質又はポリペプチドを収集及び精製することと、
ｄ）ステップｃ）から得られた多量体タンパク質又はポリペプチドを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法である。
【0407】
したがって、本開示の更なる態様は、２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質；又はポリペプチド、を含む医薬組成物を調製するための方法であって、
ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、トランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することと、
ｃ）細胞から発現された二量体タンパク質又はポリペプチドを収集及び精製することと、
ｄ）ステップｃ）から得られた二量体タンパク質又はポリペプチドを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法である。
ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、トランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することと、
ｃ）細胞から発現された二量体タンパク質又はポリペプチドを収集及び精製することと、
ｄ）ステップｃ）から得られた二量体タンパク質又はポリペプチドを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法である。
【0408】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるベクターに含まれる。
【0409】
好ましい実施形態では、ステップｃ）から得られた二量体タンパク質等の多量体タンパク質又はポリペプチドは、当該薬学的に受容される担体に溶解される。
【0410】
好ましい実施形態では、ステップｃ）から得られた多量体タンパク質又はポリペプチドは、当該薬学的に許容される担体に溶解される。
好ましい実施形態では、ステップｃ）から得られた二量体タンパク質又はポリペプチドは、当該薬学的に許容される担体に溶解される。精製は、クロマトグラフィー、遠心分離、又は溶解度差等の任意の好適な方法に従って行われてもよい。
好ましい実施形態では、ステップｃ）から得られた二量体タンパク質又はポリペプチドは、当該薬学的に許容される担体に溶解される。精製は、クロマトグラフィー、遠心分離、又は溶解度差等の任意の好適な方法に従って行われてもよい。
【0411】
別の態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を調製するための方法であって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、方法が、
ａ）ポリヌクレオチドを調製することと、
ｂ）任意選択で、ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすることと、
ｃ）ステップａ）から得られたポリヌクレオチド又はステップｂ）から得られたベクターを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法に関する。
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含み、方法が、
ａ）ポリヌクレオチドを調製することと、
ｂ）任意選択で、ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすることと、
ｃ）ステップａ）から得られたポリヌクレオチド又はステップｂ）から得られたベクターを薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法に関する。
【0412】
ポリヌクレオチドは、当業者に既知の任意の好適な方法によって調製されてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学合成によって調製されてもよい。
【0413】
発現ベクターは、本明細書に記載されるベクターのいずれであってもよい。
【0414】
特に、標的化単位及び／又は二量体化単位をコードするヌクレオチド配列は、個々に合成され得、次いで、ベクター骨格にライゲートされて、抗原単位をコードする核酸配列をベクターにライゲートすることによって最終ポリヌクレオチドを産生してもよい。
【0415】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の構築物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質の、医薬品としての使用に関する。
【0416】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の構築物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質の、医薬品としての使用に関する。
【0417】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の構築物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質の、医薬品としての使用に関する。
【0418】
医薬品
一態様では、本開示は、本明細書に記載の構築物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多量体タンパク質又は二量体タンパク質の、医薬品としての使用に関する。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の構築物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多量体タンパク質又は二量体タンパク質の、医薬品としての使用に関する。
【0419】
投与
本開示の構築物又は医薬組成物は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患又は移植片拒絶を処置するために使用され得、処置は、予防目的又は治療目的のいずれかであってもよい。
本開示の構築物又は医薬組成物は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患又は移植片拒絶を処置するために使用され得、処置は、予防目的又は治療目的のいずれかであってもよい。
【0420】
構築物／医薬組成物は、そのような医薬組成物を投与された個体において寛容を誘導するように投与される。寛容は、単回投与、及び好ましくは適切な時間間隔を置いた複数回投与のいずれかによって誘導される。
【0421】
更なる態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有するか、又はその防止を必要とする対象を処置するための方法であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0422】
更なる態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有するか、又はその防止を必要とする対象を処置するための方法であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0423】
更なる態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有するか、又はその防止を必要とする対象を処置するための方法であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0424】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供する。
【0425】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供する。
【0426】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供する。
【0427】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0428】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いのある対象の予防的又は治療的処置において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供し、
医薬組成物は、当該対象に投与される。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供し、
医薬組成物は、当該対象に投与される。
【0429】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いのある対象の予防的又は治療的処置において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供し、
医薬組成物は、当該対象に投与される。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供し、
医薬組成物は、当該対象に投与される。
【0430】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いのある対象の予防的又は治療的処置において使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供し、
医薬組成物は、当該対象に投与される。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物を提供し、
医薬組成物は、当該対象に投与される。
【0431】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0432】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置のための医薬組成物の使用であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0433】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置のための医薬組成物の使用であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0434】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置のための医薬組成物の使用であって、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0435】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0436】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いのある対象の予防的又は治療的処置のための医薬品の製造のための医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0437】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いのある対象の予防的又は治療的処置のための医薬品の製造のための医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0438】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いのある対象の予防的又は治療的処置のための医薬品の製造のための医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0439】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0440】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための、医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0441】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための、医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0442】
更に別の態様では、本開示は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための、医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む、医薬組成物の使用を提供する。
【0443】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0444】
更に、以下が本明細書に開示される：
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物の、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための医薬品の製造のための使用であって、医薬品が当該対象に投与される、使用。
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物の、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための医薬品の製造のための使用であって、医薬品が当該対象に投与される、使用。
【0445】
更に、以下も本明細書に開示される：
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物の、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための使用であって、医薬品が当該対象に投与される、使用。
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物の、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための使用であって、医薬品が当該対象に投与される、使用。
【0446】
更に、以下も本明細書に開示される：
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物の、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための使用であって、医薬品が当該対象に投与される、使用。
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物の、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための使用であって、医薬品が当該対象に投与される、使用。
【0447】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0448】
更に、以下も本明細書に開示される：
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物であって、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用される場合の、医薬組成物。
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物であって、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用される場合の、医薬組成物。
【0449】
更に、以下も本明細書に開示される：
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物であって、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用される場合の、医薬組成物。
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物であって、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用される場合の、医薬組成物。
【0450】
更に、以下も本明細書に開示される：
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物であって、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用される場合の、医薬組成物。
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物であって、
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用される場合の、医薬組成物。
【0451】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0452】
更に、以下も本明細書に開示される：
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することによる、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための医薬品。
薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えばｉ）で定義されるヌクレオチドによってコードされる２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することによる、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための医薬品。
【0453】
また、本明細書に開示されるのは、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することによる、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための医薬品である。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することによる、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための医薬品である。
【0454】
また、本明細書に開示されるのは、薬学的に許容される担体と、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することによる、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的である。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉ）で定義されたヌクレオチドによってコードされる複数のポリペプチドからなる二量体タンパク質と、を含む医薬組成物を対象に投与することによる、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的である。
【0455】
第１及び第２の標的化単位、第１及び第２の接合領域、並びに抗原単位は、本明細書において上に詳細に記載されている。
【0456】
処置成功の指標は、当技術分野で既知であり、これには、抗原特異的調節性Ｔ細胞の増加したレベル、抗原特異的エフェクターＴ細胞の減少したレベル（及び調節性Ｔ細胞の増加したレベル）、エフェクターＴ細胞の減少したレベル、抗原単位中の抗原単位／Ｔ細胞エピトープで刺激された場合のＥＬＩＳＰＯＴにおけるＴ細胞活性化の減少したレベル、好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）における好塩基球活性化の減少したレベルが含まれる。放射性アレルゲン吸着試験（ＲＡＳＴ）を同様に使用して、寛容誘導構築物の投与前後の対象からの血液試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体レベルが比較され得、より低いアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体レベルは、寛容誘導の成功を示す。
【実施例】
【0457】
実施例１：多発性硬化症の処置に使用するための、本発明による寛容誘導構築物の設計、産生、及びインビトロ特性評価。
【0458】
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、中枢神経系において発現されるタンパク質である。ＭＯＧの免疫優性３５～５５エピトープであるＭＯＧ（３５～５５）は、多発性硬化症の間の細胞性及び体液性免疫応答の両方についての主要な標的である。ＭＯＧ（３５～５５）誘導性の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、最も一般的に使用されている多発性硬化症の動物モデルである（Ｈｕｎｔｅｒｍａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２０２２）。
【0459】
ＤＮＡベクターの設計
記載された全ての遺伝子配列は、発現ベクターｐＡＬＤ－ＣＶ７７にクローニングされたＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から取り寄せた。以下の単位／部分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを設計した：
１． シグナルペプチド
２． １ｓｔ標的化単位
３． １ｓｔ接合領域：ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１（配列番号１アミノ酸１～１２）、ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域４（配列番号１アミノ酸１３～２７）、グリシン－ロイシンリンカー（配列番号１０２）。
４． 抗原単位：ＭＯＧ（２７～６３）（配列番号１２）。
５． ２ｎｄ接合領域
６． ２ｎｄ標的化単位
標的化単位及び第２の二量体化単位におけるヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１の挿入を含むベクター間の差異を表１に記載する。
記載された全ての遺伝子配列は、発現ベクターｐＡＬＤ－ＣＶ７７にクローニングされたＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から取り寄せた。以下の単位／部分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを設計した：
１． シグナルペプチド
２． １ｓｔ標的化単位
３． １ｓｔ接合領域：ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１（配列番号１アミノ酸１～１２）、ヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域４（配列番号１アミノ酸１３～２７）、グリシン－ロイシンリンカー（配列番号１０２）。
４． 抗原単位：ＭＯＧ（２７～６３）（配列番号１２）。
５． ２ｎｄ接合領域
６． ２ｎｄ標的化単位
標的化単位及び第２の二量体化単位におけるヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１の挿入を含むベクター間の差異を表１に記載する。
【0460】
【表2】
【0461】
＊＊抗原単位：ＭＯＧ（３５～５５）（配列番号１４）
＊＊＊細胞外ドメイン
プラスミドＤＮＡベクターＶＢ５０３８、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２、ＶＢ５０４３、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０６６、ＶＢ５０６７、ＶＢ５０７２、ＶＢ５０７３、ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５は、本開示によるベクターであり、表１に記載の標的化単位、二量体化単位及び抗原単位を含む、寛容誘導構築物をコードする。
＊＊＊細胞外ドメイン
プラスミドＤＮＡベクターＶＢ５０３８、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２、ＶＢ５０４３、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０６６、ＶＢ５０６７、ＶＢ５０７２、ＶＢ５０７３、ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５は、本開示によるベクターであり、表１に記載の標的化単位、二量体化単位及び抗原単位を含む、寛容誘導構築物をコードする。
【0462】
対照として使用したベクターを表２に記載する。
【0463】
【表3】
【0464】
ＤＮＡベクターＶＢ５０５２（配列番号３３）及びＶＢ５００２ｂ（配列番号３４）は、炎症促進性様式でＡＰＣを標的化することが知られているヒトＣＣＬ３Ｌ１標的化単位を含む融合タンパク質をコードする、すなわち、そのような標的化単位を含む抗原特異的構築物は、それらが投与される対象において炎症性免疫応答を誘導し、この化合物がＩＦＮ－γ産生を誘導することが予想される（例えば、国際公開第２０１１１６１２４４ （Ａ１）号を参照されたい）。
【0465】
ＤＮＡベクターＶＢ５０５１（配列番号３５）及びＶＢ５００１ｂ（配列番号３６）は、抗原単位ＭＯＧ（２７～６３）のみ、すなわち単一のタンパク質／ペプチドをコードする。
【0466】
ネズミＭＯＧ（２７～６３）抗原単位は、Ｔ細胞エピトープＭＯＧ（３５～５５）を含む。
【0467】
ＭＯＧ含有構築物のタンパク質発現及び分泌のインビトロ特性評価。
この実験の目的は、ＭＯＧ含有ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の上清におけるタンパク質発現及び分泌を特性評価する（特徴付ける）ことであった。
この実験の目的は、ＭＯＧ含有ＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の上清におけるタンパク質発現及び分泌を特性評価する（特徴付ける）ことであった。
【0468】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．から入手し、ＭＯＧ（２７～６３）含有ＤＮＡベクター（ＶＢ５０４２、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０６７、ＶＢ５０７２、ＶＢ４０７３、ＶＢ５０７４、及びＶＢ５０７５）で一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（１．７×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して０．６４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（８％ ＣＯ２、３７℃）中、オービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）上でインキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収した。
【0469】
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、ＭＯＧ（２７～６３）含有ＤＮＡベクターＶＢ５０３８で一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、２×１０５細胞／ウェルを、１０％ＦＢＳ増殖培地を含む２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって提案された条件下でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬を使用して１μｇのそれぞれのＤＮＡベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間維持し、細胞上清を収集した。
【0470】
ＭＯＧ含有ベクターによってコードされる分泌タンパク質を、ＭＯＧに対する抗体及び標的化単位のうちの１つを使用して、一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＨＥＫ２９３細胞からの上清のサンドイッチＥＬＩＳＡによって特徴付けた。結果を図４～図６に示す。
【0471】
図４Ａ及び４Ｂは、捕捉抗体としてマウス抗ＭＯＧ抗体（０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び検出抗体としてヤギ抗ネズミＩＬ－１０ビオチン化抗体（０．８μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＥＬＩＳＡにおいて、全てのＩＬ－１０コード寛容誘導構築物がインビトロで発現及び分泌されたことを示す。
【0472】
図５は、捕捉抗体としてマウス抗ＭＯＧ抗体（０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び検出抗体としてヤギ抗マウスＣＴＬＡ－４ビオチン化抗体（０．８μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ４７６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＥＬＩＳＡにおいて、ＣＴＬＡ－４をコードする寛容誘導構築物がインビトロで発現及び分泌されたことを示す。
【0473】
図６は、捕捉抗体としてマウス抗ＭＯＧ抗体（０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び検出抗体としてヤギ抗マウスＳＣＧＢ３Ａ２（３．３μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ３４６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＥＬＩＳＡにおいて、ＳＣＧＢ３Ａ２をコードする寛容誘導構築物がインビトロで発現及び分泌されたことを示す。
【0474】
ネズミＩＬ－１０に対する抗体（捕捉抗体：ラット抗ネズミＩＬ－１０抗体、２μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びネズミＳＣＧＢ３Ａ２に対する抗体（検出抗体：ヤギ抗マウスＳＣＧＢ３Ａ２、３，３μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ３４６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する上清のサンドイッチＥＬＩＳＡによって、それぞれ第１及び第２の標的化単位としてＳＣＧＢ３Ａ２及びＩＬ－１０を有する全長寛容誘導構築物の分泌を検証した。結果を図７に示し、この図は、ＤＮＡベクターＶＢ５０７３及びＶＢ５０７２によってコードされる標的化単位としてＩＬ－１０及びＳＣＧＢ３Ａ２を有するワクチンが、それぞれ第２の二量体化単位においてヒトＩｇＧ３由来のヒンジ領域１の余分なコピーの有無にかかわらず、全長融合タンパク質として発現及び分泌されたことを示す。
【0475】
ＤＥＣ２０５受容体への寛容誘導構築物の結合のインビトロ特性評価
この実験の目的は、組換えＤＥＣ２０５受容体へのｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５標的化単位の機能的結合を特徴付けることであった。標的化単位の機能的結合を、組換えＤＥＣ２０５受容体でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、検出抗体として抗原単位又は第２の標的化単位に対する抗体を使用することによって、第１の標的化単位としてｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５をコードするＤＮＡベクターＶＢ５０３８で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清に対するＥＬＩＳＡにおいて評価した。
この実験の目的は、組換えＤＥＣ２０５受容体へのｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５標的化単位の機能的結合を特徴付けることであった。標的化単位の機能的結合を、組換えＤＥＣ２０５受容体でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、検出抗体として抗原単位又は第２の標的化単位に対する抗体を使用することによって、第１の標的化単位としてｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５をコードするＤＮＡベクターＶＢ５０３８で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清に対するＥＬＩＳＡにおいて評価した。
【0476】
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、ＶＢ５０３８で一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、２×１０５細胞／ウェルを、１０％ＦＢＳ増殖培地を含む２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって提案された条件下でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬を使用して、１μｇのそれぞれのＤＮＡベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間維持し、細胞上清を収集した。ＶＢ５０３８によってコードされる分泌タンパク質を、直接ＥＬＩＳＡによって一過性にトランスフェクトされた細胞からの上清において評価した。ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍＬの組換えＤＥＣ２０５受容体（ａａ ２１６－５０３、ＯＰＣＤ ０５０７２、Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）でコーティングし、上清を添加する前にブロッキングした。組換え受容体へのワクチンタンパク質の結合を、ＭＯＧに対する抗体（マウス抗ＭＯＧ抗体、１μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はネズミＩＬ－１０に対する抗体（ヤギ抗ネズミＩＬ－１０ビオチン化抗体、１μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。
【0477】
図８に示される結果は、ＶＢ５０３８を含有するｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５のＤＥＣ２０５受容体への結合及び全長融合タンパク質の分泌を確認する。
寛容誘導構築物のＩＬ－１０受容体への結合のインビトロ特性評価
この実験の目的は、組換えＩＬ－１０受容体へのＩＬ－１０標的化単位の機能的結合を特徴付けることであった。標的化単位の機能的結合を、組換えＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、検出抗体の抗原単位に対する抗体を使用することによって、第２の標的化単位としてＩＬ－１０をコードするＤＮＡワクチンで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清に対するＥＬＩＳＡにおいて評価した。
寛容誘導構築物のＩＬ－１０受容体への結合のインビトロ特性評価
この実験の目的は、組換えＩＬ－１０受容体へのＩＬ－１０標的化単位の機能的結合を特徴付けることであった。標的化単位の機能的結合を、組換えＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、検出抗体の抗原単位に対する抗体を使用することによって、第２の標的化単位としてＩＬ－１０をコードするＤＮＡワクチンで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清に対するＥＬＩＳＡにおいて評価した。
【0478】
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、ＶＢ５０３８で一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、２×１０５細胞／ウェルを、１０％ＦＢＳ増殖培地を含む２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって提案された条件下でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬を使用して、１μｇのそれぞれのＤＮＡベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間維持し、細胞上清を収集した。ＶＢ５０３８によってコードされる分泌タンパク質を、直接ＥＬＩＳＡによって一過性にトランスフェクトされた細胞からの上清において評価した。ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルの２．５μｇ／ｍＬ組換えＩＬ－１０受容体でコーティングし、上清を添加する前にブロッキングした。組換え受容体へのワクチンタンパク質の結合を、ＭＯＧに対する抗体（１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍＬマウス抗ＭＯＧ抗体、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出した。
【0479】
図９に示される結果は、第２の標的化単位としてＩＬ－１０を有する寛容誘導構築物タンパク質が、ＩＬ－１０受容体に結合することができることを実証する。
【0480】
ベクターＶＢ５０５１にコードされたＭＯＧ（２７～６３）ペプチドの哺乳動物細胞の一過性トランスフェクション後のタンパク質発現及び分泌のインビトロ特性評価
この実験の目的は、インビトロで一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞における、ベクターＶＢ５０５１によってコードされるＭＯＧ（２７～６３）抗原単独対照のタンパク質発現及び分泌を評価することであった。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して０．６４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（８％ ＣＯ２、３７℃）中、オービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）上でインキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収した。
この実験の目的は、インビトロで一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞における、ベクターＶＢ５０５１によってコードされるＭＯＧ（２７～６３）抗原単独対照のタンパク質発現及び分泌を評価することであった。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して０．６４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（８％ ＣＯ２、３７℃）中、オービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）上でインキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収した。
【0481】
ＭＯＧ（２７～６３）ペプチドの分泌を、直接ＥＬＩＳＡ、上清でのコーティング、及びＭＯＧに対する抗体（捕捉抗体、１００μｌ／ウェル、３．３μｇ／ｍＬマウス抗ＭＯＧ抗体、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する検出によって特徴付けた。図１０は、ＭＯＧ（２７～６３）ペプチドがＶＢ５０５１から発現され、当該ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞から分泌されることを示す。
【0482】
ＤＮＡベクターＶＢ５０５２及びＶＢ５００２ｂによってコードされる炎症促進性対照構築物での哺乳動物細胞の一過性トランスフェクション後のタンパク質発現及び分泌のインビトロ特性評価
ＤＮＡベクターＶＢ５０５２（配列番号３３）及びＶＢ５００２ｂ（配列番号３４）は、炎症促進性様式でＡＰＣを標的化することが知られているヒトＣＣＬ３Ｌ１標的化単位を含む融合タンパク質をコードする、すなわち、そのような標的化単位を含む抗原特異的ワクチンは、それらが投与される対象において炎症性免疫応答を誘導し、この化合物がＩＦＮ－γ産生を誘導することが予想される（例えば、国際公開第２０１１１６１２４４ （Ａ１）号を参照されたい）。
ＤＮＡベクターＶＢ５０５２（配列番号３３）及びＶＢ５００２ｂ（配列番号３４）は、炎症促進性様式でＡＰＣを標的化することが知られているヒトＣＣＬ３Ｌ１標的化単位を含む融合タンパク質をコードする、すなわち、そのような標的化単位を含む抗原特異的ワクチンは、それらが投与される対象において炎症性免疫応答を誘導し、この化合物がＩＦＮ－γ産生を誘導することが予想される（例えば、国際公開第２０１１１６１２４４ （Ａ１）号を参照されたい）。
【0483】
これらの実験の目的は、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞におけるＤＮＡベクターＶＢ５０５２及びＶＢ５００２ｂによってコードされるタンパク質のタンパク質発現及び分泌を特徴付けることであった。
【0484】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．から入手し、ＤＮＡベクターＶＢ５０５２で一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（１．７×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して０．６４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（８％ ＣＯ２、３７℃）中でオービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）上でインキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収した。
【0485】
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから入手し、ＤＮＡベクターＶＢ５００２ｂで一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、２×１０５細胞／ウェルを、１０％ＦＢＳ増殖培地を含む２４ウェル組織培養プレートに播種し、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって提案された条件下でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬を使用して１μｇのそれぞれのＤＮＡベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの５日後に上清を回収した。
【0486】
ＤＮＡベクターＶＢ５０５２によってコードされる分泌タンパク質を、ＭＯＧ（マウス抗ＭＯＧ、０．２５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びヒトＣＣＬ３Ｌ１（ヤギ抗ヒトＣＣＬ３ ０．２μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって、一過性にトランスフェクトされた細胞からの上清において評価した。結果を図１１Ａに示し、ベクターＶＢ５０５２によってコードされる炎症促進性対照ワクチンが高度に発現され、完全長融合タンパク質として分泌されたことを示す。
【0487】
ＤＮＡベクターＶＢ５００２ｂによってコードされる分泌タンパク質を、ヒトＩｇＧ３（ＣＨ３）（マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ３ドメイン）、１μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、１５３２７２、Ｂｉｏｒａｄ）及びヒトＣＣＬ３Ｌ１（ヤギ抗ヒトＣＣＬ３ ０．２μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ２７０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって、一過性にトランスフェクトされた細胞からの上清において評価した。結果を図１１Ｂに示し、ベクターＶＢ５００２ｂによってコードされる免疫原性対照ワクチンが発現され、タンパク質として分泌されたことを示す。
【0488】
ウェスタンブロットによるＤＮＡベクターＶＢ５０３８、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５から発現されたタンパク質の特性評価。
ＤＮＡベクターＶＢ５０３８、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０７４、ＶＢ５０７５及びＶＢ５００２ｂによってコードされるタンパク質を更に特徴付けるために、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清に対してウェスタンブロット分析を実行した。
ＤＮＡベクターＶＢ５０３８、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０７４、ＶＢ５０７５及びＶＢ５００２ｂによってコードされるタンパク質を更に特徴付けるために、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清に対してウェスタンブロット分析を実行した。
【0489】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．から入手し、ＤＮＡベクターＶＢ５０３８及びＶＢ５００２ｂで一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（３×１０６細胞／ｍＬ、１．６ｍＬ）を６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して１μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを、加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（８％ＣＯ２、３７℃）中、オービタルシェーカー（直径１９ｍｍ、１２５ｒｐｍ）上でインキュベートした。１８時間のインキュベーション後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３トランスフェクションエンハンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を各ウェルに添加した。プレートを更に７８時間インキュベートした後、上清を回収した。試料は、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの１０５μｌの上清を、還元条件及び非還元条件についてそれぞれ７．５μｌのＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）又は７．５μｌの超純水を含む３７．５μｌの４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合することによって調製した。試料（還元又は非還元）を７０℃で１０分間加熱した後、４％～２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加した（添加試料体積は図の説明文に記載）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ染色済みタンパク質標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を含む１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳランニング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で実行した。Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏセミドライトランスファーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用することによって、タンパク質をゲルからＥｔＯＨ活性化低蛍光（ＬＦ）０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に移した。ＰＶＤＦ膜をＥｖｅｒｙＢｌｏｔ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で５分間ブロッキングし、マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びラット抗ネズミＩＬ－１０抗体（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブして、それぞれＭＯＧ及びＩＬ－１０を検出した。膜を蛍光色素コンジュゲート二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、乾燥させた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰイメージングシステム（設定Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８及び８００、Ａｕｔｏ Ｏｐｔｉｍａｌ）を使用することによって画像を撮影した。結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。
【0490】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．から入手し、ＤＮＡベクターＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２、ＶＢ５０５０、ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５で一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２又は１．７×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して０．６４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（８％ ＣＯ２、３７℃）中、オービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）上でインキュベートした。プレートを７２時間インキュベートした後、上清を回収した。試料は、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの１４μｌの上清を、還元条件及び非還元条件についてそれぞれ１μｌのＤＴＴ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）又は１μｌの超純水を含む５μｌの４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合することによって調製した（所与の比率での総試料体積のスケールアップ）。試料（還元又は非還元）を７０℃で１０分間加熱した後、４％～２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加した（図の説明文に記載の追加試料体積）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ染色済みタンパク質標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を含む１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳランニング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で実行した。Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏセミドライトランスファーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用することによって、タンパク質をゲルからＥｔＯＨ活性化低蛍光（ＬＦ）０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に移した。ＰＶＤＦ膜をＥｖｅｒｙＢｌｏｔ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で５分間ブロッキングし、マウス抗ＭＯＧ（ｓｃ－７３３３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はラット抗ネズミＩＬ－１０（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブして、それぞれＭＯＧ又はＩＬ－１０を検出した。膜を蛍光色素コンジュゲート種特異的二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、乾燥させた。Ｄｙｌｉｇｈｔ－４８８チャネルにおけるＩＬ１０検出のために、膜をＤｙｌｉｇｈｔ－４８８二次抗体で再プローブした。膜をエタノール及びＴＢＳＴ中で再活性化した。膜をブロッキングし、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８コンジュゲート二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、乾燥させた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰイメージングシステムを使用することによって画像を撮影した。結果を図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１２Ｆ及び図１２Ｇに示す。
【0491】
第１の標的化単位としてｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５、抗原単位としてＭＯＧ（２７～６３）、及び第２の標的化単位としてＩＬ－１０をコードするワクチン（ＶＢ５０３８、ＶＢ５０４１、ＶＢ５０４２及びＶＢ５０５０）の抗ＭＯＧ抗体を用いたウェスタンブロット分析（図１２Ａ及び図１２Ｃ）は、これらのワクチンが全長融合タンパク質として分泌されたことを示す。抗ネズミＩＬ－１０抗体での検出（図１２Ｂ及び図１２Ｄ）は、以前に記載された抗ネズミＭＯＧ抗体と同じ分子で単一バンドを示し、これは両方の抗体が同じタンパク質バンドを検出したことを実証し、したがって、ＭＯＧ及びＩＬ－１０が同じ融合タンパク質の一部であることを確認する。図１２Ｂ及び図１２Ｅの非還元試料は、これらのタンパク質の二量体化を示す。
【0492】
第１の標的化単位としてＶＳＩＧ－３、抗原単位としてＭＯＧ（２７～６３）、及び第２の標的化単位としてＩＬ－１０（ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５）をコードするワクチンの抗ネズミＭＯＧを用いたウェスタンブロット分析（図１２Ｆ）は、これらのワクチンが全長融合タンパク質として分泌されたことを示す。タンパク質は、それらの計算された分子量に基づいて予想されるよりも遅い速度で移動し、これは、既知の翻訳後グリコシル化によって説明することができる（図１２Ｆ）。ＶＢ５０７４及びＶＢ５０７５でトランスフェクトされた細胞からの上清における抗ネズミＩＬ－１０での検出（図１２Ｇ）は、両方の抗体が同じタンパク質バンドを検出したことを示し、したがって、ＭＯＧ及びＩＬ－１０が同じ融合タンパク質の一部であることを確認する。
【0493】
実施例２：ＶＢ５０６７の寛容誘導能力の評価。
【0494】
ＶＢ５０６７（表１に記載）の寛容誘導能力を、５０μｇのＶＢ５０６７で１回ワクチン接種したマウス由来の脾臓において評価し、誘導されたＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比を計算することによって決定した。ＩＬ－１０（免疫抑制機能を発揮することが知られている抗炎症性サイトカイン）及びＩＦＮ－γ（炎症性免疫応答を誘導するためのマーカー）シグナルを、ＭＯＧ（３５～５５）ペプチドでワクチン接種したマウスから採取した脾細胞の再刺激後に、二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにおいて決定した。ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比は、ＤＮＡベクターによって誘導された免疫応答がどの程度寛容原性応答に偏っているかを示す。寛容原性プロファイルを、ワクチン接種に応答して誘導され、エクスビボで検出されたＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ ３＋Ｔ細胞の頻度によって更に評価した。Ｆｏｘｐ３は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発生及び機能における免疫抑制経路のマスター調節因子として作用するものであり、ＭＯＧ特異的炎症性免疫応答を抑制及び制御するように作用し、それによって自己寛容を維持するＴｒｅｇ細胞を示す。得られた結果を、炎症促進性対照ワクチンＶＢ５０５２によって誘発された応答又は／及びＶＢ５０５１ワクチン接種の寛容誘導能力（両方とも表２に記載）と比較した。
【0495】
マウスワクチン接種及びＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ
以下の研究設計を適用した：
雌の６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。全ての動物をＲａｄｉｕｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）の動物施設に収容した。全ての動物プロトコルは、ノルウェー食品安全機関（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって承認された。５匹のマウス／群を、ＶＢ５０６７（表１に記載）、ＶＢ５０５２及びＶＢ５０５１（表２に記載）の試験に使用した。ＶＢ５０５２を、ＭＯＧ（２７～６３）コードワクチンの炎症促進性バージョンとして含めた。ＶＢ５０５２は、炎症促進性様式でＡＰＣを標的化することが知られているヒトＣＣＬ３Ｌ１標的化単位を含み、すなわち、そのような標的化単位を含むワクチンは、それらが投与される対象において炎症性免疫応答を誘導し、この化合物がＩＦＮ－γ産生を誘導することが予想される。ＭＯＧ（２７～６３）ペプチドのみをコードするＤＮＡベクター、ＶＢ５０５１を、ＶＢ５０６７との比較として含めた。
以下の研究設計を適用した：
雌の６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。全ての動物をＲａｄｉｕｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）の動物施設に収容した。全ての動物プロトコルは、ノルウェー食品安全機関（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって承認された。５匹のマウス／群を、ＶＢ５０６７（表１に記載）、ＶＢ５０５２及びＶＢ５０５１（表２に記載）の試験に使用した。ＶＢ５０５２を、ＭＯＧ（２７～６３）コードワクチンの炎症促進性バージョンとして含めた。ＶＢ５０５２は、炎症促進性様式でＡＰＣを標的化することが知られているヒトＣＣＬ３Ｌ１標的化単位を含み、すなわち、そのような標的化単位を含むワクチンは、それらが投与される対象において炎症性免疫応答を誘導し、この化合物がＩＦＮ－γ産生を誘導することが予想される。ＭＯＧ（２７～６３）ペプチドのみをコードするＤＮＡベクター、ＶＢ５０５１を、ＶＢ５０６７との比較として含めた。
【0496】
滅菌ＰＢＳに溶解した５０μｇのＤＮＡベクターＶＢ５０６７又は対照ベクターＶＢ５０５１若しくはＶＢ５０５２の１用量を、筋肉内針注射によって各前脛骨筋に投与し（２×２５μｌ、１０００μｇ／ｍＬ）、続いてＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅインビボエレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ，ＵＳＡ）を用いてエレクトロポレーションを行った。ワクチン接種の７日後に脾臓を採取し、細胞ストレーナーですりつぶして単細胞懸濁液を得た。塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。洗浄後、脾細胞を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２０２（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して計数し、６×１０６細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁し、９６ウェルＩＦＮ－γ／ＩＬ－１０二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートに６×１０５細胞／ウェルとして播種した。次いで、脾細胞を１６．６７μｇ／ｍＬのＭＯＧ（３５～５５）ペプチドで４４時間再刺激した後、製造業者のプロトコル（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）に従って二色ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにおいてＩＦＮ－γ及びＩＬ－１０サイトカイン産生について試験した。スポット形成細胞をＩＲＩＳ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔ及びＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダー（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）で測定し、Ａｐｅｘソフトウェア（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）を使用して分析した。結果は、３連のＩＬ－１０＋又はＩＦＮ－γ＋スポット／１０６脾細胞の平均数として示す。
【0497】
図１３Ａから分かるように、ＩＬ－１０の産生は、３つ全ての構築物；ＶＢ５０６７、ＶＢ５０５１及びＶＢ５０５２でワクチン接種したマウスから採取した非再刺激脾細胞において検出されたが、低いバックグラウンドレベルのＩＦＮ－γしか観察されなかった。図１３Ｂに示すように、脾細胞のＭＯＧ（３５～５５）再刺激時に、ＶＢ５０５２によるワクチン接種後にＩＦＮ－γレベルの上昇が検出され、これは、ＶＢ５０６７及びＶＢ５０５１によって誘発されたレベルを超えて有意に増加した。過剰な炎症を回避し、炎症の最終的な消散を確実にするために、ＩＦＮ－γ等の炎症促進性サイトカインの産生が、ＩＬ－１０１等の抗炎症性サイトカインの産生を含む負のフィードバック機構によって調節されることが重要である。したがって、ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０のレベルの増加は、誘導された炎症応答を制御するそのようなフィードバック機構によって説明され得る。図１３Ｃに示すように、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６７では有意に高いＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が検出され、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０６７の免疫抑制能が高いことが示された。
【0498】
四量体（Ｈ－２ＩＡｂ／ＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨ）を使用するワクチン接種マウス由来の脾臓におけるＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。
ＭＯＧ特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞（すなわち、ＭＯＧ特異的炎症性免疫応答を抑制及び制御するように作用し、それによって自己寛容を維持するＴ細胞を示す）の生成を、ＭＯＧ特異的四量体染色及びフローサイトメトリーによってマウスにおいて同定した（ＣＤ４＋ＭＯＧ（３８～４９）－ｔｅｔ＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）。
ＭＯＧ特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞（すなわち、ＭＯＧ特異的炎症性免疫応答を抑制及び制御するように作用し、それによって自己寛容を維持するＴ細胞を示す）の生成を、ＭＯＧ特異的四量体染色及びフローサイトメトリーによってマウスにおいて同定した（ＣＤ４＋ＭＯＧ（３８～４９）－ｔｅｔ＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）。
【0499】
簡潔に述べると、各群からプールした２×１０６個の脾細胞を９６ウェルＶ底プレートに移した。四量体及び抗体を、使用前に５％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で希釈し、光から保護した。細胞洗浄を必要とした全てのステップは、特に明記しない限り、５％ＦＢＳを含むＰＢＳで実行した。最初に、細胞を、（ＭＯＧ ３８－４９）に特異的なＰｒｏＴ２（登録商標）ＭＨＣクラスＩＩ四量体（１μｇ／ｍＬ、Ｈ－２ ＩＡｂ－ＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨ－ＰｒｏＴ２（登録商標）四量体ＰＥ、２９５８、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）で染色し、プレートを加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で２時間インキュベートした。細胞を洗浄せずに、ＦＣ受容体を氷上で５分間ブロッキングして、フローサイトメトリー抗体のＦｃ受容体への非特異的結合を防止した（ｐｒｅｃｖｅｎｔ）（０．２５μｇ／ｍＬ、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）ＰＬＵＳ（抗マウスＣＤ１６／３２）抗体、１５６６０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞を洗浄せずに、細胞を氷上で３０分間、抗マウスＣＤ８ ＰＥ－Ｃｙ７（０．２５μｇ／ｍＬ、クローン：５３－６．７、１００７２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗マウスＣＤ４ ｅＦｌｕｏｒ４５０（０．２５μｇ／ｍＬ、クローン：ＧＫ１．５、４８－００４１－８２、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（０．２５μｇ／ｍＬ、クローン：ＰＣ６１、１０２０３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有する表面抗体カクテルで染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を氷上で１０分間、ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（ウェル当たり１５０μｌ、ＰＢＳ中１：８０００希釈、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ７８０、５６５３８８、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞をＰＢＳのみで２回洗浄し、固定し、製造業者の説明書に従ってＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（ウェル当たり２００μｌ、００－５５２３－００、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して透過処理した。細胞を洗浄し、細胞を氷上で３０分間、抗マウスＦＯＸＰ３ ｅＦｌｕｏｒ ６６０（０．２５μｇ／ｍＬ、クローン：ＦＪＫ－１６ｓ、５０－５７７３－８２、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＫｉ－６７ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（０．２５μｇ／ｍＬ、クローン：クローン：１１Ｆ６、１５１２０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有する細胞内抗体カクテルで染色した。細胞を洗浄し、５％ＦＢＳを含む１５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）Ａ３ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。以下の対照である未染色対照（＝細胞はいかなる抗体も受けなかった）及び蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照（＝全てのフルオロフォア標識抗体で染色した試料、陽性シグナルと陰性シグナルとを正確に区別するためのマイナスワン）を、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ｖ１０．８ソフトウェア（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して所望の集団をゲーティングするためのガイドとして使用した。
【0500】
図１４に示されるように、ＶＢ５０５１と比較して、より高いパーセンテージのＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞が、ＶＢ５０６７に応答して検出された。
【0501】
したがって、実施例２は、標的化単位としてｓｃＦｖ－抗ＤＥＣ２０５及びＣＴＬＡ－４並びに抗原単位としてＭＯＧ（２７～６３）を有する構築物をコードするＶＢ５０６７によるワクチン接種が、炎症促進性ワクチンＶＢ５０５２と比較して、より高い抗炎症性サイトカイン対炎症性サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）及び炎症性ＩＦＮ－γ産生の欠如をもたらすことを示す。更に、ｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５及びＣＴＬＡ－４標的タンパク質は、ＶＢ５０５１と比較して、より高いパーセンテージのＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞を誘導する。まとめると、これらの結果は、ｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５及びＣＴＬＡ－４二重特異性構築物によるワクチン接種が、ＶＢ５０５２とは対照的に、炎症促進性サイトカイン産生（ＩＦＮ－γ）の欠如を示し、ＶＢ５０５１と比較してより大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発することを示す。
【0502】
１Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ＭＡ，Ｓｏｕｓａ ＬＰ，Ｐｉｎｈｏ Ｖ，Ｐｅｒｒｅｔｔｉ Ｍ，Ｔｅｉｘｅｉｒａ ＭＭ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｗｈａｔ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｉｔｓ Ｏｎｓｅｔ？ Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ａｐｒ ２６；７：１６０．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１６．００１６０．
【0503】
実施例３：ＶＢ５０４２の寛容誘導能力の評価。
【0504】
実施例２に記載のように、ＶＢ５０４２（表１に記載）の寛容誘導能を決定し、ＶＢ５０５２（表２に記載）の炎症促進性対照ワクチンによって誘導された応答及びＶＢ５０５１（表２に記載）の寛容誘導能と比較した。
【0505】
図１５Ａから分かるように、ＩＬ－１０の産生は、３つ全ての構築物；ＶＢ５０４２、ＶＢ５０５１及びＶＢ５０５２でワクチン接種したマウスから採取した非再刺激脾細胞において検出されたが、低いバックグラウンドレベルのＩＦＮ－γしか観察されなかった。図１５Ｂに示されるように、脾細胞のＭＯＧ（３５～５５）再刺激の際に、ＶＢ５０５２でのワクチン接種後にＩＦＮ－γのレベルの上昇が検出され、これは、ＶＢ５０４２及びＶＢ５０５１によって誘発されたものを超えて有意に増加した。ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０のレベルの増加は、実施例２に記載されるように、炎症応答を制御するための潜在的なフィードバック機構によって説明され得る。ＶＢ５０４２及びＶＢ５０５１のいずれかでワクチン接種したマウス由来の脾細胞は、ＭＯＧ（３５～５５）ペプチド再刺激あり（図１５Ａ）及びなし（図１５Ｂ）の両方で、同様のレベルのＩＬ－１０及びＩＦＮ－γを示した。図１５Ｃに示すように、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０４２では有意に高いＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が検出され、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０４２の免疫抑制能が高いことが示された。
【0506】
図１６に示されるように、ＶＢ５０５１と比較して、より高いパーセンテージのＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞が、ＶＢ５０４２に応答して検出された。
【0507】
したがって、実施例３は、標的化単位としてｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５及びＩＬ－１０並びに抗原単位としてＭＯＧ（２７～６３）を有する構築物をコードするＶＢ５０４２によるワクチン接種が、炎症促進性ワクチンバージョンＶＢ５０５２と比較して、より高い非炎症サイトカイン対炎症サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）及び炎症ＩＦＮ－γの欠如をもたらすことを示す。更に、ｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５及びＩＬ－１０標的化タンパク質は、ＶＢ５０５１と比較して、より高い頻度のＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞を誘導した。まとめると、これらの結果は、ｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５及びＩＬ－１０二重特異性構築物によるワクチン接種が、ＶＢ５０５２とは対照的に、炎症促進性サイトカイン産生（ＩＦＮ－γ）の欠如を示し、ＶＢ５０５１と比較してより大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発することを示す。
【0508】
実施例４：ＶＢ５０７３の寛容誘導能力の評価。
【0509】
実施例２に記載のように、ＶＢ５０７３（表１に記載）の寛容誘導能を決定し、炎症促進性対照ワクチンＶＢ５０５２（表２に記載）によって誘導された応答及びＶＢ５０５１（表２に記載）の寛容誘導能と比較した。
【0510】
図１７Ａから分かるように、ＩＬ－１０の産生は、３つ全ての構築物；ＶＢ５０７３、ＶＢ５０５１及びＶＢ５０５２でワクチン接種したマウスから採取した非再刺激脾細胞において検出されたが、低いバックグラウンドレベルのＩＦＮ－γしか観察されなかった。図１７Ｂに示すように、脾細胞のＭＯＧ（３５～５５）再刺激時に、ＶＢ５０５２でのワクチン接種後に高レベルのＩＦＮ－γが検出され、これはＶＢ５０７３及びＶＢ５０５１によって誘発されたものを超えて有意に増加した。ＶＢ５０５２に応答して観察されたＩＬ－１０のレベルの増加は、実施例２に記載されるように、炎症応答を制御するための潜在的なフィードバック機構によって説明され得る。ＶＢ５０７３又はＶＢ５０５１のいずれかでワクチン接種されたマウス由来の脾細胞は、ＭＯＧ（３５～５５）ペプチド再刺激あり（図１７Ｂ）及びなし（図１７Ａ）の両方で同様のレベルのＩＬ－１０及びＩＦＮ－γを示した。図１７Ｃに示すように、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０７３では有意に高いＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ比が検出され、ＶＢ５０５２と比較してＶＢ５０７３の免疫抑制能が高いことが示された。
【0511】
図１８に示すように、ＶＢ５０５１と比較して、より高いパーセンテージのＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞が、ＶＢ５０７３に応答して検出された。
【0512】
したがって、実施例４は、標的化単位としてＳＣＧＢ３Ａ２及びＩＬ－１０、並びに抗原単位としてＭＯＧ（３８～４９）を有する構築物をコードするＶＢ５０７３によるワクチン接種が、より高い非炎症サイトカイン対炎症サイトカイン比（ＩＬ－１０／ＩＦＮ－γ）をもたらし、炎症促進性構築物ＶＢ５０５２と比較して炎症ＩＦＮ－γ産生の欠如を示し、ＶＢ５０５１と比較してより高い頻度のＭＯＧ（３８～４９）特異的Ｆｏｘｐ３＋細胞を誘導することを示す。まとめると、これらの結果は、ＳＣＧＢ３Ａ２及びＩＬ－１０二重特異性構築物によるワクチン接種が、ＶＢ５０５２とは対照的に、炎症促進性サイトカイン産生（ＩＦＮ－γ）の欠如を示し、ＶＢ５０５１と比較してより大きな抗原特異的寛容原性応答を誘発することを示す。
【0513】
実施例５：甲殻類アレルギーの処置に使用するための６つのＴ細胞エピトープを有する本発明による寛容誘導構築物の設計、産生、及びインビトロ特性評価。
【0514】
トロポミオシンは、甲殻類における主要なアレルゲンである。６つの主要なＴ細胞エピトープを、Ｍｅｔ ｅ １過敏症のＢａｌｂ／ｃマウスモデルにおいて、Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ ｅｎｓｉｓ（Ｍｅｔ ｅ １）種由来のトロポミオシンについて同定した。６つのＴ細胞エピトープのペプチドによる経口免疫療法は、シュリンプトロポミオシンに対するアレルギー応答を効果的に減少させた（Ｗａｉ，Ｃ．Ｙ．Ｙ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
【0515】
ＤＮＡベクターの設計
以下の表３に列挙される要素（エレメント）／単位をコードする核酸配列を含むＤＮＡベクターＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８を設計し、産生した。記載された全ての遺伝子配列は、発現ベクターｐＡＬＤ－ＣＶ７７にクローニングされたＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から取り寄せた。
以下の表３に列挙される要素（エレメント）／単位をコードする核酸配列を含むＤＮＡベクターＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８を設計し、産生した。記載された全ての遺伝子配列は、発現ベクターｐＡＬＤ－ＣＶ７７にクローニングされたＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から取り寄せた。
【0516】
【表4】
【0517】
Ｍｅｔ ｅ １（２４１－２６０）、（２１０－２３０）、（１３６－１５５）、（７６－９５）、（４６－６５）、（１６－３５）抗原単位（配列番号２２）は、Ｔ細胞エピトープ間にＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）リンカーを含有する。
【0518】
Ｍｅｔ ｅ １含有寛容誘導構築物のタンパク質発現及び分泌のインビトロ特性評価
この実験の目的は、哺乳動物細胞の一過性トランスフェクション後のＭｅｔ ｅ １含有ＤＮＡベクターＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８によってコードされるタンパク質の発現及び分泌を特徴付けることであった。
この実験の目的は、哺乳動物細胞の一過性トランスフェクション後のＭｅｔ ｅ １含有ＤＮＡベクターＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８によってコードされるタンパク質の発現及び分泌を特徴付けることであった。
【0519】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．から入手し、ＤＮＡベクターＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８で一過性にトランスフェクトした。簡潔に述べると、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（１．７×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して０．６４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、プレートを加湿ＣＯ２細胞インキュベーター（８％ ＣＯ２、３７℃）中、オービタルシェーカー（直径３ｍｍ、９００ｒｐｍ）上でインキュベートした。プレートを７２時間インキュベートした後、上清を回収した。
【0520】
Ｍｅｔ ｅ １含有ベクターによってコードされる分泌タンパク質を、ネズミＩＬ－１０に対する抗体（捕捉抗体：マウス抗ネズミＩＬ－１０抗体、２μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、検出抗体：ヤギ抗ネズミＩＬ－１０ビオチン化抗体、０．８μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、ＢＡＦ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって、一過性にトランスフェクトされた細胞からの上清において評価した。結果を図１９に示し、両方のＭｅｔ ｅ １含有構築物が高レベルで発現及び分泌されたことを示す。
ＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８から発現されたインタクトなタンパク質の特性評価
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清試料に対してウェスタンブロット分析を実行して、ＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８によってコードされるタンパク質を更に特徴付けた。
ＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８から発現されたインタクトなタンパク質の特性評価
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの上清試料に対してウェスタンブロット分析を実行して、ＶＢ５０７７及びＶＢ５０７８によってコードされるタンパク質を更に特徴付けた。
【0521】
試料は、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの１４μｌの上清を、還元条件及び非還元条件についてそれぞれ１μｌのＤＴＴ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）又は１μｌの超純水を含む５μｌの４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合することによって調製した（所与の比率での総試料体積のスケールアップ）。試料（還元又は非還元）を７０℃で１０分間加熱した後、４％～２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加した（添加試料体積は図の説明文に記載）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ染色済みタンパク質標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を含む１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳランニング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で実行した。Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏセミドライトランスファーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用することによって、タンパク質をゲルからＥｔＯＨ活性化低蛍光（ＬＦ）０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に移した。ＰＶＤＦ膜をＥｖｅｒｙＢｌｏｔ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で５分間ブロッキングし、ラット抗ネズミＩＬ－１０（ＭＡＢ４１７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブしてＩＬ－１０を検出した。膜を蛍光色素コンジュゲート種特異的二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、乾燥させた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰイメージングシステムを使用することによって画像を撮影した。
【0522】
結果を図２０に示す。
【0523】
抗ネズミＩＬ－１０抗体を用いたウェスタンブロット分析は、６つのＭｅｔ ｅ １Ｔ細胞エピトープ含有構築物が全長融合タンパク質として分泌されたことを示す。
【0524】
配列
配列番号１
ＩｇＧ３由来のヒンジエクソンｈ１（アミノ酸１～１２）及びヒトＩｇＧ３由来のヒンジエクソンｈ４（アミノ酸１３～２７）のアミノ酸配列
Ｅ１ＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ１２Ｅ１３ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ２７
配列番号２
ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列：上部ヒンジ領域（アミノ酸１～４）、中間ヒンジ領域（アミノ酸５～１５）及び下部ヒンジ領域（アミノ酸１６～２３）。
配列番号１
ＩｇＧ３由来のヒンジエクソンｈ１（アミノ酸１～１２）及びヒトＩｇＧ３由来のヒンジエクソンｈ４（アミノ酸１３～２７）のアミノ酸配列
Ｅ１ＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ１２Ｅ１３ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ２７
配列番号２
ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列：上部ヒンジ領域（アミノ酸１～４）、中間ヒンジ領域（アミノ酸５～１５）及び下部ヒンジ領域（アミノ酸１６～２３）。
【0525】
Ｅ１ＰＫＳ４Ｃ５ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ１５Ａ１６ＰＥＬＬＧＧＰ２３
配列番号３
ヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４
ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号５
ＣＲＥＢ ｂＺＩＰモチーフのアミノ酸配列
ＶＫＣＬＥＮＲＶＡＶＬＥＮＱＮＫＴＬＩＥＥＬＫＡＬＫＤＬＹ
配列番号６
マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（Ｉｇ ＶＨシグナル配列）
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ
配列番号７
マウス単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗ＤＥＣ２０５
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号８
ヒンジ領域形態ヒトＩｇＧ１。上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（１－５）、中間ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（６－２０）。
ＧＬＱＧＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
配列番号９
ネズミＩＬ－１０
ＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号１０
成熟ネズミＴＧＦβ１
ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ
配列番号１１
ネズミＣＴＬＡ－４細胞外ドメイン
ＥＡＩＱＶＴＱＰＳＶＶＬＡＳＳＨＧＶＡＳＦＰＣＥＹＳＰＳＨＮＴＤＥＶＲＶＴＶＬＲＱＴＮＤＱＭＴＥＶＣＡＴＴＦＴＥＫＮＴＶＧＦＬＤＹＰＦＣＳＧＴＦＮＥＳＲＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＶＤＴＧＬＹＬＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＦＶＧＭＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ
配列番号１５
ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２シグナル配列
ＭＫＬＶＳＩＦＬＬＶＴＩＧＩＣＧＹＳＡＴＡ
配列番号１６
ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２
ＬＬＩＮＲＬＰＶＶＤＫＬＰＶＰＬＤＤＩＩＰＳＦＤＰＬＫＭＬＬＫＴＬＧＩＳＶＥＨＬＶＴＧＬＫＫＣＶＤＥＬＧＰＥＡＳＥＡＶＫＫＬＬＥＡＬＳＨＬＶ
配列番号１７
ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３シグナル配列
ＭＴＲＲＲＳＡＰＡＳＷＬＬＶＳＬＬＧＶＡＴＳ
配列番号１８
ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３細胞外ドメイン
ＬＥＶＳＥＳＰＧＳＶＱＶＡＲＧＱＴＡＶＬＰＣＡＦＳＴＳＡＡＬＬＮＬＮＶＩＷＭＶＩＰＬＳＮＡＮＱＰＥＱＶＩＬＹＱＧＧＱＭＦＤＧＡＬＲＦＨＧＲＶＧＦＴＧＴＭＰＡＴＮＶＳＩＦＩＮＮＴＱＬＳＤＴＧＴＹＱＣＬＶＮＮＬＰＤＲＧＧＲＮＩＧＶＴＧＬＴＶＬＶＰＰＳＡＰＱＣＱＩＱＧＳＱＤＬＧＳＤＶＩＬＬＣＳＳＥＥＧＩＰＲＰＴＹＬＷＥＫＬＤＮＴＬＫＬＰＰＴＡＴＱＤＱＶＱＧＴＶＴＩＲＮＩＳＡＬＳＳＧＬＹＱＣＶＡＳＮＡＩＧＴＳＴＣＬＬＤＬＱＶＩＳＰＱＰＲＳＶ
配列番号１９
ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ
配列番号２０
ヒトＣＣＬ３Ｌ１シグナル配列
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳ
配列番号２１
ヒトＣＣＬ３Ｌ１
ＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡ
配列番号２３
ＶＢ５０５０のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２９８～３３４）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３３５～３３９）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３４０～３５４）、ネズミＩＬ－１０（３５５～５１４）。
配列番号３
ヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４
ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号５
ＣＲＥＢ ｂＺＩＰモチーフのアミノ酸配列
ＶＫＣＬＥＮＲＶＡＶＬＥＮＱＮＫＴＬＩＥＥＬＫＡＬＫＤＬＹ
配列番号６
マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（Ｉｇ ＶＨシグナル配列）
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ
配列番号７
マウス単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗ＤＥＣ２０５
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＴＳＬＧＮＳＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＫＧＷＬＡＷＹＱＱＫＳＧＮＡＰＱＬＬＩＹＫＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＩＦＴＩＳＮＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＹＱＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＦＹＭＮＷＩＲＱＰＰＧＱＡＰＥＷＬＧＶＩＲＮＫＧＮＧＹＴＴＥＶＮＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＱＮＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＧＰＹＹＹＳＧＤＤＡＰＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号８
ヒンジ領域形態ヒトＩｇＧ１。上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（１－５）、中間ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（６－２０）。
ＧＬＱＧＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
配列番号９
ネズミＩＬ－１０
ＳＲＧＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴＨＦＰＶＧＱＳＨＭＬＬＥＬＲＴＡＦＳＱＶＫＴＦＦＱＴＫＤＱＬＤＮＩＬＬＴＤＳＬＭＱＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＶＥＶＭＰＱＡＥＫＨＧＰＥＩＫＥＨＬＮＳＬＧＥＫＬＫＴＬＲＭＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹＭＭＩＫＭＫＳ
配列番号１０
成熟ネズミＴＧＦβ１
ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ
配列番号１１
ネズミＣＴＬＡ－４細胞外ドメイン
ＥＡＩＱＶＴＱＰＳＶＶＬＡＳＳＨＧＶＡＳＦＰＣＥＹＳＰＳＨＮＴＤＥＶＲＶＴＶＬＲＱＴＮＤＱＭＴＥＶＣＡＴＴＦＴＥＫＮＴＶＧＦＬＤＹＰＦＣＳＧＴＦＮＥＳＲＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＶＤＴＧＬＹＬＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＦＶＧＭＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ
配列番号１５
ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２シグナル配列
ＭＫＬＶＳＩＦＬＬＶＴＩＧＩＣＧＹＳＡＴＡ
配列番号１６
ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２
ＬＬＩＮＲＬＰＶＶＤＫＬＰＶＰＬＤＤＩＩＰＳＦＤＰＬＫＭＬＬＫＴＬＧＩＳＶＥＨＬＶＴＧＬＫＫＣＶＤＥＬＧＰＥＡＳＥＡＶＫＫＬＬＥＡＬＳＨＬＶ
配列番号１７
ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３シグナル配列
ＭＴＲＲＲＳＡＰＡＳＷＬＬＶＳＬＬＧＶＡＴＳ
配列番号１８
ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３細胞外ドメイン
ＬＥＶＳＥＳＰＧＳＶＱＶＡＲＧＱＴＡＶＬＰＣＡＦＳＴＳＡＡＬＬＮＬＮＶＩＷＭＶＩＰＬＳＮＡＮＱＰＥＱＶＩＬＹＱＧＧＱＭＦＤＧＡＬＲＦＨＧＲＶＧＦＴＧＴＭＰＡＴＮＶＳＩＦＩＮＮＴＱＬＳＤＴＧＴＹＱＣＬＶＮＮＬＰＤＲＧＧＲＮＩＧＶＴＧＬＴＶＬＶＰＰＳＡＰＱＣＱＩＱＧＳＱＤＬＧＳＤＶＩＬＬＣＳＳＥＥＧＩＰＲＰＴＹＬＷＥＫＬＤＮＴＬＫＬＰＰＴＡＴＱＤＱＶＱＧＴＶＴＩＲＮＩＳＡＬＳＳＧＬＹＱＣＶＡＳＮＡＩＧＴＳＴＣＬＬＤＬＱＶＩＳＰＱＰＲＳＶ
配列番号１９
ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ
配列番号２０
ヒトＣＣＬ３Ｌ１シグナル配列
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱＶＬＳ
配列番号２１
ヒトＣＣＬ３Ｌ１
ＡＰＬＡＡＤＴＰＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰＳＶＩＦＬＴＫＲＧＲＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡ
配列番号２３
ＶＢ５０５０のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２９８～３３４）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３３５～３３９）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３４０～３５４）、ネズミＩＬ－１０（３５５～５１４）。
【0526】
【表5】
ＶＢ５０３８のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス単鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２９８～３３４）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３３５～３３９）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３４０～３５４）、ネズミＩＬ－１０（３５５～５１４）。ＭＯＧ（２７～６３）配列の一部は、Ｋｒｉｅｎｋｅｅｔ ａｌ．２０２１の論文から入手した。
【0527】
【表6】
ＶＢ５０４２のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２９８～３３４）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３３５～３３９）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３４０～３５４）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（３５５～３６６）、ネズミＩＬ－１０（３６７～５２６）。
【0528】
【表7】
ＶＢ５０６６のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２９８～３３４）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３３５～３３９）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３４０～３５４）、マウスＴＧＦβ１成熟配列（３５５～４６６）。
【0529】
【表8】
ＶＢ５０４３のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２９８～３３４）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３３５～３３９）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３４０～３５４）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（３５５～３６６）、マウスＴＧＦβ１成熟配列（３５５～４７８）。
【0530】
【表9】
ＶＢ５０６７のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２９８～３３４）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３３５～３３９）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３４０～３５４）、マウスＣＴＬＡ－４（３５５～４８０）。
【0531】
【表10】
ＶＢ５０７２のアミノ酸配列。ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２シグナル配列（１～２１）、ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２（２２～９１）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（９２～１０３）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（１０４～１１８）、リンカー（１１９～１２３）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（１２４～１６０）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（１６１～１６５）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１ １６６～１８０）、ネズミＩＬ－１０（１８１～３４０）。
【表11】
ＶＢ５０７３のアミノ酸配列。ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２シグナル配列（１～２１）、ネズミＭＡＲＣＯリガンドＳＣＧＢ３Ａ２（２２～９１）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（９２～１０３）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（１０４～１１８）、リンカー（１１９～１２３）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（１２４～１６０）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（１６１～１６５）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１ １６６～１８０）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（１８１～１９２）、ネズミＩＬ－１０（１９３～３５２）
【表12】
ＶＢ５０７４のアミノ酸配列。ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３シグナル配列（１～２２）、ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３細胞外ドメイン（２３～２４０）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２４１～２５２）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２５３～２６７）、リンカー（２６８～２７２）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２７３～３０９）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３１０～３１４）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３１５～３２９）、ネズミＩＬ－１０（３３０～４８９）。
【0532】
【表13】
ＶＢ５０７５のアミノ酸配列。ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３シグナル配列（１～２２）、ネズミＶＩＳＴＡリガンドＶＳＩＧ－３細胞外ドメイン（２３～２４０）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２４１～２５２）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２５３～２６７）、リンカー（２６８～２７２）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２７３～３０９）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３１０～３１４）、中間ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３１５～３２９）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（３３０～３４１）、ネズミＩＬ－１０（３４２～５０１）。
【0533】
【表14】
ＶＢ５０５２のアミノ酸配列。ヒトＣＣＬ３Ｌ１シグナル配列「Ｍｉｐ１ａ」（１～２３）、ヒトＣＣＬ３Ｌ１「ｈＭｉｐ１ａ」（２４～９３）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（９４～１０５）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（１０６～１２０）、リンカー（１２１～１３０）、ｈＣＨ３ ＩｇＧ３（１３１～２３７）、リンカー（２３８～２４２）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２４３～２７９）。
【0534】
【表15】
ＶＢ５００２ｂのアミノ酸配列。ヒトＣＣＬ３Ｌ１シグナル配列「Ｍｉｐ１ａ」（１～２３）、ヒトＣＣＬ３Ｌ１「ｈＭｉｐ１ａ」（２４～９３）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（９４～１０５）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（１０６～１２０）、リンカー（１２１～１３０）、ｈＣＨ３ ＩｇＧ３（１３１～２３７）、リンカー（２３８～２４２）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２４３～２７９）。ＭＯＧ（２７～６３）配列の一部は、Ｋｒｉｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．２０２１の論文から入手した。
【0535】
【表16】
ＶＢ５０５１のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２０～５６）。
【0536】
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＱＡＰ
配列番号３６
ＶＢ５００１ｂのアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２０～５６）。ＭＯＧ（２７～６３）配列の一部は、Ｋｒｉｅｎｋｅｅｔ ａｌ．２０２１の論文から入手した。
配列番号３６
ＶＢ５００１ｂのアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、ＭＯＧアミノ酸２７～６３（２０～５６）。ＭＯＧ（２７～６３）配列の一部は、Ｋｒｉｅｎｋｅｅｔ ａｌ．２０２１の論文から入手した。
【0537】
ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＡＱＰ
配列番号３７
ＶＢ５０７７のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、Ｍｅｔ ｅ １「２４１～２６０」、「２１０～２３０」、「１３６～１５５」、「７６～９５」、「４６～６５」、「１６～３５」（２９３～４６８）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（４６９～４７３）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（４７４～４８８）、ネズミＩＬ－１０（４８９～６４８）。
配列番号３７
ＶＢ５０７７のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、Ｍｅｔ ｅ １「２４１～２６０」、「２１０～２３０」、「１３６～１５５」、「７６～９５」、「４６～６５」、「１６～３５」（２９３～４６８）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（４６９～４７３）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（４７４～４８８）、ネズミＩＬ－１０（４８９～６４８）。
【0538】
【表17】
ＶＢ５０７８のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、Ｍｅｔ ｅ １「２４１～２６０」、「２１０～２３０」、「１３６～１５５」、「７６～９５」、「４６～６５」、「１６～３５」（２９３～４６８）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（４６９～４７３）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（４７４～４８８）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（４８９～５００）、ネズミＩＬ－１０（５０１～６６０）。
【0539】
【表18】
ＶＢ５０４１のアミノ酸配列。マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列「Ｉｇ ＶＨシグナル配列」（１～１９）、マウス一本鎖可変断片「ｓｃＦｖ」抗ＤＥＣ２０５（２０～２６５）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（２６６～２７７）、ヒンジｈ４ ｈＩｇＧ３（２７８～２９２）、リンカー（２９３～２９７）、ＭＯＧアミノ酸３５～５５（２９８～３１８）、上部ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３１９～３２３）、中央ヒンジ領域ｈＩｇＧ１（３２３～３３８）、ヒンジｈ１ ｈＩｇＧ３（３３９～３５０）、ネズミＩＬ－１０（３１５～５１０）。
【0540】
【表19】
１．寛容誘導構築物であって、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義される複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、例えば、ｉｉ）で定義される２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物。
【0541】
２．寛容誘導構築物であって、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された複数のポリペプチドからなる多量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物。
【0542】
３．寛容誘導構築物であって、
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物。
ｉ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、指定された順序で、
ａ．第１の標的化単位、第１の接合領域；
ｂ．抗原単位；
ｃ．第２の接合領域；及び
ｄ．第２の標的化単位；を含み、
抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原若しくは異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、ポリヌクレオチド；又は
ｉｉ）ｉ）で定義されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
ｉｉｉ）ｉｉ）で定義された２つのポリペプチドからなる二量体タンパク質、を含む、寛容誘導構築物。
【0543】
４．二量体タンパク質等の多量体タンパク質が、それらの接合領域を介して、好ましくはそれらのそれぞれの第１の接合領域及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている２つのポリペプチド等の複数のポリペプチドからなる、実施形態１～３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0544】
５．多量体タンパク質が、それらの接合領域を介して、好ましくはそれらのそれぞれの第１の接合領域及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結された複数のポリペプチドからなる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0545】
６．二量体タンパク質が、それらの接合領域を介して、好ましくはそれらのそれぞれの第１の接合領域及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結された２つのポリペプチドからなる、実施形態１～５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0546】
７．第１及び第２の接合領域が、柔軟性単位及び結合単位を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0547】
８．第１及び／又は第２の接合領域が、非共有結合単位である結合単位を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0548】
９．非共有結合単位が、三量体化単位である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0549】
１０．三量体化単位が、コラーゲン由来三量体化単位である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0550】
１１．コラーゲン由来三量体化単位が、ヒトコラーゲン由来ＸＶＩＩＩ三量体化ドメインである、実施形態１０に記載の寛容誘導構築物。
【0551】
１２．コラーゲン由来三量体化単位が、ヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメインである、実施形態１０に記載の寛容誘導構築物。
【0552】
１３．非共有結合単位が、四量体化単位である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0553】
１４．四量体化ドメインが、ｐ５３に由来するドメインである、実施形態１３に記載の寛容誘導構築物。
【0554】
１５．非共有結合単位が、二量体化単位である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0555】
１６．二量体化単位が、ヒンジ領域及び免疫グロブリンドメインを含む、実施形態１５に記載の寛容誘導構築物。
【0556】
１７．二量体化単位が、免疫グロブリン定常ドメインである、実施形態１６に記載の寛容誘導構築物。
【0557】
１８．二量体化単位が、ｄＨＬＸタンパク質を含む、実施形態１５に記載の寛容誘導構築物。
【0558】
１９．第１及び／又は第２の接合領域が、共有結合単位である結合単位を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0559】
２０．第１及び／若しくは第２の接合領域が、天然に存在する配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0560】
２１．第１及び／若しくは第２の接合領域が、人工配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0561】
２２．第１及び第２の接合領域が、１つ以上のシステイン残基を含む共有結合単位を含む、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0562】
２３．共有結合単位が、少なくとも２つのシステイン残基を含む、実施形態２２に記載の寛容誘導構築物。
【0563】
２４．共有結合単位が、少なくとも２つのシステイン残基、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個のシステイン残基を含む、実施形態２２又は２３に記載の寛容誘導構築物。
【0564】
２５．共有結合単位が、システインリッチ配列を含む、実施形態１９～２２の寛容誘導構築物。
【0565】
２６．第１の接合領域の共有結合単位が、第２の接合領域の共有結合単位とは異なる数のシステイン残基を含む、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0566】
２７．第１の接合領域の共有結合単位に含まれるシステイン残基が、第２の接合領域の共有結合単位に含まれるシステイン残基とは異なって位置付けられている、実施形態２２～２６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0567】
２８．第１の接合領域の共有結合単位のシステイン残基間のアミノ酸残基の数が、第２の接合領域のものと異なる、実施形態２２～２７に記載の寛容誘導構築物。
【0568】
２９．システイン残基の数が、抗原単位の長さに基づく、実施形態２２～２８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0569】
３０．共有結合単位のうちの少なくとも１つが、免疫グロブリンに由来する、実施形態１９～２９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0570】
３１．共有結合単位が、ＩｇＧ３のエクソンｈ４又はＩｇＧ１の中央ヒンジ等の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域である、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0571】
３２．ヒンジ領域が、Ｉｇ由来、例えばＩｇＧ由来、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３に由来する、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0572】
３３．ヒンジ領域が、ＩｇＭに由来する、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0573】
３４．ヒンジ領域が、配列番号１５７を有するヌクレオチド配列若しくは当該ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0574】
３５．共有結合単位が、配列番号１のアミノ酸配列１３～２７に対して少なくとも４０％の配列同一性、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0575】
３６．共有結合単位が、配列番号１のアミノ酸配列１３～２７を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失又は挿入されている、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0576】
３７．共有結合単位が、配列番号１のアミノ酸配列１３～２３ ２７からなる、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0577】
３８．共有結合単位が、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ４である、実施形態３１に記載の寛容誘導構築物。
【0578】
３９．共有結合単位が、配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号１５６；配列番号１のアミノ酸１３～２７に対応する）を含む、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0579】
４０．共有結合単位が、システイン残基が例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性でそれらの数及び位置において保持される限り、配列番号２のアミノ酸配列５～１５に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0580】
４１．共有結合単位が、配列番号２のアミノ酸配列５～１５を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失又は挿入されている、実施形態１～３０に記載の寛容誘導構築物。
【0581】
４２．共有結合単位が、配列番号２のアミノ酸配列５～１５からなるか、又はそれを含む、実施形態４１に記載の寛容誘導構築物。
【0582】
４３．共有結合単位が、ＩｇＧ１の中央ヒンジ領域である、実施形態３０に記載の寛容誘導構築物。
【0583】
４４．共有結合単位が、非免疫原性配列である、実施形態１９～４３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0584】
４５．共有結合単位が、天然に存在するペプチド配列である、実施形態１９～４４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0585】
４６．共有結合単位が、２～１００アミノ酸、例えば３～７０アミノ酸、例えば４～５０アミノ酸又は５～３０アミノ酸からなる、実施形態１９～４５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0586】
４７．共有結合単位が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸からなる、実施形態１９～４６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0587】
４８．共有結合単位のうちの少なくとも１つが、人工配列である、実施形態１９～４７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0588】
４９．第１及び第２の接合領域が、非共有結合単位である結合単位を含む、実施形態８～４８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0589】
５０．非共有結合単位が、疎水性相互作用等の非共有相互作用を通して多量体化に寄与する、実施形態８～４９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0590】
５１．非共有結合単位が、疎水性相互作用等の非共有相互作用を通して二量体化に寄与する、実施形態８～５０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0591】
５２．非共有結合単位が、非共有結合相互作用を介して多量体タンパク質を形成する能力を有する、実施形態８～５１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0592】
５３．非共有結合単位が、非共有結合相互作用を介して二量体を形成する能力を有する、実施形態８～５２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0593】
５４．非共有結合単位のうちの少なくとも１つが、天然に存在する配列である、実施形態８～５３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0594】
５５．非共有結合単位のうちの少なくとも１つが、人工配列である、実施形態８～５４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0595】
５６．非共有結合単位が、免疫グロブリンであるか、又はそれを含む、実施形態８～５５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0596】
５７．非共有結合単位が、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｃドメイン）等の免疫グロブリンドメイン、例えば、カルボキシ末端定常ドメイン（すなわち、ＣＨ３ドメイン）、ＣＨ１ドメイン若しくはＣＨ２ドメイン、又はＣドメインと実質的に同一である配列若しくはその変異体からなるか、又はそれを含む、実施形態８～５６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0597】
５８．非共有結合単位が、ＩｇＧに由来する、例えばＩｇＧ３若しくはＩｇＧ１に由来する、好ましくはＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる、実施形態８～５７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0598】
５９．非共有結合単位が、ＩｇＧ３に由来するＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる、実施形態８～５８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0599】
６０．非共有結合単位が、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含むか、又はそれからなる、実施形態８～５９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0600】
６１．非共有結合単位が、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％若しくは例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含むか、又はそれからなる、実施形態８～６０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0601】
６２．非共有結合単位が、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩｇＧ３に由来するカルボキシ末端Ｃドメインを含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つが、別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、２１以下のアミノ酸、例えば２０以下のアミノ酸、例えば１９以下のアミノ酸、例えば１８以下のアミノ酸、例えば１７以下のアミノ酸、例えば１６以下のアミノ酸、例えば１５以下のアミノ酸、例えば１４以下のアミノ酸、例えば１３以下のアミノ酸、例えば１２以下のアミノ酸、例えば１１以下のアミノ酸、例えば１０以下のアミノ酸、例えば９以下のアミノ酸、例えば８以下のアミノ酸、例えば７以下のアミノ酸、例えば６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失又は挿入されている、実施形態８～６１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0602】
６３．非共有結合単位が、ＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる、８～６２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0603】
６４．非共有結合単位が、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる、８～６３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0604】
６５．非共有結合単位が、配列番号４によるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％若しくは例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる、８～６４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0605】
６６．非共有結合単位が、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインを含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つが、別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、２１以下のアミノ酸、例えば２０以下のアミノ酸、例えば１９以下のアミノ酸、例えば１８以下のアミノ酸、例えば１７以下のアミノ酸、例えば１６以下のアミノ酸、例えば１５以下のアミノ酸、例えば１４以下のアミノ酸、例えば１３以下のアミノ酸、例えば１２以下のアミノ酸、例えば１１以下のアミノ酸、例えば１０以下のアミノ酸、例えば９以下のアミノ酸、例えば８以下のアミノ酸、例えば７以下のアミノ酸、例えば６以下のアミノ酸、例えば５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失又は挿入されている、実施形態８～６５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0606】
６７．前記非共有結合単位が、ロイシンジッパーモチーフを含むか、又はそれからなる、８～６６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0607】
６８．ロイシンジッパーモチーフが、真核生物転写因子のｂＺＩＰクラスに由来する、実施形態６７に記載の寛容誘導構築物。
【0608】
６９．非共有結合単位が、Ｊｕｎ／Ｆｏｓベースのロイシンジッパーを含むか、又はそれからなる、8～６７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0609】
７０．ロイシンジッパーモチーフが、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、８～６７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0610】
７１．非共有結合単位が、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８１％又は少なくとも８１％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、８～６７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0611】
７２．非共有結合単位が、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、１２以下、例えば１１以下、例えば１０以下、例えば９以下、例えば８以下、例えば７以下、例えば６以下、例えば５以下、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸、例えば１以下のアミノ酸の場合である、８～６７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0612】
７３．非共有結合単位が、複数のポリペプチド、例えば２つ、３つ、４つ以上のポリペプチドを接合して、多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質、三量体タンパク質又は四量体タンパク質にする、８～７２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0613】
７４．非共有結合単位が、三量体化単位、例えばコラーゲン由来三量体化単位、例えばヒトコラーゲン由来三量体化ドメイン、例えばヒトコラーゲン由来ＸＶＩＩＩ三量体化ドメイン又はヒトコラーゲンＸＶ三量体化ドメインであるか、又はそれを含む、８～７３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0614】
７５．非共有結合単位が、配列番号１５８を有するヌクレオチド配列若しくは当該ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる三量体化単位である、８～７４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0615】
７６．三量体化単位が、Ｔ４フィブリチンのＣ末端ドメインを含むか、又はそれからなる、８～７５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0616】
７７．非共有結合単位が、配列番号１５９を有するアミノ酸配列若しくは当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる三量体化単位である、８～７６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0617】
７８．非共有結合単位が、ｐ５３に由来するドメイン等の四量体化単位を含むか、又はそれからなる、８～７７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0618】
７９．非共有結合単位が、配列番号１６０を有するヌクレオチド配列若しくは当該ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる四量体化単位である、８～７８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0619】
８０．第１及び／若しくは第２の接合領域が、天然に存在する配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～７９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0620】
８１．第１及び／若しくは第２の接合領域が、人工配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～８０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0621】
８２．第１及び／又は第２の接合領域におけるシステイン残基の数が、抗原単位の長さに基づく、実施形態１～８１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0622】
８３．接合領域が、共有結合単位及び非共有結合単位を含む結合単位を含む、実施形態１～８２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0623】
８４．接合領域が、非免疫原性である、実施形態１～８３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
８５．柔軟性単位が、標的化単位と結合単位との間にある、実施形態７～８４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
８５．柔軟性単位が、標的化単位と結合単位との間にある、実施形態７～８４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0624】
８６．柔軟性単位が、非免疫原性配列である、実施形態７～８５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0625】
８７．柔軟性単位のうちの少なくとも１つが、天然に存在するペプチド配列である、実施形態７～８６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0626】
８８．柔軟性単位が、免疫グロブリンに由来する、実施形態７～８７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0627】
８９．柔軟性単位が、ＩｇＧ３のエクソンｈ１又はＩｇＧ１の下部ヒンジ等の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域である、実施形態７～８８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0628】
９０．柔軟性単位が、ＩｇＧ３のヒンジエクソンｈ１を含むか、又はそれからなる、実施形態７～８９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0629】
９１．柔軟性単位が、ＩｇＧ１の下部ヒンジ領域を含むか、又はそれからなる、実施形態７～９０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0630】
９２．柔軟性単位が、配列番号１のアミノ酸配列１～１２を含むか、又はそれからなる、実施形態７～９１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0631】
９３．柔軟性単位が、配列番号２のアミノ酸配列１６～２３に対して少なくとも５０％の配列同一性、例えば６０％又は例えば７０％又は例えば８０％若しくは例えば９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態７～９２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0632】
９４．柔軟性単位のアミノ酸のいずれか１つが、別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、３以下のアミノ酸、２以下のアミノ酸又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失又は挿入されている、実施形態７～９３のいずれか１つの寛容誘導構築物。
【0633】
９５．柔軟性単位が、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンのヒンジ領域、例えばシステイン残基を含まない免疫グロブリンのヒンジ領域に由来する、実施形態７～９４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0634】
９６．柔軟性単位のうちの少なくとも１つが、人工配列である、実施形態７～９５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0635】
９７．柔軟性単位が、セリン及び／又はグリシンリッチリンカーである、実施形態７～８３及び９６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0636】
９８．柔軟性単位が、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）等のグリシン－セリンリンカーである、実施形態７～８４及び９７～９８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0637】
９９．柔軟性単位が、プロテアーゼの標的ではない、実施形態７～９９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0638】
１００．柔軟性単位が、最大２０アミノ酸、例えば最大１５アミノ酸、例えば１２アミノ酸又は１０アミノ酸からなる、実施形態７～９９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0639】
１０１．第２の接合領域に含まれる柔軟性単位が、５～６０アミノ酸、例えば７～５５アミノ酸又は８～５０アミノ酸又は９～４５アミノ酸又は１０～４０アミノ酸又は１１～３５アミノ酸又は１２～３０アミノ酸又は１３～２０アミノ酸からなる、実施形態７～１００のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0640】
１０２．柔軟性単位が、グリシン、アラニン若しくはロイシン等の小さな非極性アミノ酸、又はセリン若しくはスレオニン等の極性アミノ酸を含む、実施形態７～１０１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0641】
１０３．接合領域が、非免疫原性である、実施形態１～１０２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0642】
１０４．第１又は第２の標的化単位のうちの少なくとも１つが、抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分を含み、好ましくは、第１及び第２の標的化単位の両方が、抗原提示細胞上の表面分子と相互作用する部分を含む、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0643】
１０５．表面分子が、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、又はＴＧＦβＲ３）、ＩＬ－１０ＲＡ及びＩＬ１０－ＲＢ等のＩＬ１０Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１１Ｒ及びＩＬ１３Ｒ、ＩＬ２７Ｒ、ＩＬ３５Ｒ、ＩＬ３７Ｒ、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＣＤ２０５、ＣＤ１０９、ＶＩＳＴＡ、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣＩＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８３、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＧＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ｂ、ＤＣＩＲ２、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＲ、ＤＣ－Ｓｉｇｎ、Ｔｒｅｍｌ４、Ｄｅｃｔｉｎ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、アリール炭化水素受容体並びにビタミンＤ受容体からなる群から選択される、実施形態１０４に記載の寛容誘導構築物。
【0644】
１０６．標的化単位が、天然リガンド、抗体又はその一部、例えばｓｃＦｖ、又は合成リガンドである部分を含む、実施形態１０５に記載の寛容誘導構築物。
【0645】
１０７．天然リガンドが、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ２７、ＩＬ３５、ＩＬ３７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４としても知られる細胞間接着分子１）、ケラチン、ＶＳＩＧ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＴＬＡ－４、好ましくはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１の細胞外ドメイン、好ましくはＰＤ－１及びＢＴＬＡの細胞外ドメイン、好ましくはＢＴＬＡの細胞外ドメインからなる群から選択される、実施形態１０６に記載の寛容誘導構築物。
【0646】
１０８．標的化単位が、ＩＬ－１０又はＴＧＦβ、好ましくはヒトＩＬ－１０若しくはヒトＴＧＦβを含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0647】
１０９．標的化単位が、ヒトＴＧＦβのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0648】
１１０．標的化単位が、ヒトＴＧＦβのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、それに対して少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0649】
１１１．標的化単位が、最大２２アミノ酸、例えば最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＴＧＦβのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0650】
１１２．標的化単位が、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0651】
１１３．標的化単位が、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、それに対して少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0652】
１１４．標的化単位が、最大２２アミノ酸、例えば最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0653】
１１５．標的化単位が、ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列若しくはヒトＩＬ－１０をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0654】
１１６．標的化単位が、ＳＣＧＢ３Ａ２又はＶＳＩＧ－３、好ましくはヒトＶＳＩＧ－３又はヒトＳＣＧＢ３Ａ２であるか、又はそれを含む、実施形態１～１１５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0655】
１１７．標的化単位が、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0656】
１１８．標的化単位が、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0657】
１１９．標的化単位が、最大２２アミノ酸、例えば最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0658】
１２０．標的化単位が、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列若しくはヒトＳＣＧＢ３Ａ２をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１１９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0659】
１２１．標的化単位が、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１２０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0660】
１２２．標的化単位が、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１２１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0661】
１２３．標的化単位が、最大２２アミノ酸、例えば最大２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が置換、欠失又は挿入されていることを除いて、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１２２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0662】
１２４．標的化単位が、ヒトＶＳＩＧ－３のアミノ酸配列若しくはヒトＶＳＩＧ－３をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１２３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0663】
１２５．標的化単位が、ＣＤ２０５に対する特異性を有する抗体若しくはその一部、例えばｓｃＦｖを含むか、又はそれからなる、実施形態１～１２４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0664】
１２６．第１及び第２の標的化単位が同一である、実施形態１～１２５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0665】
１２７．第１及び第２の標的化単位が異なる、実施形態１～１２５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0666】
１２８．表面分子が、同じ細胞上に存在する、実施形態１０４～１２７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0667】
１２９．第１又は第２の標的化単位の結合が、構築物の内在化を引き起こす、実施形態１０４～１２８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0668】
１３０．抗原単位が、第１の接合領域と第２の接合領域との間に位置する、実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0669】
１３１．抗原単位が、自己抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ、例えば自己抗原の１つのＴ細胞エピトープ又は自己抗原の２つ以上のＴ細胞エピトープ、例えば自己抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～１３０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0670】
１３２．複数のＴ細胞エピトープが、同じ自己抗原に含まれるもの等、同じ自己抗原のものである、実施形態１３１に記載の寛容誘導構築物。
【0671】
１３３．複数のＴ細胞エピトープが、異なる自己抗原に含まれるもの等、複数の異なる自己抗原のものである、実施形態１３１又は１３２に記載の寛容誘導構築物。
【0672】
１３４．抗原単位が、２つ以上のＴ細胞エピトープを含み、抗原単位が、Ｔ細胞エピトープを分離する１つ以上のリンカーを含む、実施形態１～１３３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0673】
１３５．抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の複数のＴ細胞エピトープ等の複数の抗原を含み、Ｔ細胞エピトープが、好ましくはリンカーによって分離されている、実施形態１～１３４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0674】
１３６．抗原単位が、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含み、各Ｔ細胞エピトープが、リンカーによって他のＴ細胞エピトープから分離されている、実施形態１～１３５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0675】
１３７．ｎ個の抗原を含む抗原単位が、ｎ－１個のサブユニットを含み、各サブユニットが、自己抗原、アレルゲン、同種抗原又は異種抗原のＴ細胞エピトープ、及びリンカーを含み、末端Ｔ細胞エピトープを更に含む、実施形態１～１３６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0676】
１３８．ｎが、１～５０、例えば、３～５０又は１５～４０又は１０～３０又は１０～２５又は１０～２０又は１５～３０又は１５～２５又は１５～２０の整数である、実施形態１３７に記載の寛容誘導構築物。
【0677】
１３９．抗原単位が、非免疫原性であるように設計されたリンカーを含む、実施形態１～１３８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0678】
１４０．抗原単位が、アレルゲンの１つ以上のＴ細胞エピトープ、例えばアレルゲンの１つのＴ細胞エピトープ又はアレルゲンの２つ以上のＴ細胞エピトープ、例えばアレルゲンの複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１３１～１３９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0679】
１４１．複数のＴ細胞エピトープが、同じアレルゲンに含まれるもの等、同じアレルゲンのものである、実施形態１３１～１４０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0680】
１４２．複数のＴ細胞エピトープが、複数の異なるアレルゲンのものである、すなわち異なるアレルゲンに含まれる、実施形態１３１～１４１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0681】
１４３．抗原単位が、同種抗原／異種抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ、例えば同種抗原／異種抗原の１つのＴ細胞エピトープ又は同種抗原／異種抗原の２つ以上のＴ細胞エピトープ、例えば同種抗原／異種抗原の複数のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～１４２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0682】
１４４．複数のＴ細胞エピトープが、同じ同種抗原／異種抗原のものである、すなわち、同じ同種抗原／異種抗原に含まれる、実施形態１３１～１４３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0683】
１４５．複数のＴ細胞エピトープが、異なる同種抗原／異種抗原に含まれるもの等、複数の異なる同種抗原／異種抗原のものである、実施形態１３１～１４４のいずれかの寛容誘導構築物。
【0684】
１４６．抗原単位が、１つのＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～１４５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0685】
１４７．抗原単位が、複数のＴ細胞エピトープ等の２つ以上のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～１４６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0686】
１４８．抗原単位が、７～１５０アミノ酸、好ましくは７～１００アミノ酸、例えば、約１０～約１００アミノ酸、又は約１５～約１００アミノ酸、又は約２０～約７５アミノ酸、又は約２５～約５０アミノ酸、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０アミノ酸の長さを有するＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～１４７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0687】
１４９．１つのＴ細胞エピトープの長さが、タンパク質が正しく折り畳まれないような長さである、実施形態１３１～１４８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0688】
１５０．Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）による提示に好適な長さを有する、実施形態１３１～１４９のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0689】
１５１．抗原単位が、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ上での特異的提示に好適な長さを有するＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～１５０のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0690】
１５２．Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩ提示のために７～１１アミノ酸の長さを有する、実施形態１３１～１５１のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。別の実施形態では、Ｔ細胞エピトープ配列は、ＭＨＣクラスＩＩ提示のために、９～６０アミノ酸、例えば９～３０アミノ酸、例えば１５～６０アミノ酸、例えば１５～３０アミノ酸の長さを有する。
【0691】
１５３．Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩ提示のために１５アミノ酸の長さを有する、実施形態１３１～１５２のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0692】
１５４．抗原単位が、最大３５００アミノ酸、例えば６０～３５００アミノ酸、例えば約８０又は約１００又は約１５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、例えば約２００～約２５００アミノ酸、例えば約３００～約２０００アミノ酸又は約４００～約１５００アミノ酸又は約５００～約１０００アミノ酸を含む、実施形態１～１５３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0693】
１５５．抗原単位が、１～１０個のＴ細胞エピトープ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９若しくは１０個のＴ細胞エピトープ、又は１１～２０個のＴ細胞エピトープ、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個のＴ細胞エピトープ、又は２１～３０個のＴ細胞エピトープ、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個のＴ細胞エピトープ、又は３１～４０個のＴ細胞エピトープ、例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０個のＴ細胞エピトープ、又は４１～５０個のＴ細胞エピトープ、例えば、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１～１５４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0694】
１５６．サブユニット抗原単位が、１～３個のＴ細胞エピトープ、例えば、１、２、３若しくは１～５個のＴ細胞エピトープ、例えば、１、２、３、４、５若しくは３～６個のＴ細胞エピトープ、例えば、３、４、５、６若しくは５～１５個のＴ細胞エピトープ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５個のＴ細胞エピトープ、又は７～１７個のＴ細胞エピトープ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６若しくは１７個のＴ細胞エピトープ、又は９～１９個のＴ細胞エピトープ、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８若しくは１９個のＴ細胞エピトープを含む、実施形態１３７～１５５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0695】
１５７．Ｔ細胞エピトープが、抗原単位中にランダムに配置されている、実施形態１３１～１５６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0696】
１５８．Ｔ細胞エピトープが、多量体化／二量体化単位から抗原単位の末端への方向に、より抗原性の高いものからより抗原性の低いものの順序で配置されている、実施形態１３１～１５７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0697】
１５９．Ｔ細胞エピトープが、第１の接合領域から前記第２の接合領域への方向に、より抗原性の高いものからより抗原性の低いものの順序で配置されている、実施形態１３１～１５８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0698】
１６０．最も疎水性のＴ細胞エピトープが、第１の抗原単位の実質的に中央に位置付けられ、最も親水性のＴ細胞エピトープが、接合領域に向かって位置付けられている、実施形態１３１～１５８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0699】
１６１．Ｔ細胞エピトープが、親水性Ｔ細胞エピトープと疎水性Ｔ細胞エピトープとの間で交互に配置されている、実施形態１３１～１５８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0700】
１６２．Ｔ細胞エピトープをコードするＧＣリッチ配列が、ＧＣクラスターが回避されるように配置されている、実施形態１３１～１５８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0701】
１６３．ＧＣリッチＴ細胞配列が、それらの間に少なくとも１つの非ＧＣリッチＴ細胞配列が存在するように配置されている、実施形態１６２に記載の寛容誘導構築物。
【0702】
１６４．構築物が、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含むポリヌクレオチドである、実施形態１～１６３のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0703】
１６５．ポリヌクレオチドが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１６４のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0704】
１６６．ポリヌクレオチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１６５のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0705】
１６７．ポリヌクレオチドが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％を有するアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0706】
１６８．ポリヌクレオチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１６７のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0707】
１６９．シグナルペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、シグナルペプチドのアミノ酸のいずれか１つが、別のアミノ酸に置換、欠失又は挿入され、但し、５以下のアミノ酸、例えば４以下のアミノ酸、例えば３以下のアミノ酸、例えば２以下のアミノ酸又は１以下のアミノ酸がそのように置換、欠失又は挿入されている、実施形態１～１６８のいずれか１つに記載の寛容誘導構築物。
【0708】
１７０．実施形態１～１６９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【0709】
１７１．実施形態１７０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【0710】
１７２．実施形態に記載のポリヌクレオチド及び／又は実施形態１６９若しくは１７０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【0711】
１７３．実施形態１～１６９のいずれかに１つ記載のヌクレオチド配列核酸によってコードされるポリペプチド。
【0712】
１７４．複数のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、実施形態１～１６９のいずれか１つに記載の多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質。
【0713】
１７５．複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、実施形態１～１６９のいずれかに１つに記載の多量体タンパク質。
【0714】
１７６．２つのポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、実施形態１～１７５のいずれかに１つに記載の二量体タンパク質。
１７７．医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を、薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法。
１７７．医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を、薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法。
【0715】
１７８．医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を、薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法。
ａ）実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を、薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法。
【0716】
１７９．医薬組成物を調製する方法であって、
ａ）実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法。
ａ）実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を提供することと、
ｂ）ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質を薬学的に許容される担体と合わせることと、を含む、方法。
【0717】
１８０．実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【0718】
１８１．実施形態１～１７５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は多量体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【0719】
１８２．実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は二量体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【0720】
１８３．実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含み、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤及び／又は希釈剤を更に含む、医薬組成物。
【0721】
１８４．薬学的に許容される担体が、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、滅菌等張水性緩衝液、及びそれらの組み合わせ（combin157ation）からなる群から選択される、実施形態１～１７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【0722】
１８５．医薬品として使用するための、実施形態１８０～１８５に記載の医薬組成物。
【0723】
１８６．自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態の処置において使用するための、実施形態１８０～１８５に記載の医薬組成物。
【0724】
１８７．自己免疫疾患の処置に使用するための、実施形態１８０～１８６に記載の医薬組成物。
【0725】
１８８．アレルギーの処置に使用するための、実施形態１８０～１８７に記載の医薬組成物。
【0726】
１８９．移植片拒絶の処置に使用するための、実施形態１８０～１８８に記載の医薬組成物。
【0727】
１９０．自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する若しくは有する疑いがある対象、又はその防止を必要とする対象を処置するための方法であって、薬学的に許容される担体を含む実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【0728】
１９１．医薬組成物が、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物である、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用するための、医薬組成物。
【0729】
１９２．医薬組成物が、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物である、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いがある対象の予防的又は治療的処置において使用するための、医薬組成物。
【0730】
１９３．医薬組成物が、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物である、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置のための、医薬組成物の使用。
【0731】
１９４．医薬組成物が、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物である、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患に罹患しているか又は罹患している疑いがある対象の予防的又は治療的処置のための医薬品の製造のための、医薬組成物の使用。
【0732】
１９５．医薬組成物が、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物である、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有する対象の予防的又は治療的処置のための、医薬組成物の使用。
【0733】
１９６．医薬品が当該対象に投与される、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有するか又は有することが疑われる対象の予防的又は治療的処置のための医薬品の製造のための、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
【0734】
１９７．医薬品が当該対象に投与される、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有するか又は有することが疑われる対象の予防的又は治療的処置のための、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
【0735】
１９８．自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患の予防的又は治療的処置において使用される場合の、実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【0736】
１９９．実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することによる、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶からなる群から選択される免疫疾患を有するか又は有することが疑われる対象の予防的又は治療的処置のための医薬品。
【0737】
２００．ポリペプチド又は二量体タンパク質等の多量体タンパク質を調製する方法であって、
ａ）実施形態１７１に記載のベクター又は実施形態１～１７０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）二量体タンパク質等の多量体タンパク質、及び／又は細胞によって発現されたポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法。
ａ）実施形態１７１に記載のベクター又は実施形態１～１７０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）二量体タンパク質等の多量体タンパク質、及び／又は細胞によって発現されたポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法。
【0738】
２０１．ポリペプチド又は多量体タンパク質を調製する方法であって、
ａ）実施形態１７１に記載のベクター又は実施形態１～１７０及び１７３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された多量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法。
ａ）実施形態１７１に記載のベクター又は実施形態１～１７０及び１７３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された多量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法。
【0739】
２０２．ポリペプチド又は二量体タンパク質を調製する方法であって、
ａ）実施形態１７１に記載のベクター又は実施形態１～１７０及び１７３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された二量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法。
ａ）実施形態１７１に記載のベクター又は実施形態１～１７０及び１７３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、
ｂ）細胞を培養することであって、それによって細胞が当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する、ことと、
ｃ）細胞によって発現された二量体タンパク質及び／又はポリペプチドを取得及び精製することと、を含む、方法。
【0740】
２０３．ステップｃ）が、二量体タンパク質等の複数のタンパク質を含有する画分を精製するステップを含み、２つのポリペプチド等の複数のポリペプチドが、それらのそれぞれの第１の接合領域を介して、及びそれらのそれぞれの第２の接合領域を介して互いに連結されている、実施形態２００～２０２のいずれか１つに記載の方法。
【0741】
２０４．自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び移植片拒絶の予防的又は治療的処置等における、望まない免疫反応を伴う状態を処置するための方法であって、実施形態１～１７０及び１７３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、多量体タンパク質若しくは二量体タンパク質、実施形態１７１に記載のベクター、又は実施形態１８０～１８９のいずれか１つに記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【0742】
２０５．対象が、哺乳動物である、実施形態２０４に記載の方法。
【0743】
２０６．哺乳動物が、ヒトである、実施形態２０５に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図12G】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】