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特表2024-516991細胞接着性の３Ｄ印刷されたオブジェクトを生成するための官能化および非官能化ＥＣＭ、ＥＣＭ断片、ペプチドおよび生理活性成分の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-18
(54)【発明の名称】細胞接着性の３Ｄ印刷されたオブジェクトを生成するための官能化および非官能化ＥＣＭ、ＥＣＭ断片、ペプチドおよび生理活性成分の使用
(51)【国際特許分類】
A61L 27/36 20060101AFI20240411BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20240411BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20240411BHJP
A61L 27/16 20060101ALI20240411BHJP
【ＦＩ】
A61L27/36 130
A61L27/24
A61L27/22
A61L27/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023567873
(86)(22)【出願日】2022-05-06
(85)【翻訳文提出日】2023-12-28
(86)【国際出願番号】 US2022028080
(87)【国際公開番号】W WO2022236061
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】63/185,293
(32)【優先日】2021-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516346377
【氏名又は名称】ラング バイオテクノロジー ピービーシー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】コウル，アマン
(72)【発明者】
【氏名】ヘルナンデス，ビクター
(72)【発明者】
【氏名】シアー，バーバラ
(72)【発明者】
【氏名】アリアス，イザベル
(72)【発明者】
【氏名】アルバレス，ルイス
【テーマコード（参考）】
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C081AB31
4C081BA12
4C081BA13
4C081BA16
4C081CA08
4C081CD11
4C081CD12
4C081CD15
4C081CD17
4C081DA01
4C081DA12
(57)【要約】
この開示の実施形態は、バイオインクおよびバイオインク組成物に関する。これらのバイオインクは、ヒドロゲルへと３Ｄ印刷され得る。印刷されたヒドロゲルは、初代細胞および人工多能性幹細胞の付着、増殖および拡散を支持することができる。バイオインク中の化合物は、化学合成手段等により、化学的官能性を組み込まれるように修飾され得る。化学的官能性の組み込みは、バイオインク中の構成成分としての修飾された材料の組み込みを可能とし得る。修飾は、所望の構成成分の化学的共役を可能とし得る。所望の構成成分は、細胞の付着および増殖を補助するその細胞相互作用特性を維持し得る。そのような組み込みは、細胞接着を妨げることなく、バイオプリンティングされたオブジェクトの機械的特性の調整を可能とし得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
架橋された（メタ）アクリル化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料および非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料を含む、組成物。
【請求項2】
（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料と非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料との比が、約５：１～約１：５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料が、約５～約９５パーセントの（メタ）アクリル化の程度を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＥＣＭ材料が、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンから選択される、請求項１または３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
前記ＥＣＭ材料がＩ型コラーゲンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料が、モノまたはジ（メタ）アクリル化ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料を含む、請求項１または５のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
前記ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料が、ＲＧＤ、ＫＱＡＧＤＶ、ＹＩＧＳＲ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ、ＶＰＧＩＧ、ＦＨＲＲＩＫＡ、ＫＲＳＲ、ＡＰＧＬ、ＶＲＮ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ、ＧＶＰＧＩ、ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ、およびＩＥＧＲから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料がプロテアーゼに感受性の配列である、請求項６に記載の組成物。
【請求項9】
前記プロテアーゼが、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１～１０、キモトリプシン高特異性（［ＦＹＷ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、キモトリプシン低特異性（［ＦＹＷＭＬ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌（Staphylococcal）ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビンおよびトリプシンから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物が、重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレート、ポリ（ヒドロキシエチル）（メタクリレート）、ポリＮ－ヒドロキシルアクリルアミド、３－ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシブチルアクリレートをさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
前記ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーが、約４００～約２０，０００の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーが、約２０００～約４０００のＭｗを有する、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーが、前記組成物の約５～約５０ｗｔ．％の量で存在する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物が、初代細胞および／または人工多能性幹細胞の付着、増殖および拡散を支持する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記組成物が、成形されたかまたは３Ｄ印刷されたヒドロゲル物品である、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物が、成形されたかまたは３Ｄヒドロゲル印刷された、光架橋された物品である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記物品が、臓器の三次元物品であり、前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項１５または１６に記載の成形されたかまたは３Ｄ印刷されたヒドロゲル物品。
【請求項18】
三次元物品を作製する方法であって、印刷可能な組成物の層を表面に堆積させて堆積層を得るステップ、
前記堆積層に照射するステップ、ならびに
前記堆積層が三次元物品を形成するまで前記堆積するステップおよび照射するステップを繰り返すステップ
を含み、
前記印刷可能な組成物が、（メタ）アクリル化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料、非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料および光開始剤を含む、方法。
【請求項19】
前記ＥＣＭ材料が、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記印刷可能な組成物が、ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記印刷可能な組成物が、モノまたはジ（メタ）アクリル化ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料をさらに含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料が、ＲＧＤ、ＫＱＡＧＤＶ、ＹＩＧＳＲ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ、ＶＰＧＩＧ、ＦＨＲＲＩＫＡ、ＫＲＳＲ、ＡＰＧＬ、ＶＲＮ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ、ＧＶＰＧＩ、ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ、およびＩＥＧＲから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料がプロテアーゼに感受性の配列である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項24】
前記プロテアーゼが、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１～１０、キモトリプシン高特異性（［ＦＹＷ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、キモトリプシン低特異性（［ＦＹＷＭＬ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌（Staphylococcal）ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビンおよびトリプシンから選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料と非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料との比が、約５：１～約１：５である、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料が、約５～約９５パーセントの（メタ）アクリル化の程度を有する、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記光開始剤が、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）トリメチルベンゾイルベースの光開始剤、ジフェニル（２，４，６－トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド（ＴＰＯナノ粒子）イルガキュアクラスの光開始剤、ルテニウム、およびリボフラビン、またはそれらの混合物を含む、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記印刷可能な組成物が、ポリマー、ＵＶ３８６Ａ染料、天然の細胞外マトリックス、光開始剤、ペプチド、アミノ酸、成長因子、変性細胞外マトリックス、細胞外マトリックス断片またはそれらの混合物を含む１つまたは複数の添加剤をさらに含む、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記印刷可能な組成物が、３００ｎｍ～４２０ｎｍの間の吸光度スペクトルを有し、細胞毒性でなく、分子構造中にベンザイン環の組成を有する任意のＵＶ染料を含む、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
印刷された足場が、前記足場が置かれた緩衝液にモノマーを溶出するときに細胞毒性でない、請求項１８から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項31】
前記印刷可能な組成物が、プロトン性溶媒をさらに含む、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記プロトン性溶媒が、水、ポリエチレングリコール、グリコールジアクリレート誘導体またはそれらの混合物を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項33】
前記三次元物品が、臓器または臓器の一部を複製する、請求項１８から３０のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている、２０２１年５月６日に出願された米国仮出願第６３／１８５，２９３号の優先権を主張するものである。
本出願は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている、２０２１年５月６日に出願された米国仮出願第６３／１８５，２９３号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【0002】
背景
ヒドロゲルを含む組成物は、生体適合性構造に使用されるオブジェクトを形成するために使用され得る。これらのオブジェクトは、三次元（３Ｄ）印刷（プリンティング（printing））技術を使用して形成され得る。細胞は、合成臓器（synthetic organ）などの実用的な用途のために付着され得る。
ヒドロゲルを含む組成物は、生体適合性構造に使用されるオブジェクトを形成するために使用され得る。これらのオブジェクトは、三次元（３Ｄ）印刷（プリンティング（printing））技術を使用して形成され得る。細胞は、合成臓器（synthetic organ）などの実用的な用途のために付着され得る。
【発明の概要】
【0003】
要旨
この開示の実施形態は、バイオインクおよびバイオインク組成物に関する。これらのバイオインクは、ヒドロゲルへと３Ｄ印刷され得る。印刷されたヒドロゲルは、初代細胞（primary cell）および人工多能性幹細胞の付着（attachment）、増殖（proliferation）および拡散（spreading）を支持することができる。バイオインク中の化合物は、化学合成手段等により、化学的官能性を組み込まれるように修飾され得る。化学的官能性の組み込みは、バイオインク中の構成成分としての修飾された材料の組み込みを可能とし得る。修飾は、所望の構成成分の化学的共役（chemical conjugation）を可能とし得る。所望の構成成分は、細胞の付着および増殖を補助するその細胞相互作用特性を維持し得る。そのような組み込みは、細胞接着を妨げることなく、バイオプリンティングされたオブジェクトの機械的特性の調整を可能とし得る。
この開示の実施形態は、バイオインクおよびバイオインク組成物に関する。これらのバイオインクは、ヒドロゲルへと３Ｄ印刷され得る。印刷されたヒドロゲルは、初代細胞（primary cell）および人工多能性幹細胞の付着（attachment）、増殖（proliferation）および拡散（spreading）を支持することができる。バイオインク中の化合物は、化学合成手段等により、化学的官能性を組み込まれるように修飾され得る。化学的官能性の組み込みは、バイオインク中の構成成分としての修飾された材料の組み込みを可能とし得る。修飾は、所望の構成成分の化学的共役（chemical conjugation）を可能とし得る。所望の構成成分は、細胞の付着および増殖を補助するその細胞相互作用特性を維持し得る。そのような組み込みは、細胞接着を妨げることなく、バイオプリンティングされたオブジェクトの機械的特性の調整を可能とし得る。
【0004】
本明細書では、例えば、本明細書において開示されている材料を使用した、鋳造、フラッド硬化（flood curing）、光硬化、光重合（photopylmerization）、交互積層印刷（layer by layer printing）またはオブジェクトの押出により形成されたオブジェクトが開示される。オブジェクトは、臓器組織の代替物（organ tissue replacement）であってもよい。オブジェクトは、商品価値のある他のオブジェクトであってもよい。この開示の実施形態は、３Ｄ印刷されたオブジェクトおよびそれらを形成する方法に関する。
【0005】
この開示の実施形態は、細胞付着および結果として生じたフレームワークとの相互作用を改善するために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を修飾するシステムおよび方法に関する。本明細書では、結果として生じたフレームワークならびに細胞の付着および相互作用の方法、ならびにそれで製造されたオブジェクトが開示される。本明細書で示すように、Ｉ型コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、メタクリレート基などの基で官能化されて光架橋性ヒドロゲル中への組み込みを可能とし得る。細胞外マトリックスの組み込みは、細胞の付着およびヒドロゲル内の相互作用を可能とし、ヒドロゲルを生体適合性とし得る。
【0006】
この開示の実施形態は、架橋された（メタ）アクリル化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料および非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料を含む組成物に関する。組成物は、約５：１～約１：５（例えば、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４または約１：５）の、（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料と非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料との比を有し得る。（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料は、約５～約９５パーセント（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％）の（メタ）アクリル化の程度を有し得る。ＥＣＭ材料は、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンから選択することができる。ＥＣＭ材料はＩ型コラーゲンであってもよい。（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料は、モノまたはジ（メタ）アクリル化ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料を含み得る。
【0007】
ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、ＲＧＤ、ＫＱＡＧＤＶ、ＹＩＧＳＲ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ、ＶＰＧＩＧ、ＦＨＲＲＩＫＡ、ＫＲＳＲ、ＡＰＧＬ、ＶＲＮ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ、ＧＶＰＧＩ、ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ、およびＩＥＧＲから選択することができる。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、プロテアーゼに感受性の配列であり得る。プロテアーゼは、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１～１０、キモトリプシン高特異性（［ＦＹＷ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、キモトリプシン低特異性（［ＦＹＷＭＬ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌（Staphylococcal）ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビンおよびトリプシンから選択することができる。
【0008】
組成物は、ポリマー材料をさらに含んでもよい。ポリマー材料は親水性であってもよい。ポリマー材料は、アクリルアミド、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、２－ヒドロキシルエチルメタクリレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート（hydroxyehtyle methacrylate））、トリエチレングリコールジメタクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート（dimethacrylte）、Ｎ、Ｎ’－メチレンビアクリルアミド、またはアミン末端官能化４アームポリ（エチレングリコール）の１つまたは複数を含み得る。ポリマー材料は、重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレート、ポリ（ヒドロキシエチル）（メタクリレート）、ポリＮ－ヒドロキシルアクリルアミド３－ヒドロキシプロピルアクリレートまたはヒドロキシブチルアクリレートであってもよい。ポリマー材料は、約４００～約２０，０００の重量平均分子量（weight average molecular weight）（Ｍｗ）を有するポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーであってもよい。ポリマー材料は、約２０００～約４０００のＭｗを有するポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーであってもよい。ポリマー材料は、上述の組成物のいずれかの混合物であってもよい。ポリマー材料は、組成物の約５～約５０ｗｔ．％（例えば、約５ｗｔ．％、約１０ｗｔ．％、約１５ｗｔ．％、約２０ｗｔ．％、約２５ｗｔ．％、約３０ｗｔ．％、約３５ｗｔ．％、約４０ｗｔ．％、約４５ｗｔ．％または約５０ｗｔ．％）の量で存在し得る。一部の実施形態では、ポリマー材料は、組成物の約５～約５０ｗｔ．％（例えば、約５ｗｔ．％、約１０ｗｔ．％、約１５ｗｔ．％、約２０ｗｔ．％、約２５ｗｔ．％、約３０ｗｔ．％、約３５ｗｔ．％、約４０ｗｔ．％、約４５ｗｔ．％または約５０ｗｔ．％）の量で存在する、重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーであり得る。
【0009】
組成物は、初代細胞および／または人工多能性幹細胞の付着、増殖および拡散を支持することができる。組成物は、成形されたかまたは３Ｄ印刷されたヒドロゲル物品であってもよい。組成物は、成形されたかまたは３Ｄヒドロゲル印刷された、光架橋された物品であってもよい。成形されたかまたは３Ｄ印刷されたヒドロゲル物品は、臓器または臓器の一部の三次元物品であってもよい。臓器は、成人のヒトなどの哺乳動物の臓器であってもよい。
【0010】
この開示の実施形態は、三次元物品を作製する方法であって、印刷可能な組成物の層を表面に堆積（deposite）させて堆積層（deposited layer）を得るステップ、堆積層に照射するステップ、ならびに堆積層が三次元物品を形成するまで堆積するステップおよび照射するステップを繰り返すステップを含む、方法に関し得る。印刷可能な組成物は、例えば、（メタ）アクリル化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料、非（メタ）アクリル化（non-(meth)acryalted）ＥＣＭ材料、または（メタ）アクリル化ＥＣＭおよび非（メタ）アクリル化ＥＣＭの混合物、ならびにまた光開始剤を含み得る。ＥＣＭ材料は、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンの１つまたは複数を含み得る。
【0011】
印刷可能な組成物は、ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーも含み得る。印刷可能な組成物は、モノまたはジ（メタ）アクリル化ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料を含み得る。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、ＲＧＤ、ＰＨＳＲＮ（ＧＧＧＥＲＣＧ）ＧＧＲＧＤＳＰＹ、ＧＣＲＥＫＫＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ、ＧＣＲＥＫＫＴＬＱＰＶＹＥＹＭＶＧＶ、ＧＣＲＥＩＳＡＦＬＧＩＰＦＡＥＰＰＭＧＰＲＲＦＬＰＰＥＰＫＫＰ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＧＤＲＣＧ、ＧＦＯＧＥＲ、ＫＱＡＧＤＶ、ＹＩＧＳＲ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ、ＶＰＧＩＧ、ＦＨＲＲＩＫＡ、ＫＲＳＲ、ＡＰＧＬ、ＶＲＮ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ、ＧＶＰＧＩ、ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ、およびＩＥＧＲを含み得る。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、プロテアーゼに感受性の配列を含むことができる。一部の実施形態では、プロテアーゼは、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１～１０、キモトリプシン高特異性（［ＦＹＷ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、キモトリプシン低特異性（［ＦＹＷＭＬ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌（Staphylococcal）ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビンおよびトリプシンから選択することができる。
【0012】
（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料と非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料との比は、約５：１～約１：５（例えば、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４または約１：５）であってもよい。（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料は、約５～約９５パーセント（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％）の（メタ）アクリル化の程度を有し得る。光開始剤は、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）トリメチルベンゾイルベースの光開始剤、ジフェニル（２，４，６－トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド（ＴＰＯナノ粒子）イルガキュアクラスの光開始剤、ルテニウム、およびリボフラビン、またはそれらの混合物を含み得る。
【0013】
この開示の実施形態は、１つまたは複数の添加剤が、ポリマー、光活性染料、天然の細胞外マトリックス、光開始剤、ペプチド、アミノ酸、成長因子、変性細胞外マトリックス、細胞外マトリックス断片またはそれらの混合物を含む、印刷可能な組成物を含み得る。光活性染料は、３００ｎｍ～４２０ｎｍの間の吸光度スペクトルを有するＵＶ染料であってもよい。光活性染料は、３００ｎｍ～４００ｎｍの波長範囲を有し得る。光活性染料は非細胞毒性であり得る。光活性染料は、分子構造中にベンザイン環を含み得る。光活性染料は、キノロンイエロー、ＵＶ染料またはそれらと類似の分子構造を有する染料であってもよい。光活性染料はＵＶ ３８６Ａ染料であってもよい。
【0014】
実施形態には、印刷された足場（scafford）も含む。印刷された足場は、足場が置かれた緩衝液にモノマーを溶出（leaching out）するときに非細胞毒性であり得る。実施形態は、上述の足場を印刷するのに使用される組成物を含み得る。実施形態は、形成された三次元物品を含み得る。三次元物品は、臓器または臓器の一部を複製（replicate）してもよい。
【0015】
実施形態は、プロトン性溶媒を含む印刷可能な組成物も含む。プロトン性溶媒は、水、ポリエチレングリコール、グリコールジアクリレート誘導体またはそれらの混合物を含み得る。
【0016】
この開示の実施形態は、開示される方法により形成される、官能化および非官能化細胞外マトリックス、マトリックス断片、ペプチドおよび生理活性成分（bioactive component）の使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図2】図２Ａは、異なる表面、（ｉ）ガラス（対照）、（ｉｉ）５０％ＤＯＦのコラーゲンを含有するバイオインク、（ｉｉｉ）９０％ＤＯＦを含有するバイオインク、ならびに（ｉｖ）０％ＤＯＦのコラーゲンおよび９０％ＤＯＦのコラーゲン（１：２の比）を含有するバイオインク上で７日間培養した肺線維芽細胞の細胞の拡散、密度、および細胞カバー率（cell coverage）の％の画像を示し、図２Ｂはそのグラフを示す。追加の説明は実施例１に提供する。
【図3】図３Ａは、異なる表面、（ｉ）ガラス（対照）、（ｉｉ）９％のＰＥＧＤＡハイブリッドおよび９％のＰＥＧＤＡ上で１日間培養した肺動脈内皮細胞の細胞の拡散、密度、および細胞カバー率の％の画像を示し、図３Ｂはそのグラフを示す。アスタリスク（＊）はｐ値０．０５未満を示す。追加の説明は実施例２に提供する。
【図4】図４は、７日間の経過にわたる、ＰＥＧＤＡ ＭＷ ３４００、９５％ＤＯＦのコラーゲンおよび０％ＤＯＦのコラーゲン（２：１の比）で構成される３Ｄ印刷されたディスク上の、肺平滑筋細胞培養物の付着、増殖および拡散を示す図である。追加の説明は実施例３に提供する。
【図5-1】図５Ａ～５Ｃは、異なるバイオインクを使用して作製され、および官能化と非官能化コラーゲンとの異なる比を有する、異なる３Ｄ印刷されたオブジェクトへの細胞接着を示す図である。追加の説明は実施例４に提供する。
【図5-2】図５Ａ～５Ｃは、異なるバイオインクを使用して作製され、および官能化と非官能化コラーゲンとの異なる比を有する、異なる３Ｄ印刷されたオブジェクトへの細胞接着を示す図である。追加の説明は実施例４に提供する。
【図6】図６は、７日の期間にわたる、官能化および非官能化コラーゲン支持体を含有するバイオインクで作製された３Ｄ印刷されたオブジェクトへの肺線維芽細胞の細胞の付着および増殖を示す図である。追加の説明は実施例５に提供する。
【図8-1】図８Ａ～８Ｅは、細胞の接着および増殖に対するＣｏｌｌＭＡ ＤＯＦの効果を示す図である（＞９０％、約５０％（～５０％）、ハイブリッド（５０％の非ＭＡ、５０％のＨＭ））。追加の説明は実施例７に提供する。
【図11-1】図１１Ａ～１１Ｄは、異なる３Ｄ印刷されたディスク上に「挿入された」細胞の細胞カバー率、細胞拡散および細胞密度の特徴を示す図である。（図１１Ａ）プラットフォーム上の３Ｄ印刷されたディスクの画像、（図１１Ｂ）ＡＣ４２ １ｍｍディスク、ＡＣ４２ ３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散および細胞密度の１日目の分析、（図１１Ｃ）ＡＣ４２ １ｍｍディスク、ＡＣ４２ ３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散および細胞密度の４日目の分析、（図１１Ｄ）ＡＣ４２ １ｍｍディスク、ＡＣ４２ ３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散および細胞密度の７日目の分析。
【図11-2】図１１Ａ～１１Ｄは、異なる３Ｄ印刷されたディスク上に「挿入された」細胞の細胞カバー率、細胞拡散および細胞密度の特徴を示す図である。（図１１Ａ）プラットフォーム上の３Ｄ印刷されたディスクの画像、（図１１Ｂ）ＡＣ４２ １ｍｍディスク、ＡＣ４２ ３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散および細胞密度の１日目の分析、（図１１Ｃ）ＡＣ４２ １ｍｍディスク、ＡＣ４２ ３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散および細胞密度の４日目の分析、（図１１Ｄ）ＡＣ４２ １ｍｍディスク、ＡＣ４２ ３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散および細胞密度の７日目の分析。
【図12-1】図１２Ａ～１２Ｂは、異なる３Ｄ印刷されたディスク上の細胞の細胞カバー率、細胞拡散および細胞密度の特徴を示す図である。（Ａ）ＬＦＮ、ＰＡＥＣまたはＳＡＥＣ種（シード（seed））を播種したＡＣ４２ １ｍｍディスク、３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散の比較および細胞密度の比較。（Ｂ）ＬＦＮ、ＰＡＥＣまたはＳＡＥＣ種を播種したＡＣ４２ １ｍｍディスクおよび３ｍｍディスクの領域カバー率のパーセント、細胞拡散の比較および細胞密度の比較。
【発明を実施するための形態】
【0018】
詳細な説明
本明細書で使用される場合、「３Ｄ印刷（３Ｄプリンティング（3D printing））」は、三次元オブジェクトを、そのオブジェクトのデジタルモデルを使用して作製するのに使用される任意の技術を指す。代表的な３Ｄ印刷技術には、選択的レーザー焼結（ＳＬＳ）法、熱溶解積層（ＦＤＭ）法、３Ｄインクジェット印刷法、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）法および光造形法が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「３Ｄ印刷（３Ｄプリンティング（3D printing））」は、三次元オブジェクトを、そのオブジェクトのデジタルモデルを使用して作製するのに使用される任意の技術を指す。代表的な３Ｄ印刷技術には、選択的レーザー焼結（ＳＬＳ）法、熱溶解積層（ＦＤＭ）法、３Ｄインクジェット印刷法、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）法および光造形法が挙げられる。
【0019】
本明細書で使用される場合、「印刷可能なインク」および「印刷可能な組成物」は、３Ｄ印刷技術を使用してオブジェクトを形成するのに使用することができる任意の組成物を指す。「バイオインク」は、１つまたは複数の所望の生体適合性特性を有する材料を形成する、印刷可能なインクである。例えば、バイオインクは所望の細胞のタイプの接着および増殖を促進する１つまたは複数の材料を含有し得る。印刷されたオブジェクトは、初代細胞および人工多能性幹細胞の付着、増殖および拡散を支持することができる。一部の場合では、バイオインクはヒドロゲルへと形成することができる。バイオインク中の化合物は、化学合成手段等により、化学的官能性を組み込まれるように選択または修飾され得る。化学的官能性は、バイオインク中の成分としての修飾された材料の組み込みを可能とし得る。修飾は、所望の構成成分の化学的共役を可能とし得る。所望の構成成分は、その細胞相互作用特性を維持し得る。そのような組み込みは、細胞接着を妨げることなく、印刷されたオブジェクトの機械的特性の調整を可能とし得る。
【0020】
本明細書で使用される場合、「細胞外マトリックス」および「ＥＣＭ」は、天然および合成のＥＣＭ、ならびにＥＣＭを構成する１つまたは複数の材料を指す。例えば、ＥＣＭは、天然に存在するＥＣＭまたは合成技術を使用して作製されたＥＣＭを指すことができる。ＥＣＭは、天然に存在するＥＣＭ、例えば、コラーゲン（天然または合成）を構成する１つまたは複数の材料も指すことができる。一部の場合では、「ＥＣＭ材料」は、特定の材料を指すのに使用される。ＥＣＭは、３Ｄ印刷を含む様々な技術を使用して作製することができる。ＥＣＭは、ヒドロゲル材料を使用して作製することができる。
【0021】
本明細書で使用される場合、「細胞外マトリックス」および「ＥＣＭ」は、天然および合成のＥＣＭ、ならびにＥＣＭを構成する１つまたは複数の材料を指す。例えば、ＥＣＭは、天然に存在するＥＣＭまたは合成技術を使用して作製されたＥＣＭを指すことができる。ＥＣＭは、天然に存在するＥＣＭ、例えば、天然または合成のいずれかのコラーゲンを構成する１つまたは複数の材料も指すことができる。一部の場合では、「ＥＣＭ材料」は、特定の材料を指すのに使用される。ＥＣＭは、３Ｄ印刷を含む様々な技術を使用して作製することができる。ＥＣＭは、ヒドロゲル材料を使用して作製することができる。Ｉ型コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンなどのＥＣＭマトリックス材料は、メタクリレート基で官能化されて光架橋性ヒドロゲル中への組み込みが可能となり得る。ＥＣＭ材料の、３Ｄ印刷された材料などの他の材料およびオブジェクトへの組み込みは、生体適合性を増大し、材料およびオブジェクト内の細胞の付着および相互作用を可能とし得る。材料が細胞付着を可能とする程度は、ＥＣＭ材料の量、材料上または材料内の結合部位の利用可能性、材料の表面荷電、材料の極性、ならびに材料の機械的特性に応じて変動し得る。
【0022】
本出願は、以下の文書の各々を、それらの全体を参照により組み込む。（ａ）米国仮出願第６３／１８５，３００号明細書、２０２１年５月６日出願、題名「ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ ＴＨＥ ＳＩＺＥ ＯＦ ３Ｄ ＰＲＩＮＴＩＮＧ ＨＹＤＲＯＧＥＬ ＯＢＪＥＣＴＳ ＵＳＩＮＧ ＨＤＲＯＰＨＩＬＩＣ ＭＯＮＯＭＥＲＳ， ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ ＭＯＮＯＭＥＲＳ， ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＥＲＳ」、ならびに同じ題名で２０２２年５月６日に出願された米国非仮出願および／またはＰＣＴ出願、（ｂ）米国仮出願第６３／１８５，３０２号明細書、２０２１年５月６日出願、題名「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ３Ｄ－ＰＲＩＮＴＥＤ ＯＢＪＥＣＴＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ」、ならびに同じ題名で２０２２年５月６日に出願された米国非仮出願および／またはＰＣＴ出願、（ｃ）米国仮出願第６３／１８５，３０５号明細書、２０２１年５月６日出願、題名「ＰＨＯＴＯＣＵＲＡＢＬＥ ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＭＥＮＴ ＯＦ ３Ｄ ＰＲＩＮＴＥＤ ＨＹＤＲＯＧＥＬ ＯＢＪＥＣＴＳ」、ならびに同じ題名で２０２２年５月６日に出願された米国非仮出願および／またはＰＣＴ出願、（ｄ）米国仮出願第６３／１８５，２９９号明細書、２０２１年５月６日出願、題名「ＡＤＤＩＴＩＶＥ ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ ＯＦ ＨＹＤＲＯＧＥＬ ＴＵＢＥＳ ＦＯＲ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、ならびに同じ題名で２０２２年５月６日に出願された米国非仮出願および／またはＰＣＴ出願、（ｅ）米国仮出願第６３／１８５，２９８号明細書、２０２１年５月６日出願、題名「ＭＩＣＲＯＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ３－Ｄ ＰＲＩＮＴＩＮＧ ＡＮＤ ＩＴＳ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、ならびに同じ題名で２０２２年５月６日に出願された米国非仮出願および／またはＰＣＴ出願。
【0023】
ＥＣＭは、アミン基上のリジン残基を、例えば、メタクリレート無水物（ＭＡＡ）と置換することにより、メタクリレート基で官能化され得る。ＥＣＭの（メタ）アクリル化の程度は、ＡＡまたはＭＡＡで修飾された利用可能なアミン基のパーセンテージにより定義することができる。（メタ）アクリル化の程度がより高いと、相関してＡＡまたはＭＡＡで修飾されたアミン基がより多くなり、結果として遊離アミン基は少なくなる。
【0024】
官能化の程度は、官能化の特定の程度またはタイプを達成するために変動させてもよい。官能化および非官能化成分のハイブリッド形態を使用してもよい。一部の実施形態では、コラーゲンは、修飾されて（メタ）アクリル化コラーゲンを形成し得る。ハイブリッドの組合せを使用してもよく、この場合、メタクリル化および非メタクリル化コラーゲンの両方を含有するヒドロゲルを指すことができる。（メタ）アクリル化および非（メタ）アクリル化コラーゲンを含有するポリ（エチレングリコール）ジアクリレートで作製された３Ｄ印刷されたオブジェクトは、例えば、線維芽細胞、内皮細胞、および平滑筋を含む肺由来細胞の、付着、拡散および／または増殖を支持し得る。
【0025】
コラーゲンの代わりに、またはコラーゲンに加えて、様々な生体材料が使用され得る。これらの生体材料は、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ＩＩＩ型コラーゲン、短いペプチド（例えばＲＧＤ）、ＥＣＭタンパク質の断片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（glycosamoinoglycans）、ヒアルロン酸または任意の種（species）からの任意の他のＥＣＭを含み得る。これらのＥＣＭについての利用可能な結合部位は、異なる化学基による官能化または修飾を介して変化させることができる。これらの化学基は、アミン基または細胞が親和力を有する他の基に結合し得る。
【0026】
ＥＣＭ組成物は、鋳造、押出または３Ｄ印刷用途における使用、例えば組成物を形成するためのバイオインクの使用のために、製剤化（処方（formulate））され得る。一部の実施形態では、これらの組成物は、ヒドロゲルを含む３Ｄ印刷された材料への細胞の接着、増殖、拡散および遊走を増大する。これらの３Ｄ印刷された材料は、生物学、生物医学、医療機器および／またはヘルスケア用途のために使用され得る。これらの印刷された材料は、診断機器のために使用され得る。これらの印刷されたヒドロゲルは、生体成分の表面への結合部位の緊密な制御を要する表面を必要とする用途に有用であり得る。
【0027】
この開示のある特定の実施形態は、架橋された（メタ）アクリル化および非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料を含む組成物に関する。組成物は、約５：１～約１：５（例えば、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４または約１：５）の、（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料と非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料との比を有し得る。（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料は、約５～約９５パーセント（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％）の（メタ）アクリル化の程度を有し得る。ＥＣＭ材料は、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンから選択することができる。ＥＣＭ材料はＩ型コラーゲンであってもよい。（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料は、モノまたはジ（メタ）アクリル化ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料を含み得る。
【0028】
ＥＣＭは、１つまたは複数のペプチドを含むことができる。適切なペプチドの非限定的な例には、ＲＧＤ、ＰＨＳＲＮ（ＧＧＧＥＲＣＧ）ＧＧＲＧＤＳＰＹ、ＧＣＲＥＫＫＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ、ＧＣＲＥＫＫＴＬＱＰＶＹＥＹＭＶＧＶ、ＧＣＲＥＩＳＡＦＬＧＩＰＦＡＥＰＰＭＧＰＲＲＦＬＰＰＥＰＫＫＰ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＧＤＲＣＧ、ＧＦＯＧＥＲ、ＫＱＡＧＤＶ、ＹＩＧＳＲ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ、ＶＰＧＩＧ、ＦＨＲＲＩＫＡ、ＫＲＳＲ、ＡＰＧＬ、ＶＲＮ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ、ＧＶＰＧＩ、ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ、およびＩＥＧＲが挙げられる。適切なペプチドには、インテグリン結合、シンデカン結合、ＥＣＭ沈着および／またはＭＭＰ依存性リモデリングを含む、ネイティブなＥＣＭの特性を模倣するペプチド材料も挙げられる。ペプチドは、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ（例えば、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭまたは約５ｍＭ）の量で印刷可能な組成物中に存在し得る。一部の場合では、ＥＣＭ材料は、約０．５ｍＭのペプチド～約１０ｍＭのペプチドを含有することができる。他の場合では、ＥＣＭ材料は、約５ｍＭのペプチド～約２０ｍＭのペプチドを含有することができる。他の場合では、ＥＣＭ材料は、約１０ｍＭのペプチド～約１００ｍＭのペプチドを含有することができる。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、プロテアーゼに感受性のアミノ酸配列であり得る。プロテアーゼは、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１～１０、キモトリプシン高特異性（［ＦＹＷ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、キモトリプシン低特異性（［ＦＹＷＭＬ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌（Staphylococcal）ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビンおよびトリプシンから選択することができる。
【0029】
組成物は、ポリマー材料をさらに含んでもよい。ポリマー材料は親水性であってもよい。ポリマー材料には、アクリルアミド、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、２－ヒドロキシルエチルメタクリレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、トリエチレングリコールジメタクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、Ｎ、Ｎ’－メチレンビアクリルアミド、またはアミン末端官能化４アームポリ（エチレングリコール）であり得る。ポリマー材料は、重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレート、ポリ（ヒドロキシエチル）（メタクリレート）、ポリＮ－ヒドロキシルアクリルアミド３－ヒドロキシプロピルアクリレートまたはヒドロキシブチルアクリレートであってもよい。ポリマー材料は、約４００～約２０，０００の重量平均分子量（Ｍｗ）を有するポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーであってもよい。ポリマー材料は、約２０００～約４０００のＭｗを有するポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーであってもよい。ポリマー材料は、上述の組成物のいずれかの混合物であってもよい。ポリマー材料は、組成物の約５～５０ｗｔ．％（例えば、約５ｗｔ．％、約１０ｗｔ．％、約１５ｗｔ．％、約２０ｗｔ．％、約２５ｗｔ．％、約３０ｗｔ．％、約３５ｗｔ．％、約４０ｗｔ．％、約４５ｗｔ．％または約５０ｗｔ．％）の量で存在し得る。一部の実施形態では、ポリマー材料は、組成物の約５～約５０ｗｔ．％（例えば、約５ｗｔ．％、約１０ｗｔ．％、約１５ｗｔ．％、約２０ｗｔ．％、約２５ｗｔ．％、約３０ｗｔ．％、約３５ｗｔ．％、約４０ｗｔ．％、約４５ｗｔ．％または約５０ｗｔ．％）の量で存在する、重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーであり得る。
【0030】
印刷可能な組成物
この開示の実施形態は、三次元物品を作製する方法であって、印刷可能な組成物の層を表面に堆積させて堆積層を得るステップ、堆積層に照射するステップ、ならびに堆積層が三次元物品を形成するまで堆積するステップおよび照射するステップを繰り返すステップを含む、方法に関し得る。印刷可能な組成物は、（メタ）アクリル化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料、非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料、および光開始剤を含むことができる。ＥＣＭ材料は、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンを含むことができる。
この開示の実施形態は、三次元物品を作製する方法であって、印刷可能な組成物の層を表面に堆積させて堆積層を得るステップ、堆積層に照射するステップ、ならびに堆積層が三次元物品を形成するまで堆積するステップおよび照射するステップを繰り返すステップを含む、方法に関し得る。印刷可能な組成物は、（メタ）アクリル化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料、非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料、および光開始剤を含むことができる。ＥＣＭ材料は、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンおよびフィブロネクチンを含むことができる。
【0031】
印刷可能な組成物は、ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーを含むことができる。印刷可能な組成物は、モノまたはジ（メタ）アクリル化ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料を含み得る。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、ＲＧＤ、ＰＨＳＲＮ（ＧＧＧＥＲＣＧ）ＧＧＲＧＤＳＰＹ、ＧＣＲＥＫＫＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ、ＧＣＲＥＫＫＴＬＱＰＶＹＥＹＭＶＧＶ、ＧＣＲＥＩＳＡＦＬＧＩＰＦＡＥＰＰＭＧＰＲＲＦＬＰＰＥＰＫＫＰ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＧＤＲＣＧ、ＧＦＯＧＥＲ ＫＱＡＧＤＶ、ＹＩＧＳＲ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ、ＶＰＧＩＧ、ＦＨＲＲＩＫＡ、ＫＲＳＲ、ＡＰＧＬ、ＶＲＮ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ、ＧＶＰＧＩ、ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ、およびＩＥＧＲの１つまたは複数を含み得る。適切なペプチドには、インテグリン結合、シンデカン結合、ＥＣＭ沈着および／またはＭＭＰ依存性リモデリングを含む、ネイティブなＥＣＭの特性を模倣するペプチド材料も挙げられる。ペプチドは、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ（例えば、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭまたは約５ｍＭ）の量で印刷可能な組成物中に存在し得る。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、プロテアーゼに感受性の配列を含むことができる。プロテアーゼは、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１～１０、キモトリプシン高特異性（［ＦＹＷ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、キモトリプシン低特異性（［ＦＹＷＭＬ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌（Staphylococcal）ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビンおよびトリプシンから選択することができる。
【0032】
（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料と非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料との比は、約５：１～約１：５（例えば、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４または約１：５）であってもよい。（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料は、約５～約９５パーセント（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％）の（メタ）アクリル化の程度を有し得る。光開始剤は、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）トリメチルベンゾイルベースの光開始剤、ジフェニル（２，４，６－トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド（ＴＰＯナノ粒子）イルガキュアクラスの光開始剤、ルテニウム、およびリボフラビン、またはそれらの混合物を含み得る。
【0033】
この開示の実施形態は、１つまたは複数の添加剤が、ポリマー、光活性染料、天然の細胞外マトリックス、光開始剤、ペプチド、アミノ酸、成長因子、変性細胞外マトリックス、細胞外マトリックス断片またはそれらの混合物を含む、印刷可能な組成物を含み得る。光活性染料は、３００ｎｍ～４２０ｎｍの間の吸光度スペクトルを有するＵＶ染料であってもよい。光活性染料は、３００ｎｍ～４００ｎｍの波長範囲を有し得る。光活性染料は非細胞毒性であり得る。光活性染料は、分子構造中にベンザイン環を含み得る。光活性染料は、キノロンイエロー、ＵＶ染料またはそれらと類似の分子構造を有する染料であってもよい。光活性染料はＵＶ ３８６Ａ染料であってもよい。
【0034】
本明細書において記載されている印刷可能な組成物は、３Ｄ印刷を使用して足場を作製するのに使用することができる。印刷された足場は、例えば、適切な緩衝液中に置かれたときに非細胞毒性となる適切に製剤化されたバイオインクを使用して、製剤化され得る。足場を形成するために選択されたバイオインクは、結果として生じる足場の所望の生体適合性に応じて選択することができる。例えば、足場は、肺由来細胞などの選択された細胞タイプの接着、成長および増殖を支持し得る。
【0035】
印刷可能な組成物は、プロトン性溶媒を含むことができる。プロトン性溶媒は、水、ポリエチレングリコール、グリコールジアクリレート誘導体またはそれらの混合物を含むことができる。一部の場合では、印刷可能な組成物は、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）またはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の緩衝液を含有することができる。ポリエチレングリコールジアクリレートは、１ｗｔ．％前後～２０ｗｔ．％前後に変動し得る。ポリエチレングリコールジアクリレートの非限定的な例には、ポリエチレン（olyehylene）ジアクリレート３４００（ＰＥＧＤＡ３４００）、ポリエチレンジアクリレート６０００（ＰＥＧＤＡ６０００）、ポリエチレンジアクリレート５７５（ＰＥＧＤＡ５７５）およびそれらの混合物が挙げられる。印刷可能な組成物は、約１ｗｔ．％～約２０ｗｔ．％のＨＰＡまたはＨＢＡを含有することができる。印刷可能な材料は、約０．５ｗｔ．％～約３ｗｔ．％のＮ－ヒドロキシエチルアクリルアミド（ＨＥＡＡ）も含有することができる。印刷可能な材料は、約０．５ｗｔ．％～約１０ｗｔ．％の（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料および／または非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料を含有することもできる。さらに、印刷可能な材料は、約０．５ｗｔ．％～約３ｗｔ．％のＰＥＧ－アクリレートＣＧＲＧＤＳ、例えば、ＰＥＧ３４００アクリレートＣＧＲＧＤＳを含有することもできる。印刷可能な材料は、約０．５％～約５％の光開始剤および約０．１％～約５％の光吸収剤染料を含有することができる。
【0036】
組成物は、初代細胞および／または人工多能性幹細胞の付着、増殖および拡散を支持することができる。組成物は、成形されたかまたは３Ｄ印刷されたヒドロゲル物品であってもよい。組成物は、成形されたかまたは３Ｄヒドロゲル印刷された、光架橋された物品であってもよい。成形されたかまたは３Ｄ印刷されたヒドロゲル物品は、臓器の三次元物品であってもよい。臓器は、哺乳動物の臓器であってもよい。
【0037】
本明細書において記載されている印刷可能な組成物は、臓器または臓器の一部を模倣または複製する三次元オブジェクトへと形成することができる。例えば、本明細書において記載されている印刷可能な組成物は、例えば、３Ｄ印刷技術を使用して、肺の構成（アーキテクチャ（architecture））を模倣または複製する構造へと形成することができる。印刷可能な組成物は、細胞の接着および成長のための足場を形成するのに使用することができ、結果として、肺のガス交換機能を行うことができる構造などの、臓器の１つまたは複数の所望の特性を有する構造が生じる。これらのオブジェクトは、ヒドロゲルを含むことができる。臓器または臓器の一部は、好ましい一実施形態では、ヒト肺であることができる。３Ｄオブジェクトの形状は特に限定されず、管の形状であってもよく、または臓器もしくは臓器の断片と実質的に同じ形状、サイズであってもよく、および／または同じ相対寸法を有する。
【0038】
一部の実施形態では、印刷可能な組成物から形成されたオブジェクトは、臓器もしくは臓器の断片と実質的に同じ形状、サイズであり、および／または同じ相対寸法を有する。ある特定の実施形態では、臓器または臓器の断片は、血管、気管、気管支、食道、尿管、腎尿細管、胆管、腎管、胆管、肝管、神経導管（nerve conduit）、ＣＳＦシャント、肺、腎臓、心臓、肝臓、脾臓、脳、胆嚢、胃、膵臓、膀胱、リンパ管、骨格骨、軟骨、皮膚、腸、筋肉、喉頭、または咽頭を含む。追加の実施形態では、血管の形状は、肺動脈、腎動脈、冠動脈、末梢動脈、肺静脈または腎静脈を含む。ある特定の実施形態において、構造は血液透析用グラフトを含む。他の実施形態は、構造が実質的に肺葉、肺、肺の気道樹（気道ツリー（airway tree））、肺血管系またはそれらの組合せの形状である場合を含む。一部の実施形態では、強化は、外圧が構造に加わるときに、構造を通る空気流または血液（もしくは流体）流を維持することを含む。
【0039】
この開示の実施形態は、開示される方法により形成される、官能化および非官能化細胞外マトリックス、マトリックス断片、ペプチドおよび生理活性成分の使用に関する。
【0040】
３Ｄ組成物
この開示の実施形態は、三次元物品を作製する方法であって、印刷可能な組成物の層を表面に堆積させて堆積層を得るステップ、堆積層に照射するステップ、ならびに堆積層が三次元物品を形成するまで堆積するステップおよび照射するステップを繰り返すステップを含む、方法に関し得る。印刷可能な組成物は、ヒドロゲル材料、修飾または未修飾の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料および光開始剤を含み得る。
この開示の実施形態は、三次元物品を作製する方法であって、印刷可能な組成物の層を表面に堆積させて堆積層を得るステップ、堆積層に照射するステップ、ならびに堆積層が三次元物品を形成するまで堆積するステップおよび照射するステップを繰り返すステップを含む、方法に関し得る。印刷可能な組成物は、ヒドロゲル材料、修飾または未修飾の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料および光開始剤を含み得る。
【0041】
三次元（３Ｄ）ヒドロゲル構造は特に限定されず、例えば１つまたは複数の異なる重合化モノマーで作製された複合構造であることができる。本発明において使用され得るヒドロゲル材料は当業者に公知であり得、それを作製する方法も同様である。例えば、Calo et al., European Polymer Journal Volume 65, April 2015, Pages 252-267に記載されているヒドロゲルが使用され得る。一部の実施形態では、ヒドロゲル構造は、重合化（メタ）アクリレートおよび／または（メタ）アクリルアミドヒドロゲルを含む。一部の実施形態では、構造は、重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレート、重合化ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリルアミド、重合化ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート／（メタクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（ε－カプロラクトン）、ポリカプロラクトン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸の塩、ポリメタクリル酸の塩、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、例えば、ポリ（メタクリル酸）無水物、ポリ（アクリル酸）無水物、ポリセバシン酸無水物、コラーゲン、ポリ（ヒアルロン酸）、ヒアルロン酸含有ポリマーおよびコポリマー、ポリペプチド、デキストラン、デキストラン硫酸、キトサン、キチン、アガロースゲル、フィブリンゲル、ダイズ由来のヒドロゲル、アルギネート系ヒドロゲル、ポリ（アルギン酸ナトリウム）、ヒドロキシプロピルアクリレート（ＨＰＡ）、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）ならびにそれらの組合せを含むポリマーを含む。一部の実施形態では、ヒドロゲルポリマーのＭｗは、約４００Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ、１０００Ｄａ、１１００Ｄａ、１２００Ｄａ、１３００Ｄａ、１４００Ｄａ、１５００Ｄａ、１６００Ｄａ、１７００Ｄａ、１８００Ｄａ、１９００Ｄａ、２０００Ｄａ、２１００Ｄａ、２２００Ｄａ、２３００Ｄａ、２４００Ｄａ、２５００Ｄａ、２６００Ｄａ、２７００Ｄａ、２８００Ｄａ、２９００Ｄａ、３０００Ｄａ、３１００Ｄａ、３２００Ｄａ、３３００Ｄａ、３４００Ｄａ、３５００Ｄａ、３６００Ｄａ、３７００Ｄａ、３８００Ｄａ、３９００Ｄａ、４０００Ｄａ、４１００Ｄａ、４２００Ｄａ、４３００Ｄａ、４４００Ｄａ、４５００Ｄａ、４６００Ｄａ、４７００Ｄａ、４８００Ｄａ、４９００Ｄａ、５０００Ｄａ、５１００Ｄａ、５２００Ｄａ、５３００Ｄａ、５４００Ｄａ、５５００Ｄａ、５６００Ｄａ、５７００Ｄａ、５８００Ｄａ、５９００Ｄａ、６０００Ｄａ、６１００Ｄａ、６２００Ｄａ、６３００Ｄａ、６４００Ｄａ、６５００Ｄａ、７０００Ｄａ、７５００Ｄａ、８０００Ｄａ、８５００Ｄａ、９０００Ｄａ、９５００Ｄａ、１００００Ｄａ、１５０００Ｄａ、または２００００Ｄａである。一部の実施形態では、ヒドロゲルポリマーはＮＡＰを主成分として含み、かつ、本明細書において記載されている、すなわち、ＰＥＧＤＡで官能化された１つまたは複数のペプチドおよび／またはコラーゲンをさらに含む。
【0042】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは架橋ポリマーを含む。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリマー中の架橋可能な部分のパーセンテージに対して、約０％～約１０％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％または約９０％～約１００％架橋されている。架橋部分は、例えば、（メタ）アクリレート基を含み得る。
【0043】
この開示の実施形態は、開示される方法により形成される、官能化および非官能化細胞外マトリックス、マトリックス断片、ペプチドおよび生理活性成分の使用に関する。一部の場合では、これらの細胞外マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、および／またはフィブロネクチンを含む材料から形成され得る。一部の場合では、この化合物、例えばコラーゲンは、メタクリレート無水物と反応して、図１に示すようなメタクリル化コラーゲンなどのメタクリル化化合物を形成し得る。
【0044】
本明細書において開示されているように、ヒドロゲル中のコラーゲン官能化の程度（degree of functionalized）（ＤＯＦ）は、例えば（メタ）アクリル化コラーゲンと非（メタ）アクリル化コラーゲンとの比において変動し得る。一部の場合では、コラーゲンはハイブリッドであるか、または官能化および非官能化成分の両方を含有し得る。例えば、ハイブリッドは、（メタ）アクリル化および非（メタ）アクリル化コラーゲンの両方を含有するヒドロゲルを指し得る。（メタ）アクリル化および非（メタ）アクリル化コラーゲンを含有するポリ（エチレングリコール）ジアクリレートで作製された３Ｄ印刷されたオブジェクトは、肺由来の線維芽細胞、内皮細胞および平滑筋の、付着、拡散および／または増殖を支持し得る。
【0045】
本明細書において開示されているように、コラーゲンの代わりに、代替の生体材料が使用され得る。これらの生体材料は、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ＩＩＩ型コラーゲン、短いペプチド（例えばＲＧＤ）、ＥＣＭタンパク質の断片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（glycosamoinoglycans）、ヒアルロン酸または任意の種からの任意の他の細胞外マトリックスを含み得る。
【0046】
印刷可能な組成物は、細胞の付着および／または機械的特性を強化するために修飾され得る。これらの印刷可能な組成物またはインクは、アクリレート反応性と直交する固有の機械的特性または反応性（unique mechanical properties or reactivity orthogonal to acrylate reactivity）を有し得る。インクまたは印刷可能な組成物の成分は、ポリ（エチレングリコール）ジ（メタ）アクリレートモノマーを含み得る。印刷可能な組成物は、モノまたはジ（メタ）アクリル化ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料を含み得る。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、ＲＧＤ、ＰＨＳＲＮ（ＧＧＧＥＲＣＧ）ＧＧＲＧＤＳＰＹ、ＧＣＲＥＫＫＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ、ＧＣＲＥＫＫＴＬＱＰＶＹＥＹＭＶＧＶ、ＧＣＲＥＩＳＡＦＬＧＩＰＦＡＥＰＰＭＧＰＲＲＦＬＰＰＥＰＫＫＰ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＧＤＲＣＧ、ＧＦＯＧＥＲ、ＫＱＡＧＤＶ、ＹＩＧＳＲ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ、ＶＰＧＩＧ、ＦＨＲＲＩＫＡ、ＫＲＳＲ、ＡＰＧＬ、ＶＲＮ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ、ＧＶＰＧＩ、ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ、およびＩＥＧＲの１つまたは複数を含み得る。適切なペプチドには、インテグリン結合、シンデカン結合、ＥＣＭ沈着および／またはＭＭＰ依存性リモデリングを含む、ネイティブなＥＣＭの特性を模倣するペプチド材料も挙げられる。ペプチドは、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ（例えば、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭまたは約５ｍＭ）の量で印刷可能な組成物中に存在し得る。あるいは、または加えて、３Ｄ印刷されたオブジェクトは、１つまたは複数のペプチドでさらに表面を修飾され得る。表面の修飾は、未反応の部分を１つまたは複数のペプチドを含む溶液に接触させることにより、３Ｄ印刷されたオブジェクト中の未反応の（メタ）アクリレート部分を１つまたは複数のペプチドと反応させることによって、達成され得る。この開示は、ペプチドについて上で説明したのと同様な、本明細書において開示されている他のＥＣＭまたはＥＣＭ様材料を用いた表面修飾を含むことを理解されたい。ＥＣＭまたはＥＣＭ様材料は、プロテアーゼに感受性の配列を含むことができる。プロテアーゼは、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１～１０、キモトリプシン高特異性（［ＦＹＷ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、キモトリプシン低特異性（［ＦＹＷＭＬ］へのＣ末端、Ｐの前ではない）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌（Staphylococcal）ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビンおよびトリプシンから選択することができる。
【0047】
細胞外マトリックスについての利用可能な結合部位は、異なる化学基による官能化または修飾を介して変化させることができる。これらの化学基は、アミン基または細胞が親和力を有する他の基に結合し得る。以下は、ＥＣＭまたはＥＣＭ／ＥＣＭ様の印刷可能な組成物またはインクを作製するのに使用することができる生理活性成分Ｒ１を有する、モノおよびジ（メタ）アクリレートの例である。
【0048】
【化1】
ＲＧＤ フィブロネクチン、ビトロネクチン細胞接着
ＰＨＳＲＮＫＲＧＤ フィブロネクチン細胞接着
ＧＣＲＥＫＫＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ ラミニン細胞接着
ＧＣＲＥＫＫＴＬＱＰＶＹＥＹＭＶＧＶ フィブロネクチンに親和力を有するペプチド
ＧＣＲＥＩＳＡＦＬＧＩＰＦＡＥＰＰＭＧＰＲＲＦＬＰＰＥＰＫＫＰ Ｃｏｌ ＩＶに親和力を有するペプチド、および
ＬＭＮＧＣＲＤＧＰＱＧＷＧＱＤＲＣＧ 細胞分解性ペプチド
ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＧＤＲＣＧ 細胞分解性ペプチド
ＫＱＡＧＤＶ 平滑筋細胞接着
ＹＩＧＳＲ ラミニンＢ１細胞接着
ＲＥＤＶ フィブロネクチン内皮細胞接着
ＩＫＶＡＶ ラミニン神経突起伸張
ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ ラミニンＢ２神経突起伸張
ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥ 神経細胞接着分子の星状細胞の接着
ＶＰＧＩＧ エラスチンは人工ＥＣＭの弾性率を強化する
ＦＨＲＲＩＫＡ ヘパリン結合ドメインは造骨細胞の石灰化を改善する
ＫＲＳＲ ヘパリン結合ドメインの造骨細胞の接着
ＡＰＧＬ コラゲナーゼ媒介性分解
ＶＲＮ プラスミン媒介性分解
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ エラスターゼ媒介性分解
ＧＧＬＧＰＡＧＧＫ プロテアーゼ感受性ペプチド
ＧＶＰＧＩ 機械的安定性に関連するエラスチン
ＬＰＥＴＧ（Ｇ）ｎ ソルターゼ媒介性ライゲーション
ＩＥＧＲ プロテアーゼ感受性
ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分のプロテアーゼ消化物
単糖類、オリゴ糖類、多糖類（ヒアルロン酸、ヘパラン、アグリカン、コンドロイチン、シアル酸）
酸化還元（レドックス）反応性
スルフヒドリル（－ＳＨ）
ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）
Ｒ１は以下のプロテアーゼに感受性の以下の配列のいずれかであることもでき、［Ｐ４…Ｐ２’］はプロテアーゼ切断部位配列の指定について一般的に受け入れられている命名法である。
【0049】
【表1-1】
【0050】
【表1-2】
【0051】
修飾ＥＣＭ材料と未修飾ＥＣＭ材料との比は、用途に基づき最適化され得る。例えば、修飾ＥＣＭ材料と未修飾ＥＣＭ材料との比は、材料特性および所望の細胞付着などのパラメーターに基づき最適化され得る。一部の実施形態では、修飾ＥＣＭ材料と未修飾ＥＣＭ材料との比は、約５：１～約１：５（例えば、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４または約１：５）であってもよい。修飾ＥＣＭ材料は、約５～約９５パーセント（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％）の修飾の程度を有し得る。一部の場合では、修飾はＥＣＭの（メタ）アクリル化であってもよい。これらの実施形態では、（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料と非（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料との比は、約５：１～約１：５（例えば、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４または約１：５）であってもよい。（メタ）アクリル化ＥＣＭ材料は、約５～約９５パーセント（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％）の（メタ）アクリル化の程度を有し得る。
【0052】
組成物は光開始剤を含んでもよい。光開始剤は特に限定されない。光開始剤は光活性染料であってもよい。光活性染料は、１００～４２０ｎｍの間の吸光度スペクトルを有するＵＶ染料であってもよい。ＵＶ染料は、３００ｎｍ～４２０ｎｍの間の吸光度スペクトルを有し得る。光活性染料は、３００ｎｍ～４００ｎｍの波長範囲を有し得る。光活性染料は非細胞毒性であり得る。光活性染料は、分子構造中にベンザイン環を含み得る。光活性染料は、キノロンイエロー、ＵＶ染料またはそれらと類似の分子構造を有する染料であってもよい。光活性染料はＵＶ ３８６Ａ染料であってもよい。
【0053】
光開始剤は、例えば、ベンゾフェノン、フェニルビス（２，４，６－トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド（ＢＡＰＯ）、２－ヒドロキシ－２－メチル－ｌ－フェニル－プロパン－１－オン、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ（hydroxethoxy））－２－メチルプロピオフェノン、２，２’－アゾビス［２－メチル－ｎ－（２－ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン、フェニル（２，４，６－トリメチルベンゾイル）ホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、およびエチル（２，４，６－トリメチルベンゾイル）フェニルホスフィン酸、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、トリメチルベンゾイルベースの光開始剤、ジフェニル（２，４，６－トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド（ＴＰＯナノ粒子）イルガキュアクラスの光開始剤、ルテニウム、およびリボフラビン、またはそれらの混合物を含み得る。
【0054】
方法
ある特定の実施形態では、ヒドロゲル足場、オブジェクト、および／または作製方法が開示される。オブジェクトは３Ｄ印刷によって形成され得る。上に列挙される組成物および材料は、３Ｄ印刷されたオブジェクトを形成するために３Ｄプリンタ中のインクとして使用され得る。
ある特定の実施形態では、ヒドロゲル足場、オブジェクト、および／または作製方法が開示される。オブジェクトは３Ｄ印刷によって形成され得る。上に列挙される組成物および材料は、３Ｄ印刷されたオブジェクトを形成するために３Ｄプリンタ中のインクとして使用され得る。
【0055】
当業者は当該技術分野において公知の印刷法を理解し、非限定的な例には、選択的レーザー焼結（ＳＬＳ）法、熱溶解積層（ＦＤＭ）法、３Ｄインクジェット印刷法、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）法および光造形法が挙げられる。熱溶解積層（ＦＤＭ）法では、インクは、ＣＡＤファイルによって画定されたツールパスに沿って押出ヘッドにより堆積される。材料は２５μｍ厚さの微細な層に堆積され、部品は下から上へと、１層ずつ作られる。熱溶解積層法をベースとする一部の３Ｄプリンタは、一方が建築材料（building material）であり、他方が柱（pillar）などの支持材料である２つの異なる材料を押し出すことができる、デュアルプリントノズルヘッドを備える。支持材料は水で洗浄することができる。
【0056】
３Ｄインクジェット印刷は、速度、低コスト、高精度および使い易さのために有効に最適化され、工学的設計の概念段階から初期段階の機能試験に至るまで、可視化に適したものとなる。インクジェット印刷法において、複雑な３Ｄ物品は、射出とそれに続くＵＶ／Ｖｉｓ光によりインク組成物から生成される。インクジェット印刷プロセスにおいて、光硬化性インクは、ビルディングプラットフォーム上に、いくつかのノズルを通して、ＣＡＤファイルにより画定されるパターンで射出され得る。
【0057】
３Ｄ印刷技術のうちの効率的な技術は、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）法または光造形法（ＳＬＡ）である。ＤＬＰまたはＳＬＡ法を使用する３Ｄプリンタ中、インク材料はバット上に重ねられるかまたはシート上に広げられ、インクの所定の領域または表面が、デジタルマイクロミラーデバイスまたは回転鏡により制御された紫外－可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）光に曝露される。ＤＬＰ法では、追加の層は繰り返しまたは連続的に置かれ、各層は所望の３Ｄ物品が形成されるまで硬化される。ＳＬＡ法は、インクが放射線ビームの線により固化する点で、ＤＬＰ法とは異なる。３Ｄ印刷の他の方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、3D Printing Techniques and Processes by Michael Degnan, Dec 2017, Cavendish Square Publishing, LLCにおいて見出され得る。
【0058】
一部の実施形態では、３Ｄ印刷されたオブジェクトが形成されると、細胞はその上に堆積される。
【実施例】
【0059】
以下の実施例は、当業者に例示し説明を提供するために、本開示の一部の実施形態の特定の態様を記載する。実施例は、この開示の一部の実施形態を理解および実践するのに有用な特定の方法を提供するのみであるため、実施例は、この開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0060】
印刷
実施例において使用されるすべての試料は、３Ｄインクジェット印刷法またはデジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）法を使用して調製し、バイオインクの成分を混合し、次いで３Ｄオブジェクトを、例えば、Ｌａｂｆａｂ反転デジタルライトプロジェクション（ＤＬＰ）３Ｄ印刷システムを使用して印刷した。
実施例において使用されるすべての試料は、３Ｄインクジェット印刷法またはデジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）法を使用して調製し、バイオインクの成分を混合し、次いで３Ｄオブジェクトを、例えば、Ｌａｂｆａｂ反転デジタルライトプロジェクション（ＤＬＰ）３Ｄ印刷システムを使用して印刷した。
【0061】
バイオインクの成分は、利用可能である場合には商業的供給源から調達した。生物学的に活性なペプチドをマイケル型反応を行うことにより合成して、ペプチドを１つまたは複数の（メタ）アクリレートモノマーまたはポリマーに連結した。
【0062】
細胞接着調査
以下の細胞接着試験を、以下のプロトコールの少なくとも一部に従って行った。最初に３Ｄ印刷されたディスクを得、完全にメタクリル化していないコラーゲンで作製されている場合には、ディスクを、滅菌された１ＭのＮａＨＣＯ３を用いる架橋処理に供した。ディスクを少なくとも３０分、ＤＰＢＳ＋＋で２回洗浄した。次いで、ディスクを５×Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ溶液（ＤＰＢＳ－－中に希釈した１００×抗生物質抗真菌剤）に終夜入れた。次いで、５×Ａｎｔｉ－ａｎｔｉを、各々少なくとも３０分間、２回のＰＢＳ洗浄液に入れ替えた。光学９６ウェルプレートを使用して、３つのウェルを各々２００ｕＬの洗浄液で充填した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ（または等価物）を使用して、これらの３つのウェルから洗浄液の平均の３８４ｎｍの吸光度が得られた。３８４ｎｍの吸光度は０．１未満であり、微量の染料／ＰＩが許容可能なレベルにあることを示した。
以下の細胞接着試験を、以下のプロトコールの少なくとも一部に従って行った。最初に３Ｄ印刷されたディスクを得、完全にメタクリル化していないコラーゲンで作製されている場合には、ディスクを、滅菌された１ＭのＮａＨＣＯ３を用いる架橋処理に供した。ディスクを少なくとも３０分、ＤＰＢＳ＋＋で２回洗浄した。次いで、ディスクを５×Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ溶液（ＤＰＢＳ－－中に希釈した１００×抗生物質抗真菌剤）に終夜入れた。次いで、５×Ａｎｔｉ－ａｎｔｉを、各々少なくとも３０分間、２回のＰＢＳ洗浄液に入れ替えた。光学９６ウェルプレートを使用して、３つのウェルを各々２００ｕＬの洗浄液で充填した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ（または等価物）を使用して、これらの３つのウェルから洗浄液の平均の３８４ｎｍの吸光度が得られた。３８４ｎｍの吸光度は０．１未満であり、微量の染料／ＰＩが許容可能なレベルにあることを示した。
【0063】
次いで、ディスクを５００ｕＬのＬＦＮ ＧＭ（肺線維芽細胞成長培地）を有するウェルに移し、所定の数の細胞を溶液に添加する。所定の時間後、１０％ホルマリン＋０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を、対照には３００ｕＬ／ウェル、３Ｄディスクを含有するウェルには５００ｕＬ／ウェル添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで定着薬を廃棄物容器へと吸引し、試料をＤＰＢＳ－－で洗浄した（３×５分間の洗浄）。次いでディスクを、１：２０，０００のＳｙｔｏｘＯｒａｎｇｅおよび３：４００のＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ ４８８を含有する溶液で染色した。最終のＤＰＢＳ洗浄の後、ディスクを細胞接着について評価した。
【0064】
実施例１
肺線維芽細胞を、ガラス（対照）、５０％ＤＯＦのコラーゲンを含有するバイオインク、９０％ＤＯＦのコラーゲンを含有するバイオインク、ならびに０％ＤＯＦのコラーゲンおよび９０％ＤＯＦのコラーゲン（１：２の比）を含有するバイオインク上で７日間培養した。
肺線維芽細胞を、ガラス（対照）、５０％ＤＯＦのコラーゲンを含有するバイオインク、９０％ＤＯＦのコラーゲンを含有するバイオインク、ならびに０％ＤＯＦのコラーゲンおよび９０％ＤＯＦのコラーゲン（１：２の比）を含有するバイオインク上で７日間培養した。
【0065】
バイオインクを上記の手順により製剤化した（処方した）。次に、官能化の程度が異なるコラーゲンを含むバイオインクを、ディスクへと３Ｄ印刷した。上記の手順に従って、肺線維芽細胞を各試料上に堆積させた。線維芽細胞を、ガラス（対照）、５０％ＤＯＦのコラーゲンを含有するバイオインクからの印刷されたディスク、９０％ＤＯＦを含有するバイオインクからの印刷されたディスク、ならびに０％ＤＯＦのコラーゲンおよび９０％ＤＯＦのコラーゲン（１：２の比）のハイブリッドを含有するハイブリッドバイオインク製剤からの印刷されたディスク上で７日間培養した。画像を、図２（Ａ）に示すように撮影した。細胞の拡散、密度および細胞カバー率の％のグラフを、図２（Ｂ）の細胞の拡散、密度および細胞カバー率の％のグラフに示すように、各試料についてプロットした。
【0066】
実施例２
肺動脈内皮細胞を、ガラス、９％のＰＥＧＤＡハイブリッドからの印刷されたディスク、９％のＰＥＧＤＡからの印刷されたディスク上で１日間培養した。
肺動脈内皮細胞を、ガラス、９％のＰＥＧＤＡハイブリッドからの印刷されたディスク、９％のＰＥＧＤＡからの印刷されたディスク上で１日間培養した。
【0067】
バイオインクを上記の手順により製剤化した。ＰＥＧＤＡおよびＰＥＧＤＡハイブリッドを含むバイオインクを、ディスクへと３Ｄ印刷した。上記の手順に従って、肺動脈内皮細胞を各試料上に堆積させた。次いで、肺動脈内皮細胞を、ガラス（対照）、ＰＥＧＤＡおよびＰＥＧＤＡハイブリッドディスク上で１日間培養した。画像を、図３（Ａ）に示すように撮影した。細胞の拡散、密度および細胞カバー率の％のグラフを、図３（Ｂ）の細胞の拡散、密度および細胞カバー率の％のグラフに示すように、各試料についてプロットした。
【0068】
実施例３
ＰＥＧＤＡ ＭＷ３４００を含む３Ｄ印刷されたディスク、９５％ＤＯＦのコラーゲンおよび０％ＤＯＦのコラーゲン（２：１比）を含む３Ｄ印刷されたディスク上での付着および増殖に対する肺平滑筋細胞の能力を調査した。
ＰＥＧＤＡ ＭＷ３４００を含む３Ｄ印刷されたディスク、９５％ＤＯＦのコラーゲンおよび０％ＤＯＦのコラーゲン（２：１比）を含む３Ｄ印刷されたディスク上での付着および増殖に対する肺平滑筋細胞の能力を調査した。
【0069】
バイオインクを上記の方法により製剤化した。バイオインクを３Ｄ印刷して、ＰＥＧＤＡ ＭＷ ３４００を含むディスク、９５％ＤＯＦのコラーゲンおよび０％ＤＯＦのコラーゲン（２：１比）を含む３Ｄ印刷されたディスクを形成した。肺平滑細胞（Lung smooth cells）を、上記の方法に従ってディスク上に堆積させた。細胞を７日間の経過にわたり、ディスクにわたり付着、増殖および拡散させた。２、５および７日目のディスクの画像を、図４に示すように撮影した。
【0070】
実施例４
官能化と非官能化コラーゲンとの異なる比を有するバイオインクから作製された３Ｄ印刷されたオブジェクトへの細胞接着特性の数。バイオインクＣ２０１、Ｃ２０２およびＣ２０３を、以下の表２中の構成成分（component）を含めて形成した。これらのバイオインクを、上記の方法に従って３Ｄ印刷した。
官能化と非官能化コラーゲンとの異なる比を有するバイオインクから作製された３Ｄ印刷されたオブジェクトへの細胞接着特性の数。バイオインクＣ２０１、Ｃ２０２およびＣ２０３を、以下の表２中の構成成分（component）を含めて形成した。これらのバイオインクを、上記の方法に従って３Ｄ印刷した。
【0071】
【表2】
【0072】
【0073】
グラフ５Ｃに示すように、試料Ｃ２０１はＣ２０２およびＣ２０３に対して顕著により大きい細胞接着を示した。
【0074】
実施例５
官能化および非官能化コラーゲンを含有する３Ｄ印刷されたバイオインクを調べて、肺線維芽細胞の付着および増殖への支持（support）を日毎に評価した。
官能化および非官能化コラーゲンを含有する３Ｄ印刷されたバイオインクを調べて、肺線維芽細胞の付着および増殖への支持（support）を日毎に評価した。
【0075】
３０ ＤＯＦのハイブリッドコラーゲン（０ ＤＯＦ（非メタクリル化コラーゲン）と９０ ＤＯＦ（メタクリル化（Methaycrylated）コラーゲン）との混合物）を含むハイブリッドバイオインクを、固体（０．５～２ｗｔ．％）としてのＬＡＰをＰＥＧＤＡ ３４００（５～１４ｗｔ．％）およびＨＰＡ（８～１７ｗｔ．％）を含む水溶液に添加することにより形成し、結果として生じた溶液を透明（clear）になるまでスピード混合（speed mix）した。染料（０．１２％）を添加し、溶液がｐＨ２～３の間であることを確認した。次に、３０ ＤＯＦのハイブリッドコラーゲン（４０～５５ｗｔ．％）を添加し、溶液を均質になるまで撹拌した。官能化の程度は３０％であった。バイオインクを３Ｄ印刷した。肺細胞を、上記の方法に従って試料上に堆積させた。細胞の付着および増殖の量を、１、４および７日目に画像化し、図６に示した。
【0076】
実施例６
細胞接着特性に対するＨＥＡＡ（％）成分の効果を調べた。図７で説明された３Ｄ印刷されたディスクを上記の方法に従って得、細胞を上記の方法に従ってディスク上に堆積させた。
細胞接着特性に対するＨＥＡＡ（％）成分の効果を調べた。図７で説明された３Ｄ印刷されたディスクを上記の方法に従って得、細胞を上記の方法に従ってディスク上に堆積させた。
【0077】
【0078】
実施例７
細胞の接着および増殖に対するＣｏｌｌＭＡ ＤＯＦの効果（＞９０％、約５０％、ハイブリッド（５０％の非ＭＡ、５０％のＨＭ））。以下の試料の組成を含む３Ｄ印刷バイオインクにより、試料を形成した。
試料１組成物
ＰＥＧＤＡ３．４ｋ（３～１０ｗｔ．％）；ＬＡＰ（０．３～１．０ｗｔ．％）；ＵＶ３８６Ａ；ＣｏｌＭＡ（９０ ＤＯＦ）
試料２組成物
ＰＥＧＤＡ３．４ｋ（３～１０ｗｔ．％）；ＬＡＰ（０．３～１．０ｗｔ．％）；ＵＶ３８６Ａ；ＣｏｌＭＡ（５０ ＤＯＦ）
試料３組成物
ＰＥＧＤＡ３．４ｋ（３～１０ｗｔ．％）；ＬＡＰ（０．３～１．０ｗｔ．％）；ＵＶ３８６Ａ；ＣｏｌＭＡハイブリッド（０ ＤＯＦ＋９０ ＤＯＦ）
細胞の接着および増殖に対するＣｏｌｌＭＡ ＤＯＦの効果（＞９０％、約５０％、ハイブリッド（５０％の非ＭＡ、５０％のＨＭ））。以下の試料の組成を含む３Ｄ印刷バイオインクにより、試料を形成した。
試料１組成物
ＰＥＧＤＡ３．４ｋ（３～１０ｗｔ．％）；ＬＡＰ（０．３～１．０ｗｔ．％）；ＵＶ３８６Ａ；ＣｏｌＭＡ（９０ ＤＯＦ）
試料２組成物
ＰＥＧＤＡ３．４ｋ（３～１０ｗｔ．％）；ＬＡＰ（０．３～１．０ｗｔ．％）；ＵＶ３８６Ａ；ＣｏｌＭＡ（５０ ＤＯＦ）
試料３組成物
ＰＥＧＤＡ３．４ｋ（３～１０ｗｔ．％）；ＬＡＰ（０．３～１．０ｗｔ．％）；ＵＶ３８６Ａ；ＣｏｌＭＡハイブリッド（０ ＤＯＦ＋９０ ＤＯＦ）
【0079】
レオロジーを測定した。図８Ａのグラフに結果を示す。
【0080】
Ｌａｂｆａｂ反転デジタルライトプロジェクション（ＤＬＰ）３Ｄ印刷システムを使用してバイオインクを３Ｄ印刷した。線維芽細胞を堆積させ、上記の手順によりインキュベートした。図８Ｅは、日毎の細胞拡散、細胞密度および細胞カバー率のパーセントのグラフを示す。細胞拡散、細胞密度およびカバー率のパーセントを、上記の手順により、１、４および７日目に図８Ｂ～Ｄに示すように計算した。試料間の細胞拡散、細胞密度および細胞カバー率のパーセントのグラフを図８Ｅにグラフ化した。示すように、細胞の拡散は、７日目にはハイブリッドおよび５０％ＤＯＦインクで改善した。細胞は、７日間の経過にわたり、９０％ＤＯＦおよびハイブリッドインクと比較して、５０％ＤＯＦインク上で活性に増殖した。この１つのモデルは、非メタクリル化コラーゲンがハイブリッドゲルから溶出し得るということである。
【0081】
実施例８
ＰＡＥＣ細胞の細胞密度、細胞の拡散および細胞カバー率の比較。
ＰＡＥＣ細胞の細胞密度、細胞の拡散および細胞カバー率の比較。
【0082】
ＰＡＥＣ細胞を、１０，５００／ｃｍ２の量で播種し、１日間培養した。試料をガラススライドと比較した。図９に示すように、細胞密度、細胞の拡散および細胞カバー率を、試料と対照との間で比較した。
【0083】
実施例９
上記の試料１～３のような成分を有する試料を、５つの異なるバッチのコラーゲンを使用して製造した。これらのバッチの各々について、インク成分を水中で混合し、次いでインクをディスクへと３Ｄ印刷することにより試料を形成した。各試料に、５０００細胞／ｃｍ２（ＰＡＥＣ）を播種した。加えて、ガラス対照にＰＡＲＣを播種した。細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントを、１、４および７日目に評価した。
上記の試料１～３のような成分を有する試料を、５つの異なるバッチのコラーゲンを使用して製造した。これらのバッチの各々について、インク成分を水中で混合し、次いでインクをディスクへと３Ｄ印刷することにより試料を形成した。各試料に、５０００細胞／ｃｍ２（ＰＡＥＣ）を播種した。加えて、ガラス対照にＰＡＲＣを播種した。細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントを、１、４および７日目に評価した。
【0084】
実施例１０
ｘ％ＤＯＦの Ｃｏｌ Ｉを有する５％のＰＥＧＤＡ上のＬＦＮ
ｘ％ＤＯＦの Ｃｏｌ Ｉを有する５％のＰＥＧＤＡ上のＬＦＮ
【0085】
官能化の程度の異なる５％のＰＥＧＤＡおよびＩ型コラーゲンの試料を製造した。試料には、ガラス対照、５０％の程度のＩ型コラーゲン官能化、９０％のＩ型コラーゲン官能化、およびハイブリッド試料を含めた。試料を、インク成分を水中で混合し、次いでインクをディスクへと３Ｄ印刷することにより形成した。上記に記載されているものと同様の方法で、各試料に細胞を播種した。
【0086】
図１０Ａに示すように、細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントおよび画像を、１日目に各試料間で比較した。図１０Ｂに示すように、細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントおよび画像を、４日目に各試料間で比較した。図１０Ｃに示すように、細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントおよび画像を、７日目に各試料間で比較した。図１０Ｄに示すように、細胞拡散、細胞密度および細胞カバー率のパーセントを、各試料について日毎にグラフ化した。
【0087】
実施例１１
この試験は、ＡＣ４２（６～１２ｗｔ．％のＨＰＡ；６～１２ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ３．４ｋ、様々なメタクリル化コラーゲン、ＬＡＰ、ＵＶ染料を有するバイオインク）の生体適合性を評価した。バイオインクをＬａｂＦａｂプリンタ上で印刷して、３つの時点の試験（１、４、７日）のための３ｍｍのディスクおよび１ｍｍのディスクを形成した。これらのディスクを、プラットフォームに接着した。細胞を播種する前のディスクの画像を、図１１Ａに示す。
この試験は、ＡＣ４２（６～１２ｗｔ．％のＨＰＡ；６～１２ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ３．４ｋ、様々なメタクリル化コラーゲン、ＬＡＰ、ＵＶ染料を有するバイオインク）の生体適合性を評価した。バイオインクをＬａｂＦａｂプリンタ上で印刷して、３つの時点の試験（１、４、７日）のための３ｍｍのディスクおよび１ｍｍのディスクを形成した。これらのディスクを、プラットフォームに接着した。細胞を播種する前のディスクの画像を、図１１Ａに示す。
【0088】
ディスクを、２４ウェルプレート中、１ＭのＮａＨＣＯ３中で１０分架橋した。架橋に続けて、ディスクをＰＢＳ＋＋洗浄のために速度６０の振盪プレート上のペトリ皿に移した（２回、少なくとも各１０分間）。終夜の５×洗浄のために、ディスクをウェルプレートに移した。
【0089】
ＬＦＮ細胞を各ディスクに播種した。１０Ｋの細胞を各ウェルに添加して、各試料ディスクに播種した。ウェルあたり２０Ｋの細胞を添加して、対照に播種した。図１１Ｂに示すように、細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントおよび画像を、１日目に各試料間で比較した。細胞は１日目には良好に拡散した（非常にコンフルエントとなった）。図１１Ｃに示すように、細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントおよび画像を、４日目に各試料間で比較した。細胞は４日目には完全にコンフルエントとなった。図１１Ｄに示すように、細胞拡散、細胞密度、細胞カバー率のパーセントおよび画像を、７日目に各試料間で比較した。細胞は７日目には互いに重なり合っていた。ディスクは高い細胞付着を有したが、一部は４日目および７日目にはコンフルエントな細胞シートから剥がれ落ち、ＬＦＮ試験についての細胞密度は低減し得る。
【0090】
実施例１２
図１２Ａ～１２Ｂは、ＬＦＮ、ＰＡＥＣまたはＳＡＥＣ種を播種したＡＣ４２ １ｍｍディスク、３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散の比較および細胞密度の比較を示す。ＡＣ４２バイオインクをＬａｂＦａｂプリンタ上で印刷して、３つの時点の試験（１、４、７日）のための３ｍｍのディスクおよび１ｍｍのディスクを形成した。これらのディスクを、プラットフォームに接着した。図１２Ａにディスクの画像を示す。
図１２Ａ～１２Ｂは、ＬＦＮ、ＰＡＥＣまたはＳＡＥＣ種を播種したＡＣ４２ １ｍｍディスク、３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の領域カバー率のパーセント、細胞拡散の比較および細胞密度の比較を示す。ＡＣ４２バイオインクをＬａｂＦａｂプリンタ上で印刷して、３つの時点の試験（１、４、７日）のための３ｍｍのディスクおよび１ｍｍのディスクを形成した。これらのディスクを、プラットフォームに接着した。図１２Ａにディスクの画像を示す。
【0091】
ディスクを、２４ウェルプレート中、１ＭのＮａＨＣＯ３中で１０分架橋した。架橋に続けて、ディスクをＰＢＳ＋＋洗浄のために速度６０の振盪プレート上のペトリ皿に移した（２回、少なくとも各１０分間）。終夜の５×洗浄のために、ディスクをウェルプレートに移した。ＬＦＮ、ＰＡＥＣまたはＳＡＥＣ細胞を各ディスクに播種した。
【0092】
図１２Ａは、ＬＦＮ、ＰＡＥＣまたはＳＡＥＣ種を播種したＡＣ４２ １ｍｍディスク、３ｍｍディスク、溶出対照およびガラス対照の、１日目の領域カバー率のパーセント、細胞の拡散の比較および細胞密度の比較を示す。図１２Ｂは、ＬＦＮ、ＰＡＥＣまたはＳＡＥＣ種を播種したＡＣ４２ １ｍｍディスクおよび３ｍｍディスクの、１日目の領域カバー率のパーセント、細胞の拡散の比較および細胞密度の比較を示す。
【0093】
実施例１３
２～５ｗｔ．％のＨＰＡまたはＨＢＡ、１～５ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ５７５、３～８ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ６０００、１～６ｍＭのＰＥＧ３４００アクリレートＣＧＲＧＤＳ、ＬＡＰ、ＵＶ３８６Ａおよび水を含むバイオインクから、ディスクを印刷した。
２～５ｗｔ．％のＨＰＡまたはＨＢＡ、１～５ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ５７５、３～８ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ６０００、１～６ｍＭのＰＥＧ３４００アクリレートＣＧＲＧＤＳ、ＬＡＰ、ＵＶ３８６Ａおよび水を含むバイオインクから、ディスクを印刷した。
【0094】
ＰＡＥＣおよびＳＡＥＣカバー率を、１および４日目に調べた。図１４Ａは、２～５ｗｔ．％のＨＰＡ、１～２ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ５７５、３～８ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ６０００、１～６ｍＭのＰＥＧ３４００アクリレートＣＧＲＧＤＳ、ＬＡＰ、ＵＶ３８６Ａを含むディスク上の細胞カバー率を示す。図１４Ｂは、２～５ｗｔ．％のＨＰＡ、３～４ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ５７５、３～８ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ６０００、１～６ｍＭのＰＥＧ３４００アクリレートＣＧＲＧＤＳ、ＬＡＰ、ＵＶ３８６Ａを含むディスク上の細胞カバー率を示す。図１４Ｃは、２～５ｗｔ．％のＨＢＡ、３～４ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ５７５、３～８ｗｔ．％のＰＥＧＤＡ６０００、１～６ｍＭのＰＥＧ３４００アクリレートＣＧＲＧＤＳ、ＬＡＰ、ＵＶ３８６Ａを含むディスク上の細胞カバー率を示す。
【0095】
実施例１４
以下の成分を有するインクから印刷されたディスクを、ＰＨＳＲＮＫＲＧＤＳ（０．５～１ｍＭ）およびＡＧ７３（０．３～０．７ｍＭ）で、印刷後の未反応のアクリレート基を溶液中のペプチドと反応させることにより、表面修飾した。
以下の成分を有するインクから印刷されたディスクを、ＰＨＳＲＮＫＲＧＤＳ（０．５～１ｍＭ）およびＡＧ７３（０．３～０．７ｍＭ）で、印刷後の未反応のアクリレート基を溶液中のペプチドと反応させることにより、表面修飾した。
【0096】
【表3】
【0097】
【0098】
本明細書で使用される場合、単数の用語「１つの」（「ａ」、「ａｎ」）および「その」（「ｔｈｅ」）は、別途文脈が明確に指示していない限り、複数の指示物を含み得る。したがって、例えば、オブジェクトへの言及は、別途文脈が明確に指示していない限り、複数のオブジェクトを含み得る。
【0099】
本明細書で使用される場合、「実質的に」および「約」という用語は、小さな変動を記載および説明するのに使用される。事象または状況と併せて使用されるとき、用語は、事象または状況が正確に起こった場合、ならびに事象または状況が近似的に発生する場合を指すことができる。数値と併せて使用されるとき、用語は、その数値の±１０％未満もしくはそれと等しい、例えば±５％未満もしくはそれと等しいか、±４％未満もしくはそれと等しいか、±３％未満もしくはそれと等しいか、±２％未満もしくはそれと等しいか、±１％未満もしくはそれと等しいか、±０．５％未満もしくはそれと等しいか、±０．１％未満もしくはそれと等しいか、または±０．０５％未満もしくはそれと等しい変動の範囲を指すことができる。第１の数値に対して第２の数値と「実質的に」または「ほぼ（about）」同じであると言及するとき、用語は、第１の数値が、第２の数値の±１０％未満もしくはそれと等しい、例えば±５％未満もしくはそれと等しいか、±４％未満もしくはそれと等しいか、±３％未満もしくはそれと等しいか、±２％未満もしくはそれと等しいか、±１％未満もしくはそれと等しいか、±０．５％未満もしくはそれと等しいか、±０．１％未満もしくはそれと等しいか、または±０．０５％未満もしくはそれと等しい変動の範囲内にあることを指すことができる。
【0100】
加えて、量、比および他の数値は、本明細書において範囲形式で示される場合がある。そのような範囲形式が簡便性および簡潔性のために使用されることが理解されるべきであり、範囲の限界として明示的に指定された数値を含むだけでなく、各数値およびサブ範囲が明示的に指定されているかのようにその範囲内に包含されるすべての個々の数値またはサブ範囲を含むように、柔軟に理解されるべきであることを理解されたい。例えば、約１～約２００の範囲内の比は、約１および約２００の明示的に列挙されている限界を含むだけでなく、約２、約３および約４などの個々の比、ならびに約１０～約５０、約２０～約１００などのサブ範囲も含むように理解されるべきである。
【0101】
本開示をその特定の実施形態を参照して説明したが、これは当業者により、添付の特許請求の範囲により定義されるような本開示の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、等価物で代替することができると理解されるべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、方法、操作（複数可）を、本開示の目的、趣旨および範囲に適合させるために、多くの修正を行うことができる。そのような全ての修正は、本明細書に添付の特許請求の範囲にあるように意図される。特に、ある特定の方法が特定の順序で行われる特定の操作を参照して説明されるが、これらの操作は、本開示の教示から逸脱することなく、合わせられ、細分され、または並べ替えられて等価の方法を形成してもよいことが理解される。したがって、本明細書において具体的に示されない限り、操作の順序およびグルーピングは本開示の制限にはならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図8-5】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】