知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-19
(54)【発明の名称】ＣＡＲＥエレメントを用いたＤＮＡ増幅方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240412BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240412BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240412BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240412BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20240412BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240412BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100
C12N15/113 100Z
C12N15/09 Z ZNA
C12N5/10
C12N15/35
C12N15/09 110
C12Q1/686
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564038
(86)(22)【出願日】2022-04-14
(85)【翻訳文提出日】2023-12-15
(86)【国際出願番号】 GB2022050957
(87)【国際公開番号】W WO2022223954
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】2105581.9
(32)【優先日】2021-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2110922.8
(32)【優先日】2021-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2113603.1
(32)【優先日】2021-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2116571.7
(32)【優先日】2021-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518305392
【氏名又は名称】オックスフォード ジェネティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＸＦＯＲＤ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】ケイウッド、ライアン
(72)【発明者】
【氏名】ブライティ、デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ギルマン、アダム
(72)【発明者】
【氏名】スー、ウェイヘン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA08
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR39
4B063QS38
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、ヌクレオチド配列を増幅する方法に関する。増幅されるヌクレオチド配列には、複数のＣＡＲＥエレメントと隣接している。本発明は、増幅されるヌクレオチド配列に隣接する第１および第２のＣＡＲＥエレメントを含む核酸分子（例えば、プラスミドおよびベクター）を提供する。本発明は、前記核酸分子を含む宿主細胞および前記核酸分子を用いた増幅方法も提供する。本発明は、特に、ウイルス遺伝子の増幅および組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生に適用できる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞内で第１のヌクレオチド配列を増幅する方法であって、（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）第１の核酸分子を含み、前記第１の核酸分子は、
（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きであり、
前記宿主細胞は、必要に応じて、
（ｉｉ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子またはアデノウイルス後期遺伝子と作動可能に関連する１つ以上のプロモーターを含む１つ以上の第２の核酸分子をさらに含み、
前記宿主細胞内に、ＡＡＶ Ｒｅｐならびに１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物および／またはアデノウイルス後期遺伝子産物が存在するような条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、前記第１のヌクレオチド配列の増幅を促進する、工程を含む方法。
【請求項2】
前記方法は、前記工程（ａ）の前に、前記宿主細胞に前記第１の核酸分子を導入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記各ＡＡＶ ｐ５プロモーターは、それぞれ独立して、（ａ）ＴＡＴＡボックスと、
（ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐ結合部位と、
（ｃ）ｔｒｓ様エレメントと、を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記各ＡＡＶ ｐ５プロモーターは、それぞれ独立して、（ｄ）ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１結合部位、
（ｅ）ＹＹ１－６０結合部位、および
（ｆ）ＹＹ１＋１結合部位のうちの１つ以上を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含むか、または下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からなる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。（ｉ）ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１～３２０、１９１～３５３または１９１～５４２に対応するＡＡＶゲノムの領域；
（ｉｉ）配列番号７、９または１０のうちの１つのヌクレオチド配列を有する分子；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に対して、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する、（ｉ）または（ｉｉ）の変異体か、あるいは（ｉ）または（ｉｉ）の長さの少なくとも８０％または少なくとも９０％である、（ｉ）または（ｉｉ）の断片であって、前記変異体または前記断片は、アデノウイルスおよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の存在下で、２つの変異体または２つの断片と隣接している第１のヌクレオチド配列の増幅を促進することができ、前記２つ変異体または前記２つの断片は、どちらも同じ５'－３'の向きである、変異体または断片。
【請求項6】
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域およびＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域およびＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域の各ヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含むか、または下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からなる、請求項６に記載の方法。（ｉ）前記ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～１９０に対応するＡＡＶゲノムの領域；
（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列を有する分子；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に対して、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する、（ｉ）または（ｉｉ）の変異体か、あるいは（ｉ）または（ｉｉ）の長さの少なくとも８０％または少なくとも９０％である、（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項8】
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含むか、または下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からなる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。（ｉ）ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～３２０、１４６～３５３または１４６～５４２に対応するＡＡＶゲノムの領域；
（ｉｉ）配列番号６、１１または１２のうちの１つのヌクレオチド配列を有する分子；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に対して、少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する、（ｉ）または（ｉｉ）の変異体か、あるいは（ｉ）または（ｉｉ）の長さの少なくとも８０％または９０％である、（ｉ）または（ｉｉ）の断片であって、前記変異体または前記断片は、アデノウイルスおよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の存在下で、２つの変異体または２つの断片と隣接している第１のヌクレオチド配列の増幅を促進することができ、前記２つ変異体または前記２つの断片は、どちらも同じ５'－３'の向きである、変異体または断片。
【請求項9】
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分をさらに含み、好ましくは、前記５'部分は、（ｉ）前記ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３２１～５４１に対応するＡＡＶゲノムの領域、
（ｉｉ）前記ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３２１～３５３に対応するＡＡＶゲノムの領域、または
（ｉｉｉ）前記領域に対して、少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する、（ｉ）または（ｉｉ）の変異体を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１のヌクレオチド配列は、（ａ）治療ポリペプチド、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはｓｇＲＮＡ、または
（ｃ）ウイルス遺伝子をコードする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記第１のヌクレオチド配列は、組み換えＡＡＶゲノムをコードし、好ましくは、前記組み換えＡＡＶゲノムは、導入遺伝子に隣接する末端逆位反復配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記第１のヌクレオチド配列は、（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、
（ｉｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、
（ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、または
（ｉｖ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および導入遺伝子を含み、
（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかは、必要に応じて、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接していてもよい、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１のヌクレオチド配列は、アデノウイルス後期遺伝子ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをさらにコードする、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記宿主細胞は、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質を発現し、前記第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および必要に応じてＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、（ｉ）前記第１のＣＡＲＥエレメントの前記ｐ５プロモーターは、前記第１のＣＡＲＥエレメントの前記ｐ５プロモーターからｒｅｐ遺伝子が発現しないように改変されており、好ましくは、前記第１のＣＡＲＥエレメントの前記ｐ５プロモーターにリプレッサー結合部位を挿入することにより、前記第１のＣＡＲＥエレメントの前記ｐ５プロモーターからｒｅｐ遺伝子が発現しないように改変されている、または
（ｉｉ）ｒｅｐ遺伝子は、異種誘導性プロモーターまたは異種抑制性プロモーターと作動可能に関連している、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および／またはアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質は、前記宿主細胞の染色体から発現せず、前記アデノウイルスＥ１Ａタンパク質および／または前記アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質は、前記宿主細胞内で、アデノウイルスベクターから発現し、前記第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子ならびに必要に応じてＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／または組み換えＡＡＶゲノムを含み、（ｉ）前記ｐ５プロモーターは、ｒｅｐ遺伝子の発現を促進することができる、または
（ｉｉ）前記ｐ５プロモーターは、ｒｅｐ遺伝子の発現を促進することができない、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
（ｉ）前記第１の核酸分子は、機能的Ｒｅｐタンパク質をコードしない、および／または（ｉｉ）前記第１の核酸分子は、機能的Ｃａｐタンパク質をコードしない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
（ａ）前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、または（ｂ）前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞のエピソーム内に存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記第１の核酸分子は、下記構造：｛－［ＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］－｝n
ただし、ｎは２以上とする、
を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
導入遺伝子を含む組み換えウイルス粒子を産生するプロセスであって、下記工程（ａ）および（ｂ）を含むプロセス。（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）導入遺伝子に隣接する５'－ウイルスＩＴＲおよび３'－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉ）クレーム１～１５または１７～１８のいずれか１項に規定されている第１の核酸分子であって、前記第１のヌクレオチド配列がウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子を含み、前記第１の核酸分子は、前記宿主細胞内のエピソームプラスミドまたはエピソームベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子の増幅を促進するとともに、前記トランスファープラスミドをパッケージするのに十分なＡＶヘルパー遺伝子であって、前記ヘルパー遺伝子は、前記宿主細胞内のエピソームヘルパープラスミドに存在しているか、アデノウイルスベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、ヘルパー遺伝子と、を含み、
前記宿主細胞により、ウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子が増幅され、ウイルス粒子が集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する、工程；
（ｂ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培地から回収する工程。
【請求項20】
前記アデノウイルスヘルパー遺伝子は、前記宿主細胞にアデノウイルスを感染させることによって供給される、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項21】
核酸分子であって、前記核酸分子は、（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントの一方または両方は、それぞれ独立して、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域をさらに含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きである、核酸分子。
【請求項22】
（ｉ）前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントの前記ｐ５プロモーターは、それぞれ独立して、請求項３または４に規定されている、または（ｉｉ）前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、請求項５に規定されている、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項23】
（ｉ）前記ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域は、請求項７に規定されている、または（ｉｉ）前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、請求項８に規定されている、請求項２１または２２に記載の核酸分子。
【請求項24】
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分をさらに含み、好ましくは、前記５'部分は、請求項９に規定されている、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項25】
前記第１のヌクレオチド配列は、請求項１０～１３のいずれか１項に規定されている、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項26】
（ｉ）前記第１の核酸分子は、機能的Ｒｅｐタンパク質をコードしない、および／または（ｉｉ）前記第１の核酸分子は、機能的Ｃａｐタンパク質をコードしない、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項27】
前記核酸分子は、下記構造：｛－［ＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］－｝n
ただし、ｎは２以上とする、
を有する、請求項２１～２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項28】
請求項２１～２７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項29】
改変された宿主細胞を産生するプロセスであって、前記プロセスは、（ａ）宿主細胞に請求項２１～２７のいずれか１項に記載の核酸分子を導入することを含み、
それにより、改変された宿主細胞を産生する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヌクレオチド配列を増幅する方法に関する。増幅されるヌクレオチド配列は、複数のＣＡＲＥエレメントと隣接している。本発明は、増幅されるヌクレオチド配列に隣接する第１および第２のＣＡＲＥエレメントを含む核酸分子（例えば、プラスミドおよびベクター）を提供する。本発明は、前記核酸分子を含む宿主細胞および前記核酸分子を用いた増幅方法も提供する。本発明は、特に、ウイルス遺伝子の増幅および組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生に適用できる。
【0002】
ＡＡＶベクターを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が染色体に組み込まれているＨｅｌａ細胞株のトランスフェクションおよびアデノウイルス感染により、組み込まれたｒｅｐ－ｃａｐ配列が１００倍に増幅されることが、これまでに報告されている（Tessier, J., et al. J. Virol. 2001; 375-383; Chadeuf, G., et al., J. Gene Med. 2000; 2: 260-268）。これらの増幅配列は、染色体外に存在していた。当該論文において、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）は、この増幅に必須であるといわれた。
この現象は、ＵＳ２００４／００１４０３１にさらに記載されており、それには１つのシス作用複製エレメント（cis-acting replication element：ＣＡＲＥ）が関与していた。このＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９０～３６１に対応する１７１個のヌクレオチドの領域に位置するといわれ（実施例１２）、前記領域にはＡＡＶ ｐ５プロモーターが含まれる。
さらに、ＵＳ２００４／００１４０３１において、前記ＣＡＲＥエレメントが、隣接した異種遺伝子の増幅を誘導できること（実施例１１）、すなわち、１つのＣＡＲＥエレメントが複製起点として作用できることが報告されている。
この現象は、ＵＳ２００４／００１４０３１にさらに記載されており、それには１つのシス作用複製エレメント（cis-acting replication element：ＣＡＲＥ）が関与していた。このＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９０～３６１に対応する１７１個のヌクレオチドの領域に位置するといわれ（実施例１２）、前記領域にはＡＡＶ ｐ５プロモーターが含まれる。
さらに、ＵＳ２００４／００１４０３１において、前記ＣＡＲＥエレメントが、隣接した異種遺伝子の増幅を誘導できること（実施例１１）、すなわち、１つのＣＡＲＥエレメントが複製起点として作用できることが報告されている。
【0003】
これらの報告は、作動可能に関連したヌクレオチド配列を増幅するために、ＣＡＲＥエレメントを用いる可能性を提起した。
【発明の概要】
【0004】
現在のところ、１つのＣＡＲＥエレメントでは、ＣＡＲＥ依存複製を促進するには不十分であることが判明している。つまり、２つのＣＡＲＥエレメントが必要であり、これらは増幅されるヌクレオチド配列に隣接しなければならず、かつ、前記２つのＣＡＲＥエレメントは、ＤＮＡ分子内で互いに同じ向き（５'から３'）に配置されなければならない。このようなＣＡＲＥエレメントの作用の正確なメカニズムを特定することで、ヌクレオチド配列を増幅する新たな方法を生み出しやすくなる。
【0005】
従って、本発明の一つの目的は、増幅されるヌクレオチド配列、例えば、プロモーターによって駆動される目的遺伝子などの領域に隣接する第１および第２のＣＡＲＥエレメントを含む核酸分子（例えば、プラスミドおよびベクター）を提供することである。本発明の別の目的は、前記核酸分子を含む宿主細胞および前記核酸分子を用いた増幅方法を提供することを含む。
【0006】
本発明は、特に、ウイルス遺伝子の増幅および組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生に適用できる。従って、本発明のさらに別の目的は、Ｒｅｐポリペプチドおよび／またはＣａｐポリペプチドの高い発現レベルを達成してＡＡＶ粒子を形成する、ＡＡＶ産生方法を提供することである。
【0007】
一実施形態において、本発明は、宿主細胞内で第１のヌクレオチド配列を増幅する方法を提供する。前記方法は、
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）第１の核酸分子を含み、前記第１の核酸分子は、
（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きであり、
前記宿主細胞は、必要に応じて、
（ｉｉ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子またはアデノウイルス後期遺伝子と作動可能に関連する１つ以上のプロモーターを含む１つ以上の第２の核酸分子をさらに含み、
前記宿主細胞内に、ＡＡＶ Ｒｅｐならびに１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物および／またはアデノウイルス後期遺伝子産物が存在するような条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、前記第１のヌクレオチド配列の増幅を促進する、工程を含む。
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）第１の核酸分子を含み、前記第１の核酸分子は、
（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きであり、
前記宿主細胞は、必要に応じて、
（ｉｉ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子またはアデノウイルス後期遺伝子と作動可能に関連する１つ以上のプロモーターを含む１つ以上の第２の核酸分子をさらに含み、
前記宿主細胞内に、ＡＡＶ Ｒｅｐならびに１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物および／またはアデノウイルス後期遺伝子産物が存在するような条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、前記第１のヌクレオチド配列の増幅を促進する、工程を含む。
【0008】
別の実施形態において、本発明は、導入遺伝子を含む組み換えウイルス粒子を産生するプロセスを提供する。前記プロセスは、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）導入遺伝子に隣接する５'－ウイルスＩＴＲおよび３'－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉ）本発明の核酸分子であって、前記第１のヌクレオチド配列がウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子を含み、前記核酸分子は、前記宿主細胞内のエピソームプラスミドまたはエピソームベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子の増幅を促進するとともに、前記トランスファープラスミドをパッケージするのに十分なＡＶヘルパー遺伝子であって、前記ヘルパー遺伝子は、前記宿主細胞内のエピソームヘルパープラスミドに存在しているか、アデノウイルスベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、ヘルパー遺伝子と、を含み、
前記宿主細胞により、ウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子が増幅され、ウイルス粒子が集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する、工程；
（ｂ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培地から回収する工程。
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）導入遺伝子に隣接する５'－ウイルスＩＴＲおよび３'－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉ）本発明の核酸分子であって、前記第１のヌクレオチド配列がウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子を含み、前記核酸分子は、前記宿主細胞内のエピソームプラスミドまたはエピソームベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子の増幅を促進するとともに、前記トランスファープラスミドをパッケージするのに十分なＡＶヘルパー遺伝子であって、前記ヘルパー遺伝子は、前記宿主細胞内のエピソームヘルパープラスミドに存在しているか、アデノウイルスベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、ヘルパー遺伝子と、を含み、
前記宿主細胞により、ウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子が増幅され、ウイルス粒子が集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する、工程；
（ｂ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培地から回収する工程。
【0009】
さらなる実施形態において、本発明は、核酸分子を提供する。前記核酸分子は、
（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントの一方または両方は、それぞれ独立して、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域をさらに含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きである。
（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび／または前記第２のＣＡＲＥエレメントの一方または両方は、それぞれ独立して、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域をさらに含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きである。
【0010】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【0011】
さらなる実施形態において、本発明は、改変された宿主細胞を産生するプロセスを提供する。前記プロセスは、
（ａ）宿主細胞に本発明の核酸分子を導入することを含み、
これにより、改変された宿主細胞を産生するプロセスである。
（ａ）宿主細胞に本発明の核酸分子を導入することを含み、
これにより、改変された宿主細胞を産生するプロセスである。
【0012】
本発明の核酸分子は、好ましくは、ＤＮＡである。それは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【0013】
本明細書において、「ＣＡＲＥエレメント」という用語は、シス作用複製エレメントを指す。ＣＡＲＥエレメントとは、アデノウイルスおよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の存在下で、第１のヌクレオチド配列に第１および第２のＣＡＲＥエレメントと隣接しているときに、第１のヌクレオチド配列の複製を促進することができるヌクレオチドの配列であり、この場合、第１および第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きである。ＣＡＲＥエレメントの例は、従来、Tessier, J., et al. J. Virol. 2001; 375-383; Chadeuf, G., et al. J. Gene Med. 2000; 2: 260-268; US2004/0014031; Nony, P. et al. J. Virol. 2001に記載されている。ＣＡＲＥエレメントは、好ましくは、ＡＡＶ ＣＡＲＥエレメントである。
【0014】
本発明に用いられる第１および第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含む。第１および第２のＣＡＲＥエレメントのｐ５プロモーター配列は、同じでも異なっていてもよい。
【0015】
野生型ＡＡＶ ｐ５プロモーターは、
（ａ）ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１結合部位と、
（ｂ）ＹＹ１－６０結合部位と、
（ｃ）ＴＡＴＡボックスと、
（ｄ）ＡＡＶ Ｒｅｐ結合部位と、
（ｅ）ｔｒｓエレメントと、
（ｆ）ＹＹ１＋１結合部位と、を含む。
好ましくは、本発明の第１および第２のＣＡＲＥエレメントにおけるＡＡＶ ｐ５プロモーターは、それぞれ独立して、上記（ａ）～（ｆ）のうちの１、２、３、４、５または６個を含み、より好ましくは、（ａ）～（ｆ）のうちの４～６または５～６個を含み、最も好ましくは、上記（ａ）～（ｆ）の全てを含む。ｐ５プロモーターに存在する場合、（ａ）～（ｆ）のそれぞれは、上記の順序（５'－３'）であることが好ましい。
（ａ）ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１結合部位と、
（ｂ）ＹＹ１－６０結合部位と、
（ｃ）ＴＡＴＡボックスと、
（ｄ）ＡＡＶ Ｒｅｐ結合部位と、
（ｅ）ｔｒｓエレメントと、
（ｆ）ＹＹ１＋１結合部位と、を含む。
好ましくは、本発明の第１および第２のＣＡＲＥエレメントにおけるＡＡＶ ｐ５プロモーターは、それぞれ独立して、上記（ａ）～（ｆ）のうちの１、２、３、４、５または６個を含み、より好ましくは、（ａ）～（ｆ）のうちの４～６または５～６個を含み、最も好ましくは、上記（ａ）～（ｆ）の全てを含む。ｐ５プロモーターに存在する場合、（ａ）～（ｆ）のそれぞれは、上記の順序（５'－３'）であることが好ましい。
【0016】
野生型ＡＡＶ ｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ７８ポリペプチドおよびＲｅｐ６８ポリペプチドの発現を促進する。ｐ５プロモーターは、野生型ｒｅｐ遺伝子の５'末端に位置する。野生型ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列：
を有する。
【化1】
【0017】
上記配列において、ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１結合部位、ＹＹ１－６０結合部位、ＴＡＴＡボックス、ＡＡＶ Ｒｅｐ結合部位およびＹＹ１＋１結合部位に、この順で下線を付している。ｔｒｓエレメントは、ＹＹ１＋１結合部位内にある。コアプロモーター配列は太字で強調されている。
【0018】
本発明に用いられるＣＡＲＥエレメントにおいて、ｐ５プロモーターは、一般的に、機能的ｐ５プロモーターである。本明細書において、「機能的ｐ５プロモーター」という用語は、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその変異体からなるヌクレオチド配列か、または配列番号１のヌクレオチド配列またはその変異体を含むヌクレオチド配列であって、前記変異体は、配列番号１に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有しており、なおかつ、作動可能に関連した、１つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド分子の転写を促進することができるヌクレオチド配列であり、好ましくは、Ｒｅｐ７８ポリペプチドおよびＲｅｐ６８ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド分子の転写を促進することができるヌクレオチド配列を指す。ｐ５プロモーターの活性レベルは、試験用ｐ５プロモーター配列と好適な導入遺伝子とを作動可能に関連させ、この導入遺伝子の発現レベルを分析することによって判定してもよい。発現レベルが、同じ導入遺伝子と作動可能に関連したときの野生型ＡＡＶ ｐ５プロモーターの発現レベルの５％未満（好ましくは、１％未満）であれば、機能的ではないと考えられる。
【0019】
ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１は、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）ロイシンジッパーファミリーのメンバーである。それは、ＤＮＡエンハンサーボックス応答エレメントに結合する、偏在的に発現した転写因子である。ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１結合部位の配列は、aggtcacgtgagtg（配列番号２）である。本発明は、ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１を結合することができる、上記配列の変異体（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する変異体）を含む。ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１は、ＣＡＲＥによる増幅にとって重要とされているが、必須でなくてもよい。
【0020】
ＹＹ１（Ｙｉｎ－Ｙａｎｇ１）は、ジンクフィンガータンパク質のＧＬＩ－Ｋｒｕｐｐｅｌクラスに属する、偏在的に分布した転写因子である。このタンパク質は、多様なプロモーターの抑制および活性に関与している。ＹＹ１－６０結合部位の配列は、cgacattttである。本発明は、ＹＹ１を結合することができる、上記配列の変異体（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する変異体）を含む。ＹＹ１－６０結合部位は、ＣＡＲＥによる増幅にとって重要とされているが、必須でなくてもよい。あるいは、ＹＹ１－６０部位の代わりに、ＹＹ１＋１結合部位を用いてもよい。
【0021】
ｐ５ ＴＡＴＡボックスは、tatttaa配列を有する。ＣＡＲＥエレメント内のｐ５プロモーターのＴＡＴＡボックスは、ＣＡＲＥによる増幅に必要と考えられる。本発明は、上記配列の変異体（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する変異体）を含む。
【0022】
Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）は、Ｒｅｐ認識配列（ＲＲＳ）またはＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）としても知られている。ＡＡＶゲノムには３つのＲＢＳがある。すなわち、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）のそれぞれに１つずつあり、もう１つは、ｐ５プロモーターを含む、Ｐ５組み込み効率エレメント（Ｐ５ＩＥＥ）と称される領域にある。
【0023】
ＡＡＶ ＲＢＳは、gcccgagtgagcacgc配列（配列番号３）を有する。ＡＡＶ ＩＴＲ（ＡＡＶ－ＩＴＲ－ＲＢＳ）におけるＲＲＳの１６－ｍｅｒのコア配列は、配列番号４に示されている：５'－ＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ－３'（配列番号４）。ＡＡＶＳ１（ＡＡＶＳ１－ＲＢＳ）におけるＲＲＳの１６－ｍｅｒのコア配列は、配列番号５に示されている：５'－ＣＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣ－３'（配列番号５）。本発明は、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドを結合することができる、上記配列の変異体（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する変異体）を含み、最も好ましくは、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８ポリペプチドを結合することができる、上記配列の変異体（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する変異体）を含む。ＣＡＲＥエレメント内にＲＢＳ部位があることは、ＣＡＲＥによる増幅に必要と考えられる。
【0024】
末端分離部位（terminal resolution site：ｔｒｓ）は、エンドヌクレアーゼ活性を有するＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８の標的となり、部位特異的および鎖特異的な方法で切断される。このメカニズムにより、複製中に生成された二本鎖ＡＡＶ分子は、パッケージ可能な一本鎖ウイルスゲノムに分解される。ＡＡＶ ｐ５プロモーターにおいて、ｔｒｓエレメントは、ccattt配列を有する。本発明は、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８を結合することができる、上記配列（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する）の変異体（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する変異体）を含む。ｔｒｓエレメントは、必須である場合もある。
【0025】
ＹＹ１＋１結合部位の配列は、ctccattttである。本発明は、ＹＹ１を結合することができる、上記配列の変異体（例えば、１、２または３つのヌクレオチド置換を有する変異体）を含む。ＹＹ１＋１結合部位は、ＣＡＲＥによる増幅にとって重要とされているが、必須でなくてもよい。あるいは、ＹＹ１＋１部位の代わりに、ＹＹ１－６０結合部位を用いてもよい。
【0026】
一部の実施形態において、第１のＣＡＲＥエレメントのｐ５プロモーターは、第１のＣＡＲＥエレメントのｐ５プロモーターからｒｅｐ遺伝子が発現しないように改変されており、好ましくは、第１のＣＡＲＥエレメントのｐ５プロモーターにリプレッサー結合部位を挿入することにより、第１のＣＡＲＥエレメントのｐ５プロモーターからｒｅｐ遺伝子が発現しないように改変されている。
【0027】
他の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、異種誘導性プロモーターまたは異種抑制性プロモーターと作動可能に関連している。
【0028】
第１および／または第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ独立して、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含んでもよい。第１および第２のＣＡＲＥエレメントにおけるｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域の配列は、同じでも異なっていてもよい。本明細書において、「ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域」という用語は、ＡＡＶ ｐ５プロモーターの上流にあるＤＮＡ領域の配列に対応する配列を有する、連続したヌクレオチドの伸長を指す。
【0029】
野生型ＡＡＶ２ゲノムでは、ヌクレオチド１～１４５は、ＡＡＶの左側末端逆位反復配列（ＩＴＲ）をコードし、ヌクレオチド１９１～３２０は、ｐ５プロモーターに関連する。従って、ＡＡＶ２ゲノムにおいて、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域とは、ヌクレオチド１４６～１９０の一部または全部を含む、連続したヌクレオチドの伸長である。
【0030】
一実施形態において、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域は、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含むか、または下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からなる。
（ｉ）ＡＡＶ２ヌクレオチド１４６～１９０、またはその対応するヌクレオチドであって、異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ５）由来の対応するヌクレオチド；
（ｉｉ）（ｉ）に対して、少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の断片であって、（ｉ）の長さの少なくとも８０％、９０％または９５％である断片。
（ｉ）ＡＡＶ２ヌクレオチド１４６～１９０、またはその対応するヌクレオチドであって、異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ５）由来の対応するヌクレオチド；
（ｉｉ）（ｉ）に対して、少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の断片であって、（ｉ）の長さの少なくとも８０％、９０％または９５％である断片。
【0031】
ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域の機能は、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含まない本発明の核酸分子を対照として用いた場合に得られるＤＮＡ増幅の程度に比べて、第１のヌクレオチド配列のＤＮＡ増幅の程度を向上させることである。
【0032】
本発明において、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域は、ＡＡＶ ｐ５プロモーターの上流（５'）にあり、ＡＡＶ ｐ５プロモーターに作動可能に連結している。好ましくは、ｐｒｅ－ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域は、ＡＡＶ ｐ５プロモーターに連続的に結合している。
ＡＡＶ ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分、例えば、atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccc（配列番号２４）
を含んでもよい。
ＡＡＶ ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分、例えば、atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccc（配列番号２４）
を含んでもよい。
【0033】
上記配列は、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３２１～５４１（すなわち、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子の２２１個のヌクレオチド）を含む。異なるＡＡＶゲノムにおけるその対応する配列を用いてもよい。
好ましくは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分は、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３２１～３５３（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３３個のヌクレオチド）、例えば、（ＡＡＶ２）atgccggggttttacgagattgtgattaaggtc（配列番号２５）からなるか、または前記ヌクレオチドを含む。異なるＡＡＶゲノムにおけるその対応する配列を用いてもよい。一部の実施形態において、ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分を含まない。
好ましくは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分は、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３２１～３５３（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３３個のヌクレオチド）、例えば、（ＡＡＶ２）atgccggggttttacgagattgtgattaaggtc（配列番号２５）からなるか、または前記ヌクレオチドを含む。異なるＡＡＶゲノムにおけるその対応する配列を用いてもよい。一部の実施形態において、ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分を含まない。
【0034】
本発明の一部の実施形態（例えば、第１のヌクレオチド配列がｒｅｐ遺伝子を含む）において、（ＣＡＲＥエレメント内の）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分は、ＡＴＧコドンを含まない（これにより、Ｒｅｐポリペプチドの発現を最小限に抑える）。例えば、ＡＴＧコドンは、ＡＴＡコドンに変異されてもよい。
【0035】
本明細書において、「ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分」という用語は、好ましくは、配列番号２４もしくは２５またはその変異体からなるヌクレオチド配列か、または配列番号２４もしくは２５またはその変異体を含むヌクレオチド配列であって、前記変異体は、配列番号２４または２５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を指す。
【0036】
一部の好ましい実施形態において、ＣＡＲＥエレメントは、下記のうちの１つからなるか、または下記のうちの１つを含む。
－配列番号６に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～３２０に対応するＡＡＶゲノムの領域：
ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgcc（配列番号６）、
－配列番号７に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１～３５３に対応するＡＡＶゲノムの領域：
gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtc（配列番号７）、
－配列番号８に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～１９０に対応するＡＡＶゲノムの領域：
ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggag（配列番号８）、
－配列番号９に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１～５４２に対応するＡＡＶゲノムの領域：
（ｐ５プロモーターに下線を引いている）、
－配列番号１０に示される、野生型ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１～３２０に対応するＡＡＶゲノムの領域：
gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgcc（配列番号１０）、
－配列番号１１に示される、野生型ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～５４２に対応するＡＡＶゲノムの領域：
Ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccg、
－配列番号１２に示される、野生型ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～３５３に対応するＡＡＶゲノムの領域：
Ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtc。
－配列番号６に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～３２０に対応するＡＡＶゲノムの領域：
ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgcc（配列番号６）、
－配列番号７に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１～３５３に対応するＡＡＶゲノムの領域：
gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtc（配列番号７）、
－配列番号８に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～１９０に対応するＡＡＶゲノムの領域：
ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggag（配列番号８）、
－配列番号９に示される、ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１～５４２に対応するＡＡＶゲノムの領域：
【化2】
－配列番号１０に示される、野生型ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１９１～３２０に対応するＡＡＶゲノムの領域：
gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgcc（配列番号１０）、
－配列番号１１に示される、野生型ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～５４２に対応するＡＡＶゲノムの領域：
Ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccg、
－配列番号１２に示される、野生型ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～３５３に対応するＡＡＶゲノムの領域：
Ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtc。
【0037】
好ましくは、第１および／または第２のＣＡＲＥエレメントは、配列番号６～１２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列またはその変異体を有する。前記変異体は、配列番号６～１２のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、アデノウイルスおよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の存在下で、第１および第２の変異体と隣接している第１のヌクレオチド配列の増幅を促進することができる。この場合、第１および第２の変異体は、どちらも同じ５'－３'の向きである。
【0038】
一部の実施形態において、第１および／または第２のＣＡＲＥエレメントは、配列番号６～１２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の機能的断片であり、前記機能的断片は、ヌクレオチド配列の長さの少なくとも８０％、９０％または９５％である。
【0039】
本明細書において、「機能的断片」とは、アデノウイルスおよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の存在下で、第１のヌクレオチド配列に第１および第２の断片と隣接しているときに、第１のヌクレオチド配列の複製を促進することができるヌクレオチドの配列であり、この場合、第１および第２の断片は、どちらも同じ５'－３'の向きである。
【0040】
どのＣＡＲＥエレメントにおいても、ＣＡＲＥエレメント内の、
（ｃ）ＴＡＴＡボックス、
（ｄ）ＡＡＶ Ｒｅｐ結合部位、および
（ｅ）ｔｒｓエレメント
の相対位置、絶対位置および／またはヌクレオチド配列は、維持されることが好ましい。また、
（ａ）ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１結合部位、
（ｂ）ＹＹ１－６０結合部位、および
（ｆ）ＹＹ１＋１結合部位
の相対位置、絶対位置および／または配列も、維持されることが好ましい。
（ｃ）ＴＡＴＡボックス、
（ｄ）ＡＡＶ Ｒｅｐ結合部位、および
（ｅ）ｔｒｓエレメント
の相対位置、絶対位置および／またはヌクレオチド配列は、維持されることが好ましい。また、
（ａ）ＭＬＴＦ／ＵＳＦ１結合部位、
（ｂ）ＹＹ１－６０結合部位、および
（ｆ）ＹＹ１＋１結合部位
の相対位置、絶対位置および／または配列も、維持されることが好ましい。
【0041】
核酸分子において、
（ａ）第１のＣＡＲＥエレメント、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列、および
（ｃ）第２のＣＡＲＥエレメント
がこの５'－３'の順に作動可能に関連するように、第１および第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ第１のヌクレオチド配列の上流および下流に配置される。
（ａ）第１のＣＡＲＥエレメント、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列、および
（ｃ）第２のＣＡＲＥエレメント
がこの５'－３'の順に作動可能に関連するように、第１および第２のＣＡＲＥエレメントは、それぞれ第１のヌクレオチド配列の上流および下流に配置される。
【0042】
さらに、第１および第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きである。ＣＡＲＥエレメントの５'－３'の向きは、その自然（野生型）環境に応じて定められる。
【0043】
第１のＣＡＲＥエレメントの３'末端と第２のＣＡＲＥエレメントの５'末端との間の距離は、例えば、１～５Ｋｂ、５～１０Ｋｂ、１０～１５Ｋｂ、１５～５０Ｋｂまたは５０～１００Ｋｂであり得る。他の実施形態（例えば、目的遺伝子ＧＯＩを含むＣＡＲＥ－ＧＯＩ－ＣＡＲＥカセット）において、上記距離は、５～１０００ヌクレオチド、５～５００ヌクレオチドまたは５～５０ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態において、上記距離は、１０００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満または５０ヌクレオチド未満である。他の実施形態において、上記距離は、少なくとも５０、１００または１０００ヌクレオチドである。
【0044】
第１および第２のＣＡＲＥエレメントは、同じヌクレオチド配列を有していてもよく、有していなくてもよい。
【0045】
第１のヌクレオチド配列は、連続したヌクレオチドの配列である。第１のヌクレオチド配列は、一般的に、増幅が望まれる核酸分子であればよい。
【0046】
第１のヌクレオチド配列（例えば、そのコーディング配列）は、５'－３'の向きでもよく、３'－５'の向きでもよい。すなわち、第１のＣＡＲＥエレメントの３'末端は、第１のヌクレオチド配列の３'末端に結合され得る。
【0047】
一実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、目的遺伝子（ＧＯＩ）または導入遺伝子および必要に応じて作動可能に関連したプロモーター（例えば、ポリメラーゼＩＩプロモーター）をコードするヌクレオチド配列である。このプロモーターは、構成型でもよく、誘導性でもよい。
【0048】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、導入遺伝子を含む。第１のヌクレオチド配列は、コーディング配列でもよく、非コーディング配列でもよい。第１のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡでもよく、ｃＤＮＡでもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはその断片をコードする。
【0049】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、治療ポリペプチドまたはその断片をコードする。好ましい治療ポリペプチドとしては、例えば、抗体、ＣＡＲ－Ｔ分子、ｓｃＦＶ、ＢｉＴＥｓ、ＤＡＲＰｉｎｓおよびＴ細胞受容体が挙げられる。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ＤＲＤ１などのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ヒトの視覚または網膜機能に関与する遺伝子の機能的コピーであり、例えば、ＲＰＥ６５またはＲＥＰの機能的コピーである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ヒトの血液産生に関与する遺伝子の機能的コピーであるか、または第ＩＸ因子などの血液成分であるか、またはβおよびαサラセミアもしくは鎌形赤血球貧血に関与するものである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）またはアデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）におけるものなどの免疫機能に関与する遺伝子の機能的コピーである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、細胞の増殖を増加／減少させるタンパク質、例えば、増殖因子受容体である。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、イオンチャネルポリペプチドである。一部の好ましい実施形態では、治療ポリペプチドは、免疫チェックポイント分子である。好ましくは、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ１またはＧＩＴＲである。
【0050】
一部の好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａ１２またはその変異体もしくは誘導体）またはＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡをコードする。
【0051】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、哺乳動物に感染することが知られているウイルスからの遺伝子を含む。第１のヌクレオチド配列内にコードされる遺伝子は、ワクチンとして使用されてもされなくてもよいウイルス様粒子に自己集合することができるポリペプチドをコードし得る。好ましい一実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ノロウイルスカプシドタンパク質をコードする。
【0052】
他の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、自己集合して多量体複合体を形成することができ、ワクチンとしてヒトの免疫応答を誘導することが知られている１つ以上のポリペプチドをコードしてもよい。好ましい実施形態は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）五量体複合体に必要な５つの遺伝子をコードし得る。これらは、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を含む。
【0053】
他の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、自己集合してウイルス様粒子を形成せず、ワクチンとしてヒトの免疫応答を誘導することが知られているタンパク質をコードしてもよい。好ましい実施形態は、エボラＦタンパク質、インフルエンザＦおよびＨタンパク質またはコロナウイルスＳ、ＥもしくはＭタンパク質をコードし得る。
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、レトロウイルスからの遺伝子を含み、より好ましくは、レンチウイルスからの遺伝子を含む。上記遺伝子として、Ｇａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子およびＥｎｖ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、レトロウイルスからの遺伝子を含み、より好ましくは、レンチウイルスからの遺伝子を含む。上記遺伝子として、Ｇａｇ－Ｐｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子およびＥｎｖ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0054】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ラブドウイルスからの遺伝子を含み、より好ましくは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）からの遺伝子を含む。上記遺伝子として、ＶＳＶ糖タンパク質遺伝子（すなわち、ＶＳＶ Ｇ遺伝子）が挙げられるが、これに限定されない。
【0055】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、遺伝子治療ウイルスベクターを集合させるのに必要な遺伝子をコードするか、または遺伝子治療トランスファーベクターをコードするウイルスパッケージング細胞株を作製するために必要な遺伝子を含む。
【0056】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、遺伝子治療ベクターを産生するのに必要な全ての遺伝子およびトランスファーベクターをコードするウイルス産生細胞株を作製するために必要な遺伝子を含む。
【0057】
さらに他の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、レンチウイルスベクターのための１つ以上の遺伝子（例えば、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ＲＥＶ、ＶＳＶーＧ、ＲＤ１１４）、またはアデノウイルスベクターのための１つ以上の遺伝子（例えば、Ｈｅｘｏｎ、Ｆｉｂｒｅ、Ｐｅｎｔｏｎ、ｐＶＩＩまたはｐＶＩ）を含んでもよい。
【0058】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ｒｅｐ遺伝子配列および／またはｃａｐ遺伝子配列を含むか、またはその断片を含む。好ましくは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子はＡＡＶ遺伝子である。
【0059】
一部の実施形態において、第１の核酸分子または第１のヌクレオチド配列は、ｒｅｐ遺伝子配列を含まないか、またはその断片を含まない。
【0060】
他の実施形態において、第１の核酸分子または第１のヌクレオチド配列は、ｃａｐ遺伝子配列を含まないか、またはその断片を含まない。
【0061】
一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ルシフェラーゼ、ハーセプチン重鎖、ハーセプチン軽鎖、ＴＧＦβ１およびＢＭＰ２からなる群から選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【0062】
本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子をいい、前記ＯＲＦのそれぞれは、ＡＡＶ Ｒｅｐ非構造的タンパク質またはその変異体もしくは誘導体をコードする。これらのＡＡＶ Ｒｅｐ非構造的タンパク質（またはその変異体もしくは誘導体）は、ＡＡＶゲノム複製および／またはＡＡＶゲノムパッケージングに関与している。
【0063】
野生型ｒｅｐ遺伝子は、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０という３つのプロモーターを含む。異なる長さの、２つの重複するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）は、ｐ５から、およびｐ１９から、産生することができる。これらのｍＲＮＡのそれぞれは、１つのスプライスドナー部位と２つの異なるスプライスアクセプター部位とを使用して、スプライスアウトできるイントロンを含むか、またはスプライスアウトできないイントロンを含む。このように、６つの異なるｍＲＮＡが形成でき、そのうち４つのみが機能的である。イントロンを除去していない２つのｍＲＮＡ（ｐ５から転写されたものと、ｐ１９から転写されたもの）は、共通ポリアデニル化ターミネーター配列まで読み取られ、かつ、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２をそれぞれコードする。イントロンの除去および５'モストスプライスアクセプター部位の使用は、なんらかの機能的Ｒｅｐタンパク質の産生をもたらすわけではない－前記配列の残りのフレームがシフトするから正しいＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ４０タンパク質を産生できず、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ５２のターミネーターがスプライスアウトされるので、それらの正しいＣ末端を産生することもないだろう。逆に、イントロンの除去および３'スプライスアクセプターの使用は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０の正しいＣ末端を含み、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２のターミネーターをスプライスアウトすることになるだろう。従って、機能的スプライシングのみで、イントロンをまとめてスプライスアウトすることを回避する（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２を産生する）か、または３'スプライスアクセプターを使用する（Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０を産生する）かのどちらかになるだろう。その結果、重複した配列を持つ４つの異なる機能的Ｒｅｐタンパク質が、これらのプロモーターから合成できる。
【0064】
野生型ｒｅｐ遺伝子では、ｐ４０プロモーターは３'末端に位置する。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）の転写は、野生型ＡＡＶゲノムでは、このプロモーターから開始される。
【0065】
前記４つの野生型Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０である。従って、野生型ｒｅｐ遺伝子は、前記４つのＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする遺伝子である。
【0066】
本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、野生型ｒｅｐ遺伝子およびその誘導体ならびに同等の機能を有する人工のｒｅｐ遺伝子を含む。
【0067】
一実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、機能的Ｒｅｐ７８ポリペプチド、機能的Ｒｅｐ６８ポリペプチド、機能的Ｒｅｐ５２ポリペプチドおよび機能的Ｒｅｐ４０ポリペプチドをコードする。別の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、機能的Ｒｅｐ７８ポリペプチドおよび機能的Ｒｅｐ６８ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子ｐ１９プロモーターは、非機能的である。
【0068】
野生型ＡＡＶ（血清型２）ｒｅｐ遺伝子ヌクレオチド配列は、配列番号１３に示されている。一実施形態において、「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、配列番号１３に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、Ｒｅｐ７８ポリペプチド、Ｒｅｐ６８ポリペプチド、Ｒｅｐ５２ポリペプチドおよびＲｅｐ４０ポリペプチドの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を指す。
【0069】
一部の実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはｒｅｐ遺伝子は、機能的プロモーターと作動可能に関連していない。このようにして、Ｒｅｐポリペプチドの低レベルの発現が得られ、この発現レベルは、アデノウイルスの増殖を妨げないほど十分に低く、また、ＡＡＶ産生を妨げるほど細胞に対して十分な毒性を示さない。
【0070】
野生型ＡＡＶにおいて、ｒｅｐ遺伝子産物の発現は、ｐ５プロモーターおよびｐ１９プロモーターによって駆動される。
【0071】
本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子が機能的プロモーターと作動可能に関連していない」という表現は、ｒｅｐ遺伝子が機能的ｐ５プロモーターまたは機能的ｐ１９プロモーターを含まず、かつ、ｒｅｐ遺伝子がその他のいずれの機能的プロモーターとも作動可能に関連しないこと、例えば、ベースラインまたは最小限のみのｒｅｐ遺伝子の転写が得られるということを意味する。
【0072】
本発明の一部の好ましい実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の転写は、ポリメラーゼＩＩプロモーターによって駆動される。プロモーターは、誘導性でもよく、構成型でもよい。プロモーターが誘導性である場合、誘導剤（化学物質、タンパク質またはその両方）は、好ましくは、ＣＡＲＥによる増幅が誘導されると同時に添加され得る。プロモーターが構成型である場合、プロモーターの強度は、ＣＡＲＥエレメントが増幅されていないときに、ｒｅｐ遺伝子が細胞に対して毒性を示すほど強すぎてはならない。
【0073】
一部の実施形態において、複数のＣＡＲＥエレメントのうちの１つに含まれるｐ５プロモーターは、ｒｅｐ遺伝子を駆動し得る。ただし、このような構成で使用された場合、細胞は、アデノウイルスＥ１Ａを安定的にコードせず、発現もしないだろう。Ｅ１Ａタンパク質があると、Ｐ５プロモーターが活性化するため、細胞に毒性を引き起こすことが知られている。好ましい実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ＣＡＲＥエレメント内のｐ５プロモーターによって駆動されない。
【0074】
本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子をいい、前記ＯＲＦのそれぞれは、ＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質またはその変異体もしくは誘導体をコードする。これらのＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質（またはその変異体もしくは誘導体）は、ＡＡＶカプシドを形成する。
前記３つのＣａｐタンパク質は、好適な細胞に感染することができる感染性ＡＡＶウイルス粒子の産生を可能にするように機能しなければならない。前記３つのＣａｐタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３であり、これらのサイズは、一般的には、それぞれ８７ｋＤａ、７２ｋＤａおよび６２ｋＤａである。従って、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、３つのＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする遺伝子である。
前記３つのＣａｐタンパク質は、好適な細胞に感染することができる感染性ＡＡＶウイルス粒子の産生を可能にするように機能しなければならない。前記３つのＣａｐタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３であり、これらのサイズは、一般的には、それぞれ８７ｋＤａ、７２ｋＤａおよび６２ｋＤａである。従って、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、３つのＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする遺伝子である。
【0075】
野生型ＡＡＶにおいて、これらの３つのタンパク質はｐ４０プロモーターから翻訳され、１つのｍＲＮＡを形成する。このｍＲＮＡが合成されたのちに、長いイントロンまたは短いイントロンを切り取ることができ、その結果、２．３ｋｂまたは２．６ｋｂのｍＲＮＡが形成される。
【0076】
ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシドタンパク質サブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成され、前記サブユニットは、１：１：１０の比率で正二十面体対称に配置されており、推定サイズは３．９ ＭＤａである。
【0077】
本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、野生型ｃａｐ遺伝子およびその誘導体ならびに同等の機能を有する人工のｃａｐ遺伝子を含む。ＡＡＶ（血清型２）ｃａｐ遺伝子ヌクレオチド配列およびＣａｐポリペプチド配列は、それぞれ配列番号１４および１５に示されている。本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、好ましくは、配列番号１４に示される配列を有するヌクレオチド配列か、配列番号１５をコードするヌクレオチド配列か、配列番号１４に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列か、または配列番号１５をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチドおよびＶＰ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。
【0078】
ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、好ましくは、ウイルス遺伝子であるか、またはウイルス遺伝子に由来する。より好ましくは、それらはＡＡＶ遺伝子であるか、またはＡＡＶ遺伝子に由来する。一部の実施形態において、ＡＡＶは、アデノ随伴ディペンドパルボウイルスＡである。他の実施形態において、ＡＡＶは、アデノ随伴ディペンドパルボウイルスＢである。
【0079】
１１の異なるＡＡＶ血清型が公知である。前記公知の血清型は、いずれも多種多様な組織型の細胞に感染することができる。組織特異性は、カプシド血清型によって決まる。ＡＡＶは、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０または血清型１１に由来し得る。好ましくは、ＡＡＶは、血清型１、血清型２、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８または血清型９である。最も好ましくは、ＡＡＶ血清型は５である（すなわち、ＡＡＶ５）。
【0080】
ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子（およびその中のタンパク質コーディングＯＲＦのそれぞれ）は、１つ以上の異なるウイルス（例えば、２つ、３つまたは４つの異なるウイルス）に由来し得る。例えば、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２由来であってもよく、一方で、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５由来であってもよい。
【0081】
ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が系統および分離株によって異なることは、当業者に認識されている。本明細書には、そのような系統および分離株の全てに由来するこれらの遺伝子の配列が、その誘導体とともに、含まれる。
【0082】
他の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列を含まないか、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含まないか、またはＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含まない。他の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ配列を含まない。一部の実施形態において、ＣＡＲＥエレメントは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に（連続的または非連続的に）連結していない。
【0083】
好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は組み換えＡＡＶゲノムを含み、好ましくは、組み換えＡＡＶゲノムは、導入遺伝子に隣接する末端逆位反復配列を含む。
【0084】
本明細書において、「組み換えＡＡＶゲノム」という用語は、（非野生型）介在配列に隣接するＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶゲノムを指す。好ましくは、介在配列は、１００ｂｐを超える長さである。
【0085】
特に、介在配列は、上記で規定された第１のヌクレオチド配列、例えば、以下のものをコードするヌクレオチド配列であってもよい：目的遺伝子（ＧＯＩ）または導入遺伝子；治療ポリペプチドまたはその断片；ＣＲＩＳＰＲ酵素またはｓｇＲＮＡ；哺乳動物に感染することが知られているウイルスからの遺伝子；ヒトの免疫応答を誘導することが知られている１つ以上のポリペプチド；レトロウイルスまたはラブドウイルスからの遺伝子；遺伝子治療ウイルスベクターを集合させるのに必要な遺伝子をコードするか、または遺伝子治療トランスファーベクターをコードするウイルスパッケージング細胞株を作製するために必要な遺伝子；遺伝子治療ベクターを産生するのに必要な全ての遺伝子およびトランスファーベクターをコードするウイルス産生細胞株を作製するために必要な遺伝子；または、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターのための１つ以上の遺伝子。好ましくは、組み換えＡＡＶゲノムは、導入遺伝子を含む。
【0086】
組み換えＡＡＶゲノムは、好ましくは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含まない。
【0087】
本明細書において、「組み換えＡＡＶゲノム」、「ＡＡＶトランスファーベクター」および「トランスファープラスミド」という用語は、交換可能に使用される。それらは全て、介在ヌクレオチド配列に隣接する５'－および３'－ウイルス性（好ましくは、ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むベクターを指し、好ましくは、導入遺伝子に隣接する５'－および３'－ウイルス性（好ましくは、ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むベクターを指す。
【0088】
本明細書において、「作動可能に関連する」および「作動可能に連結する」という用語は、交換可能に使用される。どちらの用語も、一方のポリヌクレオチドの機能が他方のポリヌクレオチドの機能に影響を及ぼすような、単一の核酸断片上のポリヌクレオチド同士の結合を指す。これらのポリヌクレオチドは、並置、隣接または連続的に連結していてもよく、一方が他方の上流に配置されてもよい。上記用語は、一方のポリヌクレオチドの機能が他方のポリヌクレオチドの機能に影響を与え得る距離内にあるポリヌクレオチド同士の物理的接続を意味している。例えば、プロモーターがコーディングポリヌクレオチドまたは機能性ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合（すなわち、コーディングポリヌクレオチドまたは機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある場合）、プロモーターは、コーディングポリヌクレオチドまたは機能性ＲＮＡに作動可能に連結している。センスまたはアンチセンスの向きのコーディングポリヌクレオチドは、調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる。
【0089】
複数のＣＡＲＥエレメントと第１のヌクレオチド配列とは、作動可能に連結している。本明細書において、複数のＣＡＲＥエレメントおよび第１のヌクレオチド配列の文脈での「作動可能に連結する」という用語は、アデノウイルスおよびＡＡＶの存在下で、複数のＣＡＲＥエレメントが第１のヌクレオチド配列の増幅を促進するように、これらのＣＡＲＥエレメントと第１のヌクレオチド配列とが連結していることを意味する。これは、複数のＣＡＲＥエレメントが第１のヌクレオチド配列に隣接している状態で、複数のＣＡＲＥエレメントおよび第１のヌクレオチド配列が同じ核酸分子に存在すること、例えば、それらが並置、隣接または連続的に連結していることを意味する。
【0090】
好ましくは、第１のヌクレオチド配列は、１つ以上の転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメント（例えば、エンハンサー、プロモーター、ターミネーター配列など）を含む。
【0091】
第１のヌクレオチド配列は、コザック配列（翻訳開始部位）をさらに含んでもよい。
【0092】
ＣＡＲＥによる増幅については、増幅の誘導因子としてアデノウイルス（ＡＶ）を用いて、最も広範に研究されている。本発明の一部の実施形態において、ＡＶがＣＡＲＥ増幅を誘導する一方で、より多くのＡＶ粒子を生成しないようにすることが好ましい。なぜなら、生成されたＡＶ粒子は、ＣＡＲＥによる増幅中に産生されるあらゆる物質（例えば、ＡＡＶタンパク質またはワクチン粒子）を汚染する可能性があるからである。従って、ＡＶ粒子の形成を防ぐことが好ましい。
【0093】
一部の好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ＡＶ後期遺伝子ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする。本発明の他の実施形態において、本発明の核酸分子を含む細胞は、ＡＶ後期遺伝子ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする。
【0094】
好ましいＡＶ後期遺伝子ｍＲＮＡとしては、ヘキソン、ペントン、ファイバー、タンパク質ＶＩ、タンパク質ＩＩＩａ、タンパク質ＶＩＩＩ、タンパク質ＩＸ、タンパク質Ｍｕ、タンパク質ＶＩＩ、タンパク質Ｖ、タンパク質ＩＸおよびＩｖａ２のｍＲＮＡが挙げられる。最も好ましくは、ｓｈＲＮＡは、複数のＡＶ後期遺伝子を標的とする。ＡＶ後期遺伝子に対するｓｈＲＮＡの最も好ましい標的は、ＡＶ正二十面体の形成に欠かせない遺伝子（例えば 、ヘキソン）である。従って、これらの遺伝子を標的にすることにより、ＡＶ粒子の集合を抑制または防止する。
【0095】
第１のヌクレオチド配列の増幅を促進するために、１つ以上の他の因子がシスまたはトランスで供給され得る。
【0096】
特に、以下の因子のうちの１つ以上が、ポリペプチドの形態か、または前記ポリペプチドをコードする遺伝子の形態で供給され得る：（ｉ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物；（ｉｉ）１つ以上のアデノウイルス後期遺伝子産物；および／または（ｉｉｉ）１つ以上のＡＡＶ遺伝子産物。これらの遺伝子産物のそれぞれは、必要に応じて、別々の部分または部分の組み合わせとして供給されてもよく、宿主細胞にアデノウイルスまたはＡＡＶを感染させることによって供給されてもよい。
【0097】
好ましくは、アデノウイルス初期遺伝子産物は、アデノウイルスＥ１Ａ、アデノウイルスＥ１Ｂ、アデノウイルスＥ２Ａ、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡおよびアデノウイルスＥ４から選択される。アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子産物およびアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子産物は、好ましくは、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が存在する細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞または９１１細胞のように、宿主細胞ゲノムに組み込まれている細胞株）において、本発明の核酸分子を用いて供給される。好ましくは、前記１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物は、Ｅ２Ａを含む。アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子産物およびアデノウイルスＥ４遺伝子産物は、細胞株にアデノウイルスを感染させることによって供給されてもよい。
【0098】
ＡＡＶの産生に関する本発明の実施形態において、ＡＡＶのパッケージングを行うために、１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物が必要になることがある。これらの遺伝子産物は、好ましくは、宿主細胞内のアデノウイルスベクターに存在する。
【0099】
好ましくは、アデノウイルス後期遺伝子産物は、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ ３３ＫポリペプチドおよびアデノウイルスＬ４ １００Ｋポリペプチドのうちの１つ以上から選択される。Ｌ４ ２２Ｋ、Ｌ４ ３３ＫおよびＬ４ １００Ｋなどのアデノウイルス後期遺伝子産物は、別々の核酸分子に供給されてもよく、細胞株にアデノウイルスを感染させることによって供給されてもよい。本明細書には、好ましいＬ４ ２２Ｋ配列およびＬ４ ３３Ｋ配列が開示されている。好ましくは、ＡＡＶ遺伝子産物は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８である。ＡＡＶ遺伝子産物は、ＡＡＶに供給されてもよい。
【0100】
一部の実施形態において、核酸分子は、２つのＣＡＲＥエレメントまたはその断片のみを含む。他の実施形態において、核酸分子は、５、１０または２０を超えるＣＡＲＥエレメントまたはその断片を含まない。他の実施形態において、核酸分子は、核酸分子の１０００、５０００または１００００個のヌクレオチドの伸長のいずれかに、２つのＣＡＲＥエレメントまたはその断片のみを含む。他の実施形態において、核酸分子は、順方向および逆方向のどちらのＣＡＲＥエレメントも含まない。
【0101】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、宿主細胞ゲノム、例えば、ヒト染色体に組み込まれる。例えば、本発明の核酸分子の１～１００、１～２０または５～１０コピーが宿主細胞ゲノム、例えば、ヒト染色体に組み込まれてもよい。一部の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子のコピーは、宿主細胞の染色体における複数（例えば、２～１０かそれ以上）の異なる位置に組み込まれ得る。この場合、核酸分子は互いに連結されていない。
【0102】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、ヒト第１９染色体のＡＡＶＳ１部位に組み込まれる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、十分に特徴付けられた部位、すなわち、ＡＡＶＳ１部位に組み込まれるように、ヒト第１９染色体を標的とすることができる唯一の既知の真核生物ウイルスである。ＡＡＶの部位特異的な組み込みは、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８によって媒介される。後者のウイルスタンパク質は、ウイルスゲノムおよびＡＡＶＳ１部位に位置するＲＲＳを介して、ウイルスゲノムおよび第１９染色体上のＡＡＶＳ１部位の両方に結合する。ＡＡＶＳ１部位は、インサイチューハイブリダイゼーションにより、ヒト第１９染色体の１９ｑ１３．４－ｑｔｅｒにマッピングされている（Giraud, C., E. Winocour, and K. I. Berns. 1994. Site-specific integration by adeno-associated virus is directed by a cellular DNA sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10039-10043）。
【0103】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、プラスミドまたはベクターなどのエピソーム内に存在する。一部の実施形態において、プラスミドまたはベクターは、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０かそれ以上）の本発明の核酸分子を含む。これらの核酸分子は、連続していてもよく非連続であってもよい。
【0104】
一部の実施形態において、第１の核酸分子は、細胞への導入前に予め連結されていてもよく、連結されたＤＮＡ分子（例えば、プラスミドまたはベクター）が細胞の染色体に組み込まれることになる。本明細書において、「連結する」という用語は、下記構造を有するか、または含む分子を指す。
｛－［ＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］－｝n
ただし、ｎは、２以上（例えば、２または３～１０かそれ以上）とする。
｛－［ＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］－｝n
ただし、ｎは、２以上（例えば、２または３～１０かそれ以上）とする。
【0105】
例えば、上記分子は、［第１のＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］－［第２のＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］（すなわち、ｎ＝２）という構造を有し得る。このような構造は、本発明のさらなる実施形態を形成する。
他の実施形態において、核酸分子は、細胞に挿入される前または挿入されてから自己連結できるように設計されてもよい。この自己連結によって本発明の核酸の形成が容易になる。上記自己連結はＤＮＡ分子の適合性付着端に依存するので、上記自己連結を促すＤＮＡ塩基対に基づいて、ＤＮＡ分子が一方向に集合して本発明の一連の核酸分子となる。
他の実施形態において、核酸分子は、細胞に挿入される前または挿入されてから自己連結できるように設計されてもよい。この自己連結によって本発明の核酸の形成が容易になる。上記自己連結はＤＮＡ分子の適合性付着端に依存するので、上記自己連結を促すＤＮＡ塩基対に基づいて、ＤＮＡ分子が一方向に集合して本発明の一連の核酸分子となる。
【0106】
例えば、上記分子は、下記構造を有し得るか、または含み得る。
Ｘ１－｛－［ＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］－｝n－Ｘ２
ただし、ｎは、１以上（例えば、１または２～１０かそれ以上）とし、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、一本鎖ＤＮＡのストレッチであり、Ｘ１およびＸ２のヌクレオチド配列は、互いに相補的または部分的に相補的であるとする。このような構造は、本発明のさらなる実施形態を形成する。
Ｘ１－｛－［ＣＡＲＥエレメント］－［第１のヌクレオチド配列］－｝n－Ｘ２
ただし、ｎは、１以上（例えば、１または２～１０かそれ以上）とし、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、一本鎖ＤＮＡのストレッチであり、Ｘ１およびＸ２のヌクレオチド配列は、互いに相補的または部分的に相補的であるとする。このような構造は、本発明のさらなる実施形態を形成する。
【0107】
Ｘ１およびＸ２のヌクレオチド配列が互いに相補的または部分的に相補的であることで、これらの構造は、本発明の核酸分子の線状コンカテマーを形成することができる。
【0108】
一部の実施形態において、生体内での自己集合を促進するために、ＤＮＡ分子を用いて、本発明の核酸分子の構成要素（例えば、ＣＡＲＥエレメントおよび第１のヌクレオチド配列）を架橋してもよい。これは、ＣＡＲＥエレメントおよび第１のヌクレオチド配列と相同性を共有するような架橋によって達成されるため、細胞内の相同性依存的修復による本発明の核酸分子の集合に有利となる。
【0109】
本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は単離細胞であってもよく、例えば、それらは生きた動物または哺乳動物の体内には存在しない。好ましくは、宿主細胞は、哺乳類細胞である。哺乳類細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウサギ、ロバ、ウマ、ヒツジ、ウシおよび類人猿に由来する任意の臓器または組織に由来するものが挙げられる。前記細胞は、好ましくは、ヒト細胞である。前記細胞は、初代細胞であってもよく、不死化細胞であってもよい。
【0110】
好ましい細胞には、ＨＥＫ－２９３細胞株、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ｅ細胞株、ＨＥＫ－２９３ ＦＴ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ｓ細胞株、ＨＥＫ－２９３ＳＧ細胞株、ＨＥＫ－２９３ ＦＴＭ細胞株、ＨＥＫ－２９３ＳＧＧＤ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ａ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、Ｃ１２７細胞株、Ａ５４９細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＣＨＯ細胞株、マウス骨髄腫細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、９１１細胞株およびＶｅｒｏ細胞株などがある。ＨＥＫ－２９３細胞は、Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を含むように改変されているため、これらのタンパク質がヘルパープラスミドに供給されたり、本発明に用いられるアデノウイルスベクター内に存在したりする必要がない。同様に、ＰｅｒＣ６細胞および９１１細胞も、より小さな改変を含み、使用することができる。最も好ましくは、ヒト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、ＰｅｒＣ６細胞または９１１細胞である。他の好ましい細胞には、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞およびＶＥＲＯ細胞などがある。
【0111】
他の好ましい細胞には、ＨＥＫ－２９３ＡＤ細胞および浮遊ＣＨＯ－Ｘ細胞などがある。
【0112】
さらに他の実施形態において、宿主細胞は、下記（ｃ）および（ｄ）の一方または両方をさらに含む。
（ｃ）ＩＴＲと隣接した導入遺伝子を含むＡＡＶトランスファープラスミド；
（ｄ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡから選択される１つ以上の遺伝子を含む、ＡＡＶ産生のためのアデノウイルスヘルパープラスミド。
本発明の一部の実施形態において、ヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ遺伝子を含む。他の実施形態において、ヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ遺伝子を含まない。後者の場合、Ｅ２Ａ遺伝子がないと、ヘルパープラスミドに必要なＤＮＡの量がかなり減少する。このような細胞は、通常、パッケージング細胞として知られている。
（ｃ）ＩＴＲと隣接した導入遺伝子を含むＡＡＶトランスファープラスミド；
（ｄ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡから選択される１つ以上の遺伝子を含む、ＡＡＶ産生のためのアデノウイルスヘルパープラスミド。
本発明の一部の実施形態において、ヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ遺伝子を含む。他の実施形態において、ヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ遺伝子を含まない。後者の場合、Ｅ２Ａ遺伝子がないと、ヘルパープラスミドに必要なＤＮＡの量がかなり減少する。このような細胞は、通常、パッケージング細胞として知られている。
【0113】
本発明の一部の実施形態において、宿主細胞は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスを含まない。一部の実施形態（例えば、第１のヌクレオチド配列がｒｅｐ遺伝子を含む）において、宿主細胞は、Ｅ１Ａ遺伝子またはＥ１Ａ遺伝子産物を含まない。一部の実施形態（例えば、第１のヌクレオチド配列がｒｅｐ遺伝子を含む）において、宿主細胞は、Ｅ１Ｂ遺伝子またはＥ１Ｂ遺伝子産物を含まない。一部の実施形態（例えば、第１のヌクレオチド配列がアデノウイルス遺伝子を含む）において、宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物を含まない。
【0114】
一部の好ましい実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、アデノウイルスベクター内にコードされたポリペプチド（アクチベーター）によって活性化され得るプロモーターの制御下で、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。
【0115】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、（遠隔）プロモーター、例えば、宿主細胞に存在するプロモーターを転写活性化することができるポリペプチドをコードする。好ましくは、宿主細胞内のプロモーターは、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に関連する（すなわち、その発現を駆動する）プロモーターである。
【0116】
一部の実施形態において、アデノウイルスベクターは、当該アデノウイルスベクターには存在しないプロモーターを転写活性化することができるポリペプチドをコードする。
【0117】
上記アクチベーターの例としては、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６転写アクチベーター、およびｐ５３タンパク質由来のトランスアクチベータードメインが挙げられる。上記アクチベーターは、ｃａｐ遺伝子プロモーターのクメート結合部位またはテトラサイクリン結合部位に結合するようなＤＮＡ結合ドメインに連結していてもよい。これにより、アデノウイルスベクターが宿主細胞内に存在する場合にのみｃａｐ遺伝子の転写が誘導されるので、アデノウイルス製造中にＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を発現する負担が軽減される。
【0118】
本発明の核酸分子、プラスミドおよびベクター、ならびに宿主細胞は、適切な技術によって作製することができる。本発明の核酸分子およびパッケージング細胞を産生するための組み換え方法は、当技術分野において周知である（例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J., (updated 2014)）。
【0119】
本発明の核酸分子からの導入遺伝子および他の所望の遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子）の発現は、適切な分析法で分析してもよい。分析法としては、ウェスタンブロット法、ノーザンブロット法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＴ－ＱＰＣＲ法およびドットブロット法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸の増幅は、適切な検出方法、例えば、（本明細書の実施例に記載されている）ｑＰＣＲによって１ｍｌあたりのゲノムコピー数を分析し、これを細胞の染色体中の参照遺伝子座と比較することにより、測定され得る。理想的には、このような遺伝子座は、参照ゲノムあたり１または２コピーになるため、相対的なコピー数を参照すれば、増幅を比較するのに用いることができる。
【0120】
さらに別の実施形態において、本発明は、改変された宿主細胞を産生するプロセスを提供する。前記プロセスは、
（ａ）改変された宿主細胞を産生するために、宿主細胞に本発明の核酸分子を導入することを含む。
（ａ）改変された宿主細胞を産生するために、宿主細胞に本発明の核酸分子を導入することを含む。
【0121】
一部の実施形態において、核酸分子は、ベクターまたはプラスミドの形態である。一部の実施形態において、プロセスは、核酸分子が宿主細胞ゲノムに組み込まれるような条件下で行われる。
【0122】
一部の実施形態において、宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドおよび／またはＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドおよび／またはＡＡＶゲノムを発現するか、または発現することができる宿主細胞である。例えば、宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドおよび／またはＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、１つ以上の本発明の核酸分子が安定的に組み込まれた宿主細胞であってもよい。Ｒｅｐポリペプチドおよび／またはＣａｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、好適な調節エレメント、例えば、誘導性プロモーターまたは構成型プロモーターと作動可能に関連する。
【0123】
例えば、宿主細胞は、第１のヌクレオチド配列がＡＡＶ Ｒｅｐポリペプチドおよび／またはＡＡＶ Ｃａｐポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を含む、１つ以上のＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡベクターを含む宿主細胞であってもよい。Ｒｅｐポリペプチドおよび／またはＣａｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、好適な調節エレメント、例えば、誘導性プロモーターまたは構成型プロモーターと作動可能に関連する。宿主細胞は、ＡＡＶパッケージング細胞またはＡＡＶ産生細胞であり得る。
【0124】
本明細書において、細胞に１つ以上のプラスミド、ベクターまたは核酸分子を「導入する」という用語は、形質転換を含み、特に、エレクトロポレーション、接合、感染、形質導入またはトランスフェクションのいずれの形態をも含む。
【0125】
さらに別の実施形態において、本発明は、宿主細胞内で第１のヌクレオチド配列を増幅する方法を提供する。前記方法は、下記工程（ａ）を含む。
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）第１の核酸分子を含み、前記第１の核酸分子は、
（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きであり、
前記宿主細胞は、必要に応じて、
（ｉｉ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子またはアデノウイルス後期遺伝子と作動可能に関連する１つ以上のプロモーターを含む１つ以上の第２の核酸分子をさらに含み、
前記宿主細胞内に、ＡＡＶ Ｒｅｐならびに１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物および／またはアデノウイルス後期遺伝子産物が存在する条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、前記第１のヌクレオチド配列の増幅を促進する、工程。
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）第１の核酸分子を含み、前記第１の核酸分子は、
（ａ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第１のＣＡＲＥエレメントと、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターを含むか、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターからなる第２のＣＡＲＥエレメントと、を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順（５'－３'）に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントは、どちらも同じ５'－３'の向きであり、
前記宿主細胞は、必要に応じて、
（ｉｉ）１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子またはアデノウイルス後期遺伝子と作動可能に関連する１つ以上のプロモーターを含む１つ以上の第２の核酸分子をさらに含み、
前記宿主細胞内に、ＡＡＶ Ｒｅｐならびに１つ以上のアデノウイルス初期遺伝子産物および／またはアデノウイルス後期遺伝子産物が存在する条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、前記第１のヌクレオチド配列の増幅を促進する、工程。
【0126】
一部の実施形態において、前記方法は、前記工程（ａ）の前に、前記宿主細胞に前記第１の核酸分子を導入する工程をさらに含んでもよい。
【0127】
好ましくは、アデノウイルス初期遺伝子産物は、アデノウイルスＥ１Ａ、アデノウイルスＥ１Ｂ、アデノウイルスＥ２Ａ、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡおよびアデノウイルスＥ４から選択され、最も好ましくは、アデノウイルスＥ１Ａである。好ましくは、アデノウイルス後期遺伝子産物は、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ ３３ＫポリペプチドおよびアデノウイルスＬ４ １００Ｋポリペプチドのうちの１つ以上から選択される。
【0128】
一部の実施形態において、第２の核酸分子は、宿主細胞内のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに存在する。好ましくは、アデノウイルス初期遺伝子産物は、アデノウイルスＥ１Ａ、アデノウイルスＥ１Ｂ、アデノウイルスＥ２Ａ、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡおよびアデノウイルスＥ４から選択され、最も好ましくは、アデノウイルスＥ１Ａである。好ましくは、アデノウイルス後期遺伝子産物は、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋポリペプチド、アデノウイルスＬ４ ３３ＫポリペプチドおよびアデノウイルスＬ４ １００Ｋポリペプチドのうちの１つ以上から選択される。
【0129】
一部の好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、（ｉｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、（ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、または（ｉｖ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および導入遺伝子を含み、（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかは、必要に応じて、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接していてもよい。
【0130】
第１のヌクレオチド配列がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含まない一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む組み換えＡＡＶは、好ましくは、細胞に存在するか、またはプラスミドまたはベクターなどを介して細胞に導入される。第１のヌクレオチド配列がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含まない他の実施形態において、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む組み換えＡＶベクターは、好ましくは、細胞に存在するか、または細胞に導入される。ｒｅｐ遺伝子は、Ｅ３領域などの、ＡＶゲノムの他の位置に挿入されてもよい。
【0131】
一部の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子はＡＶベクター内に存在し、機能的プロモーターと作動可能に関連していない。
【0132】
さらに別の実施形態において、本発明は、導入遺伝子を含む組み換えウイルス粒子を産生するプロセスを提供する。前記プロセスは、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）導入遺伝子に隣接する５'－ウイルスＩＴＲおよび３'－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉ）本発明の核酸分子であって、第１のＣＡＲＥエレメントおよび第２のＣＡＲＥエレメントと隣接したウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子を含み、前記核酸分子は、前記宿主細胞内のエピソームプラスミドまたはエピソームベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子の増幅を促進するとともに、前記トランスファープラスミドをパッケージするのに十分なＡＶヘルパー遺伝子であって、前記ヘルパー遺伝子は、前記宿主細胞内のエピソームヘルパープラスミドに存在しているか、アデノウイルスベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、ヘルパー遺伝子と、を含み、
前記宿主細胞により、ウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子が増幅され、ウイルス粒子が集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する、工程；
（ｂ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培地から回収する工程。
（ａ）宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）導入遺伝子に隣接する５'－ウイルスＩＴＲおよび３'－ウイルスＩＴＲを含むトランスファープラスミドと、
（ｉｉ）本発明の核酸分子であって、第１のＣＡＲＥエレメントおよび第２のＣＡＲＥエレメントと隣接したウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子を含み、前記核酸分子は、前記宿主細胞内のエピソームプラスミドまたはエピソームベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子の増幅を促進するとともに、前記トランスファープラスミドをパッケージするのに十分なＡＶヘルパー遺伝子であって、前記ヘルパー遺伝子は、前記宿主細胞内のエピソームヘルパープラスミドに存在しているか、アデノウイルスベクターに存在しているか、または前記宿主細胞ゲノムに組み込まれている、ヘルパー遺伝子と、を含み、
前記宿主細胞により、ウイルスｒｅｐ遺伝子およびウイルスｃａｐ遺伝子が増幅され、ウイルス粒子が集合するような条件下で、前記宿主細胞を培養する、工程；
（ｂ）パッケージされたウイルス粒子を前記宿主細胞から回収するか、または前記培地から回収する工程。
【0133】
好ましくは、ウイルスはＡＡＶである。好ましくは、宿主細胞はウイルスパッケージング細胞である。
【0134】
本発明の核酸分子がプラスミドまたはベクター内にある場合、そのプラスミドまたはベクターは、トランスファープラスミドの導入前または導入後に、宿主細胞に導入され得る。ヘルパー遺伝子がヘルパープラスミドまたはアデノウイルスベクター内にある場合、そのヘルパープラスミドまたはアデノウイルスベクターは、トランスファープラスミドの導入前または導入後に、宿主細胞に導入され得る。上記の文脈において、「アデノウイルスベクター」という用語は、アデノウイルスを含む。
【0135】
ＡＶヘルパー遺伝子は、好ましくは、（アデノウイルス）Ｅ１Ａ遺伝子、（アデノウイルス）Ｅ１Ｂ遺伝子、（アデノウイルス）Ｅ４遺伝子および（アデノウイルス）ＶＡ遺伝子の１つ以上から選択される。本発明の一部の実施形態において、ヘルパー遺伝子は、Ｅ２Ａ遺伝子をさらに含む。他の実施形態において、ヘルパー遺伝子は、Ｅ２Ａ遺伝子を含まない。ＡＶヘルパー遺伝子は、ＡＶ後期遺伝子を含んでもよい。
【0136】
好ましくは、回収されたウイルス粒子は、その後単離される、および／または精製される。
【0137】
宿主細胞は、第１の核酸分子および存在する場合には第２の核酸分子が発現するような条件下で、（適切な培地で）培養される。宿主細胞に適した培養条件は、当技術分野において周知である（例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J., (updated 2014)）。一部の実施形態において、宿主細胞は、培地、好ましくは、液体培地に存在し得る。
【0138】
本明細書において、「増幅する」という用語は、複数のＤＮＡ分子の産生を指す。複数のＤＮＡ分子は、長さが異なる分子を含む可能性が高い。本発明の核酸分子に隣接するＤＮＡ領域は、細胞の染色体に挿入されると、本発明の核酸分子よりも低いレベル（約１０分の１）でも増幅されるかもしれない。
【0139】
複数のＤＮＡ分子のうちの個々のＤＮＡ分子は、第１および第２のＣＡＲＥエレメントまたはその断片のヌクレオチド配列の一部を含むヌクレオチド配列を有し得る。理論に束縛されるものではないが、最小増幅領域は、第１のヌクレオチド配列に隣接するＣＡＲＥエレメント内のそれぞれのＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）間に位置すると考えられることから、各ＣＡＲＥエレメントの部分および第１のヌクレオチド配列が増幅される。一部の実施形態において、ＣＡＲＥエレメント全体が増幅されてもよい。本発明の核酸分子の繰り返しコンカテマーで構成される本発明の実施形態では、ＤＮＡ増幅は、増幅プロセス中に、本発明の複数の核酸分子にわたって進行することもある。
【0140】
複数のＤＮＡ分子のうちの個々のＤＮＡ分子は、第１のヌクレオチド配列の全部または一部を含むヌクレオチド配列も有し得る。
【0141】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、１～１００コピー、好ましくは１～２０コピー、最も好ましくは５～１０コピーで細胞に存在し得る。複数の（増幅された）ＤＮＡ分子は、細胞内において５０～１０００かそれ以上の離散ＤＮＡ分子からなってもよい。達成される増幅のレベルは、第１のヌクレオチド配列の配列長、その複雑さ、および細胞内の最初の核酸分子のコピー数によって決まる。
【0142】
複数の増幅されたＤＮＡ分子は、二本鎖ＤＮＡ分子である。この分子は、一本鎖ＤＮＡを合成した後、前記一本鎖ＤＮＡの分子をアニーリングして二本鎖ＤＮＡ分子を形成することにより作製される。複数の増幅されたＤＮＡ分子は、直鎖状の染色体外ＤＮＡ分子である。
【0143】
一部の実施形態において、本発明の１つ以上の方法またはプロセスは、
増幅されたＤＮＡ分子および／またはその遺伝子産物を単離および／または精製する工程をさらに含む。
増幅されたＤＮＡ分子および／またはその遺伝子産物を単離および／または精製する工程をさらに含む。
【0144】
例えば、エタノールの存在下でシリカ樹脂を用いるＤＮＡ精製により、増幅されたＤＮＡ産物を精製してもよい。増幅されたＤＮＡ産物の遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、その特定の産物の精製に適した任意の方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィーで精製してもよい。
【0145】
一部の好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに組み込まれたＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子を含み（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、さらに、ｒｅｐ遺伝子は、第１のＣＡＲＥエレメント内のｐ５プロモーターから発現しない。
【0146】
他の好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および必要に応じてＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、宿主細胞は、宿主細胞の染色体からＥ１Ａ遺伝子（および必要に応じてＥ１Ｂ遺伝子）を発現せず、Ｅ１Ａ遺伝子（および必要に応じてＥ１Ｂ遺伝子）は、宿主細胞内で、アデノウイルスベクターから発現し、さらに、ｒｅｐ遺伝子は、必要に応じて、第１のＣＡＲＥエレメント内のｐ５プロモーターから発現する。
【0147】
他の好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、導入遺伝子（例えば、抗原、ＶＬＰタンパク質または治療タンパク質）を含み、宿主細胞は、必要に応じて、宿主細胞ゲノムに組み込まれたＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子を含む（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）。
【0148】
他の好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに組み込まれたＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子を含み、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子は、Ｅ１プロモーターから発現せず（例えば、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子は、誘導性プロモーターから発現する）、さらに、ｒｅｐ遺伝子は、第１のＣＡＲＥエレメント内のｐ５プロモーターから発現しない。
【0149】
これらの好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、必要に応じて、ＡＶ後期遺伝子ｍＲＮＡまたはＡＶ Ｅ２Ｂ遺伝子に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをさらにコードしてもよい。これらの好ましい実施形態では、本発明の核酸分子を含む細胞において、前記細胞は、必要に応じて、ＡＶ後期遺伝子ｍＲＮＡまたはＡＶ Ｅ２Ｂ遺伝子に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードしてもよい。
【0150】
ＷＯ２０１９／０２０９９２は、主要後期プロモーターにリプレッサーエレメントを挿入することにより、後期アデノウイルス遺伝子の転写を調節（例えば、阻害）できることを開示している。アデノウイルス後期遺伝子の発現の「スイッチを切る」ことで、細胞のタンパク質製造能力を所望の組み換えタンパク質またはＡＡＶ粒子の産生に転用することができる。
【0151】
しかしながら、出願人らは、その後、ＷＯ２０１９／０２０９９２に記載のように、主要後期プロモーターを抑制することによって後期アデノウイルス遺伝子を阻害すると、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれた場合、これらの遺伝子のＣＡＲＥ依存複製を阻害するという望ましくない効果があることを見出した。
【0152】
好ましくは、アデノウイルスベクターは、抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を含み、より好ましくは、前記ＭＬＰは、アデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御できる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、さらに、前記リプレッサーエレメントの１つ以上は、ＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される。
【0153】
好ましくは、核酸分子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびトランスファープラスミドは、（ｉ）宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれているか、または（ｉｉ）宿主細胞内のエピソームプラスミドまたはエピソームベクターに存在している。
【0154】
ウイルス（好ましくは、ＡＡＶ）粒子を産生するプロセスの好ましい特徴としては、下記のものがある。
－ＭＬＰ ＴＡＴＡボックスと転写＋１位との間に、前記１つ以上のリプレッサーエレメントが挿入される。
－前記リプレッサーエレメントは、リプレッサータンパク質と結合することができる。
－前記リプレッサーエレメントと結合することのできるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、アデノウイルスゲノム内でコードされる。
－前記リプレッサータンパク質は、前記ＭＬＰの制御下で転写される。
－前記リプレッサータンパク質は、テトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサーであり、好ましくは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）である。
－前記リプレッサーエレメントは、配列番号１６に示される配列を含むか、または前記配列からなるテトラサイクリンリプレッサー結合部位である。
－前記ＭＬＰのヌクレオチド配列は、配列番号１７または１８に示される配列を含むか、または前記配列からなる。
－前記リプレッサーエレメントの存在は、アデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響を及ぼさない。
－導入遺伝子は、アデノウイルス初期領域の１つに挿入され、好ましくは、トランスファープラスミドの代わりにアデノウイルスＥ１領域に挿入される。
－前記導入遺伝子は、その５'－ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含む。
－前記導入遺伝子は、治療ポリペプチドをコードする。
－前記導入遺伝子は、ウイルスタンパク質をコードし、好ましくは、細胞の中または外に集まってウイルス様粒子を産生することができるタンパク質をコードし、好ましくは、前記導入遺伝子は、ノロウイルスＶＰ１または肝炎Ｂ ＨＢｓＡＧをコードする。
－ＭＬＰ ＴＡＴＡボックスと転写＋１位との間に、前記１つ以上のリプレッサーエレメントが挿入される。
－前記リプレッサーエレメントは、リプレッサータンパク質と結合することができる。
－前記リプレッサーエレメントと結合することのできるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、アデノウイルスゲノム内でコードされる。
－前記リプレッサータンパク質は、前記ＭＬＰの制御下で転写される。
－前記リプレッサータンパク質は、テトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサーであり、好ましくは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）である。
－前記リプレッサーエレメントは、配列番号１６に示される配列を含むか、または前記配列からなるテトラサイクリンリプレッサー結合部位である。
－前記ＭＬＰのヌクレオチド配列は、配列番号１７または１８に示される配列を含むか、または前記配列からなる。
－前記リプレッサーエレメントの存在は、アデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響を及ぼさない。
－導入遺伝子は、アデノウイルス初期領域の１つに挿入され、好ましくは、トランスファープラスミドの代わりにアデノウイルスＥ１領域に挿入される。
－前記導入遺伝子は、その５'－ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含む。
－前記導入遺伝子は、治療ポリペプチドをコードする。
－前記導入遺伝子は、ウイルスタンパク質をコードし、好ましくは、細胞の中または外に集まってウイルス様粒子を産生することができるタンパク質をコードし、好ましくは、前記導入遺伝子は、ノロウイルスＶＰ１または肝炎Ｂ ＨＢｓＡＧをコードする。
【0155】
特に好ましくは、前記リプレッサーエレメントの１つ以上は、ＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される。
【0156】
２つのアミノ酸配列または核酸配列をアライメントするために利用できるアルゴリズムは、多数確立されている。典型的には、１つの配列が参照配列となり、参照配列に対して試験配列を比較すればよい。配列比較アルゴリズムは、試験配列の参照配列に対する百分率配列同一性を、指定されたプログラムパラメータに基づいて算出する。比較を目的としたアミノ酸配列または核酸配列の整合（alignment）は、例えば、コンピュータ実行アルゴリズム（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡまたはＴＦＡＳＴＡ）、またはＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムなどによって実施されてもよい。
【0157】
百分率アミノ酸配列同一性および百分率ヌクレオチド配列同一性は、ＢＬＡＳＴ法のアライメントを使用して判定してもよい（Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）。好ましくは、標準またはデフォルトの整合パラメータを用いる。
【0158】
タンパク質データベース内の類似した配列を見つけるために、標準タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を使用してもよい。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様に、ｂｌａｓｔｐは類似した局所的な領域を発見することができるように設計されている。配列の類似性が全配列に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐは全般的アライメントも報告し、これはタンパク質同定の目的には好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータを用いる。一部の場合では、「低複雑度フィルター」を外してもよい。
【0159】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施してもよい。比較を目的としたギャップアライメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389の記載に従ってギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を利用することができる。またその代わりに、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を用いて、分子間の遠隔関係を検出する累次検索を実施することができる（Altschul et al. (1997) 上記参照）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いてもよい。
【0160】
ヌクレオチド配列の比較については、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔおよびｂｌａｓｔｎを用いてこの目標を達成してもよい。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータを用いる。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間で長いアライメントを効率よく発見するよう特に設計されている。不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いて、本発明の核酸と類似しているが、同一ではないヌクレオチド配列を発見することができる。
ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似した配列を発見する。プログラムは、始めにクエリワードとの完全一致を特定する（ワードヒット）。次に、ＢＬＡＳＴプログラムはこれらのワードヒットを多段階で拡張し、最終ギャップ整合を生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。
ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似した配列を発見する。プログラムは、始めにクエリワードとの完全一致を特定する（ワードヒット）。次に、ＢＬＡＳＴプログラムはこれらのワードヒットを多段階で拡張し、最終ギャップ整合を生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。
【0161】
ＢＬＡＳＴ検索の精度を支配する重要なパラメータの１つはワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも感度が高い最も重要な理由は、より短いデフォルトワードサイズ（１１）を用いることである。このためｂｌａｓｔｎは、他の生物に由来する関連ヌクレオチド配列に対する整合発見において、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも優れている。ｂｌａｓｔｎではワードサイズを調節することが可能であり、デフォルト値より短縮して最小で７とし、検索感度を高めることができる。
【0162】
新たに導入された不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔページを用いることにより、より感度の高い検索を遂行することができる（www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html）。このページでは、Ｍａら（Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5）によって報告されたものと同様のアルゴリズムを用いる。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔは、整合拡張のシードとして完全ワードマッチを必要とするのではなく、テンプレートのより長いウインドウ内で非連続ワードを用いる。コーディングモードでは、第１および第２コドン位置での一致の発見に注目する一方で、第３位の不一致を無視することにより、第３塩基のゆれを考慮に入れる。同じワードサイズを用いた不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴにおける検索は、同じワードサイズを用いた標準的ｂｌａｓｔｎよりも感度および効率が高い。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔに固有のパラメータは、ワードサイズ：１１または１２；テンプレート：１６、１８または２１；テンプレートタイプ：コーディング（０）、非コーディング（１）または両方（２）である。
【0163】
一部の実施形態において、デフォルトパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴＰ２．５．０＋アルゴリズム（ＮＣＢＩから入手可能なものなど）を用いてもよい。他の実施形態において、ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ １による２つのタンパク質配列のＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ整合を用いたＢＬＡＳＴ Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（ＮＣＢＩから入手可能なものなど）を用いてもよい。
【0164】
本明細書において、アミノ酸配列の文脈での「配列同一性」という用語は、「配列類似性」に置き換えてもよい。「類似性」という用語は、所定の配列の規定された長さにわたって同様の物理化学的特性を有するアミノ酸残基の保存的置換を可能にするということである。類似性の割合は、適切な類似性スコアリングマトリックスで決定される。
【0165】
さらに別の実施形態において、
（ａ）第１のＣＡＲＥエレメントまたはその断片と、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）第２のＣＡＲＥエレメントまたはその断片と、を含む核酸分子であって、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントまたはそれらの断片は、どちらも同じ５'－３'の向きである、核酸分子を提供する。
（ａ）第１のＣＡＲＥエレメントまたはその断片と、
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と、
（ｃ）第２のＣＡＲＥエレメントまたはその断片と、を含む核酸分子であって、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、前記核酸分子において、この順に作動可能に関連しており、前記第１のＣＡＲＥエレメントおよび前記第２のＣＡＲＥエレメントまたはそれらの断片は、どちらも同じ５'－３'の向きである、核酸分子を提供する。
【0166】
一部の実施形態において、第１および／または第２のＣＡＲＥエレメントは、
（ｉ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分と、を含む。
（ｉ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５'部分と、を含む。
【0167】
一部の実施形態において、第１および／または第２のＣＡＲＥエレメントは、
（ｉｉｉ）ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～１９０に対応するＡＡＶゲノムの領域か、前記領域に対して、少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を有する、前記領域の変異体か、または前記領域の長さの少なくとも５０％（好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）である、前記領域の断片を含む。
（ｉｉｉ）ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド１４６～１９０に対応するＡＡＶゲノムの領域か、前記領域に対して、少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を有する、前記領域の変異体か、または前記領域の長さの少なくとも５０％（好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）である、前記領域の断片を含む。
【0168】
本願に記載された各参照文献の開示は、その全体が、参照により、本明細書中に具体的に援用される
【図面の簡単な説明】
【0169】
【図4】図４は、Ａｄ５ Ｅ２Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの使用を示し、これにより、ＭＬＰ抑制中に、Ａｄ５－Ｅ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１に感染したＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ２ ｒｅｐのＤＮＡ増幅が増加することを示す（ＤＭＳＯ処理群）。
【0170】
実施例
本発明は以下の実施例によってさらに例示されるが、別段の言及がない限り、その部および割合は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示を目的としてのみ提示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例により、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な変更および変法を行って多様な用途および条件に適合させることができる。従って、本願に提示および記載するものに加えて、本発明の多様な変法が、先行する記述により当業者に明らかになるであろう。そのような変法も付属の請求項の範囲内となることを意図している。
本発明は以下の実施例によってさらに例示されるが、別段の言及がない限り、その部および割合は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示を目的としてのみ提示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例により、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な変更および変法を行って多様な用途および条件に適合させることができる。従って、本願に提示および記載するものに加えて、本発明の多様な変法が、先行する記述により当業者に明らかになるであろう。そのような変法も付属の請求項の範囲内となることを意図している。
【0171】
実施例１：ＣＡＲＥ駆動増幅カセットの作製
レポーターカセットとして、増強緑色蛍光（ｅＧＦＰ）発現カセットを作製した。これには、ｅＧＦＰ遺伝子に隣接するコザック－シャイン・ダルガルノ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化配列（ポリ（Ａ）シグナル）が含まれていた。
図１に示すように、ｅＧＦＰ発現カセットの上流および下流に、全てのコンポーネントの５'－３'の方向性を維持して、野生型ＡＡＶ２配列（ＮＣ＿００１４０１．２）の断片をクローニングし、３つのＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを作製した。
第１の増幅カセットは、ＡＡＶ２ヌクレオチド１９１～３２０（「１９１～３２０ＣＡＲＥ」）を含んでいた。第２の増幅カセットは、ＡＡＶ２ヌクレオチド１４６～３５３（「１４６～３５３ＣＡＲＥ」）を含んでいた。第３の増幅カセットは、ＡＡＶ２ヌクレオチド１４６～５４２（「１４６～５４２ＣＡＲＥ」）を含んでいた。第３の増幅カセットは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含んでいた。このカセットでは、ＡＡＶ Ｒｅｐオープンリーディングフレーム（３２１ｎｔの位置から開始）を置換によって変異させて、ＡＴＧ開始コドンを除去した。
天然型ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域は、ｅＧＦＰ ＯＲＦの転写を開始するために、ＴＡＴＡボックス、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分離部位（ｔｒｓ）を含む、いかなる場合にも維持された。ＡＡＶ２（ＣＡＲＥ）ヌクレオチド領域を持たない「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」カセットも作製した。また、ｅＧＦＰカセットが無い「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」カセットも作製した。
レポーターカセットとして、増強緑色蛍光（ｅＧＦＰ）発現カセットを作製した。これには、ｅＧＦＰ遺伝子に隣接するコザック－シャイン・ダルガルノ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化配列（ポリ（Ａ）シグナル）が含まれていた。
図１に示すように、ｅＧＦＰ発現カセットの上流および下流に、全てのコンポーネントの５'－３'の方向性を維持して、野生型ＡＡＶ２配列（ＮＣ＿００１４０１．２）の断片をクローニングし、３つのＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを作製した。
第１の増幅カセットは、ＡＡＶ２ヌクレオチド１９１～３２０（「１９１～３２０ＣＡＲＥ」）を含んでいた。第２の増幅カセットは、ＡＡＶ２ヌクレオチド１４６～３５３（「１４６～３５３ＣＡＲＥ」）を含んでいた。第３の増幅カセットは、ＡＡＶ２ヌクレオチド１４６～５４２（「１４６～５４２ＣＡＲＥ」）を含んでいた。第３の増幅カセットは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含んでいた。このカセットでは、ＡＡＶ Ｒｅｐオープンリーディングフレーム（３２１ｎｔの位置から開始）を置換によって変異させて、ＡＴＧ開始コドンを除去した。
天然型ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域は、ｅＧＦＰ ＯＲＦの転写を開始するために、ＴＡＴＡボックス、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分離部位（ｔｒｓ）を含む、いかなる場合にも維持された。ＡＡＶ２（ＣＡＲＥ）ヌクレオチド領域を持たない「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」カセットも作製した。また、ｅＧＦＰカセットが無い「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」カセットも作製した。
【0172】
実施例２：組み込まれたＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥベクターのＣＡＲＥ指向ＤＮＡ増幅
実施例１で作製したＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡをトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、Ｒｅｐ７８トランスフェクトした細胞を計数し、４８ウェルプレートに９．６ｅ４細胞／ウェルで６通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度５０で、各細胞株の３つのウェルにＴＥＲＡ－Ｅ１（実施例３参照）を接種した。残りの３つの非感染ウェル（図２では「Ｎｏｎｅ」と表示）は、当量のＤＭＳＯのみで処理した。感染の９６時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図２に、各細胞株における、非感染サンプルに対する相対的な倍率変化を示す。
「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」および「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、それぞれＡＡＶ配列またはｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生されたＨｅＬａ細胞株を表す。
これらの結果は、複数のＣＡＲＥエレメントと隣接したｅＧＦＰ遺伝子を含む増幅カセットにおいて、有意なレベルのｅＧＦＰカセットの増幅が生じたことを示している。
実施例１で作製したＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡをトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、Ｒｅｐ７８トランスフェクトした細胞を計数し、４８ウェルプレートに９．６ｅ４細胞／ウェルで６通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度５０で、各細胞株の３つのウェルにＴＥＲＡ－Ｅ１（実施例３参照）を接種した。残りの３つの非感染ウェル（図２では「Ｎｏｎｅ」と表示）は、当量のＤＭＳＯのみで処理した。感染の９６時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図２に、各細胞株における、非感染サンプルに対する相対的な倍率変化を示す。
「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」および「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、それぞれＡＡＶ配列またはｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生されたＨｅＬａ細胞株を表す。
これらの結果は、複数のＣＡＲＥエレメントと隣接したｅＧＦＰ遺伝子を含む増幅カセットにおいて、有意なレベルのｅＧＦＰカセットの増幅が生じたことを示している。
【0173】
実施例３：Ａｄ５ Ｅ２Ｂ転写ユニットのｓｉＲＮＡノックダウンによるアデノウイルスゲノム複製の減少
ＷＯ２０１９／０２０９９２は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）にリプレッサーエレメントを挿入することにより、後期アデノウイルス遺伝子の転写を調節（例えば、阻害）できることを開示している。アデノウイルス後期遺伝子の発現の「スイッチを切る」ことで、細胞のタンパク質製造能力を所望の組み換えタンパク質またはＡＡＶ粒子の産生に転用することができる。
ＷＯ２０１９／０２０９９２に開示された方法に従って、Ｅ３領域が欠失したＭＬＰ抑制性アデノウイルス（「ＴＥＲＡ－Ｅ１」）を作製した。
Ａｄ５－Ｅ１（ウイルスＥ３領域が欠失した血清型５アデノウイルス）は、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。
ＨｅＬａＲＣ３２細胞を４８ウェル組織培養プレートに９．０ｅ４細胞／ウェルで播種し、細胞に、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡ（Kneidinger et al. 2012. Antiviral Res, 94: 195-207）、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＣ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＭＯＩ ５０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１またはＡｄ５－Ｅ１を感染させて、ＡＡＶトランスファーゲノムをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ）をトランスフェクトした。感染の４時間後にドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで細胞を処理した。感染の７２時間後に全ＤＮＡを抽出し、Ａｄ５ヘキソンに対するプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲによって定量した。
その結果を図３に示す。図３は、Ａｄ５ Ｅ２Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡにより、ＨｅＬａＲＣ３２細胞におけるＴＥＲＡ－Ｅ１ゲノムおよびＡｄ５－Ｅ１ゲノムの複製が減少することを示している。同じ原理は、ＡＶ粒子の産生を抑制するために、本発明のプロセスのＡＡＶ産生に適用し得る。
ＷＯ２０１９／０２０９９２は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）にリプレッサーエレメントを挿入することにより、後期アデノウイルス遺伝子の転写を調節（例えば、阻害）できることを開示している。アデノウイルス後期遺伝子の発現の「スイッチを切る」ことで、細胞のタンパク質製造能力を所望の組み換えタンパク質またはＡＡＶ粒子の産生に転用することができる。
ＷＯ２０１９／０２０９９２に開示された方法に従って、Ｅ３領域が欠失したＭＬＰ抑制性アデノウイルス（「ＴＥＲＡ－Ｅ１」）を作製した。
Ａｄ５－Ｅ１（ウイルスＥ３領域が欠失した血清型５アデノウイルス）は、分子クローニング法によって生成され、ＨＥＫ２９３細胞から産生された。
ＨｅＬａＲＣ３２細胞を４８ウェル組織培養プレートに９．０ｅ４細胞／ウェルで播種し、細胞に、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡ（Kneidinger et al. 2012. Antiviral Res, 94: 195-207）、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＣ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＭＯＩ ５０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１またはＡｄ５－Ｅ１を感染させて、ＡＡＶトランスファーゲノムをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ）をトランスフェクトした。感染の４時間後にドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで細胞を処理した。感染の７２時間後に全ＤＮＡを抽出し、Ａｄ５ヘキソンに対するプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲによって定量した。
その結果を図３に示す。図３は、Ａｄ５ Ｅ２Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡにより、ＨｅＬａＲＣ３２細胞におけるＴＥＲＡ－Ｅ１ゲノムおよびＡｄ５－Ｅ１ゲノムの複製が減少することを示している。同じ原理は、ＡＶ粒子の産生を抑制するために、本発明のプロセスのＡＡＶ産生に適用し得る。
【0174】
実施例４：Ａｄ５ Ｅ２Ｂ転写ユニットのｓｉＲＮＡノックダウンによる、安定したＡＡＶパッケージングＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ ｒｅｐ ＤＮＡ増幅の増加
実施例３に記載したように、ＴＥＲＡ Ｅ１組み換えアデノウイルスおよびＡｄ５ Ｅ１組み換えアデノウイルスを作製した。
ＨｅＬａＲＣ３２細胞を４８ウェル組織培養プレートに９．０ｅ４細胞／ウェルで播種し、細胞に、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡ（Kneidinger et al. 2012. Antiviral Res, 94: 195-207）、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＣ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＭＯＩ ５０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１またはＡｄ５－Ｅ１を感染させて、ＡＡＶトランスファーゲノムをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ）をトランスフェクトした。感染の４時間後にドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで細胞を処理した。感染の７２時間後に全ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子に対するプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲによって定量した。
その結果を図４に示す。図４は、Ａｄ５ Ｅ２Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡにより、ＭＬＰ抑制中に、Ａｄ５－Ｅ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１に感染したＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ２ ｒｅｐのＤＮＡ増幅が増加することを示している（ＤＭＳＯ処理群）。同じ原理は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の産生を増強するために、本発明のプロセスのＡＡＶ産生に適用し得る。
実施例３に記載したように、ＴＥＲＡ Ｅ１組み換えアデノウイルスおよびＡｄ５ Ｅ１組み換えアデノウイルスを作製した。
ＨｅＬａＲＣ３２細胞を４８ウェル組織培養プレートに９．０ｅ４細胞／ウェルで播種し、細胞に、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡ（Kneidinger et al. 2012. Antiviral Res, 94: 195-207）、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＣ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＭＯＩ ５０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１またはＡｄ５－Ｅ１を感染させて、ＡＡＶトランスファーゲノムをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ）をトランスフェクトした。感染の４時間後にドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで細胞を処理した。感染の７２時間後に全ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子に対するプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲによって定量した。
その結果を図４に示す。図４は、Ａｄ５ Ｅ２Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡにより、ＭＬＰ抑制中に、Ａｄ５－Ｅ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１に感染したＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ２ ｒｅｐのＤＮＡ増幅が増加することを示している（ＤＭＳＯ処理群）。同じ原理は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の産生を増強するために、本発明のプロセスのＡＡＶ産生に適用し得る。
【0175】
実施例５：Ａｄ５ Ｅ２Ｂ転写ユニットのｓｉＲＮＡノックダウンによる、安定したＡＡＶパッケージングＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ ｃａｐ ＤＮＡ増幅の増加
実施例３に記載したように、ＴＥＲＡ Ｅ１組み換えアデノウイルスおよびＡｄ５ Ｅ１組み換えアデノウイルスを作製した。
ＨｅＬａＲＣ３２細胞を４８ウェル組織培養プレートに９．０ｅ４細胞／ウェルで播種し、細胞に、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡ（Kneidinger et al. 2012. Antiviral Res, 94: 195-207）、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＣ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＭＯＩ ５０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１またはＡｄ５－Ｅ１を感染させて、ＡＡＶトランスファーゲノムをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ）をトランスフェクトした。感染の４時間後にドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで細胞を処理した。感染の７２時間後に全ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ２ ｃａｐに対するプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲによって定量した。
その結果を図５に示す。図５は、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡにより、ＭＬＰ抑制中に、Ａｄ５－Ｅ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１に感染したＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ２ ｃａｐのＤＮＡ増幅が増加することを示している（ＤＭＳＯ処理群）。同じ原理は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の産生を増強するために、本発明のプロセスのＡＡＶ産生に適用し得る。
実施例３に記載したように、ＴＥＲＡ Ｅ１組み換えアデノウイルスおよびＡｄ５ Ｅ１組み換えアデノウイルスを作製した。
ＨｅＬａＲＣ３２細胞を４８ウェル組織培養プレートに９．０ｅ４細胞／ウェルで播種し、細胞に、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡ（Kneidinger et al. 2012. Antiviral Res, 94: 195-207）、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＣ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＭＯＩ ５０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１またはＡｄ５－Ｅ１を感染させて、ＡＡＶトランスファーゲノムをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ）をトランスフェクトした。感染の４時間後にドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで細胞を処理した。感染の７２時間後に全ＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ２ ｃａｐに対するプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲによって定量した。
その結果を図５に示す。図５は、Ａｄ５ Ｅ２Ｂユニットを標的とするｓｉＲＮＡにより、ＭＬＰ抑制中に、Ａｄ５－Ｅ１およびＴＥＲＡ－Ｅ１に感染したＨｅＬａＲＣ３２細胞からのＡＡＶ２ ｃａｐのＤＮＡ増幅が増加することを示している（ＤＭＳＯ処理群）。同じ原理は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の産生を増強するために、本発明のプロセスのＡＡＶ産生に適用し得る。
【0176】
実施例６：２９３ＡＤ細胞株へのＲｅｐ７８のトランスフェクションによる、組み込まれたＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥベクターのＣＡＲＥ指向ＤＮＡ増幅
ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、２９３ＡＤ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡ（図６では「Ｒｅｐ」と表示）、または２．５μｇのスタッファーＤＮＡのみ（図６では「Ｓｔｕｆｆｅｒ」と表示）を細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、４８ウェルプレートに９．６ｅ４細胞／ウェルで３通り播種した。トランスフェクションの１４４時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図６に、各細胞株における、スタッファーＤＮＡランスフェクションサンプルに対する相対的な倍率変化を示す。
「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」および「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、それぞれＡＡＶ配列またはｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生された２９３ＡＤ細胞株を表す。
図６の結果は、天然ではアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子およびアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子をコードし、発現する２９３ＡＤ細胞株において有意なＣＡＲＥ指向増幅を誘導するのに、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質だけで十分であることを示している。
ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、２９３ＡＤ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡ（図６では「Ｒｅｐ」と表示）、または２．５μｇのスタッファーＤＮＡのみ（図６では「Ｓｔｕｆｆｅｒ」と表示）を細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、４８ウェルプレートに９．６ｅ４細胞／ウェルで３通り播種した。トランスフェクションの１４４時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図６に、各細胞株における、スタッファーＤＮＡランスフェクションサンプルに対する相対的な倍率変化を示す。
「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」および「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、それぞれＡＡＶ配列またはｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生された２９３ＡＤ細胞株を表す。
図６の結果は、天然ではアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子およびアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子をコードし、発現する２９３ＡＤ細胞株において有意なＣＡＲＥ指向増幅を誘導するのに、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質だけで十分であることを示している。
【0177】
実施例７：２９３ＡＤ細胞株における、組み込まれたＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥベクターのＣＡＲＥ指向ＤＮＡ増幅
ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、２９３ＡＤ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡ、または２．５μｇのスタッファーＤＮＡのみを細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、４８ウェルプレートに９．６ｅ４細胞／ウェルで６通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度５０で、各細胞株の３つのウェルにＴＥＲＡ－Ｅ１を接種した。残りの３つの非感染ウェル（図７では「Ｎｏｎｅ」と表示）は、当量のＤＭＳＯのみで処理した。
感染の９６時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図７に、各細胞株における、スタッファーのみをトランスフェクトした非感染サンプルに対する相対的な倍率変化を示す。
「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」および「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、それぞれＡＡＶ配列またはｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生された２９３ＡＤ細胞株を表す。
図７の結果は、２９３細胞株は、Ｒｅｐ７８の存在下よりも、Ｒｅｐ７８およびアデノウイルスヘルパー機能の存在下でより高いレベルのｅＧＦＰカセットのＣＡＲＥ指向増幅を達成することを示している。
ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、２９３ＡＤ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡ、または２．５μｇのスタッファーＤＮＡのみを細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、４８ウェルプレートに９．６ｅ４細胞／ウェルで６通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度５０で、各細胞株の３つのウェルにＴＥＲＡ－Ｅ１を接種した。残りの３つの非感染ウェル（図７では「Ｎｏｎｅ」と表示）は、当量のＤＭＳＯのみで処理した。
感染の９６時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図７に、各細胞株における、スタッファーのみをトランスフェクトした非感染サンプルに対する相対的な倍率変化を示す。
「ｅＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ」および「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、それぞれＡＡＶ配列またはｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生された２９３ＡＤ細胞株を表す。
図７の結果は、２９３細胞株は、Ｒｅｐ７８の存在下よりも、Ｒｅｐ７８およびアデノウイルスヘルパー機能の存在下でより高いレベルのｅＧＦＰカセットのＣＡＲＥ指向増幅を達成することを示している。
【0178】
実施例８：浮遊ＣＨＯ－Ｘ細胞における、組み込まれたＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥベクターのＣＡＲＥ指向ＤＮＡ増幅
ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計４．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、浮遊ＣＨＯ－Ｘ細胞を２４ディープウェルプレートに３ｅ６細胞／ウェルで播種した。この細胞に５．０μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｅ１２５フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．４５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび４．０５μｇのスタッファーＤＮＡ、または４．５μｇのスタッファーＤＮＡのみを細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、２４ディープウェルプレートに３ｅ６細胞／ウェルで播種した。さらに４８時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、２４ディープウェルプレートに６ｅ５細胞／ウェルで２通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度１０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１を接種したか、または、当量のＤＭＳＯのみで処理することによって細胞をモック（模擬）感染させた。感染の７２時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。図８に、各細胞株における、スタッファーのみをトランスフェクトした非感染サンプルに対する相対的な倍率変化を示す。「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生されたＣＨＯ－Ｘ細胞株を表す。
図８の結果は、大規模な産業用治療タンパク質の製造に広く使用されている非ヒト由来細胞株である、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＣＡＲＥ指向増幅が達成可能であることを示している。
ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ増幅カセットを、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードする組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。トランスフェクトされるＤＮＡの合計４．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、浮遊ＣＨＯ－Ｘ細胞を２４ディープウェルプレートに３ｅ６細胞／ウェルで播種した。この細胞に５．０μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｅ１２５フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．４５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび４．０５μｇのスタッファーＤＮＡ、または４．５μｇのスタッファーＤＮＡのみを細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、２４ディープウェルプレートに３ｅ６細胞／ウェルで播種した。さらに４８時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、２４ディープウェルプレートに６ｅ５細胞／ウェルで２通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度１０で、細胞にＴＥＲＡ－Ｅ１を接種したか、または、当量のＤＭＳＯのみで処理することによって細胞をモック（模擬）感染させた。感染の７２時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。図８に、各細胞株における、スタッファーのみをトランスフェクトした非感染サンプルに対する相対的な倍率変化を示す。「ＣＡＲＥ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ｅＧＦＰカセットを欠いていることを除いて、ＣＡＲＥ－ｅＧＦＰ－ＣＡＲＥ細胞株と同じ方法で産生されたＣＨＯ－Ｘ細胞株を表す。
図８の結果は、大規模な産業用治療タンパク質の製造に広く使用されている非ヒト由来細胞株である、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＣＡＲＥ指向増幅が達成可能であることを示している。
【0179】
実施例９：２９３ＡＤ細胞株における、組み込まれたＣＡＲＥ－ＧＯＩ－ＣＡＲＥベクターのＣＡＲＥ指向ＤＮＡ増幅
さまざまな目的遺伝子（ＧＯＩ）を、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードするＣＡＲＥ－ＧＯＩ－ＣＡＲＥ組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。それぞれのＧＯＩレポーターカセットは、異種プロモーターが無いルシフェラーゼカセットの場合を除いて、コザック-シャイン・ダルガルノ配列の上流にある異種プロモーター、当該ＧＯＩおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列（ポリ（Ａ）シグナル）を含んでいた。各レポーターカセットには、５'－３'の方向性を維持する複数のＣＡＲＥエレメントを隣接させた。
トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、２９３ＡＤ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡ（図９では「Ｒｅｐ／」と表示）、または２．５μｇのスタッファーＤＮＡのみ（図９では「Ｓｔｕｆｆｅｒ／」と表示）を細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、６ウェルプレートに８．４ｅ５細胞／ウェルで２通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度１０で、トランスフェクションにつき１つのウェルにＴＥＲＡ－Ｅ１（図９では「／ｖｉｒｕｓ」と表示）を接種した。残りの非感染ウェルは、当量のＤＭＳＯのみで処理した（図９では「／ｃｏｎｔｒｏｌ」と表示）。感染の９６時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図９に、各細胞株における、スタッファーのみをトランスフェクトした非感染サンプル（図９では「Ｓｔｕｆｆｅｒ／ｃｏｎｔｒｏｌ」と表示）に対する相対的な倍率変化を示す。
図９の結果は、異種プロモーター配列を含むカセットを含む、異なるＧＯＩカセットに対するＣＡＲＥ指向増幅の有用性を示している。
さまざまな目的遺伝子（ＧＯＩ）を、ピューロマイシン耐性およびΦＣ３１インテグラーゼａｔｔＢ認識部位をコードするＣＡＲＥ－ＧＯＩ－ＣＡＲＥ組み込みプラスミドにクローニングした（Thyagarajan et al. 2001. Mol. Cell. Biol. 21, 3926-3934）。それぞれのＧＯＩレポーターカセットは、異種プロモーターが無いルシフェラーゼカセットの場合を除いて、コザック-シャイン・ダルガルノ配列の上流にある異種プロモーター、当該ＧＯＩおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列（ポリ（Ａ）シグナル）を含んでいた。各レポーターカセットには、５'－３'の方向性を維持する複数のＣＡＲＥエレメントを隣接させた。
トランスフェクトされるＤＮＡの合計２．５μｇに対して１０：１の比率で、ΦＣ３１発現プラスミドおよび所望の組み込み構築物をトランスフェクトする１６時間前に、２９３ＡＤ細胞を６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。この細胞に０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン選択を行い、２～３週間後、Ｔ７５ｃｍ2フラスコに安定したプール細胞株を増殖させた。
ＣＡＲＥ指向増幅を試験するために、０．２５μｇのＲｅｐ７８発現プラスミドおよび２．２５μｇのスタッファーＤＮＡ（図９では「Ｒｅｐ／」と表示）、または２．５μｇのスタッファーＤＮＡのみ（図９では「Ｓｔｕｆｆｅｒ／」と表示）を細胞株にトランスフェクトする１６時間前に、細胞株を、選択せずに、６ウェルプレートに９．６ｅ５細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、トランスフェクトした細胞を計数し、６ウェルプレートに８．４ｅ５細胞／ウェルで２通り播種した。
翌日、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下、感染多重度１０で、トランスフェクションにつき１つのウェルにＴＥＲＡ－Ｅ１（図９では「／ｖｉｒｕｓ」と表示）を接種した。残りの非感染ウェルは、当量のＤＭＳＯのみで処理した（図９では「／ｃｏｎｔｒｏｌ」と表示）。感染の９６時間後に各ウェルからゲノムＤＮＡを回収し、１反応あたり１０ｎｇのＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲによって３回定量した。ｅＧＦＰ、内部宿主遺伝子ＲＰＰＨ１およびＴＥＲＴに対して、ＳＹＢＲによるｑＰＣＲを行った。内部宿主遺伝子の幾何学的正規化により、サンプルごとに相対ｅＧＦＰ値を算出した（Vandesompele et al. 2002. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3(7): RESEARCH0034）。図９に、各細胞株における、スタッファーのみをトランスフェクトした非感染サンプル（図９では「Ｓｔｕｆｆｅｒ／ｃｏｎｔｒｏｌ」と表示）に対する相対的な倍率変化を示す。
図９の結果は、異種プロモーター配列を含むカセットを含む、異なるＧＯＩカセットに対するＣＡＲＥ指向増幅の有用性を示している。
【0180】
実施例１０：重要なＣＡＲＥ領域のさらなる同定
高レベルのＤＮＡ増幅に関与するＣＡＲＥエレメントの領域を同定する目的で、追加のＣＡＲＥ－レポーター遺伝子－ＣＡＲＥプラスミドを多数作製した。
下記の表の各プラスミドは、図１に示したものと同様に、特定の「５'ＡＡＶ ｓｅｑ」配列からなる第１のＣＡＲＥエレメント、ｅＧＦＰ発現カセットおよび特定の「３'ＡＡＶ ｓｅｑ」（配列）からなる第２のＣＡＲＥエレメントを含んでいた。実施例２に記載したものと同様の方法で、ＣＡＲＥ指向増幅を評価した。
その結果、達成されるＤＮＡ増幅レベルにおいて、ｐｒｅ－ｐ５プロモーター配列（ＡＡＶ２ ｎｔ １４６～１９１）が有意な役割を果たしていること、また、第２のＣＡＲＥエレメントの配列が第１のＣＡＲＥエレメントの配列よりも重要であることが判明した。さらに、上記結果によれば、ＣＡＲＥによるＤＮＡ増幅には、ｒｅｐ－コーディング配列は必要ないことが明らかになった。
高レベルのＤＮＡ増幅に関与するＣＡＲＥエレメントの領域を同定する目的で、追加のＣＡＲＥ－レポーター遺伝子－ＣＡＲＥプラスミドを多数作製した。
下記の表の各プラスミドは、図１に示したものと同様に、特定の「５'ＡＡＶ ｓｅｑ」配列からなる第１のＣＡＲＥエレメント、ｅＧＦＰ発現カセットおよび特定の「３'ＡＡＶ ｓｅｑ」（配列）からなる第２のＣＡＲＥエレメントを含んでいた。実施例２に記載したものと同様の方法で、ＣＡＲＥ指向増幅を評価した。
その結果、達成されるＤＮＡ増幅レベルにおいて、ｐｒｅ－ｐ５プロモーター配列（ＡＡＶ２ ｎｔ １４６～１９１）が有意な役割を果たしていること、また、第２のＣＡＲＥエレメントの配列が第１のＣＡＲＥエレメントの配列よりも重要であることが判明した。さらに、上記結果によれば、ＣＡＲＥによるＤＮＡ増幅には、ｒｅｐ－コーディング配列は必要ないことが明らかになった。
【0181】
【表1】
【0182】
本願に添付する配列表は、本願明細書の一部を構成する。
追加配列の記述
配列番号１３ Ｒｅｐ核酸配列（ＡＡＶ血清型２）
配列番号１４ Ｃａｐ核酸配列（ＡＡＶ血清型２）
配列番号１５ Ｃａｐアミノ酸配列（ＡＡＶ血清型２）
配列番号１６ ＴｅｔＲ結合部位
配列番号１７ 修飾ＭＬＰ
配列番号１８ 修飾ＭＬＰ
配列番号１９ Ｌ４ ２２Ｋタンパク質名：ヒトアデノウイルスＤ血清型９（ＨＡｄＶ－９）
（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｑ５ＴＪ００）
配列番号２０ Ａｄ５ Ｌ４ ２２Ｋ
配列番号２１ Ａｄ５ Ｌ４ ２２Ｋ
配列番号２２ Ａｄ５ Ｌ４ ３３Ｋ
配列番号２３ Ａｄ５ Ｌ４ ３３Ｋ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｐ２４９４０（ＳＦ３３Ｋ＿ＡＤＥ０５）
配列表フリーテキスト
＜２１０＞ １６ ＜２２３＞ ＴｅｔＲＲ結合部位
＜２１０＞ １７ ＜２２３＞ 修飾ＭＬＰ
＜２１０＞ １８ ＜２２３＞ 修飾ＭＬＰ
追加配列の記述
配列番号１３ Ｒｅｐ核酸配列（ＡＡＶ血清型２）
配列番号１４ Ｃａｐ核酸配列（ＡＡＶ血清型２）
配列番号１５ Ｃａｐアミノ酸配列（ＡＡＶ血清型２）
配列番号１６ ＴｅｔＲ結合部位
配列番号１７ 修飾ＭＬＰ
配列番号１８ 修飾ＭＬＰ
配列番号１９ Ｌ４ ２２Ｋタンパク質名：ヒトアデノウイルスＤ血清型９（ＨＡｄＶ－９）
（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｑ５ＴＪ００）
配列番号２０ Ａｄ５ Ｌ４ ２２Ｋ
配列番号２１ Ａｄ５ Ｌ４ ２２Ｋ
配列番号２２ Ａｄ５ Ｌ４ ３３Ｋ
配列番号２３ Ａｄ５ Ｌ４ ３３Ｋ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｐ２４９４０（ＳＦ３３Ｋ＿ＡＤＥ０５）
配列表フリーテキスト
＜２１０＞ １６ ＜２２３＞ ＴｅｔＲＲ結合部位
＜２１０＞ １７ ＜２２３＞ 修飾ＭＬＰ
＜２１０＞ １８ ＜２２３＞ 修飾ＭＬＰ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】