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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-19
(54)【発明の名称】グリア芽腫を治療するための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240412BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240412BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240412BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240412BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240412BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240412BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240412BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240412BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240412BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20240412BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240412BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P35/00 ZNA
A61K47/68
A61K39/395 T
A61K35/17
A61K39/00 H
A61P35/02
C07K16/28
C12N15/13
C12N5/078
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565138
(86)(22)【出願日】2022-04-22
(85)【翻訳文提出日】2023-11-28
(86)【国際出願番号】 IB2022000243
(87)【国際公開番号】W WO2022224041
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】63/178,054
(32)【優先日】2021-04-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】518243599
【氏名又は名称】ネオティーエックス セラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100095832
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 芳徳
(74)【代理人】
【識別番号】100187850
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 芳弘
(72)【発明者】
【氏名】シャハー，ミカル
(72)【発明者】
【氏名】ネイサン，アッシャー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA03
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085DD61
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、5T4標的化剤、例えば抗5T4抗体を含むスーパー抗原コンジュゲートを使用してグリア芽腫(GBM)を治療するための方法および組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリア芽腫を有する被験体において腫瘍体積を低減する方法であって、該被験体に、有効量の5T4標的化剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項2】
グリア芽腫を有する被験体において腫瘍細胞を殺傷する方法であって、該被験体に、有効量の5T4標的化剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項3】
グリア芽腫の治療を必要とする被験体においてグリア芽腫を治療する方法であって、該被験体に、有効量の5T4標的化剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項4】
(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞の少なくとも0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%または30%が、免疫組織化学により測定する場合に5T4の細胞膜発現を示す、請求項１～３いずれか記載の方法。
【請求項5】
(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞の0.5%～10%(例えば0.5%～3%、3%～5%または5%～10%)が、免疫組織化学により測定する場合に5T4の細胞膜発現を示す、請求項１～４いずれか記載の方法。
【請求項6】
5T4標的化剤が、抗体、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、免疫細胞またはワクチンを含む、請求項１～５いずれか記載の方法。
【請求項7】
5T4標的化剤が、抗5T4抗体に共有結合されたスーパー抗原を含むスーパー抗原コンジュゲートである、請求項１～６いずれか記載の方法。
【請求項8】
スーパー抗原が、ブドウ球菌エンテロトキシンAまたはその免疫学的バリアントおよび/または断片を含む、請求項７記載の方法。
【請求項9】
スーパー抗原が、配列番号：3のアミノ酸配列あるいはその免疫学的に反応性のバリアントおよび/または断片を含む、請求項７または８記載の方法。
【請求項10】
抗5T4抗体が、5T4癌抗原に結合するFab断片を含む、請求項７～９いずれか記載の方法。
【請求項11】
抗5T4抗体が、配列番号：8のアミノ酸残基1～222を含む重鎖および配列番号：9のアミノ酸残基1～214を含む軽鎖を含む、請求項７～１０いずれか記載の方法。
【請求項12】
スーパー抗原コンジュゲートが、配列番号：8を含む第1のタンパク質鎖および配列番号：9を含む第2のタンパク質鎖を含む、請求項７～１１いずれか記載の方法。
【請求項13】
5T4標的化剤が免疫細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項14】
免疫細胞がキメラ抗原受容体(CAR)発現免疫細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
免疫細胞がT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項16】
免疫細胞がT細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項17】
被験体に免疫増強物質を投与する工程をさらに含む、請求項１～１６いずれか記載の方法。
【請求項18】
免疫増強物質がCTLA-4-またはPD-1系阻害剤である、請求項１７記載の方法。
【請求項19】
PD-1系阻害剤がPD-1またはPD-L1阻害剤である、請求項１８記載の方法。
【請求項20】
PD-1阻害剤が抗PD-1抗体である、請求項１９記載の方法。
【請求項21】
抗PD-1抗体が、ニボルマブ ペンブロリズマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、MEDI0680、ピディリズマブ、ドスタルリマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、カムレリズマブ、ピミバリマブ、チスレリズマブおよびプロルゴリマブから選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項22】
PD-L1阻害剤が抗PD-L1抗体である、請求項１９記載の方法。
【請求項23】
抗PD-L1抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、CS1001、タギタンリマブ、コシベリマブ、TQB2450、エンバフォリマブ、SHR-1316、STI-A1014、BGB-A333、MSB2311、HLX-20およびBMS-936559から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項24】
被験体がヒト被験体である、請求項１～２３いずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願についての他所参照
本願は、2021年4月22日に出願された米国仮特許出願第63/178,054号の利益および優先権を主張し、その開示は、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書に援用される。
本願は、2021年4月22日に出願された米国仮特許出願第63/178,054号の利益および優先権を主張し、その開示は、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書に援用される。
【0002】
発明の分野
本開示は一般的に、被験体においてグリア芽腫を治療するための方法および組成物に関し、より具体的に本開示は、5T4結合剤を使用してグリア芽腫を治療するための方法および組成物に関する。
本開示は一般的に、被験体においてグリア芽腫を治療するための方法および組成物に関し、より具体的に本開示は、5T4結合剤を使用してグリア芽腫を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
米国癌学会によると、米国では毎年100万人を超える人々が癌と診断される。癌は、一旦自然の制御機構に供されたが、制御されない様式で増殖し続ける癌性細胞に形質転換した細胞の制御されない増殖により生じる疾患である。
米国癌学会によると、米国では毎年100万人を超える人々が癌と診断される。癌は、一旦自然の制御機構に供されたが、制御されない様式で増殖し続ける癌性細胞に形質転換した細胞の制御されない増殖により生じる疾患である。
【0004】
多形グリア芽腫(グリア芽腫またはGBM)は、ヒトにおける最も一般的で最も攻撃的な悪性の原発性脳腫瘍である。GBMは、神経ネットワークを形成し、脳において種々の重要で活発な役割を実行する星形のグリア細胞である星状細胞の腫瘍である。GBMは高度に致死性であり、過剰な壊死および高い割合の脈管形成を特徴とする。GBMを有すると診断された患者は乏しい予後および生存率を有する。治療は典型的に、切除、化学療法または放射線を含む。医療の標準(テモゾロミド)を用いたメジアン生存は、25%未満の2年生存を有して15ヶ月である。治療なしの生存は、通常数か月のみである。さらに、Human Protein Atlasには、悪性神経膠腫は、5T4(TPBG)発現について膜性または細胞質性の免疫反応性を示さないことが記載される(world wide web proteinatlas.org /ENSG00000146242-TPBG/pathology参照)。
【0005】
癌の治療および管理において有意な進歩がなされているにもかかわらず、癌、例えばグリア芽腫を治療および管理するための新規で有効な治療のためのずっと続いているの必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【0006】
発明の概要
本発明は部分的に、グリア芽腫(GBM)腫瘍試料および細胞株が、有意なレベルの5T4発現を示す、およびGBMを治療するために5T4標的化剤(例えば抗5T4抗体を含むスーパー抗原コンジュゲート)を含む抗癌治療が使用され得るという発見に基づく。
本発明は部分的に、グリア芽腫(GBM)腫瘍試料および細胞株が、有意なレベルの5T4発現を示す、およびGBMを治療するために5T4標的化剤(例えば抗5T4抗体を含むスーパー抗原コンジュゲート)を含む抗癌治療が使用され得るという発見に基づく。
【0007】
したがって、本発明は、(i)グリア芽腫を有する被験体において腫瘍体積を低減する、(ii)グリア芽腫を有する被験体において腫瘍細胞を殺傷するおよび/または(iii)治療の必要がある被験体においてグリア芽腫を治療する方法を提供する。前述の方法は、有効量の5T4標的化剤を被験体に投与する工程を含む。
【0008】
前述の方法のいずれかのある態様において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞の少なくとも0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%または30%は、免疫組織化学により測定する場合、5T4の細胞膜発現を示す。5T4の細胞質発現に対する膜発現の存在は、5T4を癌性細胞(例えばGBM細胞)の標的化された治療のための標的として使用する場合に有意である。
【0009】
前述の方法のいずれかのある態様において、5T4標的化剤は、抗体、二重特異性T細胞エンゲージャー(engager)(BiTE)、免疫細胞またはワクチンであるかまたはそれらを含む。ある態様において、5T4標的化剤は、抗5T4抗体に共有結合されるスーパー抗原を含むスーパー抗原コンジュゲートであるかまたはそれを含む。スーパー抗原は、ブドウ球菌エンテロトキシンAまたはその免疫学的に反応性のバリアントおよび/または断片を含み得る。ある態様において、スーパー抗原は、配列番号：3のアミノ酸配列あるいはその免疫学的に反応性のバリアントおよび/または断片を含む。ある態様において、抗5T4抗体は、配列番号：8のアミノ酸残基1～458を含む重鎖および配列番号：9のアミノ酸残基1～214を含む軽鎖を含む。ある態様において、スーパー抗原コンジュゲートは、配列番号：8を含む第1のタンパク質鎖および配列番号：9を含む第2のタンパク質鎖を含む。
【0010】
前述の方法のいずれかのある態様において、5T4標的化剤は、例えばT細胞、ナチュラルキラー細胞(NK)またはナチュラルキラーT細胞(NKT)であり得る免疫細胞(例えば単離された免疫細胞)であるかまたはそれを含む。ある態様において、免疫細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現免疫細胞である。
【0011】
前述の方法のいずれかのある態様において、該方法はさらに、被験体に、例えばCTLA-4系阻害剤またはPD-1系阻害剤であり得る免疫増強物質(immunopotentiator)を投与する工程を含む。ある態様において、PD-1系阻害剤は、PD-1またはPD-L1阻害剤である。ある態様において、PD-1阻害剤は、抗PD-1抗体、例えばニボルマブ ペンブロリズマブおよびセミプリマブから選択される抗PD-1抗体である。ある態様において、PD-L1阻害剤は、抗PD-L1抗体、例えばアテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブから選択される抗PD-L1抗体である。
【0012】
本発明のこれらおよび他の局面および特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において記載される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
【図3】図3は、2つのタンパク質鎖を含む例示的なスーパー抗原コンジュゲート、ナプツモマブ・エスタフェナトクス/ANYARA(登録商標)に対応するアミノ酸配列である。第1のタンパク質鎖は、配列番号：7の残基1～458(配列番号：8も参照)を含み、配列番号：7の残基223～225に対応するGGPトリペプチドリンカーを介して共有結合される配列番号：7の残基1～222に対応するキメラ5T4 Fab重鎖および配列番号：7の残基226～458に対応するSEA/E-120スーパー抗原を含む。第2の鎖は、配列番号：7の残基459～672(配列番号：9も参照)を含み、キメラ5T4 Fab軽鎖を含む。2つのタンパク質鎖は、Fab重鎖および軽鎖の間の非共有相互作用により一緒に保持される。
【図4】図4A～4Bは、5T4(左)または対照IgG抗体(右)のいずれかに対する抗体で染色したグリア芽腫腫瘍切片の代表的な免疫組織化学(IHC)画像である(A-0.5X；B-20X)。この腫瘍切片において、20%のグリア芽腫細胞は、膜5T4発現を示した。それぞれの画像の左上のバーは、画像スケールを示す(A 2000μm；B 100μm)。図4Aのボックスは、図4Bにおいて拡大され、示された腫瘍切片中の領域を示す。
【図5】図5は、フローサイトメトリーにより測定した場合のU-138 (GBM)、U-87 (GBM) GMS-10 (GBM)、Caki-2 (RCC；高5T4発現対照)およびOVCAR-3 (卵巣癌；低5T4発現対照)細胞株上の5T4発現を示す。FCは、アイソタイプ対照抗体染色に対する5T4抗体染色の倍率変化を示す。
【図6A】図6A～Cは、グリア芽腫(GBM)細胞株に対するT細胞と組み合わせたナプツモマブ・エスタフェナトクス(NAP)の抗癌効果を示す一連の用量応答曲線である。GBM細胞を、NAP (0～10μg/ml)で48時間処理し、生存細胞を数えた。3つのGBM細胞株：U-138 (図6A)、U-87 (図6B)およびGMS-10 (図6C)についての用量応答曲線を示す。IC50(癌細胞生存能力の50%を阻害するNAP濃度)は、U-138、U-87およびGMS-10それぞれについて0.5ng/ml、0.3ng/mlおよび0.95ng/mlであることが分かった。
【図6B】図6A～Cは、グリア芽腫(GBM)細胞株に対するT細胞と組み合わせたナプツモマブ・エスタフェナトクス(NAP)の抗癌効果を示す一連の用量応答曲線である。GBM細胞を、NAP (0～10μg/ml)で48時間処理し、生存細胞を数えた。3つのGBM細胞株：U-138 (図6A)、U-87 (図6B)およびGMS-10 (図6C)についての用量応答曲線を示す。IC50(癌細胞生存能力の50%を阻害するNAP濃度)は、U-138、U-87およびGMS-10それぞれについて0.5ng/ml、0.3ng/mlおよび0.95ng/mlであることが分かった。
【発明を実施するための形態】
【0014】
詳細な説明
本発明は部分的に、グリア芽腫(GBM)腫瘍試料および細胞株が、有意なレベルの5T4発現(特に5T4の膜発現)を示す、およびGBMを治療するために5T4標的化剤(例えば抗5T4抗体を含むスーパー抗原コンジュゲート)を使用した抗癌治療が使用され得るという発見に基づく。悪性神経膠腫における5T4発現の膜および細胞質の免疫反応性は陰性であると考えられたので(Human Protein Atlas、上述参照)この発見は予期されないものであった。実施例1に記載されるように、評価したGBM組織試料の多く(80%を超える)が、膜5T4発現陽性を示したことが驚くべきことに発見された。さらに、5T4抗原は、細胞性および/または組織試料において迅速に分解することも発見された。理論に拘束されることを望まず、以前の試験は、エキソビボでのその不安定性を考慮すれば膜結合5T4の有意さを同定し得なかった可能性がある。
本発明は部分的に、グリア芽腫(GBM)腫瘍試料および細胞株が、有意なレベルの5T4発現(特に5T4の膜発現)を示す、およびGBMを治療するために5T4標的化剤(例えば抗5T4抗体を含むスーパー抗原コンジュゲート)を使用した抗癌治療が使用され得るという発見に基づく。悪性神経膠腫における5T4発現の膜および細胞質の免疫反応性は陰性であると考えられたので(Human Protein Atlas、上述参照)この発見は予期されないものであった。実施例1に記載されるように、評価したGBM組織試料の多く(80%を超える)が、膜5T4発現陽性を示したことが驚くべきことに発見された。さらに、5T4抗原は、細胞性および/または組織試料において迅速に分解することも発見された。理論に拘束されることを望まず、以前の試験は、エキソビボでのその不安定性を考慮すれば膜結合5T4の有意さを同定し得なかった可能性がある。
【0015】
したがって、一局面において、本発明は、グリア芽腫を有する被験体において腫瘍体積を低減する方法を提供する。別の局面において、本発明は、グリア芽腫を有する被験体において腫瘍細胞を殺傷する方法を提供する。別の局面において、本発明は、グリア芽腫の治療を必要とする被験体においてグリア芽腫を治療する方法を提供する。前述の局面のそれぞれにおいて、該方法は、被験体に5T4標的化剤の有効量を投与する工程を含む。
【0016】
5T4標的化剤を用いた治療に適した被験体を同定する方法も提供される。該被験体は、被験体から採取された細胞試料および/または組織試料中の膜5T4の発現(および発現レベル)に基づいて同定され得る。膜5T4の発現および発現レベルは、当該技術分野における種々の技術、例えば免疫組織化学試験により決定され得る。状況に応じて、検出可能なレベルの膜5T4を有する被験体は、5T4標的化剤を用いた治療に適切である。
【0017】
ある状況において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞の少なくとも0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%は、免疫組織化学および/または蛍光細胞分析分離装置(FACS)により測定する場合に5T4の細胞膜発現を示す。
【0018】
ある態様において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞の約0.5%～約80%、約0.5%～約60%、約0.5%～約40%、約0.5%～約20%、約0.5%～約15%、約0.5%～約10%、約0.5%～約5%、約0.5%～約4%、約0.5%～約3%、約0.5%～約2%、約0.5%～約1%、約1%～約80%、約1%～約60%、約1%～約40%、約1%～約20%、約1%～約15%、約1%～約10%、約1%～約5%、約1%～約4%、約1%～約3%、約1%～約2%、約2%～約80%、約2%～約60%、約2%～約40%、約2%～約20%、約2%～約15%、約2%～約10%、約2%～約5%、約2%～約4%、約2%～約3%、約3%～約80%、約3%～約60%、約3%～約40%、約3%～約20%、約3%～約15%、約3%～約10%、約3%～約5%、約3%～約4%、約4%～約80%、約4%～約60%、約4%～約40%、約4%～約20%、約4%～約15%、約4%～約10%、約4%～約5%、約5%～約80%、約5%～約60%、約5%～約40%、約5%～約20%、約5%～約15%、約5%～約10%、約10%～約80%、約10%～約60%、約10%～約40%、約10%～約20%、約10%～約15%、約15%～約80%、約15%～約60%、約15%～約40%、約15%～約20%、約20%～約80%、約20%～約60%、約20%～約40%、約40%～約80%、約40%～約60%または約60%～約80%は、免疫組織化学および/または蛍光細胞分析分離(FACS)により測定する場合に5T4の細胞膜発現を示す。
【0019】
腫瘍細胞により示される5T4膜発現のレベルは、例えば本明細書の実施例2に記載されるように例えばフローサイトメトリーにより測定され得る。ある態様において、5T4膜発現は、アイソタイプ対照に対する抗5T4抗体の腫瘍細胞への結合における倍率増加(倍率変化またはFCとも称される)として定量化される。例えば、ある態様において、例えばフローサイトメトリーにより測定した場合に、アイソタイプ対照に対する抗5T4抗体の腫瘍細胞への結合において、約1.5倍増加、約2倍増加、約2.5倍増加、約3倍増加、約4倍増加、約5倍増加、約6倍増加、約7倍増加、約8倍増加、約9倍増加、約10倍増加、約11倍増加、約12倍増加、約13倍増加、約14倍増加、約15倍増加、約16倍増加、約17倍増加、約18倍増加、約19倍増加、約20倍増加または約20倍より高い増加がある。ある態様において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞は、低5T4発現対照、例えばOVCAR-3とほぼ同じまたはそれより高いレベルの5T4の細胞膜発現を示すが、高5T4発現対照、例えばCaki-2とほぼ同じまたはそれより低いレベルの5T4の細胞膜発現を示す。
【0020】
ある態様において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞は、例えばフローサイトメトリーにより測定する場合に5T4の低い膜発現を示す。例えばある態様において、腫瘍細胞は、適切な低5T4発現対照、例えばOVCAR-3よりも低い5T4の細胞膜発現もしくはそれとほぼ同じレベルの5T4の細胞膜発現および/または適切な高5T4発現対照、例えばCaki-2よりも低い5T4の細胞膜発現を示す。
【0021】
ある態様において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞は、例えばフローサイトメトリーにより測定する場合、5T4の中程度の膜発現を示す。例えば、ある態様において、腫瘍細胞は、適切な低5T4発現対照、例えばOVCAR-3よりも高い5T4の細胞膜発現および/または適切な高5T4発現対照、例えばCaki-2よりも低い5T4の細胞膜発現を示す。
【0022】
ある態様において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞は、例えばフローサイトメトリーにより測定する場合、高い5T4の膜発現を示す。例えば、ある態様において、腫瘍細胞は、適切な高5T4発現対照、例えばCaki-2よりも高い5T4の細胞膜発現もしくはそれとほぼ同じレベルの5T4の細胞膜発現および/または適切な低5T4発現対照、例えばOVCAR-3よりも高い5T4の細胞膜発現を示す。
【0023】
ある態様において、(i)被験体中の腫瘍細胞、(ii)被験体中の腫瘍中の腫瘍細胞および/または(iii)被験体由来の腫瘍試料(例えば腫瘍組織試料)中の腫瘍細胞は、例えばフローサイトメトリーにより測定する場合、グリア芽腫細胞株よりも低いレベル、それとほぼ同じレベルまたはそれよりも高いレベルの5T4膜発現を示す。ある態様において、グリア芽腫細胞株は、U-138、U87またはGMS-10である。
【0024】
前述の方法のいずれかのある態様において、5T4標的化剤は、抗体、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、免疫細胞(例えばT細胞、例えばCAR-T細胞)またはワクチンであるかまたはそれらを含む。
【0025】
ある態様において、5T4標的化剤は、癌幹細胞を除去しないかまたはそうでなければ癌幹細胞を阻害しない。ある態様において、5T4標的化剤は、癌幹細胞を除去するかまたはそうでなければ癌幹細胞を阻害することにより、被験体におけるグリア芽腫の治療を主には媒介しない。
【0026】
本発明の種々の特徴および局面を、以下により詳細に記載する。
【0027】
I. 定義
そうではないと定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的で、以下の用語を下に定義する。
そうではないと定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的で、以下の用語を下に定義する。
【0028】
本明細書で使用する場合、用語「a」または「an」は1つ以上を意味し得る。例えば、「スーパー抗原および免疫細胞(a superantigen and an immune cell)による治療」などの記述は、1つのスーパー抗原および1つの免疫細胞による；1つより多くのスーパー抗原および1つの免疫細胞による；1つのスーパー抗原および1つより多くの免疫細胞による；または1つより多くのスーパー抗原および1つより多くの免疫細胞による治療を意味し得る。
【0029】
本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「抗体」は、インタクトな抗体(例えば、インタクトなモノクローナル抗体)または抗体の抗原結合断片、例えば最適化された、遺伝子工学で作り変えられたまたは化学的にコンジュゲートされたインタクトな抗体または抗体の抗原結合断片(例えば、完全ヒト抗体、半合成抗体または完全合成抗体を含むファージディスプレー抗体)を意味すると理解される。最適化された抗体の例は、アフィニティ成熟抗体である。遺伝子工学で作り変えられた抗体の例は、Fc最適化抗体、免疫原性を低減するように遺伝子工学で作り変えられ抗体および多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)である。抗原結合断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、一本鎖抗体(例えば、scFv)、ミニボディおよびダイアボディが挙げられる。毒素部分にコンジュゲートされた抗体は、化学的にコンジュゲートされた抗体の例である。
【0030】
本明細書で使用する場合、用語「癌」および「癌性」は、典型的に制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的な状態を意味すると理解される。癌の例としては、限定されないが、黒色腫、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ球の悪性疾患が挙げられる。癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌(例えば、上皮扁平上皮細胞癌(epithelial squamous cell cancer))、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌種(squamous carcinoma)、腹膜の癌、肝細胞癌、胃または胃(gastric or stomach)癌、例えば胃腸癌、膵癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、骨癌、脳癌、網膜芽腫、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎(kidney or renal)癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、ならびに頭部頸部癌、歯肉または舌(gum or tongue)癌が挙げられる。癌は癌または癌性細胞を含み、例えば癌は、複数の個々の癌または癌性細胞、例えば白血病、または複数の関連のある癌もしくは癌性細胞を含む腫瘍を含み得る。
【0031】
本明細書で使用する場合、用語「癌幹細胞」または「CSC」は、自己更新、多くの細胞型に分化するおよび多くの癌細胞型を生じる能力、不確定な寿命ならびに省略された細胞周期制御などの通常幹細胞に関連する特徴を有する癌細胞のサブ集団をいう。CSCは、腫瘍形成性であり、動物腫瘍モデルにおいて少数の細胞から腫瘍を形成し得る。CSCは、別のサブ集団として腫瘍中で持続し得、新たな腫瘍を生じることにより再発および転移を引き起こし得る。
【0032】
本明細書で使用する場合、用語「治療抵抗性」は、治療に応答しないかまたはもはや応答しない癌をいう。ある態様において、治療抵抗性の癌は、治療の開始前または開始時に治療に対して抵抗性であり得る。他の態様において、治療抵抗性の癌は、治療中またはその後に抵抗性になり得る。治療抵抗性の癌は抵抗性の癌とも称される。本明細書で使用する場合、用語「再発(recurrence)」または「再発(relapse)」は、以前の治療の陽性の応答(例えば腫瘍負荷の低減、腫瘍体積の低減、腫瘍転移の低減または治療に対する陽性応答を示すバイオマーカーの変化)後の、治療抵抗性の癌または治療抵抗性の癌の徴候および症状の戻りをいう。
【0033】
本明細書で使用する場合、用語「免疫原」は、免疫応答を誘発する(provoke)(引き起こす(evoke)、誘導する(induce)または引き起こす(cause))分子である。この免疫応答は、抗体産生、特定の細胞、例えば特異的免疫学的コンピテント細胞等の活性化、またはその両方を含み得る。免疫原は、限定されないが、生物由来の分子、例えばタンパク質、タンパク質のサブユニット、殺傷または不活性化された全細胞または溶解物、合成分子、ならびに生物学的および非生物学的の両方の種々の他の薬剤などの多くの種類の物質に由来し得る。本質的に任意のマクロ分子(天然に存在するマクロ分子または組み換えDNAアプローチにより産生されるマクロ分子を含む)、例えば実質的に全てのタンパク質が免疫原として働き得ることが理解される。
【0034】
本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」は、免疫応答を誘発する(引き起こす、誘導するまたは引き起こす)免疫原の能力に関する。異なる分子は異なる程度の免疫原性を有し得、別の分子と比較してより高い免疫原性を有する分子は、例えば、より低い免疫原性を有する薬剤よりも高い免疫応答を誘発(引き起こす、誘導するまたは引き起こす)し得ることが知られる。
【0035】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、本明細書で使用する場合に抗体、特異的な免疫学的コンピテント細胞またはその両方により認識される分子をいう。抗原は、多くの種類の物質、例えば限定されないが、生物由来の分子、例えば、タンパク質、タンパク質のサブユニット、核酸、脂質、殺傷または不活性化された全細胞または溶解物、合成分子、ならびに生物学的および非生物学的の両方の種々の他の薬剤などに由来し得る。
【0036】
本明細書で使用する場合、用語「抗原性」は、抗体、特異的な免疫学的コンピテント細胞またはその両方により認識される抗原の能力に関する。
【0037】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープスプレッディング(epitope spreading)」は、抗原に対して方向づけられた最初のエピトープ特異的免疫応答から抗原(分子内スプレッディング)または他の抗原(分子間スプレッディング)上の他のエピトープまでの免疫応答のエピトープ特異性の多様化をいう。エピトープスプレッディングは、腫瘍集団中の回避バリアントの可能性を低減してそのために疾患の進行に影響しながら、被験体の免疫系に、元の治療プロトコルに応答して免疫系により最初に認識されないさらなる標的エピトープを決定させる。
【0038】
本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」は、B細胞、T細胞(CD4+またはCD8+)、制御T細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、NKT細胞、NK細胞、好塩基球、好酸球または好中球などの免疫系の細胞による、刺激に対する応答をいう。いくつかの態様において、応答は特定の抗原に特異的であり(「抗原特異的応答」)、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞またはB細胞の抗原特異的受容体を介したそれらによる応答をいう。いくつかの態様において、免疫応答は、CD4+応答またはCD8+応答などのT細胞応答である。これらの細胞によるかかる応答は、例えば、細胞傷害性、増殖、サイトカインもしくはケモカイン産生、輸送または貪食作用を含み得、応答している免疫細胞の性質に依存し得る。
【0039】
本明細書で使用する場合、用語「主要組織適合性複合体」または「MHC」は、遺伝子の特定のクラスターをいい、その多くは抗原提示に関連する進化的に関連のある細胞表面タンパク質をコードし、組織適合性の重要な決定因子である。クラスI MHCまたはMHC-Iは主に、CD8+Tリンパ球(CD8+ T細胞)への抗原提示において機能する。クラスII MHCまたはMHC-IIは主に、CD4+Tリンパ球(CD4+ T細胞)への抗原提示において機能する。
【0040】
本明細書で使用する場合、用語「由来する(derived)」、例えば「由来する(derived from)」は、限定されないが、例えば細菌、ウイルスおよび真核細胞および生物などの生物学的宿主由来の野生型の分子、ならびに改変された分子、例えば化学的手段により改変されるかまたは組み換え発現系において産生される分子を含む。
【0041】
本明細書で使用する場合、用語「血清反応性(seroreactive)」、「血清反応(seroreaction)」または「血清反応性(seroreactivity)」は、分子などの薬剤が、限定されないがヒトなどの哺乳動物の血清中で抗体と反応する能力を意味すると理解される。これは、例えば抗体が薬剤を不活性化または中和するかどうかに関わらず分子に特異的な抗体および分子に結合する非特異的抗体を含む全ての種類の抗体との反応を含む。当該分野で公知であるように、異なる薬剤は、互いに対して異なる血清反応性を有し得、ここで別のものよりも低い血清反応性を有する薬剤は、例えばより少ない抗体と反応するか、および/またはより高い血清反応性を有する薬剤よりも低い抗体に対する親和性および/またはアビディティを有する。これはまた、哺乳動物、例えばヒトなどの動物において抗体免疫応答を誘発する薬剤の能力を含み得る。
【0042】
本明細書で使用する場合、用語「可溶性T細胞受容体」または「可溶性TCR」は、受容体鎖の膜貫通領域が欠失または突然変異して、細胞により発現された場合に該受容体が膜に挿入、膜を横断またはそうでなければ膜と結合しないことを除き、完全長(例えば、膜結合)受容体の鎖を含む「可溶性」T細胞受容体を意味することが理解される。可溶性T細胞受容体は、野生型受容体の細胞外ドメインまたは該ドメインの細胞外断片のみを含み得る(例えば、膜貫通および細胞質ドメインを欠く)。
【0043】
本明細書で使用する場合、用語「スーパー抗原」は、MHCクラスII分子およびT細胞受容体のVβドメインに結合することによりT細胞のサブセットを刺激し、それにより特定のVβ遺伝子セグメントを発現するT細胞を活性化する分子の部類を意味することが理解される。該用語は、野生型、天然に存在するスーパー抗原、例えば特定の細菌から単離されるかまたはその改変されない遺伝子から発現されたもの、および改変されたスーパー抗原を含み、ここで例えば、スーパー抗原をコードするDNA配列は、例えば標的化部分との融合タンパク質を産生するか、および/またはスーパー抗原の特定の特性、例えば限定されないが、そのMHCクラスII結合(例えば親和性を低減)および/またはその血清反応性、および/またはその免疫原性、および/または抗原性(例えば、その血清反応性を低減)を改変するように、例えば遺伝的に作り変えることにより改変されている。該定義は、本明細書または以下の米国特許および米国出願：米国特許第5,858,363号、第6,197,299号、第6,514,498号、第6,713,284号、第6,692,746号、第6,632,640号、第6,632,441号、第6,447,777号、第6,399,332号、第6,340,461号、第6,338,845号、第6,251,385号、第6,221,351号、第6,180,097号、第6,126,945号、第6,042,837号、第6,713,284号、第6,632,640号、第6,632,441号、第5,859,207号、第5,728,388号、第5,545,716号、第5,519,114号、第6,926,694号、第7,125,554号、第7,226,595号、第7,226,601号、第7,094,603号、第7,087,235号、第6,835,818号、第7,198,398号、第6,774,218号、第6,913,755号、第6,969,616号および第6,713,284号、米国特許出願第2003/0157113号、第2003/0124142号、第2002/0177551号、第2002/0141981号、第2002/0115190号、第2002/0051765号および第2001/0046501号、ならびにPCT国際公開番号WO/03/094846に記載される野生型および改変されたスーパー抗原ならびにその任意の免疫学的反応性バリアントおよび/または断片を含む。
【0044】
本明細書で使用する場合、用語「標的化部分」は、細胞分子、例えば細胞表面分子、好ましくは疾患特異的分子、例えば癌(または癌性)細胞上で優先的に発現される抗原に結合し得る任意の構造、分子または部分をいう。例示的な標的化部分としては、限定されないが、抗体(その抗原結合断片を含む)等、可溶性T細胞受容体、インターロイキン、ホルモンおよび成長因子が挙げられる。
【0045】
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍標的化スーパー抗原」または「TTS」または「癌標的化スーパー抗原」は、1つ以上の標的化部分と(直接的または間接的のいずれかで)共有結合する1つ以上のスーパー抗原を含む分子を意味することが理解される。
【0046】
本明細書で使用する場合、用語「T細胞受容体」は、T細胞に特異的な受容体を意味することが理解され、当該技術分野において公知の用語の理解が含まれる。該用語はまた、例えば不変のCD3鎖との複合体として細胞膜で発現される高度に可変性のαまたはβ鎖のジスルフィド結合ヘテロダイマーを含む受容体、ならびにT細胞のサブセット上でCD3との複合体として細胞膜で発現される可変性のγおよびδ鎖で作製される受容体を含む。
【0047】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」および「有効量」は、疾患または状態の治療において少なくともいくらかの効果を生じる活性剤、例えば医薬活性剤または医薬組成物の量を意味することが理解される。治療的処置のために本発明を実施するために使用される医薬活性剤(1つまたは複数)の有効量は、投与の様式、被験体の年齢、体重および一般的な健康状態により変化する。有効量は、1以上の投与、適用または用量において投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることは意図されない。
【0048】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物により治療される生物をいう。かかる生物としては好ましくは、限定されないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)が挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
【0049】
本明細書で使用する場合、用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の治療を意味することが理解される。該用語としては、(a)疾患の阻害、すなわち疾患の発症の阻止；および(b)疾患の軽減、すなわち疾患状態の後退を引き起こすこと；および(c)疾患の治療(curing)が挙げられる。治療的処置の文脈で使用する場合、用語「予防(prevent)」または「阻害(block)」は、所定の作用、行為、活性または事象を完全に予防もしくは阻害、または完全ではなく予防もしくは阻害(例えば部分的に予防または阻害)すると理解される。
【0050】
本明細書で使用する場合、用語「癌の増殖を阻害する」は、インビトロまたはインビボにおいて癌または癌性細胞の増殖速度を測定可能に遅延、停止または反転することを意味することが理解される。望ましくは、増殖速度は、細胞増殖速度を決定するための適切なアッセイを使用して決定した場合、20%、30%、50%または70%またはそれ以上だけ遅延される。典型的に、増殖速度の反転は、新形成細胞の細胞死の壊死またはアポトーシス機構を開始または促進させて達成され、新生物の収縮を生じる。
【0051】
本明細書で使用する場合、用語「バリアント(variant)」、「バリアント(variants)」、「改変される(modified)」、「改変される(altered)」、「変異される(mutated)」等は、参照のタンパク質、ペプチドまたは他の化合物とは異なるタンパク質もしくはペプチドおよび/または他の薬剤および/または化合物を意味することが理解される。この意味におけるバリアントは、以下または他の場所でより詳細に記載される。例えば、バリアントの核酸配列の変化はサイレントであり得、例えば該変化は核酸配列にコードされるアミノ酸を改変させないことがある。改変がこの型のサイレント変化に限定される場合、バリアントは参照ペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。バリアントの核酸配列の変化は、参照核酸配列にコードされるペプチドのアミノ酸配列を改変させ得る。かかる核酸変化は、以下に記載されるように、参照配列にコードされるタンパク質またはペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および/または切頭(truncation)を生じ得る。一般的に、アミノ酸配列の違いは限定されるので、参照およびバリアントの配列は、全体的に同様であり、多くの領域で同じである。バリアントおよび参照タンパク質またはペプチドは、任意の組合せで存在し得る1つ以上の置換、付加、欠失、融合および/または切頭によりアミノ酸配列において異なり得る。バリアントはまた、参照配列よりも短くなることにより、例えば末端または内部の欠失により参照タンパク質またはペプチド配列とは異なる本発明のタンパク質またはペプチドの断片であり得る。本発明のタンパク質またはペプチドの別のバリアントはまた、参照タンパク質またはペプチドと本質的に同じ機能または活性を保持するタンパク質またはペプチドを含む。バリアントはまた、(i)1つ以上のアミノ酸残基が保存されるかまたは保存されないアミノ酸残基により置換され、かかる置換されたアミノ酸残基が遺伝コードにコードされるものであり得るかまたはコードされるものであり得ないもの、あるいは(ii)1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)成熟タンパク質またはペプチドがタンパク質またはペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)などの別の化合物と融合されるもの、あるいは(iv)リーダー配列または分泌配列または成熟タンパク質またはペプチドの精製のために使用される配列などのさらなるアミノ酸が成熟タンパク質またはペプチドに融合されるものであり得る。バリアントは、突然変異誘発技術、および/または核酸、アミノ酸、細胞もしくは生物に適用されるものを含む化学的改変、融合、付加(adjunct)などの改変機構により作製され得、および/または組み換え手段により作製され得る。
【0052】
本明細書で使用する場合、用語「連続投与」および関連のある用語は、少なくとも1つの薬剤(例えばスーパー抗原コンジュゲート)と少なくとも1つのさらなる薬剤(例えば免疫細胞)の投与をいい、これらの薬剤の時差的な投与(すなわち時間をずらした)および投与量における変形を含む。これは、別の薬剤の投与の前、それと重複(部分的または完全に)、またはその後に投与される1つの薬剤を含む。また、用語「連続投与」および関連のある用語は、少なくとも1つのスーパー抗原、1つの免疫細胞ならびに1つ以上の(more or more)任意のさらなる化合物、例えばコルチコステロイド、免疫調節因子、および被験体に投与されるスーパー抗原コンジュゲートに対する潜在的な免疫反応性を低減するように設計される別の薬剤などの投与も含む。
【0053】
本明細書で使用する場合、用語「全身的な」および「全身的に」は投与の文脈において、薬剤が、限定されないが腫瘍中などの体の限局された部分のみではなく、体全体と関連する少なくとも1つの系、例えば限定されないが循環系、免疫系およびリンパ系に暴露されるような薬剤の投与を意味することが理解される。したがって、例えば全身的治療または全身的に投与される薬剤は、体全体に関連する少なくとも1つの系が、標的組織だけとは対照的に、すなわちそれとは異なって治療または薬剤に暴露される治療または薬剤である。
【0054】
本明細書で使用する場合、用語「非経口投与」は、腸を介した吸収を含まずに化合物が被験体に吸収される投与の任意の形態を含む。本発明において使用される例示的な非経口投与としては、限定されないが、筋内、静脈内、腹腔内または関節内の投与が挙げられる。
【0055】
用語「約」の使用が量的値の前にある場合、本発明は、具体的にそうではないと記載されなければ、具体的な量的値自体も含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、そうではないと示されないか推測されない限り、名目上の値から±10%の変動をいう。
【0056】
本明細書における種々の場所で、値は群または範囲で開示される。該記載は、かかる群および範囲の構成メンバーのそれぞれおよび全ての個々のサブ組合せを含むことが具体的に意図される。例えば、0～40の範囲の整数は具体的に、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39および40を個々に開示することを意図し、1～20の範囲の整数は具体的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20を個々に開示することを意図する。
【0057】
本記載を通して、組成物が具体的な構成成分を有する、含む(including)、または含む(comprising)と記載される場合、またはプロセスおよび方法が具体的な工程を有する、含むまたは含むと記載される場合、さらに、記載される構成成分から本質的になるかまたはそれからなる本発明の組成物があること、ならびに記載されるプロセス工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法があることが企図される。
【0058】
本願において、要素または構成成分が記載される要素または構成成分のリストに含まれるおよび/またはそれから選択されるといわれる場合、要素または構成成分が記載される要素または構成成分のいずれか1つであり得るか、あるいは要素または構成成分が記載される要素または構成成分の2つ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
【0059】
さらに、本明細書に記載される組成物または方法の要素および/または特徴は、本明細書において明示的であるか黙示的であるかのいずれであろうと、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の方法において組み合され得ることが理解されるべきである。例えば特定の化合物について参照がなされる場合、文脈からそうではないことが理解されない限り、化合物は、本発明の組成物の種々の態様において、および/または本発明の方法において使用され得る。すなわち、本願において、態様は、記載および図示される明確かつ簡潔な適用を可能にする方法で記載されかつ示されるが、態様は本教示および本発明(1つまたは複数)から逸脱することなく、種々に組み合され得るかまたは分離され得ることが意図され理解される。例えば、本明細書に記載されかつ示される全ての特徴は、本明細書に記載され、示される発明(1つまたは複数)の全局面に適用可能であり得ることが理解される。
【0060】
表現「の少なくとも1つ」は、文脈および用途からそうではないと理解されない限り、該表現の後に記載されるもののそれぞれおよび記載されるものの2つ以上の種々の組合せを個々に含むことが理解されるべきである。3つ以上の記載されるものに関する表現「および/または」は、文脈からそうではないと理解されない限り同じ意味を有すると理解されるべきである。
【0061】
それらの文法的同等物を含む用語「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」または「含む(containing)」の使用は、そうではないと具体的に記載されないかまたは文脈から理解されない限り、例えばさらなる記載されない要素または工程を排除しない開放型および非限定的であると一般的に理解されるべきである。
【0062】
工程の順序または特定の行為を行うための順序は、本発明が実行可能なままである限りは重要でないことが理解されるべきである。さらに2つ以上の工程または行為は同時に行われてもよい。
【0063】
任意および全ての例、または本明細書における例示的用語、例えば「など(such as)」または「含む(including)」の使用は、本発明を単によりよく説明することが意図され、特許請求されない限りは、本発明の範囲に限定を課さない。明細書における用語は、任意の特許請求されない要素を本発明の実施に必須として示すように解釈されるべきではない。
【0064】
II. 5T4標的化剤
上記されるように、本発明は部分的に、グリア芽腫組織が有意なレベルの5T4(特に、有意なレベルの膜5T4)を発現し得るという発見に基づく。結果的に、5T4標的化剤は、治療のためにグリア芽腫細胞を標的化することに使用され得る。
上記されるように、本発明は部分的に、グリア芽腫組織が有意なレベルの5T4(特に、有意なレベルの膜5T4)を発現し得るという発見に基づく。結果的に、5T4標的化剤は、治療のためにグリア芽腫細胞を標的化することに使用され得る。
【0065】
5T4は、特定の癌上で発現される72kDaの腫瘍胎児性糖タンパク質である。例えば、免疫組織化学分析により、5T4発現は、結腸直腸癌、卵巣癌、胃癌および非小細胞肺癌の乏しい予後の指標であることが示される。ヒト5T4のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アクセッション番号Z29083でGenBankにおいて利用可能である。配列分析により、5T4が、タンパク質のロイシンリッチリピート(LRR)ファミリーの一員であることが同定された。該タンパク質は、44アミノ酸の短い細胞質テイルおよび関連するシステイン含有隣接領域を有する2つのロイシンリッチリピート(LRR)領域を含む細胞外ドメインを含む。細胞外ドメイン中の7つのコンセンサスNxS/T Nグリコシル化部位の全ては、2つの高マンノース鎖および5つのシアル化された(sialylate)、少数のコアフコシル化を有する2～4アンテナ(bi- to tetra-antennary)複合体鎖を含む複合体グリカンの組合せでグリコシル化される。
【0066】
用語「5T4標的化剤」は本明細書で使用する場合、治療を5T4抗原に方向づける薬剤をいう。標的化剤は、例えば5T4に結合し得るかまたは代替的に、例えば5T4に結合するさらなる分子の生成を媒介し得る。例えば、用語5T4標的化剤は、被験体における5T4抗原に対する免疫応答の生成を媒介するワクチンを包含する。
【0067】
ある態様において、標的化剤は、5T4に結合(例えば直接結合)する。かかる態様において、標的化剤は代替的に、結合剤と称され得る。用語「結合剤」は、本明細書で使用する場合、目的の分析物(例えば5T4)に優先的または特異的に結合する薬剤をいう。用語「優先的に結合」または「特異的に結合」は、結合剤に関して使用する場合、(i)より安定に、(ii)より迅速に、(iii)より強い親和性で、(iv)より長い持続時間で、または(v)または(i)～(iv)のいずれか2つ以上の組合せで、標的分析物以外の分子と共にそれが結合する特定の標的分析物と結合(bind)および/または結合(associate)する薬剤をいう。例えば標的分析物に特異的または優先的に結合する結合剤は、例えばそれが異なる分析物に結合するよりも強い親和性、アビディティで、容易におよび/または長い持続時間で標的分析物に結合する結合ドメインである。結合剤は、表面プラスモン共鳴により測定する場合に、分析物に対して約100nM、50nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nMもしくは0.01nMまたはより強い親和性を有し得る。例えば、結合剤は、分析物に対して、約0.01nM～約100nM、約0.1nM～約100nMまたは約1nM～約100nMの範囲の親和性を有し得る。第1の標的分析物に優先的に結合する結合剤は、第2の標的分析物に優先的に結合してもしなくてもよいことが理解される。このように、「優先的な結合」は、排他的な結合を(含み得るが)必ずしも必要とはしない。
【0068】
例示的な結合剤としては、酵素(例えば基質および阻害剤に結合するもの)、抗体(例えば抗原に結合するもの)、抗原(例えば標的抗体に結合するもの)、受容体(例えばリガンドに結合するもの)、リガンド(例えば受容体に結合するもの)、核酸一本鎖ポリマー(例えば核酸分子に結合して、例えばDNA-DNA、RNA-RNAまたはDNA-RNA二本鎖を形成するもの)、および標的分析物に結合する合成分子が挙げられる。天然、合成、半合成および遺伝子的に改変されたマクロ分子が、結合剤として使用され得る。結合剤としては、生物学的結合剤、例えば抗体、アプタマー、受容体、酵素または核酸が挙げられる。
【0069】
A. 抗体
一般的に、抗体は、4つのポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質である。ポリペプチド鎖の2つは免疫グロブリン重鎖(H鎖)と称され、ポリペプチド鎖の2つは免疫グロブリン軽鎖(L鎖)と称される。免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、鎖間のジスルフィド結合により連結される。免疫グロブリン重鎖は、鎖間のジスルフィド結合により連結される。軽鎖は、1つの可変領域(VL)および1つの定常領域(CL)からなる。重鎖は、1つの可変領域(VH)および少なくとも3つの定常領域(CH1、CH2およびCH3)からなる。可変領域は、抗体の結合特異性を決定する。
一般的に、抗体は、4つのポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質である。ポリペプチド鎖の2つは免疫グロブリン重鎖(H鎖)と称され、ポリペプチド鎖の2つは免疫グロブリン軽鎖(L鎖)と称される。免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、鎖間のジスルフィド結合により連結される。免疫グロブリン重鎖は、鎖間のジスルフィド結合により連結される。軽鎖は、1つの可変領域(VL)および1つの定常領域(CL)からなる。重鎖は、1つの可変領域(VH)および少なくとも3つの定常領域(CH1、CH2およびCH3)からなる。可変領域は、抗体の結合特異性を決定する。
【0070】
それぞれの可変領域は、フレームワーク領域(FR)として知られる4つの比較的保存された領域が隣り合う、相補性決定領域(CDR)として知られる3つの超可変領域を含む。FRおよびCDRの範囲は定義されている(Kabat, E.A., et al. (1991) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, FIFTH EDITION, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；およびChothia, C. et al. (1987) J. MOL. BIOL. 196:901-917)。CDR1、CDR2およびCDR3と称される3つのCDRは、抗体結合特異性に寄与する。天然に存在する抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの遺伝子工学で作り変えられた抗体についての開始材料として使用されている。
【0071】
本明細書で使用する場合、抗体は、インタクトな抗体(例えばインタクトなモノクローナル抗体)または抗体のFc断片(例えばモノクローナル抗体のFc断片)もしくは抗体の抗原結合断片(例えばモノクローナル抗体の抗原結合断片)などのその断片、例えば改変された、遺伝子工学で作り変えられたまたは化学的にコンジュゲートされたインタクトな抗体、抗原結合断片またはFc断片を含み得る。抗原結合断片の例としては、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、一本鎖抗体(例えばscFv)、ミニボディおよびダイアボディが挙げられる。改変されたかまたは遺伝子工学で作り変えられた抗体の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体および多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)が挙げられる。化学的にコンジュゲートされた抗体の例は、毒素部分にコンジュゲートされた抗体である。
【0072】
抗体分子は、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEの重鎖定常領域から選択される；特に、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の(例えばヒト)重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有し得る。別の態様において、抗体分子は、例えばκまたはλの(例えばヒト)軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体の特性を改変するように(例えばFc受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基数、エフェクター細胞機能および/または補体機能の1つ以上を増加または減少するように)改変、例えば突然変異され得る。一態様において、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定し得る。他の態様において、抗体は、エフェクター細胞を補充しないかまたは補体を固定しない。別の態様において、抗体は、Fc受容体に結合する低減された能力を有するかまたはその能力を有さない。例えば、これは、Fc受容体への結合を支持しないアイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の変異体であり、例えばこれは突然変異を誘発されるかまたは欠失されるFc受容体結合領域を有する。
【0073】
ある態様において、抗体は、標準的な結合アッセイ、例えば表面プラスモン共鳴またはバイオレイヤー干渉計を用いて測定する場合、ヒト5T4に、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.75nM、0.5nM、0.1nM、0.075nMもしくは0.05nMまたはそれ以下のKDで結合する。
【0074】
本明細書に開示される抗体はさらに、親和性および/または特異性などの生化学的特性を向上するため、凝集、安定性、沈殿および/または非特異的相互作用などの生物物理学的特性を向上するためおよび/または免疫原性を低減するために、最適化(例えば親和性成熟)され得る。親和性成熟手順は当該技術分野の通常の技術内にある。例えば、DNAシャッフリング、鎖シャッフリング、CDRシャッフリング、ランダム突然変異誘発および/または部位特異的突然変異誘発により多様性が免疫グロブリン重鎖および/または免疫グロブリン軽鎖に導入され得る。
【0075】
ある態様において、単離されたヒト抗体は、1つ以上の体性突然変異を含む。これらの場合において、抗体は、抗体を最適化するためにヒト生殖細胞系配列に対して改変され得る(すなわち生殖細胞系操作(germlining)と称されるプロセス)。
【0076】
一般的に、最適化された抗体は、抗原に対して、それが由来する最適化されない(または親)抗体と少なくとも同じまたは実質的に同じ親和性を有する。好ましくは、最適化された抗体は、親抗体と比較した場合に抗原に対してより高い親和性を有する。
【0077】
ある態様において、抗体は、標準的なインビトロコンジュゲーション化学を使用して、小分子毒素または放射性核種などのエフェクター剤にコンジュゲートされ得る。エフェクター剤がポリペプチドである場合、抗体は、融合タンパク質としてエフェクターに化学的にコンジュゲートされ得るかまたはエフェクターに連結され得る。融合タンパク質の構築は当該技術分野の通常の技術内にある。
【0078】
抗体は、標準的なインビトロコンジュゲーション化学を使用して、小分子毒素または放射性核種などのエフェクター部分にコンジュゲートされ得る。エフェクター部分がポリペプチドである場合、抗体は、融合タンパク質としてエフェクターに化学的にコンジュゲートされ得るかまたはエフェクターに連結され得る。融合タンパク質の構築は当該技術分野の通常の技術内にある。
【0079】
ある態様において、抗体は、二重特異性または多重特異性抗体であり得る。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、単一の抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。他のかかる抗体は、第1の抗原に対する結合部位と第2の抗原に対する結合部位を合わせ得る。代替的に、抗原特異的アームは、T細胞受容体分子(例えばCD3)またはFcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)およびFcガンマRIII (CD16)などのIgGに対するFc受容体(FcγR)などの白血球上の誘発分子に結合するアームと合わされ得る。二重特異性抗体は、細胞傷害性剤を感染された細胞に局在化させるためにも使用され得、例えば抗体は、抗原結合アームおよび細胞傷害性剤(例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン)に結合するアームを有し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。二重特異性抗体を作製するための方法は当該技術分野で公知である。二重特異性抗体の一例は、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE(登録商標))である。BiTEは、T細胞の細胞障害活性を標的化された疾患細胞に方向づける二重特異性抗体である。BiTEは典型的に、その1つがCD3受容体を介してT細胞に結合し、もう1つが特異的分子(例えば5T4)を介して感染細胞に結合する2つの一本鎖可変断片(scFv)を含む融合タンパク質である。BiTEは、T細胞と標的細胞の間の連結を形成して、例えばMHC Iまたは共刺激分子の存在とは独立してパーフォリンおよびグランザイムを産生することにより、T細胞に、標的細胞に対する細胞傷害活性を示させる。
【0080】
例示的な抗5T4抗体としては、米国特許番号US7,531,648、米国特許公開番号US20060088522、US20100173382、US20160185859、US20160304617、US20180162937、US20190194346およびUS20190374651ならびに国際(PCT)公開番号WO9855607、WO2001036486、WO2003038098、WO2006031653、WO2007106744、WO2012131527、WO2013068874、WO2014137931、WO2016022939、WO2020076992およびWO2021048423に記載されるものが挙げられる。さらなる抗5T4抗体は、例えばR&D Systems (MN, USA)、Lifespan Biosciences, Inc (WA, USA)およびCreative Biolabs (NY, USA)から市販される。
【0081】
ある態様において、抗5T4抗体は、マウスIgG1/κ抗体C242の定常領域配列に融合される抗5T4可変領域配列を含み、例えば抗5T4抗体は、配列番号：7の残基1～222に対応するキメラ重鎖および配列番号：7の残基223～225に対応するキメラ5T4 Fab軽鎖 を含む。2つのタンパク質鎖は、Fab重鎖と軽鎖の間の非共有相互作用により一緒に保持される。
【0082】
B. スーパー抗原コンジュゲート
1. スーパー抗原
スーパー抗原は、例えばピコモル濃度でTリンパ球を活性化し得る細菌性タンパク質、ウイルスタンパク質およびヒトの遺伝子工学で作り変えられたタンパク質である。スーパー抗原はまた、Tリンパ球(T細胞)の大きなサブセットを活性化し得る。スーパー抗原は、処理されることなく主要組織適合性複合体I(MHCI)に結合し得、特に、従来のペプチド結合部位における多形性のほとんどを回避するMHCクラスII分子上(例えば単球上)の抗原結合溝の外側の保存された領域に結合し得る。スーパー抗原はまた、T細胞受容体の超可変ループに結合するよりもむしろ、T細胞受容体(TCR)のVβ鎖に結合し得る。細菌性スーパー抗原の例としては、限定されないが、ブドウ球菌エンテロトキシン(SE)、化膿連鎖球菌外毒素(SPE)、黄色ブドウ球菌トキシックショック症候群毒素(TSST-1)、連鎖球菌マイトジェン外毒素(SME)、連鎖球菌スーパー抗原(SSA)、ブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA)、ブドウ球菌エンテロトキシンA(SEB)およびブドウ球菌エンテロトキシンE(SEE)が挙げられる。
1. スーパー抗原
スーパー抗原は、例えばピコモル濃度でTリンパ球を活性化し得る細菌性タンパク質、ウイルスタンパク質およびヒトの遺伝子工学で作り変えられたタンパク質である。スーパー抗原はまた、Tリンパ球(T細胞)の大きなサブセットを活性化し得る。スーパー抗原は、処理されることなく主要組織適合性複合体I(MHCI)に結合し得、特に、従来のペプチド結合部位における多形性のほとんどを回避するMHCクラスII分子上(例えば単球上)の抗原結合溝の外側の保存された領域に結合し得る。スーパー抗原はまた、T細胞受容体の超可変ループに結合するよりもむしろ、T細胞受容体(TCR)のVβ鎖に結合し得る。細菌性スーパー抗原の例としては、限定されないが、ブドウ球菌エンテロトキシン(SE)、化膿連鎖球菌外毒素(SPE)、黄色ブドウ球菌トキシックショック症候群毒素(TSST-1)、連鎖球菌マイトジェン外毒素(SME)、連鎖球菌スーパー抗原(SSA)、ブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA)、ブドウ球菌エンテロトキシンA(SEB)およびブドウ球菌エンテロトキシンE(SEE)が挙げられる。
【0083】
多くのスーパー抗原をコードするポリヌクレオチド配列が単離およびクローニングされており、これらまたは改変された(再度遺伝子工学で作り変えられた)ポリヌクレオチド配列から発現されるスーパー抗原は、抗癌療法に使用されている(下記ナプツモマブ・エスタフェナトクス/ANYARA(登録商標)参照)。これらのポリヌクレオチド配列により発現されるスーパー抗原は、野生型スーパー抗原、改変されたスーパー抗原、あるいは標的化部分にコンジュゲートされたまたは融合された野生型もしくは改変されたスーパー抗原であり得る。スーパー抗原は、ヒトなどの哺乳動物に、直接、例えば注射により投与され得るか、または例えば体外での患者の血液のスーパー抗原への暴露、もしくは例えばスーパー抗原をコードする遺伝子を治療対象の哺乳動物内に配置して(例えば公知の遺伝子治療法およびベクター、例えば該遺伝子を含み、かつ発現し得る細胞等を介して)哺乳動物内で該遺伝子を発現させることにより送達され得る。
【0084】
スーパー抗原およびそれらの哺乳動物への投与の例は、以下の米国特許および特許出願：米国特許第5,858,363号、第6,197,299号、第6,514,498号、第6,713,284号、第6,692,746号、第6,632,640号、第6,632,441号、第6,447,777号、第6,399,332号、第6,340,461号、第6,338,845号、第6,251,385号、第6,221,351号、第6,180,097号、第6,126,945号、第6,042,837号、第6,713,284号、第6,632,640号、第6,632,441号、第5,859,207号、第5,728,388号、第5,545,716号、第5,519,114号、第6,926,694号、第7,125,554号、第7,226,595号、第7,226,601号、第7,094,603号、第7,087,235号、第6,835,818号、第7,198,398号、第6,774,218号、第6,913,755号、第6,969,616号および第6,713,284号、米国特許出願番号2003/0157113、2003/0124142、2002/0177551、2002/0141981、2002/0115190および2002/0051765、ならびにPCT国際公開番号WO/03/094846に記載される。
【0085】
2. 改変されるスーパー抗原
本発明の範囲内で、スーパー抗原は、スーパー抗原がTリンパ球を刺激する能力を保持または増強し、例えばその血清反応性もしくは免疫原性などのスーパー抗原の他の局面を例えば改変し得る改変を含む種々の方法において遺伝子工学で作り変えられ得る。改変されたスーパー抗原としては、スーパー抗原活性(すなわち、Tリンパ球のサブセットを活性化する能力)を有する合成分子が挙げられる。
本発明の範囲内で、スーパー抗原は、スーパー抗原がTリンパ球を刺激する能力を保持または増強し、例えばその血清反応性もしくは免疫原性などのスーパー抗原の他の局面を例えば改変し得る改変を含む種々の方法において遺伝子工学で作り変えられ得る。改変されたスーパー抗原としては、スーパー抗原活性(すなわち、Tリンパ球のサブセットを活性化する能力)を有する合成分子が挙げられる。
【0086】
スーパー抗原の生物学的利用性または活性、すなわち腫瘍細胞の細胞傷害性を生じるようなT細胞応答の誘導の目に見えるほどの消失を有さずに、スーパー抗原をコードするポリヌクレオチド配列に対して種々の変化がなされ得ることが企図される。さらに、MHCクラスII分子に対するスーパー抗原の親和性は、スーパー抗原の細胞傷害性に対する効果を最小にしつつ減少され得る。例えば、これは、スーパー抗原がMHCクラスII抗原に結合するその野生型の能力を保持する場合(かかる場合と同様に、クラスII発現細胞、例えば免疫系細胞が、スーパー抗原への応答によっても影響を受け得る)、そうでなければ起こり得る毒性を低減することを補助し得る。
【0087】
合成スーパー抗原を作製することを含むスーパー抗原(例えばポリヌクレオチドおよびポリペプチド)を改変するための技術は当該技術分野で周知であり、例えばPCR突然変異誘発、アラニンスキャン突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発が挙げられる(米国特許第5,220,007号；第5,284,760号；第5,354,670号；第5,366,878号；第5,389,514号；第5,635,377号および第5,789,166号参照)。
【0088】
ある態様において、スーパー抗原は、参照野生型スーパー抗原と比較してその血清反応性が低減されるように改変され得るが、T細胞を活性化するその能力は、野生型と比較して保持されるかまたは増強される。かかる改変されたスーパー抗原を作製するための1つの技術としては、1つのスーパー抗原由来の特定の領域中の特定のアミノ酸を別のものに置換することが挙げられる。これは、SEA、SEEおよびSEDを含むが限定されない多くのスーパー抗原が特定の機能に関連する特定の領域において配列相同性を共有しているために可能である(Marrack and Kappler (1990) SCIENCE248(4959): 1066；異なる野生型および遺伝子工学で作り変えられたスーパー抗原の間の相同性の領域を示す図1も参照)。例えば本発明のある態様において、所望のT細胞活性化誘導応答を有するが、望ましくない高い血清反応性を有するスーパー抗原は、得られるスーパー抗原がそのT細胞活性化能力を保持するが、低減された血清反応性を有するように改変される。
【0089】
ヒトの血清は通常スーパー抗原に対して種々の力価の抗体を含むことが当業者に公知であり理解される。ブドウ球菌スーパー抗原について、例えば、相対的な力価はTSST-1>SEB>SEC-1>SE3>SEC2>SEA>SED>SEEである。結果的に、例えばSEE(ブドウ球菌エンテロトキシンE)の血清反応性は、例えばSEA(ブドウ球菌エンテロトキシンA)のものよりも低い。このデータに基づいて、当業者は、例えばSEB(ブドウ球菌エンテロトキシンB)などの高力価スーパー抗原に変えて例えばSEEなどの低力価スーパー抗原を好ましく投与し得る。しかしながら、発見されてもいるように、異なるスーパー抗原は、互いに対して異なるT細胞活性化特性を有し、野生型スーパー抗原について、最良のT細胞活性化スーパー抗原は、しばしば望ましくない高い血清反応性も有する。
【0090】
これらの相対的な力価は時々、中和抗体による問題などの血清反応性による潜在的な問題に対応する。したがって、SEAまたはSEEなどの低力価スーパー抗原の使用は、非経口的に投与されたスーパー抗原の血清反応性を低減または回避することに有用であり得る。低力価スーパー抗原は、例えば一般的な集団において典型的な抗スーパー抗原抗体により測定した場合に低い血清反応性を有する。いくつかの例において、低力価スーパー抗原はまた低い免疫原性を有し得る。かかる低力価スーパー抗原は、本明細書に記載されるように、その低力価を保持するように改変され得る。
【0091】
望ましいT細胞活性化特性および低減された血清反応性、ならびにいくつかの例においては同様に低減された免疫原性の全てを有するスーパー抗原を作製するために、スーパー抗原を改変するためのアプローチが使用され得る。スーパー抗原の間の相同性の特定の領域が血清反応性に関連することを考慮すると、所望のT細胞活性化および所望の血清反応性および/または免疫原性を有する組み換えスーパー抗原を遺伝子工学で作り変えることが可能である。さらに、スーパー抗原またはブドウ球菌エンテロトキシンのタンパク質配列および免疫学的交差反応性は、2つの関連のある群に分けられる。1つの群はSEA、SEEおよびSEDからなる。第2の群はSPEA、SECおよびSEBである。したがって、高力価またはブドウ球菌エンテロトキシンに対する内因性抗体との交差反応性を減少または排除するために低力価スーパー抗原を選択することが可能である。
【0092】
血清反応性において役割を果たすと考えられるスーパー抗原中の領域としては、例えばアミノ酸残基20、21、22、23、24、25、26および27を含む領域A；アミノ酸残基34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48および49を含む領域B；アミノ酸残基74、75、76、77、78、79、80、81、82、83および84を含む領域C；アミノ酸残基187、188、189および190を含む領域D；ならびにアミノ酸残基217、218、219、220、221、222、223、224、225、226および227を含む領域Eが挙げられる(米国特許第7,125,554号および本明細書中の図1参照)。したがって、改変された血清反応性を有するスーパー抗原を作製するために、例えばアミノ酸置換を使用してこれらの領域を突然変異し得ることが企図される。
【0093】
上述のスーパー抗原のためのポリペプチドまたはアミノ酸配列は、任意の配列データバンク、例えばタンパク質データバンクおよび/またはGenBankから得られ得る。例示的なGenBankアクセッション番号としては、限定されないが、SEEはP12993；SEAはP013163；SEBはP01552；SEC1はP01553；SEDはP20723；およびSEHはAAA19777である。
【0094】
本発明のある態様において、野生型SEE配列(配列番号：1)または野生型SEA配列(配列番号：2)は、同定された領域A～Eのいずれかのアミノ酸(図1参照)を他のアミノ酸で置換するように改変され得る。かかる置換は、例えばK79、K81、K83およびD227またはK79、K81、K83、K84およびD227、または例えばK79E、K81E、K83SおよびD227SまたはK79E、K81E、K83S、K84SおよびD227Aを含む。ある態様において、該スーパー抗原はSEA/E-120(配列番号：3；米国特許第7,125,554号も参照)、SEAD227A(配列番号：4；米国特許第7,226,601号も参照)またはSEA/E-18 (配列番号：10；米国特許第7,125,554号も参照)である。
【0095】
天然に存在するスーパー抗原または参照スーパー抗原をコードするポリヌクレオチドの生物学的な機能同等物は、同時に天然に存在するスーパー抗原または参照スーパー抗原をコードする能力を保持しながら異なる配列を含むように遺伝子工学で作り変えられたポリヌクレオチドを含み得る。これは、同じアミノ酸をコードする遺伝コードの縮重、すなわち複数のコドンの存在のために達成され得る。一例において、ポリヌクレオチドがタンパク質をコードする能力を乱さずに、該ポリヌクレオチドに制限酵素認識配列を導入することが可能である。他のポリヌクレオチド配列は、参照スーパー抗原とは異なるが、参照スーパー抗原に対して機能的には少なくとも1つの生物学的特性または活性において実質的に同等である(例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%の生物学的特性または活性、例えば限定されずに腫瘍細胞の細胞傷害性を生じるT細胞応答を誘導する能力)スーパー抗原をコードし得る。
【0096】
別の例において、ポリヌクレオチドは、より大きな変化を含み得るが参照スーパー抗原と機能的に同等なスーパー抗原であり得る(コードし得る)。特定のアミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域、基質分子上の結合部位、受容体等の構造との相互作用性の結合能力の目に見えるほどの消失を有することなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸について置換され得る。さらに、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の生物学的活性を乱し得ずに、結果的に構造的な変化はしばしばタンパク質がその設計された機能を実行する能力に影響を及ぼすものではない。したがって、本発明の目標を依然として満足しながらも、本明細書に開示される遺伝子およびタンパク質の配列において種々の変化がなされ得ることが企図される。
【0097】
アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖の置換基、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等の相対的な類似性を利用するように設計され得る。アミノ酸側鎖の置換基のサイズ、形状および/または種類の分析により、アルギニン、リジンおよび/またはヒスチジンは全て正の電荷を有する残基であること；アラニン、グリシンおよび/またはセリンは全て同様の大きさであること；および/またはフェニルアラニン、トリプトファンおよび/またはチロシンは全て一般的に同様の形状を有することが明らかになる。そのため、これらの考察に基づいて、アルギニン、リジンおよび/またはヒスチジン；アラニン、グリシンおよび/またはセリン；および/またはフェニルアラニン、トリプトファンおよび/またはチロシンは、本明細書において、生物学的に機能的な同等物であると定義される。また、天然には存在しないアミノ酸を導入することが可能であり得る。他の天然に存在するアミノ酸および天然には存在しないアミノ酸によるアミノ酸置換を作製するためのアプローチは、米国特許第7,763,253号に記載される。
【0098】
機能的同等物に関して、「生物学的に機能的な同等物」タンパク質および/またはポリヌクレオチドの定義において、同等な生物学的活性の許容され得るレベルを有する分子を保持しながら、分子の所定の部分においてなされ得る限られた数の変化があるという概念が暗に示されることが理解される。したがって、生物学的に機能的な同等物は、選択されたアミノ酸(またはコドン)が生物学的機能に実質的に影響を与えることなく置換され得るタンパク質(およびポリヌクレオチド)であると考えられる。機能的な活性としては、腫瘍細胞の細胞傷害性を生じるためのT細胞応答の誘導が挙げられる。
【0099】
また、改変されるスーパー抗原は、異なるがこの場合においては関連のあるポリペプチドを使用してのキメラ分子の生成を含む「ドメイン交換(domain swapping)」を介して種々のタンパク質の相同な領域を置換することにより生成され得ることが企図される。種々のスーパー抗原タンパク質を比較してこれらの分子の機能的に関連のある領域を同定することにより(例えば図1参照)、スーパー抗原機能に対するこれらの領域の重要性(criticality)が決定されるようにこれらの分子の関連のあるドメインを交換することが可能になる。これらの分子は、これらの「キメラ」がおそらく同じ機能を提供しながら天然の分子と区別され得ることにおいてさらなる価値を有し得る。
【0100】
ある態様において、スーパー抗原は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3および配列番号：4から選択される参照スーパー抗原の配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、スーパー抗原は任意に、参照スーパー抗原の生物学的活性または特性の少なくとも50%、60%、70% 80%、90%、95%、98%、99%または100%を保持する。
【0101】
ある態様において、スーパー抗原は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3および配列番号：4から選択されるスーパー抗原をコードする核酸に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%同一である核酸によりコードされるアミノ酸配列を含み、ここで、スーパー抗原は任意に、参照スーパー抗原の生物学的活性または特性の少なくとも50%、60%、70% 80%、90%、95%、98%、99%または100%を保持する。
【0102】
配列同一性は、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign (DNASTAR)ソフトウェアを使用して決定され得る。プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるアルゴリズムを使用したBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)分析(Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268；Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES.25:3389-3402、参照により援用される)は、配列類似性の検索のために調整される。配列データベースの検索における基本的な問題の議論については、参照により十分に援用されるAltschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129参照。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大の整列(alignment)を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定し得る。ヒストグラム、ディスクリプション、アラインメント、エクスペクト(すなわちデータベース配列に対する適合を報告するための統計的有意さ閾値)、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルト設定にある。blastp、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、BLOSUM62マトリックスである(Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919、参照により十分に援用される)。4つのblastnパラメーターは以下の通りに調整され得る：Q=10(ギャップ生成ペナルティー)；R=10(ギャップ伸長ペナルティー(gap extension penalty))；wink=1(クエリに沿ってwink.sup.thの位置毎にワードヒットを生じる)；およびgapw=16(ギャップのあるアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する)。同等のBlastpパラメーター設定は、Q=9；R=2；wink=1；およびgapw=32であり得る。検索はまた、NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST Advanced Optionパラメーターを使用して実施され得る(例えば：-G、オープンギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて5/タンパク質について11；-E、伸長ギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて2/タンパク質について1；-q、ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティー[整数]：デフォルト=-3；-r、ヌクレオチド適合についての報酬(reward)[整数]：デフォルト=1；-e、予測値[実数]：デフォルト=10；-W、ワードサイズ[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて11/megablastについて28/タンパク質について3；-y、ビットでのblast伸長についてのドロップオフ(X)：デフォルト=blastnについて20/その他について7；-X、ギャップのあるアラインメントについてのXドロップオフ値(ビット(in bit))：デフォルト=全てのプログラムについて15であるがblastnには適用可能ではない；および-Z、ギャップのあるアラインメントについての最終Xドロップオフ値(ビット)：blastnについて50、その他について25)。ペアワイズタンパク質アラインメントについてのClustalWも使用され得る(デフォルトパラメータは、例えばBlosum62マトリックスおよびギャップオープンペナルティー(Gap Opening Penalty)=10およびギャップ伸長ペナルティー=0.1を含み得る)。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間の最適合比較はDNAパラメーターGAP=50(ギャップ生成ペナルティー)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティー)を使用し、タンパク質比較における同等の設定はGAP=8およびLEN=2である。
【0103】
3. 標的化されるスーパー抗原
特異性を高めるために、スーパー抗原は好ましくは、5T4標的化部分にコンジュゲートされて、標的化されたスーパー抗原コンジュゲートを生成する。標的化部分は、スーパー抗原を癌性細胞、例えば癌性細胞の表面に結合させるために使用され得るビヒクルである。標的化されたスーパー抗原コンジュゲートは、多くのTリンパ球を活性化する能力を保持するべきである。例えば、標的化されたスーパー抗原コンジュゲートは、多くのT細胞を活性化して、T細胞を、標的化部分に結合した腫瘍関連抗原を含む組織に方向づけるべきである。かかる状況において、特定の標的細胞が優先的に殺傷され、身体の残りは比較的無傷で残される。増殖抑制性化学療法薬などの非特異的な抗癌剤は非特異的であり、治療対象である腫瘍とは関連の無い多くの細胞を殺傷するので、この型の治療が望ましい。例えば、標的化されたスーパー抗原コンジュゲートを用いた試験により、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)による腫瘍組織への浸潤を伴う炎症は、標的化されたスーパー抗原の第1の注射に応答して急速に増加することが示されている(Dohlsten et al. (1995) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA92:9791-9795)。CTLの腫瘍への浸潤を伴うこの炎症は、標的化されたスーパー抗原の抗腫瘍療法の主要なエフェクターの1つである。
特異性を高めるために、スーパー抗原は好ましくは、5T4標的化部分にコンジュゲートされて、標的化されたスーパー抗原コンジュゲートを生成する。標的化部分は、スーパー抗原を癌性細胞、例えば癌性細胞の表面に結合させるために使用され得るビヒクルである。標的化されたスーパー抗原コンジュゲートは、多くのTリンパ球を活性化する能力を保持するべきである。例えば、標的化されたスーパー抗原コンジュゲートは、多くのT細胞を活性化して、T細胞を、標的化部分に結合した腫瘍関連抗原を含む組織に方向づけるべきである。かかる状況において、特定の標的細胞が優先的に殺傷され、身体の残りは比較的無傷で残される。増殖抑制性化学療法薬などの非特異的な抗癌剤は非特異的であり、治療対象である腫瘍とは関連の無い多くの細胞を殺傷するので、この型の治療が望ましい。例えば、標的化されたスーパー抗原コンジュゲートを用いた試験により、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)による腫瘍組織への浸潤を伴う炎症は、標的化されたスーパー抗原の第1の注射に応答して急速に増加することが示されている(Dohlsten et al. (1995) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA92:9791-9795)。CTLの腫瘍への浸潤を伴うこの炎症は、標的化されたスーパー抗原の抗腫瘍療法の主要なエフェクターの1つである。
【0104】
腫瘍標的化スーパー抗原は、癌に対する免疫療法を提示し、スーパー抗原にコンジュゲートされた標的化部分を含む治療的融合タンパク質である(Dohlsten et al. (1991) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 88:9287-9291；Dohlsten et al. (1994) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA91:8945-8949)。
【0105】
標的化部分は原則的に、5T4に結合し得る任意の構造であり得る。標的化部分は、抗体、例えばその抗原結合断片、可溶性T細胞受容体、成長因子、インターロイキン(例えばインターロイキン-2)、ホルモン等から選択され得る。
【0106】
ある好ましい態様において、標的化部分は、抗体(例えばFab、F(ab)2、Fv、一本鎖抗体等)である。例示的な抗5T4抗体としては、米国特許番号US7,531,648、米国特許公開番号US20060088522、US20100173382、US20160185859、US20160304617、US20180162937、US20190194346およびUS20190374651ならびに国際(PCT)公開番号WO9855607、WO2001036486、WO2003038098、WO2006031653、WO2007106744、WO2012131527、WO2013068874、WO2014137931、WO2016022939、WO2020076992およびWO2021048423に記載されるものが挙げられる。さらなる抗5T4抗体は、例えばR&D Systems (MN, USA)、Lifespan Biosciences, Inc (WA, USA)およびCreative Biolabs (NY, USA)から市販される。
【0107】
【0108】
好ましい態様において、好ましいコンジュゲートは、ナプツモマブ・エスタフェナトクス/ANYARA(登録商標)として知られ、抗5T4抗体のFab断片とSEA/E-120スーパー抗原の融合タンパク質であるスーパー抗原コンジュゲートである(図2参照)。ナプツモマブ・エスタフェナトクス/ANYARA(登録商標)は、遺伝子工学で作り変えられたブドウ球菌エンテロトキシンスーパー抗原(SEA/E-120)、およびマウスIgG1/κ抗体C242の定常領域配列に融合された改変された5T4可変領域配列を含む標的化5T4 Fabを累積的に含む2つのタンパク質鎖を含む。図3に関して、第1のタンパク質鎖は、配列番号：7の残基1～458(配列番号：8も参照)を含み、配列番号：7の残基223～225に対応するGGPトリペプチドリンカーを介して共有的に連結される配列番号：7の残基1～222に対応するキメラ5T4 Fab重鎖および配列番号：7の残基226～458に対応するSEA/E-120スーパー抗原を含む。第2の鎖は、配列番号：7の残基459～672(配列番号：9も参照)を含み、キメラ5T4 Fab軽鎖を含む。2つのタンパク質鎖は、Fab重鎖と軽鎖の間の非共有相互作用により一緒に維持される。配列番号：7の残基1～458は配列番号：8の残基1～458に対応し、配列番号：7の残基459～672は配列番号：9の残基1～214に対応する。ナプツモマブ・エスタフェナトクス/ANYARA(登録商標)は、Fab重鎖とFab軽鎖の間の非共有相互作用により一緒に維持される配列番号：8および9のタンパク質を含む。ナプツモマブ・エスタフェナトクス/ANYARA(登録商標)は、約10pMの濃度で癌細胞のT細胞媒介性の殺傷を誘導し、コンジュゲートのスーパー抗原構成要素は、ヒト抗体およびMHCクラスIIに対して低い結合を有するように遺伝子工学で作り変えられている。
【0109】
他の抗体に基づく標的化部分は、当該技術分野において公知であり、以下により詳細に記載される技術を使用して設計、改変、発現および精製され得ることが企図される。
【0110】
別の種類の標的化部分は、可溶性T細胞受容体(TCR)を含む。可溶性TCRのいくつかの形態は、細胞外ドメインのみかまたは細胞外ドメインおよび細胞質ドメインのいずれかを含み得る。米国公開出願番号U.S. 2002/119149、U.S. 2002/0142389、U.S. 2003/0144474およびU.S. 2003/0175212、ならびに国際公開番号WO2003020763；WO9960120およびWO9960119に記載されるように、膜貫通ドメインが欠失されおよび/またはTCRが膜結合ではないように作り変えられた可溶性TCRを産生するように、TCRの他の改変も構想され得る。
【0111】
標的化部分は、組み換え技術またはスーパー抗原への標的化部分の化学的連結のいずれかを使用して、スーパー抗原にコンジュゲートされ得る。
【0112】
標的化部分に直接または間接的に(例えば、リンカーを含むアミノ酸を介して)連結されるスーパー抗原をコードする遺伝子が、従来の組み換えDNA技術を使用して生成および発現され得ることが企図される。例えば、改変されたスーパー抗原のアミノ末端は標的化部分のカルボキシ末端に連結され得るか、またはその逆であり得る。標的化部分として機能し得る抗体または抗体断片について、軽鎖または重鎖のいずれかは、融合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、Fab断片について、改変されたスーパー抗原のアミノ末端は、抗体重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)に連結され得る。いくつかの例において、改変されたスーパー抗原は、VHおよびVLドメインのスーパー抗原への連結によりFab断片に連結され得る。代替的に、ペプチドリンカーを使用して、スーパー抗原と標的化部分を一緒に連結し得る。リンカーを使用する場合、リンカーは、好ましくはGln、Ser、Gly、Glu、Pro、HisおよびArgなどの親水性アミノ酸残基を含む。好ましいリンカーは、1～10アミノ酸残基、より具体的には3～7アミノ酸残基からなるペプチド架橋である。例示的なリンカーは、トリペプチド-GlyGlyPro-である。これらのアプローチは、ナプツモマブ・エスタフェナトクス/ANYARA(登録商標)スーパー抗原コンジュゲートの設計および製造において成功裡に使用されている。
【0113】
スーパー抗原が、化学的連結を介して標的化部分に連結され得ることも企図される。標的化部分へのスーパー抗原の化学的連結は、リンカー、例えばペプチドリンカーを必要とし得る。ペプチドリンカーは、好ましくは親水性であり、アミド、チオエーテル、ジスルフィド等から選択される1つ以上の反応性部分を示す(米国特許第5,858,363号、第6,197,299号および第6,514,498号参照)。化学的連結がホモまたはヘテロ二官能性架橋試薬を使用し得ることも企図される。スーパー抗原の標的化部分への化学的連結は、しばしば化合物中の多くの位置に存在する官能基(例えば、一級アミノ基またはカルボキシ基)を利用する。
【0114】
スーパー抗原についての産生系の例は、例えば米国特許第6,962,694号に見られる。
C. 免疫細胞
C. 免疫細胞
【0115】
免疫細胞としては、例えばリンパ球、例えばB細胞およびT細胞、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、ナチュラルキラーT細胞(NKT細胞)、骨髄性細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球が挙げられる。
【0116】
ある態様において、免疫細胞は、例えば培養されたT細胞、例えば始原T細胞(primary T cell)もしくは培養されたT細胞株からのT細胞、例えばJurkat、SupTi等、または哺乳動物、例えば治療される被験体から得られるT細胞であり得るT細胞である。哺乳動物から得られる場合、T細胞は、限定されないが血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは流体などの多くの供給源から得られ得る。T細胞はまた、富化または精製され得る。T細胞は、任意の種類のT細胞であり得、任意の発生段階のものであり得、限定されないが、CD4+/CD8+二重陽性T細胞、CD4+ヘルパーT細胞、例えばTh1およびTh2細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞(例えば細胞傷害性T細胞)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、記憶T細胞(例えば中心記憶T細胞およびエフェクター記憶T細胞)、ナイーブT細胞等が挙げられる。細胞(例えばT細胞)は、治療される被験体由来の自己細胞または代替的にドナー由来の同種異系細胞を含み得る。
【0117】
ある態様において、T細胞は、T細胞受容体を介して5T4に結合する。T細胞受容体は、内因性または組み換えT細胞受容体であり得る。T細胞受容体は、T細胞の表面上で一緒になって、MHC拘束抗原を認識し得るヘテロダイマー性受容体を形成する、α-およびβ鎖と称される二本の鎖を含む。α-およびβ鎖のそれぞれは、定常領域および可変領域の2つの領域を含む。α-およびβ鎖のそれぞれの可変領域は、T細胞受容体に抗原結合活性および結合特異性を付与するCDR1、CDR2およびCDR3として知られる相補性決定領域(CDR)と称される3つのループを画定する。
【0118】
ある態様において、免疫細胞、例えばT細胞またはNKT細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)を介して5T4に結合し、すなわちT細胞またはNKT細胞は、CARをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、免疫受容体由来の抗原特異的結合部分および1つ以上のシグナル伝達鎖を含む任意の人工受容体をいう。CARは、ヒンジおよび膜貫通領域を介して、T細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメイン(例えばT細胞誘導ドメイン(例えばCD3ζから)と直列のT細胞共刺激ドメイン(例えばCD28、CD137、OX40、ICOSまたはCD27から))および/またはNK細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメイン(例えばDNAX活性化タンパク質12(DAP12))に連結される、抗原に特異的な抗体の一本鎖可変断片(scFv)を含み得る。キメラ抗原受容体を発現するT細胞はCAR T細胞と称され、キメラ抗原受容体を発現するNK細胞はCAR NK細胞と称され、キメラ抗原受容体を発現するNKT細胞はCAR NKT細胞と称される。
【0119】
例示的な5T4標的化CAR T細胞は、米国特許公開番号US20200407461およびUS20200010560ならびに国際(PCT)公開番号WO2016022939に記載される。
【0120】
CAR T細胞は、当該技術分野で公知の方法を使用して作製され得る。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血(cord blood)、胸腺組織、感染の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍およびT細胞株などのいくつかの供給源から得られ得る。例えば、T細胞は、当業者に公知の任意のいくつかの技術、例えばFicollTM分離を使用して被験体から回収されたある単位の血液から得られ得る。ある態様において、個体の循環血液由来の細胞はアフェレーシスにより得られる。アフェレーシス生成物は典型的に、リンパ球、例えばT細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含む。アフェレーシスにより回収される細胞は、血漿画分を除去し、その後の処理工程のための適切なバッファまたは媒体に細胞を入れるために、洗浄され得る。例えば、細胞は、リン酸緩衝化食塩水(PBS)で洗浄され得る。洗浄後、細胞を、例えばCa2+非含有もしくはMg2+非含有PBS、PlasmaLyte Aまたは他の食塩水および/またはバッファ溶液などの種々の生体適合性バッファに再懸濁し得る。T細胞はまた、例えばPERCOLLTM勾配による遠心分離によりまたは向流遠心分離溶出により赤血球を溶解し、単球を枯渇させることにより末梢血リンパ球から単離され得る。CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+およびCD45RO+ T細胞などのT細胞の特定のサブ集団はさらに、陽性または陰性の選択技術により単離され得る。例えば一態様において、T細胞は、抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズ、例えばDYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific)との、所望のT細胞の陽性選択に十分な時間のインキュベーションにより単離される。
【0121】
T細胞は、当該技術分野で公知の方法によりCARを発現するように遺伝子工学で作り変えられ得る。一般的に、CARをコードするポリヌクレオチドベクターが構築され、該ベクターは、T細胞の集団にトランスフェクトまたは形質導入される。例えば、CARをコードするヌクレオチド配列は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して細胞に送達され得る。例示的なレトロウイルスベクターとしては、限定されないが、pMSGV(マウス幹細胞ウイルス系スプライスgagベクター)由来のベクター骨格pMSGV1-CD8-28BBZが挙げられる。他の例示的なレンチウイルスベクターについては、例えばDull et al., (1998) J. VIROL. 72:8463-8471および米国特許第5,994,136号、第6,682,907号、第7,629,153号、第8,329,462号、第8,748,169号、第9,101,584号参照。レトロウイルス形質導入は、Johnson et al. (2009) BLOOD 114, 535-546のものなどの公知の技術を使用して実行され得る。形質導入されたT細胞上のCARの表面発現は、例えばフローサイトメトリーにより決定され得る。CARをコードするヌクレオチド配列も、インビトロ転写されたmRNAを使用して細胞に送達され得る。
【0122】
T細胞および/またはCARを発現するように遺伝子工学で作り変えられたT細胞は、例えば米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開番号20060121005に記載されるような方法を一般的に使用して、活性化および拡大され得る。一般的に、T細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触により拡大される。例えば、T細胞集団は、抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD2抗体またはプロテインキナーゼCアクチベーター(例えばブリオスタチン)および/またはカルシウムイオノフォアとの接触により刺激され得る。
【0123】
CAR T細胞を製造するためのさらなる方法は、例えばLevine et al. (2016) MOL. THER. METHODS CLIN. DEV. 4:92-101に記載される。
【0124】
CARの発現のためまたはCARの発現の制御のための系の例としては、「オンスイッチ(ON-Switch)」CAR (Wu et al. (2015) SCIENCE 350: aab4077)、コンビナトリアル活性化系(Fedorov et al. (2014) CANCER JOURNAL 20:160-165；Kloss et al. (2013) NATURE BIOTECHNOLOGY 31: 71-75)、ドキシサイクリン誘導性CAR (Sakemura et al. (2016) CANCER IMMUNOL. RES. 4:658-668)、抗体誘導性CAR (Hill et al. (2018) NATURE CHEMICAL BIOLOGY 14:112-117)、殺傷スイッチ(Di Stasi et al. (2011) N. ENGL. J. MED. 365:1673-1683 (2011)；Budde et al. (2013) PLoS ONE 8: e82742)、休止スイッチ(pause switch)(Wei et al. (2012) NATURE 488: 384-388)、調整可能受容体系(Ma et al. (2016) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 113: E450-458；Rodgers et al. (2016) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA113: E459-468；Kudo et al. (2014) CANCER RES. 74: 93-103)、および増殖スイッチ(Chen et al. (2010) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 107, 8531-8536)が挙げられる。
【0125】
D. 発現方法
目的のタンパク質、例えば抗体、スーパー抗原コンジュゲート、キメラ抗原受容体および/またはT細胞受容体サブユニットは、目的のタンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込むことにより、目的の宿主細胞中で発現され得る。
目的のタンパク質、例えば抗体、スーパー抗原コンジュゲート、キメラ抗原受容体および/またはT細胞受容体サブユニットは、目的のタンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込むことにより、目的の宿主細胞中で発現され得る。
【0126】
宿主細胞は、例えば形質転換またはトランスフェクション技術により遺伝的に作り変えられて、核酸配列を組み込み、スーパー抗原を発現し得る。宿主細胞への核酸配列の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、弾道導入(ballistic introduction)、感染または他の方法により実行され得る。かかる方法は多くの標準的な実験室マニュアル、例えばDavis et al. (1986) BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGYおよびSambrook, et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載される。
【0127】
適切な宿主細胞の代表的な例としては、細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌の細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属細胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエS2およびスポドプテラSf9細胞；哺乳動物細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK-293およびBowes黒色腫細胞が挙げられる。
【0128】
組換えDNA技術を使用する場合、目的のタンパク質は、標準的な発現ベクターおよび発現系を使用して発現され得る。スーパー抗原をコードする核酸配列を含むように遺伝子的に作り変えられた発現ベクターは、スーパー抗原を産生するように宿主細胞に導入(例えばトランスフェクト)される(例えばDohlsten et al. (1994), Forsberg et al. (1997) J. BIOL. CHEM. 272:12430-12436, Erlandsson et al. (2003) J. MOL. BIOL. 333:893-905およびWO2003002143参照)。
【0129】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用因子を含み；発現のための他の因子は、宿主細胞によりまたはインビトロ発現系において補充され得る。発現ベクターとしては、当該技術分野で公知の全てのもの、例えば目的の組み換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド(例えばネイキッドまたはリポソームに含まれる)、レトロトランスポゾン(例えばpiggyback、sleeping beauty)およびウイルス(例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)が挙げられる。
【0130】
ある態様において、発現ベクターはウイルスベクターである。用語「ウイルス」は、本明細書において、タンパク質合成またはエネルギー生成機構を有さない偏性の細胞内寄生生物をいうために使用される。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター(例えばレンチウイルスベクター)、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン-バールウイルス(EBV)ベクター、ポリオーマウイルスベクター(例えばシミアン空胞形成(vacuolating)ウイルス40(SV40)ベクター)、ポックスウイルスベクターおよびシュードタイプ(pseudotype)ウイルスベクターが挙げられる。
【0131】
ウイルスは、RNAウイルス(RNAで構成されるゲノムを有する)またはDNAウイルス(DNAで構成されるゲノムを有する)であり得る。ある態様において、ウイルスベクターはDNAウイルスベクターである。例示的なDNAウイルスとしては、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、アデノウイルス、アスファウイルス(asfarviruses)、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1および2(HSV-1およびHSV-2)、エプスタイン-バールウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV))、パピローマウイルス(例えばHPV)、ポリオーマウイルス(例えばシミアン空胞形成ウイルス40(SV40))およびポックスウイルス(例えばワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、鶏痘ウイルス、羊痘(sheeppox)ウイルス、粘液腫ウイルス)が挙げられる。ある態様において、ウイルスベクターはRNAウイルスベクターである。例示的なRNAウイルスとしては、ブンヤウイルス(例えばハンタウイルス)、コロナウイルス、フラビウイルス(例えば黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス)、肝炎ウイルス(例えばA型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス)、インフルエンザウイルス(例えばインフルエンザウイルスA型、インフルエンザウイルスB型、インフルエンザウイルスC型)、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノロウイルス(例えばノーウォークウイルス)、ポリオウイルス、呼吸器合胞体(respiratory syncytial)ウイルス(RSV)、レトロウイルス(例えばヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1))およびトロウイルスが挙げられる。
【0132】
ある態様において、発現ベクターは、目的のタンパク質、例えばスーパー抗原コンジュゲート、キメラ抗原受容体および/またはT細胞受容体サブユニットをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される制御配列またはプロモーターを含む。用語「操作可能に連結される」は、機能的関係にあるポリヌクレオチド因子の連結をいう。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に、「操作可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、遺伝子の転写に影響を及ぼす場合に遺伝子に操作可能に連結される。操作可能に連結されるヌクレオチド配列は、典型的に連続である。しかしながら、数キロベースだけプロモーターから離れる場合にエンハンサーが一般的に機能し、イントロン配列が可変の長さのものであり得るように、いくつかのポリヌクレオチド因子は、操作可能に連結され得るが、直接隣り合わず、異なる対立遺伝子または染色体からトランスに機能しさえし得る。
【0133】
使用され得る例示的なプロモーターとしては、限定されないが、レトロウイルスLTR、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、U6プロモーターまたは任意の他のプロモーター(例えばヒストン、pol IIIおよびβ-アクチンプロモーターを含むがこれに限定されない真核生物細胞性プロモーターなどの細胞性プロモーター)が挙げられる。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、限定されないが、アデノウイルスプロモーター、TKプロモーターおよびB19パルボウイルスプロモーターが挙げられる。
【0134】
ある態様において、プロモーターは誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの使用により、操作可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現が所望の場合にオンまたはオフになる。ある態様において、プロモーター、例えばメタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターは、外因性分子または活性の存在下で誘導される。ある態様において、プロモーター、例えばIL-2プロモーター、NFATプロモーター、細胞表面タンパク質プロモーター(例えばCD69プロモーターまたはPD-1プロモーター)、サイトカインプロモーター(例えばTNFプロモーター)、細胞性活性化プロモーター(例えばCTLA4、OX40またはCD40Lプロモーター)または細胞表面接着タンパク質プロモーター(例えばVLA-1プロモーター)は、腫瘍微小環境内で誘導される。
【0135】
ある態様において、プロモーターは、数日間測定される迅速で持続的な発現を媒介する(例えばCD69プロモーター)。ある態様において、プロモーターは、遅延された遅い誘導性の発現を媒介する(例えばVLA1プロモーター)。ある態様において、プロモーターは、迅速で一過的な発現を媒介する(例えばTNFプロモーター、極初期応答遺伝子プロモーターおよびその他)。
【0136】
例えば強い、弱い、誘導性、組織特異的、発生特異的、活性化の特定の速度論を有する(例えば初期および/または後期活性化)、および/または誘導された遺伝子の発現の特定の速度論を有する(例えば短いまたは長い発現)プロモーターの選択は、当業者の通常の技術の範囲内であり、本明細書に含まれる教示から当業者に明らかである。
【0137】
ある態様において、目的のタンパク質、例えば抗体またはスーパー抗原コンジュゲートは、使用前に精製されて、種々の精製プロトコルを使用して達成され得る。部分的または完全な精製(または均質への精製)を達成するためにクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使用して目的のタンパク質は精製され得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー；アフィニティクロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。用語「精製される」は、本明細書で使用される場合、他の構成成分から単離可能な組成物をいうことを意図し、ここで目的の巨大分子(例えばタンパク質)は、その元の状態と比較して任意の程度にまで精製される。一般的に、用語「精製される」は、種々の他の構成成分を除去するために分画に供された巨大分子をいい、該巨大分子は実質的にその生物学的活性を維持する。用語「実質的に精製される」は、目的の巨大分子が、組成物の含量の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%以上を構成するなどの、組成物の主要な構成成分を形成する組成物をいう。
【0138】
タンパク質の精製の程度を定量するための種々の方法は、当業者に公知であり、例えば活性画分の比活性の決定およびSDS-PAGE分析、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、または任意の他の分画技術による画分中の所定のタンパク質の量の評価が挙げられる。タンパク質精製における使用に適した種々の技術としては、例えば硫酸アンモニウム、PEG、抗体等による沈殿または熱変性、その後の遠心分離による沈殿；イオン交換、ゲルろ過、逆相、ハイドロキシアパタイト、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技術の組合せが挙げられる。種々の精製工程を実行する順序は変更され得ること、または特定の工程が省略され、さらに実質的に精製されたタンパク質もしくはペプチドの調製のための適切な方法が生じ得ることが企図される。
【0139】
III. 医薬組成物
治療用途のために、5T4標的化剤は、好ましくは薬学的に許容され得る担体と合わされる。用語「薬学的に許容され得る」は、本明細書で使用する場合、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を有することなく、妥当な利益/リスク比に釣り合った、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した、正常な医学的判断の範囲内にあるこれらの化合物、材料、組成物および/または剤型をいう。
治療用途のために、5T4標的化剤は、好ましくは薬学的に許容され得る担体と合わされる。用語「薬学的に許容され得る」は、本明細書で使用する場合、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を有することなく、妥当な利益/リスク比に釣り合った、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した、正常な医学的判断の範囲内にあるこれらの化合物、材料、組成物および/または剤型をいう。
【0140】
用語「薬学的に許容され得る担体」は、本明細書で使用する場合、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を有することなく、妥当な利益/リスク比に釣り合った、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適したバッファ、担体および賦形剤をいう。薬学的に許容され得る担体は、リン酸緩衝化食塩水溶液、水、エマルジョン(例えば油/水または水/油エマルジョンなど)および種々の型の湿潤化剤などの標準的な医薬担体のいずれかを含む。該組成物はまた、安定化剤および保存剤を含み得る。担体、安定化剤およびアジュバントの例について、例えばMartin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]参照。薬学的に許容され得る担体としては、薬学的投与に適合性であるバッファ、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で公知である。
【0141】
ある態様において、医薬組成物は、例えば組成物のpH、容量オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸収または浸透を改変、維持または保存するための製剤化材料を含み得る。かかる態様において、適切な製剤化材料としては、限定されないが、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど)；抗菌剤；酸化防止剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど)；バッファ(ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など)；かさ増し剤(bulking agent)(マンニトールまたはグリシンなど)；キレート剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)など)；錯体形成剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、β-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなど)；充填剤；単糖；二糖；および他の炭水化物(グルコース、マンノースまたはデキストリンなど)；タンパク質(血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど)；着色剤、矯味矯臭剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー(ポリビニルピロリドンなど)；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン(ナトリウムなど)；保存剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など)；溶媒(グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど)；糖アルコール(マンニトールまたはソルビトールなど)；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤(プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール(tyloxapal)など)；安定性増強剤(スクロースまたはソルビトールなど)；張度増強剤(ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール ソルビトールなど)；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および/または薬学的アジュバント(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18版、(Mack Publishing Company, 1990)参照、が挙げられる。
【0142】
ある態様において、医薬組成物は、ナノ粒子、例えばポリマー性ナノ粒子、リポソームまたはミセルを含み得る(Anselmo et al. (2016) BIOENG. TRANSL. MED. 1: 10-29参照)。
【0143】
ある態様において、医薬組成物は、持続-または制御送達製剤を含み得る。持続-または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体腐食性ミクロ粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術も当業者に公知である。持続放出調製物は、形作られた物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の、例えば多孔質ポリマー性ミクロ粒子または半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート(inethacrylate))、エチレン酢酸ビニルまたはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含み得る。持続放出組成物はまた、当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得るリポソームを含み得る。
【0144】
本明細書に開示される5T4標的化剤を含む医薬組成物が単位剤型で提供され得、任意の適切な方法により調製され得る。医薬組成物は、その意図される投与経路に適合性であるように製剤化されるべきである。投与経路の例は、静脈内(IV)、筋内、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、鞘内および直腸の投与である。ある態様において、本明細書に開示される5T4標的化剤を含む医薬組成物は、IV注入により投与される。代替的に、薬剤は、例えば薬剤(1つまたは複数)の作用部位への直接的な注射により、しばしばデポーまたは持続放出製剤において、全身的よりもむしろ局所的に投与され得る。ある態様において、本明細書に開示される5T4標的化剤を含む医薬組成物は、腫瘍内注射により投与される。
【0145】
有用な製剤は医薬分野で公知の方法により調製され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 (Mack Publishing Company, 1990)参照。非経口投与に適した製剤構成成分としては、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；EDTAなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファ；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤が挙げられる。
【0146】
静脈内投与のために、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォールELTM (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)が挙げられる。担体は、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保護されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。
【0147】
医薬製剤は好ましくは滅菌性である。滅菌は、任意の適切な方法、例えば滅菌濾過膜を通す濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に実施され得る。
【0148】
ある態様において、医薬組成物は、例えば少なくとも約0.1%の活性化合物を含み得る。他の態様において、活性化合物は、約2%～約75%の重量の単位または約25%～約60%、例えばその中で導かれ得る任意の範囲を含み得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、生成物貯蔵寿命および他の薬理学的な問題などの要因は、かかる医薬製剤を調製する当業者により企図され、したがって種々の投与量および治療養生法が望ましくあり得る。かかる決定は、当業者に知られており、使用される。
【0149】
活性剤は、癌細胞の成長もしくは増殖を減少、低減、阻害もしくはそうでなければ排除する、アポトーシスを誘導する、癌もしくは腫瘍の脈管形成を阻害する、転移を阻害する、または細胞において細胞傷害性を誘導するのに有効な量(1つまたは複数)で投与される。癌の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物(1つまたは複数)の有効量は、投与の様式、被験体の年齢、体重および一般的な健康状態に応じて変化する。これらの用語は、単一の薬剤が単独で、弱く作用し得るかまたは全く作用し得ないが、例えば限定されないが連続投与により別の薬剤と合わされた場合に、2つ以上の薬剤が作用して相乗的な結果を生じる相乗的な状況を含む。
【0150】
一般的に、活性構成成分の治療有効量は、0.1mg/kg～100mg/kg、例えば1mg/kg～100mg/kg、1mg/kg～10mg/kgの範囲内である。投与される量は、治療される疾患または徴候の種類および程度、患者の全体的な健康状態、抗体のインビボ効力、医薬製剤および投与経路などの変数に依存する。開始用量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上のレベルを超えて増加され得る。代替的に、開始用量は、最適よりも少なくあり得、日用量は、治療の経過の間に漸進的に増加され得る。例えば0.5mg/kg～20mg/kgで行われるように設計された従来の第I相用量段階的増加試験において、ヒト用量は最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量、抗体の血清半減期および治療されている疾患などの要因に応じて変化し得る。例示的な投与頻度は、1日1回、1週間に1回および2週間毎に1回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば静脈内注入である。ある態様において、5T4標的化剤は凍結乾燥され、次いで投与の時点で緩衝化食塩水中に再構成される。
【0151】
ある態様において、5T4標的化剤が単離される場合、天然に存在するかまたは遺伝子工学で作り変えられた免疫細胞、例えばT細胞は、用量が、例えば105～109細胞/kg、105～108細胞/kg、105～107細胞/kg、105～106細胞/kg、106～109細胞/kg、106～108細胞/kg、106～107細胞/kg、107～109細胞/kg、107～108細胞/kgまたは108～109細胞/kgまたは106～1011総細胞、106～1010総細胞、106～109総細胞、106～108総細胞、106～107総細胞、107～1011総細胞、107～1010総細胞、107～109総細胞、107～108総細胞、108～1011総細胞、108～1010総細胞108～109総細胞、109～1011総細胞、109～1010総細胞または1010～1011総細胞の範囲内にある。投与される量は、治療される疾患または徴候の種類および程度、患者の全体的な健康状態、活性剤のインビボ効力、医薬製剤および投与経路などの変数に依存する。進行は、定期的な評価によりモニタリングされ得る。
【0152】
特定の非限定的な例において、5T4標的化剤の用量はまた、1投与あたり約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重、約20マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重から約1,000mg/kg/体重またはそれ以上、およびその中で導かれ得る任意の範囲を含み得る。本明細書に挙げられる数字から導かれ得る範囲の非限定的な例において、約5mg/kg/体重～約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約500ミリグラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約100ミリグラム/kg/体重の範囲。他の例示的用量範囲、約1マイクログラム/kg/体重～約1,000マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約100マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約75マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約50マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約40マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約30マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約20マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約15マイクログラム/kg/体重、約1マイクログラム/kg/体重～約10マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約1,000マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約100マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約75マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約50マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約40マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約30マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約20マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約15マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重～約10マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約1,000マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約100マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約75マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約50マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約40マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約30マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約20マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重～約15マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重～約1,000マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重～約100マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重～約75マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重～約50マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重～約40マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重～約30マイクログラム/kg/体重、約15マイクログラム/kg/体重～約20マイクログラム/kg/体重、約20マイクログラム/kg/体重～約1,000マイクログラム/kg/体重、約20マイクログラム/kg/体重～約100マイクログラム/kg/体重、約20マイクログラム/kg/体重～約75マイクログラム/kg/体重、約20マイクログラム/kg/体重～約50マイクログラム/kg/体重、約20マイクログラム/kg/体重～約40マイクログラム/kg/体重、約20マイクログラム/kg/体重～約30マイクログラム/kg/体重等の範囲が、上述の数に基づいて投与され得る。
【0153】
ある態様において、例えば5T4標的化剤の投与、投与される5T4標的化剤の有効量または用量は、0.01～500μg/被験体の体重kg、例えば0.1～500μg/被験体の体重kg、および例えば1～100μg/被験体の体重kgの範囲の量である。
【0154】
本明細書に記載される組成物は、局所的または全身的に投与され得る。投与は一般的に、非経口投与である。好ましい態様において、医薬組成物は、皮下的に、およびさらにより好ましい態様において静脈内に投与される。非経口投与のための調製物としては、滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。
【0155】
IV. 治療的用途
本明細書に開示される組成物および方法は、被験体において種々の形態のグリア芽腫を治療するためまたは被験体においてグリア芽腫の増殖を抑制するために使用され得る。本発明は、被験体においてグリア芽腫を治療する方法を提供する。該方法は、被験体に、開示される5T4標的化剤の有効量を、単独または被験体においてグリア芽腫を治療するための別の治療剤と組み合わせてのいずれかで投与する工程を含む。例えば、開示される5T4標的化剤は、例えば少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または100%だけ、癌細胞の増殖速度を遅らせるため、転移の発生数または数を低減するため、腫瘍サイズを低減するため、腫瘍増殖を抑制するため、腫瘍または癌細胞に対する血液供給を低減するため、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進するため、癌の進行を予防または抑制するために被験体に投与され得る。代替的に、5T4標的化剤は、癌を治療するように、例えば癌を有する被験体の寿命を、例えば3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、1年、5年または10年だけ増加するように被験体に投与され得る。
本明細書に開示される組成物および方法は、被験体において種々の形態のグリア芽腫を治療するためまたは被験体においてグリア芽腫の増殖を抑制するために使用され得る。本発明は、被験体においてグリア芽腫を治療する方法を提供する。該方法は、被験体に、開示される5T4標的化剤の有効量を、単独または被験体においてグリア芽腫を治療するための別の治療剤と組み合わせてのいずれかで投与する工程を含む。例えば、開示される5T4標的化剤は、例えば少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または100%だけ、癌細胞の増殖速度を遅らせるため、転移の発生数または数を低減するため、腫瘍サイズを低減するため、腫瘍増殖を抑制するため、腫瘍または癌細胞に対する血液供給を低減するため、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進するため、癌の進行を予防または抑制するために被験体に投与され得る。代替的に、5T4標的化剤は、癌を治療するように、例えば癌を有する被験体の寿命を、例えば3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、1年、5年または10年だけ増加するように被験体に投与され得る。
【0156】
限定されないが、前神経(proneural)グリア芽腫、神経グリア芽腫、古典的グリア芽腫、間葉グリア芽腫、原発性グリア芽腫、続発性グリア芽腫、グレードIグリア芽腫、グレードIIグリア芽腫、グレードIIIグリア芽腫および/またはグレードIVグリア芽腫などのいくつかのグリア芽腫は、本明細書に記載される方法および組成物を使用して治療され得ることが企図される。
【0157】
5T4発現は、試料、例えば被験体由来の試料中で測定され得ることが企図される。5T4は、目的の組織、体液および/または被験体由来の細胞試料中、当該技術分野で公知の技術を使用して検出され得る。体液試料は、例えば血液、血清または血漿であり得る。組織試料は、例えば腫瘍組織であり得る。細胞試料は、例えば癌細胞試料であり得る。腫瘍組織または試料のいずれかは、当該技術分野で公知の技術、例えばホルマリンで固定されたパラフィン包埋切片を使用して保存または処理され得ることが理解される。
【0158】
好ましくは、治療される患者は、適切な骨髄機能(>2,000/mm3の末梢絶対顆粒球数および100,000/mm3の血小板数と定義される)、適切な肝臓機能(ビリルビン<1.5mg/dl)および適切な腎機能(クレアチニン<1.5mg/dl)を有する。
【0159】
治療養生法は変化し得、しばしば腫瘍のサイズ、腫瘍の位置、疾患の進行ならびに患者の健康状態および年齢に依存し得る。特定の種類の腫瘍は、より集中的な治療プロトコルを必要とし得るが、同時に患者はより集中的な治療養生法を許容できないことがある。臨床医はしばしば、当該技術分野における医師の技術ならびに治療製剤の公知の効力および毒性(もしあれば)に基づいて、かかる決定をするために最も適合され得る。
【0160】
原発性の腫瘍または切除後の腫瘍床のための治療の典型的な経過は、複数の投与を含み得る。典型的な原発性腫瘍治療は、2週間の期間にわたり6回の投与適用を含み得る。2週間養生法は、1、2、3、4、5、6またはそれ以上の回数反復され得る。治療の経過の間に、計画された投与を完了する必要性が再度評価され得る。
【0161】
スーパー抗原コンジュゲートを用いた免疫療法はしばしば、迅速(数時間以内)で強力なTリンパ球のポリクローナルな活性化を生じる。スーパー抗原コンジュゲート治療サイクルは、4～5回の毎日の静脈内スーパー抗原コンジュゲート薬物注射を含み得る。かかる治療サイクルは、例えば4～6週間の間隔で与えられ得る。CTLの腫瘍への浸潤を伴う炎症は、抗腫瘍治療的スーパー抗原の主要なエフェクターの1つである。CTLの短期間の大規模な活性化および分化の後、T細胞応答は迅速に(4～5日以内)低下して、ベースラインレベルに戻る。したがって、細胞増殖抑制性薬物がスーパー抗原治療に干渉し得るリンパ球増殖の期間は短く、十分に画定される。
【0162】
ある態様において、被験体は、スーパー抗原コンジュゲート、例えば本明細書において企図されるスーパー抗原コンジュゲートを、2～6日連続して(例えば2、3、4、5または6日連続して)、2～12週間(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12週間)毎に毎日投与される。ある態様において、被験体は、スーパー抗原コンジュゲート、例えば本明細書において企図されるスーパー抗原コンジュゲートを、連続して4日間、3～4週間(例えば3または4週間)毎に毎日投与される。ある態様において、被験体は、スーパー抗原コンジュゲート、例えば本明細書において企図されるスーパー抗原コンジュゲートを、2～8週間毎に１回(例えば2、3、4、5、6、7または8週間毎に１回)投与される。
【0163】
本明細書に記載される方法および組成物は、単独または他の治療剤および/またはモダリティーと組み合わせて使用され得る。用語「組み合わせて」投与されるは、本明細書で使用する場合、患者に対する治療の効果がある時点において重複するように2つ(またはそれ以上)の異なる治療が、障害を有する被験体の苦痛の経過の間に被験体に送達されることを意味すると理解される。ある態様において、1つの治療の送達は、第2のものの送達が開始される際に依然として行われているので、投与期間の重複がある。これは、時々本明細書において「同時(simultaneous)」または「同時(concurrent)送達」と称される。他の態様において、1つの治療の送達は、他の治療の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合のある態様において、組み合された投与のために治療はより効果的である。例えば、第2の治療はより効果的であり、例えばより少ない第2の治療を用いて同等の効果が見られるか、または第2の治療は、第1の治療の非存在下で第2の治療が投与される場合に見られるよりも大きい程度にまで症状を低減するか、または第1の治療により同様の状況が見られる。ある態様において、送達は、症状または障害に関連する他のパラメーターの低減が、他のものの非存在下で送達される1つの治療により観察されるものよりも大きいようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的または相加的よりも大きいものであり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が、第2のものを送達する場合に依然として検出可能であるようなものであり得る。
【0164】
ある態様において、本発明の治療養生法は、新生物または腫瘍細胞と、第1の治療および第2の治療を同時に接触させることを含み得る。これは、該細胞と、単一の組成物もしくは両方の薬剤を含む医薬製剤を接触させること、または該細胞と、2つの別の組成物もしくは製剤を同時に接触させることにより達成され得、ここで1つの組成物は第1の治療を含み、他のものは第2の治療を含む。
【0165】
代替的に、第1の治療は、数分、数日～数週間の範囲の間隔で、第2の治療の先になり得るかまたは後になり得る。第1の治療および第2の治療が細胞に別々に適用される態様において、第1の治療および第2の治療が依然として、細胞に対して有利に合された効果を発揮し得るように、各送達の時間の間に有意な時間が終了しないことを確実にするべきである。かかる例において、該細胞と、両方のモダリティーを互いに約12～72時間以内で接触させ得ることが企図される。いくつかの状況において、治療時間を有意に延長することが望ましくあり得るが、ここで数日(2、3、4、5、6または7)～数週間(1、2、3、4、5、6、7または8)がそれぞれの投与の間に経過する。
【0166】
第1の治療が「A」および第2の治療が「B」である種々の組合せ：A/B/A、B/A/B、B/B/A、A/A/B、A/B/B、B/A/A、A/B/B/B、B/A/B/B、B/B/B/A、B/B/A/B、A/A/B/B、A/B/A/B、A/B/B/A、B/B/A/A、B/A/B/A、B/A/A/B、A/A/A/B、B/A/A/A、A/B/A/AおよびA/A/B/Aが使用され得る。
【0167】
ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、1つ以上のさらなる治療、例えば外科手術、放射線治療または別の治療調製物の投与と組み合わせて投与される。ある態様において、さらなる治療は、化学療法、例えば細胞傷害性剤を含み得る。ある態様において、さらなる治療は、標的化された治療、例えばチロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤を含み得る。ある態様において、さらなる治療は、抗炎症、抗脈管形成、抗線維症または抗増殖性の化合物、例えばステロイド、生物学的免疫調整剤、モノクローナル抗体、抗体断片、アプタマー、siRNA、アンチセンス分子、融合タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、気管支拡張剤、スタチン、抗炎症剤(例えばメトトレキサート)またはNSAIDを含み得る。ある態様において、さらなる治療は、投与される5T4標的化剤に対する被験体の起こり得る免疫反応性を低減するように設計された化合物を含み得る。例えば、投与される5T4標的化剤に対する免疫反応性は、例えば被験体において抗薬物抗体の産生を低減する抗CD20抗体および/または抗CD19抗体を用いた共投与により低減され得る。ある態様において、さらなる治療は、異なる部類の治療剤の組合せを含み得る。
【0168】
ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、免疫増強物質と組み合わせて投与される。
【0169】
ある態様において、例示的な免疫増強物質は、(a)T細胞シグナル伝達の活性化の刺激、(b)癌性細胞とT細胞の間のT細胞抑制性シグナル伝達の抑制、(c)非ヒトIgG1媒介性免疫応答経路、例えばヒトIgG4免疫グロブリン媒介性経路を介するT細胞の拡大、活性化および/または活性をもたらす抑制性シグナル伝達の抑制、(d)(a)および(b)の組合せ、(e)(a)および(c)の組合せ、(f)(b)および(c)の組合せ、ならびに(g)(a)、(b)および(c)の組合せをなし得る。
【0170】
ある態様において、免疫増強物質はチェックポイント経路阻害剤である。例えば、チェックポイント阻害剤は、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニスト、CTLA-4アンタゴニスト、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、B7-H3アンタゴニスト、B7-H4アンタゴニスト、BTLAアンタゴニスト、KIRアンタゴニスト、LAG3アンタゴニスト、TIM-3アンタゴニスト、VISTAアンタゴニストまたはTIGITアンタゴニストから選択され得る。
【0171】
PD-1は、過剰に活性な免疫応答を防ぐために適切な時点でT細胞活性を阻害またはそうでなければ調節する免疫系チェックポイントとして機能するT細胞の表面に存在する受容体である。しかしながら、癌細胞は、T細胞の表面上でPD-1と相互作用してT細胞活性を遮断または調節するリガンド、例えばPD-L1、PD-L2等を発現することによりこのチェックポイントを利用し得る。このアプローチを使用して、癌は、T細胞媒介性免疫応答を回避し得る。
【0172】
CTLA-4経路において、T細胞上のCTLA-4とそのリガンド(例えば、CD80、B7-1およびCD86としても公知)の抗原提示細胞(癌細胞(call)ではない)の表面上の相互作用は、T細胞阻害をもたらす。結果的に、T細胞活性化または活性を阻害するリガンド(例えばCD80またはCD86)は、癌細胞ではなく抗原提示細胞(免疫系における重要な細胞型)により提供される。CTLA-4およびPD-1の結合の両方はT細胞に対して同様の負の効果を有するが、これら2つの免疫チェックポイントによる下方制御のタイミング、原因的なシグナル伝達機構および免疫阻害の解剖学的な位置は異なる(Buchbinder et al. (2016) AMERICAN JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY. 39(1))。T細胞活性化の初期の誘導段階に制限されるCTLA-4とは異なり、PD-1はエフェクター段階中かなり後に機能する(Keir et al. (2008) ANNU. REV IMMUNOL., 26:677-704)。CTLA-4およびPD-1は、独立した重複しない作用機構を有する2つのT細胞抑制性受容体を提示する。
【0173】
ある態様において、免疫増強物質は、癌性細胞により発現される抗原が、癌性細胞とT細胞の間のT細胞抑制性シグナル伝達を抑制することを(完全にまたは部分的に)防ぐ。一態様において、かかる免疫増強物質は、チェックポイント阻害剤、例えばPD-1系阻害剤である。かかる免疫増強物質の例としては、例えば抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体および抗PD-L2抗体が挙げられる。
【0174】
ある態様において、5T4標的化剤はPD-1系阻害剤と共に投与される。PD-1系阻害剤は、(i)PD-1阻害剤、すなわちT細胞上のPD-1に結合して、目的の癌細胞により発現されるPD-1リガンドの結合を防ぐ分子(例えば抗体または小分子)、および/または(ii)PD-L阻害剤、例えばPD-L1もしくはPD-L2阻害剤、すなわちPD-1リガンド(例えばPD-L1またはPD-L2)に結合して、PD-1リガンドがT細胞上のその同種のPD-1に結合することを防ぐ分子(例えば抗体または小分子)を含み得る。
【0175】
ある態様において、5T4標的化剤は、CTLA-4阻害剤、例えば抗CTLA-4抗体と共に投与される。例示的な抗CTLA-4抗体は、米国特許第6,984,720号、第6,682,736号、第7,311,910号；第7,307,064号、第7,109,003号、第7,132,281号、第6,207,156号、第7,807,797号、第7,824,679号、第8,143,379号、第8,263,073号、第8,318,916号、第8,017,114号、第8,784,815号および第8,883,984号、国際(PCT)公開番号WO98/42752、WO00/37504およびWO01/14424ならびに欧州特許番号EP 1212422 B1に記載される。例示的なCTLA-4抗体としては、イピリムマブまたはトレメリムマブが挙げられる。
【0176】
ある態様において、免疫増強物質は、癌性細胞により発現される抗原が、例えばADCC経路を介さずにヒトIgG4(非ヒトIgG1)媒介性免疫応答経路を介してT細胞の拡大、活性化および/または活性を抑制することを、(完全にまたは部分的に)防ぐ。いくつかの態様において、免疫増強物質により増強される免疫応答はいくつかのADCC活性を含み得るが、免疫応答の主な構成要素(1つまたは複数)は、ADCC活性を含まないことが企図される。対照的に、免疫療法において現在使用されている抗体のいくつか、例えばイピリムマブ(抗CTLA-4 IgG1モノクローナル抗体)は、エフェクター細胞上のFc受容体によるそれらのFcドメインを介したシグナル伝達を通じて、ADCCを介して標的化された細胞を殺傷し得る。多くの他の治療抗体と同様に、イピリムマブはヒトIgG1免疫グロブリンとして設計され、イピリムマブは、CTLA-4とCD80またはCD86との間の相互作用を阻害するが、その作用機構は高レベルの細胞表面CTLA-4を発現する腫瘍浸潤性制御性T細胞のADCC枯渇を含むと考えられる。(Mahoney et al. (2015) NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY 14: 561-584)。CTLA-4は、抗CTLA-4 IgG1抗体を投与した場合にT細胞活性化をネガティブに制御するように機能するT細胞のサブセット(制御性T細胞)上で高度に発現されることを考慮すると、制御性T細胞の数は、ADCCを介して低減される。
【0177】
ある態様において、その作用の形態が主に、T細胞集団を有意に枯渇させることなく(例えばT細胞集団を拡大させる)、癌細胞とT細胞の間の抑制性シグナルを阻害することである免疫増強物質を使用することが望ましい。これを達成するために、ヒトIgG4アイソタイプを有するかまたはそれに基づく抗体、例えば抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体または抗PD-L2抗体を使用することが望ましい。ヒトIgG4アイソタイプは、ヒトIgG1アイソタイプと比較してほとんどまたは全くADCC活性を引き起こさないので(Mahoney et al. (2015)上述)、特定の状況下で好ましい。したがって、ある態様において、免疫増強物質、例えば抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体または抗PD-L2抗体は、ヒトIgG4アイソタイプを有するかまたはそれに基づく。ある態様において、免疫増強物質は、Treg、例えば非CTLA-4チェックポイントで方向づけられるIgG4抗体(例えば抗PD-1 IgG4阻害剤)を枯渇することが知られていない抗体である。
【0178】
ある態様において、免疫増強物質は、ヒトIgG1アイソタイプあるいは抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)および/または補体媒介性細胞傷害性(CDC)を誘発する別のアイソタイプを有するかあるいはそれに基づく抗体である。他の態様において、免疫増強物質は、ヒトIgG4アイソタイプあるいは抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)および/または補体媒介性細胞傷害性(CDC)をほとんどまたは全く誘発しない別のアイソタイプを有するかあるいはそれに基づく抗体である。
【0179】
例示的なPD-1系阻害剤は、米国特許第8,728,474号、第8,952,136号および第9,073,994号、ならびに欧州特許第1537878B1号に記載される。例示的な抗PD-1抗体は、例えば米国特許第8,952,136号、第8,779,105号、第8,008,449号、第8,741,295号、第9,205,148号、第9,181,342号、第9,102,728号、第9,102,727号、第8,952,136号、第8,927,697号、第8,900,587号、第8,735,553号および第7,488,802号に記載される。例示的な抗PD-1抗体としては、ニボルマブ(OPDIVO(登録商標)、Bristol-Myers Squibb)、ペンブロリズマブ(KEYTRUDA(登録商標)、Merck)、セミプリマブ(LIBTAYO(登録商標)、Regeneron/Sanofi)、スパルタリズマブ(spartalizumab) (PDR001)、MEDI0680 (AMP-514)、ピディリズマブ(pidilizumab) (CT-011)、ドスタルリマブ(dostarlimab) (TSR-042, WBP-285)、シンチリマブ(sintilimab) (IBI308)、トリパリマブ(toripalimab) (JS 001)、カムレリズマブ(camrelizumab) (SHR1210)、ピミバリマブ(pimivalimab) (JTX-4014)、チスレリズマブ(tislelizumab) (BGB-A317)、プロルゴリマブ(prolgolimab)、INCMGA00012 (MGA012)およびAMP-514が挙げられる。例示的な抗PD-L1抗体は、例えば米国特許第9,273,135号、第7,943,743号、第9,175,082号、第8,741,295号、第8,552,154号および第8,217,149号に記載される。例示的な抗PD-L1抗体としてはアベルマブ(BAVENCIO(登録商標)、EMD Serono/Pfizer)、アテゾリズマブ(TECENTRIQ(登録商標)、Genentech)およびデュルバルマブ(IMFINZI(登録商標)、Medimmune/AstraZeneca)、CS1001 (CStone Therapeutics)、タギタンリマブ(tagitanlimab) (KL-A167)、コシベリマブ(cosibelimab) (CK-301; Checkpoint Therapeutics)、TQB2450、エンバフォリマブ(envafolimab) (KN035)、SHR-1316、STI-A1014、BGB-A333、MSB2311、HLX-20およびBMS-936559 (Bristol-Myers Squibb)が挙げられる。
【0180】
ある態様において、被験体は、PD-1系阻害剤、例えば抗PD-1抗体、例えば本明細書において企図される抗PD-1抗体を、1～5週間毎(例えば1、2、3、4または5週間毎)に投与される。ある態様において、被験体は、PD-1系阻害剤、例えば抗PD-1抗体、例えば本明細書において企図される抗PD-1抗体を、2～4週間毎(例えば2、3または4週間毎)に投与される。
【0181】
PD-1系阻害剤は、例えば本明細書に上述のような当業者に公知の技術を使用して設計、発現および精製され得る。抗PD-1抗体は、米国特許第8,728,474号、第8,952,136号および第9,073,994号に記載されるように、設計、発現、精製、製剤化および投与され得る。
【0182】
他の免疫増強物質(例えば、抗体および種々の小分子)は、以下のリガンド：B7-H3 (特に前立腺、腎細胞、非小細胞肺、膵臓、胃、卵巣、結腸直腸の細胞に見られる)；B7-H4 (特に乳房、腎細胞、卵巣、膵臓、黒色腫の細胞に見られる)；HHLA2 (特に、乳房、肺、甲状腺、黒色腫、膵臓、卵巣、肝臓、膀胱、結腸、前立腺、腎臓の細胞に見られる)；ガレクチン(特に非小細胞肺、結腸直腸、および胃の細胞に見られる)；CD30 (特にホジキンリンパ腫、大細胞リンパ腫の細胞に見られる)；CD70 (特に非ホジキンリンパ腫、腎細胞に見られる)；ICOSL (特にグリア芽腫、黒色腫の細胞に見られる)；CD155 (特に腎臓、前立腺、膵臓グリア芽腫の細胞に見られる)：およびTIM3の1つ以上を含むシグナル伝達経路を標的化し得る。同様に、使用され得る他の潜在的な免疫増強物質としては、例えば4-1BB (CD137)アゴニスト(例えば完全ヒトIgG4抗CD137抗体ウレルマブ/BMS-663513)、LAG3阻害剤(例えばヒト化IgG4抗LAG3抗体LAG525、Novartis)；IDO阻害剤(例えば小分子INCB024360、Incyte Corporation)、TGFβ阻害剤(例えば小分子ガルニセルチブ、Eli Lilly)、ならびにT細胞および/または腫瘍細胞上に見られる他の受容体またはリガンドが挙げられる。ある態様において、前述のリガンドの1つ以上を含むシグナル伝達経路を標的化する免疫増強物質(例えば抗体および種々の小分子)は、アゴニスト/アンタゴニスト相互作用に基づくがADCCを介さない薬学的介入に従順である。
【0183】
本発明は、外科的介入と組み合わせて使用され得ることがさらに構想される。外科的介入の場合において、本発明は、例えば手術できない腫瘍被験体を切除するために、手術前に使用され得る。代替的に、本発明は、残存または転移性の疾患を治療するために手術時に、および/またはその後に使用され得る。例えば、切除された腫瘍床は、5T4標的化剤を含む製剤を用いて注射またはかん流され得る。かん流は、例えば埋め込まれたカテーテルを手術の部位に残すことにより、切除後に継続され得る。定期的な手術後の処置も構想される。本発明の治療と外科的手術の任意の組合せは本発明の範囲内にある。
【0184】
適切な場合、例えば腫瘍が切除されて、腫瘍床が、残存する微視的な疾患を排除するように処置される場合にも、連続投与が適用され得る。シリンジまたは焼灼を介した送達が好ましい。かかる連続かん流は、治療の開始後、約1～2時間から、約2～6時間まで、約6～12時間まで、約12～24時間まで、約1～2日まで、約1～2週間までまたはそれより長い期間に行われ得る。一般的に、連続かん流を介した治療的組成物の用量は、単回または複数回の注射により与えられ、かん流が行われる時間にわたり調整されるものと同等である。特に黒色腫および肉腫の治療において、本発明の治療的組成物を投与するために四肢のかん流が使用され得ることがさらに企図される。
【0185】
本明細書に記載される方法または組成物と組み合わせて投与され得る例示的な細胞傷害性剤としては、例えば微小管阻害薬(antimicrotubule agents)、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、タンパク質合成および分解阻害剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、プラチナ化製剤(platinating agents)、核酸合成の阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDAC阻害剤、例えばボリノスタット(SAHA、MK0683)、エンチノスタット(MS-275)、パノビノスタット(LBH589)、トリコスタチンA(TSA)、モセチノスタット(MGCD0103)、ベリノスタット(PXD101)、ロミデプシン(FK228、デプシペプチド))、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン、アルキルスルホネート、トリアゼン、葉酸アナログ、ヌクレオシドアナログ、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、タキサン、エポチロン、インターカレート剤(intercalating agents)、シグナル伝達経路を妨害し得る薬剤、アポトーシスを促進する薬剤および放射線、または毒性剤を送達するために表面タンパク質に結合する抗体分子コンジュゲートが挙げられる。一態様において、本明細書に記載される方法または組成物と共に投与され得る細胞傷害性剤は、白金系薬剤(例えばシスプラチン)、シクロホスファミド、ダカルバジン、メトトレキサート、フルオロウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ヒドロキシ尿素、トポテカン、イリノテカン、アザシチジン、ボリノスタット、イキサベピロン、ボルテゾミブ、タキサン(例えばパクリタキセルまたはドセタキセル)、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、コルヒチン、アントラサイクリン(例えばドキソルビシンまたはエピルビシン) ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、アドリアマイシン、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、リシンまたはマイタンシノイドである。
【実施例】
【0186】
実施例
以下の実施例は単なる例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することは意図されない。
以下の実施例は単なる例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することは意図されない。
【0187】
実施例1
この実施例には、ヒトグリア芽腫(GBM)腫瘍組織における5T4の発現分析が記載される。
この実施例には、ヒトグリア芽腫(GBM)腫瘍組織における5T4の発現分析が記載される。
【0188】
ヒトGBM組織試料は、商業的供給源から得て、ウサギ抗ヒト5T4抗体(クローンEPR5529; Abcam, ab134162)を使用して、免疫組織化学(IHC)により分析した。染色した試料を、訓練された病理学者が5T4存在率について採点した。存在率は、膜5T4発現を有する少なくとも0.5%腫瘍細胞を有する腫瘍コアのパーセンテージとして定義された。30の試料を分析した。予測されずに、分析されたGBM組織試料の87%(26/30)が、腫瘍膜陽性を示した。26の陽性症例のうち、67%(21/30)は、3%までの膜5T4発現を有する腫瘍細胞を有し、17% (5/30)は、10%より高い膜5T4発現を有する腫瘍細胞を有した。代表的なIHC画像を図4に示す。
【0189】
実施例2
この実施例には、ヒトグリア芽腫(GBM)細胞株U-138、U-87およびGMS-10における5T4膜発現の分析が記載される。高レベルの5T4を発現することが知られるヒト腎臓細胞癌(RCC)細胞株(Caki-2)および低レベルの5T4を発現することが知られるヒト卵巣癌細胞株(OVCAR-3)を対照として使用した。5T4膜発現はフローサイトメトリーにより決定した。
この実施例には、ヒトグリア芽腫(GBM)細胞株U-138、U-87およびGMS-10における5T4膜発現の分析が記載される。高レベルの5T4を発現することが知られるヒト腎臓細胞癌(RCC)細胞株(Caki-2)および低レベルの5T4を発現することが知られるヒト卵巣癌細胞株(OVCAR-3)を対照として使用した。5T4膜発現はフローサイトメトリーにより決定した。
【0190】
細胞株は、Alexa Fluor 647コンジュゲートマウスIgG1抗ヒト5T4モノクローナル抗体(クローン524744; R&D systems, FAB49751R)を用いたフローサイトメトリーを使用して分析した。Alexa Fluor 647コンジュゲートマウスIgG1アイソタイプ対照抗体を、染色についての陰性対照として使用した。細胞株をPBSで洗浄して、生存能力色素(Zombie Violet, BioLegend 77477またはZombie NIR, Biolegend 423105)を用いて標識し、次いでフローサイトメトリーバッファ(PBS、0.5% BSA、2mM EDTA、0.05% NaN3)中示されるmAbと室温で30分間インキュベートした。その後細胞をフローサイトメトリーバッファで洗浄して、MACSQuantフローサイトメーター(Miltenyi Biotec)上で取得した。死細胞を分析から除去した。FlowJo 10ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。図5に見られるように、全ての3つのGBM細胞株U-138、U-87およびGMS-10は、5T4発現について陽性であった。U-138、U-87およびGMS-10細胞株についてのアイソタイプ対照に対する5T4 mAb染色の倍率変化(FC)はそれぞれ5、8および11であり、これはOVCAR-3細胞株上の発現より高かった(FC=3)が、Caki-2細胞株上の発現よりも低かった(FC=19)。
【0191】
実施例3
この実施例には、ヒトグリア芽腫(GBM)細胞株U-138、U-87およびGMS-10に対する5T4標的化スーパー抗原ナプツモマブ・エスタフェナトクス(NAP；ANYARA(登録商標))と組み合わせたT細胞の抗癌効果を試験するインビトロ試験が記載される。
この実施例には、ヒトグリア芽腫(GBM)細胞株U-138、U-87およびGMS-10に対する5T4標的化スーパー抗原ナプツモマブ・エスタフェナトクス(NAP；ANYARA(登録商標))と組み合わせたT細胞の抗癌効果を試験するインビトロ試験が記載される。
【0192】
末梢血単核細胞(PBMC)を健常なドナーから単離した。PBMCを、10ng/mlのブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA)と4日間インキュベートした。次いでT細胞を単離して、IL-2とさらに1日間インキュベートした。1ウェル当たり8x103のU-138、U-87またはGMS-10細胞を、96ウェルプレート中1時間、T細胞とインキュベートした。エフェクター:標的比(T細胞:GBM細胞)は10:1であった。インキュベーションの1時間後、異なる濃度(0～10μg/mlの範囲)でNAPをウェルに添加して、プレートをさらに4～48時間インキュベートした。処理の終了時に懸濁されたT細胞および腫瘍細胞を含む培養上清を除去し、付着した腫瘍細胞を培養培地で1回洗浄した。残存GBM細胞の生存能力は、製造業者のプロトコルに従って、CCK8キット(Cell Counting Kit-8, Sigma Aldrich)により試験した。対照群の生存能力を100%に標準化した。癌細胞の生存能力(%) = (処理群のOD値/対照群のOD値) x 100。Graph Pad Prismソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0193】
3つのGBM細胞株についての用量応答曲線を示す：U-138 (図6A)、U-87 (図6B)およびGMS10 (図6C)。T細胞とNAPの組合せは、U-138、U-87およびGMS-10癌細胞の生存能力を低減し、NAPのIC50は、それぞれ0.5ng/ml、0.3ng/mlおよび0.95ng/mlであった(4～13pM)。これらのデータは、比較的低レベルの5T4発現を有するGBM細胞株を含む3つ全ての5T4発現GBM細胞株に対してNAPが高度に協力であることを示す。
【0194】
実施例4
この実施例には、5T4標的化スーパー抗原NAPと組み合わせたT細胞のGMS-10ヒトグリア芽腫(GBM)細胞株に対する抗癌効果が、5T4抗原により媒介されるかどうかを試験するインビトロ試験が記載される。
この実施例には、5T4標的化スーパー抗原NAPと組み合わせたT細胞のGMS-10ヒトグリア芽腫(GBM)細胞株に対する抗癌効果が、5T4抗原により媒介されるかどうかを試験するインビトロ試験が記載される。
【0195】
PBMCは健常なドナーから単離した。PBMCを、10ng/mlのブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA)と4日間インキュベートした。次いでT細胞を単離して、IL-2とさらに1日間インキュベートした。1ウェル当たり2x104のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)標識GMS-10細胞を96ウェルプレート中24時間インキュベートした。5T4抗原を阻害するために、これらの細胞を0～50μg/mlの抗5T4Fab、5T4FabV18とインキュベートした。24時間のインキュベーション後、GMS-10細胞を洗浄して、前活性化T細胞を、10:1のエフェクター:標的(T細胞:GMS-10細胞)比でウェルに添加した。インキュベーションの1時間後、異なる濃度(0～0.005μg/ml)のNAPをウェルに添加して、プレートをさらに48時間インキュベートした。処理の終了時に、懸濁されたT細胞および腫瘍細胞を含む培養上清を除去した。付着した腫瘍細胞をはがし、PBSで1回洗浄して、死細胞について染色した。残存GMS-10細胞の生存能力はFACSにより決定した。対照群中のCFSEゲート(gated)細胞の生存能力を100%に標準化した。癌細胞の生存能力(%) = (処理群の細胞計数値/対照群の細胞計数値) x 100。
【0196】
この試験の結果を図7に示す。示されるように、抗5T4Fabによる5T4抗原の阻害は、用量依存的様式でNAPの抗癌効果を低下させた。これらのデータは、GMS-10 GBM細胞株に対するNAP活性は、GMS-10細胞の表面上に発現される5T4抗原により媒介されることを示す。
【0197】
参照による援用
本明細書に参照される特許および科学文献のそれぞれの全開示は、全ての目的のために参照により援用される。
本明細書に参照される特許および科学文献のそれぞれの全開示は、全ての目的のために参照により援用される。
【0198】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化され得る。そのため、前述の態様は、全ての観点において、本明細書に記載される発明の限定ではなく例示としてみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が、本発明に包含されることが意図される。
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化され得る。そのため、前述の態様は、全ての観点において、本明細書に記載される発明の限定ではなく例示としてみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が、本発明に包含されることが意図される。
【0199】
配列表
【表1-1】
【表1-2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】