(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-19
(54)【発明の名称】中等症から重症の骨形成不全症の処置
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240412BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240412BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240412BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240412BHJP
C07K 16/22 20060101ALI20240412BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240412BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240412BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240412BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61P19/08
A61P43/00 121
A61K45/00
C07K16/22
C07K19/00
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023567146
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-12-22
(86)【国際出願番号】 US2022027666
(87)【国際公開番号】W WO2022235796
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】63/185,967
(32)【優先日】2021-05-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391058060
【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ブレンダン・リー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZC751
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB11
4C085BB36
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）を結合しかつ中和する作用剤の治療有効量を対象に投与することによって、対象における中等症から重症の骨形成不全症（ＯＩ）を処置および改善するための方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
それを必要とするヒト対象において骨形成不全症（ＯＩ）を処置するための方法であって、前記対象に治療有効量の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含み、前記抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片が、
それぞれ、配列番号４～６を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３、および
それぞれ、配列番号７～９を含む軽鎖ＣＤＲ１～３を含み、
前記治療有効量が１～１０ｍｇ／ｋｇである、方法。
【請求項2】
抗体または抗原結合断片は、配列番号１０を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１１を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
抗体はヒトＩｇＧ４定常領域および／またはヒトκ軽鎖定常領域を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ヒトＩｇＧ４定常領域はＳ２２８Ｐ突然変異（Ｅｕ付番）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
抗体は、配列番号３を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
抗体は骨標的部分を含み、場合により骨標的部分はポリアルギニンペプチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
抗体は１つまたはそれ以上のポリアルギニンペプチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
抗体は、抗体または抗原結合断片の、重鎖のＮ末端、もしくはＣ末端、もしくは両末端で、および／または
軽鎖のＣ末端で、
ポリアルギニンペプチドに融合されている、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ポリアルギニンペプチドはＤ１０（配列番号１４）である、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ＯＩは、中等症から重症のＯＩまたはタイプＩＶのＯＩである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
ヒト対象は、成人患者（≧１８歳）または小児患者（＜１８歳）である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
ヒト対象は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子またはＣＯＬ１Ａ２遺伝子に突然変異を有し、場合により、突然変異は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子もしくはＣＯＬ１Ａ２遺伝子のグリシン置換突然変異、またはＣＯＬ１Ａ２遺伝子のバリン欠失である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
投与は、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、骨量密度（ＢＶ／ＴＶ）、全骨面（ＢＳ）、骨面密度（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁中心距離（Ｔｂ．Ｓｐ）、および全骨量（Ｄｅｎｓ ＴＶ）からなる群から選択される骨パラメータを改善する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
骨パラメータは、腰椎面積ＢＭＤ（ＬＳ ａＢＭＤ）であり、場合により、ＬＳ ａＢＭＤは、ベースラインレベルと比べて投与後に少なくとも１～１０％向上する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
投与は、骨代謝回転および／または骨細胞密度を低下させ、場合により、骨代謝回転の低下は、血清ＣＴＸの低下または血清オステオカルシン（ＯＣＮ）の上昇によって示される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
治療有効量は１ｍｇ／ｋｇである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
治療有効量は４ｍｇ／ｋｇである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
投与する工程を毎月、２か月ごと、３か月ごと、６か月ごと、９か月ごと、または１２か月ごとに繰り返すことをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
抗体または抗原結合断片は静脈内注入によって投与される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、テリパラチド、または抗スクレロスチン剤を対象に投与することをさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
ビスホスホネートは、アレンドロネート、パミドロネート、ゾレドロネート、およびリセドロネートから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片であって、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法において骨形成不全症の処置に使用するための、
抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項24】
請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法において骨形成不全症を処置するための医薬の製造における抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片の、使用。
【請求項25】
製品またはキットであって、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法において骨形成不全症の処置に使用するための、抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を含む、
製品またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月７日出願の米国仮特許出願第６３／１８５，９６７号の優先権を主張するものである。この優先権出願の開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本出願は、２０２１年５月７日出願の米国仮特許出願第６３／１８５，９６７号の優先権を主張するものである。この優先権出願の開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【0002】
政府の資金援助
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金ＡＲ０６８０６９の下に政府支援によりなされたものである。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金ＡＲ０６８０６９の下に政府支援によりなされたものである。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【0003】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出している配列表を含み、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。２０２２年５月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０２６＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１７，８７５バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出している配列表を含み、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。２０２２年５月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０２６＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１７，８７５バイトのサイズである。
【0004】
共同研究契約
本研究は、Ｓａｎｏｆｉ Ｇｅｎｚｙｍｅとの研究契約によって支援されたものである。
本研究は、Ｓａｎｏｆｉ Ｇｅｎｚｙｍｅとの研究契約によって支援されたものである。
【背景技術】
【0005】
骨形成不全症（ＯＩ）は、結合障害の遺伝的にも表現型的にも不均一なメンデル遺伝病であり、この遺伝病は１０，０００～２０，０００人の出生で１人の推定有病率である。ＯＩの骨格系症状には、低骨量、骨の脆弱性、再発性骨折、側弯症、および骨変形が含まれる。骨格外症状には、筋肉量の低下、筋力低下、象牙形成不全症、難聴、および肺疾患が含まれる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。ＯＩの個体の管理には通常、集学的アプローチが伴う。ＯＩ骨脆弱性の基幹となる療法には、骨粗鬆症の処置に使用される医薬の転用が伴う（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。
【0006】
骨リモデリングを低下させる骨吸収抑制薬のクラスであるビスホスホネート（ＢＰＮ）は、とりわけ小児ＯＩにおいて標準治療となってきた。児童では、ＢＰＮは、面積骨密度および体積骨密度（ａＢＭＤおよびｖＢＭＤ）、側弯症の進行、生活の質、および一部の研究では骨折発生率に対して有益な効果を有することが示されてきた（非特許文献１８；非特許文献１４；非特許文献１９；非特許文献２０）。しかし、ＯＩの不均一性および臨床試験計画のばらつきを考慮すると、ＢＰＮの効果は一致していない。成人では、ビスホスホネートによる長期処置の利益および帰結はあまり確かではない（非特許文献９；非特許文献２１）。加えて、ＯＩの成人が関与するランダム化試験では、同化剤であるテリパラチドを用いる処置により、軽症型（ＯＩのタイプＩ）の個体ではａＢＭＤおよびｖＢＭＤの向上がもたらされたが、中等症型から重症型の障害（ＯＩのタイプＩＩＩおよびタイプＩＶ）ではもたらされなかった。さらに、転用されたこういった療法はいずれも、ＯＩにおける特定の発症メカニズムに対処するものではなく、したがって、骨格外症状に対して効果がまったくない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｍａｒｉｎｉ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｉｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ（２０１７）３：１７０５２頁
【非特許文献2】Ｍａｒｏｍら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ｃ Ｓｅｍｉｎ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．（２０１６）１７２（４）：３６７～８３頁
【非特許文献3】Ｐａｔｅｌら、Ｃｌｉｎ Ｇｅｎ．（２０１５）８７（２）：１３３～４０頁
【非特許文献4】Ｒｏｓｓｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ．（２０１９）３１（６）：７０８～１５頁
【非特許文献5】Ｔａｍら、Ｃｌｉｎ Ｇｅｎ．（２０１８）９４（６）：５０２～１１頁
【非特許文献6】ＤｉＭｅｇｌｉｏら Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．（２００６）２１：１３２～４０頁
【非特許文献7】Ｇａｔｔｉら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．（２００５）２０（５）：７５８～６３頁
【非特許文献8】Ｇａｔｔｉら、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．（２０１３）９３（５）：４４８～５２頁
【非特許文献9】Ａｄａｍｉら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．（２００３）１８（１）：１２６～３０頁
【非特許文献10】Ｂｉｓｈｏｐら、Ｅａｒ Ｈｕｍ Ｄｅｖ．（２０１０）８６（１１）：７４３～６頁
【非特許文献11】Ｃｈｅｖｒｅｌら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．（２００６）２１（２）：３００～６頁
【非特許文献12】Ｇｌｏｒｉｅｕｘら、ＮＥＪＭ（１９９８）３３９（１４）：９４７～５２頁
【非特許文献13】Ｒａｕｃｈら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．（２００９）２４（７）：１２８２～９頁
【非特許文献14】Ｒａｕｃｈら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．（２００３）１８（４）：６１０～４頁
【非特許文献15】Ｏｒｗｏｌｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２０１４）１２４（２）：４９１～８頁
【非特許文献16】Ｈｏｙｅｒ－Ｋｕｈｎら、Ｊ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ／（２０１６）１６（１）：２４～３２頁
【非特許文献17】Ａｎｉｓｓｉｐｏｕｒら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．（２０１４）９６（３）：２３７～４３頁
【非特許文献18】Ｂｉｓｈｏｐら、Ｌａｎｃｅｔ（２０１３）３８２（９９０２）：１４２４～３２頁
【非特許文献19】Ｂａｉｎｓら、ＪＢＭＲ Ｐｌｕｓ（２０１９）３（５）：ｅ１０１１８
【非特許文献20】Ｒａｕｃｈら、Ｂｏｎｅ（２００７）４０（２）：２７４～８０頁
【非特許文献21】Ｓｈｉら、Ａｍ Ｊ Ｔｈｅｒ．（２０１６）２３（３）：ｅ８９４～９０４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、中等症型から重症型のＯＩを標的とする効果的な療法に対する満たされていない深刻なニーズが依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示は、それを必要とするヒト対象において骨形成不全症（ＯＩ）を処置するための方法であって、その対象に治療有効量の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含み、抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片が、それぞれ、配列番号４～６を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３、およびそれぞれ、配列番号７～９を含む軽鎖ＣＤＲ１～３を含み、前記治療有効量が１～１０ｍｇ／ｋｇである方法を提供する。
【0010】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１０を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１１を含む軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ４定常領域および／またはヒトκ軽鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ４定常領域はＳ２２８Ｐ突然変異（Ｅｕ付番）を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。他の特定の実施形態では、抗体は、配列番号３を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。
【0011】
一部の実施形態では、抗体は骨標的部分を含み、場合により骨標的部分はポリアルギニンペプチドである。一部の実施形態では、抗体は、例えば、抗体または抗原結合断片の、重鎖のＮ末端、もしくはＣ末端、もしくは両末端に、および／または軽鎖のＣ末端に、１つまたはそれ以上のポリアルギニンペプチドを含む。特定の実施形態では、ポリアルギニンペプチドはＤ１０（配列番号１４）である。
【0012】
一部の実施形態では、ＯＩは、中等症から重症のＯＩまたはタイプＩＶのＯＩである。一部の実施形態ではヒト対象は、成人患者（≧１８歳）または小児患者（＜１８歳）である。一部の実施形態では、ヒト対象は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子またはＣＯＬ１Ａ２遺伝子に突然変異を有し、場合により、突然変異は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子もしくはＣＯＬ１Ａ２遺伝子のグリシン置換突然変異、またはＣＯＬ１Ａ２遺伝子のバリン欠失である。
【0013】
一部の実施形態では、投与は、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、骨量密度（ＢＶ／ＴＶ）、全骨面（ＢＳ）、骨面密度（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁中心距離（Ｔｂ．Ｓｐ）、および全骨量（Ｄｅｎｓ ＴＶ）からなる群から選択される骨パラメータを改善する。さらなる実施形態では、骨パラメータは、腰椎面積ＢＭＤ（ＬＳ ａＢＭＤ）であり、場合により、ＬＳ ａＢＭＤは、ベースラインレベルと比べて投与後に少なくとも１～１０％で向上する。
【0014】
一部の実施形態では、投与は、骨代謝回転および／または骨細胞密度を低下させ、場合により、骨代謝回転の低下は、血清ＣＴＸの低下または血清オステオカルシン（ＯＣＮ）の上昇によって示される。
【0015】
一部の実施形態では、投与する工程は毎月、２か月ごと、３か月ごと、６か月ごと、９か月ごと、または１２か月ごとに、例えば、４ｍｇ／ｋｇの用量で繰り返される。抗体または抗原結合断片は静脈内注入によって投与することができる。
【0016】
一部の実施形態では、方法は、ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート、パミドロネート、ゾレドロネート、およびリセドロネート）、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、テリパラチド、または抗スクレロスチン剤のような別の治療薬を対象に投与することをさらに含む。
【0017】
本明細書の処置方法において骨形成不全症の処置に使用するための、抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片、および、本明細書の処置方法において骨形成不全症を処置するための医薬の製造における抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片の使用も、本明細書で提供される。
【0018】
本明細書の処置方法において骨形成不全症の処置に使用するための、抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を含む、製品（例えば、キット）も提供される。
【0019】
その他の本発明の特徴、目的および利点は、以下の発明の詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を指示するものの、例示のためにのみ与えられており、限定するものでないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】組織学、ＲＮＡ、およびタンパク質研究向けのヒト骨標本プロセシングを示す図である。パネルＡ：骨標本を２層液体窒素に浸漬し、電動ドリルにより微粉砕したことを示す骨標本微粉砕環境の例示。パネルＢ：プロセシング前の骨標本の画像を右上隅に示す。微粉砕後、乳棒の底の骨粉を液体窒素中で採取した。微粉砕領域のすぐ隣の２～３ｍｍ３の領域を組織学および免疫化学向けに処理した。
【図2-1】ＯＩのタイプＩＩＩの個体および非罹患対照の骨組織学を示す図である。パネルＡ：採取された骨標本のＨ＆Ｅ染色組織切片の全部の画像。非罹患個体からの標本の大部分は皮質骨であった。ＯＩのタイプＩＩＩの標本はより不均一であった。大部分は皮質骨であったが、２つの標本（ＯＩ６２およびＯＩ８３）は骨梁骨のみを含有した。１件の標本（ＯＩ４１）は線維性軟骨を有し、１件の標本（ＯＩ３５）は仮骨および骨梁骨を含有した。スケールバー：２００μｍ。パネルＢ：非罹患対照骨およびＯＩのタイプＩＩＩ骨の代表的なより高倍率（１０×）Ｈ＆Ｅ染色画像。対照骨では、よく組織化されたハバース管系が観察され、一方、ＯＩのタイプＩＩＩ骨は、ほとんど組織化されていないハバース管を有する、より線維性の皮質骨を示し、いっそう球形の形状であるより多くの骨細胞が認められた。スケールバー：５０μｍ。
【図3】タイプＩＩＩのＯＩ骨における骨細胞密度の上昇を示す図である。非罹患対照（ｎ＝４）およびＯＩのタイプＩＩＩ（ｎ＝１０）における骨細胞密度の定量化。各ドットは、一個体の骨細胞密度を表す。平均値および標準偏差を図示する。
【図4-1】ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇおよびＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅのプラットフォームを使用した遺伝子の発現変化を示す図である。ＲＮＡ－ｓｅｑデータとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータの両方とともに１件の非ＯＩ対照および１件のタイプＩＩＩのＯＩを解析に含めた。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ品質管理を満たす１５５の遺伝子を、ＲＮＡ－ｓｅｑ差次的発現データの検証に使用した。１５５の遺伝子のＲＮＡ－ｓｅｑおよびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇからの倍率変化の方向（非ＯＩ対照と比較して上昇または低下）を、赤色の上矢印（タイプＩＩＩのＯＩで上昇）または青色の下矢印（タイプＩＩＩのＯＩで低下）として提示する。紫色の背景：２つのプラットフォーム間で不一致の倍率変化の方向。白色の背景：２つのプラットフォーム間で一致した倍率変化の方向。一致率は９２％である。
【図5-1】タイプＩＩＩのＯＩ骨におけるＴＧＦβシグナル伝達の活性化を実証するトランスクリプトーム解析およびバイオインフォマティクス解析を表す図である。パネルＡに、すべての対照およびＯＩのタイプＩＩＩの主成分分析（ＰＣＡ）プロットを３－ＰＣ次元で示す。パネルＢに、すべての対照骨およびＯＩのタイプＩＩＩ骨のデータのＲＰＫＭを使用したユークリッド距離に基づく階層的クラスタリングを示す。青色：下方制御されている；黄色：上方制御されている。パネルＣに、ＴＧＦβシグナル伝達の活性化を実証した遺伝子セット濃縮プロットを示す。ＮＥＳ：正規化濃縮スコア。ＦＤＲ：誤検出率。解析データベースに設定されたＴＧＦβ遺伝子に関与する遺伝子の発現パターン。青色：下方制御されている。赤色：上方制御されている。Ｃ：対照。ＯＩ：ＯＩのタイプＩＩＩ。
【図6-1】タイプＩＩＩのＯＩ骨における濃縮倍率変化を伴う、有意に濃縮されたＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）解析結果を示す図である。骨格プロセス、骨細胞、コラーゲン、および骨格関連の主要なシグナル伝達経路のカテゴリーに基づくＰａｒｔｅｋ ＧＯ濃縮の結果を提供する。有意性は、Ｐ値＜０．０５によって定義した。
【図7-1】タイプＩＩＩのＯＩおよび対照の転写プロファイルの上位２０位の遺伝子セット濃縮アッセイ（ＧＳＥＡ）結果を示す図である。タイプＩＩＩのＯＩにおけるまたは非ＯＩ対照における上位２０の濃縮遺伝子セットを提供する。ＮＥＳ：正規化濃縮スコア。ＦＤＲ ｑ－ｖａｌ：誤検出率調整済みｑ－値。
【図8-1】ＲＰＰＡ解析において有意に変化したタンパク質を示す図である。表に、タイプＩＩＩのＯＩ骨における公称Ｐ値＜０．０５に基づいて、有意に変化したタンパク質の完全なリストを示す。タンパク質発現レベルを、タンパク質アレイの正規化強度として提示する。
【図9】ＯＩのタイプＩＩＩ骨におけるリン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）レベルの上昇を示す図である。パネルＡに、対照およびＯＩのタイプＩＩＩの骨切片におけるｐＳＭＡＤ２の免疫組織化学染色を示す。より高倍率の画像を右下の黒のボックスに示す。すべてのＯＩサンプル、特に骨細胞においてｐＳＭＡＤ２シグナルの上昇を検出した。スケールバー：２０μｍ。パネルＢに、対照骨およびＯＩのタイプＩＩＩ骨から抽出されたタンパク質中のリン酸化ＳＭＡＤ２（ｐ－ＳＭＡＤ２）および総ＳＭＡＤ２（Ｔ－ＳＭＡＤ２）のウェスタンブロットを示す。総タンパク質５０μｇをロードした。さらなるＯＩ６２サンプルを仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理してリン酸化シグナルを除去し、正確なｐＳＭＡＤ２シグナル（矢印で指示）のネガティブ対照として機能させた。パネルＣに、（Ｂ）のウェスタンブロットの定量結果を示すが、リン酸化（ホスフォ）対総ＳＭＡＤ２の比として示す。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。Ｃ：対照。ＯＩ：ＯＩのタイプＩＩＩ。
【図10】ＯＩの成人におけるフレソリムマブの安全性を評価する試験からの血液学的な安全性データを示す図である。ヘモグロビンの降下が２人の参加者（ＦＲ００５とＦＲ００９）で認められ、両人とも軽症と類別した。これら２個体は、治験薬に関連すると類別された鼻出血と、治験薬と無関係であると類別されなかった月経出血を有した。血小板数およびＩＮＲは正常範囲内であった。
【図11】骨代謝回転マーカーおよび骨密度に対するフレソリムマブの効果を例示する図である。オステオカルシン（Ｏｃｎ）レベルおよびＣ末端テロペプチド（ＣＴＸ）レベルの上昇が、１ｍｇ・１ｋｇの体重－１のコホートの参加者４人のうち３人で観察され、ピーク値は処置後３０日から９０日の間に観察された。４ｍｇ・１ｋｇの体重－１のコホートでは、Ｏｃｎの低下が３０日目に観察され、この抑制は１８０日目まで持続した。参加者ＦＲ０１２では、移動することが不可能であったため、３０日目の骨代謝回転マーカーを取得することができなかった。ＯＩのタイプＩＶの個体２人は、両方の用量コホートでＬ１－４ ａＢＭＤの確固たる向上を有した。
【図12】ＬＳ ａＢＭＤの２つの中央読取り値の間の相関関係および一致を例示する図である。ＬＳ ａＢＭＤは、試験計画に盲検化された独立した２人のリーダーによって読み取られた。２つの読取り値の間には強い相関関係があった（Ｒ＝０．９９５）。Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎプロットは、２つの読取り値の間で高度な一致を示した。平均差、一致の上限、一致の下限、および信頼区間を、それぞれ青色、緑色、および赤色で図示する。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本開示は、ヒトＴＧＦβのすべてのアイソフォームと結合し、これらを中和するモノクローナル抗体を投与することによって、ヒト患者において中等症から重症のＯＩ（例えば、タイプＩＶのＯＩ）を処置する方法を提供する。本方法は、患者のＯＩの症状を改善するのに、抗ＴＧＦβ抗体の頻繁ではない投薬（例えば、３か月ごとまたは６か月ごと）で十分とすることができるという驚くべき発見に基づくものである。
【0022】
ＯＩ骨脆弱性に対する標準治療の療法には、骨粗鬆症を処置するのに使用される医薬の転用を含む。しかし、ＯＩの不均一性および臨床試験計画のばらつきを考慮すると、ＢＰＮの効果は一貫していない。さらに、ＯＩの成人を含むランダム化試験では、同化剤であるテリパラチドを用いる処置により、軽症型（ＯＩのタイプＩ）の個体ではａＢＭＤおよびｖＢＭＤの向上がもたらされたが、中等症型から重症型の障害（ＯＩのタイプＩＩＩおよびタイプＩＶ）ではもたらされなかった。転用されたこういった療法はいずれも、ＯＩにおける特定の発症メカニズムに対処するものではなく、したがって、骨格外症状に対して効果がまったくない。本発明者らは、１または４ｍｇ／ｋｇの単回用量の抗ＴＦＧｐ抗体で処置された中等症から重症のＯＩの個体は、腰椎面積骨ミネラル密度（ＬＳ ａＢＭＤ）の確固たる向上を示したとの驚くべき知見を得た。
【0023】
骨におけるＴＧＦβシグナル伝達を標的とすることは、重要な薬力学的利点を提供する。骨格外組織におけるこのような重要な経路をモジュレートするには、持続的な薬理学的阻害が必要であるが、ヒトの骨のリモデリングユニットはおよそ３か月である。したがって、単一時点にての薬理学的阻害は、循環中の薬物の終末半減期および持続性を超えた長時間の効果を有する可能性がある。本明細書では、汎特異的抗ＴＧＦβ抗体の単回用量による処置でも、９０日目および１８０日目の骨代謝回転およびａＢＭＤの変化に関連していたことが示されている。加えて、投与頻度が低いことで、累積投薬量がより低くなり、その結果、全身毒性の軽減が可能になることに起因して、安全性の利点がもたらされる。低頻度投薬の効能は驚くべきものであるが、なぜなら、ＯＩマウスでの前臨床試験では、週３回の頻度にての抗ＴＧＦβ抗体（マウス抗体１Ｄ１１）を用いる処置により改善に関する所見がもたらされたが、より少ない頻度で（例えば、Ｑ４Ｗで）マウスに投薬した場合はその改善が減弱したからである。
【0024】
Ｉ．骨形成不全症
ＯＩは、骨マトリクス沈着またはホメオスタシスに関与する１種またはそれ以上のタンパク質の欠損によって特徴付けられる一群の先天性骨障害を包含する。特定の遺伝子突然変異、生成するタンパク質の欠損、および罹患個体の表現型によって定義される１９超のタイプのＯＩがある。分類には、Ｘ線およびその他の画像検査での所見が含まれる。主たるＯＩのタイプは以下の通リである（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウエブサイトからの情報）。
ＯＩは、骨マトリクス沈着またはホメオスタシスに関与する１種またはそれ以上のタンパク質の欠損によって特徴付けられる一群の先天性骨障害を包含する。特定の遺伝子突然変異、生成するタンパク質の欠損、および罹患個体の表現型によって定義される１９超のタイプのＯＩがある。分類には、Ｘ線およびその他の画像検査での所見が含まれる。主たるＯＩのタイプは以下の通リである（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウエブサイトからの情報）。
【0025】
タイプＩは、最も軽症かつ最も一般的なタイプである。罹患児童すべてのうちの約５０％がこのタイプを有する。骨折および変形は少数である。
【0026】
タイプＩＩは最も重症のタイプである。乳児は非常に短い腕や脚、小さい胸部、および柔らかい頭蓋骨を有する。乳児は骨折をもって生まれる場合があり、出生体重が低く、十分に発達していない肺を有する場合もある。タイプＩＩのＯＩの乳児は、通常、生後数週間以内に死亡する。
【0027】
タイプＩＩＩは、新生児時に死亡しない乳児において最も重症のタイプである。出生時、乳児は、正常よりもやや短い腕や、腕、脚および肋骨の骨折を有する場合がある。乳児は、正常な頭部よりも大きい頭部、三角形状の顔、変形した胸部と背骨、および呼吸と嚥下の問題を有する場合もある。
【0028】
タイプＩＶは、症状が軽症から重症の間であるＯＩのタイプである。タイプＩＶの乳児は出生時に診断される場合がある。乳児は、ハイハイまたは歩行するまではまったく骨折しない場合がある。腕と脚の骨がストレートではない場合がある。乳児は正常に成長しないおそれがある。
【0029】
タイプＶはタイプＩＶに類似する。症状は中等症から重症とすることができる。大きな骨が骨折している領域に、肥大肥厚した領域（仮骨肥大）を有することが普通である。
【0030】
タイプＶＩは非常にまれである。症状は中等症であり、タイプＩＶに類似する。
【0031】
タイプＶＩＩは、タイプＩＶまたはタイプＩＩ同様とすることができる。正常な身長よりも低い身長であるのが普通である。正常な上腕や大腿骨よりも短い上腕や大腿骨を有することも普通である。
【0032】
タイプＶＩＩＩは、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩに類似する。患者は非常に柔らかい骨を有し、重症の成長の問題を抱える。
【0033】
表現型はＯＩのタイプのうちで様々であるが、共通の症状として、骨格と歯の不完全骨化、骨量減少、脆弱骨、および病的骨折が含まれる。具体的な症状には、折れやすい骨、骨の変形（例えば脚の湾曲）、白目（強膜）の変色、たる状胸部、曲がった脊椎、三角形状の顔、動揺関節、筋力低下、あざができやすい皮膚、成人早期の難聴、および／または柔らかい変色歯が含まれる。ＯＩの合併症には、呼吸器感染（例えば、肺炎）、心臓の問題（例えば、心臓弁機能低下）、腎臓結石、関節の問題、難聴、および異常な眼の状態（失明を始めとする）が含まれる。ＯＩは、Ｘ線、臨床検査（例えば、血液検査および遺伝子検査）、二重エネルギーＸ線吸収測定法スキャン（ＤＸＡまたはＤＥＸＡスキャン）、および骨生検によって診断またはモニタリングすることができる。
【0034】
複数の病原性遺伝子突然変異がＯＩの種々のサブタイプを引き起こすことができるが、９０％超がＣＯＬ１Ａ１遺伝子（Ｉ型コラーゲンアルファ１鎖をコードする）もしくはＣＯＬ２Ａ１遺伝子（タイプＩＩコラーゲンアルファ１鎖をコードする）、またはＩ型コラーゲンを翻訳後修飾するタンパク質（ＣＲＴＡＰ、ＰＰＩＢおよびＬＥＰＲＥ１）をコードする遺伝子における病原性バリアントによって引き起こされる（Ｐａｔｅｌら、同書；Ｌｉｍら、Ｂｏｎｅ（２０１７）１０２：４０～４９頁）。
【0035】
本開示の処置方法は、タイプＩＶのＯＩのような中等症型から重症型のＯＩを処置する上で効果的である。一部の実施形態では、患者のＯＩは、ＣＯＬ１Ａ１もしくはＣＯＬ１Ａ２における突然変異（例えば、グリシン置換）によって、またはＣＲＴＡＰ、ＰＰＩＢもしくはＬＥＰＲＥ１における両対立遺伝子病原性バリアントによって引き起こされる。例えば、下の表１および３に示される突然変異を参照されたい。
【0036】
ＩＩ．抗ＴＧＦβ抗体
ＴＧＦβは、細胞の増殖および分化、胚発生、細胞外マトリクス形成、骨の発達、創傷治癒、造血、ならびに免疫応答および炎症応答に関与する多機能性サイトカインである。分泌されたＴＧＦβタンパク質は、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）および成熟ＴＧＦβペプチドへと切断され、潜在型および活性型で見いだされる。成熟ＴＧＦβペプチドは、ホモ二量体および他のＴＧＦβファミリーメンバとのヘテロ二量体の両方を形成する。
ＴＧＦβは、細胞の増殖および分化、胚発生、細胞外マトリクス形成、骨の発達、創傷治癒、造血、ならびに免疫応答および炎症応答に関与する多機能性サイトカインである。分泌されたＴＧＦβタンパク質は、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）および成熟ＴＧＦβペプチドへと切断され、潜在型および活性型で見いだされる。成熟ＴＧＦβペプチドは、ホモ二量体および他のＴＧＦβファミリーメンバとのヘテロ二量体の両方を形成する。
【0037】
３種類のヒト（ｈ）ＴＧＦβのアイソフォーム：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３（それぞれ、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１１３７、Ｐ０８１１２、およびＰ１０６００）がある。ＴＧＦβ１は、ＴＧＦβ２と２７個、ＴＧＦβ３と２２個、主に保存的なアミノ酸が異なる。ヒトＴＧＦβはマウスＴＧＦβと非常に類似する：ヒトＴＧＦβ１はマウスＴＧＦβ１とアミノ酸わずか１個の差異を有する；ヒトＴＧＦβ２はマウスＴＧＦβ２とアミノ酸わずか３個の差異を有する；ヒトＴＧＦβ３はマウスＴＧＦβ３と同一である。
【0038】
ホモ二量体またはヘテロ二量体のＴＧＦβ膜貫通受容体複合体へのＴＧＦβタンパク質の結合は、細胞内ＳＭＡＤタンパク質によって媒介されるカノニカルＴＧＦβシグナル伝達経路を活性化する。ＴＧＦβの脱調節は、ヒトにおいて、先天的欠損症、がん、慢性炎症、自己免疫疾患および線維性疾患のような様々な状態に関係あるとされてきた、病理学的プロセスにつながる（例えば、Ｂｏｒｄｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．（１９９４）３（４）：４４６～５２頁；Ｂｏｒｄｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ増補（１９９５）４９：Ｓ５９～６１頁を参照されたい）。
【0039】
本ＯＩ処置方法の場合、抗ＴＧＦβ抗体は、汎特異的抗体、すなわち、高い親和性で、ＴＧＦβの３つのアイソフォームすべてと結合し、これらを中和する抗体とすることができる。一部の実施形態では、抗体はフレソリムマブである。フレソリムマブは、組換えヒト抗体である。その重鎖を下に示す：
【0040】
【化1】
【0041】
フレソリムマブの軽鎖を下に示す：
【0042】
【化2】
【0043】
一部の実施形態では、本明細書の抗ＴＧＦβ抗体は、フレソリムマブのバリアント、Ａｂ１である。Ａｂ１の重鎖は、ＩｇＧ４ヒンジ領域の一残基のみがフレソリムマブの重鎖と異なる。残基はＳ２２８（Ｅｕ付番）であり、この場合、Ａｂ１はその位置にプロリンを有する、すなわち、フレソリムマブと比べてＳ２２８Ｐ置換を有する。Ａｂ１とフレソリムマブは同じ軽鎖を有する。Ａｂ１の重鎖を下に示す：
【0044】
【化3】
【0045】
一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、フレソリムマブのＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のうちの１つまたはそれ以上（例えば、６つすべて）を含む。換言すると、抗体は以下のＨＣＤＲおよびＬＣＤＲのうちの１つまたはそれ以上（例えば、６つすべて）を含む：
ＨＣＤＲ１ ＳＮＶＩＳ（配列番号４）
ＨＣＤＲ２ ＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧ（配列番号５）
ＨＣＤＲ３ ＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹ（配列番号６）
ＬＣＤＲ１ ＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡ（配列番号７）
ＬＣＤＲ２ ＧＡＳＳＲＡＰ（配列番号８）
ＬＣＤＲ３ ＱＱＹＡＤＳＰＩＴ（配列番号９）
ＨＣＤＲ１ ＳＮＶＩＳ（配列番号４）
ＨＣＤＲ２ ＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧ（配列番号５）
ＨＣＤＲ３ ＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹ（配列番号６）
ＬＣＤＲ１ ＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡ（配列番号７）
ＬＣＤＲ２ ＧＡＳＳＲＡＰ（配列番号８）
ＬＣＤＲ３ ＱＱＹＡＤＳＰＩＴ（配列番号９）
【0046】
一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、フレソリムマブまたはＡｂ１のＶＨおよび／またはＶＬを含む。換言すると、抗体は以下の配列のうちの１つまたは両方を含む：
ＶＨ：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ ＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ ＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹ ＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩ ＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹ ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬ ＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷ ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）
ＶＬ：
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴ ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ ＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧ ＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫ ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ ＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰ ＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴ ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥ ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ ＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧ ＱＧＴＲＬＥＩＫ
（配列番号１１）
ＶＨ：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ ＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ ＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹ ＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩ ＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹ ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬ ＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷ ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）
ＶＬ：
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴ ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ ＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧ ＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫ ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ ＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰ ＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴ ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥ ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ ＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧ ＱＧＴＲＬＥＩＫ
（配列番号１１）
【0047】
一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプのようなヒトＩｇＧアイソタイプのものである。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ４定常領域は、以下のアミノ酸配列を含む：
【0048】
【化4】
【0049】
一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体（例えば、Ａｂ１およびフレソリムマブ）は、ヒトκ軽鎖定常領域（Ｃκ）を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＣκは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号１３）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号１３）
【0050】
一部の実施形態では、完全な抗ＴＧＦβ抗体の抗原結合断片も使用することができる。「抗原結合断片」という用語または類似の用語は、抗原と相互作用するとともに当該抗原に対するその特異性と親和性を結合剤に付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部分を指す。抗原結合断片の非限定的な例としては、以下が挙げられる：Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ断片、および抗体の超可変ドメインを模倣するアミノ酸残基から構成される最小認識単位。
【0051】
一部の実施形態では、本明細書の抗体または抗原結合断片は、骨標的部分に接続される。さらなる実施形態では、骨標的部分はポリアルギニン（ポリＤ）ペプチドである。本明細書で使用される場合、「ポリＤペプチド」という用語は、複数のアスパラギン酸またはアスパルテートまたは「Ｄ」アミノ酸、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０個、またはそれ超のアスパラギン酸のアミノ酸（残基）を有するペプチド配列を指す。例えば、ポリＤペプチドは、約２～約３０個、または約３～約１５個、または約４～約１２個、または約５～約１０個、または約６～約８個、または約７～約９個、または約８～約１０個、または約９～約１１個、または約１２～約１４個のアスパラギン酸残基を含むことができる。ポリＤペプチドは、アスパラギン酸残基のみを含んでもよく、１個またはそれ以上の他のアミノ酸もしくは類似の化合物を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「Ｄ１０」という用語は、配列番号１４に見られるように、１０個のアスパラギン酸のアミノ酸の連続した配列を指す。一部の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２超のポリＤペプチドを含むことができる。
【0052】
ポリＤペプチドは、組換え技術を介した融合によって抗ＴＧＦβ抗体または抗原結合断片に接続することができ、その結果、ポリＤがペプチジル結合をとおして抗体または断片に接続される（すなわち、抗体または断片は融合タンパク質である）。例えば、ポリＤペプチドを、重鎖のＮ末端もしくはＣ末端、もしくは両末端に、および／または軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端、もしくは両末端に、融合することができる。ポリＤペプチドはまた、化学コンジュゲーションによって、例えば、リンカー部分（例えば、マレイミド官能基およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の有無にかかわらず、抗体または抗体結合断片上のシステイン残基またはリジン残基との化学反応によって、抗ＴＧＦβ抗体または抗原結合断片に接続させることもできる。例えば、ＷＯ２０１８／１３６６９８を参照されたい。
【0053】
ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖のＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端でＤ１０ペプチドに融合されたフレソリムマブである。一部の実施形態では、抗体は、軽鎖のＣ末端でＤ１０ペプチドに融合されたフレソリムマブである。特定の実施形態では、抗体は、重鎖の両末端でおよび軽鎖のＣ末端でＤ１０ペプチドに融合されたフレソリムマブである。
【0054】
ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖のＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端でＤ１０ペプチドに融合されたＡｂ１である。一部の実施形態では、抗体は、軽鎖のＣ末端でＤ１０ペプチドに融合されたＡｂ１である。特定の実施形態では、抗体は、重鎖の両末端でおよび軽鎖のＣ末端でＤ１０ペプチドに融合されたＡｂ１である。
【0055】
本開示の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野において十分に確立されている方法によって作製することができる。抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子が転写および翻訳の制御配列のような必要な発現制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターへと挿入することができる。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスのような植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソーム等が含まれる。抗体軽鎖コード配列および抗体重鎖コード配列を、別々のベクターへと挿入してもよく、同一または異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結してもよい。本開示の抗体をコードする発現ベクターを、発現向けの宿主細胞に導入する。宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養し、この抗体を次いで回収し単離する。宿主細胞には、哺乳動物、植物、細菌または酵母の各宿主細胞が含まれる。発現向けの宿主として利用可能な哺乳動物細胞株には、当技術分野においてよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、２９３フリースタイル細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。細胞株は、それらの発現レベルに基づいて選択することができる。使用することができる他の細胞株は、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞のような昆虫細胞株である。宿主細胞用の組織培養培地は、ウシ血清アルブミンのような動物由来成分（ＡＤＣ）を含んでも含まなくてもよい。一部の実施形態では、ＡＤＣを含まない培養培地がヒトの安全のために好ましい。組織培養は、流加培養法、連続灌流法、または宿主細胞および所望の収率に適当なその他の任意の方法を使用して実施することができる。
【0056】
ＩＩＩ．医薬組成物および使用
本明細書に記載の方法は、ＯＩ患者に治療有効量の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、ＴＧＦβに結合する抗体の用量であって、中等症から重症のＯＩ（例えば、タイプＩＶのＯＩ）に関連する１つもしくはそれ以上の症状の検知可能な改善をもたらす抗体の用量、または中等症から重症のＯＩの状態もしくは症状を生じさせる根本的な病理学的メカニズムと相関する生物学的効果（例えば、特定のバイオマーカーのレベルの低下）を生じさせる、抗体の用量を意味する。
本明細書に記載の方法は、ＯＩ患者に治療有効量の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、ＴＧＦβに結合する抗体の用量であって、中等症から重症のＯＩ（例えば、タイプＩＶのＯＩ）に関連する１つもしくはそれ以上の症状の検知可能な改善をもたらす抗体の用量、または中等症から重症のＯＩの状態もしくは症状を生じさせる根本的な病理学的メカニズムと相関する生物学的効果（例えば、特定のバイオマーカーのレベルの低下）を生じさせる、抗体の用量を意味する。
【0057】
ＯＩの改善とは、骨代謝回転の低下、骨リモデリング速度の減速、および／または骨細胞密度の低下として顕在化することができる。一部の実施形態では、ＯＩの改善は、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、骨量密度（ＢＶ／ＴＶ）、全骨面（ＢＳ）、骨面密度（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁中心距離（Ｔｂ．Ｓｐ）、および全骨量（Ｄｅｎｓ ＴＶ）からなる群から選択される骨パラメータの改善によって指示される。
【0058】
ある特定の実施形態では、改善された骨パラメータは、二重エネルギーＸ線吸収測定法によって決定した、腰椎面積ＢＭＤ（ＬＳ ａＢＭＤ）である。処置前のベースラインレベルと比較して、ＬＳ ａＢＭＤ値は少なくとも１％、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５０、２０、またはそれ超のパーセントで向上することができる。
【0059】
一部の実施形態では、ＢＭＤ、骨量、および／または骨強度は、治療有効量の抗ＴＧＦβ抗体または断片での処置の後に約５％～約２００％で向上する。ある特定の実施形態では、ＢＭＤ、骨量、および／または骨強度は、処置の後に、約５％～約１０％、１０％～約１５％、１５％～約２０％、２０％～約２５％、２５％～約３０％、３０％～約３５％、３５％～約４０％、４０％～約４５％、４５％～約５０％、５０％～約５５％、５５％～約６０％、６０％～約６５％、６５％～約７０％、７０％～約７５％、７５％～約８０％、８０％～約８５％、８５％～約９０％、９０％～約９５％、９５％～約１００％、１００％～約１０５％、１０５％～約１１０％、１１０％～約１１５％、１１５％～約１２０％、１２０％～約１２５％、１２５％～約１３０％、１３０％～約１３５％、１３５％～約１４０％、１４０％～約１４５％、１４５％～約１５０％、１５０％～約１５５％、１５５％～約１６０％、１６０％～約１６５％、１６５％～約１７０％、１７０％～約１７５％、１７５％～約１８０％、１８０％～約１８５％、１８５％～約１９０％、１９０％～約１９５％、または１９５％～約２００％で向上する。
【0060】
一部の実施形態では、治療有効量は、例えば、尿中ヒドロキシプロリン、尿中総ピリジノリン（ＰＹＤ）、尿中遊離デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、尿中コラーゲンＩ型架橋Ｎ－テロペプチド（ＮＴＸ）、尿中または血清コラーゲンＩ型架橋Ｃ末端－テロペプチド（ＣＴＸ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ）のような血清または尿中バイオマーカーの低下によって指示される、骨代謝回転の低下をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβに結合する抗体による処置の後の低下は、ベースラインレベル（例えば、処置前）と比較して、約５％～約２００％だけである。例えば、低下は、処置の後、約５％～約１０％、１０％～約１５％、１５％～約２０％、２０％～約２５％、２５％～約３０％、３０％～約３５％、３５％～約４０％、４０％～約４５％、４５％～約５０％、５０％～約５５％、５５％～約６０％、６０％～約６５％、６５％～約７０％、７０％～約７５％、７５％～約８０％、８０％～約８５％、８５％～約９０％、９０％～約９５％、９５％～約１００％、１００％～約１０５％、１０５％～約１１０％、１１０％～約１１５％、１１５％～約１２０％、１２０％～約１２５％、１２５％～約１３０％、１３０％～約１３５％、１３５％～約１４０％、１４０％～約１４５％、１４５％～約１５０％、１５０％～約１５５％、１５５％～約１６０％、１６０％～約１６５％、１６５％～約１７０％、１７０％～約１７５％、１７５％～約１８０％、１８０％～約１８５％、１８５％～約１９０％、１９０％～約１９５％、または１９５％～約２００％とすることができる。
【0061】
一部の実施形態では、治療有効量は総アルカリホスファターゼ、骨特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン（ＯＣＮ）、およびＩ型プロコラーゲン（Ｃ末端／Ｎ末端）のような、骨沈着の血清または尿中バイオマーカーのレベルの向上をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、向上は、ベースラインレベル（例えば、処置前）と比較して、処置の後、約５％～約２００％だけである。例えば、向上は、処置の後、約５％～約１０％、１０％～約１５％、１５％～約２０％、２０％～約２５％、２５％～約３０％、３０％～約３５％、３５％～約４０％、４０％～約４５％、４５％～約５０％、５０％～約５５％、５５％～約６０％、６０％～約６５％、６５％～約７０％、７０％～約７５％、７５％～約８０％、８０％～約８５％、８５％～約９０％、９０％～約９５％、９５％～約１００％、１００％～約１０５％、１０５％～約１１０％、１１０％～約１１５％、１１５％～約１２０％、１２０％～約１２５％、１２５％～約１３０％、１３０％～約１３５％、１３５％～約１４０％、１４０％～約１４５％、１４５％～約１５０％、１５０％～約１５５％、１５５％～約１６０％、１６０％～約１６５％、１６５％～約１７０％、１７０％～約１７５％、１７５％～約１８０％、１８０％～約１８５％、１８５％～約１９０％、１９０％～約１９５％、または１９５％～約２００％とすることができる。
【0062】
一部の実施形態では、治療有効量は骨沈着を促進する。一部の実施形態では、治療有効量は聴覚、視覚、肺機能、および腎機能のような、ＯＩにより影響を受ける非骨格臓器の機能を改善する。
【0063】
治療有効量は１～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇとすることができる。一部の実施形態では、ＯＩ患者は、静脈内注射によりこの量のフレソリムマブまたはＡｂ１を用いて処置される。処置は、患者にとって医師により適当とみなされる間隔で繰り返すことができる。一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片による処置は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、９か月ごと、１２か月ごと、または１８か月ごとに繰り返すことができる。
【0064】
患者は成人（例えば、１８歳以上の患者）とすることができる。患者は、小児患者（１８歳よりも若い患者、例えば、新生児～６歳である、６～１２歳である、または１２～１８歳である患者）とすることができる。
【0065】
ＩＶ．併用療法
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＧＦβ抗体療法は、他のＯＩ処置と組み合わせることができる。さらなる治療剤の例としては、それらに限定されないが、ビスホスホネート、カルシトニン、テリパラチド、およびＯＩを処置、予防、または改善すると知られるその他の任意の化合物が挙げられる。さらなる治療剤は、ＴＧＦβに結合する抗体と同時にまたは連続的に投与することができる。ビスホスホネートの例は、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、ゾレドロネート、およびリセドロネートである。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、副甲状腺ホルモンアナログおよびカルシトニンのような骨形成を刺激する薬物である。
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＧＦβ抗体療法は、他のＯＩ処置と組み合わせることができる。さらなる治療剤の例としては、それらに限定されないが、ビスホスホネート、カルシトニン、テリパラチド、およびＯＩを処置、予防、または改善すると知られるその他の任意の化合物が挙げられる。さらなる治療剤は、ＴＧＦβに結合する抗体と同時にまたは連続的に投与することができる。ビスホスホネートの例は、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、ゾレドロネート、およびリセドロネートである。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、副甲状腺ホルモンアナログおよびカルシトニンのような骨形成を刺激する薬物である。
【0066】
本明細書で特に定義しない限り、本開示に関連して使用する科学的および技術的用語は、当業者であれば共通して理解される意味を有するものとする。例示的方法および材料を下に記載するが、本明細書に記載されているものに類似するまたは均等な方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。矛盾があるときは、定義を含めて本明細書が優先することになる。概して、本明細書に記載する、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用する命名法ならびにそれらの技法は、よく知られているものであり、当分野で一般に使用されるものである。酵素反応および精製技法は、当分野で一般に実行される通リまたは本明細書に記載される通リ、製造業者の仕様に従い実施される。さらに、文脈から特段必要でない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書および実施形態をとおして、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の各言い回しまたは「有する（ｈａｓ）」、「有し／有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含み／含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変化形は、記載する整数または整数の群を含むが、あらゆる他の任意の整数または整数の群を除外しないことを含意すると解釈される。本明細書に記述するあらゆる刊行物および他の参考文献は、全体として参照により本明細書に組み入れる。複数の文献が本明細書で引用されているが、このような引用は、これらの文献のどれであるかを問わず、当分野の常識の一部を形成するという容認を構成するものではない。
【0067】
本発明がより深く理解されるように、以下の例を記載する。これらの例は、例示のみを目的としており、いかようにも本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【実施例】
【0068】
以下の実施例では、ＯＩにより罹患の児童（ｎ＝１０）および非罹患の児童（ｎ＝４）から得た骨に関して組織学およびＲＮＡ－ｓｅｑを実行した。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）濃縮アッセイ、遺伝子セット濃縮アッセイ（ＧＳＥＡ）、およびＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用して、キーとなる調節不全経路および調節因子を特定した。逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）、ウェスタンブロット（ＷＢ）、および免疫組織化学（ＩＨＣ）を実行して、タンパク質レベルにての変化を確認した。ＯＩのタイプＩＩＩおよびタイプＩＶの成人８人において、汎抗ＴＧＦβ中和抗体であるフレソリムマブ１または４ｍｇ／ｋｇ用量の単回投与による第Ｉ相試験を実行した。フレソリムマブの安全性ならびに腰椎面積骨ミネラル密度（ＬＳ ａＢＭＤ）および骨リモデリングマーカーに対するフレソリムマブ効果について評価した。試験用の材料および方法の詳細は以下の通りである。
【0069】
ヒト骨サンプルの採取およびプロセシング
ＯＩの児童およびＯＩに非罹患の児童からの骨は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ）、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国の治験審査委員会（ＩＲＢ）によって承認されたプロトコルの下で取得した。骨サンプルは、医学的理由で外科手術をすでに受けている児童から取得した。普通なら廃棄されていたであろう、手術中に除去された骨の破片を採取し、処理した。すべてのサンプルの採取に先立ち、両親または法的保護者からインフォームドコンセントを得た。以前に報告されたプロトコル（Ｃｈｏｕら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２０１３）２１（３）：４５０～６１頁）に従い、骨標本を、図１に記載のように液体窒素ベースの環境で処理した。
ＯＩの児童およびＯＩに非罹患の児童からの骨は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ）、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国の治験審査委員会（ＩＲＢ）によって承認されたプロトコルの下で取得した。骨サンプルは、医学的理由で外科手術をすでに受けている児童から取得した。普通なら廃棄されていたであろう、手術中に除去された骨の破片を採取し、処理した。すべてのサンプルの採取に先立ち、両親または法的保護者からインフォームドコンセントを得た。以前に報告されたプロトコル（Ｃｈｏｕら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２０１３）２１（３）：４５０～６１頁）に従い、骨標本を、図１に記載のように液体窒素ベースの環境で処理した。
【0070】
ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、検証およびデータ解析
微粉砕骨からの総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、塩化リチウム沈殿によってさらに精製した。ＲＮＡの質と量を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）によって測定した。次いで、総ＲＮＡをＲＮＡ－ｓｅｑに供し、これに続いて、経路および上流の調節因子について検証およびバイオインフォマティクス解析を行った。
微粉砕骨からの総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、塩化リチウム沈殿によってさらに精製した。ＲＮＡの質と量を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）によって測定した。次いで、総ＲＮＡをＲＮＡ－ｓｅｑに供し、これに続いて、経路および上流の調節因子について検証およびバイオインフォマティクス解析を行った。
【0071】
タンパク質抽出、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）、および免疫組織化学（ＩＨＣ）
溶解緩衝剤を使用することによって、４℃で一晩、微粉砕骨からタンパク質を抽出した（２５０ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）。抽出物をメタノール－水－クロロホルム沈殿によって濃縮し、ＷＢについては４％ＳＤＳ緩衝剤（４ＳＢ；４％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解するか、またはＲＰＰＡについてはＳＤＳサンプル緩衝剤で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。合計で、３つの対照骨サンプルと５つのＯＩのタイプＩＩＩ骨サンプルをＷＢに含めた；４つの対照骨サンプルと８つのタイプＩＩＩのＯＩ骨サンプルをＲＰＰＡおよびＩＨＣに含めた（表１）。
溶解緩衝剤を使用することによって、４℃で一晩、微粉砕骨からタンパク質を抽出した（２５０ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）。抽出物をメタノール－水－クロロホルム沈殿によって濃縮し、ＷＢについては４％ＳＤＳ緩衝剤（４ＳＢ；４％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解するか、またはＲＰＰＡについてはＳＤＳサンプル緩衝剤で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。合計で、３つの対照骨サンプルと５つのＯＩのタイプＩＩＩ骨サンプルをＷＢに含めた；４つの対照骨サンプルと８つのタイプＩＩＩのＯＩ骨サンプルをＲＰＰＡおよびＩＨＣに含めた（表１）。
【0072】
【表1】
【0073】
第Ｉ相臨床試験計画
中等症型から重症型のＯＩの成人においてフレソリムマブを評価する第Ｉ相用量漸増治験を、国立衛生研究所のＲａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ’ｓ Ｂｒｉｔｔｌｅ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍの一部として実行した。試験のステージ１では、フレソリムマブの単回注入を伴った（１ｍｇ／ｋｇ体重および４ｍｇ／ｋｇ体重；各用量コホートでｎ＝４）。合計のフォローアップ期間は６か月とした。主要アウトカム評価項目は、フレソリムマブの単回用量の安全性とした。副次アウトカムは、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）による腰椎面積骨ミネラル密度（ＬＳ ａＢＭＤ）ならびに血中の骨代謝回転マーカー（ＯｃｎおよびＣＴＸ）に対するフレソリムマブの効果を評価することとした。
中等症型から重症型のＯＩの成人においてフレソリムマブを評価する第Ｉ相用量漸増治験を、国立衛生研究所のＲａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ’ｓ Ｂｒｉｔｔｌｅ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍの一部として実行した。試験のステージ１では、フレソリムマブの単回注入を伴った（１ｍｇ／ｋｇ体重および４ｍｇ／ｋｇ体重；各用量コホートでｎ＝４）。合計のフォローアップ期間は６か月とした。主要アウトカム評価項目は、フレソリムマブの単回用量の安全性とした。副次アウトカムは、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）による腰椎面積骨ミネラル密度（ＬＳ ａＢＭＤ）ならびに血中の骨代謝回転マーカー（ＯｃｎおよびＣＴＸ）に対するフレソリムマブの効果を評価することとした。
【0074】
２０以上の骨折、およびＣＯＬ１Ａ１もしくはＣＯＬ１Ａ２におけるグリシン置換突然変異またはＣＲＴＡＰ、ＰＰＩＢもしくはＬＥＰＲＥ１における両対立遺伝子病原性バリアントを有すること基づいて中等症から重症のＯＩの診断を受けた１８歳を超える個体を登録した。
【0075】
除外基準は以下とした：１）ａＢＭＤの評価を妨げるＬＳおよび両股関節にての器具使用、２）スクリーニング前の３か月の長骨の骨折、３）スクリーニングの６か月以内の経口ＢＰＮによる処置、またはスクリーニングの１２か月以内の静脈内ＢＰＮおよびテリパラチドによる処置、４）予定の骨格手術、５）自己免疫疾患、結核、がんまたは前がん病変の病歴、心臓弁膜症、出血傾向のような安全性に影響を与えるおそれのある特徴を有すること。骨代謝回転のマーカーを、ＣＬＩＡおよびＣＡＰの認定分析機関によって測定した。ＤＸＡスキャンを、Ｔｅｘａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌで検証済みの臨床機械を使用して実行した。スキャンを、試験手順に盲検とされた２人のセントラルリーダーによって読み取った。
【0076】
組織学および骨細胞密度解析
処理した骨標本を４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）で４８時間固定し、１０％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で４℃で１４日間脱灰した。形態学的および骨細胞数の解析向けに、パラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。骨細胞密度を、ＢＩＯＱＵＡＮＴ ＯＳＴＥＯ（ＢＩＯＱＵＡＮＴ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ、米国）を使用して算出した。
処理した骨標本を４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）で４８時間固定し、１０％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で４℃で１４日間脱灰した。形態学的および骨細胞数の解析向けに、パラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。骨細胞密度を、ＢＩＯＱＵＡＮＴ ＯＳＴＥＯ（ＢＩＯＱＵＡＮＴ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ、米国）を使用して算出した。
【0077】
ＲＮＡ－Ｓｅｑおよびデータ解析
ＲＮＡ－Ｓｅｑの場合、製造業者の取扱説明書に従って適用したＥＲＣＣ スパイクイン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＴｕｒｅＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリー調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）に総ＲＮＡ２５０ｎｇを使用した。等モルにプールしたライブラリー２２ｐＭを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｃＢｏｔマシンを使用したブリッジ増幅のために高出力ｖ４フローセルの１つのレーンにロードした。ペアエンド１００サイクルランを使用して、ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｍｏｄｅ ｗｉｔｈ ｖ４ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＦＣ－４０１－４００３、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でフローセルを配列決定した。ＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ３アダプターライゲートライブラリー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を２重量％で添加して、バランスダイバシティを確保し、クラスター化および配列決定のパフォーマンスをモニタリングした。各サンプルについて平均４，２５０万のペアエンドリードを生成した。参照としてｈｇ１９－ＥＲＣＣを用いて、Ｇｅｎｉａｌｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｉａｌｉｓ．ｃｏｍ）によるＨＩＳＡＴ２を使用して、アラインメントを実行した。次いで、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）のＲＮＡ－ｓｅｑ解析パイプラインを使用して、正規化、差次的発現、階層的クラスタリング、およびＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析を実行した。統計学的有意性を、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ ＲＮＡ－ｓｅｑ解析パイプラインに内蔵されるＡＮＯＶＡによって決定した。次いで、有意に差次的に発現した遺伝子（倍率変化＞２および誤検出率＜０．０５）を、上流の調節因子予測のために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）へとロードした。経路濃縮解析用のＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）プログラム（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を開発者の取扱説明書に従って使用した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑの場合、製造業者の取扱説明書に従って適用したＥＲＣＣ スパイクイン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＴｕｒｅＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリー調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）に総ＲＮＡ２５０ｎｇを使用した。等モルにプールしたライブラリー２２ｐＭを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｃＢｏｔマシンを使用したブリッジ増幅のために高出力ｖ４フローセルの１つのレーンにロードした。ペアエンド１００サイクルランを使用して、ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｍｏｄｅ ｗｉｔｈ ｖ４ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＦＣ－４０１－４００３、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でフローセルを配列決定した。ＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ３アダプターライゲートライブラリー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を２重量％で添加して、バランスダイバシティを確保し、クラスター化および配列決定のパフォーマンスをモニタリングした。各サンプルについて平均４，２５０万のペアエンドリードを生成した。参照としてｈｇ１９－ＥＲＣＣを用いて、Ｇｅｎｉａｌｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｉａｌｉｓ．ｃｏｍ）によるＨＩＳＡＴ２を使用して、アラインメントを実行した。次いで、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）のＲＮＡ－ｓｅｑ解析パイプラインを使用して、正規化、差次的発現、階層的クラスタリング、およびＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析を実行した。統計学的有意性を、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ ＲＮＡ－ｓｅｑ解析パイプラインに内蔵されるＡＮＯＶＡによって決定した。次いで、有意に差次的に発現した遺伝子（倍率変化＞２および誤検出率＜０．０５）を、上流の調節因子予測のために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）へとロードした。経路濃縮解析用のＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）プログラム（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を開発者の取扱説明書に従って使用した。
【0078】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）によるＲＮＡ－ｓｅｑ検証
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、米国）ヒトＷＮＴ ｎＣｏｕｎｔｅｒパネルを、検出した遺伝子発現倍率変化の検証のためのＲＮＡ－ｓｅｑデータとともに１件のＯＩのタイプＩＩＩサンプルおよび１件の対照サンプルを使用してランした。解析を、通常のモジュールでｎＳｏｌｖｅｒ（商標）を使用して実行した。リードカウント２０未満の遺伝子はバックグラウンドとみなし、さらなる解析から除外した。計１５５の遺伝子を検証した。一致性を、発現方向で同じ変化を示した遺伝子のパーセンテージによって決定した。
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、米国）ヒトＷＮＴ ｎＣｏｕｎｔｅｒパネルを、検出した遺伝子発現倍率変化の検証のためのＲＮＡ－ｓｅｑデータとともに１件のＯＩのタイプＩＩＩサンプルおよび１件の対照サンプルを使用してランした。解析を、通常のモジュールでｎＳｏｌｖｅｒ（商標）を使用して実行した。リードカウント２０未満の遺伝子はバックグラウンドとみなし、さらなる解析から除外した。計１５５の遺伝子を検証した。一致性を、発現方向で同じ変化を示した遺伝子のパーセンテージによって決定した。
【0079】
逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）
ＲＰＰＡを、標準化プロトコル（Ｍａｒｉｎｉら、同書）を使用することによって実行した。各サンプルについて、技術上の変動を考慮して、３回の技術的反復でアッセイした。各生体サンプルのタンパク質発現強度（ＰＥＩ）を、各生体サンプルの技術的な３回反復の平均強度の算出から最初に導出した。次いで、対照群またはタイプＩＩＩのＯＩ群の平均発現強度を、群内の各サンプルのＰＥＩの平均から算出した。スチューデントｔ検定を使用して、対照とタイプＩＩＩのＯＩの間の統計学的有意性を決定した。公称Ｐ値０．０５を使用して有意性を決定した。
ＲＰＰＡを、標準化プロトコル（Ｍａｒｉｎｉら、同書）を使用することによって実行した。各サンプルについて、技術上の変動を考慮して、３回の技術的反復でアッセイした。各生体サンプルのタンパク質発現強度（ＰＥＩ）を、各生体サンプルの技術的な３回反復の平均強度の算出から最初に導出した。次いで、対照群またはタイプＩＩＩのＯＩ群の平均発現強度を、群内の各サンプルのＰＥＩの平均から算出した。スチューデントｔ検定を使用して、対照とタイプＩＩＩのＯＩの間の統計学的有意性を決定した。公称Ｐ値０．０５を使用して有意性を決定した。
【0080】
ウェスタンブロッティング（ＷＢ）
総タンパク質５０μｇをローディングに使用した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによる分離およびＰＶＤＦ膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）への転写の後、５％ミルクを使用して膜をブロックし、これ続いて一次抗体（ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＭＡＤ２（３１０８Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＳＭＡＤ２（５３３９Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））およびＧＡＰＤＨ（Ｇ９２９５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに４℃で一晩インキュベートした。適当な二次抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）Ｇｅｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を使用してシグナルを捕捉した。
総タンパク質５０μｇをローディングに使用した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによる分離およびＰＶＤＦ膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）への転写の後、５％ミルクを使用して膜をブロックし、これ続いて一次抗体（ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＭＡＤ２（３１０８Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＳＭＡＤ２（５３３９Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））およびＧＡＰＤＨ（Ｇ９２９５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに４℃で一晩インキュベートした。適当な二次抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）Ｇｅｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を使用してシグナルを捕捉した。
【0081】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
脱パラフィン後、３％過酸化水素処理の後の抗原賦活化のために切片を０．０５％トリプシンとともに３７℃でインキュベートした。５％正常ヤギ血清でブロックした後、製造者の取扱説明書に従い、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＭＡＤ２（４４－２４４Ｇ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）の一次抗体とともに４℃で一晩、切片をインキュベートした。抗ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｖｉｏｎ、スイス）を適用し、０．１％３，３’－ジアミノベンジジンを使用してブロットを発色させた。
脱パラフィン後、３％過酸化水素処理の後の抗原賦活化のために切片を０．０５％トリプシンとともに３７℃でインキュベートした。５％正常ヤギ血清でブロックした後、製造者の取扱説明書に従い、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＭＡＤ２（４４－２４４Ｇ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）の一次抗体とともに４℃で一晩、切片をインキュベートした。抗ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｖｉｏｎ、スイス）を適用し、０．１％３，３’－ジアミノベンジジンを使用してブロットを発色させた。
【実施例1】
【0082】
ＯＩのタイプＩＩＩの児童からの骨における無秩序な線維性骨および骨細胞密度の上昇
脛骨または大腿骨からの骨片を、ＯＩのタイプＩＩＩの児童１０人（９人はＣＯＬ１Ａ１またはＣＯＬ１Ａ２にグリシン置換突然変異を有し、１人はＣＯＬ１Ａ２にバリン欠失を有する）およびＯＩによって罹患していない児童４人から採取した（表１）。組織学的に、対照標本は主に皮質骨を含有したが、一方、ＯＩ標本は皮質骨と骨梁骨の両方を含有した。形態学的検査が明らかにしたところは、ＯＩ骨は、対照と比較して、支配的に線維性である骨を有する無秩序なハバース系を明示したこと、である（図２）。以前の報告（Ｎｉｊｈｕｉｓら、Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．（２０１９）１３（１）：１～１１頁）と一致して、骨細胞密度はＯＩ骨中で３倍超高く（ＯＩで６８６．４４／ｍｍ２対対照で２２１．９４／ｍｍ２）、対照と比較して、小窩はより球形に見えた（図２および図３）。ＯＩにとって典型的であるこれらのデータは、サンプルの高品位性を暗に示すものである。
脛骨または大腿骨からの骨片を、ＯＩのタイプＩＩＩの児童１０人（９人はＣＯＬ１Ａ１またはＣＯＬ１Ａ２にグリシン置換突然変異を有し、１人はＣＯＬ１Ａ２にバリン欠失を有する）およびＯＩによって罹患していない児童４人から採取した（表１）。組織学的に、対照標本は主に皮質骨を含有したが、一方、ＯＩ標本は皮質骨と骨梁骨の両方を含有した。形態学的検査が明らかにしたところは、ＯＩ骨は、対照と比較して、支配的に線維性である骨を有する無秩序なハバース系を明示したこと、である（図２）。以前の報告（Ｎｉｊｈｕｉｓら、Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．（２０１９）１３（１）：１～１１頁）と一致して、骨細胞密度はＯＩ骨中で３倍超高く（ＯＩで６８６．４４／ｍｍ２対対照で２２１．９４／ｍｍ２）、対照と比較して、小窩はより球形に見えた（図２および図３）。ＯＩにとって典型的であるこれらのデータは、サンプルの高品位性を暗に示すものである。
【実施例2】
【0083】
グローバルトランスクリプトーム解析は、ＯＩのタイプＩＩＩ骨におけるキーとなる調節不全経路としてＴＧＦβシグナル伝達の上昇を実証する
ヒトＯＩ骨におけるキーとなる調節不全経路を偏りのない方法で特定するために、本発明者らは、対照骨およびＯＩのタイプＩＩＩ骨を使用してＲＮＡ－ｓｅｑを実行した。ＲＮＡ－ｓｅｑ結果の精度を保証するために、本発明者らは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）によって１５５の遺伝子を検証し、発現倍率変化について９２％の一致性を実証した（図４）。トランスクリプトームデータの主成分分析（ＰＣＡ）により、対照骨とＯＩ骨との間の明瞭な分離が明らかになった（図５、パネルＡ）。遺伝子発現プロファイルは、ＯＩ骨よりも対照でいっそう均一であった。全トランスクリプトームＲＰＫＭの階層的クラスタリングが示したところは、対照骨とＯＩ骨との間のまったく別のクラスターであり、このことによって、ＯＩにおける全体的な分子シグネチャの変化が指示された（図５、パネルＢ）。差次的遺伝子発現解析に続いて、ＧＯ濃縮解析を実行した。ＧＯの生物学的プロセスでは、著しく濃縮した骨格関連機能が、骨の骨梁および骨成熟の低下とともに、骨形成、骨吸収、骨リモデリングの上昇を始めとするＯＩの分子シグネチャを捕らえた。一貫して、ＧＯ細胞プロセスでは、骨芽細胞と破骨細胞の分化の高まりがＯＩで特定された。ＧＯシグナル伝達経路では、ＢＭＰ－ＴＧＦβ、副甲状腺ホルモン経路、ＷＮＴ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を始めとする主要な骨リモデリング経路が上方制御されていた。最も興味深いことには、ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化調節は、すべての経路のうちで最も有意に上方制御された経路であった（Ｐ＝１．７８×１０－１５）（図６）。こういった濃縮結果は、ＯＩ骨の既知の分子病理学的特徴と一致するだけではなく、ＴＧＦβ下流イベントであるＳＭＡＤリン酸化はＯＩのタイプＩＩＩ骨において最も影響を受ける標的であることも、先入観なく明らかとした。
ヒトＯＩ骨におけるキーとなる調節不全経路を偏りのない方法で特定するために、本発明者らは、対照骨およびＯＩのタイプＩＩＩ骨を使用してＲＮＡ－ｓｅｑを実行した。ＲＮＡ－ｓｅｑ結果の精度を保証するために、本発明者らは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）によって１５５の遺伝子を検証し、発現倍率変化について９２％の一致性を実証した（図４）。トランスクリプトームデータの主成分分析（ＰＣＡ）により、対照骨とＯＩ骨との間の明瞭な分離が明らかになった（図５、パネルＡ）。遺伝子発現プロファイルは、ＯＩ骨よりも対照でいっそう均一であった。全トランスクリプトームＲＰＫＭの階層的クラスタリングが示したところは、対照骨とＯＩ骨との間のまったく別のクラスターであり、このことによって、ＯＩにおける全体的な分子シグネチャの変化が指示された（図５、パネルＢ）。差次的遺伝子発現解析に続いて、ＧＯ濃縮解析を実行した。ＧＯの生物学的プロセスでは、著しく濃縮した骨格関連機能が、骨の骨梁および骨成熟の低下とともに、骨形成、骨吸収、骨リモデリングの上昇を始めとするＯＩの分子シグネチャを捕らえた。一貫して、ＧＯ細胞プロセスでは、骨芽細胞と破骨細胞の分化の高まりがＯＩで特定された。ＧＯシグナル伝達経路では、ＢＭＰ－ＴＧＦβ、副甲状腺ホルモン経路、ＷＮＴ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を始めとする主要な骨リモデリング経路が上方制御されていた。最も興味深いことには、ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化調節は、すべての経路のうちで最も有意に上方制御された経路であった（Ｐ＝１．７８×１０－１５）（図６）。こういった濃縮結果は、ＯＩ骨の既知の分子病理学的特徴と一致するだけではなく、ＴＧＦβ下流イベントであるＳＭＡＤリン酸化はＯＩのタイプＩＩＩ骨において最も影響を受ける標的であることも、先入観なく明らかとした。
【0084】
ＯＩ骨におけるシグナル伝達の変化を独立して探るために、次に本発明者らは、対照骨およびＯＩ骨からのＲＰＫＭを使用してＧＳＥＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、ＰＮＡＳ（２００５）１０２（４３）：１５５４５～５０頁）を実行した。ＧＳＥＡにより、ＴＧＦβシグナル伝達がＯＩにおいて著しく活性化したトップ経路として特定された（図５、パネルＣ；図７）。まとめると、これらの結果によって示唆されたところは、ＴＧＦβシグナル伝達とはＯＩのタイプＩＩＩ骨における主要かつ最も一貫した活性化経路であること、である。
【実施例3】
【0085】
ＴＧＦβは、ＯＩのタイプＩＩＩからの骨における活性な上流調節因子である
トランスクリプトーム解析から特定したＴＧＦβ経路の活性化がＴＧＦβリガンドに実際に起因するものであるか調査するために、本発明者らは、３，７２２の有意に変化した遺伝子に基づく上流調節因子の予測にＩＰＡを利用した。すべての潜在的な上流調節因子のうちで、ＴＧＦβは特定された最も活性化した上流調節因子であった（Ｚスコア＝４．２８、Ｐ＝１．３２×ｌ０－１４）（表２）。タンパク質レベルにての変化をもたらしたこれらのトランスクリプトーム上のこれらの発見を確実するために、本発明者らは、骨から抽出したタンパク質を使用してターゲットプロテオミクスＲＰＰＡを実行した。調べた２３０種のタンパク質のうち、２９種のタンパク質が、ＯＩ骨と対照骨との間で公称の統計学的に有意な強度変化を示した（図８）。この解析では、ＴＧＦβがＩＰＡによって最も有意に活性化された上流調節因子として特定された（Ｚスコア＝２．１７、Ｐ＝６．３７×１０－１２）（表２）。
トランスクリプトーム解析から特定したＴＧＦβ経路の活性化がＴＧＦβリガンドに実際に起因するものであるか調査するために、本発明者らは、３，７２２の有意に変化した遺伝子に基づく上流調節因子の予測にＩＰＡを利用した。すべての潜在的な上流調節因子のうちで、ＴＧＦβは特定された最も活性化した上流調節因子であった（Ｚスコア＝４．２８、Ｐ＝１．３２×ｌ０－１４）（表２）。タンパク質レベルにての変化をもたらしたこれらのトランスクリプトーム上のこれらの発見を確実するために、本発明者らは、骨から抽出したタンパク質を使用してターゲットプロテオミクスＲＰＰＡを実行した。調べた２３０種のタンパク質のうち、２９種のタンパク質が、ＯＩ骨と対照骨との間で公称の統計学的に有意な強度変化を示した（図８）。この解析では、ＴＧＦβがＩＰＡによって最も有意に活性化された上流調節因子として特定された（Ｚスコア＝２．１７、Ｐ＝６．３７×１０－１２）（表２）。
【0086】
【表2】
【実施例4】
【0087】
ＯＩのタイプＩＩＩ骨におけるＳＭＡＤ２リン酸化の上昇
ＯＩのタイプＩＩＩ骨におけるインサイツでのＴＧＦβシグナル伝達の上昇を確証的に示すために、本発明者らは、ＴＧＦβ下流標的、リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）に対する抗体を使用してＩＨＣを実行した。
ＯＩのタイプＩＩＩ骨におけるインサイツでのＴＧＦβシグナル伝達の上昇を確証的に示すために、本発明者らは、ＴＧＦβ下流標的、リン酸化ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）に対する抗体を使用してＩＨＣを実行した。
【0088】
対照と比較して、本発明者らは、ＯＩのタイプＩＩＩ骨においてｐＳＭＡＤ２染色の一貫した上昇を発見した（図９、パネルＡ）。対照骨およびＯＩのタイプＩＩＩ骨からのタンパク質ライセートを使用するＷＢをとおして、本発明者らは、検査したすべてのＯＩサンプルにおいてｐＳＭＡＤ２の上昇を観察した（図９、パネルＢ）。さらなる定量化により、ＯＩ骨におけるｐＳＭＡＤ２／総ＳＭＡＤ２比の有意な上昇が実証された（図９、パネルＣ）。すべてまとめると、これらの結果が示唆したところは、ＴＧＦβ活性化とはＯＩのヒトにおいて駆動発病メカニズムであること、である。
【実施例5】
【0089】
ＯＩにおける治療介入としてのフレソリムマブ
本発明の発見を解釈するために、本発明者らは、ＴＧＦβのすべての哺乳動物アイソフォームを中和するヒトＩｇＧ４κモノクローナル抗体であるフレソリムマブの安全性を評価する第Ｉ相治験を実行した。本発明者らが作成してきた前臨床データおよびヒトデータと一貫性があるように、ＣＯＬ１Ａ１もしくはＣＯＬ１Ａ２のグリシン置換突然変異、またはＣＲＴＡＰ、ＰＰＩＢ、もしくはＬＥＰＲＥ１の両対立遺伝子病原性バリアントによって引き起こされる臨床的に中等症から重症のＯＩの個体のみを登録した。計８人の個体を登録した（表３）。
本発明の発見を解釈するために、本発明者らは、ＴＧＦβのすべての哺乳動物アイソフォームを中和するヒトＩｇＧ４κモノクローナル抗体であるフレソリムマブの安全性を評価する第Ｉ相治験を実行した。本発明者らが作成してきた前臨床データおよびヒトデータと一貫性があるように、ＣＯＬ１Ａ１もしくはＣＯＬ１Ａ２のグリシン置換突然変異、またはＣＲＴＡＰ、ＰＰＩＢ、もしくはＬＥＰＲＥ１の両対立遺伝子病原性バリアントによって引き起こされる臨床的に中等症から重症のＯＩの個体のみを登録した。計８人の個体を登録した（表３）。
【0090】
【表3】
【0091】
４人が１ｍｇ／ｋｇ体重の用量でフレソリムマブの単回投与を受け、４人が４ｍｇ／ｋｇ体重の用量でフレソリムマブの単回投与を受けた。フレソリムマブによる処置は忍容性が高かった。両コホートにおいて重篤な有害事象（ＡＥ）はなく、臨床的に有意な臨床検査値の変化もまったく観察されなかった（図１０）。１ｍｇ／ｋｇコホートでは、２件のみのＡＥ：薬物投与後の吐き気および鼻出血が、治験薬にたぶん／おそらく関連すると類別された。４ｍｇ／ｋｇコホートでは、７件のＡＥ：倦怠感、頭痛、鼻出血、尿潜血、皮膚のかさぶたからの出血、および１人の参加者における１８０日目の補正ＱＴ間隔４５７ミリ秒、が治験薬にたぶん／おそらく関連すると類別された。
【0092】
フレソリムマブ１ｍｇ／ｋｇによる処置は、骨代謝回転のマーカーであるＯｃｎおよびＣＴＸの上昇に関連していた。骨リモデリングのピーク上昇が、処置の後３０日目から９０日目の間に観察された。４ｍｇ／ｋｇ用量での処置は、処置の後３０日目から始まるＯｃｎの持続的な低下に関連していた（図１１）。ＬＳ ａＢＭＤの２つの中央読取り値（測定時点までマスクした）は、高度の相関（ｒ＝０．９９５）および一致を有した（図１２）。したがって、ベースラインからの変化率を算出する上で、２つの読取り値からの平均ａＢＭＤを使用した。１ｍｇ／ｋｇの用量では、２人のＯＩのタイプＩＶ参加者がＬＳ ａＢＭＤの確固たる向上を示したが、一方、ＯＩ ＶＩＩＩの個体はまったく変化を示さなかった。ａＢＭＤの降下を示したＯＩのタイプＩＩＩの参加者は、課題をもたらす深刻な側弯症を有したが、ＤＸＡスキャンからの結果を解析した。
【0093】
４ｍｇ／ｋｇコホートでは、ＬＳ ａＢＭＤを９０日目および１８０日目に評価した。ＯＩのタイプＩＶの２人の参加者は、９０日目までａＢＭＤの確固たる向上を有した。急激なａＢＭＤ降下を示したＯＩのタイプＩＩＩの個体は、大腿骨の骨折を負いその結果長時間の不動の状態であった；ａＢＭＤは遠隔施設で測定した、したがって、このことは比較を理想的とは言えないものにした。
【0094】
結論として、本発明者らは、本試験において、骨粗鬆症のメンデル型であるＯＩにおけるグローバルシグナル伝達異常を包括的かつ偏りのない方法で調べた。本発見と「オミックスケール」データは、ＯＩの処置に影響を与えるだけでなく、低骨量に関する他の障害にも関連する可能性がある。さらに、本試験は、フレソリマブの単回用量による処置でも、本発明者らの試験での９０日目および１８０日目の骨代謝回転およびａＢＭＤの変化に関連しているという驚くべき発見につながった。加えて、骨生物学のユニークな特性により、累積投薬量と投与頻度がより低いことで、全身毒性の軽減が可能になるので、潜在的な安全性の利点が提供される。実際、本明細書で投与したフレソリムマブの用量は、黒色腫、特発性肺線維症、全身性硬化症、および限局性分節性糸球体硬化症に対する試験で与えた用量と比較してより低かった。単回用量の投与では、重篤なＡＥは観察されなかった。さらに、本発明者らは、２つの試験用量の間で骨代謝回転マーカーに対する異なる効果を観察した。１ｍｇ／ｋｇの用量では、フレソリムマブは骨リモデリングの軽度の上昇に関連していた。しかし、４ｍｇ／ｋｇのフレソリムマブ処置によると、血漿Ｏｃｎレベルで示されるように、骨代謝回転の持続的な抑制がもたらされた。ＬＳ ａＢＭＤに対する効果は、疾患の重症度に応じて変動がより大きかった。ＯＩのタイプＩＶの２人の参加者は、１ｍｇ／ｋｇの単回用量でＬＳ ａＢＭＤが６．８％および８．６％向上した。４ｍｇ／ｋｇコホートでは、注入の３か月後に１人の参加者が７．６％の向上を有し、２人が２．９％と１．３％の向上を示した。これらの向上は、軽症だが重症ではないＯＩの個体において６か月で２％の向上を明示した同化剤テリパラチドと比較してより高く、ＯＩのタイプＩＩＩおよびタイプＩＶにおける６か月の試験期間にわたるＬＳ ａＢＭＤ向上の５．４％に関連していた毎月の高用量セトルスマブに匹敵する（Ｅｒｉｃら、ＪＢＭＲ Ｐｌｕｓ（２０２１）５（Ｓ１）：増補：ｅ１０４５５）。ＯＩのタイプＩＩＩの２人の参加者（ＦＲ００５およびＦＲ０１２）は、ａＢＭＤの低下を有した。
【0095】
配列表
下の表に、本開示において言及されるアミノ酸配列を示す。
下の表に、本開示において言及されるアミノ酸配列を示す。
【0096】
【表4】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】