特表 2024-517232 腫瘍溶解性ＨＳＶの普遍的再標的化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-19

(54)【発明の名称】腫瘍溶解性ＨＳＶの普遍的再標的化

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240412BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 15/38 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240412BHJP

   C07K 16/08 20060101ALI20240412BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240412BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61K 47/66 20170101ALI20240412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240412BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240412BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240412BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20240412BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20240412BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240412BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z ZNA

C12N7/01

C12N15/38

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07K16/08

C07K16/30

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61K47/66

A61P43/00 121

A61K47/68

A61K35/763

A61K48/00

C07K16/46

A61K38/17

A61K39/395 L

A61K39/395 T

A61K39/395 C

A61K39/395 E

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023567874

(86)(22)【出願日】2022-05-04

(85)【翻訳文提出日】2023-12-22

(86)【国際出願番号】 IB2022054111

(87)【国際公開番号】W WO2022234473

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/184,283

(32)【優先日】2021-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100217663

【弁理士】

【氏名又は名称】末広 尚也

(72)【発明者】

【氏名】バイラット，デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】マーベイ，マシュー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA18

4C084BA19

4C084CA53

4C084DC50

4C084MA05

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB261

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA26

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA05

4C087NA05

4C087NA13

4C087ZB26

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA03

4H045DA76

4H045EA29

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書では、二重特異性アダプタータンパク質、及び腫瘍溶解性ＨＳＶを腫瘍細胞などの標的細胞に再標的化するためのその使用が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＡＡを発現する腫瘍細胞に組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を再標的化する方法であって、前記腫瘍細胞を有する対象に、
（ａ）前記組換えＨＳＶであって、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、前記組換えＨＳＶと、
（ｂ）単離された二重特異性アダプタータンパク質であって、前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する第１の結合ドメインと、前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡに対する結合特異性を有する第２の結合ドメインと、を含む、前記二重特異性アダプタータンパク質と、を投与することを含み、
前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドを結合し、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡを結合し、それによって前記組換えＨＳＶを前記腫瘍細胞に再標的化する、方法。

【請求項2】

前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）をコードするヌクレオチド配列の一部分への挿入又はその置換によって前記組換えＨＳＶに挿入される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記組換えＨＳＶに挿入されて、前記野生型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体ＶＨＨ、及びポリペプチドＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＴＡＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、単鎖抗体ＶＨＨ、ポリペプチドＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドが、ＧＣＮ４転写因子又はその断片を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＧＣＮ４転写因子又はその断片が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、前記ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項８又は９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号１６）、ＨＣＤＲ２（配列番号１７）及びＨＣＤＲ３（配列番号１８）からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号１９）、ＬＣＤＲ２（配列番号２０）及びＬＣＤＲ３（配列番号２１）からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号２２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号２３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドが、Ｌａタンパク質又はその断片を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｌａタンパク質又はその断片が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、前記Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号２６）、ＨＣＤＲ２（配列番号２７）及びＨＣＤＲ３（配列番号２８）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号２９）、ＬＣＤＲ２（配列番号３０）及びＬＣＤＲ３（配列番号３１）からなるＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号３２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号３３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドが、第１のロイシンジッパー部分を含み、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、第２のロイシンジッパー部分を含み、前記第１及び第２のロイシンジッパー部分が、ロイシンジッパー二量体を形成することができる、請求項１～３に記載の方法。

【請求項19】

前記第１のロイシンジッパー部分が合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）であり、かつ前記第２のロイシンジッパー部分が合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）であるか、又は前記第１のロイシンジッパー部分が合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）であり、かつ前記第２のロイシンジッパー部分が合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡが、ＰＳＭＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＲＯＲ１、ＫＬＫ２、及びＨＬＡ－Ｇからなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＰＳＭＡであり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号３５）、ＨＣＤＲ２（配列番号３６）及びＨＣＤＲ３（配列番号３７）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号３８と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号３９）、ＨＣＤＲ２（配列番号４０）及びＨＣＤＲ３（配列番号４１）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号４２と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項２１に記載の方法。

【請求項26】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４４）及びＨＣＤＲ３（配列番号４５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２（配列番号４７）及びＬＣＤＲ３（配列番号４８）からなるＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである、請求項２１に記載の方法。

【請求項27】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号４９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号５０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである、請求項２１に記載の方法。

【請求項28】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＴＭＥＦＦ２であり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項29】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号５３）、ＨＣＤＲ２（配列番号５４）及びＨＣＤＲ３（配列番号５５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号５６）、ＬＣＤＲ２（配列番号５７）及びＬＣＤＲ３（配列番号５８）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号５９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号６１）、ＨＣＤＲ２（配列番号６２）及びＨＣＤＲ３（配列番号６３）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号６４）、ＬＣＤＲ２（配列番号６５）及びＬＣＤＲ３（配列番号６６）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号６７と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＫＬＫ２であり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項34】

ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号７２）、ＨＣＤＲ２（配列番号７３）及びＨＣＤＲ３（配列番号７４）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号７５）、ＬＣＤＲ２（配列番号７６）及びＬＣＤＲ３（配列番号７７）からなるＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号７８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号７９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号８０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号８１と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＨＬＡ－Ｇであり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＨＬＡ－Ｇに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項38】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＲＯＲ１であり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項39】

ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号９４と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有するポリペプチドＤＡＲＰｉｎである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

対象におけるがんを治療する方法であって、ＴＡＡががん細胞によって発現され、前記方法が、前記対象に、
（ａ）組換えＨＳＶであって、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えＨＳＶと、
（ｂ）単離された二重特異性アダプタータンパク質であって、前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する第１の結合ドメインと、前記がん細胞によって発現される前記ＴＡＡに対する結合特異性を有する第２の結合ドメインと、を含む、前記二重特異性アダプタータンパク質と、を投与することを含み、
前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、前記組換えＨＳＶによって発現される前記異種リガンドペプチドを結合し、前記特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、前記がん細胞によって発現される前記ＴＡＡを結合し、それによって前記がん細胞の腫瘍溶解を引き起こす、方法。

【請求項41】

前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）をコードするヌクレオチド配列の一部分への挿入又はその置換によって前記組換えＨＳＶに挿入される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記組換えＨＳＶに挿入されて、野生型ｇＤのアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する、請求項４０又は４１に記載の方法。

【請求項43】

組換えＨＳＶを腫瘍細胞に再標的化するための二重特異性アダプタータンパク質であって、前記組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する第１の結合ドメインと、前記腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡに対する結合特異性を有する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項44】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１及び第２の結合ドメインのそれぞれが、抗原結合断片を含む、請求項４３に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項45】

前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、単鎖抗体ＶＨＨ、及びポリペプチドＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される、請求項４４に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項46】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項47】

ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号１６）、ＨＣＤＲ２（配列番号１７）及びＨＣＤＲ３（配列番号１８）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号１９）、ＬＣＤＲ２（配列番号２０）及びＬＣＤＲ３（配列番号２１）からなるＶＬを含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである、請求項４６に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項48】

ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号２２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号２３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである、請求項４６に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項49】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインが、Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項50】

Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号２６）、ＨＣＤＲ２（配列番号２７）及びＨＣＤＲ３（配列番号２８）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号２９）、ＬＣＤＲ２（配列番号３０）及びＬＣＤＲ３（配列番号３１）からなるＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである、請求項４９に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項51】

Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号３２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号３３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである、請求項４９に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項52】

前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第１の結合ドメインがロイシンジッパー部分を含む、請求項４３に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項53】

前記ロイシンジッパー部分が、合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又は合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）である、請求項５２に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項54】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＰＳＭＡであり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項55】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号３５）、ＨＣＤＲ２（配列番号３６）、及びＨＣＤＲ３（配列番号３７）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項５４に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項56】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号３８と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項５４に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項57】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号３９）、ＨＣＤＲ２（配列番号４０）、及びＨＣＤＲ３（配列番号４１）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項５４に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項58】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号４２と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである、請求項５４に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項59】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４４）及びＨＣＤＲ３（配列番号４５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２（配列番号４７）及びＬＣＤＲ３（配列番号４８）からなるＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである、請求項５４に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項60】

ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号４９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号５０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである、請求項５４に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項61】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＴＭＥＦＦ２であり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項62】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号５３）、ＨＣＤＲ２（配列番号５４）、及びＨＣＤＲ３（配列番号５５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号５６）、ＬＣＤＲ２（配列番号５７）、及びＬＣＤＲ３（配列番号５８）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項６１に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項63】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号５９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項６１に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項64】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号６１）、ＨＣＤＲ２（配列番号６２）、及びＨＣＤＲ３（配列番号６３）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号６４）、ＬＣＤＲ２（配列番号６５）、及びＬＣＤＲ３（配列番号６６）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項６１に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項65】

ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号６７と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである、請求項６１に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項66】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＫＬＫ２であり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項67】

ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、ＨＣＤＲ１（配列番号７２）、ＨＣＤＲ２（配列番号７３）、及びＨＣＤＲ３（配列番号７４）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号７５）、ＬＣＤＲ２（配列番号７６）、及びＬＣＤＲ３（配列番号７７）からなるＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである、請求項６６に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項68】

ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号７８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号７９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである、請求項６６に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項69】

ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号８０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号８１と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである、請求項６６に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項70】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＨＬＡ－Ｇであり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＨＬＡ－Ｇに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項71】

前記腫瘍細胞によって発現される前記ＴＡＡがＲＯＲ１であり、前記二重特異性アダプタータンパク質の前記第２の結合ドメインが、ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項72】

ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する前記抗原結合断片が、配列番号９４と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有するポリペプチドＤＡＲＰｉｎである、請求項７１に記載の二重特異性アダプタータンパク質。

【請求項73】

請求項４３～７１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性アダプタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。

【請求項74】

請求項７３に記載の単離核酸配列を含む、単離ベクター。

【請求項75】

請求項７４に記載の単離ベクターを含む、組換え宿主細胞。

【請求項76】

請求項１～３９のいずれか一項に記載の組換えＨＳＶと、前記組換えＨＳＶの使用説明書と、を含む、キット。

【請求項77】

請求項４３～７２のいずれか一項に記載の単離された二重特異性アダプタータンパク質と、前記二重特異性アダプタータンパク質の使用説明書と、を含む、キット。

【請求項78】

請求項１～９３のいずれか一項に記載の組換えＨＳＶと、請求項４３～７２のいずれか一項に記載の単離されたアダプタータンパク質と、使用説明書と、を含む、キット。

【請求項79】

異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＨＳＶであって、前記異種リガンドペプチドが、Ｌａタンパク質又はその断片を含み、前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型ｇＤを置換する一部分への挿入又はその置換によって前記組換えＨＳＶに挿入される、組換えＨＳＶ。

【請求項80】

前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記組換えＨＳＶに挿入されて、野生型ｇＤのアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する、請求項７９に記載の組換えＨＳＶ。

【請求項81】

前記Ｌａタンパク質又はその断片が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項７９又は８０に記載の組換えＨＳＶ。

【請求項82】

異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＨＳＶであって、前記異種リガンドペプチドがロイシンジッパー部分を含み、前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型ｇＤの一部分への挿入又はその置換によって前記組換えＨＳＶに挿入される、組換えＨＳＶ。

【請求項83】

前記異種リガンドペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型ｇＤのアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する前記組換えＨＳＶに挿入される、請求項８２に記載の組換えＨＳＶ。

【請求項84】

前記ロイシンジッパー部分が、合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又は合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）である、請求項８３に記載の組換えＨＳＶ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０２１年５月５日出願の米国特許仮出願第６３／１８４，２８３号の利益を主張するものである。

【0002】

（発明の分野）
本開示は、二重特異性アダプタータンパク質、及び腫瘍溶解性ＨＳＶを腫瘍細胞などの標的細胞に再標的化するためのその使用が提供される。

【0003】

（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年２月２８日に作成され、名称はＪＢＩ６４６０ＷＯＰＣＴ１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは１９２，５１２バイトである。

【背景技術】

【0004】

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）は、固形腫瘍の治療のために広く研究されている。グループとして、それらは、伝統的ながん療法を超える多くの利点をもたらす（Ｍａｒｋｅｒｔ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＳＶ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌｉｏｍａ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．２０００ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；１０（１）：１７－３０；Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ １０；３０（７）：６５８－７０；及びＳｈｅｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １（ＨＳＶ－１）ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６ Ｎｏｖ；１３（１１）：９７５－９２）。具体的には、ｏＨＳＶは通常、それらを自然免疫のいくつかの態様による阻害に対して感受性にする変異を具体化する。結果として、それらは、感染に対する１つ又は２つ以上の自然免疫応答が損なわれているがん細胞において複製するが、自然免疫応答が損なわれていない正常細胞においては複製しない。ｏＨＳＶは、通常、ウイルスが複製し得る腫瘍塊に直接送達される。全身的ではなく標的組織に送達されると考えられるので、抗がん薬に特徴的な副作用はない。ウイルスは、複数回投与されるそれらの能力を削減する適応免疫応答を特徴的に誘導する。ｏＨＳＶは、効力の喪失又は炎症応答などの有害反応の誘導の証拠なしに、腫瘍に複数回投与されている。ＨＳＶは、それらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込むことができ、腫瘍への投与時にこれらの遺伝子の発現を調節することができる大きなＤＮＡウイルスである。ｏＨＳＶと共に使用するのに適した外来遺伝子は、腫瘍に対する適応免疫応答の誘導を助けるものである。

【0005】

細胞の自然免疫応答を克服する際の欠陥は、ウイルスが抗がん剤としてその腫瘍溶解性ｏＨＳＶを示す腫瘍の範囲を決定する。欠失が広範囲になればなるほど、ｏＨＳＶが有効であるがん細胞の範囲は、欠失したウイルス遺伝子の機能に依存して、より限定的になる。最も新しいｏＨＳＶは、その抗がん活性を強化するために少なくとも１つの細胞遺伝子を組み込む（Ｃｈｅｅｍａ ＴＡ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｉｎ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｊｕｌ １６；１１０（２９）：１２００６－１１；Ｇｏｓｈｉｍａ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＦ１０，ａ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｖａｒｉａｎｔ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｍｕｒｉｎｅ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１４ Ｊｕｎ １５；１３４（１２）：２８６５－７７；Ｍａｒｋｅｒｔ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｍａｙ；８６（９）：５３０４－１３；及びＷａｌｋｅｒ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １ ｅｎｃｏｄｉｎｇ １５－ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；８５（１４）：７３６３－７１）。

【0006】

骨格と称されるｏＨＳＶの構造と、骨格への挿入に適した外来遺伝子と、を別々に考慮することが好都合である。上記のように、骨格の構造は、感受性がんの範囲を決定する。外来遺伝子は、宿主にがん細胞を適応免疫応答の正当な標的として認識させる。

【0007】

ＨＳＶゲノムは、Ｌ及びＳと称される２つの共有結合した成分からなる。各成分は、逆方向反復に隣接する固有の配列（Ｌ成分についてはＵＬ、Ｓ成分についてはＵＳ）からなる。Ｌ成分の逆方向反復は、ａｂ及びｂ’ａ’と称される。Ｓ成分の逆方向反復は、ａ’ｃ’及びｃａと称される。逆方向反復ｂ’ａ’及びａ’ｃ’は、内部逆方向反復領域を構成する。Ｌ成分及びＳ成分の両方の逆方向反復領域は、それぞれＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ Ｐ及びＯＲＦ Ｏと称されるタンパク質をコードする５つの遺伝子の２つのコピー、並びに転写されるがタンパク質をコードしないＤＮＡの大きなストレッチを含むことが知られている。

【0008】

歴史的に、がん患者において試験されたウイルスは、３つの異なる設計に分類される。第１のものは、ＩＣＰ３４．５遺伝子の欠失がウイルスを有意に弱毒化するという証拠に基づいていた（Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９７ Ａｐｒ １５；５７（８）：１５０２－９；Ｃｈｏｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍ（ｒ）９０，０００ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｅＩＦ－２ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｈｕｔｏｆｆ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇａｍｍａ １３４．５－ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９５ Ｎｏｖ ７；９２（２３）：１０５１６－２０；Ｃｈｏｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－１ ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｔｏ ｇａｍｍａ １３４．５，ａ ｇｅｎｅ ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０ Ｎｏｖ ３０；２５０（４９８５）：１２６２－６；及びＣｈｏｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｇａｍｍａ １（３４．５）ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １ ｐｒｅｃｌｕｄｅｓ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｓｈｕｔｏｆｆ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２ Ａｐｒ １５；８９（８）：３２６６－７０）。悪性神経膠芽腫の治療のためのその安全性を確実にするために、患者において試験された第１のウイルスであるＧ２０７は、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子における更なる変異によって更に弱毒化された（Ｍｉｎｅｔａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｍｕｌｔｉ－ｍｕｔａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９５ Ｓｅｐ；１（９）：９３８－４３）。ＩＣＰ３４．５及びリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の両方に変異を有するＧ２０７は、過度に弱毒化され、野生型プロテインキナーゼＲを発現するがん細胞において遮断された（Ｓｍｉｔｈ ＫＤ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＭＥＫ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＫＲ ａｎｄ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｄｅｌｔａｇａｍｍａ（１）３４．５ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；８０（３）：１１１０－２０）。

【0009】

第２の設計は、ＵＳ１１と称されるウイルスタンパク質が感染の初期に発現される場合、ＩＣＰ３４．５の不在を部分的に補償し、野生型プロテインキナーゼＲを発現する細胞において成長する能力を回復するという実証に基づいていた（Ｍｕｌｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｕｐｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａ ＧＡＤＤ３４－ｒｅｌａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；７３（４）：３３７５－８５）。このウイルスの骨格の設計は、ＵＳ１２遺伝子及びＵＳ１１のプロモータが欠失しているという点で、Ｃａｓｓａｄｙらによって公開された設計に従う（Ｃａｓｓａｄｙ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ＵＳ１１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇａｍｍａ１（３４．５）ｇｅｎｅ ｉｆ ｐｒｅｓｅｎｔ ｂｅｆｏｒｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ ｂｙ ｐｒｅｃｌｕｄｉｎｇ ｉｔｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８ Ｎｏｖ；７２（１１）：８６２０－６；Ｃａｓｓａｄｙ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ－ｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｇａｍｍａ１３４．５ ｇｅｎｅｓ ｐｒｅｃｌｕｄｅｓ ｓｈｕｔｏｆｆ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＩＦ－２ａｌｐｈａ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８ Ｓｅｐ；７２（９）：７００５－１１；及びＭｕｌｖｅｙ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｕｐｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａ ＧＡＤＤ３４－ｒｅｌａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；７３（４）：３３７５－８５）。結果として、ＵＳ１１は後期遺伝子としてではなく最初期遺伝子として発現される。ＦＤＡによって承認されたｏＨＳＶ ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（以前はＯｎｃｏＶｅｘ ^{ＧＭ－ＣＳＦ}として知られていた）は、この骨格設計を利用し、ＣＭＶプロモータ制御下でヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を更にコードする（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＩＣＰ３４．５ ｄｅｌｅｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ，ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ，ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｕｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：２９２－３０３）。

【0010】

最初にＲ７０２０と称され、後にＮＶ１０２０と改名された第３のウイルスの骨格は、弱毒化生ウイルスワクチンとして最初に試験された自然発生変異体の改変の結果であった（Ｍｅｉｇｎｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｅｓ Ｒ７０１７ ａｎｄ Ｒ７０２０：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１９８８ Ｓｅｐ；１５８（３）：６０２－１４及びＭｅｉｇｎｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｔｅｎｃｙ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９８８ Ｊａｎ；１６２（１）：２５１－４）。この変異体は、内部逆方向反復（ｂ’ａ’及びａ’ｃ’からなり、遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ Ｐ及びＯＲＦ ０の１コピーをコードする）並びにＵＬ５６及びＵＬ２４をコードする遺伝子を欠いていた。更に、それは細菌配列を含み、ワクチンとして意図されたので、いくつかのＨＳＶ－２糖タンパク質をコードする遺伝子も含んでいた。Ｒ７０２０を、結腸がんからの肝転移を有する患者において広範に試験した。加えて、以下において試験を行った：無胸腺ヌードマウス及び膀胱腫瘍モデルにおける頭頸部上皮扁平上皮がん及び前立腺がん異種移植片（Ｓｚｅ ＤＹ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｔｒａ－ａｒｔｅｒｉａｌ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ＮＶ１０２０ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｊａｎ；２３（１）：９１－７；Ｃｏｚｚｉ ＰＪ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｅｓ Ｇ２０７ ａｎｄ Ｎｖ１０２０ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａｎ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ｍｏｄｅｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００１ Ｍａｙ；１５（７）：１３０６－８；Ｃｕｒｒｉｅｒ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｌｏｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｈｕｍａｎ ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｂｙ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５ Ａｐｒ；１２（４）：４０７－１６；Ｆｏｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｈｅｒｐｅｓ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｃａｎ ｂｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｖｉａ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｆｅｂ；１７（２）：３８９－９４；Ｇｅｅｖａｒｇｈｅｓｅ ＳＫ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ＮＶ１０２０ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｓｅｐ；２１（９）：１１１９－２８；Ｋｅｌｌｙ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｍｕｔａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－１ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｒｅａｔｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｎｅｒｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００８ Ｊｕｎ；２２（６）：１８３９－４８；Ｋｅｍｅｎｙ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｓｅ Ｉ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ，ＮＶ１０２０，ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６ Ｄｅｃ；１７（１２）：１２１４－２４；及びＷｏｎｇ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ａｎ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｓｕｒｇ．２００１ Ｊｕｌ；１９３（１）：１２－２１）。

【0011】

標的細胞へのＨＳＶの侵入は多段階プロセスであり、ウイルス糖タンパク質ｇＤ、ｇＨ／ｇＬ、ｇＣ及びｇＢの複雑な相互作用及び立体構造変化を必要とする。これらの糖タンパク質は、ＨＳＶ粒子の最も外側の構造であり、膜からなるウイルスエンベロープを構成する。細胞侵入のために、ｇＣ及びｇＢは、細胞表面ヘパラン硫酸へのＨＳＶ粒子の最初の付着を媒介する。その後、ウイルスと標的細胞とのより特異的な相互作用は、ｇＤがネクチン－１（ヒト：ＨｖｅＣ）及びＨＶＥＭ（ＨｖｅＡとしても知られる）である少なくとも２つの代替細胞受容体に結合し、ビリオン－細胞膜融合につながる事象のカスケードを開始させるｇＤの立体構造変化を引き起こすという点で、起こる。それにより、中間タンパク質ｇＨ／ｇＬ（ヘテロ二量体）が活性化され、これがｇＢを誘発して膜融合を触媒する。

【0012】

現在の技術では、遺伝子操作されたｏ－ＨＳＶが開発されており、これは腫瘍細胞に対して高度に特異的な親和性（tropism）を示し、そうでなければ弱毒化されない。このアプローチは、腫瘍特異的受容体に対するＨＳＶ親和性の再標的化として定義されている。

【0013】

がん特異的受容体へのＨＳＶの再標的化は、ｇＤが特異的リガンドをコードする異種配列を保有するような、ｇＤの遺伝子改変を必要とする。組換えウイルスに感染すると、野生型ｇＤの代わりにキメラｇＤ－リガンド糖タンパク質をエンベロープ中に有する子孫ウイルスが形成される。リガンドは、選択された細胞上に特異的に発現される分子と相互作用し、組換えｏ－ＨＳＶの選択された細胞への侵入を可能にする。ＨＳＶの再標的化のために首尾よく使用されてきたリガンドの例は、ＩＬ１３α、ｕＰａＲ、ＨＥＲ２に対する単鎖抗体及びＥＧＦＲに対する単鎖抗体である。

【0014】

再標的化は、組換えウイルスが選択された細胞に標的化されることを必然的に伴うが、再標的化は、組換えウイルスが依然としてその天然の細胞受容体を標的化することができ、身体の細胞の感染及び死滅をもたらすことを妨げない。ヘルペスウイルスのその天然受容体への結合及び身体の正常細胞の死滅を防止するために、天然受容体への結合を減少させる試みがなされてきた。これは「脱標的化」と呼ばれ、これは、組換えヘルペスウイルスでは、未改変ヘルペスウイルスの天然受容体に対する結合能力が低下しているか、又は全くないことを意味し、「低下した」という用語は、そのような結合低減改変を有しない同じヘルペスウイルスと比較して使用される。これは、正常細胞が感染しないか、又は感染の程度が低下し、したがって、正常細胞が死滅しないか、又は死滅する正常細胞が少ないという効果を有する。このような脱標的化ヘルペスウイルスは、正常細胞への感染がより少ないか又は全くないことによって有害な活性が減少し、罹患細胞を死滅させることによって有益な活性が増加している。

【発明の概要】

【0015】

当技術分野では、疾患特異的受容体へのＨＳＶの再標的化のための方法が知られているが、再標的化される能力を有するこれらのＨＳＶは、それらが大量に産生されることができ、疾患を治療するための医薬品として利用可能であるように増殖される必要がある。安全性の理由から、ヒトにおける腫瘍細胞などの罹患細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質などの物質の導入を回避するために、ＨＳＶの増殖及び産生のための細胞は罹患細胞であるべきではないという事実を考慮すると、ＨＳＶは、ＨＳＶの増殖及び産生のためにヒトに有害である成分を産生しない「安全な」細胞に感染するＨＳＶを可能にするための更なる改変を含む必要がある。

【0016】

本明細書に開示される本発明は、組換えＨＳＶを安全に増殖させ、正常細胞から脱標的化し、罹患（例えば、腫瘍）細胞に効果的に再標的化することができるシステムを提供する。

【0017】

ＴＡＡを発現する腫瘍細胞に組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を再標的化する方法であって、腫瘍細胞を有する対象に、（ａ）組換えＨＳＶであって、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えＨＳＶと、（ｂ）単離された二重特異性アダプタータンパク質であって、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する第１の結合ドメインと、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡに対する結合特異性を有する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性アダプタータンパク質と、を投与することを含み、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインが、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドを結合し、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインが、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡを結合し、それによって組換えＨＳＶを腫瘍細胞に再標的化する、方法が本明細書において提供される。

【0018】

本方法の一実施形態では、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列は、野生型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）をコードするヌクレオチド配列の一部分への挿入又はその置換によって組換えＨＳＶに挿入される。

【0019】

本方法の更なる実施形態では、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＨＳＶに挿入されて、野生型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する。

【0020】

本方法のなお更なる実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、組換えＨＳＶによって発現される異種ペプチドに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0021】

本方法のなお更なる実施形態では、異種ペプチドに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体ＶＨＨ、及びポリペプチドＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される。

【0022】

本方法のなお更なる実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0023】

なお更なる実施形態では、ＴＡＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、単鎖抗体ＶＨＨ、ポリペプチドＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される。

【0024】

本方法のなお更なる実施形態では、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドは、ＧＣＮ４転写因子又はその断片を含む。

【0025】

本方法のなお更なる実施形態では、ＧＣＮ４転写因子又はその断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0026】

本方法のなお更なる実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0027】

本方法のなお更なる実施形態では、ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号１６）、ＨＣＤＲ２（配列番号１７）及びＨＣＤＲ３（配列番号１８）からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号１９）、ＬＣＤＲ２（配列番号２０）及びＬＣＤＲ３（配列番号２１）からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである。

【0028】

本方法のなお更なる実施形態では、ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号２２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号２３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである。

【0029】

本方法のなお更なる実施形態では、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドは、Ｌａタンパク質又はその断片を含む。

【0030】

本方法のなお更なる実施形態では、Ｌａタンパク質又はその断片は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0031】

本方法のなお更なる実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0032】

本方法のなお更なる実施形態では、Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号２６）、ＨＣＤＲ２（配列番号２７）及びＨＣＤＲ３（配列番号２８）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号２９）、ＬＣＤＲ２（配列番号３０）及びＬＣＤＲ３（配列番号３１）からなるＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである。

【0033】

本方法のなお更なる実施形態では、Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号３２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号３３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである。

【0034】

本方法のなお更なる実施形態では、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドは、第１のロイシンジッパー部分を含み、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、第２のロイシンジッパー部分を含み、第１及び第２のロイシンジッパー部分は、ロイシンジッパー二量体を形成することができる。

【0035】

本方法のなお更なる実施形態では、第１のロイシンジッパー部分は合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）であり、かつ第２のロイシンジッパー部分は合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）であるか、又は第１のロイシンジッパー部分は合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）であり、かつ第２のロイシンジッパー部分は合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）である。

【0036】

本方法のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡは、ＰＳＭＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＲＯＲ１、ＫＬＫ２、及びＨＬＡ－Ｇからなる群から選択される。

【0037】

本方法のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＰＳＭＡであり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0038】

本方法のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号３５）、ＨＣＤＲ２（配列番号３６）及びＨＣＤＲ３（配列番号３７）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0039】

本方法のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号３８と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0040】

本方法のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号３９）、ＨＣＤＲ２（配列番号４０）及びＨＣＤＲ３（配列番号４１）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0041】

本方法のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号４２と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0042】

本方法のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４４）及びＨＣＤＲ３（配列番号４５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２（配列番号４７）及びＬＣＤＲ３（配列番号４８）からなるＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである。

【0043】

本方法のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号４９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号５０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである。

【0044】

本方法のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＴＭＥＦＦ２であり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0045】

本方法のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号５３）、ＨＣＤＲ２（配列番号５４）及びＨＣＤＲ３（配列番号５５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号５６）、ＬＣＤＲ２（配列番号５７）及びＬＣＤＲ３（配列番号５８）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0046】

本方法のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号５９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0047】

本方法のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号６１）、ＨＣＤＲ２（配列番号６２）及びＨＣＤＲ３（配列番号６３）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号６４）、ＬＣＤＲ２（配列番号６５）及びＬＣＤＲ３（配列番号６６）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0048】

本方法のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号６７と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0049】

本方法のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＫＬＫ２であり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0050】

本方法のなお更なる実施形態では、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号７２）、ＨＣＤＲ２（配列番号７３）及びＨＣＤＲ３（配列番号７４）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号７５）、ＬＣＤＲ２（配列番号７６）及びＬＣＤＲ３（配列番号７７）からなるＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである。

【0051】

本方法のなお更なる実施形態では、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号７８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号７９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである。

【0052】

本方法のなお更なる実施形態では、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号８０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号８１と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである。

【0053】

本方法のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＨＬＡ－Ｇであり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｇに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0054】

本方法のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＲＯＲ１であり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0055】

本方法のなお更なる実施形態では、ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号８６と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有するポリペプチドＤＡＲＰｉｎである。

【0056】

対象におけるがんを治療する方法であって、ＴＡＡががん細胞によって発現され、方法が、対象に、（ａ）組換えＨＳＶであって、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えＨＳＶと、（ｂ）単離された二重特異性アダプタータンパク質であって、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する第１の結合ドメインと、がん細胞によって発現されるＴＡＡに対する結合特異性を有する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性アダプタータンパク質と、を投与することを含み、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインが、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドを結合し、特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインが、がん細胞によって発現されるＴＡＡを結合し、それによってがん細胞の腫瘍溶解を引き起こす、方法が本明細書において更に提供される。

【0057】

本治療方法の一実施形態では、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列は、野生型糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）をコードするヌクレオチド配列の一部分への挿入又はその置換によって組換えＨＳＶに挿入される。

【0058】

本治療方法の更なる実施形態では、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＨＳＶに挿入されて、野生型ｇＤのアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する。

【0059】

組換えＨＳＶを腫瘍細胞に再標的化するための二重特異性アダプタータンパク質であって、組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドに対する結合特異性を有する第１の結合ドメインと、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡに対する結合特異性を有する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性アダプタータンパク質が本明細書においてなお更に提供される。

【0060】

本二重特異性アダプタータンパク質の一実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１及び第２の結合ドメインのそれぞれは、抗原結合断片を含む。

【0061】

本二重特異性アダプタータンパク質の更なる実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、単鎖抗体ＶＨＨ、及びポリペプチドＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される。

【0062】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0063】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号１６）、ＨＣＤＲ２（配列番号１７）及びＨＣＤＲ３（配列番号１８）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号１９）、ＬＣＤＲ２（配列番号２０）及びＬＣＤＲ３（配列番号２１）からなるＶＬを含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである。

【0064】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＧＣＮ４転写因子又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号２２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号２３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖである。

【0065】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインが、Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0066】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号２６）、ＨＣＤＲ２（配列番号２７）及びＨＣＤＲ３（配列番号２８）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号２９）、ＬＣＤＲ２（配列番号３０）及びＬＣＤＲ３（配列番号３１）からなるＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである。

【0067】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、Ｌａタンパク質又はその断片に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号３２と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号３３と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗Ｌａ ｓｃＦｖである。

【0068】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインはロイシンジッパー部分を含む。

【0069】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ロイシンジッパー部分は、合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又は合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）である。

【0070】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＰＳＭＡであり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0071】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号３５）、ＨＣＤＲ２（配列番号３６）及びＨＣＤＲ３（配列番号３７）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0072】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号３８と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0073】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号３９）、ＨＣＤＲ２（配列番号４０）及びＨＣＤＲ３（配列番号４１）を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0074】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号４２と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む抗ＰＳＭＡ ＶＨＨである。

【0075】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４４）及びＨＣＤＲ３（配列番号４５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２（配列番号４７）及びＬＣＤＲ３（配列番号４８）からなるＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである。

【0076】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合断片が、配列番号４９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号５０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖである。

【0077】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＴＭＥＦＦ２であり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0078】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号５３）、ＨＣＤＲ２（配列番号５４）及びＨＣＤＲ３（配列番号５５）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号５６）、ＬＣＤＲ２（配列番号５７）及びＬＣＤＲ３（配列番号５８）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0079】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号５９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0080】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号６１）、ＨＣＤＲ２（配列番号６２）及びＨＣＤＲ３（配列番号６３）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号６４）、ＬＣＤＲ２（配列番号６５）及びＬＣＤＲ３（配列番号６６）からなるＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0081】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＴＭＥＦＦ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号６７と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖである。

【0082】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＫＬＫ２であり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0083】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１（配列番号７２）、ＨＣＤＲ２（配列番号７３）及びＨＣＤＲ３（配列番号７４）からなるＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（配列番号７５）、ＬＣＤＲ２（配列番号７６）及びＬＣＤＲ３（配列番号７７）からなるＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである。

【0084】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号７８と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号７９と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである。

【0085】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＫＬＫ２に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号８０と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号８１と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖである。

【0086】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＨＬＡ－Ｇであり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｇに対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0087】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＴＡＡはＲＯＲ１であり、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合断片を含む。

【0088】

本二重特異性アダプタータンパク質のなお更なる実施形態では、ＲＯＲ１に対する結合特異性を有する抗原結合断片は、配列番号８６と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有するポリペプチドＤＡＲＰｉｎである。

【0089】

上記の単離された二重特異性アダプタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子が、本明細書においてなお更に提供される。

【0090】

上記の単離核酸配列を含む、単離ベクターが、本明細書においてなお更に提供される。

【0091】

上記の単離ベクターを含む、組換え宿主細胞が、本明細書においてなお更に提供される。

【0092】

上記の組換えＨＳＶと、組換えＨＳＶの使用説明書と、を含む、キットが、本明細書においてなお更に提供される。

【0093】

上記の単離された二重特異性アダプタータンパク質と、二重特異性アダプタータンパク質の使用説明書と、を含む、キットが、本明細書においてなお更に提供される。

【0094】

上記の組換えＨＳＶと、上記の単離されたアダプタータンパク質と、使用説明書と、を含む、キットが本明細書においてなお更に提供される。

【0095】

異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＨＳＶであって、異種リガンドペプチドが、Ｌａタンパク質又はその断片を含み、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列が、野生型ｇＤを置換する一部分への挿入又はその置換によって組換えＨＳＶに挿入される、組換えＨＳＶが、本明細書においてなお更に提供される。一実施形態では、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＨＳＶに挿入されて、野生型ｇＤのアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する。更なる実施形態では、Ｌａタンパク質又はその断片は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0096】

異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＨＳＶであって、異種リガンドペプチドがロイシンジッパー部分を含み、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列が、野生型ｇＤの一部分への挿入又はその置換によって組換えＨＳＶに挿入される、組換えＨＳＶが、本明細書においてなお更に提供される。一実施形態では、異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＨＳＶに挿入されて、野生型ｇＤのアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を置換する。更なる実施形態では、ロイシンジッパー部分は、合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又は合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）である。

【図面の簡単な説明】

【0097】

上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。

【図1】その二重特異性に起因して、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質が組換えＨＳＶを腫瘍細胞に再標的化することを示す。

【図2】本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質の様々な実施形態を示す。図２は、配列番号１５として「（ＧＧＧＧＳ）_４」、及び配列番号１２４として「ＧＧＧＧＳ」を開示する。

【図3】ＧＣＮ４再標的化組換えＨＳＶのゲノム構造を示す。図３は、配列番号５を開示する。

【図4】ＲＥ／ＥＲ再標的化組換えＨＳＶを示し、これは、二重特異性アダプタータンパク質によって腫瘍細胞に再標的化されている。

【図5】ＥＲ／ＲＥロイシンジッパー対を使用するＨＳＶ１再標的化に使用されるＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤ（ＥＲ／ＲＥ再標的化ｇＤ）及びＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｈネクチン１（ＥＲ／ＲＥ－ネクチン１）の構造を示す。ＥＲ／ＲＥ再標的化ｇＤは、ｇＤのＡＡ６～３８をＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－ロイシンジッパー及び（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号１２６）で置換することによって得た。ＥＲ／ＲＥ－ネクチン１は、ｈネクチン１の第１のＩｇ－様ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１５２２３（ＮＥＣＴ１＿ＨＵＭＡＮ）のＡＡ３１～１４５）をＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌロイシンジッパー及び（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号１２６）で置換することによって得た。図５は、出現順に配列番号８及び１３４をそれぞれ開示する。

【図6】ＧＣＮ４再標的化ウイルス（ＭＯＩ＝１）によるＶｅｒｏ－Ｈ６－ネクチン１及びＢ１６－Ｆ１０－Ｈ６－ネクチン１細胞の感染を示す。親Ｖｅｒｏ及びＢ１６－Ｆ１０細胞を再標的化についての陰性対照として使用した。ＧＦＰを発現するｏＨＳＶ１を、Ｖｅｒｏ細胞に対する感染についての陽性対照として使用した（左パネル）。

【図7A】トランスフェクションの４８時間後の、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔの上清におけるＰＳＭＡ－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の発現を示す。二重特異性アダプタータンパク質を、抗ｍｙｃタグ抗体で検出した。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を陰性対照（モック）として使用した。

【図7B】ＦＡＣＳによって分析されたＨＥＫ２９３Ｔ－ＰＳＭＡ安定細胞株の表面におけるＰＳＭＡの発現を示す。親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、陰性対照として用いた。

【図7C】ＰＳＭＡ－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の存在下でのＧＣＮ４再標的化ウイルス（ＭＯＩ＝０．１）によるＨＥＫ２９３Ｔ－ＰＳＭＡ及びＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ＋）の感染を示す。親ＨＥＫ２９３Ｔ及びＤＵ１４５細胞（ＰＳＭＡ－）を、再標的化についての陰性対照として使用した。ＧＦＰを発現するｏＨＳＶ１を感染についての陽性対照として使用した（下パネル）。

【図8A】トランスフェクションの４８時間後の、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔの上清におけるＴＭＥＦＦ２－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の発現を示す。二重特異性アダプタータンパク質を、抗ｍｙｃタグ抗体で検出した。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を対照（モック）として使用した。

【図8B】ＦＡＣＳによって分析されたＶｅｒｏ－ＴＭＥＦＦ２安定細胞株の表面でのＴＭＥＦＦ２の発現（ＴＭＥＦＦ２発現についての細胞選別の前後）を示す。親Ｖｅｒｏ細胞を陰性対照として使用した。

【図8C】ＴＭＥＦＦ２－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の存在下でのＧＣＮ４再標的化ウイルス（ＭＯＩ＝０．１）によるＶｅｒｏ－ＴＭＥＦＦ２及び２２Ｒｖ１細胞（ＴＭＥＦＦ２＋）の感染を示す。親Ｖｅｒｏを再標的化についての陰性対照として使用した。ＧＦＰを発現するｏＨＳＶ１を感染についての陽性対照として使用した。２２Ｒｖ１細胞は、感染２４時間及び７２時間で示され、二重特異性アダプタータンパク質の存在下での再標的化ウイルスの成長を確認した。

【図9A】トランスフェクションの４８時間後の、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔの上清におけるＫＬＫ２－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の発現を示す。二重特異性アダプタータンパク質を、抗ｍｙｃタグ抗体で検出した。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を陰性対照（モック）として使用した。

【図9B】ＦＡＣＳによって分析されたＶｅｒｏ－ＫＬＫ２－ネクチン１安定細胞株の表面でのＫＬＫ２の発現（ＦＬＡＧタグ発現についての細胞選別の前後）を示す。親Ｖｅｒｏ細胞を対照として使用した。

【図9C】ＫＬＫ２－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の存在下でのＧＣＮ４再標的化ウイルス（ＭＯＩ＝０．１）によるＶｅｒｏ－ＫＬＫ２－ネクチン１細胞の感染を示す。親Ｖｅｒｏを再標的化についての陰性対照として使用する。ＧＦＰを発現するｏＨＳＶ１を感染についての陽性対照として使用した（下パネル）。

【図10A】トランスフェクションの４８時間後の、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔの上清中のＨ６ｗ－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の発現を示す。二重特異性アダプタータンパク質を、抗ｍｙｃタグ抗体で検出した。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を陰性対照（モック）として使用した。

【図10B】ＦＡＣＳによって分析されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面でのＲＯＲ１の発現を示す（実線：アイソタイプ、薄灰色：抗ＲＯＲ１）。

【図10C】Ｈ６ｗ－Ｈ６二重特異性アダプタータンパク質の存在下でのＧＣＮ４再標的化ウイルス（ＭＯＩ＝０．１）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染を示す。親２９３Ｔ細胞を、再標的化についての陰性対照として使用した。ＧＦＰを発現するｏＨＳＶ１を感染の陽性対照として使用した（上パネル）。

【図11A】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞間融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、ＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤのＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ネクチン１への再標的化を示す（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２０１０，Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０１２）。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトし、一方、標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ネクチン１及びｎＤＳＰをトランスフェクトした（レーン２）。陰性対照（レーン１）は、ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ネクチン１を発現するプラスミドを省いた以外はレーン２と同一である。

【図11B】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞間融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、Ｂ５８８ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ二重特異性アダプターを使用したＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤのＰＳＭＡへの再標的化を示す。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＰＳＭＡ、Ｂ５８８ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした（レーン５）。陽性対照（レーン３）は、エフェクター細胞としてＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＢ５８８ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ、並びに標的細胞としてＰＳＭＡ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。陰性対照（レーン４）は、二重特異性アダプターＢ５８８ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌを発現するプラスミドを省いた以外はレーン５と同一である。

【図11C】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞－細胞融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ二重特異性アダプターを使用するＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤのＫＬＫ２への再標的化を示す。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＫＬＫ２－ネクチン１、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした（レーン８）。陽性対照（レーン６）は、エフェクター細胞としてＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、標的細胞としてＫＬＫ２－ネクチン１及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。陰性対照（レーン７）は、二重特異性アダプターＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌを発現するプラスミドを省いた以外はレーン８と同一である。

【図11D】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞－細胞融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、ＴＭＥＦ９ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ二重特異性アダプターを使用するＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤのＴＭＥＦＦ２への再標的化を示す。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＴＭＥＦＦ２、ＴＭＥＦ９ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした（レーン１１）。陽性対照（レーン９）は、エフェクター細胞としてＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＴＭＥＦ９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、標的細胞としてＴＭＥＦＦ２及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。陰性対照（レーン１０）は、二重特異性アダプターＴＭＥＦ９ＬＨ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌを発現するプラスミドを省いた以外はレーン１１と同一である。

【図12A】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞間融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、Ｌａ－ｄ６－３８ｇＤの５Ｂ９ＨＬ－ネクチン１への再標的化を示す（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２０１０，Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０１２）。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＬａ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトし、一方、標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、５Ｂ９ＨＬ－ネクチン１及びｎＤＳＰをトランスフェクトした（レーン２）。陰性対照（レーン１）は、５Ｂ９ＨＬ－ネクチン１を発現するプラスミドを省いた以外はレーン２と同一である。

【図12B】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞間融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、Ｂ５８８ＬＨ－５Ｂ９ＨＬ二重特異性アダプターを使用したＬａ－ｄ６－３８ｇＤのＰＳＭＡへの再標的化を示す。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＬａ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＰＳＭＡ、Ｂ５８８ＬＨ－５Ｂ９ＨＬ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした（レーン５）。陽性対照（レーン３）は、エフェクター細胞としてＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＢ５８８ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ、並びに標的細胞としてＰＳＭＡ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。陰性対照（レーン４）は、二重特異性アダプターＢ５８８ＬＨ－５Ｂ９ＨＬを発現するプラスミドを省いた以外はレーン５と同一である。

【図12C】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞間融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－５Ｂ９ＨＬ二重特異性アダプターを使用するＬａ－ｄ６－３８ｇＤのＫＬＫ２への再標的化を示す。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＬａ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＫＬＫ２－ネクチン１、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－５Ｂ９ＨＬ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした（レーン８）。陽性対照（レーン６）は、エフェクター細胞としてＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、標的細胞としてＫＬＫ２－ネクチン１及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。陰性対照（レーン７）は、二重特異性アダプターＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－５Ｂ９ＨＬを発現するプラスミドを省いた以外はレーン８と同一である。

【図12D】ルシフェラーゼレポーター活性が細胞間融合の尺度である、二重スプリットレポータータンパク質系を使用するインビトロ融合アッセイによって測定された、ＴＭＥＦ９ＬＨ－５Ｂ９ＨＬ二重特異性アダプターを使用するＬａ－ｄ６－３８ｇＤのＴＭＥＦＦ２への再標的化を示す。エフェクター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＬａ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）に、ＴＭＥＦＦ２、ＴＭＥＦ９ＬＨ－５Ｂ９ＨＬ及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした（レーン１１）。陽性対照（レーン９）は、エフェクター細胞としてＨＳＶ１ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ及びＴＭＥＦ９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ及びｃＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、標的細胞としてＴＭＥＦＦ２及びｎＤＳＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした。陰性対照（レーン１０）は、二重特異性アダプターＴＭＥＦ９ＬＨ－５Ｂ９ＨＬを発現するプラスミドを省いた以外はレーン１１と同一である。

【発明の詳細な説明】

【0098】

「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて、各種刊行物、論文及び特許が引用又は記載され、これらの参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の前後関係を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

【0099】

特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。

【0100】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。

【0101】

別途記載されない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

【0102】

別途記載のない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。

【0103】

本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって満たされる。

【0104】

本明細書に使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、その意味に含まれ、したがって、本明細書に使用される用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、その意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。

【0105】

本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」、又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されないことを示す。

【0106】

本明細書で使用されるとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」、又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。

【0107】

本明細書で使用するとき、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。

【0108】

「右」、「左」、「下方」、及び「上方」という語は、参照される図面内での方向を指定する。

【0109】

好ましい本発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。

【0110】

２つ若しくは３つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれらをコードする単離されたポリヌクレオチド；単離されたモノクローナル抗体又は二重特異性抗体及びその抗原結合断片、並びにそれらをコードする核酸）の文脈における用語「同一である」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセント分の同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ若しくは３つ以上の配列又はサブ配列を指す。

【0111】

配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0112】

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。

【0113】

配列同一性パーセント及び配列類似性を求めるのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと位置合わせしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリ配列における長さＷの短いワードを特定することによって、高スコア配列対（high scoring sequence pair、ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。

【0114】

ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に０より大きい）及びパラメータＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に０より小さい）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ又は２つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するもの）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

【0115】

配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。

【0116】

２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１核酸によりコード化されるポリペプチドが、第２核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

【0117】

本明細書で使用するとき、「単離（された）」という用語は、生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの構成成分が天然に生じる生物の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質）から実質的に分離されたか、これらの他の成分とは別に生成されたか、又はこれらの他の成分から精製されたものであることを意味する。このため、「単離（された）」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離（された）」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、その組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離される。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。

【0118】

本明細書で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ又は２つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される）も包含する。

【0119】

「ベクター」なる用語は、生体系内で複製され得る、又はこうした系間を移動することができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生物系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含んでいる。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用する再構成生物系が挙げられ得る。ベクターポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであり得る。例示的なベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージベクター、及びウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。用語「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成生物系において利用することができるベクターを意味する。

【0120】

本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞のいずれのタイプの細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクト又は形質導入した細胞である。別の一実施形態では、「宿主細胞」は、かかるトランスフェクト又は形質導入された細胞の子孫又は潜在的な子孫である。ある細胞の子孫は、例えば、後続の世代で生じ得る変異若しくは環境の影響、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みによって、親細胞との同一性を有していない場合がある。

【0121】

本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、全ての天然に生じる、転写後及び翻訳後修飾も更に包含する。

【0122】

「異種」は、本明細書で使用するとき、それぞれ、所与の生物の天然核酸又はタンパク質において見出されないヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を意味する。例えば、本開示の組換えＨＳＶの文脈において、「異種」ＧＣＮ４転写因子又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＨＳＶにおいて天然に見出されない核酸であり、すなわち、コードされたＧＣＮ４転写因子又はその断片は、天然に存在するＨＳＶによってコードされない。

【0123】

「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原、例えば、抗体又はエピトープ結合ペプチドを結合するタンパク質の一部分を指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝的に操作されたポリペプチドであってもよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの部分、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（domain antibody、ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合する代替足場、並びに抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質が挙げられる。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結して、ＶＨ及びＶＬドメインが別々の一本鎖により発現された場合にＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又はダイアボディを形成することができる、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を遺伝子操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又は代替足場にコンジュゲートさせてもよい。例示的な抗原結合断片には、ＤＡＲＰｉｎなどの遺伝子操作された抗体模倣タンパク質も含まれる。

【0124】

組換え（再標的化）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、腫瘍溶解目的のために改変又は適合された多くのヒト及び動物ウイルスのうちの１つである。ＨＳＶのいくつかの固有の特性は、ＨＳＶを腫瘍溶解剤として魅力的な候補にする。第１に、ＨＳＶによる溶解感染は、通常、他のＤＮＡウイルスによる感染よりもはるかに迅速に標的細胞を死滅させる。標的細胞間での迅速な複製及び拡散は、ウイルスがインビボでその完全な腫瘍溶解能を発揮することを可能にする重要な特性であり、これは、身体の免疫機構が、より遅く成長するウイルスの拡散を制限する可能性がより高いためである。第２に、ＨＳＶは広い親和性を有し、それに由来する腫瘍溶解性ウイルスは、多くの異なるタイプの腫瘍に治療的に適用することができる。原則として、この特性は、他の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、アデノウイルス由来のもの）とは対照的に、ＨＳＶを使用するウイルス療法に対する耐性の迅速な発生を防ぐはずである。最後に、アシクロビル及びファムシクロビルなどの有効な抗ＨＳＶ薬は、ウイルスからの望ましくない感染又は毒性の場合の安全対策として容易に利用可能である。

【0125】

「単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）」及び「腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本明細書中で使用されるＨＳＶは、腫瘍細胞内で選択的に複製し得、その結果、それらの破壊及び隣接する腫瘍細胞に広がり得る子孫ビリオンの産生を生じる。ＨＳＶ、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２の両方の血清型を本明細書で使用することができる。一実施形態では、本明細書で使用されるＨＳＶはＨＳＶ－１である。更なる実施形態では、本明細書で使用されるＨＳＶは、ＨＳＶ１７１６（別名Ｓｅｐｒｅｈｖｉｒ）、Ｇ２０７、Ｇ４７Ｄｅｌｔａ、Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（別名ＯｎｃｏＶｅｘ^{ＧＭ－ＣＳＦ}）、ＮＶ１０２０、ＮＶ１０２３、ＮＶ１０３４、ＮＶ１０４２、ｒＱＮｅｓｔｉｎ３４．５、ＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＯＮＣＲ－１４８、ＯＮＣＲ－１７７、ＯＮＣＲ－１５２、ＯＮＣＲ－１５３、ＶＧ１６１を含むがこれらに限定されない腫瘍溶解性ＨＳＶ、並びにＷＯ／２０１３／０３６７９５（ＢｅｎｅＶｉｒ Ｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．）に開示及び教示されるものを含む他の公知のＨＳＶから選択され得る。

【0126】

糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）は、宿主細胞へのＨＳＶ侵入に必須であり、ヘルペスウイルス感染性において必須の役割を果たす５５ｋＤａのビリオンエンベロープ糖タンパク質である。ＨＳＶが細胞に侵入すると、ｇＤとヘテロ二量体ｇＨ／ｇＬとの相互作用は、細胞へのＨＳＶ侵入に関与する４つの糖タンパク質ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ及びｇＢが関与する活性化カスケードにおける重要な事象である。活性化カスケードは、ｇＤがその受容体であるネクチン－１、ＨＶＥＭ及び修飾ヘパラン硫酸のうちの１つに結合することから始まり、これがｇＨ／ｇＬに伝達され、最終的にｇＢに伝達される。ｇＢは、ＨＳＶと標的細胞膜との融合を行う。ヘテロダイマーｇＨ／ｇＬは、ｇＤのプロフュージョンドメインと相互作用し、このプロフュージョンドメインは、細胞侵入の間にｇＤとその受容体のうちの１つとの相互作用の際に除去される。ｇＤは、ＨＳＶがその天然受容体（例えば、ネクチン－１及びＨＶＥＭ）に標的化される原因となるいくつかの特異的領域を含む。

【0127】

本明細書には、ＨＶＥＭ結合部位の全部又は一部及びネクチン－１結合部位の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列が欠失している組換えＨＳＶが開示される。

【0128】

一実施形態では、組換えＨＳＶは、ＨＶＥＭ結合部位の全部又は一部及びネクチン－１結合部位の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列が欠失し、リガンドペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列によって置換されている。

【0129】

シグナルペプチド（下線）を有するｇＤの全配列は以下の通りである。
ＭＧＧＴＡＡＲＬＧＡＶＩＬＦＶＶＩＶＧＬＨＧＶＲＧＫＹＡＬＡＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬＤＱＬＴＤＰＰＧＶＲＲＶＹＨＩＱＡＧＬＰＤＰＦＱＰＰＳＬＰＩＴＶＹＹＡＶＬＥＲＡＣＲＳＶＬＬＮＡＰＳＥＡＰＱＩＶＲＧＡＳＥＤＶＲＫＱＰＹＮＬＴＩＡＷＦＲＭＧＧＮＣＡＩＰＩＴＶＭＥＹＴＥＣＳＹＮＫＳＬＧＡＣＰＩＲＴＱＰＲＷＮＹＹＤＳＦＳＡＶＳＥＤＮＬＧＦＬＭＨＡＰＡＦＥＴＡＧＴＹＬＲＬＶＫＩＮＤＷＴＥＩＴＱＦＩＬＥＨＲＡＫＧＳＣＫＹＡＬＰＬＲＩＰＰＳＡＣＬＳＰＱＡＹＱＱＧＶＴＶＤＳＩＧＭＬＰＲＦＩＰＥＮＱＲＴＶＡＶＹＳＬＫＩＡＧＷＨＧＰＫＡＰＹＴＳＴＬＬＰＰＥＬＳＥＴＰＮＡＴＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶＧＴＶＡＰＱＩＰＰＮＷＨＩＰＳＩＱＤＡＡＴＰＹＨＰＰＡＴＰＮＮＭＧＬＩＡＧＡＶＧＧＳＬＬＡＡＬＶＩＣＧＩＶＹＷＭＨＲＲＴＲＫＡＰＫＲＩＲＬＰＨＩＲＥＤＤＱＰＳＳＨＱＰＬＦＹ（配列番号１）

【0130】

ｇＤの成熟タンパク質は以下の通りである。
ＫＹＡＬＡＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬＤＱＬＴＤＰＰＧＶＲＲＶＹＨＩＱＡＧＬＰＤＰＦＱＰＰＳＬＰＩＴＶＹＹＡＶＬＥＲＡＣＲＳＶＬＬＮＡＰＳＥＡＰＱＩＶＲＧＡＳＥＤＶＲＫＱＰＹＮＬＴＩＡＷＦＲＭＧＧＮＣＡＩＰＩＴＶＭＥＹＴＥＣＳＹＮＫＳＬＧＡＣＰＩＲＴＱＰＲＷＮＹＹＤＳＦＳＡＶＳＥＤＮＬＧＦＬＭＨＡＰＡＦＥＴＡＧＴＹＬＲＬＶＫＩＮＤＷＴＥＩＴＱＦＩＬＥＨＲＡＫＧＳＣＫＹＡＬＰＬＲＩＰＰＳＡＣＬＳＰＱＡＹＱＱＧＶＴＶＤＳＩＧＭＬＰＲＦＩＰＥＮＱＲＴＶＡＶＹＳＬＫＩＡＧＷＨＧＰＫＡＰＹＴＳＴＬＬＰＰＥＬＳＥＴＰＮＡＴＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶＧＴＶＡＰＱＩＰＰＮＷＨＩＰＳＩＱＤＡＡＴＰＹＨＰＰＡＴＰＮＮＭＧＬＩＡＧＡＶＧＧＳＬＬＡＡＬＶＩＣＧＩＶＹＷＭＨＲＲＴＲＫＡＰＫＲＩＲＬＰＨＩＲＥＤＤＱＰＳＳＨＱＰＬＦＹ（配列番号２）

【0131】

一実施形態では、組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（ＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬＤＱＬＴＤＰＰＧＶＲＲＶＹ（配列番号３））のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失している腫瘍溶解性ＨＳＶに由来する。

【0132】

一実施形態では、組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、５～１５０アミノ酸、又は５～１２０アミノ酸、又は５～１００アミノ酸、又は５～８０アミノ酸、又は５～６０アミノ酸、又は５～５０アミノ酸、又は５～４５アミノ酸、又は５～４０アミノ酸、又は１０～４０アミノ酸、又は１０～３５アミノ酸の長さを有する異種リガンドペプチドをコードするヌクレオチド配列によって置換されている、腫瘍溶解性ＨＳＶに由来する。

【0133】

一実施形態では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、ＧＣＮ４再標的化組換えＨＳＶであり、異種リガンドペプチドは、ＧＣＮ４転写因子又はその断片若しくはエピトープである。このようなＧＣＮ４再標的化組換えＨＳＶでは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、ＧＣＮ４転写因子又はその断片若しくはエピトープを含むペプチド配列をコードする異種ヌクレオチド配列によって置換されている。一態様では、異種ヌクレオチド配列は、ＧＣＮ４エピトープ（ＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶ、配列番号４）を含むペプチド配列をコードする。別の態様では、異種ヌクレオチド配列は、リンカーに隣接するＧＣＮ４エピトープ（配列番号４）から構成されるＧＣＮ４由来ペプチド（ＴＳＧＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＳＧＧＧＧＳＧＮＳ、配列番号５）を含むペプチド配列をコードする。

【0134】

一実施形態では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、ロイシンジッパー再標的化組換えＨＳＶであり、異種リガンドペプチドは、ロイシンジッパー部分である。そのようなロイシンジッパー再標的化組換えＨＳＶでは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、ロイシンジッパー部分（Ｍｏｌｌ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＩ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｕｐ ｔｏ １０（－１５）Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００１ Ｍａｒ；１０（３）：６４９－５５に開示されているものなど）又はその断片を含むペプチド配列をコードする異種ヌクレオチド配列によって置換されている。一態様では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（ＬＥＩＲＡＡＦＬＲＱＲＮＴＡＬＲＴＥＶＡＥＬＥＱＥＶＱＲＬＥＮＥＶＳＱＹＥＴＲＹＧＰＬ、配列番号６；ＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧ、配列番号７）を含むペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって置換されている。更なる態様では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、ＲＥ由来ペプチド（ＧＴＬＥＩＲＡＡＦＬＲＱＲＮＴＡＬＲＴＥＶＡＥＬＥＱＥＶＱＲＬＥＮＥＶＳＱＹＥＴＲＹＧＰＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＮＳ、配列番号８；ＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴ、配列番号９）を含むペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって置換されている。ＲＥ由来ペプチドは、リンカーに隣接する合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）から構成される。なお更なる態様では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（ＬＥＩＥＡＡＦＬＥＲＥＮＴＡＬＥＴＲＶＡＥＬＲＱＲＶＱＲＬＲＮＲＶＳＱＹＲＴＲＹＧＰＬ、配列番号１０；ＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＧＧＡＡＴＡＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧ、配列番号１１）を含むペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって置換されている。なお更なる態様では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、リンカーに隣接する合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）から構成されるＥＲ由来ペプチドを含むペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって置換されている。

【0135】

一実施形態では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、Ｌａ再標的化組換えＨＳＶであり、異種リガンドペプチドは、Ｌａタンパク質又はその断片若しくはエピトープである。このようなＬａ再標的化組換えＨＳＶにおいて、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードする核酸配列は、欠失し、核自己抗原Ｌａタンパク質又はその断片若しくはエピトープを含むペプチド配列をコードする異種ヌクレオチド配列によって置換されている（Ｋｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｆｉｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＳＳ－Ｂ／Ｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｕｔｏｅｐｉｔｏｐｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ａ ｖｉｒａｌ ｇａｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０ Ｍａｙ；８５（５）：１５６６－７４）。一態様では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失し、Ｌａエピトープ（ＳＫＰＬＰＥＶＴＤＥＹ、配列番号１２）を含むペプチド配列をコードする異種ヌクレオチド配列によって置換されている（例えば、Ｋｏｒｉｓｔｋａ，Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｓｕｒｆａｃｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ Ｌａ／ＳＳ－Ｂ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ４２（２０１３）１０５－１１６を参照されたい）。更なる態様では、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、野生型ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列が欠失され、リンカーが隣接するＬａエピトープ（配列番号１２）によって構成されるＬａ由来ペプチド（ＧＴＧＳＫＰＬＰＥＶＴＤＥＹＧＧＧＧＳＧＮＳ、配列番号１３；ＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴ、配列番号１４）を含むペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって置換されている。

【0136】

このような改変により、組換えＨＳＶは、正常細胞から脱標的化され得、以下に開示される二重特異性アダプタータンパク質と組み合わせて、罹患細胞（例えば、腫瘍細胞）に再標的化され得る。

【0137】

具体的には、本明細書中に開示される組換えＨＳＶが、細胞培養物中に存在する細胞及びおそらく罹患細胞に効率的に再標的化されるために、正常細胞上に存在するｇＤの天然受容体に対する組換えＨＳＶの結合部位が不活性化されることが有利である。これは、感染されることが意図される細胞への効率的な標的化を可能にし、一方、ヘルペスウイルスによって天然に感染される正常細胞の感染が減少される。ｇＤは、宿主細胞へのウイルス侵入に必須であり、ヘルペスウイルス感染性において必須の役割を果たす。ｇＤのそれらの天然受容体への結合部位の不活性化は、リガンドの標的分子を有する細胞への再標的化に有利に働く。本開示によれば、ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８をコードするヌクレオチド配列を欠失させることによって、組換えＨＳＶの天然ＨＶＥＭ結合部位（ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３４）及び天然ネクチン－１結合部位（ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸３５～３９）の両方が不活性化され、その結果、これらの受容体を保有する細胞への結合が減少する。これは、ｇＤの天然受容体からの組換えＨＳＶの効率的な脱標的化をもたらし、したがって、正常細胞からの本開示の組換えＨＳＶの脱標的化をもたらす。

【0138】

更に、組換えＨＳＶはまた、二重特異性アダプタータンパク質（以下に記載されるような）に結合することができ、二重特異性アダプタータンパク質と組み合わせて、がんなどの疾患を治療する際の有効な治療薬として使用することができる。この実施形態は、以下に詳述される。

【0139】

更に、本明細書に開示される組換えＨＳＶは、安全に増殖させることができる。ＨＳＶを成長させるための好適な技術及び条件は、当該技術分野において周知であり（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｇｏｙａｌ，１９８８）、ＨＳＶを細胞と共にインキュベートすること、及び感染細胞培養物の培地からＨＳＶを回収することを含む。

【0140】

「培養された」細胞は、当該分野で公知のように、維持及び増殖されるインビトロ細胞培養中に存在する細胞である。培養細胞は、制御された条件下で、一般的にそれらの自然環境の外側で成長される。通常、培養細胞は多細胞真核生物、特に動物細胞に由来する。「ＨＳＶの成長について承認された細胞株」は、ＨＳＶによって感染され得ること（すなわち、ウイルスが細胞に侵入し、増殖し得、ウイルスを産生し得ること）が既に示されている任意の細胞株を含むことを意味する。細胞株は、単一細胞に由来し、同じ遺伝子組成を含む細胞の集団である。一実施形態では、組換えヘルペスウイルスの増殖及び産生のための細胞は、Ｖｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ－２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＲＣ５、又はＲＳ細胞である。

【0141】

本開示によれば、増殖及び産生のための細胞株は、本明細書に開示される組換えＨＳＶに結合することができる標的分子を保有するように改変される。例えば、ＨＶＥＭ結合部位の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列を有し、ネクチン－１結合部位の全部又は一部が欠失している組換えＨＳＶの場合、増殖及び産生のための細胞株は、組換えＨＳＶに対する結合特異性を有する標的分子（例えば、抗原結合断片）を保有するように改変され得る。特定の一態様では、細胞株は、組換えＨＳＶ上の切断型ｇＤに対する結合特異性を有する抗原結合断片を保有するように改変され得る。又は、ＨＶＥＭ結合部位の全部又は一部及びネクチン－１結合部位の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列が欠失し、リガンドペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列によって置換された組換えＨＳＶについては、増殖及び産生のための細胞株は、リガンドペプチドに対する結合特異性を有する標的分子（例えば、抗原結合断片）を保有するように改変され得る。

【0142】

一実施形態では、細胞株は、ＧＣＮ４転写因子若しくはその断片、又はそのエピトープを結合することができる標的分子を保有し、ＧＣＮ４再標的化組換えＨＳＶを増殖させるために使用することができる。一実施形態では、細胞株は、ＧＣＮ４転写因子若しくはその断片、又はそのエピトープを結合することができる抗原結合断片又は抗原結合ドメインである標的分子を保有する。一実施形態では、本明細書において使用される細胞株は、配列番号４によって同定されるＧＣＮ４エピトープを結合することができるか、又は配列番号５によって同定されるＧＣＮ４エピトープに由来するペプチドを結合することができる抗原結合断片である標的分子を保有する。一態様では、細胞株は、ＧＣＮ４転写因子若しくはその断片、又はそのエピトープを結合することができる抗原結合断片を発現するように改変されたＶｅｒｏ細胞株である。別の態様において、Ｖｅｒｏ細胞株は、配列番号４によって同定されるＧＣＮ４エピトープを結合することができるか、又は配列番号５によって同定されるＧＣＮ４エピトープに由来するペプチドに結合することができる抗原結合断片を発現するように改変されている。

【0143】

一実施形態では、細胞株は、組換えＨＳＶによってコードされるロイシンジッパー部分を結合することができる標的分子を保有し、ロイシンジッパー再標的化組換えＨＳＶを増殖させるために使用することができる。一態様では、細胞株は、合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）又はロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）を結合することができるその断片である標的分子を保有する。更なる態様では、細胞株は、ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又はその断片を結合することができるロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）又はその断片を含むペプチドを発現するように改変されたＶｅｒｏ細胞株である。なお更なる態様では、細胞株は、合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又はロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）を結合することができるその断片である標的分子を保有する。なお更なる態様では、細胞株は、ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）又はその断片を結合することができるロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又はその断片を含むペプチドを発現するように改変されたＶｅｒｏ細胞株である。

【0144】

一実施形態では、細胞株は、Ｌａタンパク質又はその断片若しくはエピトープを結合し得る標的分子を保有し、Ｌａ再標的化組換えＨＳＶを増殖させるために使用され得る。一実施形態では、細胞株は、Ｌａタンパク質又はその断片若しくはエピトープを結合することができる抗原結合断片である標的分子を保有する。一実施形態では、本明細書で使用される細胞株は、配列番号１２によって同定されるＬａエピトープを結合することができるか、又は配列番号１３によって同定されるＬａタンパク質に由来するペプチドを結合することができる抗原結合断片である標的分子を保有する。一態様では、細胞株は、Ｌａタンパク質若しくはその断片、又はそのエピトープを結合することができる抗原結合断片を発現するように改変されたＶｅｒｏ細胞株である。別の態様では、Ｖｅｒｏ細胞株は、配列番号１２によって同定されるＬａタンパク質を結合することができるか、又は配列番号１３によって同定されるＬａタンパク質に由来するペプチドを結合することができる抗原結合断片を発現するように改変されている。

【0145】

二重特異性アダプタータンパク質
組換えＨＳＶ（上記のような）の異種ヌクレオチド配列によってコードされるリガンドペプチドを特異的に結合する第１の結合ドメインと、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はヒトＴＡＡなどの標的を特異的に結合する第２の結合ドメインと、を含むように操作された、単離された二重特異性アダプタータンパク質が、本明細書で更に開示される。

【0146】

本明細書に開示されるように、二重特異性アダプタータンパク質は、ペプチドリンカーによって連結された第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み得る。また、本開示の範囲内で、二重特異性アダプタータンパク質は、ジスルフィド結合などの分子間結合を介してコンジュゲートされた第１及び第２の結合ドメインを含み得る。

【0147】

一実施形態では、リガンドペプチドは、ＧＣＮ４転写因子若しくはその断片、又はそのエピトープである。二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、ＧＣＮ４転写因子若しくはその断片、又はＧＣＮ４のエピトープ、又は配列番号４によって同定されるＧＣＮ４のエピトープ、又は配列番号５によって同定されるリンカーに隣接するＧＣＮ４のエピトープを特異的に結合する。

【0148】

一実施形態では、リガンドペプチドは、ロイシンジッパー部分又はその断片であり、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、リガンドペプチドを特異的に結合する対形成ロイシンジッパー部分を含む。一態様では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、ロイシンジッパー部分ＲＥ若しくはその断片、又はロイシンジッパー部分ＲＥのエピトープ、又は配列番号６によって同定されるロイシンジッパー部分ＲＥ、又は配列番号８によって同定されるリンカーに隣接するロイシンジッパー部分ＲＥを特異的に結合する。更に別の実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、ロイシンジッパー部分ＥＲ若しくはその断片、又はロイシンジッパー部分ＥＲのエピトープ、又は配列番号１０によって同定されるロイシンジッパー部分ＥＲ、又はリンカーに隣接するロイシンジッパー部分ＥＲを特異的に結合する。

【0149】

一実施形態では、リガンドペプチドは、Ｌａタンパク質若しくはその断片、又はそのエピトープである。二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、Ｌａタンパク質若しくはその断片、又はＬａのエピトープ、又は配列番号１２によって同定されるＬａのエピトープ、又は配列番号１３によって同定されるリンカーに隣接するＬａのエピトープを特異的に結合する。

【0150】

本明細書で使用するとき、「リガンドペプチド若しくはその断片、又はそのエピトープを特異的に結合する」結合ドメインは、１×１０^－７Ｍ以下、又は１×１０^－８Ｍ以下、又は５×１０^－９Ｍ以下、又は１×１０^－９Ｍ以下、又は５×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１０Ｍ以下のＫＤで、リガンドペプチド若しくはその断片、又はそのエピトープを結合する抗原結合ドメインを指す。「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を使用して決定することができる。例えば、ある抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴法を使用することによって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを使用することなどによって、又は例えば、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤーインターフェロメトリー技術を使用することによって、求めることができる。ＫＤの値が小さいほど、親和性・結合特異性は高い。

【0151】

本明細書で使用するとき、「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」という用語は、発現されて、ＴＡＡに結合することができる抗体によって認識されることができる任意の抗原を指す。ＴＡＡの例としては、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＭＥＦＦ２、ＲＯＲ１、ＫＬＫ２、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ７０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺幹細胞抗原（prostate stem cell antigen、ＰＣＳＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ又はＢＣＭ）、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（G-protein coupled receptor family C group 5 member D、ＧＰＲＣ５Ｄ）、インターロイキン－１受容体アクセサリタンパク質（Interleukin-1 receptor accessory protein、ＩＬ１ＲＡＰ）、デルタ様３（delta-like 3、ＤＬＬ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（carbonic anhydrase IX、ＣＡＩＸ）、がん胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、上皮性糖タンパク質－２（epithelial glycoprotein-2、ＥＧＰ２）、上皮性糖タンパク質－４０（epithelial glycoprotein-40、ＥＧＰ－４０）、上皮性接着分子（epithelial adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ）、葉酸結合タンパク質（folate-binding protein、ＦＢＰ）、胎児性アセチルコリン受容体（acetylcholine receptor、ＡＣｈＲ）、葉酸受容体ａ及びｂ（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａ ａｎｄ ｂ、ＦＲａ及びＦＲｂ）、ガングリオシドＧ２（ganglioside G2、ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、上皮増殖因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＲＢ３、ＥＲＢ４、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（interleukin-13 receptor subunit alpha-2、ＩＬ－１３Ｒａ２）、ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kinase insert domain receptor、ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（L1 cell adhesion molecule、ＬＩＣＡＭ）、メラノーマ関連抗原１（メラノーマ抗原ファミリーＡ１、ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン－１６（Ｍｕｃ－１６）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、腫瘍関連糖タンパク質７２（tumor-associated glycoprotein 72、ＴＡＧ－７２）、血管内皮増殖因子受容体（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、タイプ１チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６（Ｎｋｐ３０）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン－４（chondroitin sulfate proteoglycan-4、ＣＳＰＧ４）、ＤＮＡＸアクセサリ分子（DNAX accessory molecule、ＤＮＡＭ－１）、エフリンタイプＡ受容体２（ＥｐＨＡ２）、線維芽細胞関連タンパク質（fibroblast associated protein、ＦＡＰ）、Ｇｐ１００／ＨＬＡ－Ａ２、グリピカン３（glypican 3、ＧＰＣ３）、ＨＡ－１Ｈ、ＨＥＲＫ－Ｖ、ＩＬ－１１Ｒａ、潜在膜タンパク質（latent membrane protein、ＬＭＰ１）、神経細胞接着分子（neural cell-adhesion molecule、Ｎ－ＣＡＭ／ＣＤ５６）、及びＴＲＡＩＬ受容体（trail receptor、ＴＲＡＩＬ Ｒ）が挙げられ得るが、それらに限定されない。

【0152】

本明細書で使用するとき、「特異的に結合する」又は「に対する結合特異性を有する」結合ドメインは、１×１０^－７Ｍ以下、又は１×１０^－８Ｍ以下、又は５×１０^－９Ｍ以下、又は１×１０^－９Ｍ以下、又は５×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１０Ｍ以下のＫＤで、標的を結合する結合ドメインを指す。

【0153】

本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、広義で使用され、かつヒト、ヒト化、複合、及びキメラ抗体を含む、免疫グロブリン又は抗体分子、並びにモノクローナル又はポリクローナルである抗体断片を含む。一般に、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、周知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。したがって、本明細書に開示される抗体は、５つの主要なクラス又は対応する下位クラスのいずれかのものであることができる。一実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。脊椎動物種の抗体軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちカッパ及びラムダのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によれば、本明細書に開示される抗体は、ラット又はヒト抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重及び軽定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含有し、これらのそれぞれは３つのドメイン（すなわち相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、代替的にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と称される。

【0154】

本明細書で使用するとき、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、リガンドペプチド（例えば、ＧＣＮ４若しくはＬａタンパク質）又はＴＡＡのエピトープを特異的に結合する単離された抗体は、リガンドペプチド又はＴＡＡのエピトープを結合しない抗体を実質的に含まない）。加えて、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。

【0155】

本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在する可能性のある自然発生変異を除いて同一である。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、又は組換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。

【0156】

本明細書で使用するとき、「単鎖抗体」という用語は、当該分野における従来の単鎖抗体を指す。１つの例示的な単鎖抗体は、短いペプチド（例えば、約５～約２０アミノ酸のペプチド）によって接続された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。別の例示的な単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含む単鎖抗原結合断片（ｓｃＦａｂ）である。更に別の例示的な単鎖抗体は、ラクダ科動物抗体の重鎖の可変領域に対応するＶＨＨ（又はいわゆるナノボディ）である。

【0157】

本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において既知である任意の技術を使用して作製される、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、インタクトな若しくは完全長の抗体、その断片、並びに／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。

【0158】

本明細書で使用するとき、用語「ヒト化抗体」とは、抗体の抗原結合特性が保持されるが、人体における抗原の抗原性が低下するように、修飾により配列相同性をヒト抗体のものに増加させた非ヒト抗体を意味する。

【0159】

本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ又は３つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗原結合ドメインの可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗原結合ドメインの配列に対応する。

【0160】

本明細書で使用するとき、用語「ＤＡＲＰｉｎ」（設計アンキリン反復タンパク質；第５章参照。「Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＤＡＲＰｉｎｓ）：Ｆｒｏｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ５０３：１０１^～１３４（２０１２）；及び「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＡＲＰｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｂ－ｎａｎｏｍｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＳＲＰ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００８）３８２，１２１１－１２２７（これらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）は、標的タンパク質に対する高い特異性及び高い結合親和性を有する抗体模倣タンパク質を指し、これは、遺伝子操作によって調製される。ＤＡＲＰｉｎは、天然アンキリンタンパク質に由来し、少なくとも２つのアンキリン反復モチーフを含む構造を有し、例えば、少なくとも３つ、４つ又は５つのアンキリン反復モチーフを含む。ＤＡＲＰｉｎは、反復モチーフの数に応じて任意の好適な分子量を有することができる。例えば、３つ、４つ、又は５つのアンキリン反復モチーフを含むＤＡＲＰｉｎは、それぞれ、約１０ｋＤａ、約１４ｋＤａ、又は約１８ｋＤａの分子量を有し得る。

【0161】

ＤＡＲＰｉｎは、構造を提供するコア部分と、コアの外側に存在し、標的に結合する標的結合部分と、を含む。構造コアは保存されたアミノ酸配列を含み、標的結合部分は標的に応じて異なるアミノ酸配列を含む。

【0162】

一実施形態では、本明細書に開示される単離された二重特異性アダプタータンパク質は、第１及び第２の結合ドメインのそれぞれが、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はＶＨＨなどの単鎖抗体を含む、単離された二重特異性抗体である。

【0163】

更なる実施形態では、第１及び第２の結合ドメインの一方又は両方は、ＤＡＲＰｉｎなどの抗原結合断片を含む。

【0164】

なお更なる実施形態では、単離された二重特異性アダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１の結合ドメイン、リンカー（例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎポリペプチドリンカー（ｎは少なくとも２の整数である）（配列番号１２８））、及び第２の結合ドメインを含む。又は、単離された二重特異性アダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２の結合ドメイン、リンカー（（Ｇ_４Ｓ）_ｎポリペプチドリンカー（ｎは少なくとも２の整数である）（配列番号１２８））、及び第１の結合ドメインを含む。

【0165】

なお更なる実施形態では、単離された二重特異性アダプタータンパク質は、ジスルフィド結合などの分子間結合を介してコンジュゲートされた第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み得る。

【0166】

図２は、本明細書において有用な二重特異性アダプタータンパク質の例示的な構成を示す。例えば、第１の結合ドメインは、抗ＧＣＮ４ポリペプチドリガンド（Ｈ６ ｓｃＦｖ）から形成され、これは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ＧＧＧＧＳ）_４リンカー（配列番号１５）によって連結された軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＨＬ）からなる。第２の結合ドメインは、単鎖可変断片ｓｃＦｖ、単鎖抗体ＶＨＨ、又は標的（例えば、腫瘍細胞）に対する特異性を有するポリペプチドＤａｒｐｉｎから形成される。

【0167】

本発明によれば、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質は、標的細胞（腫瘍細胞など）への組換えＨＳＶ感染を駆動するためのアダプターとして使用することができる。例えば、図１及び４に示されるように、その第１の結合ドメインが組換えＨＳＶを特異的に結合し、第２の結合ドメインが標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を特異的に結合することにより、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質は、標的感染のために組換えＨＳＶビリオンを標的細胞に送り込むことができる。

【0168】

第１の結合ドメイン
二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、組換えＨＳＶの異種ヌクレオチド配列によってコードされるリガンドペプチドを特異的に結合するリガンド結合ドメインである。

【0169】

一実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、ＧＣＮ４転写因子若しくはその断片、又はそのエピトープ、又は配列番号４によって同定されるそのエピトープを特異的に結合するＧＣＮ４結合ドメインである。ＧＣＮ４結合ドメインは抗原結合断片であってもよい。ＧＣＮ４結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はＶＨＨなどの単鎖抗体を含んでもよい。

【0170】

一実施形態では、ＧＣＮ４結合ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに／又は軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ＶＬを含み、その配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧ（配列番号１６）；
ＨＣＤＲ２：ＩＷＧＤＧＩＴ（配列番号１７）；
ＨＣＤＲ３：ＶＴＧＬＦＤＹ（配列番号１８）；
ＬＣＤＲ１：ＴＧＡＶＴＴＳＮＹ（配列番号１９）；
ＬＣＤＲ２：ＧＴＮ（配列番号２０）；
ＬＣＤＲ３：ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号２１）。

【0171】

一態様では、二重特異性アダプタータンパク質のＧＣＮ４結合ドメインは、配列番号２２（ＤＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＤＹＧＶＮＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＶＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＳＧＤＳＡＲＹＹＣＶＴＧＬＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号２３（ＤＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＳＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む。

【0172】

更なる態様では、二重特異性アダプタータンパク質のＧＣＮ４結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎポリペプチドリンカー（ｎは少なくとも２の整数である（配列番号１２８））によってＶＬドメインから分離されたＶＨドメインから構成され得る。ＶＨドメインは、配列番号２２と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。ＶＬドメインは、配列番号２３と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向又はＶＬ－ＶＨ配向であってもよい。１つの例示的な抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向、及び配列番号２４（ＤＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＤＹＧＶＮＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＶＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＳＧＤＳＡＲＹＹＣＶＴＧＬＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＳＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。別の例示的な抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ－ＶＨ配向、及び配列番号２５（ＤＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＳＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＤＹＧＶＮＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＶＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＳＧＤＳＡＲＹＹＣＶＴＧＬＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ）（Ｈ６ ｓｃＦｖ）と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。

【0173】

一実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、合成ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又はその断片を特異的に結合するＲＥ結合ドメインである。一態様では、ＲＥ結合ドメインは、ロイシンジッパー部分ＲＥを結合することができる抗原結合断片を含む。別の態様では、ＲＥ結合ドメインは、ロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又はその断片を特異的に結合することができるロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）又はその断片を含む。

【0174】

一実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、合成ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）又はその断片を特異的に結合するＥＲ結合ドメインである。一態様では、ＥＲ結合ドメインは、ロイシンジッパー部分ＥＲを結合することができる抗原結合断片を含む。別の態様では、ＥＲ結合ドメインは、ロイシンジッパー部分ＥＲ（配列番号１０）又はその断片を特異的に結合することができるロイシンジッパー部分ＲＥ（配列番号６）又はその断片を含む。

【0175】

一実施形態では、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、Ｌａタンパク質若しくはその断片、又はそのエピトープ、又は配列番号１２によって同定されるそのエピトープを特異的に結合するＬａ結合ドメインである。Ｌａ結合ドメインは、抗原結合断片であってもよい。Ｌａ結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はＶＨＨなどの単鎖抗体を含んでもよい。

【0176】

一実施形態では、Ｌａ結合ドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶＬを含み、その配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＨＹＹＩＹ（配列番号２６）；
ＨＣＤＲ２：ＷＭＧＧＶＮＰＳＮＧＧＴＨＦ（配列番号２７）；
ＨＣＤＲ３：ＲＳＥＹＤＹＧＬＧＦＡＹ（配列番号２８）；
ＬＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＲＴＰＫＮＹＬＡ（配列番号２９）；
ＬＣＤＲ２：ＬＬＩＹＷＡＳＴＲＫＳ（配列番号３０）；
ＬＣＤＲ３：ＫＱＳＹＮＬＬ（配列番号３１）。

【0177】

一態様によれば、二重特異性アダプタータンパク質のＬａ結合ドメインは、配列番号３２（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＨＹＹＩＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＮＰＳＮＧＧＴＨＦＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＥＹＤＹＧＬＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号３３（ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＰＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＫＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。

【0178】

更なる態様では、二重特異性アダプタータンパク質のＬａ結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。抗Ｌａ ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎポリペプチドリンカー（ｎは少なくとも２の整数である（配列番号１２８））によってＶＬドメインから分離されたＶＨドメインから構成され得る。ＶＨドメインは、配列番号３０と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。ＶＬドメインは、配列番号３１と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。抗Ｌａ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向又はＶＬ－ＶＨ配向であってもよい。１つの例示的な抗Ｌａ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向、及び配列番号３４（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＨＹＹＩＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＮＰＳＮＧＧＴＨＦＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＥＹＤＹＧＬＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＰＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＫＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）（５Ｂ９ＨＬ）と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。

【0179】

第２の結合ドメイン
二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、ＰＳＭＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＫＬＫ２、ＨＬＡ－Ｇ又はＲＯＲ１などのＴＡＡを特異的に結合するＴＡＡ結合ドメインである。一態様では、ＴＡＡ結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はＶＨＨなどの単鎖抗体を含み得る。別の態様では、ＴＡＡ結合ドメインは、ＤＡＲＰｉｎなどの抗体模倣タンパク質を含み得る。

【0180】

一実施形態では、第２の結合ドメインは、抗ＰＳＭＡ ＶＨＨ又は抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖなどのＰＳＭＡを特異的に結合する。

【0181】

一実施形態では、第２の結合ドメインは、抗ＰＳＭＡ ＶＨＨを含む。１つの例示的な抗ＰＳＭＡ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１（ＧＳＴＦＳＩＮＡ、配列番号３５）、ＨＣＤＲ２（ＬＳＳＧＧＳＫ、配列番号３６）、及びＨＣＤＲ３（ＮＡＥＩＹＹＳＤＧＶＤＤＧＹＲＧＭＤＹ、配列番号３７）を含む。又は、例示的な抗ＰＳＭＡ ＶＨＨは、配列番号３８（ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＨＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＳＩＮＡＩＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＬＳＳＧＧＳＫＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＥＩＹＹＳＤＧＶＤＤＧＹＲＧＭＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ（Ｂ１１６））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。別の例示的な抗ＰＳＭＡ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１（ＧＰＰＬＳＳＹＡ、配列番号３９）、ＨＣＤＲ２（ＩＳＷＳＧＳＮＴ、配列番号４０）、及びＨＣＤＲ３（ＡＡＤＲＲＧＧＰＬＳＤＹＥＷＥＤＥＹＡＤ、配列番号４１）を含む。又は、例示的な抗ＰＳＭＡ ＶＨＨは、配列番号４２（ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＰＰＬＳＳＹＡＶＡＷＦＲＱＴＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＳＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＶＬＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＲＲＧＧＰＬＳＤＹＥＷＥＤＥＹＡＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（Ｂ１１０））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0182】

一実施形態では、第２の結合ドメインは、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを含む。本明細書に開示される抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向又はＶＬ－ＶＨ配向であってもよい。一態様では、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、ＨＣＤＲ１（ＧＦＴＦＳＦＹＮ、配列番号４３）、ＨＣＤＲ２（ＩＳＴＳＳＳＴＩ、配列番号４４）、及びＨＣＤＲ３（ＡＲＥＧＳＹＹＤＳＳＧＹＰＹＹＹＹＤＭＤＶ、配列番号４５）を含むＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（ＳＳＮＩＧＡＧＹＤ、配列番号４６）、ＬＣＤＲ２（ＧＮＴ、配列番号４７）、及びＬＣＤＲ３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＴＰＹＶＶ、配列番号４８）を含むＶＬを含む。別の態様では、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４９（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＹＩＳＴＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＳＹＹＤＳＳＧＹＰＹＹＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号５０（ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＴＰＹＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む。

【0183】

１つの例示的な抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向、及び配列番号５１（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＹＩＳＴＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＳＹＹＤＳＳＧＹＰＹＹＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＴＰＹＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（Ｂ５８８ＨＬ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。別の例示的な抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ－ＶＨ配向、及び配列番号５２（ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＴＰＹＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＹＩＳＴＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＳＹＹＤＳＳＧＹＰＹＹＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ｂ５８８ＬＨ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。

【0184】

更なる実施形態では、第２の結合ドメインは、抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖなどのＴＭＥＦＦ２を特異的に結合する。本明細書に開示される抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向又はＶＬ－ＶＨ配向であってもよい。一態様では、抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、ＨＣＤＲ１（ＧＦＴＦＳＳＹＳ、配列番号５３）、ＨＣＤＲ２（ＩＳＧＳＧＧＦＴ、配列番号５４）、及びＨＣＤＲ３（ＡＲＭＰＬＮＳＰＨＤＹ、配列番号５５）を含むＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（ＱＧＩＲＮＤ、配列番号５６）、ＬＣＤＲ２（ＡＡＳ、配列番号５７）、及びＬＣＤＲ３（ＬＱＤＹＮＹＰＬＴ、配列番号５８）を含むＶＬを含む。一態様では、抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、配列番号５９（ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＦＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＰＬＮＳＰＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６０（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む。一態様では、抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、ＨＣＤＲ１（ＧＶＳＩＳＳＹＦ、配列番号６１）、ＨＣＤＲ２（ＩＳＴＳＧＳＴ、配列番号６２）、及びＨＣＤＲ３（ＶＲＤＷＴＧＦＤＹ、配列番号６３）を含むＶＨ、並びに／又はＬＣＤＲ１（ＳＳＤＶＧＳＹＮＬ、配列番号６４）、ＬＣＤＲ２（ＥＧＳ、配列番号６５）、及びＬＣＤＲ３（ＳＳＹＡＧＳＳＴＹＶ、配列番号６６）を含むＶＬを含む。一態様では、抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、配列番号６７（ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＩＳＳＹＦＷＳＷＬＲＱＰＡＧＫＧＬＱＷＩＧＲＩＳＴＳＧＳＴＮＨＮＰＳＬＫＳＲＶＩＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＷＴＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号６８（ＳＹＥＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＩＧＴＳＳＤＶＧＳＹＮＬＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＶＰＫＬＭＩＹＥＧＳＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＡＧＳＳＴＹＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む。

【0185】

１つの例示的な抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向、及び配列番号６９（ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＩＳＳＹＦＷＳＷＬＲＱＰＡＧＫＧＬＱＷＩＧＲＩＳＴＳＧＳＴＮＨＮＰＳＬＫＳＲＶＩＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＷＴＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＳＹＥＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＩＧＴＳＳＤＶＧＳＹＮＬＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＶＰＫＬＭＩＹＥＧＳＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＡＧＳＳＴＹＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（ＴＭＥＦ９ＨＬ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。別の例示的な抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ－ＶＨ配向、及び配列番号７０（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＦＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＰＬＮＳＰＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＴＭＥＦ８４７ＬＨ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。更に別の例示的な抗ＴＭＥＦＦ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ－ＶＨ配向、及び配列番号７１（ＳＹＥＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＩＧＴＳＳＤＶＧＳＹＮＬＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＶＰＫＬＭＩＹＥＧＳＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＡＧＳＳＴＹＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＩＳＳＹＦＷＳＷＬＲＱＰＡＧＫＧＬＱＷＩＧＲＩＳＴＳＧＳＴＮＨＮＰＳＬＫＳＲＶＩＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＷＴＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＴＭＥＦ９ＬＨ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。

【0186】

なお更なる実施形態では、第２の結合ドメインは、抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖなどのＫＬＫ２を特異的に結合する。本明細書に開示される抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向又はＶＬ－ＶＨ配向であってもよい。一態様では、抗ＫＬＫ ２ ｓｃＦｖは、ＨＣＤＲ１（ＧＮＳＩＴＳＤＹＡ、配列番号７２）、ＨＣＤＲ２（ＩＳＹＳＧＳＴ、配列番号７３）、ＨＣＤＲ３（ＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦ、配列番号７４）、ＬＣＤＲ１（ＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬ、配列番号７５）、ＬＣＤＲ２（ＡＡＳ、配列番号７６）、及びＬＣＤＲ３（ＱＱＴＲＫＶＰＹＴ、配列番号７７）を含む。別の態様では、抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖは、配列番号７８（ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＶＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号７９（ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＱＧＴＫ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む。更に別の態様では、抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖは、配列番号８０（ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＲＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＨ、及び／又は配列番号８１（ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＡＡＳＮＶＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）と少なくとも９５％、若しくは少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるポリペプチド配列を有するＶＬを含む。

【0187】

１つの例示的な抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向、及び配列番号８２（ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＶＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（１１Ｂ６ＨＬ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。別の例示的な抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向、及び配列番号８３（ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＲＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＡＡＳＮＶＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＫＬ２Ｂ３５９ＨＬ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。更に例示的な抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ－ＶＨ配向、及び配列番号８４（ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＶＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１１Ｂ６ＬＨ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。更に例示的な抗ＫＬＫ２ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ－ＶＨ配向、及び配列番号８５（ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＡＡＳＮＶＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＲＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ））と少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。

【0188】

なお更なる実施形態では、第２の結合ドメインは、抗ＨＬＡ－Ｇ ｓｃＦｖなどのＨＬＡ－Ｇを特異的に結合する。本明細書に開示される抗ＨＬＡ－Ｇ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＶＬ配向又はＶＬ－ＶＨ配向であってもよい。

【0189】

なお更なる実施形態では、第２の結合ドメインは、ポリペプチドリガンドＤＡＲＰｉｎなどのＲＯＲ１を特異的に結合する。ＲＯＲ１に対する特異性を有する例示的なＤＡＲＰｉｎは、配列番号８６（ＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡＳＤＲＹＧＲＴＰＬＨＬＡＡＦＮＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＫＤＫＩＧＮＴＰＬＨＬＡＡＮＨＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＶＶＮＡＴＤＷＬＧＶＴＰＬＨＬＡＡＶＦＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＱＤＫＦＧＫＴＡＦＤＩＳＩＤＮＧＮＥＤＬＡＥＩＬＱＫＬ（Ｈ６ｗ、例えば、Ｋｏｃｈ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＡＲＰｉｎｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ａｔ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｉｅｎｎａを参照されたい））と９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を有する。

【0190】

なお更なる実施形態では、本発明は、二重特異性アダプタータンパク質又はその断片をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができることが、当業者には理解されよう。したがって、本発明の二重特異性アダプタータンパク質又はその断片をコードする核酸配列を、タンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は当業者には理解されるであろう。

【0191】

本開示のなお更なる実施形態では、本発明は、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質又はその断片をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本開示を考慮して、当業者に既知である任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は抑制型プロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当技術分野において知られており、細胞内でその抗原結合ドメインを生成するために、本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成法を使用して、本発明の実施形態に従った組換え発現ベクターを生成することができる。

【0192】

なお更なる実施形態では、本発明は、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質又はその断片をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを形質導入した細胞に関する。「形質導入された」又は「形質導入」という用語は、外因性の核酸が宿主細胞に移送又は導入されるプロセスを指す。「形質導入された」細胞は、外因性の核酸で形質導入されたものである。その細胞は、対象の一次細胞及びその子孫を含む。

【0193】

別の一般的な態様では、本発明は、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質又はその断片をコードする単離核酸分子を含むベクターを細胞に形質導入することによって形質転換細胞を調製する方法に関する。

【0194】

別の一般的な態様において、本発明は、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質又はその断片をコードする単離核酸分子を含む、宿主細胞に関する。本開示を考慮すると、当業者に知られている任意の宿主細胞を、本発明の抗体又はその抗原結合断片の組換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１若しくはＢＬ２１細胞（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ抗体の発現の場合）、ＣＨＯ－ＤＧ４４若しくはＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はＨＥＫ２９３細胞（例えば、完全長ＩｇＧ抗体の発現の場合）である。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、組換え核酸が効果的に発現するように宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる、化学的トランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞に形質転換される。

【0195】

本開示のなお更なる実施形態では、本発明は、本明細書に開示される単離された二重特異性アダプタータンパク質を産生する方法であって、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から（例えば、上清から）二重特異性アダプタータンパク質を回収することと、を含む、方法に関する。発現された二重特異性アダプタータンパク質は、当該技術分野において既知の従来技術に従って、また、本明細書に記載されるように、細胞から採取し、精製することができる。

【0196】

医薬組成物
上に開示された組換えＨＳＶと、上に開示された単離された二重特異性アダプタータンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物が、本明細書でなお更に開示される。本明細書で使用するとき、「医薬組成物」という用語は、上に開示された組換えＨＳＶと、上に開示された単離された二重特異性アダプタータンパク質と、を、１つ又は２つ以上の医薬的に許容される担体と共に含む、製品を意味する。

【0197】

本明細書で使用するとき、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野において周知である他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書に使用される場合、「医薬的に許容される担体」という用語は、本発明による組成物の有効性にも本発明による組成物の生物学的活性にも干渉しない非毒性性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮すると、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、ウイルス及び／又は遺伝子操作された免疫細胞の医薬組成物における使用に好適な、任意の医薬的に許容される担体を、本発明で使用できる。

【0198】

使用方法
別の一般的な態様では、本発明は、上に開示された二重特異性アダプタータンパク質を使用して、上に開示された組換えＨＳＶを腫瘍細胞に再標的化する方法に関する。本方法は、組換えＨＳＶ及び二重特異性アダプタータンパク質を対象に投与することを含み、二重特異性アダプタータンパク質の第１の結合ドメインは、組換えＨＳＶを特異的に結合し、二重特異性アダプタータンパク質の第２の結合ドメインは、腫瘍細胞のＴＡＡを特異的に結合し、それによって組換えＨＳＶが腫瘍細胞に再標的化される。

【0199】

本方法において、組換えＨＳＶ及び二重特異性アダプタータンパク質は、二重特異性アダプタータンパク質の第１のドメインが組換えＨＳＶによって発現される異種リガンドペプチドを特異的に結合し、二重特異性アダプタータンパク質の第２のドメインが選択された腫瘍細胞の表面上のＴＡＡを特異的に結合するように選択される。例えば、組換えＨＳＶを前立腺がん細胞に再標的化するために、ＧＣＮ４再標的化組換えＨＳＶ、並びに抗ＧＣＮ４ ｓｃＦｖを含む第１の結合ドメイン及び抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを含む第２の結合ドメインを有する二重特異性アダプタータンパク質を選択することができる。

【0200】

別の一般的な態様では、本発明は、がんの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に開示される一致する二重特異性アダプタータンパク質を有する組換えＨＳＶを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。本方法によって、組換えＨＳＶは、一致する二重特異性アダプタータンパク質によって対象におけるがん細胞に再標的化され、それによってがん細胞の腫瘍溶解を引き起こす。本明細書で使用するとき、「腫瘍溶解」は、標的がん細胞の生存率の減少を指す。生存率は、処理した細胞の生細胞カウントによって決定することができ、減少の程度は、処理した細胞中の生細胞数を未処理の細胞中の生細胞数と比較することによって、又は処理前後の生細胞カウントを比較することによって決定することができる。

【0201】

がんは、例えば、前立腺がん、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、胆管細胞がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphoma、ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、及び他の液体腫瘍から選択され得るが、これらに限定されない。

【0202】

本発明の実施形態によれば、組換えＨＳＶ及び二重特異性アダプタータンパク質を含む医薬組成物は、治療有効量の本明細書に開示される組換えＨＳＶ及び二重特異性アダプタータンパク質を含む。本明細書で使用するとき、「治療有効量」という用語は、対象に所望の生物学的又は薬理的応答を惹起する活性成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記載される目的に対して経験的かつ通常の方法で決定することができる。

【0203】

組換えＨＳＶ及び二重特異性アダプタータンパク質に関して本明細書で使用するとき、治療有効量とは、免疫応答の調節を必要とする対象においてそれを行う、二重特異性アダプタータンパク質と組み合わせた組換えＨＳＶの量を意味する。また、組換えＨＳＶに関して本明細書で使用するとき、治療有効量とは、疾患、障害、若しくは状態の治療をもたらす、疾患、障害、若しくは状態の進行を予防する若しくは遅延させる、又は疾患、障害、若しくは状態に関連する症状を低減する若しくは完全に緩和する、二重特異性アダプタータンパク質を伴う組換えＨＳＶの量を意味する。

【0204】

特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療の量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害若しくは状態又はそれに関連する症状の重症度を軽減又は改善すること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の進行を予防すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の進行又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の再発を予防すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／あるいは（ｘｉｉ）別の療法の予防又は治療効果を強化又は改善すること。

【0205】

治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は状態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために最適に漸増される。

【0206】

特定の実施形態によれば、本明細書に記載される医薬組成物は、対象への想定される投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、又は筋肉内投与に好適であるように製剤化することができる。

【0207】

本発明の医薬組成物は、当業者に既知の任意の便利な様式で投与され得る。例えば、本発明の医薬組成物は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、及び／又は移植によって対象に投与することができる。本発明の組換えＨＳＶ及び一致する二重特異性アダプタータンパク質を含む医薬組成物は、経動脈に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、瘤内に、髄内に、筋肉内に、胸膜内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内に投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象のリンパ球枯渇を伴って又は伴わずに投与され得る。

【0208】

本明細書に開示される組換えＨＳＶ及び二重特異性アダプタータンパク質を含む医薬組成物は、滅菌液体調製物、典型的には細胞懸濁液を含む等張性水溶液、又は任意選択的に、選択されたｐＨにまで緩衝されるエマルジョン、分散液などとして提供され得る。医薬組成物は、組換えＨＳＶ及び二重特異性アダプタータンパク質の完全性及び生存性、並びに医薬組成物の投与に適した担体、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などを含むことができる。

【0209】

本明細書で使用するとき、用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、及び「治療（treatment）」は全て、がんに関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善又は回復を指し、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」はまた、疾患、障害、又は病態を退縮させる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、腫瘍若しくはがんなどの疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ又は２つ以上の症状の緩和、進行若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。

【0210】

特定の実施形態によれば、がんの治療において使用される組換えＨＳＶ及び一致する二重特異性アダプタータンパク質を含む医薬組成物が提供される。がん療法のために、提供される医薬組成物は、化学療法、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ、抗ＬＡＧ－３ｍＡｂ、抗ＥＧＦＲｍＡｂ、抗ＨＥＲ－２ｍＡｂ、抗ＣＤ１９ｍＡｂ、抗ＣＤ３３ｍＡｂ、抗ＣＤ４７ｍＡｂ、抗ＣＤ７３ｍＡｂ、抗ＤＬＬ－３ｍＡｂ、抗アペリンｍＡｂ、抗ＴＩＰ－１ｍＡｂ、抗ＦＯＬＲ１ｍＡｂ、抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ、抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ、他の免疫腫瘍学薬、抗血管新生薬、放射線療法、抗体－薬物複合体（antibody-drug conjugate、ＡＤＣ）、標的療法、又は他の抗がん薬が挙げられるがこれらに限定されない、別の治療法と併用され得る。

【0211】

特定の実施形態によれば、がんの治療を必要とする対象においてそれを行う方法は、対象に、本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質と組み合わせて組換えＨＳＶを投与することを含む。

【0212】

キット
別の一般的な態様では、本明細書に開示される組換えＨＳＶと、本明細書に開示される単離された二重特異性アダプタータンパク質と、任意選択的に医薬担体と、を含むキット、単位投与量、及び製造物品が本明細書に提供される。特定の実施形態では、キットは、その使用説明書を提供する。

【0213】

別の特定の態様では、（１）本明細書に開示される組換えＨＳＶと、（２）本明細書に開示される単離された二重特異性アダプタータンパク質又はその断片と、を含むキットが、本明細書において提供される。組換えＨＳＶ及び単離された二重特異性アダプタータンパク質は、別個の成分として、又はプレミックスとしてキットに含まれ得る。

【0214】

別の特定の態様では、（１）本明細書に開示される組換えＨＳＶと、（２）本明細書に開示される二重特異性アダプタータンパク質又はその断片をコードする単離核酸分子と、を含むキットが、本明細書において提供される。組換えＨＳＶ及び単離核酸分子は、別個の成分として、又はプレミックスとしてキットに含まれ得る。

【実施例】

【0215】

ＧＣＮ４／Ｈ６ ｓｃＦｖによるＨＳＶの再標的化
材料及び方法
細胞培養
Ｖｅｒｏ細胞（Ｖｅｒｏ ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）を、４．５ｇ／Ｌグルコース、ピルビン酸ナトリウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１００Ｕ／ｍＬ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。無血清Ｖｅｒｏ（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ ｃＧＭＰ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＶＥＲＯ－ＳＦ－ＡＣＦ ＭＣＢ）を、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１００Ｕ／ｍＬ）を補充したＶＰ－ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔを、４．５ｇ／Ｌグルコース、ピルビン酸ナトリウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１００Ｕ／ｍＬ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。２２Ｒｖ１細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、ピルビン酸ナトリウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１００Ｕ／ｍＬ）を補充したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １４６０培地（ＲＰＭＩ－１４６０）中で維持した。ＬＮＣａＰを、４．５ｇ／Ｌグルコース、ピルビン酸ナトリウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１００Ｕ／ｍＬ）を補充した、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＤＵ１４５を、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１００Ｕ／ｍＬ）を補充した、ＥＢＳＳ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で維持した。

【0216】

ＧＣＮ４再標的化ｏＨＳＶ１細菌人工染色体（ＢＡＣ）
ＧＣＮ４再標的化ＨＳＶ１ ＢＡＣ（又は組換えＨＳＶ１）は、ＨＳＶ１Ｐａｔｔｏｎ株ゲノムを含有し（例えば、完全な説明については、Ｍｕｌｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００７ Ａｐｒ；８１（７）：３３７７－９０を参照されたい）、これに、ＥＧＦＰ－ＦＲＴ－ＫＡＮ－ＦＲＴ－Ｔ２Ａ－１ＸＧＣＮ－ｄ６－３８ｇＤカセットを、ＵＳ６遺伝子（ｇｅｎｅｂａｎｋ ＭＦ９５９５４４．１ヌクレオチド１３８３０９～１３９４９３）の開始コドンと終止コドンとの間に挿入した。カセットは、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）アミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４２２１２、Ｆ６４Ｌ及びＳ６５Ｔ変異）と、ＯＶＡペプチド（下線）及びインフレームＦＲＴ部位（イタリック体太字、ヌクレオチド配列ｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃ）（配列番号１３０）を含むペプチドリンカー（ＡＡ配列：

【0217】

）（配列番号１２９）と、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド（ＡＡ配列：ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号１３１）と、内因性ＵＳ６シグナルペプチド（ＡＡ配列

【0218】

（配列番号１３２）、シグナルペプチドには下線）を含むＵＳ６アミノ酸１～３０と、ＧＣＮ４エピトープペプチド（配列

【0219】

（配列番号５）、エピトープには下線（配列番号４））を含有する３０ＡＡ挿入と、ＵＳ６ ＡＡ３９～３６９（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ５７０８３）とのインフレーム融合物を含有する。

【0220】

ＧＣＮ４再標的化ＨＳＶ１
ＧＣＮ４再標的化ウイルスは、ｇＤ相補ＶＳＦ細胞株ｅＦ９の１ｅ６細胞に、リポフェクタミン３０００を含む１μｇのＧＣＮ４再標的化ＨＳＶ１ ＢＡＣをトランスフェクトすることによって得た。続いて、ウイルスをＶｅｒｏ Ｈ６－ネクチン１細胞上で継代することによって増幅した。

【0221】

ｇＤ相補ＶＳＦ細胞株
無血清Ｖｅｒｏ細胞（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ ｃＧＭＰ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＶＥＲＯ－ＳＦ－ＡＣＦ ＭＣＢ）に、内因性ＵＳ６遺伝子の代わりに挿入されたＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＵＳ６（糖タンパク質Ｄ）カセットを含有するＨＳＶ１ Ｐａｔｔｏｎ株ゲノムの５．７ｋｂ断片を保有するレンチウイルスを形質導入した。ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＵＳ６ ＯＲＦは、ＵＳ６ ＯＲＦの上流の１．５ｋｂのゲノム配列及びＵＳ６ ＯＲＦの下流の２．２ｋｂのゲノム配列に隣接している。ブラストサイジン（２ｕｇ／ｍＬ）で選択した後、単細胞クローンを限界希釈によって単離した。クローンを、ｇＤ欠損ＨＳＶ１ ＢＡＣクローンの成長を救済するそれらの能力についてスクリーニングした。

【0222】

Ｈ６－ネクチン１細胞株
Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）及びＢ１６－Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－６４７５ＴＭ）に、Ｇ_４Ｓリンカー（配列番号１２４）によって分離されたヒトネクチン－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５２２３）のＡＡ１４６～５１７に融合した抗ＧＣＮ４ Ｈ６ ｓｃＦｖを発現するレンチウイルスを形質導入した。ブラストサイジン選択（それぞれ７．５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬ）後、単一細胞クローンを限界希釈によって単離し、ウェスタンブロットによってＨ６－ネクチン１発現についてスクリーニングした。

【0223】

ＰＳＭＡ細胞株
ＨＥＫ－２９３Ｔに、ヒトＰＳＭＡを発現するレンチウイルス（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、カタログ番号：ＬＰＰ－Ｇ００５０－Ｌｖ１０５－０５０－Ｓ）を形質導入した。ピューロマイシン選択（２．５μｇ／ｍＬ）後、単一細胞クローンを限界希釈によって単離し、ウェスタンブロット及びＦＡＣＳ分析によってＰＳＭＡ発現についてスクリーニングした。

【0224】

ＴＭＥＦＦ２細胞株
Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）に、ヒトＴＭＥＦＦ２を発現するレンチウイルスを形質導入した。ピューロマイシン選択（５μｇ／ｍＬ）後、安定な集団を、細胞選別によってＰＳＭＡ発現について濃縮した。

【0225】

ＫＬＫ２－ネクチン１細胞株
Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）に、ヒトネクチン－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５２２３、トランスメンブレン＋細胞質ドメイン）のＡＡ３３７～５１７に融合したＳ１９５Ａ変異（触媒死変異体）を保有するヒトＫＬＫ２（ＡＡ２５～２６１、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０１５１）を発現するレンチウイルスを形質導入した。ピューロマイシン選択（５μｇ／ｍＬ）後、安定な集団を、細胞選別によってＫＬＫ２－ネクチン１発現について濃縮した。

【0226】

二重特異性アダプタータンパク質のトランスフェクション及び発現
本研究で使用した全ての二重特異性アダプタータンパク質（表１を参照されたい）を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ｍｙｃ－ＨｉｓＡベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）にクローニングした。

【0227】

トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全ＤＭＥＭ中の２４ウェルに播種した。播種の２４時間後、リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を製造業者の指示に従って使用して、細胞に５００ｎｇの各二重特異性アダプター発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し、ＧＣＮ４再標的化ＨＳＶ１感染アッセイに直ちに使用した。

【0228】

ＧＣＮ４再標的化ＨＳＶ１感染アッセイ
標的細胞を、感染の２４時間前にポリ－Ｌリシン（Ｓｉｇｍａ、０．０１％、ＲＴで３０分、ＤＰＢＳで２回洗浄）で処理した９６ウェルプレートに播種した。感染当日、培地を除去し、二重特異性アダプタータンパク質を含有する５０μＬの馴化上清と交換した。１つの未処理ウェルをトリプシン処理し、細胞を計数した。３７℃で２時間インキュベートした後、馴化培地を除去し、細胞を１００μＬのＰＢＳ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を除く）で洗浄し、ＭＯＩ＝０．１で希釈した再標的化ウイルスを含有する５０μＬの新鮮な完全培地を添加する。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。ウイルス上清を除去し、ウェルを１００μＬのＰＢＳ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を除く）で洗浄し、１００μＬの新鮮な完全培地を添加した。２４時間後、ＧＦＰ蛍光及び細胞変性効果を顕微鏡でモニターした。

【0229】

ウェスタンブロット
７５μＬの上清を２５μＬの４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ＋１００ｍＭ ＤＴＴ）と混合し、９５℃で５分間変性させた。２０μＬの各変性上清を、４～１５％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ（Ｂｉｏｒａｄ）に流し、低蛍光ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ＲＴＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒキット）に移した。ブロッキング緩衝液として、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｌｉ－ＣｏＲ）を用いた。ｃ－Ｍｙｃマウスモノクローナル抗体（９Ｅ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を一次抗体として、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷヤギ抗マウス（Ｌｉｃｏｒ）を二次抗体として用いて、Ｍｙｃタグ付き二重特異性アダプターを検出した。ブロットをＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸスキャナー（Ｌｉｃｏｒ）でスキャンした。

【0230】

ＦＡＣＳ染色
安定な細胞株及びそれらの親対応物を以下の抗体で染色した：ＰＥ標識抗ＲＯＲ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５７８０３）、ＪＦ６４６標識抗ＴＭＥＦＦ２（Ｊ４Ｂ６、ＮＯＶＵＳＢＩＯ）、ＰＥ標識抗ＰＳＭＡ抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ７７２２８）、ＰＥ標識マウスＩｇＧ１、Ｋ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ標識抗ＤＹＤＤＤＤＫ（配列番号１３３）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。簡単に説明すると、１ｅ６細胞を１００μＬ容量で染色毎に使用した。ＰＢＳ中で洗浄した後、細胞を、抗体製造業者の仕様書に従って、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）中、４℃で３０分間染色した。ＰＢＳ中で洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で固定した。試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。

【0231】

インビトロ融合アッセイ
このアッセイでは、デュアルスプリットプロテイン（ＤＳＰ）レポーター（例えば、Ｋｏｎｄｏ Ｎ，Ｍｉｙａｕｃｈｉ Ｋ，Ｍｅｎｇ Ｆ，Ｉｗａｍｏｔｏ Ａ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｚ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ－１ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｔｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｓｐａｎｎｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１０ Ｍａｙ ７；２８５（１９）：１４６８１－８を参照されたい）を使用した。エフェクター細胞の播種のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェル透明底／白色壁プレートに１／６分割した。標的細胞の播種のために、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３Ｔ－ＰＳＭＡを１２ウェルプレートに１／４分割した。翌日、９６ウェル中のエフェクター細胞にそれぞれ、ＯｐｔｉＭＥＭ中のリポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用して、ＨＳＶ１糖タンパク質ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ及びｇＤ（又は対応するｇＤ融合物）並びにスプリットタンパク質レポーターｃＤＳＰを１：２：２：１：３の質量比で発現する１８０ｎｇのプラスミドの混合物をトランスフェクトした。１２ウェル中の標的細胞に、対応する標的タンパク質（同量の空ベクターを受ける２９３Ｔ－ＰＳＭＡを除く）、対応するアダプター（対照試料は同量の空発現ベクターを受ける）及びスプリットタンパク質レポーターｎＤＳＰを発現する１μｇの１：１：１混合プラスミドを同様にトランスフェクトした。翌日、９６ウェルプレート中の培養培地を、６０μＭ Ｅｎｄｕｒｅｎ（生細胞透過性ルシフェラーゼ基質、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するフェノールレッド不含培養培地と交換し、標的細胞をベルセン溶液（Ｇｉｂｃｏ）で剥離し、フェノールレッド不含培養培地で洗浄し、６０μＭ Ｅｎｄｕｒｅｎを含有するフェノールレッド不含培養培地に再懸濁し、エフェクター細胞に添加した。エフェクター細胞への標的細胞の添加の７時間後に、細胞融合から生じるルシフェラーゼ活性を、サイトテーション（cytation）５マルチモードプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）をルミノメーターモードで用いて測定する。

【0232】

結果
ｇＤ（配列番号３）のアミノ酸６～３８を、ピコモル親和性単鎖抗体断片（Ｈ６ ｓｃＦｖ、本明細書においてＨ６と称される）が利用可能であったＧＣＮ４酵母転写因子由来の１６ＡＡエピトープ（配列番号４）を含有する３０ＡＡペプチド（配列番号５）で置換することによって、腫瘍溶解性ＨＳＶ１（ｏＨＳＶ１）を再標的化した（例えば、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ａｐｒ ３０；２７９（１８）：１８８７０－７を参照されたい）。得られたポリペプチドは、本明細書中で１ＸＧＣＮ－ｄ６－３８－ｇＤとも称される。遺伝子改変は、細菌人工染色体（１）中のｏＨＳＶ１ゲノムと、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドによって１ＸＧＣＮ－ｄ６－３８－ｇＤから分離された高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）配列を含有する発現カセットとの間の内因性糖タンパク質Ｄ遺伝子座における組換えによって得られた（材料及び方法を参照されたい）。したがって、得られたウイルスは、内因性ＵＳ６遺伝子座の５’及び３’ＵＴＲを使用して、ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－１ＸＧＣＮ－ｄ６－３８－ｇＤカセットの発現を制御し、ウイルス表面における再標的化１ＸＧＣＮ－ｄ６－３８－ｇＤの発現及び感染細胞におけるＥＧＦＰの発現をもたらす。

【0233】

ＧＣＮ４／Ｈ６再標的化及びウイルスの特異性を、Ｈ６－ネクチン１融合タンパク質をその表面に安定に発現するＢ１６－Ｆ１０及びＶｅｒｏ細胞株に感染させることによって最初に試験した。図６に示すように、ＧＣＮ４／Ｈ６再標的化ウイルスは、Ｈ６－ネクチン１を発現するＶｅｒｏ及びＢ１６－Ｆ１０細胞株の両方に感染することができたが、それらの親対応物には感染することができなかった。逆に、野生型ｇＤ糖タンパク質を発現するｏＨＳＶ１は、その表面にネクチン－１を発現する親Ｖｅｒｏ細胞株に感染することができたが、ネクチン－１発現を欠くＢ１６－Ｆ１０親細胞株には感染することができなかった。全体として、これらの結果は、ＧＣＮ４再標的化ウイルスが、受容体としてネクチン１を使用して細胞に感染するその能力を喪失したが、細胞侵入のためのその受容体としてＨ６－ネクチン１融合物を使用することができたことを確認した。

【0234】

腫瘍マーカーへの再標的化のために、抗ＧＣＮ４ Ｈ６ ｓｃＦｖを、以下の標的：ＰＳＭＡ（図７）、ＴＭＥＦＦ２（図８）、ＫＬＫ２（図９）及びＲＯＲ１（図１０）に対する異なる単鎖結合剤に融合させることによって、二重特異性アダプタータンパク質を設計した。全ての構築物のリストを表１に示す。ＰＳＭＡの場合、ＰＳＭＡ－Ｈ６二重特異性発現ベクターによって一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図７Ａ）の上清が、感染の２４時間後のＧＦＰ発現によってモニターされるように（図７Ｃ）、ＰＳＭＡを発現するＨＥＫ２９３Ｔ（図７Ｂ及び７Ｃ）並びにＰＳＭＡ陽性前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰの感染を首尾よく再標的化することが実証された。逆に、二重特異性アダプタータンパク質は、親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株又はＰＳＭＡ陰性前立腺がん細胞株ＤＵ１４５への感染を再標的化することができなかった。ＴＭＥＦＦ２（図８）についても、同様の結果が観察された。二重特異性発現ベクターによって一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清（図８Ａ）は、それらの表面にＴＭＥＦＦ２を安定に発現するＶｅｒｏ細胞（図８Ｂ及び８Ｃ）又はＴＭＥＦＦ２陽性前立腺がん細胞株２２Ｒｖ１（図８Ｃ）に感染を再標的化することができた。ヒトＴＭＥＦＦ２発現を欠く親Ｖｅｒｏ細胞株は、ＧＣＮ４再標的化ウイルスによる感染に耐性であった。ネクチン１の膜貫通及び細胞質ドメインによって細胞表面に繋ぎ止められたＫＬＫ２を発現するＶｅｒｏ細胞株（図９Ｂ及び９Ｃ）は、ＫＬＫ２－Ｈ６アダプター発現構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清の存在下で、ＧＣＮ４再標的化ＨＳＶ１による感染に対して感受性にされた（図９Ａ）。対照的に、親Ｖｅｒｏ細胞株は耐性であった。別の例では、表面にＲＯＲ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図１０Ｂ）は、ＲＯＲ１－Ｈ６アダプター発現構築物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清の存在下で、ＧＣＮ４再標的化ＨＳＶ１による感染に対して感受性であった（図１０Ｃ）。

【0235】

まとめると、これらの結果は、ＧＣＮ４ペプチド／Ｈ６ ｓｃＦｖ対を用いたＨＳＶ１の再標的化が効率的かつ多用途であることを実証する。これは、様々な腫瘍マーカーに対する最小限の操作で、異なる形式の結合剤（ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｄａｒｐｉｎ）に容易に適合させることができる。

【0236】

ロイシンジッパーＲＥ／ＥＲによるＨＳＶ再標的化
ロイシンジッパー対を使用するＨＳＶ１再標的化を実証するために（図５を参照されたい）、スプリットタンパク質レポーター系を使用する直接インビトロ融合アッセイを開発した。簡潔に述べると、細胞（エフェクター細胞）の集団に、ｉ）アミノ酸６～３６が配列（配列番号６）のロイシンジッパー、続いて（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号１２６）で置換された修飾ｇＤ糖タンパク質（ＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤ）を、ｉｉ）ＨＳＶ１膜融合機構の３つの他の野生型糖タンパク質成分（ｇＢ、ｇＨ及びｇＬ）を、及びｉｉｉ）スプリットタンパク質レポーター系対の成分のうちの１つ（ｃＤＳＰ）を、トランスフェクトした。上記のＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－ロイシンジッパーに相補的なＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－ロイシンジッパー（配列番号１０）及び（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号１２６）がヒトネクチン１のＡＡ３１～１４５を置換するタンパク質融合物（ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ネクチン１と称する）を、及びスプリットタンパク質レポーター系対（ｎＤＳＰ）の第２成分を、別の集団（標的細胞）にトランスフェクトした。標的細胞及びエフェクター細胞を接触させると、堅牢なルシフェラーゼ活性を測定することができ、このことは、エフェクター細胞と標的細胞との間の膜融合及びその後のルシフェラーゼレポーターの再構成を示す（図１１Ａ）。比較すると、ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ネクチン１受容体を反応から除外した場合、融合は検出されず、このことは、融合がＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ネクチン１の存在を必要とすることを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はヒトネクチン１を天然に発現するので、対照反応はまた、ＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤがその天然受容体ネクチン１に対するその親和性を喪失していることを示した。

【0237】

二重特異性アダプターを使用して特定の腫瘍マーカーへのＨＳＶ１再標的化を実証するために、次いで、標的細胞におけるＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ネクチン１のトランスフェクションを、目的の特定の腫瘍マーカー（ＰＳＭＡ、ＫＬＫ２－ネクチン１融合体、及びＴＭＥＦＦ２）、及びＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１２４）によってＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ－ロイシンジッパーに融合された対応する結合タンパク質（それぞれＢ５８８ＬＨ、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ、及びＴＭＥＦ９ＬＨ）から構成される分泌二重特異性アダプターのトランスフェクションによって置換した実験において、インビトロ融合アッセイを繰り返した（表１を参照されたい）。陰性対照として、二重特異性アダプターを標的細胞反応から省いた。陽性対照として、ＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ－（Ｇ_４Ｓ）_３－ｄ６－３８ｇＤの代わりにアミノ酸６～３６が対応する腫瘍マーカー結合タンパク質（それぞれＢ５８８ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ、及びＴＭＥＦ９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ）で置換された修飾ｇＤ糖タンパク質をエフェクター細胞にトランスフェクトし、二重特異性アダプターを標的細胞のトランスフェクションから省いた。図１１Ｂ～１１Ｄに示すように、二重特異性アダプターの存在は、ルシフェラーゼ活性（右欄）によって測定されるように、それらのそれぞれの対照（左欄）と同等の様式で、標的細胞とエフェクター細胞との間の膜融合を効率的に誘導する。対照的に、二重特異性アダプターの非存在下では、融合は検出されない（中央の列）。これにより、融合が特異的であり、二重特異性アダプターによって媒介されることが確認される。

【0238】

全体として、図１１Ａ～１１Ｄのデータは、ＨＳＶ１糖タンパク質融合機構による膜融合が、相補的ロイシンジッパーの対を代わりに使用して、ＧＣＮ４ペプチド／Ｈ６ ｓｃＦｖ対と同じ方法で再標的化され得、二重特異性アダプターを使用するＨＳＶ１再標的化戦略の範囲を広げることを実証する。

【0239】

Ｌａエピトープ／５Ｂ９ＨＬ ｓｃＦｖによるＨＳＶ再標的化
異なるペプチド／ｓｃＦｖ対を使用するＨＳＶ１再標的化を実証するために、スプリットタンパク質レポーター系を使用する直接インビトロ融合アッセイを開発した。簡潔には、細胞（エフェクター細胞）の集団に、ｉ）アミノ酸６～３６が２つのリンカー（最終配列：ＧＴＧＳＫＰＬＰＥＶＴＤＥＹＧＧＧＧＳＧＮＳ（配列番号１３））に隣接するＬａエピトープ（配列番号１２）で置換され、Ｌａ－ｄ６－３８ｇＤと称される改変ｇＤ糖タンパク質を、ｉｉ）ＨＳＶ１膜融合機構の３つの他の野生型糖タンパク質成分（ｇＢ、ｇＨ及びｇＬ）を、及びｉｉｉ）スプリットタンパク質レポーター系対（ｃＤＳＰ）の成分のうちの１つを、トランスフェクトした。別の細胞集団（標的細胞）に、５Ｂ９ＨＬ ｓｃＦｖ（配列番号ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＨＹＹＩＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＮＰＳＮＧＧＴＨＦＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＥＹＤＹＧＬＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＰＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＫＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３４））、続いてＧ_４Ｓリンカー（配列番号１２４）がヒトネクチン１（５Ｂ９ＨＬ－ネクチン１と称される）のＡＡ３１～１４５を置換するタンパク質融合物を、及びスプリットタンパク質レポーター系対（ｎＤＳＰ）の第２の成分を、トランスフェクトした。標的細胞及びエフェクター細胞を接触させると、堅牢なルシフェラーゼ活性を測定することができ、このことは、エフェクター細胞と標的細胞との間の膜融合及びその後のルシフェラーゼレポーターの再構成を示す（図１２Ａ）。比較すると、５Ｂ９ＨＬ－ネクチン１受容体が標的細胞トランスフェクションから除外される場合、融合は検出されず、融合が５Ｂ９ＨＬ－ネクチン１の存在を必要とすることを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はヒトネクチン１を天然に発現するので、対照反応はまた、Ｌａ－ｄ６－３８ｇＤがその天然受容体ネクチン１に対するその親和性を喪失していることを示す。

【0240】

二重特異性アダプターを使用して特定の腫瘍マーカーへのＨＳＶ１再標的化を実証するために、次いで、標的細胞における５Ｂ９ＨＬ－ネクチン１のトランスフェクションを、目的の特定の腫瘍マーカー（ＰＳＭＡ、ＫＬＫ２－ネクチン１融合体、及びＴＭＥＦＦ２）、及びＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１２４）によって５Ｂ９ＨＬ ｓｃＦｖに融合された対応する結合タンパク質（それぞれＢ５８８ＬＨ、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ、及びＴＭＥＦ９ＬＨ）から構成される分泌二重特異性アダプターのトランスフェクションによって置換した実験において、インビトロ融合アッセイを繰り返した（表１を参照されたい）。陰性対照として、二重特異性アダプターを標的細胞反応から省いた。陽性対照として、Ｌａ－ｄ６－３８ｇＤの代わりにアミノ酸６～３６が対応する腫瘍マーカー結合タンパク質（それぞれＢ５８８ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ、ＫＬ２Ｂ３５９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ、及びＴＭＥＦ９ＬＨ－ｄ６－３８ｇＤ）で置換された修飾ｇＤ糖タンパク質をエフェクター細胞にトランスフェクトし、二重特異性アダプターを標的細胞のトランスフェクションから省いた。図１２Ｂ～１２Ｄに示すように、二重特異性アダプターの存在は、ルシフェラーゼ活性（右欄）によって測定されるように、それらのそれぞれの対照（左欄）と同等の様式で、標的細胞とエフェクター細胞との間の膜融合を効率的に誘導する。対照的に、二重特異性アダプターの非存在下では、融合は検出されない（中央の列）。これにより、融合が特異的であり、二重特異性アダプターによって媒介されることが確認される。

【0241】

全体として、図１２Ａ～１２Ｄのデータは、ＨＳＶ１糖タンパク質融合機構による膜融合が、異なるペプチド／ｓｃＦｖ対（ここではＬａ／５Ｂ９ＨＬ ｓｃＦｖ）を使用して、ＧＣＮ４ペプチド／Ｈ６ ｓｃＦＶ対と同じ方法で再標的化され得、二重特異性アダプターを使用するＨＳＶ１再標的化戦略の範囲を広げることを実証する。

【0242】

【表1-1】

【0243】

【表1-2】

【0244】

【表1-3】

【0245】

【表1-4】

【0246】

【表1-5】

【0247】

【表1-6】

【0248】

【表1-7】

【0249】

【表1-8】

【0250】

【表1-9】

【0251】

【表1-10】

【0252】

【表1-11】

【0253】

【表1-12】

【0254】

【表1-13】

【0255】

【表1-14】

【0256】

【表1-15】

【0257】

【表1-16】

【0258】

【表1-17】

【0259】

【表1-18】

【0260】

【表1-19】

【0261】

【表1-20】

【0262】

【表1-21】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【配列表】

2024517232000001.app

【国際調査報告】