特表 2024-517327 インターロイキン－２２の治療用誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-19

(54)【発明の名称】インターロイキン－２２の治療用誘導体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/24 20060101AFI20240412BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 11/08 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 11/16 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240412BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240412BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240412BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240412BHJP

【ＦＩ】

C12N15/24 ZNA

C07K14/54

A61P3/00

A61P1/16

A61P11/00

A61P1/00

A61P13/12

A61P25/00

A61P17/00

A61P3/04

A61P3/10

A61P3/06

A61P43/00 105

A61P11/08

A61P11/16

A61P31/12

A61P31/04

A61P17/02

A61P29/00

A61K38/20

A61P1/04

A61P37/06

A61K47/54

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023570002

(86)(22)【出願日】2022-05-11

(85)【翻訳文提出日】2024-01-09

(86)【国際出願番号】 EP2022062846

(87)【国際公開番号】W WO2022238510

(87)【国際公開日】2022-11-17

(31)【優先権主張番号】21173310.0

(32)【優先日】2021-05-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21173388.6

(32)【優先日】2021-05-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522179105

【氏名又は名称】サイトカイ・ファーマ・アーペーエス

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン・サス－ウルム

(72)【発明者】

【氏名】ラスムス・ヨルゲンセン

(72)【発明者】

【氏名】セバスティアン・ベック・ヨルゲンセン

(72)【発明者】

【氏名】ヘニング・トゲルセン

(72)【発明者】

【氏名】トマス・ホウ－イェンセン

(72)【発明者】

【氏名】ミカエル・パオロ・バストナー・サンドリニ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA01

4C076AA06

4C076AA09

4C076AA11

4C076AA16

4C076AA22

4C076AA24

4C076AA30

4C076AA31

4C076AA36

4C076AA53

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB24

4C076BB31

4C076CC01

4C076CC04

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC19

4C076CC21

4C076CC32

4C076CC35

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA36

4C084DA12

4C084MA13

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA28

4C084MA31

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZA681

4C084ZA682

4C084ZA701

4C084ZA702

4C084ZA751

4C084ZA752

4C084ZA811

4C084ZA812

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB081

4C084ZB082

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC211

4C084ZC212

4C084ZC331

4C084ZC332

4C084ZC351

4C084ZC352

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA55

4H045CA42

4H045DA02

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の新規な誘導体、特に、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合された脂肪酸を含む誘導体であって、そのＩＬ－２２タンパク質が、アミノ酸置換を少なくとも１つ含む誘導体、及び治療におけるその誘導体の使用に関するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＬ－２２タンパク質に共有結合された脂肪酸を含むＩＬ－２２誘導体であって、前記ＩＬ－２２タンパク質が、ｈＩＬ－２２のバリアントであり、前記バリアントが、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、前記脂肪酸が、前記置換位で共有結合されている前記ＩＬ－２２誘導体。

【請求項2】

前記置換が、Ｒ９５Ｃ及びＬ１０６Ｃから選択されている、請求項１に記載の誘導体。

【請求項3】

前記脂肪酸が、前記ＩＬ－２２タンパク質にリンカーによって共有結合されている、請求項１に記載の誘導体。

【請求項4】

前記脂肪酸が、
（ｉ）下記の式Ｉのもの、
ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－^＊
（式中、ｘは、１０～１８、任意に、１２～１８、１４～１６もしくは１６～１８の範囲の整数であり、^＊は、前記ＩＬ－２２タンパク質もしくは前記リンカーへの結合位置を定めている）
（ｉｉ）ジ脂肪酸、
（ｉｉｉ）Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８もしくはＣ２０のジ酸、
（ｉｖ）Ｃ１６もしくはＣ１８のジ酸、
（ｖ）Ｃ１８のジ酸、
（ｖｉ）下記の式ＩＩのもの、
Ｈ_３Ｃ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－^＊
（式中、ｘは、１０～１８、任意に、１２～１８、１４～１６もしくは１６～１８の範囲の整数であり、^＊は、前記ＩＬ－２２タンパク質もしくは前記リンカーへの結合位置を定めている）
（ｖｉｉ）モノ脂肪酸、
（ｖｉｉｉ）Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８もしくはＣ２０のモノ酸、
（ｉｘ）Ｃ１６もしくはＣ１８のモノ酸、及び／または
（ｘ）Ｃ１６のモノ酸である、
先行請求項のいずれかに記載の誘導体。

【請求項5】

前記バリアントが、
（ｉ）ｈＩＬ－２２の１位、２１位、３５位、６４位、１１３位及び／または１１４位でさらに置換されており、
（ｉｉ）Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択した、ｈＩＬ－２２の置換をさらに含み、
（ｉｉｉ）ｈＩＬ－２２の３５位及び６４位にＧｌｎ残基をさらに含み、
（ｉｖ）ｈＩＬ－２２との配列同一性が少なくとも１０％であり、ならびに／または
（ｖ）ｈＩＬ－２２内にバリエーションを１個、２個、３個、４個もしくは５個以上含み、前記バリエーションが独立して、欠失、置換及び挿入からなる群から選択されている、
先行請求項のいずれかに記載の誘導体。

【請求項6】

前記バリアントが、
（ｉ）ｈＩＬ－２２の伸長形態であり、
（ｉｉ）Ｎ末端ペプチドを含み、
（ｉｉｉ）Ｎ末端の３量体を含み、及び／または
（ｉｖ）Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇを含み、及び／または
（ｖ）最大で５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個もしくは５０個のアミノ酸からなるＮ末端ペプチドを含む、
先行請求項のいずれかに記載の誘導体。

【請求項7】

前記リンカーが、
（ｉ）任意にＧｌｕ及び／もしくはＬｙｓを含む１つ以上のアミノ酸、
（ｉｉ）オキシエチレングリシン単位を１つ、もしくはキシエチレングリシン単位が複数、任意に２～５単位連結したもの、
（ｉｉｉ）１つ以上のオリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）残基、
（ｉｖ）エチレンジアミン（Ｃ_２ＤＡ）基、
（ｖ）アセトアミド（Ａｃ）基、
（ｖｉ）γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃ、
（ｖｉｉ）γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃ、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃ、
を含む、請求項３～６のいずれかに記載の誘導体

【請求項8】

前記誘導体が、リンカーによって前記ｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１８のジ酸を含む、先行請求項のいずれかに記載の誘導体。

【請求項9】

前記バリアントが、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されたＣｙｓ残基を含み、前記リンカーが、前記Ｃｙｓ残基に結合している、請求項３～８のいずれかに記載の誘導体。

【請求項10】

前記誘導体が、本明細書で定められているような誘導体１、２、３または４である、先行請求項のいずれかに記載の誘導体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれかに記載の誘導体と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が、吸入による投与、注射による投与、局所投与、経口投与または点眼投与に適し、任意に、前記注射が、腹腔内注射、皮下注射または静脈内注射である前記医薬組成物。

【請求項12】

治療で使用するための、請求項１～１０のいずれかに記載の誘導体、または請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓、中枢神経系（ＣＮＳ）または皮膚の疾患、障害または病状を治療する方法で使用するための、請求項１～１０のいずれかに記載の誘導体、または請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項14】

（ｉ）前記代謝性の疾患、障害または病状が、肥満症、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高血糖症または高インスリン血症であり、
（ｉｉ）前記肝臓の疾患、障害または病状が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、慢性肝不全の急性増悪（ＡＣＬＦ）、アセトアミノフェン誘発性肝臓毒性、急性肝損傷、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変、または手術もしくは移植を原因とする病理学的状態であり、
（ｉｉｉ）前記肺の疾患、障害または病状が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、化学損傷、ウイルス感染、細菌感染または真菌感染であり、
（ｉｖ）前記消化管の疾患、障害または病状が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、化学損傷、ウイルス感染または細菌感染であり、
（ｖ）前記腎臓の疾患、障害または病状が、急性腎臓病または慢性腎臓病であり、
（ｖｉ）前記ＣＮＳの疾患、障害または病状が、多発性硬化症であり、あるいは
（ｖｉｉ）前記皮膚の疾患、障害または病状が、創傷、炎症性疾患またはＧｖＨＤである、
請求項１４に記載の誘導体または医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の新規な誘導体、特には、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合された脂肪酸を含む誘導体に関するものである。そのＩＬ－２２タンパク質は、天然型の成熟ヒトＩＬ－２２（以下、「ｈＩＬ－２２」という）のバリアントであり、その脂肪酸は、特定の置換に共有結合している。本発明には、それらを作製する方法、ならびに代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓、中枢神経系（ＣＮＳ）及び皮膚の疾患、障害及び病状の治療、予防及び改善を含むに療法で、それらを使用する方法も含まれる。

【背景技術】

【0002】

ＩＬ－２２は、分子量が１７ＫＤａである１４６アミノ酸のタンパク質である。ＩＬ－２２は、サイトカインのＩＬ－１０ファミリーに属し、ユビキタスに発現するＩＬ－１０受容体Ｂサブユニット（ＩＬ－１０ＲＡ２）と、発現が上皮に限られるＩＬ－２２受容体Ａサブユニット（ＩＬ－２２ＲＡ１）からなるヘテロ二量体の受容体を選択的に活性化する。ＩＬ－２２は、免疫細胞から放出されるが、上皮細胞を選択的に標的とする点で、特有のサイトカインである。したがって、ＩＬ－２２によって誘導されるシグナル伝達経路は、様々な組織（標的としては、皮膚、腸、肺、肝臓、腎臓、膵臓及び胸腺が挙げられる）に関連している可能性があるが、ＩＬ－２２は、それらのシグナル伝達経路を上皮特異的に活性化する。可溶性結合タンパク質であるＩＬ－２２ＢＰは、ＩＬ－２２を中和することで、ＩＬ－２２の作用を調節する。

【0003】

ＩＬ－２２は、化学的または機械的な損傷を反映するシグナル、例えば、環境毒素またはトリプトファン中間体に応答した、アリール炭化水素受容体の活性化、ならびに死にかけた細胞または侵入してきた病原体のタンパク質、断片及び破片に応答した、Ｔｏｌｌ様受容体４などのパターン認識受容体の活性化に対する応答として放出される。ＩＬ－２２の放出は、特定のサイトカイン、特にＩＬ－２３によって、及びＩＬ－２３ほどではないがＩＬ１βによって、さらに刺激される。したがって、ＩＬ－２２は、病原体への感染とともに、免疫の活性化も反映した合図に対する応答として分泌される。

【0004】

ＩＬ－２２の作用は、いくつかの活性／経路が体系化されて関与した結果である。損傷すると、ＩＬ－２２は、上皮バリアの組織及び器官に作用して、（例えば、抗アポトーシス遺伝子のプログラムの活性化を通じて）その細胞を保護し、バリア機能を維持する。ＩＬ－２２は、（例えば、成熟細胞の増殖及び幹細胞の活性化を誘導することによって）修復も加速させ、（例えば、上皮間葉転換の低減、ＮＬＲＰ３インフラマソームのアンタゴナイズ、及び肝星細胞の老化の誘導を通じて、）線維化を防ぎ、（例えば、抗微生物性ペプチド及び走化性シグナルを誘導することによって）炎症を制御する。ＩＬ－２２は、高血糖症、高脂血症及び高インスリン血症など、糖尿病または過体重の哺乳動物で観察されることが多い病状を含む広範な病状を治療できるものとして報告されている。

【0005】

しかしながら、ＩＬ－２２は概して、腎臓によって身体から急速に除去され、これにより、臨床現場での使用は限られている。これは、サイトカインの一般的な特徴であり、半減期が延長されたサイトカイン薬剤開発候補は、例えば、オンコロジー及び免疫療法の治療のための薬剤開発段階に達している。概して、半減期が延長されたこれらのサイトカインでは、Ｆｃ融合溶液またはＰＥＧ化が使われている。したがって、循環ＩＬ－２２の半減期を延長する既知の方法は、腎臓で除去されないように、ＩＬ－２２のサイズを人工的に７０ｋＤａ超に増大させようとすることである。この作用に対して、現在最良の解決策は、ＩＬ－２２を抗体のＦｃ断片にライゲーションすることであり、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＧｅｎｅｒｏｎ Ｓｈａｎｇｈａｉのいずれも、臨床開発段階にある長時間作用型のＩＬ－２２－Ｆｃ融合体を有する。ＩＬ－２２をポリエチレングリコールで修飾すること（ＰＥＧ化）は、腎臓で除去されないようにする別の既知の手段である。

【0006】

しかしながら、これらの既存の解決策には、問題点がある。利用可能なデータにより、ＰＥＧ自体に免疫原性があり、ＰＥＧ化された生物学的製剤を有する細胞において、ＰＥＧを含む空胞が観察されることが示唆されている。活性の低下及び不均一性も、ＰＥＧ化の不都合な面である。Ｆｃ融合技術は、よく知られているが、抗体Ｆｃ断片の付加は、ＩＬ－２２の構造を大きく変化させることに当たり、半減期の延長よりも、ＩＬ－２２の特性に影響を及ぼす。Ｆｃの融合により、タンパク質のサイズが、およそ１７ｋＤａからおよそ８５ｋＤａまで増大するので、拡散速度、分布、及び受容体への関与の動態といった特性に影響が及ぶことがある。例えば、いくつかのＦｃ融合体は、特定の経路を介した投与用としては、ゆっくり吸収され及び／または大きすぎる。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＧｅｎｅｒｏｎのいずれによっても、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体の用量制限性の有害作用として、中程度かつ可逆性の皮膚反応が報告されている。さらに、その効力は、大きい融合パートナーを原因とする立体障害性を通じて影響を受けることがある。

【0007】

加えて、天然型のＩＬ－２２は、半減期が数時間と非常に短く、その臨床的有用性が大きく制限されるのに対して、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体は、男性での半減期が１週間以上であることが報告されている。いくつかの条件において、天然型のＩＬ－２２と比べて半減期が長いが、例えば、至適な漸増、局所的な適用及び作用のために、Ｆｃ融合体よりも半減期が短い強力な分子を有するのが有益となる。現時点では、この問題について説明された解決策はない。

【0008】

したがって、当該技術分野では、天然型の分子に比べて、循環半減期、ならびに局所的な組織コンパートメント及び生体液における半減期を増強するとともに、最適化された薬物動態特性及び薬物動力特性を示す新たな生体適合性のＩＬ－２２修飾体に対するニーズが残っている。理想的には、それらの修飾体は、天然型分子の効力及びその他の特性を維持し、既知の誘導体で示された毒性、免疫原性及びいずれかのその他の有害反応も回避しなくてはならない。

【発明の概要】

【0009】

第１の態様では、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合された脂肪酸を含むＩＬ－２２誘導体を提供し、そのＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２のバリアントであり、前記バリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、その脂肪酸は、前記置換位で共有結合している。

【0010】

その置換は、Ｒ９５Ｃ及びＬ１０６Ｃから選択されていてよい。

【0011】

本発明の実施形態では、その脂肪酸は、そのＩＬ－２２タンパク質にリンカーによって共有結合している。

【0012】

その脂肪酸は、下記の式Ｉのものであってよく、
ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－^＊
式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、^＊は、そのＩＬ－２２タンパク質またはリンカーへの結合位置を定める。その脂肪酸は、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のジ酸のようなジ脂肪酸であってよい。有益なことに、その脂肪酸は、Ｃ１６またはＣ１８のジ酸であり、最も有益なことには、その脂肪酸は、Ｃ１８のジ酸である。

【0013】

そのモノ脂肪酸は、下記の式ＩＩのものであってよく、
Ｈ_３Ｃ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－^＊
式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、^＊は、そのＩＬ－２２タンパク質またはリンカーへの結合位置を定める。その脂肪酸は、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸のようなモノ脂肪酸であってよい。有益なことに、その脂肪酸は、Ｃ１６またはＣ１８のモノ酸であり、最も有益なことには、その脂肪酸は、Ｃ１６のモノ酸である。

【0014】

そのバリアントは、ｈＩＬ－２２の置換形態であり、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含む。そのバリアントは、１つ以上のさらなる位置、任意に、１位、２１位、３５位、６４位、１１３位及び／または１１４位で置換されていてもよい。そのバリアントは、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｒ９５Ｃ、Ｌ１０６Ｃ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択した、ｈＩＬ－２２の置換を含んでよい。有益なことに、そのバリアントは、ｈＩＬ－２２の３５位及び６４位にＧｌｎ残基を含む。そのバリアントは、ｈＩＬ－２２との配列同一性が少なくとも１０％であってよい。そのバリアントは、ｈＩＬ－２２内にバリエーションを１個、２個、３個、４個または５個以上含んでよく、前記バリエーションは独立して、欠失、置換及び挿入からなる群から選択されている。

【0015】

そのバリアントは、ｈＩＬ－２２の伸長形態であってよい。そのバリアントは、Ｎ末端の３量体のようなＮ末端ペプチドを含んでよい。有益なことに、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇを含む。そのバリアントは、最大で５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のアミノ酸からなるＮ末端ペプチドを含んでよい。

【0016】

そのリンカーは、任意にグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／またはリジン（Ｌｙｓ）を含め、アミノ酸を１つ以上含んでよい。そのリンカーは、オキシエチレングリシン単位を１つ、またはオキシエチレングリシン単位が複数、任意に２～５単位、有益なことには２単位連結したものを含んでよい。そのリンカーは、オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）残基を１つ以上含んでよい。そのリンカーは、エチレンジアミン（Ｃ_２ＤＡ）基及び／またはアセトアミド（Ａｃ）基を含んでよい。有益なことに、そのリンカーは、上記の要素のすべてを組み合わせて含む。特に、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－Ａｃ、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃまたはγＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであってよい。

【0017】

そのリンカーは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されたＣｙｓ残基に結合したＣｙｓ反応性リンカーであってよい。

【0018】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１８のジ酸を含む。有益なことに、そのバリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されたＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは、前記Ｃｙｓ残基に結合している。本発明の例示的な誘導体は、本明細書で誘導体１、誘導体２、誘導体３及び誘導体４と定められたものである。

【0019】

第２の態様では、第１の態様の誘導体を調製するプロセスであって、脂肪酸をＩＬ－２２タンパク質に共有結合させることを含むプロセスを提供し、そのＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２のバリアントであり、前記バリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、そのプロセスは、その脂肪酸を前記置換位で共有結合する。

【0020】

第３の態様では、第１の態様の誘導体と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物を提供し、その医薬組成物は、吸入による投与、注射による投与、局所投与、経口投与または眼内投与に適し、任意に、その注射は、腹腔内注射、皮下注射または静脈内注射である。

【0021】

第４の態様では、治療で使用するための第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物を提供する。

【0022】

第５の態様では、治療方法で使用するための第１の態様の誘導体または第２の態様の医薬組成物を提供し、前記方法は、その誘導体を体重１ｋｇ当たり０．００１μｇ～体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの１日量で投与することを含む。

【0023】

第６の態様では、代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓、ＣＮＳまたは皮膚の疾患、障害または病状を治療する方法で使用するための第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物を提供する。

【0024】

その代謝性の疾患、障害または病状は、肥満症、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高血糖症または高インスリン血症であってよい。

【0025】

その肝臓の疾患、障害または病状は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、慢性肝不全の急性増悪（ＡＣＬＦ）、急性肝損傷、アセトアミノフェン誘発性肝臓毒性、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変、または手術もしくは移植を原因とする病理学的状態であってよい。

【0026】

その肺の疾患、障害または病状は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、化学損傷、ウイルス感染、細菌感染または真菌感染であってよい。

【0027】

その消化管の疾患、障害または病状は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、化学損傷、ウイルス感染または細菌感染であってよい。

【0028】

その腎臓の疾患、障害または病状は、急性腎臓病または慢性腎臓病であってよい。

【0029】

そのＣＮＳの疾患、障害または病状は、多発性硬化症であってよい。

【0030】

その皮膚の疾患、障害または病状は、創傷、炎症性疾患またはＧｖＨＤであってよい。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】（Ａ）Ｃ１８のジ酸、（Ｂ）Ｃ１６のジ酸及び（Ｃ）Ｃ１４のジ酸を示しており、それぞれ、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに連結している。脂肪酸とリンカーとのこれらの組み合わせを本発明の誘導体で用いてよい。脂肪酸とリンカーとの組み合わせのうち、（Ａ）で示されている組み合わせは、本明細書で誘導体１及び誘導体２と定められた誘導体で用いられている。

【図2】本発明の誘導体のうち、本明細書で誘導体１と定められた誘導体の構造を示す。

【図3】本発明の誘導体のうち、本明細書で誘導体２と定められた誘導体の構造を示す。

【図4】（Ａ）Ｃ１８のジ酸、（Ｂ）Ｃ１６のジ酸及び（Ｃ）Ｃ１４のジ酸を示しており、それぞれ、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに連結している。脂肪酸とリンカーとのこれらの組み合わせは、本発明の誘導体の比較薬のうち、本明細書で比較薬６～１５と定められた比較薬で用いられている。

【図5】本明細書で比較薬６と定められたＩＬ－２２タンパク質の構造を示す。

【図6】本明細書における比較薬１１としてのＩＬ－２２タンパク質の構造を示す。

【図7】本明細書で比較薬１５と定められたＩＬ－２２タンパク質の構造を示す。

【図8】糖尿病マウスモデルにおける８日間の試験において、ｈＩＬ－２２、及び主鎖バリエーションのみを有する比較用のＩＬ－２２バリアント（本明細書では比較薬３と定めた）の１日１回投与が血中グルコースに及ぼす作用（平均±標準誤差）を示す。

【図9】糖尿病マウスモデルにおける１６日間の試験において、本発明の誘導体の比較薬（本明細書では比較薬６と定めた）の１日１回投与が、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体（具体的には、ヒトＦｃのＮ末端をｈＩＬ－２２に融合したもの。以下、「ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２」という）と比べて、（Ａ）血中グルコース及び（Ｂ）食物摂取量に及ぼす作用を示す（平均±標準誤差。^＊は、独立ｔ検定を用いた時に、ｐ＜０．０５であったことを意味する）。

【図10A】糖尿病マウスモデルにおける１６日間の試験において、比較薬６及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の１日１回投与が、それぞれ異なる標的関与バイオマーカーに及ぼす作用を示す（平均±標準誤差。^＊＊＊は、独立ｔ検定を用いた時に、ｐ＜０．０００２であったことを意味する）。

【図10B】糖尿病マウスモデルにおける１６日間の試験において、比較薬６及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の１日１回投与が、それぞれ異なる標的結合バイオマーカーに及ぼす作用を示す（平均標準誤差。^＊＊＊は、独立ｔ検定を用いた時に、ｐ＜０．０００３であったことを意味する）。

【図10C】糖尿病マウスモデルにおける１６日間の試験において、比較薬６及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の１日１回投与が、それぞれ異なる標的結合バイオマーカーに及ぼす作用を示す（平均標準誤差。^＊＊＊は、独立ｔ検定を用いた時に、ｐ＜０．００２６であったことを意味する）。

【図11】糖尿病マウスモデルにおける１３日間の試験において、比較薬１１を１日１回、（３つの異なる用量で）投与した場合の血中グルコースに対する用量－応答曲線を、比較薬６及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と比べたものを示す（平均±標準誤差）。

【図12A】アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の誘導による肝損傷のマウスモデルにおいて、比較薬６及び１１が、肝損傷を予防する作用を２つの異なる肝臓酵素の血漿中レベルによって立証したもの示す。ダネット検定の１因子線形モデルを使用し、ビヒクル＋ＡＰＡＰと比べて、^＊はｐ＜０．０５を意味し、^＊＊はｐ＜０．０１を意味する。

【図12B】アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の誘導による肝損傷のマウスモデルにおいて、比較薬６及び１１が、肝損傷を予防する作用を２つの異なる肝臓酵素の血漿中レベルによって立証したもの示す。ダネット検定の１因子線形モデルを使用し、ビヒクル＋ＡＰＡＰと比べて、^＊＊はｐ＜０．０１を意味する。

【図13A】ＡＰＡＰの誘導による肝損傷のマウスモデルにおいて、比較薬６及び１１がアポトーシスを予防する作用を示す。

【図13B】ＡＰＡＰの誘導による肝損傷のマウスモデルにおいて、比較薬６及び１１が細胞増殖に及ぼす作用を示す。ＮＳは、有意差なしを意味する。

【図14A】ブレオマイシンの誘導による肺損傷のラットモデルにおいて、比較薬１１が、プレドニゾロンと比べて、肺の炎症を予防及び／または低減する作用を示す。

【図14B】ブレオマイシンの誘導による肺損傷のラットモデルにおいて、比較薬１１が、プレドニゾロンと比べて、肺の線維化を予防及び／または低減する作用を示す。

【図14C】ブレオマイシンの誘導による肺損傷のラットモデルにおいて、比較薬１１が、プレドニゾロンと比べて、肺の線維化を予防及び／または低減する作用を示す。

【図15】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の誘導による大腸炎のマウスモデルにおいて、比較薬１１が大腸の炎症を予防する作用を示す。^＊＊＊＊は、ビヒクル（ＤＳＳを含む）と比べて、ｐ＜０．０００１であることを意味する。

【図16】ＤＳＳの誘導による大腸炎のマウスモデルにおいて、比較薬１１が、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と比べて、粘膜上皮の創傷を予防する作用を示す。倍率は４倍であり、スケールバーは５００μｍである。

【図17】ＤＳＳの誘導による大腸炎のマウスモデルにおける血漿中の再生膵島由来タンパク質タンパク質３γ（Ｒｅｇ３ｇ）レベルを、標的関与の尺度として（Ｒｅｇ３ｇは、ＩＬ－２２の標的関与マーカーである）示す。

【図18A】コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の誘導による肝損傷のマウスモデルにおいて、比較薬６が肝損傷を予防する作用を２つの異なる肝臓酵素の血清中レベルによって立証したものを示す。

【図18B】コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の誘導による肝損傷のマウスモデルにおいて、比較薬６が肝損傷を予防する作用を２つの異なる肝臓酵素の血清中レベルによって立証したものを示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下では、ギリシャ文字は、ローマ綴りではなく、ギリシャ文字で表されている。例えば、αはアルファであり、εはイプシロンであり、γはガンマであり、μはミューである。アミノ酸残基は、そのフルネーム、３文字表記または１文字表記によって定められていることがあり、それらのいずれも、完全に同じである。

【0033】

「ＩＬ－２２誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、共有結合された脂肪酸を有するＩＬ－２２タンパク質を指し、そのＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２のバリアントであり、前記バリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、その脂肪酸は、前記置換位で共有結合されている。その用語には、その脂肪酸がそのＩＬ－２２タンパク質に直接共有結合されている誘導体、及びその共有結合がリンカーによるものである誘導体の両方が含まれる。

【0034】

脂肪酸の共有結合は、ペプチド及びタンパク質の半減期を延長するための実証済みの技術であり、脂肪酸をペプチドまたはタンパク質から延ばす方法である。この技術は、１型糖尿病及び２型糖尿病用の市販製品、例えば、インスリンＬｅｖｅｍｉｒ（登録商標）（デテミル）及びＴｒｅｓｉｂａ（登録商標）（デグルデク）、ならびにグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）誘導体Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標）（リラグルチド）及びＯｚｅｍｐｉｃ（登録商標）（セマグルチド）から知られている。

【0035】

脂肪酸の結合により、アルブミンに結合可能となり、それによって、腎排泄が防止され、タンパク質分解がされないように、多少、立体保護がなされる。有益なことに、脂肪酸の結合により、Ｆｃの融合またはＰＥＧ化と比べて、ＩＬ－２２への修飾が最小限になる。この点では、Ｆｃの融合及びＰＥＧ化が、ＩＬ－２２のサイズを、腎臓での除去の閾値よりも大きくするためのものであるのに対して、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合された脂肪酸を含む誘導体は、そのＩＬ－２２タンパク質のサイズと同様の小さいサイズを保持している。すなわち、脂肪酸の結合は、修飾が最小限であるので、得られる誘導体は、分布、拡散速度、ならびに受容体への関与（結合、活性化及びトラフィッキング）を含め、天然型のような特性を保持するとともに、免疫原性リスクを最小限に抑えると考えられる。

【0036】

上記のように、脂肪酸の結合は、糖尿病向けのインスリン及びＧＬＰ－１誘導体において治療効力が実証されている。しかしながら、ＩＬ－２２は、そのサイズ、配列及び生物学的特性が大きく異なるタンパク質である。したがって、本発明者には、治療効果を保持したまま、脂肪酸をＩＬ－２２に共有結合できるとは直感的には理解しがたかった。このように、ＩＬ－２２への修飾が最小限であることにより、高い効力（ｈＩＬ－２２と同じかまたは近い効力）を得られるとともに、循環半減期の延長、または生体液（例えば血漿もしくは腸液）もしくは組織調製液における半減期の延長も合わせて実現できることは特に驚くべきことであった。

【0037】

すなわち、第１の態様では、本発明は、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合された脂肪酸を含むＩＬ－２２誘導体に関するものであり、そのＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２のバリアントであり、前記バリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、その脂肪酸は、前記置換位で共有結合されている。その脂肪酸は、そのＩＬ－２２タンパク質に直接、またはリンカーを介して共有結合されていてよく、そのリンカー自体は、様々なサブユニットから考案できる。「ＩＬ－２２タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、天然型のＩＬ－２２タンパク質、例えばｈＩＬ－２２、またはそのバリアントを意味することができる。「バリアント」は、本明細書にさらに定義されているように、天然型タンパク質のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列を有するタンパク質であることができる。本発明の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２のバリアントであり、前記バリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含む。

【0038】

天然においては、ヒトＩＬ－２２タンパク質は、分泌のために、３３アミノ酸のシグナルペプチドとともに合成される。成熟ヒトＩＬ－２２タンパク質（すなわちｈＩＬ－２２）は、１４６アミノ酸長であり、マウスＩＬ－２２（マウスＩＬ－２２は１４７アミノ酸長である）との配列同一性が８０．８％である。ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１と定められている。他のＩＬ－１０ファミリーメンバーのように、ＩＬ－２２の構造は、α－へリックスを６個含む（へリックスＡ～Ｆという）。

【0039】

本発明の誘導体は、ｈＩＬ－２２の天然型配列内にアミノ酸配列バリエーションを１つ以上有する。具体的には、その誘導体は、９５位及び／または１０６位にアミノ酸置換を有する。加えて、その誘導体は、天然型配列に対して（すなわち、天然型配列の外側に）、アミノ酸配列バリエーションを１つ以上含んでよい。

【0040】

「～内に」、「～に対して」、「～に対応して」及び「～と同等の」のような表現は、本明細書では、その天然型タンパク質、例えばｈＩＬ－２２の配列を参照することによって、ＩＬ－２２タンパク質における変更部位及び／または脂肪酸の共有結合部位を特徴付ける目的で使用する。配列番号１では、ｈＩＬ－２２の１番目のアミノ酸残基（アラニン（Ａｌａ））を１位と割り当てる。

【0041】

したがって、ｈＩＬ－２２の配列内のバリエーションは、配列番号１における１～１４６番目の残基のいずれかに対するバリエーションである。例えば、ｈＩＬ－２２における１０番目の残基の天然型ＡｓｐをＧｌｕに置換することは、本明細書では、「Ｄ１０Ｅ」として表す。その誘導体が、１０位で共有結合された脂肪酸も有する場合には、その結合は、本明細書では、「１０Ｅ」の残基での結合という。

【0042】

しかしながら、ｈＩＬ－２２の配列に対するバリエーションは、配列番号１における１～１４６番目の残基の外側のバリエーションである。例えば、本明細書で定義されているような誘導体は、１５アミノ酸長のＮ末端ペプチドを含んでよい。そのＮ末端ペプチドの残基には、負の番号を割り当て、ｈＩＬ－２２の１番目の残基に結合された残基から開始され、すなわち、そのＮ末端ペプチドの残基のうち、ｈＩＬ－２２の１番目の残基に結合された１番目の残基は、「－１」と示される。すなわち、その誘導体が、－１位から始まるＮ末端ペプチドの７番目の残基において、共有結合された脂肪酸を有し、この残基がＣｙｓであるとすると、その誘導体の共有結合部位は、本明細書では「－７Ｃ」という。しかし、当然ながら、このような誘導体について、配列表で用いられているナンバリングは、ＷＩＰＯ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５に従って１から始まることになるので、その誘導体についての配列表の１位は実際には、本明細書で言及されているような－７番目の残基である。

【0043】

天然型配列内にバリエーションを２個、３個、４個または５個以上加えて、本発明の誘導体を形成してよい。例えば、この点では、バリエーションを１０個超、１５個超、２０個超、２５個超、５０個超、７５個超、１００個超、またはさらには１２５個超、加えてもよい。その天然型配列の１～１４６番目の残基のいずれかを変化させてよい。バリエーションを加えるための例示的な残基は、ｈＩＬ－２２の１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２２番目、２４番目、２５番目、２６番目、２７番目、２９番目、３０番目、３２番目、３３番目、３４番目、３５番目、３６番目、３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目、４２番目、４４番目、４５番目、４７番目、４８番目、４９番目、５０番目、５１番目、５２番目、５３番目、５４番目、５５番目、５６番目、５８番目、５９番目、６１番目、６２番目、６３番目、６４番目、６５番目、６７番目、６８番目、６９番目、７０番目、７１番目、７２番目、７３番目、７４番目、７５番目、７７番目、７８番目、７９番目、８２番目、８３番目、８４番目、８６番目、８８番目、９０番目、９１番目、９２番目、９３番目、９４番目、９５番目、９６番目、９７番目、９８番目、９９番目、１００番目、１０２番目、１０３番目、１０４番目、１０５番目、１０６番目、１０７番目、１０８番目、１０９番目、１１０番目、１１１番目、１１２番目、１１３番目、１１４番目、１１５番目、１１６番目、１１７番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１２１番目、１２２番目、１２３番目、１２４番目、１２６番目、１２７番目、１２８番目、１２９番目、１３０番目、１３２番目、１３３番目、１３４番目、１３５番目、１３７番目、１３８番目、１３９番目、１４１番目、１４３番目、１４４番目、１４５番目及び／または１４６番目の残基である。１番目、２１番目、３５番目、６４番目、９５番目、１０６番目、１１３番目及び／または１１４番目の残基のバリエーションが特に有益である。最低でも、本発明の誘導体は、９５番目または１０６番目の残基にバリエーションを含む。

【0044】

その天然型配列内のバリエーションは、典型的にはアミノ酸置換である。「置換」という用語は、本明細書で使用する場合、天然型タンパク質のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを意味することができる。置換は、保存的置換であってもよいし、または非保存的置換であってもよい。本発明では、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位の置換を必ず用いる。有益なことに、その置換は、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃである。追加の例示的な置換は、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｐ２Ｃ、Ｐ２Ｈ、Ｉ３Ｃ、Ｉ３Ｈ、Ｉ３Ｖ、Ｓ４Ｈ、Ｓ４Ｎ、Ｓ５Ｈ、Ｓ５Ｔ、Ｈ６Ｃ、Ｈ６Ｒ、Ｃ７Ｇ、Ｒ８Ｇ、Ｒ８Ｋ、Ｌ９Ｓ、Ｄ１０Ｅ、Ｄ１０Ｓ、Ｋ１１Ｃ、Ｋ１１Ｇ、Ｋ１１Ｖ、Ｓ１２Ｃ、Ｎ１３Ｃ、Ｎ１３Ｇ、Ｆ１４Ｓ、Ｑ１５Ｃ、Ｑ１５Ｅ、Ｑ１６Ｖ、Ｐ１７Ｌ、Ｙ１８Ｆ、Ｉ１９Ｑ、Ｔ２０Ｖ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｒ２２Ｓ、Ｆ２４Ｈ、Ｍ２５Ｅ、Ｍ２５Ｌ、Ｌ２６Ｓ、Ａ２７Ｌ、Ｅ２９Ｐ、Ａ３０Ｑ、Ｌ３２Ｃ、Ｌ３２Ｒ、Ａ３３Ｃ、Ａ３３Ｎ、Ｄ３４Ｆ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ３６Ｑ、Ｔ３７Ｃ、Ｔ３７Ｉ、Ｄ３８Ｌ、Ｖ３９Ｑ、Ｒ４０Ｗ、Ｌ４１Ｑ、Ｉ４２Ｐ、Ｅ４４Ｒ、Ｋ４５Ａ、Ｆ４７Ｔ、Ｈ４８Ｇ、Ｈ４８Ｒ、Ｇ４９Ｎ、Ｖ５０Ｓ、Ｓ５１Ｃ、Ｍ５２Ａ、Ｍ５２Ｃ、Ｍ５２Ｌ、Ｍ５２Ｖ、Ｓ５３Ｃ、Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３Ｙ、Ｅ５４Ｄ、Ｅ５４Ｆ、Ｒ５５Ｑ、Ｒ５５Ｖ、Ｃ５６Ｑ、Ｌ５８Ｋ、Ｍ５９Ｉ、Ｑ６１Ｅ、Ｖ６２Ｄ、Ｌ６３Ｃ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｆ６５Ｇ、Ｌ６７Ｑ、Ｅ６９Ｄ、Ｅ６９Ｌ、Ｖ７０Ｓ、Ｌ７１Ｃ、Ｆ７２Ｄ、Ｆ７２Ｌ、Ｐ７３Ｃ、Ｐ７３Ｌ、Ｑ７４Ｔ、Ｒ７７Ｉ、Ｆ７８Ｑ、Ｑ７９Ｅ、Ｍ８２Ｙ、Ｑ８３Ｇ、Ｅ８４Ｒ、Ｖ８６Ａ、Ｆ８８Ｎ、Ａ９０Ｐ、Ａ９０Ｔ、Ｒ９１Ｃ、Ｒ９１Ｋ、Ｒ９１Ｙ、Ｌ９２Ｒ、Ｓ９３Ｙ、Ｎ９４Ｃ、Ｎ９４Ｑ、Ｒ９５Ｋ（Ｒ９５Ｃをまだ用いていない場合）、Ｒ９５Ｑ（Ｒ９５Ｃをまだ用いていない場合）、Ｌ９６Ｅ、Ｓ９７Ｋ、Ｔ９８Ｃ、Ｔ９８Ｎ、Ｔ９８Ｓ、Ｃ９９Ｖ、Ｈ１００Ｓ、Ｅ１０２Ｓ、Ｇ１０３Ｄ、Ｄ１０４Ｙ、Ｄ１０５Ｙ、Ｌ１０６Ｅ（Ｌ１０６Ｃをまだ用いていない場合）、Ｌ１０６Ｑ（Ｌ１０６Ｃをまだ用いていない場合）、Ｈ１０７Ｌ、Ｈ１０７Ｎ、Ｉ１０８Ｌ、Ｑ１０９Ｙ、Ｒ１１０Ｃ、Ｒ１１０Ｋ、Ｎ１１１Ｋ、Ｖ１１２Ｅ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ、Ｋ１１４Ｒ、Ｌ１１５Ｖ、Ｋ１１６Ｙ、Ｄ１１７Ｅ、Ｔ１１８Ｇ、Ｖ１１９Ａ、Ｋ１２０Ｈ、Ｋ１２１Ｒ、Ｌ１２２Ａ、Ｇ１２３Ｖ、Ｇ１２６Ｙ、Ｅ１２７Ｃ、Ｉ１２８Ｖ、Ｋ１２９Ｖ、Ｇ１３２Ｙ、Ｅ１３３Ｑ、Ｌ１３４Ｐ、Ｄ１３５Ｍ、Ｌ１３７Ｄ、Ｆ１３８Ｒ、Ｍ１３９Ｌ、Ｍ１３９Ｒ、Ｌ１４１Ｑ、Ｎ１４３Ｓ、Ａ１４４Ｅ、Ｃ１４５Ｅ、Ｉ１４６Ｒ及び／またはＩ１４６Ｖである。追加の置換は、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択されているのが有益であろう。Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑは、特に有益である。驚くべきことに、本発明で用いられているような置換は、ＩＬ－２２の活性に悪影響を及ぼさない。

【0045】

追加の置換の特定の組み合わせとしては、（ｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ３５Ｄ及びＮ６４Ｄ、（ｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＮ６４Ｃ、（ｉｖ）Ａ１Ｇ及びＱ１１３Ｃ、（ｖ）Ａ１Ｇ及びＫ１１４Ｃ、（ｖｉ）Ａ１Ｇ及びＭ２５Ｌ、（ｖｉｉ）Ａ１Ｇ及びＭ５２Ｌ、（ｖｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＭ１３９Ｌ、（ｉｘ）Ａ１Ｇ及びＮ３６Ｑ、（ｘ）Ａ１Ｇ及びＤ１１７Ｅ、（ｘｉ）Ａ１Ｇ及びＮ２１Ｑ、（ｘｉｉ）Ａ１Ｇ及びＮ３５Ｑ、（ｘｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＮ６４Ｑ、（ｘｉｖ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ及びＮ３５Ｑ、（ｘｖ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｖｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｖｉｉ）Ａ１Ｇ及びＫ１１Ｃ、（ｘｖｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＮ１３Ｃ、（ｘｉｘ）Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘ）Ａ１Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉ）Ｈ６Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉｉ）Ｉ３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉｉｉ）Ｐ２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉｖ）Ｌ３２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖ）Ｎ３５Ｑ、Ｍ５２Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖｉ）Ｎ１３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖｉｉ）Ｎ２１Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＮ９４Ｃ、（ｘｘｉｘ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＰ７３Ｃ、（ｘｘｘ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＱ１１３Ｃ、（ｘｘｘｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ９１Ｃ、（ｘｘｘｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ１１０Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｓ１２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｉｖ）Ｎ３５Ｑ、Ｓ５１Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｖ）Ｎ３５Ｑ、Ｓ５３Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｖｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｔ３７Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＴ９８Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｑ１５Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｉｘ）Ｎ３５Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｘ）Ｈ６Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、ならびに（ｘｘｘｘｉ）Ａ３３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑが挙げられる。あらゆる組み合わせの置換が想定されており、それらは、本発明の一部を形成する。

【0046】

第１の態様の誘導体は、９５位及び／または１０６位に置換を含む。有益なことには、その置換は、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃである。その誘導体は典型的には、追加のアミノ酸置換を含んでよく、それにより、天然型の残基において、任意に、上で定めた位置のいずれか、例えば、１位、２位、３位、６位、１１位、１２位、１３位、１５位、２１位、３２位、３３位、３５位、３７位、５１位、５２位、５３位、６３位、６４位、７１位、７３位、９１位、９４位、９８位、１１０位、１１３位、１１４位及び／または１２７位で、Ｃｙｓに置換されている。Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を、３５位及び６４位の２つの糖鎖付加部位における置換と組み合わせるのが特に有益である。これにより、効力または半減期に悪影響を及ぼすことなく、取り込みが速くなるからである（実施例１の誘導体１及び２を参照されたい）。有益な一実施形態では、第１の態様の誘導体は、Ｒ９５Ｃという置換を含む（実施例１１、誘導体４）。有益な一実施形態では、第１の態様の誘導体は、Ｌ１０６Ｃという置換を含む（実施例１１、誘導体３）。有益な一実施形態では、第１の態様の誘導体は、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ９５Ｃという置換を含む。別の有益な実施形態では、第１の態様の誘導体は、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＬ１０６Ｃという置換を含む。しかしながら、別の実施形態では、第１の態様の誘導体は、ｈＩＬ－２２（配列番号１）内に、前記Ｒ９５Ｃまたは前記Ｌ１０６Ｃを含み、追加の置換またはバリエーションを含まないことが有益である場合もある。

【0047】

その天然型配列内のバリエーションは、アミノ酸の挿入も含んでよい。その天然型配列内に、アミノ酸が最大で５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個またはさらには最大で５０個、挿入されていてよい。この点では、３量体、５量体、７量体、８量体、９量体及び４４量体が特に有益である。例示的な配列が表１に示されている。挿入は、その天然型配列のいずれの位置でも行うことができるが、ヘリックスＡ（例えば３０番目の残基）、ループＣＤ（例えば７５番目の残基）、ヘリックスＤ（例えば８５番目の残基）及び／またはヘリックスＦ（例えば１２４番目の残基）の位置が好ましい。

【表1】

【0048】

その天然型配列内の１個、２個、３個、４個または５個以上のバリエーションは独立して、置換及び挿入からなる群から選択されていてよい。

【0049】

その天然型配列内のバリエーションは、上記に加えてまたは上記の代わりに、配列番号１内のアミノ酸の欠失を１つ以上含んでよい。すなわち、そのペプチドは、アミノ酸の欠失を最大で５個含んでよい。アミノ酸の欠失は、３個以下または２個以下が好ましい。前記欠失は、例えば配列番号１内の別々の（すなわち、連続していない）位置に存在してよい。そのバリエーションは、上記に加えてまたは上記の代わりに、配列番号１内の２個、３個、４個または５個の連続するアミノ酸の欠失であってよく、これは、最大で５個の隣接する一連のアミノ酸が欠失されていてよいことを意味する。ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列に対する配列バリエーションは、存在する場合、典型的には、Ｎ末端にペプチドが付加されているなどの伸長を含む。そのペプチドは、最大で５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個またはさらには最大で５０個のアミノ酸からなっていてよい。この点では、単量体、３量体、８量体、１３量体、１５量体、１６量体、２１量体、２８量体が特に有益である。例示的な配列は、表２に示されている。ある実施形態では、第１の態様の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、Ｇ－Ｐ－ＧというＮ末端を含む。ある実施形態では、第１の態様の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、Ｇ－Ｐ－ＧというＮ末端を含まない。

【表2】

【0050】

ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列に対する配列バリエーションは、存在する場合、Ｃ末端におけるペプチドの付加を含んでよい。そのペプチドは、最大で５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個またはさらには最大で５０個のアミノ酸からなっていてよい。例示的なＣ末端ペプチド配列としては、（Ｎ末端ペプチドについて）表２に示されている配列が挙げられる。この点では、任意にＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓ－Ｃというアミノ酸配列（配列番号１８）を有する７量体が特に有益である。

【0051】

本発明の誘導体は、本明細書に記載されているような、バリアントｈＩＬ－２２のアミノ酸配列に加えて、Ｎ末端ペプチド及びＣ末端ペプチドの両方を含んでよい。本明細書に記載されているＮ末端ペプチドとＣ末端ペプチドの組み合わせのいずれも、本発明において想定されているとともに、明示的に含まれる。

【0052】

ｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合された脂肪酸を含むいずれのＩＬ－２２誘導体であって、前記バリアントが、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、その脂肪酸が、前記置換位で共有結合されているＩＬ－２２誘導体までに本発明が及ぶことは明らかであろう。その「バリアント」は、ｈＩＬ－２２との配列同一性が少なくとも１０％であるタンパク質であることができる。ある実施形態では、そのバリアントは、ｈＩＬ－２２との配列同一性が少なくとも２０％またはさらには少なくとも３０％である。そのバリアントは、ｈＩＬ－２２の「アミノ酸配列を実質的に」有してよく、これは、ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも４０％である配列を意味することができる。したがって、ある実施形態では、第１の態様の誘導体は、ｈＩＬ－２２とのアミノ酸配列同一性が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である。実験の部分に開示されている本発明の特定の誘導体に組み込まれている例示的なＩＬ－２２タンパク質バリアントは、配列番号１９、２０、２３及び３３に示されている。

【0053】

熟練の技術者には、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを計算する方法は明らかであろう。まず、２つの配列をアラインメントしたものを用意してから、配列同一性の値を計算する必要がある。２つの配列の同一性パーセントは、（ｉ）それらの配列をアラインメントするのに用いる方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（様々なプログラムに実装されている）、または３Ｄ比較による構造的アラインメント、ならびに（ｉｉ）そのアラインメント方法、例えば、ローカルアラインメントとグローバルアラインメントで用いるパラメーター、使用するペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）及びギャップペナルティ、例えば、関数形式及び定数に応じて異なる値を取ることがある。

【0054】

アラインメントを行った後に、２つの配列間の同一性パーセントを計算するには、多種多様な方法がある。例えば、方法の１つでは、同一である数を（ｉ）最短配列の長さ、（ｉｉ）アラインメント部分の長さ、（ｉｉｉ）配列の長さの平均、（ｉｖ）ギャップのない位置の数、または（ｉｖ）オーバーハングを除いて等しくした位置の数で除してよい。さらに、同一性パーセントが、長さに大きく依存することも明らかであろう。すなわち、配列対が短いほど、たまたま配列同一性が高くなると予想し得る。

【0055】

したがって、アミノ酸配列を正確にアラインメントするのは、複雑なプロセスであることは明らかであろう。一般的なマルチプルアラインメントであるＣｌｕｓｔａｌＷ［４８，４９］は、本発明によるタンパク質のマルチプルアラインメントを行う好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに適するパラメーターは、タンパク質のアラインメントにおいては、ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップエクステンションペナルティ＝０．２及びマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔであってよい。ＤＮＡ及びタンパク質のアラインメントでは、ＥＮＤＧＡＰ＝－１及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。配列を最適にアラインメントするために、これらのパラメーター及びその他のパラメーターを変更する必要があることを当業者は認識するであろう。

【0056】

好ましくは、続いて、このようなアラインメント結果から、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントの計算値を（Ｎ／Ｔ）×１００として計算でき、式中、Ｎは、それらの配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、比較する位置であって、ギャップを含むが、オーバーハングを含まない位置の総数である。すなわち、２つの配列間の同一性パーセントを計算するための最も好ましいの方法は、（ｉ）適切なパラメーター群、例えば上記のようなパラメーター群を用いたＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて、配列アラインメントを準備することと、（ｉｉ）配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）×１００という式にＮ及びＴの値を挿入することを含む。

【0057】

類似の配列を定める代替的な方法は、当業者には分かるであろう。

【0058】

適切なことに、第１の態様の誘導体は、２００個以下のアミノ酸を含む。例えば、その誘導体は、アミノ酸を１９０個未満、１８０個未満、１７０個未満、１６０個未満またはさらには１５０個未満含む。適切なことに、その誘導体は、アミノ酸を少なくとも１４６個含むことになるが、これは、ｈＩＬ－２２のアミノ酸の数である。その誘導体は、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも１６０個のアミノ酸、少なくとも１７０個のアミノ酸またはさらには少なくとも１８０個のアミノ酸を含んでもよい。本発明の誘導体は、上記の範囲内のいずれかの長さのタンパク質を含むことができるが、典型的には、１４６～１８０アミノ酸長となる。

【0059】

本発明の誘導体であって、本明細書に記載のバリアントのアミノ酸配列を有する誘導体は、ＩＬ－２２タンパク質に９５位または１０６位で共有結合された脂肪酸を含む。その脂肪酸は典型的には、そのＩＬ－２２タンパク質にリンカーによって共有結合されている。その脂肪酸及びリンカーは、アミド結合を介して互いに連結しているのが適切であり、そのリンカーは、そのＩＬ－２２タンパク質に共有結合されている。したがって、その脂肪酸及びリンカーは、そのＩＬ－２２タンパク質上の側鎖として存在してよい。共有結合された脂肪酸が、ＩＬ－２２の活性に悪影響を及ぼさないことは、本発明者には驚くべきことであった。脂肪酸の結合に、半減期の延長などの追加の利点が伴うことは、特に驚くべきことであった。

【0060】

その脂肪酸は、いずれかの適切な脂肪酸であってよい。特に、その脂肪酸は、下記の式Ｉのものであってよく、
ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－^＊
式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、^＊は、そのＩＬ－２２タンパク質またはリンカーへの結合位置を定める。その脂肪酸は、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のジ酸のようなジ脂肪酸であってよい。有益なことに、その脂肪酸は、Ｃ１６またはＣ１８のジ酸であり、最も有益なことには、その脂肪酸は、Ｃ１８のジ酸である。

【0061】

例えば、式Ｉにおける－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１０である直鎖アルキレンであってよい。この脂肪酸は利便的には、Ｃ１２のジ酸と称してもよく、すなわち、炭素原子を１２個有するジカルボン酸脂肪酸である。あるいは、式Ｉにおける－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１２である直鎖アルキレンであってもよい。この脂肪酸は利便的には、Ｃ１４のジ酸と称してもよく、すなわち、炭素原子を１４個有するジカルボン酸脂肪酸である。同様に、式Ｉにおける－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１４である直鎖アルキレン（Ｃ１６のジ酸）、１６である直鎖アルキレン（Ｃ１８のジ酸）または１８である直鎖アルキレン（Ｃ２０のジ酸）であってよい。第１の態様の誘導体は、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のジ酸を含むのが適切であり、Ｃ１６またはＣ１８のジ酸を含むのがより適切であり、Ｃ１８のジ酸を含むのがさらに適切である。

【0062】

あるいは、その脂肪酸は、式ＩＩのものであってよく、
Ｈ_３Ｃ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－^＊
式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、^＊は、そのＩＬ－２２タンパク質またはリンカーへの結合位置を定める。その脂肪酸は、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸のようなモノ脂肪酸であってよい。有益なことに、そのモノ脂肪酸は、Ｃ１６またはＣ１８のモノ酸であり、最も有益なことには、Ｃ１６のモノ酸である。

【0063】

例えば、式ＩＩにおける－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１０である直鎖アルキレンであってよい。この脂肪酸は利便的には、Ｃ１２のモノ酸と称してよく、すなわち、炭素原子を１２個有するモノカルボン酸脂肪酸である。あるいは、式ＩＩにおける－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１２である直鎖アルキレンであってよい。この脂肪酸は利便的には、Ｃ１４のモノ酸と称してよく、すなわち、炭素原子を１４個有するモノカルボン酸脂肪酸である。同様に、式ＩＩにおける－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１４である直鎖アルキレン（Ｃ１６のモノ酸）、１６である直鎖アルキレン（Ｃ１８のモノ酸）または１８である直鎖アルキレン（Ｃ２０のモノ酸）であってよい。第１の態様の誘導体は、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸を含むのが適切であり、Ｃ１６またはＣ１８のモノ酸を含むのがより適切であり、Ｃ１６のモノ酸を含むのがさらに適切である。

【0064】

そのジ酸またはモノ酸は、アルブミンと非共有結合を形成することによって、血流中で、その誘導体の循環を促進できてよい。短いジ酸及びモノ酸（例えばＣ１６のジ酸またはモノ酸）ほど、それよりも長いジ酸及びモノ酸（例えばＣ１８のジ酸及びモノ酸）よりも、アルブミン親和性が低くなるので、半減期が短くなる。しかしながら、それらの誘導体は依然として、長時間作用する誘導体であり、男性での予測半減期は、１日を超える。

【0065】

そのモノ酸は新油性でもあり、これは、生体膜に結合する傾向があることを意味する。生体膜に組み込まれることで、アルブミンに依存しないこの保護力により、局所的な貯蔵部が形成し得るので、確実に局所作用が長くなる。これにより、局所投与、経口投与、肛門坐剤もしくは直腸泡沫剤としての投与、または肺吸入において利点が得られるという仮説を立てることができる。

【0066】

また、脂肪酸の結合はそれ自体、そのＩＬ－２２タンパク質がタンパク分解しないように安定させる。その結果得られる半減期は典型的には、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体の半減期と同等である（すなわち、ｈＩＬ－２２と比べて大幅に改善されている）。

【0067】

第１の態様の誘導体は、脂肪酸とＩＬ－２２タンパク質との特定の組み合わせを含んでよい。例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のジ酸またはモノ酸が、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位にＣｙｓ残基を含むＩＬ－２２タンパク質に結合していてよい。一例では、第１の態様の誘導体は、Ｃ１８のジ酸を含み、そのＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されたＣｙｓ残基を含む。別の例では、第１の態様の誘導体は、Ｃ１８のジ酸を含み、そのＩＬ－２２タンパク質は、（誘導体１及び２におけるように、）ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されたＣｙｓ残基、及びｈＩＬ－２２の３５位及び６４位で置換されたＧｌｎ残基を含む。これらの例では、そのＩＬ－２２タンパク質は、Ａ－Ｅ－Ｐ－Ｅ－Ｅ（配列番号９）という配列を有するＮ末端５量体またはＣ末端５量体をさらに含んでもよい。

【0068】

上記のように、その脂肪酸は、リンカーに連結しているのが適切であり、そのリンカーが、ＩＬ－２２タンパク質に９５位または１０６位で結合している。そのリンカーは、１つ以上のＧｌｕ残基及び／またはＬｙｓ残基など、１つ以上のアミノ酸を含め、リンカー要素をいくつか含んでよい。そのリンカーは、オキシエチレングリシン単位を１つ、またはオキシエチレングリシン単位が複数、任意に２～５単位、有益なことには２単位連結したものを含んでよい。上記の代わりにまたは上記に加えて、ＯＥＧ残基、Ｃ_２ＤＡ及び／またはＡｃ基が１つ以上含まれていてもよい。そのリンカーは、Ｃｙｓ反応性単位を含んでよい。「Ｃｙｓ反応性単位」は、本明細書で使用する場合、Ｃｙｓの硫黄原子と反応して、炭素と硫黄との共有結合を作ることができる機能的単位を意味することができる。Ｃｙｓ反応性単位は、いくつかの形態のいずれかを有することができるが、脱離基に結合した炭素原子を含むのが適切であり、その脱離基は、炭素と硫黄との結合の形成中に、Ｃｙｓの硫黄原子に置換される。その脱離基は、ハロゲン、任意に臭素原子であってよい。臭化物であるこの脱離基は、Ａｃ官能基に対するα位であることができ、有益なことに、ブロモ－Ａｃ官能基である。あるいは、その脱離基は、メシル酸塩もしくはトシル酸塩の形態の、官能化されたヒドロキシル基、または官能化されていないヒドロキシル基であってよい。さらに、その脱離基は、マレイミドまたはその他の官能基であることができる。例示的なリンカーとしては、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃ、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃ及びγＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃが挙げられるが、いずれかの適切なリンカーを用いてよい。特定の実施形態では、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃである。

【0069】

いくつかの実施形態では、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃというリンカーに共有結合されたモノ脂肪酸を含むバリアントが好ましいこともある。いくつかの実施形態では、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃ及びγＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃから選択したリンカーに共有結合されたジ脂肪酸を含むバリアントが好ましいこともある。いくつかの実施形態では、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃ及びγＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃから選択したリンカーに共有結合されたＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のジ脂肪酸を含むバリアントが好ましいこともある。いくつかの実施形態では、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃというリンカーに共有結合されたＣ１４のジ脂肪酸を含むバリアントが好ましいこともある。いくつかの実施形態では、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃというリンカーに共有結合されたＣ１６、Ｃ１８またはＣ２０のジ脂肪酸を含むバリアントが好ましいこともある。

【0070】

そのリンカーは、配列番号１内のＣｙｓ残基に結合したＣｙｓ反応性リンカーであってよい。そのリンカーは、配列番号１に対するＣ末端またはＮ末端の伸長部において、Ｃｙｓ残基に結合したＣｙｓ反応性リンカーであってよい。

【0071】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇ、及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0072】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇ、及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0073】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１６またはＣ１８のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇ、及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0074】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１６のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇ、及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0075】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸を含み、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0076】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0077】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１６、Ｃ１８またはＣ２０のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0078】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１６またはＣ１８のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0079】

ある実施形態では、その誘導体は、リンカーによってｈＩＬ－２２のバリアントに共有結合されたＣ１６のモノ酸を含み、そのリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、そのバリアントは、Ｎ末端のＧ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、そのリンカーは任意に、前記Ｃｙｓ残基に結合している。

【0080】

その脂肪酸またはリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質における９５位または１０６位の置換アミノ酸残基に結合している。天然型残基は典型的には、その脂肪酸またはリンカーの結合を可能にするために、ＣｙｓまたはＬｙｓで置換されている。特に、その脂肪酸またはリンカーは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されたＣｙｓ残基に結合していてよい。

【0081】

その脂肪酸またはリンカーのそのＩＬ－２２タンパク質への結合は、共有結合である。例えば、Ｃｙｓ反応性の脂肪酸またはリンカーを用いて、その脂肪酸またはリンカーをそのＩＬ－２２タンパク質のＣｙｓ残基に結合していてよい。その脂肪酸またはリンカーは、そのＣｙｓ残基の硫黄原子に、チオエーテル結合を介して共有結合されいてよい。あるいは、Ｌｙｓ反応性の脂肪酸またはリンカーを用いて、その脂肪酸またはリンカーをＩＬ－２２タンパク質のＬｙｓ残基に結合していてよい。あるいは、その脂肪酸またはリンカーは、そのＩＬ－２２タンパク質のＮ末端の遊離アミン（－ＮＨ_２）基に共有結合されていてもよい（１位のアミノ酸には関わらない）。適切なＮ末端反応性の種を含む脂肪酸またはリンカーが準化学量論的量でも、結合は、Ｃｙｓへの結合の場合と同様に進行できる。その脂肪酸またはリンカーは、アルデヒド（Ｎ末端反応性の種）の形態で与えられていて、古典的に知られている還元的アミノ化を用いて、遊離アミンに共有結合されていてもよい。

【0082】

したがって、第１の態様の誘導体は、リンカーによって、ｈＩＬ－２２のバリアントに結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０のジ酸またはモノ酸を含むのが適切であり、そのバリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、そのリンカーは、前記置換位で共有結合されている。有益なことに、Ｃｙｓ残基には、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されており、そのリンカーは、そのＣｙｓ残基に結合している。任意に、Ｇｌｎ残基に、３５位及び６４位で置換されている。

【0083】

第１の態様の例示的な誘導体は、配列番号１９、２０、２３または３３に示されているようなＩＬ－２２タンパク質を含む。特に有益な誘導体は、表３に示されているとともに、図２及び３に図示されており、本明細書に例示されている。

【表3】

【0084】

図１Ａには、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに連結したＣ１８のジ酸が図示されている。これは、誘導体１及び２で用いられている脂肪酸及びリンカー（側鎖）である。図１Ｂには、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに連結したＣ１６のジ酸が示されている。図１Ｃには、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに連結したＣ１４のジ酸が示されている。

【0085】

誘導体１は図２に、誘導体２は図３に示されている。誘導体３は、Ｌ１０６Ｃという置換を含む点では、誘導体１と同様であるが、配列番号１と比べると、３５位及び６４位が変化していない点が異なる。誘導体４は、Ｒ９５Ｃという置換を含む点では、誘導体２と同様であるが、配列番号１と比べると、３５位及び６４位が変化していない点が異なる。

【0086】

本発明の誘導体は、様々な立体異性体で存在してもよく、本発明は、これらのすべてに関するものである。

【0087】

本発明の第２の態様によれば、第１の態様の誘導体を調製するプロセスであって、脂肪酸をＩＬ－２２タンパク質に共有結合させることを含み、そのＩＬ－２２タンパク質が、ｈＩＬ－２２のバリアントであり、前記バリアントが、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位に置換を含み、そのプロセスが、その脂肪酸を前記置換位で共有結合させることを含むプロセスを提供する。

【0088】

そのプロセスを用いて、本明細書で記載または想定されている様々なＩＬ－２２誘導体のいずれか作製してよいが、脂肪酸をバリアントＩＬ－２２タンパク質に共有結合させると、特に有益である。その第２の態様で用いるＩＬ－２２タンパク質は、置換形態のｈＩＬ－２２であり、９５位及び／または１０６位の天然型残基が、代わりのアミノ酸に置き換えられている。そのバリアントｈＩＬ－２２タンパク質は任意に、１位、２１位、３５位、６４位、１１３位及び／または１１４位でさらに置換されている。例示的な置換としては、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｒ９５Ｃ、Ｌ１０６Ｃ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及び／またはＫ１１４Ｒが挙げられる。好ましくは、そのＩＬ－２２タンパク質は、９５位及び／または１０６位においてはＣｙｓ残基で、３５位及び／または６４位においてはＧｌｎ残基で置換されている。その他のバリアントは、３５位及び／または６４位に修飾を含まない。

【0089】

その脂肪酸は、組み換え手段を含め、当該技術分野で知られているいずれかの手段によって得ることができる。適切な脂肪酸は、市販のものであるか、または利用可能な出発物質から、標準的な化学合成を用いて容易に誘導されたものである。

【0090】

そのＩＬ－２２タンパク質は、組み換え手段を含め、当該技術分野で知られているいずれかの手段によって得ることができる。組み換えｈＩＬ－２２の作製は、以前に説明されており、当該技術分野で周知である。所望のバリアントＩＬ－２２タンパク質は、同様の方法で作製できる。当該分野の熟練の研究者は、所望のバリアントＩＬ－２２タンパク質をコードする適切な核酸配列を容易に特定できるであろう。したがって、当業者は、当該技術分野における既存の知識に基づき、本発明のこの部分を容易に実施できるであろう。そのＩＬ－２２タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物システムで、標準的な技法を用いて作製するのが適切である。ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を用いて、その組み換えタンパク質のアフィニティー精製を補助してもよい。

【0091】

この点では、本発明で用いるようなＩＬ－２２タンパク質は、発現後に切断可能なＨｉｓタグを用いて調製でき、このタグは、ニッケルカラムへのアフィニティーによって精製できる１０個未満、好ましくは６個のヒスチジン残基がＮ末端またはＣ末端に付加されている。Ｈｉｓタグは、既知のプロテアーゼによって消化されて、遊離ＩＬ－２２タンパク質を脱離できるリンカーを介して、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結する。その切断可能なＨｉｓタグは、ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＳＧＳＧＳＥＶＬＦＱというアミノ酸配列（配列番号２１）を有することができ、そのプロテアーゼ切断性リンカーは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）リンカー（その天然型切断部位のコンセンサス配列は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（配列番号２２）であり、この配列中、「＼」は、切断されるペプチド結合を示す）、またはヒトライノウイルス－１４ ３Ｃ（ＨＲＶ１４－３Ｃ）のプロテアーゼ切断性リンカー（ＥＶＬＦＱというコンセンサスな切断部位を有する）であることができる。切断は、およそ１０μｇのプロテアーゼを、２．５μｇのタンパク質及び１０ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、室温で４時間インキュベートすることによって行ってよい。

【0092】

本発明をさらに例示するために、以下のように、タンパク質を調製する代表的なプロセスを示す。そのプロセスには、そのＩＬ－２２タンパク質の所望のアミノ酸配列をコードするプラスミドＤＮＡを調製することが伴う。このプラスミドを細胞株、例えばＣＨＯ－Ｋ１に一過性にトランスフェクションでき、その細胞株を関連する培地中で成長させてから、既知のエンハンサーを追加することによって、成長を増大させる。続いて、既知の遠心分離法及び滅菌ろ過法を通じて、分泌されたＩＬ－２２タンパク質を回収してから、そのタンパク質をニッケルカラムで精製できる。濃縮及び緩衝液交換の後、ＨＲＶ１４－３Ｃプロテアーゼを用いてＨｉｓタグを除去してから、脂肪酸でアルキル化し（下にさらに説明されている）、最終精製及び緩衝液交換を行う。糖鎖除去とともに、または糖鎖除去を行わずに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィー－タンデム質量解析（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）を用いた、最終生成物の解析を利用して、その最終生成物の品質を担保できる。

【0093】

その脂肪酸は、第１の態様について記載されているように、そのＩＬ－２２タンパク質に、直接、またはリンカーを用いるかのいずれかで共有結合できる。そのリンカーは、当該技術分野で知られているいずれかの手段によって得ることができる。その脂肪酸及びリンカーを用いる場合、それらを調製する代表的な方法は、下記のとおりである（Ｃ１６のジ酸によって例示されているが、同様の方法を用いて、いずれの誘導体も作製できる）。

【0094】

ジクロロメタン（５００ｍｌ）中のＮ－（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（１００ｇ、４０１ｍｍｏｌ）の溶液を、ジクロロメタン（７５０ｍｌ）中のエチレンジアミン（１８９ｍｌ、２．８１ｍｏｌ）の溶液に加える。３０分後、その懸濁液をろ過、洗浄し、真空下で濃縮する。その残渣をトルエン（７５０ｍｌ）で希釈し、洗浄し、ジクロロメタン（４×２００ｍｌ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮し、ヘキサン（２００ｍｌ）で希釈する。その溶液に、エーテル（１００ｍｌ、４００ｍｍｏｌ）中の塩化水素の４Ｍ溶液を加え、得られた懸濁液を真空下で濃縮し、ヘキサン（１ｌ）で希釈する。沈殿した固体をろ過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥して、（２－アミノエチル）カルバミン酸ベンジルエステル塩酸塩を白色粉末として得る。

【0095】

２－クロロトリチル樹脂１００－２００に、｛２－［２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－エトキシ］－エトキシ｝－酢酸（Ｆｍｏｃ－Ａｄｏ－ＯＨ、１７．５ｇ、４５．４ｍｍｏｌ）を担持させる そのＦｍｏｃ基を除去し、その樹脂に、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（１４０ｍｌ）中の０－６－クロロ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＣＴＵ、２４．２ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２１．４ｍｌ、１２３ｍｍｏｌ）の溶液を加え、その混合物を１時間振とうする。その樹脂をろ過及び洗浄する。２０％ピペリジンで処理することによって、上記のように、そのＦｍｏｃ基を除去する。その樹脂を上記のように洗浄する。

【0096】

その樹脂に、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（１４０ｍｌ）中の（Ｓ）－２－（フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－ペンタン二酸１－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、２９．０ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）、ＴＣＴＵ（２４．２ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２１．４ｍｌ、１２３ｍｍｏｌ）の溶液を加え、その混合物を１時間振とうする。その樹脂を上記のようにろ過及び洗浄する。２０％ピペリジンで処理することによって、上記のように、そのＦｍｏｃ基を除去する。その樹脂を上記のように洗浄する。

【0097】

その樹脂に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド／ジクロロメタンの混合物（４：１、２００ｍｌ）中の１６－ｔｅｒｔ－ブトキシ）－１６－オキソヘキサデカン酸（２３．３ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）、ＴＣＴＵ（２４．２ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（２１．４ｍｌ、１２３ｍｍｏｌ）の溶液を加える。その樹脂を１時間振とうし、ろ過し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３×２５０ｍｌ）、ジクロロメタン（２×２５０ｍｌ）、メタノール（２×２５０ｍｌ）及びジクロロメタン（６×２５０ｍｌ）で洗浄する。２，２，２－トリフルオロエタノール（２５０ｍｌ）で１８時間処理することによって、その生成物をその樹脂から切断する。その樹脂をろ別し、ジクロロメタン（２×２５０ｍｌ）、２－プロパノール／ジクロロメタンの混合物（１：１、２×２５０ｍｌ）、２－プロパノール（２５０ｍｌ）及びジクロロメタン（３×２５０ｍｌ）で洗浄する。

【0098】

その溶液を合わせ、その溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。純粋な（Ｓ）－２２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４１，４１－ジメチル－１０，１９，２４，３９－テトラオキソ－３，６，１２，１５，４０－ペンタオキサ－９，１８，２３－トリアザドテトラコンタン酸を真空下で乾燥し、淡黄色の濃厚な黄色油として得る。

【0099】

その後に、乾燥ジクロロメタン（１１０ｍｌ）中の（Ｓ）－２２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４１，４１－ジメチル－１０，１９，２４，３９－テトラオキソ－３，６，１２，１５，４０－ペンタオキサ－９，１８，２３－トリアザドテトラコンタン酸（２２．４ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）の溶液に、２－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１１．４ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（８．７７ｍｌ、６２．９ｍｍｏｌ）を加える。乾燥ジクロロメタン（１６５ｍｌ）中の（２－アミノ－エチル）－カルバミン酸ベンジルエステル塩酸塩（６．９４ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）の懸濁液にトリエチルアミン（７２ｍｌ、４１．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を上記の溶液に加える。その混合物を室温で一晩撹拌してから、蒸発乾固する。その残渣を再溶解し、洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、カラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、０．０４０～０．０６０ｍｍ、溶離液：ジクロロメタン／メタノール（９５：５））蒸発して、１５－［（Ｓ）３－（２－｛２－［（２－｛２－［（２－ベンジルオキシカルボニルアミノ－エチルカルバモイル）－メトキシ］－エトキシ｝エチル－カルバモイル）メトキシ］エトキシ）－エチルカルバモイル）－１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルプロピルカルバモイル］－ペンタデカン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステルを淡黄色の濃厚な油として得る。

【0100】

メタノール（３５０ｍｌ）中の上記の化合物（２３．８ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）の溶液にパラジウム炭素（１０％、１．２７ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物に、常圧で４時間水添する。その触媒をろ別し、そのろ液を蒸発乾固する。メタノールの残渣を除去するために、その残渣をジクロロメタンから数回蒸発させ、真空下で乾燥して、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－１－アミノ－２５－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４，１３，２２，２７－テトラオキソ－６，９，１５，１８－テトラオキサ－３，１２，２１，２６－テトラアザドテトラコンタン－４２－オエートを濃厚な無色の油として得る。

【0101】

乾燥ジクロロメタン（２９０ｍｌ）中の上記のアミン（２０．５ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４．９８ｍｌ、２８．６ｍｍｏｌ）を－３０℃で、アルゴン下で加える。ブロモアセチルブロミド（２．４８ｍｌ、２８．６ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた溶液を－３０℃で、さらに３時間撹拌する。その冷却浴を除去し、その混合物を室温で１時間撹拌し、その溶媒を真空下で除去する。その残渣を酢酸エチル（４５０ｍｌ）に再溶解し、クエン酸の５％水溶液（３００ｍｌ）で洗浄する。その相を１時間以内に分離する。有機層を一晩分離させて、３つの相を得る。その透明な水層を除去し、残りの２相を臭化カリウムの飽和水溶液（１００ｍｌ）とともに振とうする。それらの相を一晩分離させ、その水相を除去し、その有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥する。その溶媒を真空下で除去し、その残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー：ジクロロメタン／メタノール（９５：５））によって精製し、ｔｅｒｔブチル（Ｓ）－１－ブロモ－２８－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２，７，１６，２５，３０－ペンタオキソ－９，１２，１８，２１－テトラオキサ－３，６，１５，２４，２９－ペンタアザペンタ－テトラコンタン－４５－オエートを無色の固体として得る。

【0102】

上記の化合物（１９．５ｇ、１９．８ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１２０ｍｌ）に溶解し、得られた溶液を室温で１．５時間撹拌する。トリフルオロ酢酸を真空下で除去し、その残渣をジクロロメタン（６×２００ｍｌ）から蒸発させる。その油状残渣にジエチルエーテル（２００ｍｌ）を加え、その混合物を一晩撹拌し、懸濁液を得る。その固体生成物をろ過し、ジエチルエーテル及びヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥して、所望の生成物１５－｛（Ｓ）－１－カルボキシ３－［２－（２－｛［２－（２－｛［２－（２－ブロモアセチルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝－エトキシエチル－カルバモイル］メトキシ｝エトキシル－エチルカルバモイル］プロピルカルバモイル｝ペンタデカン酸を白色粉末として得る。

【0103】

その脂肪酸またはリンカーのそのＩＬ－２２タンパク質への共有結合は、当該技術分野における標準的な手順を用いて行ってよい。すなわち、リンカーを用いる場合には、リンカーにより、そのＩＬ－２２タンパク質をその脂肪酸に共有結合させる。非限定的な例として、Ｃｙｓ反応性の脂肪酸またはリンカーは、そのＩＬ－２２タンパク質のＣｙｓ残基の硫黄原子と反応して、チオエーテル結合を形成し得る。その共有結合工程に適する条件は、以下のように例示し得る。すなわち、水中のトリスを、トリス及びＮａＣｌ－緩衝液（１．３５ｍｇ／ｍｌ）中のＩＬ－２２タンパク質（７０ｍｇ）に加えて、ｐＨ８まで調整する。水に溶解したビス（ｐ－スルホナトフェニル）－フェニルホスフィン二水和物二カリウム（ＢＳＰＰ）塩（１２ｍｇ）を加え、緩やかに４時間、室温で撹拌する。エタノール（０．５ｍｌ）中の１５－｛（Ｓ）－１－カルボキシ－３－［２－（２－｛［２－（２－｛［２－（２－ブロモアセチルアミノ）－エチルカルバモイル］エトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］メトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］プロピル－カルバモイル｝ペンタデカン酸（１９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を緩やかに一晩撹拌する。ミリＱ水（１５０ｍｌ）を加え、その伝導率を２．５ｍＳ／ｃｍに低下させる。続いて、結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）、溶出用緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、流量６ｍｌ、及び６０カラム容量を超えるグラジエント０－８０％の溶出用緩衝液を用いたＭｏｎｏＱ １０／１００ ＧＬカラムで、アニオン交換を用いて、その混合物を精製する。

【0104】

本発明の誘導体は、クロマトグラフィー、電気泳動、溶解度差または抽出など、当該技術分野で知られているいずれかの適切な手順を用いて精製してよい。

【0105】

本明細書に記載されているように、本発明者は、生物学的活性を維持したままで、脂肪酸をＩＬ－２２タンパク質に共有結合できることを見出し、驚いた。このように、ＩＬ－２２に対する改変が最小限であることにより、高い（ｈＩＬ－２２に近い）効力が得られるとともに、循環半減期を非常に長くできるのは、特に驚くべきことであった。この特定の組み合わせの特性は、非常に望ましい場合がある。

【0106】

その誘導体の効力は、ヒトＩＬ－２２受容体を発現する全細胞によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで求めてよい。例えば、ヒトＩＬ－２２受容体の応答は、ＩＬ－２２Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２及びリン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）応答性レポーター遺伝子を過剰発現するベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を用いて測定し得る。あるいは、そのＩＬ－２２受容体を内在的に発現するＨｅｐＧ２細胞を用いてもよい。その受容体の活性化により、ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路が活性化し、それにより、例えば、ＳＴＡＴ３で誘導されるプロモーターを有するルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて、またはｐＳＴＡＴ３をアッセイすることによって測定できる。Ｉｎ ｖｉｖｏ効力は、当該技術分野で知られているように、動物モデルまたは臨床試験で求めてよい。

【0107】

薬物の効力の尺度として、半最大効果濃度（ＥＣ_５０）の値を用いる場合が多い。この尺度は、最大効果の５０％をもたらすのに必要な薬物濃度を表すので、ＥＣ_５０値が低いほど、効力が高い。本発明の誘導体は適切にも、細胞内で、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化を用いて測定した効力（ＥＣ_５０値）が、１．５ｎＭ未満、１．２５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満またはさらには０．１ｎＭ未満である（例えば、実施例１に記載されているようにして求めた）。本発明の誘導体は適切にも、細胞内で、ｐＳＴＡＴ３をアッセイすることによって測定した効力（ＥＣ_５０値）が、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、７ｎＭ未満またはさらには５ｎＭ未満である。

【0108】

有益なことに、そのＩＬ－２２誘導体の効力は、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体の効力よりも高いことがある。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、そのＩＬ－２２－Ｆｃ融合体ＵＴＴＲ１１４７Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力が、ｈＩＬ－２２と比べて３４分の１に低下したことを報告している（Ｓｔｅｆａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１８，１５２：２２４－２３５）。これに対して、脂肪酸のバリアントｈＩＬ－２２への共有結合によっては、効力が３分の１または５分の１にしか低下しないことが示されている（実施例１における誘導体１及び２を参照されたい）。ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体及び本発明の誘導体の両方とも、半減期がｈＩＬ－２２よりも改善する点、及び少なくともいくつかの状況での生体機能の改善という点では、同程度である場合があるが、本発明の誘導体は、効力の低下が最小限であるという追加の利点を有する場合がある。

【0109】

その誘導体の循環排泄半減期（Ｔ_１／２）は、マウス、ラットまたはミニブタのような適切な動物モデルで、その誘導体を皮下投与または静脈内投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで求めてよい。適切な方法は、当業者には分かるであろう。非限定的な例として、第１の態様の誘導体は、マウスに皮下投与または静脈内投与した後の循環半減期が、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間またはさらには少なくとも８時間である。その誘導体は、ラットに皮下投与または静脈内投与した後の循環半減期が、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間またはさらには少なくとも１３時間であるとみられる。その誘導体は、ミニブタに皮下投与または静脈内投与した後の循環半減期が、少なくとも２５時間、少なくとも４０時間、少なくとも７０時間またはさらには少なくとも１００時間であるとみられる。

【0110】

本発明者は、本発明の誘導体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて速やかに吸収されることも見出した。有益なことに、皮下投与後のその誘導体の吸収は、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体の吸収よりも速く行われる可能性がある。平均吸収時間は、取り込み量を測定するための正確なパラメーターである。用量、及び薬物投与後の最高血漿中濃度の影響を受けないからである。吸収時間は、平均滞留時間、すなわち、薬物が、吸収の完了から排泄まで、体内に滞留する時間に基づき計算できる。本発明の誘導体は適切にも、ブタにおける平均吸収時間が、１００時間未満、９０時間未満、８０時間未満、７０時間未満またはさらには６０時間未満である。

【0111】

本発明の誘導体は、高い物理的安定性及び／または溶解度のような生物物理学的な特性に優れており、これらの特性は、当該技術分野における標準的な方法を用いて測定し得る。実際、モノ酸で誘導体化されたバリアントは、生物物理学的な特性が、ｈＩＬ－２２と比べて有意に変化しており、それにより、その潜在的な治療能力が改善される。注目すべきことに、その誘導体は、例えば、アルブミンへの結合及び脂質膜との相互作用を通じて、タンパク質分解及び腎臓での除去に対して安定化している。重要なことに、本発明者は、脂肪酸部分を含むモノ酸のコンジュゲーションをＩＬ－２２タンパク質の主鎖の所定の部位で行うことができ、そのコンジュゲートされた誘導体の活性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した場合に、損なわれることもないことを見出した。

【0112】

したがって、本発明の第３の態様によれば、第１の態様の誘導体と薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物を提供する。その医薬組成物は、吸入による投与、注射による投与、局所投与、経口投与または点眼による投与に適することがあり、任意に、その注射は、本明細書にさらに記載されているように、腹腔内注射、皮下注射または静脈内注射である。一実施形態では、皮下投与が好ましい。一実施形態では、静脈内投与が好ましい。一実施形態では、経口投与が好ましい。

【0113】

第３の態様の医薬組成物は、本明細書で説明または想定されている様々なＩＬ－２２誘導体のいずれかを含んでよい。その医薬組成物は、本明細書で誘導体１、２、３または４と定められているＩＬ－２２誘導体の１つを含むのが適切である。

【0114】

第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物は適切にも、ｈＩＬ－２２と比べて、循環排泄半減期の延長を示す。有益なことに、循環排泄半減期が、ｈＩＬ－２２と比べて少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％以上延長することになる。

【0115】

第３の態様の医薬組成物は、第１の態様の誘導体を治療有効量と、薬学的に許容されるビヒクルとを組み合わせることによって調製し得る。薬学的に活性な成分と様々な賦形剤との調合は、当該技術分野で知られている。

【0116】

第１の態様の誘導体の「治療有効量」は、対象に投与したときに、疾患、障害または病状を治療するか、または所望の効果をもたらすのに必要となる誘導体量であるいずれかの量である。

【0117】

例えば、使用する誘導体の治療有効量は、約０．００１ｍｇ～約１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇであってよい。誘導体の量は、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ～約５０ｍｇの量であるのが好ましい。

【0118】

「薬学的に許容されるビヒクル」とは、本明細書で言及されている場合には、医薬組成物を調合する際に有用であることが当業者に知られているいずれかの既知の化合物、または既知の化合物の組み合わせである。

【0119】

一実施形態では、その薬学的に許容されるビヒクルは、固体であってよく、任意に、その組成物は、再懸濁用の粉末の形態であってよい。薬学的に許容される固体ビヒクルとしては、香味剤、滑沢剤、溶解補助剤、懸濁化剤、色素、充填剤、潤沢剤、不活性結合剤、保存剤または色素としても作用する１つ以上の物質を挙げてよい。そのビヒクルは、カプセル化材であってもよい。散剤においては、ビヒクルは、本発明による微粉化誘導体と添加混合された微粉化固体である。その散剤は好ましくは、最大で９９％の誘導体を含む。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース及びイオン交換樹脂が挙げられる。

【0120】

別の実施形態では、医薬用ビヒクルはゲルであってもよく、その組成物は、クリームなどの形状であってもよい。

【0121】

しかしながら、医薬用ビヒクルは液体であってもよく、任意に、その医薬組成物は、溶液の形状であってもよい。液体ビヒクルは、溶液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤及び加圧組成物を調製する際に用いる。本発明による誘導体は、水、有機溶媒、水と有機溶媒の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪のような薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁してよい。液体ビヒクルは、溶解補助剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤のようなその他の適切な医薬品添加物を含むことができる。非経口投与用の液体ビヒクルの適切な例としては、水（上記のような添加物、例えば、セルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液を部分的に含む）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、精製ヤシ油及びラッカセイ油）が挙げられる。非経口投与用では、ビヒクルは、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルのような油性エステルであることもできる。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形状の組成物に有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素またはその他の薬学的に許容される噴射剤であることができる。

【0122】

すなわち、本発明の医薬組成物を調製するプロセスは、当該技術分野において標準的な通常の工程を含んでよい。

【0123】

したがって、本発明の第４の態様によれば、治療で使用するための第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物を提供する。対象を本発明の誘導体またはその誘導体を含む医薬組成物で治療する方法も提供する。本発明で説明または想定されている様々なＩＬ－２２誘導体のいずれも、本発明のこれらの態様に明示的に含まれる。

【0124】

本明細書で使用する場合、「治療すること」及び「療法」のような用語には、疾患、障害または病状の治療、改善または予防が明示的に含まれる。

【0125】

そのＩＬ－２２誘導体またはその誘導体を含む医薬組成物は、治療すべき対象に直接投与してよい。その誘導体または医薬組成物は、吸入による投与、注射による投与、局所投与、経口投与、直腸投与または眼内投与を含むいずれかの手段によって投与してよい。吸入によって投与するときには、鼻または口を介してよい。好ましくは、その誘導体または医薬組成物は、注射によって投与し、典型的には、皮下投与または静脈内投与する。上記のように、本発明のモノ酸誘導体の親油性は、局所投与、経口投与、直腸投与（例えば、坐剤もしくはフォーム剤）または肺吸入にも有益である場合がある。したがって、その誘導体は、投与（例えば、注射による投与、吸入による投与、局所塗布、直腸投与もしくは経口投与、または点眼送達）の柔軟性において、Ｆｃ融合体を上回る明らかな利点を有する。その誘導体の方が、サイズが小さく、効力が高いからである。治療すべき対象に、本発明の誘導体を投与すると、ｈＩＬ－２２と比べて循環時間が長くなり、このことが、疾患、障害または病状の治療を助けることは明らかであろう。上記のように、「治療すること」には、疾患、障害または病状を改善及び予防することも含まれる。

【0126】

滅菌溶液剤または滅菌懸濁剤である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、腹腔内注射及び特には皮下注射または静脈内注射によって利用できる。その誘導体は、投与時に、滅菌水、滅菌生理食塩水またはその他の適切な注射可能な滅菌媒質を用いて溶解または懸濁してよい滅菌固体組成物として調製してよい。

【0127】

吸入に有用な形状としては、滅菌溶液剤、滅菌乳剤及び滅菌懸濁剤が挙げられる。あるいは、その誘導体は、Ｄｉｓｃｈａｌｅｒ（登録商標）またはＴｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）を介して、微粉末またはエアゾール剤の形状で投与してよい。経鼻吸入は適切にも、微粉末もしくはエアゾールの点鼻スプレーの形状、または改変型のＤｉｓｃｈａｌｅｒ（登録商標）もしくはＴｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）であってもよい。

【0128】

局所製剤としては、溶液剤、クリーム剤、フォーム剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、パスタ剤、チンキ剤及びパウダー剤が挙げられる。その製剤は、経皮塗布、すなわち、皮膚に直接塗布してもよいし、または粘膜に塗布してもよい。

【0129】

経口投与は適切にも、錠剤、カプセル剤、または液体懸濁剤もしくは乳剤を介してよい。経口投与用の液体ビヒクルの適切な例としては、水（添加物、例えば、セルロース誘導体、好ましくは、ナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液を部分的に含む）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、精製ヤシ油及びラッカセイ油）が挙げられる。本発明の誘導体は、他の溶質または懸濁化剤（例えば、その溶液を等張化するのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールとその無水物のオレイン酸エステルを酸化エチレンと共重合したもの）などを含む滅菌溶液または滅菌懸濁液の形状で経口投与してよい。溶液剤、シロップ剤及びエリキシル剤も、本発明の一部を形成する。本発明による誘導体は、固体組成物の形状で経口投与することもできる。経口投与に適する固体組成物としては、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤及び散剤が挙げられる。

【0130】

直腸投与は適切にも、坐剤またはフォーム剤を介してもよい。

【0131】

眼内投与用の製剤は典型的には、局所塗布用の溶液剤、懸濁剤及び軟膏剤、例えば点眼剤の形状である。あるいは、滅菌溶液剤または滅菌懸濁剤を眼内注射によって使用できる。その誘導体は、投与時に、滅菌水、滅菌生理食塩水またはその他の適切な注射可能な滅菌媒質を用いて溶解または懸濁してよい滅菌固体組成物として調製してよい。その製剤は、結膜下注射用、硝子体内注射用、眼球後注射用または前房内注射用でもあってよい。

【0132】

本発明の誘導体または医薬組成物は、それを必要とするいずれの対象にも投与してよい。「対象」は、本明細書で使用する場合、脊椎動物、哺乳動物または飼育動物であってよい。したがって、本発明による誘導体及び組成物を用いて、いずれかの哺乳動物、例えば、家畜（例えばウマ）、ペットを治療してもよいし、または他の動物用の用途で用いてもよい。最も好ましくは、その対象は、ヒトである。その誘導体及び組成物は、疾患、障害または病状の徴候がすでに見られる者のみに投与する必要はない。むしろ、それらは、一見健康である対象に、純粋に、将来このような疾患、障害または病状に罹患する可能性に対する予防的措置として投与できる。

【0133】

本発明によるＩＬ－２２誘導体及び組成物は、疾患、障害または病状を治療するために、単剤療法（すなわち、その誘導体または組成物の単独使用）で用いてよいことは明らかであろう。あるいは、本発明による誘導体及び組成物は、疾患、障害または病状を治療するための既知の療法の補助剤として、またはその療法と組み合わせて用いてよい。

【0134】

ＩＬ－２２誘導体の所要量は、その生物学的活性、半減期及びバイオアベイラビリティによって求め、ひいては、投与方法、その誘導体及び組成物の生理化学的特性、ならびに単剤療法として用いるか、または併用療法で用いるかによって決まることは明らかであろう。投与頻度は、治療を受けている対象におけるその誘導体の半減期の影響も受けることになる。最適な投与量は、当業者が求めてよく、その量は、使用する特定の誘導体、医薬組成物の強度、投与方法、ならびに疾患、障害または病状の進行とともに変動する。対象の年齢、体重、性別、食事及び投与時間を含め、治療を受ける特定の対象によって決まる追加の要因により、投与量を調整する必要が生じる。

【0135】

概して、使用する誘導体または組成物に応じて、疾患、障害または病状を治療するために、本発明によるＩＬ－２２誘導体を体重１ｋｇ当たり０．００１μｇ～体重１ｋｇ当たり１０ｍｇという１日量で用いてよい。より好ましくは、その１日量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～体重１ｋｇ当たり１ｍｇであり、より好ましくは、体重１ｋｇ当たり０．１μｇ～体重１ｋｇ当たり５００μｇであり、最も好ましくは、およそ、体重１ｋｇ当たり０．１μｇ～体重１ｋｇ当たり１００μｇである。

【0136】

そのＩＬ－２２誘導体または組成物は、疾患、障害または病状の発症前、発症中または発症後に投与してよい。１日量は、１回の投与（例えば１日１回の注射）として与えてよい。あるいは、その誘導体または組成物は、１日に２回以上の投与が必要となることもある。例として、誘導体は、０．０７μｇ～７００ｍｇの１日量（すなわち、体重を７０ｋｇと想定している）を２回（または、治療する疾患、障害または病状の重症度に応じて３回以上）として投与してよい。治療を受けている患者に、起床時に第１の用量を投与し、続いて、夕方に（２用量のレジメの場合）、またはその後に３時間もしくは４時間の間隔で、第２の用量を投与してよい。あるいは、１週間に１回、２週間に１回もしくは１カ月に１回、またはもっと頻繁に、例えば、１週間に２回もしくは３回、服用量を投与してよい。製薬業界（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験など）で従来から用いられている手順のような既知の手順を用いて、本発明による誘導体及び組成物の所定の製剤を形成するとともに、治療レジメ（薬剤の１日量及び投与頻度など）を実施してよい。

【0137】

多くの試験により、特に、肺、肝臓、腸、腎臓、皮膚、膵臓及び胸腺における複数の上皮損傷モデルにおいて、ＩＬ－２２の重要な作用が示されている。機序的には、複数の研究者による試験において、例えば、抗アポトーシス、増殖、自然免疫、抗酸化ストレス、抗線維化及び幹細胞／前駆細胞の動員におけるいくつかの経路が、ＩＬ－２２の作用を企てることが十分に実証されている。重要な機序的知見は、ヒト細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはヒトｅｘ ｖｉｖｏ モデル（例えば、ヒトの腸の初代オルガノイド）でさらに確認されている。すなわち、上皮損傷の際の細胞死の予防、再生の確保、及び炎症の制御におけるＩＬ－２２の強力な役割が、十分に確立されている。

【0138】

したがって、本発明の第５の態様によれば、治療方法で使用するための第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物を提供し、前記方法は、その誘導体を体重１ｋｇ当たり０．００１μｇ～体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの１日量で投与することを含む。このような１日量の投与は、本明細書にさらに説明されている。

【0139】

損傷させた遺伝子モデル（ＩＬ－２２のノックアウトまたはトランスジェニック過剰発現）を解析することによって、多くの試験が行われている。これらの試験では、損傷時に、ＩＬ－２２が欠損しているか、またはＩＬ－２２が過剰発現することになる。別の試験では、損傷時に、ＩＬ－２２を抗体で中和し、場合によっては、急性損傷段階を越えて（例えば、亜急性に、またはかなり再生段階に入った時点まで）ＩＬ－２２を中和する。その他の研究は、外生投与したＩＬ－２２の作用を見ることによって、治療シナリオにより近づいている。利用可能な文献で総合的に見ると、それぞれに異なるモデルにおいて、ノックアウト、過剰発現、損傷前もしくは損傷後のＩＬ－２２の中和またはタンパク質の外生投与にかかわらず、ＩＬ－２２が、損傷器官を保護して、再生を促すという同じ状況が表されていることに留意するのが重要である。これにより、ＩＬ－２２の治療潜在力の広範な用途及び広範なタイムウィンドウが示され、ｈＩＬ－２２よりも長時間作用するＩＬ－２２タンパク質がなぜ必要とされるのかも示されている。

【0140】

したがって、本発明の第６の態様によれば、代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓、ＣＮＳまたは皮膚の疾患、障害または病状を治療する方法で使用するための第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物を提供する。本発明で説明または想定されている様々なＩＬ－２２誘導体のいずれも、本発明のこの態様に明示的に含まれる。

【0141】

その代謝性の疾患、障害または病状は、肥満症、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高血糖症または高インスリン血症であってよい。

【0142】

その肝臓の疾患、障害または病状は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、ＡＣＬＦ、アセトアミノフェン誘発性肝臓毒性、急性肝損傷、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変、または手術もしくは移植を原因とする病理学的状態であってよい。

【0143】

その肺の疾患、障害または病状は、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、化学損傷、ウイルス感染、細菌感染または真菌感染であってよい。

【0144】

その消化管の疾患、障害または病状は、ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＧｖＨＤ、化学損傷、ウイルス感染または細菌感染であってよい。

【0145】

その腎臓の疾患、障害または病状は、急性腎臓病または慢性腎臓病であってよい。

【0146】

そのＣＮＳの疾患、障害または病状は、多発性硬化症であってよい。

【0147】

その皮膚の疾患、障害または病状は、創傷、炎症性疾患またはＧｖＨＤであってよい。

【0148】

ＩＬ－２２誘導体またはその誘導体を含む医薬組成物で、ＩＬ－２２による治療に応答する病状、例えば、上記の疾患、障害または病状の１つ以上を有する対象を治療する方法も提供する。

【0149】

そのＩＬ－２２誘導体は、本発明の第１の態様について定められた特徴のすべてを有する。その医薬組成物は、本発明の第３の態様について定められた特徴のすべてを有する。ＩＬ－２２による治療に応答する病状、例えば、上記の疾患、障害または病状の１つ以上を有する対象を治療する方法は、本発明の第４の態様について定められた特徴のすべてを有する。

【0150】

本明細書に記載されているようなＩＬ－２２誘導体または組成物のどれを、どの患者に投与すべきかに関する制限はない。むしろ、本明細書に記載されている誘導体及び組成物のいずれも、本明細書に記載されているようないずれの患者にも投与できることが意図されている。

【0151】

本明細書（いずれの添付の特許請求、要約及び図面を含む）に記載されている特徴のすべて、及び／または本明細書で開示されているいずれの方法もしくはプロセスの工程のすべては、上記態様のいずれと、いずれの組み合わせでも組み合わせてよく、ただし、このような特徴及び／または工程の少なくともいくつかが相反する組み合わせを除く。

【0152】

本発明をさらに深く理解するために、また、本発明の実施形態を実施し得る方法を示すために、以下では、実施例について述べるが、実施例は、いかなる場合も、本発明を限定するようには意図されていない。

【実施例】

【0153】

実施例に記載されている試験で用いた材料及び方法は、別段に示されていない限り、以下のとおりであった。

【0154】

誘導体及び比較薬
表４には、データセットで表された、ＩＬ－２２誘導体及び比較薬の大要が示されている。

【0155】

そのＩＬ－２２誘導体は、主鎖及び共有結合部位がそれぞれ異なっていた。誘導体１～４のそれぞれで用いたリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃであった。そのリンカーは、残基９５Ｃまたは残基１０６Ｃに結合していた。

【0156】

比較薬には、ｈＩＬ－２２及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２（組み換え融合タンパク質）が含まれる。また、比較薬として含まれるのは、様々な主鎖、様々な種類の脂肪酸及び様々な共有結合部位を有するｈＩＬ－２２誘導体であり、すなわち、本発明を適用し得る誘導体の多様性を表している。比較薬７（－７Ｃ）、９（－７Ｃ）、１３（６Ｃ）及び１４（３３Ｃ）を除くすべての場合において、そのリンカーは、残基１Ｃに結合させた。比較薬１２は、１Ｃでの共有結合を例示するものであるが、１Ｃで共有結合された脂肪酸を有する他の誘導体の大半に存在するＧ－Ｐ－ＧというＮ末端ペプチドを欠損している。

【表4-1】

【表4-2】

【0157】

以下は、プロトコールの例示であり、特許請求されている発明を例示するように意図されているに過ぎない。実施例のために作製したような比較薬６～９及び１１の品質管理解析は、以下のように行った。

【0158】

１ｍｇ／ｍｌの試料を２０μｌ、Ｎ－グリコシダーゼＦ ２μｌに室温で４８時間加えることによって、糖鎖除去後の試料で、タンパク質のインタクト質量を求めた。続いて、その試料をｐＨ７．４のＰＢＳで０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、Ｗａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１を用いたＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２に接続したＳｙｎａｐｔ Ｇ２を用いて解析した。Ａ：水中０．１％のギ酸及びＢ：アセトニトリル／０．０９％ギ酸という移動相（複数可）とともに、１０－９０ Ｃｏｌｕｍｎ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４（１．７μｍ、１×１００ｍｍ）を使用した。流量は１２０μｌ／分とし、ＵＶは２１４ｎｍ（２０ｐｔｓ／秒）とし、グラジエントは表５に示されているとおりであった。

【表5】

【0159】

結果は、表６に示されている。

【表6】

【0160】

すなわち、品質管理データによって、意図した比較薬が実際に作製されたことが確認された。

【0161】

以下は、プロトコールの例示であり、特許請求されている発明を例示するように意図されているに過ぎない。当業者には分かるように、これらの試験で用いた動物及び時間経過の正確な数字は変動し得る。

【0162】

実施例１－Ｃ９５またはＣ１０６の修飾を有するＩＬ－２２誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
方法
レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ、及びＳＴＡＴ３で誘導されるプロモーターを有するルシフェラーゼをトリプルトランスフェクションしたＢＨＫ細胞において効力を試験した。この試験は、感度が高いハイスループットなアッセイであり、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化を測定した。

【0163】

（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）内のｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）内のＩＬ２２Ｒ及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０内の２ｘＫＺｄｅｌ２というプラスミドを用いて、安定なレポーターＢＨＫ細胞株を作製した。すなわち、その細胞株により、ｐＳＴＡＴ３駆動性のプロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現させた。

【0164】

アッセイプロトコールの０日目に、その細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、ブラック、クリアボトム）において、基礎培地（５００ｍｌの場合：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、アルブミンを含む）（５０ｍｌ）及び１％（ｗ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍｌ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、そのプレートを反転させることによって、培地を除去した。新しい基礎培地を１ウェル当たり５０μｌ加え、その細胞を６０分インキュベートした。

【0165】

そのＩＬ－２２誘導体を比較薬としてのｈＩＬ－２２とともに、ｄｕｐｌｉｃａｔｅで試験した。

【0166】

すなわち、各ウェルに、希釈した誘導体または比較薬（基礎培地で希釈）を５０μｌ加え、そのプレートを４時間静置した。すなわち、すでにウェルにおいて５０μｌの培地中で希釈されていたので、その誘導体及び比較薬は２倍希釈されていた。Ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ ｐｌｕｓ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を１００μｌ加えることによって、その刺激を４時間後に終了した。そのプレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密閉し、４５０ｒｐｍで１５分振とうしてから、１２時間後以内に、Ｍｉｔｈｒａｓまたは類似のシステムを用いて読み取った。

【0167】

Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、データ解析を行った。それぞれの誘導体または比較薬の半最大効果濃度（ＥＣ_５０）をその効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、ｌｏｇ（化合物）と応答との対比（可変勾配（４ｐ））を用いて求めた。曲線の傾きは、標準物質を１とした。

【0168】

結果
表７には、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化について、ＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイで測定した誘導体及び比較薬のＥＣ_５０が示されている。

【表7】

【0169】

そのＢＨＫ細胞アッセイは、大量のアルブミンを含んでいたので、これらの誘導体を試験した時には、ＥＣ_５０測定値には、アルブミンの結合の影響が組み込まれていた。

【0170】

アルブミンが存在するＢＨＫ細胞アッセイでは、誘導体１は、効力がｈＩＬ－２２と比べて３分の１に低下し、誘導体２は、効力がｈＩＬ－２２と比べて５分の１に低下した。

【0171】

結論
その培地中にアルブミンを有するＢＨＫ細胞アッセイでは、誘導体１及び誘導体２では、効力がｈＩＬ－２２と比べて３分の１または５分の１に低下した。それに比べて、上記のように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより、ＩＬ－２２のＦｃ融合体については、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力が３４分の１に低下したことが報告されている。

【0172】

すなわち、ＩＬ－２２誘導体は、アルブミンの存在下でも、効力がｈＩＬ－２２と同程度である。Ｃｙｓ置換及びＧｌｎ置換、ならびに脂肪酸の共有結合は、異なる位置でも許容される。実際、本発明者は、天然のアミノ酸をＣｙｓに置換することで、９５番目及び１０６番目の残基へコンジュゲーションしても、ＩＬ－２２タンパク質の活性に対する影響が最小限であるので、これらの残基が、特に魅力的なコンジュゲーション部位とみなされることを示した。その天然のアミノ酸は、Ｒ９５及びＬ１０６である。

【0173】

すなわち、データにより、本発明の誘導体は、バイオアベイラビリティ及び効力に優れるので、代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓、ＣＮＳ及び皮膚の疾患、障害及び病状を含む広範な適応症に対する新規かつ改善型の治療が得られることが示されている。

【0174】

実施例２－ジ脂肪酸を含む比較薬の薬物動態試験
方法
マウス（ｎ＝２７）、ラット（ｎ＝４～８）及びミニブタ（ｎ＝２～５）において、ｈＩＬ－２２及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２を含め、所定の比較薬で薬物動態試験を行った。

【0175】

（ｉ）マウス及びラット
８週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを３０匹と、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを５匹、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。そのマウスを１０匹からなる群で飼育した。動物は、実験の前に、１週間馴化した。投与前に、体重を測定した。これは、薬物動態の計算のために重要である。これらの動物は、実験の全体にわたって覚醒させていたとともに、餌及び水を自由摂取させた。

【0176】

いずれの比較薬も、マウス用には、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．３ｍｇ／ｍｌの溶液として、ラット用には０．５ｍｇ／ｍｌの溶液として調製した。マウスでは、２．０ｍｇ／ｋｇの用量を試験した。ラットでは、１ｍｇ／ｋｇの用量を試験した。

【0177】

その比較薬は、これらの動物に皮下投与した。投与後、所定の時点に、血液試料を採取した。

【0178】

マウスでは、スパースサンプリングを利用し、すなわち、２７匹のマウスに比較薬を投与し、血液試料を３匹の異なるマウスから、５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間、１６時間、２４時間、３２時間及び４８時間という時点のそれぞれに採取した。したがって、それぞれのマウスは、試験過程において採取した試料が２個に過ぎなかった。最後の試料を採取後、マウスは、頸椎脱臼によって安楽死させた。

【0179】

５匹のラットに比較薬を投与し、３つの血液試料を５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間という時点のそれぞれに採取した。それぞれのラットは、試験過程において採取した試料が１７個であった。最後の試料を採取後、ラットは、二酸化炭素によって安楽死させた。

【0180】

血液試料（１００μｌ）は、マウス及びラットから舌の血液によって採取し、ＥＤＴＡチューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＶｅｔＭｅｄ ２００ Ｋ３Ｅ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ番号０９．１２９３．１００）に移した。採取から２０分以内に、その血液を５分、８０００Ｇ、４℃で遠心分離した。その血漿試料（４０～５０μｌ）をＭｉｃｒｏｎｉｃのハーフチューブに移した。

【0181】

（ｉｉ）ミニブタ
体重がおよそ１５ｋｇである９カ月齢の雌のＧｏｔｔｉｎｇｅｎ系ミニブタをＥｌｌｅｇａａｒｄ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｉｇｓ Ａ／Ｓから入手した。手術（カテーテル挿入）前に、馴化期間をおよそ１８日置き、その期間中には、カテーテルからの皮下投与及び血液サンプル採取に備えて、ミニブタの社会化及びしつけを行った。手術の３～５日前には、ミニブタを単独で飼育した。投与の６日前には、すべてのミニブタに、中心静脈カテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃ－ＴＰＮＳ－６．５－９０－ＲＥＤＯ、シリコン、サイズ６．５フレンチ、長さ１０６ｃｍのタイプのＴＰＮ）が２本挿入されており、手術後、少なくとも５日間の回復時間を置いてから、試験（投与）を開始した。

【0182】

いずれの比較薬も、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の溶液として調製した。使用した用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ（静脈内投与）または０．２ｍｇ／ｋｇ（皮下投与）であった。

【0183】

ミニブタは、投与中、プロポフォールで軽度に麻酔した。静脈内注射は、ミニブタに、長中心カテーテルを通じて行った。投与後、カテーテルを１０ｍｌの滅菌生理食塩水でフラッシュした。皮下注射は、２５Ｇのニードルを用いて、深さ５ｍｍで行った。ニードルは、注射後、皮膚内に１０秒保持して、逆流を回避した。

【0184】

血液試料をそのミニブタから、静脈内投与の１．５時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、２４時間後、２８時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１４４時間後、１６８時間後、１９２時間後、２１６時間後、２４０時間後、２６４時間後、３１２時間後、３３６時間後、３６０時間後、３８４時間後、４０８時間後、４３２時間後及び４８０時間後という時点に採取した。血液試料を皮下投与からは１．５時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、４６時間後、５２時間後、７２時間後、９６時間後、１４４時間後、１６８時間後、１９２時間後、２１６時間後、２４０時間後、２６４時間後、３１２時間後、３３６時間後、３６０時間後、３８４時間後、４０８時間後、４３２時間後及び４８０時間後という時点に採取した。

【0185】

血液試料（１ｍｌ）は、ミニブタからＥＤＴＡチューブ（血液１ｍｌ当たり１．６ｍｇのＫ３ＥＤＴＡを得るために、Ｋ３ＥＤＴＡの入った１．３ｍｌチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に採取した。試料は、湿った氷の上で、最長で３０分、遠心分離（１０分、４℃、２０００Ｇ）されるまで保持した。比較薬の測定に備えて、２００μｌの血漿をＭｉｃｒｏｎｉｃチューブに移し、解析するまで、－２０℃で保存した。

【0186】

（ｉｉｉ）試料の処理
以前に説明されているように（Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ，２００７，１２（２）：２４０－７）、自社開発の発光酸素チャネリング（ＬＯＣＩ（登録商標））アッセイを用いて、比較薬の血漿中レベルを測定した。このアッセイの際には、濃度依存性のビーズ－アナライト免疫複合体を作製することで、光を出力させ、その光をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎというリーダーで測定した。抗体のビーズへのカップリング、抗体のビオチン化及びＬＯＣＩアッセイ手順は、以前に説明されているようにして行った（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ，２０１０，５１（１）：２１７－２４）。キャリブレーター及び品質管理（ＱＣ）試料を試験試料と同じマトリックスで作製した。アッセイ精度（ＣＶ（％））を評価したところ、すべての試験試料において、２０％未満であることが示された。

【0187】

アッセイでは、抗ヒトＩＬ－２２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ７８２２）コンジュゲートアクセプタービーズを、ビオチン化モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＭ７８２１、ヒトＩＬ－２２に対して作製）及び一般的なストレプトアビジンコートドナービーズとともに使用した。ラット血漿中のヒトＩＬ－２２の定量下限未満（ＬＬＯＱ）は、４ｐＭであった。しかしながら、それぞれの比較薬は、同じ比較薬のキャリブレーター群に対して測定した。それぞれの比較薬のｈＩＬ－２２に対する交差反応性を測定し、それを用いて、アッセイ感度を調整した。

【0188】

Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ）で、ノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を用いて、ミニブタについて、血漿中濃度－時間のプロファイルを測定した。個々の濃度を用いるとともに、１／（Ｙ×Ｙ）によって重み付けして、線形対数台形を用いて計算を行った。循環排泄半減期（Ｔ_１／２）は、第１のスクリーニングパラメーターであったので、静脈内投与を用いた。クリアランス及び分布体積は、対象とする第２のパラメーターであり、試験１日目に頻繁に血液試料を採取する理由であった。

【0189】

マウス及びラットにおいて、薬物動態を評価する目的で測定した唯一のパラメーターは、循環排泄半減期（Ｔ_１／２）であった。ミニブタでは、測定した追加のパラメーターは、薬物投与後の最高（ピーク）血漿中濃度（Ｃ_ｍａｘ）、Ｃ_ｍａｘに達するまでの時間（Ｔ_ｍａｘ）、血漿中薬物濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ、ある用量の薬物を投与後の実際の薬物生体暴露を反映する）を薬物用量について正規化したもの（ＡＵＣ／Ｄ）、平均滞留時間（ＭＲＴ、すなわち、薬物が、吸収の完了から排泄まで、体内に滞留する時間）、平均吸収時間（ＭＡＴ）及び投与量の全身アベイラビリティ（すなわちバイオアベイラビリティ、Ｆ）であった。ＭＡＴは、皮下投与後のＭＲＴ（ＭＲＴ_ＳＣ）から、静脈内投与後のＭＲＴ（ＭＲＴ_ＩＶ）を減じた値として計算されている。

【0190】

結果
表８には、マウスで得られた結果が示されており、表９には、ラットで得られた結果が示されており、表１０及び１１には、ミニブタで得られた結果が示されている。ＮＤは、未決定である。ＩＶは、静脈内投与である。ＳＣは、皮下投与である。

【表8】

【0191】

表８に示されているように、主鎖バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較薬１及び３）は、投与経路にかかわらず、循環半減期が短かった。Ｆｃの融合による保護（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）により、半減期が大幅に延長された。脂肪酸の共有結合（Ｃ１８のジ酸、比較薬６及び１１）により、マウスでは、循環半減期が中程度となった。それらの比較薬は、マウスでは、皮下投与した時に、静脈内投与と比べて循環期間が長くなった。

【0192】

上記から、ｈＩＬ－２２のＲ９５Ｃ位またはＬ１０６Ｃ位で、Ｃ１８のジ酸がＣｙｓに共有結合されていると、マウスにおいて、循環半減期が同様に中程度となることは明らかである。すなわち、誘導体１、２、３または４のように、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を含む誘導体においても、同様の結果が予想される。

【表9】

【0193】

表９に示されているように、主鎖バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較薬１）は、循環半減期が短かった。脂肪酸の共有結合（比較薬６、８及び１１）により、ラットでは、用いた脂肪酸（Ｃ１６のジ酸に対してＣ１８のジ酸）及び投与経路にかかわらず、循環半減期が延長された。それらの比較薬は典型的には、皮下投与した時に、静脈内投与と比べて循環期間が長くなった。

【0194】

上記から、ｈＩＬ－２２のＲ９５Ｃ位またはＬ１０６Ｃ位で、Ｃ１６またはＣ１８のジ酸がＣｙｓに共有結合されていると、ラットにおいて、循環半減期が同様に中程度となるとともに、皮下投与すると、静脈内投与と比べて循環時間が延長されることは明らかである。すなわち、誘導体１、２、３または４のように、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を含む誘導体についても、同様の結果が予想される。

【表10】

【0195】

表１０に示されているように、主鎖バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較薬１及び２）は、循環半減期が短く、ｈＩＬ－２２と同程度であった。比較薬であるＦｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）、及びその他の比較薬のすべて（比較薬６、１１及び１５）は、循環半減期が有意に延長された。比較薬６、１１及び１５は、ミニブタでは、静脈内投与したところ、循環半減期が５０時間を超え、比較薬であるＩＬ－２２－Ｆｃ融合体と同程度であった。

【0196】

上記から、ｈＩＬ－２２のＲ９５Ｃ位またはＬ１０６Ｃ位で、Ｃ１６またはＣ１８のジ酸がＣｙｓに共有結合されていると、ミニブタにおいて、循環半減期が同様に中程度となることは明らかである。すなわち、誘導体１、２、３または４のように、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を含む誘導体についても、同様の結果が予想される。

【表11】

【0197】

表１１に示されているように、比較薬１１では、ＭＡＴが、比較薬であるＦｃ融合体（ｈＦｃ－ＩＬ－２２）と比べて早くなることが示された。ＭＡＴは、Ｔ_ｍａｘを単に比較するよりも正確な薬物取り込み尺度である。ＭＡＴでは、Ｃ_ｍａｘの差も考慮されるからである（Ｔ_ｍａｘは、用量及びＣ_ｍａｘの両方の影響を受ける）。ミニブタとヒトとの類似性から、この試験には、マウスまたはラットではなく、ミニブタを使用した。

【0198】

結論
既知の脂肪酸アルキル化ＧＬＰ－１誘導体であるセマグルチドは、ミニブタにおいて、半減期が４６時間であり（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１５，５８（１８）：７３７０－８０）、男性では、半減期が１６０時間であり、これは、１週間に１回の投与プロファイルに相当するとともに、ピーク／トラフ比が２である。Ｆｃ融合体であるＧＬＰ－１誘導体デュラグルチドの半減期は、同程度である。

【0199】

したがって、ミニブタにおいて、比較薬６、１１及び１５によって、皮下投与した時に示された少なくとも４０時間の半減期、及び静脈内投与した時に示された５０時間超は、男性では、１週間に１回の投与プロファイルに相当するとともに、ピーク／トラフ比は２であると仮定される。

【0200】

すなわち、そのデータから、これらの比較薬により、ＩＬ－２２の循環半減期が増強され、薬物動態及び薬物動力の特性の最適化が見られるので、代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓、眼、胸腺、膵臓及び皮膚の疾患、障害及び病状を含む広範な適応症に対する新規かつ改善型の治療が得られることが示されている。

【0201】

実施例３－ジ脂肪酸を含む比較薬のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
方法
２つのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、配列番号１と比べて修飾を有するＩＬ－２２タンパク質の効力を試験した。

【0202】

第１のアッセイは、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ、及びＳＴＡＴ３で誘導されるプロモーターを有するルシフェラーゼをトリプルトランスフェクションしたＢＨＫ細胞でのレポーター遺伝子アッセイであった。この試験は、感度が高いハイスループットなアッセイであり、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化を測定した。

【0203】

（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）内のｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）内のＩＬ２２Ｒ及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０内の２ｘＫＺｄｅｌ２というプラスミドを用いて、安定なレポーターＢＨＫ細胞株を作製した。すなわち、その細胞株により、ｐＳＴＡＴ３駆動性のプロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現させた。

【0204】

アッセイプロトコールの０日目に、その細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、ブラック、クリアボトム）において、基礎培地（５００ｍｌの場合：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、アルブミンを含む）（５０ｍｌ）及び１％（ｗ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍｌ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、そのプレートを反転させることによって、培地を除去した。新しい基礎培地を１ウェル当たり５０μｌ加え、その細胞を６０分インキュベートした。

【0205】

比較薬として、ｈＩＬ－２２、及び主鎖バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアントとともに、比較薬６、８、９及び１１～１５を試験した。アッセイ実行数「ｎ」は、１～２４の範囲であった。

【0206】

すなわち、各ウェルに、比較薬（基礎培地で希釈した）を５０μｌ加え、そのプレートを４時間静置した。すなわち、すでにウェルにおいて５０μｌの培地中で希釈されていたので、その比較薬は２倍希釈されていた。Ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ ｐｌｕｓ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を１００μｌ加えることによって、その刺激を４時間後に終了した。そのプレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密閉し、４５０ｒｐｍで１５分振とうしてから、１２時間後以内に、Ｍｉｔｈｒａｓまたは類似のシステムを用いて読み取った。

【0207】

Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、データ解析を行った。それぞれの比較薬の半最大効果濃度（ＥＣ_５０）をその効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、ｌｏｇ（化合物）と応答との対比（可変勾配（４ｐ））を用いて求めた。曲線の傾きは、標準物質を１とした。

【0208】

第２のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイでは、ＩＬ－２２Ｒａ及びＩＬ－１０Ｒｂを内在的に発現するヒト肝臓由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞において、ｐＳＴＡＴ３を測定した。

【0209】

１日目に、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ ＃３５－４４０７ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、２５，０００～３０，０００細胞／ウェルで播種した。播種及び継代のために用いた細胞培地は、ＤＭＥＭ（１×）＋２５ｍＭ（４．５ｇ／ｌ）のグルコース－ピルベート（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１９６５－０２６）＋１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ＋１％（ｗ／ｖ）Ｐ／Ｓであった。２日目に、その細胞は、アッセイできる状態であった。ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１９６５－０２６）において、その細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ＦＣＳで飢餓状態にし（すなわち、アルブミン濃度が非常に低かった）、５０μｌを各ウェルに加え、６０分静置した。

【0210】

Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｅを用いて、標準物質として、７個の濃度（０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ）の各比較薬で、試験を行った。すなわち、各ウェルに、希釈した比較薬（ＤＭＥＭ中０．１％（ｗ／ｖ）のＦＣＳで希釈）を５０μｌ加え、そのプレートを１５分静置した。すなわち、すでにウェルにおいて５０μｌの培地中で希釈されていたので、その比較薬は２倍希釈されていた。その細胞を溶解させるために、培地をその細胞から除去し、新たに調製した１×溶解緩衝液（キットのＳｕｒｅＦｉｒｅ溶解緩衝液）を５０μｌ、各ウェルに加えた。そのプレートを３５０ｒｐｍで１０分、室温で攪拌した。

【0211】

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）ＳＴＡＴ３（ｐ－Ｔｙｒ７０５）のアッセイプロトコール（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号ＴＧＲＳ３Ｓ（５００－１０Ｋ－５０Ｋ））に従って、ＩＬ－２２の誘導による、ＳＴＡＴ３のリン酸化を測定した。この点では、アッセイのために、溶解液４μｌを３８４ウェルプロキシプレートに移した（ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを４μｌ加えた）。使用直前に、（活性化緩衝液を反応緩衝液で５倍に希釈すること、及びアクセプタービーズを希釈緩衝液で５０倍に希釈することによって）アクセプターミックスを調製した。アクセプターミックスを５μｌ、各ウェルに加え、そのプレートを粘着フィルムＴｏｐｓｅａｌ Ａで密閉し、２時間、室温でインキュベートした。使用直前に、（ドナービーズを希釈緩衝液で２０倍に希釈することによって）ドナーミックスを調製した。ドナーミックスを２μｌ、弱い光の下で、ウェルに加えた。そのプレートを再度、粘着フィルムＴｏｐｓｅａｌ Ａで密閉し、２時間、室温でインキュベートした。そのプレートをＡｌｐｈａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ適合性のプレートリーダーで読み取った。

【0212】

Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、データ解析を行った。第１に、ｌｏｇ（化合物）と応答との対比（可変勾配（４ｐ））解析をＰｒｉｓｍで用いて、非線形回帰を行った。曲線の傾きを１とした。続いて、Ｐｒｉｓｍにおいて、コントロール化合物（ｈＩＬ－２２）のＹ＝ｔｏｐを正規化に使用した。各データセットにおいて、０％を最小値と設定し、１００％を、（コントロールについての）上記の非線形回帰のＹ＝ｔｏｐと設定した。非線形回帰を上記のように繰り返し、試験した比較薬の重量当たりの活性率（％）は、最高値下の結果を読み取り、ＥＣ_５０は、ＥＣ_５０を読み取った。

【0213】

結果
表１２には、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化について、ＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイで測定した比較薬のＥＣ_５０が示されている。

【表12】

【0214】

そのＢＨＫ細胞アッセイは、大量のアルブミンを含んでいたので、測定されたＥＣ_５０には、それらの比較薬を試験した時に、アルブミン結合の作用が組み込まれていた。

【0215】

主鎖バリエーションのみを有するＩＬ－２２バリアントである比較薬４は、効力がｈＩＬ－２２と同等であることが示された。比較薬４と同じ主鎖を有するが、親和性が中程度であるアルブミン結合物質（Ｃ１６のジ酸）に共有結合された比較薬８は、効力が、ｈＩＬ－２２と比べて４分の１に低下した。同様に同じ主鎖を有するが、高親和性のアルブミン結合物質（Ｃ１８のジ酸）に共有結合された比較薬６は、効力が、ｈＩＬ－２２と比べて７分の１に低下した。

【0216】

これらの結果を実施例１と比べると、ＩＬ－２２タンパク質において、配列番号１内の９５位または１０６位でＣｙｓに共有結合されたジ脂肪酸の作用が、上記の比較薬６、８、９、１１、１２、１３、１４または１５で言及されている位置のいずれかで結合された同様のジ脂肪酸の作用と非常に類似していることは明らかである。実施例１のデータは、Ｃ１８のジ酸に関するものであるので、Ｃ１６のジ脂肪酸について、この実施例で示されたのと同様のＥＣ_５０値が、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換とともに、Ｃ１６のジ脂肪酸での置換を含む誘導体にも当てはまると推定できる。すなわち、誘導体１、２、３または４のように、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を含む誘導体について、同様の結果が見られるように予想される。

【0217】

比較薬１１～１４の結果を比較することによって、３５Ｑ、６４Ｑという背景（すなわち、３つのＩＬ－２２糖鎖付加部位のうちの２つが変異されている）を相殺して、アルキル化の位置及び主鎖バリエーションの精査を行った。これらの比較薬で得られた結果から、Ｃｙｓ置換及び脂肪酸の共有結合が、いくつかの（所定の）位置において許容される可能性があることが示され、これは、本発明者には驚くべきことであった。

【0218】

表１３には、ｐＳＴＡＴ３について、ＨｅｐＧ２細胞アッセイで測定した比較薬のＥＣ_５０が示されている。

【表13】

【0219】

受容体の内在発現レベルを有し、シグナル増幅がほとんど見られず、アルブミンを含まないＨｅｐＧ２細胞アッセイでは、比較薬６は、効力が、ｈＩＬ－２２と比べて２．５分の１に低下した（比較薬６と同じ主鎖を有するが、脂肪酸を有さないｈＩＬ－２２バリアントである比較薬４と同程度であった）。

【0220】

表１４には、Ｎ末端伸長部における脂肪酸の共有結合及び糖鎖付加部位の変異を評価するために、ＢＨＫ細胞アッセイ及びＨｅｐＧ２細胞アッセイの両方の結果が並列されている。ＮＤは、未決定である。

【表14】

【0221】

比較薬１１は、比較薬６とは、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑという追加の置換（３つの糖鎖付加部位のうち２つが変異している）によって異なるが、これらの効力は同程度である（比較薬１１において、効力がわずかに低下する傾向がある）。

【0222】

Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑというこれらの２つの置換の作用は、実施例１に示されているように、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃを含む誘導体における作用と同様である。すなわち、誘導体１、２、３または４のように、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を有する誘導体において、同様の結果が見られると予想される。

【0223】

比較薬７及び９は、１５量体のＮ末端伸長部とともに、その伸長部（－７Ｃ）に、脂肪酸の結合のためのＣｙｓ残基を有するが、驚くべきことに、これは、十分に許容されることが示されている。

【0224】

実施例１に示されている同様の効力データ、ならびに置換及び同様の脂肪酸結合を含む他の誘導体のＮ末端伸長部の上記評価により、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃを含む誘導体に適用したＮ末端伸長部の同様の作用を予想し得る。すなわち、誘導体１、２、３または４のように、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を含む誘導体についても、同様の結果が予想される。

【0225】

結論
試験した比較薬において、脂肪酸の共有結合により観察された、効力の低下は主に、アルブミンの結合によるものであり、主鎖置換には、原因はほとんど見られなかった。このことは、驚くべきことに、比較薬４及びｈＩＬ－２２の効力が同程度であったことによって示された。それに比べて、上記のように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより、ＩＬ－２２のＦｃ融合体については、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力が３４分の１に低下したことが報告されている。

【0226】

アルブミンレベルが非常に低いＨｅｐＧ２細胞アッセイでは、比較薬６（ＢＨＫアッセイ（アルブミンの結合が見られる）において、効力が７分の１に低下した比較薬）は、効力が、ｈＩＬ－２２と比べて２．５分の１にしか低下しなかった。

【0227】

比較薬６及び１１の効力が同程度であったことにより（表１４）、驚くべきことに、３５Ｑ及び６４Ｑという変異が、効力に影響を及ぶすことなく、許容されることが示された。

【0228】

すなわち、これらの比較薬は、アルブミンの存在下で、高い効力を維持し、アルブミンの非存在下では、ｈＩＬ－２２と効力がほぼ同等である。Ｃｙｓ置換及び脂肪酸の共有結合は、いくつかの位置で許容される。

【0229】

すなわち、データから、これらの比較薬は、バイオアベイラビリティ及び効力に優れることが示されているので、代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓及び皮膚の疾患、障害及び病状を含む広範な適応症に対する新規かつ改良型の治療が得られる。

【0230】

実施例４－糖尿病における、ジ脂肪酸を含む比較薬のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
この試験は、糖尿病マウスモデルにおいて、比較薬を１日１回、８～１６日間投与する作用を調べるために設計した。この試験は、治療（予防ではない）方式で行い、これは、投与を開始する前に、糖尿病の所見が発現したことを意味する。このマウスモデルは、脂肪肝を有する（レプチン受容体ノックアウト）ので、このモデルは、肝疾患の代謝性モデルとしても機能する。

【0231】

方法
７～８週齢の雄Ｃ５７ＢＫＳ ｄｂ／ｄｂマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手して（－１０日目）、実験の開始前に、少なくとも１週間馴化した。到着から１週間後（－３日目）、そのマウスを無作為に分け、１０匹からなる群で飼育した（または食物摂取試験のために、単独で飼育した）。－３日目、及び１～１６日目の各試験日に、血中グルコース及び食物摂取量を測定した。

【0232】

さらなる比較薬としてのＩＬ－２２のＦｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）及びネガティブコントロールとしてのビヒクルのみとともに、比較薬６を試験した。それぞれの薬剤は、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（各群におけるｎ＝６～１０）において、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇという１日１回量で、１～１６日目の各日に皮下投与した。食物摂取量は、比較薬／コントロールの投与後に低減した。

【0233】

試験期間にわたって、血中グルコースを毎日測定した。終了時に、麻酔したマウスにおいて、眼の血液試料を採取した。血液５００μｌをＥＤＴＡチューブに採取した。その試料を氷上で維持し、５分、６０００Ｇ、４℃で、２０分以内で遠心分離した。血漿を０．７５ｍｌのｍｉｃｒｏｎｉｃチューブに分離し、成分濃度を後で測定するために、直ちに凍結した。

【0234】

比較薬の濃度を測定するとともに、標的結合バイオマーカー（肝臓由来の急性期タンパク質であるハプトグロビン及び血清中アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）、ならびに消化管由来のペプチドＹＹ（ＰＹＹ））の血漿中レベルを試験の最後に測定した。ハプトグロビンは、ＣＯＢＡＳという計器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で、市販のキットによって、メーカーの指示に従って測定した。ＰＹＹは、マウスＰＹＹ及びラットＰＹＹを認識する市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＡＬＰＣＯ）によって、メーカーの指示に従って測定した。ＳＡＰは、マウスペントラキシン２／ＳＡＰを認識する市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、メーカーの指示に従って測定した。

【0235】

結果
試験期間にわたる血中グルコースレベルが、図８及び９Ａに示されている。

【0236】

図８から見ることができるように、ｈＩＬ－２２、及び主鎖バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較薬３）は、試験過程にわたって、血中グルコースが、ビヒクルコントロールと比べて低下しなかった。

【0237】

図９Ａから見ることができるように、比較薬６及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２のいずれも、血中グルコースが、正常レベルと比較して低下し、試験末期には、比較薬６の有効性がわずかに高かった。ただし、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の標的関与度の方が高く、その所定の試験では、定常状態暴露レベルが比較薬６よりも高いことが示されている。治療した動物では、ビヒクルコントロールと比べて、食物摂取量の低下が観察された（図９Ｂを参照されたい）。すなわち、比較薬６は、ｄｂ／ｄｂモデルにおいて、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と同様の形で、血中グルコースが正常化したが、上記のように、ｈＩＬ－２２または比較薬３では、そのような作用は観察されなかった。

【0238】

標的関与バイオマーカーであるハプトグロビン、ＳＡＰ及びＰＹＹのレベルは、試験の最後に測定したものが、それぞれ図１０Ａ～Ｃに示されている。それらのグラフで見ることができるように、３つのすべての標的関与バイオマーカーが、比較薬６及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によってアップレギュレートし、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２による方が、比較薬６よりもアップレギュレートした。

【0239】

図１１には、比較薬１１（２つの糖鎖付加部位での追加の置換を除き、比較薬６と同じである）の用量－応答データが示されている。試験した３つのすべての用量（０．１ｍ／ｋｇ、０．２５ｍ／ｋｇ及び０．５ｍ／ｋｇ）は、血中グルコースを時間とともに低下させ、濃度の上昇とともに、段階的に低下させるのに有効であった

【0240】

結論
ｄｂ／ｄｂモデルにおいて、試験した比較薬及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の両方とも、血中グルコースを正常化したことによって、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果が示された。重要なことに、ｈＩＬ－２２の投与では、このような作用は見られず、治療効果を得るには、長時間作用型の比較薬及びＦｃ融合体で見られた長期暴露が必要であることが示された。抗糖尿病効果の作用機序は、まだ十分には解明されていないが、ＩＬ－２２が肝臓に及ぼす作用（肝糖新生及び脂質生成）が主な寄与因子であると考えられる。

【0241】

食物摂取量も、比較薬６による治療によって低下したことが示されたので、肥満症の治療としての有効性が示された。

【0242】

標的関与バイオマーカーも、その比較薬及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によって、アップレギュレートしたことが観察された。ｄｂ／ｄｂマウスにおいて測定した特定のバイオマーカーは、男性に置き換えられることが知られている。

【0243】

皮下投与したｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の循環半減期（Ｔ_１／２）は、特にマウスにおいて、比較薬６よりも長いことに留意することが重要である（Ｔ_１／２は、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２では２０時間、比較薬６では８時間であった。表８を参照されたい）。したがって、定常状態においては、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の暴露値の方が高い。これは、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２群において、標的関与バイオマーカー（ハプトグロビン、ＳＡＰ及びＰＹＹ）が、比較薬６の群よりも高かった観察結果（図１０）によりさらに裏付けられており、示した実験においては、標的関与自体も高かったことが示されている。すなわち、１６日間の投与試験の最後の３日間には、Ｆｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）の方が、暴露量及び標的関与が高かったにもかかわらず、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の有効性は、比較薬６）よりも劣っていた。

【0244】

したがって、そのデータにより、比較薬６は、糖尿病及び肝疾患のマウスモデルにおいて、治療効力に優れることが示されている。ｄｂ／ｄｂマウスにおいて測定した特定のバイオマーカーは、男性に置き換えられることが知られているので、このような治療効力も置き換えられると予測するのが賢明である。

【0245】

実施例５－肝損傷（Ｉ）における、ジ脂肪酸を含む比較薬のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
この試験は、肝損傷マウスモデルにおいて、本発明の誘導体の比較薬を投与する作用を調べる目的で設計した。この試験は、予防形式で行い、これは、投与を開始した後に、肝損傷を誘導したに過ぎないことを意味する。

【0246】

方法
１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｒｊマウスを入手し、１週間馴化してから試験を開始した。肝損傷を単回腹腔内用量（３００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｌ／ｋｇ）のＡＰＡＰで誘導した。ビヒクルコントロールとともに、比較薬６及び１１を１．５ｍｇ／ｋｇで２時間皮下投与してから、ＡＰＡＰを投与した（ｎ＝５～１０）。この試験は、ＡＰＡＰの投与から２４時間後に終了させた。血漿中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の測定に備えて、確実に放血死を行った。

【0247】

血液試料をヘパリン処理チューブに採取し、血漿を分離し、解析まで－８０℃で保存した。ＡＬＴ及びＡＳＴは、市販のキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、自動分析装置ＣＯＢＡＳ ｃ５０１で、メーカーの指示に従って測定した。

【0248】

組織学的解析に備えて、肝臓をホルマリンで固定して、パラフィン包埋を行った。

【0249】

ｋｉ６７の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を介して、増殖を測定した。ＶＩＳというソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、ＩＨＣ陽性染色を画像解析によって定量した。

【0250】

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端ラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイで、アポトーシスを測定した。簡潔に述べると、パラフィン包埋した切片を含むスライドをキシレンで脱パラフィンし、一連の段階的なエタノールで再水和した。そのスライドをプロテイナーゼＫで前処理し、内在性ペルオキシダーゼ活性を過酸化水素でブロックした。ＴＵＮＥＬ混合物（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰＯＤ、Ｒｏｃｈｅ）をそのスライドに加えてから、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によって増幅し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（色原体）によって可視化した。最後に、そのスライドをヘマトキシリンで対比染色し、カバースリップを載せた。

【0251】

結果
試験終了時のＡＬＴの血漿中レベルは図１２Ａに、ＡＳＴの血漿中レベルは図１２Ｂに示されている。肝損傷前に、比較薬６または１１で処置したマウスにおいて、ビヒクル／ＡＰＡＰコントロールと比べて、ＡＬＴ及びＡＳＴの量が有意に減少したことが示された。

【0252】

試験終了時のＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は図１３Ａに、ｋｉ６７陽性細胞の数は図１３Ｂに示されている。肝損傷の前に、比較薬６または１１で処置したマウスにおいて、ビヒクル／ＡＰＡＰコントロールと比べて、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の量は（有意に）減少した。ｋｉ６７陽性細胞の量は、ＡＰＡＰ処置群にわたって同等であった。

【0253】

結論
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝障害の指標として用いられている肝臓酵素である。したがって、比較薬６及び１１は、ＡＰＡＰによって誘導される損傷から肝臓を保護することが示された。同様の効力及び半減期を明らかにした大量のデータに基づき、本明細書に開示されている誘導体に、同様の作用を予測できる。

【0254】

ＴＵＮＥＬアッセイの結果により、比較薬６及び１１が、ビヒクル／ＡＰＡＰコントロールと比べて、肝損傷を原因とするアポトーシスから保護したことが示された。しかしながら、細胞増殖には、これらの比較薬による影響は及ぼなかった。（コントロールで見られるように、）損傷に対する応答として、増殖が生理学的にアップレギュレートするので、結果により、比較薬６及び１１の増殖作用が示されている。損傷の低減の後に、増殖の減少が続かない（損傷に対する増殖の比率が上昇する）からである。

【0255】

したがって、データにより、その比較薬は、マウスモデルにおいて、肝損傷から保護する有効性に優れることが示されている。マウスにおいて測定した特定のバイオマーカーは、男性に置き換えられることが知られているので、観察された保護機能も置き換えられると予測するのが賢明である。

【0256】

実施例６－肺損傷における、ジ脂肪酸を含む比較薬のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
この試験は、肺損傷ラットモデルにおいて、本発明の誘導体の比較薬を投与する作用を調べる目的で設計した。この試験は、予防形式及び治療形式の両方で行い、これは、肺損傷を誘導する前に投与を開始し、その後も継続したことを意味する。

【0257】

方法
肺損傷を誘導するために、ブレオマイシンを１００μｌ、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの肺に、口腔咽頭吸引によって単回用量として１日目に投与した（群２～６）。生理食塩水をネガティブコントロールとして投与した（群１）。

【0258】

群３、４及び５のラットに、比較薬１１を－１日目に０．５ｍｇ／ｋｇ、２日目に１．５ｍｇ／ｋｇまたは３日目に４．５ｍｇ／ｋｇで、１日１回、（皮下注射によって）投与した。群６のラットには、－１日目から３日目に、（強制経口投与によって）１日１回、プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇで投与した。

【0259】

そのラットから得た気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の可溶性コラーゲンを測定するために、加えたプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む滅菌ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で肺を洗浄し（３×４ｍｌ）、その洗浄液を１匹のラットごとに１本のチューブに入れた。可溶性コラーゲンは、Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ Ｓｉｒｃｏｌ Ｓ１０００（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＢＡＬＦ上清で測定した。

【0260】

４日目に、すべてのラットを検死に出した（安楽死）。組織病理検査のために、すべてのラットから右肺を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で膨張固定してから、ＮＢＦで浸漬固定した。平行な長手方向の切片を３枚、右肺後葉からトリミングし、カセット０１にマウントした。右肺の前葉、中葉及び副葉も、長手方向に切片化し、カセット０２にマウントした。

【0261】

それぞれのカセットから２枚のスライドを作製し、一方のスライドは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、もう一方は、ヘマトキシリン及びピクロシリウスレッド（Ｈ＆ＰＳＲ）で染色した。

【0262】

続いて、乱数発生器を用いて、それぞれのスライドに無作為な数字を割り当てた。識別キーをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに記録し、スライド評価後に、コピーを試験の病理担当者に提供した。すなわち、肺ごとに６枚の切片を盲検的に読み取った。

【0263】

続いて、動物病理担当者が、それぞれのＨ＆Ｅ染色スライドで、それぞれの切片を炎症の重症度についてスコア化した（０＝なし、１＝最小限、２＝軽度、３＝中程度及び４＝重度）。群ごとのスコアの平均及び中央値を計算した。病理担当者は、それぞれのＨ＆ＰＳＲ染色スライドで、それぞれの切片を線維化の重症度についても、（改良型のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを用いて０＝低～８＝高まで）スコア化した。群ごとのスコアの平均及び中央値を計算し、ノンパラメトリックなＡＮＯＶＡであるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓの事後検定解析を行った。

【0264】

結果
その顕微鏡所見の概要が表１５に示されており、この表では、それぞれの群の炎症及び線維化に関するスコアの平均及び中央値が明らかにされている。

【表15】

【0265】

表１５の１及び２を比較することによって立証されるように、ブレオマイシンは、そのラットモデルにおいて、肺の炎症及び線維化の両方を誘導した。スコアの平均及び中央値は、群３～５、すなわち、比較薬１１で治療したラットで低めであった。これらの低めのスコアは、プレドニゾロンで治療したラット（群６）で見られたスコアと同程度であった。

【0266】

この試験におけるそれぞれのラットの炎症スコアの中央値は図１４Ａに、線維化スコアの中央値は図１４Ｂにも示されている。

【0267】

図１４Ａに示されているように、ブレオマイシン／ビヒクルコントロール（群２）において、その群の炎症スコアの中央値は、ネガティブコントロール（群１）と比べて上昇した。比較薬１１で治療したラット及びプレドニゾロンで治療したラット（群６）において、その群の炎症スコアの中央値は、ブレオマイシン／ビヒクルコントロールと比べて低下した（用量の高い群５においても、有意に低下した）。

【0268】

図１４Ｂに示されているように、ブレオマイシン／ビヒクルコントロール（群２）において、その群の線維化スコアの中央値は、ネガティブコントロール（群１）と比べて上昇した。しかしながら、比較薬１１で治療したラットにおいて、群の線維化スコアの中央値は、ブレオマイシン／ビヒクルコントロールと比べて低下した（用量の高い群５においても、有意に低下した）が、コントロールであるプレドニゾロンと比べると、低下しなかった。

【0269】

図１４Ｃに示されているように、ブレオマイシン／ビヒクルコントロール（群２）において、ブレオマイシンの誘導による肺損傷後のＢＡＬＦ中の可溶性コラーゲンの量は、ネガティブコントロール（群１）と比べて増加し、この量は、プレドニゾロンによる治療（群６）によって減少しなかった。しかしながら、比較薬１１で治療したラットから得たＢＡＬＦでは、ブレオマイシン／ビヒクルコントロールと比べて、可溶性コラーゲンの量の有意な低下が、（試験したすべての用量にわたって）観察された。ＢＡＬＦ中の可溶性コラーゲンは、線維化のリードアウトであるので、これらの結果により、上で即座に記録した組織構造データが確認される。

【0270】

結論
この顕微鏡的試験の結果により、本発明の誘導体の比較薬が、ラットモデルにおいて、ブレオマイシンの誘導による、肺の炎症及び線維化を予防及び／または低減できることが示された。炎症に関して見られた作用は、肺炎症の治療用と知られている副腎皮質ステロイドであるプレドニゾロンで観察された作用と同程度であった。しかしながら、その比較薬では、線維化に対する特有の作用が見られたが、プレドニゾロンでは見られなかった。同様の効力及び半減期を明らかにした大量のデータに基づき、本発明の誘導体に、同様の作用を予測できる。

【0271】

実施例７－大腸炎における、ジ脂肪酸を含む比較薬のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
この試験は、大腸炎マウスモデルにおいて、本発明の誘導体の比較薬を投与する作用を調べる目的で設計した。この試験は、予防形式及び治療形式の両方で行い、これは、大腸の炎症を誘導した日と同じ日に投与を開始し、その後も継続したことを意味する。

【0272】

方法
飼料を与えた雌Ｃ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウスを、体重に基づき５群（１群当たりｎ＝８）に無作為に分けた。５群のうち４群で、ＤＳＳを用いて、大腸炎を誘導した。これらのマウスに、ＤＳＳを飲料水中で７日間、試験０日目から６日目まで投与した。第５の群では、マウスに、ＤＳＳを含まない水を与え、すなわち、健常コントロールとして機能させた。試験０日目から、ＤＳＳマウスをビヒクル、比較薬１１（０．３５ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与）または比較薬としてのＩＬ－２２－Ｆｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２、０．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与）で１日１回、１０日間処置した。体重、餌及び水の摂取量を毎日モニタリングした。

【0273】

試験１０日目には、血液試料をマウスからＥＤＴＡチューブに採取し、血漿を分離し、解析まで－８０℃で保存した。メーカーの指示に従ってＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ）を用いて、再生膵島由来タンパク質３γ（Ｒｅｇ３ｇ）をｄｕｐｌｉｃａｔｅで測定した。Ｒｅｇ３ｇは、ＩＬ－２２の標的関与マーカーである。

【0274】

終了時に、立体学的解析のために、腸を取り出した。したがって、その消化管を氷冷生理食塩水でフラッシュし、その内容物を静かに除去してから、サンプリングを行った。

【0275】

その腸をホルマリンに一晩浸透させ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＶＩＰ）、その後、パラフィンブロックに包埋した。続いて、系統均一ランダムサンプリング（ＳＵＲＳ）の原理を用いて、ホルマリンで固定したその腸を近位方向から遠位方向にサンプリングし、その結果、合わせて４つのスラブを得て、マルチカセットに配置した。いずれの組織スラブも、後の段階で個々のスラブの識別が可能であるように配置した。そのパラフィンブロックをトリミングし、最上部５μｍを切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ＋対物ガラスにマウントした。大腸では、別の切片を最上部から５００μｍの距離で切断し、それにより、それぞれのマウスから、合わせて８枚の大腸切片が得られた。

【0276】

すなわち、大腸の二次元断面の三次元解釈を用いて、大腸炎症の体積を立体学的に測定した。スキャンしたＨ＆Ｅ染色スライドで、ｎｅｗＣＡＳＴのシステム（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ）を用いて、体積の立体学的な推定を行った。適切なサイズのグリッドシステムを用いたポイント計数によって、消化管の合計体積、粘膜の体積、粘膜下層及び筋層の体積、ならびに炎症を起こした組織の体積を推定し、その際、対象となる構造に当たったすべてのポイントを計数した。対象となる構造に当たったポイントの数は、下記の数学的な関係に従って、体積に変換した。

【0277】

【数1】

式中、Ａ（ｐ）は、ポイント当たりの面積であり、ｐは、対象となる構造に当たったポイントの総数であり、ｔは、切片間の距離である。１群当たりの炎症体積の平均を計算し、統計解析を行った。

【0278】

Ｈ＆Ｅ染色スライドを見ることによって、大腸の形態も終了時に評価した。

【0279】

結果
大腸炎症の体積は、図１５に示されている。比較薬１１で治療したマウスでは、いずれの用量でも、ビヒクルコントロール（この場合も、ＤＳＳを含む）と比べて、炎症が予防されたことが示された。とりわけ、炎症は、比較薬１１で治療した群では、その処置群において、大腸炎症の体積が、健常コントロール（ＤＳＳを含まないビヒクル）と同じであったことによって立証されたように、正常レベルに留まった。このことは、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２で処置した群にも当てはまった。

【0280】

終了時の大腸の形態の代表的なＨ＆Ｅ染色画像が、図１６に示されている。ビヒクル処置マウス（黒色の矢印でマーキングされている）では、ＤＳＳによる処置後、粘膜上皮の創傷を見ることができるが、いずれかの用量の比較薬１１またはｈＦｃ－ｈＩＬ－２２で治療したマウスでは見られなかった。これにより、上皮組織での保護作用が示されている。

【0281】

血漿中Ｒｅｇ３ｇレベルは、図１７に示されている。ＤＳＳによる処置により、Ｒｅｇ３ｇの基底レベルの上昇が誘導された（ビヒクルと、ＤＳＳを含まないビヒクルを比較する）。さらなる上昇は、低用量（０．３５ｍｇ／ｋｇ）の比較薬１１群では検出不能であったが、高用量（１ｍｇ／ｋｇ）の比較薬１１群及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２群では見られた。ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２（０．５ｍｇ／ｋｇ）群において、比較薬１１（１ｍｇ／ｋｇ）群と比べて、Ｒｅｇ３ｇレベルが高かったことにより、この比較薬１１群よりも低い用量にもかかわらず、標的関与が大きかったことが示され、これは、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２のマウスにおける半減期の延長に関連する可能性が高かった（半減期は、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２では３０時間であったのに対して、比較薬１１では９．１時間であった）。

【0282】

結論
すなわち、データにより、本発明の誘導体の比較薬は、マウスモデルにおいて、大腸炎及び粘膜上皮の創傷から保護する有効性に優れることが示されている。これにより、消化管の疾患、障害及び病状に対する新規かつ改良型の治療が見出されたことが示されている。特に、これらの知見により、炎症性腸疾患など、粘膜上皮の損傷を特徴とする疾患を治療できる可能性が示されている。同様の効力及び半減期を明らかにした大量のデータに基づき、本発明の誘導体に、同様の作用を予測できる。

【0283】

実施例８－肝損傷（ＩＩ）における、ジ脂肪酸を含む比較薬のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
この試験は、第２の肝損傷マウスモデル（第１のモデルは、実施例５で上記されている）において、本発明の誘導体の比較薬を投与する作用を調べる目的で設計した。この試験は、予防形式で行い、これは、投与を開始した後に、肝損傷を誘導したに過ぎないことを意味する。

【0284】

方法
雄Ｃ５７Ｂｌ６／６ｊマウスを５つの群（１群当たりｎ＝８）に分けた。この５つの群のうちの２群で、ＣｏｎＡによる処置に対して－２６時間及び－２時間に、比較薬６を１ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。別の２群には、これらの時点にビヒクルのみを投与した。４つのすべての群に、ＣｏｎＡを静脈内ボーラスとして、３０秒の期間にわたって、１５ｍｇ／ｋｇの用量で与えて、肝損傷を誘導した。第５の群には、健常コントロールとして、ＣｏｎＡを与えなかった（上記のように、ビヒクルのみ）。

【0285】

ＣｏｎＡの注射から８時間後または２４時間後に、それらのマウスをイソフルランによる麻酔下に置き、（凝固活性化剤を含む血清用ポリプロピレンゲルチューブを用いて）最大容量の血液を心臓穿刺によって採取した。処置を行わなかったマウス（群５）を８時間の時点に殺処分した。そのチューブを数回反転させることによって、その血液を各チューブ内の凝固活性化剤と混合した。そのチューブを１５分、室温で保持してから、２０００ｇで１０分、４℃で遠心分離した。自動システム（Ｋｏｎｅｌａｂ ２０）をメーカーの指示に従って用いて、その血清試料中で、ＡＬＴ及びＡＳＴを測定した。

【0286】

結果
試験終了時のＡＬＴの血漿中レベルは図１８Ａに、ＡＳＴの血漿中レベルは図１８Ｂに示されている。ＡＬＴ及びＡＳＴの量は、肝損傷の前に、比較薬６で処置したマウスにおいて、ビヒクル／ＣｏｎＡコントロールと比べて、試験した両方の時点で減少したことが示された。

【0287】

結論
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝障害の指標として用いられている肝臓酵素である。したがって、比較薬６は、実施例５で、ＡＰＡＰによって誘導される損傷から保護するのと同様に、ＣｏｎＡによって誘導される損傷から、肝臓を保護することが示された。マウスにおいて測定した特定のバイオマーカーは、男性に置き換えられることが知られているので、観察された保護機能も置き換えられると予測するのが賢明である。同様の効力及び半減期を明らかにした大量のデータに基づき、本明細書に開示されている他の誘導体に、同様の作用を予測できる。

【0288】

実施例９－モノ脂肪酸を含む比較薬のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
方法
レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ、及びＳＴＡＴ３で誘導されるプロモーターを有するルシフェラーゼをトリプルトランスフェクションしたＢＨＫ細胞において効力を試験した。この試験は、感度が高いハイスループットなアッセイであり、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化を測定した。

【0289】

（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）内のｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）内のＩＬ２２Ｒ及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０内の２ｘＫＺｄｅｌ２というプラスミドを用いて、安定なレポーターＢＨＫ細胞株を作製した。すなわち、その細胞株により、ｐＳＴＡＴ３駆動性のプロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現させた。

【0290】

アッセイプロトコールの０日目に、その細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、ブラック、クリアボトム）において、基礎培地（５００ｍｌの場合：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、アルブミンを含む）（５０ｍｌ）及び１％（ｗ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍｌ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、そのプレートを反転させることによって、培地を除去した。新しい基礎培地を１ウェル当たり５０μｌ加え、その細胞を６０分インキュベートした。

【0291】

さらに比較薬としてのｈＩＬ－２２とともに、比較薬１６をｄｕｐｌｉｃａｔｅで試験した。

【0292】

すなわち、各ウェルに、希釈した比較薬（基礎培地で希釈）を５０μｌ加え、そのプレートを４時間静置した。すなわち、すでにウェルにおいて５０μｌの培地中で希釈されていたので、その比較薬は２倍希釈されていた。Ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ ｐｌｕｓ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を１００μｌ加えることによって、その刺激を４時間後に終了した。そのプレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密閉し、４５０ｒｐｍで１５分振とうしてから、１２時間後以内に、Ｍｉｔｈｒａｓまたは類似のシステムを用いて読み取った。

【0293】

Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、データ解析を行った。その比較薬の半最大効果濃度（ＥＣ_５０）を効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、ｌｏｇ（化合物）と応答との対比（可変勾配（４ｐ））を用いて求めた。曲線の傾きは、標準物質を１とした。

【0294】

結果
表１６には、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化について、ＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイで測定した比較薬のＥＣ_５０が示されている。「ｎ」は、個々のアッセイ実行数を示す。いずれのアッセイ実施操作も、同じ条件下で行ったが、別個の個別の実験は、別々の日に行った。

【表16】

【0295】

そのＢＨＫ細胞アッセイは、大量のアルブミンを含んでいたので、測定されたＥＣ_５０には、比較薬１６を試験した時に、アルブミン結合の作用が組み込まれていた。

【0296】

主鎖バリエーション及び共有結合されたＣ１６のモノ酸を有する比較薬１６は、ｈＩＬ－２２と同等の効力があることが示された。

【0297】

結論
驚くべきことに、比較薬１６とｈＩＬ－２２の効力が同等であったことが観察された。それに比べて、上記のように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより、ＩＬ－２２のＦｃ融合体については、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力が３４分の１に低下したことが報告されている。

【0298】

したがって、比較薬は、アルブミンの存在下において、高い効力を維持する。Ｃｙｓ置換、Ｎ末端のトリペプチド伸長部及びモノ脂肪酸の共有結合は、十分に許容されるのが明らかである。

【0299】

すなわち、データから、比較薬１６は、バイオアベイラビリティ及び効力に優れることが示されているので、代謝性、肝臓、肺、消化管、腎臓、ＣＮＳ及び皮膚の疾患、障害及び病状を含む広範な適応症に対する新規かつ改良型の治療が得られる。

【0300】

実施例１０－モノ脂肪酸を含む比較薬及びジ脂肪酸を含む比較薬の平均滞留時間及び効力の試験
方法
以下には、２つの方法が記載されている。第１の方法は、平均滞留時間（ＭＲＴ）を求める目的で、ラットにおいて、所定の比較薬１、６、８、１０及び１６で行った薬物動態試験に関するものである。第２の方法は、同じ比較薬のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＣ_５０（ｎＭ）を求めるための効力アッセイに関するものである。

【0301】

ラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ＭＲＴの測定
４匹のラットに、比較薬を投与し、３つの血液試料を５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間という時点のそれぞれに採取した。それぞれのラットは、試験過程において採取した試料が１７個であった。最後の試料を採取後、ラットは、二酸化炭素によって安楽死させた。

【0302】

血液試料（１００μｌ）は、ラットから舌の血液によって採取し、ＥＤＴＡチューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＶｅｔＭｅｄ ２００ Ｋ３Ｅ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ番号０９．１２９３．１００）に移した。採取から２０分以内に、その血液を５分、８０００Ｇ、４℃で遠心分離した。その血漿試料（４０～５０μｌ）をＭｉｃｒｏｎｉｃのハーフチューブに移した。

【0303】

以前に説明されているように（Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ，２００７，１２（２）：２４０－７）、自社開発の発光酸素チャネリング（ＬＯＣＩ（登録商標））アッセイを用いて、比較薬の血漿中レベルを測定した。このアッセイの際には、濃度依存性のビーズ－アナライト免疫複合体を作製することで、光を出力させ、その光をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎというリーダーで測定した。抗体のビーズへのカップリング、抗体のビオチン化及びＬＯＣＩ（登録商標）アッセイ手順は、以前に説明されているようにして行った（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ，２０１０，５１（１）：２１７－２４）。キャリブレーター及び品質管理（ＱＣ）試料を試験試料と同じマトリックスで作製した。アッセイ精度（ＣＶ（％））を評価したところ、すべての試験試料において、２０％未満であることが示された。

【0304】

アッセイでは、抗ヒトＩＬ－２２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ７８２２）コンジュゲートアクセプタービーズを、ビオチン化モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＭ７８２１、ヒトＩＬ－２２に対して作製）及び一般的なストレプトアビジンコートドナービーズとともに使用した。ラット血漿中のヒトＩＬ－２２の定量下限未満（ＬＬＯＱ）は、４ｐＭであった。しかしながら、それぞれの比較薬は、同じ比較薬のキャリブレーター群に対して測定した。それぞれの比較薬のｈＩＬ－２２に対する交差反応性を測定し、それを用いて、アッセイ感度を調整した。

【0305】

Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ）を用いて、ＭＲＴ（すなわち、薬物が、吸収の完了から排泄まで、体内に滞留する時間）を含む薬物動態パラメーターを計算した。

【0306】

ＢＨＫ細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＣ_５０（ｎＭ）の測定
ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ、及びＳＴＡＴ３で誘導されるプロモーターを有するルシフェラーゼをトリプルトランスフェクションしたＢＨＫ細胞でのレポーター遺伝子アッセイを使用した。この試験は、感度が高いハイスループットなアッセイであり、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化を測定した。

【0307】

（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）内のｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）内のＩＬ２２Ｒ及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０内の２ｘＫＺｄｅｌ２というプラスミドを用いて、安定なレポーターＢＨＫ細胞株を作製した。すなわち、その細胞株により、ｐＳＴＡＴ３駆動性のプロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現させた。

【0308】

アッセイプロトコールの０日目に、その細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、ブラック、クリアボトム）において、基礎培地（５００ｍｌの場合：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、アルブミンを含む）（５０ｍｌ）及び１％（ｗ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍｌ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、そのプレートを反転させることによって、培地を除去した。新しい基礎培地を１ウェル当たり５０μｌ加え、その細胞を６０分インキュベートした。

【0309】

比較薬１、１６、１０、８及び６を試験した。アッセイ実行数「ｎ」は、１～２４の範囲であった。

【0310】

すなわち、各ウェルに、比較薬（基礎培地で希釈した）を５０μｌ加え、そのプレートを４時間静置した。すなわち、すでにウェルにおいて５０μｌの培地中で希釈されていたので、その比較薬は２倍希釈されていた。Ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ ｐｌｕｓ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を１００μｌ加えることによって、その刺激を４時間後に終了した。そのプレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密閉し、４５０ｒｐｍで１５分振とうしてから、１２時間後以内に、Ｍｉｔｈｒａｓまたは類似のシステムを用いて読み取った。

【0311】

Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、データ解析を行った。それぞれの比較薬の半最大効果濃度（ＥＣ_５０）をその効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、ｌｏｇ（化合物）と応答との対比（可変勾配（４ｐ））を用いて求めた。曲線の傾きは、標準物質を１とした。

【0312】

結果
試験した比較薬のラットでの平均滞留時間及びｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＣ_５０は、表１７に示されている。「ｎ」は、独立した日におけるアッセイ反復数を表す。

【表17】

【0313】

データにより、配列番号１と比べてＡ１Ｇという修飾を含むｈＩＬ－２２型の比較薬１に対して、同じ主鎖に結合された脂肪酸を、モノ酸からジ酸に変更したところ、平均滞留時間が延長されたことが示されている（比較薬１６及び比較薬８のデータを比較する）。そのジ酸の長さを長くしたところ、平均滞留時間も延長された（比較薬８及び６のデータを比較する）。

【0314】

データによって、モノ酸の結合により、結合させなかった場合と比べて、平均滞留時間が延長されたが、ジ酸を結合した場合とは明らかに対照的なことに、ｈＩＬ－２２と比べた効力には、悪影響は及ぼなかったことも示された（比較薬１６及び比較薬８のデータを比較する）。

【0315】

結論
ラットで測定した平均滞留時間を用いて、この比較試験により、ジ脂肪酸鎖の長さを長くした効果は、半減期の延長であったとともに、野生型様のヒトＩＬ－２２（比較薬１）と比較した効力低下は、許容される程度であったことが確認された。同様の結果は、ミニブタによる試験でも見られた（実施例２を参照されたい）。ミニブタで測定した場合の半減期（実施例２）により、Ｃ１８のジ脂肪酸は、ＩＬ－２２の伸長部として用いたＦｃ融合体と同様に半減期が延長される一方で、Ｃ１６のジ脂肪酸は、この両方よりも半減期が短縮し、これらのいずれも、野生型ヒトＩＬ－２２よりもかなり長いことが示された。

【0316】

ラットにおけるこの最新のデータセットで、モノ脂肪酸の結合により、確かに、平均滞留時間が、同じ長さのジ脂肪酸と比べて短縮することを我々は示した（比較薬１６及び比較薬８を比較する）。同時に、モノ脂肪酸による脂質化を含む誘導体は、ＩＬ－２２の野生型様である比較薬１と同じ半減期を維持するうえに、平均滞留時間を、比較薬１と比べて少なくとも４倍延長することが示されている。

【0317】

本明細書に示されているｉｎ ｖｉｖｏでの実施例では、効力低下と半減期延長との間のバランスにより、生体作用が依然として得られ、本発明の誘導体が、薬剤開発及び疾患治療のための候補薬に適するものとなることも我々は示した。

【0318】

モノ脂肪酸の結合及び長さとジ脂肪酸の結合及び長さとのこれらの比較データにより、所望の投与、または治療すべき疾患もしくは状態に応じて、試験したすべての脂肪酸の結合が確実に、様々な薬剤開発の目的に適うという結論を我々は得る。すなわち、ＩＬ－２２タンパク質の伸長手段としてモノ脂肪酸を使用するのに最適なのは、伸長作用が望まれるが、ジ酸及びＦｃ融合体よりも短い循環時間が望まれる状況であるであろう。

【0319】

Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという置換を含む誘導体においては、例えばＮ３５Ｑ及び／またはＮ６４Ｑのような追加の修飾の有無にかかわらず、ジ脂肪酸またはモノ脂肪酸のコンジュゲーションが平均滞留時間及び効力に及ぼす同様の作用が予想され、このような誘導体は、本明細書では、誘導体１、２、３または４として例示されている。

【0320】

実施例１１－Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃという修飾を有する比較薬のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
方法
これらの実験は、異なるラボで行ったので、実施例１には含まれていない。用いたアッセイは同じであったが、設備及び試料の取り扱いが、その実験から得られた値に影響を及ぼし得ることは、当業者には明らかであろう。

【0321】

レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ、及びＳＴＡＴ３で誘導されるプロモーターを有するルシフェラーゼをトリプルトランスフェクションしたＢＨＫ細胞において効力を試験した。この試験は、感度が高いハイスループットなアッセイであり、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化を測定した。

【0322】

（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）内のｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）内のＩＬ２２Ｒ及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０内の２ｘＫＺｄｅｌ２というプラスミドを用いて、安定なレポーターＢＨＫ細胞株を作製した。すなわち、その細胞株により、ｐＳＴＡＴ３駆動性のプロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現させた。

【0323】

アッセイプロトコールの０日目に、その細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、ブラック、クリアボトム）において、基礎培地（５００ｍｌの場合：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、アルブミンを含む）（５０ｍｌ）及び１％（ｗ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍｌ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、そのプレートを反転させることによって、培地を除去した。新しい基礎培地を１ウェル当たり５０μｌ加え、その細胞を６０分インキュベートした。

【0324】

誘導体３及び誘導体４をさらなる比較薬としてのｈＩＬ－２２とともに、ｄｕｐｌｉｃａｔｅで試験した。

【0325】

すなわち、各ウェルに、希釈した比較薬（基礎培地で希釈）を５０μｌ加え、そのプレートを４時間静置した。すなわち、すでにウェルにおいて５０μｌの培地中で希釈されていたので、その比較薬は２倍希釈されていた。Ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ ｐｌｕｓ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を１００μｌ加えることによって、その刺激を４時間後に終了した。そのプレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密閉し、４５０ｒｐｍで１５分振とうしてから、１２時間後以内に、Ｍｉｔｈｒａｓまたは類似のシステムを用いて読み取った。

【0326】

Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、データ解析を行った。それぞれの比較薬の半最大効果濃度（ＥＣ_５０）をその効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、ｌｏｇ（化合物）と応答との対比（可変勾配（４ｐ））を用いて求めた。曲線の傾きは、標準物質を１とした。

【0327】

結果
表１８には、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化について、ＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイで測定した比較薬のＥＣ_５０が示されている。

【表18】

【0328】

そのＢＨＫ細胞アッセイは、大量のアルブミンを含んでいたので、測定されたＥＣ_５０には、それらの比較薬を試験した時に、アルブミン結合の作用が組み込まれていた。

【0329】

アルブミンが存在するＢＨＫ細胞アッセイでは、誘導体３は、効力がｈＩＬ－２２と比べて３分の１に低下し、誘導体４は、効力がｈＩＬ－２２と比べて１１分の１に低下した。

【0330】

結論
その培地中にアルブミンを有するＢＨＫ細胞アッセイでは、誘導体４では、効力がｈＩＬ－２２と比べて１１分の１に、誘導体３では、３倍分の１に低下したに過ぎなかった。それに比べて、上記のように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより、ＩＬ－２２のＦｃ融合体については、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力が３４分の１に低下したことが報告されている。

【0331】

実施例１２－Ｃ１６のモノ酸がコンジュゲーションされた比較薬１７のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
方法
その方法は、実施例１１に記載されているアッセイに従って実施し、同じ実験設定で実施した。

【0332】

これらの実験は、異なるラボで行ったので、その結果は、表７には含まれていない。用いたアッセイ、細胞株及びプロトコールは同じであったが、設備及び試料の取り扱いが、その実験から得られた値に影響を及ぼし得ることは、当業者には明らかであろう。

【0333】

比較薬１７をさらなる比較薬としてのｈＩＬ－２２とともに、ｄｕｐｌｉｃａｔｅで試験した。

【0334】

結果
表１９には、ＩＬ－２２受容体の媒介による、ＳＴＡＴ３の活性化について、ＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイで測定した比較薬のＥＣ_５０が示されている。

【表19】

【0335】

そのＢＨＫ細胞アッセイは、大量のアルブミンを含んでいたので、その誘導体を試験した時には、ＥＣ_５０測定値には、アルブミンの結合の影響が組み込まれていた。

【0336】

アルブミンが存在するＢＨＫ細胞アッセイでは、比較薬１７は、効力がｈＩＬ－２２と比べて低下しなかった。

【0337】

結論
その培地中にアルブミンを有するＢＨＫ細胞アッセイでは、比較薬１７は、効力の低下がｈＩＬ－２２と比べて見られなかった。それに比べて、上記のように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより、ＩＬ－２２のＦｃ融合体については、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力が３４分の１に低下したことが報告されている。これにより、特許請求する誘導体は、Ｇ－Ｐ－Ｇという伸長部をＮ末端に含むことができるが、生体作用のためには、厳密には必須ではないことが確認される。

【0338】

本明細書において、本発明の特定の特徴を例示及び説明してきたが、当業者は、多くの修正物及び均等物を思いつくであろう。したがって、請求項は、このようなすべての修正形態及び均等物を、本発明の真の趣旨の範囲内に入るものとして網羅するように意図されていることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【配列表】

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【国際調査報告】