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特表2024-517333ＭＰＲＯプロテアーゼ及びＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２複製の阻害剤としてのエタクリン酸誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-19
(54)【発明の名称】ＭＰＲＯプロテアーゼ及びＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２複製の阻害剤としてのエタクリン酸誘導体
(51)【国際特許分類】
C07D 209/08 20060101AFI20240412BHJP
A61K 31/404 20060101ALI20240412BHJP
C07D 231/56 20060101ALI20240412BHJP
A61K 31/416 20060101ALI20240412BHJP
A61K 31/16 20060101ALI20240412BHJP
C07D 211/58 20060101ALI20240412BHJP
A61K 31/445 20060101ALI20240412BHJP
C07D 295/205 20060101ALI20240412BHJP
A61K 31/495 20060101ALI20240412BHJP
C07D 471/04 20060101ALI20240412BHJP
A61K 31/437 20060101ALI20240412BHJP
C07D 235/08 20060101ALI20240412BHJP
A61K 31/4184 20060101ALI20240412BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240412BHJP
【ＦＩ】
C07D209/08 CSP
A61K31/404
C07D231/56
A61K31/416
A61K31/16
C07D211/58
A61K31/445
C07D295/205
A61K31/495
C07D471/04 106Z
A61K31/437
C07D235/08
A61K31/4184
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023570086
(86)(22)【出願日】2022-05-10
(85)【翻訳文提出日】2024-01-09
(86)【国際出願番号】 MA2022000005
(87)【国際公開番号】W WO2022240277
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】53521
(32)【優先日】2021-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】MA
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523426677
【氏名又は名称】ウニベルシテ・ユーロ－メディテラネエンヌ・ドゥ・フェス
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】エル・カッズーリ，サイード
(72)【発明者】
【氏名】トゥイユ，ナディア
(72)【発明者】
【氏名】エル・ファヒメ，エルモスタファ
(72)【発明者】
【氏名】エル・アッブーシ，アブデルムーラ
(72)【発明者】
【氏名】ヘムラリ，ムフシン
(72)【発明者】
【氏名】エル・ブラーミ，ナビル
(72)【発明者】
【氏名】エル・アラウイ，アブデラジズ
(72)【発明者】
【氏名】ブヌー，サリム
(72)【発明者】
【氏名】ブースミナ，モスタファ
【テーマコード（参考）】
4C065
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C065AA04
4C065BB05
4C065CC01
4C065DD03
4C065EE02
4C065HH01
4C065JJ01
4C065KK01
4C065KK09
4C065LL01
4C065PP03
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC13
4C086BC21
4C086BC37
4C086BC39
4C086BC50
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB33
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA03
4C206GA23
4C206HA21
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZB33
(57)【要約】
本発明は、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の新規化合物、薬物としての、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の処置のための、ＣＯＶＩＤ－１９病、及びβ－コロナウイルスに関連するあらゆる疾患の処置のための、並びにＭｐｒｏプロテアーゼとの相互作用を研究するためのそのインビトロ適用のための、その使用に関する。本発明はまた、有効成分として少なくとも１つの式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含む医薬組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式（Ｉ）及び（ＩＩ）を有することを特徴とする化合物であって：【化1】
Ｗ及びＺが同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシル又はアミンを表し、好ましくはＷが水素又は塩素原子であり、Ｚが塩素、フッ素、臭素原子又はヒドロキシルであり；
Ｖ、Ｘ及びＹが同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、炭素、窒素、酸素又は硫黄原子を表し、好ましくはＶ及びＸが窒素原子であり、Ｙが炭素又は窒素原子であり、
Ｕが、炭素原子、又は６員芳香環の前記炭素原子を置換した１つ以上の窒素原子であり、好ましくはＵが炭素原子又は１つ若しくは２つの窒素原子であり、
ｎ及びｎ’が、同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含み得る、アルキル、ヒドロキシ、パーフルオロアルキル、アルキルチオ、アミノアルキル及びアルコキシ鎖の長さを表し
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が、同一でも異なっていてもよく、互いに独立して、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はアミンを表し、前記アルキル、ヒドロキシ、パーフルオロアルキル、アルキルチオ、アミノアルキル及びアルコキシ基が、１～１０個の炭素原子を含み得る、化合物。
【請求項2】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物として、特に以下が言及され得る：以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）アセトアミド：
【化2】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド：
【化3】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－４－イル）アセトアミド：
【化4】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－５－イル）アセトアミド：
【化5】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－６－イル）アセトアミド：
【化6】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド：
【化7】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－６－イル）アセトアミド：
【化8】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）アセトアミド：
【化9】
以下の式の１－（４－（２－（１Ｈ－インダゾール－１－イル）－２－オキソエトキシ）－２，３－ジクロロフェニル）－２－メチレンブタン－１－オン：
【化10】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド：
【化11】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－６－イル）アセトアミド：
【化12】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－７－イル）アセトアミド：
【化13】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド：
【化14】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル５－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド）－１Ｈ－インダゾール－１－カルボキシレート：
【化15】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－（プロパ－２－イン－１－イル）－１Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド：
【化16】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド）エチル）－カルバメート：
【化17】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル（１－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセチル）ピペリジン－４－イル）カルバメート：
【化18】
以下の式のＮ－（２－クロロエチル）－２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド：
【化19】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセチル）ピペラジン－１－カルボキシレート：
【化20】
以下の式のＮ－ブチル－２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド：
【化21】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－５－イル）メチル）アセトアミド：
【化22】
以下の式の１－（２，３－ジクロロ－４－（２－（５－メチル－１Ｈ－インダゾール－１－イル）－２－オキソエトキシ）フェニル）－２－メチレンブタン－１－オン：
【化23】
以下の式の１－（２，３－ジクロロ－４－（２－オキソ－２－（１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｂ］ピリジン－１－イル）エトキシ）フェニル）－２－メチレンブタン－１－オン：
【化24】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－５－イル）アセトアミド：
【化25】
【請求項3】
薬物として適用するための、請求項１又は請求項２に記載の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物。
【請求項4】
ＣＯＶＩＤ－１９疾患の治療用の薬物として適用するための、請求項３に記載の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物。
【請求項5】
β－コロナウイルスによって引き起こされる病状の治療用の薬物として適用するための、請求項３に記載の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物。
【請求項6】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を阻害するためにインビトロで適用するための、請求項３に記載の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物。
【請求項7】
Ｍｐｒｏプロテアーゼを阻害するためにインビトロで適用するための、請求項３に記載の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物。
【請求項8】
研究ツールとしての、特にＭｐｒｏプロテアーゼの活性部位と相互作用することができる分子の同定のための、請求項３に記載の標識された式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の使用。
【請求項9】
医薬組成物において有効成分として使用するための、請求項１、２及び３に記載の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物。
【請求項10】
医薬組成物において他の薬物と組み合わせて使用するための、請求項１、２及び３に記載の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
いくつかのコロナウイルスは、風邪から、より重篤な疾患、例えば中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）にまで及ぶ呼吸器感染症を引き起こし得る。ＣＯＶＩＤ－１９疾患又は重症急性呼吸器症候群は、コロナウイルス科のウイルスによっても引き起こされる。このウイルスは、中国湖北省武漢で最初に発見され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と名付けられた［Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０２０，３８２，７２７－７３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０２０，３８２，１１９９－１２０７］。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの配列決定は、それがＳＡＲＳ－ＣｏＶと７９．６％同一であることを示している［Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５７９，２６５－２６９；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５７９，２７０－２７３］。
【0002】
Ｍｐｒｏプロテアーゼ（３ＣＬｐｒｏとしても知られる）は、タンパク質の産生に必要な酵素であり、次いでウイルスの発生及び複製のために重要である。このプロテアーゼは、現在、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２処置の開発のための最も有望な標的の１つであると考えられている。これには、化学組成及びＸ線回折構造が現在十分に解明されているＭｐｒｏを阻害することができる分子の発見を要するであろう［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，４０９－４１２］。この酵素は、二量体の形態で、２つの重要なアミノ酸、すなわちＨｉｓ４１及びＣｙｓ１４５の存在を特徴とする触媒部位を含む。さらに、この部位は、ウイルスの増殖に必要なアミノ酸及びタンパク質の産生に直接関与している［Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，１３３１－１３３５］（図１）。
【0003】
２００２年及び２００３年のＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの出現後、Ｍｐｒｏを阻害することができる小さな抗ウイルス分子を開発するために世界中でいくつかの研究が行われてきた。このプロテアーゼはＳＡＲＳ－ＣｏＶにも存在し、その構造は昨年ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で発見されたものと比較してあまり変化していないことに留意されたい［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，４０９－４１２］）。また、Ｍｐｒｏはヒトにおいてホモログを有さず、それが抗ウイルス薬の開発の主要な標的であることの別の理由であることにも留意すべきである［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１６，１２，ｅ１００５５３１；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌ．２００５，３，ｅ３２４］。さらに、Ｍｐｒｏは、いくつかのβ－コロナウイルス（ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）において保存され、これにより、目下の疾患だけでなく、他の形態のβ－コロナウイルスによって引き起こされる他の健康危機の事象における将来の疾患の処置の開発も企図することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０２０，３８２，７２７－７３
【非特許文献2】Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０２０，３８２，１１９９－１２０７
【非特許文献3】Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５７９，２６５－２６９
【非特許文献4】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５７９，２７０－２７３
【非特許文献5】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，４０９－４１２
【非特許文献6】Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，１３３１－１３３５
【発明の概要】
【0005】
２０１９年末に健康危機が始まって以来、小分子によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍｐｒｏプロテアーゼの阻害に関する非常に興味深い研究が、非常に有名な学術誌に発表されている［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５８２，２８９－２９３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，４０９－４１２；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，１３３１－１３５；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２０，２７，５２９－５３２］。これらの種々の研究の分析に続いて、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の設計及び開発のためのいくつかの重大かつ重要な情報を以下のセクションに要約する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】Ｍｐｒｏの三次元構造を、９０°回転させた２つの異なる概観で示す。この図はまた、Ｈｉｓ４１（青色ボール）及びＣｙｓ１４５（黄色ボール）から構成される触媒部位の位置、並びに酵素の二量体としての構造を示す。
【図2】Ｍｐｒｏ活性部位とリガンド（活性物質）との間の結合表面の表示を含む。この最近の研究のおかげで、Ｄａｉ、Ｚｈａｎｇ、Ｊｉａｎｇ及びＳｕのチームは、２つの分子、１１ａ及び１１ｂ（図２）を提供し、各々は、Ｃｙｓ１４５、シクロヘキシル又は３－フルオロフェニルと共有結合してポケットＳ２を占有するアルデヒド、及びポケットＳ４と水素結合するためのインドールを含む［Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０，３６８，１３３１－１３３５］。化合物１１ａ及び１１ｂのＩＣ５０（半数阻害濃度）は、それぞれ０．０５３及び０．０４０μＭである。
【図3】生成物Ｎ３及びエブセレンの構造を示す。
【図4】カルモフール及びＭｐｒｏの活性部位間の相互作用モードを示す。
【図5】化合物ＧＲＬ－１７２０及び５ｈのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス活性、並びにＭｐｒｏプロテアーゼと複合体化した化合物５ｈのＸ線回析による構造を示す。
【図6】合成及び試験された化合物の構造を示す。
【図7】化合物の構造及びＭｐｒｏとのそれらの結合モードを示す。
【図8】細胞変性効果の例示を示す。
【図9】異なる濃度での分子Ｐ７、Ｐ２６及びＰ３０の感染力価の低下率を示す。
【図10】分子Ｐ７、Ｐ２６及びＰ３０による感染力価の低下率を示す。
【図11】リガンドＰ７とＭｐｒｏの活性部位のａａとの相互作用の例示を示す。
【図12】ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２上の、遺伝子ＲｄＲＰ、遺伝子Ｎ、及び遺伝子ＥのＲＴ－ＰＣＲを示す。
【図13】３つの化合物、Ｐ７、Ｐ２６、Ｐ３０のＩＣ５０値を示す。
【図14】活性部位での位置及び配向の、ドッキング解析結果を示す。
【図15】リガンドとＭＰＲＯの活性部位のａａと間で確立された、各結合タイプのデータを示す。
【図16】式Ｉ及びＩＩの化合物の合成スキームを示す。
【0007】
ペプチド模倣化合物Ｎ３（図３）とＭｐｒｏとの間の相互作用の機構に基づいて、Ｊｉａｎｇ、Ｒａｏ及びＹａｎｇは、コンピュータ支援薬物設計を使用して阻害剤を特定し、次いで化合物Ｎ３と複合体化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍｐｒｏの結晶構造を決定した。ハイスループットバーチャルスクリーニングによって、承認された薬物、臨床試験中の薬物候補、及び他の生物学的に活性な化合物を含む、１０，０００を超える化合物が分析された。この研究の結果として、６つの化合物が、０．６７～２１．４μＭの範囲のＩＣ５０値でＭｐｒｏを阻害することが見出された。これら６つの化合物のうちの１つであるエブセレンも、細胞レベルで有望な抗ウイルス活性を示した（図３）［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５８２，２８９－２９３］。
【0008】
別の研究では、Ｚｈａｎｇ及びＹａｎｇのチームは、Ｘ線構造によって、Ｍｐｒｏとカルモフールとの間の相互作用モードを強調することができた（カルモフールは１９８０年から結腸直腸癌の処置に使用されている［Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００５，３５，５３６－５４４］）。この化合物は、触媒部位、すなわちＣｙｓ１４５と共有結合を確立し、一方、アルキル（疎水性）部分はポケットＳ２を占有する（図４）［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２０，２７，５２９－５３２］（図３）。カルモフールの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性（ＩＣ５０＝１．８２μＭ）は、１０，０００個の化合物のスクリーニング後に同じチームによって初めて明らかにされた［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０２０，５８２，２８９－２９３］。
【0009】
ごく最近、Ｍｐｒｏ阻害剤として、ＧＲＬ－１７２０及び５ｈと呼ばれる２つの新しい分子がＭｉｔｓｕｙａ及び同僚によって開発された。ＶｅｒｏＥ６細胞に関する細胞ベースの研究及びｑＰＣＲによるＲＮＡ複製を使用して、研究者らは、両化合物が、ＧＲＬ－１７２０及び５ｈについてそれぞれ１５±４及び４．２±０．７μＭのＥＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻止することを示した。Ｘ線回折分析によるさらなる研究は、活性部位のいくつかのアミノ酸残基との極性相互作用によって、化合物５ｈがＭｐｒｏとの共有結合を他の結合と同様に形成することを示した（図５）［Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０２１，１２：６６８］。
【0010】
またごく最近になって、Ｒｕｔ、Ｄｒａｇ及び同僚らは、天然及び非天然アミノ酸の混合物からの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の擬似ペプチド阻害剤の設計及び合成を発表した（図６）。最良の分子Ａｃ－ＱＳＳ－ＶＳ（１５）（Ａｃ－Ａｂｕ－ｄＴｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＶＳ）は、３．７μＭのＥＣ５０を有する。さらに、Ｂ－ＱＳ１－ＶＳ（１３）と呼ばれる別の分子（Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ（４）－Ａｂｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＶＳ）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭｐｒｏと複合体化させることにより結晶構造を得た。合成された化合物の蛍光のおかげで、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に罹患している患者の鼻咽頭上皮細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍｐｒｏの活性部位と、阻害剤との相互作用を監視した［Ｒｕｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０２１，１７，２２２－２２８］。
【0011】
最近の多数の努力にもかかわらず、ＣＯＶＩＤ－１９を処置する治療法は未だに存在しない。Ｍｐｒｏの結晶構造の決定（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５８２，２８９－２９３）の後、公表された研究のほとんどは、より迅速に進行し、いくつかの前臨床段階を回避するために、Ｍｐｒｏの活性部位と、既に市販されているか、又は臨床開発中のいくつかの生物活性化合物（抗ウイルス剤、抗癌剤など）との間の相互作用を研究する分子モデリングに関連する（Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０２０，１０，１２４９３；Ｂｏｌｃａｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０２０，１０，２０９２７）。例えば、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０２０，５８２，２８９－２９３）によって公表された結晶構造に基づいて、分子モデリングによって研究された化合物の大部分は、ペプチド模倣体Ｎ３の作用を模倣することによってＭｐｒｏ活性部位の阻害を標的とし（図７）、その作用機構は、Ｃｙｓ１４５と共有結合することができる求電子性化学基（マイケルアクセプター）を含む（図７Ａ）。例えば、Ｗ．Ｃｕｉ、Ｋ．Ｙａｎｇ及びＨ．Ｙａｎｇによって報告された論文において、分子モデリングによるカルモフール（図７Ｂ）の研究は、カルモフールのカルボン酸官能基が１．８Å共有結合によってＣｙｓ１４５の硫黄原子に結合している一方で、脂肪酸テールがポケットＳ２に挿入されていることを示している。カルモフール分子全体は、多数の水素結合及び疎水性相互作用によって安定化される。対照的に、阻害剤Ｎ３（図７Ａ）は、異なる機構を介して挿入され、チオールのビニル基へのマイケル付加によってＣｙｓ１４５と共有結合を形成する。一方ではＭｐｒｏとペプチド模倣体α－ケトアミドＧＣ－３７６及び１３ｂとの間の結合様式（図１Ｃ及び図１Ｄ）、他方ではＭｐｒｏとアルデヒド１１ａとの間の結合様式（図１Ｅ）について、モデリング研究はまた、これらの化合物のカルボニル基がＣｙｓ１４５に共有結合していることを示した。一方、これらの同じ化合物上に存在する他の基は、プロテアーゼの部位Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４を占め、疎水性及び水素相互作用を確立する（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，２０２０，７，６１６３４１）。
【0012】
本発明者らは、特に調製の単純性のために、実際の需要によりよく適合する新しい抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２化合物及びＭｐｒｏ（又は３ＣＬｐｒｏ）プロテアーゼ阻害剤を設計及び調製した。これらの化合物は、ヒト治療に使用される可能性があり得る。
【0013】
この目的は、以下に記載され、本発明の第１の目的である式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物によって達成され、これらの化合物は強力な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＭｐｒｏ阻害剤である。さらに、化合物は、一般に２～４工程で容易に調製される。式（Ｉ）及び（ＩＩ）の全ての化合物は、文献で周知の非常に単純な化学反応を用いて非常に簡便に得られる。
【0014】
本発明は、以下の式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物に関する。
【0015】
【化1】
－Ｗ及びＺは、同一でも異なっていてもよく、互いに独立して、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシル又はアミンを表し、好ましくはＷは水素又は塩素原子であり、Ｚは塩素、フッ素、臭素原子又はヒドロキシであり、
－Ｖ、Ｘ及びＹは、同一でも異なっていてもよく、互いに独立して、炭素、窒素、酸素又は硫黄原子を表し、好ましくはＶ及びＸは窒素原子であり、Ｙは炭素又は窒素原子である。
－Ｕは、炭素原子、又は６員芳香環の炭素原子を置換する１つ以上の窒素原子であり、好ましくはＵは、炭素原子又は１つ若しくは２つの窒素原子である。
－ｎ及びｎ’は、同一でも異なっていてもよく、互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含んでいてもよいアルキル、ヒドロキシ、パーフルオロアルキル、アルキルチオ、アミノアルキル及びアルコキシ鎖の長さを表す。
－Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一でも異なっていてもよく、互いに独立して、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はアミンを表し、前記アルキル、ヒドロキシ、パーフルオロアルキル、アルキルチオ、アミノアルキル及びアルコキシ基は、１～１０個の炭素原子を含んでいてもよい。
【0016】
本発明の目的のための用語：
－アルキル：１～１０個の炭素、好ましくは１～２個の炭素原子を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の炭化水素脂肪族基を指す。用語「分岐」は、メチル又はエチルなどの少なくとも１つの低級アルキル基が直鎖アルキル鎖（高級アルキル）によって担持されていることを意味する。用語「低級」アルキルは、１又は２個の炭素原子を有するアルキルを指し、用語「高級」アルキルは、３～１０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基を指す。例として、アルキル基には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ブチル及びｎ－ペンチルが含まれる。
－ハロゲン原子：臭素、塩素、ヨウ素又はフッ素原子を示し、臭素、塩素及びフッ素が好ましい指定である。
－パーフルオロアルキル：全ての水素原子がフッ素原子で置換されている、以下に定義されるアルキル基を示す。パーフルオロアルキル基の中でも、トリフルオロメチル基、パーフルオロエチル基が好ましい。
－アルコキシ：アルキル基が上記と同じ意味を有し得るＯ－アルキル基を示す。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ及びペントキシ基に言及することができる。
－アルキルチオ：アルキル基が上記と同じ意味を有し得るＳ－アルキル基を示す。アルキルチオ基の例として、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ及びペンチルアミノ基に言及することができる。
－アミノアルキル：アルキル基が上記と同じ意味を有し得るＮ－アルキル基を示す。アミノアルキル基の例として、アミノメチル、アミノエチル、イソ－プロピルアミノ、ブチルアミノ及びペンチルアミノ基に言及することができる。
－アリール：４～６個の炭素、好ましくは５～６個の炭素原子を有する不飽和環状芳香族炭化水素基を示す。
－ヘテロアリール：１個以上の炭素原子が窒素、酸素又は硫黄原子で置換されている上記に定義されるアリールを示す。ヘテロアリール基の例として、ピリジン、ピリミジン、チオフェン、フラン、イミダゾール、ピロール及びトリアゾール基に言及することができる。
－アルキル：１～１０個の炭素、好ましくは１～２個の炭素原子を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の炭化水素脂肪族基を指す。用語「分岐」は、メチル又はエチルなどの少なくとも１つの低級アルキル基が直鎖アルキル鎖（高級アルキル）によって担持されていることを意味する。用語「低級」アルキルは、１又は２個の炭素原子を有するアルキルを指し、用語「高級」アルキルは、３～１０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基を指す。例として、アルキル基には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ブチル及びｎ－ペンチルが含まれる。
－ハロゲン原子：臭素、塩素、ヨウ素又はフッ素原子を示し、臭素、塩素及びフッ素が好ましい指定である。
－パーフルオロアルキル：全ての水素原子がフッ素原子で置換されている、以下に定義されるアルキル基を示す。パーフルオロアルキル基の中でも、トリフルオロメチル基、パーフルオロエチル基が好ましい。
－アルコキシ：アルキル基が上記と同じ意味を有し得るＯ－アルキル基を示す。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ及びペントキシ基に言及することができる。
－アルキルチオ：アルキル基が上記と同じ意味を有し得るＳ－アルキル基を示す。アルキルチオ基の例として、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ及びペンチルアミノ基に言及することができる。
－アミノアルキル：アルキル基が上記と同じ意味を有し得るＮ－アルキル基を示す。アミノアルキル基の例として、アミノメチル、アミノエチル、イソ－プロピルアミノ、ブチルアミノ及びペンチルアミノ基に言及することができる。
－アリール：４～６個の炭素、好ましくは５～６個の炭素原子を有する不飽和環状芳香族炭化水素基を示す。
－ヘテロアリール：１個以上の炭素原子が窒素、酸素又は硫黄原子で置換されている上記に定義されるアリールを示す。ヘテロアリール基の例として、ピリジン、ピリミジン、チオフェン、フラン、イミダゾール、ピロール及びトリアゾール基に言及することができる。
【0017】
本発明の好ましい一実施形態によれば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、Ｚ及びＷがハロゲン及びアルコキシ、好ましくはヒドロキシを表すものから選択される。
【0018】
本発明の好ましい一実施形態によれば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、Ｘ及びＹが窒素原子及び炭素原子又は２つの窒素原子を表すものから選択される。
【0019】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、ｎ及びｎ’が０～３個の炭素の鎖長を表し、好ましくはｎ及びｎ’が０及び１に等しいものから選択される。
【0020】
本発明の好ましい一実施形態によれば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が水素、アルキル、ヒドロキシ及びアルキルアミン、好ましくは水素、メチル、アミノメチル及びヒドロキシを表すものから選択される。
【0021】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物として、以下を挙げることができる。
【0022】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）アセトアミド：
【0023】
【化2】
【0024】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド：
【0025】
【化3】
【0026】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－４－イル）アセトアミド：
【0027】
【化4】
【0028】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－５－イル）アセトアミド：
【0029】
【化5】
【0030】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－６－イル）アセトアミド：
【0031】
【化6】
【0032】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド：
【0033】
【化7】
【0034】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－６－イル）アセトアミド：
【0035】
【化8】
【0036】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）アセトアミド：
【0037】
【化9】
【0038】
以下の式の１－（４－（２－（１Ｈ－インダゾール－１－イル）－２－オキソエトキシ）－２，３－ジクロロフェニル）－２－メチレンブタン－１－オン：
【0039】
【化10】
【0040】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド：
【0041】
【化11】
【0042】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－６－イル）アセトアミド：
【0043】
【化12】
【0044】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－７－イル）アセトアミド：
【0045】
【化13】
【0046】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド：
【0047】
【化14】
【0048】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１４（４－メトキシフェニル）－スルホニル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド：
【0049】
【化15】
【0050】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル５－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド）－１Ｈ－インダゾール－１－カルボキシレート：
【0051】
【化16】
【0052】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－（プロパ－２－イン－１－イル）－１Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド：
【0053】
【化17】
【0054】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド）エチル）－カルバメート：
【0055】
【化18】
【0056】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル（１－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセチル）ピペリジン－４－イル）カルバメート：
【0057】
【化19】
【0058】
以下の式のＮ－（２－クロロエチル）－２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド：
【0059】
【化20】
【0060】
以下の式のｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセチル）ピペラジン－１－カルボキシレート：
【0061】
【化21】
【0062】
以下の式のＮ－ブチル－２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド：
【0063】
【化22】
【0064】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－５－イル）メチル）アセトアミド：
【0065】
【化23】
【0066】
以下の式の１－（２，３－ジクロロ－４－（２－（５－メチル－１Ｈ－インダゾール－１－イル）－２－オキソエトキシ）フェニル）－２－メチレン－ブタン－１－オン：
【0067】
【化24】
【0068】
以下の式の１－（２，３－ジクロロ－４－（２－オキソ－２－（１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｂ］ピリジン－１－イル）エトキシ）フェニル）－２－メチレンブタン－１－オン：
【0069】
【化25】
【0070】
以下の式の２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－５－イル）アセトアミド：
【0071】
【化26】
【0072】
化合物の調製
－全ての類似体を以下の反応スキーム１に従って合成する。
－使用されるアミンは、一般に、文献［Ｓｗａｒｎａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３，７４０－７４３；Ｄｏｗｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，１８，７３８１－７３９９；Ｕｓｎｉｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２，４８，２６８０－２６８２］の基準に従って２工程で調製される。次いで、エタクリン酸（ＥＡ）を、スキーム１に記載の手順に従って行われるアミド化反応を介して、種々のアミンで処理する。この手順は、室温で活性化剤、例えばＤＣＭ中のＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で行われた。所望の生成物は、シリカゲルカラムでの精製後に満足のいく収率で得られる。
－全ての類似体を以下の反応スキーム１に従って合成する。
－使用されるアミンは、一般に、文献［Ｓｗａｒｎａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，３，７４０－７４３；Ｄｏｗｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，１８，７３８１－７３９９；Ｕｓｎｉｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２，４８，２６８０－２６８２］の基準に従って２工程で調製される。次いで、エタクリン酸（ＥＡ）を、スキーム１に記載の手順に従って行われるアミド化反応を介して、種々のアミンで処理する。この手順は、室温で活性化剤、例えばＤＣＭ中のＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で行われた。所望の生成物は、シリカゲルカラムでの精製後に満足のいく収率で得られる。
【0073】
本発明による種々の化合物の合成プロトコル及び特徴付け
溶媒を標準的な方法に従って乾燥させ、使用前に窒素下で蒸留した。全ての試薬は、従来の商業的供給元から事前に精製することなく使用されている。１３Ｃ炭素及び１Ｈプロトンの核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ＪＥＯＬ ＡＣ５００（５００ ＭＨｚ）装置で記録されている。化学シフト（δ）は、残留ＴＭＳ基準ピークに対してｐｐｍで記録される。ＪＮＭ－ＥＣＺ５００Ｒ／Ｓ１ ＦＴ ＮＭＲシステム（ＪＥＯＬ）
溶媒を標準的な方法に従って乾燥させ、使用前に窒素下で蒸留した。全ての試薬は、従来の商業的供給元から事前に精製することなく使用されている。１３Ｃ炭素及び１Ｈプロトンの核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ＪＥＯＬ ＡＣ５００（５００ ＭＨｚ）装置で記録されている。化学シフト（δ）は、残留ＴＭＳ基準ピークに対してｐｐｍで記録される。ＪＮＭ－ＥＣＺ５００Ｒ／Ｓ１ ＦＴ ＮＭＲシステム（ＪＥＯＬ）
【0074】
実験プロトコル
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）アセトアミド（Ｐ５）の調製
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）アセトアミド（Ｐ５）の調製
【0075】
【化27】
【0076】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド（Ｐ７）の調製
【0077】
【化28】
【0078】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－４－イル）アセトアミド（Ｐ１１）の調製
【0079】
【化29】
【0080】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－５－イル）アセトアミド（Ｐ１２）の調製
【0081】
【化30】
【0082】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インドール－６－イル）アセトアミド（Ｐ１３）の調製
【0083】
【化31】
【0084】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド（Ｐ１８）の調製
【0085】
【化32】
【0086】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－６－イル）アセトアミド（Ｐ２０）の調製
【0087】
【化33】
【0088】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）アセトアミド（Ｐ２１）の調製
【0089】
【化34】
【0090】
１－（４－（２－（１Ｈ－インダゾール－１－イル）－２－オキソエトキシ）－２，３－ジクロロフェニル）－２－メチレンブタン－１－オン（Ｐ２２）の調製
【0091】
【化35】
【0092】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド（Ｐ２６）の調製
【0093】
【化36】
【0094】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－６－イル）アセトアミド（Ｐ２９）の調製
【0095】
【化37】
【0096】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－７－イル）アセトアミド（Ｐ３０）の調製
【0097】
【化38】
【0098】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（２－メチル－２Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド（Ｐ３１）の調製
【0099】
【化39】
【0100】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１４（４－メトキシフェニル）スルホニル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル）アセトアミド（Ｐ３２）の調製
【0101】
【化40】
【0102】
ｔｅｒｔ－ブチル５－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）－フェノキシ）アセトアミド）－１Ｈ－インダゾール－１－カルボキシレート（Ｐ３３）の調製
【0103】
【化41】
【0104】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－（プロパ－２－イン－１－イル）－１Ｈ－インダゾール－４－イル）アセトアミド（Ｐ３４）の調製
【0105】
【化42】
【0106】
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）－フェノキシ）アセトアミド）エチル）－カルバメート（Ｐ３５）の調製
【0107】
【化43】
【0108】
ｔｅｒｔ－ブチル（１－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセチル）ピペリジン－４－イル）カルバメート（Ｐ３６）の調製
【0109】
【化44】
【0110】
Ｎ－（２－クロロエチル）－２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド（Ｐ３７）の調製
【0111】
【化45】
【0112】
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセチル）ピペラジン－１－カルボキシレート（Ｐ３８）の調製
【0113】
【化46】
【0114】
Ｎ－ブチル－２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）アセトアミド（Ｐ３９）の調製
【0115】
【化47】
【0116】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（（１－メチル－１Ｈ－インダゾール－５－イル）メチル）アセトアミド（Ｐ４０）の調製
【0117】
【化48】
【0118】
１－（２，３－ジクロロ－４－（２－（５－メチル－１Ｈ－インダゾール－１－イル）－２－オキソエトキシ）フェニル）－２－メチレンブタン－１－オン（Ｐ４１）の調製
【0119】
【化49】
【0120】
１－（２，３－ジクロロ－４－（２－オキソ－２－（１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｂ］ピリジン－１－イル）エトキシ）フェニル）－２－メチレンブタン－１－オン（Ｐ４２）の調製
【0121】
【化50】
【0122】
２－（２，３－ジクロロ－４－（２－メチレンブタノイル）フェノキシ）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－５－イル）アセトアミド（Ｐ４３）の調製
【0123】
【化51】
【0124】
生物学的活性
プロトコル
ＣＯＶＩＤ－１９に対して有効な薬物を見つける最も速い方法は、他の疾患に対して既に使用されている薬物を使用して臨床試験を行うことである、というのも、本発明者らはそれらを投与する方法を知っており、その有効用量を知っているからである（ドラッグリポジショニング戦略）。しかしながら、所与のプロテアーゼの阻害剤は、異なる構造的及び機能的特性を有する別のプロテアーゼの遮断に必ずしも有効ではない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３ＣＬｐｒｏプロテアーゼを遮断することができるα，β－不飽和ケトンのファミリーからの分子（マイケルアクセプター）は、患者を処置するための真の希望を表す。いくつか、例えば、Ｃ型肝炎患者を処置するために２０１１年に処方された最初のプロテアーゼ阻害剤の中にあったテラプレビル及びボセプレビルは、既に臨床的に使用されている。プロテアーゼ阻害剤の開発は、ＣＯＶＩＤ－１９に対して効果的な処置を迅速に行うために、実体のある供給源から利益を得るべきである。
プロトコル
ＣＯＶＩＤ－１９に対して有効な薬物を見つける最も速い方法は、他の疾患に対して既に使用されている薬物を使用して臨床試験を行うことである、というのも、本発明者らはそれらを投与する方法を知っており、その有効用量を知っているからである（ドラッグリポジショニング戦略）。しかしながら、所与のプロテアーゼの阻害剤は、異なる構造的及び機能的特性を有する別のプロテアーゼの遮断に必ずしも有効ではない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３ＣＬｐｒｏプロテアーゼを遮断することができるα，β－不飽和ケトンのファミリーからの分子（マイケルアクセプター）は、患者を処置するための真の希望を表す。いくつか、例えば、Ｃ型肝炎患者を処置するために２０１１年に処方された最初のプロテアーゼ阻害剤の中にあったテラプレビル及びボセプレビルは、既に臨床的に使用されている。プロテアーゼ阻害剤の開発は、ＣＯＶＩＤ－１９に対して効果的な処置を迅速に行うために、実体のある供給源から利益を得るべきである。
【0125】
本発明者らは、Ａｍａｎａｔ Ｆ ｅｔ ａｌ ［Ａｍａｎａｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０２０，５８，ｅ１０８］によって記載されたマイクロ中和試験を使用して、抗体又は薬物がインビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入及び／又は複製を阻止することができるかどうかを定量的に評価した。これを行うために、中程度のスループットを可能にする９６ウェルフォーマットでマイクロ中和試験を行う。Ａｍａｎａｔ ｅｔ ａｌ．［Ａｍａｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０２０，５８，ｅ１０８］によって最初に記載された試験は、Ｅｌｉｓａ試験によるウイルス核タンパク質（ＮＰ）の染色に基づいているが、本発明者らは、ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ（Ｒ）及びエンベロープ遺伝子（Ｅ）をそれぞれコードする遺伝子の増幅によるＲＴ－ＰＣＲに基づく試験を選択した。このアプローチは、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ ［Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５８３，４５９－４６８］によっても使用され、阻害の定量的な評価を可能にし、したがって、細胞変性効果（ＣＰＥ）の目視観察結果を実証する。
【0126】
実験部
生物学
候補分子の抗ＳＲＡＳ－ＣｏＶ－２活性は、Ｖｅｒｏ細胞においてインビトロで研究されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＶｅｒｏ細胞の感染の特徴は、Ｙａｊｉｎｇ ［Ｙａｏ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ Ｓｉｎ．２０２０，３５，３４８－３５０］によって説明されている。Ｖｅｒｏ細胞株は、１９６２年に単離されたミドリザル腎臓細胞に由来している。本研究で使用したＶｅｒｏ－Ｅ６及びＶｅｒｏ細胞は、２つの細胞バンク（ＩＮＲＡ Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）及び（Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、Ｒａｂａｔ、モロッコ）からそれぞれ３９継代及び１５９継代で得た。グルコース及びＬ－グルタミンを含む培養培地調合物を使用した。
生物学
候補分子の抗ＳＲＡＳ－ＣｏＶ－２活性は、Ｖｅｒｏ細胞においてインビトロで研究されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＶｅｒｏ細胞の感染の特徴は、Ｙａｊｉｎｇ ［Ｙａｏ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ Ｓｉｎ．２０２０，３５，３４８－３５０］によって説明されている。Ｖｅｒｏ細胞株は、１９６２年に単離されたミドリザル腎臓細胞に由来している。本研究で使用したＶｅｒｏ－Ｅ６及びＶｅｒｏ細胞は、２つの細胞バンク（ＩＮＲＡ Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）及び（Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、Ｒａｂａｔ、モロッコ）からそれぞれ３９継代及び１５９継代で得た。グルコース及びＬ－グルタミンを含む培養培地調合物を使用した。
【0127】
Ｖｅｒｏ－Ｅ６及びＶｅｒｏ細胞の培養
細胞培養及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染は、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ－３）の実験室で行われた。細胞を、６％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２％ドナー血清（ＤＳ）を含む培養培地中で培養した。以降、これを参照培地（ＲＭ）と呼ぶ。細胞増殖の最初の工程は、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞については３０，０００ｃｅｌｌ．ｃｍ－２、及びＶｅｒｏ細胞については４０，０００ｃｅｌｌ．ｃｍ－２を播種した１７５ｃｍ２のＴ静的培養フラスコ内で行われる。これらの培養物を、３７℃及び５％ ＣＯ２の制御されたインキュベーターに入れる。細胞継代のために、細胞をトリプシン処理し、細胞懸濁液を回収し、その後の播種に使用した。次いで、培養体積を、予め３７℃にしておいた新鮮なＥＣＭで調整した。
細胞培養及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染は、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ－３）の実験室で行われた。細胞を、６％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２％ドナー血清（ＤＳ）を含む培養培地中で培養した。以降、これを参照培地（ＲＭ）と呼ぶ。細胞増殖の最初の工程は、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞については３０，０００ｃｅｌｌ．ｃｍ－２、及びＶｅｒｏ細胞については４０，０００ｃｅｌｌ．ｃｍ－２を播種した１７５ｃｍ２のＴ静的培養フラスコ内で行われる。これらの培養物を、３７℃及び５％ ＣＯ２の制御されたインキュベーターに入れる。細胞継代のために、細胞をトリプシン処理し、細胞懸濁液を回収し、その後の播種に使用した。次いで、培養体積を、予め３７℃にしておいた新鮮なＥＣＭで調整した。
【0128】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の分離及び確認
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの単離は、バイオセーフティ実験室Ｌ３（ＢＳＬ－３）で、Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ ｅｔ Ｍａｌａｄｉｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｅｕｓｅｓ Ｔｒｏｐｉｃａｌｅｓ（ＣＶＭＩＴ）、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｍｉｌｉｔａｉｒｅ ｄ’Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ｖ，Ｒａｂａｔに入院した女性患者において、陽性と判明した鼻咽頭及び口咽頭の２つの試料から実施された（２７９ＣＣ）。ウイルスの単離は、ＩＮＯＣと呼ばれる保全培地を用いて、（Ｈａｒｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０）に記載されるプロトコルに従って行う。細胞変性効果（ＣＰＥ）は、第１の継代から見える（図８）。ウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて抽出され、ＩＶＤ ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ（商標）ＣＯＶＩＤ－１９ ＰＬＵＳ ＲｅａｌＡｍｐアッセイキット（韓国）を使用するｑＲＴ－ＰＣＲによって増幅された細胞上清に対して、Ｖｅｒｏ細胞におけるウイルス増殖の確認試験を行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの単離は、バイオセーフティ実験室Ｌ３（ＢＳＬ－３）で、Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ ｅｔ Ｍａｌａｄｉｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｅｕｓｅｓ Ｔｒｏｐｉｃａｌｅｓ（ＣＶＭＩＴ）、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｍｉｌｉｔａｉｒｅ ｄ’Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ｖ，Ｒａｂａｔに入院した女性患者において、陽性と判明した鼻咽頭及び口咽頭の２つの試料から実施された（２７９ＣＣ）。ウイルスの単離は、ＩＮＯＣと呼ばれる保全培地を用いて、（Ｈａｒｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０）に記載されるプロトコルに従って行う。細胞変性効果（ＣＰＥ）は、第１の継代から見える（図８）。ウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて抽出され、ＩＶＤ ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ（商標）ＣＯＶＩＤ－１９ ＰＬＵＳ ＲｅａｌＡｍｐアッセイキット（韓国）を使用するｑＲＴ－ＰＣＲによって増幅された細胞上清に対して、Ｖｅｒｏ細胞におけるウイルス増殖の確認試験を行った。
【0129】
培養物中の単離ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全ゲノム配列決定
完全なウイルスゲノムの配列決定は、ＮＧＳ（Ｉｏｎ ｐｒｏｔｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びサンガーシーケンシングを使用して行われた。配列決定に使用されるウイルス遺伝物質は、Ｖｅｒｏ－Ｅ６上の２７９ＣＣ株の継代Ｐ４から抽出される。サンガー法によって得られた完全ゲノムの配列は、参照ｈＣｏＶ－１９／Ｍｏｒｏｃｃｏ／ＨＭＩＭＶ－２７９ＣＣ／２０２０ アクセッションＩＤ：ＥＰＩ－ＩＳＬ－９７１４５１の下で国際ＧＩＳＡＩＤデータベースに寄託されている。
完全なウイルスゲノムの配列決定は、ＮＧＳ（Ｉｏｎ ｐｒｏｔｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びサンガーシーケンシングを使用して行われた。配列決定に使用されるウイルス遺伝物質は、Ｖｅｒｏ－Ｅ６上の２７９ＣＣ株の継代Ｐ４から抽出される。サンガー法によって得られた完全ゲノムの配列は、参照ｈＣｏＶ－１９／Ｍｏｒｏｃｃｏ／ＨＭＩＭＶ－２７９ＣＣ／２０２０ アクセッションＩＤ：ＥＰＩ－ＩＳＬ－９７１４５１の下で国際ＧＩＳＡＩＤデータベースに寄託されている。
【0130】
ウイルスの順化、増殖、産生及び回収
次いで、ＩＮＯＣ培地上のＶｅｒｏ－Ｅ６から単離された２７９ＣＣウイルスを、継代２（Ｐ２）からのＶｅｒｏ細胞に順化させる。ウイルスの増殖及び産生を、ＩＮＯＣ培地を含むＴ５００ｃｍ２静置培養フラスコ中で行う。ウイルス産生は、感染後５日間続く。日毎に分取すると、ウイルス力価の増加をモニタリングし、細胞増殖及び代謝をモニタリングすることができる。感染後５日目にウイルスを回収する。次いで、培養上清を遠心分離によって清澄化し、分取し、－８０℃で凍結する。
次いで、ＩＮＯＣ培地上のＶｅｒｏ－Ｅ６から単離された２７９ＣＣウイルスを、継代２（Ｐ２）からのＶｅｒｏ細胞に順化させる。ウイルスの増殖及び産生を、ＩＮＯＣ培地を含むＴ５００ｃｍ２静置培養フラスコ中で行う。ウイルス産生は、感染後５日間続く。日毎に分取すると、ウイルス力価の増加をモニタリングし、細胞増殖及び代謝をモニタリングすることができる。感染後５日目にウイルスを回収する。次いで、培養上清を遠心分離によって清澄化し、分取し、－８０℃で凍結する。
【0131】
ウイルス力価の決定
感染力価は、感染細胞の培養上清中で決定され、リード・ミュンヒ法（１９３８）に従って計算された。それらは限界希釈感染技術を用いて得られ、ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（５０％組織培養感染量）又はｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして表される。
感染力価は、感染細胞の培養上清中で決定され、リード・ミュンヒ法（１９３８）に従って計算された。それらは限界希釈感染技術を用いて得られ、ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（５０％組織培養感染量）又はｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして表される。
【0132】
式（１）又は（２）の化合物の例として、化合物Ｐ７、Ｐ２６及びＰ３０を選択して、実施された生物学的試験を説明する。
【0133】
合成分子の抗ウイルス効果を評価するためのスクリーニング
分子濃度の決定
３つの化合物を、それらのモル濃度に従ってＤＭＳＯに可溶化する。
分子濃度の決定
３つの化合物を、それらのモル濃度に従ってＤＭＳＯに可溶化する。
【0134】
細胞毒性試験
細胞毒性試験は、主に、蛍光色素のヨウ化プロピジウム（ｌｏｇｏｓ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）による細胞生存率の評価からなる。蛍光光学及び画像分析ソフトウェア（Ｌｕｍａ，ｌｏｇｏｓ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）と一体化された自動セルカウンターを使用して、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に実施する。
細胞毒性試験は、主に、蛍光色素のヨウ化プロピジウム（ｌｏｇｏｓ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）による細胞生存率の評価からなる。蛍光光学及び画像分析ソフトウェア（Ｌｕｍａ，ｌｏｇｏｓ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）と一体化された自動セルカウンターを使用して、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に実施する。
【0135】
異なる化合物の細胞毒性は、非感染細胞のプレートにおける各試験の平均細胞数によって決定される。結果を図１Ａに示し、パーセント（％）で表す。
【0136】
分子の抗ウイルス効果の決定
分子の抗ウイルススクリーニング培養を、２．５×１０５細胞／ｍＬの密度で、１００μｌの体積のＭＥＣ培地を含む９６ウェル培養プレート中で行う。使用したプロトコルは、予防的アプローチに従う（４時間インキュベーションした後にインビトロ感染）。実際、試験される化合物の有無にかかわらず、細胞を４時間インキュベートし、次いで、０．０４のＭＯＩ（感染の多重度）で、３７℃、５％ ＣＯ２下で４８時間ＩＮＯＣ中で感染させる。
分子の抗ウイルススクリーニング培養を、２．５×１０５細胞／ｍＬの密度で、１００μｌの体積のＭＥＣ培地を含む９６ウェル培養プレート中で行う。使用したプロトコルは、予防的アプローチに従う（４時間インキュベーションした後にインビトロ感染）。実際、試験される化合物の有無にかかわらず、細胞を４時間インキュベートし、次いで、０．０４のＭＯＩ（感染の多重度）で、３７℃、５％ ＣＯ２下で４８時間ＩＮＯＣ中で感染させる。
【0137】
インビトロでのウイルス産生に対する効果（抗ウイルス効果）を、インキュベーションの４８時間後にｑＲＴ－ＰＣＲによって、及びＶｅｒｏ細胞における感染力価（ｌｏｇＤＩＴＣ５０／ｍＬ又はＤＩＴＣ５０／ｍＬ）を決定することによって測定する。各条件における感染力価の比は、対照条件（無処理）で測定された感染力価の関数として表される。
【0138】
試験される化合物が存在する実験条件で測定した感染力価は、細胞が感染しているが処理されていない対照条件と比較して大幅に減少する。
【0139】
実際、分子Ｐ７（１６．６μＭ）、Ｐ２６（１６．６μＭ）及びＰ３０（５．５４μＭ）は、対照と比較して、それぞれ１００％、９７．９６％及び９６．７５％の感染力価の減少を可能にする（図９参照）。
【0140】
これらの結果に基づいて、有効濃度範囲を決定し、したがってＩＣ５０（最大半値阻害濃度）、すなわちウイルス産生の５０％阻害を得るために必要な用量を決定するために、同じ実験条件下でＶｅｒｏ細胞上の３つの化合物のそれぞれについてより広い範囲の濃度を試験した（図１０参照）。
【0141】
実際、１０μＭの分子Ｐ７、Ｐ２６及びＰ３０は、対照と比較して、それぞれ１００％、９３．０９％及び１００％の感染力価の減少を可能にする（図２参照）。８μＭでは、これらの分子の阻害率は、それぞれ９６．７０％、５２．１４％及び９９．６７％程度である。６μＭでは、Ｐ２６及びＰ３０のみがウイルス複製を約３０％阻害したが、Ｐ７はこの濃度ではウイルス複製を全く阻害しなかった。
【0142】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の複製に対する３つの分子の阻害効果は、３つのウイルス遺伝子、すなわち遺伝子ＲｄＲＰ、遺伝子Ｎ及び遺伝子Ｅに対してＲＴ－ＰＣＲによって確認された（表１）。
【0143】
これらの３つの化合物のＩＣ５０値を以下の表（表２）に列挙する：
これらのＩＣ５０値は、これらの化合物の非感染適用において知られている通常の濃度と比較して比較的低い。これらの値は、細胞毒性濃度（ＣＣ５０）からも遠い。
これらのＩＣ５０値は、これらの化合物の非感染適用において知られている通常の濃度と比較して比較的低い。これらの値は、細胞毒性濃度（ＣＣ５０）からも遠い。
【0144】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍｐｒｏタンパク質の構造
３ＣＬｐｒｏ（Ｍｐｒｏ）の構造は、蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＵ７）からダウンロードされており、この構造はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬｐｒｏと、Ｃｙｓ１４５に共有結合したその阻害剤との複合体である［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５８２，２８９－２９３］。この構造は、Ｒｏｓｅｔｔａでエネルギー的に最小化されている［Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１１，４８７，５４５－５７４］。
３ＣＬｐｒｏ（Ｍｐｒｏ）の構造は、蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＵ７）からダウンロードされており、この構造はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３ＣＬｐｒｏと、Ｃｙｓ１４５に共有結合したその阻害剤との複合体である［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５８２，２８９－２９３］。この構造は、Ｒｏｓｅｔｔａでエネルギー的に最小化されている［Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１１，４８７，５４５－５７４］。
【0145】
ドッキング手順：
１－３ＣＬｐｒｏ（Ｍｐｒｏ）（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＵ７）の構造の、その極性水素並びにその全ての原子の部分電荷の付加による最適化。タンパク質骨格は、最小化中に固定された。１０００個のモデルの中から最も低いスコアのモデルを選択した。ＭＧＬＴｏｏｌｓ（バージョン１．５．６）を使用して、ドッキング用のＰＤＢＱＴファイルを生成した。
１－３ＣＬｐｒｏ（Ｍｐｒｏ）（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＵ７）の構造の、その極性水素並びにその全ての原子の部分電荷の付加による最適化。タンパク質骨格は、最小化中に固定された。１０００個のモデルの中から最も低いスコアのモデルを選択した。ＭＧＬＴｏｏｌｓ（バージョン１．５．６）を使用して、ドッキング用のＰＤＢＱＴファイルを生成した。
【0146】
式（１）又は（２）の化合物の例として化合物Ｐ７を選択して、分子モデリング試験を説明する。
【0147】
２－リガンド最適化：
分子ドッキングのために選択されたリガンドは、部分電荷及び水素原子を添加した後、ＰＲＯＤＲＧサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖａｐｃｌ．ｂｉｏｃｈ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｄｒｇ／）を使用してエネルギーを最小化することによって最適化された。
分子ドッキングのために選択されたリガンドは、部分電荷及び水素原子を添加した後、ＰＲＯＤＲＧサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖａｐｃｌ．ｂｉｏｃｈ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｄｒｇ／）を使用してエネルギーを最小化することによって最適化された。
【0148】
３－構成ファイルの調製及びポテンシャルグリッド計算。
構成ファイルを、ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａを実行するために調製した。ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓを使用して、Ｍｐｒｏ用の「ｉｎｐｕｔ．ＰＤＢＱＴ」ファイルを調製し、ボックス（Ｘ；Ｙ；Ｚ）の位置及び次元を定義する。グリッドのサイズは、２０×２０×２０ポイント（ｘ、ｙ及びｚ）に設定され、グリッドの中心は、それぞれ－１０．７２９２０４、１２．４１７６５３、及び６８．８１６１２２のｘ、ｙ、及びｚ次元に設定されている。調製ファイルは「．ＰＤＢＱＴ」フォーマットで保存された。
構成ファイルを、ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａを実行するために調製した。ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓを使用して、Ｍｐｒｏ用の「ｉｎｐｕｔ．ＰＤＢＱＴ」ファイルを調製し、ボックス（Ｘ；Ｙ；Ｚ）の位置及び次元を定義する。グリッドのサイズは、２０×２０×２０ポイント（ｘ、ｙ及びｚ）に設定され、グリッドの中心は、それぞれ－１０．７２９２０４、１２．４１７６５３、及び６８．８１６１２２のｘ、ｙ、及びｚ次元に設定されている。調製ファイルは「．ＰＤＢＱＴ」フォーマットで保存された。
【0149】
４－分子ドッキング
分子ドッキングプロセスを使用して、可能なリガンドの位置及び配向を探索し、ドッキング部位の特異性及びドッキングされるリガンドの相互作用の可能性を最大限に活用する。ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａ（バージョン１．１．２）［Ｔｒｏｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２０１０，３１，４５５－４６１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０１６，２９，５２０－５２７］を使用して、合成した分子をＭｐｒｏの基質結合ポケットでドッキングした（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＵ７）。リガンドドッキングシミュレーションは、受容体を剛性にしながら柔軟に保たれている。
分子ドッキングプロセスを使用して、可能なリガンドの位置及び配向を探索し、ドッキング部位の特異性及びドッキングされるリガンドの相互作用の可能性を最大限に活用する。ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａ（バージョン１．１．２）［Ｔｒｏｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２０１０，３１，４５５－４６１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０１６，２９，５２０－５２７］を使用して、合成した分子をＭｐｒｏの基質結合ポケットでドッキングした（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＵ７）。リガンドドッキングシミュレーションは、受容体を剛性にしながら柔軟に保たれている。
【0150】
５－ドッキング解決策の探索
最良のドッキング解決策は、各リガンドが受容体に結合する様々な方法を考慮して、ｋｃａｌ．ｍｏｌ－１単位で最低エネルギーを有する活性ポケットに関して最も可能性の高い位置及び向きを探すことである（表３）。
最良のドッキング解決策は、各リガンドが受容体に結合する様々な方法を考慮して、ｋｃａｌ．ｍｏｌ－１単位で最低エネルギーを有する活性ポケットに関して最も可能性の高い位置及び向きを探すことである（表３）。
【0151】
５－結果の分析
次いで、最良の解決策又は姿勢は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｂｉｏｖｉａ ２０２１ソフトウェア（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）によって評価され、ＰｙＭＯＬを使用して、先に説明された元の構造におけるＣｙｓ１４５の反応性原子と硫黄原子との間のドッキングスコア、順位付け及び距離によって調査された［Ａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．２０１６，５６，１５６３－１５７５］。
次いで、最良の解決策又は姿勢は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｂｉｏｖｉａ ２０２１ソフトウェア（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）によって評価され、ＰｙＭＯＬを使用して、先に説明された元の構造におけるＣｙｓ１４５の反応性原子と硫黄原子との間のドッキングスコア、順位付け及び距離によって調査された［Ａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．２０１６，５６，１５６３－１５７５］。
【0152】
ドッキング後の分析は、結合部位のサイズ及び位置、水素結合相互作用、疎水性相互作用、及び固定されたリガンド位置から＜５Åの相互作用半径としての結合距離を示した。化合物を活性部位にドッキングさせ、次いで、各リガンドの結合姿勢を観察し、タンパク質とのそれらの相互作用を特徴付け、各リガンドの最もエネルギー的に好ましい立体配座を選択した（図１１）。
【0153】
合成分子の物理化学的特性（表４）は、リピンスキーのドラッグライクネス（ｄｒｕｇｌｉｋｅｎｅｓｓ）ルールとしても知られる、リピンスキーのルールオブファイブの基準を満たした。これらの規則は、化合物の構造類似性と活性経口薬物の構造類似性の評価を可能にし、物理化学的プロファイルに基づいている。分子量、及び供与体と受容体との間の水素結合相互作用は、タンパク質標的及びリガンド結合部位の重要な構造決定因子である［Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１６，１０１，３４－４１；Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００１，４６，３－２６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，１８，４７８－８８］．特に、化合物は、５以下の水素結合供与体及び１０以下の水素結合受容体、５００未満の分子質量及び５未満の計算されたｌｏｇ Ｐ値（ＣＬｏｇ Ｐ）を有する場合、リガンドとして透過性であり、活性である可能性が高くなる［Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００１，４６，３－２６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，１８，４７８－８８］。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】