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特表2024-517345ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのための新規のタンパク質および核酸配列
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-19
(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのための新規のタンパク質および核酸配列
(51)【国際特許分類】
C12N 15/50 20060101AFI20240412BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20240412BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240412BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240412BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240412BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20240412BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240412BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240412BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240412BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240412BHJP
【ＦＩ】
C12N15/50
C07K14/165 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/86 Z
A61P31/14
A61K39/215
A61K35/76
A61K31/7105
A61K48/00
A61K38/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023570240
(86)(22)【出願日】2022-05-16
(85)【翻訳文提出日】2024-01-09
(86)【国際出願番号】 EP2022063214
(87)【国際公開番号】W WO2022238585
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】21173941.2
(32)【優先日】2021-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】315012541
【氏名又は名称】ドムペ・ファルマチェウティチ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】アレグレッティ，マルチェッロ
(72)【発明者】
【氏名】チミニ，アンナマリア
(72)【発明者】
【氏名】ベッカーリ，アンドレア・ロザリオ
(72)【発明者】
【氏名】タラリコ，カルミネ
(72)【発明者】
【氏名】マウリ，エリザベッタ・マリア・エステル
(72)【発明者】
【氏名】カッターニ，フランカ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA01
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA03
4C085BA71
4C085BB11
4C085EE01
4C085FF11
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA17
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB33
4H045AA10
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防における使用のための、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体もしくはそのフラグメント、またはそれらをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡに関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質。
【請求項2】
配列番号２、２８、２９、３０または３１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質。
【請求項3】
請求項１または２に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体であって、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている、上記変異体。
【請求項4】
前記変異体が、以下の位置：－ 配列番号１のアミノ酸８１８に対応する位置から配列番号１のアミノ酸８２２に対応する位置までのアミノ酸配列、
－ 配列番号１のアミノ酸８４１に対応する位置から配列番号１のアミノ酸８４４に対応する位置までのアミノ酸配列、および
－ 配列番号１のアミノ酸８６１に対応する位置から配列番号１のアミノ酸配列８６５位までのアミノ酸配列
において、対応する突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の同じアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体。
【請求項5】
前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の以下のアミノ酸：－ 配列番号１のアミノ酸８９２、８９９および９４２に対応する位置におけるアラニン、
－ 配列番号１のアミノ酸８１７に対応する位置におけるフェニルアラニン、
－ 配列番号１のアミノ酸９８６に対応する位置におけるリジン、および
－ 配列番号１のアミノ酸９８７に対応する位置におけるバリン
のうち少なくとも２つが、プロリンで置き換えられている、請求項３または４に記載の変異体。
【請求項6】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４または配列番号５５の配列を有する、請求項３～５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項7】
配列番号１のアミノ酸６８２、６８３および６８５に対応する位置におけるアミノ酸のアルギニンが、グルタミンで置き換えられている、請求項３～６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項8】
配列番号１のアミノ酸６８５に対応する位置におけるアミノ酸のアルギニンが、アラニンで置き換えられている、請求項３～６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項9】
以下に列挙した配列番号１のアミノ酸に対応する位置におけるアミノ酸改変をさらに含有する、請求項３～８のいずれか一項に記載の変異体：Ｔ１９Ｒ、ＥＦ１５６／１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１ＲおよびＤ９５０Ｎ、または
Ａ６７Ｖ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
【請求項10】
請求項１または２に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または請求項３～９のいずれか一項に記載の変異体の免疫原性フラグメントであって、－ 配列番号１のアミノ酸８１８に対応する位置から配列番号１のアミノ酸８２２までに対応する位置のアミノ酸配列、
－ 配列番号１のアミノ酸８４１に対応する位置から配列番号１のアミノ酸８４４までに対応する位置のアミノ酸配列、および
－ 配列番号１のアミノ酸８６１から配列番号１の８６５位までに対応する位置のアミノ酸配列
から選択される、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の少なくとも１つの配列を含む、上記免疫原性フラグメント。
【請求項11】
－ 配列番号２または配列番号３１の８１８位から８２２位までのアミノ酸配列、－ 配列番号２、配列番号２８、配列番号３０または配列番号３１の８４１位から８４４位までのアミノ酸配列、および
－ 配列番号２、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の８６１位から８６５位までのアミノ酸配列
から選択される、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の少なくとも１つの配列を含有する、請求項１０に記載の免疫原性フラグメント。
【請求項12】
以下のアミノ酸配列：－ 配列番号１の２３２位から２４６位までのアミノ酸配列、
－ 配列番号１の２３３位から２４７位までのアミノ酸配列、
－ 配列番号１の４７１位から５０３位までのアミノ酸配列、
－ 配列番号１の６０４位から６２５位までのアミノ酸配列、
－ 配列番号２または配列番号３１の８１７位から８３３位までのアミノ酸配列、
－ 配列番号１の８９１位から９０７位までのアミノ酸配列
－ 配列番号１の８９７位から９１３位までのアミノ酸配列、
－ 配列番号１の１１６４位から１１９１位までのアミノ酸配列、および
－ 配列番号１の１１８２位から１２０９位までのアミノ酸配列
から選択される、少なくとも２つのオーバーラップしない配列をさらに含有する、請求項１０または１１に記載の免疫原性フラグメント。
【請求項13】
請求項１もしくは２に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、請求項３～９のいずれか一項に記載の変異体、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載の免疫原性フラグメントの配列、および１つもしくはそれより多くの追加の配列を含むタンパク質。
【請求項14】
請求項１もしくは２に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、請求項３～９のいずれか一項に記載の変異体、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の免疫原性フラグメント、または請求項１３に記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡ。
【請求項15】
ウリジン残基が、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン、４－チオシュードウリジン、２－チオシュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、１－カルボキシメチルシュードウリジン、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチルシュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、１－タウリノメチル－４－チオウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチルシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジンから選択される修飾ヌクレオシドで置き換えられた、好ましくは１－メチルシュードウリジンで置き換えられた配列を有する、請求項１４に記載のｍＲＮＡ。
【請求項16】
請求項１もしくは２に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、請求項３～９のいずれか一項に記載の変異体、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の免疫原性フラグメント、または請求項１３に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項17】
請求項１６に記載のＤＮＡを含有するプラスミド。
【請求項18】
請求項１６に記載のＤＮＡを含有する、ウイルスベクター、好ましくは、アデノまたはポックスウイルスから選択されるウイルスベクター。
【請求項19】
対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防において使用するための、請求項１もしくは２に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、請求項３～９のいずれか一項に記載の変異体、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の免疫原性フラグメント、または請求項１３に記載のタンパク質、請求項１４もしくは１５に記載のｍＲＮＡ、請求項１６に記載のＤＮＡ、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項20】
請求項１もしくは２に記載の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、請求項３～９のいずれか一項に記載の変異体、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の免疫原性フラグメント、または請求項１３に記載のタンパク質、請求項１４もしくは１５に記載のｍＲＮＡ、請求項１６に記載のＤＮＡ、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８に記載のウイルスベクターを含有するワクチン組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにおける使用に好適なタンパク質および核酸配列に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス（Ｃｏｖｓ）は、コロナウイルス科に属する一本鎖のエンベロープを有するＲＮＡウイルスの大きいファミリーである。ヒトに感染できることが公知の限られた数のコロナウイルスは、これまでに、軽度の感染を引き起こす比較的害のない呼吸器のヒト病原体とみなされていた。しかしながら、ヒトにおいて重度の、時には死に至る気道感染を引き起こす２種のコロナウイルスサブタイプである、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）および中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）が出現した（Pereira, Hら、1989 Coronaviridae. Andrewes ‘Viruses of Vertebrates、第5版、42～57頁、Holmes, K.V.ら、Virology 1996、1:1075～1093）。２０１９年１２月に、中国で不定形の肺炎の症例が発生し、後にその原因が新規のコロナウイルスであることが明らかになった。世界保健機関（ＷＨＯ）は、このウイルスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と名付け、関連疾患をＣＯＶＩＤ－１９と名付けた。
【0003】
このウイルスは急速に世界中に蔓延し、２０２０年３月１１日にＷＨＯはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染をパンデミックとして宣言した。ＣＯＶＩＤ－１９に感染したほとんどの人は、軽度から中程度の呼吸器疾患（発熱、疲労、乾性咳および呼吸困難）を経験し、特殊な処置を必要とすることなく回復する。年配の人や、心臓血管疾患、糖尿病、慢性呼吸器疾患、およびがんのような基礎疾患を有する人は、重篤な疾患を発症するする可能性がより高い。
【0004】
疫学的および臨床的な特徴ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者の転帰の分析から、症候的なＣＯＶＩＤ－１９を有する人の１５％が、重度の肺炎などの重い疾患を有し、５％が生命を脅かす合併症を伴う深刻な疾患を経験することが示された。深刻な疾患としては、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、敗血症性ショック、心疾患、血栓塞栓性事象、例えば肺塞栓症および多臓器不全が挙げられる。
【0005】
また、深刻なＣＯＶＩＤ－１９疾患を発症する人において、まれな神経学的な合併症や精神医学的な合併症などの長期的な結果が合理的に予想されるという証拠も増えつつある。これらの例としては、卒中、譫妄、不安、うつ病、脳の損傷または炎症、および睡眠障害を挙げることができる。
【0006】
世界的な症例と死亡の劇的な増加ならびにそれらの社会的および経済的な結果のために、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを制御し終結させることを助ける安全で有効なワクチンの開発に努力の焦点を当ててきた。
【0007】
様々なワクチンが開発中であり、一部がすでにＣＯＶＩＤ－１９予防のために承認された。
全てのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンおよびワクチン候補は、様々な戦略および技術、すなわち、様々な異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の宿主への導入に基づく、従来の不活化または生きた弱毒化ウイルスワクチン、アジュバントを伴う組換え生産されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に基づくワクチン、および宿主細胞でのインビボでの生産のためにウイルスタンパク質抗原をコードする遺伝子を送達する、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはベクターワクチンなどの遺伝子ベースのワクチンを利用して、ウイルスタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導することによって作用する。
全てのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンおよびワクチン候補は、様々な戦略および技術、すなわち、様々な異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の宿主への導入に基づく、従来の不活化または生きた弱毒化ウイルスワクチン、アジュバントを伴う組換え生産されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に基づくワクチン、および宿主細胞でのインビボでの生産のためにウイルスタンパク質抗原をコードする遺伝子を送達する、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはベクターワクチンなどの遺伝子ベースのワクチンを利用して、ウイルスタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導することによって作用する。
【0008】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２は、４つの構造タンパク質、すなわちスパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質によって特徴付けられる（Chen Yら、J Med Virol 2020、92:418～423）。
【0009】
現在、すでに承認されたかまたは開発中のほとんどのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、標的抗原としてスパイクタンパク質を使用する。このタンパク質は、実際に、防御免疫応答を誘導することが可能な重要な抗原決定基とみなされる（Ouら、Nat Commun 2020;11:1620）。さらに、このタンパク質また、細胞侵入受容体であるアンジオテンシン変換酵素ＩＩ（ＡＣＥ２）を介した細胞へのウイルスの侵入に必須の分子でもある。それゆえに、Ｓタンパク質を標的化する抗体は、ウイルスが宿主細胞の内部に侵入し複製することを防ぐ。
【0010】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、配列番号１の１２７３アミノ酸の配列を有し、Ｎ末端に配置されたシグナルペプチド（アミノ酸１～１３）、Ｓ１サブユニット（１４～６８５残基）およびＳ２サブユニット（６８６～１２７３残基）からなる。Ｓ１サブユニットは、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介したＡＣＥ２への受容体結合を媒介し、Ｓ２サブユニットは、ウイルスと宿主細胞膜との融合に関与する（Letkoら、Nat Microbiol 2020、5: 562～569、Huangら、Acta Pharmacologica Sinica 2020、41:1141～1149）。融合プロセス中、Ｓ２サブユニットは、融合前のコンフォメーションから融合後の（ヘアピン）コンフォメーションに変化する。その後、表面のプロテアーゼがＳ２サブユニットを切断する（Silveriraら、Life Sci 2021、267:1128919）。
【0011】
ＥＭＡによってこれまで承認されたワクチンは、タンパク質抗原としてのスパイクタンパク質の宿主における生産を誘導する核酸に基づく：ファイザー（Pfizer）およびビオンテック（BioNTech）により開発されたｍＲＮＡベースコミナティ（Comirnaty）ワクチン、モデルナ（Moderna）により開発された、ｍＲＮＡベースのモデルナ（Moderna）ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンならびにオックスフォード大学およびアストラゼネカにより開発された、ＤＮＡ、ウイルスベクターによって送達されるワクチンであるバキスゼブリア（Vaxzevria）、ならびにヤンセン・シラグ・インターナショナル（Janssen-Cilag International）により開発されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンヤンセン（Janssen）。
【0012】
これらのアプローチに基づく他のワクチンは開発中であり、同様に、活性成分として組換え生産されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を使用するワクチン、例えばノババック（Novavax）によるワクチンＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３ならびにメディカゴ（Medicago）およびＧＳＫによるＣｏ－ＶＬＰも開発中である（Forniら、Cell Death & Differentiation 2021、28:626～639）。
【0013】
近年の証拠は、ウイルス感染の容易化とは独立して、細胞のシグナル伝達に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の潜在的な活性を示唆している。
特定には、スパイクタンパク質は、マウスおよびヒトマクロファージにおいて、インビトロの炎症促進性応答を誘導でき（Shiratoら、Heliyon 2021、7(2)eO6187）、培養したヒト血管細胞における細胞シグナル伝達事象を活性化できることが示されている（Suzukiら、Vascular Pharmacology 2021、137:106823）。
特定には、スパイクタンパク質は、マウスおよびヒトマクロファージにおいて、インビトロの炎症促進性応答を誘導でき（Shiratoら、Heliyon 2021、7(2)eO6187）、培養したヒト血管細胞における細胞シグナル伝達事象を活性化できることが示されている（Suzukiら、Vascular Pharmacology 2021、137:106823）。
【0014】
ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのほとんどが生物にスパイクタンパク質を導入するため、この観点は非常に有意義である。
これまで承認されたｍＲＮＡおよびＤＮＡワクチンを筋肉内注射によって投与した後、スパイクタンパク質は、主として筋細胞、線維芽細胞、樹状細胞およびリンパ球で発現されるが、一部のワクチンでは、他の臓器でも所定の発現のレベルが検出されていることが報告されている（https://www.ema.europa.eu/において情報を得ることができる）。
これまで承認されたｍＲＮＡおよびＤＮＡワクチンを筋肉内注射によって投与した後、スパイクタンパク質は、主として筋細胞、線維芽細胞、樹状細胞およびリンパ球で発現されるが、一部のワクチンでは、他の臓器でも所定の発現のレベルが検出されていることが報告されている（https://www.ema.europa.eu/において情報を得ることができる）。
【0015】
それゆえに、上記を考慮して、ワクチン接種によって生産されたスパイクタンパク質の体内の存在が、生物学的プロセスに干渉し、それにより短期および長期的に副作用を引き起こす可能性があるかどうかを調査する必要がある。
【0016】
核ホルモン受容体は、甲状腺やステロイドホルモン、ならびにレチノイン酸およびビタミンＤなどの様々な他の脂溶性シグナルによって活性化されるリガンドによって制御される転写因子のファミリーである。
【0017】
ステロイドホルモン、特定にはアンドロゲンおよびエストロゲンは、二次性徴の発生および維持、代謝、血液の塩バランス、免疫および炎症性応答、ストレスに対する応答ならびに／またはニューロンの機能などの多様な生理学的機能を調節することが示されている。
【0018】
さらに、これらのホルモンのレベルまたは活性における不均衡は、多くの病理学的プロセスに関与している。
特定には、エストロゲンは、乳がん、子宮内膜がん、腎臓がん、および子宮がんの原因に関与しており（Okamotoら、Toxicology Letters 2020、318:99～103）、一方で前立腺がんの病因におけるアンドロゲンの重要な役割が実証された（Cold Spring Harb Perspect Med 2017;7:a030452）。
特定には、エストロゲンは、乳がん、子宮内膜がん、腎臓がん、および子宮がんの原因に関与しており（Okamotoら、Toxicology Letters 2020、318:99～103）、一方で前立腺がんの病因におけるアンドロゲンの重要な役割が実証された（Cold Spring Harb Perspect Med 2017;7:a030452）。
【0019】
さらに、外因性アンドロゲンおよびエストロゲンの投与は、プロトロンビン環境の生成およびより高いリスクの血栓形成現象に寄与する止血および線維素溶解経路の多くの局面の調節障害に関連していた（Roscaら、J. Clin. Med. 2021、10:147;Abou-Ismailら、Thrombosis Research 2020、192:40～51;Walkerら、JAMA Intern Med.2020、180(2):190～197）。
【0020】
これらの分子の活性は、核内受容体であるエストロゲンおよびアンドロゲン受容体によって媒介され、これらはホルモンによって活性化される転写因子として機能する。これらの受容体は、多様な活性に関与するが、著しい構造的および機能的な類似性を有する。これらは、リガンドの非存在下において、転写的に不活性な形態で標的細胞内に存在する。リガンドが活性化されると、それらは標的遺伝子のプロモーターに結合し、集合的にコレギュレーターとして公知の多数の相互作用タンパク質と転写複合体を形成し、ここでコレギュレーターは、転写活性を活性化するか（コアクチベーター（ＣｏＡ））または不活性化するか（コリプレッサー（ＣｏＲ））のいずれかによって、標的遺伝子発現の活性化または抑制を引き起こすことができる（Patelら、Pharm Ther 2018、186:1～24;Zellaら、Arch Biochem Biophys 2007、460(2):206～212）。核内受容体とコアクチベーターとの相互作用は、異なる核ホルモン受容体のコアクチベータータンパク質内に存在し共通するＬｘｘＬＬモチーフ（式中、Ｌは、ロイシンであり、ｘは、任意のアミノ酸である）によって媒介される。これらのモチーフは、これらのタンパク質の受容体への結合およびその転写活性の強化に必要であり、十分である（Patelら、Pharm Ther 2018、186:1～24;Zellaら、Arch Biochem Biophys 2007、460(2):206～212;Changら、Trends Pharm Sci2005、26(5):225～228）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0021】
【非特許文献1】Pereira, Hら、1989 Coronaviridae. Andrewes ‘Viruses of Vertebrates、第5版、42～57頁、
【非特許文献2】Holmes, K.V.ら、Virology 1996、1:1075～1093
【非特許文献3】Chen Yら、J Med Virol 2020、92:418～423
【非特許文献4】Ouら、Nat Commun 2020;11:1620
【非特許文献5】Letkoら、Nat Microbiol 2020、5: 562～569、
【非特許文献6】Huangら、Acta Pharmacologica Sinica 2020、41:1141～1149
【非特許文献7】Silveriraら、Life Sci 2021、267:1128919
【非特許文献8】Forniら、Cell Death & Differentiation 2021、28:626～639
【非特許文献9】Suzukiら、Vascular Pharmacology 2021、137:106823
【非特許文献10】Shiratoら、Heliyon 2021、7(2)eO6187
【非特許文献11】https://www.ema.europa.eu/
【非特許文献12】Okamotoら、Toxicology Letters 2020、318:99～103
【非特許文献13】Cold Spring Harb Perspect Med 2017;7:a030452
【非特許文献14】Roscaら、J. Clin. Med. 2021、10:147
【非特許文献15】Abou-Ismailら、Thrombosis Research 2020、192:40～51
【非特許文献16】Walkerら、JAMA Intern Med.2020、180(2):190～197
【非特許文献17】Patelら、Pharm Ther 2018、186:1～24
【非特許文献18】Zellaら、Arch Biochem Biophys 2007、460(2):206～212
【非特許文献19】Changら、Trends Pharm Sci2005、26(5):225～228
【発明の概要】
【0022】
驚くべきことに、本発明者らはここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が、ＮＣＯＡ１結合ドメインに結合して、エストロゲンおよびアンドロゲン受容体の転写活性を活性化することができる、核内コアクチベーター１（ＮＣＯＡ１）のものと相同な多数のＬｘｘＬＬ様モチーフを含有することを見出した。さらに、異なる核内受容体にわたるＮＣＯＡ１結合ドメインの配列相同性が、ビタミンＤや甲状腺ホルモン受容体などの他の核内受容体により誘導された転写も活性化するスパイクタンパク質の潜在的な能力を裏付ける。
【0023】
この発見から、ワクチンで生産されたかまたはワクチンに含有されるスパイクタンパク質は、核内受容体、特定にはエストロゲンおよびアンドロゲン受容体の活性に干渉する可能性があること、さらに、これらの受容体によって媒介される生理学的および病理学的な活性の間に不均衡を生じさせ、それにより不要な重篤な副作用を引き起こすことが導き出される。
【0024】
本発明者らは、エストロゲンおよびアンドロゲン受容体のＮＣＯＡ１結合ドメインへのタンパク質の結合活性を破壊する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＬｘｘＬＬモチーフにおける突然変異を同定した。
【0025】
したがってこれらの配列は、ＣＯＶＩＤ－１９に対するより安全なワクチンの開発に有用である。
したがって、本発明の目的は、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体である。
したがって、本発明の目的は、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体である。
【0026】
本発明のさらなる目的は、配列番号２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１のアミノ酸配列を有する、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。
【0027】
本発明のさらなる目的は、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の免疫原性フラグメントである。
本発明のさらなる目的は、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体または免疫原性フラグメントをコードするｍＲＮＡである。
本発明のさらなる目的は、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体または免疫原性フラグメントをコードするｍＲＮＡである。
【0028】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防での使用のための、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体、フラグメント、ｍＲＮＡまたはＤＮＡである。
【0029】
本発明のさらなる目的は、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体、またはフラグメント、ｍＲＮＡもしくはＤＮＡを含むワクチンである。
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防での使用のための、前記ワクチンである。
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防での使用のための、前記ワクチンである。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】図１は、核内受容体コアクチベーターと複合体化したエストロゲン受容体（ＥＲ）を示す。 複合体全体は、グラフィックで報告される；ＥＲ単量体は、灰色の表面で示され、一方でＮＣＯＡセグメントは、黒色のグラフィックとラインで報告される。
【図2】図２は、ＥＲ１およびＥＲ２の最も重要な相互作用のネットワークを示す。最も信頼できる相互作用タンパク質のなかでも、核内受容体コアクチベーター（Nuclear receptor Coactivator：ＮＣＯＡ）は、核内受容体と直接結合し、転写活性を刺激する。
【図4】図４は、スパイク－ＥＲブラインドドッキングの３Ｄの最良のドッキング仮説を示す。タンパク質は、グラフィックで報告される。ＥＲ二量体は、白色のグラフィックで示され、一方でスパイクタンパク質は、黒色の表面で報告される。
【図5】図５は、スパイク－ＥＲモチーフ配向ドッキングの３Ｄの最良のドッキング仮説を示す。タンパク質は、グラフィックで報告される。ＥＲ二量体は、白色のグラフィックで示され、一方でスパイクタンパク質は、黒色の表面で報告される。
【図6】図６は、実施例２に記載した通りに測定された、単独またはラロキシフェンの存在下のいずれかでの、媒体（ＣＴＲ）、エストラジオール（ＥＳＴＲ）、野生型スパイクタンパク質（スパイク）または２つの組合せでのＭＣＦ－７乳がん細胞の処理により誘導された、対照のパーセンテージとして表される細胞増殖を示す。
【図7】図７は、実施例２に記載した通りに測定された、媒体（ＣＴＲＬ）、ペプチド２、５もしくは７、野生型スパイクタンパク質、野生型スパイクタンパク質とラロキシフェン、またはラロキシフェン単独でのＭＣＦ－７乳がん細胞の処理により誘導された、対照のパーセンテージとして表される細胞増殖を示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、実験の章で詳細に説明されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が、核内受容体の、特定にはエストロゲンおよびアンドロゲン受容体の結合および活性化を媒介することができる３つのＬｘｘＬＬ様モチーフを露出させているという驚くべき発見に基づく。実施例に示されるように、これらのモチーフのそれぞれは、エストロゲンまたはアンドロゲン受容体により誘導されたがん細胞の増殖を活性化することができる。
【0032】
この発見は、上記モチーフの１つまたはそれより多くを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質もしくは変異体またはそのフラグメントの宿主への投与またはそれにおける生産に基づくＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの潜在的な副作用に関連する懸念をもたらす。
【0033】
発明者らは、同定された３つのモチーフのうち１つまたはそれより多くに対応する特定のアミノ酸突然変異を導入することは、スパイクタンパク質の受容体と相互作用するスパイクタンパク質の能力を破壊しながらも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗原特異的な免疫応答の効率を改変しないことを見出した。
【0034】
それゆえに、これらの突然変異を含む配列を有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の新しい、または商業的に入手可能なスパイクベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、またはそれをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡ配列における使用は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の使用と比較して、より高い安全性プロファイルを有する同等に有効な免疫応答を維持することを可能にする。
【0035】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防のためのワクチンにおける活性成分として使用するのに好適な、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体およびそのフラグメント、加えて、それらをコードするｍＲＮＡおよびＤＮＡを対象とする。
【0036】
したがって、本発明の第１の目的は、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体であって、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－ＰＯＤＴＣ２、配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体である。
【0037】
好ましくは、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている。
【0038】
好ましくは、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、少なくとも、配列番号１のアミノ酸８１８、８２１および８２２、またはアミノ酸８４１、またはアミノ酸８６１、８６４および８６５が、アラニンで置き換えられている。
【0039】
好ましくは、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、少なくとも、配列番号１のアミノ酸８１８、８２１および８２２、またはアミノ酸８４１および８４４、またはアミノ酸８６１、８６４および８６５が、アラニンで置き換えられている。
【0040】
一実施態様によれば、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるイソロイシンまたはロイシンが、アラニンで置き換えられている。
【0041】
この実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
別の好ましい実施態様によれば、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８４１および８４４に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンが、アラニンで置き換えられている。この実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。
別の好ましい実施態様によれば、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８４１および８４４に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンが、アラニンで置き換えられている。この実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。
【0042】
別の好ましい実施態様によれば、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンが、アラニンで置き換えられている。この実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する。
【0043】
別の好ましい実施態様によれば、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンが、アラニンで置き換えられている。この実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する。
【0044】
別の好ましい実施態様によれば、本発明による前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体において、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンが、アラニンで置き換えられている。
【0045】
この実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する。
上記で論じられたように、さらに実験の章で実証されたように、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に導入されたアミノ酸の置き換えは、核ホルモン受容体上のスパイクタンパク質の活性を阻害することができ、同時に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のコンフォメーションおよび抗原性特性を改変しない。
上記で論じられたように、さらに実験の章で実証されたように、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に導入されたアミノ酸の置き換えは、核ホルモン受容体上のスパイクタンパク質の活性を阻害することができ、同時に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のコンフォメーションおよび抗原性特性を改変しない。
【0046】
本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、突然変異タンパク質の安定性を改善したり、またはスパイクタンパク質のアミノ酸配列における改変を特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの対象となる変異体に対する免疫原性活性を改善したりするさらなる置換、または欠失もしくは挿入を導入することによって改変されてもよい。
【0047】
したがって、本発明のさらなる目的は、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のいずれかの変異体である。
本発明による変異体において、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている。
本発明による変異体において、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸イソロイシンまたはロイシンの少なくとも１つが、アラニンで置き換えられている。
【0048】
好ましくは、前記変異体は、野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置において、対応する突然変異ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２タンパク質の同じアミノ酸を有する。
【0049】
より好ましくは、前記変異体は、以下の位置：
－ 配列番号１のアミノ酸８１８に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８２２に対応する位置のアミノ酸配列、
－ 配列番号１のアミノ酸８４１に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８４４に対応する位置のアミノ酸配列、および
－ 配列番号１のアミノ酸８６１～配列番号１の８６５位に対応する位置のアミノ酸配列
において、対応する突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の同じアミノ酸配列を有する。
－ 配列番号１のアミノ酸８１８に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８２２に対応する位置のアミノ酸配列、
－ 配列番号１のアミノ酸８４１に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８４４に対応する位置のアミノ酸配列、および
－ 配列番号１のアミノ酸８６１～配列番号１の８６５位に対応する位置のアミノ酸配列
において、対応する突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の同じアミノ酸配列を有する。
【0050】
好ましくは、変異体は、上述した配列番号１のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置におけるアミノ酸の置き換えを示す。
【0051】
本発明によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の「変異体」は、アミノ酸の１つまたはそれより多くの置換、欠失または挿入を含有するという点で上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。アミノ酸の前記置換、欠失または挿入は、配列番号１のアミノ酸８１８、８２１、８２２、８４１、８４４、８６１、８６４および８６５に対応する位置を除く任意の位置であってもよい。好ましくは、前記置換、欠失または挿入は、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のコンフォメーションおよび抗原性特性に干渉しない。より好ましくは、前記置換、欠失または挿入は、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の抗原性特性および／または安定性を改善する。好ましくは、変異体は、上述した対応する突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％のアミノ酸同一性を有する配列を有する。
【0052】
好ましい一実施態様において、前記変異体は、融合前コンフォメーションのタンパク質を安定化するアミノ酸の置き換えを有する配列を有する。このコンフォメーションにおけるスパイクタンパク質の抗原としての使用は、感染の早期段階で、ウイルスが細胞に侵入する前に、ウイルスに応答し、それを不活性化することができる抗体の生産を誘導し、そのようにして、ワクチンの効能を有意に増加させる。
【0053】
融合前の状態のスパイクタンパク質を安定化するアミノ酸の置き換えを有する多数のスパイク変異体がすでに同定されている。これらのなかでも、例えば、ファイザー／ビオンテック（ＢＮＴ１６２ｂ）およびモデルナ（ｍＲＮＡ－１２７３）の両方からの、ｍＲＮＡワクチンによってコードされる、アミノ酸の置き換えＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを有する突然変異ＳＡＲＳ－２－Ｓスパイクタンパク質（Ｓ－２Ｐ）が挙げられる。さらに、安定な融合前コンフォメーションを有し、Ｓ－２Ｐと比較してより高い発現収量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の代替変異体も文献に記載されている。これらは、置き換えＡ８９２ＰおよびＡ９４２ＰまたはＦ８１７ＰおよびＡ８９９Ｐを特徴とする。最終的に、文献に記載される安定性および発現に関して最も有望な変異体は、上述した６つ全てのアミノ酸の置き換えを含むＨｅｘａＰｒｏ変異体である。
【0054】
１つの好ましい実施態様によれば、本発明による変異体において、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の以下のアミノ酸：
－ 配列番号１のアミノ酸８９２、８９９および９４２に対応する位置におけるアラニン、
－ 配列番号１のアミノ酸８１７に対応する位置におけるフェニルアラニン、
－ 配列番号１のアミノ酸９８６に対応する位置におけるリジン、および
－ 配列番号１のアミノ酸９８７に対応する位置におけるバリン
のうちの少なくとも２つが、プロリンで置き換えられている。
－ 配列番号１のアミノ酸８９２、８９９および９４２に対応する位置におけるアラニン、
－ 配列番号１のアミノ酸８１７に対応する位置におけるフェニルアラニン、
－ 配列番号１のアミノ酸９８６に対応する位置におけるリジン、および
－ 配列番号１のアミノ酸９８７に対応する位置におけるバリン
のうちの少なくとも２つが、プロリンで置き換えられている。
【0055】
本発明のこの実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の融合前のコンフォメーションを安定化する突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の特に好ましい変異体が本明細書の以下で提供される。
【0056】
第１の変異体は、配列番号２の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２の９８６位におけるアミノ酸のリジンおよび配列番号２の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３）。
【0057】
第２の変異体は、配列番号２の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４）。
【0058】
第３の変異体は、配列番号２の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニンおよび配列番号２の８９９位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号５）。
【0059】
第４の変異体は、配列番号２の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２の９８６位におけるアミノ酸のリジン、配列番号２の９８７位におけるバリン、ならびに配列番号２の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号６）。
【0060】
第５の変異体は、配列番号２の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号２の８９２、８９９および９４２位におけるアラニン、配列番号２の９８６位におけるリジン、ならびに配列番号２の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号７）。
【0061】
第６の変異体は、配列番号２の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号２の８９２、８９９および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号８）。
【0062】
第７の変異体は、配列番号２８の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２８の９８６位におけるアミノ酸のリジンおよび配列番号２８の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３２）。
【0063】
第８の変異体は、配列番号２８の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２８の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３３）。
【0064】
第９の変異体は、配列番号２８の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２８の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニンおよび配列番号２８の８９９位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３４）。
【0065】
第１０の変異体は、配列番号２８の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２８の９８６位におけるアミノ酸のリジン、配列番号２８の９８７位におけるバリン、ならびに配列番号２８の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３５）。
【0066】
第１１の変異体は、配列番号２８の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２８の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号２８の８９２、８９９および９４２位におけるアラニン、配列番号２８の９８６位におけるリジン、ならびに配列番号２８の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３６）。
【0067】
第１２の変異体は、配列番号２８の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２８の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号２８の８９２、８９９および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３７）。
【0068】
第１３の変異体は、配列番号２９の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２９の９８６位におけるアミノ酸のリジンおよび配列番号２９の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３８）。
【0069】
第１４の変異体は、配列番号２９の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２９の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号３９）。
【0070】
第１５の変異体は、配列番号２９の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２９の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニンおよび配列番号２９の８９９位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４０）。
【0071】
第１６の変異体は、配列番号２９の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２９の９８６位におけるアミノ酸のリジン、配列番号２９の９８７位におけるバリン、ならびに配列番号２９の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４１）。
【0072】
第１７の変異体は、配列番号２９の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２９の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号２９の８９２、８９９および９４２位におけるアラニン、配列番号２９の９８６位におけるリジン、ならびに配列番号２９の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４２）。
【0073】
第１８の変異体は、配列番号２９の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号２９の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号２９の８９２、８９９および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４３）。
【0074】
第１９の変異体は、配列番号３０の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３０の９８６位におけるアミノ酸のリジンおよび配列番号３０の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４４）。
【0075】
第２０の変異体は、配列番号３０の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３０の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４５）。
【0076】
第２１の変異体は、配列番号３０の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３０の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニンおよび配列番号３０の８９９位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４６）。
【0077】
第２２の変異体は、配列番号３０の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３０の９８６位におけるアミノ酸のリジン、配列番号３０の９８７位におけるバリン、ならびに配列番号３０の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４７）。
【0078】
第２３の変異体は、配列番号３０の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３０の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号３０の８９２、８９９および９４２位におけるアラニン、配列番号３０の９８６位におけるリジン、ならびに配列番号３０の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４８）。
【0079】
第２４の変異体は、配列番号３０の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３０の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号３０の８９２、８９９および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号４９）。
【0080】
第２５の変異体は、配列番号３１の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３１の９８６位におけるアミノ酸のリジンおよび配列番号３１の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号５０）。
【0081】
第２６の変異体は、配列番号３１の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３１の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号５１）。
【0082】
第２７の変異体は、配列番号３１の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３１の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニンおよび配列番号３１の８９９位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号５２）。
【0083】
第２８の変異体は、配列番号３１の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３１の９８６位におけるアミノ酸のリジン、配列番号３１の９８７位におけるバリン、ならびに配列番号３１の８９２および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号５３）。
【0084】
第２９の変異体は、配列番号３１の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３１の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号３１の８９２、８９９および９４２位におけるアラニン、配列番号３１の９８６位におけるリジン、ならびに配列番号３１の９８７位におけるバリンが、プロリンで置き換えられている（配列番号５４）。
【0085】
第３０の変異体は、配列番号３１の突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の変異体であり、配列番号３１の８１７位におけるアミノ酸のフェニルアラニン、配列番号３１の８９２、８９９および９４２位におけるアラニンが、プロリンで置き換えられている（配列番号５５）。
【0086】
ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにおける活性成分として使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を安定化するために、タンパク質をプロテアーゼ耐性にするタンパク質の変異体を使用することが有利であるとも記載されている。例えば、ワクチン候補ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３は、活性成分として、タンパク質の抗原性特性に干渉せず、プロテアーゼ耐性を著しく増加させるアミノ酸の置き換えＲ６８２Ｑ、Ｒ６８３Ｑ、Ｒ６８５Ｑを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体を含有する。プロテアーゼのフューリンによるタンパク質の切断を防止するさらなるアミノ酸の置き換えは、アミノ酸の置き換えＲ６８５Ａである。
【0087】
さらに好ましい実施態様によれば、上記の好ましい実施態様のいずれかとも組み合わせて、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体において、配列番号１のアミノ酸６８２、６８３および６８５に対応する位置におけるアミノ酸のアルギニンは、グルタミンで置き換えられている。
【0088】
この実施態様による特に好ましい変異体は、配列番号１のアミノ酸６８２、６８３および６８５に対応する位置におけるアミノ酸のアルギニンのグルタミンでの置き換えをさらに含有する上述した変異体のいずれかである。
【0089】
この実施態様による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の特に好ましい変異体は、配列番号９～配列番号１５のアミノ酸配列を有するもの（変異体３１～３７）である。
さらに好ましい実施態様によれば、上記の好ましい実施態様のいずれかとも組み合わせて、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体において、配列番号１のアミノ酸６８５に対応する位置におけるアミノ酸のアルギニンが、アラニンで置き換えられている。
さらに好ましい実施態様によれば、上記の好ましい実施態様のいずれかとも組み合わせて、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体において、配列番号１のアミノ酸６８５に対応する位置におけるアミノ酸のアルギニンが、アラニンで置き換えられている。
【0090】
この実施態様による特に好ましい変異体は、配列番号１のアミノ酸６８５に対応する位置におけるアミノ酸のアルギニンのアラニンでの置き換えをさらに含有する上述した変異体のいずれかである。
【0091】
スパイクタンパク質のアミノ酸配列に改変を有するＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスの対象となる変異体に対する免疫応答を増加させるために、このような改変を取り込んだＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質配列に基づくワクチンが開発中である。
【0092】
したがって、さらに好ましい実施態様によれば、上記の好ましい実施態様のいずれかとも組み合わせて、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体は、デルタ（Ｂ．１．６１７．２）：およびオミクロン（ＢＡ．１）ウイルス変異体のスパイクタンパク質に見出されるアミノ酸改変を含む。
【0093】
この実施態様によれば、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の変異体は、以下に列挙した配列番号１のアミノ酸に対応する位置における以下のアミノ酸改変を含有する：
－ Ｔ１９Ｒ、ＥＦ１５６／１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１ＲおよびＤ９５０Ｎ、または
－ Ａ６７Ｖ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
－ Ｔ１９Ｒ、ＥＦ１５６／１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１ＲおよびＤ９５０Ｎ、または
－ Ａ６７Ｖ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
【0094】
この実施態様による特に好ましい変異体は、以下に列挙した配列番号１のアミノ酸に対応する位置における以下のアミノ酸改変をさらに含有する上述した変異体のいずれかである：
Ｔ１９Ｒ、ＥＦ１５６／１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１ＲおよびＤ９５０Ｎ、または
Ａ６７Ｖ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
Ｔ１９Ｒ、ＥＦ１５６／１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１ＲおよびＤ９５０Ｎ、または
Ａ６７Ｖ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
【0095】
多数のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン候補が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の免疫原性フラグメントまたはそれをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡに基づく（Forniら、Cell Death & Differentiation 2021、28:626～639）。
【0096】
実験の章で実証されたように、野生型スパイクタンパク質における発明者らによって同定されたＬｘｘＬＬモチーフは、核内受容体を活性化する能力を有する。
それゆえに、このタイプのワクチンに関して、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の免疫原性フラグメントまたはその変異体の使用は、すでに上記で論じられた理由のために有利である。
それゆえに、このタイプのワクチンに関して、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の免疫原性フラグメントまたはその変異体の使用は、すでに上記で論じられた理由のために有利である。
【0097】
したがって、本発明のさらなる目的は、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体の免疫原性フラグメントであり、前記フラグメントは、
－ 配列番号１のアミノ酸８１８に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８２２に対応する位置のアミノ酸配列、
－ 配列番号１のアミノ酸８４１に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８４４に対応する位置のアミノ酸配列、および
－ 配列番号１のアミノ酸８６１～配列番号１の８６５位に対応する位置のアミノ酸配列
から選択される、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の少なくとも１つの配列を含む。
－ 配列番号１のアミノ酸８１８に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８２２に対応する位置のアミノ酸配列、
－ 配列番号１のアミノ酸８４１に対応する位置～配列番号１のアミノ酸８４４に対応する位置のアミノ酸配列、および
－ 配列番号１のアミノ酸８６１～配列番号１の８６５位に対応する位置のアミノ酸配列
から選択される、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の少なくとも１つの配列を含む。
【0098】
したがって、本発明のさらなる目的は、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体の免疫原性フラグメントであり、前記フラグメントは、
－ 配列番号２または配列番号３１の８１８位～８２２位のアミノ酸配列、
－ 配列番号２、配列番号２８、配列番号３０または配列番号３１の８４１位～８４４位のアミノ酸配列、および
－ 配列番号２、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の８６１位～８６５位のアミノ酸配列
から選択される、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の少なくとも１つの配列を含む。
－ 配列番号２または配列番号３１の８１８位～８２２位のアミノ酸配列、
－ 配列番号２、配列番号２８、配列番号３０または配列番号３１の８４１位～８４４位のアミノ酸配列、および
－ 配列番号２、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の８６１位～８６５位のアミノ酸配列
から選択される、前記突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または変異体の少なくとも１つの配列を含む。
【0099】
したがって、本発明のさらなる目的は、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体の免疫原性フラグメントであり、前記フラグメントは、配列番号２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１のアミノ酸８１８～アミノ酸８６５のアミノ酸配列に対応する配列を含む。
【0100】
本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体の「フラグメント」は、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端で短縮化された配列に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。
【0101】
本発明による免疫原性フラグメントは、宿主において防御免疫応答を開始させることができるエピトープを含有する。
配列番号１の配列２３２～２４６、２３３～２４７、４７１～５０３、６０４～６２５、８１７～８３３、８９１～９０７、８９７～９１３、１１６４～１１９１、１１８２～１２０９に対応する、自己免疫応答を開始させるリスクが低減された、防御抗体の生産を刺激する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエピトープが同定された。それとは逆に、ペプチド５９７～６０３が、エピトープ配列依存性を介して感染を強化する抗体を誘導することが見出された。
配列番号１の配列２３２～２４６、２３３～２４７、４７１～５０３、６０４～６２５、８１７～８３３、８９１～９０７、８９７～９１３、１１６４～１１９１、１１８２～１２０９に対応する、自己免疫応答を開始させるリスクが低減された、防御抗体の生産を刺激する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエピトープが同定された。それとは逆に、ペプチド５９７～６０３が、エピトープ配列依存性を介して感染を強化する抗体を誘導することが見出された。
【0102】
したがって、好ましくは、本発明による免疫原性フラグメントは、以下のアミノ酸配列から選択される、少なくとも２つの、オーバーラップしない配列をさらに含有する：
－ 配列番号１の２３２位～２４６位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の２３３位～２４７位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の４７１位～５０３位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の６０４位～６２５位のアミノ酸配列、
－ 配列番号２または配列番号３１の８１７位～８３３位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の８９１位～９０７位のアミノ酸配列
－ 配列番号１の８９７位～９１３位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の１１６４位～１１９１位のアミノ酸配列、および
－ 配列番号１の１１８２位～１２０９位のアミノ酸配列。
－ 配列番号１の２３２位～２４６位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の２３３位～２４７位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の４７１位～５０３位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の６０４位～６２５位のアミノ酸配列、
－ 配列番号２または配列番号３１の８１７位～８３３位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の８９１位～９０７位のアミノ酸配列
－ 配列番号１の８９７位～９１３位のアミノ酸配列、
－ 配列番号１の１１６４位～１１９１位のアミノ酸配列、および
－ 配列番号１の１１８２位～１２０９位のアミノ酸配列。
【0103】
好ましくは、本発明による免疫原性フラグメントは、配列番号２、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の８６５位～１２０９位のアミノ酸配列を含む。
好ましくは、本発明による免疫原性フラグメントは、配列番号１の４７１位～８１７位のアミノ酸配列を含む。
好ましくは、本発明による免疫原性フラグメントは、配列番号１の４７１位～８１７位のアミノ酸配列を含む。
【0104】
好ましくは、本発明による免疫原性フラグメントは、配列番号１の２３２位～４７０位のアミノ酸配列を含む。
好ましくは、本発明の変異体またはフラグメントは、配列番号１の５９７位～６０３位のアミノ酸配列を含有しない。
好ましくは、本発明の変異体またはフラグメントは、配列番号１の５９７位～６０３位のアミノ酸配列を含有しない。
【0105】
本発明のさらなる目的は、本発明による突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体またはそのフラグメントのアミノ酸配列および１つまたはそれより多くの追加の配列を含むタンパク質である。
【0106】
１つの好ましい実施態様によれば、前記追加の配列は、免疫原性ではなく、タンパク質またはフラグメント特異的な機能特性、例えば組織分布に関するそのような特性を付与するために使用される。
【0107】
別の好ましい実施態様によれば、前記追加の配列は、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体またはそのフラグメントのエピトープに対する免疫応答を刺激することができる。
【0108】
本発明のさらなる目的は、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体、ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡである。
好ましい実施態様によれば、安定性を増加させ、インビボにおける分解を回避するために、前記ｍＲＮＡは、ヌクレオシドが改変されたｍＲＮＡ配列である。
好ましい実施態様によれば、安定性を増加させ、インビボにおける分解を回避するために、前記ｍＲＮＡは、ヌクレオシドが改変されたｍＲＮＡ配列である。
【0109】
好ましい実施態様によれば、前記ヌクレオシドが改変されたｍＲＮＡ配列において、ウリジン残基は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン、４－チオシュードウリジン、２－チオシュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、１－カルボキシメチルシュードウリジン、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチルシュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、１－タウリノメチル－４－チオウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチルシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジンから選択される改変されたヌクレオシド（修飾ヌクレオシド）で置き換えられ、好ましくは１－メチルシュードウリジンで置き換えられる。
【0110】
別の実施態様によれば、好ましくはｍＲＮＡをさらに安定化するために、本発明によるｍＲＮＡのコード領域は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の対応するコード領域中に存在するＧ／Ｃ含量と比較して増加したＧ／Ｃを含有する。これは、Ｇ／Ｃ比率の増加を可能にする同義コドン置換を配列に導入することにより得られる。
【0111】
別の実施態様によれば、好ましくは、本発明によるｍＲＮＡにおいて、コドン出現頻度は、ヒト細胞における発現のために最適化されている。
本発明のさらなる目的は、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体またはそのペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
本発明のさらなる目的は、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体またはそのペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
【0112】
好ましい実施態様によれば、前記ＤＮＡは、プラスミドに含有される。好ましくは、前記プラスミドは、少なくともプロモーターおよび停止コドンを含有する。
代替の好ましい実施態様によれば、前記ＤＮＡは、ウイルスベクターに含有される。
代替の好ましい実施態様によれば、前記ＤＮＡは、ウイルスベクターに含有される。
【0113】
前記ウイルスベクターは、非複製性であってもよいし、または複製性であってもよい。前記ウイルスベクターは、好ましくは、アデノまたはポックスウイルスから選択される。より好ましくは、前記ウイルスベクターは、アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクター、アデノウイルス２６型（Ａｄ２６）ベクター、複製欠損サルアデノウイルスＣｈＡｄＯｘｉベクターから選択される。
【0114】
本発明によるタンパク質、ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、当業界において周知の方法によって調製することができる。
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防での使用のための、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体もしくはそのペプチド、またはそれらをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡである。
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防での使用のための、上述した突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体もしくはそのペプチド、またはそれらをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡである。
【0115】
本発明のさらなる目的は、上記で定義された突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、変異体もしくはそのフラグメント、またはそれらをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡを含有するワクチン組成物である。
【0116】
ワクチン組成物は、好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９の予防における使用のためのものである。ワクチンは、タンパク質または核酸ベースのワクチンの調製のための周知の技術、例えばＢａｔｔｙら、ＡｄｖＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ２０２１、１６９：１６８～１８９に記載されるような技術に従って製剤化することができる。
【0117】
好ましくは、前記ワクチンは、アジュバント剤を含有する。
本発明による「アジュバント」は、組成物の免疫刺激性特性を強化することができる成分である。
本発明による「アジュバント」は、組成物の免疫刺激性特性を強化することができる成分である。
【0118】
前記アジュバントは、当業者周知であり、使用される特定の抗原および配合物に好適なアジュバントから選択される。
本発明によるワクチンは、非経口投与によって投与されてもよく、好ましくは皮内、筋肉内または皮下投与、経口投与または経鼻投与によって投与されてもよい。
本発明によるワクチンは、非経口投与によって投与されてもよく、好ましくは皮内、筋肉内または皮下投与、経口投与または経鼻投与によって投与されてもよい。
【0119】
実施例
【実施例1】
【0120】
遺伝子情報科学的分析
材料および方法
１． インタラクトーム分析
物理的な相互作用に加えて機能的な関連の両方を含むタンパク質間の全ての公知の予測された関連を統合するＳＴＲＩＮＧデータベース［Szklarczyk Dら、Nucleic Acids Res.2021、49:D605～D612、doi:10.1093/nar/gkaa1074］を使用して、生体分子間の機能的な関連を分析した。各タンパク質－タンパク質相互作用は、「スコア」で注釈が付けられる。このスコアは相互作用の強度または特異度を示さないが、信頼性のみを示す。全てのスコアは０から１でランク付けし、１は、最も高い可能性のある信頼性である。
材料および方法
１． インタラクトーム分析
物理的な相互作用に加えて機能的な関連の両方を含むタンパク質間の全ての公知の予測された関連を統合するＳＴＲＩＮＧデータベース［Szklarczyk Dら、Nucleic Acids Res.2021、49:D605～D612、doi:10.1093/nar/gkaa1074］を使用して、生体分子間の機能的な関連を分析した。各タンパク質－タンパク質相互作用は、「スコア」で注釈が付けられる。このスコアは相互作用の強度または特異度を示さないが、信頼性のみを示す。全てのスコアは０から１でランク付けし、１は、最も高い可能性のある信頼性である。
【0121】
２． ３Ｄモデル選択
スパイク３Ｄモデルを、その野生型の形態に戻し、完全にグリコシル化されたＰＤＢ ６ＶＹＢに基づいて構築した。３つのプロトマーの非対称グリコシル化を、公開されたＮ－グリカンおよびＯ－グリカンの糖分析データから導き出した（Casalini Lら、ACS Cent.Sci.2020、6:1722～1734、https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c01056）。Ａｍｂｅｒ１４ＳＢ力場を使用して、タンパク質をモデル化し（Maier J Aら、J.Chem.Theory Comput.2015、11:3696～3713、https://doi.org/10.1021/acs.jcts.5b00255）、ＧＬＹＣＡＭ０６力場のＧＬＹＣＡＭ０６Ｊ－１バージョンによって、炭水化物成分をモデル化した（Kirschner KNら、J.Comput.Chem.2008、29:622～655、https://doi.org/10.1002/jcc.20820）。このようにして調製された構造を、分子ドッキングシミュレーションの開始点として使用した。ｐｄｂ２ｇｍｘ ＧＲＯＭＡＣＳツールを用いて、ａｍｂｅｒ９９ｓｂ力場を使用してトポロジーファイルを作成した（Lindorff-Larsen Kら、Proteins 2010、78:1950～1958、https://dx.doi.org/10.1002/prot.22711）。タンパク質を三斜晶系ボックスに挿入し、溶質から１５Åまで伸長させ、ＴＩＰ３Ｐ水分子に浸漬した（Jorgensen WLら、J Chem Phys 1983、79:926～935、https://dx.doi.org/10.1063/1.445869）。対イオンを付加して、ゲニオン（genion）ＧＲＯＭＡＣＳツールを用いて全体的な電荷を中和した。エネルギー最小化の後、タンパク質原子に対して１０００ｋＪ・ｍｏｌ－１ｎｍ－２の位置的な拘束を適用することによって５ｎｓにわたりシステムを緩和させた。この工程の後、非拘束ＭＤシミュレーションを、ＧＲＯＭＡＣＳ ２０１８．３シミュレーションパッケージを使用して、２ｆｓのタイムステップで１マイクロ秒の長さにわたり行った（スーパーコンピュータのガリレオ（Galileo）およびマルコーニ（Marconi）－１００、ＣＩＮＥＣＡ、ボローニャ、イタリア）（Abraham MJら、SoftwareX 2015、1:19～25、https://dx.doi.org/10.1016/j.softx.2015.06.001）。Ｖ－リスケール温度カップリングを採用して、温度を３００Ｋで一定に維持した（Bussi Gら、J Chem Phys、2007126:014101. https://dx.doi.org/10.1063/1.2408420）。粒子・メッシュ・エバルトの方法を、長期にわたる静電的相互作用の処理のために使用した（Darden Tら、J.Chem.Phys 1993、98:10089、https://doi.org/10.1063/1.464397）。各軌道の最初の５ｎｓを分析から除外した。１マイクロ秒のＭＤシミュレーションの後に得られた軌道を、代表的な構造を得るためにクラスター化した。特定には、ドッキング研究に使用される構造は、ＭＤ実験から抽出された第１のクラスターの第１の重心である。
スパイク３Ｄモデルを、その野生型の形態に戻し、完全にグリコシル化されたＰＤＢ ６ＶＹＢに基づいて構築した。３つのプロトマーの非対称グリコシル化を、公開されたＮ－グリカンおよびＯ－グリカンの糖分析データから導き出した（Casalini Lら、ACS Cent.Sci.2020、6:1722～1734、https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c01056）。Ａｍｂｅｒ１４ＳＢ力場を使用して、タンパク質をモデル化し（Maier J Aら、J.Chem.Theory Comput.2015、11:3696～3713、https://doi.org/10.1021/acs.jcts.5b00255）、ＧＬＹＣＡＭ０６力場のＧＬＹＣＡＭ０６Ｊ－１バージョンによって、炭水化物成分をモデル化した（Kirschner KNら、J.Comput.Chem.2008、29:622～655、https://doi.org/10.1002/jcc.20820）。このようにして調製された構造を、分子ドッキングシミュレーションの開始点として使用した。ｐｄｂ２ｇｍｘ ＧＲＯＭＡＣＳツールを用いて、ａｍｂｅｒ９９ｓｂ力場を使用してトポロジーファイルを作成した（Lindorff-Larsen Kら、Proteins 2010、78:1950～1958、https://dx.doi.org/10.1002/prot.22711）。タンパク質を三斜晶系ボックスに挿入し、溶質から１５Åまで伸長させ、ＴＩＰ３Ｐ水分子に浸漬した（Jorgensen WLら、J Chem Phys 1983、79:926～935、https://dx.doi.org/10.1063/1.445869）。対イオンを付加して、ゲニオン（genion）ＧＲＯＭＡＣＳツールを用いて全体的な電荷を中和した。エネルギー最小化の後、タンパク質原子に対して１０００ｋＪ・ｍｏｌ－１ｎｍ－２の位置的な拘束を適用することによって５ｎｓにわたりシステムを緩和させた。この工程の後、非拘束ＭＤシミュレーションを、ＧＲＯＭＡＣＳ ２０１８．３シミュレーションパッケージを使用して、２ｆｓのタイムステップで１マイクロ秒の長さにわたり行った（スーパーコンピュータのガリレオ（Galileo）およびマルコーニ（Marconi）－１００、ＣＩＮＥＣＡ、ボローニャ、イタリア）（Abraham MJら、SoftwareX 2015、1:19～25、https://dx.doi.org/10.1016/j.softx.2015.06.001）。Ｖ－リスケール温度カップリングを採用して、温度を３００Ｋで一定に維持した（Bussi Gら、J Chem Phys、2007126:014101. https://dx.doi.org/10.1063/1.2408420）。粒子・メッシュ・エバルトの方法を、長期にわたる静電的相互作用の処理のために使用した（Darden Tら、J.Chem.Phys 1993、98:10089、https://doi.org/10.1063/1.464397）。各軌道の最初の５ｎｓを分析から除外した。１マイクロ秒のＭＤシミュレーションの後に得られた軌道を、代表的な構造を得るためにクラスター化した。特定には、ドッキング研究に使用される構造は、ＭＤ実験から抽出された第１のクラスターの第１の重心である。
【0122】
エストロゲン受容体に関して、エストラジオールおよび核内受容体コアクチベーター１を含有するコード３ＯＬＬを用いたＸＲＡＹ ＰＤＢモデルを使用した（Mocklinghoff Sら、ChemBioChem 2010、11:2251～2254、https://doi.org/10.1QQ2/cbic.2Q1000532）。
【0123】
３． タンパク質－タンパク質ドッキング手順
一方は受容体に関し、他方はリガンドに関する２つの個々のタンパク質の入力を準備した。特定には、スパイクタンパク質およびＥＲを、それぞれ受容体およびリガンドとして使用した。次いで、ＨＤＯＣＫツールは、ＦＦＴベースの検索方法を介してサンプルに推定の結合モードをドッキングすることを実行し、次いでタンパク質－タンパク質相互作用をスコア付けする。最後に、上位１００種の予測された複合体構造を提供し、最良の１０種の仮説を視覚的に検査して、計算の信頼度を確認した。ワークフロー全体が記載されている（Yan Yら、Nat Protoc 2020、15:1829～1852、https://doi.org/10.1038/s41596-020-0312-x）。
一方は受容体に関し、他方はリガンドに関する２つの個々のタンパク質の入力を準備した。特定には、スパイクタンパク質およびＥＲを、それぞれ受容体およびリガンドとして使用した。次いで、ＨＤＯＣＫツールは、ＦＦＴベースの検索方法を介してサンプルに推定の結合モードをドッキングすることを実行し、次いでタンパク質－タンパク質相互作用をスコア付けする。最後に、上位１００種の予測された複合体構造を提供し、最良の１０種の仮説を視覚的に検査して、計算の信頼度を確認した。ワークフロー全体が記載されている（Yan Yら、Nat Protoc 2020、15:1829～1852、https://doi.org/10.1038/s41596-020-0312-x）。
【0124】
スパイクタンパク質と核エストロゲン受容体（ＥＲ）との結合メカニズムに関する構造情報がないことを考慮して、第１のチェックは、エストロゲン受容体と相互作用することが知られているタンパク質の同定を含んでいた。これらのＥＲと相互作用するタンパク質を同定した後、第２の工程は、スパイクタンパク質とＥＲエフェクタータンパク質とのあらゆる配列類似性の研究を含んでいた。
【0125】
実施例１ａ
核内受容体コアクチベーターおよびＬｘｘＬＬモチーフ
多くの転写因子およびコファクターは、エフェクタータンパク質との相互作用を確実にする共通の構造的なモチーフを示す。これらのタンパク質－タンパク質相互作用に参加するモチーフは、ＬｘｘＬＬ（ＬＤＸ）と呼ばれ、転写制御の様々な態様に関連する（Plevin MJら、Trends Biochem Sci 2005、30:66～69. https://dx.doi.org/10.1016/j.tibs.2004.12.001）。ＬｘｘＬＬ配列は、最初に、核内受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の活性化機能－２（ＡＦ－２）領域と結合するタンパク質において同定された。これらのモチーフは、コアクチベーター（ＮＣＯＡ－１、２および３）を含む多くの核受容体結合タンパク質を用いた核受容体の制御において基礎となるものである（Heery DMら、Nature 1997、387:733～736、https://doi.org/10.1038/42750）。
核内受容体コアクチベーターおよびＬｘｘＬＬモチーフ
多くの転写因子およびコファクターは、エフェクタータンパク質との相互作用を確実にする共通の構造的なモチーフを示す。これらのタンパク質－タンパク質相互作用に参加するモチーフは、ＬｘｘＬＬ（ＬＤＸ）と呼ばれ、転写制御の様々な態様に関連する（Plevin MJら、Trends Biochem Sci 2005、30:66～69. https://dx.doi.org/10.1016/j.tibs.2004.12.001）。ＬｘｘＬＬ配列は、最初に、核内受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の活性化機能－２（ＡＦ－２）領域と結合するタンパク質において同定された。これらのモチーフは、コアクチベーター（ＮＣＯＡ－１、２および３）を含む多くの核受容体結合タンパク質を用いた核受容体の制御において基礎となるものである（Heery DMら、Nature 1997、387:733～736、https://doi.org/10.1038/42750）。
【0126】
ＥＲとＮＣＯＡとの相互作用を示す実験的および構造的な確認により、ＬｘｘＬＬモチーフに焦点を当てることが可能になり、それから開始して、スパイクタンパク質配列のマッピングを行い、ＥＲとその核コアクチベーターとの相互作用を模擬できるスパイクの構造的なモチーフおよび相同な部分を検索した（図１）。
【0127】
実施例１ｂ
エストロゲン受容体結合タンパク質ネットワーク分析
ＥＲ１およびＥＲ２の最も重要な相互作用のネットワーク（図２）は、最も信頼できるＥＲ１およびＥＲ２と相互作用するタンパク質のなかでも、核内受容体コアクチベーター（ＮＣＯＡ）は核内受容体と直接結合し、転写活性を刺激することを強調する。ＮＡＣＯとスパイクとの配列アライメントをウイルスタンパク質の３次元分析と組み合わせることにより、原則的にＥＲとの相互作用領域の場所として作用することができる外部ゾーンにおいて、スパイクタンパク質が、ＬＤＸモチーフ（ＬＰＰＬＬ、野生型スパイクにおいてアミノ酸８６１～８６５）およびＬｘｘＬＬに相同な２つのモチーフ（ＩＥＤＬＬ、野生型スパイクにおいて、アミノ酸８１８～８２２およびＬＧＤＩＡ、アミノ酸８４１～８４６）を含有することが明らかになったが、これは、構造的な視点からも妥当である（実際に、これらの領域はアルファ－へリックスコンフォメーションの形態をとる）。様々なＬＤＸドメインが、特定のコファクター－受容体相互作用と関連しており、スパイクＬＤＸ１は、ＮＣＯＡ１ ＬＤＸ４に類似しており、クラスＩＩＩドメインに属する（図３）（Savkur RSら、J Pept Res 2004、63:207～212、http://dx.doi.org/10.1111/M399-3011.2004.00126.x。
エストロゲン受容体結合タンパク質ネットワーク分析
ＥＲ１およびＥＲ２の最も重要な相互作用のネットワーク（図２）は、最も信頼できるＥＲ１およびＥＲ２と相互作用するタンパク質のなかでも、核内受容体コアクチベーター（ＮＣＯＡ）は核内受容体と直接結合し、転写活性を刺激することを強調する。ＮＡＣＯとスパイクとの配列アライメントをウイルスタンパク質の３次元分析と組み合わせることにより、原則的にＥＲとの相互作用領域の場所として作用することができる外部ゾーンにおいて、スパイクタンパク質が、ＬＤＸモチーフ（ＬＰＰＬＬ、野生型スパイクにおいてアミノ酸８６１～８６５）およびＬｘｘＬＬに相同な２つのモチーフ（ＩＥＤＬＬ、野生型スパイクにおいて、アミノ酸８１８～８２２およびＬＧＤＩＡ、アミノ酸８４１～８４６）を含有することが明らかになったが、これは、構造的な視点からも妥当である（実際に、これらの領域はアルファ－へリックスコンフォメーションの形態をとる）。様々なＬＤＸドメインが、特定のコファクター－受容体相互作用と関連しており、スパイクＬＤＸ１は、ＮＣＯＡ１ ＬＤＸ４に類似しており、クラスＩＩＩドメインに属する（図３）（Savkur RSら、J Pept Res 2004、63:207～212、http://dx.doi.org/10.1111/M399-3011.2004.00126.x。
【0128】
実施例１ｃ
スパイクタンパク質－ＥＲブラインドドッキング
ＥＲはウイルスタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と結合しないことを実験的に検証した（データは示されない）。インシリコの予測を確認し、検証するために、ウイルスＲＢＤ以外の領域で相互作用するＥＲの能力を、ＨＤＯＣＫサーバー［http://hdock.phys.hust.edu.cn/］を使用して、２つのタンパク質間のブラインドドッキングの平均によって評価した。ブラインドドッキングアプローチは、いかなる構造的なバイアスも考慮に入れず、完全にガイド無しである。見出された最良の結合の仮説は、証拠として、いわゆる「融合ペプチド部分」に属するスパイクタンパク質の側面領域に対するＥＲの高親和性を認めている（図４）。
スパイクタンパク質－ＥＲブラインドドッキング
ＥＲはウイルスタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と結合しないことを実験的に検証した（データは示されない）。インシリコの予測を確認し、検証するために、ウイルスＲＢＤ以外の領域で相互作用するＥＲの能力を、ＨＤＯＣＫサーバー［http://hdock.phys.hust.edu.cn/］を使用して、２つのタンパク質間のブラインドドッキングの平均によって評価した。ブラインドドッキングアプローチは、いかなる構造的なバイアスも考慮に入れず、完全にガイド無しである。見出された最良の結合の仮説は、証拠として、いわゆる「融合ペプチド部分」に属するスパイクタンパク質の側面領域に対するＥＲの高親和性を認めている（図４）。
【0129】
実施例１ｄ
スパイクタンパク質－ＥＲモチーフ配向ドッキング
ＥＲ残基がＮＣＯＡによって認識されるという構造情報を使用して、タンパク質－タンパク質相互作用を最適化することによってスパイクへのＥＲのドッキング研究をガイドした。入力としてタンパク質構造および残基の拘束を用いて、ＨＤＯＣＫサーバーによって好適なモデルを作成した。ＥＲとＮＣＯＡとの相互作用の構造情報がわかっていることを考慮して、ＮＣＯＡとの相互作用を保証するＥＲ残基を考慮した第２のドッキング研究を行うことによって、分子ドッキング手順をガイドした。ガイドされたドッキング研究から得た最良の結合仮説は、図５に示されており、ＬｘｘＬＬパターンに相同なモチーフを含有するスパイク領域へのＥＲの結合が強調される。
スパイクタンパク質－ＥＲモチーフ配向ドッキング
ＥＲ残基がＮＣＯＡによって認識されるという構造情報を使用して、タンパク質－タンパク質相互作用を最適化することによってスパイクへのＥＲのドッキング研究をガイドした。入力としてタンパク質構造および残基の拘束を用いて、ＨＤＯＣＫサーバーによって好適なモデルを作成した。ＥＲとＮＣＯＡとの相互作用の構造情報がわかっていることを考慮して、ＮＣＯＡとの相互作用を保証するＥＲ残基を考慮した第２のドッキング研究を行うことによって、分子ドッキング手順をガイドした。ガイドされたドッキング研究から得た最良の結合仮説は、図５に示されており、ＬｘｘＬＬパターンに相同なモチーフを含有するスパイク領域へのＥＲの結合が強調される。
【実施例2】
【0130】
がん細胞株における増殖活性のインビトロの評価
材料および方法
ペプチド２、５および７
相同なＬｘｘＬＬ様のコアから開始して、以下のアミノ酸配列を有する２、５および７と名付けられた３つのペプチドを合成した：
ペプチド２：ＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬ（配列番号１６）
ペプチド５：ＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩ（配列番号１７）
ペプチド７：ＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩ（配列番号１８）。
材料および方法
ペプチド２、５および７
相同なＬｘｘＬＬ様のコアから開始して、以下のアミノ酸配列を有する２、５および７と名付けられた３つのペプチドを合成した：
ペプチド２：ＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬ（配列番号１６）
ペプチド５：ＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩ（配列番号１７）
ペプチド７：ＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩ（配列番号１８）。
【0131】
ペプチドのそれぞれは、野生型スパイクタンパク質で見出されるＬｘｘＬＬモチーフのうちの１つを含有する。
ＣＡＳＬＯ ＡｐＳ（デンマーク工科大学（Technical University of Denmark)、DTU-Science Park Diplomvej 381、DK-2800 コンゲンス・リュンビュー、デンマーク）によって、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成プロトコールを使用してペプチドを合成した。各ペプチドをＮ末端でアセチル化し、Ｃ末端でアミド化し、それらを凍結乾燥した塩酸塩として貯蔵した。ペプチドの純度を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８－２５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ、１ｍＬ／分の流速；吸光度は２２０ｎｍで検出）によって評価し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によっても検証した。
ＣＡＳＬＯ ＡｐＳ（デンマーク工科大学（Technical University of Denmark)、DTU-Science Park Diplomvej 381、DK-2800 コンゲンス・リュンビュー、デンマーク）によって、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成プロトコールを使用してペプチドを合成した。各ペプチドをＮ末端でアセチル化し、Ｃ末端でアミド化し、それらを凍結乾燥した塩酸塩として貯蔵した。ペプチドの純度を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃ１８－２５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ、１ｍＬ／分の流速；吸光度は２２０ｎｍで検出）によって評価し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によっても検証した。
【0132】
試験濃度
スパイクタンパク質を、培地中１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。ラロキシフェンを、培地中２μＭの最終濃度で使用した。エストラジオールストック溶液をエタノールで調製し、希釈した培地中１ｎＭの最終濃度で使用した。ペプチドを、ＰＢＳで、４ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで１０ｕｇ／ｍｌの濃度をアッセイに使用した（培地中の最終濃度）。
スパイクタンパク質を、培地中１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。ラロキシフェンを、培地中２μＭの最終濃度で使用した。エストラジオールストック溶液をエタノールで調製し、希釈した培地中１ｎＭの最終濃度で使用した。ペプチドを、ＰＢＳで、４ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで１０ｕｇ／ｍｌの濃度をアッセイに使用した（培地中の最終濃度）。
【0133】
増殖アッセイ
細胞増殖を評価するために、ＢｒｄＵアッセイを実行した（アブカム（Abcam）、ＵＫ）。ＢｒｄＵは、活発に増殖する細胞の新たに合成されるＤＮＡに取り込まれる。２０ｕＬの希釈した１×ＢｒｄＵ標識を適切なウェルに添加し、２４時間インキュベートした。ＢｒｄＵを分裂細胞のＤＮＡに取り込ませた。取り込まれたＢｒｄＵへの抗体結合を可能にするために、細胞を固定し、透過化し、およびＤＮＡを変性する必要がある。これは全て、固定溶液での処理によって１工程で行われる。検出器である抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体をピペットでウェルに入れ、そのまま１時間インキュベートし、その間に、全ての取り込まれたＢｒｄＵに抗体を結合させる。様々な洗浄を実行して、未結合の抗体を洗い落とし、検出器抗体に結合するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を添加した。次いで、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加し、暗所で、室温で３０分間インキュベートした。最後に、反応を止めるために、停止溶液を添加した。プレートを、４５０ｎｍに設定された分光光度計マイクロタイタープレートリーダーを使用して読んだ。
細胞増殖を評価するために、ＢｒｄＵアッセイを実行した（アブカム（Abcam）、ＵＫ）。ＢｒｄＵは、活発に増殖する細胞の新たに合成されるＤＮＡに取り込まれる。２０ｕＬの希釈した１×ＢｒｄＵ標識を適切なウェルに添加し、２４時間インキュベートした。ＢｒｄＵを分裂細胞のＤＮＡに取り込ませた。取り込まれたＢｒｄＵへの抗体結合を可能にするために、細胞を固定し、透過化し、およびＤＮＡを変性する必要がある。これは全て、固定溶液での処理によって１工程で行われる。検出器である抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体をピペットでウェルに入れ、そのまま１時間インキュベートし、その間に、全ての取り込まれたＢｒｄＵに抗体を結合させる。様々な洗浄を実行して、未結合の抗体を洗い落とし、検出器抗体に結合するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を添加した。次いで、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加し、暗所で、室温で３０分間インキュベートした。最後に、反応を止めるために、停止溶液を添加した。プレートを、４５０ｎｍに設定された分光光度計マイクロタイタープレートリーダーを使用して読んだ。
【0134】
乳がん細胞株
ＭＣＦ－７細胞株は、浸潤性乳腺／乳癌細胞ホルモン依存性（両方ともエストロゲンおよびプロゲステロン受容体陽性）である。
ＭＣＦ－７細胞株は、浸潤性乳腺／乳癌細胞ホルモン依存性（両方ともエストロゲンおよびプロゲステロン受容体陽性）である。
【0135】
ＭＣＦ－７をＡＴＣＣから得て、５％ＣＯ２および９５％の加湿したインキュベーター（サーモ（Thermo）、米国）中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、コーニング（Corning）、米国）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミン（シグマ（Sigma）、米国）が補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で増殖させた。処理の前、ＦＢＳ中のエストロゲンレベルを低減させるために、５％デキストランでコーティングされたチャコール処理血清を含有するフェノールレッド非含有培地中で２４時間細胞を培養し、続いて０．２％ＢＳＡが補充されたフェノールレッド非含有の無血清培地中で少なくとも２４時間インキュベートした。
【0136】
実験の第１のセットにおいて、細胞を、エストラジオール、野生型スパイクタンパク質、ラロキシフェン、エストラジオールおよびラロキシフェン、野生型スパイクタンパク質およびラロキシフェン、エストラジオール、スパイクタンパク質およびラロキシフェンで２４時間処理し、増殖を測定した。
【0137】
図６に結果を示す。見てわかるように、エストラジオールとスパイクはどちらも実質的に細胞の増殖を増加させることができ、この活性はラロキシフェンでの同時処理によって打ち消された。これらのデータは、野生型スパイクが、ＥＲ媒介メカニズムを用いて乳がん細胞の増殖を誘導できることを実証する。
【0138】
実験の第２のセットにおいて、細胞を、ペプチド２、５および７、野生型スパイク、スパイク＋ラロキシフェンまたはラロキシフェン単独で２４時間処理し、増殖を測定した。
図７に結果を示す。以下の表１に平均およびＳＤを示す。
図７に結果を示す。以下の表１に平均およびＳＤを示す。
【0139】
【表1】
【0140】
見てわかるように、ペプチドは全て、スパイクにより誘導された増殖と類似した増殖を誘導することができる。得られたデータは、野生型スパイクタンパク質におけるＬｘｘＬモチーフのそれぞれがエストロゲン受容体の活性化を誘導できることを実証した。
【0141】
前立腺がん細胞株
確立されたアンドロゲン依存性細胞株ＬＮＣａｐを、この研究のためのモデルとして使用した。
確立されたアンドロゲン依存性細胞株ＬＮＣａｐを、この研究のためのモデルとして使用した。
【0142】
細胞を、５％ＣＯ２および９５％の加湿したインキュベーター（サーモ、米国）中で、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、コーニング、米国）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミン（シグマ、米国）が補充されたＤＭＥＭ中で培養した。処理の前、ＦＢＳ中のエストロゲンレベルを低減させるために、５％デキストランでコーティングされたチャコール処理血清を含有するフェノールレッド非含有培地中で２４時間細胞を培養し、続いて０．２％ＢＳＡが補充されたフェノールレッド非含有無血清培地中で少なくとも２４時間インキュベートした。次いで細胞を、ペプチド２、５および７または野生型スパイクで２４時間処理し、増殖を測定した。
【0143】
図８に結果を示す。以下の表２に平均およびＳＤを示す：
【0144】
【表2】
【0145】
得られた結果は、ペプチドおよびスパイクタンパク質の両方が、アンドロゲン受容体の活性化によって増殖を誘導できることを実証する。
【実施例3】
【0146】
プロテオーム分析
ヒト単球ＴＨＰ－１をＡＴＣＣから購入し、製造元の指示に従って培養した。次いで、ＴＨＰ－１を、７２時間の２０ｎｇ／ｍｌの１２－ミリスチン酸ホルボール１３－酢酸（ＰＭＡ）、続いて２４時間のＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）を使用して分化させ、実施例２で使用される濃度のエストラジオール、ラロキシフェンおよび野生型スパイク、野生型スパイク＋ラロキシフェン、エストラジオール＋野生型スパイク、エストラジオール＋ラロキシフェン＋野生型スパイクで２４時間処理した。次いで培地を収集し、プロテオームプロファイルアッセイを行った。
ヒト単球ＴＨＰ－１をＡＴＣＣから購入し、製造元の指示に従って培養した。次いで、ＴＨＰ－１を、７２時間の２０ｎｇ／ｍｌの１２－ミリスチン酸ホルボール１３－酢酸（ＰＭＡ）、続いて２４時間のＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）を使用して分化させ、実施例２で使用される濃度のエストラジオール、ラロキシフェンおよび野生型スパイク、野生型スパイク＋ラロキシフェン、エストラジオール＋野生型スパイク、エストラジオール＋ラロキシフェン＋野生型スパイクで２４時間処理した。次いで培地を収集し、プロテオームプロファイルアッセイを行った。
【0147】
詳細には、ＴＨＰ－１処理細胞からの馴化培地を遠心分離して、微粒子を除去し、即座にアッセイした。サンプル量を示唆された通りに調整した（５００μｌ）。試薬を製造元のプロトコール（Ｒ＆Ｄ、米国）に従って調製した。
【0148】
簡単に言えば、膜を、ロッキングプラットフォーム振盪機で１時間、アレイバッファー６と共にインキュベートした。それぞれの調製されたサンプルに、２つの別個の試験管中の１ｍｌのアレイバッファー４、次いで１５μｌの再構成されたマウスサイトカイン検出抗体カクテル（＞４０マウスサイトカイン）を添加することによってサンプルを調製し、１時間インキュベートした。次いで、アレイバッファー６を吸引し、サンプル／抗体混合物で交換し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜を３回洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：２０００）を、ロッキングプラットフォーム振盪機で、室温で３０分間インキュベートした。
【0149】
膜を再度洗浄し、１ｍｌの調製されたＣｈｅｍｉ試薬ミックスを各膜の上に置いた。複数の曝露時間を、ＵＶＩＴＥＣデジタルアナライザー（アライアンス（Alliance）、英国ケンブリッジ）を使用して達成した。展開された膜で見られた陽性シグナルは、アレイ画像上に透明オーバーレイテンプレートを置き、それを参照スポットの対と各アレイの３つの角でアライメントすることによって同定することができる。
【0150】
アッセイ手順中にアレイをストレプトアビジン－ＨＲＰと共にインキュベートしたことを実証するために、参照スポットが含まれる。ピクセル密度（各サイトカインを表す二連の対の平均シグナル）をＦｉｊｉソフトウェアによって分析し、各スポットから平均バックグラウンドを引いた。
【0151】
図９に結果を報告する。見てわかるように、ＩＬ－８は、最も豊富に出現し、エストラジオールと野生型スパイクの両方によって上方調節される。スパイクの作用を相殺することにおいて、ラロキシフェンが有効であった。非酵素的キチナーゼ－３様－タンパク質－１（ＣＨＩ３Ｌ１）は、エストラジオールと野生型スパイクの両方によって上方調節されるが、ラロキシフェンは、スパイク単独の作用のみを相殺することができた。
【0152】
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、エストラジオールと野生型スパイクの両方によって上方調節され、ラロキシフェンは、スパイク単独の作用を相殺することができた。
【実施例4】
【0153】
野生型スパイクタンパク質および突然変異体の生産および精製
野生型スパイクタンパク質の１６～１２１３のアミノ酸（細胞外ドメイン）ならびに後述される対応するＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７突然変異体をコードするヌクレオチド配列を生成し、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよびプロモーター、タンパク質分泌のためのマウスＩｇカッパ鎖リーダー配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨ－ポリＡ）シグナル、真核細胞におけるタンパク質発現に特化した終結配列、ならびに細菌におけるプラスミド増幅のためのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡベクターに挿入した。
野生型スパイクタンパク質の１６～１２１３のアミノ酸（細胞外ドメイン）ならびに後述される対応するＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７突然変異体をコードするヌクレオチド配列を生成し、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよびプロモーター、タンパク質分泌のためのマウスＩｇカッパ鎖リーダー配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨ－ポリＡ）シグナル、真核細胞におけるタンパク質発現に特化した終結配列、ならびに細菌におけるプラスミド増幅のためのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡベクターに挿入した。
【0154】
詳細には、突然変異配列は以下の通りであった：
・ＳＰ５：配列番号１に対する突然変異Ｌ８４１Ａ、Ｉ８４４Ａ、
・ＳＰ７：配列番号１に対する突然変異Ｌ８６１Ａ、Ｌ８６４Ａ、Ｌ８６５Ａ、
・ＳＰ５＋ＳＰ７：配列番号１に対する突然変異Ｌ８４１Ａ、Ｉ８４４Ａ、Ｌ８６１Ａ、Ｌ８６４Ａ、Ｌ８６５Ａ。
・ＳＰ５：配列番号１に対する突然変異Ｌ８４１Ａ、Ｉ８４４Ａ、
・ＳＰ７：配列番号１に対する突然変異Ｌ８６１Ａ、Ｌ８６４Ａ、Ｌ８６５Ａ、
・ＳＰ５＋ＳＰ７：配列番号１に対する突然変異Ｌ８４１Ａ、Ｉ８４４Ａ、Ｌ８６１Ａ、Ｌ８６４Ａ、Ｌ８６５Ａ。
【0155】
これらはそれぞれ、配列番号１に対する、安定化するアミノ酸の置き換えＲ６８５Ａ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐも含有する。
スパイクタンパク質ならびにＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３（サーモフィッシャー（Thermo Fisher））脂質カチオン性トランスフェクション試薬でのＥｘｐｉ２９３Ｆ高密度細胞の一過性トランスフェクションによって、製造元の指示に従って生産した。トランスフェクション開始から５日間のインキュベーション後に、タンパク質を含有する上清を収集し、後続の精製工程のために遠心分離およびろ過による清澄化に供した。ＰｕｒｅＣｕｂｅ Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂スラリー（キューブ－バイオテク（Cube-Biotech））を使用するＩＭＡＣ（固定化金属キレートアフィニティークロマトグラフィー）を使用して、タンパク質をバッチ精製した。簡単に言えば、樹脂スラリーを遠心分離し、平衡バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのイミダゾール）と共にインキュベートした。平衡化した樹脂を組換えタンパク質を含有する培養上清と合わせ、回転プラットフォーム上で４℃で一晩インキュベートした。その後、樹脂を遠心分離によって収集し、洗浄し、３００ｍＭのイミダゾールを含有する溶出バッファーによってタンパク質を溶出させ、スライド－Ａ－ライザー（slide-A-lyzers）（サーモフィッシャー）を製品データシートに示された通りに使用して、リン酸バッファー（ＰＢＳ）中での透析に供した。透析から回収したら、タンパク質を、分光光度計で２８０ｎｍで吸光度を測定することによって定量化した。タンパク質の純度を、還元条件下と非還元条件下の両方で実行されたＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって評価した。それらのｈＡＣＥ２受容体への結合能力および関連する親和性のさらなる特徴付けを、実施例４ａに記載した通りバイオレイヤー干渉ＢＬＩによって評価した。
スパイクタンパク質ならびにＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３（サーモフィッシャー（Thermo Fisher））脂質カチオン性トランスフェクション試薬でのＥｘｐｉ２９３Ｆ高密度細胞の一過性トランスフェクションによって、製造元の指示に従って生産した。トランスフェクション開始から５日間のインキュベーション後に、タンパク質を含有する上清を収集し、後続の精製工程のために遠心分離およびろ過による清澄化に供した。ＰｕｒｅＣｕｂｅ Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂スラリー（キューブ－バイオテク（Cube-Biotech））を使用するＩＭＡＣ（固定化金属キレートアフィニティークロマトグラフィー）を使用して、タンパク質をバッチ精製した。簡単に言えば、樹脂スラリーを遠心分離し、平衡バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのイミダゾール）と共にインキュベートした。平衡化した樹脂を組換えタンパク質を含有する培養上清と合わせ、回転プラットフォーム上で４℃で一晩インキュベートした。その後、樹脂を遠心分離によって収集し、洗浄し、３００ｍＭのイミダゾールを含有する溶出バッファーによってタンパク質を溶出させ、スライド－Ａ－ライザー（slide-A-lyzers）（サーモフィッシャー）を製品データシートに示された通りに使用して、リン酸バッファー（ＰＢＳ）中での透析に供した。透析から回収したら、タンパク質を、分光光度計で２８０ｎｍで吸光度を測定することによって定量化した。タンパク質の純度を、還元条件下と非還元条件下の両方で実行されたＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって評価した。それらのｈＡＣＥ２受容体への結合能力および関連する親和性のさらなる特徴付けを、実施例４ａに記載した通りバイオレイヤー干渉ＢＬＩによって評価した。
【0156】
実施例４ａ
ｈＡＣＥ－２受容体結合アッセイ
オクテットレッド（Octet Red）（フォルテバイオ（ForteBio））システムを使用することによって、生産されたスパイクタンパク質（野生型ならびにＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７）のｈＡＣＥ２受容体と結合する能力を検証するために、結合研究を実行した。全ての工程を、各ウェル中２００μｌの溶液を含有する９６－ウェルプレート（グライナー・バイオ・ワン（Greiner Bio-one）からの９６－ウェルマイクロプレート、Ｆ型底、黒色、６５５２０９）で、６００ｒｐｍで撹拌しながら、２５℃で実行した。この研究では、全てのタンパク質および分析物の希釈のために、さらに、センサーの洗浄するために、動態バッファー１×（カタログ番号１８－１１０５、フォルテバイオ）を使用した。まず、抗ヒトＦｃオクテット（Octet）バイオセンサー（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕獲バイオセンサー、カタログ番号１８－５０６０、フォルテバイオ（FORTEBIO））を使用してｈＡＣＥ２－ｈＦｃタンパク質を捕獲することによって、動態アッセイを実行した。１×バッファー中にバイオセンサーを１０分間浸漬し、続いて、基底シグナルを６０秒間測定し、この時点で、ｈＡＣＥ２－ｈＦｃを３００秒にわたりローディングした（バイオセンサーが完全に飽和するまで）。１×カイネティックバッファー中で１２０秒洗浄する工程の後、ｈＡＣＥ２－ｈＦｃと結合したバイオセンサーチップを、異なる濃度の抗原（スパイク、野生型タンパク質ならびにその突然変異体ＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７）を含有するウェル中に３００秒間浸漬して、関連曲線を評価し、続いてカイネティックバッファー中で９００秒間の解離時間を評価した。結合曲線データを収集し、次いでデータ分析ソフトウェアｖ１１．１（フォルテバイオ）を使用して分析した。抗原結合サイクルの開始時および１回の参照の減算の後に、結合センサーグラムをアライメントした。１：１のグローバルラングミュア結合モデルを使用してＫｄ値を計算した。
ｈＡＣＥ－２受容体結合アッセイ
オクテットレッド（Octet Red）（フォルテバイオ（ForteBio））システムを使用することによって、生産されたスパイクタンパク質（野生型ならびにＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７）のｈＡＣＥ２受容体と結合する能力を検証するために、結合研究を実行した。全ての工程を、各ウェル中２００μｌの溶液を含有する９６－ウェルプレート（グライナー・バイオ・ワン（Greiner Bio-one）からの９６－ウェルマイクロプレート、Ｆ型底、黒色、６５５２０９）で、６００ｒｐｍで撹拌しながら、２５℃で実行した。この研究では、全てのタンパク質および分析物の希釈のために、さらに、センサーの洗浄するために、動態バッファー１×（カタログ番号１８－１１０５、フォルテバイオ）を使用した。まず、抗ヒトＦｃオクテット（Octet）バイオセンサー（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕獲バイオセンサー、カタログ番号１８－５０６０、フォルテバイオ（FORTEBIO））を使用してｈＡＣＥ２－ｈＦｃタンパク質を捕獲することによって、動態アッセイを実行した。１×バッファー中にバイオセンサーを１０分間浸漬し、続いて、基底シグナルを６０秒間測定し、この時点で、ｈＡＣＥ２－ｈＦｃを３００秒にわたりローディングした（バイオセンサーが完全に飽和するまで）。１×カイネティックバッファー中で１２０秒洗浄する工程の後、ｈＡＣＥ２－ｈＦｃと結合したバイオセンサーチップを、異なる濃度の抗原（スパイク、野生型タンパク質ならびにその突然変異体ＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７）を含有するウェル中に３００秒間浸漬して、関連曲線を評価し、続いてカイネティックバッファー中で９００秒間の解離時間を評価した。結合曲線データを収集し、次いでデータ分析ソフトウェアｖ１１．１（フォルテバイオ）を使用して分析した。抗原結合サイクルの開始時および１回の参照の減算の後に、結合センサーグラムをアライメントした。１：１のグローバルラングミュア結合モデルを使用してＫｄ値を計算した。
【0157】
様々な抗原を有するバイオセンサーの先端もカイネティックバッファーを含有するウェル中に浸漬して、捕獲された抗原の天然の解離を補うために、１回の参照の減算を可能にした。バイオセンサーの先端を、再生させずに使用した。
【0158】
以下の表３に示される結果は、野生型スパイクタンパク質およびその突然変異体がｈＡＣＥ２受容体と高親和性で結合することを実証する。
【0159】
【表3】
【0160】
実施例４ｂ
エストロゲン様活性
スパイクタンパク質のエストロゲン様活性を評価するために、酵素結合免疫吸着測定法（マイオバイオソース（Myobiosource）、カタログ番号ＭＢＳ１６０１１６７）によって、酒石酸抵抗性Ａｃｋホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を評価した。
エストロゲン様活性
スパイクタンパク質のエストロゲン様活性を評価するために、酵素結合免疫吸着測定法（マイオバイオソース（Myobiosource）、カタログ番号ＭＢＳ１６０１１６７）によって、酒石酸抵抗性Ａｃｋホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を評価した。
【0161】
ＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージＡＴＣＣ、米国）を製造元のプロトコールの通りに培養し、次いで２４ウェルの培養皿中、細胞１．５×１０５個／ｃｍ２を植え付け、核内因子ｋｂリガンドのマウス受容体活性化剤（ＲＡＮＫＬ、ミルテニーバイオテク（Miltenyi Biotec）、ドイツ）を３５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、これまでに説明されたようにして（Collin-OsdobyおよびOsdoby 2012、PMID:22130930）、破骨細胞（ＯＣ）の発達（日０）を開始させた。３日目に、細胞を顕微鏡下で検査し、ＲＡＮＫＬを含有する新鮮な培地を再びフィードした。６日目、ＲＡＷ－ＯＣ集団が優勢であり、処理、次いで生化学的な研究の準備をした。細胞を、１ｎＭのエストラジオールまたは１０ｎｇ／ｍｌのスパイク野生型、ＳＰ５、ＳＰ７またはＳＰ５＋ＳＰ７で２４時間処理した。処理の２４時間後、細胞を滅菌試験管により迅速に収集し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して再懸濁して、細胞懸濁液をおよそ１００万個／ｍｌの濃度に希釈した。次いで、細胞を繰り返しの凍結融解サイクルに供して、内部の成分を外に出した。その間、キットの試薬を室温にした。標準曲線、試薬およびサンプルを製造元のプロトコールに従って調製した。簡単に言えば、５０μｌの標準を「標準ウェル」に添加し、４０μｌのサンプルを「サンプルウェル」に添加した。次いで１０μｌの抗ＴＲＡＰ抗体をサンプルウェルに添加し、５０μｌのストレプトアビジン－ＨＲＰをサンプルウェルおよび標準ウェルに添加した。プレートをシーラーで覆い、ロッキングプラットフォームでよく混合し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄し、各ウェルに５０μｌの基質溶液Ａに加えて５０μｌの基質溶液Ｂを添加し、暗所で、３７℃で１０分間インキュベートした。最後に、５０μｌの停止溶液を各ウェルに添加し、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して即座に光学密度を決定した。図１０に結果を示す。以下の表４に平均およびＳＤを示す。
【0162】
【表4】
【0163】
結果は、野生型スパイクが、エストラジオールで観察された作用と同じ作用を細胞に対して発揮することを実証する。それとは逆に、全ての突然変異体ＳＰ５、ＳＰ７およびＳＰ５＋ＳＰ７が、ＲＡＮＫＬで刺激した対照のものと同じＴＲＡＰレベルを示したことから、これらの突然変異が、スパイクタンパク質のエストロゲン受容体を活性化する能力を抑制することが示される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】