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特表2024-517377神経変性疾患に用いるための単離または人工ヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-22
(54)【発明の名称】神経変性疾患に用いるための単離または人工ヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240415BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240415BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240415BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240415BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240415BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20240415BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240415BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20240415BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240415BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20240415BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240415BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20240415BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240415BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240415BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20240415BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240415BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240415BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240415BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20240415BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20240415BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/867 Z
C12N15/864 100Z
C12N5/10
C07K14/435
C12N15/861 Z
C12N15/869 Z
A61P25/28
A61P25/02
A61P25/00
A61P39/02
A61K31/7088
A61P25/14
A61P21/02
A61K35/12
A61K35/76
A61K38/16
A61K35/761
A61K35/763
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023561037
(86)(22)【出願日】2022-05-13
(85)【翻訳文提出日】2023-11-22
(86)【国際出願番号】 IB2022054493
(87)【国際公開番号】W WO2022238974
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】117230
(32)【優先日】2021-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523374987
【氏名又は名称】ウニベルシダージ ド アルガルヴェ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＤＯ ＡＬＧＡＲＶＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】クレヴィオ デイヴィジ フォドリゲズ ノーブリガ
(72)【発明者】
【氏名】レベッカ カヴァーコ コッペノール
(72)【発明者】
【氏名】アドリアーナ イザベル ド ヴァレ マルセロ
(72)【発明者】
【氏名】アンドレ フィリペ ヴィエイラ ダ コンセイサオ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
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4B065AC14
4B065BA02
4B065BC01
4B065CA44
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(57)【要約】
本開示は、医薬品で、好ましくはポリグルタミン病の治療に使用するための、GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質１（G3BP1）をコードする単離または人工ヌクレオチド配列に関する。さらに、本発明は、医薬品で、好ましくはポリグルタミン病の治療において、使用するために、かかる配列を含むベクター、かかるベクターを含む宿主細胞、タンパク質G3BP1、またはそれらの組成物にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬品または獣医薬品に使用するための、タンパク質G3BP1をコードする単離または人工ヌクレオチド配列であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、およびそれらの混合物からなるリストから選択される配列と少なくとも９５％同一である、単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項2】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、およびそれらの混合物からなるリストから選択された配列と同一の配列である、請求項１に記載の使用のための単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項3】
中枢神経系疾患および末梢神経系疾患の治療に使用するための、請求項１または２に記載の単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項4】
神経変性疾患の治療に使用するための、請求項１～３のいずれかに記載の単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項5】
運動障害、すなわちバランス、運動協調性および／または運動性能の欠如の治療に使用するための、請求項１～４のいずれかに記載の単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項6】
ポリグルタミン病の治療に使用するための、請求項１～５のいずれかに記載の単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項7】
ポリグルタミン病の治療に使用するための単離または人工ヌクレオチド配列であって、前記ポリグルタミン病は、タンパク質凝集の制御によって正の影響を受ける、請求項１～６のいずれかに記載の単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項8】
前記タンパク質凝集の制御が、影響を受けたタンパク質のポリグルタミンセグメントの膨張によって引き起こされるタンパク質凝集の制御である、請求項７に記載の使用のための、請求項１～７のいずれかに記載の単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項9】
ポリグルタミン病の治療に使用するための単離または人工ヌクレオチド配列であって、前記ポリグルタミン病は、ハンチントン病（HD）、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、およびポリグルタミン反復性脊髄小脳失調症からなる群より選択される、請求項１～８のいずれかに記載の使用のための単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項10】
前記ポリグルタミン反復性脊髄小脳失調症が、脊髄小脳失調症１型（SCA1）、脊髄小脳失調症２型（SCA2）、脊髄小脳失調症３型（SCA3）、脊髄小脳失調症６型（SCA6）、脊髄小脳失調症７型（SCA7）、および脊髄小脳失調症１７型（SCA17）からなる群より選択される、請求項９に記載の使用のための単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項11】
前記配列は、患者の脳内または患者の脊髄内に直接投与される、請求項１～１０のいずれかに記載の使用のための単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項12】
前記配列が、血管内、静脈内、鼻腔内、脳室内または髄腔内注射によって投与される、請求項１～１１のいずれかに記載の使用のための単離または人工ヌクレオチド配列。
【請求項13】
医薬品に使用するための、請求項１～１２のいずれかに記載の単離または人工ヌクレオチド配列を含む、ベクターまたは構築物。
【請求項14】
前記ベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの群から選択される、請求項１３に記載の使用のためのベクター。
【請求項15】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１３または１４に記載の使用のためのベクター。
【請求項16】
前記ベクターがAAVベクターである、請求項１３～１５のいずれかに記載の使用のためのベクター。
【請求項17】
医薬品に使用するための、請求項１３～１６のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項18】
医薬品に使用するための、単離または人工ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質G3BP1であって、前記配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、およびそれらの混合物からなるリストから選択される配列と少なくとも９５％同一である、タンパク質G3BP1。
【請求項19】
医薬品または獣医薬品に使用するための、医薬組成物であって、治療上有効な量の請求項１～１３のいずれかに記載の単離または人工ヌクレオチド配列、または請求項１４～１６のいずれかに記載のベクター、または請求項１７に記載の宿主細胞、または請求項１８に記載のタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、医薬組成物。
【請求項20】
医薬品または獣医薬品に使用するためのキットであって、請求項１～１３のいずれかに記載の単離または合成ヌクレオチド配列、または請求項１４～１６のいずれかに記載のベクター、または請求項１７に記載の宿主細胞、または請求項１８に記載のタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、医薬品、好ましくはポリグルタミン病の治療に使用するための、GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質１（G3BP1）をコードする単離または人工ヌクレオチド配列に関する。さらに、本発明は、好ましくはポリグルタミン病の治療において、医学で使用するために、かかる配列、かかるベクターを含む宿主細胞、タンパク質G3BP1、またはそれらの組成物を含むベクターにも関する。
【背景技術】
【0002】
ポリグルタミン（PolyQ）病は、ハンチントン病（HD）、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、およびいくつかの脊髄小脳失調症（SCA1、2、3、6、7、17）を含む遺伝性神経変性疾患群である。これらの疾患は、各疾患関連遺伝子のコード領域におけるトリヌクレオチドCAGの異常な膨張によって特徴づけられ、これは、それぞれのタンパク質における伸長したポリグルタミントラクト（tract）をコードする。これらの疾患の中心的な特徴は、変異タンパク質の凝集であり、これは、他のタンパク質やmRNAとの異常な相互作用を促進し、いくつかの細胞経路や細胞小器官（オルガネラ）のを障害する1。それにもかかわらず、特定の脳領域の選択的神経変性に至る分子事象の完全な像はまだ完全には理解されていない。さらに、これまで、PolyQ病患者の早期死亡をもたらす病気の進行を止めたり遅らせたりすることができる治療法は存在しない。
【0003】
SCA2およびSCA3（またはMachado‐Joseph病‐MJD）は、最も多くみられる脊髄小脳失調症の２つであり、いずれも主に小脳および脳幹を侵す神経変性プロファイルを特徴とする。SCA2は、31‐33のCAG反復より上のATXN2遺伝子の異常な突然変異によって引き起こされ、その結果、過剰に拡張したataxin‐2タンパク質２が生じる。SCA3は、ATXN3遺伝子の44‐45CAGを超える異常な変異によって引き起こされ、ataxin‐3タンパク質が異常に3,4拡大する。変異体のataxin‐2とataxin‐3は、ともに凝集しやすく、他のタンパク質を隔離できる大きな介在物を形成する。大きな介在物は病気の特徴としてしばしば報告されているが、それらが直接的に毒性につながるかどうかはまだ議論の余地がある5－8。
【0004】
PolyQタンパク質の病理学的（pathological）凝集およびPolyQタンパク質が関与する異常な相互作用は、細胞ストレス反応経路の有意な変化をさせることができる9,10。ストレスに対処するために、細胞はストレス顆粒（SG）の集合（アッセンブリ）を含む、生存を促進するいくつかの機構を示す。これらは一過性に形成された病巣で、ストレス期のRNAのトリアージ（triage）と調節に作用する11。近年、神経変性疾患を含む、いくつかの疾患の病因の根底にあるSG調節異常が示唆されている12。SGは、RNA結合タンパク質（RBP）が主成分であるが、ストレスのタイプと種類の細胞に依存して異なる組成物を有することができる動的構造である。SGのマーカーおよびコア核剤（nucleator）でもある、これらの構成要素の１つは、GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質１（G3BP1）である13,14。G3BP1は、mRNAの安定化、劣化、およびスプライシング調節において重要な役割を果たす15,16,17。構造的に、G3BP1は少なくとも２つの重要なドメイン、RNA認識ドメイン（RRM）、および核輸送因子２様ドメイン（NTF2様）を有する。前者はG3BP1のmRNA結合能に重要であるが、後者は孔複合体15を介したタンパク質の核内輸送に関与する15。さらに、そのSer‐149残基におけるG3BP1のリン酸化は、最近の研究は彼の仮説を支持しないが、SG集合（アッセンブリ）において重要であると言及された。G3BP1の機能にはこれらすべてのドメインと触媒部位が重要であるが、RNA代謝の具体的な手順におけるこれらのそれぞれの役割はまだ解明されていない13,14。
【0005】
過去数年間にわたって開発された広範な努力にもかかわらず、polyQ病の病因は完全には理解されおらず、疾患の進行を遅らせたり止めたりする治療選択肢はいずれも存在しない。したがって、疾患の病因に関与する新たな分子標的を同定し、この疾患群に対する新たな治療戦略を開発することが不可欠である。
【0006】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を説明するために開示される。
【発明の概要】
【0007】
本発明では、G3BP1、SCA2およびSCA3の病因におけるSG成分の関与、および治療の標的としてのその適否を検討した。G3BP1の過剰発現は、凝集体（集合体）を有する細胞数およびataxin‐2とataxin‐3タンパク質のレベルの有意な減少を導くことが観察された。このG3BP1の作用機序にはNTF2様ドメインとSer149残渣（residue）が重要であると考えられる。さらに、SCA2およびSCA3患者の試料では、G3BP1レベルが低下することが分かった。重要なことに、SCA2およびSCA3レンチウイルスマウスモデルにおいて、G3BP1レベルのノックダウンは凝集体の個数を増加させ、SCA2およびSCA3との関連においてこのタンパク質の重要な機能的役割を強調した。反対に、SCA2およびSCA3のレンチウイルスマウスモデルにおけるG3BP1レベルの再確立は、それぞれ変異体ataxin‐2または変異体ataxin‐3の発現に関連する神経病理学的異常を低下させた。同じ系統において、G3BP1発現は、トランスジェニックマウスモデルにおいて挙動および神経病理学的欠損を有意に減少させることができた。全体として、本発明者らは、驚くべきことに、G3BP1をPolyQ疾患、すなわちSCA2およびSCA3の関連標的として同定し、そのような疾患に対する治療戦略を開示した。
【0008】
本発明者らは、SCA2およびSCA3疾患を有する患者において、G3BP1レベルの低下があることを示した。この発見に基づいて、本発明者らは、標的細胞においてG3BP1を発現する核酸をコードするベクターを使用することにより、SCA2およびSCA3に対抗する治療戦略として、G3BP1発現の変調に取り組む可能性を首尾よく研究した。
【0009】
したがって、本発明の目的は、医薬品（医学的に）または獣医薬品（獣医学的に）、好ましくはポリグルタミン病の治療に使用するための、GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質１（G3BP1）をコードする単離または人工ヌクレオチド配列を提供することである。さらに、本発明は、医薬品または獣医薬品において、好ましくはポリグルタミン病の治療で使用するために、かかる配列、かかるベクターを含む宿主細胞、タンパク質G3BP1、またはそれらの組成物を含むベクターにも関連する。
【0010】
一実施形態によると、G3BP1タンパク質は、NCBI配列参照GI：10146（GeneBank accession：NM_005754.3）によって同定される核酸配列によってコードされる、NCBI配列参照：NP_005745.1によって同定されるタンパク質である。
【0011】
本開示の一態様は、医薬品または獣医薬品で使用するための、タンパク質G3BP1をコードする単離または人工ヌクレオチド配列に関し、ここで、該配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、およびそれらの混合物からなるリストから選択される配列と少なくとも９５％同一である
【0012】
一実施形態では、医薬品または獣医薬品で使用するための、単離または人工ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、およびそれらの混合物からなるリストから選択される配列と同一である。
【0013】
一実施形態によると、単離または人工ヌクレオチド配列を、中枢および末梢神経系疾患の治療に使用することとしてもよい。
【0014】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチド配列を、神経変性疾患の治療に使用することとしてもよい。
【0015】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチド配列を、運動障害、すなわち、バランス、運動協調性および／または運動性能の欠如の治療に使用することとしてもよい。
【0016】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチド配列を、ポリグルタミン病の治療に使用することとしてもよい。
【0017】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチド配列は、ポリグルタミン病の治療に使用することとしてもよく、ここで、該ポリグルタミン病は、タンパク質凝集の制御によって正に影響され、ここで、タンパク質凝集の前記制御は、影響を受けたタンパク質のポリグルタミンセグメントにおける拡大によって引き起こされるタンパク質凝集の制御である。
【0018】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチド配列は、ポリグルタミン病の治療において使用することとしてもよく、ここで、疾患は、ハンチントン病（HD）、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、およびポリグルタミン反復性脊髄小脳失調症からなる群より選択される。
【0019】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチド配列を、ポリグルタミン反復性脊髄小脳失調症の治療に使用することとしてもよく、ここで、ポリグルタミン反復性脊髄小脳失調症は、脊髄小脳失調症１型（SCA1）、脊髄小脳失調症２型（SCA2）、脊髄小脳失調症３型（SCA3）、脊髄小脳失調症６型（SCA6）、脊髄小脳失調症７型（SCA7）および脊髄小脳失調症１７型（SCA17）からなる群より選択される。
【0020】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチドは、患者の脳内または患者の脊髄内に直接投与されることとしてもよい。
【0021】
別の実施形態では、単離または人工ヌクレオチドは、血管内、静脈内、鼻腔内、脳室内または髄腔内注射によって投与されることとしてもよい。
【0022】
本開示の別の態様は、上述のような単離または人工ヌクレオチド配列を含むベクターまたは構築物に関する。
【0023】
一実施形態では、ベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの群から選択される。
【0024】
別の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【0025】
本開示の別の態様は、医薬品または獣医薬品において使用するための、上述したベクターを含む宿主細胞に関する。
【0026】
本開示の別の態様は、医薬品または獣医薬品において使用するための、単離または人工ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質G3BP1に関し、ここで、配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、およびそれらの混合物からなるリストから選択される配列と少なくとも９５％同一である。
【0027】
本開示の別の態様は、上述の単離または人工ヌクレオチド配列、または上述のベクター、または上述の宿主細胞、または上述のタンパク質、またはそれらの組み合わせの治療上有効量を含む、医薬品または獣医薬品において使用するための医薬組成物に関する。
【0028】
本開示の別の態様は、上述の単離もしくは合成ヌクレオチド配列、または上述のベクター、上述の宿主細胞、または上述のタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、医薬品または獣医薬品において使用されるキットに関する。
【0029】
以下の図は、開示を説明するための好ましい実施形態を提供するものであり、発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】亜ヒ酸ナトリウムによって媒介される応力顆粒の集合（アッセンブリ）は、ATXN2およびATXN3の凝集体の個数およびタンパク質レベルを変化させない。ａは、eGFPタグ（上部パネル）と融合させ、亜ヒ酸ナトリウムで処理して応力顆粒（SG）の集合を誘導し、SGマーカー（中央パネル）であるPABPに対する抗体で染色した、ATXN2の病理的（pathological）および非病理的形成を発現するNeuro2a細胞からの共焦点顕微鏡による代表的画像。ｂは、ATXN2の病理的および非病理的形成を発現するNeuro2a溶解物およびSGの集合を誘導するために亜ヒ酸ナトリウムで処理したNeuro2a溶解物の代表的ウェスタンブロット。ATXN2、ホスホ‐eIF２αおよびβチューブリン（β‐tubulin）抗体を用いてウェスタンブロットを標識した。ｃは、ATXN2凝集体を有する細胞の数は、SG集合時に有意に変化しなかった（n＝３独立実験）。ｄは、非病理的ATXN2（ATXN2WT）タンパク質のレベルは、SG集合時に有意に変化しなかった。ｅは、病理的ATXN2（ATXN2MUT）タンパク質のレベルは、SG集合時に有意に変化しなかった。（n＝５独立実験）。ｆは、ATXN3の病理的および非病理的形成を発現するNeuro2a細胞からの共焦点顕微鏡代表画像は、eGFPタグ（上のパネル）と融合し、亜ヒ酸ナトリウムで処理してSG集合を誘導し、PABP１に対する抗体で染色した。ｇは、ATXN3の病理的および非病理的形成を発現するNeuro2a溶解物およびSGの集合を誘導するために亜ヒ酸ナトリウムで処理したNeuro2a溶解物の代表的なウェスタンブロット。ATXN3、ホスホ‐eIF２αおよびβチューブリン抗体を用いてウェスタンブロットを標識した。ｈは、ATXN3凝集体を有する細胞数はSG集合時に有意に変化しなかった（n＝３独立実験）。ｉは、非病理的ATXN3（ATXN3WT）タンパク質のレベルはSG集合時に有意に変化しなかった。ｊは、病理的ATXN3（ATXN3MUT）タンパク質のレベルはSG集合時に有意に変化しなかった（n＝５独立実験）。値は平均値±標準誤差（SEM）で表す。スケール：１０μm。
【図2】G3BP1の発現は、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの凝集を有する細胞数を減少させる。ａは、３つの異なる実験条件において、ATX2MUTを発現するNeuroa2細胞を描写する共焦点顕微鏡の代表的な画像。ｂは、３つの異なる実験条件において、ATX3MUTを発現するNeuroa2細胞を描写する共焦点顕微鏡の代表的画像。ｃは、トランスフェクトされた細胞１００個当たりのATX2MUTの凝集を有するセル数は、両方の対照条件と比較して、G3BP1発現時に有意に減少した。ｄは、トランスフェクトされた細胞１００個当たりのATX3MUTの凝集を有するセル数は、両方の対照条件と比較して、G3BP1発現時に有意に減少した。（n＝３の独立した実験、*P<０．０５；一元配置分散分析（one-way ANOVA）とその後の事後ボンフェローニ多重比較検定）。値は平均値±標準誤差で表す。スケール：１０μm。ｅは、lacZまたはG3BP1と共トランスフェクトした、ATXN2の病理的および非病理的形成を発現するNeuro2a溶解物の代表的ウェスタンブロット。ｆは、lacZまたはG3BP1と共トランスフェクトした、ATXN2の病理的および非病理的形成を発現するNeuro2a溶解物の代表的ウェスタンブロット。ｇは、ATXN2WTタンパク質のレベルは、lacZを共発現する細胞対照細胞と比較して、G3BP1発現時に有意に低下する。ｈは、ATXN2MUTタンパク質のレベルは、lacZを共発現する細胞対照細胞と比較して、G3BP1発現時に有意に低下する。ｉは、ATXN3WTタンパク質のレベルは、lacZを共発現する細胞対照細胞と比較して、G3BP1発現時に有意に低下する。ｊは、ATXN3MUTタンパク質のレベルは、lacZを共発現する細胞対照細胞と比較して、G3BP1発現時に有意に低下する。（n＝５の独立した実験；*p<０．０５；** p<０．０１；スチューデントt検定）。
【図3】G3BP1のNFT2様ドメインは、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの凝集およびタンパク質レベルのモジュレーション（変調）において重要である。ａは、G3BP1構造ドメインおよび欠損（deleted）NFT2ドメインおよび欠損RRMドメインを有するそれぞれの構築物の図式的表現。Δ：欠損。NTF2：核輸送因子（nuclear transport factor）２ドメイン。Ser：セリン。PxxP：プロリンリッチ領域。RRM：RNA認識モチーフ。RGGボックス：アルギニンおよびグリシンリッチボックス。ｂは、Neuro2a細胞を全長G3BP1、G3BP1‐ΔRRMまたはG3BP1‐ΔNTFのいずれかでトランスフェクトした。タンパク質溶解物を、異なる分子量を有するG3BP1切断形態の発現を示すウェスタンブロットにより分析した。ｃは、ATXN2MUTおよびlacZまたはG3BP1またはG3BP1‐ΔNTF2またはG3BP1‐ΔRRMを発現するNeuroa2細胞を示す代表的な共焦点顕微鏡画像。ATXN2MUTの発現は、凝集体（矢印）の形成につながる。ｄは、ATXN3MUTおよびlacZまたはG3BP1またはG3BP1‐ΔNTF2またはG3BP1‐ΔRRMを発現するNeuroa2細胞を表す代表的な共焦点顕微鏡画像。ATXN3MUTの発現は、凝集体（矢印）の形成に導く。スケール：１０μm。ｅは、G3BP1‐ΔRRMを有する１００トランスフェクト細胞当たりのATX2MUTの凝集体を有する細胞の数は、lacZ対照条件と比較して有意に減少し、全長G3BP1条件と比較して増加した。G3BP1‐ΔNTF2の発現は、他のすべての実験条件と比較して、凝集体を有する細胞数の有意な増加を導いた。（n＝４独立実験；ATXN2MUT＋lacZに対し##P＜０．０１；ATXN2MUT＋G3BP1に対し**** P<０．０００１；ATXN2MUT＋G3BP1‐ΔRRMに対する++++ P＜０．０００１；一元配置（one-way）ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ（post hoc Bonferron）多重比較検定）。ｆは、G3BP1‐ΔRRMを有する１００トランスフェクト細胞当たりのATX3MUTの凝集体を有する細胞数はlacZ対照条件と比較して有意に減少し、完全長G3BP1条件と比較して増加した。G3BP1‐ΔNTF2の発現は、ATXN3MUT＋G3BP1およびATXN3MUT+G3BP1‐ΔRRMと比較して、凝集体を有する細胞の数を有意に増加させる。（n＝４独立実験；ATXN3MUT＋lacZに対し##P＜０．０１；ATXN3MUT＋G3BP1に対し**** P<０．０００１；ATXN3MUT＋G3BP1‐ΔRRMに対する++ P＜０．０１；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。ｇは、lacZまたはG3BP1‐ΔRRMまたはG3BP1‐ΔNTF2と共トランスフェクトされたATXN2MUTを発現するNeuro2a溶解物の代表的ウエスタンブロット。ｈは、ATXN2MUTタンパク質のレベル（濃度）は、他の実験条件と比較してG3BP1‐ΔRRM発現により有意に減少し、一方、G3BP1‐ΔNTF2は、他の条件と比較して、ATXN2MUTタンパク質レベルを有意に増加させる。（n＝４独立実験；ATXN2MUT＋lacZに対し** P<０．０１；ATXN2MUT＋G3BP1‐ΔRRMに対し####P＜０．０００１；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。ｉは、lacZまたはG3BP1‐ΔRRMまたはG3BP1‐ΔNTF2と共トランスフェクトしたATN3MUTを発現するNeuro2a溶解物の代表的ウェスタンブロット。ｊは、ATXN3MUTタンパク質のレベルは他の実験条件と比較してG3BP1‐ΔRRM発現により有意に減少し、一方、G3BP1‐ΔNTF2の発現はATXN3MUT＋G3BP1‐ΔRRMと比較してATXN3MUTタンパク質レベルの有意な増加をもたらす。（n＝４独立実験；ATXN3MUT＋lacZに対し* P<０．０５； ATXN3MUT＋lacZに対し** P<０．０１；ATXN3MUT＋G3BP1‐ΔRRMに対する###P＜０．００１；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図4】Ser149リン酸化部位は、ataxin‐2およびataxin‐3変異タンパク質に対するG3BP1の作用において重要である。ａは、ATXN2MUTおよび野生型（wild-type）G3BP1またはGB3BP1（S149A）またはGB3BP1（S149D）を発現するNeuroa2細胞を示す代表的な共焦点顕微鏡画像。野生型G3BP1またはリン酸化模倣体G3BP1（S149D）を発現する細胞では、ATXN2MUTの凝集体は存在せず（白矢印）、ATXN2MUTの凝集体が観察されるリン酸化のない（phospho-dead）G3BP1（Ser149A）を発現する細胞とは対照的である（白色矢頭）。ｂは、ATXN3MUTおよび野生型G3BP1またはGB3BP1（S149A）またはGB3BP1（S149D）を発現するNeuroa2細胞を示す代表的な共焦点顕微鏡画像。野生型G3BP1またはリン酸化模倣G3BP1（S149D）を発現する細胞では、ATXN3MUTの凝集体（白矢印）は存在せず、リン酸化死G3BP1（Ser149A）を発現する細胞とは対照的に、ATXN3MUTの凝集体（白矢印）が観察される。スケール：２０μm。ｃは、野生型G3BP1またはG3BP1（S149A）またはG3BP1（S149D）を共トランスフェクトした、ATXN2MUTを発現するNeuro2a溶解物の代表的なウェスタンブロット。ｄは、野生型G3BP1またはG3BP1（S149A）またはG3BP1（S149D）を共トランスフェクトした、ATXN3MUTを発現するNeuro2a溶解物の代表的なウェスタンブロット。ｅは、リン酸化死G3BP1（Ser149A）を発現する細胞では、ATX2MUT＋G3BP1と比較して、ATXN2MUTタンパク質のレベルが有意に増加する（n＝３の独立実験；*P<０．０５；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。ｆは、すべての実験条件間において、ATX2MUT mRNAレベルに有意な変化は認められなかった。ｇは、リン酸化死G3BP1（Ser149A）を発現する細胞では、他の２つの条件と比較して、ATXN3MUTタンパク質のレベルが有意に増加したが、リン酸化模倣G3BP1（Ser149D）を発現する細胞は、他の２つの条件と比較して、有意に減少した。（n＝３の独立した実験；ATXN3MUT＋G3BP1に対する*P<０．０５；ATXN3MUT＋G3BP1（Ser149D）に対する## P＜０．０１；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図5】SCA2およびSCA3においてG3BP1のmRNAおよびタンパク質レベルが低下し、マウス脳におけるそのサイレンシングが凝集を増加させる。ａは、SCA2患者および健常対照者由来の線維芽細胞のタンパク質溶解物の代表的なウェスタンブロット。ｂは、SCA3患者および健常対照者の線維芽細胞由来のタンパク質溶解物の代表的なウェスタンブロット。ｃ、ｄは、対照者と比較してSCA2においてG3BP1タンパク質およびmRNAのレベルが有意に低下している。ｅ、ｆは、対照者と比較して、SCA3においてG3BP1タンパク質およびmRNAのレベルが有意に低下している。（健常対照者n＝３；SCA2 n＝２；SCA3 n＝５）ｇは、トランスジェニックSCA3マウスモデル由来の小脳のタンパク質溶解物の代表的なウェスタンブロット。ｈ、ｉは、G3BP1タンパク質およびmRNAのレベルが、C57BL/6野生型動物（n＝３～５）と比較して、SCA3トランスジェニックマウスで有意に低下している。ｊは、SCA2モデルに対する注入部位の模式図。簡単に述べると、shRNAスクランブルおよびATXN2MUTをコードするレンチウイルスベクターを線条体の片側半球に同時注入し、対側半球にG3BP1を標的とするshRNAとATXN2MUTを同時注入した。ｋは、注入後４週間目に、動物を安楽死させ、ataxin‐2で標識した脳切片を作製し、病理的凝集体の存在を強調した。ｌは、ATXN2MUT凝集体の平均数は、対照半球と比較して、shG3BP1発現時に有意に増加する。ｍは、SCA2モデルの注入部位の模式図。簡単に述べると、shRNAスクランブル３ereおよびATXN3MUTをコードするレンチウイルスベクターを線条体の片側半球に同時注入し、対側半球にG3BP1を標的とするshRNAおよびATXN2MUTを同時注入した。ｎは、注入後４週間で、動物を安楽死させ、ataxin‐3で標識した脳切片を作製し、病理的凝集体の存在を強調した。ｏは、ATXN3MUT凝集体の平均数は、対照半球と比較して、shG3BP1発現時に有意に増加する。（*P＜０．０５；** P<０．０１；*** P<０．００１；スチューデントｔ検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図6】G3BP1の発現は、SCA2およびSCA3のレンチウイルスマウスモデルにおいて、凝集体の個数およびニューロンマーカーの消失を減少させる。ａは、ATXN2またはATXN3の変異体（変異型）をコードするレンチウイルス粒子をマウスの線条体に定位的に注入するか、変異体およびG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を同時注入した。ａは、SCA2のマウスモデルに注入したレンチウイルスベクターおよび注射部位の模式図。動物の左右両側に注入し、注入の１２週間後に安楽死させ、組織を採取した。ｂは、SCA3のマウスモデルに注入したレンチウイルスベクターおよび注射部位の模式図。動物の左右両側に注入し、注入の４週間後に安楽死させ、組織を採取した。ｃは、SCA2のレンチウイルスマウスモデル由来の脳切片を、ataxin‐2およびDARP‐32抗体を用いた免疫組織化学により分析した。画像は、ATXN2MUTの凝集体（黒矢頭；スケール：２０μm）および神経性マーカーDARPP‐32の染色の消失（黒線）（スケール： ２００μm）を示す。ｄは、G3BP1を発現する半球は、対照半球と比較して、ATXN2MUT凝集体数の減少を示した（n＝５; *** p<０．０００１；スチューデントｔ検定）。ｅは、ATXN2MUTのみを発現する対側半球と比較して、G3BP1発現は、神経性マーカー消失を救済する（n＝５; *** p<０．０００１；スチューデントｔ検定）。ｆは、SCA3のレンチウイルスマウスモデルからの免疫組織化学脳切片の代表的画像。図は、ユビキチン化ATXN3MUT凝集体（暗点；スケール：２０μm）および神経性マーカーDARPP‐32染色の欠失（スケール：２００μm）を示す。ｇは、G3BP1の発現は、対照条件と比較して、ユビキチン化ATXN3MUT凝集体数の有意な減少につながった（n＝７；*** p<０．０００１；スチューデントｔ検定）。ｈは、G3BP1発現は、対照と比較して、神経性マーカーロスを救済する（n＝７; *** p<０．０００１；；スチューデントｔ検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図7】野生型マウスの脳において、G3BP1をコードするレンチウイルスベクターを過剰発現させても、ニューロンマーカーの消失や炎症は生じなかった。８～１２週齢のマウスに、PBSまたはヒトG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を線条体に定位注入（両側）し、注射後4週間で組織採取のために安楽死させた。ａは、線条体における注入部位の模式図。ｂは、PBSを注入したマウスの脳切片およびG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を注入した対側半球におけるDARPP‐32枯渇体積（黒い破線；上側のパネル；スケール：２００μm）およびG3BP1（下側のパネル；スケール：５０μm）標識の免疫組織化学画像分析。ｃは、マウス脳切片におけるDARPP‐32枯渇の総面積は、PBSの注入と比較した場合、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子の注入により減少した（n=４; *P<０．０５；スチューデントｔ検定）。ｅは、GFAP免疫反応性の定量化では、両半球間に有意な差は検出されなかった。スケール：２００μm。値は平均値±標準誤差で表す。
【図8】SCA3トランスジェニックマウスモデルにおいて、G3BP1の発現は運動障害および神経病理的異常を軽減する。６９のグルタミンを含むataxin‐3タンパク質の切断型を発現するトランスジェニックマウスを、GFP（対照群）またはG3BP1（処理群）をコードするレンチウイルス粒子と共に小脳に定位的に注入した。４週齢のマウスを、最初に注入の１～２日前に試験し、注入後９週間まで３週間ごとに繰り返し試験し、術後１０週間で安楽死させた。ａ～ｃは、注入後９週間でのマウスの運動能力の代表的なプロット。ａは、G3BP1を注入したマウスは、GFPまたは非注入マウスで処置した対照マウスと比較して、回転棒でより多くの時間が残るので、運動能力を有意に改善した（ロータロッド（rotarod）試験によって評価）。ｂは、G3BP1を注入したマウスは、GFPまたは非注入動物で処置した対照マウスと比較して、水充填槽を通過し、プラットフォームに到達するのに必要な時間を有意に減少させた。ｃは、足跡分析は、GFPまたは非注入動物で処置した対照と比較して、G3BP1を注射したマウスは、重複測定を改善したことを示した。ｄは、GFP（対照）またはG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を注入したマウスの小脳由来の免疫組織化学の脳切片の代表的な画像。上部パネル：HAタグ免疫反応性により評価したataxin‐3凝集体（集合体）（矢頭；スケール：５０μmおよび２００μm）。下部パネル：カルビンジン免疫反応性により評価したプルキンエ細胞（スケール：１００μmおよび２００μm）。ｅは、G3BP1発現は、GFPを注入したまたは非注入対照マウスと比較して、HA‐ataxin‐3凝集体（矢頭）の数を有意に減少した。ｆは、G3BP1発現は、非注射およびGFP注入対照と比較して、葉（lobe）IX内のプルキンエ細胞（赤）の数を有意に保存した。（n＝６～７; *p<０．０５；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図9】亜ヒ酸ナトリウムはNeuro2a細胞にストレス顆粒の形成を誘導し、全体的なタンパク質合成を低下させる。(A)は、未処理および固定の１時間前に亜ヒ酸ナトリウムで処理したNeuro2aの代表的な共焦点顕微鏡像であり、SGマーカーPABP免疫標識を示す。処理した細胞では、凝縮病巣PABP陽性（condensate foci PABP-positive）のSGを観察することができる。(B)は、サンセットアッセイ後のNeuro2a細胞由来のタンパク質溶解物の代表的なウェスタンブロット。細胞をG3BP1でトランスフェクトするか、亜ヒ酸ナトリウムで処理してストレス顆粒形成を誘導した。タンパク質合成阻害対照として、細胞をシクロヘキシミド（CHX）で処理し、膜をピューロマイシン抗体でプローブした。(C)は、亜ヒ酸ナトリウムによるSG誘導は全体的なタンパク質発現を減少させる。(D)は、G3BP1をトランスフェクトした細胞もまた、lacZ条件と比較して、全体的なタンパク質合成を有意に低下させた。さらに、G3BP1発現時の全タンパク質合成阻害は、既知のタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド処理と比較して差異を示さなかった（n＝４; ** p<０．００１; **** p<０．００００１；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。値は平均値±標準誤差で表す。スケール：１０μm。
【図10】Neuro2a細胞におけるG3BP1およびlacZプラスミドの発現。ａは、G3BP1またはlacZをトランスフェクトしたNeuro2a細胞由来のタンパク質溶解物の、トランスフェクション後４８時間における代表的なウェスタンブロット。ウェスタンブロットを、G3BP1、β‐galおよびβ‐アクチン抗体を用いて標識した。ｂは、lacZでトランスフェクトし、β‐galで免疫標識したNeuro2a細胞（白矢印）およびG3BP1でトランスフェクトし、G3BP1で免疫標識したNeuro2a細胞からの代表的な共焦点画像。核はDAPI（青）で染色した。スケールバー：１０μm。
【図11】G3BP1の発現は、内因性マウスAtaxin‐2およびAtaxin‐3タンパク質のレベルを変化させない。Neuro2a細胞にATXN2MUTとG3BP1またはATXN3MUTとG3BP1を同時トランスフェクトした。マウスAtaxin‐2およびAtaxin‐3タンパク質の内因性レベルを評価した。G3BP1過剰発現は、対照条件と比較して、（A）内因性Ataxin‐2と（B）内因性Ataxin‐3の両方の内因性レベルを変化させなかった（n＝４～５独立実験;スチューデントｔ検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図12】G3BP1の過剰発現はGFPの発現レベルを変化させない。Neuro2a細胞にGFPをトランスフェクトするか、GFPおよびG3BP1を同時トランスフェクトした。(A)は、抗GFP抗体で免疫ブロットしたNeuro2aタンパク質溶解物の代表的なブロット。(B)は、GFP発現はG3BP1発現で変化しなかった（n＝４独立実験；スチューデントｔ検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図13】ストレス顆粒を亜ヒ酸ナトリウムで薬理学的に誘導すると、G3BP1はPABPと共局在する。Neuro2a細胞をG3BP1でトランスフェクトし、固着の１時間前に亜ヒ酸ナトリウムで処理した。G3BP1標識を示すNeuro2a細胞由来の免疫細胞化学の代表的な画像。ストレス顆粒マーカー蛋白PABPの免疫標識を赤色で示す。G3BP1をトランスフェクトしたNeuro2a細胞では、いかなる処理もない場合、PABPとの共局在は観察されなかった。G3BP1およびSGアッセンブリ（集合体）をトランスフェクトしたNeuro2a細胞において、亜ヒ酸ナトリウム処理で薬理学的に誘導したところ、PABPはG3BP1（黄色）と共局在した。スケール：１０μm。
【図14】G3BP1は、亜ヒ酸ナトリウム誘発応力時にPABP陽性ストレス顆粒に凝集（集合）する。健常者およびSCA2およびSCA3患者の対照線維芽細胞は、固定の１時間前に亜ヒ酸ナトリウムで処理された。細胞をG3BP1（緑色）およびPABP（赤色）について免疫標識し、共焦点顕微鏡を用いて両タンパク質の共局在についてスクリーニングした。代表的な画像は、亜ヒ酸ナトリウム誘発ストレス時にG3BP1がSGに凝集することを示し、SGのマーカーであるPABPとの共局在により強調された。核はDAPI（青）で染色した。スケールバー：５０μm
【図15】セリン149リン酸化部位の部位特異的突然変異誘発。(A)は、セリンがアラニンに変化し、149aa部位、G3BP1（S149A）でリン酸化のない（phospho-dead）構築物を作製した、突然変異誘発部位によるG3BP1遺伝子構造の模式図。(B)は、セリンをアミノトランスフェラーゼに変化させ、149aa部位、G3BP1（S149D）でリン酸化模倣構築物を作製した、突然変異誘発部位を有するG3BP1遺伝子構造の模式図。(C)は、Serine‐149部位の近傍のG3BP1（配列番号１）コード領域の代表的な画像。上部のヒストグラムは、座位指向性突然変異誘発の前にGB3BP1配列を示している。中央のヒストグラムは、Serine‐149‐＞Alanine149を標的とした部位特異的突然変異誘発後のG3BP1を示している。トリプレットTCTにおける最初のチミン（T）ヌクレオチド（セリンのコード）は、トリプレットGCT（アラニンのコード）を起源とするグアニンによって置換された。以下のヒストグラムは、Serine‐149‐＞Aspartic acid 149（アスパラギン酸149）を標的とした部位特異的突然変異誘発後のG3BP1を示している。トリプレット（triplet）TCT（セリンのコード）中のチミン（T）とシトシン（C）ヌクレオチドは、トリプレットGAT（アスパラギン酸のコード）を起源とするグアニンとアデニンで置換された。
【図16】G3BP1の発現は、変異体ATXN2およびATXN3タンパク質のレベルを低下させる。(A)は、ATXN2MUT mRNAのレベルは、対照条件（ATXN2MUT＋lacZ）と比較して、G3BP1の発現時に低下する。(B)は、同じ系統において、ATXN3MUT mRNAのレベルは、対照条件（ATXN3MUT＋lacZ）と比較して、G3BP1の発現時に低下する。（n＝４の独立した実験; *P<０．０５; *** P<０．００１；スチューデントｔ検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図17】SCA2患者の死後の脳サンプルでは、G3BP1の免疫染色が低下している。ヒト脳試料における免疫組織化学の代表的な画像。健常者およびSCA2患者からの死後ヒト脳生検体を、G3BP1について免疫組織学的に染色した。上側パネル：線条体からのG3BP1免疫検出。下側パネル：小脳からのG3BP1免疫検出。SCA2患者では、健常者と比較した場合、小脳および線条体のG3BP1染色が消失していた。診断されたSCA2患者２例および健康な対照３例のサンプルを分析した。スケール：１００μmおよび４００μm。
【図18】SCA3トランスジェニックマウスモデルのプルキンエ細胞では、G3BP1の免疫染色が低下している。野生型C57BL/6マウスおよび小脳のプルキンエ細胞に６９のグルタミンを有する変異体ataxin‐3を発現するトランスジェニックSCA3マウスにおけるG3BP1およびカルビンジンの免疫組織化学の共焦点代表的な画像。これらの細胞では、野生型マウスと比較して、トランスジェニック動物におけるG3BP1の免疫染色の低下を観察することが可能である。スケール：１０μm。
【図19】G3BP1を標的とするshRNAは、そのレベルを有意に低下させる。(A)は、Neuro2a溶解物からの代表的なウェスタンブロットは、検証済みのshRNA標的化マウスG3BP1および対照shRNAスクランブルを用いてトランスフェクトする。(B)は、shG3BP1は、対照と比較して、マウス内因性G3BP1タンパク質のレベルの有意な減少をもたらす。(C)は、shG3BP1は、対照条件と比較して、マウス内因性G3BP1 mRNAのレベルの有意な減少をもたらす。（n＝２～３の独立した実験; *P<０．０５; ** P<０．０１；スチューデントｔ検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図20】線条体におけるG3BP1の発現は、SCA3レンチウイルスマウスモデルにおけるATXN3MUTのレベルを調節する。(A)は、１つの線条体半球におけるATXN2MUTをコードするレンチウイルス粒子を注入したマウス由来の線条体パンチ由来のタンパク質溶解物の代表的なウェスタンブロット、および対側半球におけるATXN2MUTおよびG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を同時注入した（注入後４週目）。(B)は、線条体の半球間のATX2MUTの可溶性レベルに有意な変化は認められなかった。(C)は、ATXN2MUTのmRNAレベルは両半球で類似していた。(D)は、１つの線条体半球におけるATXN3MUTをコードするレンチウイルス粒子を注入した、および、対側半球におけるATXN3MUTおよびG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を同時注入した、マウス由来の線条体パンチ由来のタンパク質溶解物の代表的なウェスタンブロット（注入後４週目）。(E)は、ATX3MUTのレベルは、対照半球と比較して、G3BP1発現時により低下した。(F)は、ATXN3MUTのmRNAレベルは両半球で類似していた。（SCA2 n＝３およびSCA3 n＝４、スチューデントｔ検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図21】G3BP1を注入したSCA3トランスジェニックマウスの非形質導入小脳葉は、神経病理的軽減を示さなかった。６９のグルタミンを含有するataxin‐3タンパク質の切断型を発現するSCA3トランスジェニックマウスを、G3BP1（処理群）をコードするレンチウイルス粒子を小脳に定位的に注入するか、またはGFP（対照群）をコードするレンチウイルス粒子を注入した。(A)は、GFPをコードするレンチウイルス粒子で処理したマウス（対照）またはG3BP1をコードするレンチウイルス粒子で処理したマウス小脳の脳切片の免疫組織化学分析は、上側パネルに示した：HAタグ免疫反応性により評価したataxin‐3凝集体；下側パネルに示した：カルビンジン免疫反応性により評価した小脳プルキンエ細胞。スケール：２００μm。非形質導入葉（VII）は、対照群および非注入マウスと比較して、（B）HA ataxin‐3凝集体数および（C）小脳プルキンエ細胞数に関して差異を示さなかった。（各群n＝６；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【図22】SCA3トランスジェニックマウスにG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を注入すると、小脳の分子層が保存される。６９のグルタミンを含有するataxin‐3タンパク質の切断型を発現するSCA3トランスジェニックマウスモデルを、GFP（対照群）をコードするレンチウイルス粒子を小脳に定位的に注入するか、またはG3BP1（処理群）をコードするレンチウイルス粒子を注入した。(A)は、GFP（対照）をコードするレンチウイルス粒子で処理した、または、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子で処理した、マウス小脳の脳切片の代表的なクレシルバイオレット染色画像。上側パネル：形質導入葉。下側パネル：非形質導入葉。スケール：２００μm。(B)は、G3BP1処理は、非注入マウスと比較した場合、小脳の分子層収縮（ローブII／III）を防止した。(C)は、非形質導入葉（葉IV／V）は、分子層厚に関して差を示さなかった（各群n＝６；一元配置ANOVA、その後ポストホックボンフェローニ多重比較検定）。値は平均値±標準誤差で表す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本開示は、医薬品、好ましくはポリグルタミン病の治療に使用するための、GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質１（G3BP1）をコードする単離または人工ヌクレオチド配列に関する。さらに、本発明は、医薬品（医学）で、好ましくはポリグルタミン病の治療において、使用するために、かかる配列、かかるベクターを含む宿主細胞、タンパク質G3BP1、またはそれらの組成物を含むベクターにも関する。
【0032】
一実施形態では、タンパク質GB3BP1をコードする単離または人工配列は、表１に示すリストから選択することができる。
【0033】
【表1-1】
【表1-2】
【0034】
本発明をさらに容易に理解してもらうため、まず特定用語を定義する。さらに、パラメータの値または値の範囲が記載される場合、記載された値の中間体の値および範囲も本発明の一部であることが意図されていることに留意されたい。本明細書において、物品「１つの（a）」および「１つの（an）」は、物品の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「要素（エレメント）」は、１つの要素または１つ以上の要素、例えば複数の要素を意味する。「含む」という用語は、本明細書では、「含むが、これに限定されない」という語句を意味するために使用され、その語句と同じ意味で使用される。用語「または」は、本明細書においては、文脈上他の意味を明確に示さない限り、用語「および／または」を意味するために使用され、用語「および／または」と同じ意味で使用される。例えば、「センス鎖またはアンチセンス鎖」は、「センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはセンス鎖およびアンチセンス鎖」と理解される。「約」という用語は、本明細書において、当該技術分野における公差の典型的な範囲内を意味するために使用される。例えば、「約」は、平均から約２標準偏差と理解することができる。ある実施形態では、平均±１０％を意味する。ある実施形態では、平均±５％を意味する。一連の数字または範囲の前に「約」が存在する場合、「約」は、一連または範囲内の数字のそれぞれを変更できることが理解される。数または一連の数の前の「少なくとも」という用語は、文脈から明らかなように、「少なくとも」という用語に隣接する数、および論理的に含めることができるすべての後続の数または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１５ヌクレオチド」は、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドが、示された特性を有することを意味する。少なくとも、が一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、連続（一連の）または範囲内のそれぞれの数を変更することができることが理解される。
【0035】
本発明の文脈において、「処置（治療）」、「処置する」、または「処置すること」という用語は、ここでは、（１）そのような用語が適用される病態または状態の症状の進行、悪化、または劣化を減速または停止させること；（２）そのような用語が適用される病態または状態の症状の緩和または改善をもたらすこと；および／または（３）そのような用語が適用される病態または状態を逆転または治癒することを目的とする治療方法またはプロセスを特徴付けるために使用される。
【0036】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト（成体および小児を含む）を指す。しかしながら、「対象」という用語は、非ヒト動物、特にマウスのような哺乳類、およびヒト以外の霊長類をも意味し得る。
【0037】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、転写または翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
【0038】
本明細書中で使用される場合、用語「コード配列」または「特定のタンパク質をコードする配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、インビトロまたはインビボで、転写され（DNAの場合）、および、ポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）、核酸配列を意味する。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または真核生物mRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含むことができるが、これらに限定されない。
【0039】
「G」、「C」、「A」、「T」、および「U」は、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。
【0040】
一実施形態では、本発明は、医薬品に使用するための単離されたもしくは人工的な配列またはその変形例を記載する。
【0041】
変異体には、例えば、個体間の対立遺伝子変異（例えば、多型）、選択的スプライシング形態などによる自然発生変異体が含まれる。用語「変異体」は、他の供給源または生物由来のG3BP1遺伝子配列も含む。変異体は、好ましくは、配列番号１～７の１つと実質的に相同である、すなわち、配列番号１～７の１つと典型的には少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を示す。
【0042】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知であり、そのような方法は、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAを含む。GAPはNeedleman とWunsch（(1970) J Mol Biol 48: 443-453）のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する２ つの配列のグローバル（シーケンス全体にわたる）アラインメントを見つける。BLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）は、配列同一性のパーセントを計算し、２つの配列間の類似性の統計解析を行う。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）を通じて公に入手可能である。また、MatGATソフトウェアパッケージ（Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences）で利用可能な方法の１つを用いて、類似性および同一性の全体的な割合（グローバルパーセンテージ）を決定することもできる。当業者には明らかなように、保存されたモチーフ間のアラインメントを最適化するために、軽微な手動編集を行うことができる。パーセンテージとして現在の主題に示されている配列同一性値は、デフォルトパラメータを有するBLASTを用いて、アミノ酸配列全体にわたって決定された。
【0043】
一実施形態では、本発明によるベクター使用は非ウイルスベクターである。典型的には、非ウイルスベクターは、GB3BP1をコードするプラスミドであり得る。このプラスミドは、直接、または、リポソーム、エキソソームもしくは、ナノ粒子を介して投与することができる。
【0044】
ウイルスベクター
本発明の実施において有用な遺伝子送達ウイルスベクターは、分子生物学の技術分野において周知の方法論を利用して構築することができる。典型的には、導入遺伝子を有するウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、適切な調節エレメント、および細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生に必要なエレメントから組み立てられる。
本発明の実施において有用な遺伝子送達ウイルスベクターは、分子生物学の技術分野において周知の方法論を利用して構築することができる。典型的には、導入遺伝子を有するウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、適切な調節エレメント、および細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生に必要なエレメントから組み立てられる。
【0045】
「遺伝子導入（gene transfer）」または「遺伝子送達（gene delivery）」という用語は、宿主細胞に外来DNAを確実に挿入するための方法またはシステムを意味する。このような方法は、非統合（non-integrated）伝達DNAの過渡的な発現、染色体外複製および伝達されたレプリコン（複製子）（例えば、エピソーム）の発現、または宿主細胞のゲノムDNAへの伝達された遺伝物質の統合（integration）をもたらすことができる。
【0046】
一実施形態によると、ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターが挙げられる。
【0047】
このような組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクトすることにより、またはヘルパープラスミドまたはウイルスを用いた一過性トランスフェクションにより、当該技術分野で公知の技術により製造することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv＋細胞、293細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、WO95/14785、WO96/22378、US5,882,877、US6,013,516、US4,861,719、US5,278,056、およびWO94/19478に見出される。
【0048】
好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【0049】
レンチウイルスベクターは、典型的には、ベクターゲノムを含むプラスミドと、レンチウイルスのアッセンブリおよび機能に不可欠なタンパク質のみをコードするパッケージング構築物とを同時にトランスフェクトされた（co-transfected）細胞をパッケージングする際のトランス相補によって生成される。自己不活性化（SIN）レンチウイルスベクターは、HIV‐１ LTRの固有（intrinsic、本来備わっている）プロモーター／エンハンサー活性を消失させることによって生成することができ、これは、ベクター組込み部位に隣接して位置する細胞コード配列の異常発現の可能性を減少させる（例えば、Vigna et al., J. Gene Med., 2: 308-316 (2000); Naldini et al., Science, 272: 263-267 (1996); およびMatrai et al., Molecular Therapy, 18(3): 477-490 (2010)を参照のこと）。レンチウイルスベクターを作製するための最も一般的な手順は、レンチウイルスベクタープラスミドおよびウイルスGag‐Pol、Rev‐Tat、およびエンベロープ（Env）タンパク質をコードする３つのパッケージング構築物で細胞株（例えば、293Tヒト胚腎細胞）を同時トランスフェクトすることである。
【0050】
ベクターの送達
ニューロンおよび／または星状細胞および／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはミクログリアへのウイルスベクターの送達または投与の方法は、一般に、選択されたシナプス結合細胞集団の細胞の少なくとも一部が伝達されるように、直接または造血細胞伝達を介して、該細胞へのベクターの送達に適した任意の方法を含む。ベクターは、中枢神経系の任意の細胞、末梢神経系の細胞、またはその両方に送達することができる。好ましくは、ベクターは脳の細胞に送達される。一般に、ベクターは、例えば、脳幹（髄質、橋、および中脳）、小脳、黒質皮質、線条体（尾状核および被殻）、前頭側頭葉、視覚皮質、脊髄またはそれらの組み合わせ、または好ましくは、その任意の適切な部分集団（亜集団）を含む、脳の細胞に送達される。
ニューロンおよび／または星状細胞および／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはミクログリアへのウイルスベクターの送達または投与の方法は、一般に、選択されたシナプス結合細胞集団の細胞の少なくとも一部が伝達されるように、直接または造血細胞伝達を介して、該細胞へのベクターの送達に適した任意の方法を含む。ベクターは、中枢神経系の任意の細胞、末梢神経系の細胞、またはその両方に送達することができる。好ましくは、ベクターは脳の細胞に送達される。一般に、ベクターは、例えば、脳幹（髄質、橋、および中脳）、小脳、黒質皮質、線条体（尾状核および被殻）、前頭側頭葉、視覚皮質、脊髄またはそれらの組み合わせ、または好ましくは、その任意の適切な部分集団（亜集団）を含む、脳の細胞に送達される。
【0051】
追加の投与経路は、直接可視化、例えば、表在性皮質適用、鼻腔内適用、または他の非定位的適用の下でのベクターの局所適用を含むこともできる。
【0052】
本発明のベクターのターゲット細胞は、PolyQ SCA、好ましくは神経細胞に罹患した対象の脳の細胞である。好ましくは、対象はヒトであり、一般に成人であるが、小児または幼児であり得る。
【0053】
本発明はまた、本疾患の生物学的モデルにベクターを送達することを包含する。その場合、生物学的モデルは、分娩時の発生の任意の段階にある任意の哺乳動物であり得、例えば、胚、胎児、幼児、若年性または成体であり得、好ましくは成体である。さらに、標的細胞は、本質的に任意の供給源、特に齧歯目（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）、食肉目（ネコ、イヌ）、および偶蹄目（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の他の非ヒト系（例えばゼブラフィッシュモデル系）の非ヒト霊長類および哺乳類由来であり得る。
【0054】
好ましくは、本発明の方法は、定位的注入よる脳内投与を含む。しかしながら、他の公知の送達方法もまた、本発明に従って適合され得る。例えば、脳を横切るベクターのより広範な分布のために、例えば、腰椎穿刺、大槽（後小脳延髄槽）または脳室穿刺によって脳脊髄液に注入することができる。ベクターを脳に向けるには、脊髄内または末梢神経節内、または関心となる身体部位の肉（皮下または筋肉内）に注入する。ある状況では、ベクターを血管内アプローチを介して投与することができる。例えば、ベクターは、血液脳関門が障害されている状況で動脈内（頸動脈）に投与することができる。さらに、よりグローバルな送達のために、ベクターは、マンニトールまたは超音波局所送達を含む高張液の注入によって達成される血液脳関門の「開口」の間に投与され得る。
【0055】
本明細書で使用するベクターは、送達のための任意の適切なビヒクル中に処方することができる。例えば、それらは、薬学的に許容される懸濁液、溶液またはエマルジョン中に置かれ得る。適切な媒体としては、生理食塩水およびリポソーム製剤が挙げられる。より具体的には、薬学的に許容可能な担体は、非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンの無菌水溶液を含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、食塩水、緩衝性媒体が含まれる。静脈内用のビヒクルとしては、流体および栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンガーデキストロースをベースとしたもの）等が挙げられる。
【0056】
保存剤および他の添加物が存在してもよく、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどである。
【0057】
コロイド分散系もまた、標的化遺伝子送達のために使用され得る。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および、水中油型乳化（オイルインウオーターエマルジョン）、ミセル、混合ミセル、およびリポソームまたはエキソソームを含む脂質ベースの系が含まれる。
【0058】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。しかしながら、この実施例および添付の図面は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【0059】
実施例
材料と方法
プラスミドベクター
一実施形態では、ヒトataxin‐3をコードするプラスミドは、２８のグルタミン（pEGFP‐C1‐Ataxin3Q28；#22122；Addgene）または８４のグルタミン（pEGFP‐C1‐Ataxin3Q84; #22123；Addgene）を含み、Henry Paulsonからのギフトであり、両方ともN末端でGFPタンパク質と融合される18。２２のグルタミン（pEGFP‐Ataxin2Q22）または１０４のグルタミン（pEGFP‐Ataxin2Q104）を含むヒトataxin‐2をコードするプラスミドは、Stefan Pulst教授によって親切に提供された19。LacZ遺伝子をホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK）の制御下で著者らの研究室でクローニングし20、GFP構築物を前述ののようにクローニングした21。Source Bioscienceから購入したヒトG3BP1（配列番号１）をコードするプラスミドを、製造業者のインストラクションに従って、Gateway（商標）LR Clonase（商標）II Enzyme Mix, Invitrogenを用いてレンチウイルスベクターバックボーンにクローン化した。G3BP1‐ΔNTF2（11‐133位（site）で欠失したG3BP1）およびG3BP1‐ΔRRM（340‐415位で欠失したG3BP1）構築物をGeneScriptから合成し、ベクターpcDNA3.1＋N‐MYCにクローン化した。検証済みのshRNAターゲティングマウスG3BP1（＃MSH031039‐LVRU6MP‐b）およびshRNAスクランブルを、対照（既知の標的がない、＃CSHCTR001‐LVRU6MP）としてGeneCopoeia（米国）から取得した。
材料と方法
プラスミドベクター
一実施形態では、ヒトataxin‐3をコードするプラスミドは、２８のグルタミン（pEGFP‐C1‐Ataxin3Q28；#22122；Addgene）または８４のグルタミン（pEGFP‐C1‐Ataxin3Q84; #22123；Addgene）を含み、Henry Paulsonからのギフトであり、両方ともN末端でGFPタンパク質と融合される18。２２のグルタミン（pEGFP‐Ataxin2Q22）または１０４のグルタミン（pEGFP‐Ataxin2Q104）を含むヒトataxin‐2をコードするプラスミドは、Stefan Pulst教授によって親切に提供された19。LacZ遺伝子をホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK）の制御下で著者らの研究室でクローニングし20、GFP構築物を前述ののようにクローニングした21。Source Bioscienceから購入したヒトG3BP1（配列番号１）をコードするプラスミドを、製造業者のインストラクションに従って、Gateway（商標）LR Clonase（商標）II Enzyme Mix, Invitrogenを用いてレンチウイルスベクターバックボーンにクローン化した。G3BP1‐ΔNTF2（11‐133位（site）で欠失したG3BP1）およびG3BP1‐ΔRRM（340‐415位で欠失したG3BP1）構築物をGeneScriptから合成し、ベクターpcDNA3.1＋N‐MYCにクローン化した。検証済みのshRNAターゲティングマウスG3BP1（＃MSH031039‐LVRU6MP‐b）およびshRNAスクランブルを、対照（既知の標的がない、＃CSHCTR001‐LVRU6MP）としてGeneCopoeia（米国）から取得した。
【0060】
ヒトG3BP1をコードするプラスミドを含むレンチウイルスベクター
一実施形態では、ヒトG3BP1をコードするプラスミド（配列番号１～７のうちの１つ）を、製造業者のインストラクションに従って、Gateway（商標）LR Clonase（商標）II Enzyme Mix、Invitrogenを用いて、PGKプロモーターの制御下で自己不活化レンチウイルスベクター中にクローン化した。レンチウイルスベクターは、先に記載した４プラスミド系を用いて、HEK（ヒト胚性腎臓）293T細胞において産生された25。ウイルス産生を、製造業者の指示に従い、RetroTek HIV‐1 p24抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（ZeptoMetrix）を用いて定量した。
一実施形態では、ヒトG3BP1をコードするプラスミド（配列番号１～７のうちの１つ）を、製造業者のインストラクションに従って、Gateway（商標）LR Clonase（商標）II Enzyme Mix、Invitrogenを用いて、PGKプロモーターの制御下で自己不活化レンチウイルスベクター中にクローン化した。レンチウイルスベクターは、先に記載した４プラスミド系を用いて、HEK（ヒト胚性腎臓）293T細胞において産生された25。ウイルス産生を、製造業者の指示に従い、RetroTek HIV‐1 p24抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（ZeptoMetrix）を用いて定量した。
【0061】
セリン149残渣のGB3BP1突然変異誘発
一実施形態では、製造業者の指示に従い、NZY変異誘発キット（NZYTech）を用いて部位特異的変異誘発を実施した。G3BP1のヒト変異体（GeneBankアクセッション：DQ893058.2）において、セリンを、アラニンまたは149位（site149）のアスパラギン酸によって変化させ、それぞれ、G3BP1リン酸化のない（phospho-dead）変異体（G3BP1_S149A）またはG3BP1リン酸化模倣（phosphomimic）変異体（G3BP1_S149D）を生成した。置換S149Aを誘導するために使用したプライマーの一対（ペア）は、以下の通りであった：配列番号８：5’‐CT GAG CCT CAG GAG GAG GCT GAA GAA GAA GTA GAG‐3’および配列番号９：5’‐CT CTA CTT CTT CTT CAG CCT CCT CCT GAG GCT CAG‐3’。置換S149Dを誘導するために使用したプライマーの一対は以下の通りであった：配列番号10：5’‐CT GAG CCT CAG GAG GAG GAT GAA GAA GAA GTA GAG‐3’および配列番号11：5’‐CTC TAC TTC TTC TTC ATC CTC CTC CTG AGG CTC AG‐3’。変異S149AとS149DはDNA塩基配列決定法（Eurofins Genomics）で確認した。
一実施形態では、製造業者の指示に従い、NZY変異誘発キット（NZYTech）を用いて部位特異的変異誘発を実施した。G3BP1のヒト変異体（GeneBankアクセッション：DQ893058.2）において、セリンを、アラニンまたは149位（site149）のアスパラギン酸によって変化させ、それぞれ、G3BP1リン酸化のない（phospho-dead）変異体（G3BP1_S149A）またはG3BP1リン酸化模倣（phosphomimic）変異体（G3BP1_S149D）を生成した。置換S149Aを誘導するために使用したプライマーの一対（ペア）は、以下の通りであった：配列番号８：5’‐CT GAG CCT CAG GAG GAG GCT GAA GAA GAA GTA GAG‐3’および配列番号９：5’‐CT CTA CTT CTT CTT CAG CCT CCT CCT GAG GCT CAG‐3’。置換S149Dを誘導するために使用したプライマーの一対は以下の通りであった：配列番号10：5’‐CT GAG CCT CAG GAG GAG GAT GAA GAA GAA GTA GAG‐3’および配列番号11：5’‐CTC TAC TTC TTC TTC ATC CTC CTC CTG AGG CTC AG‐3’。変異S149AとS149DはDNA塩基配列決定法（Eurofins Genomics）で確認した。
【0062】
神経芽細胞腫の培養およびトランスフェクション
一実施形態では、American Type Culture Collection cell biology bank（CCL‐131）から取得したマウス神経芽細胞腫細胞株（Neuro2a細胞）を、１０%（v/v）のウシ胎児血清（FBS）、１００U／mLのペニシリンおよび１００μg／mLのストレプトマイシンを添加したDulbecco改良イーグル培地（DMEM）中で培養した。細胞を１２‐または６‐マルチウェルプレートに播種した。増殖２４時間後、製造業者の指示に従って、ポリエチレンイミン試薬（PEI；PEI MAX Polysciences, Inc．）を用いて、ウェル当たり０．５～μgのDNA濃度で細胞をトランスフェクトした。SG誘導実験では、細胞を亜ヒ酸ナトリウム（SA、Sigma Aldrich １０μg／mL）最終濃度０．０５Mで、回収１時間前に処理した。
一実施形態では、American Type Culture Collection cell biology bank（CCL‐131）から取得したマウス神経芽細胞腫細胞株（Neuro2a細胞）を、１０%（v/v）のウシ胎児血清（FBS）、１００U／mLのペニシリンおよび１００μg／mLのストレプトマイシンを添加したDulbecco改良イーグル培地（DMEM）中で培養した。細胞を１２‐または６‐マルチウェルプレートに播種した。増殖２４時間後、製造業者の指示に従って、ポリエチレンイミン試薬（PEI；PEI MAX Polysciences, Inc．）を用いて、ウェル当たり０．５～μgのDNA濃度で細胞をトランスフェクトした。SG誘導実験では、細胞を亜ヒ酸ナトリウム（SA、Sigma Aldrich １０μg／mL）最終濃度０．０５Mで、回収１時間前に処理した。
【0063】
ヒト線維芽細胞培養
一実施形態では、SCA2、SCA3、および健康な個体からの患者線維芽細胞は、コリエル研究所から得られたか、または共同研究者によって親切に提供され22、CAG拡大について完全に特徴付けられた：SCA2（患者１：２２／４１；患者２：２０／４４）；SCA3（患者１：１８／７９；患者２：２２／７７；患者３：２３／８０；患者４：２３／７１；患者５：２４／７４）；健康な対照（１：１４／１９；２：１４／２３；３：２２／２３；４：２２／２３）。線維芽細胞を、１５%（v/v）のウシ胎児血清（FBS）、１００U／mLのペニシリンおよび１００μg／mLのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で培養を維持した。すべての細胞培養物を、５%CO２を含む加湿雰囲気中、３７℃で維持した。
一実施形態では、SCA2、SCA3、および健康な個体からの患者線維芽細胞は、コリエル研究所から得られたか、または共同研究者によって親切に提供され22、CAG拡大について完全に特徴付けられた：SCA2（患者１：２２／４１；患者２：２０／４４）；SCA3（患者１：１８／７９；患者２：２２／７７；患者３：２３／８０；患者４：２３／７１；患者５：２４／７４）；健康な対照（１：１４／１９；２：１４／２３；３：２２／２３；４：２２／２３）。線維芽細胞を、１５%（v/v）のウシ胎児血清（FBS）、１００U／mLのペニシリンおよび１００μg／mLのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で培養を維持した。すべての細胞培養物を、５%CO２を含む加湿雰囲気中、３７℃で維持した。
【0064】
翻訳率アッセイ（Translation rate assay）（SUnSETプロトコル）
一実施形態では、翻訳中のピューロマイシンの取り込みに基づいて、全体的なタンパク質合成のモニタリングおよび定量を可能にする方法が使用された。N２a細胞をマルチウェルプレートにプレーティングし、lacZまたはG3BP1でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１０mg／mlのピューロマイシン（Sigma）と１５分間インキュベートし、その後、ウェスタンブロット処理のために採取した。翻訳阻害の陽性対照として、いくつかの細胞を１０mMのシクロヘキシミド（CHX、Sigma）と１５分間インキュベートし、次いで１０mg／mlのピューロマイシン（Sigma）とさらに１５分間インキュベートした。ストレス顆粒条件のために、細胞を０．０５M亜ヒ酸ナトリウムで１時間処理し、次いで１０mg／mlのピューロマイシン（Sigma）でさらに１５分間インキュベートした。さらに、非処理細胞の対照も用いた。
一実施形態では、翻訳中のピューロマイシンの取り込みに基づいて、全体的なタンパク質合成のモニタリングおよび定量を可能にする方法が使用された。N２a細胞をマルチウェルプレートにプレーティングし、lacZまたはG3BP1でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１０mg／mlのピューロマイシン（Sigma）と１５分間インキュベートし、その後、ウェスタンブロット処理のために採取した。翻訳阻害の陽性対照として、いくつかの細胞を１０mMのシクロヘキシミド（CHX、Sigma）と１５分間インキュベートし、次いで１０mg／mlのピューロマイシン（Sigma）とさらに１５分間インキュベートした。ストレス顆粒条件のために、細胞を０．０５M亜ヒ酸ナトリウムで１時間処理し、次いで１０mg／mlのピューロマイシン（Sigma）でさらに１５分間インキュベートした。さらに、非処理細胞の対照も用いた。
【0065】
ヒト脳組織
一実施形態では、臨床的および遺伝的に確認されたSCA2患者由来の死後線条体および小脳の脳組織をNIH NeuroBioBank（USA）から入手した。NIH NeuroBioBank（USA）から、神経学的異常（condition）が診断されていない健常者の対照線条体および小脳組織を入手した。４% PFA溶液中に保存した組織を、３０％スクロース／PBS中で４８時間脱水し、‐８０℃で凍結保護し、クリオスタット（Cryostar NX５０、ThermoFisher Scientific）を用いて４０μmスライスに解剖し、４℃で遊離浮遊PBS／アジ化ナトリウム溶液中に保存した。
一実施形態では、臨床的および遺伝的に確認されたSCA2患者由来の死後線条体および小脳の脳組織をNIH NeuroBioBank（USA）から入手した。NIH NeuroBioBank（USA）から、神経学的異常（condition）が診断されていない健常者の対照線条体および小脳組織を入手した。４% PFA溶液中に保存した組織を、３０％スクロース／PBS中で４８時間脱水し、‐８０℃で凍結保護し、クリオスタット（Cryostar NX５０、ThermoFisher Scientific）を用いて４０μmスライスに解剖し、４℃で遊離浮遊PBS／アジ化ナトリウム溶液中に保存した。
【0066】
動物
一実施形態では、C57BL／6J野生型成体およびUniversidade do Algarveの動物施設で飼育されたトランスジェニックSCA3マウス23を使用した。動物は、１２時間の光‐１２時間の暗闇（fark）サイクルで、温度制御された室内に維持された。食事と水は自由に分配された。実験はすべて、実験動物の管理と使用に関する欧州共同体理事会指令（86／609／EEC）に従って実施した。研究者らは、プロジェクトNeuropath（421／2019）においてポルトガル当局（Direccao Geral de Alimentacao e Veterinaria）から認定トレーニング（FELASAコース）を受け、実験を実施することを承認した。
一実施形態では、C57BL／6J野生型成体およびUniversidade do Algarveの動物施設で飼育されたトランスジェニックSCA3マウス23を使用した。動物は、１２時間の光‐１２時間の暗闇（fark）サイクルで、温度制御された室内に維持された。食事と水は自由に分配された。実験はすべて、実験動物の管理と使用に関する欧州共同体理事会指令（86／609／EEC）に従って実施した。研究者らは、プロジェクトNeuropath（421／2019）においてポルトガル当局（Direccao Geral de Alimentacao e Veterinaria）から認定トレーニング（FELASAコース）を受け、実験を実施することを承認した。
【0067】
レンチウイルスベクター
一実施形態では、ヒトG3BP1、GFP、ATXN2MUT、およびATXN3MUTをコードするcDNAを、前述したように、PGKプロモーターの制御下で自己不活性化レンチウイルスベクター中にクローン化した24。レンチウイルスベクターは、先に記載した４プラスミド系を用いて、HEK（ヒト胚性腎臓）293T細胞において産生された25。ウイルス産生を、製造業者の指示に従い、RetroTek HIV‐１ p２４抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（ZeptoMetrix）を用いて定量した。
一実施形態では、ヒトG3BP1、GFP、ATXN2MUT、およびATXN3MUTをコードするcDNAを、前述したように、PGKプロモーターの制御下で自己不活性化レンチウイルスベクター中にクローン化した24。レンチウイルスベクターは、先に記載した４プラスミド系を用いて、HEK（ヒト胚性腎臓）293T細胞において産生された25。ウイルス産生を、製造業者の指示に従い、RetroTek HIV‐１ p２４抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（ZeptoMetrix）を用いて定量した。
【0068】
レンチウイルスベクターのインビボ注入
一実施形態では、レンチウイルスベクターの定位注入のために、濃縮されたウイルスストックを氷上で解凍し、ホモジナイズした。動物をケタミン（７５mg／kg、Nimatek、Dechra）とメデトミジン（０．７５mg／kg、DOMTOR（登録商標）、Esteve）の混合物の腹腔内注射（IP）により麻酔した。SCA2レンチウイルスマウスモデルについて、ブレグマ（bregma）に対する以下の脳座標：前‐後（Antero‐Posterior）（＋０．６）、内側‐外側（Medial‐Lateral）（+/‐１．８）、背側‐腹側（Dorsal‐Ventral）（‐３．３）に従って、マウス（１０～１２週齢）に、８２のグルタミンを含むヒトATXN2MUTをコードするレンチウイルス粒子、またはATXN2MUTとG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を、線条体の左右半球にそれぞれ注入した26。４００ng p２４／μlのレンチウイルス濃度のものを０．２０μl／minの速度で注入した。SCA3レンチウイルスマウスについては、７２のグルタミンを含有するヒトATXN3MUTまたはATXN3MUTおよびG3BP1をコードするウイルス粒子を、上記と同じ座標を用いて、４００ngのp２４／mlでマウス線条体（それぞれ左半球および右半球）に注入した。安全性アッセイを実施するために、野生型C５７／BL６マウス（１０～１２週齢）の線条体に、上記と同じ座標を用いて、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子をレンチウイルス濃度４００ng p２４／ulで注入した。トランスジェニック動物については、G3BP1またはGFPをコードするレンチウイルス粒子を、それぞれの対照として、マウス小脳（４週齢）に、レンチウイルス８００ng p２４／μlを、以下の座標で注入した：ラムダに対して吻側‐１．６mm、正中線０．０mm、および頭蓋表面に対して腹側‐１．０mm、マウスバーは‐３．３に設定した21。SCA2におけるG3BP1サイレンシング研究のために、野生型C57／BL6マウス（１０～１２週齢）を、８２のグルタミンを含むヒトATXN2MUTをコードするレンチウイルス粒子を線条体に注入し、shRNAスクランブルをコードするレンチウイルス粒子を注入し、一方、対側半球では、８２のグルタミンを含むヒトATXN2MUTをコードするレンチウイルス粒子を注入し、マウスG3BP1を標的とするshRNAをコードするレンチウイルス粒子を注入した。SCA3については、手順は類似していたが、７２のグルタミンを含有するヒトATXN3MUTをコードするレンチウイルス粒子を用いた。レンチウイルス粒子を、上記と同じ座標を用いて、４００ng p２４／ulのレンチウイルス濃度で注入した。すべての定位注入は、ハミルトンシリンジに連結した３４ゲージの平滑末端針を用いた自動注入器（Stoelting Co.）によって行った。手術の数週間後にマウスを後方分析のために屠殺した：モデルによれば、SCA2レンチウイルスマウス：４週間および１２週間；SCA3レンチウイルスマウス：４週間；G3BP1注射マウス：４週間；SCA3トランスジェニックマウス：９週間。
一実施形態では、レンチウイルスベクターの定位注入のために、濃縮されたウイルスストックを氷上で解凍し、ホモジナイズした。動物をケタミン（７５mg／kg、Nimatek、Dechra）とメデトミジン（０．７５mg／kg、DOMTOR（登録商標）、Esteve）の混合物の腹腔内注射（IP）により麻酔した。SCA2レンチウイルスマウスモデルについて、ブレグマ（bregma）に対する以下の脳座標：前‐後（Antero‐Posterior）（＋０．６）、内側‐外側（Medial‐Lateral）（+/‐１．８）、背側‐腹側（Dorsal‐Ventral）（‐３．３）に従って、マウス（１０～１２週齢）に、８２のグルタミンを含むヒトATXN2MUTをコードするレンチウイルス粒子、またはATXN2MUTとG3BP1をコードするレンチウイルス粒子を、線条体の左右半球にそれぞれ注入した26。４００ng p２４／μlのレンチウイルス濃度のものを０．２０μl／minの速度で注入した。SCA3レンチウイルスマウスについては、７２のグルタミンを含有するヒトATXN3MUTまたはATXN3MUTおよびG3BP1をコードするウイルス粒子を、上記と同じ座標を用いて、４００ngのp２４／mlでマウス線条体（それぞれ左半球および右半球）に注入した。安全性アッセイを実施するために、野生型C５７／BL６マウス（１０～１２週齢）の線条体に、上記と同じ座標を用いて、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子をレンチウイルス濃度４００ng p２４／ulで注入した。トランスジェニック動物については、G3BP1またはGFPをコードするレンチウイルス粒子を、それぞれの対照として、マウス小脳（４週齢）に、レンチウイルス８００ng p２４／μlを、以下の座標で注入した：ラムダに対して吻側‐１．６mm、正中線０．０mm、および頭蓋表面に対して腹側‐１．０mm、マウスバーは‐３．３に設定した21。SCA2におけるG3BP1サイレンシング研究のために、野生型C57／BL6マウス（１０～１２週齢）を、８２のグルタミンを含むヒトATXN2MUTをコードするレンチウイルス粒子を線条体に注入し、shRNAスクランブルをコードするレンチウイルス粒子を注入し、一方、対側半球では、８２のグルタミンを含むヒトATXN2MUTをコードするレンチウイルス粒子を注入し、マウスG3BP1を標的とするshRNAをコードするレンチウイルス粒子を注入した。SCA3については、手順は類似していたが、７２のグルタミンを含有するヒトATXN3MUTをコードするレンチウイルス粒子を用いた。レンチウイルス粒子を、上記と同じ座標を用いて、４００ng p２４／ulのレンチウイルス濃度で注入した。すべての定位注入は、ハミルトンシリンジに連結した３４ゲージの平滑末端針を用いた自動注入器（Stoelting Co.）によって行った。手術の数週間後にマウスを後方分析のために屠殺した：モデルによれば、SCA2レンチウイルスマウス：４週間および１２週間；SCA3レンチウイルスマウス：４週間；G3BP1注射マウス：４週間；SCA3トランスジェニックマウス：９週間。
【0069】
行動試験
一実施形態では、トランスジェニックマウスは、定位固定注入（４週齢）前に、注入後９週間まで３週間ごとに開始するいくつかの運動行動試験を受けた。運動と歩行（足どり）（gati）の協調は、ロータロッドおよびフットプリント試験によって、以前に記載されているのと同じ方法に従って、盲目的に行われた21。フットプリント試験の解析では、マウスが歩行試験の開始時と終了時にとったステップは含まれず、測定のために考慮されない。室温の水で満たされた長方形のタンク（１００×１０．５×２０cm）の一端にマウスを置くことにより、水泳性能を評価した。プラットフォームに到達し、タンクの横断にかかる時間が記録されるまで、マウスは自由に１m泳いだ。マウスは、１試行につき１５～２０分の間隔をおいて、３回試行を行った。統計解析には、樹木試験（tree trial）でタンクを横断するのに要した時間の平均値を用いた。
一実施形態では、トランスジェニックマウスは、定位固定注入（４週齢）前に、注入後９週間まで３週間ごとに開始するいくつかの運動行動試験を受けた。運動と歩行（足どり）（gati）の協調は、ロータロッドおよびフットプリント試験によって、以前に記載されているのと同じ方法に従って、盲目的に行われた21。フットプリント試験の解析では、マウスが歩行試験の開始時と終了時にとったステップは含まれず、測定のために考慮されない。室温の水で満たされた長方形のタンク（１００×１０．５×２０cm）の一端にマウスを置くことにより、水泳性能を評価した。プラットフォームに到達し、タンクの横断にかかる時間が記録されるまで、マウスは自由に１m泳いだ。マウスは、１試行につき１５～２０分の間隔をおいて、３回試行を行った。統計解析には、樹木試験（tree trial）でタンクを横断するのに要した時間の平均値を用いた。
【0070】
組織処理
一実施形態では、動物をペントバルビタールナトリウム過量投与により屠殺し、免疫組織化学的アッセイのために０．１Mリン酸緩衝液および４％パラホルムアルデヒド固定液（Sigma Aldrich）で経心潅流するか、または、２．５mm直径のHarris Coreペン（Ted Pella Inc.）を用いて、qPCRおよびウェスタンブロット分析のために、頸部脱臼および脳の線条体パンチ（punch）を有していた。脳と線条体パンチを４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定後、３０％スクロース／０．１Mリン酸緩衝液（PBS）中で４８時間脱水し、‐８０℃で凍結保護した。クリオスタット‐ミクロトームモデルCryoStar NX50（Thermofisher）を用いて、それぞれ３０μmおよび２５μmの矢状（sagittal）または冠状脳切片を得た。保存のために、脳切片は、０．０２%（w/v）のアジ化ナトリウムPBS中で浮遊状態で４℃で保存された。
一実施形態では、動物をペントバルビタールナトリウム過量投与により屠殺し、免疫組織化学的アッセイのために０．１Mリン酸緩衝液および４％パラホルムアルデヒド固定液（Sigma Aldrich）で経心潅流するか、または、２．５mm直径のHarris Coreペン（Ted Pella Inc.）を用いて、qPCRおよびウェスタンブロット分析のために、頸部脱臼および脳の線条体パンチ（punch）を有していた。脳と線条体パンチを４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定後、３０％スクロース／０．１Mリン酸緩衝液（PBS）中で４８時間脱水し、‐８０℃で凍結保護した。クリオスタット‐ミクロトームモデルCryoStar NX50（Thermofisher）を用いて、それぞれ３０μmおよび２５μmの矢状（sagittal）または冠状脳切片を得た。保存のために、脳切片は、０．０２%（w/v）のアジ化ナトリウムPBS中で浮遊状態で４℃で保存された。
【0071】
クレシルバイオレット染色
一実施形態では、クレシルバイオレットで脳切片を染色するために、それらをゼラチンコーティングした顕微鏡スライドに載せた。脳切片を、水、９６%（v/v）エタノール、１００%（v/v）エタノール、キシレン、７５%（v/v）エタノールおよび０．１%（w/v）クレシルバイオレット溶液に連続的に浸漬した。スライスを洗浄するために、脳切片を水、７５%（v/v）エタノール、９６%（v/v）エタノール、１００%（v/v）エタノール、およびキシレン中に連続的に浸漬した。最後に、脳切片をEukitt（Sigma-Aldrich）でマウントした。画像は、Zeiss Axio Imager Z２の１０倍対物レンズで取得した。
一実施形態では、クレシルバイオレットで脳切片を染色するために、それらをゼラチンコーティングした顕微鏡スライドに載せた。脳切片を、水、９６%（v/v）エタノール、１００%（v/v）エタノール、キシレン、７５%（v/v）エタノールおよび０．１%（w/v）クレシルバイオレット溶液に連続的に浸漬した。スライスを洗浄するために、脳切片を水、７５%（v/v）エタノール、９６%（v/v）エタノール、１００%（v/v）エタノール、およびキシレン中に連続的に浸漬した。最後に、脳切片をEukitt（Sigma-Aldrich）でマウントした。画像は、Zeiss Axio Imager Z２の１０倍対物レンズで取得した。
【0072】
免疫細胞化学
一実施形態では、免疫細胞化学的手順のために、４％パラホルムアルデヒド（PFA）固定溶液を使用して細胞を２０分間固定し、０．１Mリン酸緩衝溶液（PBS）で洗浄した。次いで、試料を０．１% Triton（商標）X‐１００を含むPBS中で１０分間インキュベートした。牛血清アルブミン（Sigma）１％を含むPSBのブロッキングを３０分間実施した。試料は、適切に希釈し４oCで一次抗体と共に一晩、二次抗体（１：２００）と共に室温で２時間インキュベートした。二次抗体をフルオロフォア（Alexa Fluor（登録商標）、Invitrogen）に結合させた。最後に、カバースリップをDAPI（Invitrogen）を用いたFluoromount‐Gマウンティング媒体を用いて顕微鏡スライドにマウントした。
一実施形態では、免疫細胞化学的手順のために、４％パラホルムアルデヒド（PFA）固定溶液を使用して細胞を２０分間固定し、０．１Mリン酸緩衝溶液（PBS）で洗浄した。次いで、試料を０．１% Triton（商標）X‐１００を含むPBS中で１０分間インキュベートした。牛血清アルブミン（Sigma）１％を含むPSBのブロッキングを３０分間実施した。試料は、適切に希釈し４oCで一次抗体と共に一晩、二次抗体（１：２００）と共に室温で２時間インキュベートした。二次抗体をフルオロフォア（Alexa Fluor（登録商標）、Invitrogen）に結合させた。最後に、カバースリップをDAPI（Invitrogen）を用いたFluoromount‐Gマウンティング媒体を用いて顕微鏡スライドにマウントした。
【0073】
免疫組織化学
一実施形態では、光イメージングのための免疫組織化学的手法は、リン酸緩衝液（１：１０００；１５分、３７℃）で希釈したフェニルヒドラジン中での脳切片のインキュベーションで開始した。ヒト脳切片について、トリス緩衝生理食塩水pH ９抗原回収方法（３０分、９５℃）による追加の工程を実施した。脳切片を、０．１% Triton（商標）Xリン酸緩衝液（１時間、室温）中の１０％正常ヤギ血清中でブロッキングし、それぞれ一次（４℃で一晩）および二次ビオチニル化抗体（室温で２時間）でインキュベーションしたものをブロッキング液で希釈した後、ベクタステインエライト（Vectastain elite）アビジン‐ビオチン‐ペルオキシダーゼキットおよび３，３’‐ジアミノベンジジン基質（いずれもVector Laboratories製）と反応させた。次いで、切片を顕微鏡スライド上に集め、濃度を増加させたエタノール溶液（７５、９６、および１００％）およびキシレンで脱水し、最終的に、マウンティング媒体Eukitt（O. Kindler GmbH & CO）を用いてカバーをスリップさせた。蛍光免疫組織化学法のために、脳切片を上述のブロッキング溶液中でインキュベートし、続いて一次および二次抗体インキュベーションを行った。４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（DAPI）（Invitrogen）を添加したFluoromount‐G Mounting培地を用いて、顕微鏡スライドに脳切片をマウントした。
一実施形態では、光イメージングのための免疫組織化学的手法は、リン酸緩衝液（１：１０００；１５分、３７℃）で希釈したフェニルヒドラジン中での脳切片のインキュベーションで開始した。ヒト脳切片について、トリス緩衝生理食塩水pH ９抗原回収方法（３０分、９５℃）による追加の工程を実施した。脳切片を、０．１% Triton（商標）Xリン酸緩衝液（１時間、室温）中の１０％正常ヤギ血清中でブロッキングし、それぞれ一次（４℃で一晩）および二次ビオチニル化抗体（室温で２時間）でインキュベーションしたものをブロッキング液で希釈した後、ベクタステインエライト（Vectastain elite）アビジン‐ビオチン‐ペルオキシダーゼキットおよび３，３’‐ジアミノベンジジン基質（いずれもVector Laboratories製）と反応させた。次いで、切片を顕微鏡スライド上に集め、濃度を増加させたエタノール溶液（７５、９６、および１００％）およびキシレンで脱水し、最終的に、マウンティング媒体Eukitt（O. Kindler GmbH & CO）を用いてカバーをスリップさせた。蛍光免疫組織化学法のために、脳切片を上述のブロッキング溶液中でインキュベートし、続いて一次および二次抗体インキュベーションを行った。４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（DAPI）（Invitrogen）を添加したFluoromount‐G Mounting培地を用いて、顕微鏡スライドに脳切片をマウントした。
【0074】
免疫化学抗体
一実施形態では、免疫化学的手順のために、以下の一次抗体が使用された：
マウス抗ataxin‐2（1:1000, ref. 611378, BD Biosciences）、マウス抗ユビキチン（1:1000, ref. 3936S, Cell Signaling）、ウサギ抗DARPP‐32（1:1000, ref. AB10518, Merck Millipore）、ウサギ抗G3BP1（1:1000, ref. 07-1801, Millipore）、マウス抗ヒトG3BP1（1:1000, ref. 611126, BD Biosciences）、抗G3BP1（1:1000, ref. 05‐1938; Sigma‐Aldrich）、マウス抗GFAP（1:1000, ref. 644702, BioLegend）、ウサギ抗HA（1:1000, ref. Ab9110, Abcam）、マウス抗カルビンジン D‐28K（1:1000, ref. C9848 , Sigma Aldrich）、マウス抗PABP‐1（1:1000, ref. 04‐1467, Millipore）、マウスβ‐Gal（14B7)（1:500, ref. 2372, Cell Signaling Technology)。
一実施形態では、免疫化学的手順のために、以下の一次抗体が使用された：
マウス抗ataxin‐2（1:1000, ref. 611378, BD Biosciences）、マウス抗ユビキチン（1:1000, ref. 3936S, Cell Signaling）、ウサギ抗DARPP‐32（1:1000, ref. AB10518, Merck Millipore）、ウサギ抗G3BP1（1:1000, ref. 07-1801, Millipore）、マウス抗ヒトG3BP1（1:1000, ref. 611126, BD Biosciences）、抗G3BP1（1:1000, ref. 05‐1938; Sigma‐Aldrich）、マウス抗GFAP（1:1000, ref. 644702, BioLegend）、ウサギ抗HA（1:1000, ref. Ab9110, Abcam）、マウス抗カルビンジン D‐28K（1:1000, ref. C9848 , Sigma Aldrich）、マウス抗PABP‐1（1:1000, ref. 04‐1467, Millipore）、マウスβ‐Gal（14B7)（1:500, ref. 2372, Cell Signaling Technology)。
【0075】
画像定量分析・データ処理
一実施形態では、免疫細胞化学画像は、定量化のためにZeiss Axio Imager Z２で、代表的な画像のためにZeiss LSM710共焦点顕微鏡で取得した。それぞれの独立した実験において、４０倍または６３倍の対物を用いて、１００個のトランスフェクトされた細胞内の凝集体を有する細胞数を計数することにより、定量分析を盲検下で実施した。レンチウイルスマウスモデルからの免疫組織化学画像を、Zeiss Axio Imager Z２およびAxio Scan Z１スライドスキャナ顕微鏡において２０倍の対物で取得した。ataxin‐2凝集体とDARP‐32染色ロスを定量するために、ZENライトソフトウエア（Zeiss）で動物当たり１８の冠状断面（colonal section）を分析し、線条体の完全な吻尾側写真を得た。すべての動物において、Ataxin‐2含有物を手動でカウントした。DARP‐32ニューロン病変領域をすべての動物について手動で測定し、次の式に従って枯渇容積の定量化を可能にした：容積＝d*（a１+a２+a３）、ここでdは連続切片間の距離（２００μm）であり、a１+a２+a３は個々の切片の枯渇領域である。トランスジェニックマウス動物からの免疫組織化学画像を、小脳全体の２８０μmにわたる８つの矢状切片を取得し、抗HA、抗カルビンジンで染色し、DAPIを２０倍対物レンズを用いてZeiss Axio Imager Z2顕微鏡で取得した。各切片について、画像解析ソフトウェア（ZEN 2.1 lite、Zeiss）を用いて、すべての小脳小葉においてHA凝集体およびプルキンエ細胞を有する細胞数を盲検下で計数した。
一実施形態では、免疫細胞化学画像は、定量化のためにZeiss Axio Imager Z２で、代表的な画像のためにZeiss LSM710共焦点顕微鏡で取得した。それぞれの独立した実験において、４０倍または６３倍の対物を用いて、１００個のトランスフェクトされた細胞内の凝集体を有する細胞数を計数することにより、定量分析を盲検下で実施した。レンチウイルスマウスモデルからの免疫組織化学画像を、Zeiss Axio Imager Z２およびAxio Scan Z１スライドスキャナ顕微鏡において２０倍の対物で取得した。ataxin‐2凝集体とDARP‐32染色ロスを定量するために、ZENライトソフトウエア（Zeiss）で動物当たり１８の冠状断面（colonal section）を分析し、線条体の完全な吻尾側写真を得た。すべての動物において、Ataxin‐2含有物を手動でカウントした。DARP‐32ニューロン病変領域をすべての動物について手動で測定し、次の式に従って枯渇容積の定量化を可能にした：容積＝d*（a１+a２+a３）、ここでdは連続切片間の距離（２００μm）であり、a１+a２+a３は個々の切片の枯渇領域である。トランスジェニックマウス動物からの免疫組織化学画像を、小脳全体の２８０μmにわたる８つの矢状切片を取得し、抗HA、抗カルビンジンで染色し、DAPIを２０倍対物レンズを用いてZeiss Axio Imager Z2顕微鏡で取得した。各切片について、画像解析ソフトウェア（ZEN 2.1 lite、Zeiss）を用いて、すべての小脳小葉においてHA凝集体およびプルキンエ細胞を有する細胞数を盲検下で計数した。
【0076】
ウェスタンブロット法
一実施形態において、試料は、細胞抽出物であれば１０x RIPA溶液（Merck Millipore）中で溶解されるか、またはマウス線条体パンチであれば尿素／DTT溶液中でホモジナイズされ、両方ともプロテアーゼインヒビター（Roche）のカクテルを含み、続いて３０秒ON、３０秒OFF、５サイクルの超音波ソニケーション（Bioruptor Pico）のいずれかであった。タンパク質濃度レベルは、細胞溶解物についてはPierce（商標）BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）、マウスサンプルについてはNZYBradford試薬（Nzytech）を用いて測定した。タンパク質抽出物をSDS‐ポリアクリルアミドゲル（７．５％および１２％）で分離し、次いでタンパク質をPVDF膜（Merck Millipore）に移し、３％のBSAまたは５％のミルクでTBS‐T中で膜をブロッキングし、一次は４℃で一晩、二次は室温で２時間一晩抗体プローブした。以下の抗体を使用した：マウス抗ataxin‐2（1:1000, ref. 611378, BD Biosciences）；マウス抗ataxin‐3（1H9）（1:1000, ref. MAB5360, BD Biosciences）；ウサギ抗G3BP1（1:1000, ref. 07-1801, Millipore）；マウス抗ヒトG3BP1（1:1000, ref. 611126, BD Biosciences）；抗G3BP1（1:1000, ref. 05-1938; Sigma‐Aldrich）；マウス抗β‐actin（1:5000, ref. A5316, Sigma Aldrich）マウス抗B‐tubulin（1:5000, ref. T7816, Sigma）；マウス抗ピューロマイシン（1:250, ref. MABE343, Millipore）；マウス抗GFP（1:1000, ref. 668205, BioLegend）；マウスβ‐Gal（14B7)（1:500, ref. 2372, Cell Signaling Technology）。エンハンスド・ケミルミネセンス（Enhanced Chemiluminescence）（GEヘルスケア）を用いて膜を分解し、ケミドック（ChemiDoc）（商標）XRS+（Bio‐Rad）でスキャンした。Image Jソフトウェアを用いて光学的デンシオメトリー分析を行った。
一実施形態において、試料は、細胞抽出物であれば１０x RIPA溶液（Merck Millipore）中で溶解されるか、またはマウス線条体パンチであれば尿素／DTT溶液中でホモジナイズされ、両方ともプロテアーゼインヒビター（Roche）のカクテルを含み、続いて３０秒ON、３０秒OFF、５サイクルの超音波ソニケーション（Bioruptor Pico）のいずれかであった。タンパク質濃度レベルは、細胞溶解物についてはPierce（商標）BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）、マウスサンプルについてはNZYBradford試薬（Nzytech）を用いて測定した。タンパク質抽出物をSDS‐ポリアクリルアミドゲル（７．５％および１２％）で分離し、次いでタンパク質をPVDF膜（Merck Millipore）に移し、３％のBSAまたは５％のミルクでTBS‐T中で膜をブロッキングし、一次は４℃で一晩、二次は室温で２時間一晩抗体プローブした。以下の抗体を使用した：マウス抗ataxin‐2（1:1000, ref. 611378, BD Biosciences）；マウス抗ataxin‐3（1H9）（1:1000, ref. MAB5360, BD Biosciences）；ウサギ抗G3BP1（1:1000, ref. 07-1801, Millipore）；マウス抗ヒトG3BP1（1:1000, ref. 611126, BD Biosciences）；抗G3BP1（1:1000, ref. 05-1938; Sigma‐Aldrich）；マウス抗β‐actin（1:5000, ref. A5316, Sigma Aldrich）マウス抗B‐tubulin（1:5000, ref. T7816, Sigma）；マウス抗ピューロマイシン（1:250, ref. MABE343, Millipore）；マウス抗GFP（1:1000, ref. 668205, BioLegend）；マウスβ‐Gal（14B7)（1:500, ref. 2372, Cell Signaling Technology）。エンハンスド・ケミルミネセンス（Enhanced Chemiluminescence）（GEヘルスケア）を用いて膜を分解し、ケミドック（ChemiDoc）（商標）XRS+（Bio‐Rad）でスキャンした。Image Jソフトウェアを用いて光学的デンシオメトリー分析を行った。
【0077】
RT‐qPCR
一実施形態によると、マウスの線条体パンチからの全RNAは、トリゾール（Invitrogen）組織解離およびRNA／DNA／タンパク質クロロホルム分離によって開始した。次いで、NZY Total RNA Isolation kit（Nzytech）を用いて、マウスおよび細胞サンプルの両方を抽出した。NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いてRNA濃度と純度を測定した。製造業者の推奨に従ってiScript cDNA合成キット（Bio‐Rad）を用いてRNA１μgのcDNA分子を製造した。定量的RT‐qPCRは、SsoAdvanced（商標）Universal SYBR（登録商標）Green Supermix（Bio‐Rad）を用いて、対象遺伝子についての自家製プライマーおよび対照としてのヒトGAPDHハウスキーピング遺伝子ついての自家製プライマーを用い、CFX96タッチリアルタイムPCR検出システム（Bio‐Rad）で実施した。mRNA遺伝子対照に対するmRNA発現レベルは、増幅値を用いて測定した。以下のプライマーを使用した：ヒトATXN2（QT01852480）およびヒトATXN3（QT00094927）QuantiTect Primer Assays、QiagenヒトG3BP1（フォワード配列番号12：5’‐GAA ATC CAA GAG GAA AAG CC‐3’；リバース配列番号13：5’‐CCC AAG AAA ATG TCC TCA AG）、ヒトGAPDH（フォワード配列番号14：5’‐ACA GTT GCC ATG TAG ACC‐3’；リバース配列番号15：5’‐TTG AGC ACA GGG TAC TTT A‐3’）およびマウスHprt（フォワード配列番号16：5’‐AGG GAT TTG AAT CAC GTT TG‐3；リバース配列番号17：5’‐TTT ACT GGC AAC ATC AAC AG‐3’）KiCqStart Pre-designed Primers, Sigma-Aldrich。
一実施形態によると、マウスの線条体パンチからの全RNAは、トリゾール（Invitrogen）組織解離およびRNA／DNA／タンパク質クロロホルム分離によって開始した。次いで、NZY Total RNA Isolation kit（Nzytech）を用いて、マウスおよび細胞サンプルの両方を抽出した。NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いてRNA濃度と純度を測定した。製造業者の推奨に従ってiScript cDNA合成キット（Bio‐Rad）を用いてRNA１μgのcDNA分子を製造した。定量的RT‐qPCRは、SsoAdvanced（商標）Universal SYBR（登録商標）Green Supermix（Bio‐Rad）を用いて、対象遺伝子についての自家製プライマーおよび対照としてのヒトGAPDHハウスキーピング遺伝子ついての自家製プライマーを用い、CFX96タッチリアルタイムPCR検出システム（Bio‐Rad）で実施した。mRNA遺伝子対照に対するmRNA発現レベルは、増幅値を用いて測定した。以下のプライマーを使用した：ヒトATXN2（QT01852480）およびヒトATXN3（QT00094927）QuantiTect Primer Assays、QiagenヒトG3BP1（フォワード配列番号12：5’‐GAA ATC CAA GAG GAA AAG CC‐3’；リバース配列番号13：5’‐CCC AAG AAA ATG TCC TCA AG）、ヒトGAPDH（フォワード配列番号14：5’‐ACA GTT GCC ATG TAG ACC‐3’；リバース配列番号15：5’‐TTG AGC ACA GGG TAC TTT A‐3’）およびマウスHprt（フォワード配列番号16：5’‐AGG GAT TTG AAT CAC GTT TG‐3；リバース配列番号17：5’‐TTT ACT GGC AAC ATC AAC AG‐3’）KiCqStart Pre-designed Primers, Sigma-Aldrich。
【0078】
統計解析
一実施形態では、統計解析は、GraphPadソフトウェア（La Jolla）に頼って、Bonferroni多重比較検定で補完されたStudent t検定または一元配置（one-way）ANOVAのいずれかを用いて行った。
一実施形態では、統計解析は、GraphPadソフトウェア（La Jolla）に頼って、Bonferroni多重比較検定で補完されたStudent t検定または一元配置（one-way）ANOVAのいずれかを用いて行った。
【0079】
結果
ストレス顆粒の集合（アッセンブリ）はATXN2およびATXN3タンパク質のレベルを変化させない。
SGは、mRNA、翻訳因子、およびRBPが合体して細胞傷害を防ぐ、ストレスに反応して形成される細胞巣である27,28。したがって、本開示の発明者らは、病理的（ATXN2MUTおよびATXN3MUT）および非病理的形態（ATXN2WTおよびATXN3WT）の両方において、ATXN2およびATXN3タンパク質動態におけるSGアセンブリの影響を調査した。そのために、ATXN2（ATXN2WT：pEGFP‐ATXN2‐Q22またはATXN2MUT：pEGFP‐ATXN2‐Q104）またはATXN3（ATXN3WT：pEGFP‐ATXN3‐Q24またはATXN3MUT：pEGFP‐ATXN3‐Q844）を発現するNeuro2a細胞において、亜ヒ酸ナトリウムを用いてSGの集合（アッセンブリ）を薬理学的に誘導した（図９a）。既報のように、ataxin‐2はSGsに動員されるが29、ataxin‐3は動員されない。両タンパク質の変異体の発現は凝集体の形成につながる（図１a，１f）。しかしながら、ストレス刺激が誘導されなかった対照条件（それぞれATXN2MUTおよびATXN3MUT）と比較して、SGの集合はATXN2MUTまたはATXN3MUT凝集体による細胞数を変化させなかった（図１c、１h）。非病理的形態のタンパク質は凝集体を形成しないが、SG集合が誘導されると、ATXN2WTとATXN3WTの両方の条件で凝集体様構造が形成される（図１a，１f）。SGの集合はeiF２αのリン酸化と翻訳抑制を伴い30、タンパク質の全合成を低下させる（図９b、c）。そこで、ATXN2とATXN3タンパク質のレベルがSG集合によって変化するかどうかを調べ、それらのレベルをウェスタンブロット法で分析した（図１b、１g）。凝集体について観察された結果と一致して、異なる実験条件の間でこれらのタンパク質のレベルにおける変化は観察されず、非病理的（図１d、１i）および病理的（図１e、１j）タンパク質形態においても観察されなかった。総合すると、これらの結果は、SGの集合は全体的な翻訳を減少させるが、ATXN2およびATXN3凝集を妨害せず、それらのタンパク質レベルも妨害しないようであることを示した。
ストレス顆粒の集合（アッセンブリ）はATXN2およびATXN3タンパク質のレベルを変化させない。
SGは、mRNA、翻訳因子、およびRBPが合体して細胞傷害を防ぐ、ストレスに反応して形成される細胞巣である27,28。したがって、本開示の発明者らは、病理的（ATXN2MUTおよびATXN3MUT）および非病理的形態（ATXN2WTおよびATXN3WT）の両方において、ATXN2およびATXN3タンパク質動態におけるSGアセンブリの影響を調査した。そのために、ATXN2（ATXN2WT：pEGFP‐ATXN2‐Q22またはATXN2MUT：pEGFP‐ATXN2‐Q104）またはATXN3（ATXN3WT：pEGFP‐ATXN3‐Q24またはATXN3MUT：pEGFP‐ATXN3‐Q844）を発現するNeuro2a細胞において、亜ヒ酸ナトリウムを用いてSGの集合（アッセンブリ）を薬理学的に誘導した（図９a）。既報のように、ataxin‐2はSGsに動員されるが29、ataxin‐3は動員されない。両タンパク質の変異体の発現は凝集体の形成につながる（図１a，１f）。しかしながら、ストレス刺激が誘導されなかった対照条件（それぞれATXN2MUTおよびATXN3MUT）と比較して、SGの集合はATXN2MUTまたはATXN3MUT凝集体による細胞数を変化させなかった（図１c、１h）。非病理的形態のタンパク質は凝集体を形成しないが、SG集合が誘導されると、ATXN2WTとATXN3WTの両方の条件で凝集体様構造が形成される（図１a，１f）。SGの集合はeiF２αのリン酸化と翻訳抑制を伴い30、タンパク質の全合成を低下させる（図９b、c）。そこで、ATXN2とATXN3タンパク質のレベルがSG集合によって変化するかどうかを調べ、それらのレベルをウェスタンブロット法で分析した（図１b、１g）。凝集体について観察された結果と一致して、異なる実験条件の間でこれらのタンパク質のレベルにおける変化は観察されず、非病理的（図１d、１i）および病理的（図１e、１j）タンパク質形態においても観察されなかった。総合すると、これらの結果は、SGの集合は全体的な翻訳を減少させるが、ATXN2およびATXN3凝集を妨害せず、それらのタンパク質レベルも妨害しないようであることを示した。
【0080】
G3BP1の過剰発現は凝集体を有する細胞数とATXN2およびATXN3タンパク質のレベルを低下させる
SGアッセンブリは、G3BP1を含むそのコア成分の過剰発現によって誘導することもでき13,31、これは、mRNA安定化と分解の両方が可能なRBPである15。しかしながら、本開示では、Neuro2a G3BP1の過剰発現のみでは、亜ヒ酸ナトリウム刺激と組み合わせた場合よりも、SG形成を誘導する効果が低いことが観察された（図１０）。この系統では、SCA2およびSCA3患者由来の線維芽細胞では、G3BP1が拡散的に発現しており（diffuse expression）、これは健康な線維芽細胞でも観察される（図１１）。逆に、亜ヒ酸ナトリウム処理時に、G3BP1は陽性病巣内で凝縮する（図１１）。SGで観察されるように、G3BP1の過剰発現は、より低いレベルではあるが、タンパク質合成の阻害にもつながる（図９b、１d）。このことを考慮に入れて、次にATXN2MUTおよびATXN3MUTタンパク質におけるG3BP1過剰発現の影響を調べた。この目標を達成するために、Neuro2a細胞にATXN2MUTまたはATXN3MUTおよびG3BP1を同時トランスフェクトし、対照細胞として、ATXN2MUTまたはATXN3MUTとlacZを同時トランスフェクトしした細胞、および、ATXN2MUTまたはATXN3MUTをトランスフェクトした細胞を用いた（図１２）。前述したように、Neuro2aでは、両タンパク質の変異体の発現によって凝集体が形成され、これがpolyQ病の特徴となっている（図２ａ、２ｂ）。G3BP1過剰発現は、対照条件と比較して、ATXN2MUT（ATXN2MUT＋G3BP1：0.39±0.0153、対ATXN2MUT：0.53±0.036、n＝３、P＝0.0233）およびATXN3MUT（ATXN3MUT＋G3BP1：0.35±0.036、対ATXN3MUT：0.66±0.073、n＝3、P＝0.0201）の両方の凝集体を有する細胞数を有意に減少させることができることが分かった（図２ｃ、２d）。次に、G3BP1過剰発現時に観察された凝集体の減少が、ATXN2MUTおよびATXN3MUTのタンパク質レベルの低下と関連するかどうかを検討した（図２ｅ、２f）。さらに、非病理的形態のタンパク質レベルにおけるG3BP1過剰発現の影響についても、それぞれATXN2WTおよびATXN3WT（図２e、２f）を分析した。G3BP1過剰発現は、ATXN2WT（ATXN2WT＋G3BP1：0.65±0.06、対ATXN2WT＋lacZ：0.692±0.08、n＝5、P＝0.04）とATXN2MUT（ATXN2MUT＋G3BP1：0.35±0.1343、対ATXN2MUT＋lacZ：0.82±0.116、n＝5、P＝0.0076）の両方の発現レベルを有意に低下させることができることが分かった（図２g、２h）。同様に、対照条件（ATXN3WT＋G3BP1：0.608±0.026、対ATXN3WT＋lacZ：0.3±0.071、n＝5、P＝0.02およびATXN3MUT＋G3BP1：0.28±0.067、対ATXN3MUT＋lacZ：0.95±0.154、ｎ＝5、P＝0.004）と比較して、G3BP1過剰発現時にATXN3WTおよびATXN3MUTレベルの有意な減少も観察された（それぞれ、図２ｉ、２ｊ）。しかしながら、G3BP1過剰発現時のAtaxin‐2およびAtaxin‐3のマウス内因性レベルに変化は認められなかった（図１３）。さらに、追加の対照実験では、G3BP1が過剰発現された場合、GFPレベルは変化しなかった（図１４）。全体として、これらの結果は、G3BP1が変異体ataxin‐2および変異体ataxin‐3タンパク質のレベルおよび凝集を低下させることを示す。
NTF2様ドメインは、ataxin‐2およびataxin‐3変異タンパク質に対するG3BP1動作において重要である。
SGアッセンブリは、G3BP1を含むそのコア成分の過剰発現によって誘導することもでき13,31、これは、mRNA安定化と分解の両方が可能なRBPである15。しかしながら、本開示では、Neuro2a G3BP1の過剰発現のみでは、亜ヒ酸ナトリウム刺激と組み合わせた場合よりも、SG形成を誘導する効果が低いことが観察された（図１０）。この系統では、SCA2およびSCA3患者由来の線維芽細胞では、G3BP1が拡散的に発現しており（diffuse expression）、これは健康な線維芽細胞でも観察される（図１１）。逆に、亜ヒ酸ナトリウム処理時に、G3BP1は陽性病巣内で凝縮する（図１１）。SGで観察されるように、G3BP1の過剰発現は、より低いレベルではあるが、タンパク質合成の阻害にもつながる（図９b、１d）。このことを考慮に入れて、次にATXN2MUTおよびATXN3MUTタンパク質におけるG3BP1過剰発現の影響を調べた。この目標を達成するために、Neuro2a細胞にATXN2MUTまたはATXN3MUTおよびG3BP1を同時トランスフェクトし、対照細胞として、ATXN2MUTまたはATXN3MUTとlacZを同時トランスフェクトしした細胞、および、ATXN2MUTまたはATXN3MUTをトランスフェクトした細胞を用いた（図１２）。前述したように、Neuro2aでは、両タンパク質の変異体の発現によって凝集体が形成され、これがpolyQ病の特徴となっている（図２ａ、２ｂ）。G3BP1過剰発現は、対照条件と比較して、ATXN2MUT（ATXN2MUT＋G3BP1：0.39±0.0153、対ATXN2MUT：0.53±0.036、n＝３、P＝0.0233）およびATXN3MUT（ATXN3MUT＋G3BP1：0.35±0.036、対ATXN3MUT：0.66±0.073、n＝3、P＝0.0201）の両方の凝集体を有する細胞数を有意に減少させることができることが分かった（図２ｃ、２d）。次に、G3BP1過剰発現時に観察された凝集体の減少が、ATXN2MUTおよびATXN3MUTのタンパク質レベルの低下と関連するかどうかを検討した（図２ｅ、２f）。さらに、非病理的形態のタンパク質レベルにおけるG3BP1過剰発現の影響についても、それぞれATXN2WTおよびATXN3WT（図２e、２f）を分析した。G3BP1過剰発現は、ATXN2WT（ATXN2WT＋G3BP1：0.65±0.06、対ATXN2WT＋lacZ：0.692±0.08、n＝5、P＝0.04）とATXN2MUT（ATXN2MUT＋G3BP1：0.35±0.1343、対ATXN2MUT＋lacZ：0.82±0.116、n＝5、P＝0.0076）の両方の発現レベルを有意に低下させることができることが分かった（図２g、２h）。同様に、対照条件（ATXN3WT＋G3BP1：0.608±0.026、対ATXN3WT＋lacZ：0.3±0.071、n＝5、P＝0.02およびATXN3MUT＋G3BP1：0.28±0.067、対ATXN3MUT＋lacZ：0.95±0.154、ｎ＝5、P＝0.004）と比較して、G3BP1過剰発現時にATXN3WTおよびATXN3MUTレベルの有意な減少も観察された（それぞれ、図２ｉ、２ｊ）。しかしながら、G3BP1過剰発現時のAtaxin‐2およびAtaxin‐3のマウス内因性レベルに変化は認められなかった（図１３）。さらに、追加の対照実験では、G3BP1が過剰発現された場合、GFPレベルは変化しなかった（図１４）。全体として、これらの結果は、G3BP1が変異体ataxin‐2および変異体ataxin‐3タンパク質のレベルおよび凝集を低下させることを示す。
NTF2様ドメインは、ataxin‐2およびataxin‐3変異タンパク質に対するG3BP1動作において重要である。
【0081】
GB3BP1は、mRNA結合、DNA結合32、ヘリカーゼを含むいくつかの分子的および生物学的機能を有するRBPであり、免疫反応において重要な機能を有する34。概して、GB3BP1を含むRBPは特異的RNA結合領域を介してmRNAと相互作用する35,36。G3BP1のRNA認識モチーフ（RRM）は標的RNA配列と相互作用することが知られている37。G3BP1はまた、核膜孔複合体を介したタンパク質の核内シャトルに関与するNTF2様ドメインを有し38、タンパク質‐タンパク質相互作用を促進し39、G3BP1二量体化を媒介し、SG生成に重要である13。したがって、本発明者らは、変異体ataxin‐2およびataxin‐3の凝集および量に対するG3BP1の作用をよりよく理解するために、１つはNTF2様ドメイン（G3BP1‐ΔNTF2）の欠失、もう１つはRRMドメイン（G3BP1‐ΔRRM）の欠失、という２つの異なる形態のタンパク質を開発した（図３a、３b）。次に、それは、ATXN2MUTまたはATXN3MUTおよびG3BP1‐ΔNTF2またはG3BP1‐ΔRRMのいずれかと、さらに、対照として全長G3BP1およびlacZと、Neuro2a細胞を同時トランスフェクトした（図３c、３d）。G3BP1‐ΔRRMの発現は、lacZ対照条件（ATXN2MUT＋G3BP1‐ΔRRM：55±0.815対ATXN2MUT＋lacZ：62±0.814、n＝4、P＜0.001、およびATXN3MUT＋G3BP1‐ΔRRM：66.5±2.305対ATXN3MUT＋lacZ：80.7±2.37、n＝4、P＜0.001）と比較して、ATXN2MUTおよびATXN3MUT＋lacZの凝集体を有する細胞数の有意な減少をもたらす（それぞれ、図３e、３f）。しかしながら、全長G3BP1の発現と比較すると、G3BP1‐ΔRRMはATXN2MUTとATXN3MUTの凝集体を有する細胞数の有意な増加をもたらす。逆に、G3BP1‐ΔNTF2の発現は、lacZおよび全長G3BP1条件と比較して、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの凝集体を有する細胞の増加をもたらす（図３e、３f）。次に、G3BP1の両方の切断形態の発現時のATXN2MUTおよびATXN3MUTのレベルを解析した（図３ｇ、３ｉ）。G3BP1‐ΔRRMは、対照と比較して、ATXN2MUTおよびATXN3MUTのレベルを有意に低下させることが分かった（それぞれ、ATXN2MUT＋G3BP1‐ΔRRM：0.48±0.035対ATXN2MUT＋lacZ：0.64±0.013、n＝4、P＜0.001、およびATXN3MUT＋G3BP1‐ΔRRM：0.725±0.001対ATXN3MUT＋lacZ：0.93±0.012、n＝4、P＜0.001）（図３ｈ、３ｊ）。逆に、G3BP1‐ΔNTF2の発現は、ATXN2MUTおよびATXN3MUTタンパク質のレベルを有意に増加させる（図３ｈ、３ｊ）。総合すると、これらの結果は、変異体ataxin‐2および変異体ataxin‐3タンパク質に対するG3BP1作用の分子機構に重要なNTF2様ドメインの関連的役割を指摘する。
【0082】
Ser149リン酸化部位は、ataxin‐2およびataxin‐3変異体タンパク質に対するG3BP1動作において重要である
G3BP1タンパク質では、NTF2様ドメインはリン酸化部位（Ser‐149）に近接して位置しており、重要は機能的な役割を果たしていると考えられる17,36。G3BP1‐ΔRRMはATXN2MUTとATXN3MUTのレベルと凝集を低減できたが、全長G3BP1よりも少なかった。そこで、本開示の発明者らは、GB3BP1の機能的役割におけるSer149の重要性を調査することを目的とした。そのために、リン酸化模倣S149Dとリン酸化されないS149Aの２つのリン酸化物質G3BP1が開発された（図１５）。Neuro2a細胞にATXN2MUTまたはATXN3MUTとG3BP1（S149D）およびG3BP1（S140A）を同時トランスフェクトした。共焦点画像により、野生型G3BP1を発現する細胞では、ATXN2MUTまたはATXN3MUTの凝集体は存在しないことが観察された（図４a、４b；白矢印）。同じパターンがリン酸化模倣G3BP1（S149D）上での発現で観察される。一方、リン酸化のない（phospho-dead）G3BP1（S149A）を発現する細胞では、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの凝集体が観察された（図４a、４b；白矢頭）。次に、２種類のリン酸化合物がATXN2MUTおよびATXN3MUTのタンパク質レベルに及ぼす影響を調べた（図４c、４d）。ATXN2MUTタンパク質のレベルは、G3BP1（S149A）式（ATXN2MUT＋G3BP1：0.24±0.026対ATXN2MUT＋G3BP1（S149A）：0.37±0.028、n＝3、P＜0.05）により有意に増加することが分かった（図４ｅ）。一方、ATXN2MUTタンパク質のレベルは、野生型G3BP1とリン酸化模倣型G3BP1（S149D）の間で類似している（図４ｅ）。同じ系統において、ATXN3MUTタンパク質のレベルは、野生型G3BP1およびG3BP1（S149D）条件と比較して、非リン酸化性G3BP1（S149A）発現時に増加する（図４g）。また、G3BP1（S149D）の発現は、野生型G3BP1状態と比較して、ATXN3MUTのレベルの有意な低下をもたらす（ATXN3MUT＋G3BP1：0.36±0.03対ATXN3MUT＋G3BP1（S149D）：0.25±0.01、n＝3、P＜0.05）。野生型G3BP1発現時に、対照条件と比較して、ATXN2MUTおよびATXN3MUTのmRNAレベルに有意な低下が認められた（図１６）。しかしながら、野生型G3BP1と比較して、２種類のリン酸化合物の発現に伴うATXN2MUTおよびATXN3MUTのmRNAレベルに差は認められなかった（図４ｆ、４ｈ）。全体として、これらの結果は、Ser‐149リン酸化部位がG3BP1分子活性に重要であり、変異体ataxin‐2と変異体ataxin‐3の凝集とタンパク質レベルを調節することを示唆する。
G3BP1タンパク質では、NTF2様ドメインはリン酸化部位（Ser‐149）に近接して位置しており、重要は機能的な役割を果たしていると考えられる17,36。G3BP1‐ΔRRMはATXN2MUTとATXN3MUTのレベルと凝集を低減できたが、全長G3BP1よりも少なかった。そこで、本開示の発明者らは、GB3BP1の機能的役割におけるSer149の重要性を調査することを目的とした。そのために、リン酸化模倣S149Dとリン酸化されないS149Aの２つのリン酸化物質G3BP1が開発された（図１５）。Neuro2a細胞にATXN2MUTまたはATXN3MUTとG3BP1（S149D）およびG3BP1（S140A）を同時トランスフェクトした。共焦点画像により、野生型G3BP1を発現する細胞では、ATXN2MUTまたはATXN3MUTの凝集体は存在しないことが観察された（図４a、４b；白矢印）。同じパターンがリン酸化模倣G3BP1（S149D）上での発現で観察される。一方、リン酸化のない（phospho-dead）G3BP1（S149A）を発現する細胞では、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの凝集体が観察された（図４a、４b；白矢頭）。次に、２種類のリン酸化合物がATXN2MUTおよびATXN3MUTのタンパク質レベルに及ぼす影響を調べた（図４c、４d）。ATXN2MUTタンパク質のレベルは、G3BP1（S149A）式（ATXN2MUT＋G3BP1：0.24±0.026対ATXN2MUT＋G3BP1（S149A）：0.37±0.028、n＝3、P＜0.05）により有意に増加することが分かった（図４ｅ）。一方、ATXN2MUTタンパク質のレベルは、野生型G3BP1とリン酸化模倣型G3BP1（S149D）の間で類似している（図４ｅ）。同じ系統において、ATXN3MUTタンパク質のレベルは、野生型G3BP1およびG3BP1（S149D）条件と比較して、非リン酸化性G3BP1（S149A）発現時に増加する（図４g）。また、G3BP1（S149D）の発現は、野生型G3BP1状態と比較して、ATXN3MUTのレベルの有意な低下をもたらす（ATXN3MUT＋G3BP1：0.36±0.03対ATXN3MUT＋G3BP1（S149D）：0.25±0.01、n＝3、P＜0.05）。野生型G3BP1発現時に、対照条件と比較して、ATXN2MUTおよびATXN3MUTのmRNAレベルに有意な低下が認められた（図１６）。しかしながら、野生型G3BP1と比較して、２種類のリン酸化合物の発現に伴うATXN2MUTおよびATXN3MUTのmRNAレベルに差は認められなかった（図４ｆ、４ｈ）。全体として、これらの結果は、Ser‐149リン酸化部位がG3BP1分子活性に重要であり、変異体ataxin‐2と変異体ataxin‐3の凝集とタンパク質レベルを調節することを示唆する。
【0083】
G3BP1のmRNAおよびタンパク質レベルはSCA2およびSCA3で低下するが、それをサイレンシングするとマウス脳での凝集が増加する
これまでの研究では、変異体PolyQタンパク質がいくつかの遺伝子の発現を調節障害することがあると報告されている1,41。実際、本明細書の発明者らは、変異体ataxin‐3の発現が、野生型ataxin‐2濃度の異常な低下をさせることを示した42。次いで、この系統（ライン）において、SCA2およびSCA3患者および疾患モデルからの試料におけるG3BP1のレベルを分析した。SCA2患者の剖検脳検体では、線条体および小脳のいずれにおいても、健常者と比較して、G3BP1の免疫検出の低下が検出された（図１７）。さらに、SCA2患者由来の線維芽細胞では、健常対照者由来の線維芽細胞と比較して、G3BP1タンパク質（図５ａ、５ｃ）およびmRNA（図５ｄ）のレベルの有意な低下が検出された。同じ系統において、SCA3患者由来の線維芽細胞では、健常対照者の線維芽細胞と比較して、G3BP1タンパク質（図５ｂ、５ｅ）およびmRNAレベル（図５ｆ）の低下が観察された。この低下は、本試験で用いたSCA3のトランスジェニックマウスモデルでも認められた（図５g‐ｉ）。事実、G3BP1タンパク質およびmRNAレベルは、野生型C57BL／6と比較して、トランスジェニックSCA3動物において有意に低下している。このトランスジェニックマウスは、小脳のプルキンエ細胞において６９のグルタミンを有する切断型（truncated form）のataxin‐3を発現する。実際、トランスジェニック動物において検出されたG3BP1の低下は、これらの細胞において特に明白である（図１８）。G3BP1低下の機能的影響を調べるために、G3BP1（shG3BP1）を標的とする検証済（validated）のshRNAをコードするレンチウイルスベクター（図１９）を、SCA2およびSCA3のレンチウイルスラットモデルに注入した43,44（図５i、５l）。簡単に述べると、線条体の片側には、ATXN2MUT（またはATXN3MUT）およびshG3BP1をコードするレンチウイルスベクターを同時注入し、反対側半球には、対照としてATXN2MUT（またはATXN3MUT）およびスクランブルshRNA（shSrc）を注入した。注入後４週目に動物を屠殺し、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの凝集体の有無について線条体を組織学的に分析した（図５ｊ、５ｍ）。G3BP1のサイレンシングは、ATXN2MUT（ATXN2MUT＋shScr：434±55.62対ATXN2MUT＋shG3BP1：228±98.85、n＝4、P＜0.01）およびATXN3MUT（ATXN3MUT＋shScr：390±26.89対ATXN3MUT＋shG3BP1：290±22.37、n＝3、P＜0.05）の平均凝集体の個数の有意な増加につながることが分かった（図５ｋ、５ｎ）。総合すると、これらの結果は、SCA2およびSCA3において、G3BP1 mRNAおよびタンパク質の減少した量（レベル）が疾患の病因に重要であることを強調する。
これまでの研究では、変異体PolyQタンパク質がいくつかの遺伝子の発現を調節障害することがあると報告されている1,41。実際、本明細書の発明者らは、変異体ataxin‐3の発現が、野生型ataxin‐2濃度の異常な低下をさせることを示した42。次いで、この系統（ライン）において、SCA2およびSCA3患者および疾患モデルからの試料におけるG3BP1のレベルを分析した。SCA2患者の剖検脳検体では、線条体および小脳のいずれにおいても、健常者と比較して、G3BP1の免疫検出の低下が検出された（図１７）。さらに、SCA2患者由来の線維芽細胞では、健常対照者由来の線維芽細胞と比較して、G3BP1タンパク質（図５ａ、５ｃ）およびmRNA（図５ｄ）のレベルの有意な低下が検出された。同じ系統において、SCA3患者由来の線維芽細胞では、健常対照者の線維芽細胞と比較して、G3BP1タンパク質（図５ｂ、５ｅ）およびmRNAレベル（図５ｆ）の低下が観察された。この低下は、本試験で用いたSCA3のトランスジェニックマウスモデルでも認められた（図５g‐ｉ）。事実、G3BP1タンパク質およびmRNAレベルは、野生型C57BL／6と比較して、トランスジェニックSCA3動物において有意に低下している。このトランスジェニックマウスは、小脳のプルキンエ細胞において６９のグルタミンを有する切断型（truncated form）のataxin‐3を発現する。実際、トランスジェニック動物において検出されたG3BP1の低下は、これらの細胞において特に明白である（図１８）。G3BP1低下の機能的影響を調べるために、G3BP1（shG3BP1）を標的とする検証済（validated）のshRNAをコードするレンチウイルスベクター（図１９）を、SCA2およびSCA3のレンチウイルスラットモデルに注入した43,44（図５i、５l）。簡単に述べると、線条体の片側には、ATXN2MUT（またはATXN3MUT）およびshG3BP1をコードするレンチウイルスベクターを同時注入し、反対側半球には、対照としてATXN2MUT（またはATXN3MUT）およびスクランブルshRNA（shSrc）を注入した。注入後４週目に動物を屠殺し、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの凝集体の有無について線条体を組織学的に分析した（図５ｊ、５ｍ）。G3BP1のサイレンシングは、ATXN2MUT（ATXN2MUT＋shScr：434±55.62対ATXN2MUT＋shG3BP1：228±98.85、n＝4、P＜0.01）およびATXN3MUT（ATXN3MUT＋shScr：390±26.89対ATXN3MUT＋shG3BP1：290±22.37、n＝3、P＜0.05）の平均凝集体の個数の有意な増加につながることが分かった（図５ｋ、５ｎ）。総合すると、これらの結果は、SCA2およびSCA3において、G3BP1 mRNAおよびタンパク質の減少した量（レベル）が疾患の病因に重要であることを強調する。
【0084】
G3BP1レベルの回復は、SCA2およびSCA3レンチリアルマウスモデルにおける神経病理を緩和する
レンチウイルスベクターによって媒介されるATXN2MUTおよびATXN3MUTの発現は、死後のヒト組織にも見られる神経病理的徴候である45‐47、神経細胞内凝集体の生成および神経細胞マーカーのロス43,44をもたらす。このように、本発明者らは、インビボにおいて、G3BP1レベルを回復させることが、ATXN2MUTおよびATXN3MUTにより誘導される神経病理的異常を改善するかどうかを検討した。ATXN2MUT（またはATXN3MUT）およびヒトG3BP1をコードするレンチウイルスベクターを線条体の片側半球に共発現させ、対照として対側半球にATXN2MUT（またはATXN3MUT）をコードするレンチウイルスベクターを注入した（図６a、６b）。SCA2レンチウイルスマウスモデルについては注入後１２週目に、SCA3レンチウイルスマウスモデルについては注入後４週目に動物を屠殺し、線条体を組織学的に分析した。両モデルにおいて、G3BP1の発現は、ATXN2MUT凝集体数（ATXN2MUT＋G3BP1：1466±31.13、n＝5、対ATXN2MUT：±71.04、n＝5、P＝0.0002）およびATXN3MUT凝集体（ATXN3MUT＋G3BP1：6066±1958、対ATXN3MUT：30076±2717、n＝7、P＜0.0001）を有意に減少させることができた（図６ｃ‐ｄ、６ｆ‐ｇ）。ATXN2とATXN3のmRNAと可溶性タンパク質レベルも、注入後４週目の動物群で分析した（図２０）。SCA2レンチウイルスモデルでは、G3BP1発現時のATXN2MUTのmRNAおよびタンパク質レベルに有意な差は認められなかった（図２０ａ‐ｂ）。一方、SCA3レンチウイルスモデルでは、G3BP1を発現する半球において、ATXN3MUTタンパク質レベルの確実な低下が認められる（ATXN3MUT＋G3BP1：0.285±0.04、対ATXN3MUT：0.413±0.08、n＝4、P＝0.054）（図２０ｄ‐ｅ）。半球間でATXN2MUTまたはATXN2MUT mRNAレベルの変化は観察されなかった（図２０ｃ、２０ｆ）。線条体における変異体ataxin‐2または変異体ataxin‐3の発現は、神経性マーカーrs４３，４４の消失をもたらす。上記の結果に従い、G3BP1発現は、対照半球と比較して、両モデルにおいてニューロンマーカーDARPP‐32の保存を導いた（ATXN2MUT＋G3BP1：0.02±0.0078、対ATXN2MUT： 0.08±0.0078、n＝5、P＝0.001；ATXN3MUT＋G3BP1：0.19±0.0291、対ATXN3MUT：0.45±0.0647、n＝7、P＝0.0072）（図６ｃ、６ｅ、６ｆ、６ｈ）。これらの結果を総合すると、線条体におけるG3BP1発現は神経保護を媒介し、変異体ataxin‐2および変異体ataxin‐3の発現に関連する神経病理的特徴を低下させることが示される。
レンチウイルスベクターによって媒介されるATXN2MUTおよびATXN3MUTの発現は、死後のヒト組織にも見られる神経病理的徴候である45‐47、神経細胞内凝集体の生成および神経細胞マーカーのロス43,44をもたらす。このように、本発明者らは、インビボにおいて、G3BP1レベルを回復させることが、ATXN2MUTおよびATXN3MUTにより誘導される神経病理的異常を改善するかどうかを検討した。ATXN2MUT（またはATXN3MUT）およびヒトG3BP1をコードするレンチウイルスベクターを線条体の片側半球に共発現させ、対照として対側半球にATXN2MUT（またはATXN3MUT）をコードするレンチウイルスベクターを注入した（図６a、６b）。SCA2レンチウイルスマウスモデルについては注入後１２週目に、SCA3レンチウイルスマウスモデルについては注入後４週目に動物を屠殺し、線条体を組織学的に分析した。両モデルにおいて、G3BP1の発現は、ATXN2MUT凝集体数（ATXN2MUT＋G3BP1：1466±31.13、n＝5、対ATXN2MUT：±71.04、n＝5、P＝0.0002）およびATXN3MUT凝集体（ATXN3MUT＋G3BP1：6066±1958、対ATXN3MUT：30076±2717、n＝7、P＜0.0001）を有意に減少させることができた（図６ｃ‐ｄ、６ｆ‐ｇ）。ATXN2とATXN3のmRNAと可溶性タンパク質レベルも、注入後４週目の動物群で分析した（図２０）。SCA2レンチウイルスモデルでは、G3BP1発現時のATXN2MUTのmRNAおよびタンパク質レベルに有意な差は認められなかった（図２０ａ‐ｂ）。一方、SCA3レンチウイルスモデルでは、G3BP1を発現する半球において、ATXN3MUTタンパク質レベルの確実な低下が認められる（ATXN3MUT＋G3BP1：0.285±0.04、対ATXN3MUT：0.413±0.08、n＝4、P＝0.054）（図２０ｄ‐ｅ）。半球間でATXN2MUTまたはATXN2MUT mRNAレベルの変化は観察されなかった（図２０ｃ、２０ｆ）。線条体における変異体ataxin‐2または変異体ataxin‐3の発現は、神経性マーカーrs４３，４４の消失をもたらす。上記の結果に従い、G3BP1発現は、対照半球と比較して、両モデルにおいてニューロンマーカーDARPP‐32の保存を導いた（ATXN2MUT＋G3BP1：0.02±0.0078、対ATXN2MUT： 0.08±0.0078、n＝5、P＝0.001；ATXN3MUT＋G3BP1：0.19±0.0291、対ATXN3MUT：0.45±0.0647、n＝7、P＝0.0072）（図６ｃ、６ｅ、６ｆ、６ｈ）。これらの結果を総合すると、線条体におけるG3BP1発現は神経保護を媒介し、変異体ataxin‐2および変異体ataxin‐3の発現に関連する神経病理的特徴を低下させることが示される。
【0085】
野生型マウスの脳におけるG3BP1の過剰発現は、ニューロン消失もアストログリオーシスも生じなかった
先の結果に基づいて、本開示の発明者らは、野生型動物の脳におけるG3BP1発現の影響を評価した。そのため、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子を野生型C57BL／６マウスの線条体の片側の半球に注入し、反対側の半球に対照としてPBSを注入した（図７ａ）。注入後４週間で、G3BP1を注入した半球におけるニューロンマーカーDARPP‐32の消失（図７ｂ）は、PBSを注入した対照半球と比較して有意に小さかった（G3BP1：0.003±0.0014、対PBS：0.01±0.0011、n＝4、スチューデントｔ検定、P＝0.035）（図７ｂ、７ｃ）。実際、G3BP1を注入した動物では、病変領域は注入部位に限定されていた。この系統では、GFAPマーカーを介して星状細胞の活性化を解析し、G3BP1を注入した半球と対照のPBSを注入した半球を比較した（図７ｄ）。両半球間でGFAPの免疫反応性に差は認められなかった（図７ｅ）。全体として、これらの結果は、正常な脳におけるG3BP1過剰発現が毒性を生じないようであることを指摘している。
先の結果に基づいて、本開示の発明者らは、野生型動物の脳におけるG3BP1発現の影響を評価した。そのため、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子を野生型C57BL／６マウスの線条体の片側の半球に注入し、反対側の半球に対照としてPBSを注入した（図７ａ）。注入後４週間で、G3BP1を注入した半球におけるニューロンマーカーDARPP‐32の消失（図７ｂ）は、PBSを注入した対照半球と比較して有意に小さかった（G3BP1：0.003±0.0014、対PBS：0.01±0.0011、n＝4、スチューデントｔ検定、P＝0.035）（図７ｂ、７ｃ）。実際、G3BP1を注入した動物では、病変領域は注入部位に限定されていた。この系統では、GFAPマーカーを介して星状細胞の活性化を解析し、G3BP1を注入した半球と対照のPBSを注入した半球を比較した（図７ｄ）。両半球間でGFAPの免疫反応性に差は認められなかった（図７ｅ）。全体として、これらの結果は、正常な脳におけるG3BP1過剰発現が毒性を生じないようであることを指摘している。
【0086】
小脳のG3BP1レベルの回復は、SCA3トランスジェニックマウスモデルにおける挙動欠損および神経病理的異常を軽減する。
PolyQ SCAは進行性ニューロン消失と運動機能障害を特徴とする。このように、この表現型を模倣するために、本明細書では、６９個のグルタミンを有する切断型のataxin‐3変異体を発現するトランスジェニックマウスモデルを使用し、重度の運動機能障害、神経変性および早期発症を特徴とした23。これは、他のpolyQ疾患で観察されるように、ataxin‐3タンパク質の小さな領域と、グルタミンの重要な経路を含むだけで、病理を引き起こすことを考慮すると、関連するpolyQモデルでもあり得る23,48。そこで、G3BP1の発現量を減少させたこのトランスジェニックマウスモデル（図５ｇ‐ｉ）において、G3BP1発現の影響を検討した。そのために、４週齢時に、動物に、G3BP1をコードするレンチウイルスベクターで小脳に定位的に注入し49、対照動物にはGFPをコードするレンチウイルスベクターを注入した。第３群の非注入動物も使用した。その後、注入後９週間まで、３週間ごとに動物を一連の挙動試験に供した。この最終時点で、GB3BP1を注入した動物は、対照動物と比較して、回転する回転棒に長時間滞留し、運動障害の向上を示した（G3BP1：1.45±0.0124、n＝7、対NI：0.84±0.1082、n＝7、P＝0.0254）（図８a）。同じ系統において、注入後９週で、動物がプールを横切って安全なプラットフォームに到達しなければならない水泳試験では、G3BP1注入動物は、対照動物と比較して、プラットフォームに到達するまでの時間が少なかった（G3BP1：0.55±0.0974、n＝7、対NI：0.99±0.173、n＝7、P＝0.0476）（図８b）。最後に、動物が足をペイントして白いシートトンネルを横切るフットプリントパターン試験では、G3BP1を注入した動物は、対照動物と比較して、足跡の重複が小さく、運動障害の向上が示唆された（G3BP1：1.06±0.1081、n＝7、NI：1.62±0.1997、n＝7、P＝0.0297）（図８c）。全体として、これらの結果は、小脳におけるG3BP1発現が運動障害を改善できることを示す。神経病理的には、このマウスモデルは、小脳のプルキンエ細胞における凝集体の形成を特徴とし、これらの細胞の数の大幅な減少および小脳層構造の強い乱れを示している23，50。そこで、神経病理的異常におけるG3BP1発現の影響を評価した（図８d）。運動障害で観察された向上に伴い、G3BP1を注入した動物は、対照（G3BP1：63.12±10.17、n＝6、対NI：101.2±15.29、n＝6、P＝0.0397）と比較して、病理的凝集体（HAタグ）の数が有意に減少したことが分かった（図８ｅ）。モデルにおけるATXN3MUTの発現は小脳のプルキンエ細胞に向けられるため、カルビンジンマーカーを用いてそれらの数も評価した。G3BP1を注入した動物は、対照と比較してプルキンエ細胞数が保存されていることがわかった（G3BP1：1.62±0.2405、n＝6、対NI：0.91±0.1904、n＝6、P＝0.0437）（図８ｆ）。重要なことに、非形質導入葉では、病理的集合体（G3BP1：44.45±7.169、n＝６、対NI：49.7±9.385、n＝6）または小脳プルキンエ細胞数（G3BP1：1±0.1457、n＝6、対NI：0.97±0.1988 n＝6）に関して実験群間で差は認められなかった（図２１）。これらのトランスジェニック動物は小脳の強い萎縮を示すので、小脳層の厚さを分析した。形質導入小葉の分子層厚（II／III）は、非注入対照と比較して有意に広いことが分かった（G3BP1：64.99±3.189、n＝6対NI：56.03±1.824、n＝6、P＜0.0118）が、非形質導入小葉では差が認められなかった（図２２）。全体として、これらの結果は、小脳におけるG3BP1発現が運動行動障害を有意に減少させ、神経病理的異常を減少させることを示す。
PolyQ SCAは進行性ニューロン消失と運動機能障害を特徴とする。このように、この表現型を模倣するために、本明細書では、６９個のグルタミンを有する切断型のataxin‐3変異体を発現するトランスジェニックマウスモデルを使用し、重度の運動機能障害、神経変性および早期発症を特徴とした23。これは、他のpolyQ疾患で観察されるように、ataxin‐3タンパク質の小さな領域と、グルタミンの重要な経路を含むだけで、病理を引き起こすことを考慮すると、関連するpolyQモデルでもあり得る23,48。そこで、G3BP1の発現量を減少させたこのトランスジェニックマウスモデル（図５ｇ‐ｉ）において、G3BP1発現の影響を検討した。そのために、４週齢時に、動物に、G3BP1をコードするレンチウイルスベクターで小脳に定位的に注入し49、対照動物にはGFPをコードするレンチウイルスベクターを注入した。第３群の非注入動物も使用した。その後、注入後９週間まで、３週間ごとに動物を一連の挙動試験に供した。この最終時点で、GB3BP1を注入した動物は、対照動物と比較して、回転する回転棒に長時間滞留し、運動障害の向上を示した（G3BP1：1.45±0.0124、n＝7、対NI：0.84±0.1082、n＝7、P＝0.0254）（図８a）。同じ系統において、注入後９週で、動物がプールを横切って安全なプラットフォームに到達しなければならない水泳試験では、G3BP1注入動物は、対照動物と比較して、プラットフォームに到達するまでの時間が少なかった（G3BP1：0.55±0.0974、n＝7、対NI：0.99±0.173、n＝7、P＝0.0476）（図８b）。最後に、動物が足をペイントして白いシートトンネルを横切るフットプリントパターン試験では、G3BP1を注入した動物は、対照動物と比較して、足跡の重複が小さく、運動障害の向上が示唆された（G3BP1：1.06±0.1081、n＝7、NI：1.62±0.1997、n＝7、P＝0.0297）（図８c）。全体として、これらの結果は、小脳におけるG3BP1発現が運動障害を改善できることを示す。神経病理的には、このマウスモデルは、小脳のプルキンエ細胞における凝集体の形成を特徴とし、これらの細胞の数の大幅な減少および小脳層構造の強い乱れを示している23，50。そこで、神経病理的異常におけるG3BP1発現の影響を評価した（図８d）。運動障害で観察された向上に伴い、G3BP1を注入した動物は、対照（G3BP1：63.12±10.17、n＝6、対NI：101.2±15.29、n＝6、P＝0.0397）と比較して、病理的凝集体（HAタグ）の数が有意に減少したことが分かった（図８ｅ）。モデルにおけるATXN3MUTの発現は小脳のプルキンエ細胞に向けられるため、カルビンジンマーカーを用いてそれらの数も評価した。G3BP1を注入した動物は、対照と比較してプルキンエ細胞数が保存されていることがわかった（G3BP1：1.62±0.2405、n＝6、対NI：0.91±0.1904、n＝6、P＝0.0437）（図８ｆ）。重要なことに、非形質導入葉では、病理的集合体（G3BP1：44.45±7.169、n＝６、対NI：49.7±9.385、n＝6）または小脳プルキンエ細胞数（G3BP1：1±0.1457、n＝6、対NI：0.97±0.1988 n＝6）に関して実験群間で差は認められなかった（図２１）。これらのトランスジェニック動物は小脳の強い萎縮を示すので、小脳層の厚さを分析した。形質導入小葉の分子層厚（II／III）は、非注入対照と比較して有意に広いことが分かった（G3BP1：64.99±3.189、n＝6対NI：56.03±1.824、n＝6、P＜0.0118）が、非形質導入小葉では差が認められなかった（図２２）。全体として、これらの結果は、小脳におけるG3BP1発現が運動行動障害を有意に減少させ、神経病理的異常を減少させることを示す。
【0087】
考察
異常に拡大したpolyQ系（tract）を含むタンパク質は、最終的に細胞死に至るいくつかの細胞経路の障害と関係している。変異体polyQタンパク質が異常に凝集する傾向が高いことは、直接的に関与しているか、または少なくとも特定の毒性結果の悪化に寄与しており、polyQの病因に決定的に作用している。過去１０年間に、いくつかの神経変性疾患に特徴的な異常なタンパク質凝集は、細胞をストレスにさらすだけでなく、細胞のストレス応答経路を障害するという仮説が立てられてきた51。ストレス顆粒の形成は、タンパク質合成のメディエーターとして重要な役割を果たすため、ストレス応答における重要な役割の１つである。SGの集合の間に、RBPやmRNAのようないくつかの重要なプレーヤーが顆粒内に隔離され、これらの成分が翻訳動作（machinary）を統合するのを妨げている12,52。また、これまでのエビデンスから、SGはいくつかのタンパク質凝集体と共存することが示されており、これらの凝集体は様々な神経変性疾患に特徴的である53。したがって、本開示の発明者らは、SGの形成を介したストレス応答の活性化は、変異体PolyQタンパク質を隔離するか、または翻訳停止を促進し、その発現を減少させることができると仮定した。変異体ataxin‐2または変異体ataxin‐3を発現するNeuro2a細胞において、SG集合（アッセンブリ）を化学的に誘導すると、全体的な翻訳レベルの有意な低下につながることがわかったが、ATXN2MUTとATXN3MUTの両方の発現レベルに干渉せず、それらのタンパク質の凝集にも干渉しないようである。
異常に拡大したpolyQ系（tract）を含むタンパク質は、最終的に細胞死に至るいくつかの細胞経路の障害と関係している。変異体polyQタンパク質が異常に凝集する傾向が高いことは、直接的に関与しているか、または少なくとも特定の毒性結果の悪化に寄与しており、polyQの病因に決定的に作用している。過去１０年間に、いくつかの神経変性疾患に特徴的な異常なタンパク質凝集は、細胞をストレスにさらすだけでなく、細胞のストレス応答経路を障害するという仮説が立てられてきた51。ストレス顆粒の形成は、タンパク質合成のメディエーターとして重要な役割を果たすため、ストレス応答における重要な役割の１つである。SGの集合の間に、RBPやmRNAのようないくつかの重要なプレーヤーが顆粒内に隔離され、これらの成分が翻訳動作（machinary）を統合するのを妨げている12,52。また、これまでのエビデンスから、SGはいくつかのタンパク質凝集体と共存することが示されており、これらの凝集体は様々な神経変性疾患に特徴的である53。したがって、本開示の発明者らは、SGの形成を介したストレス応答の活性化は、変異体PolyQタンパク質を隔離するか、または翻訳停止を促進し、その発現を減少させることができると仮定した。変異体ataxin‐2または変異体ataxin‐3を発現するNeuro2a細胞において、SG集合（アッセンブリ）を化学的に誘導すると、全体的な翻訳レベルの有意な低下につながることがわかったが、ATXN2MUTとATXN3MUTの両方の発現レベルに干渉せず、それらのタンパク質の凝集にも干渉しないようである。
【0088】
G3BP1は、SGのコア成分であり、脱リン酸化された状態でSG生成を誘導することができるRBPである13。亜ヒ酸ナトリウムによる細胞ストレス誘発は、G3BP1の構成的リン酸化状態を低下させることが報告されている13,54。しかしながら、近年、この仮説がチャレンジされ54、亜ヒ酸ナトリウムを介する細胞ストレス誘発とG3BP1のリン酸化／脱リン酸化状態との間に相関があるかどうかは明らかでない。この可能性のある関係を明らかにするために、本開示の発明者らは、SCA2患者由来線維芽細胞においてG3BP1を過剰発現させた。G3BP1は細胞内で拡散した発現を示し、亜ヒ酸ナトリウムで細胞を処理したときに起こることとは対照的であることが分かった。亜ヒ酸ナトリウム処理では、GB3BP1はSGに似た構造で自己集合する。G3BP1機能はそのリン酸化／脱リン酸化状態に依存して変化するので、次の目的は、ATXN2MUT e ATXN3MUTを発現するNeuro2a細胞におけるG3BP1過剰発現の影響を研究することであった。G3BP1の過剰発現により、変異タンパク質凝集体を有する細胞数および変異polyQタンパク質の発現レベルの低下が観察された。リン酸化されたG3BP1は細胞内に拡散し、変異体polyQタンパク質に対してその触媒活性を行うが、非リン酸化G3BP1はSG様構造に集合し、その機能を切り替えると仮定した。
【0089】
ATXN2MUTおよびATXN3MUTレベルおよび凝集体に対するG3BP1作用の特異性を明らかにするために、本開示では、低レベルのマウス内因性G3BP1を有するNeuro2a細胞を用いた。この細胞株にATXN2MUTとATXN3MUTを発現させると、正常なNeuro2a細胞株と比較して、凝集体を有する細胞数が維持されることが観察された。しかしながら、共発現G3BP1および変異タンパク質を共発現させると、結果はNeuro2a細胞で観察されること、すなわち凝集体を有する細胞数の減少に沿ったものとなる。これらの観察は、変異polyQタンパク質のレベルと凝集体の個数の減少に関与するG3BP1発現を示唆する。
【0090】
次に、本発明者らは、G3BP1のどのドメインがその作用の分子機構に関与しているかを検討した。このように、本研究は、核孔を介した核輸送に関与し、タンパク質‐タンパク質相互作用を促進することが示されているNTF2様ドメインに焦点を当てた55。さらに、標的RNA配列と相互作用し、他のタンパク質と結合することができるRRMドメインの寄与についても調べた56。NTF2またはRRMドメインの欠失を伴うG3BP1の切断された構築物を発現させることにより、RRMドメインを欠失させると、ATXN2MUTおよびATXN3MUTの両方の凝集体を有する細胞数およびその発現レベルの低下が観察された。反対に、NTF2を欠失させた場合、実験条件間に差は見られなかった。これは、NTF2ドメインがG3BP1の作用に必須であることを示唆した。次に、発明者らは、ATXN2MUTおよびATXN3MUTのmRNAレベルに対するG3BP1発現の影響を分析した。これらのレベルは、G3BP1発現時に有意に減少することが分かった。G3BP1タンパク質はATXN3 RNAと相互作用することが判明しており40、これがATXN2と比較してATXN3 mRNAで見られるより堅牢な結果の原因である可能性がある。これまでの研究では、リン酸化されたG3BP1が細胞核に移行し、おそらくエンドリボヌクレアーゼ活性をすることが示されている17,33。前述したように、G3BP1のNTF2様ドメインは、重要なリン酸化部位であるセリン149に非常に近い。このリン酸化部位は、G3BP1のエンドヌクレアーゼ活性にも結合していると考えられている33。G3BP1リン酸化の影響を評価するために、G3BP1において部位特異的突然変異誘発を行い、セリン149をアラニンについてスイッチし、それにより149 aa部位でリン酸化死タンパク質を生成した。このリン酸化死構築物を用いて、G3BP1の発現がATXN2MUTとATXN3MUTの凝集体を有する細胞数においてその影響を失うことが分かり、G3BP1のリン酸化がその分子機能にとって極めて重要であることが示唆された。
【0091】
次に、本開示の発明者らは、SCA2およびSCA3患者ならびに動物モデルの文脈下で、G3BP1発現レベルを分析した。SCA2由来のヒト脳組織の死後試料において、G3BP1染色は実質的に減少し、低レベルの発現を示唆することが分かった。従って、SCA2およびSCA3患者由来線維芽細胞は、G3BP1 mRNAおよびタンパク質のレベルを低下させることも観察された。その結果、SCA2およびSCA3で観察される分子病理的表現型は、polyQ変異タンパク質毒性の共同効果およびG3BP1の発現レベルが低いために悪化することが示された。そこで、これら２つの疾患の異なるマウスモデルを用いて、疾患緩和におけるG3BP1再確立の可能性を検討した。SCA2およびSCA3レンチウイルスマウスモデルを用いて、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子の線条体への注入は、脳組織の保存（DARPP‐32染色）および凝集体の数の減少につながることが観察された。さらに、重度の神経変性および運動障害を特徴とするトランスジェニックマウスモデルにおいて、G3BP1をコードするレンチウイルス粒子の小脳への注入は、凝集体の個数を減少させ、プルキンエ細胞の数を保存することがわかった。重要なことに、マウス小脳におけるG3BP1発現は、全体の運動能力、バランスおよび協調性を有意に改善した。
【0092】
本開示により、驚くべきことに、SCA2およびSCA3罹患者の患者由来線維芽細胞および脳試料の両方において、G3BP1発現レベルが減少することがわかった。さらに、G3BP1発現は変異体ataxin‐2およびataxin‐3の発現を減少させることができることが示された。これらの結果は、SCA2およびSCA3疾患において、G3BP1が変異体のataxin‐2およびataxin‐3を下方制御する能力が、G3BP1発現レベルの低下により障害され、表現型の増悪を導くことを強く支持する。加えて、G3BP1 NTF2様ドメインおよびser 149リン酸化部位は、変異体ataxin‐2および変異体ataxin‐3凝集を緩和するために必須であることも示された。
【0093】
本開示の結果は、G3BP1の遺伝子送達が緩和SCA2およびSCA3病理において効率的かつ安全であることを強く支持し、SCA2およびSCA3だけでなく、他のPolyQ病に対する新規治療標的としてのG3BP1を支持する。
【0094】
この文書において使用されるときはいつでも、「含む」という用語は、記述された特徴、整数、工程、構成要素の存在を示すことを意図しているが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらのグループの存在または付加を排除するものではない。
【0095】
本開示は、記載された実施形態に限定されるものではなく、当業者は、その変更に対する多くの可能性を予見する。上述の実施形態は、組み合わせ可能である。
【0096】
以下の従属請求項は、さらに、本開示の特定の実施形態を記載する。
【0097】
参考文献
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】