特表2024-517548レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸、その製造方法、及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸、その製造方法、及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240416BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240416BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240416BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
A61K31/7088
A61P31/16
A61P11/00
C12N15/29 ZNA
C12N15/10 100Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555359
(86)(22)【出願日】2022-05-25
(85)【翻訳文提出日】2023-09-08
(86)【国際出願番号】 CN2022094829
(87)【国際公開番号】W WO2023201836
(87)【国際公開日】2023-10-26
(31)【優先権主張番号】202210424718.8
(32)【優先日】2022-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511128206
【氏名又は名称】南通大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】顧 暁松
(72)【発明者】
【氏名】毛 蘇蘇
(72)【発明者】
【氏名】▲ゴン▼ 蕾蕾
(72)【発明者】
【氏名】楊 暁明
(72)【発明者】
【氏名】王 星輝
(72)【発明者】
【氏名】孫 華林
(72)【発明者】
【氏名】徐 来
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZB33
(57)【要約】
本発明は、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸、その製造方法、及び使用を開示し、前記マイクロリボ核酸は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～１５で示されるｍｉＲＮＡから選択され、好ましくは、人工合成されたＱＱ＿１５９、植物ＱＱ＿１５９、ＱＱ＿１５９の前駆体形態又はＱＱ＿１５９の成熟体形態を含む、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で示されるＱＱ＿１５９である。本発明は、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤から機能性植物マイクロリボ核酸又は該マイクロリボ核酸含有抽出物を抽出し、実験を通じて、該レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９がウイルス性インフルエンザ及び新型コロナウイルス感染による肺炎に対して一定の阻害効果及び治療作用があることを実証している。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸であって、前記マイクロリボ核酸は、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ７、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３３、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３５、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ１０、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２０、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ５、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３６、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２８、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３１、ｐｐｔ－ｍｉＲ８９４、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３２、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２１、ｐａｂ－ｍｉＲ３７１１、ＱＱ＿１５９又はｂｄｉ－ｍｉＲ１５９ａ－３ｐから選択され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ７のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３３のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３５のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ１０のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２０のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ５のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３６のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２８のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９示され、
前記ｐｐｔ－ｍｉＲ８９４のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３２のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２示され、
前記ｐａｂ－ｍｉＲ３７１１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３示され、
前記ＱＱ＿１５９のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４示され、
前記ｂｄｉ－ｍｉＲ１５９ａ－３ｐのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５示される、ことを特徴とするレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸。
【請求項2】
前記マイクロリボ核酸は、人工合成されるＱＱ＿１５９、植物ＱＱ＿１５９、ＱＱ＿１５９の前駆体形態又はＱＱ＿１５９の成熟体形態を含むＱＱ＿１５９である、ことを特徴とする請求項１に記載のレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸の製造方法であって、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤３００ｍＬを５０ｍＬ酵素除去遠沈管にそれぞれ入れて、２０００ｒｐｍで遠心分離して不純物を除去し、１本ごとに１０ｍＬの上清を吸引して氷上に置き、煎剤の体積に対して３倍の割合でＴＲＩｚｏｌｌｓ３０ｍＬを加え、激しく振って均一にした後、室温で１０ｍｉｎ静置し、その後、クロロホルム６ｍＬを加え、激しく振って均一にし、１０ｍｉｎ静置するステップ１）と、
１００００ｇを４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集するステップ２）と、
等体積のイソプロパノールを加えて－２０℃で１ｈ沈殿させ、その後、１２０００ｇを１５ｍｉｎ遠心分離するステップ３）と、
上清を慎重に捨て、７５％のエタノール５ｍＬを加えて沈殿を洗浄し、１２０００ｇを４℃で５ｍｉｎ遠心分離するステップ４）と、
遠心分離後、エタノールを慎重に捨てて、沈殿を残し、沈殿を乾燥させた後、６５℃のＤＥＰＣ水２００μＬを加えて溶解し、ＲＮＡ濃度を測定するステップ５）と、
市販ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍｉＲＮＡを精製し、カラムごとにＲＮＡを１００μｇ通し、管ごとにＤＥＰＣ水６０μＬで溶解させるステップ６）と、
ｍｉＲＮＡの濃度を測定し、８ｈ凍結乾燥させた後、－８０℃で保存するステップ７）と、を含む、ことを特徴とする製造方法。
【請求項4】
インフルエンザウイルスの複製を阻害する薬物の製造における、請求項２に記載のレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸の使用。
【請求項5】
ウイルス性インフルエンザを治療する薬物の製造における、請求項２に記載のレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸の使用。
【請求項6】
前記インフルエンザは、Ｂ型ビクトリアインフルエンザ又はＨ５Ｎ１鳥インフルエンザを含む、ことを特徴とする請求項４又は５に記載の使用。
【請求項7】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製を阻害する薬物の製造における、請求項２に記載のレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸の使用。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス性肺炎を治療する薬物の製造における、請求項２に記載のレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸の使用。
【請求項9】
インフルエンザウイルス複製を阻害する、及び／又はインフルエンザを治療するための医薬組成物であって、請求項２に記載のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９と、薬学的に許容される担体と、を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項10】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を阻害する、及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス性肺炎を治療するための医薬組成物であって、請求項２に記載のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９と、薬学的に許容される担体と、を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の技術分野に属し、具体的には、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸、その製造方法、及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
インフルエンザ（インフルと略称）は哺乳類と家禽がよく罹患する急性呼吸器疾患であり、インフルエンザウイルスによって引き起こされ、伝染性が強く、伝播速度が速く、通常は単純な呼吸器感染を招き、咳、発熱、筋肉痛、寒気や発汗などの臨床症状を含み、不快感は２～８日持続し、通常は迅速に発病する。一部の患者、特に高齢者、幼児とその他の慢性疾患を有する患者は、ウイルス性又は二次性肺炎を引き起こしやすく、深刻な場合、呼吸困難と多臓器不全を伴う。抗インフルエンザ薬による治療は、現在、インフルエンザに対抗する常用手段の１つであり、一般的に患者の感染程度や患者の身体状況によって処方を決定する。インフルエンザウイルスは最も深く研究されている病原体の１種であるが、インフルエンザウイルスは非常に変異しやすいため、従来の制御及び治療プランは絶えず改善する必要があり、ウイルス性インフルエンザに対する新薬の開発は、現在の社会において強く求められており、また、国民の健康にとっても非常に重要である。
【0003】
新型コロナウイルス（新型コロナと略称）は、過去２年間で広く伝播していた新型ウイルスの１種で、主に飛沫の呼吸経路を通じて伝播し、最近、エアロゾル、物品を通じて接触感染する可能性があることがさらに発見され、伝染性が非常に強く、伝播速度が非常に速い。臨床症状は、主に発熱、疲労、空咳、嗅覚欠損／嗅覚障害であり、重症者の場合は呼吸困難、呼吸促迫、低酸素血症の深刻な肺炎を伴い、また、その他の合併症を引き起こすことがある。現在、新型コロナウイルスに対する特効性治療薬が存在しないため、世界中に大規模に広がっている。そのため、感染症対策の薬物需要に応じて、新型コロナウイルスに特異的に対応した新しい薬物を開発することは、新型コロナウイルスに対応し、国民の生命の安全を保障する重要な手段である。
【0004】
マイクロリボ核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓと略称）は小さい内因性非コードＲＮＡである。通常、ｍｉＲＮＡコード遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され、一次転写物を産生し、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａとＤｉｃｅｒによって約２１ヌクレオチドの小さなＲＮＡに加工される。ｍｉＲＮＡは、コード領域又は標的ｍＲＮＡの３’と５’非翻訳領域との結合を通じて、転写後の遺伝子サイレンシングを媒介し、多種の生理病理プロセスにおいて重要な役割を発揮し、医学領域における応用の将来性が期待できる。
【0005】
ここ数年来、植物ｍｉＲＮＡに関する研究は急速に発展し、主にアップレギュレーション／ダウンレギュレーション策略を通じてその生物学機能を研究し、多くの研究は、光合成作用、栄養安定状態、生長発育、ホルモンシグナル伝達及びストレス応答などの方面で重要な調節作用を発揮していることを明らかにし、さらに、植物ｍｉＲＮＡが内因性ｍｉＲＮＡとして動物の遺伝子発現を調節できることが確認された。大量の文献は、漢方薬がインフルエンザ及び新型コロナウイルスによる肺炎の予防と治療において積極的な作用を発揮したことを報告した。しかし、具体的にどの有効成分なのかは明らかになっていない。漢方薬にｍｉＲＮＡを含むことを報告した文献があるが、漢方薬煎剤にどのような安定に存在するｍｉＲＮＡが存在し、これらのｍｉＲＮＡが動物の体内に入るとどのような機能を発揮するかはまだ不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、従来技術の欠点に対して、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸、その製造方法、及び使用を提供し、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤から機能性植物マイクロリボ核酸又は該マイクロリボ核酸含有抽出物を抽出し、実験を通じて、該レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９がウイルス性インフルエンザ及び新型コロナウイルス感染による肺炎に対して一定の阻害効果及び治療作用があることを実証している。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は以下の技術的解決手段によって達成される。
【0008】
レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸であって、前記マイクロリボ核酸は、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ７、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３３、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３５、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ１０、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２０、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ５、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３６、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２８、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３１、ｐｐｔ－ｍｉＲ８９４、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３２、ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２１、ｐａｂ－ｍｉＲ３７１１、ＱＱ＿１５９又はｂｄｉ－ｍｉＲ１５９ａ－３ｐから選択され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ７のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３３のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３５のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ１０のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２０のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ５のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３６のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２８のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示され、
前記ｐｐｔ－ｍｉＲ８９４のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３２のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２で示され、
前記ｐａｂ－ｍｉＲ３７１１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３で示され、
前記ＱＱ＿１５９のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で示され、
前記ｂｄｉ－ｍｉＲ１５９ａ－３ｐのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で示される。
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ７のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３３のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３５のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ１０のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２０のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ５のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３６のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２８のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示され、
前記ｐｐｔ－ｍｉＲ８９４のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ３２のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１で示され、
前記ｎｏｖｅｌ＿ｍｉｒ２１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２で示され、
前記ｐａｂ－ｍｉＲ３７１１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３で示され、
前記ＱＱ＿１５９のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で示され、
前記ｂｄｉ－ｍｉＲ１５９ａ－３ｐのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で示される。
【0009】
好ましくは、前記マイクロリボ核酸は、人工合成されるＱＱ＿１５９、植物ＱＱ＿１５９、ＱＱ＿１５９の前駆体形態又はＱＱ＿１５９の成熟体形態を含むＱＱ＿１５９である。
【0010】
レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸の製造方法であって、
レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤３００ｍＬを５０ｍＬ酵素除去遠沈管にそれぞれ入れて、２０００ｒｐｍで遠心分離して不純物を除去し、１本ごとに１０ｍＬの上清を吸引して氷上に置き、煎剤の体積に対して３倍の割合でＴＲＩｚｏｌｌｓ３０ｍＬを加え、激しく振って均一にした後、室温で１０ｍｉｎ静置し、その後、クロロホルム６ｍＬを加え、激しく振って均一にし、１０ｍｉｎ静置するステップ１）と、
１００００ｇを４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集するステップ２）と、
等体積のイソプロパノールを加えて－２０℃で１ｈ沈殿させ、その後、１２０００ｇを１５ｍｉｎ遠心分離するステップ３）と、
上清を慎重に捨て、７５％のエタノール５ｍＬを加えて沈殿を洗浄し、１２０００ｇを４℃で５ｍｉｎ遠心分離するステップ４）と、
遠心分離後、エタノールを慎重に捨てて、沈殿を残し、沈殿を乾燥させた後、６５℃のＤＥＰＣ水２００μＬを加えて溶解し、ＲＮＡ濃度を測定するステップ５）と、
市販ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍｉＲＮＡを精製し、カラムごとにＲＮＡを１００μｇ通し、管ごとにＤＥＰＣ水６０μＬで溶解させるステップ６）と、
ｍｉＲＮＡの濃度を測定し、８ｈ凍結乾燥させた後、－８０℃で保存するステップ７）と、を含む。
レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤３００ｍＬを５０ｍＬ酵素除去遠沈管にそれぞれ入れて、２０００ｒｐｍで遠心分離して不純物を除去し、１本ごとに１０ｍＬの上清を吸引して氷上に置き、煎剤の体積に対して３倍の割合でＴＲＩｚｏｌｌｓ３０ｍＬを加え、激しく振って均一にした後、室温で１０ｍｉｎ静置し、その後、クロロホルム６ｍＬを加え、激しく振って均一にし、１０ｍｉｎ静置するステップ１）と、
１００００ｇを４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集するステップ２）と、
等体積のイソプロパノールを加えて－２０℃で１ｈ沈殿させ、その後、１２０００ｇを１５ｍｉｎ遠心分離するステップ３）と、
上清を慎重に捨て、７５％のエタノール５ｍＬを加えて沈殿を洗浄し、１２０００ｇを４℃で５ｍｉｎ遠心分離するステップ４）と、
遠心分離後、エタノールを慎重に捨てて、沈殿を残し、沈殿を乾燥させた後、６５℃のＤＥＰＣ水２００μＬを加えて溶解し、ＲＮＡ濃度を測定するステップ５）と、
市販ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍｉＲＮＡを精製し、カラムごとにＲＮＡを１００μｇ通し、管ごとにＤＥＰＣ水６０μＬで溶解させるステップ６）と、
ｍｉＲＮＡの濃度を測定し、８ｈ凍結乾燥させた後、－８０℃で保存するステップ７）と、を含む。
【0011】
インフルエンザウイルス複製を阻害する薬物の製造における、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９の使用。
【0012】
ウイルス性インフルエンザを治療する薬物の製造における、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９の使用。
【0013】
好ましくは、前記インフルエンザは、Ｂ型ビクトリアインフルエンザ又はＨ５Ｎ１鳥インフルエンザを含む。
【0014】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を阻害する薬物の製造における、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９の使用。
【0015】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス性肺炎を治療する薬物の製造における、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤由来のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９の使用。
【0016】
インフルエンザウイルス複製を阻害する、及び／又はインフルエンザを治療するための医薬組成物であって、上記のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９と、薬学的に許容される担体と、を含む。
【0017】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を阻害する、及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス性肺炎を治療するための医薬組成物であって、上記のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９と、薬学的に許容される担体と、を含む。
【0018】
Ｂ型ビクトリアインフルエンザ複製を非治療目的でインビトロ阻害する方法であって、上記のマイクロリボ核酸ＱＱ＿１５９をインフルエンザＢ型ビクトリアウイルスで感染された細胞と接触させる。
【発明の効果】
【0019】
本発明の有益な効果は以下の通りであり、
本発明は、漢方薬煎剤中のマイクロリボ核酸を抽出する実験方法を提供し、この方法を用いて、レンギョウ・オウギ複方漢方薬剤中に安定に存在する１５種類のマイクロリボ核酸を初めて抽出し、同定した。その中で、ＱＱ＿１５９はウイルス性インフルエンザ及び新型コロナウイルス感染による肺炎に対して一定の阻害効果と治療作用があることが実証された。本発明は、漢方薬の抗ウイルスの天然有効成分を得るだけでなく、インフルエンザ又は新型コロナウイルスによる肺炎の臨床的な治療のためにも可能性のある核酸医薬を提供する。
本発明は、漢方薬煎剤中のマイクロリボ核酸を抽出する実験方法を提供し、この方法を用いて、レンギョウ・オウギ複方漢方薬剤中に安定に存在する１５種類のマイクロリボ核酸を初めて抽出し、同定した。その中で、ＱＱ＿１５９はウイルス性インフルエンザ及び新型コロナウイルス感染による肺炎に対して一定の阻害効果と治療作用があることが実証された。本発明は、漢方薬の抗ウイルスの天然有効成分を得るだけでなく、インフルエンザ又は新型コロナウイルスによる肺炎の臨床的な治療のためにも可能性のある核酸医薬を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】実施例２においてｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより検出された、ＱＱ＿１５９によるＢ型インフルエンザウイルス量への阻害効果である。
【図2】実施例３におけるＱＱ＿１５９がＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを感染したマウスの体重に及ぼす影響である。
【図3】実施例３におけるＱＱ＿１５９がＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを感染したマウスの生存率に及ぼす影響である。
【図4】実施例３においてＨＥ染色により検出された、ＱＱ＿１５９によるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを感染したマウスの肺部炎症への阻害効果である。
【図5】実施例３においてｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより検出された、ＱＱ＿１５９によるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを感染してから３日目（Ａ）及び５日目（Ｂ）のマウスの肺部のウイルス量への阻害効果である。
【図6】実施例４においてＨＥ染色により検出された、ＱＱ＿１５９によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを感染したマウスの肺部炎症への阻害効果である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の解決しようとする技術的課題、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、以下、図面及び具体的な実施例を参照して詳細に説明する。
【0022】
実施例１ レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤からのマイクロリボ核酸の抽出
（１）レンギョウ・オウギ復方漢方薬（キンギンカ、レンギョウ、オウゴン、セイコウ、ショウオウギ、ショウビャクジュツ、カッコウ、ボウフウ、バクモンドウ、カンゾウ）煎剤３００ｍＬを５０ｍＬ酵素除去遠沈管にそれぞれ入れて、２０００ｒｐｍで遠心分離して不純物を除去し、１本ごとに１０ｍＬの上清を吸引して氷上に置き、煎剤の体積に対して３倍の割合でＴＲＩｚｏｌｌｓ３０ｍＬを加え、激しく振って均一にした後、室温で１０ｍｉｎｄし、その後、クロロホルム６ｍＬを加え、激しく振って均一にし、１０ｍｉｎ静置した。
（２）１００００ｇを４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集した。
（３）等体積のイソプロパノールを加えて１ｈ（－２０℃）沈殿させ、その後、１２０００ｇを１５ｍｉｎ遠心分離した。
（４）上清を慎重に捨て、７５％のエタノール５ｍＬを加えて沈殿を洗浄し、１２０００ｇを４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。
（５）遠心分離後、エタノールを慎重に捨てて、沈殿を残し、沈殿を乾燥させた後、６５℃のＤＥＰＣ水２００μＬを加えて溶解し、ＲＮＡ濃度を測定した。
（６）市販ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍｉＲＮＡを精製し（カラムごとにＲＮＡを１００μｇ通し）、管ごとにＤＥＰＣ水６０μＬで溶解させた。
（７）ｍｉＲＮＡの濃度を測定し、８ｈ凍結乾燥させた後、－８０℃で保存した。
（８）ＢＧＩＳＥＱ－５００技術を用いてマイクロリボ核酸について配列決定を行い、配列決定結果を以下の表１に示す。
（１）レンギョウ・オウギ復方漢方薬（キンギンカ、レンギョウ、オウゴン、セイコウ、ショウオウギ、ショウビャクジュツ、カッコウ、ボウフウ、バクモンドウ、カンゾウ）煎剤３００ｍＬを５０ｍＬ酵素除去遠沈管にそれぞれ入れて、２０００ｒｐｍで遠心分離して不純物を除去し、１本ごとに１０ｍＬの上清を吸引して氷上に置き、煎剤の体積に対して３倍の割合でＴＲＩｚｏｌｌｓ３０ｍＬを加え、激しく振って均一にした後、室温で１０ｍｉｎｄし、その後、クロロホルム６ｍＬを加え、激しく振って均一にし、１０ｍｉｎ静置した。
（２）１００００ｇを４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集した。
（３）等体積のイソプロパノールを加えて１ｈ（－２０℃）沈殿させ、その後、１２０００ｇを１５ｍｉｎ遠心分離した。
（４）上清を慎重に捨て、７５％のエタノール５ｍＬを加えて沈殿を洗浄し、１２０００ｇを４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。
（５）遠心分離後、エタノールを慎重に捨てて、沈殿を残し、沈殿を乾燥させた後、６５℃のＤＥＰＣ水２００μＬを加えて溶解し、ＲＮＡ濃度を測定した。
（６）市販ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍｉＲＮＡを精製し（カラムごとにＲＮＡを１００μｇ通し）、管ごとにＤＥＰＣ水６０μＬで溶解させた。
（７）ｍｉＲＮＡの濃度を測定し、８ｈ凍結乾燥させた後、－８０℃で保存した。
（８）ＢＧＩＳＥＱ－５００技術を用いてマイクロリボ核酸について配列決定を行い、配列決定結果を以下の表１に示す。
【表1】
【0023】
実施例２ ＱＱ＿１５９がマーティン・ダービー犬腎臓（ＭＤＣＫ）細胞中のＢ型インフルエンザウイルス量に及ぼす影響の測定
（１）２４ウェル培養プレート内でＭＤＣＫ細胞を培養した。
（２）１０ｎＭ、５０ｎＭ又は１００ｎＭのＱＱ＿１５９ａをそれぞれ市販トランスフェクション試薬ｒｉｂｏＦＥＣＴＴＭＣＰでＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションしながら、同濃度のナンセンス配列をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションして対照群とした。
（３）Ｂ型ビクトリア系インフルエンザウイルスで上記の細胞を感染させた。
（４）ウイルス感染２４ｈ後、上清を収集し、遠心分離して細胞を合わせ、ＲＮＡを抽出し、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲによりウイルス量を検出した。
（１）２４ウェル培養プレート内でＭＤＣＫ細胞を培養した。
（２）１０ｎＭ、５０ｎＭ又は１００ｎＭのＱＱ＿１５９ａをそれぞれ市販トランスフェクション試薬ｒｉｂｏＦＥＣＴＴＭＣＰでＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションしながら、同濃度のナンセンス配列をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションして対照群とした。
（３）Ｂ型ビクトリア系インフルエンザウイルスで上記の細胞を感染させた。
（４）ウイルス感染２４ｈ後、上清を収集し、遠心分離して細胞を合わせ、ＲＮＡを抽出し、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲによりウイルス量を検出した。
【0024】
その結果、図１に示すように、対照群と比べて、１００ｎＭＱＱ＿１５９はＭＤＣＫ細胞中のＢ型ビクトリア系インフルエンザウイルスのウイルス量を顕著に阻害できた。
【0025】
実施例３ ＱＱ＿１５９がＨ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを感染したマウスに与える治療効果
（１）６週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスをＨ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスに感染させてから２ｈ後、薬物を腹腔内注射した。動物の群分け及び薬物の用量を以下の表２に示す。
表２においては、混合ＲＮＡは、レンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤から一括抽出した混合ＲＮＡである。
（２）５日間連続して投与し、毎日、体重の変化を観察して記録した（体重の低下が３０％を超えると、安楽死させ、死亡として扱う）。
（３）チャレンジ後の３日目、５日目にそれぞれ肺組織を採取し、ＨＥ染色により肺組織の炎症を検出した。
（４）ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより肺組織のウイルス量を検出した。
（５）動物を１０日目まで飼育し、生存率を観察した。
その結果、体重の変化に関しては、図２に示すように、中等濃度ＱＱ＿１５９（１２０ｐｍｏｌ／匹／日、Ｍ－ＱＱ＿１５９）、高濃度ＱＱ＿１５９（３６０ｐｍｏｌ／匹／日、Ｈ－ＱＱ＿１５９）、及び混合ＲＮＡ群では、チャレンジ後の７日目（図２にはＤ８として示されている）に、体重変化がプラトーに入るが、感染対照群では、さらに低下する傾向があり、高濃度ＱＱ＿１５９群では、体重変化率が混合ＲＮＡ群及び中等濃度ＱＱ＿１５９よりも僅かに高かった。生存率に関しては、図３に示すように、中等濃度ＱＱ＿１５９群、及び混合ＲＮＡ群では、生存率は７０％に達し、高濃度ＱＱ＿１５９群では、生存率は５０％であり、一方、感染群では、生存率は３０％しかなかった。図４に示すように、ＨＥ結果から、感染対照群と比較して、混合ＲＮＡ群及び中等濃度ＱＱ＿１５９では、マウスの肺部炎症が明らかに軽減され、また、中等濃度ＱＱ＿１５９の阻害効果がより高いことが明らかになった。図５Ａに示すように、感染後の３日目に、中等濃度ＱＱ＿１５９群、高濃度ＱＱ＿１５９群、及び混合ＲＮＡ群のいずれも、ウイルスの複製を効果的に阻害でき、図５Ｂに示すように、感染後の５日目に、中等濃度ＱＱ＿１５９は、ウイルス複製を阻害する効果が明らかに低下し、一方、高濃度ＱＱ＿１５９群及び混合ＲＮＡ群は、ウイルス複製の阻害効果がまだ良好であった。
（１）６週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスをＨ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスに感染させてから２ｈ後、薬物を腹腔内注射した。動物の群分け及び薬物の用量を以下の表２に示す。
【表2】
（２）５日間連続して投与し、毎日、体重の変化を観察して記録した（体重の低下が３０％を超えると、安楽死させ、死亡として扱う）。
（３）チャレンジ後の３日目、５日目にそれぞれ肺組織を採取し、ＨＥ染色により肺組織の炎症を検出した。
（４）ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより肺組織のウイルス量を検出した。
（５）動物を１０日目まで飼育し、生存率を観察した。
その結果、体重の変化に関しては、図２に示すように、中等濃度ＱＱ＿１５９（１２０ｐｍｏｌ／匹／日、Ｍ－ＱＱ＿１５９）、高濃度ＱＱ＿１５９（３６０ｐｍｏｌ／匹／日、Ｈ－ＱＱ＿１５９）、及び混合ＲＮＡ群では、チャレンジ後の７日目（図２にはＤ８として示されている）に、体重変化がプラトーに入るが、感染対照群では、さらに低下する傾向があり、高濃度ＱＱ＿１５９群では、体重変化率が混合ＲＮＡ群及び中等濃度ＱＱ＿１５９よりも僅かに高かった。生存率に関しては、図３に示すように、中等濃度ＱＱ＿１５９群、及び混合ＲＮＡ群では、生存率は７０％に達し、高濃度ＱＱ＿１５９群では、生存率は５０％であり、一方、感染群では、生存率は３０％しかなかった。図４に示すように、ＨＥ結果から、感染対照群と比較して、混合ＲＮＡ群及び中等濃度ＱＱ＿１５９では、マウスの肺部炎症が明らかに軽減され、また、中等濃度ＱＱ＿１５９の阻害効果がより高いことが明らかになった。図５Ａに示すように、感染後の３日目に、中等濃度ＱＱ＿１５９群、高濃度ＱＱ＿１５９群、及び混合ＲＮＡ群のいずれも、ウイルスの複製を効果的に阻害でき、図５Ｂに示すように、感染後の５日目に、中等濃度ＱＱ＿１５９は、ウイルス複製を阻害する効果が明らかに低下し、一方、高濃度ＱＱ＿１５９群及び混合ＲＮＡ群は、ウイルス複製の阻害効果がまだ良好であった。
【0026】
この実験から明らかなように、人工合成されるＱＱ＿１５９及びレンギョウ・オウギ復方漢方薬煎剤から一括抽出された混合ＲＮＡは、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスに対して一定の治療作用があり、体重の低下が遅くなり、死亡率が低下し、肺部炎症が軽減されることが所見された。
【0027】
実施例４ ＱＱ＿１５９によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに起因する肺炎の阻害効果の検討
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬで６～８週齢のｈＡＣＥ２遺伝子組換えマウスに点鼻感染した。
（２）５日間腹腔内注射（ｉｐ）投与した。１日目にウイルス感染２ｈ後に投与した。実験の群分け及び薬物の用量を以下の表３に示す。
（３）０、１、２、３、４、５日目に、体重及び症状をモニタした。
（４）感染後の５日目にマウスを殺し、肺組織を収集した。
（５）ＨＥ染色により肺組織の病理を検出した。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬで６～８週齢のｈＡＣＥ２遺伝子組換えマウスに点鼻感染した。
（２）５日間腹腔内注射（ｉｐ）投与した。１日目にウイルス感染２ｈ後に投与した。実験の群分け及び薬物の用量を以下の表３に示す。
【表3】
（４）感染後の５日目にマウスを殺し、肺組織を収集した。
（５）ＨＥ染色により肺組織の病理を検出した。
【0028】
その結果、図６に示すように、１２０ｐｍｏｌ／匹／日でＱＱ＿１５９を注射した場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染したｈＡＣＥ２遺伝子組換えマウスの肺組織の炎症に対して一定の阻害効果があり、このことから、ＱＱ＿１５９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によるマウス肺炎に対して一定の阻害効果があることが分かった。
【0029】
以上は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、なお、当業者にとっては、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良及び修正が加えられることができ、これらの改良及び修正は、本発明の保護範囲とみなされるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】