特表 2024-517558 二重特異性ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ結合タンパク質並びにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】二重特異性ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ結合タンパク質並びにその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240416BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 31/282 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 33/243 20190101ALI20240416BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 D

A61K39/395 U

A61K39/395 N

A61P35/00

A61K31/519

A61K31/282

A61K33/243

A61K31/7068

A61K31/337

A61K48/00

A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558151

(86)(22)【出願日】2022-04-29

(85)【翻訳文提出日】2023-10-17

(86)【国際出願番号】 IB2022053997

(87)【国際公開番号】W WO2022229919

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/182,156

(32)【優先日】2021-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504333972

【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】110002848

【氏名又は名称】弁理士法人ＮＩＰ＆ＳＢＰＪ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】メイゾル、ヤリヴ

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ユエ

(72)【発明者】

【氏名】ムーディー、ゴードン

(72)【発明者】

【氏名】マルホトラ、ディーパリ

(72)【発明者】

【氏名】オーヴァーストリート、マイケル

(72)【発明者】

【氏名】クランシー－トンプソン、エレノア

(72)【発明者】

【氏名】リー、カリン

(72)【発明者】

【氏名】プリッツ、ステイシー

(72)【発明者】

【氏名】ハモンド、スコット

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB42

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA02

4C086CB05

4C086EA16

4C086EA17

4C086HA09

4C086HA12

4C086HA24

4C086HA28

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C206AA01

4C206AA02

4C206JB16

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA05

4C206ZB26

4H045AA11

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA54

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ－１）並びにＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ）に特異的に結合する抗体を含む、結合タンパク質に関する。本開示はまた、かかる結合タンパク質及びかかる結合タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物を提供する。本開示は更に、かかる結合タンパク質を使用して障害又は症状を治療する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴに特異的に結合する二重特異性結合タンパク質であって、
ａ）ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインであって、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、並びに配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む、第１の結合ドメインと、
ｂ）ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインであって、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む、第２の結合ドメインと、を含む二重特異性結合タンパク質。

【請求項2】

ＰＤ－１に特異的に結合する前記第１の結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項3】

ＰＤ－１に特異的に結合する前記第１の結合ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項4】

ＰＤ－１に特異的に結合する前記第１の結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項5】

ＰＤ－１に特異的に結合する前記第１の結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項6】

ＴＩＧＩＴに特異的に結合する前記第２の結合ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項7】

ＴＩＧＩＴに特異的に結合する前記第２の結合ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項8】

ＴＩＧＩＴに特異的に結合する前記第２の結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項9】

ＴＩＧＩＴに特異的に結合する前記第２の結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項10】

前記軽鎖定常領域が、カッパ鎖である、請求項４に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項11】

前記軽鎖定常領域が、ラムダ鎖である、請求項８に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項12】

前記結合タンパク質が、抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項13】

前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１２に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項14】

前記抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項１３に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項15】

前記抗体が、ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１３又は１４に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項16】

前記二重特異性結合タンパク質－ヒトＴＩＧＩＴ相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が、約１５ｐＭ以下である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項17】

前記二重特異性結合タンパク質－ヒトＴＩＧＩＴ相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が、約９ｐＭ以下である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項18】

前記二重特異性結合タンパク質－ヒトＴＩＧＩＴ相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が、約９ｐＭ～約１５ｐＭである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項19】

前記二重特異性結合タンパク質－ヒトＰＤ－Ｌ１相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が、約０．４ｎＭ以下である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項20】

前記二重特異性結合タンパク質－ヒトＰＤ－Ｌ１相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が、約０．３ｎＭ～約０．５ｎＭである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項21】

変異Ｆｃ領域を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項22】

インビボで補体依存性細胞傷害を誘発しない、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項23】

野生型Ｆｃ領域を有する二重特異性結合タンパク質と比較して低減された補体依存性細胞傷害を有する、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項24】

インビボで抗体依存性細胞傷害を誘発しない、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項25】

野生型Ｆｃ領域を有する二重特異性結合タンパク質と比較して低減された抗体依存性細胞傷害を有する、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項26】

Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスによって番号付けされたときに、２２１Ｋ， ２２１Ｙ， ２２５Ｅ， ２２５Ｋ， ２２５Ｗ， ２２８Ｐ， ２３４Ｄ， ２３４Ｅ， ２３４Ｎ， ２３４Ｑ， ２３４Ｔ， ２３４Ｈ， ２３４Ｙ， ２３４Ｉ， ２３４Ｖ， ２３４Ｆ， ２３５Ａ， ２３５Ｄ， ２３５Ｒ， ２３５Ｗ， ２３５Ｐ， ２３５Ｓ， ２３５Ｎ， ２３５Ｑ， ２３５Ｔ， ２３５Ｈ， ２３５Ｙ， ２３５Ｉ， ２３５Ｖ， ２３５Ｅ， ２３５Ｆ， ２３６Ｅ， ２３７Ｌ， ２３７Ｍ， ２３７Ｐ， ２３９Ｄ， ２３９Ｅ， ２３９Ｎ， ２３９Ｑ， ２３９Ｆ， ２３９Ｔ， ２３９Ｈ， ２３９Ｙ， ２４０Ｉ， ２４０Ａ， ２４０Ｔ， ２４０Ｍ， ２４１Ｗ， ２４１Ｌ， ２４１Ｙ， ２４１Ｅ， ２４１Ｒ， ２４３Ｗ， ２４３Ｌ ２４３Ｙ， ２４３Ｒ， ２４３Ｑ， ２４４Ｈ， ２４５Ａ， ２４７Ｌ， ２４７Ｖ， ２４７Ｇ， ２５０Ｅ， ２５０Ｑ， ２５１Ｆ， ２５２Ｌ， ２５２Ｙ， ２５４Ｓ， ２５４Ｔ， ２５５Ｌ， ２５６Ｅ， ２５６Ｆ， ２５６Ｍ， ２５７Ｃ， ２５７Ｍ， ２５７Ｎ， ２６２Ｉ， ２６２Ａ， ２６２Ｔ， ２６２Ｅ， ２６３Ｉ， ２６３Ａ， ２６３Ｔ， ２６３Ｍ， ２６４Ｌ， ２６４Ｉ， ２６４Ｗ， ２６４Ｔ， ２６４Ｒ， ２６４Ｆ， ２６４Ｍ， ２６４Ｙ， ２６４Ｅ， ２６５Ａ， ２６５Ｇ， ２６５Ｎ， ２６５Ｑ， ２６５Ｙ， ２６５Ｆ， ２６５Ｖ， ２６５Ｉ， ２６５Ｌ， ２６５Ｈ， ２６５Ｔ， ２６６Ｉ， ２６６Ａ， ２６６Ｔ， ２６６Ｍ， ２６７Ｑ， ２６７Ｌ， ２６８Ｅ， ２６９Ｈ， ２６９Ｙ， ２６９Ｆ， ２６９Ｒ， ２７０Ｅ， ２８０Ａ， ２８４Ｍ， ２９２Ｐ， ２９２Ｌ， ２９６Ｅ， ２９６Ｑ， ２９６Ｄ， ２９６Ｎ， ２９６Ｓ， ２９６Ｔ， ２９６Ｌ， ２９６Ｉ， ２９６Ｈ， ２９６Ｇ， ２９７Ｓ， ２９７Ｄ， ２９７Ｅ， ２９８Ａ， ２９８Ｈ， ２９８Ｉ， ２９８Ｔ， ２９８Ｆ， ２９９Ｉ， ２９９Ｌ， ２９９Ａ， ２９９Ｓ， ２９９Ｖ， ２９９Ｈ， ２９９Ｆ， ２９９Ｅ， ３０５Ｉ， ３０８Ｆ， ３１３Ｆ， ３１６Ｄ， ３１８Ａ， ３１８Ｓ， ３２０Ａ， ３２０Ｓ， ３２２Ａ， ３２２Ｓ， ３２５Ｑ， ３２５Ｌ， ３２５１， ３２５Ｄ， ３２５Ｅ， ３２５Ａ， ３２５Ｔ， ３２５Ｖ， ３２５Ｈ， ３２６Ａ， ３２６Ｄ， ３２６Ｅ， ３２６Ｇ， ３２６Ｍ， ３２６Ｖ， ３２７Ｇ， ３２７Ｗ， ３２７Ｎ， ３２７Ｌ， ３２８Ｓ， ３２８Ｍ， ３２８Ｄ， ３２８Ｅ， ３２８Ｎ， ３２８Ｑ， ３２８Ｆ， ３２８１， ３２８Ｖ， ３２８Ｔ， ３２８Ｈ， ３２８Ａ， ３２９Ｆ， ３２９Ｈ， ３２９Ｑ， ３３０Ｋ， ３３０Ｇ， ３３０Ｔ， ３３０Ｃ， ３３０Ｌ， ３３０Ｙ， ３３０Ｖ， ３３０１， ３３０Ｆ， ３３０Ｒ， ３３０Ｈ， ３３１Ｇ， ３３１Ａ， ３３１Ｌ， ３３１Ｍ， ３３１Ｆ， ３３１Ｗ， ３３１Ｋ， ３３１Ｑ， ３３１Ｅ， ３３１Ｓ， ３３１Ｖ， ３３１１， ３３１Ｃ， ３３１Ｙ， ３３１Ｈ， ３３１Ｒ， ３３１Ｎ， ３３１Ｄ， ３３１Ｔ， ３３２Ｄ， ３３２Ｓ， ３３２Ｗ， ３３２Ｆ， ３３２Ｅ， ３３２Ｎ， ３３２Ｑ， ３３２Ｔ， ３３２Ｈ， ３３２Ｙ， ３３２Ａ， ３３３Ａ， ３３３Ｄ， ３３３Ｇ， ３３３Ｑ， ３３３Ｓ， ３３３Ｖ， ３３４Ａ， ３３４Ｅ， ３３４Ｈ， ３３４Ｌ， ３３４Ｍ， ３３４Ｑ， ３３４Ｖ， ３３４Ｙ， ３３９Ｔ， ３７０Ｅ， ３７０Ｎ， ３７８Ｄ， ３９２Ｔ， ３９６Ｌ， ４１６Ｇ， ４１９Ｈ， ４２１Ｋ， ４２８Ｌ， ４２８Ｆ， ４３３Ｋ， ４３３Ｌ， ４３４Ａ， ４３４Ｗ， ４３４Ｙ， ４３６Ｈ， ４４０Ｙ 及び４４３Ｗから選択される少なくとも１つの置換を含む変異体Ｆｃ領域を含む、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項27】

前記変異Ｆｃ領域が、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスによって番号付けされた４２８及び４３４から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２１に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項28】

前記変異Ｆｃ領域が、４２８Ｌ， ４２８Ｆ， ４３４Ａ， ４３４Ｗ及び４３４Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項29】

前記変異Ｆｃ領域が、ＹＴＥ変異を含む、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項30】

前記変異Ｆｃ領域が、ＦｃＲｎに対する増加した結合親和性を有する、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項31】

前記変異Ｆｃ領域が、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ三重変異（ＴＭ）を含む、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項32】

Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域がグリコシル化されていない（aglycosylate）、請求項１２～３１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項33】

Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が脱グリコシル化（deglycosylate）されている、請求項１２～３１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項34】

Ｆｃ領域を含む、請求項１２～３１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域が、低減されたフコシル化を有するか、又はフコシル化されていない、二重特異性結合タンパク質。

【請求項35】

請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項36】

ペメトレキセド、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル又はそれらの組合せから選択される抗癌化合物を更に含む、請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項37】

請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

【請求項38】

前記核酸配列が、配列番号２１と少なくとも９５％同一の配列、配列番号２３と少なくとも９５％同一の配列、配列番号２５と少なくとも９５％同一の配列、及び／又は配列番号２７と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項３７に記載の核酸。

【請求項39】

前記核酸配列が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び／又は配列番号２７を含む、請求項３７に記載の核酸。

【請求項40】

前記核酸配列が、配列番号２２と少なくとも９５％同一の配列、配列番号２４と少なくとも９５％同一の配列、配列番号２６と少なくとも９５％同一の配列、及び／又は配列番号２８と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項３７に記載の核酸。

【請求項41】

前記核酸配列が、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び／又は配列番号２８を含む、請求項３７に記載の核酸。

【請求項42】

請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。

【請求項43】

請求項４２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項44】

配列番号２１と少なくとも９５％同一である核酸配列、配列番号２３と少なくとも９５％同一である核酸配列、配列番号２５と少なくとも９５％同一である核酸配列、及び配列番号２７と少なくとも９５％同一である核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞。

【請求項45】

配列番号２２と少なくとも９５％同一の核酸配列、配列番号２４と少なくとも９５％同一の核酸配列、配列番号２６と少なくとも９５％同一の核酸配列、及び配列番号２８と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むベクターを含む、請求項４４に記載の宿主細胞。

【請求項46】

請求項４３～４５のいずれか一項に記載の宿主細胞によって発現される二重特異性抗体。

【請求項47】

腫瘍を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の医薬組成物、又は請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸を投与することを含む、方法。

【請求項48】

対象における癌を治療又は予防する方法であって、前記対象に、請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の医薬組成物、又は請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸を投与することを含む、方法。

【請求項49】

前記癌が、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、及び肺癌のうちの１つ以上である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項４８又は４９に記載の方法。

【請求項51】

前記ＮＳＣＬＣが、進行性又は転移性である、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

対象における免疫応答を増強する方法であって、前記対象に、請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の医薬組成物、又は請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸を投与することを含む方法。

【請求項53】

治療に使用するための、請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項54】

癌の治療に使用するための、請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。

【請求項55】

癌の治療のための医薬の製造における、請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質の使用。

【請求項56】

治療に使用するための、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項57】

癌の治療に使用するための、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項58】

癌の治療のための医薬の製造における、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸の使用。

【請求項59】

腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ペメトレキセド、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル又はそれらの組合せから選択される抗癌化合物と組み合わせて、治療有効量の請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の医薬組成物、又は請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項60】

対象における癌を治療又は予防する方法であって、請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の医薬組成物、又は請求項３７～４１のいずれか一項に記載の核酸を、ペメトレキセド、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル又はそれらの組合せから選択される抗癌化合物と組み合わせて投与することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１８２，１５６号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
２０２２年４月２６日に作成され、本明細書と同時に提出された、「ＴＩＧＩＴ－１０１－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」と命名された２８，１６８バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、「ＰＤ－１」（Programmed Death-1）並びに「ＴＩＧＩＴ」（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）に特異的に結合する抗体を含む、結合タンパク質に関する。本開示はまた、かかる結合タンパク質及びかかる結合タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物を提供する。本開示は更に、かかる結合タンパク質を使用して障害又は症状を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

「ＰＤ－１」（Programmed Death-1）は、Ｔ細胞調節因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーのメンバーである約３１ｋＤのＩ型膜タンパク質である（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－１，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｕｐｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，”ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７－９５（１９９２）を参照されたい）。ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び単球上で発現され、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞では低レベルで発現される。ＰＤ－１は、腫瘍学における免疫媒介療法のための十分に検証された標的である。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の拮抗阻害は、Ｔ細胞活性化を増加させ、宿主免疫系による腫瘍細胞の認識及び排除を増強する。

【0005】

ＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎｓとしても知られる）は、幾つかのＴ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）上に存在する免疫受容体である。ＴＩＧＩＴは、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び制御性Ｔ細胞を含む免疫細胞によって上方制御される。

【発明の概要】

【0006】

本明細書では、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインと、
ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインと、
を含む、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴに特異的に結合する二重特異性結合タンパク質が提供される。

【0007】

本明細書では、治療有効量の本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を対象に投与することを含む、腫瘍を有する対象を治療する方法も提供される。本明細書では、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質を投与することを含む、対象における癌を治療又は予防する方法も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1-1】親ＶＡＲ１可変重鎖において同定された残基の配列分析を示す。

【図1-2】親ＶＡＲ１可変重鎖において同定された残基の配列分析を示す。

【図2-1】親ＶＡＲ１可変軽鎖において同定された残基の配列分析を示す。

【図2-2】親ＶＡＲ１可変軽鎖において同定された残基の配列分析を示す。

【図3A】図３Ａ、３Ｂ－１及び３Ｂ－２は、親ＶＡＲ１の可変重鎖と生殖系列配列とのアラインメントを示す。図３ＡのＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従って強調されている。アラインメントは、親ＶＡＲ１が、生殖系列ではなく、バーニア残基ではない４つのアミノ酸をＦＲ１中に有したことを示す。

【図3B-1】図３Ａ、３Ｂ－１及び３Ｂ－２は、親ＶＡＲ１の可変重鎖と生殖系列配列とのアラインメントを示す。図３Ｂ－１及び３Ｂ－２のＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って強調されている。アラインメントは、親ＶＡＲ１が、生殖系列ではなく、バーニア残基ではない４つのアミノ酸をＦＲ１中に有したことを示す。

【図3B-2】図３Ａ、３Ｂ－１及び３Ｂ－２は、親ＶＡＲ１の可変重鎖と生殖系列配列とのアラインメントを示す。図３Ｂ－１及び３Ｂ－２のＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って強調されている。アラインメントは、親ＶＡＲ１が、生殖系列ではなく、バーニア残基ではない４つのアミノ酸をＦＲ１中に有したことを示す。

【図4A】図４Ａ、４Ｂ－１、及び４Ｂ－２は、親ＶＡＲ１の可変軽鎖と生殖系列配列とのアラインメントを示す。アラインメントは、親ＶＡＲ１のＶＬが、生殖系列ではない１０個のアミノ酸、ＦＲ３中のバーニア残基Ｑ（Ｑ－Ｋ）、ＣＤＲＬ３の前の鎖パッキング残基Ｆ（Ｆ－Ｙ）、及びＣＤＲＬ３の後の鎖パッキング残基Ｌ（Ｌ－Ｆ）を有したことを示す。

【図4B-1】図４Ａ、４Ｂ－１、及び４Ｂ－２は、親ＶＡＲ１の可変軽鎖と生殖系列配列とのアラインメントを示す。アラインメントは、親ＶＡＲ１のＶＬが、生殖系列ではない１０個のアミノ酸、ＦＲ３中のバーニア残基Ｑ（Ｑ－Ｋ）、ＣＤＲＬ３の前の鎖パッキング残基Ｆ（Ｆ－Ｙ）、及びＣＤＲＬ３の後の鎖パッキング残基Ｌ（Ｌ－Ｆ）を有したことを示す。

【図4B-2】図４Ａ、４Ｂ－１、及び４Ｂ－２は、親ＶＡＲ１の可変軽鎖と生殖系列配列とのアラインメントを示す。アラインメントは、親ＶＡＲ１のＶＬが、生殖系列ではない１０個のアミノ酸、ＦＲ３中のバーニア残基Ｑ（Ｑ－Ｋ）、ＣＤＲＬ３の前の鎖パッキング残基Ｆ（Ｆ－Ｙ）、及びＣＤＲＬ３の後の鎖パッキング残基Ｌ（Ｌ－Ｆ）を有したことを示す。

【図5】ＶＡＲ１変異体が効率的な発現及びペアリング特性を維持したことを示す。

【図6A】図６Ａ及び６Ｂは、ＶＡＲ１変異体が、ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＯＥ ２９３に対する親ｍＡｂの細胞結合特性を保持していたことを示す。データを蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示す。

【図6B】図６Ａ及び６Ｂは、ＶＡＲ１変異体が、ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＯＥ ２９３に対する親ｍＡｂの細胞結合特性を保持していたことを示す。データを蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示す。

【図7】本明細書に開示される結合タンパク質の特定の態様の特徴及び形式を示す。

【図8A】図８Ａは、抗原捕捉フォーマットを用いた同時結合を示す。ヒトＴＩＧＩＴ抗原をロードしたセンサーを、最初にＡＺＤ２９３６と、次いでヒトＰＤ－１との連続的な会合及び解離相互作用に曝露した。Ａｓｓｏ：会合；Ｄｉｓｓｏ：解離；ＳＡ：ストレプトアビジン。

【図8B】図８Ｂは、抗原捕捉フォーマットを用いた同時結合を示す。ヒトＰＤ－１抗原をロードしたセンサーを、最初にＡＺＤ２９３６と、次いでヒトＴＩＧＩＴとの連続的な会合及び解離相互作用に曝露した。Ａｓｓｏ：会合；Ｄｉｓｓｏ：解離；Ｎｉ－ＮＴＡ：ニッケルニトリロ三酢酸。

【図9A】図９Ａ～９Ｃは、ＡＺＤ２９３６が、単一特異性抗体と比較してＰＤ－１及びＴＩＧＩＴへの結合活性を示したことを示す。図９Ａは、操作されたＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋細胞上のヒトＴＩＧＩＴ受容体へのＡＺＤ２９３６の細胞結合を示す。ＭＦＩ＝幾何平均蛍光強度；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。ヒト単一発現細胞株への細胞結合：Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋及びＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－又はヒト二重発現Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋試験物品及び対照物品の抗体を、蛍光コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて検出し、フローサイトメトリーによって評価した。

【図9B】図９Ａ～９Ｃは、ＡＺＤ２９３６が、単一特異性抗体と比較してＰＤ－１及びＴＩＧＩＴへの結合活性を示したことを示す。図９Ｂは、操作されたＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－細胞上のヒトＰＤ－１受容体へのＡＺＤ２９３６の細胞結合を示す。ＭＦＩ＝幾何平均蛍光強度；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。ヒト単一発現細胞株への細胞結合：Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋及びＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－又はヒト二重発現Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋試験物品及び対照物品の抗体を、蛍光コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて検出し、フローサイトメトリーによって評価した。

【図9C】図９Ａ～９Ｃは、ＡＺＤ２９３６が、単一特異性抗体と比較してＰＤ－１及びＴＩＧＩＴへの結合活性を示したことを示す。図９Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋、Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－、又は二重発現Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋上のヒトＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ受容体へのＡＺＤ２９３６の細胞結合を示す。ＭＦＩ＝幾何平均蛍光強度；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓヒト単一発現細胞株への細胞結合：Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋及びＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－又はヒト二重発現Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋試験物品及び対照物品の抗体を、蛍光コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて検出し、フローサイトメトリーによって評価した。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｃは、ＡＺＤ２９３６が、Ｊｕｒｋａｔレポーターアッセイを用いて、単一特異性抗体と比較して、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴリガンドを遮断することでＴＣＲ媒介シグナル伝達を増強する活性を実証したことを示す。図１０Ａは、ヒトＰＤ １^＋ＴＩＧＩＴ^－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター２細胞共培養アッセイにおけるＡＺＤ２９３６及び抗ＰＤ－１抗体の生物活性を示す。ＣＤ１５５＝分化抗原群１５５；ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣；ＮＦＡＴ＝ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＲＬＵ＝相対光単位；ＳＤ＝標準偏差；ＴＣＲ＝Ｔ細胞受容体；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｃは、ＡＺＤ２９３６が、Ｊｕｒｋａｔレポーターアッセイを用いて、単一特異性抗体と比較して、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴリガンドを遮断することでＴＣＲ媒介シグナル伝達を増強する活性を実証したことを示す。図１０Ｂは、ヒトＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター２細胞共培養アッセイにおけるＡＺＤ２９３６の生物活性を示す。ＣＤ１５５＝分化抗原群１５５；ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣；ＮＦＡＴ＝ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＲＬＵ＝相対光単位；ＳＤ＝標準偏差；ＴＣＲ＝Ｔ細胞受容体；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。

【図10C】図１０Ａ～１０Ｃは、ＡＺＤ２９３６が、Ｊｕｒｋａｔレポーターアッセイを用いて、単一特異性抗体と比較して、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴリガンドを遮断することでＴＣＲ媒介シグナル伝達を増強する活性を実証したことを示す。図１０Ｃは、ヒトＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター２細胞共培養アッセイにおけるＡＺＤ２９３６の生物活性を示す。ＣＤ１５５＝分化抗原群；１５５；ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣；ＮＦＡＴ＝ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＲＬＵ＝相対光単位；ＳＤ＝標準偏差；ＴＣＲ＝Ｔ細胞受容体ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｄは、実施例４に記載される細胞死滅アッセイにおけるＡＺＤ２９３６の細胞死滅活性及びＩＦＮ－γ放出の刺激を示す。図１１Ａは、５人のドナーからのＰＢＭＣについてのデータを示す。

【図11B】図１１Ａ～１１Ｄは、実施例４に記載される細胞死滅アッセイにおけるＡＺＤ２９３６の細胞死滅活性及びＩＦＮ－γ放出の刺激を示す。図１１Ｂは、ＡＺＤ２９３６及び他の抗体に応答して、Ｔ細胞及びヒト腫瘍細胞共培養アッセイから放出されたヒトＩＦＮ－γの増加倍率を示す。

【図11C】図１１Ａ～１１Ｄは、実施例４に記載される細胞死滅アッセイにおけるＡＺＤ２９３６の細胞死滅活性及びＩＦＮ－γ放出の刺激を示す。図１１Ｃは、１０ｎＭ～０．１ｐＭの抗体の濃度滴定を示す。

【図11D】図１１Ａ～１１Ｄは、実施例４に記載される細胞死滅アッセイにおけるＡＺＤ２９３６の細胞死滅活性及びＩＦＮ－γ放出の刺激を示す。図１１Ｄは、図１１Ｃと同様に行われたアッセイにおけるＡＺＤ２９３６（ｎ＝６）についての算術平均細胞毒性ＥＣ５０を示す。

【図12A】図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＯＥ２１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも強い抗腫瘍活性を有したことを示す。図１２Ａ及び１２Ｂにおける縦の点線は、腹腔内注射（ＩＰ）薬物投与を示す。

【図12B】図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＯＥ２１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも強い抗腫瘍活性を有したことを示す。図１２Ａ及び１２Ｂにおける縦の点線は、腹腔内注射（ＩＰ）薬物投与を示す。

【図12C】図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＯＥ２１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも強い抗腫瘍活性を有したことを示す。

【図12D】図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＯＥ２１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも強い抗腫瘍活性を有したことを示す。

【図13A】図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＰＣ９－ＭＡＲＴ１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも高い抗腫瘍活性を有したことを示す。図１３Ａ及び１３Ｂにおける縦の点線は、腹腔内注射（ＩＰ）薬物投与を示す。

【図13B】図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＰＣ９－ＭＡＲＴ１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも高い抗腫瘍活性を有したことを示す。図１３Ａ及び１３Ｂにおける縦の点線は、腹腔内注射（ＩＰ）薬物投与を示す。

【図13C】図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＰＣ９－ＭＡＲＴ１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも高い抗腫瘍活性を有したことを示す。

【図13D】図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＺＤ２９３６が、ＰＣ９－ＭＡＲＴ１腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１よりも高い抗腫瘍活性を有したことを示す。

【図14A】図１４Ａ及び１４Ｂは、実施例６に記載されるように、ＡＺＤ２９３６、ＩｇＧ１－ＴＭアイソタイプ対照、リツキシマブ、又はＩｇＧ１アイソタイプ対照と共に、補体含有ヒト血清又は熱不活化ヒト血清と共にインキュベートした後の、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを発現するＪｕｒｋａｔ生細胞（図１４Ａ）又はＤａｕｄｉ生細胞（図１４Ｂ）のパーセンテージを示す。エラーバーはＳＤ（ｎ＝２）を表す。

【図14B】図１４Ａ及び１４Ｂは、実施例６に記載されるように、ＡＺＤ２９３６、ＩｇＧ１－ＴＭアイソタイプ対照、リツキシマブ、又はＩｇＧ１アイソタイプ対照と共に、補体含有ヒト血清又は熱不活化ヒト血清と共にインキュベートした後の、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを発現するＪｕｒｋａｔ生細胞（図１４Ａ）又はＤａｕｄｉ生細胞（図１４Ｂ）のパーセンテージを示す。エラーバーはＳＤ（ｎ＝２）を表す。

【図15】初代ヒトＰＢＭＣによる、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを発現するＪｕｒｋａｔ細胞又はＤａｕｄｉ細胞の特異的な死滅を示す。実施例６に記載されるように、濃度依存的ＡＤＣＣはリツキシマブによって媒介されたが、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、ＡＺＤ２９３６、又はＩｇＧ１ ＴＭアイソタイプ対照によっては媒介されなかった。エラーバーはＳＤ（ｎ＝２）を表す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本開示は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴに結合する抗体を含む結合タンパク質に関する。本開示はまた、かかる結合タンパク質及びかかる結合タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物を提供する。本開示は更に、かかる結合タンパク質を使用して障害又は症状を治療する方法に関する。

【0010】

本開示に従って利用される場合、別段の指示がない限り、全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると理解されるものとする。文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0011】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原を認識して特異的に結合することができるタンパク質を指す。通常の又は従来の哺乳動物抗体は、四量体を含み、これは、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）と１つの「重」鎖（典型的には、約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）とからなる。本明細書で使用される「重鎖」及び「軽鎖」という用語は、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖及び重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に典型的に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、典型的には、エフェクター機能を担う定常ドメインを画定する。したがって、天然に存在する抗体において、完全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３）、並びにＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２との間のヒンジ領域を含み、Ｖ_Ｈドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈ３ドメインは、カルボキシル末端にあり、完全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及び定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含み、Ｖ_Ｌドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｌドメインはカルボキシル末端にある。しかしながら、当業者は、天然に存在する抗体におけるドメインの位置が、抗原結合能力を失うことなく、特定の抗体様結合タンパク質フォーマットにおいて改変され得ることを理解する。ヒト軽鎖のクラスは、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖と呼ばれる。

【0012】

幾つかの態様では、軽鎖定常領域はカッパ鎖である。幾つかの態様では、軽鎖定常領域はラムダ鎖である。

【0013】

完全長軽鎖及び重鎖内で、可変ドメイン及び定常ドメインは、典型的には、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各軽鎖／重鎖の対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的には、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的にはフレームワーク領域によって整列され、これは特異的エピトープへの結合を可能にし得る。アミノ末端からカルボキシル末端まで、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方は、典型的に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。

【0014】

「抗体断片」という用語は、無傷若しくは全長鎖又は抗体の一部、一般的には標的結合領域又は可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ’、Ｆ_{（ａｂ’）２}及びＦ_ｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、一般に「抗体断片」と同義であり、抗体に関しては、Ｆ_ｖ、Ｆ_ａｂ、Ｆ_{（ａｂ’）２}などの抗体断片を指すことができる。

【0015】

本明細書に記載されるアミノ酸残基の番号付けへの言及は、ＥＵ番号付けシステムに従って行われる（また、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ． （１９９１）にも記載されている）。

【0016】

用語「ベクター」は、コードされた情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、又はウイルス）を指す。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、更なるＤＮＡセグメントが挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡ分子をいう。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、更なるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに挿入することができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指向することができる。かかるベクターは、本明細書中では「発現ベクター」と称する。

【0017】

用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域及び定常領域を有する抗体を包含する。幾つかの態様では、ヒト抗体は、マウス及びラットなどの齧歯類、並びにウサギなどのウサギ目を含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物において産生される。他の態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞において産生される。更に他の態様では、ヒト抗体は、組換えにより産生される。幾つかの態様では、二重特異性結合タンパク質は、ヒト又はヒト化抗体である。

【0018】

本明細書で使用される「抗原」又は「標的抗原」という用語は、本開示の結合タンパク質によって認識され、結合されることができる分子又は分子の一部を指す。標的抗原は、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するために動物において使用することができる。標的抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。

【0019】

本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、本開示の結合タンパク質によって認識され結合される抗原の領域又は構造的エレメントを指す。より正確には、エピトープは、結合タンパク質のＣＤＲによって結合される特異的構造である。エピトープは、タンパク質構造エレメント、炭水化物、又は膜に存在する脂質構造の部分さえも含み得る。結合タンパク質は、タンパク質及び／又は高分子の複合混合物中でその抗原標的を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。「特異的に結合する」という用語は、分子又はその断片（例えば、抗原）に特異的に結合する結合タンパク質を指す。分子又はその断片に特異的に結合する結合タンパク質は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は当該分野で公知の他のアッセイによって測定したときに、より低い親和性で他の分子に結合し得る。特に、少なくとも１つの分子又はその断片に特異的に結合する抗体又は断片は、非特異的に結合する分子と競合することができる。本開示は、複数の特異性を有する抗体（例えば、２つ以上の別個の抗原に対する特異性を有する抗体）を具体的に包含する。例えば、二重特異性抗体は、単一の標的抗原上の２つの隣接するエピトープに結合することができるか、又は２つの異なる抗原に結合することができる。

【0020】

本明細書で使用される「抗原結合部位」という用語は本開示の結合タンパク質の表面上に作製された部位であって、抗原又は抗原上のエピトープが結合する部位を指す。結合タンパク質の抗原結合部位は、典型的には、結合タンパク質の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって作製されるループ構造を参照することによって記載される。

【0021】

幾つかの態様では、本明細書で提供される結合タンパク質は、二重特異性である。本明細書で使用される場合、二重特異性結合タンパク質は、少なくとも２つの独立した抗原（若しくは標的）に、又は同じ抗原内の異なるエピトープに、対する結合特異性を有する。例示的な二重特異性結合タンパク質は、標的内の２つの異なるエピトープに結合してもよく、又は２つの異なる標的に結合してもよい。他のかかる結合タンパク質は、第１の標的結合部位を別の標的に対する第２の結合部位と組み合わせ得る。幾つかの態様では、結合タンパク質は、二重特異性抗体である。

【0022】

幾つかの態様では、二重特異性抗体は、単一の製造された分子の投与と共に、２つの抗原を同時に標的化することに由来する、相加的及び／又は相乗的な治療効果を提供する。

【0023】

幾つかの態様では、本明細書に提供される抗体は、一価二重特異性抗体（ＭＢａｂ）である。本明細書に記載される一価二重特異性抗体足場は、その一価の性質に起因して、上記の潜在的な治療リスクを低減しながら、二重特異性抗体に関連する全ての利益を満たす二重特異性抗体を生成するための、優れたプラットフォームを提供する。更に、本明細書において提供されるＭＢａｂは、容易に発現され、安定であり、低い免疫原性を有する可能性が高い。本明細書で使用される場合、「ＭＢａｂ」と略記され得る「一価二重特異性」という用語は、各アームが異なる標的抗原に特異的に結合することができ、異なる標的抗原（Ａ及びＢ）の所与の対について、ＭＢａｂがそれぞれのうちの１つに結合することができる、二重特異性抗体を指す。ある特定の態様では、一価二重特異性抗体は、２つの独立した抗原（若しくは標的）に、又は同じ抗原上の２つの独立したエピトープに特異的に、結合することができる。典型的には、一価二重特異性抗体は、２つの異なる可変領域を含む。幾つかの態様では、２つの独立した抗原に対する結合親和性は、ほぼ同じである。幾つかの態様では、２つの独立した抗原に対する結合親和性は、異なる。

【0024】

幾つかの態様では、本明細書では、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインと、
ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインとを含む、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインと、
を含む、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴに特異的に結合する二重特異性結合タンパク質が提供される。

【0025】

幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。

【0026】

幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む。幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

【0027】

幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。

【0028】

幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。

【0029】

幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む。幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

【0030】

幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。

【0031】

幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号２１の核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメインと、配列番号２３の核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメインとを含む。幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号２２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号２４の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む。

【0032】

幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号２１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメインと、配列番号２３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメインとを含む。

【0033】

幾つかの態様では、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の結合ドメインは、配列番号２２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる重鎖と、配列番号２４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる軽鎖とを含む。

【0034】

幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号２５の核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメインと、配列番号２７の核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメインとを含む。幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号２６の核酸配列によってコードされる重鎖と、配列番号２８の核酸配列によってコードされる軽鎖とを含む。

【0035】

幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号２５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメインと、配列番号２７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメインとを含む。

【0036】

幾つかの態様では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の結合ドメインは、配列番号２６と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる重鎖と、配列番号２８と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である核酸配列によってコードされる軽鎖とを含む。

【0037】

一態様では、有用な二重特異性結合タンパク質は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの両方への結合について、本明細書に含まれる任意の二重特異性結合タンパク質と競合する。一態様では、有用な結合タンパク質は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの両方への結合について、配列番号７、配列番号９、配列番号１７、及び配列番号１９を含む抗体と競合する。別の態様では、有用な結合タンパク質は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの両方への結合について、配列番号８、配列番号１０、配列番号１８、及び配列番号２０を含む抗体と競合する。

【0038】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0039】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号２１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、配列番号２３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、配列番号２５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、又は配列番号２７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、のうちの１つ以上を含む核酸配列を提供する。一態様では、核酸配列は、配列番号２１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、配列番号２３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、配列番号２５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、及び配列番号２７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、を含む。

【0040】

一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７を含む。

【0041】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号２２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、配列番号２４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、配列番号２６と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、又は配列番号２８と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の配列、のうちの１つ以上を含む核酸配列を提供する。一態様では、核酸配列は、配列番号２２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、配列番号２４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、配列番号２６と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、及び配列番号２８と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列、を含む。

【0042】

一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８を含む。

【0043】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞を提供する。一態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。一態様では、本開示は、そのゲノムに組み込まれた本明細書に記載の核酸を有する宿主細胞を提供する。

【0044】

一態様では、本開示は、配列番号２１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、配列番号２３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、配列番号２５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、及び／又は配列番号２７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0045】

一態様では、本開示は、配列番号２２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、配列番号２４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、配列番号２６と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、及び／又は配列番号２８と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％同一の核酸配列、を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0046】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される宿主細胞によって産生される二重特異性結合タンパク質を提供する。

【0047】

本明細書で使用される「天然Ｆｃ」という用語は、単量体形態であろうと多量体形態であろうと、抗体の消化から生じるか、又は他の手段によって産生される、非抗原結合断片の配列を含む分子を指し、ヒンジ領域を含有することができる。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくはヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれかであり得る。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体又は多量体の形態に連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、及びＩｇＧＡ２）に応じて１～４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である。本明細書で使用される「天然Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体、及び多量体形態の総称である。

【0048】

幾つかの態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤからのＦｃ領域のうちの１つ以上であるドメインであるか、又はそれを含む。幾つかの態様では、抗体はＩｇＧ１抗体である。

【0049】

本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」という用語は、天然Ｆｃから改変されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む分子又は配列を指す。例示的なＦｃ変異体、及びサルベージ受容体とのそれらの相互作用は、当技術分野において公知である。したがって、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含むことができる。更に、天然Ｆｃは、本開示の結合タンパク質に必要とされない構造的特徴又は生物学的活性を提供する特定の残基を改変するために、Ｆｃ変異体を産生するように除去又は変異され得る領域を含む。したがって、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすか又は関与する、１つ以上の天然Ｆｃ部位若しくは残基を欠くか、又は１つ以上のＦｃ部位若しくは残基が改変されている、分子又は配列を含む。

【0050】

幾つかの態様では、二重特異性結合タンパク質は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスによって番号付けされたときに、２２１Ｋ， ２２１Ｙ， ２２５Ｅ， ２２５Ｋ， ２２５Ｗ， ２２８Ｐ， ２３４Ｄ， ２３４Ｅ， ２３４Ｎ， ２３４Ｑ， ２３４Ｔ， ２３４Ｈ， ２３４Ｙ， ２３４Ｉ， ２３４Ｖ， ２３４Ｆ， ２３５Ａ， ２３５Ｄ， ２３５Ｒ， ２３５Ｗ， ２３５Ｐ， ２３５Ｓ， ２３５Ｎ， ２３５Ｑ， ２３５Ｔ， ２３５Ｈ， ２３５Ｙ， ２３５Ｉ， ２３５Ｖ， ２３５Ｅ， ２３５Ｆ， ２３６Ｅ， ２３７Ｌ， ２３７Ｍ， ２３７Ｐ， ２３９Ｄ， ２３９Ｅ， ２３９Ｎ， ２３９Ｑ， ２３９Ｆ， ２３９Ｔ， ２３９Ｈ， ２３９Ｙ， ２４０Ｉ， ２４０Ａ， ２４０Ｔ， ２４０Ｍ， ２４１Ｗ， ２４１Ｌ， ２４１Ｙ， ２４１Ｅ， ２４１Ｒ， ２４３Ｗ， ２４３Ｌ ２４３Ｙ， ２４３Ｒ， ２４３Ｑ， ２４４Ｈ， ２４５Ａ， ２４７Ｌ， ２４７Ｖ， ２４７Ｇ， ２５０Ｅ， ２５０Ｑ， ２５１Ｆ， ２５２Ｌ， ２５２Ｙ， ２５４Ｓ， ２５４Ｔ， ２５５Ｌ， ２５６Ｅ， ２５６Ｆ， ２５６Ｍ， ２５７Ｃ， ２５７Ｍ， ２５７Ｎ， ２６２Ｉ， ２６２Ａ， ２６２Ｔ， ２６２Ｅ， ２６３Ｉ， ２６３Ａ， ２６３Ｔ， ２６３Ｍ， ２６４Ｌ， ２６４Ｉ， ２６４Ｗ， ２６４Ｔ， ２６４Ｒ， ２６４Ｆ， ２６４Ｍ， ２６４Ｙ， ２６４Ｅ， ２６５Ａ， ２６５Ｇ， ２６５Ｎ， ２６５Ｑ， ２６５Ｙ， ２６５Ｆ， ２６５Ｖ， ２６５Ｉ， ２６５Ｌ， ２６５Ｈ， ２６５Ｔ， ２６６Ｉ， ２６６Ａ， ２６６Ｔ， ２６６Ｍ， ２６７Ｑ， ２６７Ｌ， ２６８Ｅ， ２６９Ｈ， ２６９Ｙ， ２６９Ｆ， ２６９Ｒ， ２７０Ｅ， ２８０Ａ， ２８４Ｍ， ２９２Ｐ， ２９２Ｌ， ２９６Ｅ， ２９６Ｑ， ２９６Ｄ， ２９６Ｎ， ２９６Ｓ， ２９６Ｔ， ２９６Ｌ， ２９６Ｉ， ２９６Ｈ， ２９６Ｇ， ２９７Ｓ， ２９７Ｄ， ２９７Ｅ， ２９８Ａ， ２９８Ｈ， ２９８Ｉ， ２９８Ｔ， ２９８Ｆ， ２９９Ｉ， ２９９Ｌ， ２９９Ａ， ２９９Ｓ， ２９９Ｖ， ２９９Ｈ， ２９９Ｆ， ２９９Ｅ， ３０５Ｉ， ３０８Ｆ， ３１３Ｆ， ３１６Ｄ， ３１８Ａ， ３１８Ｓ， ３２０Ａ， ３２０Ｓ， ３２２Ａ， ３２２Ｓ， ３２５Ｑ， ３２５Ｌ， ３２５１， ３２５Ｄ， ３２５Ｅ， ３２５Ａ， ３２５Ｔ， ３２５Ｖ， ３２５Ｈ， ３２６Ａ， ３２６Ｄ， ３２６Ｅ， ３２６Ｇ， ３２６Ｍ， ３２６Ｖ， ３２７Ｇ， ３２７Ｗ， ３２７Ｎ， ３２７Ｌ， ３２８Ｓ， ３２８Ｍ， ３２８Ｄ， ３２８Ｅ， ３２８Ｎ， ３２８Ｑ， ３２８Ｆ， ３２８１， ３２８Ｖ， ３２８Ｔ， ３２８Ｈ， ３２８Ａ， ３２９Ｆ， ３２９Ｈ， ３２９Ｑ， ３３０Ｋ， ３３０Ｇ， ３３０Ｔ， ３３０Ｃ， ３３０Ｌ， ３３０Ｙ， ３３０Ｖ， ３３０１， ３３０Ｆ， ３３０Ｒ， ３３０Ｈ， ３３１Ｇ， ３３１Ａ， ３３１Ｌ， ３３１Ｍ， ３３１Ｆ， ３３１Ｗ， ３３１Ｋ， ３３１Ｑ， ３３１Ｅ， ３３１Ｓ， ３３１Ｖ， ３３１１， ３３１Ｃ， ３３１Ｙ， ３３１Ｈ， ３３１Ｒ， ３３１Ｎ， ３３１Ｄ， ３３１Ｔ， ３３２Ｄ， ３３２Ｓ， ３３２Ｗ， ３３２Ｆ， ３３２Ｅ， ３３２Ｎ， ３３２Ｑ， ３３２Ｔ， ３３２Ｈ， ３３２Ｙ， ３３２Ａ， ３３３Ａ， ３３３Ｄ， ３３３Ｇ， ３３３Ｑ， ３３３Ｓ， ３３３Ｖ， ３３４Ａ， ３３４Ｅ， ３３４Ｈ， ３３４Ｌ， ３３４Ｍ， ３３４Ｑ， ３３４Ｖ， ３３４Ｙ， ３３９Ｔ， ３７０Ｅ， ３７０Ｎ， ３７８Ｄ， ３９２Ｔ， ３９６Ｌ， ４１６Ｇ， ４１９Ｈ， ４２１Ｋ， ４２８Ｌ， ４２８Ｆ， ４３３Ｋ， ４３３Ｌ， ４３４Ａ， ４３４Ｗ， ４３４Ｙ， ４３６Ｈ， ４４０Ｙ 及び４４３Ｗから選択される少なくとも１つの置換を含む変異体Ｆｃ領域を含む。

【0051】

幾つかの態様では、変異Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスによって番号付けされたときに、４２８及び４３４から選択される位置に１つ以上の修飾を含む。幾つかの態様では、変異Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスによって番号付けされたときに、４２８及び４３４から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。幾つかの態様では、変異Ｆｃ領域は、４２８Ｌ， ４２８Ｆ， ４３４Ａ， ４３４Ｗ及び４３４Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。

【0052】

Ｆｃ領域の操作は、治療用抗体の半減期を延長し、インビボでの分解から保護するために、当技術分野において広く使用されている。幾つかの態様では、ＩｇＧ抗体又は抗原結合断片のＦｃ領域は、ＩｇＧ異化作用を媒介し、ＩｇＧ分子を分解から保護するＦｃ受容体－新生児（ＦｃＲｎ）に対するＩｇＧ分子の親和性を増加させるために修飾することができる。

【0053】

他の適切なＦｃ領域アミノ酸置換又は修飾は、当技術分野において公知であり、例えば、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従って番号付けされた、２５２位におけるメチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換、２５４位におけるセリン（Ｓ）からトレオニン（Ｔ）への置換、及び２５６位におけるトレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への置換の三重置換（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ； 「ＹＴＥ」又は「ＹＴＥ」変異）（例えば、米国特許第７，６５８，９２１号、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０５８号、及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．， ６１（１）：ｅ０１０２０－１６（２０１７）、これらの各々の全内容を、参照により本明細書に組み込む）が挙げられる。

【0054】

幾つかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、半減期を改善するように操作されたＦｃ領域を含む。幾つかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＹＴＥ変異を有するＦｃ領域を含む。

【0055】

幾つかの態様では、Ｆｃ領域はグリコシル化されていない（aglycosylated）。幾つかの態様では、Ｆｃ領域は脱グリコシル化（deglycosylated）されている。幾つかの態様では、Ｆｃ領域は、低減されたフコシル化を有するか、又はフコシル化されていない。

【0056】

幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、ＦｃＲｎに対する増加した結合親和性を有する。

【0057】

三重変異（ＴＭ）Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（欧州連合番号付け規則による、Ｓａｚｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １０５：２０１６７－２０１７２（２００８））は、ＩｇＧエフェクター機能を顕著に低下させることができる。幾つかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ三重変異（ＴＭ）を有するＦｃ領域を含む。

【0058】

幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、インビボで投与された場合に低減された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有する。幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、野生型Ｆｃ領域を含有する抗体又はその結合変異体と比較して低減されたＣＤＣを有する。幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、インビボで投与された場合にＣＤＣを誘発しない。幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、インビボで投与された場合にＣＤＣの低下を引き起こす。幾つかの態様では、低減されたＣＤＣ活性を有するか、又はＣＤＣ活性を有さないＦｃ変異抗体又はその結合断片は、変異Ｆｃ領域に三重変異（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。

【0059】

幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、インビボで投与された場合に、低減された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、野生型Ｆｃ領域を含有する抗体又はその結合変異体と比較して低減されたＡＤＣＣを有する。幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、インビボで投与された場合にＡＤＣＣを誘発しない。幾つかの態様では、Ｆｃ変異抗体又はその結合断片は、インビボで投与された場合にＡＤＣＣの低下を引き起こす。幾つかの態様では、低減されたＡＤＣＣ活性を有するか、又はＡＤＣＣ活性を有さないＦｃ変異抗体又はその結合断片は、変異Ｆｃ領域に三重変異（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。

【0060】

幾つかの態様では、低減されたＣＤＣ活性を有する抗体又はその結合断片は、対象に投与された場合に低減された毒性を有する。幾つかの態様では、低減されたＡＤＣＣ活性を有する抗体又はその結合断片は、対象に投与された場合に低減された毒性を有する。

【0061】

本明細書で使用される「Ｆｃドメイン」という用語は、上記で定義された天然Ｆｃ及びＦｃ変異体及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化されたか、又は他の手段によって産生されたかにかかわらず、単量体又は多量体形態の分子を含む。

【0062】

結合タンパク質の収率を改善するために、Ｃ_Ｈ３ドメインは、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９： ６１７－２１、及びＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６： ６７７－８１などの、幾つかの例示的な分子と共に詳細に記載されている「ノブ－イントゥ－ホール」技術により改変されることができる。具体的には、２つのＣ_Ｈ３ドメインの相互作用表面を変化させて、これらの２つのＣ_Ｈ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣ_Ｈ３ドメインの各々は「ノブ」であり得るが、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体を更に安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７０： ２６－３５）、収率を増加させる。

【0063】

幾つかの態様では、結合タンパク質は、「ＤｕｅｔＭａｂ」フォーマットを有する。ＤｕｅｔＭａｂは、以下の基本構造を有する：
改変重鎖を有するＦｃ領域であって、前記改変重鎖のＣ_Ｈ１領域が、天然システインから非システインアミノ酸への置換、及び天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有する、Ｆｃ領域；対応する改変軽鎖であって、前記改変軽鎖のＣ_Ｌ領域もまた、天然システインから非システインアミノ酸への置換、及び天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有する、対応する改変軽鎖；第２の重鎖を有する第２のＦｃ領域；及び第２の対応する改変軽鎖、ここで、改変重鎖が対応する改変軽鎖に直接連結され、別個の標的結合アーム上で、第２の重鎖が第２の対応する軽鎖に直接連結され、ここで、天然非システインアミノ酸のシステインアミノ酸への置換から生じる改変重鎖の置換システインと、天然非システインアミノ酸のシステインアミノ酸への置換から生じる対応する改変軽鎖の置換システインとが、ジスルフィド結合を形成することができる。ＤｕｅｔＭａｂに関する開示は、例えば、米国特許９，５２７，９２７号に存在し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0064】

本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という用語は、本開示の結合タンパク質と抗原標的との間の相互作用の解離定数（Ｋ_Ｄ＝［Ａ］×［Ｂ］／［ＡＢ］）を指し、モル／リットルの単位を有する。本開示の結合タンパク質は、典型的には、１０^－５～１０^－１２モル／リットル以下、又は１０^－７～１０^－１２モル／リットル以下、又は１０^－３～１０^－１２モル／リットルの解離定数（Ｋ_Ｄ）、及び／又は、少なくとも１０^７Ｍ^－１、又は少なくとも１０^８Ｍ^－１、又は少なくとも１０^９Ｍ^－１、又は少なくとも１０^１２Ｍ^－１の結合親和性を有する。１０^－４モル／リットルより大きい任意のＫ_Ｄ値は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。したがって、Ｋ_Ｄ値が低いほど、親和性は大きい。幾つかの態様では、本開示の結合タンパク質は、５００ｎＭ未満、又は２００ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満、又は５００ｐＭ未満の親和性で所望の抗原に結合する。高い親和性又は非常に強い結合は、しばしば、より大きな効力と関連するが、親和性が大きいほど効力が大きいとは限らない。

【0065】

解離定数（Ｋ_Ｄ）は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。一般的に、表面プラズモン共鳴分析は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴によって、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と分析物との間のリアルタイム結合相互作用（オン速度及びオフ速度の両方）を測定する。表面プラズモン分析は、分析物を固定化し、リガンドを提示することによっても行うことができる。本開示の結合タンパク質の抗原又は抗原決定基への特異的結合はまた、例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイを含む、当技術分野で公知の任意の適切な様式で決定することができる。

【0066】

一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、約１５ｐＭ以下である。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫ_Ｄは、約９ｐＭ以下である。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫ_Ｄは、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、又は８ｐＭ以下である。

【0067】

一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫ_Ｄは、約９ｐＭ～約１５ｐＭである。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫ_Ｄは、約１０ｐＭ～約１５ｐＭである。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫ_Ｄは、約１１ｐＭ～約１５ｐＭである。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫｄ_Ｋｄは、約１２ｐＭ～約１５ｐＭである。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫ_Ｄは、約１３ｐＭ～約１５ｐＭである。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＴＩＧＩＴとの相互作用のＫ_Ｄは、約１４ｐＭ～約１５ｐＭである。

【0068】

一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＰＤ－Ｌ１との相互作用のＫ_Ｄは、約０．４ｎＭ以下である。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＰＤ－Ｌ１との相互作用のＫ_Ｄは、約０．２ｎＭ～約０．５ｎＭである。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＰＤ－Ｌ１との相互作用のＫ_Ｄは、約０．３ｎＭ～約０．５ｎＭである。一態様では、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質とヒトＰＤ－Ｌ１との相互作用のＫ_Ｄは、約０．４ｎＭ～約０．５ｎＭである。

【0069】

特定の態様では、疾患又は状態を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に開示される結合タンパク質を対象に投与することを含む方法が、本明細書に提供される。本開示は、タンパク質、核酸分子及び／又は組成物を対象に投与することによって、対象において免疫応答を誘導する方法、並びに対象において腫瘍及び／又は癌を治療又は予防する方法を提供する。

【0070】

特定の態様では、本明細書に記載される二重特異性タンパク質を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供される。一態様では、本明細書に記載される核酸を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供される。一態様では、本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供される。

【0071】

一態様では、治療に使用するための、本明細書で定義される二重特異性タンパク質が本明細書で提供される。一態様では、癌の治療に使用するための、本明細書で定義される二重特異性タンパク質が本明細書で提供される。一態様では、癌の治療のための医薬の製造における、本明細書で定義される二重特異性タンパク質の使用が本明細書で提供される。一態様では、治療に使用するための本明細書で定義される核酸が本明細書で提供される。一態様では、癌の治療に使用するための、本明細書で定義される核酸が本明細書で提供される。一態様では、癌の治療のための医薬の製造における、本明細書で定義される核酸の使用が本明細書で提供される。

【0072】

一態様では、治療方法は、追加の抗癌化合物と組み合わせて、治療有効量の本明細書に開示される結合タンパク質を対象に投与することを含む。幾つかの態様では、抗癌化合物は、小分子薬である。幾つかの態様では、抗癌化合物は、ペメトレキセド、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル又はそれらの組合せである。幾つかの態様では、結合タンパク質及び追加の抗癌治療は、同時に投与される。幾つかの態様では、結合タンパク質及び追加の抗癌治療は、同時に投与されないが、同じ治療過程中に投与される。

【0073】

「疾患」又は「症状」は、本開示の方法を使用する治療から利益を得る任意の状態を指す。「疾患」及び「症状」は、本明細書において互換的に使用され、患者を問題の障害に罹りやすくする病理学的状態を含む、慢性及び急性の障害又は疾患を含む。幾つかの態様では、疾患は腫瘍である。幾つかの態様では、疾患は固形腫瘍である。幾つかの態様では、疾患は癌である。幾つかの態様では、癌は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、及び肺癌のうちの１つ以上である。幾つかの態様では、疾患は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。幾つかの態様では、ＮＳＣＬＣは進行性又は転移性である。幾つかの態様では、進行性ＮＳＣＬＣは、ステージＩＩＩ又はステージＩＶのＮＳＣＬＣである。

【0074】

用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物、特に哺乳動物を含むことが意図される。特定の態様では、対象はヒト患者である。

【0075】

本明細書で使用される「治療」又は「治療する」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を指す。治療を必要とする対象には、疾患若しくは症状を有する対象、並びに疾患若しくは症状を有する傾向がある対象、又は疾患若しくは症状が予防される対象が含まれる。

【0076】

本明細書で使用される「投与」又は「投与すること」という用語は、所望の効果を達成するために、任意の適切な経路によって１つ以上の化合物を提供、接触、及び／又は送達することを指す。投与には、経口、舌下、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、又は頭蓋内注射）、経皮、局所、頬側、直腸、膣、鼻、眼、吸入、及びインプラントが含まれ得るが、これらに限定されない。

【0077】

本明細書で使用される「同時投与される」又は「組み合わせて」という用語は、複数の化合物若しくは薬剤の同時若しくは連続投与を指す。第１の化合物若しくは薬剤は、第２の化合物若しくは薬剤の投与の前に、それと同時に、又はその後に投与され得る。第１の化合物若しくは薬剤及び第２の化合物若しくは薬剤は、同じ日に同時に若しくは連続して投与されてもよく、又は互いに１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、若しくは１ヶ月以内に連続して投与されてもよい。幾つかの態様では、化合物若しくは薬剤は、それぞれの化合物若しくは薬剤が少なくともいくらかの生理学的効果を発揮している期間及び／又は有効性が残っている期間に同時投与される。

【0078】

本明細書で使用される「医薬組成物」又は「治療組成物」という用語は、対象に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物又は組成物を指す。幾つかの態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と、治療有効量の本開示の結合タンパク質とを含む医薬組成物を提供する。

【0079】

「治療有効用量」又は「治療用量」は、所望の臨床結果をもたらす（すなわち、治療有効性を達成する）のに十分な量である。治療有効量は、１回以上の投与で投与することができる。

【0080】

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」又は「生理学的に許容される担体」という用語は、本開示の１つ以上の結合タンパク質の送達を達成又は増強するのに適した１つ以上の製剤材料を指す。

【0081】

幾つかの態様では、本明細書に開示される結合タンパク質は、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と共に、医薬組成物として製剤化され得る。特定の態様では、かかる医薬組成物は、当技術分野で公知の方法を使用する任意の１つ以上の投与経路を介したヒト又は非ヒト動物への投与に適している。用語「薬学的に許容される担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない１つ以上の非毒性物質を意味する。かかる調製物は、慣用的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、及び必要に応じて他の治療剤を含み得る。かかる薬学的に許容される調製物はまた、ヒトへの投与に適切な適合性の固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化物質を含み得る。本明細書に記載される製剤において利用され得る他の企図される担体、賦形剤、及び／又は添加剤としては、例えば、香味剤、抗菌剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、脂質、タンパク質賦形剤、例えば血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、塩形成対イオン、例えばナトリウムなどが挙げられる。本明細書に記載の製剤における使用に適したこれら及び追加の公知の薬学的担体、賦形剤、及び／又は添加剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、（２００５年）、及び「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、第６０版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ， Ｍｏｎｔｖａｌｅ， Ｎ．Ｊ．（２００５）に列挙されているように、当技術分野において公知である。所望又は必要とされる投与様式、溶解度、及び／又は安定性に適した薬学的に許容される担体を選択することができる。

【0082】

幾つかの態様では、本開示の医薬組成物は、追加の抗癌化合物を含む。幾つかの態様では、抗癌化合物は、小分子薬である。幾つかの態様では、抗癌化合物は、ペメトレキセド、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル又はそれらの組合せである。幾つかの態様では、抗癌化合物はペメトレキセドである。幾つかの態様では、抗癌化合物はカルボプラチンである。幾つかの態様では、抗癌化合物はゲムシタビンである。幾つかの態様では、抗癌化合物はシスプラチンである。幾つかの態様では、抗癌化合物はパクリタキセルである。

【0083】

一態様では、本開示の製剤は、エンドトキシン及び／又は関連する発熱性物質を実質的に含まない、パイロジェンフリーの製剤である。エンドトキシンとしては、微生物の内部に封入された後、微生物が破壊されるか又は死滅したときにのみ放出される、毒素が挙げられる。発熱性物質にはまた、細菌及び他の微生物の外膜からの熱誘導性、熱安定性物質（糖タンパク質）が含まれる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与されると、発熱、低血圧、及びショックを引き起こし得る。潜在的な有害な影響に起因して、少量のエンドトキシンであっても、静脈内投与される医薬溶液から除去しなければならない。米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物適用のために、１回の１時間の期間で体重１キログラム当たり用量当たり５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。ある態様では、組成物中のエンドトキシン及び発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、又は５ＥＵ／ｍｇ未満、又は１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。

【0084】

インビボ投与に使用される場合、本開示の製剤は無菌であるべきである。本開示の製剤は、例えば、滅菌濾過又は放射線照射などの様々な滅菌方法によって滅菌され得る。一態様では、製剤は、予め滅菌された０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌される。注射用滅菌組成物は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載されているような従来の薬務に従って製剤化することができる。

【0085】

幾つかの態様では、治療用組成物は、特定の投与経路、例えば、経口、経鼻、肺、局所（口腔及び舌下を含む）、直腸、膣、及び／又は非経口における投与のために製剤化することができる。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という用語は、通常は注射による、腸内及び局所投与以外の投与様式を指し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含むが、これらに限定されない。局所又は経皮投与に適した本開示の製剤としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入剤が挙げられる。抗体及び他の活性物質は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体と、及び必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、又は噴射剤と混合され得る（例えば、米国特許第７，３７８，１１０号、同第７，２５８，８７３号、及び同第７，１３５，１８０号、米国特許出願公開第２００４／００４２９７２号及び同第２００４／００４２９７１号参照）。

【0086】

製剤は、単位剤形で提供することができ、薬学の分野で公知の任意の方法によって調製することができる。本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性ではなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量（例えば、「治療有効量」）を得るように変動させ得る。選択される用量レベルは、使用される特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の要因などの、種々の薬物動態学的要因に依存する。これらの投薬量は、投薬量、投与の方法、処置されるべき障害又は症状、及び個々の対象の特徴に依存して、毎日、毎週、隔週、毎月、又はより少ない頻度（例えば、半年）で投与され得る。投薬量はまた、連続注入（例えば、ポンプによる）を介して投与され得る。投与用量はまた、投与経路に依存し得る。例えば、皮下投与は、静脈内投与よりも高い用量を必要とし得る。上記のように、任意の一般的に使用される投薬レジメン（例えば、注射又は注入によって１日１回又は１週間に２回、１～１０ｍｇ／ｋｇ投与）は、ヒト癌患者を治療することに関する方法において適合され得、適切であり得る。

【0087】

特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用された全ての参考文献、及びそれらに引用された参考文献は、それらがまだ引用されていない限りにおいて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0088】

本開示を限定することなく、本開示の幾つかの態様が、例示の目的で本明細書で説明される。

【実施例】

【0089】

以下の実施例は、本開示の特定の態様及びその様々な使用を例示するものである。それらは説明の目的のためだけに記載されており、本開示の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

【0090】

実施例１：二重特異性抗体の抗ＴＩＧＩＴ部分の生成及び特徴付け
一連のモノクローナルＴＩＧＩＴ抗体を開発し、特徴付けた。親ＶＡＲ１（Ｐ－ＶＡＲ１）ＷＴ可変重鎖及び軽鎖（ＶＬ ＷＴ＋ＶＨ ＷＴ）における配列を再検討した。可変重鎖では、メチオニン酸化の潜在的リスクがＣＤＲＨ３領域において同定され、ＤＰ断片化の潜在的リスクがＣＤＲＨ３領域において同定された（図１－１及び図１－２）。可変軽鎖では、メチオニン酸化の潜在的リスクがＣＤＲＬ１領域において同定された（図２－１及び図２－２）。この潜在的な酸化を除去し、生殖系列（ＧＬ）配列と一致させるために、以下の５つの変異体モノクローナル抗体を生成した：
ＶＬ ＷＴ ＋ ＶＨ ＷＴ；
ＶＬ ＧＬ ＋ ＶＨ ＷＴ；
ＶＬ ＷＴ ＋ ＶＨ ＧＬ；
ＶＬ ＧＬ ＋ ＶＨ ＧＬ；
ＶＬ ＧＬ （ＣＤＲＬ１ Ｍ－Ｉ）＋ ＶＨ ＧＬ

【0091】

具体的には、可変重鎖領域において、最初のＥアミノ酸をＱに変異させて、生殖系列配列と一致させた。可変重鎖領域において、ＣＤＲＬ１中のメチオニン残基を、潜在的な酸化を軽減するために、生殖系列配列におけるように、１つの変異体においてイソロイシンに変異させた。Ｐ－ＶＡＲ１ ＶＨ及びＶＬドメインは、変異体の生産性及び動態に影響を及ぼすことなく、良好に改変された。（表１、図５、図６Ａ及び６Ｂ）。更に、変異体は、加速熱安定性アッセイにおいて顕著な単量体の損失、凝集又は断片化を示さなかった（表２）。

【0092】

【表1】

【0093】

全ての変異体を、１ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ緩衝液中、４５℃で２週間、加速熱安定性アッセイに供した。単量体損失、凝集及び断片化を、標準的な技術を使用して高温貯蔵の前及び後の両方で測定し、結果を表２に示した。

【0094】

【表2】

【0095】

ＰＤ１－ＴＩＧＩＴ ｄｕｅｔＭａｂ ＬＯ１１５／Ｐ－ＶＡＲ１（ＶＨＷＴ－ＶＬＷＴ）及びＶＡＲ１（ＬＯ１１５／ＶＨＧＬ－ＶＬＧＬ（Ｍ－Ｉ））の固有の動態を、製造業者の説明書に従ってＢｉａＣｏｒｅによって評価した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用して結合実験を行った。結合結果を表３に示す。

【0096】

【表3】

【0097】

実施例２：ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ二重特異性結合タンパク質及び結合タンパク質の特徴付け
ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴに結合するＤｕｅｔＭａｂフォーマットの二重特異性結合タンパク質を、以下の表４の配列を用いて作製した。表４中のＣＤＲを、Ｋａｂａｔ定義システムに基づいて強調表示する。

【0098】

【表4-1】

【0099】

【表4-2】

【0100】

【表4-3】

【0101】

【表4-4】

【0102】

【表4-5】

【0103】

同時結合試験
組換えヒトＰＤ－１及びＴＩＧＩＴタンパク質に対する同時結合試験を、Ｏｃｔｅｔ３８４機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）でのバイオレイヤー干渉法によって測定した。図８Ａに示すように、アッセイ緩衝液［ＰＢＳ ｐＨ ７．２、３ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０］中０．５μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＴＩＧＩＴタンパク質を、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）上に捕捉した。アッセイ緩衝液中５μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１タンパク質を、図８Ｂに示すように、ニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ， Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）上に捕捉した。任意の非結合タンパク質を除去するための洗浄ステップの後、それぞれのロードされたバイオセンサーを、最初に１３３ｎＭのＡＺＤ２９３６と、次いで３００ｎＭのヒトＰＤ－１又はヒトＴＩＧＩＴ抗原との連続的な会合及び解離相互作用に供した。Ｏｃｔｅｔ３８４ソフトウェアｖ．９．０を使用して、データの非線形フィットから、会合及び解離曲線を計算した。組換えヒトＰＤ－１及びＴＩＧＩＴタンパク質に同時に結合するＡＺＤ２９３６の能力を、Ｏｃｔｅｔ分析によって決定した。図８Ａ及び８Ｂに示されるように、ＡＺＤ２９３６は、ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＰＤ－１抗原への同時結合を実証した。

【0104】

実施例３：細胞結合アッセイ
図９Ａ～９Ｃに示すように、単一特異性抗ＰＤ１（ＬＯ１１５）、単一特異性抗ＴＩＧＩＴ（ＶＡＲ１）、及びアイソタイプ対照に対して細胞表面上に発現されたＰＤ１及びＴＩＧＩＴに対するＡＺＤ２９３６の結合を試験した。具体的には、細胞ベースの平衡結合アッセイを実施して、操作された細胞株の細胞表面上に発現されるヒトＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ受容体へのＡＺＤ２９３６結合の見かけの親和性を測定した。この目的のために、Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、ヒトＰＤ－１及び／又はＴＩＧＩＴ受容体を発現するように操作した。これらの細胞サブセットがＡＺＤ２９３６結合の評価に関連しているかどうかを決定するために、ヒトＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの細胞表面受容体密度を定量した。表５に示されるように、単一陽性Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ－細胞上のＰＤ－１受容体密度は、１１７００（ＳＤ±６６９０）受容体／細胞と決定され、単一陽性Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１－ＴＩＧＩＴ＋細胞上のＴＩＧＩＴ受容体密度は、１４７０００（ＳＤ±９１５００）受容体／細胞と決定された。二重陽性Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ １＋ＴＩＧＩＴ＋細胞上のＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ受容体密度は、６２１０００（ＳＤ±２１００００）及び１４９０００（ＳＤ±８９１００）であり、ＴＩＧＩＴ受容体に対して４．１７：１過剰のＰＤ－１受容体を示した。

【0105】

【表5】

ＮＤ＝測定せず；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ；ＳＤ＝標準偏差。

【0106】

ＡＺＤ２９３６の結合を二価ｍＡｂと一緒に評価し、ヒトＰＤ－１及び／又はヒトＴＩＧＩＴ受容体を発現するように操作された３つのＪｕｒｋａｔ細胞株で検出した。ＡＺＤ２９３６は、濃度依存的にＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋細胞に結合し、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのＴＩＧＩＴ受容体への細胞結合特性を維持した（図９Ａ）。二価抗ＴＩＧＩＴ抗体と比較して、ＡＺＤ２９３６は、結合ＥＣ_５０値の増加（２．８５倍）（表６）及び最大結合の増加を示した（図９Ａ）。ＡＺＤ２９３６は、濃度依存的にＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－細胞に結合した。ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合についての二価抗ＰＤ－１抗体と比較して、ＡＺＤ２９３６は、結合ＥＣ_５０値の増加（４．８２倍）（表７）及び最大結合の増加（図９Ｂ）を示した。これらの結果は、一価結合が、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＴＩＧＩＴ又はＰＤ－１の結合に十分であることを実証した。

【0107】

【表6】

【0108】

【表7】

【0109】

【表8】

【0110】

ＰＤ－１（ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－）若しくはＴＩＧＩＴ（ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋）のいずれか、又は両方の受容体（ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞株に対するＡＺＤ２９３６の細胞結合特性を、フローサイトメトリー結合アッセイによって決定した。図９Ｃに示されるように、ＡＺＤ２９３６は、同様の細胞結合特性で、Ｊｕｒｋａｔ細胞の３つのタイプ全てに結合した。３つの細胞株間のＡＺＤ２９３６結合親和性の差を評価するために、ＥＣ_５０値を決定した（表８）。ＰＤ－１単一発現細胞株に対するＡＺＤ２９３６の平均ＥＣ_５０は、０．７９７ｎＭであった。ＴＩＧＩＴ^＋ＰＤ－１^＋二重発現細胞株に対するＡＺＤ２９３６の平均ＥＣ_５０は、０．６３２ｎＭであった。ＴＩＧＩＴのみの受容体を発現するように操作された細胞株への結合は、０．３１４ｎＭで最も低い平均ＥＣ_５０値をもたらした。

【0111】

ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター２細胞共培養アッセイ
図１０Ａ～１０Ｃに示すように、ＡＺＤ２９３６を、単一特異性抗ＰＤ１（ＬＯ１１５）、単一特異性抗ＴＩＧＩＴ（ＶＡＲ１）、及びアイソタイプ対照に対して試験した。ＡＺＤ２９３６は、活性であり、単一特異性抗体と比較して、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの両方に対してより強いリガンド遮断活性を有することが示された。具体的には、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／又はＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用を遮断するＡＺＤ２９３６の能力を評価するために、ＯＫＴ３、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ１５５の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞、並びにヒトＰＤ－１、ヒトＴＩＧＩＴ又は両方の抗原を発現するように遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターＴ細胞を使用して、２細胞共培養生物活性アッセイを利用した。アッセイにおいて、ＮＦＡＴ応答エレメントの制御下でのルシフェラーゼ活性を、ＯＫＴ３による刺激に応答して測定した。ＮＦＡＴシグナル伝達は、ＴＣＲシグナル伝達の下流で起こり、増殖及びサイトカイン放出などのＴ細胞活性化の他の尺度と相関することが報告されている。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／又はＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の完全な遮断は、最大ＴＣＲアゴニズム及びその後のルシフェラーゼ活性を促進した。

【0112】

ＣＨＯ－Ｋ１ ＯＫＴ３ ＰＤ－Ｌ１ ＣＤ１５５細胞及びＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞 ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター細胞を用いた２細胞共培養アッセイにおいて、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するＡＺＤ２９３６の活性を試験した。ＡＺＤ２９３６は、４．２６ｎＭの平均ＥＣ５０（実験＃１及び＃２から、それぞれ４．７０及び３．８３ｎＭのＥＣ５０）で、２つの二連実験において濃度依存的活性を示した（図１０Ａ及び表９）。同じアッセイにおいて、抗ＰＤ－１の平均ＥＣ５０は３．０３ｎＭであった（実験＃１及び＃２から、それぞれ１．９３及び４．１４ｎＭのＥＣ５０）。抗ＴＩＧＩＴ抗体もアイソタイプ対照抗体も、このアッセイにおいて活性を示さなかった。

【0113】

ＡＺＤ２９３６がＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用を遮断する活性を試験した。このアッセイでは、ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^－ＴＩＧＩＴ^＋ ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター細胞と共培養し、ＡＺＤ２９３６、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、及びアイソタイプ対照ｍＡｂの処理後に誘導されたルシフェラーゼ活性を比較した。このアッセイにおいて、ＡＺＤ２９３６は、２つの実験から１５．３ｎＭの平均ＥＣ５０（実験＃１及び＃２において、それぞれ１７．０ｎＭ及び１３．７ｎＭのＥＣ５０）で、アイソタイプ対照抗体よりも高い活性を示した（図１０Ｂ及び表１０）。同じ実験において、抗ＴＩＧＩＴの処置は、２つの実験から２．２２ｎＭの平均ＥＣ５０をもたらした（実験＃１及び＃２においてそれぞれ１．５９及び２．８５ｎＭのＥＣ５０）。

【0114】

アッセイにおいてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及びＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用を遮断するＡＺＤ２９３６の活性を、ＣＨＯ－Ｋ１ ＯＫＴ３ ＰＤ－Ｌ１ ＣＤ１５５細胞及びＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞 ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター細胞を用いて試験した。ＡＺＤ２９３６は、５．８２ｎＭの平均ＥＣ５０（２つの別々の実験においてＥＣ５０は５．５７ｎＭ及び６．０７ｎＭ）で、２つの二連実験において活性を示した（図１０Ｃ及び表１１）。

【0115】

【表9】

ＥＣ_５０＝半数効果濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）；ＮＦＡＴ＝ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。ＥＣ_５０は、３つの反復から得られた平均値から導出した。

【0116】

【表10】

ＥＣ_５０＝半数効果濃度；ＮＦＡＴ＝ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。
ＥＣ_５０は、３つの反復から得られた平均値から導出した。

【0117】

【表11】

ＥＣ_５０＝半数効果濃度；ＮＦＡＴ＝ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。ＥＣ５０は、３つの反復から得た平均値から導出した。

【0118】

実施例４：ＯＥ２１腫瘍細胞死滅アッセイ
ＯＥ２１腫瘍細胞を死滅させるＡＺＤ２９３６の能力をインビトロアッセイ系で評価した。このセクションで使用される略語は以下の通りである：ＡＮＯＶＡ＝分散分析；ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス；ＥＢＶ＝エプスタイン・バーウイルス；ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着アッセイ；ＩＦＮ－γ＝インターフェロン－γ；ｎｓ＝有意でない；ＯＥ２１－ＶＰ＝ウイルスペプチド（ＶＰ）を発現するように操作されたヒト白人食道扁平上皮癌細胞株；ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞；ＰＤ－１＝ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ－ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＴＩＧＩＴ＝Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎｓ。

【0119】

ＨＬＡ適合、抗原特異的Ｔ細胞及び腫瘍細胞の共培養系、並びに
ウイルスペプチド抗原を安定に発現するＯＥ２１腫瘍細胞株の作製
腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅に対するＡＺＤ２９３６のインビトロ活性及び効力を評価するために、ＨＬＡ適合抗原特異的Ｔ細胞及び腫瘍細胞共培養モデルを作製した。ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性ヒト食道扁平上皮癌細胞株ＯＥ２１を、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１に結合することが知られている６つのウイルス抗原ペプチド（ＯＥ２１－ＶＰ）を発現するように操作した。利用した６種のウイルスペプチドは、ヒトエプスタイン・バーウイルスＬＭＰ２ ３５６－３６４ペプチド（ＦＬＹＡＬＡＬＬＬのアミノ酸配列； 配列番号２９）、ＬＭＰ２ ４２６－４３４（ＣＬＧＧＬＬＴＭＶのアミノ酸配列； 配列番号３０）、ＢＭＬＦ１ ２８０－２８８（アミノ酸配列ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ； 配列番号３１）、インフルエンザＭ１ ５８－６６（アミノ酸配列ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ； 配列番号３２）、Ａ型インフルエンザＰＡ４６－５４（アミノ酸配列ＦＭＹＳＤＦＨＦＩ； 配列番号３３）、及びサイトメガロウイルスｐｐ６５ ４９５－５０３（アミノ酸配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ； 配列番号３４）とした。構成的ヒトユビキチン－Ｃプロモーターから駆動されるウイルスペプチド及びＧＦＰレポーターカセットをコードする導入遺伝子を、遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ^ＴＭ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）によって生成した。標準的な分子生物学技術を用いて、導入遺伝子をレンチウイルス発現ベクターに挿入した。次いで、配列を検証した導入遺伝子構築物を使用して、ｐＰＡＣＫＨ１ ＨＩＶレンチベクターパッケージングキット（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）プロデューサー細胞株からレンチウイルス粒子を生成した。単一細胞導入遺伝子過剰発現クローン株を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選択してＧＦＰ＋細胞を単離し、均一な導入遺伝子発現プロファイルを示す細胞株をバンクし、更なる特徴付けのために以降用いた。

【0120】

ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性健常ドナーからのＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号３１）及びＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号３４）ペプチド特異的Ｔ細胞の増殖
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、活性化マーカーについてフローサイトメトリーを使用して、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１ ２８０－２８８ペプチド（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）及びＣＭＶ ｐｐ６５ ４９５－５０３ペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）に対する反応性についてスクリーニングした。簡潔には、ＰＢＭＣを１μｇ／ｍＬのペプチド及び５５国際単位（ＩＵ）／ｍＬのＩＬ－２で７日間処理し、その後、蛍光コンジュゲートしたＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５、及びＴＩＭ３抗体で染色し、結合についてフローサイトメトリーによって評価した。ドナーは、＞１０％のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ２５及びＴＩＭ－３の両方に対して陽性に染色される場合に、ＥＢＶ又はＣＭＶ反応性として同定した。

【0121】

ＥＢＶ ＢＭＬＦ１ ２８０－２８８ペプチド又はＣＭＶ ｐｐ６５ ４９５－５０３ペプチドに対して反応性のＰＢＭＣを、ＥａｓｙＳｅｐ^ＴＭＤｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせたＲｏｂｏＳｅｐ^ＴＭ－Ｓ自動細胞分離装置ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を製造業者の指示に従って使用して健常ドナー（ＨＬＡ Ａ^＊０２：０１陽性）血液から単離した。図１Ｂに示されるように、次いで、単離されたＰＢＭＣを、１μｇ／ｍＬペプチド（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び５５ ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下で、ＲＰＭＩ－１６４０^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）及びＡＩＭ－Ｖ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）の１：１混合物、５％ＨＩヒト血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する完全ＲＰＭＩ培養培地中に１．５×１０^７細胞／ｍＬで３０分間再懸濁し、その後、Ｇ－Ｒｅｘ６（登録商標）Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で、１ウェルあたり４０ｍＬのＩＬ－２培地で、３７℃、５％ ＣＯ２で７日間培養した後、分析した。

【0122】

ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号３１）及びＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号３４）ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析
増殖させたＰＢＭＣを、ＬＳＲ ＩＩ（登録商標）装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーによって分析して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を定量した。増殖後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２（Ｇｉｂｃｏ）、２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ））で洗浄し、蛍光標識したＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ又はＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶデキストラマー（ＩｍｍｕＤｅｘ（商標））と共に室温で３０分間インキュベートした。異なる細胞集団を区別するために、ＰＢＭＣを更に蛍光標識抗ＣＤ３（クローンＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８（クローンＨＩＴ８Ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＰＤ－１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び抗ＴＩＧＩＴ（クローンＡ１５１５３Ｇ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（商標））で共染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、フローサイトメトリーによって結合抗体の検出について細胞を分析した。細胞表面に結合した抗体の数を、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。増殖後の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（シングレット、デブリなし、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋及びＧＬＣＴＬＶＡＭＬ又はＮＬＶＰＭＶＡＴＶデキストラマー陽性に基づいてゲーティングされた）のパーセンテージを、下式を用いて決定した：

【0123】

抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数＝Ａ×（Ｂ／１００）；
式中、Ａは収集された細胞の総数であり、Ｂはデキストラマー陽性であるシングレット、デブリなし、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の％である。

【0124】

Ｔ細胞死滅アッセイ
腫瘍細胞の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞死滅を改変するＡＺＤ２９３６の能力を測定するために、共培養アッセイ系を開発した。Ａｇｉｌｅｎｔ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ（登録商標）プラットフォームを利用して腫瘍細胞溶解を評価し、それによって、細胞インピーダンスの喪失を腫瘍細胞死の代用として使用した（Ｏｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１４；５：６４３）。簡単に説明すると、トリプシンを用いてＯＥ２１－ＶＰ細胞を細胞培養フラスコから採取し、完全ＲＰＭＩ（商標）培養培地で１回洗浄し、完全ＲＰＭＩ（商標）培地に再懸濁し、９６ウェルＲＴＣＡ Ｅ－Ｐｌａｔｅｓ（登録商標）の各ウェルに１０，０００細胞／ウェルで加えた。腫瘍細胞を、製造業者の指示に従って、５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間、Ｅ－Ｐｌａｔｅ（登録商標）中で培養した。試験物品及び対照物品を、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を最適化されたエフェクター対標的比率（Ｅ：Ｔ）で添加する直前にウェルに添加したが、これは、本試験において利用した各ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞集団について予め決定されたものである（２：１のエフェクターＴ細胞対腫瘍標的の比）。腫瘍細胞の死及び細胞溶解の％を、Ｔ細胞添加後３～８日の範囲にわたってモニタリングし（ドナー依存性）、値を、ＲＴＣＡ Ｐｒｏ（登録商標）ソフトウェアを製造業者の指示に従って使用して計算した。

【0125】

ＥＣ５０値の分析
細胞インピーダンスの損失をＲＴＣＡ ＰＲＯ（登録商標）ソフトウェア（Agilent）で計算し、その際、腫瘍細胞死滅のマーカーとしてリアルタイム細胞インピーダンスを測定した。リアルタイム細胞溶解の曲線下面積（細胞溶解^＊時間）を決定し、試験物品又は対照物品の単独を含まないＴ細胞共培養と比較して、０．０００１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の濃度での試験物品及び対照物品共培養について、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）においてＥＣ５０値を計算するためにプロットした（ベースライン効果）。Ｔ細胞添加の６日後に生じる試験完了まで、インピーダンスを１０分毎に連続的に測定した。

【0126】

共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度の測定
ＯＥ２１－ＶＰ腫瘍細胞及び腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する共培養物の上清内で検出されたＩＦＮ－γの量を評価するために、別々の並行共培養物を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ＲＴＣＡ Ｅ－Ｐｌａｔｅｓ（登録商標）と一緒にＮｕｎｃ ９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で確立した。ＩＦＮ－γ放出の評価のために、Ｎｕｎｃ ９６ウェルプレート中の共培養物から２４時間後に上清を回収した。ＩＦＮ－γレベルの比較を、２００ｐＭ濃度の試験物品及び対照物品で評価した。ヒトＩＦＮ－γに対するＭｅｓｏｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙマルチスポットＥＬＩＳＡを製造業者の指示に従って使用して、ＩＦＮ－γを測定した。

【0127】

統計的方法
細胞溶解及びＩＦＮ－γ放出については、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＰｒｉｓｍ（登録商標）、バージョン８．０．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で統計分析を行った。一元配置分散分析（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、真球度仮定（差異の等しい変動性）、テューキーの多重比較検定を行った。対数用量 対 正規化応答を使用して、ＥＣ５０値を非線形フィット曲線でモデル化した。ＡＺＤ２９３６処理群と抗ＰＤ－１処理群との間のＥＣ５０値の差を評価するために、ＥＣ５０値を対数変換し、対のない両側スチューデントｔ検定を使用して群平均を比較し、２群について不等分散を仮定して評価した。ｐ値は、各図において、有意でない（ｎｓ）ｐ＞０．０５、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【0128】

ＣＤ８陽性Ｔ細胞を５人の健康なヒトドナーから収集し、プールした。ＥＢＶ又はＣＭＶペプチドで増殖させた初代ヒトＰＢＭＣを、試験物品及び対照物品（０．２ｎＭアイソタイプ対照、０．２ｎＭ抗ＰＤ－１、０．２ｎＭ抗ＴＩＧＩＴ、０．１ｎＭ抗ＰＤ－１＋０．１ｎＭ抗ＴＩＧＩＴ、又は０．２ｎＭ ＡＺＤ２９３６）及びＯＥ２１－ＶＰ腫瘍細胞と共培養した。

【0129】

図１１Ａは、このＣＤ８ Ｔ細胞媒介性インビトロ細胞死滅アッセイにおいて、ＡＺＤ２９３６が抗ＰＤ－１よりも高い活性を有したことを示す。図１１Ａに示されるように、ＡＺＤ２９３６は、抗ＰＤ１抗体単独の投与と比較して、ＯＥ２１－ＶＰ腫瘍細胞死滅の有意な改善を示す。

【0130】

抗原認識の際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗腫瘍免疫及びＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性効果を更に促進するサイトカインであるＩＦＮ－γを分泌する（Ｂｈａｔ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．， ２０１７ Ｊｕｎ １；８（６）：ｅ２８３６）。したがって、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＥ２１－ＶＰ細胞と共培養した後に、ＩＦＮ－γ放出を評価した。

【0131】

ＥＢＶ又はＣＭＶペプチドで増殖させた初代ヒトＰＢＭＣを、試験物品及び対照物品（０．２ｎＭアイソタイプ対照、０．２ｎＭ抗ＰＤ－１、０．２ｎＭ抗ＴＩＧＩＴ、０．１ｎＭ抗ＰＤ－１＋０．１ｎＭ抗ＴＩＧＩＴ、又は０．２ｎＭ ＡＺＤ２９３６）及びＯＥ２１－ＶＰ腫瘍細胞と共培養した。Ｔ細胞及び腫瘍細胞共培養アッセイのＩＦＮ－γの濃度を、Ｔ細胞添加の２４時間後に収集した上清から測定した。結果を図１１Ｂに示す。ＩＦＮ－γの濃度を、ヒトＩＦＮ－γについてＭｅｓｏｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙマルチスポットＥＬＩＳＡを使用して決定した。アイソタイプ対照の平均と比較した全ての値の倍率変化を報告する。データは４人の異なるドナーを表す。統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。水平線は群内算術平均値を表す。^＊＊＊、ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。

【0132】

図１１Ｂに示されるように、４人の健常ドナーのＰＢＭＣから単離及び増殖させたＴ細胞の共培養物において、ＡＺＤ２９３６は、アイソタイプ対照及び抗ＰＤ－１と比較して、腫瘍細胞との共培養物の上清中のＩＦＮ－γの量を統計的に有意に増加させた。

【0133】

インビトロ細胞死滅アッセイも使用して、ＡＺＤ２９３６と抗ＰＤ－１抗体との間の細胞毒性の差を決定した。１０ｎＭから０．１ｐＭまでの抗体の濃度滴定は、ＡＺＤ２９３６についての算術平均ＥＣ５０が２１．９±３．４ｐＭ（ＳＤ）であり、抗ＰＤ－１については１６３±７０．６ｐＭ（ＳＤ）であることを示し（図１１Ｄ）、抗ＰＤ－１と比較してＡＺＤ２９３６の効力が６．４４倍増加した（図１１Ｃ）。

【0134】

実施例５：ＯＥ２１及びＰＣ９－ＭＡＲＴ１ヒト異種移植片腫瘍マウスモデル
ＯＥ２１腫瘍モデル及びＰＣ９－ＭＡＲＴ１腫瘍モデル（それぞれ、図１２Ａ～１２Ｄ及び１３Ａ～１３Ｄ）を使用して、腫瘍増殖を阻害するＡＺＤ２９３６の能力を調べた。ＡＺＤ２９３６の活性を、免疫不全非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ）ＩＬ－２受容体ガンマヌル（ＮＳＧ）マウスを使用して、ヒト腫瘍異種移植マウスモデルにおいて調査した。動物に、ＨＬＡ－Ａ^＊２：０１によって提示されるペプチド抗原を発現するように操作されたヒト癌性細胞株を皮下接種した。１つのモデルは、ウイルスペプチドを発現するように操作された食道癌細胞株であるＯＥ２１－ＶＰを利用した。別のモデルは、黒色腫抗原－１を発現するように操作された肺腺癌細胞株であるＰＣ９－ＭＡＲＴ１を利用した。

【0135】

腫瘍細胞株を皮下（ＳＣ）注射によってマウスの側腹部に注射し、腫瘍が約２００ｍｍ^３の体積に成長した後、各マウスに、腫瘍細胞株によって発現される抗原に特異的なヒトＴ細胞をＩＶ注射した。動物に、無作為化後２４時間以内に試験物品及び対照物品の初回用量を受けさせ、その後、試験物品及び対照物品の３回の追加用量を投与した。

【0136】

動物へのＡＺＤ２９３６の腹腔内投与は、図１２Ａ～１２Ｄ及び１３Ａ～１３Ｄに示すように、その親二価抗ＰＤ－１抗体（抗ＰＤ－１）、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＰＤ－１の組合せ、並びに無関係な抗原を標的とする二価アイソタイプ対照抗体Ｒ３４７（アイソタイプ対照）の活性と比較して、腫瘍の増殖を有意に阻害した。ＡＺＤ２９３６処置は、試験の全期間にわたって、及び異なる抗原特異性を有するＴ細胞を利用する２つの異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍増殖を阻害した。ＡＺＤ２９３６の抗癌活性は、２人の独立した健常ドナーに由来する腫瘍特異的Ｔ細胞を利用して生じさせた（それぞれ、ＯＥ２１－ＶＰａｎｄモデル及びＰＣ９－ＭＡＲＴ－１モデルについて）。

【0137】

実施例６：ＡＺＤ２９３６についてのエフェクター機能の特徴付け
治療用抗体は、臨床的有効性を発揮する２つのタイプの機能性、すなわちＦａｂドメインによる標的特異的結合及びＦｃドメインの相互作用を介した免疫媒介性エフェクター機能、に依存する。ＩｇＧ抗体がそれらのＦａｂドメインを介して細胞表面抗原に結合する場合、抗体のＦｃ部分は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）（古典的補体経路を誘発する抗体の第１のメンバー）に結合し得るか、又はナチュラルキラー及び他の骨髄性細胞上に発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と会合し得る。

【0138】

Ｃ１ｑとの相互作用は補体カスケードを開始し、その結果、細胞膜を破壊することによって標的細胞を死滅させる膜攻撃複合体が形成され、このプロセスは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として記載される。抗体のＦｃドメインとＦｃγＲＩＩＩａとの相互作用は、ＦｃγＲの架橋を誘導し、これが、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒の放出を誘発し、抗体の抗原結合ドメインによって結合された標的細胞の死、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれるプロセスをもたらす（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８：３４－４７，２００８）。ＡＺＤ２９３６は、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を減少させるためにそのＦｃドメイン内に変異を有するように操作された一価二重特異性ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。これらのＦｃ変異は、三重変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓである。ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞株を利用して、ＡＺＤ２９３６がＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を開始する能力を評価した。

【0139】

補体含有ヒト血清又は熱不活性化ヒト血清と一緒に、ＡＺＤ２９３６、ＩｇＧ１－ＴＭアイソタイプ対照、リツキシマブ、又はＩｇＧ１アイソタイプ対照と共にインキュベートした後に、生きているＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１４Ａ）又はＤａｕｄｉ細胞（図１４Ｂ）のパーセンテージを、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）の添加によって推定した。Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）は、各ウェル中の生細胞の数に比例する発光シグナルを生成する。これらの結果は、ＡＺＤ２９３６がＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１^＋ＴＩＧＩＴ^＋細胞においてＣＤＣを誘発しなかったことを示す（図１４Ａ）。逆に、ＣＤＣ活性を有することが知られている抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブは、ＡＺＤ２９３６を用いたアッセイで使用したのと同じヒト血清の存在下でＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞に対して濃度依存的効果を示したが、熱不活化血清対照の存在下では示さなかった（図１４Ｂ）。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、いずれの細胞型についても生存細胞のパーセンテージに対していかなる効果も有さなかった。熱不活性化血清を使用した試料は、生存率の濃度依存的減少をもたらさず、観察された細胞死がＣＤＣによって媒介されたことが確認された。

【0140】

エフェクター細胞として健常ドナー由来のＰＢＭＣ、並びに標的細胞としてＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞株を利用して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を評価した。このアッセイにおいて、ＡＺＤ２９３６は、アイソタイプ対照試料と同様の活性を示し、標的細胞としてＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞を使用した陽性対照リツキシマブと比較して、０．０６１ｎｇ／ｍＬを超える全ての対応濃度で、ＡＤＣＣ活性の統計的に有意な低下をもたらした（図１５）。本試験の結果は、ＡＺＤ２９３６が、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株に対してＡＤＣＣ又はＣＤＣを誘発しなかったことを示す。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3A】

【図3B-1】

【図3B-2】

【図4A】

【図4B-1】

【図4B-2】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【配列表】

2024517558000001.app

【国際調査報告】