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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】神経原線維変化の蛍光マーカーおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C09K 11/06 20060101AFI20240416BHJP
C07F 5/02 20060101ALI20240416BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20240416BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240416BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
C09K11/06 660
C09K11/06
C07F5/02 D
G01N21/64 F
G01N33/53 D
G01N33/533
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558943
(86)(22)【出願日】2022-04-20
(85)【翻訳文提出日】2023-09-25
(86)【国際出願番号】 IB2022053673
(87)【国際公開番号】W WO2022224151
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】102021000010382
(32)【優先日】2021-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522037470
【氏名又は名称】フォンダツィオーネ インスチトゥート イタリアーノ ディ テクノロジア
(71)【出願人】
【識別番号】523294308
【氏名又は名称】ディスラプティブ テクノロジカル アドバンシス イン ライフ サイエンス エッセ．エッレ．エッレ． － ソシエタ’ ベネフィット、イン フォルマ アブレヴィアータ、ディテールズ エッセ．エッレ．エッレ．エッセビ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ボッフィ、アルバート
(72)【発明者】
【氏名】ギルガ、フランチェスカ
(72)【発明者】
【氏名】ソロペルト、アレッサンドロ
(72)【発明者】
【氏名】ディ アンジェラアントニオ、シルビア
【テーマコード（参考）】
2G043
4H048
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043DA02
2G043EA01
4H048AA03
4H048AB92
4H048AC25
4H048VA11
4H048VA32
4H048VA77
4H048VB10
(57)【要約】
本発明は、タウタンパク質に選択的に結合する新規な蛍光マーカー、その使用、対象の網膜におけるタウタンパク質の神経原線維変化を撮像するための方法、ならびに前記方法の実施を可能にする装置に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ【化1】
のタウタンパク質に選択的に結合する蛍光マーカーであって、
式中、ＸおよびＹが、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである、
上記蛍光マーカー。
【請求項2】
ＸおよびＹが、芳香族パラ置換環によって、または芳香族１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである、
請求項１に記載の蛍光マーカー。
【請求項3】
Ｒが、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ３）、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（Ｐｈ）２、イミダゾール、モルホリン、ピペラジンである、請求項２に記載の蛍光マーカー。
【請求項4】
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジフェニルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－アミノスチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（メチルアミノ）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（ピロリジン－１－イル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－モルホリノスチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ピペラジン－１－イル）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド
から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項5】
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイドである、請求項４に記載の蛍光マーカー。
【請求項6】
３５０～６５０ｎｍの励起波長および４５０～８００ｎｍの発光波長を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項7】
ｉ．４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンを式ＩＩ【化2】
（式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである）
のアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合反応に供する段階と、
ｉｉ．段階ｉで得られた溶液を液液抽出（ＬＬＥ）に供し、続いて精製段階により、前記式Ｉの蛍光マーカーを提供する段階と
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の蛍光マーカーの調製方法。
【請求項8】
段階ｉ．が、ピペリジンおよび酢酸の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記式ＩＩのアルデヒドが、トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒドである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
段階ｉｉが、ｉｉ．ａ 段階ｉで得られた溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液（ＮＨ４Ｃｌ）を添加する段階と、
ｉｉ．ｂ 段階ｉｉ．ａで得られた混合物を液液抽出（ＬＬＥ）に供する段階と、
ｉｉ．ｃ 段階ｉｉ．ｂで得られた水相を分離する段階と、
ｉｉ．ｄ 段階ｉｉ．ｂで得られた有機相を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水する段階と、
を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーと、１つ以上の追加の賦形剤および／または担体とを含む組成物。
【請求項12】
経口組成物または眼科用組成物の形態の、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
タウタンパク質の神経原線維変化の検出に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１もしくは１２に記載の組成物。
【請求項14】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１に記載の前記蛍光マーカーを含む組成物を、前記蛍光マーカーがタウタンパク質の神経原線維変化に結合する条件下で生体試料と接触させる段階と、前記生体試料に結合した前記蛍光マーカーを検出する段階と
を含む、タウタンパク質の神経原線維変化を検出するための方法。
【請求項15】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１もしくは１２に記載の前記蛍光マーカーを含む組成物を対象に投与する段階と、前記対象の網膜の非侵襲的蛍光撮像を実施する段階であって、前記蛍光マーカーからの蛍光の検出が、前記マーカーの前記網膜への結合を示す、段階と、
を含む、撮像方法。
【請求項16】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１に記載の前記蛍光マーカーを含む組成物を対象に投与し、複数の連続した時点ｔｉ（ｉは０～ｎである）において、前記対象の網膜上で非侵襲的定量的蛍光撮像を実施して、対応する蛍光値を得る段階と、時間の関数としての蛍光グラフを決定するために前記得られた蛍光値を使用する段階と
を含む、蛍光グラフを決定するための方法。
【請求項17】
前記連続した時点が、各時点と後続の時点との間の１週間もしくは複数週間、または１ヶ月もしくは複数ヶ月の期間によって隔てられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記非侵襲的蛍光撮像が、投与から３０分～１日後に実施される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記蛍光撮像が、３５０～６５０ｎｍに含まれる波長（λ）を有する光源を対象の網膜に照射し、前記蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出および／または定量することによって行われる、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記蛍光マーカーまたは前記組成物が、経口投与されるか、または眼軟膏もしくは点眼剤の形態で投与される、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タウタンパク質の神経原線維変化に選択的に結合する新規な蛍光マーカー、該マーカーを含む組成物、その使用、対象の網膜におけるタウタンパク質の神経原線維変化を撮像するための方法、ならびに該方法の実施を可能にする装置に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老人性認知症の症例の８０％超を占める神経変性疾患である。ＡＤの発症機序の根底にある限られた科学的証拠では、標的化された有効な治療法および診断を開発することが困難であり、今日まで、高リスク患者の生活の改善または医療費の削減を可能にする有効な予防を保証する解決策は見出されていない［Ｇｒａｈａｍ Ｖ．Ｗ．ら、２０１７］。発症機序を解明するための多数の研究および製薬業界の努力にもかかわらず、ＡＤを治療するかまたは症状の進行を有意に遮断する有効な治療法は依然として存在しない［Ｍａｓｔｅｒｓ Ｃ．Ｌら、２０１５；Ｇｒａｈａｍ Ｖ．Ｗ．ら、２０１７］。その結果、ＡＤを予防することができる治療戦略を開発するために、研究は、この疾患の正確な、好ましくは早期の、および特異的な診断方法の研究に焦点を当ててきた。脳脊髄液分析（ＣＳＦ）［Ｏｌｓｓｏｎ Ｂ．ら、２０１６］および診断用神経画像技術［Ｐｉｅｔｒｚａｋ Ｋ．ら、２０１８］の導入後、多くの進歩があった。
【0003】
これらの技術により、ＡＤに関連する脳およびバイオマーカーにおける機能的変化の存在を研究できる。
【0004】
しかしながら、これらの技術は、比較的特異的かつ選択的であるにもかかわらず、多くの制限（非常に高価で侵襲的であり、認知障害が既に進行している場合にのみ明らかな陽性結果を提供する）があり、したがって、唯一の診断ツールとして使用することができず、病態生理学的形質の死後評価に関連付けられなければならない。
【0005】
ＡＤについて３つの主要なバイオマーカーが同定されている。
βアミロイド斑の主成分であるＡβ４２ペプチド、
該高リン酸化タンパク質の結合単位（Ｐ－Ｔａｕ）、および
神経原線維変化（ＮＦＴ）の重要な要素である総タウ単量体（ｔ－タウ）。
βアミロイド斑の主成分であるＡβ４２ペプチド、
該高リン酸化タンパク質の結合単位（Ｐ－Ｔａｕ）、および
神経原線維変化（ＮＦＴ）の重要な要素である総タウ単量体（ｔ－タウ）。
【0006】
近年、認知症患者におけるβアミロイド斑の存在および量は、疾患自体の進行および臨床症状に完全には関連し得ないことが示されている。対照的に、多くの研究により、タウタンパク質の神経原線維変化の数と疾患進行とのより厳密な相関が示されている。
【0007】
これに関して、ＡＤバイオマーカーを同定するためのいくつかの蛍光プローブが文献に記載されており、および／または特許されているが、これらのうちの限られた数だけがタウタンパク質の凝集体に対してインビボで高度に選択的であり、今日まで、タウ特異的フルオロフォアは市販されていない。したがって、タウタンパク質のＮＦＴに高度に選択的に結合することができる新しいクラスのフルオロフォアを同定する必要性が強く感じられている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、式Ｉ
のタウタンパク質に選択的に結合する新規な蛍光マーカーを提供し、
式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである。
【化1】
のタウタンパク質に選択的に結合する新規な蛍光マーカーを提供し、
式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである。
【0009】
本明細書の実験の項で報告されたデータから明白であるように、本発明者らは、式Ｉの蛍光マーカー、特に本明細書ではＢＴ１－ＢＴ４およびＢＴ６として定義される蛍光化合物が、微小管結合タウタンパク質のＲ３領域に存在し、かつタンパク質自体が原線維に集合する傾向を担う、ＰＨＦ６断片の６量体モデルに対して高い結合親和性を有することを見出した。
【0010】
以下に示すインビトロアッセイによって得られた結果は、該蛍光化合物が、タウタンパク質の神経原線維凝集物に選択的に結合することができる新規で有効なマーカーであることを明確に示している。
【0011】
本発明はさらに、式Ｉの蛍光マーカーを調製するための方法、ならびに該マーカーを使用する撮像方法を提供する。
【0012】
有利には、本発明の蛍光マーカーは、血液脳関門の効率的な透過および網膜内のタウタンパク質の神経原線維変化に結合する能力を実証する。神経原線維タウ変化はタウオパチーに関連するため、対象の網膜における神経原線維変化の検出は、タウオパチーの診断における関連情報として、またはタウオパチーの診断を補助するために使用することができる。
【0013】
現在、タウ神経原線維変化を検出する従来の方法のほとんどは、脳組織の死後分析に基づいている。タウオパチーの早期診断に対する１つの主要な課題は、これらが一般に脳内の異常なタウ沈着の免疫組織化学的実証だけでなく、脳内の他の非タウタンパク質の有無および量の検出、ならびに脳の異なる領域におけるタウの形態学的特徴の研究も含むため、従来の診断方法の複雑性によって表される。
【0014】
有利には、本発明の蛍光マーカーは、血液脳関門を通過するそれらの能力と共に、タウタンパク質の神経原線維変化に対するそれらの高い親和性および特異性のおかげで、新規な撮像方法を提供するために使用することができ、タウオパチーの効果的で非侵襲的な早期診断を可能にする情報を得るために専門家によってその後分析することができる画像、またはタウオパチーの医学的治療の有効性の評価および／もしくはタウオパチーの進行の評価に使用することができる画像を提供する。
【0015】
したがって、本発明の対象は、
－式Ｉ
の蛍光マーカー
（式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールであり、該マーカーは、タウタンパク質神経原線維変化に選択的に結合する）、
－式Ｉ
【化2】
の蛍光マーカー
（式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールであり、該マーカーは、タウタンパク質神経原線維変化に選択的に結合する）、
【0016】
－ｉ．４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンを式ＩＩ
（式中、ＸおよびＹが、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである）
のアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合反応に供する段階と、
ｉｉ．段階ｉで得られた溶液を液液抽出（ＬＬＥ）に供し、続いて精製段階により、式Ｉの前記蛍光マーカーを得る段階と
を含む、式Ｉの蛍光マーカーの調製方法、
【化3】
（式中、ＸおよびＹが、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである）
のアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合反応に供する段階と、
ｉｉ．段階ｉで得られた溶液を液液抽出（ＬＬＥ）に供し、続いて精製段階により、式Ｉの前記蛍光マーカーを得る段階と
を含む、式Ｉの蛍光マーカーの調製方法、
【0017】
－式Ｉの蛍光マーカーと、１つ以上の追加の賦形剤および／または担体とを含む組成物、
【0018】
－タウタンパク質の神経原線維変化の検出に使用するための、本明細書で定義される式Ｉの蛍光マーカーまたは式Ｉのマーカーを含む組成物、
【0019】
－式Ｉの蛍光マーカーまたは式Ｉの蛍光マーカーを含む組成物を、該蛍光マーカーがタウタンパク質の神経原線維変化に結合する条件下で生体試料と接触させる段階と、
該生体試料に結合した式Ｉの蛍光マーカーを検出する段階と
を含む、タウタンパク質の神経原線維変化を検出するための方法、
該生体試料に結合した式Ｉの蛍光マーカーを検出する段階と
を含む、タウタンパク質の神経原線維変化を検出するための方法、
【0020】
－本明細書に記載されるように式Ｉの蛍光マーカーまたは式Ｉの蛍光マーカーを含む組成物を対象に投与する段階と、
該対象の網膜の非侵襲的蛍光撮像を実施する段階と（式Ｉの該マーカーからの蛍光の検出が、該マーカーの網膜への結合を示す）
を含む、撮像方法、
該対象の網膜の非侵襲的蛍光撮像を実施する段階と（式Ｉの該マーカーからの蛍光の検出が、該マーカーの網膜への結合を示す）
を含む、撮像方法、
【0021】
－式１の蛍光マーカーまたは式１の蛍光マーカーを含む組成物を対象に投与し、複数の連続した時点ｔｉ（ｉは０～ｎである）において、該対象の網膜上で非侵襲的定量的蛍光撮像を実施して、対応する蛍光値を得る段階と、
得られた蛍光値を使用して蛍光グラフを決定する段階と
を含む、蛍光グラフを決定するための方法、
得られた蛍光値を使用して蛍光グラフを決定する段階と
を含む、蛍光グラフを決定するための方法、
【0022】
－対象の網膜におけるタウタンパク質の神経原線維変化の量の進行を監視するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上で実行されると、時点ｔ０での第１の蛍光値ｆ０および１つ以上の時点ｔｎでの１つ以上の蛍光値ｆｎを提供する命令リストを含み（ｎは、０より大きい整数であり、その後の各時点ｔｎで漸進的に増加し、各ｔｎは、ｔ０後の時点に対応し、該値は本明細書で定義される方法のいずれかで得られる）、
該値の各々をｆ０からｆｎまで漸進的に比較する段階と、
各ｆｎ蛍光値が、ｆ０より低く、上記ｆｎより低い場合に、該神経原線維変化量の減少を検出する段階と、
各ｆｎ蛍光値が、ｆ０より高く、上記ｆｎより高い場合に、該神経原線維変化量の増加を検出する段階と、
各ｆｎ蛍光値が、ｆ０および上記ｆｎと同じまたは実質的に同じである場合に、該神経原線維変化量の変動が実質的に存在しないことを検出する段階と、
を実施する、コンピュータプログラム、
該値の各々をｆ０からｆｎまで漸進的に比較する段階と、
各ｆｎ蛍光値が、ｆ０より低く、上記ｆｎより低い場合に、該神経原線維変化量の減少を検出する段階と、
各ｆｎ蛍光値が、ｆ０より高く、上記ｆｎより高い場合に、該神経原線維変化量の増加を検出する段階と、
各ｆｎ蛍光値が、ｆ０および上記ｆｎと同じまたは実質的に同じである場合に、該神経原線維変化量の変動が実質的に存在しないことを検出する段階と、
を実施する、コンピュータプログラム、
【0023】
－対象の網膜における本発明の式Ｉのマーカーの蛍光レベルの自動測定のための装置であって、少なくとも（ｉ）該対象の網膜を照射するために発光するように構成された光源（該光は、３５０ｎｍ～６５０ｎｍに含まれる波長を有する）と、（ｉｉ）該光源で網膜を照射したときに、該蛍光マーカーによって発せられた蛍光を検出および／または定量化するように構成された光学ユニットとを備え、該装置が、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するように構成される、装置、
【0024】
－本明細書および特許請求の範囲に記載の方法のいずれかを実施するための本発明による装置の使用、
である。
である。
【0025】
本発明のさらなる利点、ならびに特徴および使用形態は、純粋に例として示されるいくつかの好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【0026】
用語解説
本発明のＢＯＤＩＰＹは、当技術分野で一般的に意図される意味を有し、すなわち、その分子がジピロメテン基Ｃ９Ｈ７Ｎ２に結合した二フッ化ホウ素基ＢＦ２からなる式Ｃ９Ｈ７ＢＮ２Ｆ２を有する化学化合物の技術的一般名であり、具体的には、ＩＵＰＡＣ命名法における化合物４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンである。一般名は、「ボロン－ジピロメテン」の略称である。
本発明のＢＯＤＩＰＹは、当技術分野で一般的に意図される意味を有し、すなわち、その分子がジピロメテン基Ｃ９Ｈ７Ｎ２に結合した二フッ化ホウ素基ＢＦ２からなる式Ｃ９Ｈ７ＢＮ２Ｆ２を有する化学化合物の技術的一般名であり、具体的には、ＩＵＰＡＣ命名法における化合物４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンである。一般名は、「ボロン－ジピロメテン」の略称である。
【0027】
芳香族および非芳香族という用語は、最先端で一般的に理解されている通りであり、したがって、それぞれ任意の芳香族複素環および任意の非芳香族複素環を示し得る。
【0028】
本明細書で使用される場合、「眼組織」という用語は、哺乳動物の眼および／または視神経の任意の組織、例えば網膜または黄斑および中心窩などの網膜周辺内の下部構造を含み得る。網膜は、網膜の内顆粒層および網膜の網膜神経節細胞のうちの１つ以上を含み得る。
【0029】
タウ１プローブは、Ｖｅｒｗｉｌｓｔ Ｐら、“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔａｕ Ｔａｎｇｌｅ－Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ＢＯＤＩＰＹ Ｕｎｉｖｅｒｓｅ．”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１７ Ｓｅｐ ２７；１３９（３８）：１３３９３－１３４０３による論文に記載されている構造である。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】式Ｉの化合物の一般式。
【図2】タウ原線維腔へのＢＴ１化合物の結合ポーズ。
【図3】（Ａ）ＢＴ１（１００μＭ）と３７℃で３０分間インキュベーションし、抗Ｔ２２抗体および抗ＡＴ８抗体で染色した後のインビトロで３０日目のヒトｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンを示す代表的な二値化蛍光画像。 （Ｂ）ＴＡＵ１（１００μＭ）と３７℃で３０分間インキュベーションし、抗Ｔ２２抗体および抗ＡＴ８抗体で染色した後のインビトロで３０日目のヒトｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンを示す代表的な二値化蛍光画像。 （Ｃ）上記の代表的画像の蛍光合成。ＢＴ１の蛍光画像は、検出において５５５／１５ｎｍフィルタを用いた５２０ｎｍでの励起を使用して得られ、ＴＡＵ１は、検出において５１０／５ｎｍフィルタを用いた４７０ｎｍでの励起を使用して得られた。両プローブが表示される。細胞核をＤＡＰＩで染色した。（Ｄ）プローブ特異性は、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して決定された総抗体強度のうちのＢＴ１またはＴＡＵ１によって覆われた領域内の抗体強度の比として算出される（ｎ＝３）。画像は、６０倍の倍率を使用してＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡で取得された。
【図4】（Ａ）ＢＴ１（１００μＭ）と３７℃で３０分間インキュベーションし、抗Ｔ２２抗体および抗ＡＴ８抗体で染色した後のインビトロで３０日目のヒトｉＰＳＣ由来の網膜神経節細胞を示す代表的な二値化蛍光画像。 （Ｂ）ＴＡＵ１（１００μＭ）と３７℃で３０分間インキュベーションし、抗Ｔ２２抗体および抗ＡＴ８抗体で染色した後のインビトロで３０日目のヒトｉＰＳＣ由来の網膜神経節細胞を示す代表的な二値化蛍光画像。 （Ｃ）上記の代表的画像の蛍光合成。ＢＴ１の蛍光画像は、検出において５５５／１５ｎｍフィルタを用いた５２０ｎｍでの励起を使用して得られ、ＴＡＵ１は、検出において５１０／５ｎｍフィルタを用いた４７０ｎｍでの励起を使用して得られた。両プローブが表示される。細胞核をＤＡＰＩで染色した。 （Ｄ）プローブ特異性は、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して決定された総抗体強度のうちのＢＴ１またはＴＡＵ１によって覆われた領域内の抗体強度の比として算出される（ｎ＝３）。画像は、６０倍の倍率を使用してＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡で取得された。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明者らは、ＢＩＯＤＩＰＹ由来分子の中から、式Ｉ
のタウタンパク質に選択的に結合する新規な蛍光マーカーを同定し、
式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または複素芳香族もしくは芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである。
【化4】
のタウタンパク質に選択的に結合する新規な蛍光マーカーを同定し、
式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または複素芳香族もしくは芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである。
【0032】
式Ｉの化合物は、タウタンパク質神経原線維変化（ＮＦＴ）に対して高い親和性を有する蛍光分子である。
【0033】
本発明の式Ｉの蛍光マーカーは、血液脳関門の効率的な透過を示す親油性化合物である。
【0034】
本発明の一実施形態は、上記で定義した式Ｉの蛍光マーカーに関し、ＸおよびＹは、芳香族パラ置換環または芳香族１，４二置換環によって連結された炭素原子である。
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立したヘテロ原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである。
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立したヘテロ原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである。
【0035】
本発明によれば、好ましい芳香族複素環は、ピロール、イミダゾールおよびピペリジンの中から選択される。
【0036】
本発明によれば、好ましい非芳香族複素環は、モルホリン、ピペラゾールおよびピロリジンの中から選択される。
【0037】
好ましい一実施形態では、Ｒは、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ３）、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（Ｐｈ）２、イミダゾール、モルホリン、ピペラジンから選択される。
【0038】
式Ｉの蛍光マーカーの非限定的な例としては、３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書、図面およびスキームにおいてＢＴ１とも呼ばれる）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジフェニルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ２とも呼ばれる）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－アミノスチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームではＢＴ３とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（メチルアミノ）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ４とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（ピロリジン－１－イル）ヘキサ－１，３，５トリエン－１－イル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームではＢＴ５とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－モルホリノスチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ６とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ピペラジン－１－イル）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ７とも呼ばれる）、
および３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームではＢＴ８とも呼ばれる）
が挙げられる。
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジフェニルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ２とも呼ばれる）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－アミノスチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームではＢＴ３とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（メチルアミノ）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ４とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（ピロリジン－１－イル）ヘキサ－１，３，５トリエン－１－イル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームではＢＴ５とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－モルホリノスチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ６とも呼ばれる）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ピペラジン－１－イル）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームにおいてＢＴ７とも呼ばれる）、
および３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（本明細書およびスキームではＢＴ８とも呼ばれる）
が挙げられる。
【0039】
したがって、式Ｉの蛍光マーカーは、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ１）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジフェニルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ２）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－アミノスチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ３）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（メチルアミノ）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ４）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（ピロリジン－１－イル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ５）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－モルホリノスチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ６）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ピペラジン－１－イル）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ７）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ８）
のうちの１つであり得る。
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ１）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジフェニルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ２）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－アミノスチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ３）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（メチルアミノ）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ４）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（ピロリジン－１－イル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ５）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－モルホリノスチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ６）、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ピペラジン－１－イル）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ７）、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド（ＢＴ８）
のうちの１つであり得る。
【0040】
蛍光マーカーＢＴ１～ＢＴ８の化学構造を以下のスキーム１に示す。
【0041】
【化5】
スキーム１－化合物ＢＴ１～ＢＴ８の構造
好ましい実施形態では、蛍光マーカーは、３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイドである。
【0042】
本発明の蛍光マーカーは、３５０～６５０ｎｍの励起波長および４５０～８００ｎｍの発光波長を特徴とする。
【0043】
本発明はさらに、既定の式Ｉの蛍光マーカーの調製方法であって、
ｉ．４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンを式ＩＩ
（式中、ＸおよびＹが、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または複素芳香族もしくは芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである）
のアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合反応に供する段階と、
ｉｉ．段階ｉで得られた溶液を液液抽出（ＬＬＥ）に供し、続いて精製段階により、式Ｉの前記蛍光マーカーを得る段階と
を含む、調製方法を提供する。
ｉ．４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンを式ＩＩ
【化6】
（式中、ＸおよびＹが、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または複素芳香族もしくは芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである）
のアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合反応に供する段階と、
ｉｉ．段階ｉで得られた溶液を液液抽出（ＬＬＥ）に供し、続いて精製段階により、式Ｉの前記蛍光マーカーを得る段階と
を含む、調製方法を提供する。
【0044】
一実施形態では、該クネーフェナーゲル反応は、溶媒としてトルエン（またはベンゼンまたはトリフルオロメチルベンゼン）を使用して、ピペリジン（またはピロリジン）および酢酸の存在下、Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋ条件下で行われる。クネーフェナーゲル反応は、還流下で２～４時間行われ得る。
【0045】
本発明の具体的な一実施形態では、上記方法の段階ｉｉは、以下の段階を含む。
ｉｉ．ａ段階ｉで得られた溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液（ＮＨ４Ｃｌ）を添加する段階、
ｉｉ．ｂ段階ｉｉ．ａで得られた混合物を液液抽出（ＬＬＥ）に供する段階、
ｉｉ．ｃ段階ｉｉ．ｂで得られた水相を分離する段階、
ｉｉ．ｄ段階ｉｉ．ｂで得られた有機相を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水する段階。
ｉｉ．ａ段階ｉで得られた溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液（ＮＨ４Ｃｌ）を添加する段階、
ｉｉ．ｂ段階ｉｉ．ａで得られた混合物を液液抽出（ＬＬＥ）に供する段階、
ｉｉ．ｃ段階ｉｉ．ｂで得られた水相を分離する段階、
ｉｉ．ｄ段階ｉｉ．ｂで得られた有機相を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水する段階。
【0046】
該液液抽出（ＬＬＥ）は、有機溶媒としてＤＣＭ（ジクロロメタン）を用いて行うことができる。
【0047】
本発明の一実施形態によれば、式Ｉの該蛍光マーカーを提供するための精製段階は、クロマトグラフィーによって行われる。具体的な一実施形態では、該精製は、以下の溶離剤混合物：ヘキサン：酢酸エチルを９：１の比で使用するフラッシュクロマトグラフィーによって行うことができる。
【0048】
上記方法の好ましい一実施形態では、式ＩＩの該アルデヒドは、トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒドである。
【0049】
該トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒドは、４－ブロモベンズアルデヒドを、適切な触媒および炭酸カリウムの存在下で４－ジメチルアミノスチレンとヘック反応させることによって得ることができる。
【0050】
４－ブロモベンズアルデヒドおよび４－ジメチルアミノスチレンから出発する該トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒドを製造するために使用することができる適切な触媒は、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で酢酸パラジウム（ＩＩ）（Ｐｄ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）をトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）と混合することによってその場で調製される触媒である。
【0051】
本発明はまた、本発明の少なくとも１つの蛍光マーカーと、場合により１つ以上の担体および／または賦形剤とを含む組成物に関する。
【0052】
適切な担体および／または賦形剤は、本発明の式Ｉの蛍光マーカーを溶解または安定に分散させることを可能にするという条件で、例えば、ＤＭＳＯなどの溶媒、好ましくは薬学的に許容される溶媒である。
【0053】
該組成物中の式Ｉの蛍光マーカーの濃度は、本発明の蛍光マーカーの種類に応じて調整することができる。一実施形態では、蛍光マーカーの濃度は、０．５マイクロモル～５０ミリモルの範囲であり得る。該組成物に含まれる賦形剤は、蛍光マーカーの所望の投与量が得られるように調整することができる。
【0054】
本発明の組成物は、好ましくは経口組成物の形態または眼科用組成物の形態である。
【0055】
経口組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、軟質または硬質ゼラチン、カプセル、錠剤、ロゼンジ、粉末、顆粒、丸剤、オレオゲルの形態であり得る。
【0056】
経口投与に適した組成物を調製するための、当技術分野で知られる任意の適切な担体または賦形剤を当業者が使用することができる。
【0057】
本発明による眼科用組成物は、点眼剤、眼軟膏または眼科用ローションの形態であり得る。
【0058】
眼科用組成物に適した組成物を調製するための、当技術分野で知られる任意の適切な担体または賦形剤を当業者が使用することができる。
【0059】
本発明の一態様では、タウタンパク質の神経原線維変化の検出に使用するための、式Ｉの蛍光マーカーまたは前述の蛍光マーカーを含む組成物に言及する。
【0060】
一実施形態において、本発明では、対象におけるタウタンパク質の神経原線維変化の検出に使用するための、式Ｉの蛍光マーカーまたは前述の蛍光マーカーを含む組成物に言及し、換言すれば、本発明ではまた、インビボでの対象におけるタウタンパク質の神経原線維変化の検出に使用するための、式Ｉの蛍光マーカーまたは前述の蛍光マーカーを含む組成物に言及する。
【0061】
本発明の一実施形態によれば、本明細書で教示される蛍光マーカーまたは組成物のいずれも、タウタンパク質の神経原線維変化の検出に使用するために、それを必要とする対象に投与することができる。上述のように、該検出は対象において行うことができ、侵襲的ツールなしでインビボで行うことができる。
【0062】
本発明のさらなる実施形態では、検出は、オルガノイドを含む適切な試料に対してインビトロで実施することができる。
【0063】
特に、本発明はさらに、
－式Ｉの蛍光マーカーまたは既定の式Ｉの蛍光マーカーを含む組成物を、該蛍光マーカーがタウタンパク質の神経原線維変化に結合する条件下で生体試料と接触させる段階と、
生体試料に結合した該蛍光マーカーを検出する段階と
を含む、タウタンパク質の神経原線維変化を検出するための方法を提供する。
－式Ｉの蛍光マーカーまたは既定の式Ｉの蛍光マーカーを含む組成物を、該蛍光マーカーがタウタンパク質の神経原線維変化に結合する条件下で生体試料と接触させる段階と、
生体試料に結合した該蛍光マーカーを検出する段階と
を含む、タウタンパク質の神経原線維変化を検出するための方法を提供する。
【0064】
上記の方法を用いて分析することができる生体試料の非限定的な例としては、眼組織、脳組織または嗅覚上皮が挙げられる。好ましい一実施形態では、該生体試料は眼組織である。
【0065】
一実施形態では、上記方法の接触段階は、３７℃の温度で行うことができる。蛍光マーカーが、分析される生体試料中に存在するタウタンパク質の神経原線維変化に選択的に結合するように、該接触段階では１０～１２０分に含まれる持続時間がある。
【0066】
該蛍光マーカーの存在下で生体試料をインキュベーションする期間は、適用される蛍光マーカーの量に依存するが、上述の範囲内である。一実施形態では、接触時間は３０分である。
【0067】
好ましくは、該接触段階において、本発明の蛍光マーカーは、０．５マイクロモル～５０ミリモルの範囲の濃度である。
【0068】
上記の方法は、該接触段階の後に、任意の過剰の該蛍光マーカーが生体試料から除去される洗浄段階をさらに含み得る。
【0069】
一実施形態では、生体試料内のタウタンパク質の神経原線維変化に結合した本発明の蛍光マーカーのいずれかの存在および／または量は、蛍光測定、好ましくは蛍光撮像によって決定することができる。
【0070】
蛍光撮像は、当技術分野で知られる蛍光撮像技術のいずれかに従って実施することができる。例えば、該生体試料内のタウタンパク質の神経原線維変化に対する本発明の蛍光マーカーの結合の定性的評価および／または定量的評価は、顕微鏡技術を使用して達成することができる。
【0071】
いくつかの実施形態では、上記の本発明方法の検出段階は、以下の段階をさらに含む。
該生体試料を光源で照射する段階（光源は、結合した蛍光マーカーからの蛍光発光を決定するのに適した波長（λ）を有する）、および
該蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出し、場合により定量する段階（該発光した蛍光が約４５０ｎｍ～８００ｎｍの範囲の波長を有する）。
該生体試料を光源で照射する段階（光源は、結合した蛍光マーカーからの蛍光発光を決定するのに適した波長（λ）を有する）、および
該蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出し、場合により定量する段階（該発光した蛍光が約４５０ｎｍ～８００ｎｍの範囲の波長を有する）。
【0072】
励起光源は、分析される生体試料の任意の他の成分の励起を回避するように狭い発光範囲を有することが好ましい。一実施形態では、光源は、約３５０～６５０ｎｍの範囲の波長を有し、好ましくは５５９ｎｍに等しい。
【0073】
本発明のさらに別の実施形態は、
－本明細書で定義されるように式Ｉの蛍光マーカーまたは該蛍光マーカーを含む組成物を対象に投与する段階と、
該対象の網膜の非侵襲的蛍光撮像を実施する段階と（該蛍光マーカーからの蛍光の検出が、該マーカーの網膜への結合を示す）
を含む、撮像方法に関する。
－本明細書で定義されるように式Ｉの蛍光マーカーまたは該蛍光マーカーを含む組成物を対象に投与する段階と、
該対象の網膜の非侵襲的蛍光撮像を実施する段階と（該蛍光マーカーからの蛍光の検出が、該マーカーの網膜への結合を示す）
を含む、撮像方法に関する。
【0074】
一実施形態では、本発明による式Ｉの蛍光マーカーまたは式Ｉの該蛍光マーカーを含む組成物は、経口投与または眼投与によって対象に投与することができる。
【0075】
好ましい実施形態では、本明細書で教示される蛍光マーカーまたは該蛍光マーカーを含む組成物のいずれかは、蛍光測定の少なくとも３０分から１日前に該対象に投与される。例として、投与は、蛍光測定の少なくとも１時間前、２時間前、少なくとも４時間前、少なくとも８時間前、巧みには少なくとも１２時間前、少なくとも１６時間前である。血液脳関門を効率的に透過するその能力のおかげで、本発明の式Ｉの蛍光マーカーは、投与後に網膜に到達し、その中に存在するタウタンパク質の神経原線維変化に選択的に結合することができる。
【0076】
該結合に必要な時間は、マーカーまたは組成物の投与のために選択された方法に応じて異なる。眼投与の形態での局所投与は、経口投与と比較して、その後の蛍光検出ステム（ｓｔｅｍ）のためのより短い時間を必要とするであろう。
【0077】
一実施形態では、本発明の蛍光マーカーは、単位投与量当たり０．５マイクロモル～５０ミリモルを含む量で投与される。
【0078】
本発明の方法による対象の網膜の蛍光撮像は、非侵襲的である限り、当技術分野で知られる任意の蛍光撮像技術によって実施することができる。非侵襲的蛍光撮像技術の非限定的な例には、走査レーザー検眼鏡検査（ＳＬＯ）、共焦点走査レーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）、または蛍光寿命撮像検眼鏡検査（ＦＬＩＯ）が含まれる。蛍光撮像は定性的または定量的であり得、換言すれば、単に蛍光の有無を示すことができ、または検出された蛍光の量を定量することができる。
【0079】
例として、網膜の非侵襲的蛍光撮像は、網膜内のタウタンパク質の神経原線維変化に結合した本発明の蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出および／または定量するための手段と共に、該対象の網膜を照射するための光源を使用することによって実施することができ、該発光蛍光は、約４５０～８００ｎｍの範囲の発光波長を有する。
【0080】
本明細書で使用される場合、「光源」は、対象の網膜を照射するように構成され得る任意の光源であり得、該対象の網膜内の本発明の結合した蛍光マーカーからの蛍光発光を決定するのに適した波長を有する。好ましい一実施形態では、該光源は、３５０～６５０ｎｍに含まれ、好ましくは５５９ｎｍに相当する波長を有する。
【0081】
本発明の一実施形態によれば、網膜内の本発明の結合した蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出および／または定量することは、蛍光検出および記録のために構成された任意の適切な装置によって行うことができる。適切な装置の例は、該対象の網膜の照射の結果として生成された蛍光を受け取り、網膜内のタウタンパク質の神経原線維変化に結合した式Ｉの蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出するように構成されたユニットを含む装置であり、すなわち網膜に結合した該蛍光マーカーの存在を識別し、および／またはその量を定量することを可能にする。該変化に捕捉された量が、その検出のために十分な蛍光を発光するのに十分であるため、本発明の蛍光マーカーは、網膜に結合した場合にのみ検出可能である。結合していない自由に拡散するマーカーは、その低い水溶性のために、観察される蛍光シグナルに寄与する可能性は低い。
【0082】
一実施形態では、装置は、適切な光源で照射される網膜に結合したマーカーによって発光された蛍光のカメラ画像を形成するように構成されたカメラを備えることができる。
【0083】
そのような装置は、収集された蛍光強度を分析し、専用のコンピュータプログラムおよび／または公衆に利用可能な任意の適切なソフトウェアを使用して、例えば、該結合したマーカーの平均蛍光強度値を算出することによって、網膜内の本発明の蛍光マーカーの定量的測定値を提供するようにプログラムされ得る。
【0084】
したがって、本発明の一実施形態では、上記の撮像方法は、網膜内のタウタンパク質のＮＦＴに結合した式Ｉの蛍光マーカーによって生成される蛍光のピーク強度を決定することを含み得る。タウタンパク質のＮＦＴに結合した蛍光マーカーの量は、該ピーク強度に基づいて決定することができる。
【0085】
例として、網膜内のタウタンパク質のＮＦＴに結合した本発明の式Ｉの蛍光マーカーは、ピコ秒レーザーパルスによって励起することができ、蛍光発光は、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）技術を使用して検出することができる。
【0086】
有利には、本発明の撮像方法を用いて対象の網膜の蛍光を検出して得られた画像をタウオパチーの診断に使用することができる。神経原線維タウ変化はタウオパチーに関連するため、網膜における神経原線維変化の検出は、診断のために、またはタウオパチーの診断を補助するために使用することができる。
【0087】
本明細書で使用される場合、「タウオパチー」という用語は、タウタンパク質が神経原線維または神経膠原線維変化（ＮＦＴ）に凝集すること、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、パーキンソン病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＤＢ）、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、リティコ－ボディグ病（グアムのパーキンソン認知症複合）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜腫症、後脳炎性パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、ならびに鉛脳症、結節性硬化症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症およびリポフスチン沈着症を含む神経変性疾患の部類を包含する。
【0088】
好ましい一実施形態では、該タウオパチーが、アルツハイマー病、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症、ピック病またはパーキンソン病から選択され、好ましくはアルツハイマー病である。
【0089】
本発明の一実施形態によれば、生体試料中のタウタンパク質の神経原線維変化を検出するための方法または本明細書に記載の任意の撮像方法は、タウオパチーの診断を補助するために、他の撮像技術、例えばアミロイドタンパク質を検出するための技術によって得られた結果と組み合わせることができる。
【0090】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１に記載の該蛍光マーカーを含む組成物を対象に投与し、複数の連続した時点ｔｉ（ｉは０～ｎである）において、該対象の網膜上で非侵襲的定量的蛍光撮像を実施して、対応する蛍光値を得る段階と、
得られた蛍光値を使用して時間の関数としての蛍光グラフを決定する段階と
を含む、蛍光グラフを決定するための方法。
得られた蛍光値を使用して時間の関数としての蛍光グラフを決定する段階と
を含む、蛍光グラフを決定するための方法。
【0091】
上述の方法を実施する際に、ｉ＝０の時点ｔｉは、監視が開始される時間を表す。ｉが０＋１～ｎまで増加する整数値である連続した時点ｔｉは、互いに後続する時点であり、それらの時間的連続はｉ値の増加によって示される。
【0092】
したがって、ｉ＝０の時点ｔｉは、監視が開始された時点であり、このｔｉでの網膜の式Ｉの蛍光マーカーの蛍光値は、網膜内の該蛍光の時間的進行を評価することができる開始蛍光値と考えることができる。
【0093】
網膜の非侵襲的定量的蛍光撮像は、時点ｔ１が時点ｔ２に先行し、時点ｔ３に先行するなどのように、ｉ＝０であるｔｉ後の時点およびｉ＝１～ｎへの進行で互いに続く時点において繰り返すことができる。
【0094】
したがって、上記の方法に従って後続の各ｔｉについて得られた画像内の蛍光値の比較を、時間の関数としての蛍光のグラフで詳述することができる。
【0095】
上記の方法によって提供されるようなグラフは、タウオパチーに対する医学的治療の有効性を評価するため、またはタウオパチーの時間的進行を評価するために有利に使用することができる。
【0096】
この場合、ｉ＝０の時間ｔｉは、医学的治療結果が監視される時間に対応し、これは有利には処置自体の開始前であり得るが、処置が既に開始された後であっても処置中の任意の時間に導入することができる。
【0097】
上記の方法によって提供されるグラフにおける蛍光の漸進的な減少または安定性は、タウオパチーの改善における医学的治療の有効性を示し得る。グラフの意味および関連する有効性の程度は、臨床専門家によるグラフの解釈によって評価することができる。
【0098】
上記の方法によって提供されるグラフにおける蛍光の漸進的な増加は、医学的治療の無効性を示し得る。グラフの意味および関連する無効性の程度は、臨床専門家によるグラフの解釈によって評価することができる。
【0099】
場合によっては、食習慣および生活様式の変更が、医学的治療を受ける前に対象に提案され得る。これらの場合、例えば、食習慣および生活様式の変化が疾患に良い影響を及ぼすか否かを確認するために、疾患の進行を経時的に監視することが有用であり得る。
【0100】
上記の方法によって提供されるグラフは、疾患に及ぼす該変化の影響を監視するために使用することができる。
【0101】
いずれにせよ、可能な治療効果が評価されるか否かにかかわらず、対象のタウオパチーの進行を監視することは、医師にとって興味深い可能性がある。
【0102】
したがって、本明細書に記載の蛍光グラフを決定する方法は、対象のタウオパチーの進行を監視するために有利に使用することができる。
【0103】
一般的な撮像方法の説明において式Ｉの蛍光マーカーまたは該蛍光マーカーを含む組成物の投与様式および投与量に関して以前に記載されたことは、上記の他の方法のいずれにも当てはまる。
【0104】
分析対象の網膜の非侵襲的定量的蛍光撮像は、本明細書で前述したものを含む、当技術分野で知られる非侵襲的蛍光撮像技術のいずれか１つに従って実施することができる。特に、本発明の好ましい一実施形態によれば、上記撮像方法のいずれにおいても、該蛍光撮像は、３５０～６５０ｎｍに含まれる波長（λ）を有する光源を前記対象の網膜に照射し、前記蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出および／または定量することによって行われる。
【0105】
網膜の蛍光撮像を含む上記の方法のいずれも、「正規化」、該対象の網膜から発光されたバックグラウンド自己蛍光に基づいて、タウタンパク質のＮＦＴに結合した本発明の蛍光マーカーの決定された量または蛍光レベルをさらに含み得る。本明細書で使用される場合、そのような「正規化」は、タウタンパク質のＮＦＴに結合した本発明の蛍光マーカーから発光される蛍光の量からバックグラウンド自己蛍光の量を差し引くことを含み、そのような量の比を決定することも含み、そのような正規化された結果を、タウタンパク質のＮＦＴに結合した本発明の式Ｉの蛍光マーカー量の正規化された尺度として使用することを含み得る。
【0106】
網膜におけるタウタンパク質の神経原線維変化の検出は、タウオパチーの早期かつ非侵襲的な診断を可能にし、本発明の蛍光マーカーの高い特異性は、変化の検出をより高感度かつ正確にし、それによって疾患の早期診断を改善する。
【0107】
それにより、本発明の撮像方法は、疾患の早期診断の後、通常は診断が不可能な段階での該疾患の適切な治療が続くタウオパチーの治療方法に使用することができる。
【0108】
さらに、本発明はまた、タウオパチーの治療方法も包含し、該方法では、医学的治療の有効性は、本発明によって提供される時間の関数としての蛍光のグラフの分析によって監視され、医学的治療は、該監視の結果に応じて、担当医によって継続、変動または変更される。
【0109】
以下の実験節は、限定ではなく例示のみを目的として提供され、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。特許請求の範囲は、説明の不可欠な部分である。
【実施例】
【0110】
例
例１－タウタンパク質神経原線維変化（ＮＦＴ）および分子ドッキングのための選択マーカーの設計
以下のスキーム２に示すように、１３～１９Åの電子供与体部分と受容体部分との間の距離および異なる極性を特徴とする、脂肪族アミン、環状および非または芳香族で終わる高度の共役系を有する３位で官能化されたＢＯＤＩＰＹコアからなる、ＢＴ１～ＢＴ８と呼ばれる一連の蛍光プローブが設計されている。
例１－タウタンパク質神経原線維変化（ＮＦＴ）および分子ドッキングのための選択マーカーの設計
以下のスキーム２に示すように、１３～１９Åの電子供与体部分と受容体部分との間の距離および異なる極性を特徴とする、脂肪族アミン、環状および非または芳香族で終わる高度の共役系を有する３位で官能化されたＢＯＤＩＰＹコアからなる、ＢＴ１～ＢＴ８と呼ばれる一連の蛍光プローブが設計されている。
【0111】
【化7】
スキーム２－化合物ＢＴ１～８の構造。
ＮＦＴに対する選択性を評価し、任意の異なる候補を除外するために、タンパク質自体が原線維に集合する傾向を担うＰＨＦ６断片の結晶構造に対してコンピュータで分子をスクリーニングした。微小管に結合するタウタンパク質のＲ３領域に存在するＰＨＦ６断片のヘキサペプチド３０６ＶＱＩＶＹＫ３１１の６量体モデルを、文献に報告された手順に従って、伸長および対称演算子を用いて構築した［Ｖｅｒｗｉｌｓｔ Ｐ．ら、２０１７］。
【0112】
ＰＤＢ－ＩＤ ５Ｋ７Ｎ．［ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｍ．Ｊ．ら、２０１７］によってコードされるペプチドの高分解能結晶構造を、６－Ｗｅｄを構築するためのモデル系として使用した。小分子のドッキングは、ペプチドモノマーによって形成された保存された両親媒性トンネルの内部で行った。ＡｕｔｏＤｏｃｋ４．２［Ｍｏｒｒｉｓ Ｇ．Ｍ．ら、２００９］を用いて分子ドッキングを行った。
【0113】
リガンドをＰｉｃｔｏ（ＯｐｅｎＥｙｅ）で描画し、続いてＯＭＥＧＡ（ＯｐｅｎＥｙｅ）を使用して三次元フォーマットに変換した。［Ｈａｗｋｉｎｓ ＰＣＤら、２０１０］ ＯｐｅｎＥｙｅおよびＡｕｔｏＤｏｃｋ４．２ソフトウェアは、ホウ素を含有する化合物をドッキングするための力場パラメータを提供せず、この理由から、ホウ素原子は炭素原子ハイブリダイズｓｐ３で置き換えられていることに留意されたい。ｐＨ ７．４分子のイオン化状態をＱＵＡＣＰＡＣ（ＯｐｅｎＥｙｅ）（ＱＵＡＣＰＡＣ ２．０．２．２：ＯｐｅｎＥｙｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎｔａ Ｆｅ，ＮＭ．Ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｙｅｓｏｐｅｎ．ｃｏｍ）で評価し、ＡｕｔｏＤｏｃｋと互換性のある特定のフォーマットＰＤＢＱＴをＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌ ＧＵＩ ［Ｍｏｒｒｉｓ Ｇ．Ｍ．ら、２００９］で生成した。
【0114】
各リガンドについて、遺伝的アルゴリズムの１０回の実行を行い、統計的に最も関連するドッキングポーズを、スコアの組み合わせ分析および目視検査によって決定した。
【0115】
タウ原線維腔へのＢＴ１化合物の結合ポーズを図２に示す。
【0116】
以下の表１は、化合物ＢＴ１～ＢＴ８について予測される結合親和性をまとめたものである。
ＢＴ１化合物は、インシリコ親和性、結合立体構造および極性に関して、タウタンパク質ＮＦＴの選択マーカーとして最も有望な化合物であることが分かった。
【表1】
ＢＴ１化合物は、インシリコ親和性、結合立体構造および極性に関して、タウタンパク質ＮＦＴの選択マーカーとして最も有望な化合物であることが分かった。
【0117】
例２－ＢＴ１化合物の設計および合成
要するに、ＢＴ１化合物の合成のために、合成の２段階戦略、すなわち、選択された市販のＢｏｄｉｐｙコアとトランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合が開発され、後者は、（スキーム３に示すように）反応の立体選択性を促進するために適切に選択された触媒の存在下で、４－ブロモベンズアルデヒドと４－ジメチルアミノスチレンと（両方とも市販されている）のヘック反応によって合成された。
要するに、ＢＴ１化合物の合成のために、合成の２段階戦略、すなわち、選択された市販のＢｏｄｉｐｙコアとトランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合が開発され、後者は、（スキーム３に示すように）反応の立体選択性を促進するために適切に選択された触媒の存在下で、４－ブロモベンズアルデヒドと４－ジメチルアミノスチレンと（両方とも市販されている）のヘック反応によって合成された。
【0118】
化学物質、試薬および分析方法
すべての試薬および溶媒は市販されており、さらに精製することなく使用されている。
すべての試薬および溶媒は市販されており、さらに精製することなく使用されている。
【0119】
シリカゲル（２３０～４００メッシュ）をカラムフラッシュクロマトグラフィーによる精製に使用した。すべての反応を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって監視し、ｆ２５４蛍光ゲルシリカプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ９９５６９）を使用した。融点Ｂ－４５４装置を用いて融点を決定した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、標準物質としてテトラメチルシレン（ＴＭＳ）を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ ４００ Ｕｌｔｒａ Ｓｈｉｅｌｄ（商標）装置（１Ｈ ＮＭＲについては４００ＭＨｚ、１３Ｃ ＮＭＲについては１００ＭＨｚ）で記録した。化学置換は、百万分率（ｐｐｍ）で報告される。多重度は、以下のように報告されている：一重項（ｓ）、二重項（ｄ）、三重項（ｔ）および多重項（ｍ）。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＸＱリニアイオントラップ質量分析計を用いて質量分析を行った。Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＡｐｅｘフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ－ＩＣＲ）を用いて、高分解能質量スペクトル（ＨＲ－ＭＳ）を記録した。
【0120】
合成手順
トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒド（２）化合物を、以下のスキーム３に示すヘック反応によって調製した。
トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒド（２）化合物を、以下のスキーム３に示すヘック反応によって調製した。
【0121】
【化8】
スキーム３－化合物２の合成
触媒をその場で調製した。酢酸パラジウム（ＩＩ）Ｐｄ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７５－３１－３）（１６．８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６０３－３５－０）（１９．７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に可溶である（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６８１２－２）。１０分後、４－ブロモベンズアルデヒド３（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１２２－９１－４）（２０２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノスチレン４（構成要素、Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０３９－８０－７０）（２６４．６ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５８４－０８－７）（４１４ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍｌ）の溶液を触媒溶液に添加した。反応物を８０℃で４時間撹拌したままにした。その後、反応物をＣＨ２Ｃｌ２（３回）で抽出し、有機相を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、減圧下で濃縮した。冷ヘキサン結晶化により、トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒド２化合物（１，０７４ｍｍｏｌ、２７０ｍｇ）を収率７２％で得た。
【0122】
黄色固体（収率７２％）。ｍｐ：２１８．０～２２０．０℃。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ９．９６（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ，２Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｓ，５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １９１．７５，１５０．７７，１４４．６９，１３４．６２，１３２．６６，１３０．４０，１２８．３３，１２６．３８，１２４．８６，１２２．８２，１１２．４０，４０．４７．ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１７Ｈ１８ＮＯの計算値２５２．１３、実測値２５２．１７。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ９．９６（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ，２Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｓ，５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １９１．７５，１５０．７７，１４４．６９，１３４．６２，１３２．６６，１３０．４０，１２８．３３，１２６．３８，１２４．８６，１２２．８２，１１２．４０，４０．４７．ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１７Ｈ１８ＮＯの計算値２５２．１３、実測値２５２．１７。
【0123】
化合物ＢＴ１は、クネーフェナーゲル縮合によって調製されている（以下のスキーム４）。
【0124】
【化9】
スキーム４－化合物ＢＴ１の合成
ピペリジン（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０－８９－４）（０．３５ｍｌ、６．１２ｍｍｏｌ）および酢酸（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６４－１９－７）（０．３５ｍｌ、３．５ｍｍｏｌ）の存在下で、４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インディセン（ＴＣＩ Ｅｕｒｏｐｅ １５４７９３－４９－４）（１００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）およびトランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒド（１１２．９５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を含むトルエン（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８－８８－３）１０ｍｌ溶液を１２０℃で２～４時間蒸留した。その後、ディーンスタークを除去した。反応物を室温にし、ＮＨ４Ｃｌ塩化アンモニウム水溶液５０ｍｌを添加した。続いて、水相をＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍｌ）で抽出し、有機相を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、減圧下で濃縮した。反応原料を、９：１比のヘキサン溶離液混合物：酢酸エチルを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。化合物３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロル［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイドＢＴ１（ｍｍｏｌ、ｍｇ）を収率３３％で得た。
【0125】
黒色固体（収率３３％）。ｍｐ：２５７～２６２℃。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）δ ７．６４－７．５６（ｍ，４Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．４７－７．４１（ｍ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，３Ｈ），７．２３（ｓ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），６．４９－６．４６（ｍ，１Ｈ），２．９９（ｓ，６Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １５９．６８，１４０．９３，１４０．７３，１３８．７５，１３４．６３，１３３．６９，１３１．０２，１３０．３０，１２９．００，１２８．４１，１２６．９６，１２６．１２，１２５．６３，１２３．６０，１２３．３６，１１８．８０，１１７．９６，１１７．８４，１１７．４２，１１６．７７，１１２．８０，４０．６８，３０．２６．ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ２６ＢＦ２Ｎ３の計算値４５３．２２、実測値４５４．３３。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）δ ７．６４－７．５６（ｍ，４Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．４７－７．４１（ｍ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，３Ｈ），７．２３（ｓ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝１６．２ Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），６．４９－６．４６（ｍ，１Ｈ），２．９９（ｓ，６Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １５９．６８，１４０．９３，１４０．７３，１３８．７５，１３４．６３，１３３．６９，１３１．０２，１３０．３０，１２９．００，１２８．４１，１２６．９６，１２６．１２，１２５．６３，１２３．６０，１２３．３６，１１８．８０，１１７．９６，１１７．８４，１１７．４２，１１６．７７，１１２．８０，４０．６８，３０．２６．ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ２６ＢＦ２Ｎ３の計算値４５３．２２、実測値４５４．３３。
【0126】
例３－インビトロ試験
ヒトｉＰＳＣの維持
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を、成長因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、希釈率１：１００）上のｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ ＣＯ２でクローン増殖によって維持した。
ヒトｉＰＳＣの維持
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を、成長因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、希釈率１：１００）上のｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ ＣＯ２でクローン増殖によって維持した。
【0127】
ヒトｉＰＳＣの網膜神経節細胞への分化
分化プロトコルは、若干の変更を加えたＳｌｕｃｈ Ｖ．ら、２０１７の改訂版であった。ヒトｉＰＳＣを、１×Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて単一細胞に解離させ、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ－２７６３２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓにおいて１０００細胞／ｍｍ２の密度で成長因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレートに播種した。播種日をマイナス２日（Ｄ－２）とした。
分化プロトコルは、若干の変更を加えたＳｌｕｃｈ Ｖ．ら、２０１７の改訂版であった。ヒトｉＰＳＣを、１×Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて単一細胞に解離させ、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ－２７６３２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓにおいて１０００細胞／ｍｍ２の密度で成長因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレートに播種した。播種日をマイナス２日（Ｄ－２）とした。
【0128】
翌日（Ｄ－１）、幹細胞培地を、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ［１：１］、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含む５０％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、およびビタミンＡを含まない２％ Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（すべてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）からなる神経原性基本培地（Ｎ２Ｂ２７）で完全に置き換えた。さらに２４時間後（Ｄ０）、新鮮なＮ２Ｂ２７培地に、２５μＭ フォルスコリン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１μＭ ドルソモルフィン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２．５μＭ ＩＤＥ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｍＭ ニコチンアミド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）からなる小分子の混合物を補充した。この段階で、前腹側前脳への幹細胞の拘束を増強するために、培地を毎日交換した。
【0129】
播種の約１週間後（Ｄ７）、均一でコンフルエントな神経上皮様シートが見え、細胞を１×Ａｃｃｕｔａｓｅで解離させ、Ｎ２Ｂ２７＋１０μＭ Ｒｏｃｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ中１０００／ｍｍ２の密度でポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニンコーティング（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）皿に播種した。翌日、培地を２５μＭ フォルスコリンおよび１０ｍＭ ニコチンアミドを含むＮ２Ｂ２７に切り替え、次の３～４日間毎日交換した。その後、Ｎ２Ｂ２７に２５μＭ フォルスコリン、１０ ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）のみを補充し、週に２回リフレッシュして網膜前駆細胞の増殖および増大を促進した。
【0130】
高密度コンフルエント状態（Ｄ１８～２０付近）に達すると、網膜前駆細胞シートを１×Ａｃｃｕｔａｓｅで解離させ、７００細胞／ｍｍ２の密度でポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニンコーティング皿に播種した。増殖状態からの脱出およびＲＧＣ成熟を強化するために、Ｎ２Ｂ２７培地に１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（播種のみ）、１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２５μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを補充し、培地を３０日～３５日目まで３日ごとに交換した。
【0131】
ヒトｉＰＳＣの皮質ニューロンへの分化
ドキシサイクリン誘発性ヒトＮＧＮ２遺伝子過剰発現に基づく２段階プロトコルを用いて、ヒトｉＰＳＣ－皮質ニューロンを分化させた。簡潔には、ヒトｉＰＳ細胞を１×Ａｃｃｕｔａｓｅで処理し、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ－２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ中、１０００細胞／ｍｍ２の密度で成長因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート上に播種した。播種日をマイナス３日（Ｄ－３）とする。播種の１日後（Ｄ－２）、培地を、２μｇ／ｍＬ ドキシサイクリン（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）が補充されるＤＭＥＭ／Ｆ１２ ［１：１］、１％ Ｎ２サプリメント、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸからなるＮ２培地に切り替えて、ヒトＮＧＮ２発現を誘導する。Ｎ２培地を毎日リフレッシュした。３日後（Ｄ０）、生まれたばかりのニューロンをＡｃｃｕｔａｓｅにより解離させ、ＰＤＬ／ラミニンコーティング皿に、５００細胞／ｍｍ２の密度で、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ビタミンＡを含む２％ Ｂ２７、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、０、５μｇ／ｍＬ ラミニン（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ ｎｇ／ｍＬ アスコルビン酸（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２μｇ／ｍＬ ドキシサイクリン、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ－２７６３２および１０μＭ ＤＡＰＴを補充した１０ ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）からなる成熟培地に播種した。２４時間後、Ｙ－２７６３２を除去し、ＤＡＰＴおよびドキシサイクリンを５日目まで培地に維持した。場合により、５μＭ Ａｒａ－Ｃ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を６日目から１０日目まで培地に添加して、非ニューロン増殖性細胞を除去した。その後、実験ウィンドウがＤ３０付近に達するまで、培地を毎週半分交換した。
ドキシサイクリン誘発性ヒトＮＧＮ２遺伝子過剰発現に基づく２段階プロトコルを用いて、ヒトｉＰＳＣ－皮質ニューロンを分化させた。簡潔には、ヒトｉＰＳ細胞を１×Ａｃｃｕｔａｓｅで処理し、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ－２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ中、１０００細胞／ｍｍ２の密度で成長因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート上に播種した。播種日をマイナス３日（Ｄ－３）とする。播種の１日後（Ｄ－２）、培地を、２μｇ／ｍＬ ドキシサイクリン（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）が補充されるＤＭＥＭ／Ｆ１２ ［１：１］、１％ Ｎ２サプリメント、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸからなるＮ２培地に切り替えて、ヒトＮＧＮ２発現を誘導する。Ｎ２培地を毎日リフレッシュした。３日後（Ｄ０）、生まれたばかりのニューロンをＡｃｃｕｔａｓｅにより解離させ、ＰＤＬ／ラミニンコーティング皿に、５００細胞／ｍｍ２の密度で、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ビタミンＡを含む２％ Ｂ２７、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、０、５μｇ／ｍＬ ラミニン（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ ｎｇ／ｍＬ アスコルビン酸（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２μｇ／ｍＬ ドキシサイクリン、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ－２７６３２および１０μＭ ＤＡＰＴを補充した１０ ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）からなる成熟培地に播種した。２４時間後、Ｙ－２７６３２を除去し、ＤＡＰＴおよびドキシサイクリンを５日目まで培地に維持した。場合により、５μＭ Ａｒａ－Ｃ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を６日目から１０日目まで培地に添加して、非ニューロン増殖性細胞を除去した。その後、実験ウィンドウがＤ３０付近に達するまで、培地を毎週半分交換した。
【0132】
ＢＯＤＩＰＹベースプローブによる染色
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン培養物を、１００μＭ ＴＡＵ１プローブまたは１００μＭ ＢＴ１プローブのいずれかと３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、室温で１５分間、作りたての４％ 冷ＰＦＡで固定した。
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン培養物を、１００μＭ ＴＡＵ１プローブまたは１００μＭ ＢＴ１プローブのいずれかと３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、室温で１５分間、作りたての４％ 冷ＰＦＡで固定した。
【0133】
タウ１プローブは、Ｖｅｒｗｉｌｓｔ Ｐら、“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔａｕ Ｔａｎｇｌｅ－Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ＢＯＤＩＰＹ Ｕｎｉｖｅｒｓｅ．”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１７ Ｓｅｐ ２７；１３９（３８）：１３３９３－１３４０３による論文に記載されている構造である。
【0134】
免疫細胞化学
固定されたｈｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンおよびＲＧＣを、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含む１×ＴＢＳで透過処理し、１×ＴＢＳ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および５％ヤギ血清（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するブロッキング溶液中で１時間インキュベーションした。したがって、細胞を、一次抗体を含有するブロッキング溶液中で４℃で一晩インキュベーションした。この試験で使用した一次抗体は、ヤギ抗ＰＨＦ－ｔａｕ Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５（ＡＴ８；希釈１：２００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびマウス抗オリゴマーＴＡＵ（Ｔ２２；希釈１：２００；Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）であり、続いて二次抗体（希釈１：１０００）と共に室温で１時間インキュベーションした。画像は、６０倍の水浸対物レンズを備えたＦＶ１０ｉ共焦点システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で取得した。視野当たりの蛍光強度は、ソフトウェアイメージＪを使用して決定した。
固定されたｈｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンおよびＲＧＣを、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含む１×ＴＢＳで透過処理し、１×ＴＢＳ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および５％ヤギ血清（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するブロッキング溶液中で１時間インキュベーションした。したがって、細胞を、一次抗体を含有するブロッキング溶液中で４℃で一晩インキュベーションした。この試験で使用した一次抗体は、ヤギ抗ＰＨＦ－ｔａｕ Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５（ＡＴ８；希釈１：２００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびマウス抗オリゴマーＴＡＵ（Ｔ２２；希釈１：２００；Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）であり、続いて二次抗体（希釈１：１０００）と共に室温で１時間インキュベーションした。画像は、６０倍の水浸対物レンズを備えたＦＶ１０ｉ共焦点システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で取得した。視野当たりの蛍光強度は、ソフトウェアイメージＪを使用して決定した。
【0135】
細胞内ＴＡＵ凝集体を特異的に染色するＢＴ１プローブの能力を、二値化プローブシグナル内で検出された抗体蛍光シグナルの関数として決定した。
【0136】
図３および図４は、インビトロで３０日後にｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンおよび網膜ニューロンの単層培養物で検出されたＴ２２抗体、ＡＴ８抗体およびＢＴ１またはＴＡＵ１プローブの二値化シグナルを示す。興味深いことに、ＢＴ１プローブは、Ｔ２２に関してＡＴ８シグナルとのより高い共局在化を示し、ＢＴ１プローブが、ＴＡＵのオリゴマー状態ではなく、リン酸化ＴＡＵイソ型で濃縮された細胞内凝集体を優先的に染色することを示している。
【0137】
さらに、ＢＴ１プローブは、ＴＡＵ１プローブと比較した場合、リン酸化凝集体を検出するより高い能力を示す。異なる性能ではあるが、ＢＴ１プローブによって示されるＡＴ８陽性凝集物の増強された検出は、ｉＰＳＣ由来皮質ニューロンとｉＰＳＣ由来網膜神経節細胞との間で保存されるが、ＴＡＵ１プローブの性能は同等である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2023-09-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ【化1】
のタウタンパク質に選択的に結合する蛍光マーカーであって、
式中、ＸおよびＹが、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである、
上記蛍光マーカー。
【請求項2】
ＸおよびＹが、芳香族パラ置換環によって、または芳香族１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、Ｒが、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、および
各置換基において、ＲＡが、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである、
請求項１に記載の蛍光マーカー。
【請求項3】
Ｒが、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ３）、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（Ｐｈ）２、イミダゾール、モルホリン、またはピペラジンである、請求項２に記載の蛍光マーカー。
【請求項4】
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジフェニルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－アミノスチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（メチルアミノ）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（ピロリジン－１－イル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－モルホリノスチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
５，５－ジフルオロ－１－メチル－３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ピペラジン－１－イル）スチリル）スチリル）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド、
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド
から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項5】
３－（（Ｅ）－４－（（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）スチリル）スチリル）－５，５－ジフルオロ－１－メチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］ ［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイドである、請求項４に記載の蛍光マーカー。
【請求項6】
３５０～６５０ｎｍの励起波長および４５０～８００ｎｍの発光波長を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項7】
ｉ．４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンを式ＩＩ【化2】
（式中、ＸおよびＹは、ＥもしくはＺの立体配置で二重結合によって、または芳香族もしくは複素芳香族のパラ置換環によって、または芳香族もしくは複素芳香族の１，４二置換環によって連結された炭素原子であり、
Ｒは、水素、ハロゲン、ＮＨ（ＲＡ）、Ｎ（ＲＡ）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＯＲＡ、ＯＣ（＝Ｏ）ＲＡ、ＳＲＡ、ＳＯ２ＲＡ、ＳＯ３ＲＡ、ＯＳＯ２ＲＡ、ＯＳＯ３ＲＡ、Ｃ（ＲＡ）３、またはＣ５－７芳香族もしくは脂肪族の複素環であり、各置換基において、ＲＡは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、ＣＦ３、窒素、酸素および硫黄の中から選択される最大３個の独立した複素原子を含むＣ１－７飽和または不飽和鎖、直鎖または分岐鎖、Ｃ５－７シクロアルキル、フェニル、Ｃ５－７複素環またはｎ－エチレングリコールである）
のアルデヒドとのクネーフェナーゲル縮合反応に供する段階と、
ｉｉ．段階ｉで得られた溶液を液液抽出（ＬＬＥ）に供し、続いて精製段階により、前記式Ｉの蛍光マーカーを提供する段階と
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の蛍光マーカーの調製方法。
【請求項8】
段階ｉ．が、ピペリジンおよび酢酸の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記式ＩＩのアルデヒドが、トランス－４－［２－（４－ジメチルアミノフェニル）ビニル］ベンズアルデヒドである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
段階ｉｉが、ｉｉ．ａ 段階ｉで得られた溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液（ＮＨ４Ｃｌ）を添加する段階と、
ｉｉ．ｂ 段階ｉｉ．ａで得られた混合物を液液抽出（ＬＬＥ）に供する段階と、
ｉｉ．ｃ 段階ｉｉ．ｂで得られた水相を分離する段階と、
ｉｉ．ｄ 段階ｉｉ．ｂで得られた有機相を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水する段階と、
を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーと、１つ以上の追加の賦形剤および／または担体とを含む組成物。
【請求項12】
経口組成物または眼科用組成物の形態の、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
タウタンパク質の神経原線維変化の検出に使用するための、請求項１１もしくは１２に記載の組成物。
【請求項14】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１に記載の組成物を、前記蛍光マーカーがタウタンパク質の神経原線維変化に結合する条件下で接触させた生体試料に結合した前記蛍光マーカーを検出する段階
を含む、タウタンパク質の神経原線維変化を検出するための方法。
【請求項15】
請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１もしくは１２に記載の組成物を投与された対象の網膜の非侵襲的蛍光撮像を実施する段階であって、前記蛍光マーカーからの蛍光の検出が、前記マーカーの前記網膜への結合を示す、段階、を含む、撮像方法。
【請求項16】
複数の連続した時点ｔｉ（ｉは０～ｎである）において、請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光マーカーまたは請求項１１に記載の組成物を投与された対象の網膜上で非侵襲的定量的蛍光撮像を実施して、対応する蛍光値を得る段階と、時間の関数としての蛍光グラフを決定するために前記得られた蛍光値を使用する段階と
を含む、蛍光グラフを決定するための方法。
【請求項17】
前記連続した時点が、各時点と後続の時点との間の１週間もしくは複数週間、または１ヶ月もしくは複数ヶ月の期間によって隔てられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記非侵襲的蛍光撮像が、投与から３０分～１日後に実施される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記蛍光撮像が、３５０～６５０ｎｍに含まれる波長（λ）を有する光源を対象の網膜に照射し、前記蛍光マーカーによって発光された蛍光を検出および／または定量することによって行われる、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記蛍光マーカーまたは前記組成物が、経口投与されるか、または眼軟膏もしくは点眼剤の形態で投与される、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。【国際調査報告】