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特表2024-517631乱流中で血小板を放出する方法、および当該方法を実施するための血小板放出システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】乱流中で血小板を放出する方法、および当該方法を実施するための血小板放出システム
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20240416BHJP
C12M 3/00 20060101ALN20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
C12M3/00 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563947
(86)(22)【出願日】2022-04-21
(85)【翻訳文提出日】2023-12-14
(86)【国際出願番号】 EP2022060554
(87)【国際公開番号】W WO2022223693
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】2104123
(32)【優先日】2021-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522122802
【氏名又は名称】エタブリスモン フランセ デュ サン
(71)【出願人】
【識別番号】511142062
【氏名又は名称】アンスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ レシェルシュ メディカル（アンセルム）
(71)【出願人】
【識別番号】509228260
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
(71)【出願人】
【識別番号】522122813
【氏名又は名称】アヴィニョン ユニベルシテ
(71)【出願人】
【識別番号】511134470
【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック
(71)【出願人】
【識別番号】522373448
【氏名又は名称】ウニヴェルシテ エクス マルセイユ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ Ｄ’ＡＩＸ ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
【住所又は居所原語表記】Ｊａｒｄｉｎ ｄｕ Ｐｈａｒｏ，５８ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｏｎ，１３００７ ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ（ＦＲ）
(71)【出願人】
【識別番号】515322183
【氏名又は名称】エコール・サントラル・ドゥ・マルセイユ
【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＣＥＮＴＲＡＬＥ ＤＥ ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ストラッセル，キャサリン
(72)【発明者】
【氏名】マロ，レア
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ サクラメント，バレンティン
(72)【発明者】
【氏名】ベルトラン，エリック
(72)【発明者】
【氏名】クナップ，ヤニック
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA27
4B029BB11
4B029CC01
4B029DG06
4B065AA94X
4B065BC01
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、システム（１）を用いて、流体（Ｆ）に含まれる巨核球から血小板を放出させる方法に関する。使用するシステム（１）は、円筒壁（１２）を備えた内側シリンダ（１１）と、この内側シリンダの半径方向外側に位置すると共に円筒壁（１４）を有する中空な外側シリンダ（１３）とを含み、両シリンダは、流体（Ｆ）を受容するように意図された空間（１５）によって分離されている。本方法は、巨核球を含む流体（Ｆ）を空間（１５）に供給するステップ（１００）と、内側シリンダ（１１）をその軸を中心に回転させると共に外側シリンダ（１３）は静止していることで、又は、２つのシリンダ（１１、１３）をそれらの軸を中心に逆方向に動かすことで、空間（１５）内に少なくとも部分的に流体（Ｆ）の乱流を発生させ、血小板で濃縮された第２の流体（Ｆ’）を得るステップ（２００）とを含む。
【選択図】図１ａ
【選択図】図１ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
流体（Ｆ）に含まれる巨核球から血小板を放出させる方法であって、当該方法は、システム（１）によって実行され、そのシステム（１）は、２つの同心シリンダ（１１、１３）として、円筒壁（１２）を備える内側シリンダ（１１）と、前記内側シリンダ（１１）の半径方向外側に位置する中空な外側シリンダ（１３）とを含み、前記外側シリンダ（１３）は、前記第２シリンダが閉じられる高さにベース（１３ａ）を有する円筒壁（１４）を備え、前記二つのシリンダ（１１、１３）は、機械部品のない空間（１５）によって分離され、前記空間（１５）は、前記流体（Ｆ）を受容するように意図されており、当該方法は、以下のステップ、即ち、
（１００） 巨核球を含む流体（Ｆ）を前記空間（１５）に供給するステップと、
（２００） 前記内側シリンダ（１１）をその軸を中心に回転させると共に、前記外側シリンダ（１３）は静止していることで、または、前記２つのシリンダ（１１、１３）をそれらの軸を中心に逆方向に動かすことで、前記空間（１５）内に少なくとも部分的に流体（Ｆ）の乱流を発生させ、血小板で濃縮された第２の流体（Ｆ’）を得るステップと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記外側シリンダ（１３）が静止した状態で前記内側シリンダ（１１）を動かす場合、前記内側シリンダは、レイノルズ数Ｒｅｉ（数１参照）を１４００以上に定めるように動かされる、【数1】
式中、ｒｉは前記内側シリンダ（１１）の半径、ωｉは前記内側シリンダ（１１）の角速度、ｄは前記内側シリンダ（１１）と前記外側シリンダ（１３）とを隔てる距離、θは前記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記２つのシリンダ（１１、１３）を逆方向に動かす場合、前記内側シリンダ（１１）及び前記外側シリンダ（１３）はそれぞれ、１０００より大きいレイノルズ数Ｒｅｉ（数２参照）、及び１０００より大きいレイノルズ数Ｒｅｏ（数３参照）を定めるように動かされる、【数2】
【数3】
式中、ｒｉは前記内側シリンダ（１１）の半径、ｒｏは前記外側シリンダ（１３）の半径、ωｉは前記内側シリンダ（１１）の角速度、ωｏは前記外側シリンダ（１３）の角速度、ｄは前記内側シリンダ（１１）と前記外側シリンダ（１３）とを隔てる距離、θは前記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記２つのシリンダ（１１、１３）は、５ｍｍ未満の距離（ｄ）だけ隔てられている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記２つのシリンダ（１１、１３）は、２ｍｍ～４ｍｍの距離（ｄ）だけ隔てられている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記２つのシリンダ（１１、１３）は、約３ｍｍの距離（ｄ）だけ隔てられている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（１００）において、前記流体（Ｆ）を前記空間（１５）へと連続的に供給し、前記システム（１）は、前記空間（１５）を前記流体（Ｆ）で満たすための入口（２）と、血小板で濃縮された流体（Ｆ’）を排出するための開口部（３）とを含み、前記開口部（３）は、前記ベース（１３ａ）の高さに位置する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（２００）の間、前記空間（１５）における流体（Ｆ）の滞留時間は、４分～６分、好ましくは、約５分である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記内側シリンダ（１１）と前記外側シリンダ（１３）は、それぞれ第１パターン（１２０）と第２パターン（１４０）を形成する他の周辺内側壁（１２２、１４２）を含み、前記第１パターン及び第２パターン（１２０、１４０）は、前記内側シリンダ（１１）の前記他の壁（１２２）と、前記外側シリンダ（１３）の前記他の壁（１４２）とが互いに同心で、少なくとも部分的に対向するように、互いに入れ子になっている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
流体（Ｆ）に含まれる巨核球から血小板を放出させる方法であって、当該方法は、システム（１）によって実行され、そのシステム（１）は、機械部品のない空間（１５）によって隔てられた２つの平行な平面壁（１２、１４）を含み、前記空間（１５）は前記流体（Ｆ）を受容するように設計されており、前記平面壁（１２、１４）は移動可能であり、当該記方法は、以下のステップ、即ち、
（１００） 巨核球を含む流体（Ｆ）を前記空間（１５）に供給するステップと、
（２００） 前記平面壁（１２、１４）の一方を当該平面壁の平面内で移動させると共に、前記平面壁（１２、１４）の他方は静止していることで、または、前記２つの平面壁（１２、１４）を逆方向に、且つ各平面壁をその平面内で移動させることで、前記空間（１５）内に少なくとも部分的に流体（Ｆ）の乱流を発生させ、血小板で濃縮された第２流体（Ｆ’）を得るステップと、
を含む、方法。
【請求項11】
第１の平面壁（１２）は第１のコンベヤベルトの壁であり、第２の平面壁（１４）は第２のコンベヤベルトの壁である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記２つの壁（１２、１４）を逆方向に移動させる場合、前記２つの壁（１２、１４）は同じ速度で逆方向に移動する、請求項１０又は請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記２つの壁（１２、１４）は毎秒約１メートルの速度で移動する、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記２つの壁（１２、１４）が逆方向に移動する場合、前記２つの壁（１２、１４）は平均値に対して最大１０％の速度差で移動する、請求項１０又は請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
細胞外小胞が追加的に放出される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の血小板を放出させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、とりわけ、巨核球前駆細胞を含む流体から血小板を放出する方法に関する。本発明に係る方法は、この目的用に設計された血小板放出システムによって実施される。更に本発明は、血小板を放出するためのかかるシステムにも関する。本発明は、産業規模での血小板のｉｎ ｖｉｔｒｏ（イン・ビトロ）産生、及び細胞外小胞の産生にとりわけ適している。
【背景技術】
【0002】
これまでは、通常、数十マイクロメートル～数センチメートルの小型システムを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ血小板放出法を実施するための一般的な解決策は、人体で発生する自然な血小板放出機序を再現することであった。このため、こうした方法はバイオミメティクスと呼ばれている。
【0003】
人体内で血小板が放出される機序については、今なお多くの研究がなされている。血小板放出は、巨核球の断片化の過程、及び／又は細胞質拡張体が血小板になる過程で起こることが分かっている。この高度に調整されたｉｎ ｖｉｖｏのプロセスは、血流の力によって、細胞質拡張体が内皮バリアを通過し、次いで、血小板前駆細胞が成熟して肺微小循環に入る際に、血液中で自然に発生する。巨核球は前駆細胞として重要な役割を果たしている。こうした機序は人体内では非常にゆっくりとした速度で作用しており、従来のバイオミメティクスマイクロ流体反応器内の血小板産生も比較的ゆっくりとした速度で行われている。
【0004】
特許文献１では、流体がその内部を循環する際、内皮通路を模した微細孔壁を備えた構造を持つマイクロ流体バイオリアクタを提案している。通常の動作では、流体の流れ状態は層流であり、微細孔壁の高さで測定されたせん断速度は生理学的せん断速度に対応する。通常、処理時間は数時間である。特許文献２も同様であり、この文献では、膜構造が特許文献１の微細孔壁の役割を担っている。
【0005】
近年、血小板を放出する方法を産業化する取り組みがなされ、新たな種類のバイオリアクタが開発された。特許文献３では、この種の使用を目的としたバイオリアクタの例が開示されている。提案システムは、健康な血小板の数と寿命を延ばすことを目的としている。これは、巨核球を含む流体用のリザーバと、血小板が放出されるようにリザーバ内で乱流を発生させるための少なくとも１つの手段とを備える。一実施形態において、この手段は、リザーバに沿って前後に動くブレードから構成される。このようなシステムの欠点は、ブレードが流体中に含まれる巨核球と衝突する可能性が高く、これにより、システムの使用中に得られた巨核球前駆細胞のかなりの割合が損傷を受けるという事実にある。実際、流体が移動する体積の中にブレードが存在することが、すでに巨核球前駆細胞との衝突の原因となっている。次に、ブレードの動きは、巨核球前駆細胞により強い衝撃を与えると思われている。したがって、得られた血小板の大部分が、活性が著しく低下しているか、存在すらしないこともある。さらに、培養／放出リザーバのカバー１ａは、軸を通過して、ブレードが前後に動けるようになる。かかかる配置では、リザーバ内の無菌状態を保てない可能性が高い。
【0006】
特許文献４は、巨核球から血小板を放出する別の方法を開示しており、この方法は特許文献３のチームによって実現されている。このバイオリアクタは、巨核球を含む培養液を撹拌するように、前後上下に往復運動するブレードを含む。特許文献３に記載される方法と同様、血小板放出が発生する流体が循環する空間内でブレードが動くと、巨核球前駆細胞との衝突が発生し、これにより、前記巨核球前駆細胞から放出される血小板の活性が低下する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】ＷＯ２０１４／１０７２４０Ａ１号
【特許文献2】ＷＯ２０１８／１６５３０８Ａ１号
【特許文献3】ＷＯ２０１９／０９３６４Ａ１号
【特許文献4】ＥＰ３３７２６７４Ａ１号（ＷＯ２０１７／０７７９６４相当）
【発明の概要】
【0008】
本発明は、上記欠点を克服することを目的とし、この目的のために、流体中に含まれる巨核球から血小板を放出させる方法を提案する。当該方法は、システムによって実行され、当該システムは、２つの同心シリンダとして、シリンダ壁（円筒壁）を備える内側シリンダと、内側シリンダの半径方向外側に位置する中空外側シリンダとを含み、上記外側シリンダは、上記第２シリンダが閉じる高さにあるベースのシリンダ壁（円筒壁）を含み、前記シリンダ（群）は、機械部品のない空間によって分離され、上記空間は、流体を受容するように意図されている。そして、上記方法は、以下のステップ、即ち、
－ （１００）巨核球を含む流体を前記空間に供給するステップ、
－ （２００）内側シリンダをその軸を中心に回動させるステップであって、外側シリンダは静止しているステップ、あるいは、２つのシリンダをそれらの軸を中心に逆方向に移動させるステップであり、上記空間内に少なくとも部分的に乱流流体の流れを発生させて血小板で濃縮された第２流体を得るステップ、
を含む。
－ （１００）巨核球を含む流体を前記空間に供給するステップ、
－ （２００）内側シリンダをその軸を中心に回動させるステップであって、外側シリンダは静止しているステップ、あるいは、２つのシリンダをそれらの軸を中心に逆方向に移動させるステップであり、上記空間内に少なくとも部分的に乱流流体の流れを発生させて血小板で濃縮された第２流体を得るステップ、
を含む。
【0009】
本発明で使用する乱流状態での血小板放出法は、その血小板放出システムの構造によって、血小板の劣化を防ぐことができ、かくして、血小板放出効率が著しく向上し、産業的な手法を予見させるものである。本発明に係る方法で使用されるシステムの同心シリンダは、１つ又は複数のシリンダがその軸を中心に移動する際、シリンダ間空間に位置するシステムの他の部品、又は要素がそれらに影響を与えることなく、血小板が流体中に放出されるよう、機械部品のない空間で分離される。
【0010】
さらに、シリンダ（群）は同心円状であるため、壁に沿って一定の空隙（エアーギャップ）が保証される。空隙（エアーギャップ）とは、２つの壁の間の距離のことである。これは、血小板の放出を可能にするために、システム内の流れ状態をより良好に制御するために操作可能なパラメータである。同時に、空隙自体の値によって、血小板放出の効率を更に向上させることができる。また、流体の乱流条件を得るために、１つ又は複数のシリンダの移動速度に影響を与えることも可能である。このようにして、本方法を実施する際には、乱流の流れ状態特有の条件を得るために動作パラメータを調整することができる。
【0011】
本発明の様々な特徴によれば、以下の点を総合的にあるいは個別に考慮に入れるものとする。即ち：
【0012】
－ 外側シリンダが静止している間に、内側シリンダを移動させる場合、
レイノルズ数Ｒｅｉ（数１参照）を１４００以上に定めるように内側シリンダを移動させる、
式中、ｒｉは内側シリンダの半径、ωｉは内側シリンダの角速度、ｄは内側シリンダと外側シリンダとを隔てる距離、θは上記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である；
レイノルズ数Ｒｅｉ（数１参照）を１４００以上に定めるように内側シリンダを移動させる、
【数1】
式中、ｒｉは内側シリンダの半径、ωｉは内側シリンダの角速度、ｄは内側シリンダと外側シリンダとを隔てる距離、θは上記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である；
【0013】
－ ２つのシリンダが逆方向に移動する際、内側シリンダと外側シリンダはそれぞれ、
１０００より大きいレイノルズ数Ｒｅｉ（数２参照）と、
１０００より大きいレイノルズ数Ｒｅｏ（数３参照）を定義するように移動し、
式中、ｒｉは内側シリンダの半径、ｒｏは外側シリンダの半径、
ωｉは内側シリンダの角速度、ωｏは外側シリンダの角速度、
ｄは内側シリンダと外側シリンダを隔てる距離、
θは上記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である；
１０００より大きいレイノルズ数Ｒｅｉ（数２参照）と、
１０００より大きいレイノルズ数Ｒｅｏ（数３参照）を定義するように移動し、
【数2】
【数3】
式中、ｒｉは内側シリンダの半径、ｒｏは外側シリンダの半径、
ωｉは内側シリンダの角速度、ωｏは外側シリンダの角速度、
ｄは内側シリンダと外側シリンダを隔てる距離、
θは上記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である；
【0014】
－ ２つのシリンダは、５ｍｍ未満の距離ｄだけ隔てられる；
－ ２つのシリンダは、２ｍｍ～４ｍｍの距離ｄだけ隔てられる；
－ ２つのシリンダは、約３ｍｍの距離ｄだけ隔てられる；
－ ステップ１００において、流体を空間へと連続的に供給し、システムは、空間を前記流体で満たすための入口と、血小板濃縮流体を排出するための開口部とを含み、上記開口部は、ベースの高さに位置する；
－ ステップ２００の間、上記空間における流体の滞留時間は、４分～６分、好ましくは約５分である；
－ 上記内側シリンダと上記外側シリンダは、それぞれ第１パターンと第２パターンを形成する他の周辺内側壁を含み、上記第１パターン及び第２パターンは、上記内側シリンダの上記他の壁と上記外側シリンダの上記他の壁とが互いに同心で、少なくとも部分的に対向するように、互いにネスト化されている（入れ子にされている）；
－ 細胞外小胞も放出される方法である。
－ ２つのシリンダは、２ｍｍ～４ｍｍの距離ｄだけ隔てられる；
－ ２つのシリンダは、約３ｍｍの距離ｄだけ隔てられる；
－ ステップ１００において、流体を空間へと連続的に供給し、システムは、空間を前記流体で満たすための入口と、血小板濃縮流体を排出するための開口部とを含み、上記開口部は、ベースの高さに位置する；
－ ステップ２００の間、上記空間における流体の滞留時間は、４分～６分、好ましくは約５分である；
－ 上記内側シリンダと上記外側シリンダは、それぞれ第１パターンと第２パターンを形成する他の周辺内側壁を含み、上記第１パターン及び第２パターンは、上記内側シリンダの上記他の壁と上記外側シリンダの上記他の壁とが互いに同心で、少なくとも部分的に対向するように、互いにネスト化されている（入れ子にされている）；
－ 細胞外小胞も放出される方法である。
【0015】
本発明の代替的実施形態によれば、本発明の方法は、流体に含まれる巨核球から血小板を放出させる方法に関し、上記方法は、システムによって実行され、当該システムは、機械部品のない空間によって隔てられた２つの平行な平面壁を含み、上記空間は流体を受容することを意図しており、上記（二つの）壁は移動可能である。そして、当該方法は以下のステップ、即ち、
（１００）巨核球を含む流体を上記空間に供給するステップ、
（２００）上記（二つの）平面壁の一方を、当該平面壁の平面内で移動させるステップであって、上記壁の他方は静止しているステップ、あるいは、２つの壁を逆方向に動かし、それぞれの壁をその平面内で動かすステップであり、上記空間内に少なくとも部分的に乱流流体の流れを発生させて血小板で濃縮された第２流体を得るステップ、
を含む。
（１００）巨核球を含む流体を上記空間に供給するステップ、
（２００）上記（二つの）平面壁の一方を、当該平面壁の平面内で移動させるステップであって、上記壁の他方は静止しているステップ、あるいは、２つの壁を逆方向に動かし、それぞれの壁をその平面内で動かすステップであり、上記空間内に少なくとも部分的に乱流流体の流れを発生させて血小板で濃縮された第２流体を得るステップ、
を含む。
【0016】
本発明の様々な特徴によれば、以下の点を総合的にあるいは個別に考慮に入れる。
即ち：
－ 第１平面壁は第１コンベヤベルトの壁であり、第２平面壁は第２コンベヤベルトの壁である；
－ ２つの壁が逆方向に動く場合、２つの壁は同じ速度で逆方向に動く；
－ ２つの壁は毎秒約１メートルの速度で移動する；
－ ２つの壁が逆方向に移動している場合、２つの壁は平均値に対して最大１０％の速度差で移動する；
－ 細胞外小胞も放出される。
即ち：
－ 第１平面壁は第１コンベヤベルトの壁であり、第２平面壁は第２コンベヤベルトの壁である；
－ ２つの壁が逆方向に動く場合、２つの壁は同じ速度で逆方向に動く；
－ ２つの壁は毎秒約１メートルの速度で移動する；
－ ２つの壁が逆方向に移動している場合、２つの壁は平均値に対して最大１０％の速度差で移動する；
－ 細胞外小胞も放出される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1a】本発明の第１実施形態に係る方法の実施を可能にする血小板放出システムを射影図（斜視図）で概略的に示す図である。
【図1b】本発明の第１実施形態に係る方法の実施を可能にする血小板放出システムを断面図で概略的に示す図である。
【図2b】図１の血小板放出システムを、内側シリンダが回動する際の内側シリンダと外側シリンダとの間の速度の分布を含めて、上面図で概略的に示す図である。下側の図は、空間内の流体の半径方向の速度分布を示す。
【図4a】本発明の第２実施形態に係る方法の実施を可能にする血小板放出システムを射影図（斜視図）で概略的に示す図である。
【図4b】本発明の第２実施形態に係る方法の実施を可能にする血小板放出システムを断面図で概略的に示す図である。
【図6】Ａｎｄｅｒｅｃｋのダイアグラム（１９８６年）を示す図である。
【図7】基準試料に関する、さらに、シリンダを逆方向に回動させ、空隙が３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ（左から右へ）の図１ａ及び図１ｂで示す実施形態に係る血小板放出システムを使用して、本発明に係る方法で処理された試料に関する、二重陽性血小板の数を示す図である。
【図8】基準試料（左側の点）に関する、さらに、シリンダが逆方向に回動する場合（中央の点）と、内側シリンダだけが回動する場合（右側の点）における、空隙が３ｍｍの図１ａ及び図１ｂで示す血小板放出システムを使用して、本発明に係る方法で処理した試料に関する、二重陽性血小板の数を示す図である。
【図9】本発明の方法を実施するための２シリンダ・デバイスの一例を示す図である。
【図10】ａ）フローサイトメトリにおける５，０００個のビーズの通過、ｂ）培養７日目の細胞あたりの血小板数、そして、ｃ）播種したＣＤ３４＋あたりの血小板数について、放出されたＣＤ４１＋及びＣＤ４２＋の血小板の数を示す図であり、白色の列は、ピペットで得られた結果を表し、灰色の列は、２つのシリンダが逆方向に回動する構成で得られた結果を表し、さらに、黒色の列は、内側シリンダのみが回動する構成で得られた結果を表している。
【図11】放出様式に応じて、主要な糖タンパク質を表面に発現している血小板の数を示す図である。図１１（ａ）は、２つのシリンダが逆方向に回動する構成（灰色の列）と、内側シリンダのみが回動する構成（黒色の列）との、陽性血小板の割合を比較した図である。図１１（ｂ）は、２つのシリンダが逆方向に回動する構成（灰色の列）と、ピペットを使用する構成（白色の列）とを比較した図である。図１１（ｃ）は、内側シリンダのみが回動する構成（黒色の列）と、ピペットを使用する構成（白色の列）とを比較した図である。
【図12】放出された血小板の前活性化（静止）状態と、拮抗薬（トロンビン）の存在下に置かれた際の活性化性能を示す図であり、白色の列は、ピペットで得られた結果を表し、灰色の列は、２つのシリンダが逆方向に回動する構成で得られた結果を表し、さらに、黒色の列は、内側シリンダのみが回動する構成で得られた結果を表している。左側の図はＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ前活性化マーカを分析した結果に対応し、右側の図は血小板表面のＰ－セレクチンの発現を分析した結果に対応する。
【図13】本発明の方法を使用して得られた血小板濃縮物（左図の実線円）と培養血小板との混合物と比較した、内側シリンダのみが回動する場合（左図の四角）における、及び、血小板濃縮物（右図の実線円）の混合物と比較した、２つのシリンダが逆方向に回動する場合（右図の四角）における、本発明の方法を使用して得られたマウス生体内の培養血小板についての血小板の再循環現象（時間の関数としての３分間の血小板数に対する血小板数の比）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、巨核球を含む流体Ｆから血小板を放出する方法、並びに、図１ａ、図１ｂ、図２ａ、図２ｂ、図３ａ、図３ｂ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ及び図５ｂで例示されるような、前記方法を実施するためのシステム１に関する。
【0019】
対象の流体Ｆは、例えば、巨核球前駆細胞、巨核球を含む、様々な分化段階の不死化株細胞、又は非不死化株細胞から得られた細胞集団を含む培地である。巨核球、又は巨核球細胞は、成熟すると細胞質拡張体、又は血小板前駆細胞と呼ばれる長い拡張体を持つ大きな血液細胞（最大１００μｍ、培養では３０μｍ）である。
【0020】
血小板の形成に関わる機序は、未だに多くの研究の対象となっている。その中でも、血小板放出は、巨核球Ｍｋの断片化の過程、及び／又は細胞質拡張体Ｃｋが血小板になる過程で起こることが分かっている。これは、血流の力によって血液中で自然に起こる、高度に調整されたｉｎ ｖｉｖｏプロセスである。巨核球Ｍｋは、これらが前駆細胞であるので、重要な役割を果たしている。しかし、血小板が体内で放出される過程については、依然として十分解明されておらず、内皮通過、及び血小板形成において血流が担う精確な役割についても多くの疑問が残されたままである。このプロセスは、マイクロ流体システムを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで再現され、これにより、ある特定のｉｎ ｖｉｖｏ機序がマイクロ流体実験によって裏付けられるようになった。このプロセスは、手動ピペットあるいは本明細書の導入部で紹介したデバイス等を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも再現することができ、血小板の放出に伴う機序について、より深く理解することができる（Ｓｔｒａｓｓｅｌら、”Ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｒｏｐａｌｅｔｓ”，Ｂｌｏｏｄ，５ Ｍａｙ ２０１６，ｖｏｌ．１２７，ｎ１８）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで血小板を産生することにより、血小板の形成に関与する機序を更に深く理解することができる。しかし、血小板の放出効率はｉｎ ｖｉｖｏで得られたものより低いことが多い。したがって、本発明は、乱流状態内で血小板を放出する方法について、巨核球Ｍｋ、及び／又は細胞質拡張体Ｃｋの断片化過程を再現することを目的とする。
【0021】
本発明についてより詳細に説明する前に、血小板の放出を可能にすることに加え、本発明はこうして放出された血小板から、細胞外小胞等の他の機能的細胞質要素も放出できることに、留意されたい。現状、細胞外小胞は、細胞間で生物学的物質の内容物を移動可能とする生物学的物質のベクターとして認識されている。細胞外小胞は、細胞膜に由来し、生理学的に細胞外培地に分泌されるナノ小胞である。これらはいくつかのサブタイプ（エクソソーム、微小小胞、アポトーシス小体）から構成され、大きさは３０ｎｍ～１μｍと様々である。比較として、血小板の直径は一般的に３．５μｍ～５μｍである。
【0022】
血小板を放出するこの手法の背後にある原理について、次の段落で紹介する。乱流を発生させる方法は数多くあるが、本発明で説明する方法は、２つの同心円シリンダのシステムに不安定性を発生させるのに使用されるのと同様のメカニズムを使用する。ターボマシンの動作、及び惑星の形成の根底にあるこうしたメカニズムは、一般に大規模システムで使用されている。本発明の技術分野では、工業化以前のバイオリアクタがより多く導入されているにもかかわらず、本明細書の導入部で記載したような小規模システムを使用するのが一般的な傾向であることを忘れないものとする。
【0023】
Ｃ．Ａｎｄｅｒｅｃｋらによる論文「Ｆｌｏｗ ｒｅｇｉｍｅｓ ｉｎ ａ ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｃｏｕｅｔｔｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｒｏｔａｔｉｎｇ ｃｙｌｉｎｄｅｒｓ」、Ｊ．Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈ．１９８６、並びにＧｒｏｓｓｍａｎｎらの論文「Ｈｉｇｈ－Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｎｕｍｂｅｒ Ｔａｙｌｏｒ－Ｃｏｕｅｔｔｅ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈ．，２０１６を参照のこと。以下では、これらの公開文献で示され、本願の図６に再現されているＡｎｄｅｒｅｃｋらの相図について、より具体的に焦点を当てる。Ａｎｄｅｒｅｃｋらの相図は、乱流を発生させるために角速度、ひいては、レイノルズ数を変化させることができる２つの同心円シリンダのシステムで発生しうる様々な流れ状態を示している。Ａｎｄｅｒｅｃｋの相図は、横軸に内側シリンダのレイノルズ数（公開文献によっては、Ｒｅｉ又はＲｉ）、縦軸に外側シリンダのレイノルズ数（公開文献によっては、Ｒｅｏ又はＲｏ）を示している。こうして、前述のパラメータに従って流れ状態を定義し、各種類の流れが所定のペア（Ｒｅｉ、Ｒｅｏ）によって特徴付けられるようになる。
【0024】
本発明の発明者らは、乱流の流れ状態において巨核球細胞を含む流体Ｆからの血小板放出現象が存在すること、さらに、Ａｎｄｅｒｅｃｋダイアグラムのある特定の非常に特異的なエリアにおいて、血小板放出現象が著しく改善されることを実証した。
【0025】
絶対値で内側シリンダのレイノルズ数Ｒｅｉ（数４参照）が有利には５００以上、外側シリンダのレイノルズ数Ｒｅｏ（数５参照）が有利には１０００以上の場合、これらの流れ状態（Ａｎｄｅｒｅｃｋダイアグラムでは「スパイラル乱流」または「無特徴乱流」）が発生する。
式中、ｒｉは内側シリンダ１１の半径、ｒｏは外側シリンダ１３の半径、ωｉは内側シリンダ１１の角速度、ωｏは外側シリンダ１３の角速度、ｄは内側シリンダ１１と外側シリンダ１３とを隔てる距離、θは前記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である。この状態は、（二つの）シリンダをそれぞれの軸（シリンダ軸）を中心に逆方向に回動させることで得られる。これらは二重反転シリンダとして知られている。
【数4】
【数5】
式中、ｒｉは内側シリンダ１１の半径、ｒｏは外側シリンダ１３の半径、ωｉは内側シリンダ１１の角速度、ωｏは外側シリンダ１３の角速度、ｄは内側シリンダ１１と外側シリンダ１３とを隔てる距離、θは前記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である。この状態は、（二つの）シリンダをそれぞれの軸（シリンダ軸）を中心に逆方向に回動させることで得られる。これらは二重反転シリンダとして知られている。
【0026】
これらの状態のもう１つは、乱流テイラー渦の流れ（Ａｎｄｅｒｅｃｋダイアグラムでは「乱流テイラー渦」）に対応しており、以下ではこれを「渦」と称する。この状態は、外側シリンダが静止し、内側シリンダがその軸を中心に回動する構成に相当する。テイラー乱流渦の状態を達成するためには、内側シリンダのレイノルズ数Ｒｅｉ（数６を参照）が１４００以上であれば都合がよい。
式中、ｒｉは内側シリンダ１１の半径、ωｉは内側シリンダ１１の角速度、ｄは内側シリンダ１１と外側シリンダ１３とを隔てる距離、θは前記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である。
【数6】
式中、ｒｉは内側シリンダ１１の半径、ωｉは内側シリンダ１１の角速度、ｄは内側シリンダ１１と外側シリンダ１３とを隔てる距離、θは前記内側シリンダと外側シリンダとの間の流体の動粘度である。
【0027】
これらは、本発明者らが２つの円形同心シリンダのシステムで血小板放出プロセスの改善を実証した状態であり、流れ状態が乱流になるとすぐに血小板の放出が起こり、かくして、ＲｅｉとＲｅｏの範囲が前述の範囲よりも大きくなることが分かるであろう。
【0028】
以下の段落から明らかになるように、本発明の発明者らは、血小板の放出が、２つの円形同心シリンダを有するシステムだけでなく、他のシステムによっても達成され得ることを実証したが、これらのシステムはすべて、２つの実質的に平行な壁が実験で得られた所定距離だけ隔てられるという、上述のシステムと共通する点を有する。
【0029】
図１ａ及び図１ｂを参照すると、システム１の実施形態の一例は、機械部品のない空間１５で隔てられた２つの同心シリンダ１１、１３を含む。システム１は、内側シリンダ１１と、内側シリンダ１１の半径方向外側に位置する中空な外側シリンダ１３とを含み、前記内側シリンダ１１と外側シリンダ１３は同心である。「同心シリンダ」とは、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３が同軸であること、すなわち、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３の軸が一致していることを意味する。
【0030】
内側シリンダ１１は、内側シリンダ１１の高さに対応する距離ｈだけ隔てられた、実質的に円形形状の２つの平行なベース１１ａ、１１ｂを含む、中実体に相当する。内側シリンダ１１は、その高さｈに沿って外側側面を画定しており、以下、これを「第１壁１２」と称する。ちなみに、第１壁１２は円筒形状をしている。
【0031】
外側シリンダ１３は、形状が実質的に円形のベース１３ａを含む中空な固体であり、そこから第１壁１２と同様に、形状が円筒形である第２壁１４が延在している。このようにして、図示の実施形態では、外側シリンダ１３は、ベース１３ａと第２円筒壁１４とによって外部に区切られ、その上面の高さに開口部を有するシリンダハウジング１６の境界を定める。ここで、「上位」と「下位」という語句は、限定を意図するものではなく、図を参照して本発明を理解しやすくするためだけのものである。
【0032】
先に示したように、ハウジング１６は、内側シリンダ１１を外側シリンダ１３と同心に配置できるように、内側シリンダ１１を収容する。ただし、ハウジング１６の一部は空間１５を形成するために残されているため、内側シリンダ１１がハウジング１６全体を占めることはない。空間１５は、第１円筒壁１２を第２円筒壁１４から、より広義には、内側シリンダ１１を外側シリンダ１３から分離しており、これにより空間１５は、内側シリンダ１１によって内側に区切られ、外側シリンダ１３によって外側に区切られた中空シリンダの形状を有する。したがって、空間１５は、血小板の前駆細胞である巨核球細胞を含む流体Ｆを収容できるリザーバを形成する。さらに、本発明によれば、空間１５には機械部品がない。この構成の利点を以下で説明する。
【0033】
前節から分かるように、第１円筒壁１２は、第２壁１４から一定の距離ｄだけ隔置されている。同様に、外側シリンダ１３のベース１３ａと平行な第１シリンダのベース１１ａも、距離ｄ´だけ外側シリンダから隔置されるが、この距離ｄ´は、必ずしも距離ｄと同一ではない。本説明の残りの部分では、第１円筒壁１２を第２壁１４から分離する距離ｄを「空隙」（エアーギャップ）と呼ぶことにする。空隙は、システム１の設計時に設定される。空間１５内の流れ状態を制御するため、空隙は一定である。このことは、空隙が第１シリンダ１１と第２シリンダ１３の寸法によって設定される場合、最適な空隙は前記寸法に応じて選択されることはなく、前記内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３の寸法は、所望の空隙に応じて選択される（ただし、単独ではない）。流体Ｆからの血小板放出の効率における顕著な改善は、選択された空隙に依存し、さらに、第１円筒壁１２及び第２円筒壁１４の一方、あるいは、双方の速度に依存することが実証された。
【0034】
シリンダの一方、あるいは、双方の回動速度ｖは、前記内側シリンダ１１、及び外側シリンダ１３の寸法に依存することに留意されたい。定義上、前記内側シリンダ１１と外側シリンダ１３それぞれの線形速度ｖは、前記シリンダの寸法、より具体的には、それぞれの直径に依存する。そのため、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３の寸法は、所望の空隙に応じて選択されるが、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３の回動速度を考慮に入れて、選択することもできる。例えば、当業者が、シリンダを駆動するためのシステムの選択、具体的には、駆動力に制限がある場合、システム１を設計する際には、この新たな制約を考慮に入れる必要がある。
【0035】
システム１は、図１ａと図１ｂでは示されていない（しかし、図９では示されている）フレームを備えており、このフレームによって、前記第１シリンダ１１と第２シリンダ１３を上述のように配置することができる。そのため、図１ａ及び図１ｂでは、内側シリンダ１１が宙吊りされているように見えるが、実際にはフレームによって意図した位置に保持されている。外側シリンダ１３についても、同様である。
【0036】
実際には、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３が動くと、空間１５に収容された流体Ｆが移動する。この点で、システム１は、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３を駆動するためのシステム（図示せず）も備えている。その駆動システムは、電源システム、１つ以上のモータ、並びに１つ又は複数のモータを制御する速度制御システムを含む。この駆動システムにより、規定速度を前記各シリンダ１１、１３に個別に適用することができる。次に、本発明に係る方法を様々な実施形態で実施することが可能であり、以下で更に詳述する。例えば、駆動システムは、速度調整システムによって制御される電気モータで回動する磁気駆動システムから構成することができる。
【0037】
本発明に係る方法の第１実施形態によると、空間１５が巨核球を含む流体Ｆで充填された後、流体Ｆの乱流を空間１５内で発生させるよう、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３がそれらの軸を中心に逆方向に移動する。つまり、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３は回動運動を行い、内側シリンダ１１の回動方向は外側シリンダ１３の回動方向に対して逆である。
【0038】
図２ａは、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３が逆方向に動いている際の空間１５内の速度の分布を示す。図２ａで示すシステム１は、図１ａ及び１ｂに示すシステム１の拡大上面図である。第１壁１２と第２壁１４は平らに見えるが、これらは円筒形である。さらに、図示したシステム１は縮尺通りではなく、空間１５内の局所的な流れ状態をより分かりやすく説明するための寸法を選んでいるに過ぎない。以下では、流体Ｆの流速をｖと表記するが、この流速は各壁１２、１４の近傍、すなわち、それぞれエリアＲＰ１２、ＲＰ１４の高さでは比較的速く、空間１５の中央領域ＲＣでは、流体Ｆの流速ｖはほぼゼロである。この中央領域ＲＣ、及びエリアＲＰ１２とエリアＲＰ１４における流体Ｆの流れは乱流である。そのため、第１壁１２と第２壁１４との間では平均して流体Ｆは半径方向に静的であるが、壁ＲＰ１２と壁ＲＰ１４に近い領域では、大きな乱流がある。
【0039】
内側シリンダ１１と外側シリンダ１３をそれぞれレイノルズ数１０００より大きくすることで、乱流を発生させれば都合がよい。とはいえ、これは好ましい態様であり、血小板の放出を得るための前提条件ではない。
【0040】
前記内側シリンダ１１と外側シリンダ１３が、５ｍｍ未満の空隙ｄで隔てられていれば都合がよく、空間１５があるのでゼロではない。この値の範囲内（０ｍｍ＜ｄ≦５ｍｍ）では、血小板放出効率を向上させることができるが、この範囲外、とりわけ、ｄ＞５ｍｍの場合、血小板放出効率は非常に低い。したがって、血小板の放出が非常に低い基準試料と比較して、空隙値を０ｍｍ＜ｄ≦５ｍｍの範囲にすれば、血小板放出効率を改善することができる。
【0041】
実際には、空隙ｄは、前記内側シリンダ１１と外側シリンダ１３の回動速度ｖと関連しているので、所定のペア（ｄ、ｖ）でシステム１を定義すれば、都合がよい。シリンダの回動速度は、それ自体がシリンダのレイノルズ数と連動している。システム１の各形状（つまり、寸法）は、１つ以上の最適なペア（ｄ、ｖ）、すなわち、流体Ｆからの血小板の放出を最適化できる乱流を生成可能とするペアと関連している。しかし、最適な回動速度ｖはシステム１の形状に本質的に依存するが、最適な空隙はこの形状には依存しない。したがって、上述のように、最高の血小板放出効率を達成できる最適な空隙ｄを実験により決定してから、空隙を考慮して、システム１の形状を選択する。それ故、図１ａ及び図１ｂで示されているように、システム１には、この制約を満たせる、多くの異なる形状が存在することは明らかであろう。形状を選択する際には、利用可能な内側シリンダ１１と外側シリンダ１３を駆動するシステムの種類も考慮に入れる。システム１を製造したいが、小型システムを回動させる駆動システムしかないユーザは、処理される流体Ｆの量の制限を受けることになる。
【0042】
システム１の実施形態の一例によると、内側シリンダ１１は外径が２ｃｍ～６ｃｍであり、外側シリンダ１３は内径が２ｃｍ～６ｃｍ、外側シリンダ１３の高さｈは５ｃｍ～６ｃｍである。前述したように、かかるシステム１は、空隙が０ｍｍ＜ｄ≦５ｍｍの範囲であり、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３が０．５ｍ／ｓ～２ｍ／ｓの回動速度ｖで逆方向に移動する構成の場合、血小板放出効率の改善を実現できる。例えば、内側シリンダ１１の外径が２７ｍｍであり、外側シリンダ１３の内径が３３ｍｍであり、外側シリンダ１３の高さが６０ｍｍであるシステム１では、空隙が０ｍｍ＜ｄ≦５ｍｍの範囲にあり、内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３がそれぞれ０．８ｍ／ｓ～１．５ｍ／ｓの回動速度ｖで逆方向に移動する場合、血小板放出効率の向上を達成することができる。
【0043】
前記第１シリンダ１１と第２シリンダ１３は、２ｍｍ～４ｍｍの空隙ｄで隔てられていれば、一層都合が良い。この構成は、本方法が実行される場合、空隙がこの範囲外にあるシステム１で実施される方法と比較して、血小板放出効率が更に改善されるという点で有利である。内側シリンダ１１の外径が２ｃｍ～６ｃｍ、外側シリンダ１３の内径が２ｃｍ～６ｃｍ、外側シリンダ１３の高さｈが５ｃｍ～６ｃｍのシステム１を例にとると、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３の最適な回動速度ｖは０．９ｍ／ｓ～１．２ｍ／ｓであり、前記シリンダはそれぞれ逆方向に移動する。
【0044】
前記第１シリンダ１１と第２シリンダ１３は、３ｍｍの空隙ｄによって隔てられていれば、極めて都合がよい。この空隙により、図１ａ及び図１ｂに示される構成では、本発明に係る方法がこの範囲外の空隙で実施される場合と比較して、より良好な血小板放出効率を得ることができる。図７では、２つのシリンダが逆方向に回動する構成における、このような最適状態を示す。内側シリンダ１１の外径が２ｃｍ～６ｃｍ、外側シリンダ１３の内径が２ｃｍ～６ｃｍ、外側シリンダ１３の高さｈが５ｃｍ～６ｃｍのシステム１を例にとると、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３の最適な回動速度ｖはそれぞれ、約１ｍ／ｓであり、前記シリンダはそれぞれ逆方向に移動する。
【0045】
本発明に係る方法の第１実施形態の変形形態によると、この方法の第１ステップは、空間１５を流体Ｆで満たすことにあり、さらに、この方法の第２ステップは、第１壁１２を回動させる一方で、第２壁１４は静止したままとすることにあり、理解すべき点として、外側シリンダ１３が静止している間、内側シリンダ１１がその軸を中心に回動するということである。この条件下において、乱流の流れ状態が空間１５内で得られる。図８では、内側シリンダ１１のみがその軸を中心に回動する場合（右側サンプル）、両方のシリンダ１１、１３が逆方向に回動する構成と比較して、血小板放出効率が更に改善されることを示している。
【0046】
図２ｂは、第１壁１２のみが回動している場合における、第１壁１２と第２壁１４との間の流体Ｆの速度の分布を示す。図２ｂで示すシステム１は、図１ａ及び１ｂに示すシステム１の拡大上面図である。この図で示される様に、内側シリンダ１１のみが回動している場合、本発明者らは、流体Ｆが第１壁１２から離れるにつれ、その速度ｖが徐々に減少することを観察した。つまり、流体Ｆの速度ｖは、第１壁１２の高さで最も高く、第２壁１４に近づくにつれて徐々に減少し、第２壁１４の高さでは非常に遅くなる。この速度分布は、２つのシリンダ１１、１３が逆回動する構成で見られるものとは実質的に異なる。この半径方向の速度変化を補償するために、以下に述べるような流体の循環を使用することができる。
【0047】
完璧な乱流を発生させて、血小板放出を増加させる乱流渦を発生させることができれば、都合がよい。システム１によってこのような流れ状態を実現するには、内側シリンダ１１が単独でその軸を中心に回動し、内側シリンダ１１のレイノルズ数が１４００超に相当する非常に高い角速度で駆動されなければならない。この流れ状態は、シリンダの回動軸を中心に、シリンダの高さに沿って、科学文献では「ローラ」とも呼ばれる、渦という高乱流現象が存在する低乱流によって特徴付けられる。
【0048】
２つのシリンダ１１、１３が回動する第１実施形態と同様、空隙は有利には、０ｍｍ＜ｄ≦５ｍｍ、更に有利には、２ｍｍ≦ｄ≦４ｍｍ、極めて有利には、ｄ＝３ｍｍの範囲にある。第１実施形態と同様の効果が認められた。とはいえ、こうした好ましい実装形態のそれぞれに関連する最適な回動速度ｖは、内側シリンダ１１のみが回動するという点で実質的に異なる。
【0049】
内側シリンダ１１の外径が２ｃｍ～６ｃｍであり、外側シリンダ１３の内径が２ｃｍ～６ｃｍ、外側シリンダ１３の高さｈが５ｃｍ～６ｃｍである、システム１について検討する。かかるシステム１において、内側シリンダ１１の最適な回動速度ｖは、空隙ｄが０ｍｍ（０ｍｍは含まず）～５ｍｍの場合、０．８ｍ／ｓ～２．５ｍ／ｓであり、空隙ｄが２ｍｍ～４ｍｍの場合、１．２ｍ／ｓ～２．２ｍ／ｓであり、さらに、空隙が約３ｍｍの場合は１．６ｍ／ｓ～１．９ｍ／ｓである。
【0050】
さらに、空間１５に流体Ｆの流れの状態が生じることで血小板を放出させることができれば、産生された血小板がその生化学的活性の点で、生体内の血小板と同様の挙動を示すことも重要である。これは、流体Ｆのみを含む空間１５に機械部品がないことによって達成される。従来技術で知られる、流体を含むリザーバ内で動くブレードがリザーバ内で撹拌を起こすシステムとは異なり、本発明では、乱流は、内側シリンダ１１、必要に応じて、外側シリンダ１３の移動速度によって生み出される。空間１５に可動機械部品がないことにより、巨核球との衝突を防ぎ、放出された血小板の生化学的活性を保つことができる。不活性な血小板、又は活性が低下した血小板は、血管の構造的完全性を保持する機序、一次止血、あるいはプロ凝固等の機序に関与することができない。同様に、これによって血小板から放出される細胞外小胞の生化学的活性を維持することができる。
【0051】
図１ａ及び図１ｂに示すシステム１は、寸法が数センチメートルから数十センチメートルの範囲であり得る。高い血小板放出効率を保ちつつ、処理される流体の量を増加させるための解決策の１つとして、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３のサイズを大きくすることがある。とはいえ、上述の構成でこの解決策を実現するには、空隙を０ｍｍ（０ｍｍは含まない）～５ｍｍに保つために、内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３の寸法を大幅に大きくする必要がある。
【0052】
このような状況において、本発明の発明者らは、図３ａ及び図３ｂで図示されるシステム１を実装した。この実施形態では、システム１は、図１ａ及び図１ｂで示されるシステム１等の内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３を含み、以下の特徴においてのみこれとは異なる。
【0053】
図３ａ及び図３ｂで示されるように、内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３はそれぞれ、更なる壁１２２、１４２を含む。特に、壁１２２、１４２は、前記シリンダの第１壁１２と第２壁１４にそれぞれ追加される。すなわち、内側シリンダ１１は第１壁１２と他の壁１２２を含み、外側シリンダ１２は第２壁１４と他の壁１４２を含む。第１壁１２と他の壁１２２は第１パターン１２０を形成し、第２壁１４と他の壁１４２は第２パターン１４０を形成する。
【0054】
一方では第１壁１２と他の壁１２２とが、他方では第２壁１４と他の壁１４２とが互いに平行であり、さらに、少なくとも部分的に互いに対向するよう、第１パターン１２０と第２パターン１４０はネスト化（入れ子化）している。こうして得られたシステム１は、平行な円筒壁の交互配置を含み、最も外側の壁は第２壁１４であり、次に第１壁１２が来て、次に他の第１壁１４２が来て、次に他の第１壁１２２が来て、更に次に他の第２壁１４２が来るといった、具合である。したがって、第１壁１２は、少なくとも部分的に第２壁１４と第１他の壁１４２に対向している。「少なくとも部分的に対向している」という表現は、第１壁１２がその高さ全体にわたっては、前記第２壁１４及び前記他の第１壁１４２と対向していないことを意味している。図１ａ及び図１ｂで示す構成と同様に、外側シリンダ１３のベース１３ａと内側シリンダ１１「ベース」１１ａとの間には、空隙ｄ´が存在する。しかしながら、図３ａ及び図３ｂで示されるシステム１のベース１１ａは、流体Ｆが浸透するために残されている壁同士の間の何もない空間があるため、連続的ではないことに留意すべきである。したがって、この構成では、内側シリンダ１１のベース１１ａは不連続である。
【0055】
この構成は、システム１の寸法を極端に増加させずに、処理される流体Ｆの量を増加させることができるので、とりわけ有利である。壁１２、１４、１２２、１４２を交互に配置することにより、システム１の中心軸と第２壁１４との間には多数の中間空間が形成される。これらはすべて、流体Ｆが進入できる空間である。図３ａ及び図３ｂで示す実施形態の例示では、システム１は、第１壁１２及び他の２つの壁１２２と、第２壁１４及び他の２つの壁１４２とを含む。つまり、円周上に空間が４つ追加されたことになる。他の壁の数は、図３ａ及び図３ｂに示す実施形態の例に限定されない。したがって、他の壁１２２、１４２を設けることも可能であり、ｎ（ｎは厳密に正の自然数）個の他の壁１２２と、ｎ個の他の壁１４２があれば、２ｘｎ個の追加の空間が、すなわち、空間１５に加えて存在することが理解されよう。ちなみに、前記内側シリンダ１１と外側シリンダ１３の直径が大きいほど、追加の空間を多く作ることができ、処理される流体の量も増える。
【0056】
システム１の様々な空間で同じレイノルズを保つよう、壁１２、１４、１２２、１４２の間に形成されるすべての空間について、空隙がシステム１の連続する２つの空間の間に適合されることが、望ましい。これは、回動角速度が半径方向に一定で、線形速度が空間１５ごとに異なり、さらに、血小板放出効率がシステム１全体で均一に改善されるよう、空隙を適合させることが好ましいからである。したがって、第２壁１４と第１壁１２との間の空隙ｄは、第１壁１２と他の第１壁１４２との間の空隙ｄ、並びに、他の第１壁１４２と他の第１壁１２２との間の空隙ｄとは異なる。
【0057】
最適なペア（ｄ，ｖ）、つまり、流体Ｆからの血小板の放出を最適化する乱流を発生させることができるペアは、以前に見たものと同じである。この段階で、本発明に係る方法は、図３ａ及び図３ｂで概略的に示された構成のシステム１を使用して、先に説明した２つの実施形態に従って実施できることに留意されたい。したがって、内側シリンダ１１だけを回動させるのと同様、内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３を逆方向に回動させることも可能である。どのような構成を考えても、最適なペア（ｄ，ｖ）は同じであり、得られる血小板放出効率も同様である。留意すべき点として、図１ａ及び図１ｂで示される構成と比較して、図３ａ及び図３ｂで示される構成は、処理される流体Ｆの量を大幅に増加できることが、有利である。
【0058】
空隙ｄと、内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３の回動速度ｖとに加え、第３パラメータ、すなわちリザーバ内の流体の滞留時間によって、血小板放出現象に影響を与えることも可能である。念のためとして、図１ａ及び図１ｂで例示されるシステム１では、空間１５が流体Ｆ用のリザーバを形成するのに対し、図３ａ及び図３ｂで例示されるシステム１では、流体Ｆ用のリザーバを形成するのは空間１５だけでなく、平行な円筒壁の間に形成されるすべての空間も、である。いずれの場合にも流体の滞留時間を変化させるために、システム１には、フレームの高さに入口オリフィス（図示せず）を、外側シリンダのベース１３ａの高さに出口オリフィス（図示せず）を設けることができ、それぞれ流体Ｆがリザーバに浸透し、リザーバから出ることができる。
【0059】
さらに、デバイスが入口オリフィスと出口オリフィスとを備えている場合、どのような構成を想定しても、つまり、内側と外側の２つのシリンダ１１、１３が逆方向に回動する場合でも、あるいは、内側シリンダ１１だけが回動する場合であっても、リザーバ内で流体Ｆを循環させるプロセスを設定することが可能である。流体の循環は、すでに処理されてリザーバから抜き出された流体を絶えず回収し、リザーバからの未処理の流体と交換することを伴う。当然のことながら、かかる循環は、流体Ｆが外部媒体及び汚染源に曝されることがないよう、閉ループで行われれば都合が良い。したがって、循環によってバッチ処理法を連続処理法に変えることができる。これは特に産業用途に有利である。
【0060】
流体の滞留時間は、開口径、より一般的には、出口オリフィスの開口断面に作用することによって、より明確に制御される。これにより、巨核球を含む流体Ｆを継続的に処理することが可能になるため、本発明に係る方法の産業化に向けた更なる一歩となる。この構成では、流体Ｆが継続的に処理され、僅か１時間で数リットルの流体を処理できることから、システム１の寸法はそれほど重要ではない。つまり、血小板放出効率を最適化するよう、流体の滞留時間を選択する必要がある。
【0061】
リザーバ内の流体Ｆの滞留時間は、４分～６分、好ましくは、約５分であれば都合が良い。リザーバ内の液の滞留時間が５分未満の場合、血小板放出効率は最適ではない。しかし、リザーバ内の流体の滞留時間が５分を超えると、新たな利点は見られない。つまり、血小板放出効率が上がらないのは、流体Ｆがリザーバ内に５分以上留まるからである。したがって、滞留時間が５分を超える必要はない。このことは、前述の方法のいずれの実装形態において、すなわち、図１ａ及び図１ｂに示されるシステム１、又は図３ａ及び図３ｂに示されるシステム１において、内側シリンダ１１と外側シリンダ１３とが逆方向に回動する場合、並びに、図１ａ及び図１ｂに示されるシステム１、又は図３ａ及び図３ｂに示されるシステム１において、内側シリンダ１１のみが回動する場合においても認められた。
【0062】
図４ａ及び図４ｂを参照されたい。本発明に係る第２実施形態では、これは２つのコンベヤベルト１７、１８を含むシステム１によって実施される。コンベヤベルト１７、１８はそれぞれ、２つのガイド手段１７ｂ、１８ｂを中心に密接して配置されたエンドレスストリップ１７ａ、１８ａを含む。ガイド手段１７ｂ、１８ｂはローラ状である。エンドレスストリップが、各コンベヤベルト１７、１８の側縁のガイド手段１７ｂ、１８ｂの外輪郭と完全に一致するよう、かつ、エンドレスストリップがガイド手段の外輪郭と一致するエリア外では、エンドレスストリップ１７ａ、１８ａが比較的広い平坦表面を有するよう、これらガイド手段は、エンドレスストリップ１７ａ、１８ａに張力をかけるのに十分な距離を隔てている。「広い（寸法）」とは、数センチから数十センチまでの平坦表面を意味する。
【0063】
「上位ベルト」と称する第１コンベヤベルト１７は、前記上位ベルト１７の平坦表面の１つに対応する第１平面壁１２を含み、「下位ベルト」と称する第２コンベヤベルト１８は、前記下位ベルト１８の平坦表面の１つに対応する第２平面壁１４を含む。上位ベルト１７と下位ベルト１８は重ね合わされている。つまり、上位ベルト１７は下位ベルト１８に対向して配置されている。また、第１実施形態（図１ａ～図３ｂ）と同様、第１壁１２と第２壁１４とが平行で、少なくとも部分的に対向するように、下位ベルト１８と平行に配置される。注意すべき点として、「上位」と「下位」という語句は、限定的となることを意図するものではなく、図を参照して本発明を理解しやすくするためだけのものである。
【0064】
上位ベルト１７は下位ベルトから非ゼロ距離ｄだけ隔置され、これにより２つのベルトの間に空間１５が形成される。上位ベルト１７と下位ベルト１８との間に位置する空間１５は、システム１の第１実施形態における内側シリンダ１１と外側シリンダ１３との間に位置する空間１５と同様である。しかし、第１実施形態と同様、これは流体Ｆを収容することができるが、第１実施形態とは異なり、流体Ｆ用の閉鎖リザーバを形成しない。実際、図４ａ及び図４ｂに示される実施形態では、システム１は、コンベヤベルト１７、１８が配置されるリザーバ２０を含む。このリザーバには、前述の流体Ｆが含まれている。さらに、システム１は、コンベヤベルト１７、１８が図４ａ及び図４ｂで示す位置を取れるようにするフレーム（図示せず）も含む。
【0065】
エンドレスストリップ１７ａ、１８ａは移動可能である。この点について、ガイド手段１７ｂ、１８ｂは、それぞれの回動軸Ａ１７、Ａ´１７、Ａ１８、Ａ´１８を中心に、駆動システムによって回動を誘導する。第１実施形態の駆動システムと同様、これは、電源システム、１つ以上のモータ、並びに１つ又は複数のモータを制御するために使用される速度調整システムを含む。この駆動システムにより、規定速度を前記ガイド手段１７ｂ、１８ｂに個別に適用することができる。ガイド手段１７ｂ、１８ｂは、それぞれの回動軸を中心にいずれかの方向に回動することができ、その結果として、エンドレスストリップ１７ａ、１８ａを所与の方向に移動させる。
【0066】
したがって、エンドレスストリップ１７ａ、１８ａを逆方向に回動させて、前記第１壁及び第２壁１２、１４をそれぞれ、その平面内で移動させるか、又は、エンドレスストリップ１７ａ、１８ａの一方のみを回動させ、第１壁及び第２壁１２、１４の一方をその平面内で移動させるかの何れかにより、本発明に係る方法を実行することができる。そして、当業者であれば、第１実施形態と同様、このようにして、流体Ｆに含まれる巨核球からの血小板の放出に適した乱流の流れ状態を空間１５内で生成できることを、理解するであろう。血小板放出効率を更に向上させるには、最適な空隙ｄを選択すれば十分である。同時に、ガイド手段の回動速度ｖを適切な範囲、すなわち流体Ｆの流れの状態が血小板の放出を最適化できる速度範囲に選択すれば十分である。回動速度はこのパラメータに依存するため、コンベヤベルト１７、１８の寸法を十分に考慮して、乱流の流れ状態を達成するように回動速度を選択する。
【0067】
上位コンベヤベルト１７と下位コンベヤベルト１８とが同じ速度で逆方向に移動すれば都合が良い。この構成では、流体は第１壁１２と第２壁１４との間で平均的に静止したままであるにもかかわらず、更にせん断される。さらに、この構成では、その場合、最適な滞留時間は、内側シリンダ１１及び外側シリンダ１３を備えた実施形態と同じである、すなわち、最適な血小板放出効率を得るには、４分～６分、好ましくは約５分の滞留時間で十分であるはずである。とはいえ、コンベヤベルト１７、１８間の回動速度に差があれば、流体Ｆの連続供給を想定できるので、これは強制ではない。
【0068】
あるいは、上位コンベヤベルト１７と下位コンベヤベルト１８、ひいては、２つの壁１２、１４は、平均値に対して最大でも１０％の速度差で移動する。デバイス１の設計に柔軟性を持たせながら、流体の適切なせん断が維持される。
【0069】
この第２実施形態のシステム１は、コンベヤベルトのレイノルズ数の計算が異なる点を除き、第１実施形態のシステム１と同様に動作する。実際、シリンダの直径が非常に大きな値に近づいたり、無限大に近づいたりすると、このシリンダの円筒壁は平面壁と同一に見なすことができる。例えば、シリンダ１１、１３の寸法が数センチメートルから数十センチメートルの間で変化することが分かっている第１実施形態で使用されるシステム１について検討する場合、非常に大きな円筒壁は、直径が少なくとも１メートル程度となる。従って、局所的には、こうした壁は平坦とみなすことができる。システム１の第２実施形態では、コンベヤベルト１７、１８の第１壁１２と第２壁１４は、非常に大きな直径のシリンダの壁と見なすことができる。このことは、２つのシリンダ１１、１３が回動する構成、並びに内側シリンダ１１のみが回動する構成において、第１実施形態に係るシステム１に関連して見られる乱流に伴う現象が、２つのコンベヤベルトを備えたシステム１によって再現できる理由を説明する。
【0070】
さらに、図５ａで見られるように、より多くのコンベヤベルトを設けることも可能である。図５ａで示す変形形態では、追加的な一対のコンベヤベルト１７´、１８´もシステム１に設けられている。これらは上位コンベヤベルト１７及び下位コンベヤベルト１８に重ねられているため、４つのコンベヤベルトと３つの空間１５を備えたシステム１が得られる。これらの空間１５はそれぞれ乱流エリアを構成する。コンベヤベルトの数は限定的なものではなく、より多くのベルトを想定することもできるが、ただし、リザーバ２０の寸法が、想定されるコンベヤベルトの数を収容するのに適切であることを前提とする。コンベヤベルトの数が多いほど、処理できる流体Ｆの量は多くなる。この実施形態例を、図３ａ及び図３ｂに示すシステム１の実施形態例と比較するべきであるが、この実施形態例では、空間１５が、各シリンダ内の一組の他の壁１２２、１４２によって大幅に拡張されている。
【0071】
図５ｂに示す実施形態の例示では、上位コンベヤベルト１７と下位コンベヤベルト１８は、より大きくなっている。これにより、空間１５の長さを長くすることができるので、処理される流体Ｆの量を増やすことができる。しかし、この選択肢は、より大きなガイド手段１７ｂ、１８ｂに関連する動作が技術的及び／又は経済的な制約をもたらす可能性がある限り、前の選択肢よりも制約が大きくなる恐れがある。
【0072】
＜本発明の材料と方法＞
図９で示すデバイスを使用して、本発明に係る方法を実施し、実験結果を以下の図に示し、さらに、以下の段落で解説する。
図９で示すデバイスを使用して、本発明に係る方法を実施し、実験結果を以下の図に示し、さらに、以下の段落で解説する。
【0073】
［培養中の巨核球の分化］
不安定な血液製剤の調製で使用される白血球除去フィルタ（ＴＡＣＳＩ、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社、Ｚａｖｅｎｔｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から、造血前駆細胞ＣＤ３４＋を抽出した。フィルタに含まれる細胞を溶出し、磁気ビーズ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した抗ＣＤ３４＋抗体を使用して磁気ソーティングを行うことにより、この細胞をＣＤ３４＋細胞として濃縮した。次に細胞を、２０μｇ／ｍＬのヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＳＣＦ、ＴＰＯ）のカクテル（ＣＣ２２０、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ、バンクーバー、ＢＣ州）、及び１μＭのＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したＳｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ）に播種した。７日目に細胞を回収、洗浄し、１μＭのＳＲ１、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯと、２０μｇ／ｍＬのＬＤＬとを含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭに播種し、更に６日間培養した（Ｓｔｒａｓｓｅｌら、２０１６）。３７℃、正常酸素条件下、５％のＣＯ２雰囲気下で、培養液をインキュベートした。
不安定な血液製剤の調製で使用される白血球除去フィルタ（ＴＡＣＳＩ、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社、Ｚａｖｅｎｔｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から、造血前駆細胞ＣＤ３４＋を抽出した。フィルタに含まれる細胞を溶出し、磁気ビーズ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した抗ＣＤ３４＋抗体を使用して磁気ソーティングを行うことにより、この細胞をＣＤ３４＋細胞として濃縮した。次に細胞を、２０μｇ／ｍＬのヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＳＣＦ、ＴＰＯ）のカクテル（ＣＣ２２０、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ、バンクーバー、ＢＣ州）、及び１μＭのＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したＳｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ）に播種した。７日目に細胞を回収、洗浄し、１μＭのＳＲ１、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯと、２０μｇ／ｍＬのＬＤＬとを含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭに播種し、更に６日間培養した（Ｓｔｒａｓｓｅｌら、２０１６）。３７℃、正常酸素条件下、５％のＣＯ２雰囲気下で、培養液をインキュベートした。
【0074】
［培養血小板の放出］
培養１３日後、巨核球は血小板前駆細胞と称する細胞質拡張（体）を示した。血小板前駆細胞巨核球を含む培地をＣｏｕｅｔｔｅデバイスに入れて、以下に定義するいずれかの構成で血小板を放出した。
培養１３日後、巨核球は血小板前駆細胞と称する細胞質拡張（体）を示した。血小板前駆細胞巨核球を含む培地をＣｏｕｅｔｔｅデバイスに入れて、以下に定義するいずれかの構成で血小板を放出した。
【0075】
以下のＣｏｕｅｔｔｅデバイスの２つの構成について、試験した：
－ デバイスの２つのロータ（内側シリンダ１１と外側シリンダ１３）が逆方向に回動する「２ロータ」構成
－ 内側ロータ１１のみが回動する「ロータアップ」構成。
互いに相対的に移動する、密に配置された２つの壁の間の流体について調査した流れのマッピングに基づいて、これらの構成を決定した。
－ デバイスの２つのロータ（内側シリンダ１１と外側シリンダ１３）が逆方向に回動する「２ロータ」構成
－ 内側ロータ１１のみが回動する「ロータアップ」構成。
互いに相対的に移動する、密に配置された２つの壁の間の流体について調査した流れのマッピングに基づいて、これらの構成を決定した。
【0076】
キャリブレーション用ビーズ（ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標），ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を含むチューブを使用して、放出された血小板の数を推定した。５，０００個のビーズを通過させた場合の血小板数を示し、続いて、Ｄ７での細胞あたりの血小板数、及びＤ０でのＣＤ３４＋細胞の播種数に減らした。
【0077】
［形態学的調査（図１４）］
パラホルムアルデヒドで固定後、血小板をサイトスピンし、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、抗β１－チューブリン抗体（１μｇ／ｍＬ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）でインキュベートし、その後、ＧＡＭ－４８８二次抗体（１０μｇ／ｍＬ）及び抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１％のＰＢＳで希釈した。次に、細胞をＭｏｗｉｏｌ（Ｍｏｕｎｔａｎｔ、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＫ）に取り込み、オイル対物レンズ（Ｆ型浸液、ｎｅ２３＝１．５１８０、ｖｅ＝４６、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を装着した共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｒｕｅｉｌ－Ｍａｌｍａｉｓｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）で観察した。ＬＡＳＡＦソフトウェア、バージョン１．６２（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、データを取得した。
パラホルムアルデヒドで固定後、血小板をサイトスピンし、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、抗β１－チューブリン抗体（１μｇ／ｍＬ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）でインキュベートし、その後、ＧＡＭ－４８８二次抗体（１０μｇ／ｍＬ）及び抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１％のＰＢＳで希釈した。次に、細胞をＭｏｗｉｏｌ（Ｍｏｕｎｔａｎｔ、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＫ）に取り込み、オイル対物レンズ（Ｆ型浸液、ｎｅ２３＝１．５１８０、ｖｅ＝４６、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を装着した共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｒｕｅｉｌ－Ｍａｌｍａｉｓｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）で観察した。ＬＡＳＡＦソフトウェア、バージョン１．６２（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、データを取得した。
【0078】
［ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能性の調査］
活性化能力（図１２）
活性化アッセイでは、血小板懸濁液をＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａとＧＰＩｂαに対する抗体で標識化し、室温で１０分間インキュベートした。抗ＣＤ６２Ｐ抗体、ＰＡＣ１抗体（活性化型抗ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ）、アイソトープコントロールのいずれかを含む、３種類の分析チューブを作製した。室温で１０分間インキュベートした後、１０μｇ／ｍＬの１０μＭ ＴＲＡＰ（活性化チューブ用）又はＰＢＳ（非活性化チューブ用）を加えた。活性化血小板の割合をフローサイトメトリで分析した。
活性化能力（図１２）
活性化アッセイでは、血小板懸濁液をＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａとＧＰＩｂαに対する抗体で標識化し、室温で１０分間インキュベートした。抗ＣＤ６２Ｐ抗体、ＰＡＣ１抗体（活性化型抗ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ）、アイソトープコントロールのいずれかを含む、３種類の分析チューブを作製した。室温で１０分間インキュベートした後、１０μｇ／ｍＬの１０μＭ ＴＲＡＰ（活性化チューブ用）又はＰＢＳ（非活性化チューブ用）を加えた。活性化血小板の割合をフローサイトメトリで分析した。
【0079】
糖タンパク質の発現（図１１）
糖タンパク質の発現アッセイでは、ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＧＰＩｂα、ＧＰＩｂβ、ＧＰＶ、ＧＰＩＸ、ＧＰＶＩ及びＣＤ９に対する抗体で血小板懸濁液を標識化した。室温で３０分間インキュベートした後、サンプルをフローサイトメトリで分析した。複数の蛍光色素を使用する場合の分析窓を決定するために、ＦＭＯ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ）を実施した。
糖タンパク質の発現アッセイでは、ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＧＰＩｂα、ＧＰＩｂβ、ＧＰＶ、ＧＰＩＸ、ＧＰＶＩ及びＣＤ９に対する抗体で血小板懸濁液を標識化した。室温で３０分間インキュベートした後、サンプルをフローサイトメトリで分析した。複数の蛍光色素を使用する場合の分析窓を決定するために、ＦＭＯ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ）を実施した。
【0080】
［Ｉｎ ｖｉｖｏでの機能性の調査（図１３）］
輸血後の再循環
血小板前駆細胞巨核球を含む培地に、０．５μＭのイロプロスト（Ｉｌｏｍｅｄｉｎｅ０．１ｍｇ／１ｍｌ、Ｂａｙｅｒ ＡＧ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した後、培養血小板を採取した。次に血小板を遠心分離し、文献（Ｈｅｃｈｌｅｒら、２０１３；Ｓｔｒａｓｓｅｌら、２０１６）に記載されているように、アルブミンを含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液に再懸濁した。最終洗浄工程の後、３分の１の血漿と、３分の２の添加液としてインターソル（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｈｏｍｂｕｒｇ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）とからなる保存液に、血小板を移した。この保存液は、ｎａｔｉｖｅ血小板の保存と輸血に使用される。
輸血後の再循環
血小板前駆細胞巨核球を含む培地に、０．５μＭのイロプロスト（Ｉｌｏｍｅｄｉｎｅ０．１ｍｇ／１ｍｌ、Ｂａｙｅｒ ＡＧ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した後、培養血小板を採取した。次に血小板を遠心分離し、文献（Ｈｅｃｈｌｅｒら、２０１３；Ｓｔｒａｓｓｅｌら、２０１６）に記載されているように、アルブミンを含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液に再懸濁した。最終洗浄工程の後、３分の１の血漿と、３分の２の添加液としてインターソル（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｈｏｍｂｕｒｇ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）とからなる保存液に、血小板を移した。この保存液は、ｎａｔｉｖｅ血小板の保存と輸血に使用される。
【0081】
ＭＣＰ（混合血小板濃縮物）からの培養、又はｎａｔｉｖｅの５×１０７の洗浄済みヒト血小板を含むアリコートを、あらかじめマクロファージを枯渇させた（１日目にクロドロネートリポソームを注射することによる）ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ ｓｃｉｄ、Ｉｌ２ｒｇ ｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）に眼窩後静脈を介して注射した。
【0082】
輸血後３分、６分、１０分、１５分、３０分、１２０分、２４０分、１４００分、２８００分、及び４３２０分に採取した全血サンプルについて、フローサイトメトリによりヒト及びマウスの血小板の循環を分析した。各血液サンプルを、ヒトとマウスのＧＰＩｂβを認識するＲＡＭ．１－５６８抗体、及びヒトＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａのみを認識するＡＬＭＡ１７－４８８抗体で標識した後、フローサイトメトリで分析した（Ｄｏ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏら、２０２０）。結果を比較できるようにするため、分析の第１段階の３分後に、ヒト血小板数の全血小板数に対する比率を、任意で１に設定した。
【符号の説明】
【0083】
１ システム
１１ 内側シリンダ
１２ 内側シリンダの円筒壁、または、コンベヤベルトの平面壁
１３ 外側シリンダ
１３ａ 外側シリンダのベース
１４ 外側シリンダの円筒壁、または、コンベヤベルトの平面壁
１５ 空間
１１ 内側シリンダ
１２ 内側シリンダの円筒壁、または、コンベヤベルトの平面壁
１３ 外側シリンダ
１３ａ 外側シリンダのベース
１４ 外側シリンダの円筒壁、または、コンベヤベルトの平面壁
１５ 空間
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【国際調査報告】