特表 2024-517642 ウイルスワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ウイルスワクチン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/50 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 7/04 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/50 ZNA

C12N7/04

C07K14/165

A61K39/215

A61P31/14

A61P37/04

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023564119

(86)(22)【出願日】2022-04-20

(85)【翻訳文提出日】2023-12-15

(86)【国際出願番号】 EP2022060417

(87)【国際公開番号】W WO2022223617

(87)【国際公開日】2022-10-27

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/060273

(32)【優先日】2021-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522021206

【氏名又は名称】ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア

【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＳＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】シャヒン，ウール

(72)【発明者】

【氏名】ムイク，アレクサンダー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA45

4C084AA13

4C084MA41

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB331

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC08

4C085DD62

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ウイルス感染予防または処置の分野に関し、特に、本開示は、ウイルス感染に対してワクチン接種し、抗体および／またはＴ細胞応答などの有効なウイルス抗原特異的免疫応答を誘導するための薬剤ならびにこのような薬剤を作製および使用する方法に関する。ここに開示するＲＮＡなどの薬剤の対象への投与は、ウイルス感染にから該対象を保護し得る。具体的に、本開示は、ウイルスタンパク質の他のバリアントにおいて見出されるアミノ酸修飾を有するウイルスタンパク質の少なくとも一部分を含むアミノ酸配列に関する。アミノ酸配列のうち１つまたは複数をコードするＲＮＡの投与は、多様なウイルスバリアントに対する保護を提供し得る。ここに記載する方法および薬剤は、特に、コロナウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防または処置にとって有用である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置と比較して修飾されている、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）におけるアミノ酸位置を同定する工程、および
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含み、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、アミノ酸配列、または修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する工程
を含む方法。

【請求項2】

工程ｂ）を反復して、修飾されたアミノ酸配列のうち２もしくはそれ以上、または修飾されたアミノ酸配列のうち２もしくはそれ以上をコードするヌクレオチド配列のうち２もしくはそれ以上を提供することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列が、同一の親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に基づく、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列中のアミノ酸修飾が、少なくとも部分的に異なっている、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

ヌクレオチド配列を提供することが、
ｂ’）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

工程ｂ’）を反復して、修飾されたアミノ酸配列のうち２またはそれ以上をコードする変異されたヌクレオチド配列のうち２またはそれ以上を提供することを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列が、同一の親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に基づく、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列中のアミノ酸修飾が、少なくとも部分的に異なっている、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

ａ）１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置と比較して修飾されている親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）中のアミノ酸位置を同定する工程、
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする第１の変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程、および
ｃ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする第２の変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾が、ｃ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている、方法。

【請求項10】

第１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列中に含まれる親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントと、第２のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列中に含まれる親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントが、同一である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

第１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と、第２のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が、同一である、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列が、同一である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

第１の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸位置のうち１つまたは複数が、第２の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸位置とは異なる、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

第１の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の、および第２の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の、修飾された修飾アミノ酸位置中の１つまたは複数のアミノ酸が、互いに異なる、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）および／または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列が、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むワクチンを提供することをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

核酸がＲＮＡである、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを生成する方法である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

ワクチンがＲＮＡワクチンである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

ワクチンが、免疫回避のリスクが低減している、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

修飾されたアミノ酸位置のうち１つまたは複数が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）および／または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に位置する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

修飾されたアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントのアミノ酸配列が親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のアミノ酸配列とは異なっているアミノ酸位置である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

修飾されたアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントのアミノ酸配列が野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のアミノ酸配列とは異なっているアミノ酸位置である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

修飾されたアミノ酸位置が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体の可能性のある部位である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体回避変異体である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する抗体による中和に対して耐性である、請求項２６または２７に記載の方法。

【請求項29】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質が、抗体結合の低減を示す、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者の処置のために使用される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを用いて処置された患者において生成される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質中のアミノ酸位置が修飾されていない、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質が、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＳタンパク質である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、天然単離株である、または親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、天然単離株の変異体である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、流行しているまたは迅速に広がっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項37】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、懸念されるバリアントであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ バリアントである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、Ｂ.１.１.７である、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントが、野生型 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントが、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質および／または親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント中のアミノ酸位置が修飾されている、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントのうち１つまたは複数が、１つまたは複数の ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＳタンパク質である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つもしくは複数が、天然単離株である、または１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つもしくは複数が、天然単離株の変異体である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つまたは複数が、流行しているまたは迅速に広がっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である、請求項４２または４３に記載の方法。

【請求項45】

１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つまたは複数が、懸念されるバリアントであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つまたは複数が、Ｂ.１.３５１、Ｂ.１.１.２９８、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９、Ｂ.１.５２６およびＰ１からなる群から選択される、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株および１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、流行しているまたは迅速に広がっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株および１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、懸念されるバリアントであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ バリアント株である、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質および１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株がＢ.１.１.７であり、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が、Ｂ.１.３５１、Ｂ.１.１.２９８、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９、Ｂ.１.５２６およびＰ１からなる群から選択される、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントが、少なくとも２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントを含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

ｂ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントが、ｃ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントとは異なっている、請求項９～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

ｂ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントが、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９およびＢ.１.５２６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントであり、ｃ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントが、Ｂ.１.３５１、Ｐ.１およびＢ.１.１.２９８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントである、請求項９～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較した親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質中のアミノ酸修飾が、修飾されたアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾に干渉しない、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較した親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質中のアミノ酸修飾は、修飾されたアミノ酸位置中のアミノ酸修飾に対して近接した空間距離にない、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

修飾されたアミノ酸配列において、修飾されたアミノ酸位置における修飾が、大きな構造転位をもたらさない、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

修飾されたアミノ酸位置におけるアミノ酸が、表面に露出している、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

修飾されたアミノ酸位置が、少なくとも２つのアミノ酸位置を含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

ｂ）およびｃ）における修飾されたアミノ酸位置が各々、少なくとも２つのアミノ酸位置を含む、請求項９～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

修飾されたアミノ酸位置が、
１８、２０、２６、８０、１３８、１４４、１９０、２１５、２４６、２５３、４１７、４３９、４５２、４５３、４７７、４８４、５０１、５７０、７０１、７１６、
１４０、３４５、３４６、３５２、３７８、４０６、４２０、４４０、４４１、４４４、４４５、４４６、４５０、４５５、４６０、４７５、４７８、４８５、４８６、４８７、４８９、４９０、４９３、４９４、４９９、
１４２、１４５、１４６、１４７、１５０、１５２、１５４、１５６、１５７、１５８、１６４、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５８、３６５、３６９、３７０、３７４、３７６、３８４、４０５、４０８、４１５、４２１、４４３、４４７、４４８、４５６、４７２、４７３、４７６、４９６、４９８、５００、５０４
からなる群から選択される２つ以上を含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

修飾されたアミノ酸位置における修飾が、
１８Ｆ、２０Ｎ、２６Ｓ、８０Ｙ、１３８Ｙ、１４４Ｆ、１９０Ｓ、２１５Ａ、２４６Ｉ、２５３Ｇ、４１７Ｎ、４３９Ｋ、４５２Ｒ、４５３Ｆ、４７７Ｎ、４８４Ｋ、５０１Ｙ、５７０Ｄ、７０１Ｖ、７１６Ｉ、
１４０Ｌ、３４５Ａ、３４６Ｋ、３５２Ｓ、３７８Ｎ、４０６Ｑ、４２０、４４０Ｋ、４４１Ｆ、４４４、４４５Ａ、４４６Ｖ、４５０Ｋ、４５５Ｆ、４６０Ｉ、４７５Ｖ、４７８Ｉ、４８５Ｖ、４８６Ｌ、４８７Ｄ、４８９、４９０Ｓ、４９３Ｌ、４９４Ｐ、４９９Ｈ、
１４２Ｓ、１４５Ｈ、１４６Ｙ、１４７Ｎ、１５０Ｒ、１５２Ｃ、１５４Ｑ、１５６Ａ、１５７Ｌ、１５８Ｇ、１６４Ｔ、２４７Ｇ、２４８Ｈ、２４９Ｓ、２５０Ｎ、２５１Ｓ、２５２Ｖ、２５４Ｆ、２５５Ｆ、２５８Ｌ、３６５Ｄ、３６９Ｃ、３７０Ｓ、３７４Ｌ、３７６Ｉ、３８４Ｌ、４０５Ｙ、４０８Ｉ、４１５Ｎ、４２１、４４３Ａ、４４７Ｖ、４４８Ｙ、４５６Ｌ、４７２Ｖ、４７３Ｆ、４７６Ｓ、４９６Ｃ、４９８Ｈ、５００Ｉ、５０４Ｄ
からなる群から選択される２つ以上を含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

修飾されたアミノ酸位置における修飾が、
Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ８０Ｙ、Ｄ１３８Ｙ、Ｙ１４４Ｆ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ａ、Ｒ２４６Ｉ、Ｄ２５３Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４３９Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、
Ｆ１４０Ｌ、Ｔ３４５Ａ、Ｒ３４６Ｋ、Ａ３５２Ｓ、Ｋ３７８Ｎ、Ｅ４０６Ｑ、Ｄ４２０、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｆ、Ｋ４４４、Ｖ４４５Ａ、Ｇ４４６Ｖ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５５Ｆ、Ｎ４６０Ｉ、Ａ４７５Ｖ、Ｔ４７８Ｉ、Ｇ４８５Ｖ、Ｆ４８６Ｌ、Ｎ４８７Ｄ、Ｙ４８９、Ｆ４９０Ｓ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｐ４９９Ｈ、
Ｇ１４２Ｓ、Ｙ１４５Ｈ、Ｈ１４６Ｙ、Ｋ１４７Ｎ、Ｋ１５０Ｒ、Ｗ１５２Ｃ、Ｅ１５４Ｑ、Ｅ１５６Ａ、Ｆ１５７Ｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｎ１６４Ｔ、Ｓ２４７Ｇ、Ｙ２４８Ｈ、Ｌ２４９Ｓ、Ｔ２５０Ｎ、Ｐ２５１Ｓ、Ｇ２５２Ｖ、Ｓ２５４Ｆ、Ｓ２５５Ｆ、Ｗ２５８Ｌ、Ｙ３６５Ｄ、Ｙ３６９Ｃ、Ｎ３７０Ｓ、Ｆ３７４Ｌ、Ｔ３７６Ｉ、Ｐ３８４Ｌ、Ｄ４０５Ｙ、Ｒ４０８Ｉ、Ｔ４１５Ｎ、Ｙ４２１、Ｓ４４３Ａ、Ｇ４４７Ｖ、Ｎ４４８Ｙ、Ｆ４５６Ｌ、Ｉ４７２Ｖ、Ｙ４７３Ｆ、Ｇ４７６Ｓ、Ｇ４９６Ｃ、Ｑ４９８Ｈ、Ｔ５００Ｉ、Ｇ５０４Ｄ
からなる群から選択される２つ以上を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

ａ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程、および
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾が、ａ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている、方法。

【請求項64】

核酸がＲＮＡである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

ａ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントにおけるアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸、および
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントにおけるアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾が、ａ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている、医薬製剤。

【請求項66】

核酸がＲＮＡである、請求項６５に記載の医薬製剤。

【請求項67】

ＲＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化されている、請求項６６に記載の医薬製剤。

【請求項68】

医薬組成物である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項69】

ワクチンである、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項70】

キットである、請求項６５～６９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項71】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するワクチン接種のための医薬製剤の使用上の指示をさらに含む、請求項７０に記載の医薬製剤。

【請求項72】

医薬用途のための、請求項６５～７１のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項73】

医薬用途が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するワクチン接種を含む、請求項７２に記載の医薬製剤。

【請求項74】

対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に請求項６５～７３のいずれか一項に記載の医薬製剤を投与することを含む、方法。

【請求項75】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する予防的処置のための方法である、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するワクチン接種のための方法である、請求項７４または７５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ウイルス感染予防または処置の分野に関する。特に、本開示はウイルス感染に対してワクチン接種し、抗体および／またはＴ細胞応答などの有効なウイルス抗原特異的免疫応答を誘導するための薬剤ならびにこのような薬剤を作製および使用するための方法に関する。ここに開示するＲＮＡなどの薬剤の対象への投与はウイルス感染に対して該対象を保護し得る。具体的に、本開示は、ウイルスタンパク質の他のバリアントにおいて見出されるアミノ酸修飾を有するウイルスタンパク質の少なくとも一部分を含むアミノ酸配列に関する。アミノ酸配列のうち１つまたは複数をコードするＲＮＡの投与は、多様なウイルスバリアントに対する保護を提供し得る。ここに記載する方法および薬剤は、特に、コロナウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防または処置にとって有用である。

【0002】

ウイルスが複製するにつれ、その遺伝子はランダムな「コピーエラー」（すなわち、遺伝子変異）を起こす。経時的に、これらの遺伝子コピーエラーは、ウイルスに対する他の変化の中でも、ウイルスの表面タンパク質または抗原の変更につながる可能性がある。遺伝子変異によって、ウイルス抗原が「ドリフト」を引き起こす場合がある－変異ウイルスの表面が元のウイルスとは異なって見えることを意味する。ウイルスドリフトが十分である場合には、ウイルスの古い株に対するワクチンおよびこれまでのウイルス感染からの免疫性は、新しい、ドリフト株に対してもはや有効ではない場合がある。そのため、人々は、より新しい、変異されたウイルスに対して脆弱となる場合がある。

【背景技術】

【0003】

コロナウイルスはスパイクタンパク質、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）の計４構造タンパク質をコードする、プラス鎖、一本鎖ＲＮＡ（（＋）ｓｓＲＮＡ）エンベロープウイルスである。スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）は受容体認識、細胞への付着、エンドソーム経路を介する感染およびウイルスとエンドソーム膜の融合により駆動されるゲノム放出を担う。異なるファミリーメンバー間の配列は変わるが、Ｓタンパク質内に保存領域およびモチーフがあり、それによりＳタンパク質をＳ１およびＳ２の２サブドメインに分割することが可能となる。Ｓ２はその膜貫通ドメインと共に、膜融合を担うが、Ｓ１ドメインはウイルス特異的受容体を認識し、標的宿主細胞と結合する。数コロナウイルス単離株内で、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が同定され、Ｓタンパク質の一般構造が定義された（図１）。

【0004】

２０１９年１２月、中国の武漢で原因不明の肺炎の大流行が起こり、新規コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が根本原因であることが明らかとなった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子配列はＷＨＯで利用できるようになり、公開（ＭＮ９０８９４７.３）され、該ウイルスはベータコロナウイルスサブファミリーに分類された。配列分析により、系統樹はヒトに感染する他のコロナウイルスよりも重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス単離株、すなわち中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルスとの密接な関係を明らかにした。

【0005】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびその結果生じる疾患ＣＯＶＩＤ－１９は、世界的に広がり、ますます多くの国々に影響を及ぼしている。２０２０年３月１１日に、ＷＨＯはＣＯＶＩＤ－１９大流行をパンデミックと特徴づけた。２０２０年１２月１日の時点で、世界中で６３００万人超がＣＯＶＩＤ－１９の症例と確認され、１４０万人超が死亡し、１９１の国／地域が影響を受けている。現在進行中のパンデミックは、依然として世界中の公衆衛生と経済の安定に対する重大な課題となっている。

【0006】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する既存の免疫性はないので、すべての個体が感染のリスクにある。感染後、すべての個体ではなく一部は、中和抗体応答および細胞介在免疫性の観点から感染防御免疫を発生する。しかし、この保護がどの程度およびどれほど長く持続するかは現在知られていない。ＷＨＯによれば、感染個体の８０％は、入院治療を必要とせずに回復するが、１５％はより重症の疾患を発症し、５％は集中治療を必要とする。年齢が高いことおよび医学的状態下にあることは、重症の疾患を発症するリスク因子と考えられる。

【0007】

ＣＯＶＩＤ－１９の症状は、一般に、咳および発熱を伴い、胸部Ｘ線撮影ではすりガラス状の陰影や斑状の陰影を示す。しかし、多数の患者は発熱またはＸ線撮影変化を呈さず、感染は無症候性である場合があり、これは、伝播の制御に関連する。症候性の対象については、疾患の進行は、人工呼吸を必要とする急性呼吸窮迫症候群およびその後の多臓器不全および死亡につながる場合がある。入院患者における一般的な症状として（最高から最低頻度の順で）、発熱、乾性咳、息切れ、疲労、筋肉痛、悪心／嘔吐または下痢、頭痛、脱力感および鼻漏が挙げられる。嗅覚消失（嗅覚の喪失）または味覚消失（味覚の喪失）は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する個体のおよそ３％における唯一の主症状であり得る。

【0008】

すべての年齢が疾患を呈し得るが、特に、致死率（ＣＦＲ）は６０歳を超える人では高い。心血管疾患、糖尿病、高血圧症および慢性呼吸器疾患を含む併存疾患もＣＦＲの増大と関連する。感染患者に対する職業的曝露のためにＣＯＶＩＤ－１９患者の中では医療従事者が大きな比率を占めている。

【0009】

ほとんどの状況において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するため、および感染を確認するために分子検査が使用される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡを標的とする逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）検査法は、ＣＯＶＩＤ－１９の疑いのある症例を診断するための標準的なインビトロ法である。検査されるべき試料は、鼻および／または咽頭からスワブで収集される。

【0010】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、４つの構造タンパク質を有するＲＮＡウイルスである。そのうち１つであるスパイクタンパク質は、宿主細胞上に存在するアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）に結合する表面タンパク質である。したがって、スパイクタンパク質は、ワクチン開発のための関連抗原と考えられている。

【0011】

ＢＮＴ１６２ｂ２は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防のためのｍＲＮＡワクチンであり、ＣＯＶＩＤ－１９の予防で９５％以上の有効性を実証した。ワクチンは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入された全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ｓ）をコードする５’キャップｍＲＮＡでできている。最終生成物は、活性物質としてＢＮＴ１６２ｂ２を含有する注射用分散物の濃縮物として提示される。他の成分として以下がある：ＡＬＣ－０３１５（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６,１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）、ＡＬＣ－０１５９（２－[（ポリエチレングリコール）－２０００]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド）、１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、スクロースおよび注射水。

【0012】

Ｓタンパク質の配列は、プログラムが開始される時点で入手可能であった「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離株武漢－Ｈｕ－１」の配列：GenBank: MN908947.3（完全ゲノム）およびGenBank: QHD43416.1（スパイク表面糖タンパク質）に基づいて選択された。活性物質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク抗原に翻訳される、一本鎖の５’キャップコドン最適化ｍＲＮＡからなる。タンパク質配列は、抗原的に最適な融合前確認を確実にする２つのプロリン変異（Ｐ２ Ｓ）を含有する。ＲＮＡは、ウリジンを全く含有せず、ウリジンの代わりにＲＮＡ合成において修飾Ｎ１－メチルシュードウリジンが使用される。ＲＮＡは、高いＲＮＡ安定性および翻訳効率を媒介するために最適化された一般的な構造要素を含有する。ＬＮＰは、ＲＮＡをＲＮＡｓｅによる分解から保護し、筋肉内（ＩＭ）デリバリー後の宿主細胞のトランスフェクションを可能にする。ｍＲＮＡは宿主細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に翻訳される。次いで、Ｓタンパク質が細胞表面上に発現され、そこで、適応免疫応答を誘導する。Ｓタンパク質は、ウイルスに対する中和抗体の標的として同定されており、したがって、関連ワクチン構成成分と考えられる。ＢＮＴ１６２ｂ２は、２１日空けて投与される２回の３０μｇ用量の希釈ワクチン溶液で筋肉内に（ＩＭ）投与される。

【0013】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の新規循環バリアントが最近出現したために、ワクチン介入の地域的および時間的有効性について重大な懸念が生じている。出現し、急速に世界的に優勢となった最も初期のバリアントの１つにＤ６１４Ｇがあった。さらに、英国における最近のゲノム調査によって、Ｂ.１.１.７と呼ばれる（ＶＯＣ－２０２０１２／０１または５０１Ｙ.Ｖ１としても知られる）新規系統の急速な拡大増殖が示された。Ｂ.１.１.７は、スパイク中に、ＡＣＥ２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）中のＤ６１４ＧならびにＮ５０１Ｙを含む３つのアミノ酸の欠失および７つのミスセンス変異を有する。それは、複数の国において、本質的により感染性であり、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統よりも４０～７０％高いと推定されている成長速度を有すると示されている（Volz et al., 2021, Nature, https://doi.org/10.1038/s41586-021-03470-x; Washington et al., 2021, Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.052）。

【0014】

研究によって、ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンによって誘発されたヒト血清がＢ.１.１.７バリアントを交差中和することが実証され、これは、以前の感染または野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いるワクチン接種が、Ｂ.１.１.７バリアントに対する保護を依然として提供し得ることを示唆した（Muik A. et al., 2021、Science 371（6534):1152-1153）。

【0015】

ＲＢＤ中の２個のアミノ酸の欠失およびＹ４５３Ｆを含む４つのミスセンス変異を有する、ミンククラスター５またはＢ.１.１.２９８と呼ばれるバリアントによる、デンマークにおけるヒトとミンクとの間のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播のレポートもある。

【0016】

Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９と名付けられた、米国、カリフォルニア州において最近出現した他のバリアントは、スパイク中に４つのミスセンス変異を含有し、そのうちの１つは単一Ｌ４５２Ｒ ＲＢＤ変異である。

【0017】

Ｐ.２（３つのスパイクミスセンス変異を有する）およびＰ.１（１２のスパイクミスセンス変異を有する）と呼ばれるブラジルおよび日本において最初に記載されたＢ.１.１.２８系統から生じている新規バリアントは、ＲＢＤ中にＥ４８４Ｋ変異を含有し、これは、特に懸念されており、Ｐ.１はまた、特に、ＲＢＤ中にＫ４１７ＴおよびＮ５０１Ｙ変異を含有する。

【0018】

南アフリカで最初に報告され、その後世界中に広がったＢ.１.３５１系統（５０１Ｙ.Ｖ２とも呼ばれる）の複数の株の出現は、大きな懸念となっている。この系統は、ＲＢＤの外側のいくつかの変異に加えて３つのＲＢＤ変異、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙを有する。ＢＮＴ１６２ｂ２によって誘発された血清を使用して、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０株の中和と比較して、Ｂ.１.１.７－スパイクおよびＰ.１－スパイクウイルスの中和はおよそ同等であり、Ｂ.１.３５１－スパイクウイルスの中和は、頑強であるがより低いことが報告された（Liu Y. et al., 2021, N Engl J Med., doi: 10.1056/NEJMc2102017. Epub ahead of print. PMID: 33684280）。免疫応答を少なくとも部分的に回避すると思われる新規バリアントの出現を考慮して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントに対して有効であるワクチンが必要がある。

【0019】

本開示は、多様なウイルスタンパク質バリアントのエピトープを含むワクチンおよびこのようなワクチンを提供する方法を提供する。既存のワクチンを異なるウイルスバリアントの多様なウイルスタンパク質配列またはコーディング核酸を含むように再製剤化する代わりに、ここに記載される戦略は、制限された数の分子上の異なるウイルスバリアントの多様なエピトープを組み合わせることに基づいている。これによって、有効な免疫応答を誘導する各エピトープの十分に高い用量を達成しながら、相対的に低用量の有効成分、特に、ｍＲＮＡの投与が可能となる。ここに記載するワクチンは、広く中和する抗体を誘発することが可能であり、したがって、進行中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックを解決するのに適しているということが想定される。

【発明の概要】

【0020】

概要
本発明は、一般に、ウイルスタンパク質の異なるバリアントのエピトープが単一分子上で組み合わされているワクチンに関する。このような分子は、ウイルスタンパク質の他のバリアント中に存在するアミノ酸修飾を含むウイルスタンパク質の少なくとも一部分を含む。修飾は、このような他のウイルスタンパク質バリアントに対して特異的である（さらなる）エピトープを生成する。したがって、ここに記載する修飾されたウイルスタンパク質配列は、多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列である。ある実施態様において、多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列は、修飾された全長ウイルスタンパク質である。ある実施態様において、多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列は、ウイルスタンパク質の修飾された部分である。

【0021】

一部の実施態様において、ここに提供される多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列は、複数（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０などを含む、例えば、少なくとも２以上）のウイルスタンパク質バリアントからの免疫反応性エピトープ（（修飾された）アミノ酸残基）、例えば、親ウイルスタンパク質からの免疫反応性エピトープおよびさらに親ウイルスタンパク質とは異なっている１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントからの免疫反応性エピトープを含み得る。種々の実施態様において、ここに提供される多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列は、親ウイルスタンパク質とは異なっている１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントからのすべての免疫反応性エピトープ（（修飾された）アミノ酸残基）またはその一部分を含み得る。種々の実施態様において、ここに提供される多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列は、親ウイルスタンパク質とは異なっている１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントからの複数（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０などを含む、例えば、少なくとも２以上）の免疫反応性エピトープ（（修飾された）アミノ酸残基）を含み得る。

【0022】

一部の実施態様において、多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、特に、ＲＮＡなどの核酸によってコードされる。一部の実施態様において、各々が多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含む複数のアミノ酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、特に、ＲＮＡなどの核酸によってコードされる。一部の実施態様において、各々が多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含む複数のアミノ酸配列は、複数の核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、特に、ＲＮＡ分子によってコードされる。

【0023】

ＲＮＡウイルスなどのウイルスの遺伝的多様性を考慮すると、複数のウイルスバリアントに対する保護を提供するために、ここに記載する多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列およびこれらのアミノ酸配列をコードする核酸は特に有用である。ここに記載する多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列およびこれらのアミノ酸配列をコードする核酸は、多様なおよび／または他の点で頑強な（例えば、永続性、例えば、１回または複数回用量の投与後約５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日またはそれ以上検出可能な）中和抗体および／またはＴ細胞応答、例えば、ＴＨ１型Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）応答を獲得する機会を提供し得る。制限された数の構築物中の、ここに記載する多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする核酸は、複数（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０などを含む、例えば、少なくとも２以上）のウイルスバリアント株を広く、および特異的に中和し、さまざまなウイルスバリアント株に対する防御免疫応答を生成する可能性を有する免疫応答、特に、抗体応答を誘発すると予測される。一般に、制限された数の構築物は、異なるウイルスタンパク質バリアントの数よりも少ないいくつかの分子（タンパク質および／または核酸分子）、例えば、１、２、３または４分子を含み、その結果、各分子は、複数のウイルスタンパク質バリアントに対応するエピトープ配列を含む。一般に、ここに記載する多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列、すなわち、ワクチン抗原を含むアミノ酸配列およびこれらのアミノ酸配列をコードする核酸は、対象の免疫治療処置にとって有用である。ワクチン抗原は、複数のウイルスタンパク質バリアント、したがって、ウイルスバリアント株に由来する、および対象においてそれに対する免疫応答を誘導することについて特異的であるウイルスタンパク質エピトープを含む。ある実施態様において、本発明は、ここに記載するワクチン抗原のうち１つまたは複数をコードするＲＮＡなどの核酸、すなわち、ワクチンＲＮＡの投与を含む。ある実施態様において、本発明は、異なるワクチン抗原をコードするＲＮＡ分子などの核酸分子のうちの複数、例えば、２、３または４つの投与を含む。異なるワクチン抗原（同一の親ウイルスタンパク質配列に基づく可能性が高い）は、異なる修飾（異なるウイルス株に由来してもよい）、ひいては、異なる免疫原性スペクトルを含み得る。ワクチン抗原をコードするＲＮＡは投与されると、標的抗原（ウイルスタンパク質、特に異なるウイルスタンパク質バリアント）またはその進行生成物に標的化される免疫応答、例えば、抗体および／または免疫エフェクター細胞の誘導、すなわち、刺激、プライミングおよび／または拡大増殖のための抗原を提供し得る（適切な標的細胞によるＲＮＡの発現後）。ある実施態様において、本開示により誘導されるべき免疫応答はＢ細胞介在免疫応答、すなわち、抗体介在免疫応答である。これに加えてまたはこれとは別に、ある実施態様において、本開示により誘導されるべき免疫応答はＴ細胞介在免疫応答である。ある実施態様において、免疫応答は抗ウイルス免疫応答である。ある実施態様において、免疫応答は、複数のウイルス株に対して向けられる免疫応答である。

【0024】

ある態様において、本発明は、
ａ）１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置と比較して修飾される親ウイルスタンパク質中のアミノ酸位置を同定する工程、および
ｂ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含み、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、アミノ酸配列、または修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する工程
を含む方法に関する。

【0025】

ある実施態様において、方法は、工程ｂ）を反復して、修飾されたアミノ酸配列のうち２もしくはそれ以上、または修飾されたアミノ酸配列のうち２もしくはそれ以上をコードするヌクレオチド配列のうち２もしくはそれ以上を提供することを含む。

【0026】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列は、同一の親ウイルスタンパク質に基づく。

【0027】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列中のアミノ酸修飾は、少なくとも部分的に異なっている。

【0028】

ある実施態様において、ヌクレオチド配列を提供することは、
ｂ’）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含む。

【0029】

ある実施態様において、方法は、工程ｂ’）を反復して、アミノ酸配列のうち２もしくはそれ以上をコードする変異されたヌクレオチド配列のうち２もしくはそれ以上を提供することを含む。

【0030】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列は、同一の親ウイルスタンパク質に基づく。

【0031】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列中のアミノ酸修飾は、少なくとも部分的に異なっている。

【0032】

ある態様において、本発明は、
ａ）１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置と比較して修飾されている親ウイルスタンパク質中のアミノ酸位置を同定する工程、
ｂ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする第１の変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程、および
ｃ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする第２の変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾は、ｃ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている、方法に関する。

【0033】

ある実施態様において、方法は、コドンを置換して少なくとも部分的に異なるアミノ酸修飾をコードする変異されたヌクレオチド配列を得る、１つまたは複数のさらなるこのような工程を含み得る。

【0034】

ある実施態様において、第１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列中に含まれる親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントと、第２のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列中に含まれる親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントは、同一である。

【0035】

ある実施態様において、第１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と、第２のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、同一である。

【0036】

ある実施態様において、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列は、同一である。

【0037】

ある実施態様において、第１の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸位置のうち１つまたは複数は、第２の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸位置とは異なる、すなわち、１つまたは複数の異なる位置が修飾される。

【0038】

ある実施態様において、第１の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の、および第２の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の、修飾された修飾アミノ酸位置中の１つまたは複数のアミノ酸は、互いに異なる、すなわち、同一位置の１つまたは複数が修飾されているが、異なるアミノ酸残基を有する。

【0039】

ある実施態様において、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列は、全長ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を含む。

【0040】

ある実施態様において、方法は、修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供することをさらに含む。

【0041】

ある実施態様において、方法は、修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むワクチンを提供することをさらに含む。

【0042】

ある実施態様において、核酸はＲＮＡである。

【0043】

ある実施態様において、方法は、ワクチンを生成する方法である。

【0044】

ある実施態様において、ワクチンはＲＮＡワクチンである。

【0045】

ある実施態様において、ワクチンは、免疫回避のリスクが低減している。

【0046】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントのアミノ酸配列が、親ウイルスタンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸位置である。

【0047】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントのアミノ酸配列が、野生型ウイルスタンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸位置である。

【0048】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、ウイルスの回避変異体の可能性のある部位である。

【0049】

ある実施態様において、ウイルスの回避変異体は、ウイルスの抗体回避変異体である。

【0050】

ある実施態様において、ウイルスの回避変異体は、ウイルスタンパク質に対する抗体の中和に対して耐性である。

【0051】

ある実施態様において、ウイルスの回避変異体のウイルスタンパク質は、抗体結合の低減を示す。

【0052】

ある実施態様において、抗体は、ウイルスに感染した患者の処置のために使用される。

【0053】

ある実施態様において、抗体は、ウイルスによる感染に対するワクチンを用いて処置されている患者において生成される。

【0054】

ある実施態様において、親ウイルスタンパク質は、野生型ウイルスタンパク質と比較して修飾されている。

【0055】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ウイルスタンパク質と比較して修飾されている親ウイルスタンパク質中のアミノ酸位置は修飾されていない。

【0056】

ある実施態様において、親ウイルスタンパク質は、親ウイルス株のウイルスタンパク質である。

【0057】

ある実施態様において、親ウイルス株は、天然単離株である、または親ウイルス株は、天然単離株の変異体である。

【0058】

ある実施態様において、親ウイルス株は、流行しているまたは迅速に広がっているウイルスバリアント株である。

【0059】

ある実施態様において、親ウイルス株は、懸念されるバリアントであるウイルスバリアントである。

【0060】

ある実施態様において、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントは、野生型ウイルスタンパク質と比較して修飾されている。

【0061】

ある実施態様において、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントは、親ウイルスタンパク質と比較して修飾されている。

【0062】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ウイルスタンパク質および／または親ウイルスタンパク質と比較して修飾されている、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアント中のアミノ酸位置が修飾されている。

【0063】

ある実施態様において、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントのうち１つまたは複数（例えば、すべて）は、１つまたは複数のウイルス株のウイルスタンパク質である。

【0064】

ある実施態様において、１つもしくは複数のウイルス株のうち１つまたは複数（例えば、すべて）は、天然単離株である、または１つまたは複数のウイルス株のうち１つもしくは複数（例えば、すべて）は、天然単離株の変異体である。

【0065】

ある実施態様において、１つまたは複数のウイルス株のうち１つまたは複数（例えば、すべて）は、流行しているまたは迅速に広がっているウイルスバリアント株である。

【0066】

ある実施態様において、１つまたは複数のウイルス株のうち１つまたは複数（例えば、すべて）は、懸念されるバリアントであるウイルスバリアント株である。

【0067】

ある実施態様において、親ウイルス株および１つまたは複数のウイルス株は、流行しているまたは迅速に広がっているウイルスバリアント株である。

【0068】

ある実施態様において、親ウイルス株および１つまたは複数のウイルス株は、懸念されるバリアントであるウイルスバリアント株である。

【0069】

ある実施態様において、親ウイルスタンパク質および１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントは、野生型ウイルスタンパク質と比較して修飾されている。

【0070】

ある実施態様において、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントは、少なくとも２つのウイルス株のウイルスタンパク質バリアントを含む。

【0071】

ある実施態様において、ｂ）における１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントは、ｃ）における１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントとは異なっている。

【0072】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ウイルスタンパク質と比較した親ウイルスタンパク質中のアミノ酸修飾は、修飾されたアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾に干渉しない。

【0073】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ウイルスタンパク質と比較した親ウイルスタンパク質中のアミノ酸修飾は、修飾されたアミノ酸位置または修飾されたアミノ酸位置中のアミノ酸修飾に対して近接した空間距離にない。

【0074】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、修飾されたアミノ酸位置における修飾は、大きな構造転位をもたらさない。

【0075】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置におけるアミノ酸は、表面に露出している。

【0076】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、１つまたは複数の、例えば、少なくとも２つのアミノ酸位置を含む。修飾は、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアント／ウイルス株に対応する場合があり、親ウイルスタンパク質／ウイルス株またはその一部分と比較して１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアント／ウイルス株中に存在するすべての修飾を包含し得る。

【0077】

ある実施態様において、ｂ）およびｃ）における修飾されたアミノ酸位置は各々、１つまたは複数の、例えば、少なくとも２つのアミノ酸位置を含む。

【0078】

ある態様において、本発明は、
ａ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する工程であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程、および
ｂ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する工程であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾は、ａ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている、方法に関する。

【0079】

ある実施態様において、方法は、少なくとも部分的に異なるアミノ酸修飾をコードする核酸を提供する、１つまたは複数のさらなるこのような工程を含み得る。

【0080】

ある実施態様において、核酸はＲＮＡである。

【0081】

さらなる実施態様をここに記載する。

【0082】

ある態様において、本発明は、
ａ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントにおけるアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸、および
ｂ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントにおけるアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾は、ａ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている医薬製剤に関する。

【0083】

ある実施態様において、医薬製剤は、少なくとも部分的に異なるアミノ酸修飾をコードする１つまたは複数のさらなる核酸を含み得る。

【0084】

ある実施態様において、核酸はＲＮＡである。

【0085】

ある実施態様において、ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化されている。

【0086】

ある実施態様において、医薬製剤は医薬組成物である。

【0087】

ある実施態様において、医薬製剤はワクチンである。

【0088】

ある実施態様において、医薬製剤はキットである。

【0089】

ある実施態様において、医薬製剤は、ウイルスによる感染に対するワクチン接種のための医薬製剤の使用上の指示をさらに含む。

【0090】

ある態様において、本発明は、医薬用途のための医薬製剤に関する。

【0091】

ある実施態様において、医薬用途は、ウイルスによる感染に対するワクチン接種を含む。

【0092】

ある態様において、本発明は、対象に医薬製剤を投与することを含む、対象におけるウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関する。

【0093】

ある実施態様において、方法は、ウイルスによる感染に対する予防的処置のための方法である。

【0094】

ある実施態様において、方法は、ウイルスによる感染に対するワクチン接種のための方法である。

【0095】

上記の態様のさらなる実施態様は、ここに記載するとおりである。

【0096】

ある実施態様において、ここに記載するウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。ある実施態様において、ここに記載するウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）である。

【0097】

ある態様において、本発明は、
ａ）１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置と比較して修飾されている、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）におけるアミノ酸位置を同定する工程、および
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含み、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、アミノ酸配列、または修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する工程
を含む方法に関する。

【0098】

ある実施態様において、方法は、工程ｂ）を反復して、修飾されたアミノ酸配列のうち２もしくはそれ以上、またはい修飾されたアミノ酸配列のうち２もしくはそれ以上をコードするヌクレオチド配列のうち２もしくはそれ以上を提供することを含む。

【0099】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列は、同一の親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に基づく。

【0100】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列中のアミノ酸修飾は、少なくとも部分的に異なっている。

【0101】

ある実施態様において、ヌクレオチド配列を提供することは、
ｂ’）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含む。

【0102】

ある実施態様において、方法は、工程ｂ’）を反復して、修飾されたアミノ酸配列のうち２またはそれ以上をコードする変異されたヌクレオチド配列のうち２またはそれ以上を提供することを含む。

【0103】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列は、同一の親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に基づく。

【0104】

ある実施態様において、２つまたはそれ以上の修飾されたアミノ酸配列中のアミノ酸修飾は、少なくとも部分的に異なっている。

【0105】

ある態様において、本発明は、
ａ）１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置と比較して修飾されている親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）中のアミノ酸位置を同定する工程、
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする第１の変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程、および
ｃ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のコドンを、他のコドンと置換して、修飾されたアミノ酸配列をコードする第２の変異されたヌクレオチド配列を得る工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾は、ｃ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている、方法に関する。

【0106】

ある実施態様において、方法は、コドンを置換して少なくとも部分的に異なるアミノ酸修飾をコードする変異されたヌクレオチド配列を得る、１つまたは複数のさらなるこのような工程を含み得る。

【0107】

ある実施態様において、第１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列中に含まれる親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントと、第２のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列中に含まれる親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントは、同一である。

【0108】

ある実施態様において、第１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と、第２のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、同一である。

【0109】

ある実施態様において、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列は、同一である。

【0110】

ある実施態様において、第１の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸位置のうち１つまたは複数は、第２の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸位置とは異なる。

【0111】

ある実施態様において、第１の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の、および第２の変異されたヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたアミノ酸配列中の、修飾された修飾アミノ酸位置中の１つまたは複数のアミノ酸は、互いに異なる。

【0112】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）および／または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のアミノ酸配列を含む。

【0113】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のアミノ酸配列を含む。

【0114】

ある実施態様において、方法は、修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供することをさらに含む。

【0115】

ある実施態様において、方法は、修飾されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むワクチンを提供することをさらに含む。

【0116】

ある実施態様において、核酸はＲＮＡである。

【0117】

ある実施態様において、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを生成する方法である。

【0118】

ある実施態様において、ワクチンはＲＮＡワクチンである。

【0119】

ある実施態様において、ワクチンは、免疫回避のリスクが低減している。

【0120】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置のうち１つまたは複数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）および／または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に位置する。

【0121】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントのアミノ酸配列が親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のアミノ酸配列とは異なっているアミノ酸位置である。

【0122】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントのアミノ酸配列が野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のアミノ酸配列とは異なっているアミノ酸位置である。

【0123】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体の可能性のある部位である。

【0124】

ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体回避変異体である。

【0125】

ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する抗体による中和に対して耐性である。

【0126】

ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避変異体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、抗体結合の低減を示す。

【0127】

ある実施態様において、抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者の処置のために使用される。

【0128】

ある実施態様において、抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを用いて処置された患者において生成される。

【0129】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている。

【0130】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質中のアミノ酸位置は修飾されていない。

【0131】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＳタンパク質である。

【0132】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、天然単離株である、または親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、天然単離株の変異体である。

【0133】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、流行しているまたは迅速に広がっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である。

【0134】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、懸念されるバリアントであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ バリアントである。

【0135】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、Ｂ.１.１.７である。

【0136】

ある実施態様において、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、野生型 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている。

【0137】

ある実施態様において、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている。

【0138】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質および／または親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント中のアミノ酸位置が修飾されている。

【0139】

ある実施態様において、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントのうち１つまたは複数（例えば、すべて）は、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＳタンパク質である。

【0140】

ある実施態様において、１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つもしくは複数（例えば、すべて）は、天然単離株である、または１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つもしくは複数（例えば、すべて）は、天然単離株の変異体である。

【0141】

ある実施態様において、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つまたは複数（例えば、すべて）は、流行しているまたは迅速に広がっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である。

【0142】

ある実施態様において、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つまたは複数（例えば、すべて）は、懸念されるバリアントであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である。

【0143】

ある実施態様において、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうち１つまたは複数は、Ｂ.１.３５１、Ｂ.１.１.２９８、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９、Ｂ.１.５２６およびＰ１からなる群から選択される。

【0144】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株および１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、流行しているまたは迅速に広がっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株である。

【0145】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株および１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、懸念されるバリアントであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ バリアント株である。

【0146】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質および１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較して修飾されている。

【0147】

ある実施態様において、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株はＢ.１.１.７であり、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、Ｂ.１.３５１、Ｂ.１.１.２９８、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９、Ｂ.１.５２６、Ｐ１からなる群から選択される。

【0148】

ある実施態様において、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、少なくとも２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントを含む。

【0149】

ある実施態様において、ｂ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、ｃ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントとは異なっている。

【0150】

ある実施態様において、ｂ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９およびＢ.１.５２６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントであり、ｃ）における１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、Ｂ.１.３５１、Ｐ.１およびＢ.１.１.２９８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントである。

【0151】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較した親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質中のアミノ酸修飾は、修飾されたアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾に干渉しない。

【0152】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と比較した親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質中のアミノ酸修飾は、修飾されたアミノ酸位置または修飾されたアミノ酸位置中のアミノ酸修飾に対して近接した空間距離にない。

【0153】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸配列において、修飾されたアミノ酸位置における修飾は、大きな構造転位をもたらさない。

【0154】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置におけるアミノ酸は、表面に露出している。

【0155】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、１つまたは複数の、例えば、少なくとも２つのアミノ酸位置を含む。修飾は、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対応する場合があり、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株またはその一部分と比較して１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株中に存在するすべての修飾を包含し得る。

【0156】

ある実施態様において、ｂ）およびｃ）における修飾されたアミノ酸位置は各々、１つまたは複数の、例えば、少なくとも２つのアミノ酸位置を含む。

【0157】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置は、
１８、２０、２６、８０、１３８、１４４、１９０、２１５、２４６、２５３、４１７、４３９、４５２、４５３、４７７、４８４、５０１、５７０、７０１、７１６、
１４０、３４５、３４６、３５２、３７８、４０６、４２０、４４０、４４１、４４４、４４５、４４６、４５０、４５５、４６０、４７５、４７８、４８５、４８６、４８７、４８９、４９０、４９３、４９４、４９９、
１４２、１４５、１４６、１４７、１５０、１５２、１５４、１５６、１５７、１５８、１６４、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５８、３６５、３６９、３７０、３７４、３７６、３８４、４０５、４０８、４１５、４２１、４４３、４４７、４４８、４５６、４７２、４７３、４７６、４９６、４９８、５００、５０４
からなる群から選択される２つ以上を含む。

【0158】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置における修飾は、
１８Ｆ、２０Ｎ、２６Ｓ、８０Ｙ、１３８Ｙ、１４４Ｆ、１９０Ｓ、２１５Ａ、２４６Ｉ、２５３Ｇ、４１７Ｎ、４３９Ｋ、４５２Ｒ、４５３Ｆ、４７７Ｎ、４８４Ｋ、５０１Ｙ、５７０Ｄ、７０１Ｖ、７１６Ｉ、
１４０Ｌ、３４５Ａ、３４６Ｋ、３５２Ｓ、３７８Ｎ、４０６Ｑ、４２０、４４０Ｋ、４４１Ｆ、４４４、４４５Ａ、４４６Ｖ、４５０Ｋ、４５５Ｆ、４６０Ｉ、４７５Ｖ、４７８Ｉ、４８５Ｖ、４８６Ｌ、４８７Ｄ、４８９、４９０Ｓ、４９３Ｌ、４９４Ｐ、４９９Ｈ、
１４２Ｓ、１４５Ｈ、１４６Ｙ、１４７Ｎ、１５０Ｒ、１５２Ｃ、１５４Ｑ、１５６Ａ、１５７Ｌ、１５８Ｇ、１６４Ｔ、２４７Ｇ、２４８Ｈ、２４９Ｓ、２５０Ｎ、２５１Ｓ、２５２Ｖ、２５４Ｆ、２５５Ｆ、２５８Ｌ、３６５Ｄ、３６９Ｃ、３７０Ｓ、３７４Ｌ、３７６Ｉ、３８４Ｌ、４０５Ｙ、４０８Ｉ、４１５Ｎ、４２１、４４３Ａ、４４７Ｖ、４４８Ｙ、４５６Ｌ、４７２Ｖ、４７３Ｆ、４７６Ｓ、４９６Ｃ、４９８Ｈ、５００Ｉ、５０４Ｄ
からなる群から選択される２つ以上を含む。

【0159】

ある実施態様において、修飾されたアミノ酸位置における修飾は、
Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ８０Ｙ、Ｄ１３８Ｙ、Ｙ１４４Ｆ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ａ、Ｒ２４６Ｉ、Ｄ２５３Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４３９Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、
Ｆ１４０Ｌ、Ｔ３４５Ａ、Ｒ３４６Ｋ、Ａ３５２Ｓ、Ｋ３７８Ｎ、Ｅ４０６Ｑ、Ｄ４２０、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｆ、Ｋ４４４、Ｖ４４５Ａ、Ｇ４４６Ｖ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５５Ｆ、Ｎ４６０Ｉ、Ａ４７５Ｖ、Ｔ４７８Ｉ、Ｇ４８５Ｖ、Ｆ４８６Ｌ、Ｎ４８７Ｄ、Ｙ４８９、Ｆ４９０Ｓ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｐ４９９Ｈ、
Ｇ１４２Ｓ、Ｙ１４５Ｈ、Ｈ１４６Ｙ、Ｋ１４７Ｎ、Ｋ１５０Ｒ、Ｗ１５２Ｃ、Ｅ１５４Ｑ、Ｅ１５６Ａ、Ｆ１５７Ｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｎ１６４Ｔ、Ｓ２４７Ｇ、Ｙ２４８Ｈ、Ｌ２４９Ｓ、Ｔ２５０Ｎ、Ｐ２５１Ｓ、Ｇ２５２Ｖ、Ｓ２５４Ｆ、Ｓ２５５Ｆ、Ｗ２５８Ｌ、Ｙ３６５Ｄ、Ｙ３６９Ｃ、Ｎ３７０Ｓ、Ｆ３７４Ｌ、Ｔ３７６Ｉ、Ｐ３８４Ｌ、Ｄ４０５Ｙ、Ｒ４０８Ｉ、Ｔ４１５Ｎ、Ｙ４２１、Ｓ４４３Ａ、Ｇ４４７Ｖ、Ｎ４４８Ｙ、Ｆ４５６Ｌ、Ｉ４７２Ｖ、Ｙ４７３Ｆ、Ｇ４７６Ｓ、Ｇ４９６Ｃ、Ｑ４９８Ｈ、Ｔ５００Ｉ、Ｇ５０４Ｄ
からなる群から選択される２つ以上を含む。

【0160】

ある態様において、本発明は、
ａ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程、および
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する工程であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、工程
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾は、ａ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている、方法に関する。

【0161】

ある実施態様において、方法は、少なくとも部分的に異なるアミノ酸修飾をコードする核酸を提供する、１つまたは複数のさらなるこのような工程を含み得る。

【0162】

ある実施態様において、核酸はＲＮＡである。

【0163】

さらなる実施態様は、ここに記載するとおりである。

【0164】

ある態様において、本発明は、
ａ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントにおけるアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸、および
ｂ）親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも１つのフラグメントにおけるアミノ酸位置が、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸
を含み、
ｂ）におけるアミノ酸修飾は、ａ）におけるアミノ酸修飾とは少なくとも部分的に異なっている医薬製剤に関する。

【0165】

ある実施態様において、医薬製剤は、少なくとも部分的に異なるアミノ酸修飾をコードする１つまたは複数のさらなる核酸を含み得る。

【0166】

ある実施態様において、核酸はＲＮＡである。

【0167】

ある実施態様において、ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化されている。

【0168】

ある実施態様において、医薬製剤は医薬組成物である。

【0169】

ある実施態様において、医薬製剤はワクチンである。

【0170】

ある実施態様において、医薬製剤はキットである。

【0171】

ある実施態様において、医薬製剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するワクチン接種のための医薬製剤の使用上の指示をさらに含む。

【0172】

ある態様において、本発明は、医薬用途のための医薬製剤に関する。

【0173】

ある実施態様において、医薬用途は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するワクチン接種を含む。

【0174】

ある態様において、本発明は、対象に医薬製剤を投与することを含む、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導する方法に関する。

【0175】

ある実施態様において、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する予防的処置のための方法である。

【0176】

ある実施態様において、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するワクチン接種のための方法である。

【0177】

上記の態様のさらなる実施態様は、ここに記載するとおりである。

【0178】

ここに記載する核酸は、一本鎖ＲＮＡである場合があり、ここに記載する医薬製剤、例えば、ワクチンは、活性本体として一本鎖ＲＮＡを含み、これはレシピエントの細胞に侵入したら、各タンパク質に翻訳され得る。抗原配列をコードする野生型またはコドン最適化配列に加えて、ＲＮＡは安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大有効性について最適化された１以上の構造要素を含み得る（５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テイル）。ある実施態様において、ＲＮＡはこれらの要素すべてを含む。ある実施態様において、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ_２ ^{７,２’－Ｏ}ＧｐｐＳｐＧ）またはｍ_２ ^{７,３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧはＲＮＡ薬物物質の５’末端の特異的キャッピング構造として利用され得る。５’－ＵＴＲ配列として、所望により翻訳効率を上げるための最適化「コザック配列」（例えば、配列番号１２）と共に、ヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列が使用され得る。３’－ＵＴＲ配列として、高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にするために、コード配列とポリ（Ａ）－テイルの間に配置された「スプリット遺伝子のアミノ末端エンハンサー（amino terminal enhancer of split）」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと称される）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと称される）（例えば、配列番号１３）由来の２つの配列要素（ＦＩ要素）の組み合わせが使用され得る。これらはＲＮＡ安定性および総タンパク質発現増強に寄与する配列のエクスビボ選択過程により同定された（引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１７／０６０３１４参照）。あるいは、３’－ＵＴＲはヒトベータ－グロビンｍＲＮＡの２個の反復３’－ＵＴＲであり得る。さらに、３０アデノシン残基のストレッチ、続く１０ヌクレオチドリンカー配列（ランダムヌクレオチドの）およびさらなる７０アデノシン残基（例えば、配列番号１４）からなる、１１０ヌクレオチド長のポリ（Ａ）－テイルが使用され得る。このポリ（Ａ）－テイル配列はＲＮＡ安定性および翻訳効率を高めるために設計された。

【0179】

さらに、分泌型シグナルペプチド（ｓｅｃ）を、好ましくはｓｅｃがＮ末端タグとして翻訳されるような方法で、抗原コード化領域に融合し得る。ある実施態様において、ｓｅｃはＳタンパク質の分泌型シグナルペプチドに対応する。融合タンパク質で一般に使用されるとおり、大部分がアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる短リンカーペプチドをコードする配列を、ＧＳ／リンカーとして使用し得る。

【0180】

ここに記載するＲＮＡを、投与用ＲＮＡ粒子を産生するために、タンパク質および／または脂質、好ましくは脂質と組み合わせ得る。種々のＲＮＡの組み合わせを使用するならば、投与用ＲＮＡ粒子を産生するためにこれらＲＮＡを一緒にまたは別々にタンパク質および／または脂質と組み合わせてもよい。

【0181】

ある実施態様において、ここに記載する多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原は、多量体複合体、特に三量体複合体を形成できる。ある実施態様において、ここに記載する異なる多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原は、多量体複合体、特に三量体複合体を形成できる。したがって、例えば、異なる多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原をコードする異なる核酸を投与することによる、対象へのここに記載する異なる多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原の提供を含む本発明の実施態様において、異なる多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列は、多量体複合体、特に三量体複合体を形成できる場合がある。この目的のために、ここに記載する多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列は、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列の多量体複合体、特に三量体複合体の形成を可能とするドメインを含み得る。ある実施態様において、多量体複合体の形成を可能とするドメインは、三量体化ドメイン、例えば、ここに記載するような三量体化ドメイン、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質三量体化ドメインを含む。ある実施態様において、三量体化は、特に、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質三量体化ドメインを含まないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の一部分に対応する場合に、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列への三量体化ドメイン、例えば、Ｔ４フィブリチン由来の「フォルド」）三量体化ドメイン（例えば、配列番号１０）の付加によって達成される。

【0182】

ある実施態様において、ここに記載する多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原は、コドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によりコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変えない。

【0183】

ある実施態様において、多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原は、ＲＮＡによってコードされる。特に好ましい実施態様において、多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原は、単離メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドによってコードされ、単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、ワクチン抗原を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。ある実施態様において、単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの脂質ナノ粒子に製剤化されている。例えば、ある実施態様において、このような脂質ナノ粒子は、２０～６０％イオン化可能カチオン性脂質、５～２５％非カチオン性脂質（例えば、中性脂質）、２５～５５％ステロールまたはステロイドおよび０.５～１５％ポリマーコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－修飾脂質）のモル比を含み得る。ある実施態様において、脂質ナノ粒子に含まれるステロールまたはステロイドはコレステロールであり得るまたはそれを含み得る。ある実施態様において、中性脂質は１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり得るまたはそれを含み得る。ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はＰＥＧ２０００ ＤＭＧであり得るまたはそれを含み得る。一部の実施態様において、免疫原性組成物は、約１ｍｇ～１０ｍｇまたは３ｍｇ～８ｍｇまたは４ｍｇ～６ｍｇの総脂質含有量を含み得る。一部の実施態様において、このような免疫原性組成物は、約５ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬまたは７.５ｍｇ／ｍＬ～１２.５ｍｇ／ｍＬまたは９～１１ｍｇ／ｍＬの総脂質含有量を含み得る。ある実施態様において、このような単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、免疫原性組成物を少なくとも１回投与された対象における免疫応答の誘導のための有効量で提供される。ある実施態様において、免疫原性組成物において提供されるこのような単離ｍＲＮＡポリヌクレオチドは自己複製ＲＮＡではない。

【0184】

ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、特に安定化ｍＲＮＡである。ある実施態様において、ＲＮＡは少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ＲＮＡは各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。

【0185】

ある実施態様において、ＲＮＡはウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。

【0186】

ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される。

【0187】

ある実施態様において、ＲＮＡは５’キャップを含む。

【0188】

ある実施態様において、ＲＮＡは、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。

【0189】

ある実施態様において、ＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。

【0190】

ある実施態様において、ＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。

【0191】

ある実施態様において、ポリＡ配列は少なくとも１００ヌクレオチド含む。

【0192】

ある実施態様において、ポリＡ配列は配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。

【0193】

ある実施態様において、ＲＮＡは液体、固体またはそれらの組み合わせとして製剤化されているまたは製剤化されるべきである。

【0194】

ある実施態様において、ＲＮＡは注射用に製剤化されているまたは製剤化されるべきである。

【0195】

ある実施態様において、ＲＮＡは筋肉内投与用に製剤化されているまたは製剤化されるべきである。

【0196】

ある実施態様において、ＲＮＡは粒子として製剤化されているまたは製剤化されるべきである。

【0197】

ある実施態様において、粒子は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはリポプレックス（ＬＰＸ）粒子である。

【0198】

ある実施態様において、ＬＮＰ粒子は（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６,１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）、２－[（ポリエチレングリコール）－２０００]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよびコレステロールを含む。

【0199】

ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はＲＮＡとリポソームの混合により得られ得る。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はＲＮＡと脂質の混合により得られ得る。

【0200】

ある実施態様において、ＲＮＡはコロイドとして製剤化されているまたは製剤化されるべきである。ある実施態様において、ＲＮＡはコロイドの分散相を形成する粒子として製剤化されているまたは製剤化されるべきである。ある実施態様において、ＲＮＡの５０％以上、７５％以上または８５％以上が分散相に存在する。ある実施態様において、ＲＮＡはＲＮＡおよび脂質を含む粒子として製剤化されているまたは製剤化されるべきである。ある実施態様において、粒子は、水相に溶解したＲＮＡを有機相に溶解した脂質に曝すことにより形成される。ある実施態様において、有機相はエタノールを含む。ある実施態様において、粒子は、水相に溶解したＲＮＡを水相に分散した脂質に曝すことにより形成される。ある実施態様において、水相に分散された脂質はリポソームを形成する。

【0201】

ある実施態様において、ＲＮＡはｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡである。

【0202】

ある実施態様において、ここに記載する組成物または医薬製剤は医薬組成物である。

【0203】

ある実施態様において、ここに記載する組成物または医薬製剤はワクチンである。

【0204】

ある実施態様において、医薬組成物は１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物をさらに含む。

【0205】

ある実施態様において、ここに記載する組成物または医薬製剤はキットである。

【0206】

ある実施態様において、ＲＮＡおよび所望により粒子形成成分は個別のバイアルに封入される。

【0207】

ある実施態様において、キットは、対象におけるウイルス、例えば、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するための組成物または医薬製剤の使用上の指示をさらに含む。

【0208】

ある態様において、本発明は、医薬用途のためのここに記載する組成物または医薬製剤に関する。

【0209】

ある実施態様において、医薬用途は対象におけるウイルス、例えば、コロナウイルスに対する免疫応答の誘導を含む。

【0210】

ある実施態様において、医薬用途はウイルス感染、例えば、コロナウイルス感染の治療的または予防的処置を含む。

【0211】

ある実施態様において、ここに記載する組成物または医薬製剤はヒトへの投与用である。

【0212】

ある実施態様において、コロナウイルスはベータコロナウイルスである。

【0213】

ある実施態様において、コロナウイルスはサルベコウイルスである。

【0214】

ある実施態様において、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

【0215】

ある態様において、本発明は、対象にここに記載する組成物、例えば多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むワクチン抗原またはワクチン抗原をコードする核酸、例えばＲＮＡを投与することを含む、対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関する。ある実施態様において、方法は、複数のこのようなワクチン抗原または核酸の投与を含む。

【0216】

ある実施態様において、方法はコロナウイルスに対するワクチン接種のための方法である。

【0217】

ある実施態様において、方法はコロナウイルス感染の治療的または予防的処置のための方法である。

【0218】

ある実施態様において、対象はヒトである。

【0219】

ある実施態様において、コロナウイルスはベータコロナウイルスである。

【0220】

ある実施態様において、コロナウイルスはサルベコウイルスである。

【0221】

ある実施態様において、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

【0222】

ここに記載する方法のある実施態様において、組成物はここに記載する組成物である。

【0223】

ある態様において、本発明はここに記載する方法に使用するためのここに記載する組成物または医薬製剤に関する。

【0224】

ある態様において、本発明は、ここに記載する方法を実行することによって得ることができる組成物、例えば、タンパク質または核酸組成物に関する。

【図面の簡単な説明】

【0225】

【図1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳタンパク質構成の概略説示。Ｓ１サブユニット内の配列は、シグナル配列（ＳＳ）および受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）からなり、ＲＢＤはヒト細胞受容体ＡＣＥ２への結合に関連するＳタンパク質内の重要なサブユニットである。Ｓ２サブユニットはＳ２プロテアーゼ開裂部位（Ｓ２’）、続く膜融合のための融合ペプチド（ＦＰ）、中央らせん（ＣＨ）ドメインを伴う７回反復領域（ＨＲ１およびＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質テイル（ＣＴ）を含む。

【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン開発のための構築物。ここで記載する組成物は、完全および野生型Ｓタンパク質に基づいて設計されており、（１）中和感受性部位を保持する安定化変異を含む第一７回反復領域（ＨＲＰ１）に近距離に変異を伴う完全タンパク質、（２）Ｓ１ドメインまたは（３）ＲＢドメイン（ＲＢＤ）のみを含む異なる構築物に基づいたものであり得る。さらに、タンパク質フラグメントを安定化するために、フィブリチンドメイン（Ｆ）をＣ末端に融合させた。全構築物を、細胞膜へのゴルジ輸送を確実とするためシグナルペプチド（ＳＰ）で開始した。

【図3】ここに記載する構築物に基づいて設計され得るＲＮＡの一般構造。５’キャップ、５’および３’非翻訳領域、内因性分泌型シグナルペプチドとＧＳリンカーを伴うコード配列およびポリ（Ａ）テイルを備えたＲＮＡワクチンの一般的構造の略図。個々の要素は、各配列長に対して真に正確な長さで記載されていないことに留意すること。ＵＴＲ＝非翻訳領域；ｓｅｃ＝分泌型シグナルペプチド；ＲＢＤ＝受容体結合ドメイン；ＧＳ＝グリシン－セリンリンカー。

【図4】ここに記載する構築物に基づいて設計され得るＲＮＡの一般構造。５’キャップ、５’および３’非翻訳領域、内因性分泌型シグナルペプチドとＧＳリンカーを伴うコード配列およびポリ（Ａ）テイルを備えた薬物物質ＲＮＡの一般的構造の略図。個々の要素は、各配列長に対して真に正確な長さで記載されていないことに留意すること。ＧＳ＝グリシン－セリンリンカー；ＵＴＲ＝非翻訳領域；Ｓｅｃ＝分泌型シグナルペプチド；ＲＢＤ＝受容体結合ドメイン。

【図5】ここに記載する構築物に基づいて設計され得るＲＮＡの一般構造。５’キャップ、５’および３’非翻訳領域、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼレプリカーゼおよび内因性分泌型シグナルペプチドとＧＳリンカーを備えたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のコード配列およびポリ（Ａ）テイルのＲＮＡワクチンの一般的構造の略図。個々の要素は、各配列長に対して真に正確な長さで記載されていないことに留意すること。ＵＴＲ＝非翻訳領域；Ｓｅｃ＝分泌型シグナルペプチド；ＲＢＤ＝受容体結合ドメイン；ＧＳ＝グリシン－セリンリンカー。

【図6A】Ｂ.１.１.７系統スパイクタンパク質に基づく例示的新規二価ワクチン設計ワクチン配列（Ａ）Ｓ－Ｓｅｑ１および（Ｂ）Ｓ－Ｓｅｑ２の表面に露出した変異部位を例示する、直立した１つのＲＢＤを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のクライオ－ＥＭ構造。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のフューリンによって切断されたスパイクタンパク質（ＰＤＢ ＩＤ：６ＺＧＧ）の結晶構造を、ＲＣＳＢ ＰＤＢデータベースから得、ＰｙＭｏｌ ｖ.２.４.１を使用して可視化した。黄色の部位は、系統Ｂ.１.１.７変異によって標的化されるアミノ酸残基を示す。赤色の部位は、さらなる非Ｂ.１.１.７系統変異によって標的化されるアミノ酸残基を示す。

【図6B】Ｂ.１.１.７系統スパイクタンパク質に基づく例示的新規二価ワクチン設計ワクチン配列（Ａ）Ｓ－Ｓｅｑ１および（Ｂ）Ｓ－Ｓｅｑ２の表面に露出した変異部位を例示する、直立した１つのＲＢＤを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のクライオ－ＥＭ構造。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のフューリンによって切断されたスパイクタンパク質（ＰＤＢ ＩＤ：６ＺＧＧ）の結晶構造を、ＲＣＳＢ ＰＤＢデータベースから得、ＰｙＭｏｌ ｖ.２.４.１を使用して可視化した。黄色の部位は、系統Ｂ.１.１.７変異によって標的化されるアミノ酸残基を示す。赤色の部位は、さらなる非Ｂ.１.１.７系統変異によって標的化されるアミノ酸残基を示す。

【図7】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるワクチン候補発現。それぞれ、ＢＮＴ１６２ｂ２およびＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）をコードする市販のトランスフェクション試薬を使用する０.１５μｇ／ｍＬのｍｏｄＲＮＡ（ＡおよびＢ）またはＢＮＴ１６２ｂ２、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）およびＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）をコードする０.１５μｇ／ｍＬのＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡ（ＣおよびＤ）のトランスフェクション後の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＮＡによってコードされたバリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の発現。バリアントＳタンパク質の表面発現は、マウスＦｃ－タグに融合したヒト組換えＡＣＥ－２タンパク質および二次蛍光タグ付抗マウス抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出された。ワクチン候補あたりのＨＥＫ２９３Ｔ集団のＳタンパク質発現細胞のパーセンテージ（ＡおよびＣにおいて）および中央値蛍光強度（ＭＦＩ）（ＢおよびＤにおいて）が表されている。示されたデータは、トリプリケートで実施されたＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクションの平均＋ＳＤである。

【図8】異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファバリアント由来のＰ２ Ｓ構築物をコードするｍＲＮＡワクチン候補で１回免疫化した後のＢａｌｂ／Ｃマウスの血清における抗Ｓ１（Ｂ.１.１.７）ＩｇＧ抗体応答の動態。免疫化７日Ａ）、１４日後（Ｂ）、２１日（Ｃ）および２８日（Ｄ）後の、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）をコードする１μｇ ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡおよび緩衝液対照としての０.９％塩化ナトリウムで１回免疫化した後の抗Ｓ１（Ｂ.１.１.７）ＩｇＧ抗体力価。血清中の抗体応答の縦方向の軌跡がＥに示されている。データは、デュプリケートで測定されたすべての動物の平均±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝５）。異なる時点の統計分析が、表８に示されている。

【図9】異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファバリアント由来のＰ２ Ｓ構築物をコードするｍＲＮＡワクチン候補で１回免疫化した後のＢａｌｂ／Ｃマウスの血清における抗ＲＢＤ（Ｂ.１.３５１）ＩｇＧ抗体応答の動態。免疫化７日（Ａ）、１４日（Ｂ）、２１日（Ｃ）および２８日（Ｄ）後の、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）をコードする１μｇ ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡおよび緩衝液対照としての０.９％塩化ナトリウムで１回免疫化した後の抗ＲＢＤ（Ｂ.１.３５１）ＩｇＧ抗体力価。血清中の抗体応答の縦方向の軌跡がＥに示されている。データは、デュプリケートで測定されたすべての動物の平均±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝５）。異なる時点の統計分析が、表９に示されている。

【図10】異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファバリアント由来のＰ２ Ｓ構築物をコードするｍＲＮＡワクチン候補で１回免疫化した２８日後のＢａｌｂ／Ｃマウスの血清における５０％シュードウイルス中和（ｐＶＮ_５０）力価。免疫化２８日後の、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）をコードする１μｇ ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡおよび緩衝液対照としての０.９％塩化ナトリウムで１回免疫化した後の５０％シュードウイルス中和抗体（ｐＶＮ_５０）力価。分析に使用したＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルスは、先祖の武漢株（武漢）、Ｂ.１.１.７（アルファ）バリアントまたはＢ.１.３５１（ベータ）バリアントのいずれかに対して特異的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を有する。各個体の血清（群あたりｎ＝５）をデュプリケートで試験し、幾何平均ｐＶＮ_５０力価をプロットした。検出限界（ＬＯＤ；１２）未満の値については、ＬＯＤ／２値をプロットする。９５％信頼区間を伴う群幾何平均力価（水平線およびバーを越える値）が示されている。

【図11】ＢＮＴ１６ｂ２（アルファ）またはＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）で１回免疫化した２８日後のＢａｌｂ／Ｃマウスの血清における５０％シュードウイルス中和（ｐＶＮ_５０）力価。免疫化２８日後の、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）をコードする１μｇ ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡおよび緩衝液対照としての０.９％塩化ナトリウムで１回免疫化した後の５０％シュードウイルス中和抗体（ｐＶＮ_５０）力価。分析に使用したＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルスは、Ｂ.１.１.７（アルファ）バリアント、Ｂ.１.６１７.１（カッパ）バリアントまたはＢ.１.６１７.２（デルタ）バリアントのいずれかに対して特異的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を有する。各個体の血清（群あたりｎ＝５）をデュプリケートで試験し、幾何平均ｐＶＮ５０力価をプロットした。検出限界（ＬＯＤ；１２）未満の値については、ＬＯＤ／２値をプロットした。９５％信頼区間を伴う群幾何平均力価（水平線およびバーを越える値）が示されている。

【図12】マルチプレックス分析によって測定されたＢＮＴ１６ｂ２（アルファ）またはＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）で１回免疫化した、Ｂａｌｂ／ｃマウスの血清における２８日後での異なる組換えＳタンパク質に対するＩｇＧ応答。免疫化２８日後の、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）をコードする１μｇ ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡおよび緩衝液対照としての０.９％塩化ナトリウムで１回免疫化した後のＥＣＬシグナル。ＥＣＬシグナルを直線範囲について分析し（異なるグラフにおいて点線によって示される）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（Ｂ.１.１.７；１：５４００血清希釈）（Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（Ｂ.１.１.５２９；ＢＡ.１；１：１８００血清希釈）（Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（ＢＡ.１＋Ｌ４５２Ｒ；１：１８００血清希釈）（Ｃ）に対する応答が示されている。示されたデータは、デュプリケートで測定された個々の動物からの血清を表し、水平線は、群平均±ＳＥＭ（群あたりｎ＝５；緩衝液群のみｎ＝３）を示す。異なる時点の統計分析が表１２に示されている。

【発明を実施するための形態】

【0226】

詳細な記載
本発明を下に詳述するが、本発明は、特定の方法、プロトコールおよび試薬は変わり得るため、これらに限定されないことが理解される。ここで使用される用語は特定の実施態様を説明する目的しかなく、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解される。特に断らない限り、ここで使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。

【0227】

好ましくはここで使用する用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: （IUPAC Recommendations）", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, （1995）に定義されるとおりである。

【0228】

本発明の実施は、特に断らない限り、当分野における文献で説明される、化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術の慣用の方法を使用する（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照）。

【0229】

下記において、本発明の要素が記載される。これらの要素は特定の実施態様と共に列記されるが、しかしながら、これらは何らかの方法で、何らかの数を組み合わされ、さらなる実施態様を作り得ると解釈されるべきである。種々に記載した例および実施態様は、明確に記載した実施態様にのみ本発明が限定されると解釈してはならない。この記載は、明確に記載した実施態様と何らかの数の開示された要素を組み合わせる実施態様を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、すべての記載した要素のあらゆる並べ替えおよび組み合わせが、文脈に反しない限り、この記載により開示されると考えられるべきである。

【0230】

いくつかの文献がこの明細書を通して引用されている。ここに引用される文献の各々（全特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、指示など）は、前記であれ後記であれ、引用によりその全体として本明細書に包含させる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有していなかったことを認めたものと解釈されるものではない。

【0231】

定義
次に、本発明の全態様に適用される定義を提供する。次の用語は、特に断らない限り次の意味を有する。何らかの未定義の用語は、当分野で認識される意味を有する。

【0232】

用語「約」は、おおよそまたは近似を意味し、ここに示す数値または範囲の状況において、ある実施態様において、記載されるまたは請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％または±３％を意味する。

【0233】

本発明を記載する文脈（特に特許請求の範囲における文脈）における単数表現は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈される。ここでの値の範囲の列挙は、単に該範囲内の各個々の値をいう省略方法として用いることが意図される。ここで特に断らない限り、各個々の値が、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に包含される。ここに記載するすべての方法は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、任意の適当な順番で実施し得る。ここに提供される任意かつすべての例または例示的用語（例えば、「など」）は、単に本発明をより良く説明することを意図し、特許請求の範囲の範囲に限定を付すものではない。本明細書のあらゆる用語は、本発明の実施に必要な何らかの特許請求されていない要素を示すと解釈してはならない。

【0234】

特に断らない限り、用語「含む」は、本明細書で、「含む」により導入される一覧のメンバーに加えて、さらなるメンバーが所望により存在し得ることを示すために使用される。しかしながら、用語「含む」がさらなるメンバーが存在する可能性を含まない本発明の特定の実施態様として考えられ、すなわち、この実施態様の目的で、「含む」は「からなる」または「から本質的になる」の意味を有するとして理解される。

【0235】

ここで使用する用語「１または複数の」または「少なくとも１の」とは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０またはそれ以上を含む１またはそれ以上を指す。

【0236】

用語「２以上」、「少なくとも２」、「複数の」または「ポリ」とは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０またはそれ以上を含む２以上を指す。ここで使用する「減少」、「低減」、「阻害」または「損なう」などの用語は、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％またはそれ以上のレベルの全体的減少または全体的減少を引き起こす能力に関する。これらの用語は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわち、０へのまたは本質的に０への減少を含む。

【0237】

ウイルスタンパク質アミノ酸配列、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を指す場合の用語「多特異性」とは、ウイルスタンパク質の異なるバリアント、例えば、異なる天然に存在する株に正常に存在する複数のエピトープが単一アミノ酸配列中に存在するように組み合わされる前記ウイルスタンパク質に基づくアミノ酸配列を指す。

【0238】

「増加」、「増強」または「超える」などの用語は、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％またはそれ以上の増加または増強に関する。

【0239】

本開示により、用語「ペプチド」はオリゴおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合により互いに結合した約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上および最大約５０、約１００または約１５０の連続アミノ酸を含む、物質をいう。用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、大型ペプチド、特に少なくとも約１５０アミノ酸を有するペプチドをいうが、用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ここでは通常同義で使用される。

【0240】

「治療タンパク質」は、対象に治療有効量で提供されたとき、対象の状態または疾患状態に正のまたは有利な効果を有する。ある実施態様において、治療タンパク質は治療的または緩和的性質を有し、疾患または障害の１以上の症状の改善、緩和、軽減、逆転、発症遅延または重症度低減のために投与し得る。治療タンパク質は予防的性質を有し得て、このような疾患の発症遅延またはこのような疾患または病態の重症度低減のために使用し得る。用語「治療タンパク質」はタンパク質またはペプチド全体を含み、その治療活性フラグメントも意味し得る。タンパク質の治療活性バリアントも含み得る。治療活性タンパク質の例は、ワクチン接種用抗原およびサイトカインなどの免疫刺激剤を含むが、これらに限定されない。

【0241】

アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関連する「フラグメント」または「部分」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短くなっているアミノ酸配列を表す配列をいう。Ｃ末端で短くなっているフラグメント（Ｎ末端フラグメント）は、例えばオープンリーディングフレームの３’末端を欠く切断オープンリーディングフレームの翻訳によって得られ得る。Ｎ末端で短くなっているフラグメント（Ｃ末端フラグメント）は、例えば、切断オープンリーディングフレームが翻訳開始に働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠く切断オープンリーディングフレームの翻訳によって得られ得る。アミノ酸配列のフラグメントは、アミノ酸配列の例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％アミノ酸残基を含む。アミノ酸配列のフラグメントは、好ましくはアミノ酸配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０または少なくとも１００連続アミノ酸を含む。

【0242】

ここでの「バリアント」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然に存在するまたは野生型（ＷＴ）アミノ酸配列であってよくまたは野生型アミノ酸配列の修飾体であり得る。好ましくはバリアントアミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾、例えば、親と比較して１～約２０アミノ酸修飾および好ましくは１～約１０または１～約５アミノ酸修飾を有する。

【0243】

ここでの「野生型」または「ＷＴ」または「天然」は、アレルバージョンを含む、天然にみられるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。

【0244】

本発明の目的で、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。用語「バリアント」は、全変異体、スプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、高次構造、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアントおよび種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。用語「バリアント」は、特に、アミノ酸配列のフラグメントを含む。

【0245】

アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列に１または２またはそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定部位に挿入されるが、ランダム挿入と得られた産物の適切なスクリーニングも可能である。アミノ酸付加バリアントは、１以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、配列の１以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸の除去により特徴づけられる。欠失はタンパク質のどの位置でもよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端短縮化バリアントとも称される。アミノ酸置換バリアントは、配列における少なくとも１個の残基が除去され、その位置に他の残基が挿入されることにより特徴づけられる。相同タンパク質またはペプチドで保存されていないアミノ酸配列の位置および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のものに置換する修飾が好ましい。好ましくはペプチドおよびタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は保存的アミノ酸変化、すなわち、類似荷電または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖に関連するアミノ酸ファミリーの一つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸の４ファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸と分類されることもある。ある実施態様において、保存的アミノ酸置換は、次のグループ内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、スレオニン；
リシン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。

【0246】

好ましくは、あるアミノ酸配列と該あるアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列の間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％。類似性または同一性の程度は、好ましくは、対照アミノ酸配列の長さ全体の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域に対して示される。例えば、対照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなるならば、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００アミノ酸、ある実施態様において、連続アミノ酸に対して示される。ある実施態様において、類似性または同一性の程度は、対照アミノ酸配列の長さ全体に対して示される。配列類似性、好ましくは配列同一性決定のためのアラインメントは、当分野で知られるツールで、好ましくは最良配列アラインメントを使用して、例えば、Alignを使用して、標準設定で使用して、好ましくはEMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5で実施できる。

【0247】

「配列類似性」は、同一または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２個のアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２個の核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。

【0248】

用語「％同一」、「％同一性」または類似の用語は、特に、比較する配列と最適アラインメントで同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージをいう。該パーセンテージは純粋に統計であり、２配列間の差異は、必ずしも、比較する配列の全体にわたり、無作為に分布されているとは限らない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して、最適アラインメント後、配列を比較することにより実施される。比較のための最適アラインメントは、手動でまたはSmith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443による局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444による類似性サーチアルゴリズムの助けを借りてまたは該アルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST NおよびTFASTA）の助けを借りて、実施し得る。ある実施態様において、２つの配列のパーセント同一性は、United States National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（例えばblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq）で利用可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定する。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムで使用されるアルゴリズムパラメータは、（ｉ）予測閾値設定１０；（ｉｉ）ワードサイズ設定２８；（ｉｉｉ）クエリー範囲の最大マッチ設定０；（ｉｖ）マッチ／ミスマッチスコア設定１、－２；（ｖ）ギャップ・コスト設定線形；および（ｖｉ）低複雑性領域用フィルターの使用を含む。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで使用されるアルゴリズムパラメータは、（ｉ）予測閾値設定１０；（ｉｉ）ワードサイズ設定３；（ｉｉｉ）クエリー範囲の最大マッチ設定０；（ｉｖ）マトリクス設定ＢＬＯＳＵＭ６２；（ｖ）ギャップ・コスト設定 存在：１１伸長：１；および（ｖｉ）条件的組成的スコアマトリクス調節を含む。

【0249】

パーセンテージ同一性は、比較する配列が対応する同一位置数を決定し、この数を比較する位置数（例えば、対照配列における位置数）で除し、この結果を１００倍することにより得る。

【0250】

ある実施態様において、類似性または同一性の程度は、対照配列の長さ全体の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域に対して示される。例えば、対照核酸配列が２００ヌクレオチドからなるならば、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００ヌクレオチド、ある実施態様において、連続ヌクレオチドに対して示される。ある実施態様において、類似性または同一性の程度は対照配列の長さ全体に対して示される。

【0251】

相同アミノ酸配列は、本開示により、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を示す。

【0252】

ここに記載するアミノ酸配列バリアントは、例えば、組換えＤＮＡ操作により、当業者により容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Sambrook et al. （1989）に詳述される。さらに、ここに記載するペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成および類似の方法などにより、既知ペプチド合成技術の助けを借りて、容易に製造され得る。

【0253】

ある実施態様において、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）のフラグメントまたはバリアントは、好ましくは「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」なる用語は、それが由来するアミノ酸配列と同一または類似の１以上の機能的性質を示すあらゆるフラグメントまたはバリアントに関し、すなわち、機能的に等価である。抗原または抗原性配列に関して、ある特定の機能は、フラグメントまたはバリアントが由来するアミノ酸配列により示される１以上の免疫原性活性である。ここで使用する用語「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」は、特に親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸が変えられ、なお、親分子または配列の機能の１以上、例えば、免疫応答の誘導を満たすことができる、アミノ酸配列を含むバリアント分子または配列をいう。ある実施態様において、親分子または配列のアミノ酸配列の修飾は、分子または配列の特徴に顕著に影響しないまたは改変しない。異なる実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの機能は、減少していてよいが、なお顕著に存在し、例えば、機能的バリアントの免疫原性は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの免疫原性は親分子または配列と比較して増強され得る。

【0254】

指定のアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）「由来の」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源をいう。好ましくは、特定のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列は、特定の配列またはそのフラグメントに同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列は、特定の配列またはそのフラグメントのバリアントであり得る。例えば、ここで使用するのに適する抗原は、天然配列の望ましい活性を維持しながら、それらが由来する天然に存在するまたは天然配列と配列が異なるように変えられ得ることは、当業者に理解される。

【0255】

ここで使用する「指示材」または「指示」は、本発明の組成物および方法の有用性の伝達に使用できる、刊行物、記録、ダイアグラムまたは表現のための何らかの他の媒体を含む。本発明のキットの指示材は、例えば、本発明の組成物を含む容器に添付されまたは組成物を含む容器と共に輸送され得る。あるいは指示材は、指示材と組成物がレシピエントにより協同的使用されることを意図して、容器と別々に輸送され得る。

【0256】

「単離」は、天然状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同核酸またはペプチドは「単離」されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞などの非天然環境で存在できる。

【0257】

本発明の状況での「組換え」なる用語は、「遺伝子操作を介する製造」を意味する。好ましくは、本発明の状況での組換え核酸などの「組換え物体」は天然に存在しない。

【0258】

ここで使用する用語「天然に存在する」は、物体が天然に見られ得るとの事実をいう。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、天然源から単離でき、実験室で人為的に修飾されていないペプチドまたは核酸は天然に存在する。

【0259】

ここで使用する「生理学的ｐＨ」は、約７.５のｐＨをいう。

【0260】

用語「遺伝子修飾」または単に「修飾」は、核酸での細胞のトランスフェクションを含む。用語「トランスフェクション」は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明の目的で、用語「トランスフェクション」はまた細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みも含み、ここで、細胞は対象、例えば、患者に存在し得る。故に、本発明により、ここに記載する核酸のトランスフェクションのための細胞はインビトロまたはインビボに存在でき、例えば、細胞は患者の臓器、組織および／または生命体の一部を形成し得る。本発明により、トランスフェクションは、一過性でも安定的でもよい。トランスフェクションのいくつかの適用に関して、トランスフェクトされた遺伝子材料が一過性にのみ発現されるならば、十分である。ＲＮＡを、そのコードするタンパク質を一過性に発現するように、細胞にトランスフェクトし得る。トランスフェクション過程で導入された核酸が通常核ゲノムに統合されないため、外来核酸は有糸分裂を介して希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅が可能である細胞は、希釈率が大きく減少する。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望まれるならば、安定なトランスフェクションを行うべきである。このような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためのウイルスベースの系またはトランスポゾンベースの系を使用して達成され得る。一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを、細胞がそのコードするタンパク質を一過性に発現するように、トランスフェクトし得る。

【0261】

コロナウイルス
コロナウイルスは、エンベロープ、プラス鎖、一本鎖ＲＮＡ（（＋） ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。既知ＲＮＡウイルスの中で、最大のゲノム（２６～３２ｋｂ）を有し、系統学的に４属（α、β、γおよびΔ）に分類され、ベータコロナウイルスはさらに４分化系列（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に細分される。コロナウイルスは、広範なトリおよびヒトを含む哺乳動物種に感染する。一部ヒトコロナウイルスは、一般に軽度呼吸器疾患を引き起こすが、重症度は乳児、高齢および免疫不全者で大きくなり得る。各々ベータコロナウイルス分化系列ＣおよびＢに属する中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は高度病原性である。両ウイルスとも、ここ１５年以内に動物リザーバーからヒト集団に出現し、高致死率の大流行を引き起こした。非定型肺炎（コロナウイルス疾患２０１９；ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の大流行が２０１９年１２月半ばに中国で発生し、国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態にまで発展した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＮ９０８９４７.３）はベータコロナウイルス系統Ｂに属する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶと少なくとも７０％配列類似性を有する。

【0262】

一般に、コロナウイルスは４構造タンパク質、すなわち、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）およびスパイク（Ｓ）を有する。ＥおよびＭタンパク質はウイルス集合に重要な機能を有し、Ｎタンパク質はウイルスＲＮＡ合成に必要である。重要な糖タンパク質は、ウイルス結合および標的細胞への侵入を担う。Ｓタンパク質は、一本鎖不活性前駆体として合成され、産生細胞でフューリン様宿主プロテアーゼにより２つの非共有結合的結合したサブユニット、Ｓ１およびＳ２に開裂される。Ｓ１サブユニットは、宿主細胞受容体を認識する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。Ｓ２サブユニットは融合ペプチド、２つの７回反復領域および膜貫通ドメインを含み、そのすべて、大型高次構造再構成を行うことにより、ウイルスと宿主細胞膜の融合に介在するのに必要である。Ｓ１およびＳ２サブユニットは、大型融合前スパイクを形成するために三量体化する。

【0263】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ前駆体タンパク質は、Ｓ１（６８５ ａａ）およびＳ２（５８８ ａａ）サブユニットにタンパク分解的に開裂される。Ｓ１サブユニットは宿主アンギオテンシン－変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体を介して感受性細胞のウイルス侵入に介在する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。

【0264】

抗原
ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス表面タンパク質、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来する配列を含むアミノ酸配列をここに記載する。ウイルスタンパク質由来配列は、ウイルスタンパク質の他のバリアント、例えば、他の株のウイルスタンパク質バリアント中に存在するアミノ酸修飾を含有するウイルスタンパク質の少なくとも一部分に対応する。修飾によって、このような他のウイルスタンパク質バリアントに対して特異的である（さらなる）エピトープを生成する。したがって、ここで記載する修飾されたウイルスタンパク質配列は、複数のウイルスタンパク質バリアントおよび／またはウイルス株に特徴的である（修飾された）アミノ酸残基を含有するので、多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列である。また、ウイルスタンパク質由来配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸、例えば、ＲＮＡもここで記載する。ここで記載するアミノ酸配列および核酸は、対象においてウイルスタンパク質、特に異なるウイルス株のウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導するのに有用である。ここで記載する多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列（すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質）を含むアミノ酸配列はまたここで、「ワクチン抗原」、「ペプチドおよびタンパク質抗原」、「抗原分子」または簡単に「抗原」と称される。多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列はまたここで、「抗原性ペプチドまたはタンパク質」または「抗原性配列」と称される。

【0265】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス全長スパイク（Ｓ）タンパク質は、１２７３アミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸配列を有する：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（配列番号１）

【0266】

本開示の目的で、上記配列は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と考えられる。ここで示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質における位置番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列との関連にあり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントにおける位置に対応する。

【0267】

配列番号１の完全長スパイク（Ｓ）タンパク質は、プロトタイプ融合前高次構造が安定化されるような方法で修飾され得る。融合前高次構造の安定化は、完全長スパイクタンパク質のＡＳ残基９８６および９８７の２連続プロリン置換の導入により得られ得る。特に、スパイク（Ｓ）タンパク質安定化タンパク質バリアントは、アミノ酸残基９８６位がプロリンに交換され、かつアミノ酸残基９８７位もプロリンに交換される方法で得られる。ある実施態様において、プロトタイプ融合前高次構造が安定化されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
（配列番号７）

【0268】

一部の実施態様において、ここで記載する組成物および／または方法は、ワクチン接種対象の血清がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントのパネル（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上）にわたり中和活性を示すことにより特徴づけられる。一部の実施態様において、このようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）および／または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）中に変異を含む。

【0269】

一部の実施態様において、ここで記載する組成物は、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントのパネル（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上）に特徴的である１つまたは複数のアミノ酸修飾（したがって、エピトープ）を含むことにより特徴づけられる。一部の実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントに特徴的であるこのような修飾は、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）および／または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）中に変異を含む。

【0270】

Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）中の修飾には、
１８、２０、２６、８０、１３８、１４４、１９０、２１５、２４６、２５３、
１４０、
１４２、１４５、１４６、１４７、１５０、１５２、１５４、１５６、１５７、１５８、１６４、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５８
からなる群から選択される位置の修飾が含まれる。

【0271】

Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）における特異的修飾には、
Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ８０Ｙ、Ｄ１３８Ｙ、Ｙ１４４Ｆ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ａ、Ｒ２４６Ｉ、Ｄ２５３Ｇ、
Ｆ１４０Ｌ、
Ｇ１４２Ｓ、Ｙ１４５Ｈ、Ｈ１４６Ｙ、Ｋ１４７Ｎ、Ｋ１５０Ｒ、Ｗ１５２Ｃ、Ｅ１５４Ｑ、Ｅ１５６Ａ、Ｆ１５７Ｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｎ１６４Ｔ、Ｓ２４７Ｇ、Ｙ２４８Ｈ、Ｌ２４９Ｓ、Ｔ２５０Ｎ、Ｐ２５１Ｓ、Ｇ２５２Ｖ、Ｓ２５４Ｆ、Ｓ２５５Ｆ、Ｗ２５８Ｌ
からなる群から選択される修飾が含まれる。

【0272】

受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）中の修飾には、
４１７、４３９、４５２、４５３、４７７、４８４、５０１、
３４５、３４６、３５２、３７８、４０６、４２０、４４０、４４１、４４４、４４５、４４６、４５０、４５５、４６０、４７５、４７８、４８５、４８６、４８７、４８９、４９０、４９３、４９４、４９９、
３６５、３６９、３７０、３７４、３７６、３８４、４０５、４０８、４１５、４２１、４４３、４４７、４４８、４５６、４７２、４７３、４７６、４９６、４９８、５００、５０４
からなる群から選択される位置の修飾が含まれる。

【0273】

受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）中の特異的修飾には、
Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４３９Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、
Ｔ３４５Ａ、Ｒ３４６Ｋ、Ａ３５２Ｓ、Ｋ３７８Ｎ、Ｅ４０６Ｑ、Ｄ４２０、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｆ、Ｋ４４４、Ｖ４４５Ａ、Ｇ４４６Ｖ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５５Ｆ、Ｎ４６０Ｉ、Ａ４７５Ｖ、Ｔ４７８Ｉ、Ｇ４８５Ｖ、Ｆ４８６Ｌ、Ｎ４８７Ｄ、Ｙ４８９、Ｆ４９０Ｓ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｐ４９９Ｈ、
Ｙ３６５Ｄ、Ｙ３６９Ｃ、Ｎ３７０Ｓ、Ｆ３７４Ｌ、Ｔ３７６Ｉ、Ｐ３８４Ｌ、Ｄ４０５Ｙ、Ｒ４０８Ｉ、Ｔ４１５Ｎ、Ｙ４２１、Ｓ４４３Ａ、Ｇ４４７Ｖ、Ｎ４４８Ｙ、Ｆ４５６Ｌ、Ｉ４７２Ｖ、Ｙ４７３Ｆ、Ｇ４７６Ｓ、Ｇ４９６Ｃ、Ｑ４９８Ｈ、Ｔ５００Ｉ、Ｇ５０４Ｄ
からなる群から選択される修飾が含まれる。

【0274】

一部の実施態様において、ここで記載する組成物は、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と比較して、例えば、配列番号１と比較されるような１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列（例えば、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の）に基づいており、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と比較して、例えば、配列番号１と比較されるような１つまたは複数の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列（例えば、１つまたは複数の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の）中に存在する１つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾を含むことにより特徴づけられる。したがって、一部の実施態様において、ここで記載する組成物は、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と比較して、例えば、配列番号１と比較されるような親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列中に存在する１つまたは複数のアミノ酸修飾、および野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と比較して、例えば、配列番号１と比較されるような１つまたは複数の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列中に存在する１つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾を含み得ることにより特徴づけられる。

【0275】

例えば、一部の実施態様において、ここで記載する組成物は、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列として株Ｂ.１.１.７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列に基づく場合があり、したがって、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と比較して、例えば、配列番号１と比較されるような親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列中に存在するアミノ酸修飾、すなわち、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈを含み得ることにより特徴づけられる場合もある。さらに、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と比較して、例えば、配列番号１と比較されるような１つまたは複数の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列中に存在する、例えば、親株以外の１つまたは複数の株のアミノ酸修飾のうち１つまたは複数を含み得る。例えば、親株以外のこのような１つまたは複数の株は、Ｂ.１.３５１、Ｂ.１.１.２９８、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９、Ｂ.１.５２６およびＰ.１からなる群から選択され得る。

【0276】

ある実施態様において、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、（例えば、株Ｂ.１.１.７の親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列中に存在するアミノ酸修飾に加えて）Ｂ.１.５２６（ＮＹ）中に存在するアミノ酸修飾のうち１つまたは複数およびＢ.１.４２７／Ｂ.１.４２９（ＣＡＬ）中に存在するアミノ酸修飾のうち１つまたは複数を含み得る。Ｂ.１.５２６（ＮＹ）中に存在するアミノ酸修飾のうち１つまたは複数は、Ｄ２５３ＧおよびＡ７０１Ｖであり得る。Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９（ＣＡＬ）中に存在するアミノ酸修飾のうち１つまたは複数は、Ｌ４５２Ｒであり得る。さらなる修飾は、Ｌ１８Ｆ（例えば、Ｂ.１.３５１およびＰ.１中に存在するような）、Ｎ４３９ＫおよびＳ４７７Ｎを含み得る。

【0277】

ある実施態様において、多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、（例えば、株Ｂ.１.１.７の親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列中に存在するアミノ酸修飾に加えて）Ｂ.１.３５１（ＳＡ）中に存在するアミノ酸修飾のうち１つまたは複数を含み得る。Ｂ.１.３５１（ＳＡ）中に存在するアミノ酸修飾のうち１つまたは複数は、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７ＮおよびＥ４８４Ｋであり得る。

【0278】

多特異性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列を含む上記の異なるアミノ酸配列（またはコーディング核酸）の両方を組み合わせて使用して、少なくとも株Ｂ.１.３５１、Ｂ.１.１.２９８、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９、Ｂ.１.５２６およびＰ.１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントにわたって中和活性を誘導できる。

【0279】

当業者は、種々のスパイクバリアントおよび／またはそれを記載するリソースを認識している。例えば、以下の株、そのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列、特に、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と比較した、例えば、配列番号１と比較されるようなその修飾がここで有用である。

【0280】

Ｂ.１.１.７（「懸念されるバリアント２０２０１２／０１」（ＶＯＣ－２０２０１２／０１）
Ｂ.１.１.７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、英国においてＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの際に前月に採取されたサンプルから２０２０年１０月に最初に検出され、１２月中旬までに急速に広がり始めた。英国におけるＣＯＶＩＤ－１９感染率の大幅な増加と関連しており、この増加は、少なくとも一部は、ヒト細胞におけるＡＣＥ２への結合にとって必要であるスパイク糖タンパク質の受容体結合ドメイン内の変化Ｎ５０１Ｙのためであると考えられている。Ｂ.１.１.７バリアントは、２３の変異：１３の非同義変異、４つの欠失および６つの同義変異によって定義される（すなわち、タンパク質を変更する１７の変異および変更しない６つがある）。Ｂ.１.１.７におけるスパイクタンパク質変化には、欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈが含まれる。

【0281】

Ｂ.１.３５１（５０１.Ｖ２）
Ｂ.１.３５１系統であり、口語的に南アフリカＣＯＶＩＤ－１９バリアントとして知られる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。予備的結果は、このバリアントが増加した感染性を有する可能性があることを示す。Ｂ.１.３５１バリアントは、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、欠失２４２～２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖを含む複数のスパイクタンパク質変化によって定義される。Ｂ.１.３５１ゲノムのスパイク領域中に特に目的のある３つの変異がある：Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ。

【0282】

Ｂ.１.１.２９８（クラスター５）
Ｂ.１.１.２９８は、デンマーク、北ユランにおいて発見され、ミンク農場を介してミンクからヒトに広がったと考えられている。ウイルスのスパイクタンパク質中のいくつかの異なる変異は、確認されている。特異的変異には、欠失６９～７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｄ６１４Ｇ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉ、適宜Ｓ１１４７Ｌが含まれる。

【0283】

Ｐ.１（Ｂ.１.１.２４８）
系統Ｂ.１.１.２４８は、ブラジル（型）バリアントとして知られ、Ｐ.１系統と名付けられているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントの１つである。Ｐ.１は、いくつかのＳ－タンパク質修飾[Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆ]を有し、ある特定の重要なＲＢＤ位置（Ｋ４１７、Ｅ４８４、Ｎ５０１）において南アフリカからのバリアントＢ.１.３５１と類似する。

【0284】

Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９（ＣＡＬ.２０Ｃ）
系統Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９は、ＣＡＬ.２０Ｃとしても知られ、Ｓ－タンパク質中の以下の修飾によって定義される：Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２ＲおよびＤ６１４Ｇ、そのうちＬ４５２Ｒ修飾は特に関心がある。ＣＤＣは、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９を「懸念されるバリアント」としてリストアップした。

【0285】

Ｂ.１.５２５
Ｂ.１.５２５は、Ｐ.１およびＢ.１.３５１バリアントにおいて見出されるものと同一のＥ４８４Ｋ修飾を保持し、また、Ｂ.１.１.７およびＢ.１.１.２９８において見出されるものと同一のΔＨ６９／ΔＶ７０欠失を保持する。修飾Ｄ６１４Ｇ、Ｑ６７７ＨおよびＦ８８８Ｌも保持する。

【0286】

Ｂ.１.５２６
Ｂ.１.５２６は、これまでに報告されたバリアントと変異を共有するニューヨーク地域におけるウイルス単離株の新興系統として検出された。この系統におけるスパイク変異の最も一般的なセットは、Ｌ５Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ｄ２５３Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖである。

【0287】

以下の表は、ＶＯＩ／ＶＯＣである循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の概要を示す。

【0288】

【表1】

【0289】

ある実施態様において、ここで記載するワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓ）の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。

【0290】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１もしくは７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１もしくは７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0291】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む、および／あるいは（ｉｉ）配列番号１もしくは７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１もしくは７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0292】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１フラグメント（Ｓ１）の修飾されたバリアント（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓ）のＳ１サブユニット）であるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。

【0293】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0294】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９～２０４９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９～２０４９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0295】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0296】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８もしくは９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む、および／あるいは（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0297】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓ）のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列またはそのフラグメントはここでは「ＲＢＤ」または「ＲＢＤドメイン」とも称する。

【0298】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0299】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0300】

ある特定の実施態様によれば、シグナルペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列またはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に直接的にまたはリンカーを介して融合される。従って、ある実施態様において、シグナルペプチドは、上記ワクチン抗原に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント（抗原性ペプチドまたはタンパク質）由来の上記アミノ酸配列に融合する。

【0301】

このようなシグナルペプチドは、一般に約１５～３０アミノ酸長を示し、好ましくは、限定されないが抗原性ペプチドまたはタンパク質のＮ末端に位置する配列である。ここに定義するシグナルペプチドは、好ましくは、ＲＮＡによりコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の既定の細胞内コンパートメント、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム－リソソームコンパートメントへの輸送を可能とする。ある実施態様において、ここで定義するシグナルペプチド配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のシグナルペプチド配列、特に配列番号１のアミノ酸１～１６または１～１９のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、それらに限定されない。

【0302】

ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列を含む。

【0303】

ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0304】

ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列を含む。

【0305】

ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド１～５７のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１～５７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１～５７のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１～５７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド１～５７のヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１～１９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0306】

ここで定義するシグナルペプチド配列は、免疫グロブリンのシグナルペプチド配列、例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域のシグナルペプチド配列をさらに含むが、それらに限定されず、ここで、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンであり得る。特に、ここで定義するシグナルペプチド配列は、配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む配列を含む。

【0307】

ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列を含む。

【0308】

ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド５４～１１９、配列番号３２のヌクレオチド５４～１１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～１１９のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４～１１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、シグナル配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド５４～１１９のヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0309】

このようなシグナルペプチドは、好ましくはコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の分泌を促進するために使用される。より好ましくはここに定義されるシグナルペプチドは、ここに定義されるコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質に融合される。

【0310】

従って、特に好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡは抗原性ペプチドまたはタンパク質およびシグナルペプチドをコードする少なくとも１個のコード領域を含み、該シグナルペプチドは、好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質、より好ましくはここに記載する抗原性ペプチドまたはタンパク質のＮ末端に融合される。

【0311】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0312】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0313】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントを含む。

【0314】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１５、１６、１９、２０、２４または２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１５、１６、１９、２０、２４または２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0315】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0316】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド１～２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１～２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0317】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0318】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド１～２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１～２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0319】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0320】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0321】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0322】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0323】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0324】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0325】

ある特定の実施態様によれば、三量体化ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列またはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に直接的にまたはリンカーを介して融合される。従って、ある実施態様において、三量体化ドメインは、上記ワクチン抗原（これは上記のとおり所望によりシグナルペプチドに融合し得る）に含まれる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント（抗原性ペプチドまたはタンパク質）由来の上記アミノ酸配列に融合される。

【0326】

このような三量体化ドメインは、好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に位置するが、これに限定されない。ここに定義する三量体形成ドメインは、好ましくはＲＮＡによりコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の三量体化を可能とする。ここに定義する三量体化ドメインの例は、Ｔ４フィブリチンの天然三量体化ドメインであるフォルドンを含むが、これに限定されない。Ｔ４フィブリチン（フォルドン）のＣ末端ドメインはフィブリチン三量体構造の形成に必須であり、人工三量体化ドメインとして使用され得る。ある実施態様において、ここに定義する三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む配列を含むが、それらに限定されない。ある実施態様において、ここに定義する三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む配列を含むが、それらに限定されない。

【0327】

ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含む。

【0328】

ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ）配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列もしくは配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ）配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0329】

ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0330】

ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ）配列番号１１のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１１のヌクレオチド配列もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、ｉ）配列番号１１のヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0331】

このような三量体化ドメインは、好ましくはコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の三量体化を促進するために使用される。より好ましくはここに定義する三量体化ドメインはここに定義する抗原性ペプチドまたはタンパク質に融合される。

【0332】

従って、特に好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡは抗原性ペプチドまたはタンパク質およびここに定義する三量体化ドメインをコードする少なくとも１個のコード領域を含み、該三量体化ドメインは、抗原性ペプチドまたはタンパク質、より好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に融合される。

【0333】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0334】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0335】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0336】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0337】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0338】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0339】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0340】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0341】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0342】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0343】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0344】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0345】

ある特定の実施態様によれば、膜貫通ドメインドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列またはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に直接的にまたはリンカー、例えば、グリシン／セリンリンカーを介して融合される。従って、ある実施態様において、膜貫通ドメインは、上記ワクチン抗原（これは上記のとおり所望によりシグナルペプチドおよび／または三量体化ドメインに融合していてよい）に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント（抗原性ペプチドまたはタンパク質）由来の上記アミノ酸配列に融合される。

【0346】

このような膜貫通ドメインは、好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に位置するが、これに限定されない。好ましくはこのような膜貫通ドメインは、存在するならば、三量体化ドメインのＣ末端に位置するが、これに限定されない。ある実施態様において、三量体化ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列またはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質と、膜貫通ドメインとの間に存在する。

【0347】

ここに定義する膜貫通ドメインは、好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質の細胞膜への固定を可能とする。

【0348】

ある実施態様において、ここに定義する膜貫通ドメイン配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の膜貫通ドメイン配列、特に配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、それらに限定されない。

【0349】

ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む。

【0350】

ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0351】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0352】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む、および／あるいは（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0353】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0354】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0355】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0356】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0357】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0358】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0359】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0360】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。

【0361】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。

【0362】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含み、および／あるいは（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。

【0363】

ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、上記ワクチン抗原によって含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性フラグメント（抗原性ペプチドまたはタンパク質）に由来する上記アミノ酸配列からなる、または本質的にそれからなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の連続配列の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、２２０アミノ酸、２１５アミノ酸、２１０アミノ酸または２０５アミノ酸を超えないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の連続配列の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列を含む。

【0364】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ＢＮＴ１６２ｂ１（ＲＢＰ０２０.３）、ＢＮＴ１６２ｂ２（ＲＢＰ０２０.１またはＲＢＰ０２０.２）としてここに記載されるＲＮＡの修飾されたバリアントであるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）である。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ここでＲＢＰ０２０.２として記載されるＲＮＡの修飾されたバリアントであるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）である。

【0365】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）であり、（ｉ）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0366】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）であり、（ｉ）配列番号１９または２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0367】

ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）であり、（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、および／または（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0368】

ここで使用する用語「ワクチン」は、対象への接種により免疫応答を誘導する組成物をいう。ある実施態様において、誘導された免疫応答は防御免疫を提供する。

【0369】

ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡは対象の細胞で発現され、抗原分子を提供する。ある実施態様において、抗原分子の発現は細胞表面または細胞外間隙内で生じる。ある実施態様において、抗原分子はＭＨＣの状況で提示される。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡは対象の細胞で一過性に発現される。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、特に抗原分子をコードするＲＮＡの筋肉内投与後、筋肉における抗原分子をコードするＲＮＡの発現が生じる。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、脾臓における抗原分子をコードするＲＮＡの発現が生じる。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、抗原提示細胞、好ましくは特化された抗原提示細胞における抗原分子をコードするＲＮＡの発現が生じる。ある実施態様において、抗原提示細胞は樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、肺および／または肝臓における抗原分子をコードするＲＮＡの発現は生じないまたは本質的に生じない。ある実施態様において、抗原分子をコードするＲＮＡの投与後、脾臓における抗原分子をコードするＲＮＡの発現は、肺の発現量の少なくとも５倍である。

【0370】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、リンパ節および／または脾臓へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、投与後６時間以降および好ましくは最大６日までまたはそれ以上、リンパ節および／または脾臓で検出可能である。

【0371】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、Ｂ細胞卵胞、被膜下洞および／またはＴ細胞帯、特にリンパ節のＢ細胞卵胞および／または被膜下洞へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。

【0372】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋）、被膜下洞マクロファージ（ＣＤ１６９^＋）および／またはＴ細胞帯の樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）およびリンパ節の中間洞、特にＢ細胞（ＣＤ１９^＋）および／またはリンパ節の被膜下洞マクロファージ（ＣＤ１６９^＋）へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。

【0373】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、脾臓白髄へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。

【0374】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤、例えば、ｍＲＮＡ組成物は、対象への投与後、特に筋肉内投与後は、Ｂ細胞、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ^＋）、特にＢ細胞周囲の物および／または脾臓のマクロファージ、特にＢ細胞および／またはＤＣ（ＣＤ１１ｃ^＋）へのワクチン抗原をコードするＲＮＡの送達をもたらす。

【0375】

ある実施態様において、ワクチン抗原はリンパ節および／または脾臓、特に上記リンパ節および／または脾臓の細胞で発現される。

【0376】

抗原分子またはその進行産物、例えば、そのフラグメントは、免疫エフェクター細胞により運搬されるＢＣＲまたはＴＣＲなどの抗原受容体または抗体に結合し得る。

【0377】

例えば、ペプチドおよびタンパク質抗原、すなわち、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの投与により本発明により対象に提供されるペプチドおよびタンパク質抗原は、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質抗原が提供される対象における免疫応答、例えば、液性および／または細胞性免疫応答の誘導をもたらす。該免疫応答は好ましくは標的抗原、特にコロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する。

【0378】

ワクチン抗原は標的抗原、そのバリアントまたはそのフラグメントを含み得る。ある実施態様において、このようなフラグメントまたはバリアントは標的抗原と免疫学的に等価である。用語「抗原のフラグメント」または「抗原のバリアント」は、免疫応答の誘導をもたらす薬剤を意味し、その免疫応答は抗原、すなわち標的抗原を標的とする。故に、ワクチン抗原は標的抗原に対応し得るまたは含み得る、標的抗原のフラグメントに対応し得るまたは含み得るまたは標的抗原またはそのフラグメントと相同である抗原に対応し得るまたは含み得る。ワクチン抗原は標的抗原の免疫原性フラグメントまたは標的抗原の免疫原性フラグメントと相同であるアミノ酸配列を含み得る。「抗原の免疫原性フラグメント」は、好ましくは標的抗原に対する免疫応答を誘導できる抗原のフラグメントに関する。ワクチン抗原は組換え抗原であり得る。

【0379】

用語「免疫学的に等価」は、例えば、免疫学的効果のタイプに関して、同じまたは本質的に同じ免疫学的性質を示すおよび／または同じまたは本質的に同じ免疫学的効果を発揮する、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子を意味する。本開示において、用語「免疫学的に等価」は、好ましくは免疫化に使用する抗原または抗原バリアントの免疫学的効果または性質に関して使用する。例えば、アミノ酸配列は、該アミノ酸配列が、対象の免疫系に曝されたとき、対照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導するならば、該対照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。

【0380】

ここで使用する「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されている、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の状態をいう。活性化は、シグナル伝達経路の開始、誘導されるサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能とも関連し得る。用語「活性化免疫エフェクター細胞」は、数ある中で、細胞分裂を行っている免疫エフェクター細胞をいう。

【0381】

用語「プライミング」は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞がその特異的抗原と初めて接触し、エフェクターＴ細胞などのエフェクター細胞への分化が引き起こされる、過程をいう。

【0382】

用語「クローン増殖」または「増殖」は、特定の主体が繁殖する過程をいう。本発明において、本用語は、好ましくは免疫エフェクター細胞が抗原により刺激され、増殖し、該抗原を認識する特異的免疫エフェクター細胞が増幅される、免疫学的応答の状況で使用する。好ましくはクローン増殖は免疫エフェクター細胞の分化を誘導する。

【0383】

用語「抗原」は、免疫応答がそれに対して産生され得るエピトープを含む薬剤に関する。用語「抗原」は、特に、タンパク質およびペプチドを含む。ある実施態様において、抗原は、免疫系細胞、例えば樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞により提示される。抗原またはＴ細胞エピトープなどのその進行産物は、ある実施態様において、Ｔ細胞またはＢ細胞受容体または抗体などの免疫グロブリン分子により結合される。従って、抗原またはその進行産物は、特に抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と反応し得る。ある実施態様において、抗原はコロナウイルスＳタンパク質、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質などのウイルス抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。

【0384】

用語「ウイルス抗原」は、抗原性性質を有する、すなわち個体に免疫応答を誘導できる、あらゆるウイルス成分をいう。ウイルス抗原はコロナウイルスＳタンパク質、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質であり得る。

【0385】

用語「細胞表面に発現される」または「細胞表面と結合する」は、抗原などの分子が細胞の原形質膜と結合し、位置し、ここで、該分子の少なくとも一部が該細胞の細胞外間隙に面し、例えば、該細胞の外側に位置する抗体により、該細胞外面から接近可能であることを意味する。この状況で、一部は、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸である。結合は直接的でも間接的でもよい。例えば、結合は、１以上の膜貫通ドメイン、１以上の脂質アンカーによる、または、細胞の原形質膜の外側小葉に見られ得る何らかの他のタンパク質、脂質、サッカリドまたは他の構造との相互作用によるものであり得る。例えば、細胞表面と結合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であってよくまたは膜貫通タンパク質である他のタンパク質との相互作用により細胞表面と結合するタンパク質であってよい。

【0386】

「細胞表面」または「細胞の表面」は、当分野でのその通常の意味に従い使用され、故に、タンパク質および他の分子による結合のために接近可能である細胞の外側を含む。抗原は、細胞表面に位置するならば、該細胞の表面で発現され、例えば、該細胞に添加された、抗原特異的抗体による結合のために接近可能である。

【0387】

本発明における用語「細胞外部分」または「エキソドメイン」は、細胞の細胞外間隙に面し、好ましくは、例えば、該細胞の外側に位置する抗体などの結合分子により、該細胞の外側から接近可能である、タンパク質などの分子の一部をいう。好ましくは本用語は、１以上の細胞外ループまたはドメインまたはそのフラグメントをいう。

【0388】

用語「エピトープ」は、免疫系により認識される抗原などの分子の一部またはフラグメントをいう。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体により認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続または不連続部分を含み得て、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約８～約２５アミノ酸長であり得て、例えば、エピトープは好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。ある実施態様において、エピトープは約１０～約２５アミノ酸長である。用語「エピトープ」はＴ細胞エピトープを含む。

【0389】

用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子の状況で提示されたとき、Ｔ細胞により認識されるタンパク質の一部またはフラグメントをいう。用語「主要組織適合遺伝子複合体」および略語「ＭＨＣ」はＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全脊椎動物に存在する遺伝子の複合体をいう。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または罹患細胞のシグナル伝達に重要であり、ここで、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープと結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体により認識されるようにそれらを提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は、細胞表面に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチドフラグメント）および非自己抗原（例えば、侵入微生物のフラグメント）両者をＴ細胞に提示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは一般に約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたは短いペプチドが有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは一般に約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いまたは短いペプチドが有効であり得る。

【0390】

ペプチドおよびタンパク質抗原は例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸または５０アミノ酸長を含む、２～１００アミノ酸であり得る。ある実施態様において、ペプチドは５０アミノ酸より大きくてよい。ある実施態様において、ペプチドは１００アミノ酸より大きくてよい。

【0391】

ペプチドまたはタンパク質抗原は、ペプチドまたはタンパク質に対する抗体およびＴ細胞応答を進展させる免疫系の能力を誘導または増加できるあらゆるペプチドまたはタンパク質であり得る。

【0392】

ある実施態様において、ワクチン抗原は、免疫エフェクター細胞により認識可能である。好ましくは、ワクチン抗原は、免疫エフェクター細胞により認識されたら、適切な共刺激シグナル存在下、ワクチン抗原を認識する抗原受容体を運搬する免疫エフェクター細胞の刺激、プライミングおよび／または増殖を誘導できる。本発明の実施態様の状況において、ワクチン抗原は、好ましくは細胞表面、好ましくは抗原提示細胞に提示されているかまたは提示される。ある実施態様において、抗原は、ウイルス感染細胞などの罹患細胞により提示される。ある実施態様において、抗原受容体は、ＭＨＣの状況で提示される抗原のエピトープに結合するＴＣＲである。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、Ｔ細胞により発現されたおよび／またはＴ細胞上で抗原提示細胞などの細胞により抗原に対して提示されたとき刺激、該Ｔ細胞のプライミングおよび／または増殖をもたらす。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、Ｔ細胞により発現されたおよび／または罹患細胞に提示される抗原に対してＴ細胞で提示されたとき、罹患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、ここで、該Ｔ細胞は、好ましくは細胞毒性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出する。

【0393】

ある実施態様において、抗原受容体は、抗原におけるエピトープに結合する抗体またはＢ細胞受容体である。ある実施態様において、抗体またはＢ細胞受容体は抗原の天然エピトープに結合する。

【0394】

核酸
ここで使用する用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより産生されたおよび化学合成された分子などのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意図する。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡを含む。本発明では、ポリヌクレオチドは好ましくは単離されている。

【0395】

核酸はベクターに含まれ得る。ここで使用する用語「ベクター」は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルスまたはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクターまたは細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に知られるあらゆるベクターを含む。該ベクターは、発現およびクローニングベクターを含む。発現ベクターはプラスミドならびにウイルスベクターを含み、一般に所望のコード配列と、特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物）またはインビトロ発現系で操作可能に結合したコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般にある所望のＤＮＡフラグメントの操作および増幅に使用され、所望のＤＮＡフラグメントの発現に必要な機能的配列を欠き得る。

【0396】

本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、該ワクチン抗原を産生するよう処理された、抗原提示対象の細胞などの細胞で発現される。

【0397】

ここに記載する核酸は組換えおよび／または単離分子であり得る。

【0398】

本発明において、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施態様において、ＲＮＡはリボヌクレオチド残基のすべてまたは大部分を含む。ここで使用する「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドをいう。ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより産生されたＲＮＡならびに１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により天然に存在するＲＮＡと異なる修飾ＲＮＡを包含し、これらに限定されない。このような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端への非ヌクレオチド物質の付加をいい得る。ここでは、ＲＮＡのヌクレオチドが化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることもまた意図される。本発明に関して、これらの改変ＲＮＡは天然に存在するＲＮＡのアナログと考慮される。

【0399】

本発明のある実施態様において、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当分野で確立されているとおり、ｍＲＮＡは、一般に５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。ある実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写または化学合成により産生される。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写により産生され、ここで、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸をいう。

【0400】

ある実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得られ得る。転写制御用プロモーターは、あらゆるＲＮＡポリメラーゼのあらゆるプロモーターであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングおよびインビトロ転写のための適切なベクターへのその導入を含む。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得られ得る。

【0401】

本発明のある実施態様において、ＲＮＡは「レプリコンＲＮＡ」または単に「レプリコン」、特に「自己複製ＲＮＡ」または「自己増幅性ＲＮＡ」である。ある特に好ましい実施態様において、レプリコンまたは自己複製ＲＮＡはｓｓＲＮＡウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに由来するまたはそれ由来の要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的代表である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスライフサイクルのレビューのためにJose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856を参照のこと）。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、一般に１１,０００～１２,０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、一般に５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）テイルを有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成）をコードする。ゲノムに一般に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がある。４非構造タンパク質（ｎｓＰ１－ｎｓＰ４）は、一般にゲノムの５’末端付近で始まる第一ＯＲＦにより一緒にコードされ、一方アルファウイルス構造タンパク質は、第一ＯＲＦの下流に見られ、ゲノムの３’末端付近に伸びる第二ＯＲＦにより一緒にコードされる。一般に、第一ＯＲＦは第二ＯＲＦより大きく、比はおおよそ２：１である。アルファウイルスに感染した細胞において、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝子情報は、真核生物メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124）を模倣するＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルスライフサイクル早期に、（^＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来ベクターは、外来遺伝子情報の標的細胞または標的生物への送達について提案されている。単純なアプローチで、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換えられる。アルファウイルスベースのトランス複製系は、２つの別々の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子は該レプリカーゼをトランスで複製できる（故に、トランス複製系と命名）。トランス複製は、ある宿主細胞におけるこれら核酸分子の両方の存在を必要とする。レプリカーゼによりトランスで複製されることができる核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能とするため、あるアルファウイルス配列要素を含まなければならない。

【0402】

ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡは修飾ヌクレオシドを有し得る。ある実施態様において、ＲＮＡは少なくとも１個の（例えば、全）ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。

【0403】

ここで使用する用語「ウラシル」は、ＲＮＡの核酸に出現し得る核酸塩基の一つをいう。ウラシルの構造は次のとおりである。

【0404】

【化1】

【0405】

ここで使用する用語「ウリジン」は、ＲＮＡに存在し得るヌクレオシドの一つをいう。ウリジンの構造は次のとおりである。

【0406】

【化2】

【0407】

ＵＴＰ（ウリジン５’－三リン酸）は次の構造を有する。

【0408】

【化3】

【0409】

シュード－ＵＴＰ（シュードウリジン５’－三リン酸）は次の構造を有する。

【0410】

【化4】

【0411】

「シュードウリジン」は、ウラシルが窒素－炭素グリコシド結合の代わりに炭素－炭素結合を介してペントース環に結合している、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例である。

【0412】

他の例示的修飾ヌクレオシドは、次の構造を有するＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）である。

【0413】

【化5】

【0414】

Ｎ１－メチル－シュード－ＵＴＰは次の構造を有する。

【0415】

【化6】

【0416】

他の例示的修飾ヌクレオシドは、次の構造を有する５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）である。

【0417】

【化7】

【0418】

ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ中の１以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。

【0419】

ある実施態様において、ＲＮＡは少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ＲＮＡは各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。

【0420】

ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。ある実施態様において、ＲＮＡは１を超えるタイプの修飾ヌクレオシドを含んでよく、修飾ヌクレオシドは独立してシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）およびＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。

【0421】

ある実施態様において、ＲＮＡ中の１以上の、例えば、すべてのウリジンを置き換える修飾ヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ^３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ^２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ^４Ｕ）、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ^５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ^５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ^５Ｕ）、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ^５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ^５Ｕ）、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ^５Ｕ）、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ^５ｓ^２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ^１ｓ^４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ^３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５,６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ^５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ^３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ^３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ^２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕｍ）、３,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－[３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンまたは当分野で知られるあらゆる他の修飾ウリジンの何れか１以上であり得る。

【0422】

ある実施態様において、ＲＮＡは他の修飾ヌクレオシドを含むまたはさらなる修飾ヌクレオシド、例えば、修飾シチジンを含む。例えば、ある実施態様において、ＲＮＡにおいて、５－メチルシチジンは、部分的にまたは完全に、好ましくは完全にシチジンの代わりとなる。ある実施態様において、ＲＮＡは５－メチルシチジンならびにシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される１以上を含む。ある実施態様において、ＲＮＡは５－メチルシチジンおよびＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。ある実施態様において、ＲＮＡは各シチジンの代わりに５－メチルシチジンおよび各ウリジンの代わりにＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。

【0423】

ある実施態様において、本発明のＲＮＡは５’キャップを含む。ある実施態様において、本発明のＲＮＡはキャップされていない５’－三リン酸を有しない。ある実施態様において、ＲＮＡは５’－キャップアナログにより修飾され得る。用語「５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られる構造をいい、一般に５’－から５’－三リン酸結合を介してｍＲＮＡに結合したグアノシンヌクレオチドからなる。ある実施態様において、このグアノシンは７位でメチル化される。ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップアナログを付すことは、５’キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写により達成できまたはキャッピング酵素を使用して転写後ＲＮＡに付加し得る。

【0424】

ある実施態様において、ＲＮＡのための構成要素キャップは、次の構造を有するｍ_２ ^{７,３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ（ｍ_２ ^{７,３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ^２’－ＯＡｐＧと称することもある）である。

【0425】

【化8】

【0426】

下記は、ＲＮＡおよびｍ_２ ^{７,３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ^２’－ＯＡｐＧを含む例示的キャップ１ ＲＮＡである。

【0427】

【化9】

【0428】

下記は他の例示的キャップ１ ＲＮＡ（キャップアナログ無し）である。

【0429】

【化10】

【0430】

ある実施態様において、ＲＮＡは、ある実施態様において、下記構造を有するキャップアナログ抗逆転キャップ（ＡＲＣＡキャップ（ｍ_２ ^{７,３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ））を使用して、「キャップ０」構造で修飾される。

【0431】

【化11】

【0432】

下記はＲＮＡおよびｍ_２ ^{７,３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む例示的キャップ０ ＲＮＡである。

【0433】

【化12】

【0434】

ある実施態様において、「キャップ０」構造は、下記構造を有するキャップアナログベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ_２ ^{７,２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）を使用して、産生される。

【0435】

【化13】

【0436】

下記はベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ_２ ^{７,２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）およびＲＮＡを含む例示的キャップ０ ＲＮＡである。

【0437】

【化14】

【0438】

ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡの「Ｄ１」ジアステレオマーまたは「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出する、故に保持時間が短い、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである（引用によりここに包含させるＷＯ２０１１／０１５３４７参照）。

【0439】

特に好ましいキャップは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ_２ ^{７,２’－Ｏ}ＧｐｐＳｐＧ）またはｍ_２ ^{７,３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧである。

【0440】

ある実施態様において、本発明のＲＮＡは５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、ＤＮＡ分子における転写されるが、アミノ酸配列に翻訳されない領域またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子における対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）はオープンリーディングフレームの５’（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在するならば、タンパク質コード化領域の開始コドンの上流である５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは、５’キャップ（存在するならば）の下流であり、例えば５’キャップに直接隣接する。３’－ＵＴＲは、存在するならば、タンパク質コード化領域の停止コドンの下流である３’末端に位置するが、用語「３’－ＵＴＲ」は、好ましくはポリ（Ａ）配列を含まない。故に、３’－ＵＴＲは、ポリ（Ａ）配列（存在するならば）の上流であり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接する。

【0441】

ある実施態様において、ＲＮＡは配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。

【0442】

ある実施態様において、ＲＮＡは配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。

【0443】

特に好ましい５’－ＵＴＲは配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３’－ＵＴＲは配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。

【0444】

ある実施態様において、本発明のＲＮＡは３’－ポリ（Ａ）配列を含む。

【0445】

ここで使用する用語「ポリ（Ａ）配列」または「ポリＡテイル」は、一般にＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の中断されていないまたは中断された配列をいう。ポリ（Ａ）配列は当業者に知られ、ここに記載するＲＮＡにおける３’－ＵＴＲに続き得る。中断されていないポリ（Ａ）配列は、連続アデニル酸残基により特徴づけられる。本来は、中断されていないポリ（Ａ）配列が典型的である。ここに開示するＲＮＡは、転写後鋳型非依存的ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリ（Ａ）配列またはＤＮＡによりコードされ、鋳型依存的ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるポリ（Ａ）配列を有し得る。

【0446】

約１２０個のＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列が、トランスフェクトされた真核生物細胞におけるＲＮＡのレベルおよびポリ（Ａ）配列の上流（５’）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されたタンパク質のレベルに有益に影響することが示されている（Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）。

【0447】

ポリ（Ａ）配列はどんな長さでもよい。ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個または少なくとも１００個および５００個まで、４００個まで、３００個まで、２００個までまたは１５０個までのＡヌクレオチド、および、特に、約１２０個のＡヌクレオチドを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。この状況で、「本質的にからなる」は、ポリ（Ａ）配列の大部分のヌクレオチド、一般に、ポリ（Ａ）配列におけるヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドがＵヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）またはＣヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることが可能であることを意味する。この状況で、「からなる」は、ポリ（Ａ）配列における全ヌクレオチド、すなわち、ポリ（Ａ）配列のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。用語「Ａヌクレオチド」または「Ａ」は、アデニル酸をいう。

【0448】

ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列はＲＮＡ転写中、例えば、インビトロ転写ＲＮＡの調製中、コード鎖に相補的な鎖における反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づき、結合される。ポリ（Ａ）配列をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）はポリ（Ａ）カセットと称される。

【0449】

ある実施態様において、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４ヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ）のランダム配列により中断される。このようなランダム配列は５～５０、１０～３０または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。このようなカセットは、引用によりここに包含させるＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示される。ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示されるあらゆるポリ（Ａ）カセットが本発明において使用され得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が等しく分布しているランダム配列で中断され、例えば、５～５０ヌクレオチド長のポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルで、大腸菌中のプラスミドＤＮＡの一定した増殖を示し、ＲＮＡレベルで、ＲＮＡ安定性および翻訳効率の支持に関する有益な性質が含まれることにさらに関する。結果として、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ分子に含まれるポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダム配列で中断される。このようなランダム配列は５～５０、１０～３０または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。

【0450】

ある実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは３’末端でポリ（Ａ）配列に隣接せず、すなわち、ポリ（Ａ）配列は３’末端でＡ以外のヌクレオチドでマスクされずまたは後続されていない。

【0451】

ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および５００まで、４００まで、３００まで、２００までまたは１５０までヌクレオチドを含み得る。ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列は、本質的に少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および５００まで、４００まで、３００まで、２００までまたは１５０までヌクレオチドからなり得る。ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および５００まで、４００まで、３００まで、２００までまたは１５０までヌクレオチドからなり得る。ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列は少なくとも１００ヌクレオチド含む。ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列は、約１５０ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリ（Ａ）配列は、約１２０ヌクレオチドを含む。

【0452】

ある実施態様において、ＲＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド配列または配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリ（Ａ）配列を含む。

【0453】

特に好ましいポリ（Ａ）配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。

【0454】

本開示により、ワクチン抗原は、好ましくは、一本鎖、５’キャップｍＲＮＡとして投与され、それは、該ＲＮＡを投与される対象の細胞に入ると、各タンパク質に翻訳される。好ましくはＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性を最適化する構造要素を含む（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列）。

【0455】

ある実施態様において、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）は、ＲＮＡの５’末端で特異的キャッピング構造として利用される。ある実施態様において、ｍ_２ ^{７,３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧは、ＲＮＡの５’末端で特異的キャッピング構造として利用される。ある実施態様において、５’－ＵＴＲ配列はヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡに由来し、所望により翻訳効率を高めるための最適化‘コザック配列’を有する。ある実施態様において、「分割のアミノ末端エンハンサー」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと称する）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと称する）由来の２つの配列要素（ＦＩ要素）の組み合わせが、高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にするためにコード配列とポリ（Ａ）配列の間に配置される。ある実施態様において、ヒトベータ－グロビンｍＲＮＡ由来の２個の反復３’－ＵＴＲが、高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にするために、コード配列とポリ（Ａ）配列の間に配置される。ある実施態様において、３０アデノシン残基のストレッチ、続く１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基からなる１１０ヌクレオチド長のポリ（Ａ）配列が使用される。このポリ（Ａ）配列はＲＮＡ安定性および翻訳効率を高めるために設計された。

【0456】

本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ワクチン抗原を提供するために処置される対象の細胞で発現される。本発明の全態様のある実施態様において、ＲＮＡは対象の細胞で一過性に発現される。本発明の全態様のある実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原の発現は細胞表面である。本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原はＭＨＣの状況で発現され、提示される。本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原の発現は細胞外間隙においてであり、すなわち、ワクチン抗原は分泌される。

【0457】

本発明において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列でコードされる遺伝子がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。

【0458】

本発明により、用語「転写」は「インビトロ転写」を含み、ここで、用語「インビトロ転写」は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、無細胞系で、好ましくは適切な細胞抽出物を使用してインビトロ合成される過程に関する。好ましくはクローニングベクターが転写物の産生に適用される。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと称され、本発明により用語「ベクター」に包含される。本発明により、本発明において使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得られ得る。転写の制御のためのプロモーターは、あらゆるＲＮＡポリメラーゼのあらゆるプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターにより制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングにより得て、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することができる。ｃＤＮＡはＲＮＡの逆転写により得られ得る。

【0459】

ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」は、細胞のリボソームにおける過程に関し、それにより、ｍＲＮＡ鎖がペプチドまたはタンパク質を製造するようアミノ酸配列の集合を指示する。

【0460】

ある実施態様において、例えば、ＲＮＡ脂質粒子として製剤化された、ここに記載するＲＮＡの投与後、該ＲＮＡの少なくとも一部は標的細胞に送達される。ある実施態様において、該ＲＮＡの少なくとも一部は標的細胞のサイトゾルに送達される。ある実施態様において、ＲＮＡは標的細胞により翻訳されて、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生する。ある実施態様において、標的細胞は脾細胞である。ある実施態様において、標的細胞は、脾臓における専門抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は樹状細胞またはマクロファージである。ここに記載するＲＮＡ脂質粒子などのＲＮＡ粒子を、このような標的細胞のＲＮＡへの送達に使用し得る。従って、本発明はまた、対象にここに記載するＲＮＡ粒子を投与することを含む、対象における標的細胞にＲＮＡを送達する方法にも関する。ある実施態様において、ＲＮＡは、標的細胞のサイトゾルに送達される。ある実施態様において、ＲＮＡは、該ＲＮＡによりコードされるペプチドまたはタンパク質を産生するように、標的細胞により翻訳される。

【0461】

「コードする」は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の既定の配列またはアミノ酸の規定配列およびそれ由来の生物学的性質を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として作用する、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の性質をいう。故に、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生ずるならば、該タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方をタンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードするといい得る。

【0462】

ある実施態様において、ここで記載する核酸組成物、例えば、脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡを含む組成物は、（例えば、対象に投与された場合に）コードされたポリペプチドの持続発現により特徴づけられる。例えば、一部の実施態様において、このような組成物は、ヒトに投与された場合に、このようなヒトからの生物学的サンプル（例えば、血清）における検出可能なポリペプチド発現を達成し、一部の実施態様において、例えば、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４８時間またはそれ以上を含む、少なくとも少なくとも３６時間またはそれ以上である期間、このような発現が持続することにより特徴づけられる。

【0463】

ある実施態様において、本発明により投与されるワクチン抗原をコードするＲＮＡは非免疫原性である。免疫刺激剤をコードするＲＮＡは、本発明により投与されて、アジュバント効果を提供し得る。免疫刺激剤をコードするＲＮＡは標準ＲＮＡまたは非免疫原性ＲＮＡであり得る。

【0464】

ここで使用する用語「非免疫原性ＲＮＡ」は、例えば、哺乳動物への投与により免疫系による応答を誘導しないか、非免疫原性ＲＮＡに非免疫原性を与える修飾および処理を受けていない点でのみ異なる同じＲＮＡにより誘導されるより、すなわち、標準ＲＮＡ（ｓｔｄＲＮＡ）により誘導されるより、弱い応答を誘導するＲＮＡをいう。ある好ましい実施態様において、ここでは修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）とも称する非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制するための修飾ヌクレオシドのＲＮＡへの取り込みおよび二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の除去により、非免疫原性とされる。

【0465】

修飾ヌクレオシドを取り込むことにより非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にすることについて、あらゆる修飾ヌクレオシドを、ＲＮＡの免疫原性の低減または抑制する限り、使用し得る。特に好ましいのは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制する修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの１以上のウリジンの置換を含む。ある実施態様において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。ある実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ^３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ^２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ^４Ｕ）、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ^５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ^５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ^５Ｕ）、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ^５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ^５Ｕ）、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ^５Ｕ）、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ^５ｓ^２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ^１ｓ^４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ^３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５,６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ^５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ^３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ^３ ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ^２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕｍ）、３,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジンおよび５－[３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群から選択される。ある特に好ましい実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）、特にＮ１－メチル－シュードウリジンである。

【0466】

ある実施態様において、１以上のウリジンの修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの置換は、ウリジンの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の置換を含む。

【0467】

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む相当量の異常産物が、酵素の非通常性活性により産生される。ｄｓＲＮＡは炎症性サイトカインを誘導し、タンパク質合成阻害に至るエフェクター酵素を活性化する。ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔性または多孔性Ｃ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）マトリクスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣにより、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去され得る。あるいはｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによりＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ夾雑物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを使用する酵素ベースの方法が使用され得る。さらに、ｄｓＲＮＡはセルロース物質を使用してｓｓＲＮＡから分離され得る。ある実施態様において、ＲＮＡ調製物をセルロース物質と接触させ、ｓｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡのセルロース物質への結合を可能とし、ｓｓＲＮＡのセルロース物質への結合を可能としない条件下で、セルロース物質から分離する。

【0468】

ここで使用する用語「除去する（remove）」または「除去（removal）」は、ｄｓＲＮＡなどの第二物質の集団の近くから分離される非免疫原性ＲＮＡなどの第一物質の集団などの特徴をいい、ここで、第一物質の集団は必ずしも第二物質がないものではなく、第二物質の集団は必ずしも第一物質がないものではない。しかしながら、第二物質の集団の除去により特徴づけられる第一物質の集団は、第一および第二物質が分離されていない混合物と比較して、第二物質の含有量が測定できるほどに低い。

【0469】

ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡの除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物におけるＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０.５％未満、０.３％未満または０.１％未満がｄｓＲＮＡであるようなｄｓＲＮＡの除去を含む。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがないまたは本質的にない。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物を含む。例えば、ある実施態様において、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が実質的にない。ある実施態様において、精製調製物は、他のすべての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％または少なくとも９９.９％一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。

【0470】

ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡより効率的に細胞で翻訳される。ある実施態様において、翻訳は、非修飾対応物に対して２倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、３倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、４倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、５倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、６倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、７倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、８倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、９倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１０倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１５倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、２０倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、５０倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、２００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、５００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、１０００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、翻訳は、２０００倍の係数まで増強される。ある実施態様において、係数は１０～１０００倍である。ある実施態様において、係数は１０～１００倍である。ある実施態様において、係数は１０～２００倍である。ある実施態様において、係数は１０～３００倍である。ある実施態様において、係数は１０～５００倍である。ある実施態様において、係数は２０～１０００倍である。ある実施態様において、係数は３０～１０００倍である。ある実施態様において、係数は５０～１０００倍である。ある実施態様において、係数は１００～１０００倍である。ある実施態様において、係数は２００～１０００倍である。ある実施態様において、翻訳は、任意の他の顕著な量または量の範囲まで増強される。

【0471】

ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡより有意に低い自然免疫原性を示す。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、非修飾対応物より２倍低い自然免疫応答を示す。ある実施態様において、自然免疫原性は、３倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、４倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、５倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、６倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、７倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、８倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、９倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１０倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１５倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、２０倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、５０倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、２００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、５００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、１０００倍の因数まで低減される。ある実施態様において、自然免疫原性は、２０００倍の因数まで低減される。

【0472】

用語「有意に低い自然免疫原性を示す」は、自然免疫原性の検出可能な低減をいう。ある実施態様において、本用語は、非免疫原性ＲＮＡの有効量が検出可能な自然免疫応答を誘発することなく投与できるような低減をいう。ある実施態様において、本用語は、非免疫原性ＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生を検出可能に減少させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与できるような低減をいう。ある実施態様において、低減は、非免疫原性ＲＮＡが非免疫原性ＲＮＡによりコードされるタンパク質の出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与できるようなものである。

【0473】

「免疫原性」は、ヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を誘発するＲＮＡなどの外来物質の能力である。自然免疫系は、比較的非特異的および即時である免疫系の成分である。これは、適応免疫系と共に脊椎動物免疫系の二つの主成分の一つである。

【0474】

ここで使用する「内因性」は、生物、細胞、組織または系内からのまたはそこで産生されるあらゆる物質をいう。

【0475】

ここで使用する用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系外からのまたはそこで産生されるあらゆる物質をいう。

【0476】

ここで使用する用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。

【0477】

ここで使用する用語「結合」、「融合する」または「融合」は相互交換可能に使用される。これらの用語は、２以上の要素または成分またはドメインを一緒に合わせることをいう。

【0478】

コドン最適化／Ｇ／Ｃ含有量の増加
一部の実施態様において、ここで記載する多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、コドン最適化されたおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加されるコード配列によってコードされる。これはまた、コード配列の１以上の配列領域がコドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列の対応する配列領域と比較して増加している実施態様も含む。ある実施態様において、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変えない。

【0479】

用語「コドン最適化」は、好ましくは、核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を変えることがない、宿主生物の典型的コドン使用頻度を反映するために核酸分子のコード領域におけるコドンの改変をいう。本発明において、コード領域は、好ましくは、ここに記載するＲＮＡ分子を使用して処置される対象における最適発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、細胞におけるｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても翻訳効率が決定されるとの発見に基づく。故に、ＲＮＡの配列は、しばしば存在するｔＲＮＡが「稀なコドン」の代わりに利用可能となるようにコドンを修飾し得る。

【0480】

本発明のある実施態様において、ここに記載するＲＮＡのコード領域のグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量は野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含有量と比較して増加しており、ここで、該ＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されない。ＲＮＡ配列のこの修飾は、翻訳されるべき何らかのＲＮＡ領域の配列が、そのｍＲＮＡの効率的翻訳に重要であるとの事実に基づく。Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量が増加した配列より安定である。数コドンが一つのおよび同じアミノ酸をコードする（いわゆる遺伝子コードの縮重）との事実に関して、安定性のための最も都合よいコドンが決定され得る（いわゆる代替コドン使用頻度）。ＲＮＡによりコードされるアミノ酸に依存して、野生型配列と比較してＲＮＡ配列の修飾について種々の可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするが、Ａおよび／またはＵを含まないまたはＡおよび／またはＵヌクレオチドの含有量が低い他のコドンにこれらコドンを置換することにより修飾され得る。

【0481】

種々の実施態様において、ここに記載するＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％またはそれ以上増加される。

【0482】

ＲＮＡ投与の実施態様
一部の実施態様において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも一部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を提供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも一部分は、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントにおいて見出されたアミノ酸修飾を組み込むように修飾される。ＲＮＡは、前記修飾の異なるものを有するポリペプチドをコードする複数の異なるＲＮＡ分子を含み得る。ＲＮＡはポリペプチドの細胞内発現に適している。一部の実施態様において、このようなコードされるポリペプチドは、完全Ｓタンパク質に対応する配列を含まない。一部の実施態様において、コードされるポリペプチドは、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対応する配列を含む。ある実施態様において、このようなＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）はポリカチオン性ポリマー、ポリプレックス、プロテインまたはペプチドにより複合体化され得る。ある実施態様において、このようなＲＮＡは脂質ナノ粒子（例えば、ここに記載のもの）に製剤化され得る。ある実施態様において、このようなＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は免疫原性組成物（例えば、ワクチン）としてまたはそれにおいて使用するのにおよび／またはここに記載する免疫学的効果（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体および／またはＴ細胞応答（例えば、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答）の産生）の達成に特に有用および／または有効であり得る。ある実施態様において、このようなＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒト（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への暴露および／または感染があることが知られているヒトおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への暴露が知られていないヒトを含む）のワクチン接種に有用であり得る。

【0483】

ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ構築物は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む（例えば、このようなコードされるアミノ酸配列がここに記載するような少なくとも１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、プロリン置換を含み得る実施態様および／またはｍＲＮＡ配列が例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、対象にコドン最適化されている実施態様を含む）。ある実施態様において、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ構築物は、特定の対象集団（例えば、特定の年齢の集団、例えば、ここに記載するような年齢の集団）において免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として、または免疫原性組成物（例えば、ワクチン）において使用するのに特に有用および／または有効であり得る。

【0484】

一部の実施態様において、ここで記載する組成物または医薬製剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列の修飾されたバリアントであるアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む。同様に、ここで記載する方法は、このようなＲＮＡの投与を含む。

【0485】

ここで使用する活性プラットフォームは、好ましくは最小ワクチン用量で防御免疫化を達成するための、頑強な中和抗体および付随的／随伴性Ｔ細胞応答を誘導する抗原コードＲＮＡワクチンに基づき得る。投与されるＲＮＡは好ましくはインビトロ転写ＲＮＡである。

【0486】

３つの異なるＲＮＡプラットフォーム、すなわち非修飾ウリジン含有ｍＲＮＡ（ｕＲＮＡ）、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）および自己増幅性ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）が特に好ましい。ある特に好ましい実施態様において、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。

【0487】

以下で、これら３つの異なるＲＮＡプラットフォームの実施態様を記載し、ここで、その要素を説明するとき使用されるある用語は次の意味を有する。
Ｓ１Ｓ２タンパク質／Ｓ１Ｓ２ ＲＢＤ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各（修飾）抗原をコードする配列。

【0488】

ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４：ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼレプリカーゼおよびサブゲノムプロモーターと複製および翻訳を支持する保存配列要素をコードする野生型配列。

【0489】

ｖｉｒＵＴＲ：サブゲノムプロモーターの部分ならびに複製および翻訳支持配列要素をコードするウイルス非翻訳領域。

【0490】

ｈＡｇ－コザック：翻訳効率を高めるための最適化「コザック配列」を有するヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列。

【0491】

Ｓｅｃ：Ｓｅｃは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への転座を導く内因性Ｓ１Ｓ２タンパク質分泌シグナルペプチド（ｓｅｃ）に対応する。

【0492】

グリシン－セリンリンカー（ＧＳ）：短リンカーペプチドをコードする配列は、融合タンパク質で一般に使用されるとおり、大部分アミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる。

【0493】

フィブリチン：人工三量体化ドメインとして使用されるＴ４フィブリチン（フォルドン）の部分配列。

【0494】

ＴＭ：ＴＭ配列はＳ１Ｓ２タンパク質の膜貫通部分に対応する。

【0495】

ＦＩ要素：３’－ＵＴＲは、「分割のアミノ末端エンハンサー」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと称する）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと称する）由来の２つの配列要素の組み合わせである。これらは、ＲＮＡ安定性に寄与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択過程で同定された。

【0496】

Ａ３０Ｌ７０：樹状細胞におけるＲＮＡ安定性および翻訳効率を増強するために設計されたｓ３０アデノシン残基のストレッチ、続く１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基からなる１１０ヌクレオチド長のポリ（Ａ）テイル。

【0497】

一般に、ここに記載するワクチンＲＮＡは、５’から３’で、次の構造の一つを含み得る。
キャップ－５’－ＵＴＲ－ワクチン抗原コード化配列－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）
または
キャップ－ｈＡｇ－コザック－ワクチン抗原コード化配列－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０。

【0498】

一般に、ここに記載するワクチン抗原は、Ｎ末端からＣ末端で、次の構造の一つを含み得る。
シグナル配列－ＲＢＤ－三量体形成ドメイン
または
シグナル配列－ＲＢＤ－三量体形成ドメイン－膜貫通ドメイン。

【0499】

ＲＢＤおよび三量体形成ドメインはリンカー、特にアミノ酸配列GSPGSGSGSを有するリンカーなどのＧＳリンカーにより隔離され得る。三量体形成ドメインおよび膜貫通ドメインはリンカー、特にアミノ酸配列GSGSGSを有するリンカーなどのＧＳリンカーにより隔離され得る。

【0500】

シグナル配列はここに記載するシグナル配列であり得る。ＲＢＤはここに記載する（修飾）ＲＢＤドメインであり得る。三量体形成ドメインはここに記載する三量体化ドメインであり得る。膜貫通ドメインはここに記載する膜貫通ドメインであり得る。

【0501】

ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１～１６または１～１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ＲＢＤは、配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
三量体形成ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む；および
膜貫通ドメインは、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0502】

ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１～１６または１～１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列を含む、
三量体形成ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列を含む；および
膜貫通ドメインは、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む。

【0503】

ここで記載するＲＮＡまたはここで記載するワクチン抗原をコードするＲＮＡは、非修飾ウリジン含有ＲＮＡ（ｕＲＮＡ）、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）または自己増幅性ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）であり得る。ある実施態様において、ここで記載するＲＮＡまたはここで記載するワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）である。

【0504】

非修飾ウリジンメッセンジャーＲＮＡ（ｕＲＮＡ）
非修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｕＲＮＡ）薬物物質の活性本体は、細胞に挿入したとき翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。ワクチン抗原をコードする配列（すなわちオープンリーディングフレーム）に加えて、各ｕＲＮＡは、好ましくは安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大有効性のために最適化された共通構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テイル）を含む。好ましい５’キャップ構造はベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ_２ ^{７,２’－Ｏ}ＧｐｐＳｐＧ）である。好ましい５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲはそれぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ（Ａ）テイルは配列番号１４の配列を含む。

【0505】

このプラットフォームの異なる実施態様は、以下に由来する配列および以下の修飾されたバリアントである配列である：

【表2】

【0506】

図３は抗原コード化ＲＮＡの一般的構造を模式化する。

【0507】

ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）
ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）薬物物質の活性本体は、同様に細胞への挿入により翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。ワクチン抗原をコードする配列（すなわちオープンリーディングフレーム）に加えて、各ｍｏｄＲＮＡは、ｕＲＮＡとしてＲＮＡの最大有効性を最適化するための共通構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テイル）を含む。ＵＲＮＡと比較して、ｍｏｄＲＮＡはウリジンの代わりに１－メチル－シュードウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はｍ_２ ^{７,３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧである。好ましい５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲはそれぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ（Ａ）テイルは配列番号１４の配列を含む。さらなる精製工程が、インビトロ転写反応中に産生されるｄｓＲＮＡ夾雑物を減少させるためにｍｏｄＲＮＡに適用される。

【0508】

このプラットフォームの異なる実施態様は、以下に由来する配列および以下の修飾されたバリアントである配列である：

【表3】

【0509】

図４は抗原コード化ＲＮＡの一般的構造を模式化する。

【表4】

【0510】

自己増幅性ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）
自己増幅性ｍＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）薬物物質の活性本体は、細胞に侵入したとき自己増幅し、その後ワクチン抗原が翻訳される、一本鎖ＲＮＡである。好ましくは単一タンパク質をコードするｕＲＮＡおよびｍｏｄＲＮＡとは対照的に、ｓａＲＮＡのコード領域は２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。５’－ＯＲＦは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）などのＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼをコードする。レプリカーゼＯＲＦが３’でサブゲノムプロモーターおよび抗原をコードする第二ＯＲＦに続く。さらに、ｓａＲＮＡ ＵＴＲは、自己増幅に必要な５’および３’保存配列要素（ＣＳＥ）を含む。ｓａＲＮＡは、ｕＲＮＡとしてＲＮＡの最大有効性を最適化するための共通構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テイル）を含む。好ましくはｓａＲＮＡはウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ_２ ^{７,２’－Ｏ}ＧｐｐＳｐＧ）である。

【0511】

ｓａＲＮＡの細胞質送達はアルファウイルス様ライフサイクルを開始させる。しかしながら、ｓａＲＮＡはゲノムパッケージングまたは細胞侵入に必要であるアルファウイルス構造タンパク質をコードせず、それ故に複製コンピテントウイルス粒子の産生は、不可能である可能性は極めて低い。複製は、ＤＮＡを産生する何らかの中間工程に関与しない。ｓａＲＮＡの使用／取り込みは、それ故には、標的細胞内のゲノム組込みまたは他の永久遺伝子修飾のリスクがない。さらに、ｓａＲＮＡ自体、ｄｓＲＮＡ中間体の認識を介する自然免疫応答の効率的活性化により、その持続的複製を阻止する。

【0512】

このプラットフォームの異なる実施態様は、以下に由来する配列および以下の修飾されたバリアントである配列である：

【表5】

【0513】

図５は抗原コード化ＲＮＡの一般的構造を模式化する。

【0514】

一部の実施態様において、ここで記載するワクチンＲＮＡは、配列番号１５、１６、１７、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、３０および３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列の修飾されたバリアントであるヌクレオチド配列を含む。ここで記載する特に好ましいワクチンＲＮＡは、配列番号１５、１７、１９、２１、２５、２６、３０および３２からなる群から選択される、例えば、配列番号１７、１９、２１、２６、３０および３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列の修飾されたバリアントであるヌクレオチド配列を含む。

【0515】

ここに記載するＲＮＡは好ましくは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化される。ある実施態様において、ＬＮＰはカチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質；およびＲＮＡを含む。ある実施態様において、カチオン性脂質はＡＬＣ－０３１５、中性脂質はＤＳＰＣ、ステロイドはコレステロールおよびポリマーコンジュゲート脂質はALC-0159である。好ましい投与方法は筋肉内投与、より好ましくは筋肉内投与用水性凍結保護物質緩衝液のそれである。製剤は好ましくは筋肉内投与用の水性凍結保護物質緩衝液中のＲＮＡ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化された防腐剤無添加、無菌分散体である。

【0516】

種々の実施態様において、製剤は、下記成分を、好ましくは下記割合または濃度で含む。

【0517】

【表6】

ＡＬＣ－０３１５：

【0518】

【化15】

ＡＬＣ－０１５９：

【0519】

【化16】

ＤＳＰＣ：

【0520】

【化17】

コレステロール：

【0521】

【化18】

【0522】

ある実施態様において、ｍＲＮＡ対総脂質の比（Ｎ／Ｐ）は６.０～６.５、例えば約６.０または約６.３である。

【0523】

核酸含有粒子
ワクチン抗原をコードするＲＮＡなどのここに記載する核酸は、粒子として製剤化して投与され得る。

【0524】

本開示の文脈において、用語「粒子」は、分子または分子複合体により形成される構造化された主体に関する。ある実施態様において、用語「粒子」は、媒体に分散されたミクロまたはナノサイズ小型構造などのミクロまたはナノサイズ構造に関する。ある実施態様において、粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物を含む粒子などの核酸含有粒子である。

【0525】

ポリマーおよび脂質などの正に荷電した分子と負に荷電した核酸の間の静電気的相互作用が粒子形成に関与する。これは、核酸粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。ある実施態様において、核酸粒子はナノ粒子である。

【0526】

本明細書において使用する、「ナノ粒子」は、非経腸投与に適する平均直径を有する粒子をいう。

【0527】

「核酸粒子」を、核酸の目的の標的部位（例えば、細胞、組織、臓器など）への送達に使用できる。核酸粒子は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１個のカチオン性ポリマーまたはそれらの混合物および核酸から形成され得る。核酸粒子は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベースのおよびリポプレックス（ＬＰＸ）ベースの製剤を含む。

【0528】

何らかの理論に拘束されることを意図しないが、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／またはカチオン性ポリマーは核酸と一体となって凝集体を形成し、この凝集がコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。

【0529】

ある実施態様において、ここに記載する粒子はカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の少なくとも１個の脂質または脂質様物質、カチオン性ポリマー以外の少なくとも１個のポリマーまたはそれらの混合物をさらに含む。

【0530】

ある実施態様において、核酸粒子は１を超えるタイプの核酸分子を含み、ここで、核酸分子の分子パラメータはモル質量または分子構造、キャッピング、コード領域または他の特性などの基礎的構造要素に関して等、互いに類似しても異なってもよい。

【0531】

ここに記載する核酸粒子は、ある実施態様において、約３０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約７０ｎｍ～約６００ｎｍ、約９０ｎｍ～約４００ｎｍまたは約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲である平均直径を有し得る。

【0532】

ここに記載する核酸粒子は、約０.５未満、約０.４未満、約０.３未満または約０.２またはそれ未満の多分散性指数を示し得る。例として、核酸粒子は約０.１～約０.３または約０.２～約０.３の範囲の多分散性指数を示し得る。

【0533】

ＲＮＡ脂質粒子に関して、Ｎ／Ｐ比は、脂質における窒素基対ＲＮＡにおけるリン酸基数の比を示す。これは、窒素原子（ｐＨに依存して）が、通常正電荷であり、リン酸基が負電荷であるため、電荷比と相関する。Ｎ／Ｐ比は、荷電平衡が存在するとき、ｐＨに依存する。脂質製剤は、正に荷電したナノ粒子がトランスフェクションに好都合であると考えられるため、しばしば４より大きく、１２までのＮ／Ｐ比で形成される。この場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合すると考えられる。

【0534】

ここに記載する核酸粒子は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーからコロイドを得て、核酸粒子を得るために該コロイドと核酸を混合することを含み得る、広範な方法を使用して、製造できる。

【0535】

ここで使用する用語「コロイド」は、分散した粒子が沈降しない均一混合物のタイプに関する。混合物中の不溶性粒子は顕微鏡的であり、粒子径は１～１０００ナノメートルである。混合物はコロイドまたはコロイド性懸濁液と称し得る。用語「コロイド」は、混合物中の粒子のみをいい、懸濁液全体をいわないこともある。

【0536】

少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーを含むコロイドの調製について、リポソーム小胞の調製に慣用的に使用される方法が適用され、適切に適合される。リポソーム小胞調製のために最も一般的に使用される方法は次の基礎的段階を共有する：（ｉ）有機溶媒への脂質溶解、（ｉｉ）得られた溶液の乾燥および（ｉｉｉ）乾燥脂質の水和（種々の水性媒体を使用）。

【0537】

フィルム水和方法において、脂質をまず適当な有機溶媒に溶解し、フラスコの底に薄膜を生じるよう乾燥させる。得られた脂質フィルムを、リポソーム分散体を産生するのに適する水性媒体を使用して水和する。さらに、さらなる小型化工程が含まれ得る。

【0538】

水相と脂質を含む有機相の間の油中水型エマルジョンの形成を含む、逆相蒸発は、リポソーム小胞調製のためのフィルム水和の別の方法である。系均質化のために、この混合物の短時間音波処理が必要である。減圧下の有機相の除去により、乳状ゲルが生じ、これはその後リポソーム懸濁液に変わる。

【0539】

用語「エタノール注入技術」は、脂質を含むエタノール溶液を、針をとおして水溶液に迅速に注入する過程をいう。この行為は、脂質を溶液中に分散させ、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子は、コロイド性リポソーム分散体へのＲＮＡの付加により得られ得る。エタノール注入技術を使用して、このようなコロイド性リポソーム分散体は、ある実施態様において、次のとおり形成される：カチオン性脂質およびさらなる脂質などの脂質を含むエタノール溶液を、撹拌下水溶液に注入する。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子は、押し出しの工程を用いず得られ得る。

【0540】

用語「押し出す」または「押し出し」は、固定された、横断面プロファイルを有する粒子の製造をいう。特に、粒子を規定細孔のフィルターを篩過させる、粒子の小型化をいう。

【0541】

無有機溶媒特徴を有する他の方法も、コロイドの調製のために本発明により使用され得る。

【0542】

ＬＮＰは、一般に、イオン化可能カチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイドおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質などのポリマーコンジュゲート脂質の４成分を含む。各成分は搭載物保護を担い、有効細胞内送達を可能とする。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を、水性緩衝液中の核酸と迅速に混合することにより調製され得る。

【0543】

用語「平均直径」は、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用してデータ分析した、動的レーザー光散乱法（ＤＬＳ）により測定した粒子の平均流体力学的直径をいい、これは、結果として、長さ寸法および無次元である多分散性指数（ＰＩ）と共にいわゆるＺ_平均を提供する（Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321）。ここで粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、Ｚ_平均のこの値と同義的に使用される。

【0544】

「多分散性指数」は、好ましくは「平均直径」の定義に記載したいわゆるキュムラント分析による動的光散乱法測定に基づいて計算される。ある前提下、ナノ粒子のアンサンブルのサイズ分布の指標として解釈され得る。

【0545】

種々のタイプの核酸含有粒子が以前に粒子形態の核酸の送達に適すると記載されている（例えばKaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60）。非ウイルス核酸送達媒体について、核酸のナノ粒子カプセル封入は核酸を分解から物理的に保護し、特定の化学により、細胞性取り込みおよびエンドソーム脱出を助け得る。

【0546】

本発明は、核酸、核酸粒子を形成するように核酸と結合した少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーを含む粒子およびこのような粒子を含む組成物を記載する。核酸粒子は、該粒子に非共有結合相互作用により異なる形態で複合体化される核酸を含み得る。ここに記載する粒子はウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、細胞にウイルス性に感染できない。

【0547】

適当なカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは核酸粒子を形成するものであり、用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」に含まれる。用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」は、核酸粒子を形成するように核酸と結合するあらゆる成分に関する。このような成分は、核酸粒子の一部であり得る何らかの成分を含む。

【0548】

ここに記載する一部の実施態様は、１以上、例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上の核酸種、例えば、ＲＮＡ種、例えば、ａ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置に見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸、およびｂ）親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸であって、親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメント中のアミノ酸位置が、１つまたは複数のウイルスタンパク質バリアントの対応するアミノ酸位置において見出されるアミノ酸を含むように修飾されている、核酸を含む組成物、方法および使用に関する。

【0549】

一部の実施態様において、各々が親ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、セットの各コードされるフラグメントは、循環ウイルスバリアント中に生じた親のコードされるフラグメントと比較した修飾がセットのコードされるフラグメント中に存在する点を除いて、セットの他のコードされるフラグメントに対して、および親のコードされるフラグメントに対して実質的に同一である核酸のセットが提供される。

【0550】

微粒子製剤では、各核酸種を個々の微粒子製剤として個別に製剤化することが可能である。その場合には、各個々の微粒子製剤は、１つの核酸種を含む。個々の微粒子製剤は、別個の実体として、例えば、別個の容器中に存在し得る。このような製剤は、各核酸種を別個に（通常、各々、核酸含有溶液の形態で）粒子形成剤と一緒に提供し、それによって、粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。それぞれの粒子は、粒子が形成される（個々の微粒子製剤）時に提供されている特定の核酸種をもっぱら含有する。

【0551】

ある実施態様において、組成物、例えば、医薬組成物は、１を超える個々の粒子製剤を含む。それぞれの医薬組成物は、混合微粒子製剤と呼ばれる。本発明による混合微粒子製剤は、上記のように個々の微粒子製剤を個別に形成する工程、続いて、個々の微粒子製剤を混合する工程によって得ることができる。混合する工程によって、核酸含有粒子の混合集団を含む製剤を得ることができる。個々の粒子集団は、個々の微粒子製剤の混合集団を含む１つの容器中に一緒にしてもよい。

【0552】

あるいは、異なる核酸種が複合微粒子製剤として一緒に製剤化されることが可能である。このような製剤は、異なるＲＮＡ種の複合製剤（通常、複合溶液）を粒子形成剤と一緒に提供し、それによって粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。混合微粒子製剤とは対照的に、複合微粒子製剤は通常、１を超えるＲＮＡ種を含む粒子を含む。複合粒子組成物では、異なるＲＮＡ種は通常、単一粒子中に一緒に存在する。

【0553】

カチオン性ポリマー
高度な化学柔軟性を考慮して、ポリマーは、ナノ粒子ベースの送達に一般に使用される物質である。一般に、カチオン性ポリマーは、負に荷電した核酸をナノ粒子に静電的に濃縮するために使用される。これらの正に荷電した基は、しばしば５.５～７.５のｐＨ範囲でプロトン化の状態が変化し、エンドソーム破裂をもたらすイオン不均衡に至ると考えられるアミンからなる。ポリ－１－リシン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーなどのポリマーは、すべて核酸送達に適用され、ここでのカチオン性ポリマーとして適する。さらに、一部研究者らは、特に核酸送達のためのポリマーを合成している。ポリ（β－アミノエステル）は、特に、合成の容易さおよび生分解性により、核酸送達のために広範に使用されている。このような合成ポリマーも、ここでのカチオン性ポリマーとして適する。

【0554】

ここで使用する「ポリマー」は、その通常の意味を有し、すなわち、共有結合により結合した１以上の反復単位（単量体）を含む、分子構造である。反復単位は全で同一であってよくまたはある場合、１を超えるタイプの反復単位がポリマー内に存在してよい。ある場合、ポリマーは生物学的にもたらされ、すなわち、タンパク質などのバイオポリマーである。ある場合、さらなる部分、例えばここに記載するようなターゲティング部分もポリマーに存在できる。

【0555】

１を超えるタイプの反復単位がポリマーに存在するならば、ポリマーは「コポリマー」といい得る。ここで使用されるポリマーはコポリマーであり得ることは理解される。コポリマーを形成する反復単位は、任意の形式で配置される。例えば、反復単位は、無作為の順番で、交互の順番でまたは「ブロック」コポリマー、すなわち、各々第一反復単位（例えば、第一ブロック）を含む１以上の領域および各々第二反復単位（例えば、第二ブロック）を含む１以上の領域などを含むものとして配置され得る。ブロックコポリマーは、２（ジブロックコポリマー）、３（トリブロックコポリマー）またはそれ以上の数の異なるブロックを有し得る。

【0556】

ある実施態様において、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、一般に適度な濃度で顕著な細胞死を引き起こさないポリマーである。ある実施態様において、生体適合性ポリマーは生分解性である、すなわち、ポリマーは、体内等の生理学的環境内で化学的および／または生物学的に分解できる。

【0557】

ある実施態様において、ポリマーはプロタミンまたはポリアルキレンイミン、特にプロタミンであり得る。

【0558】

用語「プロタミン」は、アルギニンに富み、種々の動物（魚等）の精子細胞で体性ヒストンの代わりに特にＤＮＡと関係して見られる比較的低分子量の種々の何らかの強塩基性タンパク質をいう。特に、用語「プロタミン」は、強塩基性であり、水に可溶性であり、熱で凝固せず、加水分解により主にアルギニンを産生する、魚精子でみられるタンパク質をいう。精製された形態では、インスリン長時間作用型製剤でおよびヘパリンの抗凝血作用を中和するために使用される。

【0559】

本開示により、ここで使用する用語「プロタミン」は、天然または生物学的供給源から得られたまたはそれ由来のあらゆるプロタミンアミノ酸配列（そのフラグメントを含む）および該アミノ酸配列またはそのフラグメントの多量体形態ならびに人工であり、特に特別な目的で設計され、天然または生物学的供給源から単離され得ない（合成）ポリペプチドを含むことを意図する。

【0560】

ある実施態様において、ポリアルキレンイミンはポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０.７５・１０^２～１０^７Ｄａ、好ましくは１０００～１０^５Ｄａ、より好ましくは１００００～４００００Ｄａ、より好ましくは１５０００～３００００Ｄａ、さらにより好ましくは２００００～２５０００Ｄａである。

【0561】

本発明により好ましいのは、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの直鎖状ポリアルキレンイミンである。

【0562】

ここでの使用が意図されるカチオン性ポリマー（ポリカチオン性ポリマーを含む）は、静電的に核酸と結合できるあらゆるカチオン性ポリマーを含む。ある実施態様において、ここでの使用が意図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによりまたは核酸が封入または被包されている小胞を形成することにより、核酸が結合できる、あらゆるカチオン性ポリマーを含む。

【0563】

ここに記載する粒子は、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち、非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーも含み得る。まとめて、アニオン性および中性ポリマーがここでは非カチオン性ポリマーと称される。

【0564】

脂質および脂質様物質
用語「脂質」および「脂質様物質」は、１以上の疎水性部分または基および所望によりまた１以上の親水性部分または基を含む分子として、ここで広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子は、しばしば両親媒性物質とも称される。脂質は、通常水にほとんど溶けない。水性環境で、両親媒性質により、分子は組織化された構造および種々の相に自己集合可能となる。これらの相の一つは、水性環境で小胞、多重膜／単層リポソームまたは膜に存在するため、脂質二重層からなる。疎水性は、１以上の芳香族、シクロ脂肪族またはヘテロ環基で置換されている、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基を含むが、これらに限定されない非極性基の包含により付与される。親水性基は、極性および／または荷電基であり、炭水化物、リン酸、カルボン酸、硫酸、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよび他の類似基を含み得る。

【0565】

ここで使用する用語「両親媒性」は、極性部分および非極性部分両方を有する分子をいう。しばしば、両親媒性化合物は、長い疎水性テイルに結合した極性頭部を有する。ある実施態様において、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は形式上正電荷または形式上負電荷を有し得る。あるいは極性部分は形式上陽性および負電荷両方を有し得て、双性イオンまたは分子内塩であり得る。本開示の目的で、両親媒性化合物は、１個または複数の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。

【0566】

用語「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」は、構造的および／または機能的に脂質に関係するが、厳密な意味での脂質とは考えられ得ない物質に関する。例えば、本用語は、水性環境で小胞、多重膜／単層リポソームまたは膜に存在するため両親媒性層を形成でき、親水性部分および疎水性部分両方に界面活性剤または合成化合物を含む、化合物を含む。一般的にいうと、本用語は、脂質と類似してもしていなくてもよい、種々の構造構成の親水性部分および疎水性部分を含む、分子をいう。ここで使用する用語「脂質」は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、脂質および脂質様物質両方を包含すると考えられる。

【0567】

両親媒性層に包含され得る両親媒性化合物の具体例は、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質を含み得るが、これらに限定されない。

【0568】

ある実施態様において、両親媒性化合物は脂質である。用語「脂質」は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることにより特徴づけられる、有機化合物群をいう。一般に、脂質は脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合由来）、ステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合由来）の８カテゴリーに分割され得る。用語「脂質」は脂肪の同義語として使用されることもあるが、脂肪はトリグリセリドと称される脂質のサブグループである。脂質はまた脂肪酸およびその誘導体（トリ、ジ、モノグリセリドおよびリン脂質を含む）ならびにコレステロールなどのステロール含有代謝物などの分子も包含する。

【0569】

脂肪酸または脂肪酸残基は、カルボン酸基で終わる炭化水素鎖からなる多様な分子群である；この配置により、分子は極性、親水性末端および水に不溶性である非極性、疎水性末端を有する。一般に４～２４炭素長の炭素鎖は飽和でも不飽和でもよく、酸素、ハロゲン、窒素および硫黄を含む官能基に結合し得る。脂肪酸が二重結合を含むならば、分子の配置に顕著に影響するｃｉｓまたはｔｒａｎｓ幾何異性のいずれかの可能性がある。Ｃｉｓ－二重結合は脂肪酸鎖を屈曲させ、鎖に二重結合が多いほど、その影響は、複雑である。脂肪酸カテゴリーの他の主要な脂質クラスは、脂肪エステルおよび脂肪アミドである。

【0570】

グリセロ脂質は、一、二および三置換グリセロールであり、トリグリセリドと称されるグリセロールの脂肪酸トリエステルが最も知られる。用語「トリアシルグリセロール」は、「トリグリセリド」と同義的に使用されることがある。これらの化合物において、グリセロールの３個のヒドロキシル基は、一般に異なる脂肪酸により、各々エステル化される。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合によりグリセロールに結合した１以上の糖残基の存在により特徴づけられる、グリコシルグリセロールである。

【0571】

グリセロリン脂質は、エステル結合により２個の脂肪酸由来「テイル」に結合したおよびリン酸エステル結合により１個の「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む、両親媒性分子（疎水性と親水性両方の領域を含む）である。通常、リン脂質（スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが）と称されるグリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン（別名ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチン）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはＧＰＥｔｎ）およびホスファチジルセリン（ＰＳまたはＧＰＳｅｒ）である。

【0572】

スフィンゴ脂質は、共通構造性質、スフィンゴイド塩基主鎖を共有する、化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は一般にスフィンゴシンと称される。セラミド（Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、一般に１６～２６炭素原子鎖長の飽和または単不飽和である。哺乳動物の主要なホスホスフィンゴ脂質はスフィンゴミエリン（セラミドホスホコリン）であり、一方昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを有し、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭部基を有する。グリコスフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基へのグリコシド結合により結合した１以上の糖残基からなる分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純および複雑グリコスフィンゴ脂質である。

【0573】

コレステロールおよびその誘導体またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に、膜脂質の重要な成分である。

【0574】

サッカロ脂質は、脂肪酸が糖主鎖に直接結合し、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物をいう。サッカロ脂質において、単糖は、グリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール主鎖に置き換わる。最も知られるサッカロ脂質は、グラム陰性細菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的リピドＡ分子は、７個もの脂肪－アシル鎖で誘導体化されるグルコサミンの二糖である。大腸菌の増殖に必要な最小リポ多糖は、２個の３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサ－アシル化二糖であるＫｄｏ２－リピドＡである。

【0575】

ポリケチドは、古典的酵素ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特性を共有する反復および多モジュール酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合化により合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌および海洋供給源からの二次代謝物および天然産物の大部分を占め、構造多様性が大きい。多くのポリケチドは環状分子であり、その主鎖はしばしばグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化または他の過程によりさらに修飾される。

【0576】

本開示により、脂質および脂質様物質はカチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択したｐＨで非荷電または中性双性イオン形態で存在する。

【0577】

カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質
ここに記載する核酸粒子は、粒子形成剤として少なくとも１個のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含み得る。ここでの使用が意図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、静電的に核酸に結合できる、あらゆるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。ある実施態様において、ここでの使用が意図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、例えば核酸と複合体を形成することによりまたは核酸が封入または被包されている小胞を形成することにより、核酸と結合できる。

【0578】

ここで使用する「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質をいう。カチオン性脂質または脂質様物質は、静電気的相互作用により負に荷電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシルまたはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分および一般に正電荷を有する脂質の頭部基を有する。

【0579】

ある実施態様において、カチオン性脂質または脂質様物質は、あるｐＨ、特に酸性ｐＨで正味の正電荷のみ有し、一方、生理学的ｐＨなどの異なる、好ましくは高いｐＨで好ましくは正味の正電荷を有しない、好ましくは電荷を有しない、すなわち、中性である。このイオン化可能の挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助けることにより有効性が増強され、毒性が低減すると考えられる。

【0580】

本発明の目的で、このような「カチオンにイオン化可能な」脂質または脂質様物質は、状況に反しない限り、用語「カチオン性脂質または脂質様物質」に含まれる。

【0581】

ある実施態様において、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、正に荷電されまたはプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子（Ｎ）を含む頭部基を含む。

【0582】

カチオン性脂質の例は、１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３－（Ｎ－（Ｎ’,Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；１,２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１,２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１,２－ジステアリルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２,３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）－ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１,２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、１,２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１,２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ）および２,３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－[２（スペルミンカルボキサミド）エチル]－Ｎ,Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ,ｃｉｓ－９,１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－[５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（ｃｉｓ,ｃｉｓ－９’,１２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ,Ｎ－ジメチル－３,４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２,３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１,２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、２,２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－[１,３]－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパンアミニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（ｃｉｓ－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパンアミニウムブロマイド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（ドデシルオキシ）－１－プロパンアミニウムブロマイド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパンアミニウムブロマイド（ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパンアミニウムブロマイド（βＡＥ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（ＤＯＢＡＱ）、２－（{８－[（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ]オクチル}オキシ）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－[（９Ｚ,１２Ｚ）－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イルオキシ]プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、１,２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＭＤＡＰ）、１,２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＤＡＰ）、Ｎ１－[２－（（１Ｓ）－１－[（３－アミノプロピル）アミノ]－４－[ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ]ブチルカルボキサミド）エチル]－３,４－ジ[オレイルオキシ]－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、１,２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、２,３－ビス（ドデシルオキシ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ,Ｎ－ジメチルプロパン－１－アンモニウムブロマイド（ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミニウムブロマイド（ＤＭＯＲＩＥ）、ジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル） ８,８’－（（（（２（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ジオクタノエート（ＡＴＸ）、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（ドデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＬＤＭＡ）、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＭＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）－９－（（４－（ジメチルアミノブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、Ｎ－ドデシル－３－（（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－{２－[（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－２－{（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－[２－（２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ）－エチル]－アミノ}－エチルアミノ）プロピオンアミド（リピドイド９８Ｎ_１２－５）、１－[２－[ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ]エチル－[２－[４－[２－[ビス（２ヒドロキシドデシル）アミノ]エチル]ピペラジン－１－イル]エチル]アミノ]ドデカン－２－オール（リピドイドＣ１２－２００）を含むが、これらに限定されない。

【0583】

ある実施態様において、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％または約５０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％を構成し得る。

【0584】

さらなる脂質または脂質様物質
ここに記載する粒子はまたカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の脂質または脂質様物質、すなわち、非カチオン性脂質または脂質様物質（非カチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む）も含み得る。まとめて、アニオン性および中性脂質または脂質様物質をここでは非カチオン性脂質または脂質様物質と称する。イオン化可能／カチオン性脂質または脂質様物質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分の付加による核酸粒子の製剤の最適化は、粒子安定性および核酸送達の有効性を増強し得る。

【0585】

核酸粒子の全体的電荷に影響してもしなくてもよいさらなる脂質または脂質様物質を取り込み得る。ある実施態様において、さらなる脂質または脂質様物質は非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。ここで使用する「アニオン性脂質」は、選択したｐＨで負に荷電したあらゆる脂質をいう。ここで使用する「中性脂質」は、選択したｐＨで非荷電または中性双性イオン形態で存在する多数の脂質種の何れかをいう。好ましい実施態様において、さらなる脂質は、（１）リン脂質、（２）コレステロールまたはその誘導体；または（３）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体の混合物の中性脂質成分の一つを含む。コレステロール誘導体の例は、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびその誘導体およびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。

【0586】

使用され得る具体的リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンを含むが、これらに限定されない。このようなリン脂質は、特にジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルフタチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８:０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）およびさらに異なる疎水性鎖を有するホスファチジルエタノールアミン脂質を含む。

【0587】

ある好ましい実施態様において、さらなる脂質はＤＳＰＣまたはＤＳＰＣおよびコレステロールである。

【0588】

ある実施態様において、核酸粒子はカチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。

【0589】

ある実施態様において、ここに記載する粒子は、ペグ化脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。用語「ペグ化脂質」は、脂質部分およびポリエチレングリコール部分両方を含む分子をいう。ペグ化脂質は当分野で知られる。

【0590】

理論に拘束されることを願わないが、少なくとも１個のさらなる脂質の量と比較した少なくとも１個のカチオン性脂質の量は、核酸の荷電、粒子径、安定性、組織選択性および生物活性などの重要な核酸粒子特徴に影響し得る。従って、ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質対少なくとも１個のさらなる脂質のモル比は約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２または約３：１～約１：１である。

【0591】

ある実施態様において、非カチオン性脂質、特に中性脂質（例えば、リン脂質および／またはコレステロールの１以上）は、粒子に存在する総脂質の約０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％または約０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成し得る。

【0592】

リポプレックス粒子
本発明のある実施態様において、ここに記載するＲＮＡはＲＮＡリポプレックス粒子に存在し得る。

【0593】

本開示の文脈において、用語「ＲＮＡリポプレックス粒子」は、脂質、特にカチオン性脂質およびＲＮＡを含む粒子に関する。正に荷電したリポソームと負に荷電したＲＮＡの間の静電気的相互作用は複合体化およびＲＮＡリポプレックス粒子の自発的形成をもたらす。正に荷電したリポソームは、一般にＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成される。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。

【0594】

ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子はカチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的実施態様において、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。

【0595】

ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質対少なくとも１個のさらなる脂質のモル比は約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２または約３：１～約１：１である。特定の実施態様において、モル比は約３：１、約２.７５：１、約２.５：１、約２.２５：１、約２：１、約１.７５：１、約１.５：１、約１.２５：１または約１：１であり得る。例示的実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質対少なくとも１個のさらなる脂質のモル比は約２：１である。

【0596】

ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子は、ある実施態様において、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０～約７００ｎｍ、約４００～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍまたは約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲である平均直径を有する。特定の実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍまたは約１０００ｎｍの平均直径を有する。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。他の実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。

【0597】

ここに記載するＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経腸投与後、特に静脈内投与後、標的組織へのＲＮＡの送達に有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、エタノール中の脂質溶液を水または適当な水相に注入することにより得られ得るリポソームを使用して調製され得る。ある実施態様において、水相は酸性ｐＨを有する。ある実施態様において、水相は、例えば、約５ｍＭ量の酢酸を含む。リポソームは、リポソームとＲＮＡの混合によるＲＮＡリポプレックス粒子の調製に使用され得る。ある実施態様において、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は少なくとも１個のカチオン性脂質および少なくとも１個のさらなる脂質を含む。ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質は１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および／または１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。ある実施態様において、少なくとも１個のさらなる脂質は１,２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または１,２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。ある実施態様において、少なくとも１個のカチオン性脂質は１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１個のさらなる脂質は１,２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。ある実施態様において、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および１,２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。

【0598】

脾臓ターゲティングＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に包含させるＷＯ２０１３／１４３６８３に記載される。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓組織または脾細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を優先的に標的とするために使用し得ることが判明している。従って、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、肺および／または肝臓へのＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は生じないまたは本質的に生じない。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、このような抗原提示細胞でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、抗原提示細胞は樹状細胞および／またはマクロファージである。

【0599】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡなどの核酸は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形で投与される。ＬＮＰは、１以上の核酸分子が結合するまたは１以上の核酸分子が被包される粒子を形成できるあらゆる脂質を含み得る。

【0600】

ある実施態様において、ＬＮＰは１以上のカチオン性脂質および１以上の安定化脂質を含む。安定化脂質は中性脂質およびペグ化脂質を含む。

【0601】

ある実施態様において、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に被包されたまたは結合したＲＮＡを含む。

【0602】

ある実施態様において、ＬＮＰは、カチオン性脂質の４０～５５モルパーセント、４０～５０モルパーセント、４１～４９モルパーセント、４１～４８モルパーセント、４２～４８モルパーセント、４３～４８モルパーセント、４４～４８モルパーセント、４５～４８モルパーセント、４６～４８モルパーセント、４７～４８モルパーセントまたは４７.２～４７.８モルパーセントを構成する。ある実施態様において、ＬＮＰは、カチオン性脂質の約４７.０モルパーセント、４７.１モルパーセント、４７.２モルパーセント、４７.３モルパーセント、４７.４モルパーセント、４７.５モルパーセント、４７.６モルパーセント、４７.７モルパーセント、４７.８モルパーセント、４７.９モルパーセントまたは４８.０モルパーセントを構成する。

【0603】

ある実施態様において、中性脂質は、５～１５モルパーセント、７～１３モルパーセントまたは９～１１モルパーセントの範囲の濃度で存在する。ある実施態様において、中性脂質は約９.５モルパーセント、１０モルパーセントまたは１０.５モルパーセントの濃度で存在する。

【0604】

ある実施態様において、ステロイドは、３０～５０モルパーセント、３５～４５モルパーセントまたは３８～４３モルパーセントの範囲の濃度で存在する。ある実施態様において、ステロイドは、約４０モルパーセント、４１モルパーセント、４２モルパーセント、４３モルパーセント、４４モルパーセント、４５モルパーセントまたは４６モルパーセントの濃度で存在する。

【0605】

ある実施態様において、ＬＮＰは、ポリマーコンジュゲート脂質の１～１０モルパーセント、１～５モルパーセントまたは１～２.５モルパーセントを構成する。

【0606】

ある実施態様において、ＬＮＰは、４０～５０モルパーセントのカチオン性脂質；５～１５モルパーセントの中性脂質；３５～４５モルパーセントのステロイド；１～１０モルパーセントのポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に被包されたまたは結合したＲＮＡを含む。

【0607】

ある実施態様において、モルパーセントは、脂質ナノ粒子に存在する脂質の総モルに基づき、決定される。

【0608】

ある実施態様において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。

【0609】

ある実施態様において、ステロイドはコレステロールである。

【0610】

ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。ある実施態様において、ペグ化脂質は次の構造

【0611】

【化19】

〔式中、Ｒ^１２およびＲ^１３は各々独立して１０～３０炭素原子を含む直鎖状または分岐鎖状、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖は所望により１以上のエステル結合で中断されており；そしてｗは３０～６０の平均値を有する。〕
を有するまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体である。ある実施態様において、Ｒ^１２およびＲ^１３は各々独立して１２～１６炭素原子を含む、直鎖状、飽和アルキル鎖である。ある実施態様において、ｗは４０～５５の範囲の平均値を有する。ある実施態様において、平均ｗは約４５である。ある実施態様において、Ｒ^１２およびＲ^１３は各々独立して約１４炭素原子を含む、直鎖状、飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。

【0612】

ある実施態様において、ペグ化脂質は、例えば、下記構造を有する、DMG-PEG 2000である。

【0613】

【化20】

【0614】

ある実施態様において、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）

【0615】

【化21】

〔式中、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ^１およびＧ^２は各々独立して非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり；
Ｇ^３はＣ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり；
Ｒ^ａはＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^１およびＲ^２は各々独立してＣ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり；
Ｒ^３はＨ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり；
Ｒ^４はＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^５はＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；そして
ｘは０、１または２である。〕
の構造を有するまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体である。

【0616】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は、次の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）

【0617】

【化22】

〔式中、
Ａは３～８員シクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ^６は、各々の場合、独立してＨ、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_２４アルキルであり；
ｎは１～１５の範囲の整数である。〕
の一方を有する。

【0618】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施態様、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。

【0619】

式（ＩＩＩ）の他の実施態様において、脂質は、構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：

【0620】

【化23】

〔式中、ｙおよびｚは各々独立して１～１２の範囲の整数である。〕
の一つを有する。

【0621】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様の何れにおいても、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、ある実施態様において、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前記の何れかのある異なる実施態様において、Ｌ^１およびＬ^２は各々独立して－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、ある実施態様において、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

【0622】

式（ＩＩＩ）のある異なる実施態様において、脂質は、構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）

【0623】

【化24】

の一つを有する。

【0624】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は、構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）または（ＩＩＩＪ）

【0625】

【化25】

の一つを有する。

【0626】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のいくつかにおいて、ｎは２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｎは３、４、５または６である。ある実施態様において、ｎは３である。ある実施態様において、ｎは４である。ある実施態様において、ｎは５である。ある実施態様において、ｎは６である。

【0627】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のあるその他において、ｙおよびｚは各々独立して２～１０の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｙおよびｚは各々独立して４～９または４～６の範囲の整数である。

【0628】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ^６はＨである。前記実施態様のその他において、Ｒ^６はＣ_１－Ｃ_２４アルキルである。他の実施態様において、Ｒ^６はＯＨである。

【0629】

式（ＩＩＩ）のある実施態様において、Ｇ^３は非置換である。他の実施態様において、Ｇ３は置換である。種々の異なる実施態様において、Ｇ^３は直鎖状Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレンまたは直鎖状Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレンである。

【0630】

式（ＩＩＩ）のある他の前記実施態様において、Ｒ^１またはＲ^２または両方はＣ_６－Ｃ_２４アルケニルである。例えば、ある実施態様において、Ｒ^１およびＲ^２は、各々独立して次の構造

【0631】

【化26】

〔式中、Ｒ^７ａおよびＲ^７ｂは、各場合、独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；そして
ａは２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂおよびａは、Ｒ^１およびＲ^２が各々独立して６～２０炭素原子を含むように、選択される。〕
を有する。例えば、ある実施態様において、ａは５～９または８～１２の範囲の整数である。

【0632】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のいくつかにおいて、少なくとも１回のＲ^７ａはＨである。例えば、ある実施態様において、Ｒ^７ａは各場合Ｈである。前記の他の異なる実施態様において、少なくとも１回のＲ^７ｂはＣ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、ある実施態様において、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

【0633】

式（ＩＩＩ）の種々の実施態様において、Ｒ^１またはＲ^２または両方は、構造

【0634】

【化27】

の一つを有する。

【0635】

式（ＩＩＩ）の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ^３はＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ^４である。ある実施態様において、Ｒ^４はメチルまたはエチルである。

【0636】

種々の異なる実施態様において、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、下表に示す構造の一つを有する。

【0637】

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【表7-4】

【表7-5】

【0638】

ある実施態様において、ＬＮＰは式（ＩＩＩ）の脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。ある実施態様において、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－３である。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。ある実施態様において、ステロイドはコレステロールである。ある実施態様において、ペグ化脂質はALC-0159である。

【0639】

ある実施態様において、カチオン性脂質は、ＬＰＮに約４０～約５０モルパーセントの量で存在する。ある実施態様において、中性脂質は、ＬＰＮに約５～約１５モルパーセントの量で存在する。ある実施態様において、ステロイドは、ＬＰＮに約３５～約４５モルパーセントの量で存在する。ある実施態様において、ペグ化脂質は、ＬＰＮに約１～約１０モルパーセントの量で存在する。

【0640】

ある実施態様において、ＬＮＰは、約４０～約５０モルパーセントの量の化合物ＩＩＩ－３、約５～約１５モルパーセントの量のＤＳＰＣ、約３５～約４５モルパーセントの量のコレステロールおよび約１～約１０モルパーセントの量のALC-0159を含む。

【0641】

ある実施態様において、ＬＮＰは、約４７.５モルパーセントの量の化合物ＩＩＩ－３、約１０モルパーセントの量のＤＳＰＣ、約４０.７モルパーセントの量のコレステロールおよび約１.８モルパーセントの量のALC-0159を含む。

【0642】

種々の異なる実施態様において、カチオン性脂質は下表に示す構造の一つを有する。

【0643】

【表8】

【0644】

ある実施態様において、ＬＮＰは、上記表に示すカチオン性脂質、例えば、式（Ｂ）または式（Ｄ）のカチオン性脂質、特に式（Ｄ）のカチオン性脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。ある実施態様において、ステロイドはコレステロールである。ある実施態様において、ペグ化脂質はDMG-PEG 2000である。

【0645】

ある実施態様において、ＬＮＰは、イオン化可能脂質様物質（リピドイド）であるカチオン性脂質を含む。ある実施態様において、カチオン性脂質は次の構造を有する。

【0646】

【化28】

【0647】

Ｎ／Ｐ値は好ましくは少なくとも約４である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は４～２０、４～１２、４～１０、４～８または５～７の範囲である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は約６である。

【0648】

ここに記載するＬＮＰは、ある実施態様において、約３０ｎｍ～約２００ｎｍまたは約６０ｎｍ～約１２０ｎｍ範囲の平均直径を有し得る。

【0649】

ＲＮＡターゲティング
本発明のある態様は、ここに開示するＲＮＡ（例えば、ワクチン抗原および／または免疫刺激剤をコードするＲＮＡ）の標的化送達を含む。

【0650】

ある実施態様において、本発明は、肺ターゲティングを含む。肺ターゲティングは、投与されるＲＮＡがワクチン抗原をコードするＲＮＡであるならば、特に好ましい。ＲＮＡは、例えば、ここに記載する粒子、例えば、脂質粒子として製剤化され得るＲＮＡを、吸入により投与することにより、肺に送達され得る。

【0651】

ある実施態様において、本発明は、リンパ系、特に二次リンパ系臓器、より具体的には脾臓のターゲティングを含む。リンパ系、特に二次リンパ系臓器、より具体的には脾臓のターゲティングは、投与されるＲＮがワクチン抗原をコードするＲＮＡであるならば、特に好ましい。

【0652】

ある実施態様において、標的細胞は脾細胞である。ある実施態様において、標的細胞は、脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓における樹状細胞である。

【0653】

「リンパ系」は循環系の一部であり、リンパを運搬するリンパ管のネットワークを含む、免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ性臓器、リンパ管の伝導ネットワークおよび循環リンパからなる。一次または中枢リンパ系臓器は、未成熟前駆細胞細胞からリンパ球を産生する。胸腺および骨髄は一次リンパ系臓器を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ系臓器は、成熟ナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始させる。

【0654】

ＲＮＡは、ＲＮＡが注射用ナノ粒子製剤を形成するためのカチオン性脂質および所望によりさらなるまたはヘルパー脂質を含むリポソームに結合する、いわゆるリポプレックス製剤により、脾臓に送達され得る。リポソームは、エタノール中の脂質溶液を水または適当な水相に注入することにより得られ得る。ＲＮＡリポプレックス粒子は、リポソームとＲＮＡの混合により調製され得る。脾臓ターゲティングＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に包含させるＷＯ２０１３／１４３６８３に記載される。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓組織または脾細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を優先的に標的とするために使用し得ることが判明している。従って、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、肺および／または肝臓へのＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は生じないまたは本質的に生じない。ある実施態様において、ＲＮＡリポプレックス粒子投与後、脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が生じる。故に、本発明のＲＮＡリポプレックス粒子を、このような抗原提示細胞でのＲＮＡの発現のために使用し得る。ある実施態様において、抗原提示細胞は樹状細胞および／またはマクロファージである。

【0655】

本発明のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１個のカチオン性脂質に存在する電荷およびＲＮＡに存在する電荷の和である。電荷比少なくとも１個のカチオン性脂質に存在する正電荷対ＲＮＡに存在する負電荷の比である。少なくとも１個のカチオン性脂質に存在する正電荷対ＲＮＡに存在する負電荷の電荷比は次の式により計算される：電荷比＝[（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））×（カチオン性脂質の正電荷の総数）]／[（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））×（ＲＮＡの負電荷の総数）]。

【0656】

ここに記載する脾臓ターゲティングＲＮＡリポプレックス粒子は、生理学的ｐＨで、好ましくは約１.９：２～約１：２または約１.６：２～約１：２または約１.６：２～約１.１：２の正電荷対負電荷の電荷比などの正味の負電荷を有する。特定の実施態様において、生理学的ｐＨで、ＲＮＡリポプレックス粒子の正電荷対負電荷の電荷比は約１.９：２.０、約１.８：２.０、約１.７：２.０、約１.６：２.０、約１.５：２.０、約１.４：２.０、約１.３：２.０、約１.２：２.０、約１.１：２.０または約１：２.０である。

【0657】

免疫刺激剤を、対象に肝臓または肝臓組織へのＲＮＡの優先的送達のための製剤の免疫刺激剤をコードするＲＮＡを投与することにより、対象に投与し得る。特に、大量の免疫刺激剤の発現が望ましいおよび／または特に相当量での免疫刺激剤の全身における存在が望ましいまたは必要であるならば、このような標的臓器または組織へのＲＮＡの送達は好ましい。

【0658】

ＲＮＡ送達系は、肝臓に固有の優先度を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特に脂質ナノ粒子、例えばリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲートの親油性リガンドに付随する。肝臓蓄積は、肝臓脈管構造または脂質代謝（リポソームおよび脂質またはコレステロールコンジュゲート）の不連続性質が原因である。

【0659】

肝臓へのインビボＲＮＡの送達のために、薬物送達系を、ＲＮＡを、その分解を防止しながら肝臓に輸送するために使用し得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）被覆表面およびｍＲＮＡ含有コアからなるポリプレックスナノミセルが、生理学的条件下、ナノミセルがＲＮＡの優れたインビボ安定性を提供するため、有用な系である。さらに、密集ＰＥＧ柵からなるポリプレックスナノミセル表面により提供されるステルス性質は、宿主免疫防御を効率的に回避させる。

【0660】

肝臓ターゲティングのための適当な免疫刺激剤の例は、Ｔ細胞増殖および／または維持に関与するサイトカインである。適当なサイトカインの例は、ＩＬ２またはＩＬ７、フラグメントおよびそのバリアントおよび延長ＰＫサイトカインなどのこれらのサイトカイン、フラグメントおよびバリアントの融合タンパク質を含む。

【0661】

他の実施態様において、免疫刺激剤をコードするＲＮＡを、リンパ系、特に二次リンパ系臓器、より具体的には脾臓に優先的にＲＮＡを送達するための製剤により投与し得る。特に、この臓器または組織における免疫刺激剤の存在が望まれるが（例えば、免疫応答を誘導するため、特にサイトカインなどの免疫刺激剤がＴ細胞プライミング中または常在免疫細胞の活性化に必要であるとき）、特に相当量で免疫刺激剤が全身性に存在することが望まれない（例えば、免疫刺激剤が全身毒性を有するため）ならば、このような標的組織への免疫刺激剤の送達が好ましい。

【0662】

適当な免疫刺激剤の例は、Ｔ細胞プライミングに関与するサイトカインである。適当なサイトカインの例は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β、フラグメントおよびそのバリアントおよび延長ＰＫサイトカインなどのこれらのサイトカイン、フラグメントおよびバリアントの融合タンパク質を含む。

【0663】

免疫刺激剤
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは非免疫原性であり得る。このおよび他の実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、免疫刺激剤または免疫刺激剤をコードするＲＮＡと共投与され得る。ここに記載する方法および薬剤は、免疫刺激剤が薬物動態修飾基に結合している（以後「延長薬物動態（ＰＫ）」免疫刺激剤と称する）ならば、特に有効である。ここに記載する方法および薬剤は、免疫刺激剤が免疫刺激剤をコードするＲＮＡの形態で投与されるであるならば、特に有効である。ある実施態様において、該ＲＮＡは、全身利用能のために肝臓に標的化される。肝細胞は効率的にトランスフェクトされ得て、大量のタンパク質を産生できる。

【0664】

「免疫刺激剤」は、免疫系の成分、特に免疫エフェクター細胞の何れかの活性化誘導または活性増加により、免疫系を刺激するあらゆる物質である。免疫刺激剤は炎症誘発性であり得る。

【0665】

ある態様により、免疫刺激剤はサイトカインまたはそのバリアントである。サイトカインの例は、インターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α）またはインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）などのインターフェロン、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５およびＩＬ２３などのインターロイキン、Ｍ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子を含む。他の態様により、免疫刺激剤はＡＰＣトール様受容体アゴニストまたは共刺激／細胞付着膜タンパク質などのアジュバント型免疫刺激剤を含む。トール様受容体アゴニストの例は、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＡＭ－１などの共刺激／付着タンパク質を含む。

【0666】

サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要な小タンパク質（約５～２０ｋＤａ）のカテゴリーである。その放出は、それら周辺の細胞の挙動に影響する。サイトカインは、免疫調節因子として自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび腫瘍壊死因子を含むが、一般にホルモンまたは増殖因子は含まない（用語に一部重複はあるが）。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および肥満細胞などの免疫細胞ならびに内皮細胞、線維芽細胞および種々の間質細胞を含む広範な細胞により産生される。あるサイトカインは、１を超えるタイプの細胞により産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系に特に重要である；サイトカインは液性および細胞ベースの免疫応答のバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、増殖および反応性を制御する。あるサイトカインは、複雑な方法で他のサイトカインの作用を増強または阻害する。

【0667】

本開示により、サイトカインは天然に存在するサイトカインまたは機能的フラグメントまたはそのバリアントであり得る。サイトカインはヒトサイトカインであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。ある特に好ましいサイトカインはインターフェロン－αである。

【0668】

インターフェロン
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス、細菌、寄生虫およびまた腫瘍細胞などのいくつかの病原体の存在に応答して宿主細胞により産生および放出される、一群のシグナル伝達タンパク質である。典型的シナリオにおいて、ウイルス感染細胞はインターフェロンを放出し、近隣細胞の抗ウイルス防御を高めさせる。

【0669】

シグナル伝達で経る受容体のタイプにより、インターフェロンは一般にＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロンおよびＩＩＩ型インターフェロンの３クラスに分類される。

【0670】

全Ｉ型インターフェロンは、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られる特異的細胞表面受容体複合体に結合する。

【0671】

ヒトに存在するＩ型インターフェロンはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκおよびＩＦＮωである。一般に、体が、侵入してきたウイルスを認識したとき、Ｉ型インターフェロンが産生される。それらは線維芽細胞および単球により産生される。放出されたら、Ｉ型インターフェロンは標的細胞の特異的受容体に結合し、それによりウイルスがそのＲＮＡおよびＤＮＡを産生し、複製することを阻止するタンパク質の発現に至る。

【0672】

ＩＦＮαタンパク質は、主に形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）により産生される。主にウイルス感染に対する自然免疫に関与する。その合成を担う遺伝子は、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１と称される１３サブタイプに入る。これらの遺伝子は、染色体９上のクラスターに一緒に見られる。

【0673】

ＩＦＮβタンパク質は線維芽細胞により多量に産生される。主に自然免疫応答に関与する抗ウイルス活性を有する。ＩＦＮβ１およびＩＦＮβ３の２タイプのＩＦＮβが記載されている。天然および組換え形態のＩＦＮβ１は抗ウイルス、抗細菌および抗癌性質を有する。

【0674】

ＩＩ型インターフェロン（ヒトにおけるＩＦＮγ）は免疫インターフェロンとしても知られ、ＩＬ１２により活性化される。さらに、ＩＩ型インターフェロンは、細胞毒性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞により放出される。

【0675】

ＩＩＩ型インターフェロンは、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２－４とも称される）およびＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２－１２とも称される）からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。Ｉ型およびＩＩ型ＩＦＮよりも最近になって発見されたが、最近の情報は、あるタイプのウイルスまたは真菌感染におけるＩＩＩ型ＩＦＮの重要性を示す。

【0676】

一般に、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンは免疫応答の制御および活性化を担う。

【0677】

本開示により、Ｉ型インターフェロンは好ましくはＩＦＮαまたはＩＦＮβ、より好ましくはＩＦＮαである。

【0678】

本開示により、インターフェロンは天然に存在するインターフェロンまたは機能的フラグメントまたはそのバリアントであり得る。インターフェロンはヒトインターフェロンであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。

【0679】

インターロイキン
インターロイキン（ＩＬ）は、顕著な構造特性に基づき、４つの主要な群に分割され得る、一群のサイトカイン（分泌型タンパク質およびシグナル分子）である。しかしながら、それらのアミノ酸配列類似性はむしろ弱い（一般に１５～２５％同一性）。ヒトゲノムは５０を超えるインターロイキンおよび関連タンパク質をコードする。

【0680】

本開示により、インターロイキンは天然に存在するインターロイキンまたは機能的フラグメントまたはそのバリアントであり得る。インターロイキンはヒトインターロイキンであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。

【0681】

延長ＰＫ基
ここに記載する免疫刺激剤ポリペプチドは、免疫刺激剤部分および異種ポリペプチド（すなわち、免疫刺激剤ではないポリペプチド）を含む融合またはキメラポリペプチドとして調製され得る。免疫刺激剤は、循環半減期を延長する延長ＰＫ基に融合させ得る。延長ＰＫ基の非限定的例は下に記載される。サイトカインなどの免疫刺激剤またはそのバリアントの循環半減期を延長させる他のＰＫ基も本発明に適用可能であることは、理解されるべきである。ある実施態様において、延長ＰＫ基は血清アルブミンドメイン（例えば、マウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）である。

【0682】

ここで使用する用語「ＰＫ」は「薬物動態」の略語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝および排出を含む、化合物の性質を包含する。ここで使用する「延長ＰＫ基」は、生物学的活性分子に融合したときまたは一緒に投与されたとき、生物学的活性分子の循環半減期を延長させる、タンパク質、ペプチドまたは部分をいう。延長ＰＫ基の例は、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）、免疫グロブリンＦｃまたはＦｃフラグメントおよびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアントおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤を含む（米国公開番号２００５／０２８７１５３および２００７／０００３５４９に開示のとおり）。他の例示的延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、Kontermann, Expert Opin Biol Ther, 2016 Jul;16（7）:903-15に開示される。ここで使用する「延長ＰＫ」免疫刺激剤は、延長ＰＫ基と組み合わせた免疫刺激剤部分をいう。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤は、免疫刺激剤部分が延長ＰＫ基に結合または融合した融合タンパク質である。

【0683】

ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独（すなわち、延長ＰＫ基に融合していない免疫刺激剤）に対して延長している。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独の血清半減期に対して少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、４００％、６００％、８００％または１０００％長い。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独の血清半減期より少なくとも１.５倍、２倍、２.５倍、３倍、３.５倍、４倍、４.５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍または５０倍大きい。ある実施態様において、延長ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間または２００時間である。

【0684】

ここで使用する「半減期」は、例えば、天然機構による分解および／または排除または隔離のため、ペプチドまたはタンパク質などの化合物の血清または血漿濃度がインビボで５０％減少するのにかかる時間をいう。ここで使用するのに適する延長ＰＫ免疫刺激剤は、インビボで安定化され、その半減期が、例えば、分解および／または排除または隔離に耐える血清アルブミン（例えば、ＨＳＡまたはＭＳＡ）への融合により延長される。半減期は、薬物動態分析などのそれ自体知られるあらゆる方法で決定され得る。適当な技術は当業者には明らかであり、例えば、一般に適当な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適当に投与し；該対象から一定間隔で血液サンプルまたは他のサンプルを集め；該血液サンプル中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定し；そしてこうして得られたデータ（プロット）から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する過程を含み得る。さらなる詳細は、例えば、Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach （1996）などの標準的手引きに提供される。Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker （1982）にも言及し得る。

【0685】

ある実施態様において、延長ＰＫ基は、血清アルブミンまたはそのフラグメントまたは血清アルブミンもしくはそのフラグメントのバリアント（本発明の目的でそのすべては用語「アルブミン」に含まれる）を含む。ここに記載するポリペプチドは、アルブミン融合タンパク質を形成するようにアルブミン（またはそのフラグメントまたはバリアント）に融合され得る。このようなアルブミン融合タンパク質は、米国公開２００７００４８２８２に開示される。

【0686】

ここで使用する「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子の治療タンパク質、特に免疫刺激剤などのタンパク質への少なくとも１分子のアルブミン（またはそのフラグメントまたはバリアント）の融合により形成されたタンパク質をいう。アルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、インフレームでアルブミンをコードするポリヌクレオチドに連結された核酸の翻訳により産生され得る。治療タンパク質およびアルブミンは、アルブミン融合タンパク質の一部として、各々アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」（例えば、「治療タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と呼ばれ得る。高度に好ましい実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療タンパク質（治療タンパク質の成熟形態を含むが、それに限定されない）および少なくとも１分子のアルブミン（アルブミンの成熟形態を含むが、それに限定されない）を含む。ある実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、投与ＲＮＡの標的臓器の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞により処理され、循環に分泌される。ＲＮＡの発現のために使用される宿主細胞の分泌経路に出現する新生アルブミン融合タンパク質の処理は、シグナルペプチド開裂；ジスルフィド結合の形成；適切な折りたたみ；炭水化物の付加および処理（例えば、ＮおよびＯ結合グリコシル化など）；特異的タンパク分解性開裂；および／または多量体タンパク質への集合を含み得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にＮ末端にシグナルペプチドを有する、処理されていない形態でＲＮＡによりコードされ、細胞による分泌後、好ましくは特にシグナルペプチドが開裂されている処理された形態で存在する。最も好ましい実施態様において、「処理された形態のアルブミン融合タンパク質」は、Ｎ末端シグナルペプチド開裂を受けたアルブミン融合タンパク質産物をいい、ここでまた「成熟アルブミン融合タンパク質」ともいう。

【0687】

好ましい実施態様において、治療タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合していないときの同じ治療タンパク質の血漿安定性と比較して、高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、一般に治療タンパク質がインビボで投与され、血流に運び込まれるときと、治療タンパク質が分解され、血流から最終的に体から治療タンパク質を浄化する腎臓または肝臓などの臓器に浄化されるときの間の期間をいう。血漿安定性は、血流中の治療タンパク質の半減期の観点で計算される。血流中の治療タンパク質の半減期は、当分野で知られる一般的アッセイにより容易に決定され得る。

【0688】

ここで使用する「アルブミン」は、まとめてアルブミンタンパク質またはアミノ酸配列またはアルブミンの１以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンフラグメントもしくはバリアントをいう。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアント、特に成熟形態のヒトアルブミンまたは他の脊椎動物からのアルブミンまたはそのフラグメントまたはこれら分子のバリアントをいう。アルブミンは、脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れか、例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンは、トリおよびサケを含むが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療タンパク質部分と異なる動物からでよい。

【0689】

ある実施態様において、アルブミンは、ＵＳ５,８７６,９６９、ＷＯ２０１１／１２４７１８、ＷＯ２０１３／０７５０６６およびＷＯ２０１１／０５１４７８９に記載のものなどヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはそのフラグメントもしくはバリアントである。

【0690】

用語、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）はここでは相互交換可能に使用される。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」は広義であり、ヒト血清アルブミン（ならびにそのフラグメントおよびバリアント）ならびに他の種からのアルブミン（ならびにそのフラグメントおよびバリアント）を含む。

【0691】

ここで使用する、治療タンパク質の治療的活性または血漿安定性延長に十分なアルブミンのフラグメントは、非融合状態の血漿安定性と比較して、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分の血漿安定性が延長または拡張されるように、タンパク質の治療的活性または血漿安定性を安定化または延長するために長さまたは構造が十分であるアルブミンのフラグメントをいう。

【0692】

アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の完全長を含んでよく、または治療的活性または血漿安定性を安定化またはできる１以上のそのフラグメントを含んでよい。このようなフラグメントは１０以上アミノ酸長であり得て、アルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０以上連続アミノ酸であり得るかまたはアルブミンの特異的ドメインの一部またはすべてを含み得る。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにかかるＨＳＡの１以上のフラグメントが使用され得る。好ましい実施態様において、ＨＳＡフラグメントは成熟形態のＨＳＡである。

【0693】

一般的にいうと、アルブミンフラグメントまたはバリアントは少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。

【0694】

本開示により、アルブミンは天然に存在するアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントであり得る。アルブミンはヒトアルブミンであってよく、かつ脊椎動物の何れか、特に哺乳動物の何れかに由来してよい。

【0695】

好ましくはアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミンおよびＣ末端部分として治療タンパク質を含む。あるいはＣ末端部分としてアルブミンおよびＮ末端部分として治療タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質もまた使用され得る。他の実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端両方に融合した治療タンパク質を有する。好ましい実施態様において、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療タンパク質は同じ治療タンパク質である。他の好ましい実施態様において、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療タンパク質は異なる治療タンパク質である。ある実施態様において、異なる治療タンパク質はいずれもサイトカインである。

【0696】

ある実施態様において、治療タンパク質は、ペプチドリンカーを介してアルブミンに連結される。融合部分間のリンカーペプチドは、部分間の大きな物理的分離を提供し、故に、例えば、その同族受容体への結合のための、治療タンパク質部分の利用可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、柔軟またはより硬いようにアミノ酸からなり得る。リンカー配列はプロテアーゼによりまたは化学的に切断可能であり得る。

【0697】

ここで使用する用語「Ｆｃ領域」は、天然免疫グロブリンの、その２つの重鎖の各Ｆｃドメイン（またはＦｃ部分）により形成される部分をいう。ここで使用する用語「Ｆｃドメイン」は、単一免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の部分またはフラグメントをいい、ここで、ＦｃドメインはＦｖドメインを含まない。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、パパイン開裂部位のすぐ上流のヒンジ領域で開始し、抗体のＣ末端で終了する。従って、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば、上部、中央および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはバリアント、部分またはそのフラグメントの少なくとも１個を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。ある実施態様において、ＦｃドメインはＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）を欠く。ここでのＦｃドメインは、一般に免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインのすべてまたは一部を含む、ポリペプチドをいう。これは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン全体ならびに、例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含むこのようなペプチドのフラグメントを含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体を含むが、これらに限定されない、あらゆる種および／またはあらゆるサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは天然ＦｃおよびＦｃバリアント分子を含む。ここに示すとおり、天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインからアミノ酸配列が変化するように、あらゆるＦｃドメインが修され得ることは、当業者に理解される。ある実施態様において、Ｆｃドメインのエフェクター機能（例えば、ＦｃγＲ結合）は減少している。

【0698】

ここに記載するポリペプチドのＦｃドメインは、種々の免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。他の例では、Ｆｃドメインは一部ＩｇＧ１分子および一部ＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含み得る。他の例では、Ｆｃドメインは一部ＩｇＧ１分子および一部ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。

【0699】

ある実施態様において、延長ＰＫ基は、ＦｃドメインまたはそのフラグメントまたはＦｃドメインもしくはそのフラグメントのバリアント（本発明の目的でそのすべては用語「Ｆｃドメイン」に含まれる）を含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本発明における使用に適するＦｃドメインは、多数の異なる供給源から得られ得る。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。ある実施態様において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域由来である。しかしながら、Ｆｃドメインが、例えば、齧歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えばチンパンジー、マカク）種を含む、他の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることは、理解される。

【0700】

さらに、Ｆｃドメイン（またはそのフラグメントまたはバリアント）は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むあらゆる免疫グロブリンクラスおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むあらゆる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。

【0701】

多様なＦｃドメイン遺伝子配列（例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）が、公的に利用可能な受託機関の形で入手可能である。特定のエフェクター機能を欠くおよび／または免疫原性を減少させるための特定の修飾を有するＦｃドメイン配列を含む定常領域ドメインが選択され得る。抗体の多くの配列および抗体をコードする遺伝子は公開されており、適当なＦｃドメイン配列（例えばヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３配列またはそのフラグメントもしくはバリアント）は、これら配列から、当分野で認識されている技術を使用してもらされ得る。

【0702】

ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ２００５／０２８７１５３、ＵＳ２００７／０００３５４９、ＵＳ２００７／０１７８０８２、ＵＳ２００７／０２６９４２２、ＵＳ２０１０／０１１３３３９、ＷＯ２００９／０８３８０４およびＷＯ２００９／１３３２０８に記載されるもののような、血清アルブミン結合タンパク質である。ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ７,１７６,２７８およびＵＳ８,１５８,５７９に開示のトランスフェリンである。ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ２００７／０１７８０８２、ＵＳ２０１４／０２２００１７およびＵＳ２０１７／０１４５０６２に開示されるもののような、血清免疫グロブリン結合タンパク質である。ある実施態様において、延長ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＵＳ２０１２／００９４９０９に開示のもののような、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン（Ｆｎ）ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質の製造方法もＵＳ２０１２／００９４９０９に開示される。Ｆｎ３ベースの延長ＰＫ基の非限定的例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。

【0703】

ある態様において、本発明における使用に適する延長ＰＫ免疫刺激剤は、１以上のペプチドリンカーを用い得る。ここで使用する用語「ペプチドリンカー」は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２以上のドメイン（例えば、延長ＰＫ部分および免疫刺激剤部分）を接続するペプチドまたはポリペプチド配列をいう。例えば、ペプチドリンカーを、免疫刺激剤部分のＨＳＡドメインへの接続に使用し得る。

【0704】

延長ＰＫ基を例えば免疫刺激剤と融合するのに適するリンカーは当分野で周知である。例示的リンカーはグリシン－セリン－ポリペプチドリンカー、グリシン－プロリン－ポリペプチドリンカーおよびプロリン－アラニンポリペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーはグリシン－セリン－ポリペプチドリンカー、すなわち、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドである。

【0705】

上記異種ポリペプチドに加えてまたはその代わりに、ここに記載する免疫刺激剤ポリペプチドは、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含み得る。マーカーまたはレポーター遺伝子の例は、β－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β－ガラクトシダーゼおよびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）を含む。

【0706】

医薬組成物
ここに記載する薬剤は医薬組成物または医薬で投与でき、何らかの適当な医薬組成物の形態で投与され得る。

【0707】

ある実施態様において、ここに記載する医薬組成物は、対象におけるウイルス、例えば、コロナウイルスに対する免疫応答の誘導のための免疫原性組成物である。例えば、ある実施態様において、免疫原性組成物はワクチンである。

【0708】

本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡなどのここに記載する成分は、薬学的に許容される担体を含み得るおよび所望により１以上のアジュバント、安定化剤などを含み得る医薬組成物で投与され得る。ある実施態様において、医薬組成物は、治療的処置または予防的処置のため、例えば、ウイルス感染、例えば、コロナウイルス感染の処置または予防に使用するためである。

【0709】

用語「医薬組成物」は、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物と共に、治療上有効な薬剤を含む製剤に関する。該医薬組成物は、対象への該医薬組成物の投与により、疾患または障害の処置、予防または重症度低減に有用である。医薬組成物は当分野で医薬製剤としても知られる。

【0710】

本発明の医薬組成物は、１以上のアジュバントを含み得るまたは１以上のアジュバントと共に投与され得る。用語「アジュバント」は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えば、フロイントアジュバント）、鉱物化合物（例えばミョウバン）、細菌産物（例えば百日咳菌由来毒素）または免疫刺激複合体などの不均一な化合物群を含む。アジュバントの例は、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチド、増殖因子およびサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインを含むが、これらに限定されない。サイトカインはＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらに知られるアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバントまたはMontanide（登録商標）ISA51などの油である。本発明における使用に適する他のアジュバントは、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドを含む。

【0711】

本発明の医薬組成物は、一般に「薬学的有効量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。

【0712】

用語「薬学的に許容される」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性性をいう。

【0713】

用語「薬学的有効量」または「治療有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量をいう。特定の疾患の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患経過の阻止に関する。これは、疾患進行の減速および、特に、疾患進行妨害または逆転を含む。疾患の処置における所望の反応は、該疾患または該状態の発症遅延または発症予防でもあり得る。ここに記載する組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重大さ、年齢、生理学的状態、体格および体重を含む患者の各個のパラメータ、処置の期間、付随的治療のタイプ（存在するならば）、具体的投与経路および類似の因子による。従って、ここに記載する組成物を投与する用量は、種々のこのようなパラメータにより得る。初期用量で患者の応答が不十分である場合、高用量（または異なる、より局在化された投与経路により達成される、効果としての高用量）が使用され得る。

【0714】

本発明の医薬組成物は、塩、緩衝液、防腐剤および所望により他の治療剤を含み得る。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物を含む。

【0715】

本発明の医薬組成物で使用するのに適する防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールを含むが、これらに限定されない。

【0716】

ここで使用する用語「添加物」は、本発明の医薬組成物に存在し得るが、活性成分ではない物質をいう。添加物の例は、担体、結合剤、希釈剤、滑沢剤、濃厚剤、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、緩衝液、風味剤または着色剤を含むが、これらに限定されない。

【0717】

用語「希釈剤」は、希釈および／または菲薄化剤に関する。さらに、用語「希釈剤」は、流体、液体または固体懸濁液および／または混合媒体の何れか１以上を含む。適当な希釈剤の例は、エタノール、グリセロールおよび水を含む。

【0718】

用語「担体」は、医薬組成物の投与を促進、増強または可能にするために、活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分をいう。ここで使用する担体は、対象への投与に適する、適合性の固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質の１以上であり得る。適当な担体は、無菌水、リンゲル、乳酸リンゲル、無菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシ－プロピレンコポリマーを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は等張食塩水を含む。

【0719】

治療的使用のための薬学的に許容される担体、添加物または希釈剤は医薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. （A. R Gennaro edit. 1985）に記載される。

【0720】

医薬担体、添加物または希釈剤は、意図される投与経路および標準薬務に関して選択され得る。

【0721】

ある実施態様において、ここに記載する医薬組成物は静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。ある実施態様において、医薬組成物局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、消化管を介する吸収が関与する経腸投与または非経腸投与を含み得る。ここで使用する「非経腸投与」は、静脈内注射によるなどの、消化管を介する以外の何らかの方法での投与をいう。好ましい実施態様において、医薬組成物は筋肉内投与用に製剤化される。他の実施態様において、医薬組成物は全身投与、例えば、静脈内投与用に製剤化される。

【0722】

ここで使用する用語「共投与」は、異なる化合物または組成物（例えば、異なるワクチン抗原をコードするＲＮＡ）が同じ患者に投与される過程を意味する。異なる化合物または組成物は、同時、本質的に同時または逐次的に投与され得る。

【0723】

処置
本発明は、有効量のここに記載する組成物、例えば、ワクチン抗原または核酸、例えば、ここに記載するワクチン抗原をコードするＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、対象におけるウイルス、特にウイルスの異なる株に対する適応免疫応答を誘導するための方法および薬剤を提供する。

【0724】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象にコロナウイルス、コロナウイルス感染またはコロナウイルスに関連する疾患もしくは障害に対する免疫を提供する。本発明は、故に、コロナウイルスに関連する感染、疾患または障害を処置または予防するための方法および薬剤を提供する。

【0725】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、ウイルスに関連する感染、疾患または障害を有する対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、ウイルスに関連する感染、疾患または障害の対象を発症するリスクがある対象に投与される。例えば、ここに記載する方法および薬剤は、ウイルスに接触するリスクがある対象に投与され得る。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、ウイルスが流行している地理的領域に居住している、そこに旅行するまたは旅行することが予測される対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、ウイルスが流行している地理的領域に居住している、そこに旅行するまたは旅行することが予測される他人と接触しているまたは接触が予測される対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、仕事を介してまたはその他接触によりウイルスに曝されていることが知られている対象に投与される。ある実施態様において、ウイルスは、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

【0726】

ワクチンとして有用である組成物について、組成物は、細胞、組織または対象（例えば、ヒト）でウイルス抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。ある実施態様において、組成物は、細胞、組織または対象（例えば、ヒト）でウイルス抗原に対する免疫応答を誘導する。いくつかの例で、ワクチンは哺乳動物における防御免疫応答を誘導する。本発明の治療的化合物または組成物は、疾患または障害を有するまたは発症するリスクがある（または疑われる）対象に予防的（すなわち、疾患または障害を予防するため）または治療的（すなわち、疾患または障害を処置するため）に投与され得る。このような対象は、標準臨床的方法を使用して同定され得る。本開示の文脈において、予防投与は、疾患または障害が予防されるあるいは進行が遅延されるように、疾患の明白な臨床的症状が顕在化する前に行う。医学分野の状況において、用語「予防」は、疾患による死亡または罹病の負担を減少させるあらゆる活性を含む。予防は一次、二次および三次予防レベルで生じ得る。一次予防は疾患の発症の回避であるのに対して、二次および三次レベルの予防は、疾患進行および症状出現の予防ならびに機能回復および疾患関連合併症軽減による既に確立された疾患の負の影響の軽減を目的とする活性を含む。

【0727】

ある実施態様において、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの投与は単回投与で実施されまたは複数投与によりブーストされ得る。

【0728】

ある実施態様において、１回あたり、０.１μｇ～３００μｇ、０.５μｇ～２００μｇまたは１μｇ～１００μｇ、例えば約１μｇ、約３μｇ、約１０μｇ、約３０μｇ、約５０μｇまたは約１００μｇのここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。

【0729】

一部の実施態様において、ここに記載するレジメンは、少なくとも１回投与を含む。一部の実施態様において、レジメンは、最初の投与および少なくとも１回のその後の投与を含む。一部の実施態様において、最初の投与は、少なくとも１回のその後の投与と同じ量である。一部の実施態様において、最初の投与は、すべてのその後の投与と同じ量である。一部の実施態様において、最初の投与は、少なくとも１回のその後の投与と異なる量である。一部の実施態様において、最初の投与は、すべてのその後の投与と異なる量である。一部の実施態様において、レジメンは２回投与を含む。ある実施態様において、提供されるレジメンは２回投与からなる。

【0730】

ある実施態様において、本発明は、単回投与での投与を想起する。ある実施態様において、本発明は、プライミング用量、続く１以上のブースター用量での投与を想起する。ブースター投与または最初のブースター投与は、プライミング用量の投与７～２８日または１４～２４日後に投与され得る。

【0731】

ある実施態様において、１回あたり、６０μｇまたはそれ以下、５０μｇまたはそれ以下、４０μｇまたはそれ以下または３０μｇまたはそれ以下のここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。

【0732】

ある実施態様において、１回あたり、少なくとも０.２５μｇ、少なくとも０.５μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも２μｇ、少なくとも３μｇ、少なくとも４μｇ、少なくとも５μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも３０μｇまたは少なくとも４０μｇのここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。

【0733】

ある実施態様において、１回あたり、０.２５μｇ～６０μｇ、０.５μｇ～５５μｇ、１μｇ～５０μｇ、５μｇ～４０μｇまたは１０μｇ～３０μｇのここに記載するＲＮＡの量が投与され得る。

【0734】

異なるＲＮＡ分子が投与される（例えば、異なる多特異性ウイルスタンパク質アミノ酸配列をコードする）場合には、ここで与えられるＲＮＡの量または用量は、投与される異なるＲＮＡ分子の複合量に関する場合がある。異なるＲＮＡ分子は、同時にまたは本質的に同時に投与される場合がある。一部の実施態様において、対象に投与されるレジメンは、単一用量であり得るまたはそれを含み得る。ある実施態様において、対象に投与されるレジメンは複数回投与（例えば、少なくとも２回投与、少なくとも３回投与またはそれ以上）を含み得る。ある実施態様において、対象に投与されるレジメンは最初の投与および２回目の投与を含み得て、これらは少なくとも２週間離して、少なくとも３週間離して、少なくとも４週間離してまたはそれ以上離して与えられる。ある実施態様において、このような投与は少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月またはそれ以上離し得る。一部の実施態様において、投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日またはそれ以上離すなどの日数を離し得る。一部の実施態様において、投与は、約１～約３週間離して、または約１～約４週間離して、または約１～約５週間離して、または約１～約６週間離して、または約１～６週間以上離して行い得る。一部の実施態様において、投与は、約７～約６０日、例えば、約１４～約４８日などといった期間離し得る。一部の実施態様において、投与間の最小日数は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１またはそれ以上であり得る。一部の実施態様において、投与間の最大日数は、約６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１またはそれ以下であり得る。一部の実施態様において、投与は、約２１～約２８日離し得る。ある実施態様において、投与は約１９～約４２日離し得る。ある実施態様において、投与は約７～約２８日離し得る。ある実施態様において、投与は約１４～約２４日であり得る。ある実施態様において、投与は約２１～約４２日であり得る。

【0735】

一部の実施態様において、ワクチン接種レジメンは、最初の投与および２回目の投与を含む。一部の実施態様において、最初の投与および２回目の投与は、少なくとも２１日離して投与される。一部の実施態様において、最初の投与および２回目の投与は、少なくとも２８日離して投与される。

【0736】

ある実施態様において、最初の投与および２回目の投与（および／または他のその後の投与）は筋肉内注射により投与され得る。ある実施態様において、最初の投与および２回目の投与を三角筋に投与し得る。ある実施態様において、最初の投与および２回目の投与を同じ腕に投与し得る。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は、２１日離した一連の２回投与（例えば、各０.３ｍＬ）として投与される（例えば、筋肉内注射により）。ある実施態様において、各用量は約３０μｇである。ある実施態様において、各用量は３０μｇより高い、例えば、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇでよい。ある実施態様において、各用量は３０μｇより少ない、例えば、約２０μｇ、約１０μｇ、約５μｇなどであり得る。ある実施態様において、各用量は約３μｇまたはそれ以下、例えば、約１μｇである。あるこのような実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は１６歳以上（例えば、１６～８５歳を含む）の対象に投与される。あるこのような実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は１８～５５歳の対象に投与される。あるこのような実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は５６～８５歳の対象に投与される。ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ組成物は単回投与として投与される（例えば、筋肉内注射による）。

【0737】

ある実施態様において、１回あたり、約３０μｇのここに記載するＲＮＡの量が投与される。ある実施態様において、このような用量の少なくとも２回が投与される。例えば、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得る。

【0738】

ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡワクチンの有効性（例えば、２回投与、ここで、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得て、例えば、１回あたり約３０μｇの量で投与される）は、２回目の投与７日後開始（例えば、２回目を１回目の投与２１日後に投与したならば、１回目の投与２８日後開始）して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０または少なくとも９５％である。ある実施態様において、このような有効性は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳またはそれ以上の集団で観察される。ある実施態様において、少なくとも６５歳、例えば６５～８０歳、６５～７５歳または６５～７０歳の集団で２回目の投与７日後開始（例えば、２回目を１回目の投与２１日後に投与したならば、１回目の投与２８日後開始）するここに記載するＲＮＡワクチンの有効性（例えば、２回投与、ここで、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得て、例えば、１回あたり約３０μｇの量で投与される）は、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％または少なくとも９５％である。このような有効性は、最大１か月、２か月、３か月、６か月またはそれより長い期間にわたり観察され得る。

【0739】

一部の実施態様では、ここに記載する組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０または少なくとも９５％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載する組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも７０％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載する組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも８０％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載する組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも９０％であることにより特徴づけられる。ある実施態様において、ここに記載する組成物および／または方法は、２回目の投与７日後、予防効果が少なくとも９５％であることにより特徴づけられる。

【0740】

ある実施態様において、ワクチン有効性は、感染の証拠を有する対象数のパーセント減少として定義される（ワクチン接種した対象対ワクチン接種していない対象）。

【0741】

ある実施態様において、有効性を、ＣＯＶＩＤ－１９の潜在的症例についての調査を介して評価する。何らかの時点で、患者がここでの目的での急性呼吸器疾病を発症したならば、患者はＣＯＶＩＤ－１９疾病を有する可能性があると考えられ得る。評価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）試験を使用して試験し得る、鼻腔（中鼻甲介）スワブを含み得る。さらに、地域の標準治療試験からの臨床情報および結果が評価され得る。

【0742】

ある実施態様において、有効性評価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連症例の定義を利用でき、ここで：
・確認されたＣＯＶＩＤ－１９：症状がある期間中またはその前後４日以内の次の症状の少なくとも１つの存在およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＡＡＴ（核酸増幅ベースの試験）陽性：発熱；今までになかった咳嗽またはその増加；今までになかった息切れまたはその増加；悪寒；今までになかった筋肉痛またはその増加；今までになかった味覚または嗅覚喪失；咽喉炎；下痢；嘔吐。

【0743】

これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、有効性評価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連症例の定義を利用でき、ここで、ＣＤＣにより定義される次のさらなる症状の１以上が考慮され得る：疲労；頭痛；鼻閉または鼻汁；悪心。

【0744】

ある実施態様において、有効性評価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連重症症例の定義を利用できる
・確認された重症ＣＯＶＩＤ－１９：確認されたＣＯＶＩＤ－１９および次の少なくとも１つの存在：安静時の重症全身疾病の臨床徴候（例えば、ＲＲ≧３０呼吸／分、ＨＲ≧１２５心拍／分、室内気でsea levelでＳｐＯ_２≦９３％またはＰａＯ_２／ＦｉＯ_２＜３００ｍｍＨｇ）；呼吸不全（高流酸素、非侵襲性人工呼吸、機械的人工呼吸またはＥＣＭＯが必要として定義される）；ショックの証拠（例えば、ＳＢＰ＜９０ｍｍＨｇ、ＤＢＰ＜６０ｍｍＨｇまたは昇圧剤必要）；顕著な急性腎臓、肝臓または神経性機能不全；ＩＣＵ入院；死亡。

【0745】

これとは別にまたはこれに加えて、ある実施態様において、ＣＯＶＩＤ－１９の臨床症状がない患者には血清学的定義が使用され得る：例えば、確認されたＣＯＶＩＤ－１９がなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体陽転確認：例えば、先にＮ結合抗体結果陰性であった患者のＮ結合抗体結果陽性。

【0746】

ある実施態様において、次のアッセイの何れかまたはすべてが血清サンプルで実施され得る：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイ；Ｓ１結合ＩｇＧレベルアッセイ；ＲＢＤ結合ＩｇＧレベルアッセイ；Ｎ結合抗体アッセイ。

【0747】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は小児集団に投与される。種々の実施態様において、小児集団は、１８歳未満、例えば、５～１８歳未満、１２～１８歳未満、１６～１８歳未満、１２～１６歳未満または５～１２歳未満の対象を含むまたはそれからなる。種々の実施態様において、小児集団は、５歳未満、例えば、２～５歳未満、１２～２４か月齢未満、７～１２か月齢未満または６か月齢未満の対象を含むまたはそれからなる。

【0748】

ある実施態様において、小児集団は、１６～１８歳未満対象および／または１２～１６歳未満対象を含む１２～１８歳未満の対象を含むまたはそれからなる。この実施態様において、処置は２１日離れた２回ワクチン接種を含んでよく、ここで、ある実施態様において、ワクチンを、例えば、筋肉内投与により、１回あたり３０μｇ ＲＮＡ量で投与する。

【0749】

ある実施態様において、小児集団は、１２～１８歳未満対象および／または５～１２歳未満対象を含む５～１８歳未満の対象を含むまたはそれからなる。この実施態様において、処置は２１日離れた２回ワクチン接種を含んでよく、ここで、種々の実施態様において、ワクチンを、例えば、筋肉内投与により、１回あたり１０μｇ、２０μｇまたは３０μｇ ＲＮＡ量で投与する。

【0750】

ある実施態様において、小児集団は、２～５歳未満の対象、１２～２４か月齢未満の対象、７～１２か月齢未満の対象、６～１２か月齢未満の対象および／または６か月齢未満の対象を含む５歳未満の対象を含むまたはそれからなる。この実施態様において、処置は、例えば、２１～４２日離れた、例えば、２１日離れた２回ワクチン接種を含んでよく、ここで、種々の実施態様において、ワクチンを、例えば、筋肉内投与により、１回あたり１０μｇ、２０μｇまたは３０μｇ ＲＮＡ量で投与する。

【0751】

ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡで処置する集団は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳または少なくとも６５歳の対象を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡで処置する集団は、５５～９０歳、６０～８５歳または６５～８５歳の対象を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

【0752】

ある実施態様において、複数回の投与間の期間は少なくとも７日、少なくとも１４日または少なくとも２１日である。ある実施態様において、複数回の投与間の期間は７日～２８日、例えば１４日～２３日である。

【0753】

ある実施態様において、５回を超えない、４回を超えないまたは３回を超えないここに記載するＲＮＡが対象に投与され得る。

【0754】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象におけるコロナウイルス、コロナウイルス感染またはコロナウイルスに関連する疾患または障害に対する中和効果を提供する。

【0755】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるコロナウイルスを遮断または中和する免疫応答を誘導する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるコロナウイルスを遮断または中和するＩｇＧ抗体などの抗体の産生を誘導する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＡＣＥ２へのコロナウイルスＳタンパク質の結合を遮断または中和する免疫応答を誘導する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＡＣＥ２へのコロナウイルスＳタンパク質の結合を遮断または中和する抗体の産生を誘導する。

【0756】

ここで使用する用語「中和」は、抗体などの結合剤が受容体結合タンパク質などのウイルスの生物学的活性部位に結合し、それにより細胞のウイルス感染を阻害する、事象をいう。コロナウイルス、特にコロナウイルスＳタンパク質に関して、ここで使用する用語「中和」は、抗体などの結合剤がＳタンパク質のＲＢＤドメインに結合し、それにより細胞のウイルス感染を阻害する、事象をいう。特に、用語「中和」は、結合剤が目的のウイルスの病原性（例えば細胞に感染する能力）を排除するまたは顕著に減少させる事象をいう。

【0757】

抗原性暴露に応答して産生される免疫応答のタイプは、一般に応答に関与するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞のサブセットにより区別され得る。免疫応答は、広義にはＴｈ１およびＴｈ２の２タイプに分割され得る。Ｔｈ１免疫活性化はウイルスなどの細胞内感染のために最適化され、一方Ｔｈ２免疫応答は液性（抗体）応答のために最適化される。Ｔｈ１細胞は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を産生する。Ｔｈ２細胞はＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３を産生する。Ｔｈ１免疫活性化は、多くの臨床的状況で最も高度に望まれる。Ｔｈ２または液性免疫応答誘発に特化したワクチン組成物は、一般に大部分のウイルス疾患に有効ではない。

【0758】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ１介在免疫応答を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ１介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルを誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるインターロイキン２（ＩＬ－２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）および／またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるインターロイキン２（ＩＬ－２）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ２介在免疫応答を誘導または促進しないまたはＴｈ１介在免疫応答の誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＴｈ２介在免疫応答を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象におけるＴｈ２介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルを誘導または促進しないまたはＴｈ１介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルの誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＴｈ２介在免疫応答で典型的なサイトカインプロファイルを誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０および／またはＩＬ－１３の産生を誘導または促進しないまたは対象におけるインターロイキン２（ＩＬ－２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）および／またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０および／またはＩＬ－１３の産生を誘導または促進する。ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、ＩＬ－４の産生を誘導または促進しないまたは対象におけるインターロイキン２（ＩＬ－２）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の誘導または促進と比較して、顕著に低い程度で対象におけるＩＬ－４の産生を誘導または促進する。

【0759】

ある実施態様において、ここに記載する方法および薬剤は、対象への投与後、対象における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどの異なるＳタンパク質バリアントのパネルを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を誘導する。ある実施態様において、異なるＳタンパク質バリアントのパネルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５またはそれ以上のＳタンパク質バリアントを含む。一部の実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、ＲＢＤドメイン中にアミノ酸修飾を有するバリアントおよび／またはＲＢＤドメインの外側の、例えば、ＮＴＤドメイン中にアミノ酸修飾を有するバリアントを含む。このようなアミノ酸修飾をここに記載する。

【0760】

ある実施態様において、例えば、ここに記載する量およびレジメンで例えば、２１日離して、投与される、例えば、１回あたり３０μｇの２回投与で、投与され得る、ここに記載するＲＮＡを使用する、ここに記載するワクチン接種は、一定期間後、例えば、ウイルス感染に対する保護の減少が観察されたら、最初のワクチン接種に使用したのと同じまたは異なるワクチンを使用して繰り返し得る。このようなある期間は少なくとも６か月、１年、２年などであり得る。ある実施態様において、最初のワクチン接種に使用したとの同じＲＮＡが２回目またはさらなるワクチン接種で使用されるが、低用量または低投与頻度である。例えば、最初のワクチン接種は投与あたり約３０μｇの用量を使用するワクチン接種を含んでよく、ここで、ある実施態様において、このような用量の少なくとも２回が投与され（例えば、２回目は、１回目の投与約２１日後に投与され得る）、２回目またはさらなるワクチン接種は投与あたり約３０μｇより少ない用量を使用するワクチン接種を含んでよく、ここで、ある実施態様において、このような用量の一つのみが投与される。ある実施態様において、最初のワクチン接種で使用されたのと異なるＲＮＡが２回目またはさらなるワクチン接種で使用される。ある実施態様において、ＢＮＴ１６２ｂ２が第１のワクチン接種のために使用され、第２のまたはさらなるワクチン接種の時点で流行している株に存在する修飾を有するここに記載するようなワクチン抗原が、第２のまたはさらなるワクチン接種のために使用される。ある実施態様において、第１のワクチン接種の時点で流行している株に存在する修飾を有するワクチン抗原が、第１のワクチン接種のために使用され使用され、第２のまたはさらなるワクチン接種の時点で流行している株に存在する修飾を有するワクチン抗原が、第２のまたはさらなるワクチン接種のために使用される。

【0761】

ある実施態様において、ワクチン接種レジメンは、少なくとも２回のここに記載のＲＮＡ、例えば、２回のここに記載のＲＮＡ（ここで、２回目の投与は１回目の投与後約２１後に投与し得る）を使用する第１のワクチン接種および単回投与または複数回投与、例えば、２回のここに記載のＲＮＡを使用する第２のワクチン接種を含む。種々の実施態様において、第２のワクチン接種を、第１のワクチン接種、例えば、最初の２回投与レジメンの投与３～２４か月、６～１８か月、６～１２か月または５～７か月後に投与する。第２のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量は、第１のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量と異なっても等しくてもよい。ある実施態様において、第２のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量は第１のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量に等しい。ある実施態様において、第２のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量および第１のワクチン接種の各回に使用するＲＮＡの量は約３０μｇ／回である。ある実施態様において、第１のワクチン接種に使用したのと同じＲＮＡを第２のワクチン接種に使用する。

【0762】

ある実施態様において、第２のワクチン接種は、免疫応答のブースト（boost）をもたらす。

【0763】

ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡは他のワクチンと共投与される。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はインフルエンザワクチンと共投与される。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物および他の注射用ワクチンは別の時点で投与される。ある実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物は他の注射用ワクチンと同時に投与される。あるこのような実施態様において、ここに提供するＲＮＡ組成物および少なくとも１個の他の注射用ワクチンは異なる注射部位に投与される。

【0764】

用語「疾患」は、個体の体に影響する異常状態をいう。疾患は、しばしば特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染性疾患などもともと外部起源からの因子により引き起こされる得るかまたは自己免疫性疾患など内部機能不全により引き起こされ得る。ヒトにおいて、「疾患」は、しばしば罹患している個体の疼痛、機能不全、窮迫、社会問題もしくは死亡または該個体と接している者に類似の問題を引き起こすあらゆる状態を指すようにより広義に使用される。この広義では、傷害、能力障害、障害、症候群、感染症、単発症状、異常な挙動ならびに構造および機能の異型のバリエーションを含むこともあるが、他の状況および他の目的で、これらは識別可能なカテゴリーと考えられ得る。疾患は、通常、多くの疾患の罹患および疾患を有しながらの生活が、人生観および人格を変え得るため、個体に身体的だけでなく、感情的にも影響する。

【0765】

本発明において、用語「処置」、「処置する」または「治療的介入」は、疾患または障害などの状態と戦うことを目的とする、対象の管理およびケアに関する。本用語は、症状または合併症の軽減、疾患、障害または状態の進行遅延、症状および合併症の軽減または緩和および／または疾患、障害または状態の治癒または排除ならびに状態の予防のための治療上有効な化合物の投与など、対象が有しているある状態のための処置の全スペクトラムを含むことを意図し、ここで、予防は、疾患、状態または障害と戦うことを目的とする個体の管理およびケアとして理解され、症状または合併症の発症を予防するための活性化合物の投与を含む。

【0766】

用語「治療的処置」は、個体の健康状態を改善するおよび／または寿命を延長（増加）させる、あらゆる処置に関する。該処置は、個体の疾患の排除、個体における疾患進展の停止または減速、個体における疾患進展の阻止または減速、個体における症状の頻度または重症度の低減および／または疾患を現在有するまたは先に有していた個体における再発低減であり得る。

【0767】

用語「予防的処置」または「防止的処置」は、個体での疾患の発症を予防することを意図する、あらゆる処置に関する。用語「予防的処置」または「防止的処置」は、ここで、相互交換可能に使用される。

【0768】

用語「個体」および「対象」は、ここで、相互交換可能に使用される。これらは疾患または障害を有し得るまたは感受性があるが、該疾患または障害を有しても有していなくてもよいヒトまたは他の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）をいう。多くの実施態様において、個体はヒトである。特に断らない限り、用語「個体」および「対象」は特定の齢を意味せず、故に成人、高齢者、小児および新生児を含む。一部の実施態様において、ここに記載する対象は、より若い対象（例えば、２５歳、２０歳、１８歳、１５歳、１０歳未満またはそれ以下）である。代替的または追加的に、一部の実施態様において、ここに記載する対象は、高齢対象（例えば、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳を超える、またはそれ以上）である。

【0769】

本発明の実施態様において、「個体」または「対象」は「患者」である。

【0770】

用語「患者」は、処置を意図する個体または対象、特に罹患個体または対象を意味する。

【0771】

本開示のある実施態様において、コロナウイルスなどの、ウイルスタンパク質の少なくとも１つのフラグメントが由来するウイルスに対する免疫応答の提供およびウイルス感染、例えば、コロナウイルス感染の予防または処置が目標である。

【0772】

あるエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを含む医薬組成物を、対象における該エピトープを含む抗原に対する免疫応答を誘導するために対象に投与でき、これは治療的または部分的にもしくは完全に予防的であり得る。当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の一つは、疾患に対する免疫防御的反応が、処置する疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫化することにより生じるとの事実に基づくことを知っている。従って、ここに記載する医薬組成物は、免疫応答の誘導または増強のために適用可能である。ここに記載する医薬組成物は、故に、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。

【0773】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくとも一部分、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の少なくともＲＢＤ部分または全長もしくは本質的に全長のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされるＳタンパク質の修飾されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするここに記載するＲＮＡ構築物は、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として、もしくは免疫原性組成物（例えば、ワクチン）において使用するのに、および／またはここに記載する免疫学的効果（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体および／またはＴ細胞応答（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答）の生成）を達成するのに特に有用および／または有効であり得る。

【0774】

ここで使用する「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体的応答をいい、細胞性免疫応答および／または液性免疫応答をいう。免疫系は、脊椎動物のより原始的な自然免疫系および獲得または適応免疫系に分けられ、その各々液性および細胞性成分を含む。

【0775】

「細胞介在免疫」、「細胞性免疫」、「細胞性免疫応答」または類似の用語は、抗原の発現により特徴づけられる、特にクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣを伴う抗原の提示により特徴づけられる、細胞に向けられた細胞性応答を含むことを意味する。細胞性応答は、免疫エフェクター細胞、特に「ヘルパー」または「キラー」として作用するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞とも称する）は、免疫応答の制御に中心的役割を有し、キラー細胞（細胞毒性Ｔ細胞、細胞溶解Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、ウイルス感染細胞などの罹患細胞を殺し、さらなる罹患細胞の発生を予防する。

【0776】

免疫エフェクター細胞は、ワクチン抗原に応答するあらゆる細胞を含む。このような応答性は、活性化、分化、増殖、生存および／または１以上の免疫エフェクター機能の指標を含む。細胞は、特に、溶解能を有する細胞、特にリンパ系細胞を含み、好ましくはＴ細胞、特に、好ましくは細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される、細胞毒性リンパ球である。活性化により、これら細胞毒性リンパ球の各々は標的細胞の破壊を誘発する。例えば、細胞毒性Ｔ細胞は、次の手段の何れかまたは両方により標的細胞の破壊を誘発する。まず、活性化により、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイムおよびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に細孔を作り、グランザイムが細胞に入り、細胞質でカスパーゼカスケードを誘発し、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する。第二に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用により誘導され得る。

【0777】

本発明において用語「エフェクター機能」は、例えば、ウイルスなどの病原因子の中和および／またはウイルス感染細胞などの罹患細胞の死滅をもたらす、免疫系の成分が介在するあらゆる機能を含む。ある実施態様において、本発明のエフェクター機能は、Ｔ細胞介在エフェクター機能である。このような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）の場合、サイトカインの放出および／またはＣＤ８^＋リンパ球（ＣＴＬ）および／またはＢ細胞の活性化、ＣＴＬの場合、例えば、アポトーシスまたはパーフォリン介在細胞溶解による細胞、すなわち、抗原の発現により特徴づけられる細胞の排出、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生および抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。

【0778】

本発明において用語「免疫エフェクター細胞」または「免疫反応性細胞」は、免疫反応中エフェクター機能を発揮する細胞に関する。ある実施態様において、「免疫エフェクター細胞」は、細胞上にＭＨＣの状況で提示されるまたは細胞表面に発現され、免疫応答に介在する抗原などの抗原と結合できる。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞を含む。本発明において、好ましくは「免疫エフェクター細胞」はＴ細胞、好ましくはＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。本発明により、用語「免疫エフェクター細胞」は、適当な刺激で免疫細胞（例えばＴ細胞、特にＴヘルパー細胞または細胞溶解Ｔ細胞）に成熟できる細胞も含む。免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞および未成熟および成熟Ｂ細胞を含む。抗原に暴露されたときのＴ細胞前駆体の細胞溶解Ｔ細胞への分化は、免疫系のクローン選択に類似する。

【0779】

「リンパ系細胞」は、細胞性免疫応答などの免疫応答を産生できる細胞またはこのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくはＴリンパ球、リンパ芽球および形質細胞を含む。リンパ系細胞は、ここに記載する免疫エフェクター細胞であり得る。好ましいリンパ系細胞は、Ｔ細胞である。

【0780】

用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」はここでは相互交換可能に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）および細胞溶解Ｔ細胞を含む細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）を含む。用語「抗原特異的Ｔ細胞」または類似の用語は、該Ｔ細胞が標的とし、好ましくはＴ細胞のエフェクター機能が発揮される、抗原を認識するＴ細胞に関する。

【0781】

Ｔ細胞は、リンパ球として知られる白血球細胞群に属し、細胞介在免疫に中心的役割を有する。Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球タイプと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と称される細胞表面上の特殊な受容体の存在により区別され得る。胸腺は、Ｔ細胞の成熟を担う主要な臓器である。Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、各々別個の機能を有する。

【0782】

Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中で、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫過程における他の白血球細胞を助ける。これらの細胞は、表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４^＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原と共に提示されたとき、活性化される。活性化されたら、迅速に分裂し、活性免疫応答を制御または支援するサイトカインと称される小タンパク質を分泌する。

【0783】

細胞毒性Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。これらの細胞は、表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８^＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、体のほぼすべての細胞の表面に提示されるＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することにより標的を認識する。

【0784】

大部分のＴ細胞は、数タンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。Ｔ細胞のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、標的細胞表面に提示される、免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用できる。ＴＣＲの特異的結合は、Ｔ細胞内でシグナルカスケードを誘発し、増殖および成熟エフェクターＴ細胞への分化に至る。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－およびβ－ＴＣＲ鎖と称される２つの別々のペプチド鎖からなる。γδ Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、表面に別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小サブセットを表す。しかしながら、γδ Ｔ細胞において、ＴＣＲは１つのγ鎖および１つのδ鎖からなる。このＴ細胞群は、αβ Ｔ細胞ほど一般的ではない（総Ｔ細胞の２％）。

【0785】

「液性免疫」または「液性免疫応答」は、分泌型抗体、補体タンパク質およびある抗微生物ペプチドなどの細胞外流体でみられる巨大分子が介在する免疫の側面である。細胞介在免疫と対照的である。抗体を含むその側面は、しばしば抗体介在免疫と呼ばれる。

【0786】

液性免疫は、Ｔｈ２活性化およびサイトカイン産生、胚中心形成およびアイソタイプスイッチング、親和性成熟および記憶細胞産生を含む、抗体産生およびそれに付随するアクセサリー過程をいう。これは病原体中和、古典的補体活性化ならびに食作用および病原体排出のオプソニン促進を含む、抗体のエフェクター機能とも称される。

【0787】

液性免疫応答において、まず、Ｂ細胞が骨髄で成熟し、細胞表面で多数提示されるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が獲得される。これらの膜結合タンパク質複合体は、抗原検出に特異的な抗体である。各Ｂ細胞は、抗原と結合する特有の抗体を有する。成熟Ｂ細胞は骨髄からリンパ節または他のリンパ性臓器に遊走し、そこで、病原体と遭遇し始める。Ｂ細胞が抗原に遭遇したとき、抗原は受容体に結合し、エンドサイトーシスによりＢ細胞内部に取り込まれる。抗原はまたＭＨＣ－ＩＩタンパク質により処理され、Ｂ細胞の表面に提示される。Ｂ細胞はヘルパーＴ細胞（ＴＨ）が複合体と結合するのを待つ。この結合はＴＨ細胞を活性化し、次いで、サイトカインを放出し、Ｂ細胞の迅速な分裂を誘導し、Ｂ細胞の多数の同一クローンを産生する。これらの娘細胞は形質細胞または記憶細胞となる。記憶Ｂ細胞はここでは不活性のままである；後に、これら記憶Ｂ細胞が再感染により同じ抗原に遭遇したとき、分裂し、形質細胞を形成する。他方で、形質細胞は多数の抗体を産生し、これは、循環系に自由に放出される。これらの抗体は抗原と遭遇し、それらと結合する。これは、宿主と外来細胞の化学的相互作用を妨害するか、適切な機能を邪魔する抗原性部位間に架橋を形成でき、またはそれらの存在はそれらを攻撃および貪食するようにマクロファージまたはキラー細胞を誘引する。

【0788】

用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖を含む、免疫グロブリンを含む。各重鎖は重鎖可変領域（ここではＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。抗体は抗原と結合、好ましくは特異的に結合する。

【0789】

Ｂ細胞により発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と称されることがある。タンパク質のこのクラスに含まれる５メンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、消化器分泌物ならびに呼吸器および泌尿生殖器管の粘液分泌物などの身体分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、大部分の対象の一次免疫応答で産生される主免疫グロブリンである。凝集、補体固定および他の抗体応答に最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは、抗体機能が知られていないが、抗原受容体として役立ち得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの暴露により肥満細胞および好塩基球からメディエーターを放出させることにより、即時過敏症に介在する免疫グロブリンである。

【0790】

ここで使用する「抗体重鎖」は、天然に存在する高次構造の抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいう。

【0791】

ここで使用する「抗体軽鎖」は、天然に存在する高次構造の抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいい、κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。

【0792】

本発明は、保護的、防止的、予防的および／または治療的であり得る免疫応答を意図する。ここで使用する「免疫応答の誘導[または誘導する]」は、特定の抗原に対する免疫応答が誘導に存在しなかったことを示し、または誘導前特定の抗原に対する免疫応答が基底レベルで存在し、それが誘導後増強されたことを示し得る。それ故に、「免疫応答の誘導[または誘導する]」は、「免疫応答の増強[または増強する]」を含む。

【0793】

用語「免疫療法」は、免疫応答の誘導または増強による疾患または状態の処置に関する。用語「免疫療法」は、抗原免疫化または抗原ワクチン接種を含む。

【0794】

用語「免疫化」または「ワクチン接種」は、例えば、治療的または予防的理由のために、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する過程をいう。

【0795】

用語「マクロファージ」は、単球の分化により産生される貪食細胞のサブグループをいう。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物により活性化されるマクロファージは外来病原体を非特異的に貪食し、病原体を分解させる加水分解性および酸化的攻撃により、マクロファージ内で殺す。分解タンパク質からのペプチドがマクロファージ細胞表面で提示され、そこで、Ｔ細胞により認識され得て、Ｂ細胞表面上の抗体と直接相互作用でき、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらす。マクロファージは、抗原提示細胞のクラスに属する。ある実施態様において、マクロファージは脾マクロファージである。

【0796】

用語「樹状細胞」（ＤＣ）は、抗原提示細胞のクラスに属する貪食細胞の他のサブタイプをいう。ある実施態様において、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞はまず未成熟樹状細胞に形質転換される。これらの未成熟細胞は、高食作用性活性および低Ｔ細胞活性化能により特徴づけられる。未成熟樹状細胞は、常にウイルスおよび細菌などの病原体について周囲環境をサンプリングする。それらが提示可能抗原と遭遇したら、成熟樹状細胞に活性化され、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、タンパク質を小片に分解し、成熟したらこれらフラグメントをＭＨＣ分子を使用して細胞表面に提示させる。同時に、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として作用する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化させる能力が大きく増強される。それらはまた樹状細胞を血流を介する脾臓へのまたはリンパ系を介するリンパ節への移動を誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７も上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと並行して、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を、それらに抗原を提示することにより活性化させる。故に、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞関連免疫応答を能動的に誘導できる。ある実施態様において、樹状細胞は脾樹状細胞である。

【0797】

用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、細胞表面上（または表面で）少なくとも１個の抗原または抗原性フラグメントを表示、獲得および／または提示できる多様な細胞の細胞をいう。抗原提示細胞は専門抗原提示細胞と非専門抗原提示細胞に分けられ得る。

【0798】

用語「専門抗原提示細胞」は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上でＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用するならば、抗原提示細胞はＴ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。専門抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。

【0799】

用語「非専門抗原提示細胞」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロン－ガンマなどのあるサイトカインにより刺激されたときに発現する抗原提示細胞に関する。例示的、非専門抗原提示細胞は、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞を含む。

【0800】

「抗原処理」は、抗原の、該抗原のフラグメントである進行産物への分解（例えば、タンパク質のペプチドへの分解）および特異的Ｔ細胞への抗原提示細胞などの細胞による提示のためのＭＨＣ分子とこれらのフラグメントの１以上の（例えば、結合による）会合をいう。

【0801】

用語「抗原が関与する疾患」は、抗原が関与するあらゆる疾患、例えば抗原の存在により特徴づけられる疾患をいう。抗原が関与する疾患は感染性疾患であり得る。上記のとおり、抗原はウイルス抗原などの疾患関連抗原であり得る。ある実施態様において、抗原が関与する疾患は、好ましくは、細胞表面に抗原を発現する細胞が関与する疾患である。

【0802】

用語「感染性疾患」は、個体間または生物間で伝染し得て、微生物病原体により引き起こされるあらゆる疾患（例えば感冒）をいう。感染症は当分野で知られ、例えば、それぞれウイルス、細菌および寄生虫が原因であるウイルス性疾患、細菌性疾患または寄生虫性疾患を含む。これに関連して、感染性疾患は、例えば、肝炎、性行為感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザおよびインフルエンザであり得る。

【0803】

本開示のある実施態様において、ウイルスは、ＲＮＡウイルス、特に、感染性疾患を引き起こすＲＮＡウイルスである。

【0804】

ここに記載する文献および試験の引用は、前記の何れかが関連する先行技術であることを認めることを意図するものではない。これらの文献の内容としてのすべての記載は、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これら文献の内容の正確性について承認するものではない。

【0805】

次の記載は、当業者が種々の実施態様を製造および使用することを可能とするために示す。特定のデバイス、技術および適用の記載は単なる例として提供される。ここに記載する例への種々の修飾が当業者には容易に認識され、ここに定義される一般的原理を、種々の実施態様の精神および範囲から逸脱することなく他の例および適用に適用し得る。故に、種々の実施態様は、ここに記載し、示す例に限定されることを意図せず、むしろ、特許請求の範囲を構成する範囲に従う。

【実施例】

【0806】

［実施例１］

【0807】

二価ワクチン設計
ウイルスの感染性を増加させ得る、またはプロトタイプ武漢株に対して有効である現在のワクチンの有効性を減少させ得る、複数の確立された、進化している懸念されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株に対して広く中和する体液性免疫を生成するために、新規二価ワクチンアプローチを確立した。Ｂ.１.１.７バリアントは、世界中で優勢なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントになりつつあるので、二価ワクチン設計の基礎によって、急速に広がる系統Ｂ.１.１.７[別名、懸念されるバリアント２０２０１２／０１（ＶＯＣ－２０２０１２／０１）または２０Ｂ／５０１Ｙ.Ｖ１]のスパイク（Ｓ）糖タンパク質配列を形成する。Ｂ.１.１.７バリアントは、Ｓ糖タンパク質中にいくつかの変異を含有し（表４）、本質的により感染性であり、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統よりも４０～７０％高いと推定されている増殖速度を有すると示されている（Volz et al., Nature, 2021; Washington et al., Cell, 2021）。循環する懸念されるバリアントまたは目的のバリアント、すなわち、系統Ｂ.１.３５１（別名、２０Ｈ／５０１Ｙ.Ｖ２）、Ｐ.１、Ｂ.１.４２７／Ｂ.１.４２９（別名、ＣＡＬ.２０Ｃ）、Ｂ.１.５２６（表４）において見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）および／またはＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）へのスパイク変異ならびに中和モノクローナル抗体（ｎＡｂ）またはヒトＣＯＶＩＤ－１９回復期血清のいずれかに対する免疫回避を付与するとわかっている高い有病率を有する他の変異を導入し、２つのＢ.１.１.７ Ｓ配列の中で分配した（表５、図６）。一方、Ｂ.１.３５１系統において見出される重要な変異クラスターＫ４１７Ｎ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙは、保存して維持した。他方、単一点変異は、アミノ酸交換が適度な距離を離れており、おそらくは、別々の高次構造エピトープをもたらす方法で導入した。例えば、クラス１ ＲＢＤ標的化ｎＡｂの結合エピトープ中に位置するＳ４７７Ｎ変異は、クラス２またはクラス３ ＲＢＤ標的化ｎＡｂのいずれかの結合エピトープ中に位置するＬ４５２ＲおよびＮ４３９Ｋ変異と組み合わせた（Barnes et al., Nature, 2020）。ＮＴＤについては、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６ＩおよびＤ２５３Ｇなど、表面に露出したアミノ酸残基を標的化するさらなる変異のみが企図された。やはり、これらの変異は、アミノ酸交換が合理的距離離れており、おそらくは、別々の高次構造エピトープをもたらす方法で導入した。

【0808】

【表9】

【0809】

【表10】

［実施例２］

【0810】

インビトロ試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、市販のトランスフェクション試薬を使用して０.１５μｇ／ｍＬのｍｏｄＲＮＡで、またはワクチン候補ＢＮＴ１６２ｂ２、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）およびＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）をコードする０.１５μｇ／ｍＬのＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡで、トリプリケートでトランスフェクトした。構築物の配列仕様については、表６を参照されたい。トランスフェクション後、細胞を、ワクチン候補によってコードされるＳタンパク質を発現するように１８時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、マウス－Ｆｃタグに融合されたヒト組換えＡＣＥ－２（hACE2-mFc）および二次蛍光タグ付抗マウス抗体を用いて探索して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞表面上で異所性に発現されたワクチン候補へのＡＣＥ－２結合を検出した。ワクチンによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントＳタンパク質構築物にわたる同等のＡＣＥ－２親和性を仮定すると、ＦＡＣＳにおいて測定された中央値蛍光強度（ＭＦＩ）は、バリアントＳタンパク質表面発現の代わりとなる。

【0811】

【表11】

【0812】

簡潔には、０.４×１０^６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートにトランスフェクションの６時間前に播種した。ワクチン候補をコードするｍｏｄＲＮＡを、トランスフェクションの前にLipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）（ThermoFisher Scientific）を製造業者の使用説明書に従って使用して製剤化した、または０.１５μｇ／ｍＬのｍｏｄＲＮＡの濃度でワクチン候補をコードするＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡを使用して、細胞にトリプリケートでトランスフェクトした。細胞を３７℃および５％ ＣＯ_２で１８時間インキュベートし、その後染色した。その後、細胞を回収し、生死判定色素（eBioscience（商標）Fixable Viavility Dye eFluor（商標）450、ThermoFisher Scientific）およびhACE2-mFc（SinoBiological）と共にインキュベートし、その後、Alexa Fluor（登録商標）647 AffiniPureロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Jackson ImmunoResearch)を用いて染色し、その後、固定した（Fixation Buffer、BioLegend)。細胞をBD FACSCelesta 2（BD）を使用して取得し、データをFlowJo V10.8（BD）で分析した。

【0813】

検出試薬としてhACE2-mFcを使用して決定されたように（図７）、すべてのワクチン候補によってコードされたＳタンパク質が、細胞表面上で発現され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ－２）の宿主細胞侵入受容体へ結合できた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質発現細胞のパーセンテージおよびトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ総集団のＭＦＩで見られるように、ＬＮＰ製剤化ｍｏｄＲＮＡ（図７Ｃ、Ｄ）を用いて得られたものと比較して、Lipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）製剤化ｍｏｄＲＮＡについて（図７Ａ、Ｂ）発現レベルは低かった。しかし、同一方法でトランスフェクトされたワクチン候補は、ほぼ同等のＳタンパク質表面発現レベルを示す[それぞれ、ＢＮＴ１６２ｂ２、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）（図７Ａ、Ｂ）およびＢＮＴ１６２ｂ２、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）（図７Ｃ、Ｄ）]。
［実施例３］

【0814】

Ｂ.１.１.７（アルファ）骨格に基づいて複数のバリアント変異を使用するマウスにおける免疫原性研究
３群の５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１μｇ／動物のＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）を用いて、または生理食塩水単独を用いて０日目に１回注射した。ワクチン配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ バリアントＢ.１.３５１（ベータ、ここではＳＡと略される）由来の重要な変異を付加した、Ｂ.１.１.７（アルファ）株に基づいており、詳細は表７に示されている。筋肉内（ｉ.ｍ.）注射は、２０μＬの投与量で投与した。７日目、１４日目、２１日目および２８日目にすべての個々のマウスから血液を収集して、血清サンプルを生成した。免疫化の前の事前出血（Ｐｒｅ）のために、５匹を無作為に選んだマウスを出血させた。

【0815】

【表12】

【0816】

Ｂ.１.１.７またはＢ.１.３５１バリアントに由来する変異を含むいずれかのタンパク質を使用してすべての時点について酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施した。研究最後日の２８日目に、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベースのシュードウイルス中和試験を使用して収集された血清サンプルを中和抗体応答について試験した。

【0817】

ＥＬＩＳＡのために、Ｂ.１.１.７またはＢ.１.３５１ウイルス株（Sino Biological; cat: 40591-V08H12 [S1(B.1.1.7)]; Sino Biological; cat: 40592-V08H86 [RBD(B.1.351)]）のいずれかに由来する２つの組換えタンパク質を使用して、血清サンプルを９６ウェルプレートにおいて試験して、ＳまたはＲＢＤタンパク質特異的抗体濃度を評価した。簡潔には、MaxiSorpプレート（Thermo Fisher）の各ウェルを、１００ｎｇの組換えタンパク質またはアイソタイプ対照を用いてコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ＋０.０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し（洗浄工程）、ブロッキング緩衝液を用い、３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄工程後、サンプルまたは抗体対照を添加し、プレートを３７℃で１時間再度インキュベートした。ウェルに二次抗体を添加する前に、さらなる洗浄工程を実施した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている二次抗体を３７℃で４５分間インキュベートした。最終洗浄工程後、TMB ONE（Biotrend Chemikalien GmbH）基質をウェルに添加し、室温（ＲＴ）で８分間インキュベートした。ＨＲＰがコンジュゲートされた抗体がウェル中に存在する場合には、透明から青色への色の交換が観察され、２５％硫酸を添加することによって反応を停止した（青色から黄色）。Ｅｐｏｃｈマイクロプレートリーダー（４５０ｎｍ、参照６２０ｎｍ;BioTek）を使用してプレートの吸光度を測定した。

【0818】

すべての試験された構築物は、すべての異なる時点でＳ１（Ｂ.１.１.７）（図８）およびＲＢＤ（Ｂ.１.３５１）に対して特異的なＩｇＧ抗体を誘導し（図９）、力価は免疫化２１日後でピークに達した。結果は、原則として１つのＳタンパク質配列（ここでは：アルファ骨格）中に複数のバリアント変異が含まれていることが、ワクチン接種のための適した抗原であることを実証する。ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）は、評価されるＳ１（Ｂ.１.１.７）組換えタンパク質に最も近い抗原をコードする構築物であり、骨格ワクチン構築物として使用されたので、ハイブリッド構築物ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）での免疫化がＳ１（Ｂ.１.１.７）に対する抗体力価の低下をもたらすかを理解するために非常に適切であった。抗Ｓ１（Ｂ.１.１.７）ＩｇＧ抗体について試験する時点あたり単一のデータ点に注目すると（図８）、両ワクチン候補が、緩衝液対照と比較して上昇した力価を誘導し、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）を用いた場合、Ｂ.１.１.７由来Ｓ１タンパク質に対してより弱い応答を誘導した。ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）での免疫化と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）は、同様（７日目で）またはより低いＢ.１.１.７ Ｓ１特異的ＩｇＧ力価を誘導した。免疫化群間の有意差（表８）に焦点を合わせると、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）によって誘発されたＩｇＧ力価は、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）と比較して、研究１４日目および２８日目に有意に低かった。結果は、複数の非アルファ変異が含まれたとしても、ハイブリッドワクチン構築物は、依然として良好なワクチン候補であり、Ｂ.１.１.７（アルファ）骨格ウイルスタンパク質に対する結合抗体力価を誘発することを示す。

【0819】

【表13】

【0820】

抗ＲＢＤ（Ｂ.１.３５１）ＩｇＧ抗体について試験する時点あたり単一のデータ点に注目すると（図９）、すべてのワクチン候補が、緩衝液対照と比較してかなり上昇した力価を誘導した。ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）ワクチン候補はこのアッセイにおいて組換えＢ.１.３５１バリアントＲＢＤに最も近く、抗原に対して最高の応答を誘導し（２８日目を除く）、結果は、複数の変異を含めることによって対応するバリアントに対する免疫応答が駆動されることを実証する。ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）での免疫化と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）は、同様またはより高いＩｇＧ力価のいずれかを誘導した。免疫化群間の有意差（表９）に焦点を合わせると、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）によって誘発された力価は、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）と比較して、研究７日目および２１日目に有意に高く、Ｂ.１.１.７（アルファ）骨格にバリアント特異的変異を含めた場合に明確な有益な影響を示した。結果は、ハイブリッドワクチン構築物が良好なワクチン候補であることおよびさらなるウイルス株に向けられた実行されたバリアント特異的変異（ここでは、Ｂ.１.３５１特異的変異）が免疫学的な利益につながることを示す。

【0821】

【表14】

【0822】

免疫化後に誘導された抗体の中和機能を分析して、免疫化２８日後に収集された血液サンプルからのすべての血清を、ＶＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベースのシュードウイルス中和試験（ｐＶＮＴ）を使用して試験した。ｐＶＮＴアッセイのために、９６ウェルＶ底プレート中でマウス血清サンプルをデュプリケートで段階希釈し、規定数のＶＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス粒子とともにインキュベートし、シュードタイピングのために使用されるＳタンパク質配列は、先祖のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株（武漢）、Ｂ.１.１.７（アルファ）バリアント（変異：Δ６９／７０、Δ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ）およびＢ.１.３５１（ベータ）バリアント（変異：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ）に由来した。インキュベーション後、抗体がシュードウイルスに結合することを可能にするために、９６ウェル平底プレートに事前に播種されたＶｅｒｏ－７６細胞にシュードウイルス／血清希釈ミックスを添加した。プレートを３７℃および５％ ＣＯ_２で１６～２４時間インキュベートした。マウス血清の不在下でシュードウイルスと共にインキュベートされたＶｅｒｏ－７６細胞を陽性対照として使用した。シュードウイルスを伴わずにインキュベートされたＶｅｒｏ－７６細胞を陰性対照として使用した。インキュベーション後、上清を除去し、細胞をルシフェラーゼ試薬（Promega）を用いて溶解した。発光をCLARIOstar（登録商標）Plusマイクロプレートリーダー（BMG Labtech）で記録し、中和力価を、依然として発光の５０％低減をもたらす最高血清希釈の逆数として算出した。中和が観察されなかった場合には、検出限界（ＬＯＤ）の半分の任意の力価を報告した。

【0823】

ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）およびＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）で免疫化されたすべてのマウスが、武漢シュードウイルスに対する検出可能な中和抗体力価を示した。しかし、群幾何平均５０％シュードウイルス中和抗体（ｐＶＮ_５０）力価はかなり低く、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）免疫血清の４８からＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）免疫血清の２４の範囲であった（図１０Ａ）。武漢力価と比較して、アルファシュードウイルスに対してかなり高いｐＶＮ_５０力価が、特にＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）で免疫化した動物から採取した血清サンプルにおいて（図１０Ｂ；１８２の幾何平均力価）観察され、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）についてより小さい程度に（４３の幾何平均力価）観察された。武漢シュードウイルス力価と比較してより高いアルファは、試験した両ワクチン候補が、アルファ骨格由来のスパイクタンパク質を抗原としてコードするという事実と一致する。ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）と比較してＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）によって誘発されたより低いアルファシュードウイルス中和力価は、ハイブリッドワクチンがＲＢＤ中にさらなる「非アルファ」変異を有するという事実による可能性があり[表７；ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）のＫ４１７ＮおよびＥ４８４Ｋを参照されたい]、これらはＢ.１.１.７／アルファシュードウイルスに対してあまり有効ではない中和抗体応答を引き起こす可能性が高い。最も重要なことに、他方で、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ＋ＳＡ）ワクチンは、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）ワクチンと比較した場合にベータシュードウイルスに対してかなり高いｐＶＮ_５０力価を誘導し（図１０Ｃ；１８に対して９６の群幾何平均）、これは、実行されたベータバリアント特異的変異がよりベータ特異的な抗体応答をもたらしたことを示す。

【0824】

まとめると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐ２ Ｓワクチン構築物骨格中に複数のバリアント変異を使用することで、骨格において使用されたアミノ酸変化に対応してウイルス抗原に向けられる免疫応答がわずかに変更される。
［実施例４］

【0825】

Ｂ.１.１.７（アルファ）バックグラウンドに基づく最小バリアント変異を含むマウスにおける免疫原性研究
３群の５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１μｇ／動物のＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）を用いて、または生理食塩水単独を用いて０日目に１回注射した。構築物の配列仕様については、表１０を参照されたい。筋肉内（ｉ.ｍ.）注射は、２０μＬの投与量で投与した。２８日目にすべての個々のマウスから血液を収集して、血清サンプルを生成した。

【0826】

【表15】

【0827】

それぞれの免疫化によって誘発されたウイルス中和抗体応答を理解するために、ＶＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベースのシュードウイルス中和試験（ｐＶＮＴ）を使用して血清サンプルを試験した。ｐＶＮＴアッセイのために、９６ウェルＶ底プレート中でマウス血清サンプルをデュプリケートで段階希釈し、規定数のＶＳＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス粒子とともにインキュベートし、シュードタイピングのために使用されるＳタンパク質配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ.１.１.７（アルファ）バリアント（変異：Δ６９／７０、Δ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ）、Ｂ.１.６１７.１（カッパ）バリアント（変異：Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ）またはＢ.１.６１７.２（デルタ）バリアント（変異：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６Ｇ、Δ１５７／１５８、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ）に由来した。インキュベーション後、抗体がシュードウイルスに結合することを可能にするために、９６ウェル平底プレートに事前に播種されたＶｅｒｏ－７６細胞にシュードウイルス／血清希釈ミックスを添加した。プレートを３７℃および５％ ＣＯ_２で１６～２４時間インキュベートした。マウス血清の不在下でシュードウイルスと共にインキュベートされたＶｅｒｏ－７６細胞を陽性対照として使用した。シュードウイルスを伴わずにインキュベートされたＶｅｒｏ－７６細胞を陰性対照として使用した。インキュベーション後、上清を除去し、細胞をルシフェラーゼ試薬（Promega）を用いて溶解した。発光をCLARIOstar（登録商標）Plusマイクロプレートリーダー（BMG Labtech）で記録し、中和力価を、依然として発光の５０％低減をもたらす最高血清希釈の逆数として算出した。中和が観察されなかった場合には、検出限界（ＬＯＤ）の半分の任意の力価を報告した。

【0828】

ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）またはＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）でのマウスの免疫化によって、アルファシュードウイルスに対するほぼ同等の中和抗体力価が誘導された（それぞれ、２９１および２２１の幾何平均ｐＶＮ５０力価）。しかし、注目すべきことに、アルファスパイク抗原骨格をコードし、追加のカッパおよびデルタバリアント変異Ｌ４５２ＲおよびＥ４８４Ｑを有するＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）ワクチン候補は、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）ワクチンと比較した場合にカッパシュードウイルス（１１０に対して１９２の幾何平均力価）およびデルタシュードウイルス（８４に対して１２７の幾何平均力価）に対してより高い中和活性を誘導する傾向を示した（図１１）。

【0829】

さらに、２種の候補を用いてワクチン接種後に生成された抗体の結合能を、マルチプレックス分析を実施して分析した。簡潔には、マルチプレックスアッセイを、サンドイッチイムノアッセイ技術（Meso Scale Diagnostics、LLC）を利用するＣＯＶＩＤ－１９血清学マウスキットの提供者の一般プロトコールに従って実施した。結合マウス抗体は、「スルホ－タグ」がコンジュゲートしている二次抗体を用いて検出できた。スルホ－タグから発光された光を測定する最終工程においてマルチプレックスリーダー機器MESO QuickPlex SQ 120（Meso Scale Diagnostics、LLC）を使用する。分析のために、マルチプレックスアッセイには、表１１に列挙されるような組換えタンパク質が含まれた。

【0830】

【表16】

【0831】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（Ｂ.１.１.７）は、相同体検査システムを反映しており、これは、ワクチン候補骨格ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）が読み取りのために使用された使用された組換えタンパク質標的と同一であることを意味するが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（ＢＡ.１）組換えタンパク質を用いて試験することは、異種試験システムを表す。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（ＢＡ.１＋Ｌ４５２Ｒ）組換えタンパク質は、異種試験システムを表すが、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）ワクチン候補ともう１つの同一アミノ酸を共有する。

【0832】

電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを分析し、ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ）またはＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）のいずれかで免疫化したすべての動物は、緩衝液対照動物と比較して有意に高い強力な抗体結合力価を発生させた（図１２、表１２；一元ＡＮＯＶＡを使用する群平均比較；テューキーの多重比較検定）。ＢＮＴ１６２ｂ２（アルファ；Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ）での免疫化は、すべての試験された抗原に対するより高い力価につながったが、Ｌ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ変異を含めることによって、抗体結合に関連する１つの同一の変異を共有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（ＢＡ.１＋Ｌ４５２Ｒ）抗原への有意により高い抗体結合が誘導された。注目すべきことに、全体として、ＢＡ.１ Ｓタンパク質バリアントに対する抗体の結合は、骨格ワクチン抗原として機能するＢ.１.１.７ Ｓタンパク質と比較して大幅に減少した。

【0833】

【表17】

【0834】

まとめると、結果は、ウイルスサブタイプにおいて生じた変異を骨格構築物中に含めることが、対応するウイルス骨格と同等の免疫原性ワクチン構築物をもたらすことを実証した。含まれるアミノ酸に向けられた変異を含む抗原を試験することによって、抗体結合においてわずかな利点が示され、この指向性抗原設計アプローチの実現可能性が主張された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2024517642000001.app

【国際調査報告】