特表 2024-517655 ヒトのミトコンドリアゲノムを標的とする操作されたメガヌクレアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ヒトのミトコンドリアゲノムを標的とする操作されたメガヌクレアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 47/66 20170101ALI20240416BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240416BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240416BHJP

   C12N 5/079 20100101ALN20240416BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20240416BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20240416BHJP

   C12N 5/04 20060101ALN20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/16 Z ZNA

C12N15/861 Z

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N5/10

C12N15/88 Z

A61K38/46

A61K47/66

A61K35/76

A61P27/02

A61P25/00

A61P25/08

A61P3/10

A61P27/16

A61P25/02

A61K31/7088

C07K19/00

C12N5/079

C12N5/077

C12N5/078

C12N5/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023564420

(86)(22)【出願日】2022-04-22

(85)【翻訳文提出日】2023-12-19

(86)【国際出願番号】 US2022025945

(87)【国際公開番号】W WO2022226303

(87)【国際公開日】2022-10-27

(31)【優先権主張番号】63/178,269

(32)【優先日】2021-04-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508117721

【氏名又は名称】プレシジョン バイオサイエンシズ，インク．

(71)【出願人】

【識別番号】522247703

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ マイアミ

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】モラエス，カルロス ティー．

(72)【発明者】

【氏名】スミス，ジェームス ジェファーソン

(72)【発明者】

【氏名】ジャンツ，デレック

(72)【発明者】

【氏名】トンバーリン，ジンジャー エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】モリス，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】シュープ，ウェンディ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA44

4C076AA31

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC10

4C076CC21

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C076FF68

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA59

4C084DC22

4C084MA41

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA061

4C084ZA062

4C084ZA211

4C084ZA212

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA341

4C084ZA342

4C084ZC351

4C084ZC352

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA41

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA06

4C086ZA21

4C086ZA33

4C086ZA34

4C086ZC35

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA41

4C087NA13

4C087ZA01

4C087ZA06

4C087ZA21

4C087ZA33

4C087ZA34

4C087ZC35

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書では、ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）に存在する認識配列を認識および切断するように操作された組換えメガヌクレアーゼが開示される。本開示はさらに、遺伝子改変真核細胞を作製するための方法におけるミトコンドリア移行ペプチドと組み合わせたそのような組換えメガヌクレアーゼの使用、およびｍｔＤＮＡが改変または編集されている遺伝子改変真核細胞の集団に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

真核細胞のミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合して切断するミトコンドリアを標的とした操作されたメガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）であって、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）に結合した操作されたメガヌクレアーゼを含む、ＭＴＥＭ。

【請求項2】

前記操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、該第１のサブユニットが前記認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、該第２のサブユニットが前記認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、該第１のサブユニットおよび該第２のサブユニットがそれぞれ、配列番号１に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＭＴＥＭ。

【請求項3】

前記第１のサブユニットおよび前記第２のサブユニットがそれぞれ、配列番号１の残基７～１５３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項4】

前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号２に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項5】

前記認識配列が配列番号３を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項6】

前記ＨＶＲ１領域が、配列番号４の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項7】

前記ＨＶＲ１領域が、配列番号４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項8】

前記ＨＶＲ１領域が配列番号４の残基２１５～２７０を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項9】

前記第１のサブユニットが、配列番号４の残基１９８～３４４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項10】

前記第１のサブユニットが、配列番号４の残基２７１に対応する残基を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項11】

前記第１のサブユニットが配列番号４の残基１９８～３４４を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項12】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号４の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項13】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項14】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号４の残基３６に対応する残基を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項15】

前記ＨＶＲ２領域が配列番号４の残基２４～７９を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項16】

前記第２のサブユニットが、配列番号４の残基７～１５３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項17】

前記第２のサブユニットが配列番号４の残基７～１５３を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項18】

前記操作されたメガヌクレアーゼが、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、該リンカーが前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項19】

前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項20】

前記操作されたメガヌクレアーゼが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項21】

前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１から２０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項22】

前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号５の核酸配列によってコードされる、請求項１から２１のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項23】

前記ＭＴＰが、配列番号６～８のいずれか１つに示される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項24】

前記ＭＴＰが、配列番号６～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項25】

前記ＭＴＰが前記操作されたメガヌクレアーゼのＣ末端に結合している、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項26】

前記ＭＴＰが前記操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端に結合している、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項27】

前記ＭＴＰが前記操作されたメガヌクレアーゼに融合している、請求項１から２６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項28】

前記ＭＴＰがポリペプチドリンカーによって前記操作されたメガヌクレアーゼに結合している、請求項１から２６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項29】

前記操作されたメガヌクレアーゼが、第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰに結合している、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項30】

前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが、配列番号６～８のいずれか１つに示される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のＭＴＥＭ。

【請求項31】

前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが、配列番号６～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９または請求項３０に記載のＭＴＥＭ。

【請求項32】

前記第１のＭＴＰおよび前記第２のＭＴＰが同一である、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項33】

前記第１のＭＴＰおよび前記第２のＭＴＰが同一ではない、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項34】

前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが前記操作されたメガヌクレアーゼに融合している、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項35】

前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが、ポリペプチドリンカーによって前記操作されたメガヌクレアーゼに結合している、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項36】

前記ＭＴＥＭが核外移行配列（ＮＥＳ）に結合している、請求項１から３５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項37】

前記ＮＥＳが、配列番号９または１０に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項38】

前記ＮＥＳが、配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項39】

前記ＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＮ末端に結合している、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項40】

前記ＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＣ末端に結合している、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項41】

前記ＮＥＳが前記ＭＴＥＭに融合している、請求項１から４０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項42】

前記ＮＥＳがポリペプチドリンカーによって前記ＭＴＥＭに結合している、請求項１から４０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項43】

前記ＭＴＥＭが、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳを含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項44】

前記第１のＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＮ末端に結合し、前記第２のＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＣ末端に結合している、請求項４３に記載のＭＴＥＭ。

【請求項45】

前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳが、配列番号９または１０に示される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４３または請求項４４に記載のＭＴＥＭ。

【請求項46】

前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳが、配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項47】

前記第１のＮＥＳおよび前記第２のＮＥＳが同一である、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項48】

前記第１のＮＥＳおよび前記第２のＮＥＳが同一ではない、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項49】

前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳが前記ＭＴＥＭに融合している、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項50】

前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳが前記ＭＴＥＭに結合している、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。

【請求項51】

請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項52】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項53】

請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物。

【請求項54】

前記ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする、請求項５３に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項55】

前記組換えウイルスが、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項５４に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項56】

前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項５４または請求項５５に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項57】

前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項58】

前記プロモータが構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである、請求項５７に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項59】

前記構成的プロモータが、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または前記組織特異的プロモータが、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである、請求項５８に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項60】

請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルス。

【請求項61】

組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項６０に記載の組換えウイルス。

【請求項62】

組換えＡＡＶである、請求項６０または請求項６１に記載の組換えウイルス。

【請求項63】

前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項６０から６２のいずれか一項に記載の組換えウイルス。

【請求項64】

前記プロモータが構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである、請求項６３に記載の組換えウイルス。

【請求項65】

前記構成的プロモータが、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または前記組織特異的プロモータが、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである、請求項６４に記載の組換えウイルス。

【請求項66】

ポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物であって、前記ポリヌクレオチドが、請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含む、脂質ナノ粒子組成物。

【請求項67】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項68】

薬学的に許容される担体と請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭとを含む医薬組成物。

【請求項69】

薬学的に許容される担体と請求項５１または請求項５２に記載のポリヌクレオチドとを含む医薬組成物。

【請求項70】

薬学的に許容される担体と、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ構築物とを含む医薬組成物。

【請求項71】

薬学的に許容される担体と請求項６０から６５のいずれか一項に記載の組換えウイルスとを含む医薬組成物。

【請求項72】

薬学的に許容される担体と請求項６６または請求項６７に記載の脂質ナノ粒子組成物とを含む医薬組成物。

【請求項73】

請求項５１または請求項５２に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変真核細胞。

【請求項74】

前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変哺乳動物細胞である、請求項７３に記載の遺伝子改変真核細胞。

【請求項75】

前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒト細胞である、請求項７３に記載の遺伝子改変真核細胞。

【請求項76】

前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変植物細胞である、請求項７３に記載の遺伝子改変真核細胞。

【請求項77】

遺伝子改変真核細胞を作製するための方法であって、真核細胞に、
（ａ）該真核細胞中で発現する請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｂ）該真核細胞のミトコンドリアゲノム中の前記認識配列に切断部位を生成する請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ
を導入することを含む、方法。

【請求項78】

前記切断部位が、前記認識配列が挿入または欠失を含むように非相同末端結合によって修復される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記認識配列を含む前記ミトコンドリアゲノムが、前記遺伝子改変真核細胞中で分解される、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

前記ミトコンドリアゲノムが突然変異ミトコンドリアゲノムである、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が前記遺伝子改変真核細胞中で分解される、請求項７９または請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が、前記遺伝子改変真核細胞中で増加する、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する、請求項７９から８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記遺伝子改変真核細胞中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合が、前記遺伝子改変真核細胞中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である、請求項７９から８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記遺伝子改変真核細胞における前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項７９から８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項７９から８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する、請求項７９から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

複数の遺伝子改変細胞を含む真核細胞の集団を作製する方法であって、前記集団中の複数の真核細胞に、（ａ）前記複数の真核細胞中で発現する請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または（ｂ）前記複数の真核細胞のミトコンドリアゲノム中の前記認識配列に切断部位を生成する請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭを導入することを含む、方法。

【請求項89】

前記切断部位が、前記認識配列が挿入または欠失を含むように非相同末端結合によって修復される、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記認識配列を含む前記ミトコンドリアゲノムが、前記複数の遺伝子改変真核細胞中で分解される、請求項８８に記載の方法。

【請求項91】

前記ミトコンドリアゲノムが突然変異ミトコンドリアゲノムである、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が前記複数の遺伝子改変真核細胞中で分解される、請求項９０または請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が、前記複数の遺伝子改変真核細胞中で増加する、請求項９０から９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が、前記真核細胞の集団において増加する、請求項９０から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する、請求項９０から９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記複数の遺伝子改変真核細胞中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上増加する、請求項９０から９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記真核細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上増加する、請求項９０から９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記複数の遺伝子改変真核細胞における前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項９０から９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記真核細胞の集団中の前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項９０から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記複数の遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項９０から９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記複数の遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する、請求項９０から１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記真核細胞の集団における細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項９０から１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記真核細胞の集団における細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する、請求項９０から１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記方法がインビボで行われる、請求項７７から１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記方法がインビトロで行われる、請求項７７から１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項７７から１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記ポリヌクレオチドが請求項５２に記載のｍＲＮＡである、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物である、請求項７７から１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

前記ポリヌクレオチドが請求項５３から５９のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ構築物である、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子によって前記真核細胞に導入される、請求項７７から１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記ポリヌクレオチドが組換えウイルスによって前記真核細胞に導入される、請求項７７から１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記組換えウイルスが、請求項６０から６５のいずれか一項に記載の組換えウイルスである、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項１１１または請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項７７から１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記プロモータが構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記構成的プロモータが、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または前記組織特異的プロモータが、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項７７から１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記真核細胞がヒト細胞である、請求項７７から１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記真核細胞が、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血液前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、骨髄細胞、または腎臓細胞である、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記真核細胞が植物細胞である、請求項７７から１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

請求項７７から１２０のいずれか一項に記載の方法によって作製される、遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変真核細胞の集団。

【請求項122】

対象の標的細胞または対象の標的細胞の集団の突然変異ミトコンドリアゲノムを分解する方法であって、該標的細胞または該標的細胞の集団に、
（ａ）該標的細胞または該標的細胞の集団中で発現する請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｂ）請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ
を送達することを含み、
該ＭＴＥＭが認識配列において該突然変異ミトコンドリアゲノムに切断部位を生成し、該突然変異ミトコンドリアゲノムが分解される、方法。

【請求項123】

前記対象が哺乳動物である、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記対象がヒトである、請求項１２２または請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記標的細胞が、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血液前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞であり、または前記標的細胞の集団が、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血球前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞の集団である、請求項１２２から１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１２２から１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記ポリヌクレオチドが請求項５２に記載のｍＲＮＡである、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

前記ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物である、請求項１２２から１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

前記ポリヌクレオチドが請求項５３から５９のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ構築物である、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子によって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１２２から１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項131】

前記ポリヌクレオチドが、組換えウイルスによって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１２２から１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項132】

前記組換えウイルスが、請求項６０から６５のいずれか一項に記載の組換えウイルスである、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項１３０または請求項１３１に記載の方法。

【請求項134】

前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項１２２から１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記プロモータが構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記構成的プロモータが、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または前記組織特異的プロモータが、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団中で分解される、請求項１２２から１３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項138】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団において増加する、請求項１２２から１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する、請求項１２２から１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記標的細胞または前記標的細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である、請求項１２２から１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記遺伝子改変真核細胞における前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項１２２から１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

前記標的細胞または前記標的細胞の集団における細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項１２２から１４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

前記標的細胞または前記標的細胞の集団における細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する、請求項１２２から１４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項144】

対象のミトコンドリア障害に関連する状態を処置する方法であって、該対象に、
（ａ）治療有効量の、対象の標的細胞または標的細胞の集団に送達される、該標的細胞または該標的細胞の集団で発現する請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、または
（ｂ）該対象の標的細胞もしくは標的細胞の集団に送達される、治療有効量の請求項１から５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ
を投与することを含み、
該ＭＴＥＭが認識配列において突然変異ミトコンドリアゲノムに切断部位を生成し、該突然変異ミトコンドリアゲノムが分解される、方法。

【請求項145】

請求項６８から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

前記対象が哺乳動物である、請求項１４４または請求項１４５に記載の方法。

【請求項147】

前記対象がヒトである、請求項１４４から１４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

前記標的細胞が、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血液前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞であり、または前記標的細胞の集団が、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血球前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞の集団である、請求項１４４から１４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項149】

前記状態が、筋肉、心臓、中枢神経系、眼、骨髄、腎臓、膵臓、白血球、血管または内耳の状態である、請求項１４４から１４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項150】

前記状態が、ピアソン症候群、進行性外眼筋麻痺、カーンズ・セイアー症候群（ＫＳＳ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス癲癇（ＭＥＲＲＦ）、神経障害、運動失調、網膜色素変性（ＮＡＲＰ）、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）、母遺伝性リー症候群（ＭＩＬＳ）、母遺伝性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤ）、または重複症状を伴うミトコンドリア障害である、請求項１４４から１４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項151】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１４４から１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項152】

前記ポリヌクレオチドが請求項５２に記載のｍＲＮＡである、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物である、請求項１４４から１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

前記ポリヌクレオチドが請求項５３から５９のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ構築物である、請求項１５３に記載の方法。

【請求項155】

前記ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子によって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１４４から１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項156】

前記ポリヌクレオチドが、組換えウイルスによって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１４４から１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項157】

前記組換えウイルスが、請求項６０から６５のいずれか一項に記載の組換えウイルスである、請求項１５６に記載の方法。

【請求項158】

前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項１５６または請求項１５７に記載の方法。

【請求項159】

前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項１４４から１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

前記プロモータが組織特異的プロモータである、請求項１５９に記載の方法。

【請求項161】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団中で分解される、請求項１４４から１６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項162】

前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団において増加する、請求項１４４から１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する、請求項１４４から１６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項164】

前記標的細胞または前記標的細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である、請求項１４４から１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

前記遺伝子改変真核細胞における前記認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項１４４から１６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項166】

前記標的細胞または前記標的細胞の集団における細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項１４４から１６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記標的細胞または前記標的細胞の集団における細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する、請求項１４４から１６６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。特に、本開示は、ヒトミトコンドリアゲノムに見出される認識配列を認識および切断するように操作された組換えメガヌクレアーゼに関する。本開示はさらに、遺伝子改変真核細胞を作製するための方法におけるそのような組換えメガヌクレアーゼの使用、およびミトコンドリアＤＮＡが改変されている遺伝子改変真核細胞の集団に関する。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年４月２１日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名称はＰ８９３３９＿０１３７＿９＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿４－２１－２２．ｔｘｔであり、サイズは２０．０ｋｂである。

【背景技術】

【0003】

すべての生物において、ミトコンドリアは、正常な成長および発達の下で、ならびにストレスに応答して、細胞のエネルギーおよび代謝を調節する。これらの役割で機能するタンパク質の多くは、ミトコンドリアゲノムにコードされている。したがって、ミトコンドリアゲノムの編集は、動物および植物の両方において多様な用途を有する。ヒトにおいて、有害なミトコンドリア突然変異は、遺伝子編集療法を適用することができるいくつかの障害の原因である。

【0004】

病原性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）突然変異には、タンパク質コード、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子における大規模再編成および点突然変異が含まれる。ｍｔＤＮＡ関連疾患診断の有病率は５，０００人に約１人であるが、１０の最も一般的な病原性ｍｔＤＮＡ突然変異の集団頻度ははるかに高く、２００人に１人に近く、多くの「正常な」個体が低レベルの突然変異ゲノムを保有していることを意味する（非特許文献１）。

【0005】

突然変異ｍｔＤＮＡは、ほとんどの場合、患者の細胞中で野生型ｍｔＤＮＡと共存する（ｍｔＤＮＡヘテロプラスミー）。いくつかの研究は、野生型ｍｔＤＮＡが強い保護効果を有することを示し、突然変異ｍｔＤＮＡのレベルが８０～９０％より高い場合にのみ生化学的異常が観察された（非特許文献１）。突然変異負荷が８０％を超える場合にのみ筋線維がＯＸＰＨＯＳ欠陥を発症することが示されている（非特許文献２）。したがって、このバランスを野生型に向かってわずかな割合でもシフトさせることができる任意のアプローチは、強い治療可能性を有する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｃｈｏｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎ １３：８７８－８９０（２０１２）

【非特許文献2】Ｓｃｉａｃｃｏら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、３：１３－１９（１９９４）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、ｍｔＤＮＡ操作は、ｍｔＤＮＡを高効率で標的化し、正確な編集を生成することができないため、依然としてあまり研究されていない科学領域である。ミトコンドリアゲノムは、予測可能な修復機構およびこの細胞小器官への編集技術の送達を必要とするため、編集が困難である。ミトコンドリアゲノム編集に関連する困難さおよび予測不可能性を考慮すると、ｍｔＤＮＡの正確な編集に対する満たされていない必要性があり、これは、生命科学における調査および機会の分野全体を切り開くであろう。ミトコンドリアゲノムの定義された領域（好ましくはただ１つの遺伝子に限定される）をより予測可能な様式で標的化および編集する能力は、現在利用可能なシステムを超える明らかな利点であろう。

【課題を解決するための手段】

【0008】

ミトコンドリアゲノムの正確な編集のための組成物および方法が本明細書で提供される。これまで、ミトコンドリアゲノム編集における他のすべての試みは、大規模かつ予測不可能な欠失／再編成をもたらした。本発明は、ホーミングエンドヌクレアーゼがミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の正確な編集を可能にすることを初めて実証し、それにより、生命科学における調査および機会の分野全体を切り開く。本明細書で提供される組成物および方法は、周囲領域に影響を与えることなく、１つの特定のミトコンドリア遺伝子を編集するために使用することができる。

【0009】

一態様では、本発明は、真核細胞のミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合して切断するミトコンドリアを標的とした操作されたメガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）であって、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）に結合した操作されたメガヌクレアーゼを含むＭＴＥＭを提供する。

【0010】

いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識半部位（ｈａｌｆ－ｓｉｔｅ）に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットはそれぞれ、配列番号１に示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットはそれぞれ、配列番号１の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２に示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、認識配列は配列番号３を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２１５～２７０を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基１９８～３４４を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基３６に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２４～７９を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基７～１５３を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５の核酸配列によってコードされる。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、配列番号６～８のいずれか１つに示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、配列番号６～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼに融合している。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、ポリペプチドリンカーによって操作されたメガヌクレアーゼに結合している。いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰに結合している。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、配列番号６～８のいずれか１つに示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、配列番号６～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰは同一である。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰは同一ではない。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼに融合している。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、ポリペプチドリンカーによって操作されたメガヌクレアーゼに結合している。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭは、核外移行配列（ＮＥＳ）に結合している。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号９または１０に示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、ＭＴＥＭのＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、ＭＴＥＭのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、ＮＥＳはＭＴＥＭに融合している。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによってＭＴＥＭに結合している。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭは、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳを含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳはＭＴＥＭのＮ末端に結合し、第２のＮＥＳはＭＴＥＭのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号９または１０に示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一である。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一ではない。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ＭＴＥＭに融合している。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ＭＴＥＭに結合している。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ＭＴＥＭに結合している。

【0020】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。

【0021】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶＨＳＣカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータはＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または組織特異的プロモータはニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである。

【0022】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の組換えＤＮＡを含むプラスミドを提供する。

【0023】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶＨＳＣカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータはＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または組織特異的プロモータはニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。

【0024】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と本明細書に記載のＭＴＥＭとを含む医薬組成物を提供する。

【0025】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドとを含む医薬組成物を提供する。

【0026】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物とを含む医薬組成物を提供する。

【0027】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と本明細書に記載の任意の組換えウイルスとを含む医薬組成物を提供する。

【0028】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と本明細書に記載の任意の脂質ナノ粒子組成物とを含む医薬組成物を提供する。

【0029】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含む遺伝子改変真核細胞を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変植物細胞である。

【0030】

別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、真核細胞に、（ａ）真核細胞中で発現する本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または（ｂ）真核細胞のミトコンドリアゲノム中の認識配列に切断部位を生成する本明細書に記載のＭＴＥＭを導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、切断部位は、認識配列が挿入または欠失を含むように非相同末端結合によって修復される。いくつかの実施形態では、認識配列を含むミトコンドリアゲノムは、遺伝子改変真核細胞中で分解される。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアゲノムは突然変異ミトコンドリアゲノムである。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が遺伝子改変真核細胞中で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、遺伝子改変真核細胞で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合は、遺伝子改変真核細胞中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞中の認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する。

【0031】

別の態様では、本発明は、複数の遺伝子改変細胞を含む真核細胞の集団を作製する方法であって、集団中の複数の真核細胞に、（ａ）複数の真核細胞中で発現する本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または（ｂ）複数の真核細胞のミトコンドリアゲノム中の認識配列に切断部位を生成する本明細書に記載のＭＴＥＭを導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、切断部位は、認識配列が挿入または欠失を含むように非相同末端結合によって修復される。いくつかの実施形態では、認識配列を含むミトコンドリアゲノムは、複数の遺伝子改変真核細胞中で分解される。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアゲノムは突然変異ミトコンドリアゲノムである。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、複数の遺伝子改変真核細胞中で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、複数の遺伝子改変真核細胞で増加する。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、真核細胞の集団で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子改変真核細胞中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子改変真核細胞中の認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団中の認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子改変真核細胞における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する。

【0032】

いくつかの実施形態では、方法はインビボで行われる。いくつかの実施形態では、方法はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の任意の組換えウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶＨＳＣカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータはＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または組織特異的プロモータはニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血液前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、骨髄細胞、または腎臓細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は植物細胞である。

【0033】

別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞を作製するための任意の方法または複数の遺伝子改変細胞を含む真核細胞の集団を作製するための任意の方法によって作製される、遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変真核細胞の集団を提供する。

【0034】

別の態様では、本発明は、対象の標的細胞または対象の標的細胞の集団において突然変異ミトコンドリアゲノムを分解する方法であって、標的細胞または標的細胞の集団に、（ａ）標的細胞または標的細胞の集団で発現する本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または（ｂ）本明細書に記載のＭＴＥＭを送達することを含み、ＭＴＥＭが認識配列において突然変異ミトコンドリアゲノムに切断部位を生成し、突然変異ミトコンドリアゲノムが分解される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血液前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞であり、または標的細胞の集団は、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血球前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞の集団である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の任意の組換えウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶＨＳＣカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータはＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または組織特異的プロモータはニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、標的細胞または標的細胞の集団で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、標的細胞または標的細胞の集団で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合は、標的細胞または標的細胞の集団中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞中の認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する。

【0035】

別の態様では、本発明は、対象のミトコンドリア障害に関連する状態を処置する方法であって、対象に、（ａ）治療有効量の、対象の標的細胞もしくは標的細胞の集団に送達される、標的細胞または標的細胞の集団で発現する本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または（ｂ）治療有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭを投与することを含み、ＭＴＥＭが対象の標的細胞もしくは標的細胞の集団に送達され、ＭＴＥＭが認識配列において突然変異ミトコンドリアゲノムに切断部位を生成し、突然変異ミトコンドリアゲノムが分解される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の任意の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血液前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞であり、または標的細胞の集団は、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、心筋細胞、眼の細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、白血球、前駆細胞、血球前駆細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、内皮細胞、内耳毛細胞、もしくは腎臓細胞の集団である。いくつかの実施形態では、状態は、筋肉、心臓、中枢神経系、眼、骨髄、腎臓、膵臓、白血球、血管または内耳の状態である。いくつかの実施形態では、状態は、ピアソン症候群、進行性外眼筋麻痺、カーンズ・セイアー症候群（ＫＳＳ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス癲癇（ＭＥＲＲＦ）、神経障害、運動失調、網膜色素変性（ＮＡＲＰ）、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）、母遺伝性リー症候群（ＭＩＬＳ）、母遺伝性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤ）、または重複症状を伴うミトコンドリア障害である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の任意の組換えウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶＨＳＣカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータまたは組織特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータはＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータもしくはＵｂＣプロモータであり、または組織特異的プロモータはニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、眼特異的プロモータ、網膜特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、白血球特異的プロモータ、前駆細胞特異的プロモータ、血液前駆細胞特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、膵β細胞特異的プロモータ、内皮細胞特異的プロモータ、内耳毛細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータもしくは腎臓特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、標的細胞または標的細胞の集団で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、標的細胞または標的細胞の集団で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムの割合は、標的細胞または標的細胞の集団中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞中の認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】ＭＴＥＭ構築物およびミトコンドリア発現を示す図である。

【図1A】ミトコンドリア切断検出のための戦略を記載する図である。（マウスｍｔＤＮＡ ｔＲＮＡ－Ａｌａ突然変異［ＭＩＴ １１－１２］に対する）操作されたヌクレアーゼの認識配列切断を試験するために、一対の操作されたＣＨＯ株を、核ＤＮＡ中に野生型（ＷＴ）または突然変異ｍｔＤＮＡ標的部位のいずれかを有するように作製した。標的部位の切断が反復領域間の相同組換え事象を促進して機能的ＧＦＰを生じるように、標的部位をＧＦＰ遺伝子の直接反復の間に配置した。さらに、操作されたヌクレアーゼ標的部位の隣に組み込まれた陽性対照ヌクレアーゼ（「ＣＨＯ ２３－２４」）の標的部位がある（左パネル）。細胞株の各々をＭＩＴ １１－１２またはＣＨＯ ２３－２４（対照）をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に細胞をフローサイトメトリーによってＧＦＰ＋細胞の割合についてアッセイした（右パネル）。

【図1B】ＣＭＶプロモータ、Ｃｏｘ８またはＣｏｘ８／Ｓｕ９のミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）、免疫学的検出のためのＦｌａｇタグ、操作されたメガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）配列、およびＰｏｌｙＡ尾部を含む、エクスビボ発現のためのＭＴＥＭ遺伝子構築物を示す図である。

【図1C】ＭＴＥＭによるトランスフェクションの２４時間後にＨｅＬａ細胞に対して行われた免疫蛍光を示す図である。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒはミトコンドリアを赤色に染色し、ＦｌａｇはＭＴＥＭを緑色に染色し、合成画像はミトコンドリアへのＭＴＥＭの共局在（黄色）を示す。４０倍の倍率で撮影された画像。

【図1D】ＣＦまたはＣＳＦ構築物のいずれかによるトランスフェクションの２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＴＥＭ発現（ＦＬＡＧ）を示すウエスタンブロットの結果を報告する図である。ＣＦ＋ＧＦＰレーンおよびＣＳＦ＋ＧＦＰレーンは、ＧＦＰ配列が付加されたＭＴＥＭ構築物でトランスフェクトされた細胞におけるタンパク質発現を示す。Ｕｎｔレーンはトランスフェクトされていない細胞を表す。ＧＦＰレーンは、ＧＦＰのみでトランスフェクトされた細胞を表す。チューブリン（Ｔｕｂ）発現を負荷対照として使用した。

【図2】ｔＲＮＡ^Ａｌａ突然変異（ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ）を有するヘテロプラスミー細胞に対するＭＴＥＭの効果を示す図である。

【図2A】ＦＡＣＳ細胞選別ゲーティングの例を報告する図である。細胞をＧＦＰ共発現の存在によって選別した。「黒色」細胞（底部ゲート）および「緑色」細胞（上部ゲート）。

【図2B】５０％のｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ突然変異を有するヘテロプラスミー細胞の、２つの独立したトランスフェクションおよび細胞選別実験のＲＦＬＰ－ＨＯＴ ＰＣＲ分析を報告する図である。緑色細胞集団（Ｇｒ）における突然変異レベルをトランスフェクトされていない細胞（Ｕ）と比較した。

【図2C】図２Ｂに記載される５０％の突然変異を有する細胞における２つの細胞選別実験からのヘテロプラスミーシフトの定量化を示す図である。結果をトランスフェクトされていない細胞のヘテロプラスミーと比較した。

【図2D】経時的にＭＴＥＭでトランスフェクトされた高ヘテロプラスミー突然変異負荷量（９０％）を有するヘテロプラスミー細胞のＲＦＬＰ「最終サイクルホット」ＰＣＲ分析を示す図である。

【図2E】図２Ｄの結果の定量化を示す図である。値をトランスフェクトされていない細胞に対して正規化する。黒色細胞をＢｌｋと命名する（ｎ＝４）。

【図2F】ＭＴＥＭでトランスフェクトした高度に突然変異した細胞でチェックし、トランスフェクションの２４時間後にトランスフェクトされていない細胞と比較し、トランスフェクション後３週間追跡した全ｍｔＤＮＡレベルを報告する（ｎ＝３）図である。

【図2G】ＭＴＥＭでトランスフェクトし、３週間成長させた高レベルのヘテロプラスミー突然変異ｍｔＤＮＡを有する細胞中で推定された酸素消費率（ＯＣＲ）を示す（ｎ＝３～７）図である。データは平均±ＳＥＭである。両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った。ｐ≦０．０５＊、ｐ≦０．０１＊＊、ｐ＞０．００１＊＊＊

【図3】処置された幼若マウスにおけるＡＡＶ９－ＭＴＥＭの効果を報告する図である。

【図3A】ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ試料についてはＦｌａｇ抗体およびＡＡＶ－ＧＦＰ試料についてはＧＦＰ抗体を有するホモジネートの代表的なウエスタンブロット（ＷＢ）を示す図である（上のパネル）。ＰＩ ６週、１２週および２４週での同じ注射動物由来のＤＮＡ試料のＲＦＬＰ「最終サイクルホット」ＰＣＲ分析（ＲＦＬＰ、下のパネル）。

【図3B】脳組織に対して正規化されたＰＩ ６週、１２週、または２４週での全組織にわたるヘテロプラスミーのパーセント変化として示されるヘテロプラスミーシフトの定量化を示す図である。心臓（Ｈ）、前脛骨筋（ＴＡ）、大腿四頭筋（Ｑ）、腓腹筋（Ｇ）、腎臓（Ｋ）、肝臓（Ｌ）および脾臓（Ｓｐ）のヘテロプラスミーレベルを、脳（Ｂ）（ＭＴＥＭの発現について陰性）と比較した。

【図3C】１８Ｓ（核ＤＮＡ）に対して正規化されたＮＤ１およびＮＤ５ミトコンドリアプライマー／プローブを使用した、ＰＩ ６週および２４週での骨格筋、肝臓および脳における全ｍｔＤＮＡレベルのＲＴ－ＰＣＲによる定量化を示す図である。データは、ｎ＝３～５の平均±ＳＥＭである。両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った。ｐ≦０．０５＊、ｐ≦０．０１＊＊、ｐ≦０．００１＊＊＊、ｐ≦０．０００１＊＊＊＊

【図4】処置した成体マウスにおけるＡＡＶ９－ＭＴＥＭの影響を示す。

【図4A】ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ試料についてはＦｌａｇ抗体およびＡＡＶ－ＧＦＰ試料についてはＧＦＰ抗体を有するホモジネート（上のパネル）の代表的なウエスタンブロット（Ｗ．Ｂ．）を示す。ＰＩ ６週、１２週および２４週での同じ注射動物由来のＤＮＡ試料のＲＦＬＰ「最終サイクルホット」ＰＣＲ分析（ＲＦＬＰ、下のパネル）。

【図4B】脳組織に対して正規化されたＰＩ ６週、１２週、および２４週での全組織にわたるヘテロプラスミーのパーセント変化として示されるヘテロプラスミーシフトの定量化を示す図である。心臓（Ｈ）、前脛骨筋（ＴＡ）、大腿四頭筋（Ｑ）、腓腹筋（Ｇ）、腎臓（Ｋ）、肝臓（Ｌ）および脾臓（Ｓｐ）のヘテロプラスミーを、脳（ＭＴＥＭの発現について陰性）と比較した。

【図4C】１８Ｓ（核ＤＮＡ）に対して正規化されたＮＤ１およびＮＤ５ミトコンドリアプライマー／プローブを使用して、ＰＩ ６週および２４週で骨格筋、肝臓、および脳（Ｂ）において全ｍｔＤＮＡレベルのｑＰＣＲによる定量化を測定したことを示す図である。データは、ｎ＝３～４の平均±ＳＥＭである。両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った。ｐ≦０．０５＊、ｐ≦０．０１＊＊、ｐ≦０．００１＊＊＊、ｐ≦０．０００１＊＊＊＊

【図5】肝臓におけるｍｔ－ｔＲＮＡ^ＡｌａのＭＴＥＭ誘発性増加を報告する図である。

【図5A】ｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａおよび全ＲＮＡ負荷（２８Ｓおよび１８Ｓ）についてプローブしたＰＩ ２４週での幼若マウス肝臓のノーザンブロット分析を示す図である。

【図5B】２８Ｓ ｒＲＮＡに対して正規化された図５Ａのノーザンブロットにおけるｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａの定量化を示す図である。

【図5C】幼若マウス肝臓におけるｍｔ－ｔＲＮＡ^Ｖａｌのレベルと比較した、ｑＰＣＲによるｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａの定量化を示す図である。ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ処置動物由来のＲＮＡ試料を、ＡＡＶ９－ＧＦＰ対照およびＷＴ肝臓試料と比較した。

【図5D】成体マウス肝臓におけるｍｔ－ｔＲＮＡ^Ｖａｌのレベルと比較したｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａの定量化を報告する図である。ＰＩ ２４週で、ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ処置動物由来のＲＮＡ試料を、ＡＡＶ９－ＧＦＰ対照およびＷＴ肝臓試料と比較した。データは、ｎ＝３～４の平均±ＳＥＭである。両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った。ｐ＜０．０５＊

【図6】配列番号１０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）またはＭＴＰおよび核外移行配列（ＮＥＳ）に融合した操作されたメガヌクレアーゼによるインデル形成を示す図である。ＭＲＣ－５細胞を操作されたメガヌクレアーゼ構築物でヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）し、ＡＰＣ １１－１２結合部位でのインデル形成を２日後に分析した。

【図7】配列番号９の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）またはＭＴＰおよびＭＶＭｐ ＮＳ２核外移行配列（ＮＥＳ）に融合した操作されたメガヌクレアーゼによるインデル形成を示す図である。ＭＲＣ－５細胞を操作されたメガヌクレアーゼ構築物でヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）し、ＡＰＣ １１－１２結合部位でのインデル形成を２日後に分析した。

【0037】

配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ配列を示す。

【0038】

配列番号２は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩサブユニットを有するＭＴＥＭメガヌクレアーゼを示す。

【0039】

配列番号３は、ＭＩＴ １１－１２認識配列（センス）を示す。

【0040】

配列番号４は、ＭＩＴ １１－１２ｘ４０メガヌクレアーゼアミノ酸配列を示す。

【0041】

配列番号５は、ＭＩＴ １１－１２ｘ．４０メガヌクレアーゼ核酸配列を示す。

【0042】

配列番号６は、ＣＯＸ ＶＩＩＩ ＭＴＰを示す。

【0043】

配列番号７は、ＳＵ９ ＭＴＰを示す。

【0044】

配列番号８は、ＣＯＸ ＶＩＩＩ－ＳＵ９ ＭＴＰを示す。

【0045】

配列番号９は、ＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳ配列を示す。

【0046】

配列番号１０は、ＮＥＳ配列を示す。

【0047】

配列番号１１は、ＭＩＴ １１－１２認識配列（アンチセンス）を示す。

【0048】

配列番号１２は、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔフォワードプライマを示す。

【0049】

配列番号１３は、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔリバースプライマを示す。

【0050】

配列番号１４は、ＮＤ１フォワードプライマを示す。

【0051】

配列番号１５は、ＮＤ１リバースプライマを示す。

【0052】

配列番号１６は、ＮＤ１プローブを示す。

【0053】

配列番号１７は、ＮＤ５フォワードプライマを示す。

【0054】

配列番号１８は、ＮＤ５リバースプライマを示す。

【0055】

配列番号１９は、ＮＤ５プローブを示す。

【0056】

配列番号２０は、１８ｓフォワードプライマを示す。

【0057】

配列番号２１は、１８ｓリバースプライマを示す。

【0058】

配列番号２２は、１８ｓプローブを示す。

【0059】

配列番号２３は、ミトコンドリアｔＲＮＡ^ａｌａを検出するためのビオチン化プローブを示す。

【0060】

配列番号２４は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ第２染色体部位１を示す。

【0061】

配列番号２５は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ第２染色体部位２を示す。

【0062】

配列番号２６は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ第５染色体部位３を示す。

【0063】

配列番号２７は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ第６染色体部位４を示す。

【0064】

配列番号２８は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ第２染色体部位５を示す。

【0065】

配列番号２９は、ＡＰＣ １１－１２結合部位に対するプローブを示す。

【0066】

配列番号３０は、ＡＰＣ １１－１２結合部位に対するフォワードプライマを示す。

【0067】

配列番号３１は、ＡＰＣ １１－１２結合部位に対するリバースプライマを示す。

【0068】

配列番号３２は、参照結合部位に対するプローブを示す。

【0069】

配列番号３３は、参照結合部位用のフォワードプライマを示す。

【0070】

配列番号３４は、参照結合部位のためのリバースプライマを示す。

【発明を実施するための形態】

【0071】

発明の詳細な説明
１．１（定義）
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0072】

本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して示された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、本発明から逸脱しない。

【0073】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。

【0074】

本明細書で引用されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。

【0075】

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」は、１つ以上を意味することができる。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、単一の細胞または多数の細胞を意味し得る。

【0076】

本明細書で使用される場合、「５’キャップ」（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）という用語は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「フロント」または５’末端に付加されている改変グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第１の転写されたヌクレオチドに連結された末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護にとって重要である。キャップ付加は転写と共役しており、それぞれが他方に影響を及ぼすように共転写的に起こる。転写の開始直後に、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼに会合するキャップ合成複合体によって結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、その安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節するように改変することができる。

【0077】

本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」という用語は、遺伝子の２つ以上の変異形態のうちの１つを指す。

【0078】

本明細書で使用される場合、「構成的プロモータ」という用語は、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で遺伝子産物を細胞内で作製させるヌクレオチド配列を指す。

【0079】

本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」という用語は、遺伝子改変細胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらす遺伝子改変のための出発物質と同じ遺伝子型の野生型細胞、（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、目的の形質に既知の影響を有しない構築物で）形質転換された細胞、または（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型もしくは表現型の発現を誘導する条件もしくは刺激もしくはさらなる遺伝子改変に曝露されていない細胞を含み得る。例えば、本発明の対照または対照細胞は、ＭＴＥＭもＭＴＥＭをコードするアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドも含まない細胞または細胞集団であり得る。

【0080】

本明細書で使用される場合、２つのタンパク質またはアミノ酸配列の改変に関する「に対応する」という用語は、第１のタンパク質の特定の改変が第２のタンパク質の改変と同じアミノ酸残基の置換であること、および２つのタンパク質が（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）標準的な配列アラインメントに供される場合、第１のタンパク質の改変のアミノ酸位置が第２のタンパク質の改変のアミノ酸位置に対応するか整列することを示すために使用される。したがって、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、残基ＸおよびＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、ＸおよびＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応する。

【0081】

本明細書で使用される場合、用語「破壊された」または「破壊する」または「発現を破壊する」または「標的配列を破壊する」とは、遺伝子機能を妨害し、それによってコードされるポリペプチド／発現産物の発現および／または機能を妨げる突然変異（例えばフレームシフト突然変異）の導入のことを指す。例えば、遺伝子のヌクレアーゼ媒介破壊は、切断型タンパク質の発現および／または野生型機能を保持しないタンパク質の発現をもたらし得る。さらに、遺伝子へのドナー鋳型の導入は、コードされたタンパク質の発現、切断型タンパク質の発現、および／または野生型機能を保持しないタンパク質の発現をもたらさない可能性がある。

【0082】

本明細書で使用される場合、「コードする」という用語は、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を作製する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖との両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ぶことができる。

【0083】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはタンパク質に関して「内因性」という用語は、細胞内に天然に含まれるかまたは細胞によって発現される配列またはタンパク質を意味することを意図している。

【0084】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して「外因性」または「異種」という用語は、純粋に合成されているか、外来種に由来するか、または同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成および／またはゲノム遺伝子座においてその天然の形態から実質的に改変されている配列を意味することを意図している。

【0085】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、プロモータによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。

【0086】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野で公知のすべてのものが含まれる。

【0087】

本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている、またはその先祖においてゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている細胞または生物を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、「トランスジェニック」という用語を包含する。例えば、本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」細胞は、ミトコンドリアＤＮＡが組換え技術によって意図的に改変されている細胞を指し得る。

【0088】

本明細書で使用される場合、「相同組換え」または「ＨＲ」という用語は、修復鋳型として相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照のこと。）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列または細胞に送達された外因性核酸であり得る。

【0089】

本明細書で使用される場合、「相同アーム」または「ヌクレアーゼ切断部位に隣接する配列に相同な配列」という用語は、ヌクレアーゼによって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する、核酸分子の５´および３´末端に隣接する配列を指す。一般に、相同アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、最大２０００塩基対またはそれ以上の長さを有することができ、ゲノム中のそれらの対応する配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％またはそれ以上の配列相同性を有することができる。いくつかの実施形態では、相同アームは、約５００塩基対である。

【0090】

本明細書で使用される場合、「インビトロ転写ＲＮＡ」という用語は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから作製される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。

【0091】

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然の状態から変化または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。

【0092】

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点でレトロウイルスの中で独特であり、宿主細胞のＤＮＡにかなりの量の遺伝情報を送達することができるので、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。

【0093】

本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という用語は、１０～１０００ナノメートルの平均直径を有する典型的には球形の構造を有する脂質組成物を指す。いくつかの製剤では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、および少なくとも１つのコンジュゲート脂質を含むことができる。ｍＲＮＡなどの核酸をカプセル化するのに適した当技術分野で公知の脂質ナノ粒子が、本発明における使用のために企図される。

【0094】

本明細書で使用される場合、組換えタンパク質に関する「改変」という用語は、参照配列（例えば、野生型配列または天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、または置換を意味する。

【0095】

本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照のこと。）非相同末端結合によるＤＮＡ修復は間違いを起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の鋳型なしの付加または欠失を頻繁にもたらす。いくつかの例では、標的認識配列での切断は、標的認識部位でＮＨＥＪをもたらす。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断とそれに続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を破壊するフレームシフト突然変異などの突然変異をコード配列に導入することができる。したがって、操作されたヌクレアーゼを使用して、細胞集団中の遺伝子を効果的にノックアウトすることができる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いに縮退バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列があるバージョンでは１つ以上のイントロンを含み得る程度にイントロンを含み得る。

【0097】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のエレメント間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼをコードする核酸配列と調節配列（例えば、プロモータ）との間の作動可能な連結は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結されたエレメントは、連続していても不連続であってもよい。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用される場合、作動可能に連結されることは、コード領域が同じリーディングフレーム内にあることを意図する。

【0098】

本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「または」という単語は、「および／または」の包括的な意味で使用され、「いずれか／または」の排他的な意味では使用されない。

【0099】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、これらには多くの種類がある。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

【0100】

本明細書で使用される場合、「低減した」または「減少した」という用語は、対照細胞の集団と比較した場合の突然変異ミトコンドリアゲノムを含む細胞の集団における細胞の割合または細胞の比の低減を指す。いくつかの実施形態では、「低減した」または「減少した」は、単一細胞または細胞集団における突然変異ミトコンドリアゲノムの割合または野生型ミトコンドリアゲノムに対する突然変異ミトコンドリアゲノムの比の低減を指す。そのような低減は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または最大１００％である。したがって、「低減した」という用語は、突然変異ｍｔＤＮＡの部分的な低減および完全な低減の両方を包含する。

【0101】

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列および核酸配列の両方に関する用語である、「パーセント同一性」、「配列同一性」、「割合類似性（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」、「配列類似性」などの用語は、整列したアミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大にする配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指し、これは同一または類似の残基またはヌクレオチドの数、残基またはヌクレオチドの総数、ならびに配列アラインメントにおけるギャップの存在および長さの関数である。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するために、様々なアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴｐプログラムを、および核酸配列についてはＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方ともＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能であり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）、Ｚｈａｎｇら（２０００）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである。ワード長＝３、ギャップオープニングペナルティ＝－１１、ギャップ伸長ペナルティ＝－１、およびスコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである。ワード長＝１１、ギャップオープニングペナルティ＝－５、ギャップ伸長ペナルティ＝－２、マッチ・リワード＝１、およびミスマッチペナルティ＝－３。

【0102】

本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」という用語は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合している一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態では、ポリＡは５０～５０００、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００または４００超である。ポリ（Ａ）配列を化学的または酵素的に改変して、ｍＲＮＡの機能性、例えば局在化、安定性または翻訳の効率を調節することができる。

【0103】

本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」という用語は、ポリアデニリル部分またはその改変変異体のメッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は３´末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってプレ－ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチド（多くの場合数百）の長い配列である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）尾部は、特定の配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）尾部およびそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを助ける。ポリアデニル化は、転写終了、核からのｍＲＮＡの移行、および翻訳にとっても重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡがＲＮＡに転写された直後に核内で起こるが、さらに後に細胞質内で起こることもできる。転写が終了した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼに会合するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によって切断される。切断部位は、通常、切断部位付近の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。

【0104】

本明細書で使用される場合、「プロモータ／調節配列」という用語は、プロモータ／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。いくつかの例では、この配列はコアプロモータ配列であり得、他の例では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節エレメントを含み得る。プロモータ／調節配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。

【0105】

本明細書で使用される場合、タンパク質に関して「組換え」または「操作された」という用語は、タンパク質をコードする核酸およびタンパク質を発現する細胞または生物への遺伝子工学技術の適用の結果として変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」または「操作された」という用語は、遺伝子工学技術の適用の結果として変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術には、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、形質転換および他の遺伝子移入技術、相同組換え、部位特異的突然変異誘発および遺伝子融合が含まれるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニングおよび発現によって作製されるタンパク質は、組換えまたは操作されていると見なされない。

【0106】

本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、単鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである。組換え構築物は、天然には一緒に見られない調節配列およびコード配列を含むがこれらに限定されない核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来し、天然に見られるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。そのような構築物は、単独で使用されてもよく、またはベクターと組み合わせて使用されてもよい。

【0107】

本明細書で使用される場合、「組織特異的プロモータ」という用語は、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞がプロモータに対応する組織型の細胞である場合にのみ、実質的に細胞内で遺伝子産物を作製させるヌクレオチド配列を指す。

【0108】

本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」または「ヌクレオフェクトされた」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。

【0109】

本明細書で使用される場合、「移入ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、「移入ベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス移入ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0110】

本明細書で使用される場合、「一過性」という用語は、数時間、数日または数週間の期間にわたる非組み込み導入遺伝子の発現を指し、発現期間は、ゲノムに組み込まれているかまたは宿主細胞中の安定なプラスミドレプリコン内に含まれている場合、遺伝子の発現期間よりも短い。

【0111】

本明細書で使用される場合、「ベクター」または「組換えＤＮＡベクター」という用語は、所与の宿主細胞中でポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳が可能な複製系および配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、プラスミドベクターおよび組換えＡＡＶベクター、または遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベクターが挙げられ得るが、これらに限定されない。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチドまたは核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝的エレメントを十分に認識している。

【0112】

いくつかの実施形態では、「ベクター」はまた、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を指す。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0113】

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する、同じタイプの遺伝子の対立遺伝子集団における最も一般的な天然に存在する対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を指す。「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野生型対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）およびポリペプチドは、野生型配列と比較して１つ以上の突然変異および／または置換を含む突然変異体または変異体の対立遺伝子およびポリペプチドとは区別可能である。野生型対立遺伝子またはポリペプチドは生物において正常な表現型を付与することができるが、突然変異体または変異体の対立遺伝子またはポリペプチドは、いくつかの例では、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼまたは天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」という用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、および／もしくは対象、または比較目的で使用される細胞、生物、および／もしくは対象を指すことができる。

【0114】

本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼに言及する場合の「特異的に変化した」という用語は、ヌクレアーゼが、生理学的条件下で参照ヌクレアーゼ（例えば、野生型）に結合せず切断されない認識配列に結合して切断すること、または認識配列の切断速度が、参照ヌクレアーゼと比較して生物学的に有意な量（例えば、少なくとも２×、または２×～１０×）だけ増加または減少することを意味する。

【0115】

本明細書で使用される場合、「中心配列」という用語は、メガヌクレアーゼ認識配列の半部位を分離する４つの塩基対を指す。これらの塩基には＋１～＋４の番号を付す。中心配列は、メガヌクレアーゼ切断後に３´一本鎖オーバーハングになる４つの塩基を含む。「中心配列」は、センス鎖またはアンチセンス（反対）鎖の配列を指すことができる。メガヌクレアーゼは対称性であり、中心配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方で等しく塩基を認識する。例えば、センス鎖上の配列Ａ＋１Ａ＋２Ａ＋３Ａ＋４は、メガヌクレアーゼによってアンチセンス鎖上のＴ＋１Ｔ＋２Ｔ＋３Ｔ＋４として認識され、したがって、Ａ＋１Ａ＋２Ａ＋３Ａ＋４およびＴ＋１Ｔ＋２Ｔ＋３Ｔ＋４は機能的に等価である（例えば、両方が所与のメガヌクレアーゼによって切断され得る）。したがって、配列Ｃ＋１Ｔ＋２Ｇ＋３Ｃ＋４は、メガヌクレアーゼがその認識配列に対称ホモ二量体として結合するという事実に起因して、その反対鎖配列Ｇ＋１Ｃ＋２Ａ＋３Ｇ＋４と等価である。
本明細書で使用される場合、「切断する」または「切断」という用語は、本明細書で「切断部位」と呼ばれる、標的配列内の二本鎖切断をもたらす標的配列内の認識配列の骨格内のホスホジエステル結合の加水分解を指す。

【0116】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」または「結合親和性」という用語は、ヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列または任意の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計的に有意なパーセント変化だけ増加または減少する場合、ヌクレアーゼは「変化した」結合親和性を有する。

【0117】

本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含むメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニット内の局在配列を指す。超可変領域は、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、または好ましくは約５６個の残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号２または４のいずれか１つの２４～７９位または２１５～２７０位に対応し得る。超可変領域は、認識配列中のＤＮＡ塩基と接触する１つ以上の残基を含むことができ、モノマーまたはサブユニットの塩基選択性を変化させるように改変することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と会合する場合にＤＮＡ骨格に結合する１つ以上の残基を含むことができる。そのような残基は、ＤＮＡ骨格および標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変化させるように改変することができる。本発明の異なる実施形態では、超可変領域は、可変性を示し、塩基選択性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる１～２０残基を含むことができる。特定の実施形態では、超可変領域は、可変性を示し、塩基選択性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる約１５～２０個の残基を含む。いくつかの実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号２の２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７位の１つ以上に対応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号２の２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８位の１つ以上に対応する。

【0118】

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有していてもよく、または天然タンパク質には見られない人工配列であってもよい。リンカーは、可撓性であり、二次構造を欠いていてもよく、または生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい。リンカーは、限定されないが、米国特許第８，４４５，２５１号、第９，３４０，７７７号、第９，４３４，９３１号および第１０，０４１，０５３号に包含されるものを含むことができ、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。

【0119】

本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）に由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して天然のＩ－ＣｒｅＩに対して改変された、Ｉ－ＣｒｅＩの操作された変異体を指し得る。Ｉ－ＣｒｅＩのそのような改変された変異体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２００７／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに結合している「単鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の標的細胞で発現させた場合、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合に細胞生存率への有害な影響またはメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低下を観察することなく細胞をトランスフェクトし、３７℃で維持できるように、実質的に非毒性である。

【0120】

本明細書で使用される場合、「ミトコンドリアを標的とした操作されたメガヌクレアーゼ」または「ＭＴＥＭ」という用語は、操作されたメガヌクレアーゼがミトコンドリア細胞小器官内のミトコンドリアＤＮＡに結合して切断することができるように、操作されたメガヌクレアーゼをミトコンドリアに指向させることができるペプチドまたは他の分子に結合した操作されたメガヌクレアーゼを指す。本明細書で使用される場合、ＭＴＥＭという用語は、本明細書の他の箇所で定義されるＭＴＥＮの例である。

【0121】

本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア移行ペプチド」または「ＭＴＰ」という用語は、ミトコンドリア内で分子を輸送するために別個の分子に結合することができるペプチドまたはアミノ酸の断片を指す。例えば、ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼをミトコンドリアに輸送するために、操作されたメガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに結合することができる。ＭＴＰは、疎水性アミノ酸と正に帯電したアミノ酸の交互パターンからなり、いわゆる両親媒性ヘリックスを形成することができる。

【0122】

本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」という用語は互換的に使用され、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在するまたは操作された酵素を指す。

【0123】

本明細書で使用される場合、「認識半部位」、「認識配列半部位」または単に「半部位」という用語は、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼのモノマーまたは単鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識および結合される二本鎖ＤＮＡ分子内の核酸配列を意味する。

【0124】

本明細書で使用される場合、「認識配列」または「認識部位」という用語は、ヌクレアーゼによって結合および切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離された逆方向９塩基対の「半部位」の対を含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１の半部位と接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２の半部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’オーバーハングを生じる。「オーバーハング」または「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって作製することができる短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼおよび単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０～１３を含む。本明細書で使用される場合、「単鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによって結合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、同一ではないＤＮＡ配列に結合する。したがって、単鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリンドロームまたは非パリンドローム認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「単鎖ヘテロ二量体」または「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体または単鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。

【0125】

本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、ヌクレアーゼが認識配列と呼ばれる塩基対の特定の配列でのみ、または認識配列の特定のセットでのみ二本鎖ＤＮＡ分子に結合して切断する能力を意味する。認識配列のセットは、ある特定の保存された位置または配列モチーフを共有するが、１つ以上の位置で縮退し得る。高度に特異的なヌクレアーゼは、１つのみまたはごく少数の認識配列を切断することができる。特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。

【0126】

本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。

【0127】

本明細書で使用される場合、「処置」または「対象を処置する」という用語は、本発明の操作されたヌクレアーゼ、または本発明の操作されたヌクレアーゼをコードする核酸の投与を指す。いくつかの態様では、本発明の操作されたヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸は、処置中に本発明の医薬組成物の形態で投与される。

【0128】

本明細書で使用される場合、「ベクター」はウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を指すこともできる。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0129】

本明細書で使用される場合、「血清型」または「カプシド」という用語は、ウイルス細胞表面抗原に基づいて決定されるウイルスの種内の別個の変異体を指す。ＡＡＶの既知の血清型としては、とりわけ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶＨＳＣ（ＷｅｉｔｚｍａｎおよびＬｉｎｄｅｎ（２０１１）Ｉｎ Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。

【0130】

本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」は、遺伝子改変細胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらす遺伝子改変のための出発物質と同じ遺伝子型の野生型細胞、（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、目的の形質に既知の影響を有しない構築物で）形質転換された細胞、または（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型もしくは表現型の発現を誘導する条件、刺激もしくはさらなる遺伝子改変に曝露されていない細胞を含み得る。

【0131】

本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益または望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤または組成物、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重、体調および応答性に応じて変化する。いくつかの具体的な実施形態では、有効量のＭＴＥＭは、約１×１０^１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０^１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１×１０^１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または１×１０^１４ｇｃ／ｋｇ）のＭＴＥＭをコードする核酸または鋳型核酸を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される有効量のＭＴＥＭをコードする核酸および／もしくは鋳型核酸、またはＭＴＥＭをコードする核酸および／もしくは鋳型核酸を含む医薬組成物は、対象における疾患の少なくとも１つの症状を低減する。

【0132】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「有効用量」、「有効量」、「治療有効用量」、または「治療有効量」という用語は、有益または望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。

【0133】

本明細書で使用される場合、「ｇｃ／ｋｇ」または「遺伝子コピー／キログラム」という用語は、ＭＴＥＭをコードする核酸および／または鋳型核酸を投与される対象の体重１キログラム当たりの、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸のコピー数または鋳型核酸のコピー数を指す。

【0134】

本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、患者の疾患または状態の予防を指す。

【0135】

本明細書で使用される場合、「予防法」という用語は、疾患または疾患状態の予防または保護的処置を意味する。

【0136】

本明細書で使用される場合、「低減した」という用語は、疾患の症状または重症度の任意の低減を指す。そのような低減は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または最大１００％であり得る。したがって、「低減した」という用語は、疾患状態の部分的な低減および完全な低減の両方を包含する。

【0137】

本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等しい変数で本開示が実施され得ることを伝えることを意図している。したがって、本質的に離散的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しくなり得る。一例として、０と２との間の値を有すると記載されている変数は、その変数が本質的に離散的である場合、０、１または２の値をとることができ、その変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、または０以上２以下の任意の他の実数値をとることができるが、これらに限定されない。

【0138】

２．１ 発明の原理
ミトコンドリアは、正常な成長および発達の下で、ならびにストレスに応答して、細胞のエネルギーおよび代謝を調節する。したがって、ミトコンドリアゲノムの編集は、動物および植物の両方において多様な用途を有する。ヒトにおいて、有害なミトコンドリア突然変異は、遺伝子編集療法を適用することができるいくつかの障害の原因である。しかしながら、治療用途のためにミトコンドリアゲノム編集を使用する可能性はあるが、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を効率的に標的化し、正確な編集を生成することができないため、これは依然としてあまり研究されていない科学領域である。ミトコンドリアゲノムは、編集技術をこの細胞小器官に送達する必要があるため、編集が困難である。また、ミトコンドリアは、予測可能な修復機構を欠いている。ミトコンドリアゲノムを編集する以前の試みは、大規模かつ予測不可能な欠失／再編成をもたらした。したがって、ミトコンドリアゲノムの所定の領域（好ましくは、ただ１つの遺伝子に限定される）をより予測可能な様式で標的化および編集することを可能にする組成物および方法が望まれる。

【0139】

本開示は、ミトコンドリアゲノム内の周囲領域に影響を与えることなく、ミトコンドリアゲノム上の認識配列に結合して切断するための組成物および方法を提供する。本明細書には、操作されたヌクレアーゼ、例えばＤＳＢがｍｔＤＮＡにおいて生成され得るようにＭＴＰに結合した操作されたメガヌクレアーゼが開示される。本発明は、操作されたメガヌクレアーゼがミトコンドリア細胞小器官に指向させられ、ｍｔＤＮＡの正確な編集を容易にすることができ、したがって、生命科学における展望および機会の分野全体を開くことができることを実証する。

【0140】

２．２ ヒトミトコンドリアＤＮＡ内の認識配列を認識および切断するためのミトコンドリアを標的とした操作されたメガヌクレアーゼ
ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）に結合した操作されたメガヌクレアーゼから構築されたミトコンドリアを標的とした操作されたメガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）は、真核細胞の細胞質からミトコンドリアに効果的に輸送することができる。ミトコンドリア細胞小器官内に入ると、ＭＴＥＭは、ミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合して切断することができる。部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノム内でＤＮＡ切断を行うことが可能であり、そのようなＤＮＡ切断は、突然変異誘発性ＮＨＥＪ修復を介して、またはトランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの永久的な改変をもたらし得ることが当技術分野で公知である。ＮＨＥＪは、切断部位で突然変異誘発を生じさせ、対立遺伝子の不活性化をもたらすことができる。ＮＨＥＪ関連突然変異誘発は、初期終止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を作製するフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、またはナンセンス突然変異媒介ｍＲＮＡ分解などの機構を誘因し得る。ＮＨＥＪを介して突然変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異または野生型対立遺伝子に存在する配列を標的とするために使用することができる。さらに、標的遺伝子座において二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的に相同な配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが知られている。このようにして、外因性核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。そのような外因性核酸は、目的の任意の配列またはポリペプチドをコードすることができる。

【0141】

本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。特定の実施形態では、本発明を実施するために使用されるメガヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって結合されたＮ末端サブユニットおよびＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインの各々は、認識配列の半分（すなわち、認識半部位）を認識して結合し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が一対の４塩基対の３’一本鎖オーバーハングを生成するように、４塩基対によって埋め合わせられる。

【0142】

いくつかの実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、ＭＩＴ １１－１２認識配列（配列番号３）に結合して切断するように操作されている。そのような操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書では「ＭＩＴ １１－１２メガヌクレアーゼ」または「ＭＩＴ １１－１２ヌクレアーゼ」と呼ばれる。

【0143】

本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む第１のサブユニットと、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットとを含むことができる。さらに、第１のサブユニットは、認識配列中の第１の認識半部位に結合することができ、第２のサブユニットは、認識配列中の第２の認識半部位に結合することができる。操作されたメガヌクレアーゼが単鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第１および第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置されるように配向され得る。代替の実施形態では、第１および第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置されるように配向され得る。

【0144】

様々な実施形態では、ＭＴＥＭに含まれる操作されたメガヌクレアーゼの第１および／または第２のサブユニットは、配列番号１に示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＭＴＥＭに含まれる操作されたメガヌクレアーゼの第１および／または第２のサブユニットは、配列番号１の残基７～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＭＴＥＭに含まれる操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、ミトコンドリアゲノム内の配列番号３を含む認識配列に結合して切断し、操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２の残基２４～７９を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２の残基２１５～２７０を含む。いくつかのそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号２の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号２の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号２の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２の残基８０に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号２の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかのそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３に示される核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかのそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３に示される核酸配列によってコードされる。

【0146】

操作されたメガヌクレアーゼをミトコンドリアに指向させるためのＭＴＰは、１０～１００アミノ酸長であり得る。特定の実施形態では、ＭＴＰは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００またはそれ以上のアミノ酸長である。ＭＴＰは、続いてミトコンドリアマトリックスなどのミトコンドリアの異なる領域にタンパク質を標的化する追加のシグナルを含み得る。本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのＭＴＰの非限定的な例としては、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）Ｆ０ ＡＴＰアーゼサブユニット９（ＳＵ９）ＭＴＰ、ヒトチトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩ（ＣｏｘＶＩＩＩまたはＣｏｘ８）ＭＴＰ、ヒトＡＴＰシンターゼＭＴＰのサブユニットｃのＰ１アイソフォーム、アルデヒドデヒドロゲナーゼ標的化配列ＭＴＰ、グルタレドキシン５ ＭＴＰ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＭＴＰ、ペプチジル－プロリルイソメラーゼＭＴＰ、アセチルトランスフェラーゼＭＴＰ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼＭＴＰ、チトクロムオキシダーゼＭＴＰ、ならびにＡＴＰシンターゼＭＴＰのＦＡ部分のサブユニット、ＣＰＮ６０／Ｎｏ ＧＧリンカーＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ二倍（２ＳＯＤ）ＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ改変型（ＳＯＤｍｏｄ）ＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ改変型（２ＳＯＤｍｏｄ）二倍ＭＴＰ、Ｌ２９ ＭＴＰ、ｇＡＴＰアーゼガンマサブユニット（ＦＡγ５１）ＭＴＰ、ＣｏｘＩＶツインｓｔｒｅｐ（ＡＢＭ ９７４８３）ＭＴＰおよびＣｏｘＩＶ １０ｘＨｉｓ ＭＴＰが挙げられる。

【0147】

特定の実施形態では、ＭＴＰは、少なくとも２つのＭＴＰの組み合わせを含む。ＭＴＰの組み合わせは、同一のＭＴＰの組み合わせであってもよいし、異なるＭＴＰの組み合わせであってもよい。特定の実施形態では、ＭＴＰは、ＣｏｘＶＩＩＩ ＭＴＰ（配列番号６）およびＳＵ９ ＭＴＰ（配列番号７）を配列番号８によって表される単一のＭＴＰに含む。

【0148】

ＭＴＥＭを形成するために、ＭＴＰは、本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼに任意の適切な手段によって結合され得る。特定の実施形態では、ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端に結合することができる。他の実施形態では、ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼのＣ末端に結合することができる。いくつかの実施形態では、複数のＭＴＰを単一の操作されたメガヌクレアーゼに結合させてＭＴＥＭを形成することができる。例えば、第１のＭＴＰを操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端に結合させることができ、第２のＭＴＰをＭＴＰのＣ末端に結合させることができる。いくつかの実施形態では、第１および第２のＭＴＰは同一であり、他の実施形態では、第１および第２のＭＴＰは同一ではない。ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼの細胞のミトコンドリアへの輸送を可能にする任意の手段によって結合させることができる。特定の実施形態では、ＭＴＰは、ＭＴＰを操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に融合することによって結合している。ＭＴＰはまた、ペプチドリンカーによって操作されたメガヌクレアーゼに結合させることができるリンカーは、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５または２０個のアミノ酸であり得る。特定の実施形態では、ＭＴＰは、操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端でペプチドリンカーに結合している。

【0149】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法で使用するためのＭＴＥＭは、ＭＴＥＭが核ゲノムを切断するのを防ぐのを助けるために、核外移行配列（ＮＥＳ）に結合している。いくつかのそのような実施形態では、ＮＥＳは、配列番号９または１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ＮＥＳは、配列番号９または１０のアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＮＥＳは、操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端に結合している。他の実施形態では、ＮＥＳは、操作されたメガヌクレアーゼのＣ末端に結合している。ある特定の実施形態では、ＮＥＳは操作されたメガヌクレアーゼに融合している。ある特定の実施形態では、ＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによって操作されたメガヌクレアーゼに結合している。

【0150】

特定の実施形態では、ＭＴＥＭは複数のＮＥＳに結合している。例えば、本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼは、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳを含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、第１のＮＥＳはＭＴＥＭのＮ末端に結合し、第２のＮＥＳはＭＴＥＭのＣ末端に結合している。いくつかのそのような実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一である。他の実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一ではない。ＮＥＳは、当技術分野で公知の任意の適切な手段によってＭＴＥＭに結合させることができる。例えば、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳをＭＴＥＭに融合することができる。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによってＭＴＥＭに結合している。

【0151】

ＮＥＳを有するＭＴＥＭは、ＮＥＳを有しない操作されたメガヌクレアーゼと比較して、標的細胞または標的細胞集団（例えば、真核細胞または真核細胞集団）の核への輸送が低減または減少し得る。例えば、ＮＥＳを有するＭＴＥＭの核輸送は、ＮＥＳを有しないＭＴＥＭよりも約５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％またはそれ以上少ないものであり得る（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、ＮＥＳを有する操作されたメガヌクレアーゼは、ＮＥＳを含まないＭＴＥＭと比較して、より少ない核インデル（すなわち、標的細胞または標的細胞集団の核ゲノムにおけるより少ない切断および結果として生じる欠失）を誘導し得る。例えば、ＮＥＳを有するＭＴＥＭによって誘導される核インデルは、ＮＥＳを有しないＭＴＥＭによって誘導される核インデルよりも約５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％またはそれ以上少ないものであり得る。

【0152】

２．３ 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と本発明のＭＴＥＭとを含む、または薬学的に許容される担体と本発明のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む、医薬組成物を提供する。特に、薬学的に許容される担体と、治療有効量のＭＴＥＭをコードする核酸とを含む医薬組成物が提供され、ＭＴＥＭの操作されたメガヌクレアーゼは、ヒトｍｔＤＮＡなどのｍｔＤＮＡ内の認識配列に対して特異性を有する。

【0153】

他の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と本発明の遺伝子改変細胞とを含む医薬組成物を提供する。

【0154】

そのような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造では、ヌクレアーゼポリペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ／ＲＮＡもしくはそれを発現する細胞）は典型的には薬学的に許容される担体と混合され、得られた組成物は対象に投与される。担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象の疾患の処置に有用な１つ以上の追加の薬剤または生物学的分子をさらに含むことができる。同様に、追加の薬剤および／または生物学的分子は、別個の組成物として同時投与することができる。

【0155】

本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ウイルスゲノム）を含む組換えウイルス（すなわち、ウイルスベクター）を含む。そのような組換えウイルスは当技術分野で公知であり、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉら（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２において概説されている）。本発明で有用な組換えＡＡＶは、標的細胞型へのウイルスの形質導入および標的細胞によるＭＴＥＭの発現を可能にする任意のカプシドまたは血清型を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶＨＳＣの血清型を有する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは標的組織に直接注入される。代替の実施形態では、組換えウイルスは、循環系を介して全身送達される。異なるＡＡＶが異なる組織に局在する傾向があり、特定の組織への優先的送達のために適切なＡＡＶカプシド／血清型を選択することができることは当技術分野で公知である。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である。他の実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である。さらに他の実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。さらなる実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＨＳＣである。ＡＡＶベクターはまた、宿主細胞中で第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。組換えＡＡＶベクターによって送達される核酸は、左（５’）および右（３’）逆方向末端反復を含み得る。

【0156】

本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に製剤化された本明細書に記載の１つ以上のｍＲＮＡ（例えば、ＭＴＥＭをコードするｍＲＮＡ）を含む。

【0157】

脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質および／または脂質コンジュゲート、ならびにそのような脂質の互いに対する相対モル比の選択は、選択された脂質の特徴、意図された標的細胞の性質、および送達されるｍＲＮＡの特徴に基づく。さらなる考慮事項には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合原性および毒性が含まれる。したがって、個々の成分のモル比はそれに応じて調整することができる。

【0158】

本発明の方法で使用するための脂質ナノ粒子は、当技術分野で現在知られている様々な技術によって調製することができる。核酸－脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、その開示があらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００４０１４２０２５号および第２００７００４２０３１号に記載されている。

【0159】

脂質ナノ粒子の適切なサイズの選択は、標的細胞の部位および脂質ナノ粒子が作製されている用途を考慮しなければならない。一般に、脂質ナノ粒子は、約２５～約５００ｎｍの範囲内のサイズを有する。いくつかの実施態様では、脂質ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約３００ｎｍまたは約６０ｎｍ～約１２０ｎｍのサイズを有する。脂質ナノ粒子のサイズは、参照により本明細書に組み込まれるＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１＾１５０（１９８１）に記載されているように、準電気光散乱（ｑｕａｓｉ－ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＱＥＬＳ）によって決定することができる。特定のサイズ範囲の脂質ナノ粒子の集団を作製するための様々な方法、例えば超音波処理または均質化が当技術分野で公知である。そのような方法の１つは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。

【0160】

本発明での使用が企図されるいくつかの脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、および少なくとも１つのコンジュゲート脂質を含む。より特定の例では、脂質ナノ粒子は、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、および約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質コンジュゲートを含むことができ、非ラメラ（すなわち、非二重層）の形態を有するような方法で作製される。他の特定の例では、脂質ナノ粒子は、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、および約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質コンジュゲートを含み得、非ラメラ（すなわち、非二重層）形態を有するような方法で作製される。

【0161】

カチオン性脂質は、例えば、以下の１つ以上を含むことができる。パルミトイル－オレオイル－ノル－アルギニン（ＰＯＮＡ）、ＭＰＤＡＣＡ、ＧＵＡＤＡＣＡ、（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）（ＭＣ３）、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４およびＰａｎ ＭＣ５、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ、「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ（ｐｅｐｉａｚｉｎｏ）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジｏ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイルＮ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－ｙｌ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチル アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－β－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５´－（コレスタ－５－エン－３－β－オキシ）－３´－オキサペントキシ）－３－ジメチ（ｄｉｍｅｔｈｙ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９´，１－２´－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ´－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ´－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）またはそれらの混合物。カチオン性脂質はまた、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、Ｐａｎ ＭＣ５、またはそれらの混合物であり得る。

【0162】

様々な実施形態において、カチオン性脂質は、粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含む。

【0163】

他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含む。

【0164】

非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質成分の１つを含む。（１）コレステロールまたはその誘導体、（２）リン脂質、または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、およびそれらの混合物であり得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、リン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、またはそれらの混合物である。

【0165】

いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む。非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物である場合、混合物は、粒子中に存在する全脂質の最大約４０、５０または６０ｍｏｌ％を含み得る。

【0166】

粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、以下の１つ以上を含み得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、またはそれらの混合物。１つの特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートのいずれかを含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートは、ＣＰＬと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むＰＥＧ－脂質を含み得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、またはそれらの混合物であり得る。

【0167】

本発明での使用に適した追加のＰＥＧ－脂質コンジュゲートには、ｍＰＥＧ２０００－１，２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ ０８／８８６７６号に記載されている。本発明での使用に適したなおさらなるＰＥＧ－脂質コンジュゲートには、１－［８’－（１，２－ジミリストイル－３－プロパノキシ）－カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－ω－メチル－ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）が含まれるが、これらに限定されない。２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されている。

【0168】

いくつかの場合、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９もしくは２ｍｏｌ％（またはその任意の画分もしくは範囲）を含み得る。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の画分もしくは範囲）を含み得る。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。

【0169】

他の実施形態では、組成物は、正電荷担体とは異なる、少なくとも１つの正電荷担体および少なくとも１つの負電荷担体を含有する両性リポソームを含み、リポソームの等電点は４～８である。この目的は、リポソームがｐＨ依存性の変化する電荷を用いて調製されるという事実によって達成される。

【0170】

所望の特性を有するリポソーム構造は、例えば、膜形成または膜ベースのカチオン性電荷担体の量が低ｐＨではアニオン性電荷担体の量を超え、高ｐＨでは比が逆転する場合に形成される。これは、イオン化可能な成分が４～９のｐＫａ値を有する場合に常に当てはまる。媒体のｐＨが低下すると、すべてのカチオン性電荷担体がより多く帯電し、すべてのアニオン性電荷担体が電荷を失う。

【0171】

両性リポソームに有用なカチオン性化合物としては、本明細書で前述したカチオン性化合物が挙げられる。強カチオン性化合物は、例えば、限定されないが、以下を含み得る。ＤＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’－ジメチルメタン）カルバモイル］コレステロール、ＴＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－トリメチルアミノエタン）コレステロール、ＢＧＳＣビスグアニジニウム－スペルミジン－コレステロール、ＢＧＴＣビス－グアニジニウム－トレン－コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＳＰＥＲ（１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）－プロピルアルニド、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））、ＤＯＲＩＥ １，２－ジオレオイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＳＣ（１，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセリルコリンエステル）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－スクシニル－２－ヒドロキシエチルジスルフィドオミチン）、ＤＤＡＢジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ＤＯＧＳ（（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリコール－スペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリシン、ＣＴＡＢセチルトリメチルアルモニウムブロミド、ＣｐｙＣセチルピリジニウムクロリド、ＤＯＥＰＣ、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリンまたは他のＯ－アルキル－ホスファチジルコリンまたはエタノールアミン、リジン、アルギニンまたはオルニチンからのアミドおよびホスファチジルエタノールアミン。

【0172】

弱カチオン性化合物の例としては、限定されないが、以下が挙げられる。Ｈｉｓ－Ｃｈｏｌ（ヒスタミニル－コレステロールヘミスクシネート）、Ｍｏ－Ｃｈｏｌ（モルホリン－Ｎ－エチルアミノ－コレステロールヘミスクシネート）、またはヒスチジニル－ＰＥ。

【0173】

中性化合物の例としては、コレステロール、セラミド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、またはジアシルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。

【0174】

両性リポソームに有用なアニオン性化合物には、本明細書で前述した非カチオン性化合物が含まれる。弱アニオン性化合物の例としては、限定されないが、以下を挙げることができる。ＣＨＥＭＳ（コレステロールヘミスクシネート）、炭素数８から２５のアルキルカルボン酸、またはジアシルグリセロールヘミスクシネート。さらなる弱アニオン性化合物は、アスパラギン酸またはグルタミン酸およびＰＥのアミド、ならびにＰＳおよびグリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸または他のアミノ酸もしくはアミノジカルボン酸を有するそのアミドを含むことができる。同様の原理により、ヒドロキシカルボン酸またはヒドロキシジカルボン酸とＰＳとのエステルも弱アニオン性化合物である。

【0175】

いくつかの実施形態では、両性リポソームは、本明細書中上記で記載されるものなどのコンジュゲート脂質を含有する。有用なコンジュゲート脂質の特定の例には、ＰＥＧ改変ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ改変ジアルキルアミンおよびＰＥＧ改変１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの特定の例は、ＰＥＧ改変ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールである。

【0176】

いくつかの実施形態では、中性脂質は、粒子に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む。

【0177】

いくつかの場合、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９もしくは２ｍｏｌ％（またはその任意の画分もしくは範囲）を含む。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の画分もしくは範囲）を含み得る。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。

【0178】

中性脂質およびコンジュゲート脂質の総量を考慮すると、両性リポソームの残りの残部は、様々な比率で製剤化されたカチオン性化合物とアニオン性化合物の混合物を含むことができる。カチオン性脂質対アニオン性脂質の比は、核酸カプセル化、ゼータ電位、ｐＫａ、または帯電した脂質成分の存在に少なくとも部分的に依存する他の物理化学的特性の所望の特性を達成するために選択され得る。

【0179】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）などの真核細胞における送達および取り込みを特異的に増強する組成物を有する。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓または特に肝細胞における送達および取り込みを特異的に増強する組成物を有する。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、神経細胞における送達および取り込みを特異的に増強する組成物を有する。

【0180】

２．４ 組換えウイルスの作製方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用するための組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）を提供する。組換えＡＡＶは、典型的には、ＨＥＫ－２９３などの哺乳動物細胞株で作製される。ウイルスのｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、その自己複製を防止して治療遺伝子（例えば、ヌクレアーゼ遺伝子）を送達する余地を作るためにベクターから除去されるので、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供する必要がある。さらに、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイルス）成分を提供する必要がある（Ｃｏｔｓら（２０１３）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－８１）。多くの場合、組換えＡＡＶは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、ならびにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドで細胞株をトランスフェクトするトリプルトランスフェクションを使用して作製される。次いで、カプシドに包まれたゲノム（目的のＩＴＲおよび介在遺伝子）を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、または当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心法またはアフィニティークロマトグラフィを用いて精製し、続いて目的の遺伝子に細胞、組織またはヒト患者などの生物に送達する。

【0181】

組換えＡＡＶは典型的には細胞内で作製される（製造される）ので、ＭＴＥＭがパッケージング細胞内で発現されないことを確実にするために、本発明を実施する際に注意を払わなければならない。本発明のウイルスゲノムはヌクレアーゼの認識配列を含み得るので、パッケージング細胞株で発現される任意のヌクレアーゼは、ウイルス粒子にパッケージングされ得る前にウイルスゲノムを切断することができ得る。これは、パッケージング効率の低減および／または断片化されたゲノムのパッケージングをもたらす。パッケージング細胞におけるヌクレアーゼ発現を防止するために、いくつかのアプローチを使用することができる。

【0182】

ＭＴＥＭは、ＭＴＥＭの発現に適した任意のプロモータの制御下に置くことができる。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、またはプロモータは組織特異的プロモータ、例えば筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓β細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。

【0183】

特定の実施形態では、ＭＴＥＭは、パッケージング細胞中で活性でない組織特異的プロモータの制御下に置くことができる。例えば、筋肉組織へのヌクレアーゼ遺伝子の送達のためにウイルスベクターを開発する場合、筋肉特異的プロモータを使用することができる。筋肉特異的プロモータの例には、Ｃ５－１２（Ｌｉｕら、（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａら、（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６－８８）、または平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅら、（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）が含まれる。ＣＮＳ（ニューロン）特異的プロモータの例としては、ＮＳＥ、シナプシンおよびＭｅＣＰ２プロモータ（Ｌｅｎｔｚら（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９－８８）が挙げられる。肝臓特異的プロモータの例としては、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂなど）、ヒトα１－アンチトリプシン（Ｐａ１ＡＴなど）およびヘモペキシン（Ｐｈｐｘなど）（Ｋｒａｍｅｒら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３７５－８５）、ハイブリッド肝臓特異的プロモータ（ＡｐｏＥ遺伝子由来の肝臓遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ－ＨＣＲ）および肝臓特異的α１－アンチトリプシンプロモータ）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータおよびアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータが挙げられる。眼特異的プロモータの例には、オプシン、および角膜上皮特異的Ｋ１２プロモータが含まれる（Ｍａｒｔｉｎら、（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇら、（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，９：９５６－６６）。これらのプロモータ、または当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ－２９３細胞中で高度に活性ではなく、したがって、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞中で有意なレベルのヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは予想されない。同様に、本発明のウイルスベクターは、適合しない組織特異的プロモータ（すなわち、周知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）および肝臓特異的ヘモペキシンプロモータの使用）の使用を伴う他の細胞株の使用を企図する。組織特異的プロモータの他の例としては、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、および一遺伝子性奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が挙げられる。（Ｊａｃｏｘら、（２０１０）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。

【0184】

あるいは、組換えウイルスは、ヌクレアーゼが発現される可能性が低い異なる種由来の細胞にパッケージングすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物パッケージング細胞では活性ではない周知のサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０ウイルス初期プロモータなどの哺乳動物プロモータを使用して、微生物、昆虫または植物細胞で作製することができる。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、Ｇａｏら（Ｇａｏら、（２００７）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８－４３）によって記載されているバキュロウイルス系を使用して昆虫細胞中で作製される。哺乳動物プロモータの制御下にあるヌクレアーゼは、これらの細胞で発現される可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅら（２０１３）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９－４９）。さらに、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。したがって、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンなどの哺乳動物イントロンをヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞内のプレｍＲＮＡ転写物から効率的にスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的ヌクレアーゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライシングし、機能的ヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、昆虫パッケージング細胞における毒性タンパク質バルナーゼおよびジフテリア毒素断片Ａの発現を減弱させるためのＨＧＨおよびＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用を報告しており、これらの毒素遺伝子を有する組換えＡＡＶベクターの作製を可能にしている（Ｃｈｅｎ，Ｈら（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
ＭＴＥＭ遺伝子は、小分子誘導物質がヌクレアーゼ発現に必要とされるように、誘導性プロモータに作動可能に連結され得る。誘導性プロモータの例としては、Ｔｅｔ－Ｏｎ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃｈｅｎら、（２０１５）、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））およびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ系（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ、Ｓｏｗａら（２０１１）、Ｓｐｉｎｅ、３６（１０）：Ｅ ６２３～８）が挙げられる。両方の系、ならびに当技術分野で公知の同様の系は、小分子活性化因子（それぞれドキシサイクリンまたはエクジソン）に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサーおよびエクジソン受容体の変異体）に依存する。そのようなリガンド誘導性転写活性化因子を使用して本発明を実施することは、１）転写因子に対する（１つまたは複数の）結合部位を有するヌクレアーゼ遺伝子を、対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に置くこと、および２）転写因子をコードする遺伝子をパッケージ化されたウイルスゲノムに含めることを含む。後者の工程は、転写活性化因子も同じ細胞に提供されない場合、組換えＡＡＶ送達後にヌクレアーゼが標的細胞または組織で発現されないので必要である。次いで、転写活性化因子は、同族小分子活性化因子で処理された細胞または組織においてのみヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつどの組織に送達されるかを選択することによって、ヌクレアーゼ遺伝子発現を時空間的に調節することを可能にするので有利である。しかしながら、ウイルスゲノムに誘導物質を含める必要性は、運搬能力が著しく制限され、このアプローチに欠点をもたらす。

【0185】

別の特定の実施形態では、組換えＡＡＶは、ヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサーを発現する哺乳動物細胞株で作製される。転写リプレッサーは当技術分野で公知であり、Ｔｅｔリプレッサー、Ｌａｃリプレッサー、Ｃｒｏリプレッサーおよびλリプレッサーが挙げられる。エクジソン受容体などの多くの核ホルモン受容体は、それらの同族ホルモンリガンドの非存在下で転写リプレッサーとしても作用する。本発明を実施するために、パッケージング細胞は、転写リプレッサーをコードするベクターでトランスフェクト／形質導入され、ウイルスゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子（パッケージングベクター）は、リプレッサーがプロモータをサイレンシングするように、リプレッサーに対する結合部位を含むように改変されたプロモータに作動可能に連結される。転写リプレッサーをコードする遺伝子は、様々な位置に配置することができる。これは、別個のベクター上でコードすることができ、ＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込むことができ、ｃａｐ／ｒｅｐベクターまたはアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むことができ、または構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。転写リプレッサー部位を組み込むように一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎは、強力な構成的ＣＭＶおよびＲＳＶプロモータを、Ｌａｃリプレッサーのオペレーターを含むように改変し、改変されたプロモータからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞中で大きく減弱されることを示した（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ（１９９６）、Ｇｅｎｅ １８３：１３７～４２）。非ヒト転写リプレッサーの使用は、ヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッサーを発現するパッケージング細胞中でのみ抑制され、得られた組換えＡＡＶベクターで形質導入された標的細胞または組織では抑制されないことを確実にする。

【0186】

２．５ 遺伝子改変細胞の作製方法
本発明は、ヒトｍｔＤＮＡなどのｍｔＤＮＡ内に見出される認識配列に結合して切断する操作されたメガヌクレアーゼを含むＭＴＥＭを使用して、インビトロおよびインビボの両方で遺伝子改変細胞を作製する方法を提供する。そのような認識配列での切断は、切断部位でのＮＨＥＪ、相同組換えによる外因性配列の挿入、またはｍｔＤＮＡの分解を可能にし得る。

【0187】

本発明は、本発明のＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードする核酸が、真核細胞（例えば、ヒト細胞）などの細胞に送達され得る（すなわち、導入される）ことを含む。

【0188】

本発明のＭＴＥＭは、タンパク質の形態で、または好ましくはＭＴＥＭをコードする核酸として細胞に送達することができる。そのような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状または線状プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。したがって、本明細書に開示されるＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが本明細書で提供される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。本明細書に開示されるＭＴＥＭをコードするポリヌクレオチドは、プロモータに作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＭＴＥＭをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む発現カセットが提供される。

【0189】

ＭＴＥＭコード配列は、ＤＮＡ形態で送達される実施形態の場合、ＭＴＥＭコード配列の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結されるべきである。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎら、（１９８４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６５９－６３）、ＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４－１０）、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１αプロモータ、またはＵｂＣプロモータなどの構成的プロモータ、ならびにテトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎら（１９９２）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４５）などの誘導性プロモータが含まれる。本発明のＭＴＥＭはまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータとしては、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号）を挙げることができるが、これに限定されない。特定の実施形態では、本発明のＭＴＥＭをコードする核酸配列は、組織特異的プロモータ、例えば筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓β細胞特異的プロモータに作動可能に連結される。

【0190】

特定の実施形態では、ＭＴＥＭをコードする核酸配列は、組換えＤＮＡ構築物または発現カセット上に送達される。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータおよび本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現カセット（すなわち、「カセット」）を含むことができる。

【0191】

いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低減するので、ＭＥＴＭをコードするｍＲＮＡは細胞に送達される。

【0192】

ＭＥＴＭをコードするそのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写などの当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、７－メチル－グアノシン、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）（米国特許第７，０７４，５９６号）、ＣＬＥＡＮＣＡＰ（登録商標）類似体、例えばＣａｐ １類似体（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて５’キャップされるか、またはワクシニアキャッピング酵素などを用いて酵素的にキャップされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡは、コードされたＭＴＥＭの発現および／またはｍＲＮＡ自体の安定性を高めるために、様々な５’および３’非翻訳配列エレメントを含有し得る。そのようなエレメントには、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメントなどの翻訳後調節エレメントが含まれ得る。ｍＲＮＡは、シュードウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ ６－メチルアデノシン、５－メチルウリジンまたは２－チオウリジンなどのヌクレオシド類似体または天然に存在するヌクレオシドを含有し得る。さらなるヌクレオシド類似体としては、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号に記載されているものが挙げられる。

【0193】

精製されたＭＴＥＭを細胞に送達して、本明細書でさらに詳述されるものを含む、当技術分野で公知の様々な異なる機構によってミトコンドリアＤＮＡを切断することができる。

【0194】

別の特定の実施形態では、本発明のＭＴＥＭをコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。一本鎖ＤＮＡは、ＭＴＥＭをコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、ＭＴＥＭをコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３’相同アームをさらに含むことができる。

【0195】

別の特定の実施形態では、本発明のＭＴＥＭをコードする遺伝子は、線状化ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。そのような線状化ＤＮＡ鋳型は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。例えば、ヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるように、１つ以上の制限酵素によって消化することができる。

【0196】

精製されたＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードする核酸を細胞に送達して、本明細書で以下にさらに詳述するものを含む、当技術分野で公知の様々な異なる機構によってミトコンドリアＤＮＡを切断することができる。

【0197】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、ＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡ、またはＭＴＥＭを発現する細胞は、既知の技術に従って、薬学的に許容される担体中で全身投与または標的組織への投与のために製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質／ＲＮＡ／ｍＲＮＡ／細胞は、典型的には薬学的に許容される担体と混合される。担体は、当然のことながら、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、患者に有害であってはならない。担体は、固体もしくは液体、またはその両方であり得、単位用量製剤として化合物と共に製剤化され得る。

【0198】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞取り込みを促進するために細胞透過性ペプチドまたは標的化リガンドに結合される。当該分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚら（２００５）、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６、およびＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９が挙げられる。代替的な実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ＭＴＥＭタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細胞によって内在化されるように、標的細胞上に発現される特定の細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合または非共有結合される。あるいは、ＭＴＥＭタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、そのような細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）に共有結合または非共有結合され得る。（ＭｃＣａｌｌら（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ ９４４４４９、Ｄｉｎｄａら（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４、Ｋａｎｇら（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０、Ｑｉａｎら（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．＼１０（１１）：１４９１－５０８）。

【0199】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、生分解性ヒドロゲル内にカプセル化される。ヒドロゲルは、頻繁な注射を必要とせずに標的組織の所望の領域への治療ペイロードの持続的かつ調節可能な放出を提供することができ、刺激応答性材料（例えば、温度およびｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的または外部から加えられたキューに応答してペイロードを放出するように設計することができる（Ｋａｎｇ Ｄｅｒｗｅｎｔら（２００８）Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１０６：２０６－２１４）。

【0200】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法（Ｓｈａｒｍａら（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）を使用して、ナノ粒子に共有結合もしくは好ましくは非共有結合されるか、またはそのようなナノ粒子内にカプセル化される。ナノ粒子は、長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満であるナノスケール送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、または生物学的巨大分子で構成されたコアを使用して設計することができ、複数コピーのヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡをナノ粒子コアに結合またはカプセル化することができる。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させ、したがって、各ＭＴＥＭの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性を最大にする。そのようなナノ粒子の表面は、ポリマーまたは脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質）でさらに改変されて、その表面が細胞送達およびペイロードの取り込みを増強するための追加の機能性を付与するコア－シェルナノ粒子を形成し得る（Ｊｉａｎら（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１－３０）。ナノ粒子は、ナノ粒子を適切な細胞型に指向させるために、および／または細胞取り込みの可能性を高めるために、標的化分子にさらに有利に結合され得る。そのような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体および細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）が挙げられる。

【0201】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭまたはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されるか、カチオン性脂質（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｚｕｒｉｓら（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０、Ｍｉｓｈｒａら（２０１１）、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、２０１１：８６３７３４を参照のこと）を使用して複合体化される。リポソームおよびリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的部位での蓄積および保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合および／または破壊を通じて細胞取り込みおよび送達効率を促進することができる。

【0202】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内にカプセル化されるか、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉら（２０１１）、Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３～５３６）。ポリマー担体は、ポリマー侵食および薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度を提供するように設計することができ、高い薬物カプセル化効率は、所望の標的細胞集団への細胞内送達まで治療ペイロードの保護を提供することができる。

【0203】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔｏｎｇら（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５６－６６）。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、非特異的相互作用を低減することができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。

【0204】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与および／または送達のためにエマルジョンまたはナノエマルジョン（すなわち、１ｎｍ未満の平均粒径を有する）に製剤化される。「エマルジョン」という用語は、水不混和性相が水相と混合された場合に、無極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成することができる脂質構造を含む、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、または油中水中油型の分散液または液滴を指すが、これらに限定されない。これらの他の脂質構造には、単層、少層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）、および多層の脂質小胞、ミセル、およびラメラ相が含まれるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相および親油性相（典型的には油および有機溶媒を含有する）から構成される。エマルジョンはまた、１つ以上の界面活性剤を含むことが多い。ナノエマルジョン製剤は、例えば、米国特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同第６，６３５，６７６号、同第６，５５９，１８９号および同第７，７６７，２１６号に記載されているように周知であり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0205】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはＭＴＥＭをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、およびポリマーデンドリマーに共有結合または非共有結合する（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓら（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇら（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デンドリマー生成は、ペイロード容量およびサイズを制御することができ、高いペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の表示を利用して、安定性を改善し、非特異的相互作用を低減し、細胞特異的標的化および薬物放出を増強することができる。

【0206】

いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドは、組換えウイルスを使用して細胞に導入される。そのような組換えウイルスは当技術分野で公知であり、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えＡＡＶが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉら（２０１３）Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２において概説されている）。本発明で有用な組換えＡＡＶは、標的細胞型へのウイルスの形質導入および標的細胞によるＭＴＥＭの発現を可能にする任意のカプシドまたは血清型を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶＨＳＣの血清型を有する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは標的組織に直接注入される。代替の実施形態では、組換えウイルスは、循環系を介して全身送達される。異なるＡＡＶが異なる組織に局在する傾向があり、特定の組織への優先的送達のために適切なＡＡＶカプシド／血清型を選択することができることは当技術分野で公知である。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である。他の実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である。さらに他の実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。ＡＡＶはまた、宿主細胞中で第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。組換えＡＡＶベクターによって送達されるポリヌクレオチドは、左（５’）および右（３’）逆方向末端反復を含み得る。

【0207】

一実施形態では、ＭＴＥＭをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドの送達に使用される組換えウイルスは、自己制限組換えウイルス（ｓｅｌｆ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ）である。自己制限組換えウイルスは、ウイルスゲノム内に操作されたメガヌクレアーゼの認識配列が存在するため、細胞または生物において限られた持続時間を有することができる。したがって、自己制限組換えウイルスを、プロモータ、本明細書に記載のＭＴＥＭ、およびＩＴＲ内のメガヌクレアーゼ認識部位のコードを提供するように操作することができる。自己制限組換えウイルスは、ＭＴＥＭが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように、メガヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、または生物に送達する。送達されたメガヌクレアーゼはまた、自己制限組換えウイルス自体の中にその標的部位を見つけ、この標的部位でウイルスゲノムを切断する。切断されると、ウイルスゲノムの５’および３’末端が露出され、エキソヌクレアーゼによって分解され、したがってウイルスが死滅し、ＭＴＥＭの作製が停止する。

【0208】

ＭＴＥＭをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドがＤＮＡ形態（例えば、プラスミド）で、および／またはウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能に連結されなければならない。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスベクター由来の内因性プロモータ（例えばレンチウイルスベクターのＬＴＲ）または本明細書の他の箇所に記載されている構成的もしくは組織特異的プロモータなどのウイルスプロモータであり得る。特定の実施形態では、ＭＴＥＭをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドは、神経細胞、筋細胞、膵臓細胞、眼細胞などの標的細胞中で遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓β細胞であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓β細胞の集団であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋管細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓β細胞の集団であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓β細胞の集団である。

【0209】

いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば上記の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞または真核細胞集団に導入することによって、遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変真核細胞集団を作製する方法が本明細書で提供される。真核細胞または真核細胞集団で発現すると、操作されたメガヌクレアーゼはミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合し、切断部位を生成する。操作されたメガヌクレアーゼによって生成された切断部位は、切断部位での核酸の挿入または欠失をもたらし得るＮＨＥＪ修復経路によって修復され得る。追加的または代替的に、真核細胞または真核細胞集団のミトコンドリアゲノム内の操作されたメガヌクレアーゼによって生成された切断部位は、代替非相同末端結合（Ａｌｔ－ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）によって修復され得る。ＮＨＥＪまたはＡｌｔ－ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪは、切断部位での核酸の挿入および／または欠失をもたらし得る。特に、ＮＨＥＪまたはＡｌｔ－ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪは、切断部位に１～１０００（例えば、１～１０、１０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８０、８００～９００または９００～１０００）ヌクレオチド、例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５または１０００ヌクレオチドの挿入および／または欠失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変真核細胞または本明細書に開示される遺伝子改変真核細胞集団中のミトコンドリアゲノムを分解することができる。いくつかのそのような実施形態では、認識配列を含むミトコンドリアゲノムの割合は、対照細胞と比較して、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％低下するか、または約３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％もしくはそれ以上分解されることができる。特定の実施形態では、配列番号３のＭＴＥＭ認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムが分解される。ＭＴＥＭ認識配列を有する突然変異ミトコンドリアゲノムを分解することにより、突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの全体的な比は、本明細書に開示されるＭＴＥＭの投与または発現後に増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一の遺伝子改変真核細胞または集団の遺伝子改変真核細胞における突然変異ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する。

【0210】

特定の実施形態では、本明細書に開示される単一の遺伝子改変真核細胞または本明細書に開示される遺伝子改変真核細胞の集団における野生型ゲノムの割合は、配列番号３を含む突然変異ミトコンドリアゲノムがＭＴＥＭによって認識され、切断され、分解されるにつれて増加し得る。本明細書に開示される遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変細胞集団における野生型ミトコンドリアゲノムの割合は、本明細書に開示されるＭＴＥＭを発現しない真核細胞または真核細胞集団と比較した場合、遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変細胞集団における全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上であり得る。同様に、遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変細胞集団における配列番号３の認識配列を含む突然変異ミトコンドリアゲノムの割合は、本明細書に開示されるＭＴＥＭを発現しない真核細胞または真核細胞集団と比較した場合、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少し得る。

【0211】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変真核細胞集団におけるミトコンドリア呼吸は、本明細書に開示されるＭＴＥＭを発現しない真核細胞と比較した場合、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加し得る。本明細書に開示される遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変真核細胞集団におけるミトコンドリア呼吸は、本明細書に開示されるＭＴＥＭを発現しない真核細胞または真核細胞集団と比較した場合、約３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％またはそれ以上増加し得る。

【0212】

ある特定の場合において、認識配列は、ミトコンドリア障害に関連するミトコンドリアゲノムの領域内にある。

【0213】

正常なｍｔＤＮＡおよび突然変異したｍｔＤＮＡの両方が同じ細胞に存在することができ、これはヘテロプラスミーとして知られる状況である。欠損ミトコンドリアの数は、正常ミトコンドリアの数よりも多くてもよい。突然変異が有意な割合のｍｔＤＮＡに影響を及ぼすまで、症状は所与の世代では現れない可能性がある。異なる組織における正常および突然変異ｍｔＤＮＡの不均一な分布は、同じファミリーのメンバーにおける異なる器官に影響を及ぼし得る。これは、罹患したファミリーに様々な症状をもたらし得る。

【0214】

特定の実施形態では、真核細胞または真核細胞集団のミトコンドリアゲノムに本明細書に開示される認識配列は、ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド８４７０と１３，４４７との間に位置する。特定の実施形態では、真核細胞または真核細胞集団のミトコンドリアゲノム内の認識配列は、ヌクレオチド８４６０と８５８０との間またはヌクレオチド１３，４３７と１３，４５７との間に位置する。特定の実施形態では、配列番号３の認識配列は、突然変異ミトコンドリアゲノム上にのみ位置する。遺伝子改変真核細胞または遺伝子改変真核細胞集団で発現すると、ＭＴＥＭはミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合し、切断部位を生成することができる。したがって、変異ゲノム上にのみ位置する認識配列を標的とすることによって、ゲノムを切断し、続いて分解することができる。突然変異ミトコンドリアゲノムのこの特異的分解は、ミトコンドリア障害（例えば、ミトコンドリア共通欠失障害（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）またはＭＥＬＡＳ）の症状の処置または緩和を助けるために使用することができる。

【0215】

したがって、本明細書に開示されるＭＴＥＭをコードする核酸配列またはＭＴＥＭを含むポリヌクレオチドを標的細胞または集団に送達することによって、標的細胞または標的細胞の集団中の突然変異ミトコンドリアゲノムを分解するための方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団は突然変異ミトコンドリアゲノムを含み、ＭＴＥＭはＭＴＥＭ認識配列（例えば、配列番号３）を認識および切断する。標的細胞または標的細胞集団は、ヒト対象などの哺乳動物対象であり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓β細胞であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓β細胞の集団であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋管細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓β細胞の集団であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓β細胞の集団である。

【0216】

対象のミトコンドリア障害に関連する状態を処置する方法が本明細書に開示される。そのような方法は、本明細書に開示される治療有効量のＭＴＥＭをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド、または治療有効量のＭＴＥＭを対象に投与することを含み、ＭＴＥＭは、ミトコンドリア欠失を有する突然変異ミトコンドリアゲノム中の配列番号３の認識配列の切断部位を生成する。突然変異ミトコンドリアゲノムで生成された切断部位は、突然変異ミトコンドリアゲノムの分解をもたらし得る。特定の実施形態では、処置することは、ミトコンドリア障害に関連する状態の少なくとも１つの症状を低減または緩和することを含む。例えば、ｍｔＤＮＡ共通欠失の症状には、ミオパシー、アルツハイマー病、ピアソン症候群、皮膚の光老化、カーンズ・セイアー症候群（ＫＳＳ）、または慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）の任意の症状が含まれるが、これらに限定されない。具体的には、ｍｔＤＮＡ共通欠失の症状には、色素性網膜症、およびＰＥＯ、小脳性運動失調、知能障害（知的障害、認知症、またはその両方）、感音性難聴、下垂症、中咽頭および食道機能障害、運動不耐性、筋力低下、心伝導ブロック、内分泌障害、鉄芽球性貧血および膵臓外分泌機能障害、下垂症、外眼筋の麻痺による眼球運動障害（眼筋麻痺）、中咽頭脱力、または運動不耐性を伴う様々な重度の近位肢脱力が含まれ得る。いくつかの実施形態では、状態は、骨髄、膵臓、筋肉、骨格筋、中枢神経系、眼または耳の状態である。いくつかの実施形態では、状態は、ピアソン症候群、カーンズ・セイアー症候群（ＫＳＳ）、進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）、糖尿病または腎機能障害である。

【0217】

いくつかの実施形態では、対象に、ＭＴＥＭをコードする核酸の約１×１０^１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０^１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１×１０^１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または１×１０^１４ｇｃ／ｋｇ）の用量で本明細書に開示される医薬組成物を投与する。いくつかの実施形態では、対象に、ＭＴＥＭをコードする核酸の少なくとも約１×１０^１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０^１４ｇｃ／ｋｇの用量で医薬組成物を投与する。いくつかの実施形態では、対象に、ＭＴＥＭをコードする核酸の約１×１０^１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、約１×１０^１１ｇｃ／ｋｇ～約１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ～約１×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０^１３ｇｃ／ｋｇ～約１×１０^１４ｇｃ／ｋｇの用量で医薬組成物を投与する。ある特定の実施形態では、対象に、ＭＴＥＭをコードする核酸の約１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ～約９×１０^１３ｇｃ／ｋｇ（例えば、約１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約２×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約３×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約４×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約６×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約７×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約８×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約９×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、約２×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、約３×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、約４×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、約５×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、約６×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、約７×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、約８×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または約９×１０^１３ｇｃ／ｋｇ）の用量で医薬組成物を投与する。

【0218】

いくつかの実施態様では、対象に、ＭＴＥＭをコードするｍＲＮＡの約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子製剤を投与する。いくつかの実施態様では、対象に、ＭＴＥＭをコードするｍＲＮＡの少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子製剤を投与する。いくつかの実施態様では、対象に、ＭＴＥＭをコードするｍＲＮＡの約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇ内の用量で脂質ナノ粒子製剤を投与する。

【0219】

本発明のＭＴＥＭまたは本発明のＭＴＥＭをコードする核酸の送達のための標的組織には、神経組織、筋肉組織、神経筋組織、膵臓組織、および眼／網膜組織が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、送達のための標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓β細胞であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓β細胞の集団であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋管細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓β細胞の集団であり、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓β細胞の集団である。

【0220】

本明細書に記載の方法の様々な実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＭＴＥＭ、そのようなＭＴＥＭをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなＭＴＥＭをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスは、当技術分野で公知の任意の適切な投与経路を介して投与することができる。したがって、本明細書に記載される１つ以上のＭＴＥＭ、そのようなＭＴＥＭをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなＭＴＥＭをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、肝臓内、経粘膜、経皮、動脈内、および舌下を含む投与経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭ、またはｍＲＮＡ、またはＤＮＡベクターＭＴＥＭは、標的組織への直接注射を介して標的細胞（例えば、神経細胞、筋細胞、膵臓細胞、眼細胞など）に供給される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、幹細胞、ＣＤ３４＋ＨＳＣ、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、腎臓細胞、骨髄細胞、または耳毛細胞である。ＭＴＥＭ、そのようなＭＴＥＭをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなＭＴＥＭをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスの他の適切な投与経路は、必要に応じて処置医によって容易に決定され得る。

【0221】

いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭを、それを必要とする対象に投与する。必要に応じて、ＭＴＥＭの投与量または投与頻度は、投与する医師の判断に基づいて、処置の経過にわたって調整され得る。適切な用量は、他の要因の中でも、選択される任意のＡＡＶの詳細（例えば、血清型など）、投与経路、処置される対象（すなわち、対象の年齢、体重、性別および全身状態）、および投与様式に依存する。したがって、適切な投与量は患者によって異なり得る。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。さらに、対象は、適切な用量数だけ投与され得る。当業者は、適切な用量数を容易に決定することができる。投与量は、代替的な投与経路を考慮に入れるか、または治療上の利益となんらかの副作用とのバランスをとるように調整する必要があり得る。

【0222】

本発明の外因性核酸分子は、前述の手段のいずれかによって細胞に導入され、および／または対象に送達され得る。特定の実施形態では、外因性核酸分子は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または組換えＡＡＶなどの組換えウイルスによって導入される。外因性核酸分子を導入するのに有用な組換えＡＡＶは、本明細書で前述した血清型／カプシドを含む、ウイルスの細胞への形質導入および外因性核酸分子配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。組換えＡＡＶはまた、宿主細胞中で第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る。組換えＡＡＶを使用して導入された外因性核酸分子は、５´（左）および３´（右）逆方向末端反復に隣接することができる。

【0223】

別の特定の実施形態では、外因性核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、外因性核酸分子を含むことができ、特定の実施形態では、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するために５’および３’相同アームを含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、５’相同アームの５’上流に５’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、および３’相同アームの３’下流に３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含むことができる。

【0224】

別の特定の実施形態では、本発明のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよび／または本発明の外因性核酸分子は、線状化ＤＮＡ鋳型によるトランスフェクションによって細胞に導入することができる。ＭＴＥＭおよび／または外因性核酸分子をコードするプラスミドＤＮＡは、例えば、環状プラスミドＤＮＡが細胞へのトランスフェクションの前に線状化されるように、１つ以上の制限酵素によって消化することができる。

【0225】

細胞に送達される場合、本発明の外因性核酸は、前述の哺乳動物プロモータおよび誘導性プロモータを含む、細胞におけるコードされたポリペプチドの発現に適した任意のプロモータに作動可能に連結され得る。本発明の外因性核酸はまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータとしては、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号）を挙げることができるが、これに限定されない。

【0226】

２．６ 変異体
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の変異体を包含する。

【0227】

本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味することを意図している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１つ以上の内部部位での１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは付加、および／または天然ポリペプチドの１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換による、「天然」ポリペプチドに由来するポリペプチドを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態に包含される変異体ポリペプチドは、生物学的に活性である。すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、例えば、ｍｔＤＮＡ（例えば、ヒトｍｔＤＮＡ）に見られる認識配列、例えばＭＩＴ １１－１２認識配列（配列番号３）に結合して切断する能力を保持し続ける。そのような変異体は、例えば、人間の操作から生じ得る。いくつかの実施形態では、実施形態の天然ポリペプチドの生物学的に活性な変異体（例えば、配列番号２または４）、または本明細書に記載の認識半部位結合サブユニットの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される場合、天然ポリペプチド、天然サブユニット、天然ＨＶＲ１、または天然ＨＶＲ２のアミノ酸配列と少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチドまたはサブユニットの生物学的に活性な変異体は、わずか約１～４０アミノ酸残基、わずか約１～２０アミノ酸残基、わずか約１～１０アミノ酸残基、わずか約５アミノ酸残基、わずか４アミノ酸残基、３アミノ酸残基、２アミノ酸残基、またはさらには１アミノ酸残基だけ、そのポリペプチドまたはサブユニットと異なり得る。

【0228】

実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む様々な方法で変化し得る。そのような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列突然変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびポリヌクレオチド変化のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２、米国特許第４，８７３，１９２号、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が最適であり得る。

【0229】

いくつかの実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に開示されるＨＶＲ１およびＨＶＲ２領域の変異体を含むことができる。親ＨＶＲ領域は、例えば、例示の操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０を含むことができる。したがって、変異体ＨＶＲは、変異体ＨＶＲ領域が操作されたメガヌクレアーゼの生物学的活性（すなわち、認識配列への結合および切断）を維持するように、本明細書に例示される操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、変異体ＨＶＲ１領域または変異体ＨＶＲ２領域は、親ＨＶＲ内の特定の位置に見られるアミノ酸残基に対応する残基を含むことができる。この文脈において、「に対応する」とは、変異体ＨＶＲ中のアミノ酸残基が、同じ相対位置で（すなわち、親配列中の残りのアミノ酸に関して）親ＨＶＲ配列中に存在する同じアミノ酸残基（すなわち、別個の同一の残基）であることを意味する。例として、親ＨＶＲ配列が位置２６にセリン残基を含む場合、残基２６に「対応する残基を含む」変異型ＨＶＲはまた、親の位置２６に対して相対的な（すなわち、対応する）位置にセリンを含む。

【0230】

特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２または４の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有するＨＶＲ１を含む。

【0231】

ある特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２または４の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有するＨＶＲ２を含む。

【0232】

野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当数のアミノ酸改変が以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、これは単独でまたは組み合わせて、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で特異性が変化した操作されたメガヌクレアーゼをもたらし、その結果、得られた合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型酵素とは異なる半部位特異性を有する。表１は、認識半部位の各半部位位置（－１から－９）に存在する塩基に基づいて特異性を高めるために操作されたメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットにおいて行われ得る潜在的な置換を提供する。そのような置換は、本明細書に開示されるメガヌクレアーゼの変異体に組み込まれる。

【0233】

【表1】

【0234】

太字のエントリは野生型接触残基であり、本明細書で使用される「改変」の構成要素とはならない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖上の塩基と接触することを示す。

【0235】

ＤＮＡ結合親和性および／または活性を調節するために、操作されたメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットにおいてある特定の改変を行うことができる。例えば、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットは、配列番号１（国際公開第２００９００１１５９号）のＩ－ＣｒｅＩの位置１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡ、Ｉ－ＣｒｅＩの位置６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤ、および／またはＩ－ＣｒｅＩの位置８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含むことができる（米国特許第８０２１８６７号）。

【0236】

ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体は、遺伝暗号の縮退のために、実施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。変異体ポリヌクレオチドには、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるが、依然として実施形態の操作されたメガヌクレアーゼまたは外因性核酸分子または鋳型核酸をコードするものなどの合成由来ポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される場合、その特定のポリヌクレオチドに対する少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体（すなわち、参照ポリヌクレオチド）もまた、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性の比較によって評価することができる。

【0237】

本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、ポリペプチドの特徴に根本的な変化をもたらすとは予想されない。しかしながら、そうする前に置換、欠失または挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、当業者は、ＭＩＴ １１－１２認識配列（配列番号３）などのヒトｍｔＤＮＡ内に見出される認識配列に優先的に結合して切断するその能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによって効果が評価されることを理解するであろう。

【0238】

表２は、本明細書に開示される配列の概要である。

【0239】

【表2】

【実施例】

【0240】

本開示は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定として解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の物質および手順に対する多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0241】

実施例１；ミトコンドリアを標的とした操作されたメガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）構築物設計

【0242】

インシリコ予測および指向性進化法を使用して、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ点突然変異を認識するためにＩ－ＣｒｅＩを操作した（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４４５，２５１号および米国特許出願第２０２００１０９３８３号を参照されたい）。ペプチドリンカーを使用して、両方のホモ二量体を単量体構造に融合した。ミトコンドリアが標的とされた操作されたメガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）の特異性を、図１Ａに記載される操作されたスプリットＧＦＰアッセイを使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で最初に確認した。

【0243】

突然変異（ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ）マウスｍｔＤＮＡ配列（ＡＴＡＡＧＧＡＴＴＧＴＡＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣ、配列番号３）を認識する操作されたメガヌクレアーゼを作製した。ＣＨＯ細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベースの二本鎖切断（ＤＳＢ）組換えアッセイを使用した操作されたメガヌクレアーゼの分析は、特定の操作されたメガヌクレアーゼ（本明細書ではＭＩＴ １１－１２と呼ばれる）が、意図された（変異）標的部位に対して試験した場合、約８０％のＧＦＰ＋細胞をもたらしたが、野生型標的部位に対して試験した場合、５％未満のＧＦＰ＋細胞をもたらしたことを示した（図１Ａ）。

【0244】

エクスビボ発現のために、ミトコンドリア局在化配列（ＭＬＳ）が異なる２つの変異体（ＣＦおよびＣＳＦ）を設計した。構築物の５´末端にミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）を用いて、Ｃｏｘ８［Ｃａｎｄａｓら（２０１６）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ １０８，ｐ．５３４１７に記載されているようなＣＦ構築物］またはＣｏｘ８／Ｓｕ９［Ｂａｃｍａｎ（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（１１）：ｐ．１６９６－１７００およびＰｅｒｅｉｒａら（２０１８）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１０（９）に記載されているようなＣＳＦ構築物］を構築した。ＦＬＡＧタグもまた、ＭＴＰと操作されたメガヌクレアーゼとの間に付加した（図１Ｂ）。

【0245】

ＨｅＬａ細胞をカバーガラス上に播種し、ＭＴＥＭで２４時間トランスフェクトした。細胞を２００ｎＭのＭＩＴＯＴＲＡＣＫＥＲ（商標）Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｍ７５１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、光から保護した。細胞を室温（ＲＴ）で１５分間、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。細胞を、リン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いてＲＴで２分間透過処理した。３％ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液をブロッキング剤としてＲＴで１時間使用した。２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：２００の濃度のＦＬＡＧに対する一次抗体（Ｆ３１６５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＲＴで１時間インキュベーションした。洗浄後、細胞を３％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：２００の濃度でヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ－１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体と共にＲＴで１時間インキュベートし、光から保護した。次いで、カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ含有封入剤（ＥＶＥＲＢＲＩＴＥ封入剤、Ｂｉｏｔｉｕｍ）を用いてスライドに封入した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影した。

【0246】

ＨｅＬａ細胞における一過性トランスフェクションは、両方のＭＴＥＭ構築物がミトコンドリアに局在するタンパク質を合成したことを示した（ＣＳＦ構築物の代表的な細胞を示す、図１Ｃ）。ウエスタンブロットにより、ＣＦ構築物およびＣＳＦ構築物の両方が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後に予想サイズのタンパク質を発現することが確認された（図１Ｄ）。ウエスタンブロットのパターンは、ＣＳＦトランスフェクト細胞に偽バンド（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｂａｎｄ）を示さなかったので、ＣＳＦ変異体をその後の実験のために選択した。

【0247】

実施例２；動物モデルおよび線維芽細胞

【0248】

ｔＲＮＡ^Ａｌａ遺伝子にｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ点突然変異を有するヘテロプラスミーマウスモデルを使用して、ＭＴＥＭ構築物の有効性を評価した。このマウスモデルは以前に特徴付けられており（Ｂａｃｍａｎら（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（１１）：ｐ．１６９６－１７００、Ｋａｕｐｐｉｌａら（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１６（１１）：ｐ．２９８０－２９９０、およびＧａｍｍａｇｅら（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（１１）：ｐ．１６９１－１６９５）、突然変異レベルが組織内で５０％を超える場合に、２歳で軽度の心筋症、ならびに低減したｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａレベルを示す。このマウスに由来するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、突然変異ｍｔＤＮＡのレベルについて特徴付け、ヒトパピローマウイルスのＥ６－Ｅ７遺伝子で不死化した（Ｂａｃｍａｎ、２０１８、前出）。対照として使用した野生型動物および野生型肺線維芽細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するマウスに由来した。高レベルの突然変異を有するＭＥＦ株を作製するために、ＷＴ ｍｔＤＮＡを標的とするｍｉｔｏＴＡＬＥＮを設計した。ＭＥＦにｍｉｔｏＴＡＬＥＮをトランスフェクトし、選別し、クローンを成長させ、高レベルの突然変異ｍｔＤＮＡについて試験した（Ｂａｃｍａｎ、２０１８、前出）。

【0249】

製造業者のプロトコルを使用して、ＧＥＮＪＥＴ（商標）ＤＮＡインビトロトランスフェクション試薬（第ＩＩ版、ＳＬ １００４８９、ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ヘテロプラスミーＭＥＦをトランスフェクトした。８０％コンフルエンスのＴ７５フラスコに播種した細胞を、ＭＴＥＭ ＣＦまたはＣＳＦプラスミド（２０μｇ）と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド（１０μｇ）との２：１の比の３０μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＵを用いて選別を行い、ＧＦＰ発現のために４８８ｎｍレーザーおよび５０５ＬＰ、５３０／３０フィルターセットを用いて単一細胞蛍光にゲーティングした。本明細書で黒色として示されるＧＦＰ発現を示さない集団、および本明細書で緑色として示されるＧＦＰ発現を示す集団に基づいて細胞を選別した。トランスフェクトされていない細胞を対照として使用した。

【0250】

トランスフェクション効率は比較的低かったため、ＭＴＥＭ発現プラスミドを、ＧＦＰを発現するプラスミドと同時トランスフェクトした（２ ＭＴＥＭ：１ ＧＦＰ比）。ＧＦＰ陽性細胞は、トランスフェクション後の全細胞集団の１１～２０％を構成していた。同時トランスフェクト細胞を、２４時間後にトランスフェクトされていない（黒色）集団とトランスフェクト（緑色）集団とにＦＡＣＳ選別した（図２Ａ）。ＰＣＲ／ＲＦＬＰを使用して、２つの独立した実験のトランスフェクトされていない細胞集団およびトランスフェクト細胞集団におけるｍｔＤＮＡヘテロプラスミー変化を決定した（図２Ｂ）。定量化は、トランスフェクトされていない集団と比較した場合、トランスフェクト集団ではヘテロプラスミーに大きなシフト（５０～６０％）があることを示した。ＧＦＰプラスミドのみでトランスフェクトされた細胞は、ヘテロプラスミーの変化を示さなかった。ＧＦＰ同時トランスフェクタントプラスミドを組み込んでいないが、ＭＴＥＭプラスミドを組み込んだ可能性がある集団に起因し得る、トランスフェクトされていない細胞集団にわずかなシフトがあった（１０～２０％）（図２Ｃ）。

【0251】

ヘテロプラスミー変化の生物学的有意性を決定するために、高レベル（９０％）の突然変異ｍｔＤＮＡを有するＭＥＦ細胞株を使用した（Ｂａｃｍａｎ、２０１８、前出）。細胞を、ＭＴＥＭおよびＧＦＰを発現するプラスミドで同時トランスフェクトし、以下に記載されるように選別した。ｍｔＤＮＡを、トランスフェクションの１、７、１４および２１日後にＰＣＲ／ＲＦＬＰによって分析した。ＧＦＰ陽性細胞は、トランスフェクション後の全細胞集団の１１～２０％を構成していた。トランスフェクション後２４時間で、トランスフェクト細胞中でヘテロプラスミーの有意なシフト（約２５％）があり、これは２週間にわたって維持された（図２Ｄおよび図２Ｅ）。トランスフェクション後２４時間でトランスフェクト集団の全ｍｔＤＮＡレベルが枯渇し、次いで２１日後にベースラインに戻った（図２Ｆ）。トランスフェクトされていない集団は、おそらく先に論じたように、ＭＴＥＭを受けるいくつかの細胞に起因して、非常に軽度の減少を有した。

【0252】

３週間成長させた細胞をそれらの酸素消費率（ＯＣＲ）について分析した。ＯＣＲは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。アッセイの前日に、細胞をウェルＢ～Ｇに２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した（ウェルＡおよびＨは培地のみを含有した）。ＸＦｐセンサーカートリッジを較正緩衝液で３７℃で一晩較正した。翌日、細胞培養培地を、１０ｍＭのグルコース、１ｍＭのピルビン酸および２ｍＭのグルタミンを補充した低緩衝Ｓｅａｈｏｒｓｅ培地と交換し、３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。１μＭのオリゴマイシン、０．５μＭのＦＣＣＰ、および１μＭのロテノン＋アンチマイシンＡの各添加後に内因性呼吸の測定を行った。結果をＳｅａｈｏｒｓｅ試験後の１ウェル当たりのμｇタンパク質に対して正規化し、ＤＣタンパク質アッセイを使用してタンパク質を定量した（Ｐｅｒｅｉｒａ ２０１８、前出）。

【0253】

トランスフェクトされていない細胞は、野生型対照と比較して呼吸障害を有した。トランスフェクト細胞集団は、ＯＣＲを有意に改善した（図２Ｇ）。トランスフェクトされていない細胞におけるＯＣＲのわずかな改善も観察され（図２Ｇ）、これは、本明細書の他の箇所で論じられているようなヘテロプラスミーの軽度の変化に起因する可能性がある。

【0254】

実施例３；マウスにおけるＭＴＥＭの発現

【0255】

ＭＴＥＭをコードするＤＮＡをＡＡＶ２／９プラスミドにクローニングし、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ｖｉｒａｌ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに送ったところ、ＡＡＶ－ＭＴＥＭについて１．６×１０^１３ｖｇ／ｍｌの力価、および５．９×１０^１３ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ９－ＧＦＰを有するウイルスが作製された。幼若マウス（２．５週齢）および成体マウス（６週齢）の両方に、記載のように［Ｂａｃｍａｎ ２０１８およびＹａｒｄｅｎｉら（２０１１）Ｌａｂ Ａｎｉｍ（ＮＹ）４０（５）：ｐ．１５５－６０］後眼窩に注射した。幼若マウスに、６．６７×１０^１３ｖｇｓ／ｋｇのＡＡＶ９－ＭＴＥＭまたは６．１５×１０^１３ｖｇｓ／ｋｇのＡＡＶ９－ＧＦＰを左後眼窩洞に投与した。成体には、４．０×１０^１３ｖｇｓ／ｋｇのＡＡＶ９－ＭＴＥＭまたは３．６９×１０^１３ｖｇｓ／ｋｇのＡＡＶ９－ＧＦＰを左後眼窩洞に投与した。対照動物に、それぞれ年齢が一致する実験動物の同様の力価のＡＡＶ９－ＧＦＰを注射した。つま先生検（Ｔｏｅ ｂｉｏｐｓｙ）を６日齢で収集して、ベースヘテロプラスミーレベルを決定した。注射後（ＰＩ）６週、１２週および２４週に、マウスをケタミンおよびキシラジンで麻酔し、ＰＢＳで灌流した。心臓、前脛骨筋、大腿四頭筋、腓腹筋、腎臓、肝臓および脾臓を収集した。試料を液体窒素中で急速凍結し、次いで、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

【0256】

ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ注射動物は、すべての時点、注射後（ＰＩ）６週、１２週および２４週で、構築物に対する抗Ｆｌａｇ抗体を使用したウエスタンブロット分析によって示されるように、心臓、骨格筋、および一部の動物では肝臓におけるＭＴＥＭの一貫した発現を示した。（図３Ａ）。ＡＡＶ９－ＧＦＰ注射動物は、同じ組織でＧＦＰ発現を示したが、注射後６週および１２週で肝臓でより高い発現を示した（図３Ａ）。対応するＲＦＬＰ分析は、ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ注射動物においてＰＩ ６週で肝臓および前脛骨筋試料の突然変異ｍｔＤＮＡの有意な減少を示した（図３Ａ）。ヘテロプラスミーシフトは経時的に大きくなり、ＰＩ ２４週で、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓および脾臓の突然変異ｍｔＤＮＡが有意に減少した（図３Ｂ）。ＡＡＶ９－ＧＦＰ注射対照は、注射後にすべての組織にわたって同様のレベルの突然変異を有した（図３Ａ～図３Ｂ）。ＡＡＶ９－ＭＴＥＭまたはＡＡＶ９－ＧＦＰのいずれの注射後にも脳で発現が観察されなかったので（図３Ａ）、ヘテロプラスミーの変化を正規化するために脳組織を陰性対照として使用した。ＰＩ ６週、１２週、または２４週で分析した組織のいずれにおいてもｍｔＤＮＡレベルの有意な枯渇は見られず（図３Ｃ）、非特異的ｍｔＤＮＡ効果が最小限であるか、または全くないことが示唆された。マウスの体重は、すべての時点でＭＴＥＭ処置動物と対照動物との間で異ならなかった。

【0257】

ヘテロプラスミーｍ．５０２４Ｃ＞Ｔマウスにも、２．５週齢と比較してＡＡＶ媒介発現を許容しない６週齢でＡＡＶ９－ＭＴＥＭを全身注射した。それでも、心臓および肝臓では強い発現が観察され、骨格筋では発現が弱かった（図４Ａ）。ＡＡＶ９－ＧＦＰ注射マウスは、心臓、前脛骨筋、および肝臓で強い発現を示し、大腿四頭筋および腓腹筋ではより弱い発現を示した（図４Ａ）。ＲＦＬＰ分析は、ＭＴＥＭ処置動物における注射の６週間後という早期に肝臓における突然変異ｍｔＤＮＡの本質的に完全な排除を示し、これは経時的に持続した（図４Ｂ）。一部の骨格筋は、突然変異ｍｔＤＮＡの減少傾向を示した（ＰＩ ２４週での前脛骨筋、腓腹筋）が、結果は有意性に達しなかった（図４Ｂ）。ＡＡＶ９－ＧＦＰ注射動物は、すべての組織にわたってヘテロプラスミーレベルの変化を示さなかった（図４Ａおよび図４Ｂ）。脳を使用して変化を正規化した。全ｍｔＤＮＡレベルは、ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ処置動物の肝臓中、ＰＩ ６週でわずかに減少したが、ＰＩ １２週または２４週には減少しなかった（図４Ｃ）。

【0258】

ＭＴＥＭは、ＰＩ ６週、１２週、または２４週では検出されなかった。２．５週で注射し、ＰＩ ５日および１０日に屠殺した動物では、ＭＴＥＭ発現は肝臓でのみ検出された。しかしながら、ＧＦＰ発現は、おそらくこの構築物の発現がより高いために、心臓、骨格筋および肝臓で可視であった。ＰＩ ５日および１０日のヘテロプラスミー変化は肝臓でのみ観察された。ＰＩ ５日で突然変異ｍｔＤＮＡの平均２２％の低減があり、これはＰＩ １０日で５５％に増加した。アポトーシスがこれらの変化において役割を果たしたかどうかを決定するために、ＰＣＮＡ（肝臓再生のマーカー）、カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３の発現を肝臓試料において分析した。いずれの時点においても、ＭＴＥＭ処置動物と対照動物との間に差は観察されなかった。同様のレベルの非切断型カスパーゼ３が処置動物および対照動物で観察されたが、切断型カスパーゼ３は観察されなかった。さらに、ＰＩ ５日または１０日の全ｍｔＤＮＡレベルの枯渇は、肝臓または前脛骨筋では観察されなかった。さらに、肝臓Ｈ＆Ｅ染色は、ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ注射、ＡＡＶ９－ＧＦＰ注射、および非注射対照の間にいかなる形態学的差異も示さなかった。

【0259】

結果は、ＭＴＥＭがミトコンドリアにのみ局在したことを示したが、核オフターゲット編集を評価した。そうするために、標的化アンプリコンシーケンシングを、ＧＵＩＤＥＳｅｑに基づくインビトロ、ゲノムワイド、不偏オフターゲティングアッセイから同定された部位の選択に対して行った。ＰＩ ２４週目の若齢マウスの前脛骨筋（ＴＡ）および肝臓（Ｌ）組織からのＤＮＡを標的化アンプリコンシーケンシングによって評価した。この分析方法は、挿入／欠失（インデル）などのアンプリコン内の任意の遺伝的変異を検出する。いずれの動物について分析した部位のいずれにも、インデルは検出されなかった。

【0260】

Ｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａレベルは、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ ｔＲＮＡ^Ａｌａマウスにおいて高レベルの突然変異ｍｔＤＮＡを有する組織において減少する（Ｂａｃｍａｎ ２０１８およびＫａｕｐｐｉｌａら（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１６（１１）：ｐ．２９８０－２９９０］。ＰＩ ２４週の幼若マウスの肝臓におけるｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａレベルをノーザンブロットにより測定した。結果は、２８Ｓ ｒＲＮＡに対して正規化した場合に、ＡＡＶ９－ＧＦＰ注射対照と比較して、ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ注射動物において増加した量のｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａを示した（図５Ａおよび図５Ｂ）。定量的ＰＣＲを使用して、ｍｔ－ｔＲＮＡ^Ｖａｌに対するｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａの比を決定した。これらの結果は、ノーザンブロットの結果を裏付けた（図５Ｃおよび図５Ｄ）。ｑＰＣＲにより、ＡＡＶ９－ＭＴＥＭ処置幼若動物は、対照（ＡＡＶ９－ＧＦＰ）、さらには野生型動物と比較して、有意に高いレベルのｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａを有することが示された（図５Ｃ）。ＡＡＶ９－ＭＴＥＭを注射した成体動物はまた、対照（ＡＡＶ９－ＧＦＰ）と比較して肝臓のｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａレベルが増加した（図５Ｄ）。

【0261】

実施例４；ミトコンドリア局在化および核外移行配列の付加を伴うヌクレアーゼ活性

【0262】

この実験の目的は、操作されたメガヌクレアーゼへの核外移行シグナル（ＮＥＳ）の付加が核インデルを排除するかどうかを決定することであった。図６で使用されるＮＥＳは、Ｋｏｓｕｇｉら２００８ Ｔｒａｆｆｉｃ １２：２０５３－６２からのデータに基づいて合理的に設計された。操作されたメガヌクレアーゼのＣ末端に融合したＮＥＳアミノ酸配列は、ＬＧＡＧＬＧＡＬＧＬ（配列番号１０）であった。図７で使用されるＮＥＳは、Ｍｉｎｃｚｕｋら、２００６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（５２）：１９６８９－１９６９４から入手した。操作されたメガヌクレアーゼのＣ末端に融合したＮＥＳアミノ酸配列は、ＶＤＥＭＴＫＫＦＧＴＬＴＩＨＤＴＥＫ（配列番号９）であった。

【0263】

図６および図７で使用した操作されたメガヌクレアーゼは、核標的部位を有するＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０であった。６ｅ５ ＭＲＣ－５細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＳＥ緩衝液、条件ＣＭ－１５０）を使用して同数の操作されたメガヌクレアーゼｍＲＮＡコピーでヌクレオフェクトした。４つのメガヌクレアーゼ構築物を図６で比較した。１つはＮＬＳを有し、１つは標的化配列を有さず、１つはミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）を有し、１つはＭＴＰおよびＮＥＳを有する。４つの操作されたメガヌクレアーゼ構築物を図７で比較した。１つはＮＬＳを有し、１つはＭＴＰを有し、１つはＭＴＰおよびＮＥＳを有し、１つはＭＴＰおよびＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳを有する。ＮＬＳおよびＭＴＰは両方ともそれらのそれぞれのタンパク質のＮ末端に融合し、ＮＥＳはＣ末端に融合した。これらの異なる構築物は異なる長さのｍＲＮＡを生じるので、ｍＲＮＡコピー数はトランスフェクション間で一定に保たれた（図６のデータの５．８ｅ１１コピー、図７のデータの２．８８ｅ１１コピー）。ｇＤＮＡ抽出のためのヌクレオフェクションの２日後に細胞を回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９５％を超えた。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを用いてｇＤＮＡを単離した。

【0264】

デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、Ｐ１、Ｆ１およびＲ１（それぞれ配列番号２９、３０および３１）を使用してＡＰＣ １１－１２結合部位におけるインデル頻度を決定して、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成し、Ｐ２、Ｆ２、Ｒ２（それぞれ配列番号３２、３３および３４）を使用して、ゲノムカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成した。２つのアンプリコンの比は、未処理集団では等しく、処理試料の結合部位でのインデル形成に対して低下するはずである。増幅を、プローブ用の１ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および１２０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴ジェネレータ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：１サイクルの９５℃（２℃／ｓランプ）１０分、４５サイクルの９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒、５７．５℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（２／ｓランプ）１分、１サイクルの９８℃ １０分、４℃保持。液滴をＱＸ ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。

【0265】

Ｐ１：ＡＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号１４）
Ｆ１：ＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧ（配列番号１５）
Ｒ１：ＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＴＴ（配列番号１６）
Ｐ２：ＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣ（配列番号１７）
Ｆ２：ＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＣ（配列番号１８）
Ｒ２：ＧＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧ（配列番号１９）

【0266】

ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０へのＮＥＳの付加は、核インデルの有病率をわずかに減少させるようであり（図６）、ＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳの付加は、核インデルを完全に排除するようであった（図７）。

【0267】

ＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳは、潜在的に問題となる核オフターゲット編集を軽減する、ミトコンドリアが標的とされた操作されたメガヌクレアーゼへの非常に効果的な付加である。

【0268】

一般的な方法論
ＭＴＥＭ発現
全タンパク質ホモジネートを急速凍結組織から調製し、タンパク質を、ＤＣタンパク質アッセイ（５０００１１６、ＢｉｏＲａｄ）を製造者の説明書に従って使用して定量した。試料あたり４０マイクログラムの全タンパク質を、１０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅタンパク質ゲル（４５６８０３４、ＢｉｏＲａｄ）に入れ、次いで、ＴｒａｎｓＢｌｏｔ Ｔｕｒｂｏシステム（１７０４１５５、ＢｉｏＲａｄ）を製造者の指示に従って使用して、フッ化ポリビニリデン膜（１６２０２６０、ＢｉｏＲａｄ）に移した。ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅタンパク質ゲルにより、ＢｉｏＲａｄ Ｃｈｅｍｉｄｏｃシステムを用いたゲル活性化による全タンパク質負荷の可視化が可能になる。ブロットを、５％の乳を用いてＲＴで１時間ブロッキング処理した。使用した抗体は、マウスモノクローナルＦｌａｇ（Ｆ ３１６５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１：１０００）、マウスモノクローナルＧＦＰ（７５－１３１、ＵＣ Ｄａｖｉｓ）（１：１０００）、マウスモノクローナルＭＴＣＯ１（ａｂ １４７０５、ａｂｃａｍ）（１：１０００）、マウスモノクローナルＮＤＵＦＢ８（ａｂ１１０２４２、ａｂｃａｍ）（１：７５０）、マウスモノクローナルＴｕｂｕｌｉｎ（Ｔ９０２６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１：２０，０００）、ウサギポリクローナルカスパーゼ－３（＃９６６２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：１０００）、およびマウスモノクローナルＰＣＮＡ（ＰＣ１０＃２５８６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：２０００）であった。利用した二次抗体は、ＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合マウス（７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：５０００）またはウサギ（７０７４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：５０００）であった。一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、二次抗体をＲＴで１時間インキュベートした。膜をＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（３４０８０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で展開し、ＢｉｏＲａｄ ＣＨＥＭＩＤＯＣ（商標）イメージャで画像化した。

【0269】

ＤＮＡ抽出、「ラストサイクルホット（ｌａｓｔ－ｃｙｃｌｅ ＨＯＴ）」ＰＣＲによる定量、およびＲＦＬＰ

【0270】

フェノール－クロロホルムを使用して急速凍結組織から、およびＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳキット（７４０９０１．５０、Ｔａｋａｒａ）を使用してＦＡＣＳ選別細胞から全ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度を分光光度的に決定した（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ハイブリッド）。ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ突然変異のレベルを、「ラストサイクルホット」ＰＣＲによって決定し、ＰＣＲのラストサイクルを、放射性標識ヌクレオチドを使用して実行する。この方法は、初期アンプリコンの可視化のみを可能にすることによって、以前の融解およびアニーリング工程によって形成されたヘテロ二重鎖からの干渉を除去する。ＰＣＲアンプリコンは、以下のプライマーを用いて得られた：Ｆ－５’ＣＣＡＣＣＣＴＡＧＣＴＡＴＣＡＴＡＡＧＣＡＣＡ－３’（配列番号１２）およびＢ－５’－ＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＧＡＴＧＴＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡ－３’（配列番号１３）。アンプリコンをＰｓｔＩ－ＨＦ（Ｒ３１４０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化することによってＲＦＬＰ分析を行ったが、これは野生型ｍｔＤＮＡを消化するが、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ点突然変異を有する突然変異ｍｔＤＮＡは消化しない。消化後、生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル中で泳動し、Ｃｙｃｌｏｎｅ蛍光体イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）およびＯｐｔｉＱｕａｎｔソフトウェアバージョン５．０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてシグナルを検出した。

【0271】

全ｍｔＤＮＡレベルを決定するための定量的ＰＣＲ
試料中に存在するｍｔＤＮＡの全レベルを決定するために、以下のＢａｃｍａｎ ２０１８に記載されているように、ＴａｑＭａｎ試薬（ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ Ｓｔｄ ｑＰＣＲアッセイ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。試料をＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ ９６／Ｃ１０００ ｑＰＣＲ装置で実行した。比較サイクル閾値（Ｃｔ）法を使用して相対読み取り値を決定し、ｍｔＤＮＡ（ＮＤ１およびＮＤ５）をゲノムＤＮＡ（１８Ｓ）と比較することによって全ｍｔＤＮＡレベルを決定した。以下のプライマー／プローブセットを使用した。

【0272】

ｍｔＤＮＡ
ＮＤ１＝フォワード：ＧＣＣ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＴＡ ＧＣＣ ＡＴＡ ＡＴ（ＮＣ＿００５０８９；ｍｔＤＮＡ ３２８２－３３０１；配列番号１４）、リバース：ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＧＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＴＡ（ｍｔＤＮＡ ３４０２－３３８３；配列番号１５。

【0273】

プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＴＣＴ ＣＡＡ ＣＣＣ／ＺＥＮ／ＴＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＣＧ Ｇ／３ＩＡＢｋＦＱ／（ｍｔＤＮＡ ３３１０－３３３４；配列番号１６）。

【0274】

ＮＤ５＝フォワード：ＣＣＣ ＡＴＧ ＡＣＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＧ（ｍｔＤＮＡ １２４３２－１２４５４；配列番号１７）；リバース：ＴＧＧ ＡＡＴ ＣＧＧ ＡＣＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＡＡ（ｍｔＤＮＡ １２５３３－１２５１４；配列番号１８）。

【0275】

プローブ：／５ ＴＥＴ／ＡＧＴ ＧＣＴ／ＺＥＮ／ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＴＧ ＴＡＧ ＧＧＣ／３ ＩＡＢｋＦＱ／（ｍｔＤＮＡ １２４８２－１２４５８；配列番号１９）。

【0276】

ゲノムＤＮＡ
１８ｓ＝フォワード：ＧＣＣ ＧＣＴ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＣＴ（ＲｅｆＳｅｑ ＮＲ＿０４６２３３．２；ｃｈｒ １７：３９９８４２５３－３９９８４２７２；配列番号２０；リバース：ＴＣＧ ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＴＡＴ ＣＴ（ＲｅｆＳｅｑ ＮＲ＿０４６２３３．２；ｃｈｒ １７：３９９８４４３２－３９９８４４１２；配列番号２１）。

【0277】

プローブ：／５Ｃｙ５／ＡＡＧ ＡＣＧ ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＧＡＡ ＡＧＣ ＡＴ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（ＲｅｆＳｅｑ ＮＲ＿０４６２３３．２；ｃｈｒ１７：３９９８４２８５－３９９８４３０５；配列番号２２）

【0278】

ＲＮＡ抽出、ノーザンブロット分析、およびｍｔ－ｔＲＮＡの定量
ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて製造業者の標準プロトコルに従って急速凍結組織から単離した。分光光度定量の前に、試料をＤＮａｓｅ（ＡＭ １９０７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。ノーザンブロット分析を、２０％ホルムアルデヒドおよび１×ＭＯＰＳを含有する１．２％アガロースゲルにおいて、試料あたり４μｇの全肝臓ＲＮＡを泳動することによって行った。１×ＭＯＰＳ溶液中、８０Ｖで１５分間、続いて１２０Ｖで２．５時間電気泳動を行った。この時点で、ゲルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色して、全ＲＮＡ負荷を可視化した。次いで、ゲルを水中で１０分間２回洗浄してＥｔＢｒを除去した。ＲＮＡをナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ－ＮＸ、＃ＲＰＮ２０３Ｔ）上に一晩転写した。目的の転写物を、非放射性ビオチン化プローブを用いて５０℃で一晩検出した。翌日、膜を洗浄し、シグナルを、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン（９２６－３２２３０、Ｌｉ－ＣＯＲ）により検出した。ビオチン化プローブを使用して、ノーザンブロットによってミトコンドリアｔＲＮＡ^Ａｌａを検出した：

【0279】

［Ｂｔｎ］ＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＴＴＧ（配列番号２３）

【0280】

製造業者の指示に従って、Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡアッセイ（４３９８９８７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａおよびｍｔ－ｔＲＮＡ^Ｖａｌのレベルを検出した。Ｃｔ値をｍｔ－ｔＲＮＡ^Ｖａｌ Ｃｔ値で割ることによって、ｍｔ－ｔＲＮＡ^Ａｌａの相対レベルを計算した。

【0281】

核オフターゲットの検出
このアッセイは、操作されたメガヌクレアーゼ誘導二本鎖切断の検出においてより高感度である、「オリゴ捕捉」として知られるＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ［Ｔｓａｉら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３（２）：１８７－１９７］の改変である。表３に示すように、５つのＣ５７ＢＬ６Ｊ核ゲノム配列をこのヌクレアーゼの推定オフターゲット部位として同定し、インデルの存在について試験した。ＦＬ８３Ｂマウス細胞にＭＴＥＭをエレクトロポレーションし、形質転換のｘ日後にオリゴ捕捉によって分析した。

【0282】

【表3】

【0283】

統計分析
すべてのデータ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７および８を用いて行った。すべての統計は平均±ＳＥＭとして提示している。対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて、ペアワイズ比較を行った。２つを超える群間の比較を、１元配置ＡＮＯＶＡによって行った。０．０５以下のＰ値を有意とみなした。各条件につきＮ＝４匹のマウスに注射した（処置対対照、および各時点）。すべての測定は、別個の試料から得た。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】