特表 2024-517701 組換え生産タンパク質の低分子量種を低減させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】組換え生産タンパク質の低分子量種を低減させる方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C12N15/13 ZNA

C07K14/47

C12N5/10

C12P21/02 C

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K16/28

C07K16/46

C07K19/00

A61K38/16

A61P13/08

A61P35/00

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565546

(86)(22)【出願日】2022-04-28

(85)【翻訳文提出日】2023-12-08

(86)【国際出願番号】 US2022026707

(87)【国際公開番号】W WO2022232376

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/181,903

(32)【優先日】2021-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(71)【出願人】

【識別番号】513105328

【氏名又は名称】アムジェン リサーチ （ミュニック） ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】メンテ，アニカ

(72)【発明者】

【氏名】バスコーニ，ジョーセフ

(72)【発明者】

【氏名】ジェイコブ，ニティア・エム

(72)【発明者】

【氏名】ジャンポル，ラッセル

(72)【発明者】

【氏名】レ，フォン・ティ・ゴック

(72)【発明者】

【氏名】レ，キム

(72)【発明者】

【氏名】ペドローゾ，ジェシカ

(72)【発明者】

【氏名】スティーブンス，ジェニット

(72)【発明者】

【氏名】スラバッジャーラ，スリーカーント

(72)【発明者】

【氏名】テジャモ，チャリリン

(72)【発明者】

【氏名】ヤム，ペン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG26

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC13

4B064CC24

4B064DA03

4B065AA90X

4B065AA93Y

4B065AB04

4B065BA02

4B065BC02

4B065CA44

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA811

4C084ZB261

4C084ZC411

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA22

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、組換え生産タンパク質の低分子量種を低減させる方法に関する。特に、生産細胞培養のｐＨ制御を通して、細胞培養プロセス中に宿主細胞によって生産される低分子量種の形成を低減させる方法が開示される。組換えタンパク質の生産中に宿主細胞による選択的スプライスバリアントの発生を低減させるか又はなくす方法も開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えタンパク質組成物であって、低減された量の、タンパク質の低分子量（ＬＭＷ）種を含む組換えタンパク質組成物を生産する方法であって、
前記タンパク質をコードする核酸を発現する哺乳動物細胞を、前記タンパク質が前記哺乳動物細胞によって発現及び分泌される期間にわたり、細胞培養培地中で培養することであって、前記培養培地のｐＨは、約６．９０以下に維持される、培養することと、
前記発現されたタンパク質を前記細胞培養培地から回収して前記組換えタンパク質組成物を得ることであって、前記組成物は、２０％未満の、前記タンパク質の総ＬＭＷ種を含み、前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、得ることと
を含む方法。

【請求項2】

前記培養培地は、約６．７０～約６．９０のｐＨに維持される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記培養培地は、約６．８０のｐＨに維持される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記期間は、少なくとも３日である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記期間は、約１２日～約１５日である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記哺乳動物細胞は、灌流培養で培養される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記哺乳動物細胞は、３００×１０^５細胞／ｍＬ～８００×１０^５細胞／ｍＬの生細胞密度まで培養される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記発現されたタンパク質は、精密濾過によって前記細胞培養培地から回収される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記タンパク質をコードする前記核酸は、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記タンパク質をコードする前記核酸は、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記組成物は、採取細胞培養液である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記組成物は、約１５％以下の、前記タンパク質の総ＬＭＷ種を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記組成物は、約１０％以下の、前記タンパク質の総ＬＭＷ種を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記組成物は、約２％～約１０％の、前記タンパク質の総ＬＭＷ種を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＬＭＷ種は、前記タンパク質のスプライスバリアントアイソフォームを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記組成物中のＬＭＷ種の量は、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム法によって決定される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の選択的スプライスバリアントアイソフォームの発現及び分泌を低減させる方法であって、
シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、前記組換えタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、前記第１のポリヌクレオチドは、前記第２のポリヌクレオチドと同じオープンリーディングフレーム内にあり、前記第１のポリヌクレオチドは、前記シグナルペプチドのカルボキシ末端の６アミノ酸内に存在する任意のグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む、トランスフェクトすることと、
前記組換えタンパク質が発現され、且つ細胞培養培地中に分泌される条件下において、前記培地中で前記哺乳動物細胞を培養することと、
前記細胞培養培地から前記組換えタンパク質を回収して組換えタンパク質組成物を得ることと
を含む方法。

【請求項19】

前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号６～１９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記組換えタンパク質は、単鎖Ｔ細胞エンゲージ分子である、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記組換えタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記組換えタンパク質は、抗体又はその結合断片である、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項27】

前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記組換えタンパク質組成物は、約１０％以下の、前記タンパク質の総ＬＭＷ種を含む、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記培養培地は、約６．９０以下のｐＨに維持される、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記培養培地は、約６．７０～約６．９０のｐＨに維持される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記培養培地は、約６．８０のｐＨに維持される、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から選択されるヌクレオチド配列を含む単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子をコードする単離された核酸。

【請求項33】

請求項３２に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。

【請求項34】

請求項３２に記載の単離された核酸で形質転換された哺乳動物宿主細胞。

【請求項35】

請求項３３に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞。

【請求項36】

ＣＨＯ細胞である、請求項３４又は３５に記載の哺乳動物宿主細胞。

【請求項37】

単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子を生産する方法であって、
請求項３４～３６のいずれか一項に記載の哺乳動物宿主細胞を、前記Ｔ細胞エンゲージ分子が発現される条件下において細胞培養培地中で培養することと、
前記培養培地又は宿主細胞から前記Ｔ細胞エンゲージ分子を回収することと
を含む方法。

【請求項38】

請求項１又は１８に記載の方法によって生産された組換えタンパク質組成物。

【請求項39】

単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子と、その１種以上のＬＭＷ種とを含む組成物であって、２０％未満の、前記Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含み、前記Ｔ細胞エンゲージ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、組成物。

【請求項40】

約１５％以下の、前記Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

約１０％以下の、前記Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項42】

約２％～約１０％の、前記Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項43】

約２％～約６％の、前記Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項44】

前記ＬＭＷ種は、前記Ｔ細胞エンゲージ分子のスプライスバリアントアイソフォームを含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

前記組成物中のＬＭＷ種の量は、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム法によって決定される、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項46】

請求項３８～４５のいずれか一項に記載の組成物と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤。

【請求項47】

ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、請求項４６に記載の医薬製剤を前記患者に投与することを含む方法。

【請求項48】

前記ＰＳＭＡ発現癌は、前立腺癌である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行う方法で使用するための、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

前記ＰＳＭＡ発現癌は、前立腺癌である、請求項４９に記載の使用のための組成物。

【請求項51】

ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項52】

前記ＰＳＭＡ発現癌は、前立腺癌である、請求項５１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／１８１，９０３号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年４月１１日に作成されたコンピュータ可読フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２７３４－ＷＯ０１－ＳＥＣ＿ＳＴ２５であり、サイズが３６キロバイトである。

【0003】

本発明は、バイオ医薬品製造の分野に関する。特に、本発明は、生産細胞培養中に組換え生産タンパク質の低分子量種の形成を低減させる方法及びそのような方法によって生産される組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

操作した宿主細胞を使用した組換え法によるタンパク質の生産により、タンパク質産物の多彩なバリアントが生じる可能性があり、これらは、一貫した産物品質を確保するためにモニタリング及び／又は制御する必要がある。そのような産物バリアントは、例えば、タンパク質をコードする様々なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物をもたらす翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、酸化、脱アミド化など）又は選択的ＲＮＡスプライシングから生じ得る。所望のタンパク質産物と比較して機能的特徴が変化したタンパク質産物のバリアントは、産物関連不純物に分類される。産物関連不純物は、タンパク質医薬品の全体的な有効性及び／又は安全性に影響を及ぼす可能性があるため、多くの場合、産物関連不純物をモニタリングし、最終タンパク質医薬品において特定の指定レベルに制御する必要がある。そのようなタイプの産物関連不純物の１つは、タンパク質の低分子量（ＬＭＷ）種であり、これには、宿主細胞によって発現されるタンパク質のトランケート型、タンパク質分解プロセシングから生じるタンパク質の断片又は多鎖タンパク質の場合にはポリペプチド鎖の不完全なアセンブリが含まれ得る。細胞培養プロセス中に生産されるＬＭＷ種の量及び／又はタイプを低減させることは、医薬品からＬＭＷ種を除去するための更なる下流精製工程の必要性をなくすことができるため、特に有用である。したがって、細胞培養生産プロセス中にタンパク質のＬＭＷ種の形成を低減させる方法が望ましい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、細胞培養生産プロセス中に宿主細胞によって発現されるタンパク質のＬＭＷ種の量をなくすか又は低減させる方法の開発に部分的に基づく。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、生産細胞培養のｐＨを制御することにより、タンパク質のＬＭＷ種を低減させる。他の実施形態では、本発明の方法は、宿主細胞によって発現されるタンパク質のスプライスバリアントアイソフォームを低減させるか又はなくすことにより、タンパク質のＬＭＷ種の数及び／又は量を低減させる。

【0006】

特定の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質組成物であって、低減された量の、タンパク質のＬＭＷ種を含む組換えタンパク質組成物を生産する方法を提供する。そのような一実施形態では、本方法は、タンパク質をコードする核酸を発現する哺乳動物細胞を、タンパク質が哺乳動物細胞によって発現及び分泌される期間にわたり、細胞培養培地中で培養することであって、培養培地のｐＨは、約６．９０以下に維持される、培養することと、発現されたタンパク質を細胞培養培地から回収して組換えタンパク質組成物を得ることであって、組成物は、２０％未満の、タンパク質の総ＬＭＷ種を含む、得ることとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって生産される組換えタンパク質組成物は、任意選択により、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム法によって決定される、１８％未満の、組換えタンパク質の総ＬＭＷ種、例えば約１５％以下又は約１０％以下、例えば約２％～約１０％、約１％～約８％又は約２％～約６％の、組換えタンパク質の総ＬＭＷ種を含み得る。そのような実施形態では、組換えタンパク質組成物は、採取細胞培養液であり得る。特定の実施形態では、ＬＭＷ種は、タンパク質のスプライスバリアントアイソフォームを含む。

【0007】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞培養培地のｐＨは、約６．７０～約６．９０のｐＨ、約６．７５～約６．８５のｐＨ又は約６．８０のｐＨに維持される。細胞培養培地のｐＨは、好ましくは、少なくとも３日間又は少なくとも７日間であり得る細胞培養の生産期の持続期間にわたり、これらの範囲内に維持される。いくつかの実施形態では、細胞培養の生産期の持続期間は、約７日～約１４日である。他の実施形態では、細胞培養の生産期の持続期間は、約１２日～約１５日である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生産される組換えタンパク質組成物は、６．９０を上回るｐＨ、例えば７．００、７．１０、７．２０、７．３０又は７．４０のｐＨに維持された培養培地中で培養された形質転換哺乳動物細胞によって生産された同じ組換えタンパク質の組成物と比較して低減された量の、タンパク質の総ＬＭＷ種を含む。

【0008】

他の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の選択的スプライスバリアントアイソフォームの発現及び分泌を低減させる方法を提供する。一実施形態では、本方法は、シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、組換えタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと同じオープンリーディングフレーム内にあり、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドのカルボキシ末端の６アミノ酸内に存在する任意のグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む、トランスフェクトすることと、組換えタンパク質が発現され、且つ細胞培養培地中に分泌される条件下において、培地中で哺乳動物細胞を培養することと、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収して組換えタンパク質組成物を得ることとを含む。そのような実施形態では、哺乳動物細胞によって発現される組換えタンパク質の選択的スプライスバリアントアイソフォームの数及び／又は量は、シグナルペプチドのＣ末端の６アミノ酸内にある任意のグリシン残基のグリシンＧＧＴコドンを含む、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞によって発現される選択的スプライスバリアントアイソフォームの数及び／又は量と比較して低減され得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、約６．９０以下のｐＨ、例えば約６．７０～約６．９０のｐＨ、約６．７５～約６．８５のｐＨ又は約６．８０のｐＨに維持された細胞培養培地中で培養される。

【0009】

本発明の方法の特定の実施形態では、シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの最後から４番目のＣ末端アミノ酸として存在するグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。他の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの最後から６番目のＣ末端アミノ酸として存在するグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。更なる他の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの最後から６番目及び最後から４番目のＣ末端アミノ酸として存在する各グリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドにおける任意のグリシンＧＧＧコドンの直前のヌクレオチドは、アデニン（Ａ）以外のヌクレオチド、例えばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）であり得る。特定の一実施形態では、第１のポリヌクレオチドにおける任意のグリシンＧＧＧコドンの直前のヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）である。第１のポリヌクレオチドは、トランスフェクトされた哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の分泌を促進するのに好適な任意のシグナルペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号６～１９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする。一実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする。関連する実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。

【0010】

種々のタイプの組換えタンパク質が本発明の方法によって生産され得、それらには、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、変異タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、ペプチボディ、Ｔ細胞エンゲージ分子及び多重特異性抗原結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質は、抗体又はその結合断片である。他の実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質は、Ｔ細胞エンゲージ分子、例えば単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子などの単鎖Ｔ細胞エンゲージ分子である。そのような一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子である。関連する実施形態では、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子をコードする核酸は、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。したがって、本発明は、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子をコードする単離された核酸及び発現ベクター並びに単離された核酸又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）も含む。いくつかの実施形態では、本発明は、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子を生産する方法であって、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離された核酸又は発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞を、Ｔ細胞エンゲージ分子が発現される条件下において細胞培養培地中で培養することと、培養培地又は宿主細胞からＴ細胞エンゲージ分子を回収することとを含む方法を提供する。

【0011】

本発明は、本明細書に記載の方法によって生産される組換えタンパク質組成物も含む。そのような組換えタンパク質組成物は、他の細胞培養法によって生産される組換えタンパク質のＬＭＷ種の量及び／又は種類と比較して、組換えタンパク質のＬＭＷ種の量及び／又は種類が低減している。特定の実施形態では、本発明は、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子と、その１種以上のＬＭＷ種とを含む組成物を提供し、組成物は、２０％未満の、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含み、Ｔ細胞エンゲージ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、組成物は、１８％未満の、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種、例えば約１５％以下又は約１０％以下、例えば約２％～約１０％、約１％～約８％又は約２％～約６％の、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含む。いくつかの実施形態では、ＬＭＷ種は、Ｔ細胞エンゲージ分子のスプライスバリアントアイソフォーム、例えば配列番号２３の配列を含むスプライスバリアントアイソフォームを含む。組成物中のＬＭＷ種の量は、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム法によって決定され得る。

【0012】

本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物を含む医薬製剤も本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物と、緩衝液、糖及び界面活性剤などの１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む。

【0013】

本発明は、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物及びそのような組成物を含む医薬製剤を使用して、ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行う方法も含む。一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物を含む医薬製剤を患者に投与することを含む。ＰＳＭＡ発現癌は、前立腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膀胱癌、精巣癌、結腸癌、神経膠芽腫、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌及び黒色腫であり得る。特定の実施形態では、ＰＳＭＡ発現癌は、去勢抵抗性前立腺癌又は転移性去勢抵抗性前立腺癌などの前立腺癌である。

【0014】

単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物の、任意の治療方法における使用又はＰＳＭＡ発現癌を治療するための医薬の調製のための使用が特に企図される。例えば、本発明は、前立腺癌などのＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行う方法で使用するための、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物又は医薬製剤を包含する。本発明は、前立腺癌などのＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物又は医薬製剤の使用も含む。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】２つの異なるＣＨＯ細胞株（プロセス１及びプロセス２）が生産した採取細胞培養液中のＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドの総ＬＭＷ種のパーセンテージと、生産バイオリアクタのｐＨ設定値との関係を示す。ポリペプチドのＬＭＷ種を還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した。

【図2】数日間の培養にわたり異なる設定値のｐＨ値で動作させた生産バイオリアクタにおける、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞株の平均生細胞密度（１０^５細胞／ｍＬ）を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。

【図3】数日間の培養にわたり異なる設定値のｐＨ値で動作させた生産バイオリアクタにおける、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞株の細胞生存率の平均パーセントを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。

【図4】ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを含有する、部分的に精製した採取細胞培養液のカチオン交換クロマトグラフィーによる分離の代表的クロマトグラムを示す。分離は、Ｃａｐｔｏ－ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ（登録商標）樹脂及びｐＨ４．５酢酸塩の移動相を使用し、塩化ナトリウムの直線勾配により溶出させて実施した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってタンパク質の検出を行った。

【図5】細胞ベースの活性アッセイ（黒丸）又は結合アッセイ（黒四角）におけるＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチド原薬試料の効力と、原薬試料中に存在するＬＭＷ種のパーセンテージとの関係を示す。効力を、各原薬試料の活性を参照標準物質の活性に対して正規化することによって得られる相対効力の％としてプロットする。

【図6】細胞株成長の様々な段階でＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを発現する細胞株から単離したＲＮＡのノーザンブロット分析である。約４．５ｋｂでの予想転写物に加えて、より小さい転写物バリアントが全ての細胞株の段階で検出された。レーン１＝未トランスフェクト宿主細胞（陰性対照；ＨＣ（未トランスフェクト））；レーン２＝プレマスターセルバンク（プレＭＣＢ）；レーン３＝プレＭＣＢ生産終了（プレＭＣＢ ＥＯＰ）；レーン４＝模擬ワーキングセルバンク（ｍＷＣＢ）；レーン５＝ｍＷＣＢ生産終了（ｍＷＣＢ ＥＯＰ）；レーン６＝インビトロ細胞齢の模擬限界（ｍＬＩＶＣＡ）；及びレーン７＝ｍＬＩＶＣＡ生産終了（ｍＬＩＶＣＡ ＥＯＰ）。

【図7】ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞株（ＭＣＢ）、クローン及びプールから単離したＲＮＡのｃＤＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ分析による反応産物の分離を示すゲル画像である。配列番号２に記載のヌクレオチド配列でトランスフェクトした全ての細胞は、約３．４ｋｂでの予想転写物に加えて、白矢印で示すより短い転写物バリアント（約２．８ｋｂ）を発現した。ＮＴＣ＝未トランスフェクト対照細胞株。

【図8】ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのトランケート型をコードする転写物バリアントをもたらす選択的スプライシング事象を示す概略図である。シグナルペプチド（ＳＰ）配列内のスプライスドナー部位及びＰＳＭＡ ｓｃＦｖ配列内のスプライスアクセプター部位によりコンセンサススプライス部位が作り出され、代替転写物の５’末端から６５１ヌクレオチドが欠失する。

【図9A】ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを発現する細胞株から単離したＲＮＡのノーザンブロット分析である。元の細胞株は、配列番号２のヌクレオチド配列を発現した一方、クローン０５９及びＥ１３は、配列番号４の改変ヌクレオチド配列を発現した。第１レーン（ＨＣ（未トランスフェクト））は、未トランスフェクト宿主細胞から単離したＲＮＡであり、陰性対照を表す。元の細胞株から単離したＲＮＡで検出されたより小さい転写物バリアントは、改変ヌクレオチド配列を発現する２つのクローンでは検出不可であった。

【図9B】ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを発現する細胞株から単離したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ分析による反応産物の分離を示すゲル画像である。元の細胞株は、配列番号２のヌクレオチド配列を発現した一方、クローン０５９及びＥ１３は、配列番号４の改変ヌクレオチド配列を発現した。元の細胞株に存在するより小さい転写物バリアントは、改変ヌクレオチド配列を発現する２つのクローンでは検出不可である。

【図10】異なる細胞株から得た採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）中のＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種のパーセントを示す。元の細胞株は、配列番号２のヌクレオチド配列を発現した一方、クローン０５９及びＥ１３は、配列番号４の改変ヌクレオチド配列を発現した。ポリペプチドのＬＭＷ種を還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は、細胞培養生産プロセス中に宿主細胞によって発現される組換えタンパク質のＬＭＷ種の種類及び／又は量を低減させる方法に関する。タンパク質のトランケート型又は断片を含むタンパク質産物のＬＭＷ種は、典型的には、所望のタンパク質産物と比較して機能的活性が低減しており、最終タンパク質医薬品が所望の有効性を有することを確保するために、除去するか又は特定の量内に制御する必要があることが多い。組換えタンパク質製造プロセスの細胞培養段階中に生産されるＬＭＷ種の種類及び／又は量を低減させることで、ＬＭＷ種の不純物を除去するために設計された工程又は単位操作をなくすことにより、より合理化された下流精製プロセスが可能になり得る。本発明の方法は、例えば、ＬＭＷ種を除去するための更なる精製工程を必要とせずに、タンパク質のＬＭＷ種を２０％未満含む組換えタンパク質組成物を生産するために使用され得る。

【0017】

単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を含めた任意のタイプの組換えタンパク質が、本発明の方法に従って生産され得る。「組換えタンパク質」という用語は、タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた宿主細胞により、その宿主細胞が細胞培養中で培養されたときに生産される異種タンパク質を指す。組換えタンパク質には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、変異タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、ペプチボディ、Ｔ細胞エンゲージ分子及び多重特異性抗原結合タンパク質が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、融合タンパク質である。「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合又は連結された少なくとも１つのポリペプチドを含有するタンパク質である。典型的には、融合タンパク質は、あるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と一緒にインフレームで付加され、任意選択によりリンカーによってその配列から分離されている、融合遺伝子から発現される。次いで、融合遺伝子が組換え宿主細胞によって発現されて、融合タンパク質が生産され得る。融合タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質由来の断片、例えばリガンドポリペプチド、受容体ポリペプチド、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、酵素又は免疫グロブリンの成分ではない他のポリペプチドに融合又は連結されたＦｃ領域を含み得る。

【0018】

他の実施形態では、本発明の方法に従って生産される組換えタンパク質は、抗体又はその結合断片である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）と、２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）とを含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシル末端（Ｃ末端）に、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、ヒトカッパ（κ）定常ドメイン又はヒトラムダ（λ）定常ドメインであり得る。「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」という用語は、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシル末端（Ｃ末端）に、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）及び任意選択により免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）及びイプシロン（ε）に分類されており、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス抗体及びＩｇＡクラス抗体は、サブクラス、即ちそれぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分けられる。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する一方、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（即ち軽鎖と重鎖との間）及び２つの抗体重鎖のヒンジ領域間で、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して、互いに連結されている。

【0019】

免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に、３つの超可変領域（「相補性決定領域」又はＣＤＲと呼ばれることの方が多い）によって接合された比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同一の全体構造を示す。重鎖と軽鎖との各対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列されることで、標的タンパク質の特定のエピトープに特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に、天然に存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方は、典型的には、以下のこれらの要素の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４と一致する。これらのドメインのそれぞれにおける位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための付番方式が考案されている。この付番方式は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３において定義されている。所与の抗体のＣＤＲ及びＦＲが、この方式を使用して同定され得る。免疫グロブリン鎖のアミノ酸に関する他の付番方式としては、ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１８５－２０３；２００５）及びＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７－６７０；２００１）が挙げられる。

【0020】

本明細書において「結合断片」又は「断片」と互換的に使用される「抗原結合断片」は、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる抗体の一部である。抗原結合断片としては、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（例えば、ＶＨＨ断片）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ又はラクダなどの任意の哺乳動物供給源に由来し得る。抗原結合断片は、標的抗原との結合に関してインタクトな抗体と競合し得、且つこの断片は、インタクトな抗体の改変（例えば、酵素的切断若しくは化学的切断）により生成され得るか、又は組換えＤＮＡ技術若しくはペプチド合成を使用して新たに合成され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲ、例えば抗原に結合する抗体由来の重鎖ＣＤＲ３を含む。他の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体の重鎖由来の３つのＣＤＲの全て又は抗原に結合する抗体の軽鎖由来の３つのＣＤＲの全てを含む。更なる他の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の６つのＣＤＲの全て（重鎖由来の３つ及び軽鎖由来の３つ）を含む。

【0021】

抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片（その各々が単一の抗原結合部位を有する）と、残部の「Ｆｃ」断片（免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のドメイン以外の全てを含有する）が生成される。Ｆａｂ断片は、軽鎖及び重鎖由来の可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。このように、「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））と１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖由来のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖成分を表す。免疫グロブリンの「Ｆｃ断片」又は「Ｆｃドメイン」は、一般に、２つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択によりＣＨ４ドメインを含む。

【0022】

「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのＣ末端において、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片である。

【0023】

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、ヒンジ領域において重鎖間のジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片である。

【0024】

「Ｆｖ」断片は、抗体由来の完全な抗原認識部位及び結合部位を含有する最小の断片である。この断片は、緊密な非共有結合状態にある、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）との二量体からなる。この構成において、各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位が画定される。単一の軽鎖又は重鎖の可変領域（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖ断片の半分）は、ＶＨ及びＶＬの両方を含む結合部位全体よりも親和性が低いが、抗原を認識してこれに結合する能力を有する。

【0025】

「単鎖可変抗体断片」又は「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在し、任意選択により、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするペプチドリンカーをＶＨ領域とＶＬ領域との間に含む（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２：４２３－４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照されたい）。

【0026】

「ナノボディ」は、重鎖抗体の重鎖可変領域である。そのような可変ドメインは、そのような重鎖抗体の完全に機能的な最小の抗原結合断片であり、分子質量は、わずか１５ｋＤａである。Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３－５７，２００４を参照されたい。軽鎖を欠く機能的重鎖抗体は、特定の種の動物、例えばコモリザメ、テンジクザメ並びにラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びラマでは天然に生じる。これらの動物において、抗原結合部位は、単一ドメインであるＶＨＨドメインに縮小されている。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成する。即ち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ_２Ｌ_２を有するのみの重鎖のホモ二量体（「重鎖抗体」又は「ＨＣＡｂ」と称される）である。ラクダ化ＶＨＨは、報告によれば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有し、且つＣＨ１ドメインを欠く、ＩｇＧ２定常領域及びＩｇＧ３定常領域と再結合する。ラクダ化ＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６：２６２８５－９０，２００１）、溶液中で高い安定性を有する（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４１：３６２８－３６，２００２）ことが判明している。ラクダ化重鎖を有する抗体の作製方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号明細書及び同第２００５／００３７４２１号明細書に記載されている。代替の足場は、サメＶ－ＮＡＲ足場により厳密に一致するヒト可変様ドメインから作製され得る。

【0027】

組換えタンパク質が抗体又はその結合断片である実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る、起こり得る天然に存在する変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、典型的には様々なエピトープを対象とする様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、個々の抗原部位又はエピトープを対象とするものである。モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のあらゆる技術を使用して生産することができ、例えば免疫化スケジュールの完了後に動物（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物）から採取した脾細胞を不死化することによって生産することができる。

【0028】

いくつかの実施形態では、抗体（例えば、モノクローナル抗体）又はその結合断片は、ヒト化抗体又はその結合断片である。「ヒト化抗体」とは、領域（例えば、フレームワーク領域）が、ヒト免疫グロブリン由来の対応する領域を含むように改変されている抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、齧歯動物又はウサギなどの非ヒト動物において最初に作られたモノクローナル抗体から生産することができる。典型的には抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体内の特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体内の対応する残基と相同となるように改変されている。ヒト化は、例えば、齧歯動物又はウサギ可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより、種々の方法を使用して実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４－１５３６，１９８８を参照されたい）。別の種において作製された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトフレームワーク領域（ＦＲ）又は特定のヒト生殖系列遺伝子由来のＦＲにグラフトすることができる。コンセンサスヒトＦＲを作り出すために、いくつかのヒト重鎖アミノ酸配列又はヒト軽鎖アミノ酸配列に由来するＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。

【0029】

他の実施形態では、抗体（例えば、モノクローナル抗体）又はその結合断片は、完全ヒト抗体又はその結合断片である。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する又はそれを示す可変領域及び定常領域を含む、抗体である。完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することによって生産することができる。そのような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無効化し、ヒト重鎖タンパク質及びヒト軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大型断片をマウスゲノム中に挿入することによって生成される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全相補体より少ない相補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系改変を全て有する動物を得る。免疫原が投与されると、これらのトランスジェニック動物は、その免疫原に免疫特異的である抗体を産生するが、こうした抗体は、可変領域を含めて、マウスアミノ酸配列ではなくヒトアミノ酸配列を有する。そのような方法の更なる詳細に関しては、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。完全ヒト抗体の作製に好適な１つの特定のトランスジェニックマウス系統は、米国特許第６，１１４，５９８号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第６，８３３，２６８号明細書、同第７，０４９，４２６号明細書、同第７，０６４，２４４号明細書；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１；Ｍｅｎｄｅｚｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ，１９９８，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ，１８８：４８３－４９５；Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１－２３；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，５９３－５９７に記載されているＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）トランスジェニックマウス系統である。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関連する追加の方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第６，７１３，６１０号明細書、同第６，６７３，９８６号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第５，９３９，５９８号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，３００，１２９号明細書、同第６，２５５，４５８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書及び同第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。

【0030】

本発明の方法に従って生産され得る抗体、多重特異性抗原結合タンパク質及び融合タンパク質は、１つ以上の標的タンパク質に結合することができ、標的タンパク質には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－１８受容体サブユニット、アンジオポエチン（例えば、アンジオポエチン－１、アンジオポエチン－２又はアンジオポエチン－４）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦ－β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（とりわけＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４又はＴＧＦ－β５）を含む）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＦＧＦ受容体、Ｃ５補体、ベータ－クロトー、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、ＣＧＲＰ受容体、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１型受容体（ＰＡＣ１受容体）、ＩｇＥ、腫瘍抗原、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＨＥＲ－２、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ－４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、スクレロスチン、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ－１）、ＴＬＡ１、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子－３（ＩＣＡＭ－３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ－γ－１受容体、ＨＬＡ－ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、Ｌ－セレクチン、ＩＰＮ－γ、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）並びに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0031】

特定の実施形態では、本発明の方法に従って生産される組換えタンパク質は、Ｔ細胞エンゲージ分子である。「Ｔ細胞エンゲージ分子」という用語は、少なくとも１つのドメインを含む分子であって、そのドメインの構造が、分化抗原群３（ＣＤ３）などのＴ細胞の表面上の抗原への特異的結合を可能にする抗体（例えば、完全長免疫グロブリン分子）の最小の構造的特徴に由来するか又はそれを含むものを指す。したがって、Ｔ細胞エンゲージ分子は、一般に、１つ以上の結合ドメインを含み、その各々は、典型的には、特異的標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖「相補性決定領域」又はＣＤＲ（即ちＶＬ領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ちＶＨ領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）並びに好ましくは軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方に由来する６つ全てのＣＤＲの存在によって定義され得る。Ｔ細胞エンゲージ分子は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体由来のドメイン又は領域（例えば、ＣＤＲ又は可変領域）を含み得る。本発明の方法に従って生産されるＴ細胞エンゲージ分子は、１つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージ分子は、単鎖ポリペプチドである。他の実施形態では、Ｔ細胞エンゲージ分子は、２つ以上のポリペプチド鎖を含む（例えば、ポリペプチド二量体又は多量体である）。特定の実施形態では、Ｔ細胞エンゲージ分子は、４つのポリペプチド鎖を含み、例えば抗体又は免疫グロブリンタンパク質の形式を有し得る。

【0032】

本発明の方法に従って生産されるＴ細胞エンゲージ分子は、好ましくは、少なくとも二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子であり得る。「二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子」という用語は、２つの異なる抗原に特異的に結合することができる分子を指す。本発明の文脈において、そのような二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子は、標的細胞の細胞表面上の癌細胞抗原（例えば、ヒト癌細胞抗原）及びＴ細胞の細胞表面上のＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）に特異的に結合する。本発明の方法に従って生産される二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）並びに５Ｔ４、ＡＦＰ、ＢＣＭＡ、ベータ－カテニン、ＢＲＣＡ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤＨ１９、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ｇｐＡ３３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２、ＩＧＦＲ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＧＥ－１２、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥタンパク質、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２から選択される標的癌細胞抗原に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子は、上記の抗原のいずれかなどの癌細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３イプシロン）に特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含む単鎖ポリペプチドである。他の実施形態では、二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子は、上記の抗原のいずれかなどの癌細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３イプシロン）に特異的に結合する第２のｓｃＦｖと、単鎖Ｆｃドメイン（ｓｃＦｃドメイン）とを含む単鎖ポリペプチドである。

【0033】

抗体若しくはその抗原結合断片、多重特異性抗原結合タンパク質、融合タンパク質又はＴ細胞エンゲージ分子若しくはその結合ドメインは、類似の結合アッセイ条件下において、標的抗原に対し、他の無関係なタンパク質に対する親和性と比較して著しく高い結合親和性を有し、その結果、その標的抗原を区別することができる場合、その標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗体若しくはその結合断片、多重特異性抗原結合タンパク質、融合タンパク質又はＴ細胞エンゲージ分子若しくはその結合ドメインは、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が≦１×１０^－６Ｍでその抗原に結合し得る。抗体若しくはその結合断片、多重特異性抗原結合タンパク質、融合タンパク質又はＴ細胞エンゲージ分子若しくはその結合ドメインは、Ｋ_Ｄが≦１×１０^－８Ｍの場合、「高い親和性」で抗原に特異的に結合する。結合親和性は、アフィニティーＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置によるもの）、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載されている結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）及びＫｕｍａｒａｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２７８：１６５－８２，２０１５に記載され、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で用いられているようなバイオレイヤー干渉法を含む多様な技術を使用して決定され得る。

【0034】

特定の実施形態では、本発明の方法に従って生産される組換えタンパク質は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する第１の結合ドメインと、ＣＤ３イプシロンに特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子である。本発明の方法に従って生産され得るそのようなＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子の例は、例えば、国際公開第２０１０／０３７８３６号パンフレット、国際公開第２０１７／０２３７６１号パンフレット、国際公開第２０１７／１２１９０５号パンフレット、国際公開第２０１７／１３４１５８号パンフレット、国際公開第２０１８／０９８３５６号パンフレット、国際公開第２０１９／２２４７１８号パンフレット及び国際公開第２０２０／２０６３３０号パンフレットに記載されており、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って生産されるＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子は、単鎖Ｔ細胞エンゲージ分子である。本明細書で使用される場合、「単鎖Ｔ細胞エンゲージ分子」又は「単鎖Ｔ細胞エンゲージポリペプチド」は、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子を指す。即ち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子中のドメインの全てが（任意選択によりペプチドリンカーを介して）互いに連結されて、単一のポリペプチド鎖を形成している。本発明の文脈におけるそのような単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子の一例は、国際公開第２０１７／１３４１５８号パンフレットに記載されている分子など、アミノからカルボキシルの順に、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖドメイン、第１のペプチドリンカー、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメイン、第２のペプチドリンカー及びｓｃＦｃドメインを含む単鎖ポリペプチドである。一実施形態では、本発明の方法に従って生産される組換えタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む単鎖二重特異性Ｔ細胞エンゲージポリペプチドである。この単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に更に詳細に記載されており、配列番号２～５に記載のヌクレオチド配列を含む。

【0035】

本発明の方法は、細胞培養生産プロセス中に宿主細胞によって発現又は生産される組換えタンパク質のＬＭＷ種の種類及び／又は量を低減させる。組換えタンパク質のＬＭＷ種とは、インタクトであり完全にアセンブリされた形態の組換えタンパク質の分子量よりも分子量が小さい、組換えタンパク質の断片、トランケート型又は他の不完全なバリアントを指す。ＬＭＷ種としては、タンパク質分解断片、ｍＲＮＡスプライスバリアントの細胞発現から生じるトランケート型及び多鎖ポリペプチドのタンパク質の場合の単一成分ポリペプチド（例えば、組換えタンパク質が抗体である場合には軽鎖又は重鎖のみの種）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0036】

特定の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質組成物であって、低減された量の、タンパク質のＬＭＷ種を含む組換えタンパク質組成物を生産する方法を提供し、本方法は、タンパク質をコードする核酸を発現する哺乳動物細胞を、タンパク質が哺乳動物細胞によって発現及び分泌される期間にわたり、細胞培養培地中で培養することであって、培養培地のｐＨは、約６．９０以下に維持される、培養することと、発現されたタンパク質を細胞培養培地から回収して組換えタンパク質組成物を得ることであって、組成物は、２０％未満の、タンパク質の総ＬＭＷ種を含む、得ることとを含む。

【0037】

目的組換えタンパク質を発現するように操作した哺乳動物細胞株を作製するには、最初に、組換えタンパク質（又は多鎖タンパク質の場合にはその成分）をコードする１つ以上の核酸を１つ以上の発現ベクターに挿入する。本明細書で使用される「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、特定の宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞において作動可能に連結されているコード配列の発現に必要である所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含有する、組換えＤＮＡ分子を指す。ベクターには、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、プラスミド及び他の非ウイルスベクターが含まれ得る。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御する配列であって、イントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されているコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得る。「作動可能に連結される」とは、この用語が適用される構成要素が、それらの固有機能を果たすことができる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結される」ベクター内の制御配列、例えばプロモーターは、この制御配列が正常に活性化することによってタンパク質コード配列の転写がもたらされ、コードされたタンパク質の組換え発現が生じるように配置される。哺乳動物細胞での発現のための発現ベクターに有用な核酸制御配列としては、プロモーター、エンハンサー並びに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。分泌シグナルペプチド配列は、任意選択により、発現ベクターによってコードされて、目的コード配列に作動可能に連結されることも可能であり、これにより、必要に応じて細胞から組換えタンパク質がより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に、発現されたタンパク質を分泌させることができる。ベクターは、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする１種以上の選択マーカー遺伝子も含み得る。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどのタンパク質レポーターを使用するタンパク質断片相補アッセイを用いるベクターが使用される（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号明細書を参照されたい）。好適な哺乳動物発現ベクターは、当技術分野で公知であり、市販されてもいる。

【0038】

典型的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用されるベクターは、プラスミドを維持するための配列と、外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列とを含有する。このような配列は、典型的には、以下のヌクレオチド配列：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写制御配列及び翻訳制御配列、転写終結配列、ドナースプライス部位及びアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のための天然又は異種のシグナルペプチド配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入するためのポリリンカー領域並びに選択マーカーエレメントの１つ以上を含む。ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築され得、更なるエレメントを個別に入手してベクターにライゲートし得る。

【0039】

ベクター成分は、同種（即ち宿主細胞と同じ種及び／又は株に由来）、異種（即ち宿主細胞種又は株以外の種に由来）、ハイブリッド（即ち２つ以上の供給源に由来するフランキング配列の組み合わせ）、合成又は天然であり得る。ベクターにおいて有用な成分の配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに確認されたものなど、当技術分野で周知の方法によって得ることができる。加えて、それらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／又は好適なプローブでゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。

【0040】

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要とされ、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）を特徴とするものである。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側及び発現されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。

【0041】

複製起点は、宿主細胞内のベクターの増幅を補助する。それらは、市販の原核生物ベクターの一部として含まれ得、また公知の配列に基づいて化学合成してベクターにライゲートされ得る。種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はＨＰＶ若しくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が、哺乳動物細胞でベクターをクローニングするのに有用である。

【0042】

本発明の方法で使用される発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され且つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、プロモーターを含有する。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（即ち５’側；一般に約１００～１０００ｂｐ以内）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。従来、プロモーターは、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターという２つのクラスの一方に分類される。誘導性プロモーターは、その制御下で、栄養素の有無又は温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応じて、ポリヌクレオチドからの転写レベルの上昇を引き起こす。一方、構成的プロモーターは、それが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、即ち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。多様な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源の核酸からプロモーターを取り出し、ベクターに所望のプロモーター配列を挿入することにより、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。哺乳動物宿主細胞とともに使用するのに好適なプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。

【0043】

高等真核生物による組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を増大させるために、エンハンサー配列をベクターに挿入し得る。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増大させる、通常、約１０～３００ｂｐ長の核酸のシス作用性エレメントである。エンハンサーは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位の５’側及び３’側の両方の位置で見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的にはウイルス由来のエンハンサーが使用される。当技術分野で公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターを活性化するための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクターにおいて、コード配列の５’側及び３’側のいずれにも位置し得るが、典型的にはプロモーターの５’側の部位に位置する。

【0044】

適切な天然又は異種のシグナルペプチド配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクター中に組み込んで、細胞外への組換えタンパク質の分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、組換えタンパク質が生産される宿主細胞のタイプに依存し、異種シグナル配列で天然シグナル配列を置き換えることができる。シグナルペプチドの例は、本明細書でより詳細に説明される。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドとしては、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されているインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されているインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号明細書に記載されているインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されているＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；及び欧州特許第０４６０８４６号明細書に記載されているＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。

【0045】

転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドをコードする領域の末端に対して３’側に位置し、転写を終結させる役割を果たす。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列は、ライブラリから容易にクローニングされるか、又は更にベクターの一部として商業的に購入されるが、当業者に公知の核酸合成方法を使用して容易に合成することもできる。

【0046】

哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための例示的な転写制御配列及び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。一般に使用されるプロモーター及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２型、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。例えば、前初期遺伝子１のヒトＣＭＶプロモーター／エンハンサーを使用することができる。例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１－９８を参照されたい。ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えばＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス並びにポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、哺乳動物宿主細胞中で構造遺伝子配列を発現させるための他の遺伝エレメントを提供することができる。ウイルス初期及び後期プロモーターは、いずれもウイルスの複製起点も含有し得る断片としてウイルスゲノムから容易に得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３；Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０），Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７－５１１）。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位から、ＳＶ４０ウイルス複製起点の部位に位置するＢｇｌ Ｉ部位に延在するおよそ２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さい又はより大きいＳＶ４０断片も使用することができる。

【0047】

選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖した宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質若しくは他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン若しくはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質；又は（ｃ）複合培地若しくは規定培地から入手できない極めて重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子がある。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子も原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞の両方における選択に使用することができる。

【0048】

他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅し得る。増幅は、増殖又は細胞生存に極めて重要なタンパク質の生産に必要とされる遺伝子が組換え細胞の累代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例としては、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）／メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）系、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体を、その形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように適合されている選択圧下に置く。培地中の選択薬剤濃度を連続的に上昇させる条件下で形質転換細胞を培養することによって選択圧をかけ、それにより選択遺伝子と、目的タンパク質をコードするＤＮＡとの両方が増幅される。その結果、増幅されたＤＮＡから多量の目的ポリペプチドが合成される。

【0049】

発現ベクターが構築され、組換えタンパク質（又は多鎖タンパク質の場合にはその成分）をコードする１つ以上の核酸分子がベクターの適当な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入され得る。選択された宿主細胞への発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、形質導入、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション又は他の公知の技術を含む周知の方法によって行われ得る。選択される方法は、ある程度、使用される宿主細胞のタイプに応じることとなる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者に周知であり、マニュアル及び他の技術刊行物、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）に記載されている。

【0050】

本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞が新たなＤＮＡ又はＲＮＡを含有するように改変されている場合、細胞は、形質転換されていると見なされる。例えば、トランスフェクション、形質導入又は他の技術によって新たな遺伝物質を導入することにより、細胞がその天然状態から遺伝子改変された場合、細胞は、形質転換されている。トランスフェクション又は形質導入に続いて、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることにより、その細胞のＤＮＡで組換えられ得るか、又はエピソームエレメントとして複製されることなく一過性に維持され得るか、又はプラスミドとして独立して複製され得る。形質転換ＤＮＡが細胞分裂とともに複製される場合、細胞は「安定的に形質転換」されていると見なされる。

【0051】

本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性又は外因性ＤＮＡの取り込みを指す。多数のトランスフェクション技術が当技術分野で周知であり、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（上述）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。本明細書で使用される場合、「形質導入」という用語は、ウイルスベクターを介して外来性ＤＮＡが細胞に導入されるプロセスを指す。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌを参照されたい。

【0052】

本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換されているか又は形質転換されることが可能であり、それにより目的遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫の形態又は遺伝的構造が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結されている、組換えタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、組換えタンパク質を合成し、これは、その後、（宿主細胞が培地中に分泌する場合）培養培地から収集され得るか、又は（分泌されない場合）生産する宿主細胞から直接収集され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいか又は必要であるポリペプチドの改変（グリコシル化又はリン酸化など）及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの種々の要因に依存する。本発明の方法の特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。

【0053】

例示的な宿主細胞としては、原核生物、酵母又は高等真核生物の細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）並びにシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）並びにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、組換えポリペプチドに好適なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母が下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）並びに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのいくつかの他の属、種及び株が本明細書で一般に利用可能であり、有用である。

【0054】

脊椎動物宿主細胞も組換えタンパク質の発現に好適な宿主である。組換えタンパク質発現のための宿主として好適な哺乳動物細胞株は、当技術分野で周知であり、以下に限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞及びいくつかの他の細胞株が挙げられる。ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質を発現させるための本発明の方法のいくつかの実施形態において好ましい哺乳動物宿主細胞である。

【0055】

特定の実施形態では、本発明の方法は、形質転換宿主細胞（例えば、形質転換哺乳動物宿主細胞）を、組換えタンパク質が哺乳動物宿主細胞によって発現及び分泌される条件下及び期間で、細胞培養培地中で培養することを含む。「培養する」又は「培養すること」という用語は、多細胞生物又は組織の外部で細胞を増殖及び繁殖させることを指す。宿主細胞は、懸濁液中で又は固体基材に接着させた付着形式で培養され得る。細胞培養は、流動床バイオリアクタ、中空糸バイオリアクタ、ローラーボトル、振盪フラスコ又は撹拌槽バイオリアクタ内において、マイクロキャリアの有無にかかわらず確立され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＣＨＯ細胞などの形質転換哺乳動物細胞は、小規模、例えば５リットル以下、３リットル以下又は１リットル以下の容量で生産バイオリアクタ中において培養され得る。他の実施形態では、形質転換哺乳動物細胞（例えば、形質転換ＣＨＯ細胞）は、容積が少なくとも５００リットル、少なくとも１，０００リットル、少なくとも２，０００リットル、少なくとも５，０００リットル、少なくとも１０，０００リットル又は少なくとも１５，０００リットルの生産バイオリアクタ中で培養される。このような生産細胞培養は、数週間、更に数ヶ月にわたって維持することができ、その間、細胞は、所望の組換えタンパク質を生産する。

【0056】

温度、溶存酸素含有量、撹拌速度などを含む、哺乳動物細胞に好適な培養条件は、当技術分野で公知であり、細胞培養の期又は段階によって変動し得る。細胞培養の「増殖期」とは、細胞が概して急速に分裂している指数関数的細胞増殖の期間（即ち対数期）を指す。増殖期中、細胞は、必要な栄養素及び添加物を含有する細胞培養培地中において、特定の細胞株の最適な増殖が達成されるような条件下（通常、加湿した制御雰囲気下で約２５～４０℃の温度）で培養される。細胞は、典型的には、増殖期に１～８日間、例えば３～７日間、例えば７日間にわたって維持される。特定の細胞株の増殖期の長さは、当業者が決定することができ、一般に、培養が増殖条件下で維持された場合に可能である最大生細胞密度の約２０％～８０％の範囲内の生細胞密度まで、特定の細胞が繁殖するのに十分な期間となる。細胞培養の「生産期」とは、対数的な細胞増殖が終了し、組換えタンパク質の生産が優勢となる期間を指す。生産期中、通常、組換えタンパク質の継続的な生産を補助するために培地が補充される。

【0057】

本発明の方法の特定の実施形態では、細胞培養の増殖期から生産期への移行を推進するために培養条件が調整され得る。例えば、細胞培養の増殖期は、細胞培養の生産期よりも高い温度で起こり得る。いくつかの実施形態では、増殖期は、約３５℃～約３８℃の第１の温度で起こり得、生産期は、約２９℃～約３７℃、任意選択により約３０℃～約３６℃又は約３０℃～約３４℃の第２の温度で起こり得る。一実施形態では、培養の増殖期から生産期への移行を推進するために、約３５℃～約３７℃から約３１℃～約３３℃の温度への温度シフトが用いられ得る。例えば、カフェイン、酪酸塩及びヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質産生の化学誘導剤は、温度シフトと同時に、その前及び／若しくは後又は温度シフトの代わりに添加され得る。誘導剤が温度シフト後に添加される場合、それらは、温度シフトの１時間～５日後、任意選択により温度シフトの１～２日後に添加され得る。

【0058】

細胞培養培地という用語は、本明細書で使用される場合、インビトロ細胞培養中に宿主細胞の増殖及び生存を維持するのに十分な栄養素を含有する溶液を指す。典型的には、細胞培養培地は、緩衝液、塩、エネルギー源、アミノ酸、ビタミン及び微量必須元素を含有する。培養中の適切な宿主細胞の増殖を補助することのできる任意の培地が使用され得る。特定の培養宿主細胞における細胞増殖、細胞生存率及び／又は組換えタンパク質生産を最大化するための他の成分が更に補充され得る細胞培養培地は、市販されており、とりわけＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地及び無血清培地（例えば、ＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ）を含み、これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及び他のベンダーから得ることができる。細胞培養培地は、無血清、無タンパク質、無増殖因子及び／又は無ペプトン培地であり得る。細胞培養培地は、通常の推奨濃度より高い濃度で使用され得る栄養素又は他のサプリメントの添加によっても富栄養化され得る。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される培養培地は、既知組成培地であり、これは、全ての成分が既知の化学構造及び濃度を有する細胞培養培地を指す。既知組成培地は、典型的には、無血清であり、且つ加水分解物又は動物由来成分を含有しない。

【0059】

種々の培地配合物が、例えば、ある段階（例えば、増殖段階若しくは増殖期）から別の段階（例えば、生産段階若しくは生産期）への移行を推進させるために、且つ／又は細胞培養中の条件（例えば、灌流培養中に提供される濃縮培地）を最適化するために、培養期間中に使用され得る。増殖培地配合物は、細胞増殖を促進し、且つタンパク質発現を最小化するために使用され得る。生産培地配合物は、新たな細胞の増殖を最小化しつつ、目的組換えタンパク質の生産及び細胞の維持を促進するために使用され得る。細胞培養の生産期の過程で消費される、典型的には栄養素及びアミノ酸などのより濃縮された成分を含有する培地であるフィード培地は、活性培養、特に流加式、半灌流式又は灌流式で動作される培養を補い、且つ維持するために使用され得る。このような濃縮フィード培地は、細胞培養培地の成分の大部分を、例えばその通常の量の約５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍又は更に約１０００倍で含有し得る。

【0060】

本発明の方法では、哺乳動物細胞は、バッチ培養、流加培養又は灌流培養で培養され得る。「バッチ培養」とは、細胞培養を確立するために必要とされる全ての成分（形質転換宿主細胞、培養培地及び栄養素を含む）が培養プロセスの開始時に培養容器に提供され、培養物への補充が行われない細胞培養方法を指す。バッチ培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分が採取され、回収された組換えタンパク質が任意選択により精製される。「流加培養」とは、追加の成分又は栄養素（例えば、フィード培地）が、培養プロセスの開始後に１回以上の不連続な時間に培養物に提供される、細胞培養方法を指す。流加培養は、典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分が採取され、組換えタンパク質が任意選択により精製される。「灌流培養」とは、追加の成分又は栄養素（例えば、フィード培地）が、培養プロセスの開始後に連続的又は半連続的に培養物に提供される、細胞培養方法を指す。培地中の細胞及び／又は成分の一部は、灌流培養では典型的には連続的又は半連続的に取り出される。本発明の方法の特定の実施形態では、形質転換哺乳動物細胞は、灌流培養で培養される。

【0061】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、少なくとも１００×１０^５細胞／ｍＬ、例えば約１００×１０^５細胞／ｍＬ～約１０×１０^７細胞／ｍＬ、約２５０×１０^５細胞／ｍＬ～約９００×１０^５細胞／ｍＬ、約３００×１０^５細胞／ｍＬ～８００×１０^５細胞／ｍＬ又は約４５０×１０^５細胞／ｍＬ～６５０×１０^５細胞／ｍＬの生細胞密度まで培養される。細胞密度は、血球計、コールターカウンター又は自動細胞分析器（例えば、Ｃｅｄｅｘ自動細胞カウンター）を使用して測定され得る。生細胞密度は、死細胞のみに取り込まれるトリパンブルーで培養試料を染色することにより決定され得る。次いで、細胞総数を計数し、染色された細胞の数を細胞総数で除してその逆数を取ることにより生細胞密度が決定される。

【0062】

実施例に記載されるように、細胞培養の生産期中に細胞培養培地を特定のｐＨ範囲内に維持すると、形質転換哺乳動物細胞によって生産される組換えタンパク質のＬＭＷ種が低減することが予想外に見出された。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、組換えタンパク質をコードする核酸を発現する哺乳動物細胞を細胞培養培地中で培養することを含み、細胞培養培地のｐＨは約６．９０以下に維持される。特定の実施形態では、細胞培養の生産期中の細胞培養培地のｐＨは、約６．７０～約６．９０、例えば、約６．７０～約６．８０、約６．７５～約６．８５、約６．７８～約６．８２、約６．８０～約６．９０又は約６．８５～約６．９０のｐＨに維持される。一実施形態では、細胞培養培地のｐＨは、約６．７０に維持される。別の実施形態では、細胞培養培地のｐＨは、約６．８０に維持される。更に別の実施形態では、細胞培養培地のｐＨは、約６．９０に維持される。特定の実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質組成物は、６．９０を上回るｐＨ、例えば、７．００、７．１０、７．２０、７．３０又は７．４０のｐＨに維持された培養培地中で培養された形質転換哺乳動物細胞によって生産された同じ組換えタンパク質の組成物と比較して低減された量の、タンパク質の総ＬＭＷ種を含む。

【0063】

本発明の方法では、哺乳動物細胞は、組換えタンパク質が哺乳動物細胞によって発現及び分泌される所定の期間にわたり培養される。この期間（即ち細胞培養の生産期の持続期間）は、少なくとも３日、少なくとも７日、少なくとも１０日又は少なくとも１５日である。特定の実施形態では、細胞培養の生産期の持続期間は、約７日～約２８日、約１０日～約３０日、約７日～約１４日、約１０日～約１８日、約３日～約１５日、約５日～約８日、約１２日～約１５日、約１２日～約１８日又は約１５日～約２１日である。いくつかの実施形態では、細胞培養の生産期の持続期間は、７日、８日、９日、１２日、１５日、１８日又は２１日である。好ましくは、細胞培養培地のｐＨは、細胞培養の生産期の全持続期間にわたり上記の範囲内に維持される。

【0064】

本発明の方法は、発現された組換えタンパク質を宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）又は細胞培養培地から回収して組換えタンパク質組成物を得ることを更に含む。組換えタンパク質が細胞内で生産される場合（即ち哺乳動物宿主細胞によって分泌されない場合）、最初の工程として、宿主細胞を（例えば、機械的せん断、浸透圧ショック又は酵素的方法によって）溶解し、粒状破片（例えば、宿主細胞及び溶解断片）を、例えば、遠心分離、凝集、音波分離又は濾過（例えば、精密濾過、限外濾過、タンジェンシャルフロー濾過、交互タンジェンシャルフロー濾過及び深層濾過によるものを含む）によって除去する。特定の好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）によって培養培地中に分泌される。このような実施形態では、組換えタンパク質を、遠心分離又は精密濾過を通して宿主細胞から分離することができ、且つ任意選択により続いて限外濾過を通して濃縮することができる。いくつかの実施形態では、発現された組換えタンパク質は、精密濾過によって細胞培養培地から回収される。これら及び他の実施形態では、発現された組換えタンパク質は、交互タンジェンシャルフロー濾過によって細胞培養培地から回収される。

【0065】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞又は細胞培養培地から回収された組換えタンパク質を１つ以上の単位操作によって更に精製又は部分精製して、細胞培養培地成分、宿主細胞タンパク質若しくは核酸又は他のプロセス若しくは産物関連不純物を除去することができる。「単位操作」という用語は、目的組換えタンパク質を精製するプロセスの一部として実施される機能的工程を指す。例えば、単位操作としては、目的組換えタンパク質の捕捉、精製、ポリッシング、ウイルス不活化、ウイルス濾過、濃縮及び／又は配合などの工程が挙げられ得るが、これらに限定されない。単位操作は、捕捉工程及びウイルス不活化工程など、単一の目的又は複数の目的を達成するように設計され得る。単位操作には、処理工程間の工程の保持又は保存も含まれ得る。当業者は、精製される組換えタンパク質の特徴、組換えタンパク質が発現される宿主細胞の特徴及び宿主細胞が増殖した培養培地の組成に基づいて、組換えタンパク質を更に精製するための適切な単位操作を選択することができる。

【0066】

捕捉単位操作としては、目的組換えタンパク質に結合する薬剤を含有する樹脂及び／又は膜を利用する捕捉クロマトグラフィー、例えばアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）などを挙げることができる。このようなクロマトグラフィー材料は、当技術分野で公知であり、市販されてもいる。例えば、組換えタンパク質が抗体であるか又は抗体由来の成分（例えば、Ｆｃドメイン）を含有する場合、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ又はプロテインＬなどのリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーが、組換えタンパク質を更に精製するための捕捉クロマトグラフィー単位操作として用いられ得る。他の実施形態では、目的組換えタンパク質は、そのアミノ末端又はカルボキシル末端にポリヒスチジンタグを含み得、後にＩＭＡＣを使用して精製され得る。組換えタンパク質を、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ又はｃ－ｍｙｃエピトープなどの他の精製タグを含むように操作して、その後、そのようなタグ又はエピトープを対象とする特異的抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。

【0067】

ウイルス夾雑物を不活化させ、低減させ、且つ／又はなくすための単位操作には、濾過プロセス及び／又は溶液条件の調整が含まれ得る。ウイルス不活化を達成するための１つの方法は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＜４）でのインキュベーションである。低ｐＨのウイルス不活化操作後、ウイルスが不活化された溶液を、後続の単位操作の要件とより適合するｐＨに再調整する中和単位操作が続き得る。低ｐＨのウイルス不活化操作後、生じた濁り又は沈殿を除去するために深層濾過などの濾過が更に続く場合がある。温度又は化学組成の調整（例えば、界面活性剤の使用）も、ウイルス不活化を達成するために使用され得る。ウイルス濾過は、旭化成（Ｐｌａｖｏｎａ（登録商標））及びＥＤＭ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＶＰｒｏ（登録商標））から入手可能なものなどのマイクロ濾過膜又はナノ濾過膜を使用して実施され得る。

【0068】

ポリッシング単位操作では、目的タンパク質の精製並びに夾雑物及び不純物の除去に、種々のクロマトグラフィー方法が利用され得る。ポリッシュクロマトグラフィー単位操作は、フロースルーモード（目的タンパク質が溶離液中に含まれ、夾雑物及び不純物がクロマトグラフィー媒体に結合される）又は結合及び溶出モード（目的タンパク質がクロマトグラフィー媒体に結合され、夾雑物及び不純物が通過した後又はクロマトグラフィー媒体から洗い出された後に溶出される）のいずれかにおいて使用され得る薬剤を含有する樹脂及び／又は膜を利用する。このようなポリッシュクロマトグラフィー方法の例としては、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及びカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）などのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；混合様式又は多様式クロマトグラフィー（ＭＭ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡ）；逆相クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

原薬又は医薬品をバルク貯蔵するための、産物の濃縮及び所望の製剤緩衝液への目的組換えタンパク質の緩衝液交換は、限外濾過及びダイアフィルトレーションによって行われ得る。

【0070】

本発明の方法によって生産される組換えタンパク質組成物は、好ましくは、２０％未満の、組換えタンパク質の総ＬＭＷ種を含む。本明細書に詳述されているように、本発明の方法は、細胞培養プロセス中に宿主細胞によって生産される組換えタンパク質のＬＭＷ種の種類及び／又は量を低減させ、これによりそのようなＬＭＷ種を特異的に除去するように設計された下流単位操作の必要性をなくす。特定の実施形態では、組換えタンパク質組成物は、採取細胞培養液である。「採取細胞培養液」という用語は、細胞、細胞破片又は他の大型微粒子を組換えタンパク質から分離するための１つ以上の操作によって処理された溶液を指す。そのような操作としては、上記したように、凝集、遠心分離、音波分離並びに種々の形態の濾過（例えば、深層濾過、精密濾過、限外濾過、タンジェンシャルフロー濾過及び交互タンジェンシャルフロー濾過）が挙げられるが、これらに限定されない。採取細胞培養液には、細胞培養溶解物及び細胞培養上清が含まれる。採取細胞培養液は、約０．１μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜又はより好ましくは約０．２２μｍの孔径を有する膜で濾過することにより、微小粒子状物質及び可溶性凝集体を除去するために更に清澄化され得る。したがって、いくつかの実施形態では、組換えタンパク質組成物は、清澄化された採取細胞培養液である。

【0071】

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質組成物は、組換えタンパク質の総ＬＭＷ種を１８％未満、例えば、組換えタンパク質の総ＬＭＷ種を約１５％以下、約１２％以下、約１０％以下、約８％以下又は約６％以下含む。特定の実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質組成物は、約１％～約１８％の、組換えタンパク質の総ＬＭＷ種、例えば約５％～約１５％、約２％～約１０％、約１％～約８％又は約２％～約６％の、組換えタンパク質の総ＬＭＷ種を含む。特定の実施形態では、ＬＭＷ種は、タンパク質のスプライスバリアントアイソフォームを含む。本明細書で使用される場合、「スプライスバリアントアイソフォーム」とは、タンパク質をコードする組換え遺伝子から生じた選択的にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質のバリアントを指す。スプライスバリアントアイソフォームは、典型的には、目的とする組換えタンパク質と異なるアミノ酸配列を有し、組換えタンパク質のトランケート型であることが多い。

【0072】

組換えタンパク質のＬＭＷ種は、標準的な還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム法（ｒＣＥ－ＳＤＳ）を使用して検出及び定量され得る。組換えタンパク質のＬＭＷ種の測定に好適である例示的なｒＣＥ－ＳＤＳ法は、実施例１に記載されている。組換えタンパク質のＬＭＷ種を検出及び定量する他の方法は、当業者に公知であり、それらとしては、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ））、沈降速度超遠心分離及びモル質量を決定するための静的光散乱検出を伴うＳＥ－ＨＰＬＣが挙げられ得る。

【0073】

本発明は、哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の選択的スプライスバリアントアイソフォームの発現及び分泌を低減させる方法も提供する。組換えタンパク質のＬＭＷ種は、細胞培養プロセス中に、形質転換宿主細胞による望ましくないｍＲＮＡスプライスバリアントの発現から生じ得る。実施例３に記載されているように、分泌シグナルペプチドのカルボキシ末端（即ちＣ末端）にあるグリシン残基をコードするためにＧＧＴコドンを使用すると、強力なスプライスドナー部位が形成され、組換えタンパク質のトランケート型を発生させる選択的スプライシング事象が引き起こされることが見出された。シグナルペプチドのＣ末端にあるグリシン残基をコードするためにＧＧＴコドンをＧＧＧコドンで置き換えると、選択的スプライスバリアントが排除され、形質転換宿主細胞によって生産されるＬＭＷ種の量が低減した。したがって、特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の選択的スプライスバリアントアイソフォームの発現及び分泌を低減させる方法を含み、本方法は、シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、組換えタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと同じオープンリーディングフレーム内にあり、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドのカルボキシ末端の６アミノ酸内に存在する任意のグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む、トランスフェクトすることと、組換えタンパク質が発現され、且つ細胞培養培地中に分泌される条件下において、培地中で哺乳動物細胞を培養することと、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収して組換えタンパク質組成物を得ることとを含む。この方法は、形質転換哺乳動物細胞によって発現される組換えタンパク質のＬＭＷ種を更に低減させるために、形質転換哺乳動物細胞を約６．９０以下のｐＨに維持された細胞培養培地中で培養する上記の方法と組み合わせることができる。

【0074】

上記のように、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多くの場合、宿主細胞による組換えタンパク質の分泌を促進するために組換えタンパク質生産のための発現ベクターに組み込まれ、それにより培養培地から組換えタンパク質を直接回収することが可能となる。シグナルペプチドのＣ末端の６アミノ酸内に存在するグリシンコドンＧＧＴは、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列に偶然存在するスプライスアクセプター部位と一致し得るスプライスドナー部位として機能するようになされている。この潜在的スプライスドナー部位がシグナル配列のＣ末端内に位置していることから、発生し得るあらゆる選択的スプライシング事象により、組換えタンパク質のトランケート型がもたらされる可能性がある。したがって、シグナルペプチドのＣ末端の６アミノ酸内に存在する任意のグリシン残基のグリシンＧＧＧコドンを含むシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することで、強力なスプライスドナー部位が排除されることにより、望ましくないスプライシング事象の可能性が低減する。

【0075】

したがって、特定の実施形態では、本方法は、シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、組換えタンパク質をコードする第２のポリペプチドとを含む核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを含み、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドのＣ末端の６アミノ酸内に存在する任意のグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。「カルボキシ末端」、「カルボキシル末端」又は「Ｃ末端」とは、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で終結するポリペプチド鎖の端部に位置するアミノ酸を指す。したがって、ポリペプチド鎖のＣ末端の６アミノ酸内のアミノ酸は、ポリペプチド鎖内のアミノ酸の最後から６番目、最後から５番目、最後から４番目、最後から３番目、最後から２番目又は最後のアミノ酸である。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの最後から４番目のＣ末端アミノ酸として存在するグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの最後のＣ末端アミノ酸として存在するグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。他の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの最後から６番目のＣ末端アミノ酸として存在するグリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。更なる他の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの最後から６番目及び最後から４番目のＣ末端アミノ酸として存在する各グリシン残基のグリシンをコードするＧＧＧコドンを含む。上記の実施形態のいずれかでは、任意のグリシンＧＧＧコドンの直前のヌクレオチドは、アデニン（Ａ）以外のヌクレオチド（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ））であり得る。一実施形態では、任意のグリシンＧＧＧコドンの直前のヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）である。

【0076】

第１のポリヌクレオチドによってコードされ得る例示的なシグナルペプチドとしては、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号６）、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号７）、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号８）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号９）、ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１０）、ＭＤＩＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＫＣ（配列番号１１）、ＭＤＩＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１２）、ＭＤＭＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１３）、ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＴＦ（配列番号１４）、ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１５）、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣ（配列番号１６）、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＥ（配列番号１７）、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号１８）及びＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号１９）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする。他の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする。更なる他の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする。第１のポリヌクレオチドは、Ｃ末端の６アミノ酸内に存在する任意のグリシンをコードするコドンがＧＧＧであれば、上記のシグナルペプチドのいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。更に別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。

【0077】

第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の組換えタンパク質などの任意の所望の組換えタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、抗体又はその結合断片である。他の実施形態では、組換えタンパク質は、抗体の軽鎖又は重鎖である。更に他の実施形態では、組換えタンパク質は、融合タンパク質である。特定の他の実施形態では、組換えタンパク質は、Ｔ細胞エンゲージ分子、例えば単鎖Ｔ細胞エンゲージ分子である。関連する実施形態では、組換えタンパク質は、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子である。そのような一実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質をコードする。そのような一実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。これら及び他の実施形態では、シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと組換えタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

【0078】

好ましくは、核酸は、組換えタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと同じオープンリーディングフレーム内において、シグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む。「オープンリーディングフレーム」という用語は、ポリペプチドに翻訳される、開始コドン（例えば、ＤＮＡではＡＴＧ又はＲＮＡではＡＵＧ）で始まり、終止コドン（例えば、ＤＮＡではＴＡＡ、ＴＧＡ及びＴＡＧ又はＲＮＡではＵＡＡ、ＵＧＡ及びＵＡＧ）で終了するコドンの連続区間を指す。したがって、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが同じオープンリーディングフレーム内に位置する場合、シグナルペプチド及び組換えタンパク質は、同じｍＲＮＡに転写され、且つ同じポリペプチド鎖に翻訳される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にヌクレオチドが介在することなく、核酸内で第２のポリヌクレオチドに隣接して位置する。

【0079】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドとを含む核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、組換えタンパク質が発現され、且つ細胞培養培地中に分泌される条件下において、培地中で哺乳動物細胞を培養することと、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収して組換えタンパク質組成物を得ることとを含む。このような方法工程は、上で詳述されている。特定の実施形態では、核酸によるトランスフェクション後、哺乳動物細胞は、上記の細胞培養の生産期の持続期間中、約６．９０以下のｐＨに維持された細胞培養培地中で培養される。一実施形態では、哺乳動物細胞は、細胞培養の生産期の持続期間中、約６．７０～約６．９０のｐＨに維持された細胞培養培地中で培養される。別の実施形態では、哺乳動物細胞は、細胞培養の生産期の持続期間中、約６．７０のｐＨに維持された細胞培養培地中で培養される。更に別の実施形態では、哺乳動物細胞は、細胞培養の生産期の持続期間中、約６．８０のｐＨに維持された細胞培養培地中で培養される。更に別の実施形態では、哺乳動物細胞は、細胞培養の生産期の持続期間中、約６．９０のｐＨに維持された細胞培養培地中で培養される。

【0080】

本発明の方法の特定の実施形態では、哺乳動物細胞によって発現される組換えタンパク質の選択的スプライスバリアントアイソフォームの数又は量は、シグナルペプチドのＣ末端の６アミノ酸内にある任意のグリシン残基のグリシンＧＧＴコドンを含む、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞によって発現される選択的スプライスバリアントアイソフォームの数又は量と比較して低減する。スプライスバリアントを検出及び定量するための技術は、当業者に公知であり、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ノーザンブロット分析及びゲル電気泳動法が含まれ得る。

【0081】

特定の実施形態では、本発明の方法に従って生産される組換えタンパク質は、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子などのＴ細胞エンゲージ分子である。したがって、本発明は、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ細胞エンゲージ分子をコードする単離された核酸も含む。「単離された分子」という用語（分子が例えばタンパク質、核酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである場合）は、その起源又は誘導源により、（１）その天然状態ではそれに付随する、天然に会合した成分と会合していない分子、（２）同じ種に由来する他の分子を実質的に含まない分子、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される分子、又は（４）天然に存在しない分子である。したがって、化学合成されるか、又はそれが天然に生じる細胞と異なる細胞系で発現される分子は、その天然に会合する成分から「単離されている」ことになる。分子は、当技術分野で周知の精製技術を使用する単離により、天然に会合した成分を実質的に含まないようにもされ得る。本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子及びそれらの断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸は、ヒト供給源及び非ヒト種に由来し得る。一実施形態では、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子をコードする単離された核酸は、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子をコードする単離された核酸は、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチド配列を含む。

【0082】

「単離された核酸」又は「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する、隣接する遺伝子配列から分離された核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子又はオリゴヌクレオチドなど、鋳型から酵素的又は化学的に合成された核酸の場合は、このようなプロセスから得られる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子とは、別個の断片の形態の核酸分子又はより大きい核酸コンストラクトの成分としての核酸分子を指す。一実施形態では、核酸は、夾雑内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）に概説されているもの）により、実質的に純粋な形態で、且つその成分であるヌクレオチド配列の同定、操作及び回収を可能にする量又は濃度において、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡに由来したものであり得る。そのような配列は、好ましくは、典型的には真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供且つ／又は構築されている。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在し得、この場合、これはコード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書中で論じられている任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への産生の方向は、転写方向と称され、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

【0083】

本発明は、ベクター、例えば単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子をコードする核酸を含む上記の発現ベクター及び単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子をコードする核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞又は細胞株、特に哺乳動物宿主細胞又は細胞株も包含する。いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターは、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸を含む。関連する実施形態では、本発明は、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離された核酸又は発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞を提供する。特定の好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。加えて、本発明は、本明細書に詳述される発現ベクター及び形質転換宿主細胞又は細胞株を使用して、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子を生産する方法を含む。一実施形態では、本方法は、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離された核酸又は発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞を、Ｔ細胞エンゲージ分子が発現される条件下において、細胞培養培地中で培養することと、培養培地又は宿主細胞からＴ細胞エンゲージ分子を回収することとを含む。

【0084】

本発明は、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質組成物も含む。そのような組換えタンパク質組成物は、他の細胞培養法によって生産される組換えタンパク質のＬＭＷ種の量又は種類と比較して、組換えタンパク質のＬＭＷ種の量又は種類が低減している。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質は、抗体又はその結合断片であり、組換えタンパク質組成物は、２０％未満の、抗体又はその結合断片の総ＬＭＷ種を含む。他の実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質は、融合タンパク質であり、組換えタンパク質組成物は、２０％未満の、融合タンパク質の総ＬＭＷ種を含む。特定の実施形態では、本発明の方法によって生産される組換えタンパク質は、Ｔ細胞エンゲージ分子、例えば単鎖Ｔ細胞エンゲージ分子であり、組換えタンパク質組成物は、２０％未満の、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含む。

【0085】

特定の関連する実施形態では、本発明は、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子と、その１種以上のＬＭＷ種とを含む組成物を提供し、組成物は、２０％未満の、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含み、Ｔ細胞エンゲージ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子のそのような組成物は、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を１８％未満、例えばＴ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を約１５％以下、約１２％以下、約１０％以下、約８％以下又は約６％以下含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子の組成物は、約１％～約１８％の、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種、例えば約５％～約１５％、約２％～約１０％、約１％～約８％又は約２％～約６％の、Ｔ細胞エンゲージ分子の総ＬＭＷ種を含む。実施例２に記載されているように、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子のＬＭＷ種は、機能アッセイにおいて活性をほとんど又は全く示さなかったため、生産プロセス中に生じるそのようなＬＭＷ種の量を制御することは、ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子含有組成物の効力を許容可能なレベルに維持するために重要である。いくつかの実施形態では、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子のＬＭＷ種は、Ｔ細胞エンゲージ分子のスプライスバリアントアイソフォームを含む。そのような一実施形態では、スプライスバリアントアイソフォームは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。本発明の組成物中の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子のＬＭＷ種の量又はレベルは、これらの種を検出及び定量するための上記の方法のいずれかによって決定され得る。特定の実施形態では、組成物中のＬＭＷ種の量又はレベルは、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）法によって決定される。そのような方法では、単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージポリペプチドのＬＭＷ種は、完全長単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージポリペプチド（即ち配列番号１の配列を含むポリペプチド）に対応するメインピークよりも早く溶出するため、ｒＣＥ－ＳＤＳ電気泳動図中のプレピークに対応する。いくつかの実施形態では、ｒＣＥ－ＳＤＳ法は、実施例１に記載されているように行われる。

【0086】

本発明は、本明細書に記載の組換えタンパク質組成物のいずれか１つと、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤を含む。例えば、特定の実施形態では、医薬製剤は、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物のいずれか１つと、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む。「薬学的に許容される」とは、用いられる投与量及び濃度でヒトレシピエントに対して非毒性であり、且つ／又はヒトに投与された場合にアレルギー若しくは有害反応を生じない分子、化合物及び組成物を指す。特定の実施形態では、医薬製剤は、組換えタンパク質組成物の例えばｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度若しくは放出速度、吸収性又は透過性を改変、維持又は保存するための材料を含有し得る。そのような実施形態では、好適な材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム若しくは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（グルタミン酸塩、酢酸塩、炭酸水素塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩若しくは他の有機酸など）；増量剤（マンニトール若しくはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン若しくはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース若しくはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなど）；着色剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸若しくは過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール若しくはソルビトールなど）；界面活性剤若しくは湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性促進剤（スクロース若しくはソルビトールなど）；等張化促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム若しくは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；希釈剤；賦形剤並びに／又は医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。治療使用のための分子を製剤化する方法及び好適な材料は医薬分野において知られており、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。

【0087】

本明細書に記載の組換えタンパク質組成物を含む医薬製剤としては、液体製剤、凍結製剤及び凍結乾燥製剤が挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥材料は、投与前に適切な液体で再構成される。凍結乾燥材料は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は凍結乾燥前にタンパク質組成物が存在したものと同じ製剤中で再構成され得る。再構成容量は、凍結乾燥後のタンパク質含有量及び再構成溶液中の組換えタンパク質の所望の濃度に依存するが、約０．５ｍｌ～約５ｍｌであり得る。再構成後の溶液は、所望の用量を投与するために、必要に応じて患者に投与する前に希釈剤（例えば、生理食塩水及び／又は静脈内溶液安定剤（ＩＶＳＳ））で更に希釈され得る。

【0088】

いくつかの実施形態では、本発明の医薬製剤は、本明細書に記載の組換えタンパク質組成物、緩衝液、安定剤及び任意選択により界面活性剤を含む。緩衝液は、製剤を生理学的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約４．０～約６．５のｐＨ範囲内に維持するために使用される。好適な緩衝液としては、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、酢酸塩、トリス、クエン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩及びリン酸塩緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、医薬製剤は、グルタミン酸塩緩衝液、特にＬ－グルタミン酸塩緩衝液を含む。グルタミン酸塩緩衝液を含む医薬製剤は、約４．０～約５．５のｐＨ、約４．０～約４．４のｐＨ又は約４．２～約４．８のｐＨを有し得る。

【0089】

「安定剤」とは、組換えタンパク質の天然の立体構造を安定化し、且つ／又はタンパク質の物理的若しくは化学的分解を防止するか若しくは低減させる賦形剤を指す。好適な安定剤としては、ポリオール（例えば、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、エリスリトール及びトレイトール）、糖（例えば、フルクトース、グルコース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース、マンノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、ソルボース、スクラロース、メレジトース及びラフィノース）並びにアミノ酸（例えば、グリシン、メチオニン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン又はグルタミン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、安定剤として糖を含む。これら及び他の実施形態では、糖は、スクロースである。

【0090】

特定の実施形態では、医薬製剤は、界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、溶解した液体の表面張力を低減させる働きをする物質を指す。界面活性剤は、例えば、液体製剤中の凝集、粒子形成及び／若しくは表面吸着を防止若しくは制御すること又は凍結乾燥及び／若しくは凍結乾燥製剤における再構成プロセス中にこれらの現象を防止若しくは制御することを含む、多様な目的のために医薬製剤中に含まれ得る。界面活性剤としては、例えば、有機溶媒及び水溶液の両方において部分的溶解性を示す両親媒性有機化合物が挙げられる。界面活性剤の一般的な特徴としては、水の表面張力を低減させ、油と水との間の界面張力を低減させ、且つミセルも形成するそれらの能力が挙げられる。本発明の医薬製剤に組み込まれ得る界面活性剤は、非イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤の両方を含む。好適な非イオン性界面活性剤としては、アルキルポリ（エチレンオキシド）、オクチルグルコシド及びデシルマルトシドなどのアルキルポリグルコシド、セチルアルコール及びオレイルアルコールなどの脂肪アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ及びコカミドＴＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の具体例としては、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート２８、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５などを含むポリソルベート；例えばポロキサルコール又はポリ（エチレンオキシド）－ポリ（プロピレンオキシド）としても知られるポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７又はポリエチレン－ポリプロピレングリコールなどを含むポロキサマー及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。好適なイオン性界面活性剤としては、例えば、アニオン性、カチオン性及び双性イオン界面活性剤が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、石鹸、脂肪酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム及び他のアルキル硫酸塩などのスルホン酸塩系又はカルボン酸塩系界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）及び塩化ベンザルコニウムなどの第四級アンモニウム系界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。双性イオン又は両性界面活性剤としては、例えば、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミンオキシド、コカミドプロピルベタイン及びココアンホグリシン酸塩が挙げられる。特定の実施形態では、医薬製剤は、非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０である。別の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

【0091】

特定の実施形態では、本発明の医薬製剤は、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物のいずれか、約５ｍＭ～約２０ｍＭのＬ－グルタミン酸、約０．００５％～約０．０１５％重量／体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）及び約７％～約１２％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む。他の実施形態では、本発明の医薬製剤は、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物のいずれか、約８ｍＭ～約１２ｍＭのＬ－グルタミン酸、約０．００８％～約０．０１２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）及び約８％～約１０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む。これらの製剤のｐＨは、約４．０～約４．４の範囲（例えば、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３又は約４．４のｐＨ）である。特定の一実施形態では、医薬製剤は、約０．５ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物、約１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０及び約９％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、医薬製剤は、約４．２のｐＨを有する。

【0092】

医薬製剤は、好ましくは、非経口投与に好適である。非経口投与とは、胃腸管経由以外の経路による分子の投与を指し、腹腔内、筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、皮下、脳内、脳室内及び髄腔内投与が含まれ得る。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、静脈内投与に好適である。他の実施形態では、医薬製剤は、皮下投与に好適である。非経口投与に好適な例示的な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液及び注射用滅菌溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。好ましくは、医薬製剤は、無菌であり、且つシリンジ又は他の注射デバイスを介した送達を可能にするのに十分な流動性を有する（即ち、製剤は、シリンジ又は他の注射デバイスを通過するのを妨げるほど過度に粘性のあるものではない）。滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過によって行われ得る。組成物が凍結乾燥される場合、この濾過方法を使用した滅菌は、凍結乾燥及び再構成前又は後のいずれかに行われ得る。非経口投与用医薬製剤は、凍結乾燥形態で又は溶液中に保存され得る。非経口製剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈内注射用溶液バッグ又はバイアルに入れられ得る。非経口製剤は、シリンジ、自動注射デバイス若しくはペン型注射デバイス又はそのような注射デバイスとの使用に適合されたカートリッジ中にも保存され得る。

【0093】

非経口、皮下又は静脈内投与は、注射（例えば、針及びシリンジを使用）又は注入（例えば、カテーテル及びポンプシステムを介して）によって実施され得る。いくつかの実施形態では、本発明による投与は、静脈内注射又は静脈内注入を介するものであることが想定される。通常、静脈内（ＩＶ）注入は、ライン、ポート若しくはカテーテル（小型の可撓性チューブ）、例えば中心静脈アクセス、又は大静脈に留置されるカテーテルである中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）、又は末梢静脈に留置されるカテーテルである末梢静脈カテーテル（ＰＶＣ）を介して投与される。一般に、カテーテル又はラインは、頸部の静脈（内頸静脈）、胸部の静脈（鎖骨下静脈若しくは腋窩静脈）、鼠径部の静脈（大腿静脈）又は腕の静脈（ＰＩＣＣライン若しくは末梢挿入型中心静脈カテーテルとしても知られる）を通して留置され得る。中心ＩＶラインは、静脈を通して進められ、大型の中心静脈（通常、上大静脈、下大静脈）又は更に心臓の右心房に流入するカテーテルを有する。末梢静脈（ＰＩＶ）ラインは、末梢静脈（腕、手、脚及び足の静脈）において使用される。ポートは、外部コネクタがない中心静脈ラインであり、代わりに、これは、シリコーンゴムで被覆され、皮膚の下に埋め込まれた小型リザーバを有する。薬剤は、皮膚に小さい針を刺し、シリコーンを突き刺してリザーバに入れることにより、断続的に投与される。針が引き抜かれると、リザーバカバーは自然に再封止される。カバーは、その耐用期間中に何百回もの針刺しを許容し得る。

【0094】

上記の医薬製剤は、バイアル、シリンジ、自動注射器又は他の容器若しくは送達デバイスに充填され得、且つ任意選択により医薬製品を調製するための使用指示書（例えば、疾患、障害又は状態（例えば、癌）を治療するか、予防するか又はその発生を低減させるための医薬製剤を使用するための指示書を含む処方情報）とともにキットにパッケージ化され得る。医薬製剤は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、結晶又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として提供され得る。医薬製剤が凍結乾燥粉末として提供される実施形態では、キットは、医薬製剤を再構成するために必要な希釈剤（例えば、注射用滅菌水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、製剤緩衝液）及び投与のための製剤を調製するための指示書も含み得る。医薬製剤が静脈内投与されることが意図されている特定の実施形態では、キットは、静脈内溶液安定剤（ＩＶＳＳ）の１つ以上のバイアルと、患者に送達するために医薬製剤を希釈する前に、ＩＶＳＳを使用してＩＶバッグを前処理するための指示書とを更に含み得る。ＩＶＳＳは活性医薬成分を含有せず、典型的には、防腐剤を含まない緩衝溶液である。一実施形態では、ＩＶＳＳは、ｐＨ７．０で、クエン酸（例えば、２０～３０ｍＭ）、リジン塩酸塩（例えば、１～３Ｍ）及びポリソルベート８０（０．０５％～０．１５％（ｗ／ｖ））を含む。特定の実施形態では、ＩＶＳＳは、ｐＨ７．０で、２５ｍＭのクエン酸、１．２５Ｍのリジン塩酸塩及び０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。

【0095】

本明細書に記載の組換えタンパク質組成物及びそのような組成物を含む医薬製剤は、疾患、障害又は状態の治療、予防又はその発生の低減を必要とする患者においてそれを治療するか、予防するか又はその発生を低減させるために使用され得る。本明細書で使用される「治療」又は「治療する」という用語は、疾患、障害若しくは状態（例えば癌）を有するか又は疾患、障害若しくは状態（例えば癌）と診断された患者、疾患、障害又は状態の症状を有する患者、疾患、障害又は状態を発症するリスクがある患者或いは疾患、障害若しくは状態、疾患、障害若しくは状態の１つ以上の症状、疾患、障害若しくは状態を発症するリスク又は疾患、障害若しくは状態に対する素因の、治癒、回復、緩和、軽減、変化、寛解又は改善を目的とする疾患、障害又は状態の素因を有する患者に対する組換えタンパク質組成物又はその組成物を含む医薬製剤の適用又は投与を指す。「治療」という用語は、患者における疾患の進行の遅延若しくは停止、疾患の症状の数若しくは重症度の減少又は患者が疾患の症状を有さない持続期間の頻度若しくは長さの増加を含む、患者における疾患のあらゆる改善を包含する。「患者」という用語には、ヒト患者が含まれる。

【0096】

特定の実施形態では、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物及びそのような組成物を含む医薬製剤は、ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行うために使用され得る。したがって、本発明は、ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物又はその組成物を含む医薬製剤のいずれかを患者に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行う方法で使用するための、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物又はその組成物を含む医薬製剤を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡ発現癌の治療を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載の単鎖ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージ分子組成物又はその組成物を含む医薬製剤の使用を包含する。

【0097】

「癌」という用語は、細胞の制御されない異常増殖によって引き起こされる種々の状態を指し、新生物、原発性腫瘍、続発性腫瘍及び他の転移性病変を含む。「癌」という用語には、病期、グレード、侵襲性、攻撃性又は組織型にかかわらず、種々の癌性状態が包含される。ＰＳＭＡ発現癌とは、新生物、原発性腫瘍、続発性腫瘍及び他の転移性病変が、検出可能なレベル（例えば、組織学的又は放射線学的手段（ＰＳＭＡ ＰＥＴスキャン）による）のＰＳＭＡタンパク質を表面に発現する細胞を含有する、癌性状態を指す。癌は、臨床的若しくは放射線学的手段によって検出される組織内の腫瘍の存在、生体試料（例えば、組織生検）中の癌性細胞若しくは異常細胞の検出、癌若しくは前癌性状態を示すバイオマーカー（例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ））の検出又は癌若しくは癌を発症するリスクを示す遺伝子型の検出を含むが、これらに限定されない多くの方法で検出され得る。ＰＳＭＡ発現癌としては、前立腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膀胱癌、精巣癌、結腸癌、神経膠芽腫、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌及び黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ発現癌は、前立腺癌である。前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌（アンドロゲン除去療法に抵抗性である前立腺癌）であり得る。これら及び他の実施形態では、前立腺癌は、転移性前立腺癌、特に転移性去勢抵抗性前立腺癌である。

【0098】

実行された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0099】

実施例１．生産培養のｐＨ制御を通した組換えポリペプチドの低分子量種バリアントの低減
タンパク質の組換え生産によりタンパク質のバリアントが生じる可能性があり、その一部は機能的活性の低減など、望ましくない特性又は特徴を有し得る。そのような産物関連不純物の一例は、タンパク質の低分子量（ＬＭＷ）種である。ＬＭＷ種には、選択的ｍＲＮＡスプライスバリアントなどのトランケート型の細胞発現；発現されたタンパク質の酵素的クリッピング；又は多鎖タンパク質の場合にはポリペプチド鎖の不完全なアセンブリに起因する、タンパク質の種々のトランケート型が含まれ得る。タンパク質のＬＭＷ種は原薬の純度及び全体的な活性に影響を及ぼし得るため、タンパク質生産中のＬＭＷ種の形成を制御することは重要である。本実施例では、生産細胞培養のｐＨが単鎖二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子のＬＭＷ種のレベルに及ぼす影響について記載する。

【0100】

二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子は、Ｔリンパ球エフェクター細胞を標的癌細胞に向けるように設計される。二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子によって誘導される標的癌細胞へのＴ細胞の近接は、Ｔ細胞活性化を誘発し、標的癌細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害をもたらす。癌細胞上の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）とＴ細胞上の分化抗原群３イプシロン（ＣＤ３ε）とに結合する、半減期を延長した二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを、ヒトＰＳＭＡに対する結合特異性を有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインと、ヒトＣＤ３εに対する結合特異性を有するｓｃＦｖドメインと、単鎖Ｆｃドメインとを含む単鎖ポリペプチドとして設計した。ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている。ＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドをコードする配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定的にトランスフェクトした。

【0101】

解凍後、Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチド産生ＣＨＯ細胞株を一連の振盪フラスコ内の無血清選択増殖培地で培養し、続いて３Ｌの２段振盪フラスコ内において既知組成の選択増殖培地で培養した（Ｎ－３、Ｎ－２）。培養物を温度３６．０℃、５．０％ＣＯ_２でインキュベートし、Ｎ－１及び生産（Ｎ）バイオリアクタに接種するのに十分な細胞量が得られるまで増殖させた。培養物をＮ－２振盪フラスコからＮ－１ ３Ｌバイオリアクタ（作業容量１．５Ｌ）に移した。Ｎ－１バイオリアクタを、以下のパラメータ：温度３６．０℃、ｐＨ６．９０、６４ｍｍＨｇでの溶存酸素（ＤＯ）及び３５０ＲＰＭでの撹拌を用いて、バッチ式で４日間動作させた。３Ｌの生産（Ｎ）バイオリアクタ（作業容量およそ１．５Ｌ）に約１０×１０^５細胞／ｍＬの初期生細胞密度で播種し、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システムを使用して、０日目から３日目までバッチ式で、次いで３日目から１５日目まで灌流式で稼働させた。３日目から１５日目まで、無血清の既知組成灌流培地を細胞培養物に初速度０．５０バイオリアクタ容積／日で継続的に供給し、８日目までに初速度を１．０バイオリアクタ容積／日まで上昇させた。生産バイオリアクタを、以下のパラメータ：温度は当初３６．０℃、７日目に３２．５℃に低下、６４ｍｍＨｇでのＤＯ及び３５０ＲＰＭでの撹拌で動作させた。生産培養のｐＨがＴ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種の発生に及ぼす作用を評価するために、生産バイオリアクタのｐＨ設定値を６．７０、６．８０、６．９０及び７．１０で評価した。グルコース濃度を４．０ｇ／Ｌ以上に維持するために、必要に応じてグルコース溶液をバイオリアクタに供給した。ＡＴＦ濾過システム内のフィルタをマイクロフィルタに切り替えて、Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドがフィルタを通過して透過液に入り、且つ細胞及び細胞破片がバイオリアクタ内に保持されるようにすることにより、バイオリアクタから採取した。マイクロフィルタからの透過液を収集して、採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得た。培養物を評価するために、生産バイオリアクタから毎日試料を採った。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞培養分析器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して生細胞密度（ＶＣＤ）及び細胞生存率を求めた。

【0102】

Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種を、還元及び変性条件下における流体力学的サイズの差異に基づいてポリペプチドを分離する還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）法を使用して、異なるｐＨ設定値で動作させたバイオリアクタから収集したＨＣＣＦ中で測定した。ＨＣＣＦの試料をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製して、細胞破片及び他のマトリックス成分からＴ細胞エンゲージャーポリペプチドを分離させた。次いで、精製した物質の一部を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とβ－メルカプトエタノールとを含有する還元性試料緩衝液と混合した。試料を、７０℃で１０分間インキュベートした後、ＳＤＳゲル緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を充填した無被覆溶融シリカキャピラリーに２５℃で電気運動的に注入した。ポリペプチドがＵＶ検出窓を通過する際に、光ダイオードアレイ検出器によってポリペプチドを検出した。ＵＶ吸光度を２２０ｎｍでモニタリングした。ＬＭＷ種の定量は、完全長Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドに対応するメインピークよりも早く溶出するピークの相対面積百分率に基づくものであった。

【0103】

これらの実験の結果は、生産バイオリアクタのｐＨ設定値を低下させると、ＨＣＣＦ中のＴ細胞エンゲージャーポリペプチドの総ＬＭＷ種が低減することを示している（図１、プロセス１細胞株）。生産バイオリアクタのｐＨ設定値を７．１０から６．７０に調整した場合、ＨＣＣＦ中の総ＬＭＷ種は、平均１９．５％から平均１１．６％に低減した（表１）。６．７０～７．１０のｐＨ範囲にわたり、ｐＨとＬＭＷ種との関係は二次最適曲線でモデル化可能であり、統計分析により、生産バイオリアクタのｐＨと総ＬＭＷ種との間に強い相関関係があることが示され、決定係数は、Ｒ^２＝０．９、補正Ｒ^２＝０．８９であった。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析により、ｐＨ７．１０の条件とｐＨ６．８０及び６．７０の条件との間並びにｐＨ６．８０の条件とｐＨ６．７０の条件との間でＬＭＷ種のパーセンテージに統計学的有意差が示された（表１）。加えて、生産バイオリアクタのｐＨは細胞培養物の増殖（ＶＣＤ）及び生存率（生細胞のパーセンテージ）に影響を与え、ｐＨ６．７０のバイオリアクタでは、より高いｐＨ値で動作させたバイオリアクタと比較して、培養１２日目までＶＣＤが低減した（図２）。しかしながら、ｐＨ設定値６．７０で稼働させた生産バイオリアクタは、より高いｐＨ設定値で稼働させた他のバイオリアクタと比較して、１５日間の培養期間終了時の生存率が高くなった（図３）。

【0104】

【表1】

【0105】

要約すると、本実施例に記載した実験により、生産バイオリアクタのｐＨ設定値を低減させると、細胞培養生産プロセス中にＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種の形成が低減することが実証される。

【0106】

実施例２．低分子量種バリアントは機能的活性に影響を及ぼす
ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種の特性及びそれらが原薬の機能的活性に及ぼす影響を更に特徴付けるために、ＬＭＷ種を単離するためのカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー法を開発した。一般に、ＣＥＸクロマトグラフィーは、主に表面電荷の不均一性に基づいてタンパク質を分離する。この方法でのピークの溶出は、より早く溶出する負に荷電した種（より酸性の種）及びより遅く溶出する正に荷電した種（より塩基性の種）による正味表面電荷に応じる。

【0107】

実施例１に記載のＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを発現する細胞から得たＨＣＣＦを、プロテインＡクロマトグラフィーにより部分的に精製し、次いでＣａｐｔｏ－ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ（登録商標）カチオン交換クロマトグラフィー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を利用するＣＥＸクロマトグラフィーカラムにロードした。移動相Ａは、ｐＨ４．５で１００ｍＭ酢酸塩、２１５ｍＭ塩化ナトリウムを含有し、移動相Ｂは、ｐＨ４．５で１００ｍＭ酢酸塩、３５０ｍＭ塩化ナトリウムからなった。１８カラム容量（ＣＶ）にわたり、０％～８０％の移動相Ｂで作製した直線塩勾配を使用してタンパク質を分離した。溶離液を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニタリングした。移動相を流量１５０ｃｍ／時でカラムにアプライした。代表的なクロマトグラムを図４に示す。図に示すように、Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種に富むピークは、完全長ポリペプチド（約２０ＣＶで溶出するメインピークで表される）よりも遅く溶出するため、ＬＭＷ種は完全長ポリペプチドよりも正に帯電している（即ちＴ細胞エンゲージャーポリペプチドの塩基性種である）。ＬＭＷ種に富むポストピークを収集し、精製水で１：６に希釈し、ＣＥＸカラムに再ロードして２回目の分離サイクルに供した。ＬＭＷ種に富むポストピークをこの２回目のサイクルから収集し、精製水で１：６に希釈し、ＣＥＸカラムに再ロードして３回目の分離サイクルに供した。最後のＬＭＷ種に富むポストピークを収集し、製剤緩衝液（１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ４．２）に透析し、膜（Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅ膜、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）に通してエンドトキシンを除去した。Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種に富むこの画分を使用して、Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを含有する原薬にＬＭＷ種を特定量（２５％、５０％又は７５％）でスパイクした。実施例１に記載のｒＣＥ－ＳＤＳ法によりスパイク済み原薬試料の分析試験を行って、試料中のＬＭＷ種の量を検証した（データは示さず）。

【0108】

異なる量のＬＭＷ種をスパイクした原薬試料の活性を、細胞ベースの効力アッセイ及び結合アッセイで試験した。細胞ベースの効力アッセイでは、活性化Ｔ細胞応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）の核内因子によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エフェクター細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ Ｌｕｃ細胞；カタログ＃Ｊ１６２１、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びヒトＰＳＭＡを天然に発現する前立腺癌細胞株であるＣ４－２Ｂ細胞を使用した。ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドは、Ｃ４－２Ｂ細胞上のＰＳＭＡとＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ Ｌｕｃ細胞上のＣＤ３とに結合し、それによりＴ細胞をＣ４－２Ｂ標的細胞に近接させ、Ｔ細胞を活性化させることで、結果としてＮＦＡＴ－ＲＥが介在する発光が生じる。細胞を様々な原薬試料とともに３～６時間インキュベートし、次いでルシフェラーゼ基質を添加した。プレートリーダーで発光シグナルを測定することにより、Ｔ細胞活性化を評価した。様々な量のＬＭＷ種をスパイクした各原薬試料の細胞ベースの効力アッセイにおける活性を、Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドの参照標準物質の活性に対して正規化し、相対効力パーセントとして報告した。

【0109】

結合アッセイでは、均質近接ベースのフォーマットを利用して、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドがヒスチジンタグ付き前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡｈｉｓ）及びビオチン化分化抗原群３イプシロン抗原（ＣＤ３ε－ビオチン）の両方に結合する能力を測定した。具体的には、様々な濃度のＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドを一定濃度のＣＤ３ε－ビオチン及びＰＳＭＡ－ｈｉｓの両方並びにドナービーズ及びアクセプタービーズとともにインキュベートした。ドナービーズは、フタロシアニンと、光増感剤と、ストレプトアビジンとを含有するヒドロゲルでコーティングされていた。アクセプタービーズは、チオキセン誘導体とニッケルキレートとを含有するヒドロゲルでコーティングされていた。ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドがＣＤ３ε－ビオチン及びＰＳＭＡ－ｈｉｓに結合すると、ストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズがビオチン化ＣＤ３εに結合し、ニッケルキレートでコーティングされたアクセプタービーズがＰＳＭＡ－ｈｉｓに結合し、これによりビーズが近接する。この複合体にレーザーを照射すると、周囲酸素がドナービーズによって一重項酸素に変換される。ビーズが近接している場合、一重項酸素によってアクセプタービーズ内で一連の化学反応が誘導され、光生成（発光）が生じ、これがプレートリーダーによって測定される。この結合アッセイでは、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドがＣＤ３ε－ビオチン及びＰＳＭＡ－ｈｉｓに結合したときに観察されるシグナルの用量依存的増大を測定した。試験原薬試料の活性を、５点平行線分析フォーマットを使用して、試験試料の反応をＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチド参照標準物質について得た反応と比較することにより決定し、相対効力パーセントとして報告した。

【0110】

図５に示すように、活性アッセイの結果から、両方のアッセイにおける原薬の効力が、原薬中に存在するＬＭＷ種の量が増加するにつれて減少することが明らかとなる。Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種に富む試料（図では１００％ＬＭＷ種と表示されている）は、両方のアッセイにおいて活性をほとんど示さなかった。原薬が２５％のＬＭＷ種を含有する場合でも、細胞ベースの活性アッセイにおける原薬の効力は、５０％近く低減した。Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種は不活性の産物バリアントであることから、本実施例に記載の実験の結果は、例えば実施例１に記載の方法を使用して、生産プロセス中にこれらのＬＭＷ種の発生を制御することの重要性を強調している。

【0111】

実施例３．選択的ＲＮＡスプライシングを防止するためのコドン最適化を介した組換えポリペプチドの低分子量種バリアントの低減
真核細胞では、ゲノムＤＮＡはまず、タンパク質コード配列（エクソン）及び非タンパク質コード配列（イントロン）の両方を含有するプレメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される。続いて、ＲＮＡスプライシング複合体であるスプライソソームがイントロンを除去し、エクソンを互いに接合させ、所望のタンパク質をコードする最終的な成熟ｍＲＮＡ配列を作り出す。スプライソソームは、プレｍＲＮＡのイントロン／エクソン接合部内のドナー部位、アクセプター部位及び分岐点部位を認識する。組換えタンパク質の生産では、イントロンは、典型的には目的タンパク質をコードする核酸配列に含まれない。むしろ、所望の成熟ｍＲＮＡ配列のＤＮＡコピーである相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が使用される。しかしながら、組換えタンパク質をコードするｃＤＮＡ内にコンセンサスに近いスプライスドナー部位及びアクセプター部位が存在すると、意図しない選択的スプライシング事象が誘発される場合があり得る。これにより、したがって、オーバーハング、欠失及び挿入を含めたタンパク質のアミノ酸配列に対する改変が生じ得る。更に、スプライスドナー部位又はアクセプター部位の存在は、必ずしもスプライシングの発生を意味するわけではなく、スプライシング事象は、ドナー部位及びアクセプター部位に隣接するヌクレオチド配列（例えば、組換えタンパク質をコードするｃＤＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれる部位の周囲のゲノムコンテキスト）に依存し得ることから、配列分析のみに基づいてこれらの選択的スプライシング事象がいつ発生するかを予測することは、困難であり得る（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，Ｖｏｌ．１１：１７７７－１７８７，２００５；Ｒｏｔｉｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１０，１６７１，２０１９を参照されたい）。

【0112】

ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのＬＭＷ種のレベルの上昇（例えば、＞２０％）が、実施例１に記載の細胞株に由来するＨＣＣＦ及び配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸で安定的にトランスフェクトした他の３つのＣＨＯ細胞クローンにおいて観察された。遺伝的特徴付けにより、経時的に一貫しており、細胞齢とは無関係である単一のトランケート型転写物バリアントの存在が明らかになった（図６）。コード配列に隣接するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を、様々なクローン及びプールから単離したゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ（ＲＮＡから調製）で実施した。この分析の結果により、バリアントは、ｃＤＮＡ ＰＣＲ分析からは全てのクローン及びプールで検出されたが（図７）、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲ分析では検出されなかった（データは示さず）ことが示され、これにより、バリアントが選択的スプライシングに起因する転写物バリアントであることが確認された。

【0113】

配列番号２のヌクレオチド５３～６０にあるカッパ可変１シグナルペプチド内の強力なスプライスドナー部位（ＧＡＧ｜ｇｔｇｃｇ）と、配列番号２のヌクレオチド６９５～７０８にあるＰＳＭＡ ｓｃＦｖドメイン内のスプライスアクセプター部位（ｃｔａｔｔｔｃａｔｃＡＧ｜ＴＴ）との組み合わせを使用する選択的スプライシングが、６５１ヌクレオチドの欠失をもたらすこの転写物バリアントの発生に関する機序である可能性があるとの仮説を立てた（図８）。この仮説を検証するために、カッパ可変１シグナルペプチドヌクレオチド配列内のコンセンサススプライスドナー部位を、ヌクレオチド５５～５７にあるグリシンコドンＧＧＴをグリシンコドンＧＧＧに置き換えることによって排除した。加えて、ＰＳＭＡ ｓｃＦｖヌクレオチド配列のコンセンサススプライスアクセプター部位を、ヌクレオチド７００～７０３及び７０４～７０６にあるセリンコドンＴＣＡをセリンコドンＴＣＣ（Ａ｜ＧＴＴ～Ｃ｜ＧＴＴ）に置き換えることによって弱めた。コードされたＰＳＭＡ×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドのアミノ酸配列は、これらのコドン変化の影響を受けなかった。改変核酸配列（配列番号４）を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトした。図９Ａ及び９Ｂに示すように、バリアントは、改変核酸配列を発現するクローンから単離したＲＮＡのノーザンブロット又はＲＴ－ＰＣＲ分析によって検出不可であったため、配列番号４に記載の最適化した核酸配列におけるこれらのコドン改変により、より短い転写物バリアントの発生が排除された。改変核酸配列を発現する細胞から得たＨＣＣＦを、実施例１に記載のｒＣＥ－ＳＤＳ法により分析して、ＬＭＷ種の量を定量した。改変核酸配列を発現する細胞から単離したＨＣＣＦ中に存在するＬＭＷ種のパーセントは、元の細胞株由来のＨＣＣＦ中に観察された２３％のＬＭＷ種から５％未満に著しく低減した（図１０）。これらの結果は、元の細胞株で観察されたＬＭＷ種のレベルの上昇が、代替転写物バリアントから生じるポリペプチドのトランケート型バリアントの産生に起因することを示唆している。カッパ可変１シグナルペプチド配列内の強力なスプライスドナー部位は天然に存在するため、配列の３’末端にあるＧＧＴグリシンコドンをＧＧＧグリシンコドンに置き換えるための本実施例に記載したコドン改変アプローチを、選択的スプライシングを回避するために、このシグナルペプチド又はカルボキシ末端の６アミノ酸内にグリシン残基を有するシグナルペプチドを使用して任意の組換えタンパク質産物の生産に使用することができる。

【0114】

生産培養のｐＨがＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドをコードする改変核酸配列を発現するこの第２の細胞株のＬＭＷ種のパーセンテージにも影響を及ぼすか否かを判定するために、実施例１に記載したように細胞株を培養して増殖させた。生産バイオリアクタのｐＨ設定値を６．７０、６．９０及び７．１０で評価した。生産バイオリアクタ及び採取プロセスの動作パラメータは、実施例１に記載したものと同じであった。この第２の細胞株（プロセス２細胞株）から得たＨＣＣＦ中のＬＭＷ種のパーセントは、Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドをコードする異なる核酸を含有するプロセス１細胞株から得たＨＣＣＦ中のＬＭＷ種よりもはるかに低いが、生産バイオリアクタのｐＨ設定値を低減させると、存在する総ＬＭＷ種が更に低減するように思われる。図１、プロセス２細胞株を参照されたい。

【0115】

本明細書において論じられ、且つ引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示された本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは、変化し得ることが理解される。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。

【0116】

当業者であれば、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を、単なるルーチン実験を使用して認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0117】

【表2】

【0118】

【表3】

【0119】

【表4】

【0120】

【表5】

【0121】

【表6】

【0122】

【表7】

【0123】

【表8】

【0124】

【表9】

【0125】

【表10】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】