特表 2024-517712 マルチプレックスアッセイプレート及び製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】マルチプレックスアッセイプレート及び製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20240416BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 501D

G01N33/543 525E

G01N33/53 U

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565856

(86)(22)【出願日】2022-04-25

(85)【翻訳文提出日】2023-11-24

(86)【国際出願番号】 US2022026147

(87)【国際公開番号】W WO2022232027

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/179,731

(32)【優先日】2021-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505243216

【氏名又は名称】メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ケンテン，ジョン エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】ニコレンコ，ガリーナ

(57)【要約】

本明細書に記載されるのは、二機能性アッセイ表面を調製する方法である。特に、一次試薬と二次試薬とを含むアッセイ表面を調製するための方法が提供される。一態様では、一次試薬と二次試薬とは、異なる表面化学によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬とチオール含有二次試薬とを含むアッセイ表面を調製するための方法が提供される。一態様では、捕捉標的ハイブリッドとチオール含有二次試薬とを含むアッセイ表面を調製するための方法が提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

二機能性アッセイ表面を調製する方法であって、前記方法が、
ａ．タンパク質性一次試薬とチオール含有二次試薬とを含むコーティング溶液を炭素含有アッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成することと、
ｂ．前記コーティングされたアッセイ表面を、前記タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬が前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートすることであって、前記チオール含有二次試薬が前記チオール含有二次試薬のチオール基を介して前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される、インキュベートすることと、を含む、方法。

【請求項2】

約１０ｎｌ～約１００ｎｌ、約２５ｎｌ～約７５ｎｌ、約４０ｎｌ～約６０ｎｌ、又は約５０ｎｌの前記コーティング溶液を前記炭素含有アッセイ表面上に分配することを含み、前記コーティング溶液が、前記アッセイ表面の結合ドメイン当たり約５０ｎｌの比率で前記アッセイ表面を覆う、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記コーティング溶液が、約１００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記コーティング溶液が、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記コーティング溶液が、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬と、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０１％～約０．１％のＴＲＩＴＯＮ－Ｘと、任意選択で約０．１％～約０．５％のリン酸緩衝生理食塩水中トレハロースと、約１ｍＭのＥＤＴＡ～約２０ｍＭのＥＤＴＡとを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記コーティング溶液が、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬と、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０３％のＴＲＩＴＯＮ－Ｘ１００と、約０．４％のリン酸緩衝生理食塩水中トレハロースと、約１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

リン酸緩衝生理食塩水が、２．６７ｍＭのＫＣｌと、１．４７ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４と、８．１ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４と、１３８ｍＭのＮａＣｌとを含む、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記コーティングされたアッセイ表面を室温で少なくとも６時間～最大約１２時間、一晩乾燥させることを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

二機能性アッセイ表面を調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）チオール含有二次試薬を含むオーバーコーティング溶液を、１つ以上のタンパク質性一次試薬が上に固定化された炭素含有アッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成することと、
（ｂ）前記コーティングされたアッセイ表面を、前記チオール含有二次試薬がチオール基を介して前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートすることと、を含む、方法。

【請求項10】

約１０μＬ～約１００μＬ、約２５μＬ～約７５μＬ、約３０μＬ～約５０μＬの、前記チオール含有二次試薬を含む前記オーバーコーティング溶液を前記炭素含有アッセイ表面上に分配することを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記オーバーコーティング溶液が、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、又は５μＭ～最大約１０μＭ、１５μＭ、又は２０μＭのチオール含有二次試薬を含む、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記オーバーコーティング溶液が、脱保護コンジュゲーション緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／１０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＤｉｌｕｅｎｔ １００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）から選択される緩衝液を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記コーティングされたアッセイ表面を、約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、若しくは７００ｒｐｍ～最大約８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ若しくは１０００ｒｐｍ、又は約６５０ｒｐｍ、６７５ｒｐｍ、７００ｒｐｍ～最大約７２５ｒｐｍ、若しくは７５０ｒｐｍ、又は約７００ｒｐｍ、７０５ｒｐｍ、７１０ｒｐｍ、７１５ｒｐｍ、７２０ｒｐｍ若しくは７２５ｒｐｍ、又は約７０５ｒｐｍで振盪しながら、室温で約１時間～約５時間、約１時間～約３時間、又は約２時間インキュベートすることを含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記炭素含有アッセイ表面が、マルチウェルプレートを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

１つ以上のタンパク質性一次試薬が、別個の結合ドメインで前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記タンパク質性一次試薬が、アレイ状に前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

各結合ドメインが、１つ以上のタンパク質性一次試薬と１つ以上のチオール含有二次試薬とを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

１つ以上の結合ドメインが、固有のタンパク質性一次試薬を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

１つ以上の結合ドメインが、固有のチオール含有二次試薬を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

１つ以上の結合ドメインが、共通のチオール含有二次試薬を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項21】

前記タンパク質性一次試薬が、前記炭素含有アッセイ表面上に非共有結合的に固定化される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記タンパク質性一次試薬が、前記炭素含有アッセイ表面上に共有結合的に固定化される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記タンパク質性一次試薬が、結合対を介して前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記タンパク質性一次試薬が、結合対の第１のメンバーを含み、前記炭素含有アッセイ表面が、前記結合対の第２のメンバーを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記タンパク質性一次試薬が、ビオチンを含み、前記炭素含有アッセイ表面が、アビジン又はストレプトアビジンを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

前記タンパク質性一次試薬が、タンパク質性捕捉試薬を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記タンパク質性捕捉試薬が、抗体を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

チオール含有二次試薬が、チオール化オリゴヌクレオチドを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記タンパク質性一次試薬が、標的分析物を含有するエクソソームに結合し、前記チオール含有二次試薬が、前記標的分析物に結合する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記炭素含有アッセイ表面を、前記チオール含有二次試薬を前記炭素含有アッセイ表面上に分配する前に、１つ以上のマレイミド基を導入するように処理する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記炭素含有アッセイ表面を、ＳＭ（ＰＥＧ）_ｎ（ｎ＝２～２４である）を含むアミン－スルフヒドリル架橋剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ｎ＝４である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記炭素含有アッセイ表面上に複数のチオール含有二次試薬を固定化することを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記チオール含有二次試薬が、チオール化オリゴヌクレオチドを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記チオール化オリゴヌクレオチドが、約１～約１００、約５～約５０、又は約１０～約３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記チオール化オリゴヌクレオチドが、リンカーを介してチオール基に付着したオリゴヌクレオチドを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

前記リンカーが、約３～約２０個の原子若しくは分子若しくは単位、又は少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０～最大約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の原子若しくは分子若しくは単位を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記チオール化オリゴヌクレオチドが、５’及び３’末端を有するオリゴヌクレオチド配列と、前記５’末端（５’末端チオール化オリゴヌクレオチド）、前記３’末端（３’末端チオール化オリゴヌクレオチド）、前記オリゴヌクレオチドの内部位置、又はそれらの組み合わせに組み込まれたチオール基とを含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記チオール化オリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記チオール化オリゴヌクレオチドが、１つ以上の非天然ヌクレオチド塩基を含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記非天然ヌクレオチド塩基が、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）；５－メチルデオキシシチジン、及びＳｕｐｅｒ Ｔ（５－ヒドロキシブチンル－２’－デオキシウリジン）から選択される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記チオール含有二次試薬が、結合対のチオール化メンバーを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記チオール含有二次試薬が、チオール化ビオチン（チオール－ビオチン）を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記チオール含有二次試薬が、チオール化ポリエチレングリコール（チオール－ＰＥＧ）を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記チオール化ポリエチレングリコールが、ビオチン（チオール－ＰＥＧ－ビオチン）を更に含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記チオール含有二次試薬が、チオール化フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記タンパク質性一次試薬が、標的分析物に特異的に結合するタンパク質性捕捉試薬を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記タンパク質性一次試薬が、抗原結合物質を含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記タンパク質性一次試薬が、抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項４７又は４８に記載の方法。

【請求項50】

前記タンパク質性一次試薬が、抗原、受容体、酵素、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項51】

前記タンパク質性一次試薬が、結合対の第１のメンバーを含み、前記標的分析物が、前記結合対の第２のメンバーを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項52】

前記結合対が、ストレプトアビジン又はアビジン及びビオチンから選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記炭素含有アッセイ表面が、マルチウェルプレートを含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記炭素含有アッセイ表面が、電極を含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記炭素含有アッセイ表面が、マルチウェルプレートを含み、前記マルチウェルプレートの１つ以上のウェルが、１つ以上の電極を含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記炭素含有アッセイ表面が、マルチウェルプレートを含み、前記プレートの各ウェルが、電極を含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記炭素含有アッセイ表面が、炭素含有電極を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記炭素含有アッセイ表面が、炭素インク電極を含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記タンパク質性一次試薬が、抗体を含み、前記チオール含有二次試薬が、チオール化オリゴヌクレオチドを含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法によって調製される二機能性アッセイ表面。

【請求項61】

二機能性アッセイ表面を調製する方法であって、前記方法が、
ａ．捕捉標的ハイブリッドとチオール含有二次試薬とを含むコーティング溶液を炭素含有アッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成することと、
ｂ．前記コーティングされたアッセイ表面を、前記捕捉標的ハイブリッドとチオール含有二次試薬とが前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートすることであって、前記チオール含有二次試薬がチオール基を介して前記炭素含有アッセイ表面上に固定化されることと、を含む、方法。

【請求項62】

二機能性アッセイ表面を調製する方法であって、前記方法が、
ａ．チオール含有二次試薬を含むオーバーコーティング溶液を、１つ以上の捕捉標的ハイブリッドが上に固定化された炭素含有アッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成することと、
ｂ．前記コーティングされたアッセイ表面を、前記チオール含有二次試薬がチオール基を介して前記炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートすることと、を含む、方法。

【請求項63】

前記捕捉標的ハイブリッドが、細胞、ウイルス誘導体、細胞小器官、細胞下構造、エクソソーム、小胞、又は治療用分子である、請求項６１又は６２に記載の方法。

【請求項64】

前記捕捉標的ハイブリッドが、細胞である、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記細胞が、細菌細胞、古細菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、又は植物細胞である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記コーティング溶液が、約０．２×１０^６細胞／ｍＬ～約５×１０^６細胞／ｍＬを含む、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記捕捉標的ハイブリッドが、核、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、液胞、葉緑体、インフラマソーム、細胞翻訳複合体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞小器官である、請求項６１又は６２に記載の方法。

【請求項68】

前記捕捉標的ハイブリッドが、ウイルス、ウイルス粒子、ビリオン、ビリオン膜、ビリオン膜断片、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウイルス誘導体である、請求項６１又は６２に記載の方法。

【請求項69】

前記捕捉標的ハイブリッドが、ミセル、膜調製物、膜ラフト、膜ゴースト、膜小胞、膜断片、人工脂質膜、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞下構造である、請求項６１又は６２に記載の方法。

【請求項70】

前記捕捉標的ハイブリッドが、リソソーム、エンドソーム、ペルオキシソーム、リポソーム、エクソソーム、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される小胞である、請求項６１又は６２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書に記載されるのは、二機能性アッセイ表面を調製するための方法である。

【背景技術】

【0002】

化学的、生化学的及び／又は生物学的アッセイを実施するための数多くの方法及びシステムが開発されており、このアッセイでは、サンプル中の１つ以上の分析対象物の存在及び／又は量が、結合反応、例えば、抗原－抗体反応、核酸ハイブリダイゼーション又は受容体－リガンド反応への分析物の関与を直接的又は間接的に検出することによって決定される。いくつかのアプローチでは、結合反応における分析物の関与は、１つ以上の結合材料に付着した観察可能な標識を測定することによって示される。これらの方法及びシステムは、医療診断、食品及び飲料検査、環境モニタリング、製造品質管理、創薬、並びに基礎科学研究を含むがこれらに限定されない広範な用途で使用される。

【0003】

単一の分析物のレベルを測定するアッセイ（シングルプレックスアッセイ）は、何十年もの間、生物学的研究の主流であった。また、複数の分析物を並行して測定するアッセイ（マルチプレックスアッセイ）を実行して、ワークフロー及びサンプル量の要件を軽減することもできる。マルチプレックスアッセイには、典型的には、１つ以上の結合ドメインを含む固体表面上での固定化、及び各分析物の結合ドメインが異なるビーズ又は粒子上にあるビーズ又は粒子上での固定化の２つの形式がある。

【0004】

いくつかのアッセイでは、１つ以上の結合ドメインが１つ以上の異なる試薬を含む二機能性アッセイ表面を有することが望ましい場合がある。しかしながら、サンプル中の１つ以上の標的分析物の分析のための二機能性アッセイ表面を作製するための方法が依然として必要である。

【発明の概要】

【0005】

本明細書に提供されるのは、二機能性アッセイ表面を調製するための方法である。一態様では、この方法は、一次試薬と二次試薬とを含むコーティング溶液をアッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成する直接コーティング方法を含む。一態様では、この方法は、二次試薬を含むオーバーコーティング溶液を、一次試薬が上に固定化されたアッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成するオーバーコーティング方法を含む。一態様では、一次試薬と二次試薬とは、異なる表面化学を介してアッセイ表面上に固定化される。

【0006】

一態様では、一次試薬と二次試薬とを含むコーティング溶液をアッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成する、二機能性アッセイ表面を調製するための直接的な方法が提供される。一態様では、一次試薬は、タンパク質性一次試薬である。一態様では、一次試薬は、捕捉標的ハイブリッドである。一態様では、二次試薬は、チオール含有二次試薬である。一態様では、二次試薬は、チオール化オリゴヌクレオチドである。一態様では、アッセイ表面は、炭素含有アッセイ表面である。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を、一次試薬と二次試薬とが炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートすることを含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール基を介して炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール基とアッセイ表面上の反応性官能基との間の共有結合の形成を通じて炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、この方法は、約１０ｎｌ～約１００ｎｌ、約２５ｎｌ～約７５ｎｌ、約４０ｎｌ～約６０ｎｌ、又は約５０ｎｌのコーティング溶液をアッセイ表面上に分配することを含む。

【0007】

一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１．５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１．５ｎＭ～約１０ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１．５ｎＭ～約１５ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１５ｎＭ～約３０ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約３０ｎＭ～約５０ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約５０ｎＭ～約１００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００ｎＭ～約１５０ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１５０ｎＭ～約３００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約３００ｎＭ～約５００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約５００ｎＭ～約７５０ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約７５０ｎＭ～約１０００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１０００ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。

【0008】

一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌ、又は７５０μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌのストレプトアビジンと、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０１％～約０．１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００、任意選択で約０．１％～約０．５％のリン酸緩衝食塩水中トレハロースと、任意選択で約４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、タンパク質Ａ、及びタンパク質Ｇを含むがこれらに限定されない追加のタンパク質性成分と、約１ｍＭのＥＤＴＡ～約２０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌ、又は７５０μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌのストレプトアビジンと、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０３％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、任意選択で約０．４％のリン酸緩衝生理食塩水中トレハロースと、任意選択で約４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ＨＳＡ、タンパク質Ａ、及びタンパク質Ｇを含むがこれらに限定されない追加のタンパク質性成分と、約１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌ、又は７５０μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌのストレプトアビジンと、約１５００ｎＭ～約２５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０３％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、任意選択で約０．４％のリン酸緩衝生理食塩水中トレハロース、任意選択的で約４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ＨＳＡ、タンパク質Ａ、及びタンパク質Ｇを含むがこれらに限定されない追加のタンパク質性成分と、約１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。一態様では、リン酸緩衝生理食塩水は、２．６７ｍＭのＫＣｌと、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４と、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４と、１３８ｍＭのＮａＣｌとを含む、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を室温で一晩乾燥させることを含む。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を約４０％の制御された湿度で乾燥させることを含む。

【0009】

一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌ、又は７５０μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドと、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０１％～約０．１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、任意選択で約０．１％～約０．５％のリン酸緩衝生理食塩水中トレハロースと、任意選択で約４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ＨＳＡ、タンパク質Ａ、及びタンパク質Ｇを含むがこれらに限定されない追加のタンパク質性成分と、約１ｍＭのＥＤＴＡ～約２０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌ、又は７５０μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドと、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０３％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、約０．４％のリン酸緩衝生理食塩水中トレハロースと、任意選択で約４００μｇ／ｍｌ～約７５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ＨＳＡ、タンパク質Ａ、及びタンパク質Ｇを含むがこれらに限定されない追加のタンパク質性成分と、約１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。一態様では、リン酸緩衝生理食塩水は、２．６７ｍＭのＫＣｌと、１．４７ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４と、８．１ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４と、１３８ｍＭのＮａＣｌとを含む、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を室温で一晩乾燥させることを含む。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を約４０％の制御された湿度で乾燥させることを含む。

【0010】

一態様では、二次試薬を含むオーバーコーティング溶液を、１つ以上の一次試薬が上に固定化されたアッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成する、二機能性アッセイ表面を調製するためのオーバーコーティング方法が提供される。一態様では、アッセイ表面は、炭素含有アッセイ表面である。一態様では、一次試薬は、タンパク質性一次試薬である。一態様では、一次試薬は、捕捉標的ハイブリッドである。一態様では、二次試薬は、チオール含有二次試薬である。一態様では、二次試薬は、チオール化オリゴヌクレオチドである。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を、チオール含有二次試薬がチオール基を介して炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートすることを含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール基とアッセイ表面上の反応性官能基との間の共有結合の形成を通じて炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、この方法は、約１０μＬ～約１００μＬ、約２５μＬ～約７５μＬ、又は約３０μＬ～約５０μＬのオーバーコーティング溶液をアッセイ表面上に分配することを含む。一態様では、オーバーコーティング溶液は、約０．０１μＭ～約２０μＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、オーバーコーティング溶液は、脱保護コンジュゲーション緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／１０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＤｉｌｕｅｎｔ １００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）から選択される緩衝液を含む。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を、約５００ｒｐｍ～約７２５ｒｐｍで振盪しながら、室温で約１時間～約５時間、約１時間～約３時間、又は約２時間インキュベートすることを含む。一態様では、この方法は、コーティングされたアッセイ表面を、約７０５ｒｐｍで振盪しながら、室温でインキュベートすることを含む。

【0011】

一態様では、アッセイ表面は、マルチウェルプレートの一部である。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、マルチウェルプレートの一部である。

【0012】

一態様では、１つ以上の一次試薬が、別個の結合ドメインでアッセイ表面上に固定化される。一態様では、１つ以上のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、別個の結合ドメインで炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、複数のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、複数の一次試薬が、互いに異なる標的に結合する一次試薬を含む。一態様では、一次試薬は、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、１つ以上のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、アレイ状に炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、１つ以上の二次試薬が、アッセイ表面上に固定化される。一態様では、１つ以上のチオール含有二次試薬が、アッセイ表面上に固定化される。

【0013】

一態様では、一次試薬は第１の結合ドメインに固定化され、二次試薬は第２の結合ドメインに固定化される。一態様では、複数のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、複数の一次結合ドメインに固定化され、複数のチオール含有二次試薬が、複数の二次結合ドメインに固定化される。一態様では、各一次結合ドメインは、固有の一次試薬を含む。一態様では、各二次結合ドメインは、固有の二次試薬を含む。一態様では、各二次結合ドメインは、共通の二次試薬を含む。

【0014】

一態様では、各結合ドメインは、一次試薬と二次試薬とを含む。一態様では、各結合ドメインは、タンパク質性一次試薬とチオール含有二次試薬とを含む。一態様では、各結合ドメインは、捕捉標的ハイブリッドとチオール含有二次試薬とを含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の一次試薬を含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の二次試薬を含む。一態様では、各結合ドメインは、共通の二次試薬を含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の一次試薬と固有の二次試薬とを含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の一次試薬と共通の二次試薬とを含む。

【0015】

一態様では、一次試薬は、炭素含有アッセイ表面上に非共有結合的に固定化される。一態様では、一次試薬は、炭素含有アッセイ表面上に非共有結合的に固定化されたタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドである。一態様では、一次試薬は、炭素含有アッセイ表面上に共有結合的に固定化される。一態様では、一次試薬は、炭素含有アッセイ表面上に共有結合的に固定化されるタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドである。一態様では、一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、結合対を介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、結合対を介して炭素含有アッセイ表面上に固定化されるタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドである。一態様では、一次試薬は、結合対の第１のメンバーを含み、アッセイ表面は、結合対の第２のメンバーを含む。一態様では、一次試薬はビオチンを含み、アッセイ表面はアビジン又はストレプトアビジンを含む。一態様では、一次試薬は、タンパク質性捕捉試薬を含む。一態様では、タンパク質性捕捉試薬は、抗体、抗体の抗原結合断片、又は受容体を含む。一態様では、二次試薬は、チオール含有二次試薬である。一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール化オリゴヌクレオチドを含む。

【0016】

一態様では、アッセイ表面は、チオール含有二次試薬が炭素含有アッセイ表面上に分配される前に、１つ以上のマレイミド基を導入するように処理される炭素含有アッセイ表面である。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、ＳＭ（ＰＥＧ）_ｎ（ｎ＝２～２４である）を含むアミン－スルフヒドリル架橋剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理される。一態様では、ｎ＝４である。

【0017】

一態様では、１つ以上の二次試薬がアッセイ表面上に固定化される。一態様では、複数の二次試薬がアッセイ表面上に固定化される。一態様では、複数のチオール含有二次試薬が炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、二次試薬は、チオール化オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、約１～約１００、約５～約５０、約５～約１０ヌクレオチド、又は約１０～約３０ヌクレオチドの長さを有する。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、リンカーを介してチオール基に付着したオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、リンカーは、約３～約２０個の原子又は分子又は単位を含む。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、５’及び３’末端を有するオリゴヌクレオチド配列と、５’末端（５’末端チオール化オリゴヌクレオチド）、３’末端（３’末端チオール化オリゴヌクレオチド）、オリゴヌクレオチドの内部位置、又はそれらの組み合わせに組み込まれたチオール基とを含む。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオチド（２’－ＭＯＥ）、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド（２’－Ｆ－ＲＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせを含む。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非天然ヌクレオチド塩基を含む。一態様では、非天然ヌクレオチド塩基は、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）；５－メチルデオキシシチジン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ（５－ヒドロキシブチンル－２’－デオキシウリジン）、又はそれらの組み合わせから選択される。

【0018】

一態様では、二次試薬は、結合対のチオール化メンバーを含むチオール含有二次試薬である。一態様では、二次試薬は、チオール化ビオチン（チオール－ビオチン）を含む。一態様では、二次試薬は、チオール化ポリエチレングリコール（チオール－ＰＥＧ）を含む。一態様では、チオール化ポリエチレングリコールは、ビオチン（チオール－ＰＥＧ－ビオチン）を更に含む。

【0019】

一態様では、二次試薬は、チオール化フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含むチオール含有二次試薬である。

【0020】

一態様では、一次試薬は、標的分子若しくは標的分析物に特異的に結合するか又は標的分析物を含む捕捉試薬を含む。一態様では、一次試薬は、標的分子に特異的に結合するタンパク質性捕捉試薬を含む。一態様では、一次試薬は、抗体、抗原、受容体、酵素、又はそれらの組み合わせから選択されるタンパク質性一次試薬を含む。一態様では、一次試薬は、標的分子又は標的分析物を含む捕捉標的ハイブリッドを含む。一態様では、一次試薬は、細胞、ウイルス誘導体、小器官、細胞下構造、小胞、治療用分子、又はそれらの組み合わせから選択される捕捉標的ハイブリッドを含む。一態様では、一次試薬は、抗原結合物質を含む。一態様では、一次試薬としては、抗体又はその抗原結合断片を含む。一態様では、一次試薬は、結合対の第１のメンバーを含み、標的分子は、結合対の第２のメンバーを含む。一態様では、結合対は、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとを含む。

【0021】

一態様では、アッセイ表面は、マルチウェルプレートの一部である。一態様では、アッセイ表面は、マルチウェルプレートの一部である炭素含有アッセイ表面である。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、電極を含む。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、マルチウェルプレートの一部であり、マルチウェルプレートの１つ以上のウェルは、１つ以上の電極を含む。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、マルチウェルプレートの一部であり、プレートの各ウェルは、１つ以上の電極を含む。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、炭素含有電極を含む。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、炭素インク電極を含む。

【0022】

一態様では、一次試薬は、抗体又は抗原結合抗体断片を含むタンパク質性一次試薬であり、二次試薬は、チオール化オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、一次試薬は、細胞外小胞（ＥＶ）の表面タンパク質である標的に結合するタンパク質性一次試薬である。一態様では、細胞外小胞は、エクソソームである。一態様では、標的は、エクソソーム関連タンパク質である。一態様では、標的は、エクソソームによって封入される。一態様では、二次試薬は、エクソソーム関連タンパク質である標的に結合する。一態様では、二次試薬は、エクソソームによって封入された標的に結合する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本明細書に記載される直接コーティング方法を使用して調製された二機能性アッセイ表面のアッセイ感度を示すグラフである。

【図2】本明細書に記載されるオーバーコーティング方法を使用して調製された二機能性アッセイ表面のアッセイ感度を示すグラフである。

【図3A】異なる種類のアンカーオリゴヌクレオチド：本明細書に記載される直接コーティング方法（Ｂｉｏ－Ｐｅｇ－ＳＨ／アンカー）を使用して付着したビオチン化及びペグ化アンカーオリゴヌクレオチド；チオール化アンカーオリゴヌクレオチド（アンカー－ＳＨ）；並びにアンカーオリゴヌクレオチドなしによるアッセイプレートのアッセイ感度を比較する。

【図3B】異なる種類のアンカーオリゴヌクレオチド：本明細書に記載される直接コーティング方法（Ｂｉｏ－Ｐｅｇ－ＳＨ／アンカー）を使用して付着したビオチン化及びペグ化アンカーオリゴヌクレオチド；チオール化アンカーオリゴヌクレオチド（アンカー－ＳＨ）；並びにアンカーオリゴヌクレオチドなしによるアッセイプレートの非特異的結合（ＮＳＢ）を比較する。

【図3C】異なるタイプのアンカーオリゴヌクレオチド：本明細書に記載される直接コーティング方法（Ｂｉｏ－Ｐｅｇ－ＳＨ／アンカー）を使用して付着したビオチン化及びペグ化アンカーオリゴヌクレオチド；チオール化アンカーオリゴヌクレオチド（アンカー－ＳＨ）；並びにアンカーオリゴヌクレオチドなしによるアッセイプレートのシグナル対非特異的結合の比率を比較する。

【図4】本明細書に記載されるオーバーコーティング方法によって固定化されたＦＩＴＣ－Ｐｅｇ－ＳＨのシグナル生成を示す。

【図5A】ＰＥＧオリゴマーで修飾されたアッセイ表面を使用したＩＦＮｇのアッセイにおける非特異的結合（ＮＳＢ）を示す。５つのＰｅｇ－ＳＨ試薬（ＭＷ３５０、５５０、７５０、１０００、及び２０００）を、オーバーコーティングを介して固定化し、標準的なサンドイッチ形式（１０プレックス）で試験した。

【図5B】ＰＥＧオリゴマーで修飾されたアッセイ表面を使用した、ＴＮＦαのアッセイにおける非特異的結合（ＮＳＢ）を示す。５つのＰｅｇ－ＳＨ試薬（ＭＷ３５０、５５０、７５０、１０００、及び２０００）を、オーバーコーティングを介して固定化し、標準的なサンドイッチ形式（１０プレックス）で試験した。

【発明を実施するための形態】

【0024】

定義
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。

【0025】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、値が、デバイス、又は値を決定するために使用される方法についての誤差の固有変動を含むことを示すために使用される。

【0026】

本明細書で使用される場合、「～（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、範囲の終わりを含む範囲である。例えば、ｘとｙの間の数には、ｘ及びｙの数、並びにｘとｙの範囲内にある任意の数が明確に含まれる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「室温」は、生物学的物質の長期保存及び実験室での実験に適した室内温度であり、典型的には１５～２８℃の範囲である。諸実施形態では、室温は２０～２５℃である。

【0028】

アッセイにおいて測定される分析物、又はアッセイにおいて使用される試薬の文脈において、「複数」という用語は、分析物又は試薬の単なる２つ以上のコピーではなく（例えば、試薬Ａと試薬Ａの別のコピー）、２つ以上の構造的及び／又は機能的に異なる分析物又は試薬（例えば、試薬Ａと試薬Ｂ）を意味する。例えば、「複数の固定化試薬」という用語は、構造的又は機能的に異なる２つ以上の試薬が固定化されていることを意味し、１つの試薬の複数のコピーが存在する状況を説明するものではない。しかしながら、この文脈における「複数」という用語の使用は、複数の分析物又は試薬のいずれかの複数のコピーが存在する可能性を排除するものではない。例えば、複数の固定化試薬は、試薬Ａの１つ以上のコピーと試薬Ｂの１つ以上のコピーとを含む固定化試薬を指すことができる。アッセイ表面の文脈において、「二機能性」又は「多機能性」という用語は、２つ以上の異なるタイプの試薬が固定化されている表面を指す。一態様では、異なるタイプの試薬は、異なる表面化学によって表面上に固定化される。本明細書で使用される場合、「表面化学」とは、アッセイ表面上の試薬の固定化をもたらす化学反応を指す。表面化学は、共有結合及び非共有結合の相互作用を含む。共有結合の固定化とは、試薬とアッセイ表面上の反応性官能基との間に１つ以上の共有結合が形成されることによる固定化を指す。非共有結合の相互作用は、例えば、水素結合、静電相互作用又はイオン相互作用、及びファンデルワールス力を含む。受動吸着とは、生体分子と表面との間の疎水性相互作用又は疎水性及びイオン性相互作用を介した表面上の生体分子の固定を指す。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一のポリペプチドの他に複数のポリペプチドも包含することが意図され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸モノマーから構成される分子を指す。ポリペプチドという用語は、ペプチド骨格を有するアミノ酸の任意の鎖又は複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、又はアミノ酸の鎖若しくは複数の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、ポリペプチドの定義内に含まれ、ポリペプチドという用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、又はこれらの用語のいずれかと同義で使用することができる。ポリペプチドという用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は非天然起源のアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の産物も含む。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来し得るか、又は組換え技術によって産生され得る。ポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の様式で生成され得る。ポリペプチドの文脈において、「配列」とは、ポリペプチド中のアミノ酸のアミノ末端からカルボキシル末端方向への順序を指し、配列中で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造中で連続している。本明細書で使用される場合、「タンパク質性」という用語は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗原、酵素、受容体、又はそれらの断片若しくは部分を含むがこれらに限定されない１つ以上のポリペプチド鎖を含む天然起源又は非天然起源の巨大分子を指す。

【0030】

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせなどのリン酸骨格を有する核酸の短いポリマーを指す。一態様では、オリゴヌクレオチドは、約５、１０、１５、２０若しくは２５ヌクレオチド～最大約５０、７５、１００若しくは１５０ヌクレオチド、又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００若しくは１５０ヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列に相補的な配列を有する標的ヌクレオチドを検出するために、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。オリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖であってもよく、生物学的サンプルからの単離、組換え合成、及び化学合成を含むがこれらに限定されない方法によって得ることができる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、非天然起源の修飾を含む構造アナログを含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドを標識などの別の物質に連結する化学修飾、又は別の物質に連結することができる反応性官能基を提供する化学修飾を含むことができる。オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の非天然ヌクレオチド塩基を含むことができる。

【0031】

「反応性官能基」という用語は、例えば、別の官能基と共有結合を形成するために、更なる化学反応を受けることができる原子又は原子の関連する基を指す。反応性官能基の例としては、アミノ、チオール、ヒドロキシ、及びカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、反応性官能基は、反応性チオール基を含む。一態様では、反応性官能基を使用して生体分子を表面上に固定化する。一態様では、反応性官能基を使用して生体分子に標識を付加する。これらの化学修飾を介してヌクレオチド又は核酸に連結することができる標識としては、ビオチン、ハプテン、フルオロフォア、及び電気化学発光（ＥＣＬ）標識などの検出可能な部分が挙げられるが、これらに限定されない。

【0032】

「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、抗原に特異的に結合することができる生体分子を指すために互換的に使用することができる。ほとんどの脊椎動物において、抗体は、１本の軽（Ｌ）鎖と各々対合する２本の重（Ｈ）鎖の二量体として存在する。重鎖及び軽鎖のＮ末端は、抗体にその固有の抗原結合特異性を提供する可変ドメイン（それぞれＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ）を含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗体分子全体又はその抗原結合断片を指す。抗体又はその断片は、天然に産生されてもよく、又は部分的若しくは全体的に合成的に若しくは組換え的に産生されてもよい。抗原結合断片は、免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含み、完全長免疫グロブリンの結合特異性を保持する任意の抗体断片を指す。「抗体」という用語には、合成抗体、組換え産生抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、及び抗体断片であって、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又は上記のいずれかの抗原結合断片が含むがこれらに限定されない抗体断片が含まれる。「結合試薬」とは、「結合パートナー」と呼ばれることがある、別の物質に優先的に結合する能力を特徴とする試薬を指す。結合試薬と結合パートナーとは、「結合対」と呼ばれることがある。結合対の例としては、ビオチンとストレプトアビジン又はアビジン；相補的オリゴヌクレオチド；ハプテンとハプテン結合パートナー；抗体／抗原結合対；受容体／リガンド結合対；並びに酵素／基質結合対が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、結合対の第１のメンバーがアッセイ表面上の結合ドメインに固定化され、結合対の第２のメンバーが標的である。

【0033】

「特異的に結合する」という用語は、サンプル中の結合試薬と他の分子又は成分との相互作用と比較して、結合試薬とその標的との間の優先的相互作用を指す。結合試薬と標的との間の特異的結合は、結合試薬の結合ドメインと標的との間の相補性、並びに静電力、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性力などの非共有結合力に起因する。本明細書で使用される場合、「優先的に結合する」という用語は、結合対の１つのメンバーが、サンプル中に存在する他の化合物に対して任意の有意な結合、例えば任意の統計的に有意な結合をすることなく、適切な条件下でその結合パートナーに結合することを意味する。一態様では、結合対のメンバー、例えば、結合試薬とその標的とは、結合対のいずれかのメンバーとサンプル中に存在する他の化合物との間の親和性よりも少なくとも約５０倍、７５倍、又は１００倍大きい互いに対する親和性を有する。

【0034】

「標的」という用語は、例えば、試薬によって特異的に結合され、アッセイ表面上の特定の位置に標的を保持することができるサンプル中の物質を指す。一態様では、標的は、サンプル中の標的の存在又は量を決定できるように、アッセイ表面上の特定の位置に保持され、その場合、標的は、標的分析物と呼ばれ得る。一態様では、標的は、異なる標的分析物の検出を容易にするために、アッセイ表面上の特定の位置に保持される。一態様では、標的は、アッセイ表面上に固定化された試薬に共有結合的に結合する。一態様では、標的は、アッセイ表面上に固定化された試薬に非共有結合的に結合する。一態様では、標的は、アッセイ表面上に固定化された試薬に直接的に結合する。一態様では、標的は、例えば、標的に結合し、また、アッセイ表面上に固定化された試薬によっても結合される結合メンバーを介して、アッセイ表面上に固定化された試薬に間接的に結合される。標的の例としては、細胞；細胞膜；小器官；受容体、例えば、小胞、脂質、又は細胞膜上の受容体；受容体に結合するリガンド、アゴニスト、又はアンタゴニスト；抗体；抗原；タンパク質；ペプチド；多糖類；オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは増幅産物若しくはアンプリコンを含む）、又は薬物などの治療用分子が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、標的は、ビオチン、アビジン、又はストレプトアビジンなどの結合対のメンバーを含む。

【0035】

「相補的」とは、例えば、ＡがＴ又はＵと対になり、ＣがＧと対になる、例えば、ワトソン－クリック塩基対形成モデルに従って、水素結合の形成によって相互作用する核酸分子又は核酸分子の配列を指す。例えば、ハイブリダイゼーションは、２つの相補的ＤＮＡ分子間（ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション）、２つのＲＮＡ分子間（ＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション）、又は相補的ＤＮＡとＲＮＡ分子との間（ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション）で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、より長いヌクレオチド配列の一部に相補的である短いヌクレオチド配列の間で起こり得る。完全な相補性又は１００％の相補性とは、１つのオリゴヌクレオチド配列又は領域の各ヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチド鎖又は領域の少なくとも一部の各ヌクレオチドと水素結合することができる状態を指す。ハイブリダイゼーションは、１００％の「配列相補性」を有しない配列（すなわち、ワトソン－クリック型塩基対形成モデルなどの塩基対形成モデルに基づいてヌクレオチドの１００％未満が整列する配列）間で起こり得る。一般に、配列相補性が低い配列は、配列相補性が高い配列よりも安定性が低く、ハイブリダイズが起こりにくい。一態様では、相補的配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の配列相補性を有する。別の態様では、相補的配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相補性を有し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。相補的配列は、それらの全長に沿ってハイブリダイズする必要はなく、すなわち、より短いオリゴヌクレオチド配列は、それが相補的であるより長いオリゴヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズし得ることが理解される。

【0036】

２つの相補的配列がハイブリダイズするかどうかは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する可能性があり、温度、溶媒、イオン強度、及びその他のパラメータなどの条件に応じて変化する可能性がある。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、他の潜在的に交差反応する又は干渉する配列の存在下で、２つの相補的な核酸配列の所望のハイブリダイゼーション生成物の選択的な形成又は維持を提供するように選択することができる。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、典型的には、より長い相補的配列は、より短い相補的配列よりも高温で選択的にハイブリダイズする。

【0037】

本明細書で使用される場合、「捕捉分子」とは、標的に特異的に結合することができる分子、又はそれらの複合体若しくは組み合わせを指す。一態様では、捕捉分子は、例えば、抗体、抗原結合抗体断片、又は受容体を含むペプチド又はタンパク質である。別の態様では、捕捉分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的の相補的オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又は核酸である。一態様では、捕捉分子は、ビタミン、オリゴ糖、炭水化物、脂質、小分子、又はそれらの複合体を含む。一態様では、一次試薬は、一次標的に特異的に結合する一次捕捉分子を含む。一態様では、二次試薬は、二次標的に特異的に結合する二次捕捉分子を含む。一態様では、二次標的は、一次標的に関連付けられる。一態様では、二次標的は、一次標的によってカプセル化される。

【0038】

本明細書で使用される「生体分子」という用語は、生体、例えば、細胞によって産生される任意の化合物又は物質を指す。一態様では、生体分子は、当該技術分野で知られている抽出、分離、精製の溶媒、熱、及び／又は物理的方法によって生物学的材料から単離される。

【0039】

本明細書で使用される場合、「捕捉標的ハイブリッド」は、それをアッセイ表面上の結合ドメインに固定化することができるようにする領域を含み、標的分析物を含む生体分子、分子若しくは複合体又はそれらの組み合わせである。一態様では、標的分析物は、捕捉標的ハイブリッドの表面上にある。一態様では、標的分析物は、生体分子、例えば、細胞又は小器官の表面上にある。別の態様では、標的は、人工又は操作された捕捉分子の表面上にある。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、抗原結合物質を含む。

【0040】

一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、細胞、ウイルス誘導体、細胞小器官、細胞下構造、小胞、又は治療用分子である。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、細胞、例えば、細菌細胞、古細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞である。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、表面タンパク質分析物、又は他の所望の標的分析物を産生するように操作された細胞である。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、細胞小器官、例えば、核、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、液胞、葉緑体、インフラマソーム、細胞翻訳複合体、及びそれらの組み合わせである。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、ウイルス誘導体、例えば、ウイルス、ウイルス粒子、ビリオン、ビリオン膜、ビリオン膜断片、及びそれらの組み合わせである。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、細胞下構造、例えば、ミセル、膜調製物、膜ラフト、膜ゴースト、膜小胞、膜断片、人工脂質膜、又はそれらの組み合わせである。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、リソソーム、エンドソーム、ペルオキシソーム、リポソーム、及びそれらの組み合わせなどの小胞である。

【0041】

本明細書で使用される「ウイルス誘導体」とは、ウイルスから得られる、又はウイルスに由来する粒子又は断片を指す。ウイルス誘導体は、機械的操作、細胞内因子、及び受容体誘導性構造的リモデリング、低ｐＨ活性化コンフォメーション変化、プロテアーゼ依存性タンパク質分解、還元酵素触媒性ジスルフィド結合破壊、並びにウイルスがそれらの分解を促進するために使用するシャペロン媒介性アンフォールディング／リフォールディング反応を含む分子機構を介した分解によって形成することができる。一態様では、ウイルス誘導体には、ウイルス、ウイルス粒子、ビリオン、ビリオン膜、及びビリオン膜断片が含まれる。

【0042】

「細胞下構造」とは、細胞全体に位置するか、又は細胞全体内に存在する区画又は構造を指す。一態様では、細胞下構造は、細胞全体の区画又は構造に由来するか、又は当該技術分野で知られている様々な手段によって人工的に調製することができる。細胞下構造は、当技術分野で知られている抽出、ホモジナイズ及び遠心分離技術を含む細胞分画法によって細胞から分離又は除去することができる。一態様では、細胞内構造には、ミセル、膜調製物、膜ラフト、膜ゴースト、膜小胞、膜断片、人工脂質膜、又はそれらの組み合わせが含まれる。

【0043】

本明細書で使用される場合、「小胞」という用語は、脂質二重層によって囲まれた液体又は細胞質からなる、細胞内又は細胞外の構造を指す。小胞は、当技術分野で知られている抽出、ホモジナイズ及び遠心分離技術を含む細胞分画法によって細胞から分離又は除去することができる。一態様では、小胞は、当該技術分野で知られている生化学的及びマイクロ流体合成技術を使用してインビトロで調製された人工又は合成小胞である。一態様では、小胞は、リソソーム、エンドソーム、ペルオキシソーム、リポソーム、及びそれらの組み合わせを含む。

【0044】

概要
表面上に試薬を固定化するための方法が本明細書に提供される。一態様では、表面は、サンプル中の１つ以上の目的の分析物を検出及び／又は定量化するためのアッセイを実施するために使用されるアッセイ表面である。一態様では、１つ以上の試薬がアッセイ表面上に固定化される。一態様では、表面は、構造及び／又は機能が異なる２つ以上の試薬が、異なる表面化学を使用して固定化される、二機能性又は多機能性のアッセイ表面である。一態様では、表面は、一次試薬及び二次試薬が固定化された二機能性又は多機能性のアッセイ表面である。一態様では、一次試薬及び二次試薬は、異なる構造及び／又は機能を有する。例えば、一態様では、一次試薬はタンパク質性試薬であり、二次試薬はチオール含有試薬である。一態様では、一次試薬はタンパク質性試薬であり、二次試薬はチオール化オリゴヌクレオチドである。一態様では、一次試薬及び二次試薬は、異なる表面化学を使用して固定化される。一態様では、アッセイ表面は、マルチウェルプレートである。一態様では、アッセイ表面は、粒子又はビーズを含む。

【0045】

生体分子は、いくつかのメカニズムによって表面に付着することができる。受動吸着とは、生体分子と表面との間の疎水性相互作用又は疎水性及びイオン性相互作用を介した固定化を指す。一態様では、１つ以上の試薬が、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、複数の試薬が、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、１つ以上の一次試薬が、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、複数の一次試薬が、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、１つ以上のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、複数のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬は、捕捉分子である。一態様では、タンパク質性一次試薬は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、例えば、タンパク質性一次試薬は、ＢＳＡにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含み得る。一態様では、結合対のメンバーが、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、ストレプトアビジンが、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、受動吸着は、わずかにイオン性の疎水性表面を使用することによって増強される。

【0046】

共有結合の固定化は、試薬上の１つ以上の反応性官能基とアッセイ表面上の１つ以上の反応性官能基との間の１つ以上の共有結合の形成による固定化を指す。「反応性官能基」という用語は、例えば、別の官能基と共有結合を形成するために、更なる化学反応を受けることができる原子又は原子の関連する基を指す。反応性官能基の例としては、アミノ、チオール、ヒドロキシ、及びカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、反応性官能基は、チオール基を含む。一態様では、試薬は、試薬上のチオール部分（－ＳＨ）とアッセイ表面上の反応性官能基との間に形成された共有結合を介してアッセイ表面上に共有結合的に固定化される。一態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上のチオール部分とアッセイ表面上の反応性官能基との間に形成された共有結合を介してアッセイ表面上に共有結合的に固定化される。

【0047】

いくつかの例では、構造及び／又は機能が異なる２つ以上の試薬が固定化された二機能性又は多機能性のアッセイ表面を調製することが望ましい場合がある。例えば、２０１４年３月１２日に出願され、ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＡＳＳＡＹ ＭＥＴＨＯＤＳと題するＰＣＴ公開第２０１４／１６５０６１号（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、一次捕捉試薬及び二次アンカー試薬がその上に固定化された二機能性アッセイ表面を使用して、免疫アッセイにおいてシグナルを増幅する方法を記載している。一態様では、一次捕捉試薬は、抗体、抗原結合抗体断片又は受容体などのタンパク質性一次試薬であり、二次アンカー試薬は、オリゴヌクレオチドである。一態様では、一次捕捉試薬は、細胞、ウイルス、細胞小器官、細胞下構造、小胞又は治療用分子などの捕捉標的ハイブリッドであり、二次アンカー試薬はオリゴヌクレオチドである。一態様では、一次捕捉試薬及び二次アンカー試薬は、同時にアッセイ表面上に分配され、両方の試薬に対して同じ表面化学を使用して固定化される。例えば、二次オリゴヌクレオチド試薬は、タンパク質性一次試薬及び二次オリゴヌクレオチドアンカー試薬の両方が受動吸着によって固定化されるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質にコンジュゲートすることができる。代替的に、二次オリゴヌクレオチドアンカー試薬及び一次捕捉試薬は、ビオチンなどのハプテンにコンジュゲートされ、ストレプトアビジンでコーティングされた表面上に固定化することもできる。ＰＣＴ公開第２０１４／１６５０６１号に記載されている二機能性アッセイ表面は、アッセイ感度の向上を提供するが、アッセイモジュールは、特定の用途のために特別に調製されなければならず、これは製造コストを増加させる可能性がある。

【0048】

本明細書に提供されるのは、一次試薬及び二次試薬がアッセイ表面上に固定化された二機能性アッセイ表面を調製するための方法である。一態様では、一次試薬及び二次試薬は、異なる表面化学を使用してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化され、二次試薬は、二次試薬上の反応性官能基とアッセイ表面上の反応性官能基との間の共有結合の形成によって固定化される。一態様では、一次試薬は、結合対の相互作用によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、ビオチン部分を含み、ストレプトアビジン／ビオチン結合対の相互作用を介してストレプトアビジンでコーティングされた表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、抗体、抗原結合抗体断片、又は受容体などのタンパク質性分子であり、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。

【0049】

一態様では、一次及び二次試薬が、異なる表面化学を使用して同時にアッセイ表面上に固定化される「直接」コーティング方法が提供される。別の態様では、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドがプレート表面上に固定化される「直接」コーティング方法が提供される。有利には、二次試薬は、一次試薬と同じ表面化学を使用して固定化できるように修飾する必要がない。例えば、オリゴヌクレオチド二次試薬をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質又はビオチンなどの結合対のメンバーにコンジュゲートする必要なく、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、オリゴヌクレオチド二次試薬、例えば、チオール化オリゴヌクレオチド二次試薬と同時に、受動吸着によって、又はアビジン／ストレプトアビジン及びビオチンなどの結合対を介して固定化することができる。

【0050】

別の態様では、一次試薬が既に固定化されたアッセイ表面上に二次試薬を固定化することができる「オーバーコーティング」方法が提供される。有利には、一次試薬が以前に固定化された既存のアッセイ表面上に二次試薬を固定化することができる。

【0051】

本明細書に示されるように、オーバーコーティング方法及び直接コーティング方法によって調製されたアッセイ表面は、異なる試薬が同じ表面化学を使用して固定化された二機能性表面と比較して、同等又はより優れた性能を有する。

【0052】

アッセイモジュール
一態様では、二機能性表面を調製するための方法が提供される。一態様では、アッセイモジュールにおいて二機能性表面を調製するための方法が提供される。一態様では、アッセイモジュールは、例えば、粒子又はビーズを含む複数の表面を含む。一態様では、アッセイモジュールは、カートリッジ又はプレートなどの一元的な表面を含む。一態様では、アッセイモジュールは、ウェル、コンパートメント、チャンバ、導管、又はフローセルなどの１つ以上のアッセイセルを含む。一態様では、アッセイモジュールは、マルチウェルアッセイプレートである。マルチウェルアッセイプレートは、高スループットアッセイに使用される標準寸法の様々な形式、サイズ、及び形状で利用可能である。一態様では、アッセイモジュールは、標準的なウェル構成を有するマルチウェルプレート、例えば、６ウェル、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル、６１４４ウェル又は９６００ウェルプレートである。一態様では、アッセイモジュールは、９６ウェルプレートである。

【0053】

一態様では、アッセイ表面は、結合ドメインと呼ばれる既知の位置に１つ以上の試薬が印刷され得る２次元のパターン化されたアレイを含む。一態様では、アッセイ表面は、複数の試薬が固定化された、離散的で、重複しない、アドレス可能な結合ドメインのパターン化されたアレイを含み、各結合ドメインにおける試薬の同一性は既知であり、標的と相関させることができる。一態様では、結合ドメインの少なくとも２つが、互いに異なる結合特異性を有する試薬を含む。一態様では、アレイは、対称的なグリッドパターンで配置される。他の態様では、アレイは、放射状に分布した線、らせん状の線、又は順序付けられたクラスターを含むがこれらに限定されない別のパターンで配置される。別の態様では、各結合ドメインは、１つ以上の微粒子又はビーズの表面上に位置決めされ、微粒子又はビーズは、異なる結合ドメイン間の識別を可能にするようにコード化されている。

【0054】

一態様では、一次試薬は、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、アレイ状に炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、炭素含有アッセイ表面上にアレイ状に固定化される。一態様では、一次試薬は、炭素含有電極上にアレイ状に固定化される。一態様では、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドが、炭素含有電極上にアレイ状に固定化される。一態様では、二次試薬は、アレイ状に固定化される。一態様では、アッセイ表面は、二次試薬でコーティングされる。

【0055】

一態様では、アッセイ表面は、１つ以上の結合ドメインを含む。一態様では、アッセイ表面は、複数の結合ドメインを含む。一態様では、アッセイモジュールは、マルチウェルプレートであり、マルチウェルプレートの１つ以上のウェルは、１つ以上の結合ドメインを含む。一態様では、マルチウェルプレートの各ウェルは、複数の結合ドメインを含む。一態様では、各ウェルは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の結合ドメイン～最大２５、６４、１００、又は２５０個の結合ドメインを含む。一態様では、各ウェルは、４、７、１０、２５、６４、又は１００個の結合ドメインを含む。一態様では、結合ドメインの少なくとも２つは、２つの異なる試薬を含む。

【0056】

一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の固体表面上に別個の結合ドメインを含む。一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の粒子又はビーズを含み、１つ以上の粒子又はビーズは、１つ以上の結合ドメインを含む。一態様では、各結合ドメインは、別個の表面上、例えば、別個のビーズの表面上にある。一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の一次試薬及び１つ以上の二次試薬が上に固定化された１つ以上の粒子又はビーズを含む。一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上のタンパク質性一次試薬及び１つ以上のチオール含有二次試薬が上に固定化された１つ以上の粒子又はビーズを含む。一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の捕捉標的ハイブリッド及び１つ以上のチオール含有二次試薬が上に固定化された１つ以上の粒子又はビーズを含む。一態様では、結合ドメインは、別個のアッセイシグナルが各結合ドメイン上で生成され、各結合ドメインから測定されるように、個々のビーズである。一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の一次捕捉試薬及び１つ以上の二次試薬が上に固定化された１つ以上のコード化粒子又はビーズを含み、コード化は、特定のビーズに対する捕捉試薬及び標的を識別する。

【0057】

一態様では、アッセイ表面上の１つ以上の結合ドメインは、１つ以上のアッセイ試薬を含む。一態様では、アッセイ表面上の各結合ドメインは、１つ以上のアッセイ試薬を含む。一態様では、１つ以上の結合ドメインは、一次試薬を含む。一態様では、特定の結合ドメイン内の一次試薬は全て同じ結合特異性を有し、ある結合ドメイン内の一次試薬は、別の結合ドメイン内の一次試薬とは異なる結合特異性を有する。一態様では、１つ以上の結合ドメインは、二次試薬を含む。一態様では、特定の結合ドメイン内の二次試薬は全て同じ結合特異性を有し、ある結合ドメイン内の二次試薬は、別の結合ドメイン内の二次試薬とは異なる結合特異性を有する。一態様では、２つ以上の結合ドメイン内の二次試薬は、同じ結合特異性を有する。

【0058】

一態様では、一次試薬は、第１の結合ドメインに固定化され、二次試薬は、第２の結合ドメインに固定化される。一態様では、異なる結合特異性を有する複数の一次試薬が、複数の第１の結合ドメインに固定化され、異なる結合特異性を有する複数の二次試薬が、複数の第２の結合ドメインに固定化される。

【0059】

一態様では、アレイ内の１つの結合ドメインが、別の結合ドメインとは異なる一次試薬を含み、アレイ内の結合ドメインの一部又は全てが「固有の」一次試薬を含むようにしてもよい。一態様では、アレイ内の１つの結合ドメインが、別の結合ドメインとは異なる二次試薬を含み、アレイ内の結合ドメインの一部又は全てが「固有の」二次試薬を含むようにしてもよい。一態様では、アレイ内の各結合ドメインが、同じ二次試薬を含み、アレイ内の結合ドメインの一部又は全てが「共通の二次試薬」を含むようにしてもよい。一態様では、１つ以上の結合ドメインが、一次試薬及び二次試薬を含む。一態様では、１つ以上の結合ドメインが、固有の一次試薬及び固有の二次試薬を含む。一態様では、１つ以上の結合ドメインが、固有の一次試薬及び共通の二次試薬を含む。

【0060】

一態様では、アッセイ表面の１つ以上の結合ドメインが、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドを含む。一態様では、アッセイ表面の１つ以上の結合ドメインが、チオール含有二次試薬を含む。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、チオール含有二次試薬を含まない第１の結合ドメインに固定化され、チオール含有二次試薬が、一次試薬を含まない第２の結合ドメインに固定化される。一態様では、各結合ドメインは、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドを含む。一態様では、各結合ドメインは、チオール含有二次試薬を含む。一態様では、アッセイ表面上の１つ以上の結合ドメインが、タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬を含む。一態様では、アッセイ表面上の１つ以上の結合ドメインが、捕捉標的ハイブリッド及びチオール含有二次試薬を含む。一態様では、アッセイ表面上の各結合ドメインは、タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬を含む。一態様では、アッセイ表面上の各結合ドメインは、捕捉標的ハイブリッド及びチオール含有二次試薬を含む。一態様では、各結合ドメインは、固有のタンパク質性一次試薬及び固有のチオール含有二次試薬を含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の捕捉標的ハイブリッド及び固有のチオール含有二次試薬を含む。一態様では、各結合ドメインは、固有のタンパク質性一次試薬及び共通のチオール含有二次試薬を含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の捕捉標的ハイブリッド及び共通のチオール含有二次試薬を含む。

【0061】

一態様では、アッセイ表面はマルチウェルプレートを含み、複数の一次試薬は、マルチウェルプレートの表面上の１つ以上の結合ドメインに固定化される。一態様では、マルチウェルプレートのウェルの表面上の１つ以上の結合ドメインは、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドの１つ以上のコピーを含む。一態様では、特定の結合ドメインに固定化されたタンパク質性一次試薬は全て同じ結合特異性を有し、ある結合ドメインに固定化されたタンパク質性一次試薬は、別の結合ドメインに固定化されたタンパク質性一次試薬とは異なる結合特異性を有する。一態様では、特定の結合ドメインに固定化された捕捉標的ハイブリッドは全て同じ結合特異性を有し、ある結合ドメインに固定化された捕捉標的ハイブリッドは、別の結合ドメインに固定化された捕捉標的ハイブリッドとは異なる結合特異性を有する。一態様では、アッセイ表面はマルチウェルプレートを含み、１つ以上のチオール含有試薬は、マルチウェルプレートの表面上の１つ以上の結合ドメインに固定化される。一態様では、各結合ドメインは、チオール含有二次試薬の１つ以上のコピーを含む。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、第１の結合ドメインに固定化され、チオール含有二次試薬が、第２の結合ドメインに固定化される。一態様では、マルチウェルプレートのウェルの表面上の各結合ドメインは、一次試薬と二次試薬とを含む。一態様では、各結合ドメインは、固有のチオール含有二次試薬の１つ以上のコピーを含む。マルチウェルプレートの１つのウェル内の「固有の」チオール含有二次試薬は、マルチウェルプレートの他のウェルに含まれてもよいことに留意されたい。一態様では、マルチウェルプレートのウェル内の全ての結合ドメインは、共通のチオール含有二次試薬の１つ以上のコピーを含む。マルチウェルプレートの他のウェルは、同じチオール含有二次試薬又は異なるチオール含有二次試薬を含んでいてもよいことに留意されたい。一態様では、各結合ドメインは、固有のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドと、固有のチオール含有二次試薬とを含む。一態様では、各結合ドメインは、固有のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドと、共通のチオール含有二次試薬とを含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の捕捉抗体又は抗原結合抗体断片と、固有のチオール化オリゴヌクレオチドとを含む。一態様では、各結合ドメインは、固有の捕捉抗体又は抗原結合抗体断片と、共通のチオール化オリゴヌクレオチドとを含む。

【0062】

一態様では、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドが、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性ストレプトアビジンが、プレート表面へのストレプトアビジンの受動吸着によって固定化され、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドが、プレート表面のチオール基の共有結合によって固定化される。一態様では、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドが、アレイ状に炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドが、アレイ状に炭素含有電極上に固定化される。

【0063】

一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、アレイ状に炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、アレイ状に炭素含有電極上に固定化される。

【0064】

一態様では、タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬が、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬は、アレイ状に炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬は、アレイ状に炭素含有電極上に固定化される。一態様では、捕捉標的ハイブリッド及びチオール含有二次試薬が、アレイ状にアッセイ表面上に固定化される。一態様では、捕捉標的ハイブリッド及びチオール含有二次試薬は、アレイ状に炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、捕捉標的ハイブリッド及びチオール含有二次試薬は、アレイ状に炭素含有電極上に固定化される。

【0065】

一態様では、一次試薬が、二次試薬とは異なる表面化学を介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、タンパク質性一次試薬である。一態様では、一次試薬は、タンパク質性捕捉試薬である。一態様では、一次試薬は、捕捉標的ハイブリッドである。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、受動吸着によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンなどの結合パートナーを介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、ビオチン部分を含み、アッセイ表面は、ストレプトアビジンでコーティングされる。一態様では、二次試薬は、チオール含有二次試薬である。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、チオール含有二次試薬とは異なる表面化学を介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、二次試薬は、チオール基とアッセイ表面上の反応性官能基との相互作用を通じてアッセイ表面上に固定化される。一態様では、二次試薬は、チオール基とアッセイ表面上の反応性官能基との間の共有結合によってアッセイ表面上に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、ジスルフィド結合又はマレイミド結合の形成を通じてアッセイ表面上に固定化される。一態様では、１つ以上のチオール含有二次試薬が、炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、アッセイ表面は、マレイミド、ヨードスクシンイミド、又は活性化ジスルフィド（例えばピリジルジスルフィド）などのチオール反応性部分で修飾される。

【0066】

一態様では、タンパク質性一次試薬は、タンパク質性捕捉試薬である。本明細書で使用される場合、「捕捉試薬」は、サンプル中に存在し得る標的に結合する、アッセイ表面上に固定化される試薬である。一態様では、捕捉試薬は、標的に特異的に結合する。一態様では、一次捕捉試薬は、一次標的に特異的に結合する。一態様では、タンパク質性一次試薬は、抗原結合物質を含む。一態様では、タンパク質性一次試薬は、抗体又は抗原結合抗体断片を含む。一態様では、タンパク質性一次試薬は、酵素である。一態様では、タンパク質性捕捉試薬は、受容体である。一態様では、タンパク質性捕捉試薬は、タンパク質性部分及び結合対のメンバーを含み、結合対の第１のメンバーがタンパク質性一次試薬に付着し、結合対の他のメンバーが標的に付着する。結合対の非限定的な例としては、ビオチンとストレプトアビジン又はアビジン；相補的オリゴヌクレオチド；ハプテンとハプテン結合パートナー；受容体／リガンド；酵素／基質及び抗体／抗原結合対が挙げられる。一態様では、タンパク質性一次試薬は、タンパク質性部分を含み、結合対は、ストレプトアビジン又はアビジン及びビオチンから選択される。一態様では、一次試薬は、標的結合部分及びタンパク質性部分を含む。一態様では、一次試薬のタンパク質性部分は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。一態様では、一次試薬の標的結合部分は、捕捉分子を含む。一態様では、捕捉分子は、例えば、抗体、抗原結合抗体断片又は抗原；受容体又はリガンド；又は酵素若しくは基質を含む、ペプチド又はタンパク質などのタンパク質性分子である。別の態様では、捕捉分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的の相補的オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又は核酸を含む。一態様では、捕捉分子は、ビタミン、オリゴ糖、炭水化物、脂質、小分子、又はそれらの複合体を含む。

【0067】

一態様では、反応性官能基は、チオール基である。本明細書で使用される場合、「チオール含有二次試薬」は、スルフヒドリル部分（－ＳＨ）を含む試薬を指す。一態様では、チオール含有二次試薬は、反応性官能基を介して表面上に共有結合的に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、オリゴヌクレオチド、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、ミモトープ、又はそれらの組み合わせ若しくは複合体である。一態様では、チオール含有二次試薬は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのチオール修飾一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、ＤＮＡ結合タンパク質を含む。

【0068】

一態様では、チオール含有二次試薬は、標的結合部分及びチオール化部分を含み、二次試薬の標的結合部分は、チオール化部分を介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、標的結合部分及びチオール化オリゴヌクレオチドを含み、二次試薬の標的結合部分は、チオール化オリゴヌクレオチドを介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、二次試薬の標的結合部分は、捕捉分子を含む。一態様では、捕捉分子は、例えば、抗体、抗原結合抗体断片、又は受容体を含む、ペプチド又はタンパク質である。別の態様では、捕捉分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的の相補的オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又は核酸である。一態様では、捕捉分子は、ビタミン、オリゴ糖、炭水化物、脂質、小分子、又はそれらの複合体を含む。

【0069】

一態様では、二次試薬は、ストリンジェントな条件下で相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド部分を含む。一態様では、相補的オリゴヌクレオチドは、標的分析物である。一態様では、相補的オリゴヌクレオチドは、例えば、共有結合又は非共有結合の相互作用によって、標的分析物に会合する標的化オリゴヌクレオチドであり、その結果、標的分析物は、チオール化オリゴヌクレオチドと標的化オリゴヌクレオチドとの間の相互作用を介してアッセイ表面上に固定化され得る。一態様では、標的は、増幅産物又はアンプリコンである相補的オリゴヌクレオチドである。一態様では、相補的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自立合成反応）、及び等温増幅法、例えば、ヘリカーゼ依存性増幅及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含むがこれらに限定されない、増幅技術によって生成される増幅産物である。

【0070】

一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、約５、６、７、８、９、若しくは１０ヌクレオチド～最大約２０、３０、４０、５０、７５、若しくは１００ヌクレオチド、又は約５～約１００、約５～約５０、若しくは約１０～約３０ヌクレオチド、又は約５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、７５、若しくは１００ヌクレオチドの長さを有する。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、リンカーを介してチオール基に付着したオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、リンカーは、約３～約２０個の原子若しくは分子若しくは単位、又は少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０～最大約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の原子若しくは分子若しくは単位を含む。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、５’及び３’末端を有するオリゴヌクレオチド配列と、５’末端（５’末端チオール化オリゴヌクレオチド）、３’末端（３’末端チオール化オリゴヌクレオチド）、オリゴヌクレオチドの内部位置、又はそれらの組み合わせに組み込まれたチオール基とを含む。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせを含む。一態様では、チオール化オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非天然ヌクレオチド塩基を含む。一態様では、非天然ヌクレオチド塩基は、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）；５－メチルデオキシシチジン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ（５－ヒドロキシブチンル－２’－デオキシウリジン）；又はそれらの組み合わせから選択される。

【0071】

一態様では、チオール含有二次試薬は、タンパク質を含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質を含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、ＢＳＡなどのタンパク質を含み、非特異的結合（ＮＳＢ）を低減するためにアッセイ表面上に固定化される。スルフヒドリル基は、多くのタンパク質中に存在するが、天然のジスルフィド結合の還元によって生成することも、一級アミンを、２－イミノチオラン（トラウト試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、ＳＡＴ（ＰＥＧ）_４、又はそれらの組み合わせなどのスルフヒドリル付加試薬と反応させることによって導入することもできる。

【0072】

一態様では、チオール含有二次試薬は、結合対のチオール化メンバーを含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール化ビオチン（チオール－ビオチン）を含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール化ポリエチレングリコール（チオール－ＰＥＧ）を含む。一態様では、チオール化ポリエチレングリコールは、ビオチン（チオール－ＰＥＧ－ビオチン）を更に含む。一態様では、チオール化ビオチンは、ビオチン部分を使用してアッセイ表面上の追加の試薬を固定化することができるように、アッセイ表面上に固定化される。一態様では、ストレプトアビジン又はアビジンは、１つ以上のアッセイ試薬にコンジュゲートされ、次いで、固定化されたビオチン部分を介してアッセイ表面上に固定化される。

【0073】

一態様では、チオール含有試薬は、１つ以上の反応性基を含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、アミン反応性部分を含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を含む。一態様では、チオール含有二次試薬は、フルオレセイン及びチオールヘテロ官能化ポリエチレングリコール（ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨ）を含む。

【0074】

一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の電極を含む。一態様では、アッセイ表面は、電極表面を含む。一態様では、電極表面は、マルチウェルプレートの構成要素である。一態様では、電極表面は、粒子又はビーズの成分である。一態様では、電極は、金、銀、白金、ニッケル、鋼、イリジウム、銅、アルミニウム、又は導電性合金などの金属を含むがこれらに限定されない導電性材料から形成される。一態様では、電極は、酸化アルミニウムでコーティングされたアルミニウムを含むがこれに限定されない、酸化物でコーティングされた金属を含む。一態様では、電極は、炭素、カーボンブラック、グラファイトカーボン、カーボンナノチューブ、カーボンフィブリル、グラファイト、グラフェン、カーボンファイバー又はそれらの混合物などのカーボンベースの材料から構築される。一態様では、電極は、グラファイト、カーボンブラック、又はカーボンナノチューブなどの元素状炭素から形成される。一態様では、電極には、導電性炭素－ポリマー複合材料、カーボンインク、カーボンペースト、金属インク及びグラフェンインクなどのマトリックス中に分散された導電性粒子、及び／又は導電性ポリマーが含まれる。一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の炭素含有電極を有するマルチウェルプレートであり、例えば、１つ以上の電極は、炭素層、及び／又は炭素インクのスクリーン印刷された層を含む。

【0075】

一態様では、アッセイモジュールは、マルチウェルプレートである。一態様では、アッセイモジュールは、電極誘導発光ベースのアッセイに適したマルチウェルプレートである。一態様では、アッセイ表面は、マルチウェルプレートの１つ以上のウェル内に位置する。一態様では、アッセイモジュールは、複数のウェルと１つ以上の電極とを含む。一態様では、アッセイモジュールは、１つ以上の作用電極と１つ以上の対電極とを含む。一態様では、アッセイモジュールの１つ以上のウェルは、１つ以上の電極を含む。一態様では、マルチウェルプレートの各ウェルは、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含む。一態様では、１つ以上の電極は、１つ以上の又は複数の結合ドメインを含む。一態様では、方法は、少なくとも１つの電気化学発光部分を検出して、サンプル中の標的分析物を検出及び／又は定量化することを含む。一態様では、電気化学発光部分は、電気化学発光標識である。一態様では、アッセイモジュールは、並行して複数の分析物の検出及び／又は定量化に使用される。一態様では、アッセイモジュールは、同時マルチプレックスアッセイで使用される。電気化学発光を使用した複数の結合ドメインを含む表面上の分析物のマルチプレックス測定が知られている。例えば、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）及びＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ製品ライン、並びに米国特許第７，８４２，２４６号及び同第６，９７７，７２２号（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0076】

標的
標的には、タンパク質、毒素、核酸、増幅産物若しくはアンプリコン、微生物、ウイルス、細胞、真菌、胞子、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、リポソーム、エクソソーム、多糖類、薬物、ホルモン、ステロイド、栄養素、代謝産物、及び上記分子の任意の修飾誘導体、又は上記分子の１つ以上を含む任意の複合体又はそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。一態様では、標的は、疾患又は疾患状態を示すサンプル中の目的の分析物である。一態様では、標的は、患者がその分析物に曝露されたか否かを示す、サンプル中の目的の分析物である。一態様では、標的は、目的の分析物である異なる標的の検出を容易にするために、アッセイ表面上に保持される。

【0077】

一態様では、一次試薬は、標的に特異的に結合する。一態様では、一次試薬は、標的分析物に特異的に結合する。一態様では、二次試薬は、標的に特異的に結合する。一態様では、二次試薬は、標的分析物に特異的に結合する。一態様では、一次試薬及び二次試薬は、互いに異なる標的に結合する。一態様では、一次試薬は、二次試薬によって結合された標的分析物の検出を容易にするために、標的に結合する。一態様では、二次試薬は、一次試薬によって結合された標的分析物の検出を容易にするために、標的を結合する。

【0078】

一態様では、一次試薬は、抗体又は抗原結合抗体断片などのタンパク質性捕捉試薬であり、チオール含有二次試薬は、チオール化アンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、一次試薬は、細胞、細胞下構造、ウイルス誘導体、小胞又は治療用分子などの捕捉標的ハイブリッドであり、チオール含有二次試薬は、チオール化アンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、捕捉抗体は、標的分析物に特異的に結合する。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、標的分子又は標的分析物を含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチド試薬は、オリゴヌクレオチドを含む標的とハイブリダイズする。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチド試薬は、オリゴヌクレオチド増幅産物を含む標的とハイブリダイズする。一態様では、オリゴヌクレオチド増幅産物は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自立合成反応）及び等温増幅法、例えば、ヘリカーゼ依存性増幅及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含むがこれらに限定されない増幅技術によって生成される。一態様では、増幅産物は、ＲＣＡアンプリコンを含む。例えば、２０１４年３月１２日に出願され、ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＡＳＳＡＹ ＭＥＴＨＯＤＳと題するＰＣＴ公開第２０１４／１６５０６１号（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0079】

一態様では、一次試薬は、細胞外小胞（ＥＶ）に関連する標的に結合する。一態様では、一次試薬は、細胞外小胞の表面タンパク質に結合する。一態様では、一次試薬は、エクソソームに結合する。一態様では、エクソソームは、表面結合又は細胞質タンパク質、脂質、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないシグナル伝達分子を含む。一態様では、エクソソーム内のシグナル伝達分子の同一性及び濃度を使用して、その細胞起源及び機能を推定する。例えば、２０２０年２月２８日に出願され、ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ ＭＥＴＨＯＤＳと題する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／２０２８８（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0080】

一態様では、一次試薬は、一次標的に特異的に結合し、二次試薬は、二次標的、例えば、一次標的に関連する、又は一次標的によってカプセル化された標的分析物に特異的に結合する。一態様では、一次試薬は、細胞外小胞（ＥＶ）の表面タンパク質を含む標的に特異的に結合する。一態様では、一次試薬は、細胞外小胞（ＥＶ）の表面タンパク質に結合するタンパク質性一次試薬である。一態様では、細胞外小胞は、エクソソームである。一態様では、標的分析物は、ＥＶ関連タンパク質である。一態様では、標的分析物は、ＥＶによってカプセル化される。一態様では、二次試薬は、ＥＶ関連タンパク質である標的分析物に結合する。一態様では、二次試薬は、ＥＶによってカプセル化された標的分析物に結合する。

【0081】

捕捉標的ハイブリッド
諸実施形態では、捕捉標的ハイブリッドは、生物学的部分、例えば、細胞、ウイルス誘導体、小器官、細胞下構造、小胞、治療用分子、又はそれらの組み合わせであり、標的及び捕捉が統合され、一緒になって捕捉標的ハイブリッドを形成する。例示的な捕捉標的ハイブリッドは、細胞全体であり、それによって細胞の一部はプレートに結合し、標的は細胞の表面、例えばタンパク質上にある。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、ビオチン化され、ストレプトアビジンプレートに結合する。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、チオール含有化合物でコーティングされ、ストレプトアビジンプレートに結合する。一態様では、捕捉標的は、コーティングされておらず、その自然な状態又は状況にあり、ストレプトアビジンプレートに結合する。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、アンカーオリゴヌクレオチドとともに固定化される。アンカーオリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、ＢＳＡコンジュゲートアンカーオリゴヌクレオチド（ＢＳＡ－オリゴ）又はチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチド（チオール－オリゴ）が挙げられる。一態様では、捕捉標的ハイブリッド及びアンカーオリゴヌクレオチドは、順次固定化される。アンカーオリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、ＢＳＡコンジュゲートアンカーオリゴヌクレオチド（ＢＳＡ－オリゴ）又はチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチド（チオール－オリゴ）が挙げられる。

【0082】

一態様では、炭素含有アッセイ表面上に固定化された捕捉標的ハイブリッドは、アッセイ表面上の結合パートナーに優先的に結合する結合試薬でコーティングされる。一態様では、捕捉標的ハイブリッドは、ストレプトアビジンでコーティングされた炭素含有アッセイ表面上に固定化され、前述の表面は、ビオチン化アンカーオリゴヌクレオチドを含有する溶液でコーティングされる。

【0083】

一態様では、その表面上に標的分析物を含む捕捉標的ハイブリッド全体の使用は、溶解された細胞の溶液中に放出される追加のタンパク質のオフターゲット認識を制限する。一態様では、捕捉標的ハイブリッド全体の表面上の標的分析物の天然のコンフォメーションが維持される。

【0084】

直接コーティング方法
一態様では、一次試薬と二次試薬とを含む二機能性アッセイ表面を調製するための直接コーティング方法が提供される。一態様では、タンパク質性一次試薬とチオール含有二次試薬とを含む二機能性アッセイ表面を調製するための直接コーティング方法が提供される。一態様では、捕捉標的ハイブリッドとチオール含有二次試薬とを含む二機能性アッセイ表面を調製するための直接コーティング方法が提供される。本明細書で使用される場合、「直接コーティング」とは、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッド、及びチオール含有二次試薬のいずれかが同時にアッセイ表面上に固定化されることを意味する。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッド、及びチオール含有二次試薬のいずれかが、コーティング溶液中でアッセイ表面上に分配される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッド、及びチオール含有二次試薬のいずれかが、同じコーティング溶液中のアッセイ表面上に分配される。一態様では、コーティング溶液は、タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬の両方を含む。一態様では、コーティング溶液は、捕捉標的ハイブリッド及びチオール含有二次試薬の両方を含む。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドのいずれかと、チオール含有二次試薬とが、アッセイ表面上の別個の結合ドメインに印刷される。一態様では、液体処理システムを使用して、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドとチオール含有二次試薬とがアッセイ表面上に印刷される。一態様では、試薬は、例えば、インクジェットプリンタ又は圧電プリンタを含む非接触ディスペンサーを使用してアッセイ表面上に印刷される。一態様では、試薬は、接触プリンタを使用して、例えば、ピン、毛細管、又はインクスタンプを使用して、アッセイ表面上に印刷される。

【0085】

一態様では、一次試薬及びチオール含有二次試薬は、異なる表面化学を介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、アッセイ表面上に非共有結合的に固定化される。一態様では、一次試薬は、受動吸着によってアッセイ表面上に非共有結合的に固定化される。一態様では、一次試薬は、炭素含有アッセイ表面上に共有結合的に固定化される。一態様では、一次試薬は、結合対を介して炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、結合対の第１のメンバーを含み、アッセイ表面は、結合対の第２のメンバーを含む。一態様では、一次試薬はビオチンを含み、アッセイ表面はアビジン又はストレプトアビジンでコーティングされる。

【0086】

一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール基とアッセイ表面上の反応性官能基との間の結合の形成によって、アッセイ表面上に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、アッセイ表面上の反応性官能基を介して炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、マレイミド基を介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、アッセイ表面は、チオール含有二次試薬を炭素含有アッセイ表面上に固定化する前に、１つ以上のマレイミド基を導入するように処理される。

【0087】

一態様では、一次試薬は、アレイ状にアッセイ表面上に印刷される。一態様では、複数の一次試薬が、アレイ状に印刷される。一態様では、複数の一次試薬が、別個の結合ドメインに印刷される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドは、アレイ状にアッセイ表面上に印刷される。一態様では、複数のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、アレイ状に印刷される。一態様では、複数のタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドが、別個の結合ドメインに印刷される。

【0088】

一態様では、複数の二次試薬が、アレイ状に印刷される。一態様では、複数の二次試薬は、別個の結合ドメインに印刷される。一態様では、複数のチオール含有二次試薬が、アレイ状に印刷される。一態様では、複数のチオール含有二次試薬が、別個の結合ドメインに印刷される。

【0089】

一態様では、固有の一次試薬及び固有のチオール含有二次試薬が、各結合ドメインに印刷される。一態様では、固有の一次試薬及び共通のチオール含有二次試薬が、各結合ドメインに印刷される。一態様では、複数の一次試薬が、複数の一次結合ドメインに印刷される。一態様では、複数のチオール含有二次試薬が、複数の二次結合ドメインに印刷される。

【0090】

一態様では、この方法は、約１０ｎｌ、１５ｎｌ、２０ｎｌ、２５ｎｌ、３０ｎｌ、３５ｎｌ、４０ｎｌ、４５ｎｌ、又は５０～最大約５５ｎｌ、６０ｎｌ、６５ｎｌ、７０ｎｌ、７５ｎｌ、８０ｎｌ、８５ｎｌ、９０ｎｌ、９５ｎｌ、又は１００ｎｌのコーティング溶液をアッセイ表面上に分配することを含む。一態様では、この方法は、約２５ｎｌ～約７５ｎｌ、約４０ｎｌ～約６０ｎｌ、又は約３０ｎｌ～約５０ｎｌのコーティング溶液をアッセイ表面上に分配することを含む。一態様では、この方法は、約１０ｎｌ、１５ｎｌ、２０ｎｌ、２５ｎｌ、３０ｎｌ、３５ｎｌ、４０ｎｌ、４５ｎｌ、又は５０～最大約５５ｎｌ、６０ｎｌ、６５ｎｌ、７０ｎｌ、７５ｎｌ、８０ｎｌ、８５ｎｌ、９０ｎｌ、９５ｎｌ、又は１００ｎｌのコーティング溶液を炭素含有アッセイ表面上に分配することを含む。一態様では、この方法は、約２５ｎｌ～約７５ｎｌ、約４０ｎｌ～約６０ｎｌ、又は約３０ｎｌ～約５０ｎｌのコーティング溶液を炭素含有アッセイ表面上に分配することを含む。一態様では、この方法は、約５０ｎｌ又は７５ｎｌのコーティング溶液を炭素含有アッセイ表面上に分配することを含む。

【0091】

一態様では、コーティング溶液は、約５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、若しくは１５０μｇ／ｍｌ～最大約２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、若しくは４００μｇ／ｍｌの一次試薬、又は約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌの一次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、若しくは５００ｎＭ～最大約５００ｎＭ、１０００ｎＭ、１２５０ｎＭ、若しくは１５００ｎＭの二次試薬、又は約１５ｎＭ～約１５００ｎＭの二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌの一次試薬と、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭの二次試薬とを含む。

【0092】

一態様では、コーティング溶液は、約５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、又は１５０μｇ／ｍｌ～最大約２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、又は４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬若しくは捕捉標的ハイブリッド、又は約１００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬若しくは捕捉標的ハイブリッドを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、若しくは５００ｎＭ～最大約５００ｎＭ、１０００ｎＭ、１２５０ｎＭ、若しくは１５００ｎＭのチオール含有二次試薬、又は約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドと、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬とを含む。

【0093】

一態様では、コーティング溶液は、約５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、若しくは１５０μｇ／ｍｌ～最大約２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、若しくは４００μｇ／ｍｌのタンパク質性捕捉試薬、例えば、抗体、抗原結合抗体断片、若しくは受容体、又は約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性捕捉試薬を含む。一態様では、コーティング溶液は、約１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、若しくは５００ｎＭ～最大約５００ｎＭ、１０００ｎＭ、１２５０ｎＭ、若しくは１５００ｎＭのチオール化オリゴヌクレオチド、又は約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール化オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性捕捉試薬と、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール化オリゴヌクレオチドとを含む。

【0094】

一態様では、コーティング溶液は、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００などの非イオン性洗剤を含む。一態様では、コーティング溶液は、約０．０１％、０．０２％、又は０．０３％～最大で約０．０４％又は０．０５％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００を含む。一態様では、コーティング溶液は、約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００を含む。一態様では、コーティング溶液は、トレハロースなどの安定化剤を含む。一態様では、コーティング溶液は、約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、又は０．０５％～最大約０．１％、又は０．５％のトレハロースを含む。一態様では、コーティング溶液は、約０．０１％～約０．１％、約０．０１％～約０．０５％、又は約０．１％～約０．５％のトレハロースを含む。一態様では、コーティング溶液は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を含む。一態様では、コーティング溶液は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）などの緩衝液を含む。一態様では、ＤＰＢＳは、２．６７ｍＭのＫＣｌと、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４と、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４と、１３８ｍＭのＮａＣｌとを含む。一態様では、緩衝液は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、又は５ｍＭ～最大約１０ｍＭ、１５ｍＭ、又は２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。一態様では、コーティング溶液は、ポリエチレングリコール誘導体、例えば、市販され、本明細書ではＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と呼ばれるポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテルを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドと、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０１％～約０．１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、約０．１％～約０．５％のＤＰＢＳ中トレハロースと、約１ｍＭのＥＤＴＡ～約２０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。一態様では、コーティング溶液は、約１００μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌのタンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドと、約１５ｎＭ～約１５００ｎＭのチオール含有二次試薬と、約０．０３％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、約０．４％のＤＰＢＳ中トレハロースと、約１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。

【0095】

一態様では、二機能性アッセイ表面は、一次試薬及びチオール含有二次試薬を含むコーティング溶液をアッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面を形成することによって調製される。一態様では、アッセイ表面は、炭素含有アッセイ表面である。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、タンパク質性一次試薬及びチオール含有二次試薬が炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、捕捉標的ハイブリッド及びチオール含有二次試薬が炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、一晩インキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、室温でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、室温で一晩インキュベートされる。諸実施形態では、コーティングされたアッセイ表面は、室温を上回る温度及び下回る温度、例えば、４℃～約３７℃でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、少なくとも約６、７又は８時間～最大約１０、１１又は１２時間インキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、少なくとも約３０％、３５％、若しくは４０％～最大約４０％、４５％、若しくは５０％、又は約３０％～約５０％の制御された湿度でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、約３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％の制御された湿度でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、約４０％の制御された湿度でインキュベートされる。

【0096】

オーバーコーティング方法
一態様では、一次試薬及び二次試薬を含む二機能性アッセイ表面を調製するためのオーバーコーティング方法が提供される。一態様では、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッド、及びチオール含有二次試薬のいずれかを含む二機能性アッセイ表面を調製するためのオーバーコーティング方法が提供される。本明細書で使用される場合、「オーバーコーティング」とは、一次試薬及び二次試薬がアッセイ表面上に順次固定化されることを意味する。

【0097】

一態様では、一次試薬を含むコーティング溶液が、アッセイ表面上に分配される。一態様では、一次試薬は、アッセイ表面上の別個の結合ドメインに印刷される。一態様では、一次試薬は、アレイ状にアッセイ表面上に印刷される。一態様では、液体処理システムを使用して、一次試薬がアッセイ表面上に印刷される。一態様では、一次試薬は、例えば、インクジェットプリンタ又は圧電プリンタを含む非接触ディスペンサーを使用してアッセイ表面上に印刷される。一態様では、一次試薬は、接触プリンタを使用して、例えば、ピン、毛細管、又はインクスタンプを使用して、アッセイ表面上に印刷される。一態様では、一次試薬が既に固定化されたアッセイ表面が得られる。一態様では、一次試薬は、タンパク質性一次試薬又は捕捉標的ハイブリッドである。一態様では、一次試薬は、タンパク質性捕捉試薬である。

【0098】

一態様では、アッセイ表面は、マルチウェルプレートを含む。一態様では、アッセイ表面は、炭素含有アッセイ表面である。一態様では、アッセイ表面は、炭素含有電極を含む。

【0099】

一態様では、一次試薬は、アッセイ表面上に非共有結合的に固定化される。一態様では、一次試薬は、受動吸着によってアッセイ表面上に非共有結合的に固定化される。一態様では、一次試薬は、炭素含有アッセイ表面上に共有結合的に固定化される。一態様では、捕捉試薬は、結合対を介して炭素含有アッセイ表面上に固定化される。一態様では、一次試薬は、結合対の第１のメンバーを含み、アッセイ表面は、結合対の第２のメンバーを含む。一態様では、一次試薬はビオチンを含み、炭素含有アッセイ表面はアビジン又はストレプトアビジンでコーティングされる。

【0100】

一態様では、チオール含有二次試薬は、アッセイ表面上にチオール含有二次試薬を含むオーバーコーティング溶液を分配することによって、一次試薬が以前に固定化されたアッセイ表面上に分配される。一態様では、チオール含有二次試薬を含むオーバーコーティング溶液をアッセイ表面上に分配して、コーティングされたアッセイ表面が形成される。一態様では、チオール含有二次試薬は、オーバーコーティング溶液の液滴をアッセイ表面上に適用することによって、アッセイ表面上に固定化される。一態様では、約１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、又は４０μＬ～最大約５０μＬ、５５μＬ、６０μＬ、６５μＬ、７０μＬ、７５μＬ、８０μＬ、８５μＬ、９０μＬ、９５μＬ、又は１００μＬの、チオール含有二次試薬を含むオーバーコーティング溶液がアッセイ表面上に分配される。一態様では、約２５μＬ～約７５μＬの、チオール含有二次試薬を含むオーバーコーティング溶液がアッセイ表面上に分配される。一態様では、約３０μＬ～約５０μＬの、チオール含有二次試薬を含むオーバーコーティング溶液がアッセイ表面上に分配される。一態様では、チオール含有二次試薬は、オーバーコーティング溶液の液滴をアッセイ表面上に適用し、振盪しながらアッセイ表面をインキュベートすることによって、アッセイ表面上に固定化される。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、振盪器により約５００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、又は７００ｒｐｍ～最大約８００ｒｐｍ、９００ｒｐｍ、又は１０００ｒｐｍでインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、振盪器により約６５０ｒｐｍ、６７５ｒｐｍ、７００ｒｐｍ～最大約７２５ｒｐｍ、又は７５０ｒｐｍでインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、振盪器により約７００ｒｐｍ、７０５ｒｐｍ、７１０ｒｐｍ、７１５ｒｐｍ、７２０ｒｐｍ、又は７２５ｒｐｍでインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、振盪器により約７０５ｒｐｍでインキュベートされる。

【0101】

一態様では、オーバーコーティング溶液は、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、又は５μＭ～最大約１０μＭ、１５μＭ、又は２０μＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、オーバーコーティング溶液は、約０．０１μＭ～約２０μＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、オーバーコーティング溶液は、約１μＭ～約１０μＭのチオール含有二次試薬を含む。一態様では、オーバーコーティング溶液は、約１μＭ～約１０μＭのチオール化オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、オーバーコーティング溶液は、脱保護コンジュゲーション緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／１０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、Ｄｉｌｕｅｎｔ １００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）又はそれらの組み合わせから選択される緩衝液を含む。一態様では、脱保護コンジュゲーション緩衝液は、１０ｍＭのリン酸塩と、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む。

【0102】

一態様では、チオール含有二次試薬は、一次試薬が以前に固定化されたアッセイ表面上の別個の結合ドメインに印刷される。一態様では、液体処理システムを使用して、チオール含有二次試薬がアッセイ表面上に印刷される。一態様では、チオール含有二次試薬は、例えば、インクジェットプリンタ又は圧電プリンタを含む非接触ディスペンサーを使用して、アッセイ表面上に印刷される。一態様では、チオール含有二次試薬は、接触プリンタを使用して、例えば、ピン、毛細管、又はインクスタンプを使用して、アッセイ表面上に印刷される。

【0103】

一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、チオール含有二次試薬がチオール基を介して炭素含有アッセイ表面上に固定化される条件下でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、約１時間、２時間、３時間、又は４時間～最大約５時間インキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、約１時間～約５時間インキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、約１時間、２時間、３時間、４時間、又は５時間インキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、室温でインキュベートされる。一態様では、コーティングされたアッセイ表面は、室温で４時間インキュベートされる。

【0104】

一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール基とアッセイ表面上の反応性官能基との間の結合の形成によって、アッセイ表面上に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、アッセイ表面上のマレイミド基を介してアッセイ表面上に固定化される。一態様では、チオール含有二次試薬は、チオール基とアッセイ表面上のマレイミド基との間の共有結合を形成によって、アッセイ表面上に固定化される。一態様では、アッセイ表面は、チオール含有二次試薬がアッセイ表面上に分配される前に、１つ以上のマレイミド基を導入するように前処理される。一態様では、炭素含有アッセイ表面は、チオール含有二次試薬が炭素含有アッセイ表面上に分配される前に、１つ以上のマレイミド基を導入するように前処理される。一態様では、アッセイ表面は、ＳＭ（ＰＥＧ）_ｎ（ｎ＝２～２４である）を含むアミン－スルフヒドリル架橋剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理される。一態様では、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４又はｎ＝５である。一態様では、ｎ＝４である。

【0105】

一態様では、チオール含有二次試薬は、例えば、アッセイ表面を不動態化し、及び／又は非特異的結合を低減するために、チオール化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種を含む。

【0106】

一態様では、アッセイ表面は、例えば、ビオチンを含む試薬の固定化を容易にするために、ストレプトアビジンで前処理される。

【0107】

参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用された全ての参考文献、及びその中で引用された参考文献は、それらがまだ含まれていない範囲で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0108】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0109】

実施例１．タンパク質性捕捉抗体及びＢＳＡコンジュゲートアンカーオリゴヌクレオチドによる二機能性アッセイ表面を調製するための方法
この実施例は、９６ウェルの７スポット及び１０スポットアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）上で二機能性アッセイ表面を調製する方法について説明する。簡潔には、タンパク質性捕捉抗体を表面上に印刷し、表１に示されるＢＳＡコンジュゲートアンカーオリゴヌクレオチド（ＢＳＡ－オリゴ）又はチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチド（チオール－オリゴ）とともに固定化した。

【0110】

簡潔には、マレイミド修飾ＢＳＡ及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドを調製し、モル比１：１０でコンジュゲートした。１００μｇ／ｍｌ～４００μｇ／ｍｌの捕捉抗体と、５μｇ／ｍｌ～５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ－オリゴ又はチオール－オリゴとを含むコーティング溶液を、０．０３％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、０．４％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中トレハロース（７５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む又はＢＳＡを含まない）とを含有するコーティング溶液中で調製した。５０ｎｌ又は７５ｎｌのコーティング溶液を、カスタムディスペンサーを使用して、１０スポット又は７スポットＭＳＤ ９６ウェルプレートアッセイ表面の各結合ドメインに印刷し、４０％の制御された湿度で一晩乾燥させた。

【0111】

実施例２．ビオチン化捕捉抗体及びビオチン化アンカーオリゴヌクレオチドによる二機能性アッセイ表面を調製するための方法
この実施例は、ストレプトアビジンでコーティングされた小さなスポット又は１０スポット９６ウェルアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）上に二機能性アッセイ表面を調製するための代替方法を説明する。この実施例では、ビオチン化捕捉抗体を、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート（ｓｓＳＡ）上にビオチン化アンカーオリゴヌクレオチドとともに共固定化した。

【0112】

簡潔には、ビオチン化捕捉抗体及びビオチン化アンカーオリゴヌクレオチドを、Ｄｉｌｕｅｎｔ １００中でそれぞれ０．２５μｇ／ｍｌ及び２５ｐＭに希釈し、室温で振盪しながら１時間インキュベートして、ＳＡでコーティングされたプレート表面上に固定化した。

【0113】

実施例３．チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドによるプレートのオーバーコーティング
この実施例は、捕捉抗体がアレイ状にその上に固定化されたＭＳＤ Ｖ－Ｐｌｅｘイムノアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチド（アンカー－ＳＨ）を含むオーバーコーティング溶液でオーバーコーティングすることによって、二機能性アッセイ表面を調製するための方法を説明する。

【0114】

簡潔には、９ヌクレオチド～４３ヌクレオチドの範囲の長さのチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチド（アンカー－ＳＨ）を調製した。アンカーオリゴヌクレオチドを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリスカルボキシエチルホスフェン（ＴＣＥＰ）還元試薬のいずれかを使用して、製品添付文書の説明書（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って脱保護し、反応性チオール基を有するアンカーオリゴを作製した。チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドの一部は、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）；５－メチルデオキシシチジン；Ｓｕｐｅｒ Ｔ（５－ヒドロキシブチンル－２’－デオキシウリジン）；ロックドＤＮＡ塩基；及びペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチドから選択される１つ以上の修飾を含んでいた（表１を参照されたい）。

【0115】

チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドを、以下の緩衝液のうちの１つで希釈した：（ｉ）１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する脱保護コンジュゲーション緩衝液（ＤＣＢ）（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）、（ｉｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／１０ｍＭのＥＤＴＡ、又は（ｉｉｉ）Ｄｉｌｕｅｎｔ １００。

【0116】

ＭＳＤ Ｖ－Ｐｌｅｘイムノアッセイプレートをリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。０．５μＭ～２０μＭのチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドを含有する３５μＬ～５０μＬのオーバーコーティング溶液を各ウェルに添加し、７０５ｒｐｍで振盪しながら、室温ＲＴで２時間インキュベートして、捕捉抗体がその上に固定化された結合ドメインにチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドを固定化した。

【0117】

実施例４．捕捉抗体及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドによるプレートの直接コーティング
この実施例は、タンパク質性捕捉抗体及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチド（アンカー－ＳＨ）で１０スポットＭＳＤアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を直接コーティングすることによって、二機能性アッセイ表面を調製するための方法を説明する。この実施例では、タンパク質性捕捉抗体をプレート表面への抗体の受動吸着によって固定化し、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドをプレート表面へのチオール基の共有結合によって固定化した。

【0118】

実施例３に記載されているように、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドを調製した。

【0119】

１００μｇ／ｍｌ～４００μｇ／ｍｌの捕捉抗体と、５０ｎＭ～１５００ｎＭのチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドとを含むコーティング溶液を、０．０３％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、０．４％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中トレハロース（１０ｍＭのＥＤＴＡを含む）とを含有するコーティング溶液中で調製した。５０ｎｌのコーティング溶液を、カスタムディスペンサーを使用してアッセイ表面の各結合ドメインに印刷し、４０％の制御された湿度で一晩乾燥させた。

【0120】

実施例５．ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドによるプレートの直接コーティング
この実施例は、タンパク質性ストレプトアビジン及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチド（アンカー－ＳＨ）で１０スポットＭＳＤアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を直接コーティングすることによって、二機能性アッセイ表面を調製するための方法を説明する。この実施例では、タンパク質性ストレプトアビジンをプレート表面へのストレプトアビジンの受動吸着によって固定化し、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドをプレート表面へのチオール基の共有結合によって固定化した。

【0121】

実施例３に記載されているように、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドを調製した。

【0122】

５００μｇ／ｍｌのストレプトアビジンと、５０ｎＭ～１５００ｎＭのチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドとを含むコーティング溶液を、０．０３％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００と、０．４％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中トレハロース（１０ｍＭのＥＤＴＡを含む）とを含有するコーティング溶液中で調製した。５０ｎｌのコーティング溶液を、カスタムディスペンサーを使用してアッセイ表面の各結合ドメインに印刷し、４０％の制御された湿度で一晩乾燥させた。

【0123】

実施例６．オーバーコーティング及び直接コーティングされたアンカーオリゴヌクレオチドによるＩＬ－４アッセイ
ＩＬ－４に特異的に結合する捕捉抗体及びチオール化アンカーオリゴヌクレオチド（表１のアンカー－ＳＨ、＃２）を用いて、実施例３及び４に記載のオーバーコーティング方法及び直接コーティング方法によって二機能性アッセイプレートを調製した。アッセイ感度を、アンカーのない（アンカーなし）Ｓ－Ｐｌｅｘプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）；実施例２に記載されるように調製されたビオチン化アンカーオリゴヌクレオチドを有するストレプトアビジンでコーティングされたプレート（ｓｓＳＡ）、Ｖ－Ｐｌｅｘプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）、及び実施例１に記載されるように調製されたＢＳＡアンカーオリゴヌクレオチド（データは示さず）を使用した感度と比較した。

【0124】

二機能性表面を有するプレートを、ＰＢＳ又はＭＳＤ洗浄緩衝液で洗浄した（同じ洗浄緩衝液を全ての洗浄ステップで使用した）。分析物（較正曲線）の希釈物（分析物を含まない条件を含む）を調製し、２５μＬ～５０μＬをプレートに添加し、室温（ＲＴ）にて７００ｒｐｍで振盪しながら１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、４０μＬ～５０μＬのＴｕｒｂｏ Ｂｏｏｓｔ抗体をプレートに添加し、室温で振盪しながら１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３０μＬ～５０μＬのＥｎｈａｎｃｅ溶液をプレートに添加し、室温で振盪しながら０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３０μＬ～５０μＬのＤｅｔｅｃｔ溶液をプレートに添加し、２７℃で振盪しながら１時間インキュベートした。Ｖ－ＰｌｅｘプレートをＭＳＤ製品添付文書に従って試験した。

【0125】

アッセイ感度は４ＰＬフィット関数を使用して決定した。検出限界（ＬＯＤ）は、その標準偏差である２．５のバックグラウンドを上回るシグナルに対応する濃度として計算した。

【0126】

アッセイ感度は、アンカーなし対照と比較して、アンカーオリゴヌクレオチドを用いた全ての条件で約５倍向上した。結果を表２（以下）及び図１に示す。他の捕捉抗体（ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０）を使用して行った実験は、本発明のオーバーコーティング又は直接コーティングのアプローチを使用して、ＩＬ４アッセイで見られたものと同様のアッセイ性能の改善を示した（データは示さず）。

【表2】

【0127】

実施例７．直接コーティングされたアンカーオリゴヌクレオチド及びビオチン化アンカーオリゴヌクレオチドを用いたストレプトアビジンプレート上のＩＬ－４、ＩＬ１０、及びＧＭ－ＣＳＦアッセイ
二機能性アッセイプレートを、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート及び実施例２に記載の手順を使用して調製することで、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びＧＭ－ＣＳＦに特異的なビオチン化捕捉抗体及びビオチン化アンカーを固定化した。また、二機能性アッセイプレートを、実施例５に記載のストレプトアビジン及びアンカー－ＳＨでコーティングされたプレートを使用して調製することで、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びＧＭ－ＣＳＦに特異的なビオチン化捕捉抗体を固定化した。アッセイ感度を、両方のタイプの二機能性プレートで比較し、捕捉抗体及びアンカーは、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して表面上に付着し（ＳＡとして表３に示される）、捕捉抗体は、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して表面上に付着し、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、プレート表面にチオール基の共有結合によって固定化された（ＳＡ Ａ－直接として表３に示される）。

【0128】

アッセイを実行し、アッセイ感度を実施例６に記載されているように決定した。アッセイ感度は、両方のタイプの二機能性プレートについて類似していた。

【表3】

【0129】

実施例８．アッセイ堅牢性試験
Ｓ－Ｐｌｅｘアッセイ性能に対するチオール化アンカーオリゴヌクレオチドの効果を、ストリンジェントな洗浄を使用したアッセイ堅牢性試験で評価し、オリゴヌクレオチドアンカーがＲＣＡ産物を表面に保持する能力を評価した。感度（シグナル／ＮＳＢ）の低下は観察されず、Ｓ－Ｐｌｅｘアッセイフォーマットと比較して、ばらつき（％ＣＶ）は増加しなかった（データは示さず）。

【0130】

実施例９．ビオチン－ＰＥＧ－ＳＨ試薬
この実施例では、ビオチン及びＰＥＧスペーサー（Ｂｉｏ－ＰＥＧ－ＳＨ）、Ｎａｎｏｃｓ（ＭＷ４００、６００、及び１０００）を含むヘテロ二機能性チオール化試薬を、オーバーコーティング方法及び直接コーティング方法を使用して、Ｖ－Ｐｌｅｘ ＭＳＤプレート及び１０スポット９６ウェルアッセイプレートの表面上に固定化した。オーバーコーティング方法には、１μＭ～５μＭの濃度範囲のＢｉｏ－ＰＥＧ－ＳＨを使用した。直接コーティング方法には、１μＭ～１０μＭの濃度範囲のＢｉｏ－ＰＥＧ－ＳＨを使用した。上記の実施例３及び４に記載されているのと同じ溶媒を使用した。濃度範囲は、製造元の製品添付文書の説明書に従って、Ｅｌｌｍａｎｎ試薬（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定されたチオール基濃度に基づいていた。

【0131】

オーバーコーティング方法及び直接コーティングの両方の方法は、プレート表面上に検出可能な／機能的な量のビオチンを提供し、次いで、このビオチンを使用して、ストレプトアビジンに結合したビオチン化アンカーオリゴヌクレオチド（表１）を付着させ、二機能性Ｓ－ＰＬＥＸプレートを作製した。固定化ビオチンを介したアンカーオリゴヌクレオチドの添加は、実施例１～４に記載の二機能性表面調製ステップに加えて、Ｓ－ＰＬＥＸプロトコルアッセイの任意の他のステップでアンカー配列を添加することを可能にし（例えば、Ｔｕｒｂｏ Ｂｏｏｓｔ抗体、Ｅｎｃｈａｎｃｅ又はＤｅｔｅｃｔ試薬インキュベーションステップとともに）、それによって、例えば、抗ＤＮＡ抗体としての潜在的なサンプル－アンカー干渉を回避する。

【0132】

図２及び表４に示されるように、Ｂｉｏ－ＰＥＧ－ＳＨ試薬でオーバーコーティングされたプレートは、アンカー－ＳＨオリゴでオーバーコーティングされたものと同様の性能を示し、両方とも、アンカーオリゴヌクレオチドを含まないプレートよりも約６倍優れた性能を示した。Ｂｉｏ－ＰＥＧ－ＳＨで直接コーティングされたプレートは、実施例８に記載されているＳ－Ｐｌｅｘアッセイで使用された場合、アンカー－ＳＨオリゴヌクレオチドで直接コーティングされたプレートと同等又はより優れた性能を示した（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）。全体的な感受性の向上は、Ｂｉｏ－ＰＥＧ－ＳＨオーバーコーティングされたプレートと同様に、アンカーなしと比較して約６倍であった。

【表4】

【0133】

実施例１０．ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨ試薬
この実施例では、本明細書に記載のオーバーコーティング方法を使用して、蛍光試薬をアッセイプレート上に固定化した。簡潔には、実施例３に記載のオーバーコーティング方法を使用して、蛍光（ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨ、Ｎａｎｏｃｓ）試薬をＶ－Ｐｌｅｘアッセイプレート表面上に固定化した。蛍光試薬の存在は、特異的抗ＦＩＴＣ抗体を使用して検出した。図４に示されるように、シグナル生成は濃度に依存していた。

【0134】

実施例１１．ＰＥＧ－ＳＨ試薬
場合によっては、アッセイ及びサンプル成分は、捕捉抗体で覆われていない表面領域に付着し、バックグラウンドを増加させ、アッセイ感度に悪影響を及ぼすことがある。ＰＥＧオリゴマーによる表面修飾は、標準的なサンドイッチフォーマットアッセイにおける非特異的結合（ＮＳＢ）を低減することができるという仮説が立てられた。

【0135】

５つのＰＥＧ－ＳＨ試薬、Ｎａｎｏｃｓ（ＭＷ３５０、５５０、７５０、１０００及び２０００）を、実施例３に記載のオーバーコーティング方法を使用して捕捉抗体がその上に固定化されたＶ－Ｐｌｅｘアッセイプレート上に固定化し、Ｖ－Ｐｌｅｘ製品添付文書に従って標準１０プレックスサンドイッチ形式で試験した。図５Ａ及び５Ｂに示すように、ＩＦＮｇ及びＴＮＦαアッセイの両方において、ＰＥＧ－ＳＨでオーバーコーティングされたプレートは、濃度依存的にＮＳＢを減少させた。

【0136】

同じ試薬をａ－ＩＦＮｇ及びａ－ＴＮＦα抗体でプレート表面上に直接コーティングしても、同じ結果は得られなかった。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【国際調査報告】