特表 2024-517741 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/28

A61K39/395 D

A61K39/395 U

A61P35/00

A61P37/06

A61P31/12

A61P31/04

A61P37/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566501

(86)(22)【出願日】2022-05-02

(85)【翻訳文提出日】2023-11-01

(86)【国際出願番号】 IL2022050453

(87)【国際公開番号】W WO2022234571

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/183,635

(32)【優先日】2021-05-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523405959

【氏名又は名称】イミュノリゾン リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ボギン，オレン

(72)【発明者】

【氏名】ダッサ，リアット

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、いくつかの抗ＮＫＧ２Ｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｋｉｌｌｅｒ Ｇｒｏｕｐ ２、メンバーＤ）抗体を記載する。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が更に開示される。本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、又はＮＫＧ２Ｄの過剰発現に関連する疾患などの様々な疾患を治療するために使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む単離された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体であって、
（ｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号１６～１８のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が配列番号２０～２２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が配列番号２４～２６のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３２～３４のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が配列番号３６～３８のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が配列番号４０～４２のアミノ酸配列を含む、単離された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体。

【請求項2】

前記抗体が重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が配列番号１１及び１５、配列番号１９及び２３、配列番号２７及び３１、又は配列番号３５及び３９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体。

【請求項3】

前記抗体が、ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、ナノボディ、二重特異性抗体、又は単一ドメイン抗体である、請求項１又は２に記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体。

【請求項4】

前記ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である、請求項３に記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか一項に記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。

【請求項6】

前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含み，
（ｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号１６～１８のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が配列番号２０～２２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が配列番号２４～２６のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３２～３４のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が配列番号３６～３８のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が配列番号４０～４２のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が配列番号１１及び１５、配列番号１９及び２３、配列番号２７及び３１、又は配列番号３５及び３９のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

請求項１又は２に記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド配列。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

対象における疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項12】

前記疾患が、癌、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ、ウイルス感染、細菌感染、又はＮＫＧ２Ｄに関連する疾患である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含み、
（ｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号１６～１８のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が配列番号２０～２２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が配列番号２４～２６のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３２～３４のアミノ酸配列を含み、又は
（ｉｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が配列番号３６～３８のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が配列番号４０～４２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が配列番号１１及び１５、配列番号１９及び２３、配列番号２７及び３１、又は配列番号３５及び３９のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の記述
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年５月２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ－６０４１３５－ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは２１キロバイトである。

【0002】

本開示は、一般に抗体に関する。一実施形態では、本開示は、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体の作製及び使用を記載する。

【背景技術】

【0003】

ＮＫＧ２Ｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｋｉｌｌｅｒ Ｇｒｏｕｐ ２、メンバーＤ）は、細胞傷害性免疫細胞上で主に発現される活性化細胞表面タンパク質である。ＮＫＧ２Ｄは、全てのＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びγδＴ細胞のサブセット上に豊富に存在する。ナイーブヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞はＮＫＧ２Ｄを発現するが、マウスにおいて、それらは活性化後にのみその発現を上方制御する。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、一般に、活性化後であってもＮＫＧ２Ｄを発現しないが、ヒトにおいて、その発現は、Ｃｒｏｈｎ病、若年発症狼瘡及びサイトメガロウイルス感染症などの特定の病的状態下で誘導され得る。ＮＫＧ２Ｄの分子構造は、いくつかの構造的に異なるＭＨＣ－Ｉ様リガンドに結合することを可能にする。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、恒常性条件下でそれらの発現が一般的に低いという共通点を有する。対照的に、感染又は発癌性形質転換などの細胞ストレスを受けると、それらの発現は高度に誘導され得る。ヒトにおいて、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及びＵＬＢＰファミリーの６つのメンバーである。

【0004】

ＮＫＧ２Ｄは、シグナル伝達特性を有さない非常に短い細胞内ドメインを有する、２つのジスルフィド結合膜貫通タンパク質のホモ二量体である。マウスにおいて、ＮＫＧ２Ｄは、そのシグナル伝達を中継するためにアダプター分子ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２を使用するが、ヒトにおいて、ＮＫＧ２Ｄは、ＤＡＰ１０と排他的に会合する。ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２は、異なるシグナル伝達カスケードを開始する。ＤＡＰ１０は、ホスファチジルイノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｐ８５への結合を可能にするＹＩＭモチーフを有する。更に、ＤＡＰ１０は、Ｖａｖ１と会合するＧｒｂ２に結合する。ＤＡＰ１２は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフを含有し、これは、ＮＫＧ２Ｄ誘発時にＳｒｃキナーゼによってリン酸化される。この事象は、チロシンキナーゼ、Ｓｙｋ及びＺａｐ７０の結合及び活性化を可能にする。

【0005】

ＮＫＧ２Ｄは、潜在的に危険な細胞の認識及び排除において重要な役割を果たす。それは、腫瘍、ウイルス感染細胞、及び臓器移植に対する免疫応答を媒介することが示されている。この理由のために、ＮＫＧ２Ｄは、ストレスを受けた標的細胞上のリガンドの遭遇に応答して直接的な細胞傷害性を主に媒介すると元々考えられていた。しかしながら、ほとんどの場合、ＮＫＧ２Ｄは、それが炎症状況内で生じる場合にのみ免疫細胞活性化を媒介することができる。ＮＫ細胞及びＴ細胞の両方は、一般に、ＮＫＧ２Ｄが測定可能な効果を媒介することができる前に二次シグナルを必要とする。したがって、ＮＫＧ２Ｄの主要な機能は、他の受容体を介したシグナル伝達の調節であると思われる。その独特の特徴は、複数の個体学的に異なる免疫細胞サブセットにおいて、ならびに造血発生、プライミング、及びエフェクター応答などの免疫細胞の生活環の異なる段階の間に、多数の受容体のシグナル伝達を阻害及び増強することの両方ができることである。

【0006】

ＮＫＧ２Ｄは、癌などの重要な疾患に対する細胞溶解性免疫応答を増強する効力を有するので、治療標的として大きな可能性を有する。ＮＫＧ２Ｄの重要な役割を考慮すると、ＮＫＧ２Ｄの治療用途を研究するために抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を開発する必要がある。

【発明の概要】

【0007】

一実施形態において、本開示は、いくつかの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のそれぞれは、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含み、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１６～１８のアミノ酸配列を含み、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２０～２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号２４～２６のアミノ酸配列を含み、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３２～３４のアミノ酸配列を含み、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が配列番号３６～３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が配列番号４０～４２のアミノ酸配列を含む。

【0008】

一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のそれぞれは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の配列番号１１及び１５、配列番号１９及び２３、配列番号２７及び３１、又は配列番号３５及び３９の対のうちの１つであり得る。

【0009】

一実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体及び本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む組成物を提供する。

【0010】

本開示はまた、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体をコードするポリヌクレオチド配列、ならびにそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター及び宿主細胞を提供する。

【0011】

一実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、癌、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ、ウイルス感染又は細菌感染などの疾患を治療するために使用することができる。別の実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄに関連する疾患を治療するために使用することができる。別の実施形態では、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を使用して、ＮＫＧ２Ｄの過剰発現に関連する疾患を治療することができる。

【0012】

抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のこれら及び他の態様は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の図面及び詳細な説明の以下の記載から理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0013】

抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のいくつかの実施形態及びその使用は、添付の図面を参照して、例としてのみ本明細書で説明される。ここで特に図面を詳細に参照すると、示されている詳細は、例示のためのものであり、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の実施形態及びその使用の説明に役立つ議論を目的としていることが強調されている。この点で、図面と併せて行われる説明により、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の実施形態及びその使用がどのように実践され得るかが当業者に明らかとなる。

【図1A】組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃ（ヒトＦｃに融合されたＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン）に対する免疫化後のマウス血清試験採血（ＴＢ）又は免疫化前の前採血（ＰＢ）の結合を示す。図１Ａは、Ｂａｌｂ／ｃマウス（マウス＃８７４１、８７４１、８７４３、８７４４、８７４５）又はＳＪＬマウス（マウス＃８７４６、８７４７、８７４８、８７４９、８７５０）由来の血清のＥＬＩＳＡ結合の結果を示す。

【図1B】組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃ（ヒトＦｃに融合されたＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン）に対する免疫化後のマウス血清試験採血（ＴＢ）又は免疫化前の前採血（ＰＢ）の結合を示す。図１Ｂは、ＣＨＯ細胞において過剰発現されたヒトＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ １０に対する、又はＣＨＯ細胞において過剰発現されたｃｙｎｏ－ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０に対する、Ｂａｌｂ／ｃマウス（マウス＃８７４１、８７４１、８７４３、８７４４、８７４５）及びＳＪＬマウス（マウス＃８７４６、８７４７、８７４８、８７４９、８７５０）由来の血清のＦＡＣＳ結合を示すが、ＣＨＯ親細胞では反応性は観察されなかった。ｈＩｇＧ１：陰性ヒトＩｇＧ対照。ｍＩｇＧ１：陰性マウスＩｇＧ対照。ＮＫＧ２Ｄ Ａｂ：陽性対照ｈＩｇＧ ｍＡｂ。

【図2】選択されたマウスハイブリドーマクローンの同一性を列挙する。

【図3】ＥＬＩＳＡによる選択された精製ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）のＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原への結合を示す。

【図4A-1】ヒト又はｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への選択された精製ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）のＦＡＣＳ結合を示す。図４Ａは、ヒトＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合を示す。

【図4A-2】ヒト又はｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への選択された精製ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）のＦＡＣＳ結合を示す。図４Ａは、ヒトＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合を示す。

【図4B】ヒト又はｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への選択された精製ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）のＦＡＣＳ結合を示す。図４Ｂは、ｃｙｎｏ ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合を示す。

【図4C】ヒト又はｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への選択された精製ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）のＦＡＣＳ結合を示す。図４Ｃは、初代ＮＫ細胞への結合を提示し、全てのｍＡｂにおける用量依存的結合（１００ｎＭ、各ｍＡｂについて左のバー；又は１０ｎＭ、各ｍＡｂの右側のバー）を、様々な平均蛍光強度（ＭＦＩ）と共に示した。Ｔａｂ ＫＹＫ２．０は、ＦｃにＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ変異を有する陽性抗ＮＫＧ２Ｄ－ヒトＩｇＧ１抗体である。ヒトＩｇＧ１ＬＡＬＡ Ｐ３２８Ｇは、Ｆｃ中にＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ陰性対照Ａｂである。

【図5】ＥＬＩＳＡによって行われたエピトープビニング分析を要約し、以下のような４つの異なる群を示す。群１（長方形の連続線）は、ｍＡｂ００１、００２、００３、００４、００５、００６、００８、０１１、０１３、０１５、０１７、０１８、０２０を集める。群２（連続円）は、ｍＡｂ００７、０１０、０１４を集める。群３（長方形破線）は、ｍＡｂ０１２、０１６、０１９を集める。群４（円形破線）はｍＡｂ００９を集める。

【図6A】１００ｎＭ（各ｍＡｂについて左のバー）又は１０ｎＭ（各ｍＡｂについて右のバー）での精製抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）の結合時のＮＫ細胞の活性化を示す。図６Ａは、ＣＤ１０７ａ活性化マーカーの蓄積を示す。ＡＰＣ ＣＤ１０７Ａは、抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂクローン結合を伴わない抗ＣＤ１０７Ａ抗体染色であり、ＡＰＣ ｍＩｇＧは、陰性対照マウスＩｇＧ抗体である。ＩＭ－１０６０は陽性対照トリボディであり、ＩＭ－１０９１は陰性対照トリボディである。

【図6B】１００ｎＭ（各ｍＡｂについて左のバー）又は１０ｎＭ（各ｍＡｂについて右のバー）での精製抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）の結合時のＮＫ細胞の活性化を示す。図６Ｂは、ＩＦＮ－γ分泌を示す。ＩＭ－１０９１は陰性対照トリボディである。

【図7】選択された精製ｍＡｂ（ｍＡｂ００１～ｍＡｂ０２０）によるＮＫＧ２Ｄ－ＭＩＣＡ（ＭＩＣＡ－ＭＨＣクラスＩポリペプチド－関連配列Ａ）相互作用の阻害を示す。

【図8A】トリボディ構造の一実施形態を示す。

【図8B】Ｐｒｏトリボディ構造の一実施形態を示す。

【図8C】様々なトリボディ分子の同一性を列挙する。

【図9】ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【0014】

【表1】

【図10A】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図10B】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図10C】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図10D】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図10E】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図10F】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図10G】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図10H】分析ＳＥＣによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１）の特徴付けを示す。

【図11】ＥＬＩＳＡによるトリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１、ＩＭ１０６０及びＩＭ１０９１）のＮＫ２Ｇタンパク質への結合を示す。ＩＭ－１０６０は陽性対照トリボディであり、ＩＭ－１０９１は陰性対照トリボディである。

【図12A】トリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１、ＩＭ１０６０及びＩＭ１０９１）の、ヒトＮＫ２Ｇタンパク質を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１２Ａ）又はｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄを過剰発現するＣＨＯ細胞（図１２Ｂ）への結合を示す。ＩＭ－１０６０は陽性対照トリボディであり、ＩＭ－１０９１は陰性対照トリボディである。

【図12B】トリボディタンパク質（ＩＭ１２４４～ＩＭ１２５１、ＩＭ１０６０及びＩＭ１０９１）の、ヒトＮＫ２Ｇタンパク質を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１２Ａ）又はｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄを過剰発現するＣＨＯ細胞（図１２Ｂ）への結合を示す。ＩＭ－１０６０は陽性対照トリボディであり、ＩＭ－１０９１は陰性対照トリボディである。

【図13】３００ｎＭ、６０ｎＭ、１２ｎＭ及び２．４ｎＭでのトリボディタンパク質（ＩＭ１２４５、ＩＭ１２４６、ＩＭ１２４９、ＩＭ１２５０、ＩＭ１０６０及びＩＭ１０９１）によるＮＫ細胞活性化を示す（バー、左から右）。Ｅ＋Ｔ ＡＰＣ－ＣＤ １０７は、ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂの非存在下でのＣＤ１０７ａ染色である。Ｅ ＡＰＣ－ＣＤ１０７は、ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂ及び標的細胞の非存在下におけるＣＤ１０７染色である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本開示は、単離された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提示し、ここで、抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂの固有のＣＤＲ配列がヒト化フレームワーク内に提供される（キメラ抗体；ヒト化抗体）。加えて、これらの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＮＫＧ２Ｄ抗原結合領域の多価抗体構築物への組み込みが実証される。本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、医学的状態、例えば癌のための免疫療法処置として潜在的に使用され得る。

【0016】

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、用語「免疫グロブリン」と交換可能に使用され得、全て同じ性質及び意味を有する。抗体結合ドメイン又は抗原結合部位は、抗体の断片、又は抗体の１つ以上の断片の遺伝子操作された産物であり得、この断片は、標的抗原との特異的結合に関与する。「特異的に結合する」とは、結合が目的の抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用と区別することができることを意味する。例えば、平衡解離定数が≦１０^－５、１０^－６、又は１０^－７Ｍである場合、抗体はＮＫＧ２Ｄエピトープに特異的に結合すると言われる。一部の実施形態では、平衡解離定数は≦１０^－８Ｍ又は１０^－９Ｍであってもよい。一部の更なる実施形態では、平衡解離定数は≦１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、又は１０^－１２Ｍであってもよい。いくつかの実施形態では、平衡解離定数は≦１０^－５Ｍ～１０^－１２Ｍの範囲であり得る。

【0017】

半最大有効濃度（ＥＣ_５０）は、特定の曝露時間後にベースラインと最大応答との間の中間の応答を誘導する薬物、抗体又は毒物の濃度を指す。いくつかの実施形態では、応答は、結合親和性を含む。いくつかの実施形態において、応答は、機能的応答、例えばアゴニスト応答を含む。当業者は、特定の実施形態において本明細書で使用される場合、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＥＣ_５０測定値が、ＮＫＧ２Ｄ抗原に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の最大半量結合（ＥＣ_５０結合）の尺度を提供することを理解するであろう。当業者は、特定の実施形態において本明細書で使用される場合、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＥＣ_５０測定値が、アゴニスト応答（ＥＣ_５０機能的アゴニズム）を誘導する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の最大半量有効濃度の尺度を提供することを理解するであろう。

【0018】

いくつかの実施形態において、ＥＣ_５０は、抗体結合時に観察されるであろう５０％アゴニスト応答を得るのに必要な抗体の濃度を含む。特定の実施形態では、ＥＣ_５０の尺度は、薬物の効力の尺度として一般に使用され、いくつかの実施形態では、抗体の受容体への結合を反映し得る。いくつかの実施形態では、ナノモル濃度のＥＣ_５０結合濃度測定値を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、強い結合抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。いくつかの実施形態において、ナノモル濃度のＥＣ_５０機能的アゴニズム濃度測定値を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、機能的に有効なアゴニスト抗体を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄ分子に対する強固な結合剤を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄ分子のアゴニストを含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄ分子に対する強固な結合アゴニストを含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０はナノモル範囲である。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約２０～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約４０～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約６０～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約８０～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０１～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～１５ｎＭの範囲を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、機能的アゴニズムを測定するＥＣ_５０は、本明細書において、全て同じ性質を有する関数ＥＣ_５０と称される。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０はナノモル範囲である。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約２０～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約４０～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約６０～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約８０～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０１～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～１５ｎＭの範囲を含む。

【0023】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ＩｇＧ、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び単一ドメイン抗体を含むがこれらに限定されない、結合特異性を保持する抗体断片（複数可）を包含する（例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９；１２９：１３４－２００３を参照されたい）。ヒト化抗体、霊長類化抗体、及びキメラ抗体も、これらの用語が当技術分野で一般に理解されているので、包含される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、抗原結合部位が調節ドメインによって遮断され得る前駆体構築物を含み、結合部位の曝露は、環境条件に基づく調節された曝露、例えば、限定されないが、腫瘍微小環境への曝露を含む。

【0024】

本明細書中で使用される場合、用語「重鎖可変領域」は、用語「ＶＨドメイン」又は用語「ＶＨ」と交換可能に使用され得、全て同じ意味及び性質を有する。本明細書中で使用される場合、用語「軽鎖可変領域」は、用語「ＶＬドメイン」又は用語「ＶＬ」と交換可能に使用され得、全て同じ意味及び性質を有する。当業者は、抗体に関する「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」が、フレームワーク領域として知られる隣接ストレッチ間に挿入された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する重鎖の断片を包含することを認識するであろう。フレームワーク領域は、ＣＤＲよりも高度に保存されており、ＣＤＲを支持する足場を形成する。同様に、当業者はまた、抗体に関する「軽鎖可変領域」又は「ＶＬ」が、フレームワーク領域間に挿入された３つのＣＤＲを含有する軽鎖の断片を包含することを認識するであろう。

【0025】

本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、重鎖又は軽鎖可変領域の超可変領域（複数可）を指す。Ｎ末端から進んで、重鎖又は軽鎖ポリペプチドの各々は、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」として示される３つのＣＤＲを有する。多くの抗原－抗体複合体の結晶学的分析は、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原との広範な接触を形成することを実証した。したがって、ＣＤＲ領域は主に抗原結合部位の特異性に関与する。一実施形態では、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれに由来するＣＤＲを含む６つのＣＤＲを含む。

【0026】

本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」という用語は、重鎖又は軽鎖可変領域のＣＤＲをフレーム化する４つの隣接アミノ酸配列を指す。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得る。しかしながら、ＦＲ残基は主に、可変領域を抗原結合部位に折り畳むことに関与する。いくつかの実施形態において、可変領域の折り畳みに関与するＦＲ残基は、ＣＤＲに直接隣接する残基を含む。ＦＲ内では、特定のアミノ残基及び特定の構造的特徴が非常に高度に保存されている。これに関して、全ての可変領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。可変領域が抗原結合部位に折り畳まれる場合、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列にかかわらず、ある特定の「カノニカル」構造へのＣＤＲループの折り畳み形状に影響を及ぼすＦＲの保存された構造領域が存在することが一般に認識されている。更に、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖及び軽鎖の相互作用を安定化させる非共有結合性ドメイン間接触に関与することが知られている。

【0027】

抗体は、様々な形式で、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域（Ｆｖ）、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、及びＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない様々なドメインを有して存在し得る。

【0028】

当業者は、ｓｃＦｖが、短いリンカーペプチドによって連結された、免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む融合ポリペプチドであることを理解するであろう。リンカーは、例えば、１０～約２５個のアミノ酸を有し得る。

【0029】

当業者はまた、抗体に関する「Ｆａｂ」という用語が、一般に、ジスルフィド結合によって単一重鎖の可変領域及び第１の定常領域に結合した単一軽鎖（可変領域及び定常領域の両方）からなる抗体の部分を包含するのに対して、Ｆ（ａｂ’）_２は、ＶＨドメインを含む重鎖及びＶＬドメインを含む軽鎖の断片を含むことを理解するであろう。

【0030】

いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む全抗体分子を包含する。一部の実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）断片、可変軽鎖（ＶＬ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディを含むが、これらに限定されない、結合特異性を保持する抗体断片（複数可）を包含する。

【0031】

一実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、二重特異性抗体の一部として組み込むことができる。当技術分野で一般的に知られているように、二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片を含み、それによって２つの異なる抗原に結合することができる組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対して二価である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄへの結合について一価である。

【0032】

一実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、多重特異性抗体の一部として組み込むことができる。一実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるモノクローナル抗体、例えば２つ、３つ又は４つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片を含む組換えタンパク質である。一実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、三重特異性抗体の一部として組み込むことができる。

【0033】

一部の実施形態では、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性抗体は、１つ以上の抗原標的、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）ならびに腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を同時に標的化することによって、又はＣＤ３、エフェクターナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などのＣＴＬ受容体構成要素を同時に標的化することによって、癌免疫療法に使用される。

【0034】

抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
本開示は、いくつかの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のそれぞれは、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖上の３つのＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む。

【0035】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１６～１８のアミノ酸配列を含む。

【0036】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２０～２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号２４～２６のアミノ酸配列を含む。

【0037】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３２～３４のアミノ酸配列を含む。

【0038】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号３６～３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号４０～４２のアミノ酸配列を含む。

【0039】

別の実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一である重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。

【0040】

一実施形態では、本明細書に提示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のそれぞれは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の配列番号１１及び１５配列番号１９及び２３、配列番号２７及び３１、又は配列番号３５及び３９の対のうちの１つであり得る。別の実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一であるＶＨ及びＶＬ配列を含む。

【0041】

一実施形態では、本明細書に開示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を考慮して、当業者は、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖを構築するために当技術分野で公知の標準技術を容易に使用するであろう。

【0042】

特定の実施形態において、本開示は、適切な条件下で二量体化され得るＶＨ及びＶＬドメインを含むポリペプチドを提供する。例えば、ＶＨ及びＶＬドメインは、適切な緩衝液中で組み合わされ、疎水性相互作用などの適切な相互作用を介して二量体化され得る。別の実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインの二量体化を促進することができる酵素及び／又は補因子を含有する適切な緩衝液中で組み合わせることができる。別の実施形態において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、適切な試薬及び／又は触媒の存在下で互いに反応することを可能にする適切なビヒクル中で組み合わされ得る。

【0043】

特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、定常領域、ヒンジ領域、リンカー領域、Ｆｃ領域、もしくはジスルフィド結合領域、又はそれらの任意の組み合わせを含み得るがこれらに限定されない、より長いポリペプチド配列内に含有され得る。定常ドメインは、免疫グロブリン分子の定常部分の免疫グロブリン折り畳み単位であり、定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｃｋ、Ｃｌ）のドメインとも呼ばれる。いくつかの実施形態において、より長いポリペプチドは、本明細書に開示される方法に従って生成されたＶＨ及びＶＬドメインの一方又は両方の複数のコピーを含んでもよい。例えば、本明細書において生成されるポリペプチドが、ダイアボディ又はトリアボディを形成するために使用される場合。

【0044】

一実施形態では、本明細書に提示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、ナノボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、又は単一ドメイン抗体であり得る。例えば、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などのＩｇＧであり得る。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＩｇＧ１を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＩｇＧ２を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＩｇＧ４を含む。

【0045】

一実施形態において、本開示は、ＮＫＧ２Ｄに高い親和性で結合する抗体を提供する。一実施形態において、結合親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１－１０６，１９７９）によって記載されているスキャッチャード法の改変法によって計算される。別の実施形態において、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。別の実施形態において、結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。別の実施形態において、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。別の実施形態において、抗体親和性は、フローサイトメトリーによって測定される。

【0046】

一実施形態では、本開示はまた、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖ＣＤＲをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。別の実施形態において、本開示はまた、そのようなポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本明細書中に開示されるアミノ酸配列を考慮して、当業者は、このアミノ酸配列をコードするベクター又はプラスミドを容易に構築するであろう。別の実施形態では、本開示はまた、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。使用及び実験条件に依存して、当業者は、上記のポリヌクレオチド配列を保有及び／又は発現するために適切な宿主細胞を容易に使用するであろう。

【0047】

一実施形態において、本開示はまた、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。別の実施形態において、本開示はまた、そのようなポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本明細書中に開示されるアミノ酸配列を考慮して、当業者は、このアミノ酸配列をコードするベクター又はプラスミドを容易に構築するであろう。別の実施形態では、本開示はまた、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。使用及び実験条件に依存して、当業者は、上記のポリヌクレオチド配列を保有及び／又は発現するために適切な宿主細胞を容易に使用するであろう。

【0048】

以下の表（表１）は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体クローンの名称、ならびに対応するＶＨ、ＶＬ及びＣＤＲについての配列番号を列挙する。

【0049】

【表2】

【0050】

使用のための組成物
一実施形態において、本開示はまた、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。有用な薬学的に受容可能な担体は、当該分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５は、本明細書に開示される抗体の薬学的送達に適した組成物及び製剤を記載している。一実施形態では、組成物は、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖上の３つのＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。

【0051】

組成物の一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１６～１８のアミノ酸配列を含む。

【0052】

組成物の一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２０～２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号２４～２６のアミノ酸配列を含む。

【0053】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３２～３４のアミノ酸配列を含む。

【0054】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、配列番号３６～３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号４０～４２のアミノ酸配列を含む。

【0055】

別の実施形態において、組成物は、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一である重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。

【0056】

別の実施形態において、組成物は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の以下の：配列番号１１及び１５、配列番号１９及び２３、配列番号２７及び３１、又は配列番号３５及び３９の対のうちの１つを有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。

【0057】

別の実施形態において、組成物は、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一であるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。

【0058】

組成物のいくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、コンジュゲートの形態であり得る。本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」は、エフェクター分子又は第２のタンパク質（第２の抗体など）に共有結合された抗体又は抗体断片（抗原結合断片など）である。エフェクター分子は、例えば、薬物、毒素、治療剤、検出可能な標識、タンパク質、核酸、脂質、ナノ粒子、炭水化物又は組換えウイルスであり得る。抗体コンジュゲートは、「イムノコンジュゲート」と呼ぶこともできる。コンジュゲートが薬物（例えば、細胞毒性剤）に連結された抗体を含む場合、コンジュゲートは「抗体－薬物コンジュゲート」と呼ぶことができる。他の抗体コンジュゲートとしては、例えば、多重特異性（例えば、二重特異性又は三重特異性）抗体及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる。

【0059】

抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物は、単独で、又は担体、すなわち薬学的に許容される担体と組み合わせて対象（例えば、ヒト又は動物）に投与することができる。薬学的に許容されるとは、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、又はそれが含有される医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、対象に投与することができる。当業者に周知であるように、担体は、本明細書中に開示されるポリペプチドの任意の分解を最小にし、そして対象における任意の有害な副作用を最小にするように選択される。医薬組成物は、製薬分野で周知の任意の方法で調製することができる。

【0060】

本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、局所又は全身処置が所望されるかどうかに応じて、任意の好適な様式で（例えば、哺乳動物、細胞、又は組織に）投与することができる。例えば、組成物は、局所的に（例えば、眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮など）、経口的に、吸入によって、又は非経口的に（静脈内点滴又は皮下、腔内、腹腔内、皮内もしくは筋肉内注射によるものを含む）投与することができる。局所鼻腔内投与は、鼻孔の一方又は両方を通して鼻及び鼻腔に組成物を送達することを指す。組成物は、噴霧機構もしくは液滴機構によって、又はエアロゾル化を介して送達され得る。あるいは、投与は、腫瘍内、例えば、局所又は静脈内注射であり得る。

【0061】

組成物が非経口投与される場合、投与は一般的に注射による。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前に液体中に懸濁するのに適した固体形態、又はエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。更に、非経口投与は、一定の投与量を維持するために、徐放性又は持続放出系の調製を含むことができる。

【0062】

使用方法
一実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、癌、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ、ウイルス感染又は細菌感染などの疾患を治療するために使用することができる。別の実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄに関連する疾患を治療するために使用することができる。別の実施形態では、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を使用して、ＮＫＧ２Ｄの過剰発現に関連する疾患を治療することができる。

【0063】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、細胞傷害活性を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、癌又は腫瘍細胞に対して細胞傷害性である。

【0064】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、癌又は腫瘍に対する方法において使用することができる。一部の実施形態では、癌又は腫瘍は、固形癌又は腫瘍を含む。一部の実施形態では、癌又は腫瘍は、非固形（びまん性）癌又は腫瘍を含む。一部の実施形態では、癌又は腫瘍は、癌又は腫瘍の転移を含む。

【0065】

本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与の作業を達成するための様式、手段、技術及び手順を指し、化学、薬学、生物学、生化学及び医学分野の従事者に既知の、又は彼らによって既知の様式、手段、技術及び手順から容易に開発される様式、手段、技術及び手順を含むが、それらに限定されない。

【0066】

本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」、又は「療法」（ならびにそれらの異なる形態）は、予防的又は防止的手段を含む治療的処置を指し、その目的は、疾患又は状態に関連する望ましくない生理学的変化を防止又は減速（軽減）することである。有益な又は所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、症状の緩和、疾患又は状態の程度の減少、疾患又は状態の安定化（すなわち、疾患又は状態が悪化しない場合）、疾患又は状態の進行の遅延又は減速、疾患又は状態の改善又は緩和、及び検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず疾患又は状態の寛解（部分的であるか全体的であるかにかかわらず）が挙げられる。治療を必要とする者には、既に疾患もしくは状態を有する者、ならびに疾患もしくは状態を有する傾向がある者、又は疾患もしくは状態が予防されるべき者が含まれる。

【0067】

「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本発明の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による組成物又は製剤による治療が提供されるヒト又は非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書において互換的に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（例えば、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウスもしくはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどの哺乳動物、又は爬虫類、両生類、ニワトリ、及びシチメンチョウなどの非哺乳動物を含む。本明細書に記載の組成物は、サル及びヒトなどの霊長類、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギ、ならびにラット及びマウスなどの齧歯類を含む、任意の適切な哺乳動物を治療するために使用することができる。一実施形態において、治療される哺乳動物はヒトである。ヒトは、任意の年齢の任意のヒトであり得る。一実施形態では、患者は成人である。別の実施形態において、ヒトは小児である。ヒトは、男性、女性、妊婦、中年、青年、又は高齢者であり得る。

【0068】

本明細書に開示される方法における使用に好適な医薬組成物には、活性成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。一実施形態では、治療有効量とは、疾患の症状を予防、軽減もしくは改善するか、又は治療を受ける対象の生存を延長するのに有効な活性成分の量を意味する。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0069】

本明細書で使用される場合、「調節する」とは、分子標的又は経路の活性を「刺激する」又は「阻害する」ことを指す。例えば、組成物は、分子標的又は経路の活性を、同じ条件下であるが組成物の存在のみを欠く分子標的又は経路の活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は約９９％以上刺激又は阻害する場合、分子標的又は経路の活性を調節する。別の例では、組成物は、同じ条件下であるが組成物の存在のみを欠く分子標的又は経路の活性と比較して、分子標的又は経路の活性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍刺激又は阻害する場合、分子標的又は経路の活性を調節する。分子標的又は経路の活性は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。分子標的又は経路の活性は、インビトロ又はインビボで測定することができる。例えば、分子標的又は経路の活性は、活性を測定する当技術分野で公知の適切なアッセイによってインビトロ又はインビボ測定することができる。対照試料（組成物で処理されていない）には、１００％の相対活性値を割り当てることができる。

【0070】

一実施形態において、本方法は、本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の有効量を含む組成物を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。別の実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。

【0071】

当業者は、いくつかの実施形態において、免疫応答の調節が、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の使用を伴わない予想される結果が炎症であった状況における炎症の低減又は炎症の排除を包含することを理解するであろう。当業者はまた、いくつかの実施形態において、腫瘍又は癌を治療することが、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を使用しない転帰と比較して、腫瘍又は癌の腫瘍サイズ、成長、及び／又は拡散の低減を包含することを理解するであろう。

【0072】

一実施形態では、本開示は、有効量の本明細書に開示される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む組成物を対象に投与するステップを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。別の実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。

【0073】

一実施形態では、本開示はまた、対象における疾患を治療するための抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む組成物の使用を提供する。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。別の実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。

【0074】

一実施形態では、所望の効果を誘発するために必要とされる本ポリペプチド又はその組成物の正確な量は、対象の種、年齢、性別、体重、及び全身状態、特定のポリペプチド、投与経路、ならびに他の薬物がレジメンに含まれるかどうかに応じて、対象ごとに異なる。従って、全ての組成物について正確な量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得る。投薬量は変動し得、ポリペプチドは、１日１回以上（例えば、２回以上、３回以上、４回以上、又は５回以上）の用量で、１日以上にわたって投与され得る。抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスは、文献において容易に見出すことができる。

【0075】

一実施形態において、疾患は、ウイルス感染、細菌感染、癌、自己免疫疾患又は免疫障害であり得る。一実施形態において、疾患は、上気道ウイルス感染症、初期段階の肺感染症、又は後期段階の肺感染症であり得る。多くの疾患及び癌がウイルスによって引き起こされることが知られている。疾患を引き起こすウイルスの例としては、ノロウイルス、ロタウイルス；肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＥ；狂犬病ウイルス、西ナイルウイルス、エンテロウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＨＳＶ－２、水痘・帯状疱疹ウイルス、蚊媒介ウイルス、アルボウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルスＤ６８、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス２、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ポリオーマウイルス（ＪＣウイルス、ＢＫウイルスなど）、エボラウイルス、デング熱ウイルス、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。

【0076】

別の実施形態では、病気は、限定されないが、カルシノーマ、サルコーマ、リンパ種、白血病、胚細胞性腫瘍、芽腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、骨悪性線維性組織球腫、骨肉種、横紋筋肉腫、心臓癌、脳癌、アストロサイトーマ、グリオーマ、髄芽細胞腫、神経芽細胞種、乳癌、髄様カルシノーマ、副腎皮質腫瘍、甲状腺癌、メルケル細胞癌、眼癌、胃腸癌、大腸癌、胆のう癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、肝細胞癌、膵臓癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎細胞癌、前立腺癌、精巣癌、尿道癌、子宮肉腫、腟癌、頭部癌、頚部癌、鼻咽頭癌、造血癌、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、基底細胞癌、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、又はそれらの任意の組み合わせであり得る癌である。

【0077】

自己免疫疾患又は自己免疫障害の例には、以下が含まれるが、これらに限定されず、関節炎（急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風又は痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘発性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎骨関節炎、及び若年性関節リウマチ、変形性関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎、慢性原発性多発性関節炎、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎などの関節リウマチ）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪の乾癬などの乾癬、花粉症やジョブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥離性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症疾患、慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死融解症、強皮症（全身性強皮症を含む）、全身性硬化症などの硬化症、脊髄光学型ＭＳなどの多発性硬化症（ＭＳ）、原発進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫介在性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性結腸炎、顕微鏡的大腸炎、膠原性大腸炎、ポリポーサ性大腸炎、壊死性腸炎、経壁性大腸炎などの大腸炎、自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、呼吸窮迫症候群、成人又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む、髄膜炎、ぶどう膜の全体又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、リウマチ性脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎などの脳神経損傷、妊娠ヘルペス、妊娠類天疱瘡、陰嚢そう痒症、自己免疫性早発卵巣不全、自己免疫疾患による突発性難聴、アナフィラキシーやアレルギー性鼻炎、アトピー性鼻炎などのＩｇＥ介在疾患、ラスムッセン脳炎及び辺縁系脳炎及び／又は脳幹脳炎などの脳炎、前ぶどう膜炎、急性前ぶどう膜炎、肉芽腫性ぶどう膜炎、非肉芽腫性ぶどう膜炎、水晶体抗原性ぶどう膜炎、後部ぶどう膜炎、又は自己免疫性ぶどう膜炎などのぶどう膜炎、ネフローゼ症候群を伴う又は伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば慢性又は急性糸球体腎炎（原発性ＧＮ、免疫介在性ＧＮなど）、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性腎症、膜性又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、これはタイプＩとタイプＩＩを含み、急速に進行するＧＮ、増殖性腎炎、自己免疫性多腺内分泌不全、形質細胞性亀頭包皮炎、亀頭包皮炎を含む亀頭炎、遠心性環状紅斑、乾癬性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、滲出性苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、層状魚鱗癬、表皮溶解性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー症状と反応、アレルギー反応、アレルギー性湿疹又はアトピー性湿疹脂肪性湿疹、異汗性湿疹、及び水疱性掌蹠湿疹を含む湿疹、気管支喘息、気管支喘息、自己免疫性喘息などの喘息、Ｔ細胞の浸潤と慢性炎症反応を伴う症状、妊娠中の胎児のＡ－Ｂ－０血液型などの外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス及び円板状エリテマトーデス、脱毛症ループスを含むループス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、例えば、皮膚ＳＬＥ又は亜急性皮膚ＳＬＥなど、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、播種性エリテマトーデス、若年性発症（Ｉ型）糖尿病、これには、小児のインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）や成人発症型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）が含まれる。また、サイトカイン及びＴリンパ球、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、以下を含む血管炎、脈管炎、大血管炎（リウマチ性多発筋痛及び巨Ｔ細胞（高安）動脈炎を含む）、中血管炎（川崎病及び結節性多発性動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発性動脈炎、免疫血管炎、中枢神経系血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎などの壊死性血管炎、チャーグ・シュトラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ）及びＡＮＣＡ関連小血管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームズ陽性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、溶血性貧血又は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、アジソン病、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球透析を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷、出血に続発する多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、葉状天疱瘡、粘液膜性天疱瘡、及びエリテマトーデス天疱瘡を含む）、自己免疫性多発内分泌症、ライター病又は症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎などの免疫複合体疾患、多発性神経障害、ＩｇＭ多発性神経障害やＩｇＭ介在性神経障害などの慢性神経障害、慢性又は急性ＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自己免疫性又は免疫介在性血小板減少症、特発性角膜強膜炎、上強膜炎などの強膜炎、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎などの甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、又は亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、バセドウ病、自己免疫性多腺症候群（又は多腺内分泌障害症候群）、腫瘍随伴症候群などの多腺症候群、これはランバート・イートン筋無力症候群又はイートン・ランバート症候群、スティフマン又はスティフパーソン症候群などの神経性腫瘍随伴症候群を含む、アレルギー性脳脊髄炎又はアレルギー性脳脊髄炎及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）などの脳脊髄炎、胸腺腫関連重症筋無力症などの重症筋無力症、小脳変性、神経ミオトニー、オプソクローヌス又はオプソクローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、感覚神経障害、多巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨Ｔ細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、バーガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚症、急性発熱性好中球性皮膚症、角膜下膿疱性皮膚症、一過性の表皮溶解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変や肺単硬変などの肝硬変、自己免疫性腸症症候群、セリアック病又はセリアック病、セリアック病（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリッグ病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性難聴、難治性又は再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク質症、コーガン症候群／非梅毒性間質性角膜炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、自己免疫酒さ、帯状疱疹関連疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、原発性リンパ球増加症（モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症を含む）（例：良性モノクローナルガンマグロビン症及び意義不明のモノクローナルガンマグロビン症、ＭＧＵＳ）、末梢神経障害、腫瘍随伴症候群、てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、難聴、失明、周期性麻痺などのチャネル症、ＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性筋症、限局性又は分節性又は限局性分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼症、ぶどう膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期認知症、自己免疫性脱髄疾患や慢性炎症性脱髄性多発神経障害などの脱髄疾患、ドレスラー症候群、大脱毛症、全頭脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道の運動障害、強指症）、及び毛細血管拡張症）、男性と女性の自己免疫性不妊症、例：抗精子抗体による、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、習慣性中絶、農民肺、多形紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、鳥愛好家肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎や線維化性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソーマ症、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症などの寄生虫症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、正中性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性顔面炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フラリア症、慢性毛様体炎、異慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性又は慢性）などの毛様体炎、又はフック毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、ＳＣＫ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒素血症、膵炎、甲状腺炎、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、おたふく風邪、エバン症候群、自己免疫性生殖腺不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌後腎炎、ユビテラン性血栓血管炎、甲状腺中毒症、背側結核、脈絡膜炎、巨大Ｔ細胞性多発筋痛症、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性ネフローゼ症候群、微小変化腎症、良性家族性及び虚血－再灌流傷害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺疾患、珪肺、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性疾患、アスペルニオーネーゼ、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体アナフィラキシー性眼内症、アレルギー性腸炎、ハンセン病結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱性疾患、ハムマンリッチ病、感音性難聴、発作性ヘモグロビン尿症、性腺機能低下症、局部回腸炎、白血球減少症、感染性単核球症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経性眼炎、睾丸肉芽腫性睾丸炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、後天性脊髄萎縮症、非悪性胸腺腫、白斑、トキシックショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う状態、白血球接着不全、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症に関連する免疫応答、以下に関係する病気、白血球漏出症、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多発性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感神経性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、自己免疫性多腺症候群Ｉ型、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、拡張型心筋症などの心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭、上顎、又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加筋痛症候群、ロフラー症候群などの好酸球関連疾患、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギルス腫、又は好酸球を含む肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多発性内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、乳児期の一過性低癌
マグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性失調症候群、血管拡張症、膠原病に関連する自己免疫疾患、リウマチ、神経疾患、リンパ節炎、血圧反応の低下、血管機能不全、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏症、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流傷害、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚疾患、急性炎症成分を伴う皮膚疾患、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎又はその他の中枢神経系炎症性疾患、眼及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、ナルコレプシー、急性重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内膜過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症よって媒介される急性及び遅発性過敏症に関連する免疫応答も企図されている。

【0078】

一部の実施形態では、疾患は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）などの移植関連疾患である。一実施形態によれば、ＧＶＨＤは急性ＧＶＨＤである。別の実施形態によれば、ＧＶＨＤは慢性ＧＶＨＤである。

【0079】

別の実施形態では、本開示は、上記の疾患又は状態を治療するためにポリヌクレオチドを使用する方法であって、ポリヌクレオチドが本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体をコードする方法を提供する。

【0080】

本明細書で使用される場合、「含む（comprise）、（comprises）、（comprising）、（includes）、（including）、有する（having）」という用語及びそれらの活用形は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。

【0081】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「抗体」又は「少なくとも１つの抗体」という用語は、複数の抗体を含み得る。

【0082】

本出願を通して、本開示の種々の実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためであり、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６等の範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の具体的に開示された部分範囲、並びに１、２、３、４、５及び６等のその範囲内の個々の数字を有すると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0083】

本明細書で数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の表示数と第２の表示数との間の「範囲（ranging）／範囲（ranges）」及び第１の表示数「から」第２の表示数「までの範囲（ranging）／範囲（ranges）」という表現は、本明細書では互換的に使用され、第１及び第２の表示数、並びにそれらの間の全ての分数及び整数の数字を含むことを意味する。

【0084】

値が先行詞「約」の使用によって近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。全ての範囲は両端を含み、組み合わせ可能である。一実施形態では、「約」という用語は、示された数又は数の範囲からの０．１～５％の逸脱を指す。別の実施形態では、「約」という用語は、示された数又は数の範囲からの１～１０％の逸脱を指す。別の実施形態において、「約」という用語は、示された数又は数の範囲から最大２０％の逸脱を指す。一実施形態において、「約」という用語は、示された数又は数の範囲から±１０％の逸脱を指す。別の実施形態において、「約」という用語は、示された数又は数の範囲から±５％の逸脱を指す。

【0085】

別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、方法及び／又は材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。更に、材料、方法、及び例は、単なる例示であり、必ずしも限定することを意図していない。本明細書で言及される各参考文献又は他の引用は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

本明細書に提示される説明では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその変形を作製及び使用するステップのそれぞれが記載される。この説明は、限定することを意図するものではなく、構成要素、ステップの順序、及び他の変形形態の変更は、本抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用の範囲内であると理解されるであろう。

【0087】

明確にするために別々の実施形態に関連して説明される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用の様々な特徴は、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されているが、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びその使用の他の説明された実施形態では、別個に、又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は適切に、提供されてもよい。様々な実施形態に関連して説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の不可欠な特徴と見なされるべきではない。

【0088】

上に詳述し、以下の特許請求の範囲に請求されている本抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的に裏付けられる。

【実施例】

【0089】

実施例１
ＮＫＧ２Ｄのためのマウスハイブリドーマモノクローナル抗体生成
目的：マウスハイブリドーマ技術を使用してＮＫＧ２Ｄに対するモノクローナル抗体を生成すること。

【0090】

方法：マウスハイブリドーマ抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の生成。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、Ｂａｌｂ／ｃ及びＳＪＬマウスをＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－ｈＦｃ（ヒトＦｃに融合したＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン）で免疫することによって開発された。動物から採血し、ＥＬＩＳＡによって抗体力価について試験した（試験採血１及び試験採血２）。高力価を有する免疫マウス由来の脾臓細胞を単離し、標準的な融合手順によって融合して、特異的抗体を産生するハイブリドーマを作製した。これらの細胞のプールによって産生された抗体を含有する上清を、ヒトＦｃに融合したＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤタンパク質（ＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－ｈＦｃ）との反応性についてＥＬＩＳＡによって一次スクリーニングし、ＮＫＧ２Ｄ過剰発現細胞との反応性についてＦＡＣＳによって二次スクリーニングした。スクリーニングのために、ＦＡＣＳによる標的抗体活性について多数のハイブリドーマ上清を試験した。

【0091】

標的過剰発現細胞を９６ウェル丸底ポリスチレンプレートに入れ、ハイブリドーマ培養物からのニート上清と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、蛍光標識二次抗体と共にインキュベートした。陰性対照として、非標的タンパク質遺伝子をトランスフェクトした親細胞を用いて上清を試験し（陰性であることがわかった）、反応性抗体が標的タンパク質を特異的に認識することを確認した。陽性プールを同定し、限界希釈によってクローニングした。１～２回の融合後、特異的抗体を産生する陽性クローンを同定し、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって選択した。

【0092】

結果：動物の免疫化後、血清を、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃ（ヒトＦｃに融合したＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン）への結合について、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって試験した（図１）。図１Ａに示されるように、様々な希釈におけるＢａｌｂ／ｃ動物又はＳＪＬ動物の試験採血（ＴＢ）１は、採血前（ＰＢ）試料と比較して、ＥＬＩＳＡによってヒトＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃに対する陽性力価を示した。図１Ｂは、ＣＨＯ細胞において過剰発現されたヒト－ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ １０に対する、及びＣＨＯ細胞において過剰発現されたｃｙｎｏ－ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０に対する試験採血１力価の連続希釈を示すが、ＣＨＯ親細胞に対して反応性がない。ＳＪＬマウスは、ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０ ＣＨＯ細胞への結合について試験した場合、Ｂａｌｂ／ｃマウスと比較してより強い免疫応答を示した。同様の観察結果（データは示さず）を有する試験採血２の後、動物ＳＪＬ＃８７４８及び＃８７４９を融合のために選択した。電気融合後に一次スクリーニングを行って、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃに対するＥＬＩＳＡによって陽性クローンを同定し、ヒトＦｃを陰性対照とした。交差反応性クローンを同定するために、ヒト－ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ １０又はｃｙｎｏ－ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞に対して二次スクリーニングを行い、ＣＨＯ親細胞を陰性対照とした。一次スクリーニングにおいて、１０３個のクローンを二次スクリーニングのために選択した。二次スクリーニングにより、更にサブクローニングされたクローンを明らかにし、最後に、１８クローンを２００ｍｌ発現及びプロテインＡ精製のために進めた。図２は、選択されたクローンの同一性を示す。

【0093】

概要：ヒトＮＫＧ２Ｄタンパク質に対するマウスモノクローナルハイブリドーマ生成は、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる一次及び二次スクリーニング後にヒト及びｃｙｎｏ ＮＫＧ２Ｄに対する特異的結合剤であると同定された２０個のクローンを生じた。これらのクローンを更に発現させ、精製し、分析し、結合効力について特徴付けた。

【0094】

実施例２
ヒトＮＫＧ２Ｄに対するマウスハイブリドーマモノクローナル抗体の結合特性決定

【0095】

目的：結合によるＮＫＧ２Ｄに対するマウスモノクローナルＡｂの発現、精製及び特徴付け。

【0096】

方法：ハイブリドーマクローンの発現及び精製。簡単に説明すると、約０．２５～０．５×１０^７個の細胞を、１００ｍＬの抗体生産培地（ハイブリドーマ－ＳＦＭ＋２．５％ＦＢＳ（低ＩｇＧ））を予め充填したローラーボトルに接種し、ローラー培養装置において３００ｒ／ｈの速度で１４～１６日間、３７℃、二酸化炭素なしの条件でインキュベートした。その後、細胞懸濁液を３５０ｍＬの遠心分離ボトルに移し、３，２２０ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、０．４５μｍの濾過カプセルで濾過して細胞及び細胞片を除去した。次いで、培養上清を、親和性精製のために、予め平衡化したプロテインＡ親和性カラムにロードした。抗体を、５ ＣＶ（カラム体積）の溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ３．０）でカラムから溶出し、Ｔｒｉｚｍａ塩基で最終ｐＨ ７．０に中和し、次いで、溶出体積の１００倍のＰＢＳ、ｐＨ ７．４に対して２～８℃で一晩透析し、生物学的安全キャビネット内で０．２２μｍシリンジフィルターで滅菌濾過した。次いで、精製した抗体を等分し、使用するまで－２０℃又は－８０℃で保存した。

【0097】

標的タンパク質へのＥＬＩＳＡ結合。簡単に説明すると、標的タンパク質ＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃを最終濃度０．７μｇ／ｍＬでＰＢＳに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（カタログ９０１８、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に１００μＬ／ウェルでコーティングする。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートする。プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ中１％ＢＳＡで３７℃で１時間遮断し、Ｂｉｏｔｅｋ（Ｅｌｘ ４０５）を用いてＰＢＳＴで４回洗浄した。全てのＡｂを段階希釈し、１００μＬ／ウェルの希釈抗体をプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）－ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ Ａ３６８２）１：１００００を添加した後、細胞を３７℃で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。反応を停止させるために１００μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣｌを添加した。プレートを、４５０ｎＭ波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った（機器ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ）。データ分析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用して、非線形回帰（曲線当てはめ）を使用することによって実施した：ｌｏｇ（アゴニスト）対応答、アゴニストは抗体濃度（ｎＭ）であり、応答はＯＤ値である。

【0098】

細胞へのＦＡＣＳ結合。簡単に述べると、懸濁培養細胞を直接採取するか、又はＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅカタログ：１２６０４－０１３、供給業者Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が、採取前に接着細胞を消化する。１０００ ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てる。細胞を２×１０^６／ｍＬの濃度でＦＡＣＳ緩衝液ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）中に懸濁し、１００μＬ／ウェルの細胞懸濁液をプレートに添加する（カタログ３７９９、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）。プレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を１００μＬ／ウェルのトリボディセット抗体（４００ｎＭ開始、４倍希釈、０点を含む８点）に再懸濁し、プレートを４℃で６０分間インキュベートした。プレートを２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞を１７０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、二次抗体を用いて１００μＬ／ウェルで再懸濁し、４℃で３０分間暗所でインキュベートした。プレートを２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＦＡＣＳバースで分析した。

【0099】

ＥＬＩＳＡによるエピトープビニング。簡単に説明すると、標的抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌでＰＢＳ中に希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（カタログ９０１８、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に１００μＬ／ウェルでコーティングする。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートする。２５０μＬのＰＢＳＴ中１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間遮断した後、一連の濃度のビオチン化抗原ｈＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃを添加する。３７℃で１．５時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで１００μＬのストレプトアビジン－ＨＲＰ（カタログ：Ｓ５５１２、供給業者Ｓｉｇｍａ、１：１００００）を各ウェルに添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣＬで反応を停止させた。プレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎＭ波長で読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用して抗原のＥＣ８０を見出す。

【0100】

以下は、ｍＡｂ被覆プレートへの結合前にタンパク質と混合されたｍＡｂの連続希釈の設定を記載する。抗ヒトＮＫＧ２Ｄの標的抗体を最終濃度１μｇ／ｍＬでＰＢＳ中に希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（カタログ９０１８、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に１００μＬ／ウェルでコーティングする。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートする。２５０μＬのＰＢＳＴ中１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間遮断した後、ＥＣ８０のビオチン化抗原（２倍調製物、５０μＬを添加）及び競合抗体（４０～８０倍調製物、５０μＬを添加）の混合物を添加する。３７℃で１．５時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで１００μＬのストレプトアビジン－ＨＲＰ（カタログ：Ｓ５５１２、供給業者Ｓｉｇｍａ、１：１００００）を各ウェルに添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎＭ波長で読み取った。

【0101】

結果：図３は、ＥＬＩＳＡによる精製ｍＡｂのＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃへの結合を提示する。ｍＡｂ ０１９を除いて、これらの抗体の中で０．０３ｎＭ～０．６ｎＭの範囲のＥＣ８０値が観察された。

【0102】

図４は、ヒト／ｃｙｎｏ ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ、ならびに健常ドナーのＰＢＭＣから精製された初代ＮＫ細胞に対する、選択された精製ｍＡｂのＦＡＣＳ結合を提示する。図４に示されるように、全ての精製されたｍＡｂは、ＣＨＯＫ１－ｈＮＫＧ２Ｄ、ＣＨＯＫ１－ｃＮＫＧ２Ｄ及び初代ＮＫ細胞に対する結合活性を、様々な範囲の親和性及び効力で示した。

【0103】

ヒトＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への約０．４～３．８ｎＭの結合のＥＣ５０値範囲が観察された（図４Ａ）。同様に、ｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を過剰発現するＣＨＯ細胞への約０．７～８ｎＭの結合のＥＣ５０値範囲が観察された（図４Ｂ）。初代ＮＫ細胞への結合について試験した２つの濃度は、様々なＭＦＩを有する全てのｍＡｂにおいて用量依存的結合を示した（図４Ｃ）。ＣＨＯ親細胞では結合は観察されない（データは示さず）。

【0104】

図５は、ＥＬＩＳＡによって実施されたエピトープビニング分析を要約する。ＥＬＩＳＡ分析は、以下のようにそれらのエピトープビンにおいて区別される４つの群を示唆する。群１（四角の連続線）は、ｍＡｂ００１、００２、００３、００４、００５、００６、００８、０１１、０１３、０１５、０１７、０１８、０２０を集める。群２（連続円）は、ｍＡｂ００７、０１０、０１４を集める。群３（四角破線）は、ｍＡｂ０１２、０１６、０１９を集める。群４（円形破線）はｍＡｂ００９を集める。陽性対照Ａｂは、全ての群と異なる。

【0105】

概要：ヒトＮＫＧ２Ｄに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ハイブリドーマ技術を使用して首尾よく生成された。２０個のクローンを同定し、特徴付けた。選択されたｍＡｂを更に発現させ、ハイブリドーマクローンによって産生させた。ｍＡｂを更に精製し、ＭＳ（Ｍａｓｓ－Ｓｐｅｃ）によって分析し、ＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原へのＥＬＩＳＡ結合、ならびにヒト及びｃｙｎｏ ＮＫＧ２Ｄ／Ｄａｐ１０を発現する細胞へのＦＡＣＳ結合について特徴付け、最後にＥＬＩＳＡによってエピトープビニングについて試験して、４つのビン群を得た。

【0106】

実施例３
インビトロマウスハイブリドーマモノクローナル抗体の機能評価

【0107】

目的：抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂが初代ＮＫ細胞に結合したときのＮＫ細胞活性化を、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮｇ上方制御によってインビトロ評価すること。

【0108】

方法：簡潔に述べると、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＮＫ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１７９５５）を使用して、健常ドナーから収集したＰＢＭＣからＮＫ細胞を単離する。ＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、カタログ－２１９－ＩＬ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ－Ａ １０４９１－０１）で２日間懸濁する。抗体を９６ウェルプレート（Ｃａｔ－３５９９，Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にコーティングすることによって架橋し、次いで４℃で一晩インキュベートする。コーティングされたプレートから上清を除去し、次いでプレートを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄する。５００ ｇで５分間遠心分離することによって刺激されたＮＫ細胞を採取し、ＮＫ細胞刺激培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ－２）を用いて細胞の濃度を５×１０５／ｍＬに調整し、次いで２００μＬ／ウェルのＮＫ細胞をＡｂコーティングプレートに添加する。ＡＰＣ抗ＣＤ １０７ ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ：３２８６２０）及び対照（０．５μＬ／試験）をそれぞれＮＫ細胞に別々に添加する。プレートを加湿した５％ＣＯ２大気中で３７℃で４時間インキュベートする。ＩＦＮ－γ測定用には上清を、ＣＤ１０７ａ測定用には細胞をそれぞれ回収する。ＣＤ１０７ａ測定：細胞をＦＡＣＳプレート（Ｃａｔ－３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移す。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄する。ＡＰＣ－抗ＣＤ １０７ ａ、ＦＩＴＣ－抗ＣＤ ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ：１７－００３７－４１）及びＢＶ ４２１－抗ＣＤ ５６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ：３１８３２８）及び対照をそれぞれＮＫ細胞懸濁液に添加し、細胞を４℃で１時間インキュベートする。２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を１００μＬの冷ＰＢＳに再懸濁する。細胞を暗所に保ち、細胞をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）分析に供する。ＩＦＮ－γ測定：ヒトＩＦＮγＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（R&D、ＤＹ２８５）のプロトコルに従って、ＩＦＮ－γを測定した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中の作業濃度の捕捉抗体を９６ウェルマイクロプレート（Ｃａｔ－９０１８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にコーティングし、室温で一晩インキュベートする。３回洗浄後、プレートを３００μＬの試薬希釈剤（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で室温で少なくとも１時間遮断する。３回洗浄した後、適切に希釈した１００μＬの試料又は試薬希釈剤中の標準を添加し、室温で２時間インキュベートする。３回洗浄した後、１００μＬの希釈検出抗体を添加し、室温で２時間インキュベートする。３回洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｂの作業希釈液１００μＬを添加し、室温で２０分間インキュベートする。３回洗浄した後、１００μＬの基質溶液を加え、室温で２０分間インキュベートする。５０μＬの停止溶液を加える。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、カタログ：Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５ｅ）を使用してＯＤ４５０を読み取る。

【0109】

結果：図６は、ＣＤ１０７ａ活性化マーカーの蓄積又はＩＦＮ－γ分泌によって決定される、精製された抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂ（１０ｎＭ又は１００ｎＭ）の結合時のＮＫ細胞の活性化を示す。アッセイの妥当性は、ＩＭ－１０６０陽性対照トリボディ及びＩＭ－１０９１陰性対照トリボディによって決定されたウィンドウによって確認した。用量依存的なＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞蓄積を、マウスＩｇＧ対照と比較して、ＦＡＣＳによるｍＡｂ結合時に決定した（図６Ａ）。試験したｍＡｂのうち１０個はまた、ＥＬＩＳＡによって上清中で測定されたＩＦＮ－γ分泌を刺激した（図６Ｂ）。

【0110】

概要：２０個の精製された抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂを結合及び活性化によって特徴付けた。Ａｂを、それらの結合活性ならびにそれらのＮＫ活性化活性に基づいてランク付けした。各ビンから１つずつ、４つのｍＡｂ（ｍＡｂ ００１、ｍＡｂ００９、ｍＡｂ０１０及びｍＡｂ０１９）をＭａｓｓ－Ｓｐｅｃによって確認し（データは示さず）、トリボディ構築物への導入及び評価のために、示されたそれらの特徴に基づいて更に選択した。

【0111】

実施例４
インビトロマウスハイブリドーマモノクローナル抗体によるＮＫＧ２Ｄ－ＭＩＣＡ相互作用の遮断の評価
目的：受容体－リガンドＮＫＧ２Ｄ－ＭＩＣＡ相互作用に対する精製ｍＡｂの遮断活性をインビトロで評価すること。

【0112】

方法：競合ＥＬＩＳＡに基づくＲＢＡ：希釈標的タンパク質（ＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－ｈＦｃ、ロット：２０２００４１３００２、ＣＰ）を最終濃度１μｇ／ｍｌでＰＢＳに加え、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（カタログ９０１８、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にコーティングする。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートする。２５０μＬのＰＢＳＴ中１％ＢＳＡで１時間、３７℃で遮断した後３００ｎＭから１：５に希釈したＭａｂの系列濃度の混合物を添加し（６００ｎＭ調製物、５０μＬを添加する）及びヒトＭＩＣＡ－ＨｉｓをＥＣ８０で添加する（２倍調製物、５０μＬを添加する）。３７℃で１．５時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、１００μＬの抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ（１：５０００）を各ウェルに添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎＭ波長で読み取った。

【0113】

結果：ｍＡｂを、ＮＫＧ２Ｄ－ＭＩＣＡ相互作用を遮断するそれらの能力について分析した。図７に示すように、ＩＣ５０値として示された阻害率の範囲は１．４ｎＭ～８ｎＭであったが、ｍＩｇＧ１陰性対照では阻害活性は観察されなかった。

【0114】

結論：試験した全てのｍＡｂは、ＮＫＧ２Ａ－ＭＩＣＡ受容体－リガンド相互作用に対する遮断活性を示した。

【0115】

実施例５
ヒトＮＫＧ２Ｄに対するマウスハイブリドーマクローンに由来する抗ヒトＮＫＧ２Ｄを有するキメラトリボディの組換え産生
目的：選択された抗ヒトＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂ（ｍＡｂ ００１、ｍＡｂ００９、ｍＡｂ０１０及びｍＡｂ０１９）のマウスＣＤＲ配列をトリボディ／Ｐｒｏトリボディ構築物に導入して、それぞれ図８Ａ及び図８Ｂに示されており、以前にＷＯ２０２０／２２５８０５号に記載されており、その全文が本明細書に組み込まれるように、抗ＣＤ３ Ｆａｂ、抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂの一本鎖及び抗５Ｔ４の一本鎖を含む三重特異性キメラＡｂを作製する。

【0116】

方法：ハイブリドーマ配列決定。簡単に説明すると、ＮｕｃｌｅｏＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ，７４０４０４．２００）のプロトコルに従って、選択された陽性モノクローナルハイブリドーマ細胞（～１×１０^７）を全ＲＮＡ単離のために収集した。全ＲＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＲＡＣＥ ５’／３’のキットマニュアルに従ってｃＤＮＡ合成に使用し、ランダムプライマーを第１鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。重鎖及び軽鎖可変領域をＰＣＲで増幅するために、合成ｃＤＮＡを鋳型として用い、マウスＩｇ－プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ、６９８３１－３）由来のプライマーを遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）として用いた。正しいサイズのＰＣＲ産物を回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，７４０６０９．２５０）を用いてキットのマニュアルに従って精製し、ＴＡクローニング及び配列決定に供した。ＮＫＧ２Ｄ－ｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を、以下に記載されるようにトリボディ構築物にクローニングし、次いでこれをＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによってＮＫＧ２Ｄへの結合について特徴付けた。

【0117】

遺伝子合成及びプラスミド構築。三重特異性抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のコード配列を、ＤＮＡ合成及びＰＣＲによって生成し、その後、哺乳動物細胞系におけるタンパク質発現のためにｐＣＤＮＡ３．４ベースのプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。最後に、発現ベクター中の遺伝子配列をＤＮＡ配列決定により確認した。

【0118】

三重特異性抗体構築物の発現。トリボディ／Ｐｒｏ－トリボディ抗体の一過性発現は、ＰＥＩ法を使用して、ＣＨＯ細胞への対になったＨＣ及びＬＣ構築物（トリボディフォーマットについて１：１のＨＣ／ＬＣ比、又はＰｒｏトリボディフォーマットについて２．５：１のＨＣ／ＬＣ比）の同時トランスフェクションによって実施した。簡潔には、３Ｌ振盪フラスコ中の約５．５×１０^６／ｍｌのＣＨＯ細胞を宿主として使用した。１００ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１ｍｇの全ＤＮＡ及び４ｍｇのＰＥＩの混合物を細胞に添加し、穏やかに混合することによって、トランスフェクションを開始した。次いで、細胞をインキュベーターシェーカー中、１２０ｒｐｍ、３７℃、及び８％ＣＯ２で８～１０日間培養した。２４時間後、細胞密度及び生存率に応じてその後２～３日毎にペプトン及びグルコースの供給を行った。細胞生存率が＜８０％に低下した８～１０日目に細胞培養を終了した。馴化培地をタンパク質精製のために採取した。

【0119】

三重特異性抗体構築物の精製。親和性クロマトグラフィー及びＳＥＣによるタンパク質精製を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。採取した上清をＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１－ＸＬ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のカラムに通すことによって、トリボディの親和性捕捉を達成した。カラムを緩衝液Ａ（２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５）で洗浄した後、タンパク質を緩衝液Ｂ（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ３．０）で溶出し、直ちに１／６容量の緩衝液Ｄ（１Ｍアルギニン、４００ｍＭコハク酸、ｐＨ ９．０）で中和した。次いで、親和性精製したタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ ３０ｋＤ濃縮器（Merck Millipore）を使用して５～１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＳＥＣ緩衝液：２００ｍＭアルギニン、１３７ｍＭコハク酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－８０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（GE Lifesciences）上でのＳＥＣ精製に供した。標的トリボディ画分を回収し、次いで５％トレハロース（１４６ｍＭ）を添加した。標的トリボディを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣを用いて分析した。

【0120】

三重特異性抗体構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。トリボディのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、プレキャストポリアクリルアミドゲル中で還元及び非還元条件下で行った。簡潔に述べると、２μｇのトリボディ試料を、７０ｍＭ ＤＴＴ添加又は非添加のＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ－ＮＰ０００８）によって混合した。２５℃又は９０℃で１０分間インキュベートした後、試料及び未染色タンパク質標準（ＢＩＯ ＲＡＤ－１６１－０３６３）をゲルにロードした。電気泳動は、１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳランニング緩衝液を用いて１２０Ｖの定電圧で行った。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーを用いて一晩染色し、脱色溶液（１０％酢酸、４０％メタノール及び５０％水）で脱色した。脱色したゲルをゲルイメージングシステム（Ｔａｎｏｎ－２５００Ｒ）でスキャンした。

【0121】

三重特異性抗体構築物のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析。分析用ＳＥＣ－ＨＰＬＣは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－１０ ＨＰＬＣ装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）を用いて行った。１ｍｇ／ｍｌの２０μｌ試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ＧＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードする。移動相は２×ＰＢＳであり、流速は０．３ｍＬ／分、１５分であった。

【0122】

トリボディ構築物のＬＣ－ＭＳ分析。トリボディをＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ Ａ、ＳＥＣカラム（水１．７μｍ、４．６×３００ｍＭ）を用いて室温で分離し、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＳ－Ｂ２０－０３）によって検出した。移動相は０．１％ギ酸：アセトニトリル（７５：２５、ｖ／ｖ）であり、流速は０．２ｍＬ／分であった。質量分析を陽イオンで行った。質量分析のための他のパラメータは、１７５００の分解能、１０００～５０００ｍ／ｚのスキャン範囲、６０ｅＶのインソースＣＩＤ、３０ Ｌ／分のシースガス流量、３５０℃のキャピラリー温度、２．５ＫＶのスプレー電圧であった。

【0123】

結果：選択されたｍＡｂクローン（ＩＭ－１２４４／５で表されるｍＡｂ００１、ＩＭ－１２４６／７で表されるｍＡｂ００９、ＩＭ－１２４８／９で表されるｍＡｂ０１０、及びＩＭ－１２５０／１で表されるｍＡｂ０１９）のそれぞれの２つの変異体を提示する８つのトリボディ構築物を設計して、抗ＣＤ３ Ｆａｂ、抗ＮＫＧ２Ｄの一本鎖、及び抗５Ｔ４の一本鎖を含む三重特異性キメラＡｂを図８に示すように、調節ドメインなし（図８Ａ）又は調節ドメインあり（図８Ｂ）のいずれかで産生した。図８Ｃは、産生されたＡｂ同一性を詳述し、Ｌ－Ｈは、抗ＮＫＧ２Ｄ可変重鎖の上流に融合された抗ＮＫＧ２Ｄ可変軽鎖を示し、Ｈ－Ｌは、抗ＮＫＧ２Ｄ可変重鎖の下流に融合された抗ＮＫＧ２Ｄ可変軽鎖を示す。各トリボディ分子の発現されたＨＣ及びＬＣトリボディ構築物は会合して、非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて観察される単一の主要な約１００ｋＤａバンド、及び還元（Ｒ）条件下で約５０ｋＤａの二重バンドによって示される単一分子を形成する（図９）。図９は、それぞれ、ＩＭ－１２４４～ＩＭ１２５１のＳＤＡ－ＰＡＧＥ分析を提示し、ここで、左レーンはマーカーをｋＤａ（Ｍ）で表し、中央レーンは還元条件（Ｒ）を表し、右レーンは非還元条件（ＮＲ）を表す。図１０Ａ～Ｈは、それぞれ、ＩＭ－１２４４～ＩＭ １２５１のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を提示し、質量較正曲線に基づいて予測されるＭｗの予測される保持時間と一致する、約６分の保持時間における単一ピークを実証する。

【0124】

結論：三重特異性トリボディ変異体の発現及び精製に成功した。

【0125】

実施例６
トリボディ抗体構築物のＮＫＧ２Ｄ組換えタンパク質への結合
目的：マウスハイブリドーマクローン由来の抗５Ｔ４ＳｃＦｖドメイン、抗ＣＤ３εＦａｂドメイン、及び抗ヒトＮＫＧ２Ｄから構成される様々なトリボディ抗体構築物の、ＥＬＩＳＡによるＮＫＧ２Ｄ組換えタンパクへの、及びＦＡＣＳによる膜結合ＮＫＧ２Ｄタンパクを発現する細胞への結合効力を研究すること。様々なフォーマットは、ＣＡＰマスキング配列、切断可能リンカー、非切断可能リンカー、ならびに特定のエンゲージャーに対する結合活性を欠き、トリボディ／Ｐｒｏトリボディフォーマットの陰性対照として役立つ点変異エンゲージャー配列から構成され得る。

【0126】

方法：上記の実施例２に記載されるような抗原又は細胞へのトリボディ抗体構築物のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合。

【0127】

結果：図１１は、ＥＬＩＳＡによるＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質へのそれらの結合についての発現された三重特異性構築物分析を実証する。ＮＫＧ２Ｄ－ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質への結合ＥＣ５０は、予想通り、ＩＭ－１２４４（小さな丸）について２．６ｎＭ、ＩＭ－１２４５（小さな四角）について１．１ｎＭ、ＩＭ－１２４８（小さな菱形）について１．７ｎＭ、ＩＭ－１２４９（大きな丸）について０．７ｎＭであったが、陰性対照トリボディＩＭ－１０９１ ＮＫＧ２Ｄ変異体バリアント（大きな菱形）については結合は観察されなかった（図１１）。

【0128】

図１２は、ＦＡＣＳによるＮＫＧ２Ｄタンパク質を発現する細胞へのそれらの結合についての発現された三重特異性構築物分析を実証する。ヒトＮＫＧ２Ｄを過剰発現するＣＨＯ細胞への結合ＥＣ５０は、ＩＭ－１２４４（小さな円）、ＩＭ－１２４５（小さな四角）、ＩＭ－１２４６（小さな上向き三角）、ＩＭ－１２４７（小さな下向き三角）、ＩＭ－１２４８（小さな菱形）、ＩＭ－１２４９（大きな円）及びＩＭ－１２５０（大きな四角）について、それぞれ８．６、７、１２、２．５、４．９、４．７ｎＭであった（図１２Ａ）。ｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄを過剰発現するＣＨＯ細胞への結合ＥＣ５０は、ＩＭ－１２４４（小円）、ＩＭ－１２４５（小四角）、ＩＭ－１２４６（上の小三角）、ＩＭ－１２４７（下の小三角）、ＩＭ－１２４８（小菱形）、ＩＭ－１２４９（大円）及びＩＭ－１２５０（大四角）について、それぞれ２１、１３、１５、３０、５．９、５．３及び２．３ｎＭであった（図１２Ｂ）。ＩＭ－１２５１ ＥＣ５０値（大きい三角）は適用できなかったが、陰性対照トリボディＩＭ－１０９１ ＮＫＧ２Ｄ変異体バリアント（大きい菱形）については、予想通り、結合は観察されなかった。ＩＭ－１０６０（大きい三角）を陽性対照トリボディとして使用した。ＣＨＯ親細胞への結合は検出できなかった（データは示さず）。

【0129】

結論：選択されたハイブリドーマクローンから配列決定されたマウス可変軽鎖及び重鎖を同定し、ｓｃＦｖに変換し、トリボディ構築物に導入してキメラトリボディ分子を形成した。これらの分子を発現させ、精製し、更に結合アッセイによって特徴付け、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する結合特性が維持されていることが示された。

【0130】

図１１に示すように、トリボディフォーマット内の抗ＮＫＧ２Ｄからなるキメラトリボディの結合は、ＮＫＧ２Ｄタンパク質への結合を保持していた。同様に、図１２に示すように、結合はまた、細胞表面上にヒト及びｃｙｎｏＮＫＧ２Ｄの両方を過剰発現する細胞上でも確認された。それぞれｍＡｂ ００１、ｍＡｂ ００９、ｍＡｂ ０１０及びｍＡｂ ０１９を表すトリボディＩＭ－１２４５、ＩＭ－１２４６、ＩＭ－１２４９及びＩＭ－１２５０を、機能的活性インビトロについて更に選択した。

【0131】

実施例７
インビトロトリボディ抗体構築物の機能評価
目的：インビトロで評価するために、癌細胞の存在下での健常ドナー由来の初代ＰＢＭＣに対するトリボディ変異体による用量依存的なＮＫ細胞活性化。

【0132】

方法：標的細胞の存在下でのＮＫ細胞活性化。１０％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、カタログ－２１９－ＩＬ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ－Ａ １０４９１－０１）でＰＢＭＣを２日間懸濁する。刺激後、５００ｇで５分間遠心分離することによってＰＢＭＣ及び標的細胞ＮＣＩ－Ｈ２２６を採取し、アッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ １６４０＋５％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ－２）を用いて細胞の濃度をそれぞれ４×１０^６／ｍＬ及び２×１０^５／ｍＬに調整し、次いで５０μＬのＰＢＭＣ懸濁液及び５０μＬのＮＣＩ－Ｈ２２６懸濁液をそれぞれ丸底９６ウェルプレートに添加し、ＥＴ比は２０：１である。アッセイ緩衝液で希釈抗体（２×）を調製し、１００μＬ／ウェルを添加し、十分に混合する。ＡＰＣ抗ＣＤ １０７ ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ：３２８６２０）及び対照（０．５μＬ／試験）を試料に別々に添加する。プレートを加湿５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを２５０ｇ、４℃で４分間遠心分離し、上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）を使用して全ての細胞をＦＡＣＳプレートに移す。ＦＣＡＳ緩衝液で２回洗浄した後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液内にＦＩＴＣ－抗ＣＤ ３、ＢＶ ４２１－抗ＣＤ ５６及びＡＰＣ－ＣＤ１０７ａを添加し、プレートを暗所で４℃にて４５分間インキュベートする。ＦＣＡＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を１００μＬの冷ＰＢＳで再懸濁する。細胞をマルチカラーＦＡＣＳ分析に供する。

【0133】

結果：健常ドナー由来のＰＢＭＣを共培養した後、ＣＤ５６＋ゲート制御ＮＫ細胞集団に対するＣＤ１０７ａＭＦＩによって測定される６０～７０％の活性化が観察され、ＮＣＩ－Ｈ２２６は、３００ｎＭ、６０ｎＭ、１２ｎＭ、及び２．４ｎＭ（左から右）の様々なトリボディ（ＩＭ－１２４５、ＩＭ－１２４６、ＩＭ－１２４９、ＩＭ－１２５０）の存在下で、５Ｔ４タンパク質を発現する細胞を標的とし、一方、トリボディの非存在下では３０％の基礎活性化が行われる。３５～４０％のより低い活性化が、ＮＫＧ２Ｄへの結合を欠く陰性対照トリボディＩＭ－１０９１ ＮＫＧ２Ｄ変異体バリアントにおいて観察された。ＩＭ－１０６０は、陽性対照トリボディとして機能した（図１３）。

【0134】

結論：４つのビンからのマウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂクローン配列から構成される４つの選択されたトリボディは、インビトロでＮＫ細胞を活性化することが示された。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A-1】

【図4A-2】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【手続補正書】

【提出日】2023-12-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024517741000001.app

【国際調査報告】