特表 2024-517743 ウイルスベクター組成物及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ウイルスベクター組成物及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240416BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20240416BHJP

   C12N 5/0793 20100101ALN20240416BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N15/12

A61K48/00

A61P7/04

A61P7/00

A61P13/02

A61K35/76

C12N5/077

C12N5/0793

C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566521

(86)(22)【出願日】2022-04-29

(85)【翻訳文提出日】2023-11-21

(86)【国際出願番号】 US2022026988

(87)【国際公開番号】W WO2022232545

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/182,738

(32)【優先日】2021-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521058818

【氏名又は名称】ロジックバイオ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ション， チャン

(72)【発明者】

【氏名】チャウ， ビー． ネルソン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA52

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA511

4C084ZA512

4C084ZA531

4C084ZA532

4C084ZA811

4C084ZA812

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC83

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZA53

4C087ZA81

(57)【要約】

ＡＡＶベクター構築物による改善された遺伝子編集のための組成物及び方法を、本明細書に提供する。特に、本開示は、ある特定の長さ（例えば、各々少なくとも７５０ｎｔまたは少なくとも１０００ｎｔ）の相同性アームが、改善された編集活性を示し得ることを、認識している。本開示は、いくつかの実施形態において、相同性アームが異なる長さを有している場合に、ある特定の長さ（例えば、各々少なくとも７５０ｎｔまたは少なくとも１０００ｎｔ）の相同性アームが編集活性のさらなる改善を示し得ることを、認識している。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞のゲノムの中の標的組み込み部位に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターであって、
（ｉ）第１核酸配列及び第２核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、
前記第１核酸配列が、少なくとも１つの外来遺伝子配列を含むものであり、
前記第２核酸配列が、前記第１核酸配列の５’側または３’側に位置し、前記標的組み込み部位への組み込み時に２つの独立した遺伝子産物の産生を促進するものである、
前記ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの５’側に位置し、前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第３核酸配列；ならびに
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの３’側に位置し、前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第４核酸配列
を含み、前記第３核酸配列及び前記第４核酸配列の各々の長さが少なくとも１０００ｎｔであり、前記第３核酸配列と前記第４核酸配列とが異なる長さである、前記組換えウイルスベクター。

【請求項2】

前記外来遺伝子配列の長さが５００ｎｔ～２５００ｎｔである、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項3】

前記遺伝子配列の長さが１０００ｎｔ～２０００ｎｔである、請求項１または２に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項4】

前記第３核酸配列の長さが少なくとも７５０ｎｔである、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項5】

前記第３核酸配列の長さが少なくとも１０００ｎｔである、請求項４に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項6】

前記第３核酸配列の長さが少なくとも１６００ｎｔである、請求項５に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項7】

前記第４核酸配列の長さが少なくとも７５０ｎｔである、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項8】

前記第４核酸配列の長さが少なくとも１０００ｎｔである、請求項７に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項9】

前記第４核酸配列の長さが少なくとも１６００ｎｔである、請求項８に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項10】

前記第３及び第４核酸配列はどちらも長さが少なくとも７５０ｎｔである、請求項１～４または請求項７のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項11】

前記第３及び第４核酸配列はどちらも長さが少なくとも１０００ｎｔである、請求項１～５または請求項７～８のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項12】

前記第３核酸配列の長さが１０００ｎｔであり、前記第４核酸配列の長さが１６００ｎｔである、上記請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項13】

前記第３核酸配列の長さが１６００ｎｔであり、前記第４核酸配列の長さが１０００ｎｔである、上記請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項14】

前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項15】

前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、またはＡＡＶ－ｓＬ６５から選択される、請求項１４に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項16】

上記請求項のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター；及び
１つ以上の薬学的に許容される賦形剤
を含む、組成物。

【請求項17】

対象の中の組織の中の１つ以上の細胞のゲノムの中に導入遺伝子を組み込む方法であって、
前記組織の中の細胞が遺伝子産物にコードされる機能性タンパク質を発現することができない前記対象に、請求項１６に記載の組成物を投与すること
を含み、標的組み込み部位が前記１つ以上の細胞のゲノムの中にある、前記方法。

【請求項18】

前記１つ以上の細胞が非分裂細胞である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記１つ以上の細胞が肝細胞、筋細胞、肺細胞またはＣＮＳ細胞である、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記組成物が出生後期の間に投与される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記組成物が、出生後少なくとも７日目、出生後少なくとも１４日目、出生後少なくとも２１日目、または出生後少なくとも２８日目に投与される、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記組成物が、出生後２８日目またはそれよりも前に投与される、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記導入遺伝子がＵＧＴ１Ａ１、ＦＡＨ、第ＩＸ因子、Ａ１ＡＴ、ＡＳＬまたはＬＩＰＡであるか、またはそれを含む、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

参照組成物と比較して組み込み効率が改善される、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記組成物が、少なくとも５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記組成物が、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項１７～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記組成物が、２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記対象が動物である、請求項１７～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記対象がヒトである、請求項１７～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記対象がクリグラー・ナジャー症候群、チロシン血症、血友病、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症またはリソソーム酸性リパーゼ欠損症を有するか、または有する疑いがある、請求項２８または２９に記載の方法。

【請求項31】

少なくとも１つのペイロード、５’相同性アーム及び３’相同性アームを含むポリヌクレオチドカセットのための相同性アーム長を決定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのペイロードを含むが相同性アームを何ら含んでいないポリヌクレオチドカセットの長さを決定すること
を含み、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記長さが２．７ｋｂ未満である場合には、前記３’相同性アーム配列の長さが１ｋｂ以下であり、前記５’相同性アーム配列の長さが、
２．７ｋｂ－前記３’相同性アームの前記長さ
であり、
（ｃ）ステップ（ａ）の前記長さが２．７ｋｂを上回る場合には、前記５’及び３’相同性アームの各々の長さが、
［４．７ｋｂ－ステップ（ａ）の前記長さ］／２ヌクレオチド
である、
前記方法。

【請求項32】

細胞のゲノムの中の標的組み込み部位に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターであって、
（ｉ）第１核酸配列及び第２核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第１核酸配列が、少なくとも１つの外来遺伝子配列を含むものであり、前記第２核酸配列が、前記第１核酸配列の５’側または３’側に位置し、標的組み込み部位への組み込み時に２つの独立した遺伝子産物の産生を促進するものである、前記ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの５’側に位置し、前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第３核酸配列；ならびに
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの３’側に位置し、前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第４核酸配列
を含み、前記第３核酸配列及び前記第４核酸配列の各々の長さが請求項３１に従って決定される、前記組換えウイルスベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された米国仮出願第６３／１８２，７３８号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりその各々の全体を本明細書に援用する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子の機能不全によって引き起こされる遺伝病は、世界中の疾患の大部分を占めている。遺伝子治療は、遺伝性疾患の影響を軽減することを目的とした有望な治療法として浮上している。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示よりも前に、相同組換えを利用する特定のＡＡＶ遺伝子療法（例えば、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標））は、同じ長さの相同性アームを含むウイルスベクター組成物を採用した。本開示は、ある特定の長さ（例えば、各々少なくとも７５０ｎｔまたは少なくとも１０００ｎｔ）の相同性アームが、改善された編集活性を示し得ることを、特に認識している。本開示は、いくつかの実施形態において、相同性アームが異なる長さを有している場合に、ある特定の長さ（例えば、各々少なくとも７５０ｎｔまたは少なくとも１０００ｎｔ）の相同性アームが編集活性のさらなる改善を示し得ることを、認識している。

【0004】

あるいは、またはさらに、本開示は、ベクターデザインにおいて従前に未同定であった問題についての認識をさらに包含する。一部において、本開示は、最適化されたベクターデザインが、特定の相同性アーム長、及び／または各相同性アームの長さの間での比率を含めて、種間で異なることがある、という認識及び見解を包含する。本明細書で実証されるように、ある種での、またはある種についてのモデル系（例えば、野生型マウス、ヒト化マウス、キメラマウス）での、最適なデザインは、別の種での、または別の種についてのモデル系（例えば、野生型マウス、ヒト化マウス、キメラマウス）での最適なデザインとは異なることがある。

【0005】

本開示は、とりわけ、ＡＡＶベクターを含むウイルスベクターの設計及び／または産生を改善するための方法及び技術を提供する。様々な実施形態に従って、本開示は、ウイルスベクター構築物のある特定の配列エレメント（例えば、相同性アーム配列）が遺伝子編集効率に重大な影響を与え得るという洞察を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される１つ以上のウイルスベクター組成物（例えば、釣り合いのとれた、または不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクター組成物）をある特定の時間点（例えば、出生後の時間点）で投与することによって編集効率が改善され得ることを実証する。いくつかの実施形態では、投与の時間点は、（例えば、１つ以上の種における特定の齢に相当する）標的細胞または組織の成長段階を基準として選択される。

【0006】

いくつかの実施形態では、本開示は、組換えウイルスベクターであって、１）第１核酸配列及び第２核酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、第１核酸配列が、少なくとも１つの外来遺伝子配列を含むものであり、第２核酸配列が、第１核酸配列の５’側または３’側に位置し、標的組み込み部位への組み込み時に２つの独立した遺伝子産物の産生を促進するものである、当該ポリヌクレオチド配列の、少なくとも１つ；２）当該ポリヌクレオチドの５’側に位置し、標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第３核酸配列；ならびに３）当該ポリヌクレオチドの３’側に位置し、標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第４核酸配列を含み、第３核酸配列及び第４核酸配列の各々の長さが少なくとも１０００ｎｔであり、第３核酸配列と第４核酸配列とが異なる長さである、当該組換えウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが５００ｎｔ～２５００ｎｔである外来遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが１０００ｎｔ～２０００ｎｔである外来遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが少なくとも７５０ｎｔである第３核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが少なくとも１０００ｎｔである第３核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが少なくとも１６００ｎｔである第３核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが少なくとも７５０ｎｔである第４核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが少なくとも１０００ｎｔである第４核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが少なくとも１６００ｎｔである第４核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、どちらも長さが少なくとも７５０ｎｔである第３及び第４核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、どちらも長さが少なくとも１０００ｎｔである第３及び第４核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが１０００ｎｔである第３核酸配列、及び長さが１６００ｎｔである第４核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、長さが１６００ｎｔである第３核酸配列、及び長さが１０００ｎｔである第４核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、提供されるウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、またはＡＡＶ－ｓＬ６５から選択されるＡＡＶベクターである。

【0007】

いくつかの実施形態では、提供される組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、及び組換えウイルスベクターを含み、当該組換えウイルスベクターは、１）第１核酸配列及び第２核酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、第１核酸配列が、少なくとも１つの外来遺伝子配列を含むものであり、第２核酸配列が、第１核酸配列の５’側または３’側に位置し、標的組み込み部位への組み込み時に２つの独立した遺伝子産物の産生を促進するものである、当該ポリヌクレオチド配列の、少なくとも１つ；２）当該ポリヌクレオチドの５’側に位置し、標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第３核酸配列；ならびに３）当該ポリヌクレオチドの３’側に位置し、標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と相同な配列を含む、第４核酸配列を含み、第３核酸配列及び第４核酸配列の各々の長さは少なくとも１０００ｎｔであり、第３核酸配列と第４核酸配列とが異なる長さである。

【0008】

いくつかの実施形態では、提供される組成物は、対象の中の組織の中の１つ以上の細胞のゲノムの中に導入遺伝子を組み込む方法において使用され、上記組成物は、組織の中の細胞が遺伝子産物にコードされる機能性タンパク質を発現することができない対象に投与され、標的組み込み部位は、１つ以上の細胞のゲノムの中にある。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、１つ以上の細胞が非分裂細胞である方法において、投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、１つ以上の細胞が肝細胞、筋細胞、肺細胞またはＣＮＳ細胞である方法において、投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、方法において出生後期の間に投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、方法において出生後少なくとも７日目、出生後少なくとも１４日目、出生後少なくとも２１日目、または出生後少なくとも２８日目に投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、方法において出生後２８日目またはそれよりも前に投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、導入遺伝子がＵＧＴ１Ａ１、ＦＡＨ、第ＩＸ因子、Ａ１ＡＴ、ＡＳＬまたはＬＩＰＡであるか、またはそれを含む方法において、投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、参照組成物と比較して組み込み効率が改善される方法において、投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、方法において少なくとも５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、方法において少なくとも１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、方法において少なくとも２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、対象が動物である方法において、投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、対象がヒトである方法において、投与され得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、対象がクリグラー・ナジャー症候群、チロシン血症、血友病、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症またはリソソーム酸性リパーゼ欠損症を有するか、または有する疑いがある方法において、投与され得る。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実験プロトコールの流れ図、ならびに様々な実験で試験したマウス及びヒトベクターの特定の構成要素を示す模式図を提供する。

【図2A】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子及び様々な長さの相同性アームを含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターのＣ５７ＢＬ／６マウスにおける編集効率を示す。融合ｍＲＮＡレベル（左上パネル）、ＡＬＢ－２Ａ ＧｅｎｅＲｉｄｅバイオマーカーのレベル（右上パネル）、及び染色された肝細胞の百分率によって決定された編集効率（左下パネル）を測定した。右下パネルは、編集された肝細胞の百分率とＡＬＢ－２Ａレベルとの間の相関関係をグラフで表したものである。

【図2B】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子及び様々な長さの相同性アームを含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける編集効率を示す。マウス肝臓を採取及び染色して、編集された肝細胞を同定した（茶色の点、左の画像：１．０／１．０ＫＢの相同性アームを有するＧｅｎｅＲｉｄｅベクターで処理した肝臓からの代表的なＩＨＣ（水準）；右の画像：１．０／１．６ＫＢの相同性アームを有するＧｅｎｅＲｉｄｅベクターで処理した肝臓からの代表的なＩＨＣ）。半自動アルゴリズムを使用して画像を定量して、肝細胞編集の頻度を算出した。

【図3A】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して５’側に１０００ｎｔ及び３’側に１６００ｎｔの相同性アームを含んでいる単一のマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。新生仔期（ＰＮＤ２）、出生後１４日目（ＰＮＤ１４）及び出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のＵＧＴ１－／－マウスに、ベクターを様々な投薬量（３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）で投与した。編集効率を、（図３Ａ）ＵＧＴ１Ａ１染色、（図３Ｂ）融合ｍＲＮＡレベル及び（図３Ｃ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカーレベルの評価によって測定した。また、１２週間を通して（図３Ｄ）ビリルビンレベル（有効性バイオマーカー）及び（図３Ｅ）ビリルビン減少の百分率も測定した。

【図3B】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して５’側に１０００ｎｔ及び３’側に１６００ｎｔの相同性アームを含んでいる単一のマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。新生仔期（ＰＮＤ２）、出生後１４日目（ＰＮＤ１４）及び出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のＵＧＴ１－／－マウスに、ベクターを様々な投薬量（３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）で投与した。編集効率を、（図３Ａ）ＵＧＴ１Ａ１染色、（図３Ｂ）融合ｍＲＮＡレベル及び（図３Ｃ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカーレベルの評価によって測定した。また、１２週間を通して（図３Ｄ）ビリルビンレベル（有効性バイオマーカー）及び（図３Ｅ）ビリルビン減少の百分率も測定した。

【図3C】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して５’側に１０００ｎｔ及び３’側に１６００ｎｔの相同性アームを含んでいる単一のマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。新生仔期（ＰＮＤ２）、出生後１４日目（ＰＮＤ１４）及び出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のＵＧＴ１－／－マウスに、ベクターを様々な投薬量（３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）で投与した。編集効率を、（図３Ａ）ＵＧＴ１Ａ１染色、（図３Ｂ）融合ｍＲＮＡレベル及び（図３Ｃ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカーレベルの評価によって測定した。また、１２週間を通して（図３Ｄ）ビリルビンレベル（有効性バイオマーカー）及び（図３Ｅ）ビリルビン減少の百分率も測定した。

【図3D】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して５’側に１０００ｎｔ及び３’側に１６００ｎｔの相同性アームを含んでいる単一のマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。新生仔期（ＰＮＤ２）、出生後１４日目（ＰＮＤ１４）及び出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のＵＧＴ１－／－マウスに、ベクターを様々な投薬量（３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）で投与した。編集効率を、（図３Ａ）ＵＧＴ１Ａ１染色、（図３Ｂ）融合ｍＲＮＡレベル及び（図３Ｃ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカーレベルの評価によって測定した。また、１２週間を通して（図３Ｄ）ビリルビンレベル（有効性バイオマーカー）及び（図３Ｅ）ビリルビン減少の百分率も測定した。

【図3E】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して５’側に１０００ｎｔ及び３’側に１６００ｎｔの相同性アームを含んでいる単一のマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。新生仔期（ＰＮＤ２）、出生後１４日目（ＰＮＤ１４）及び出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のＵＧＴ１－／－マウスに、ベクターを様々な投薬量（３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）で投与した。編集効率を、（図３Ａ）ＵＧＴ１Ａ１染色、（図３Ｂ）融合ｍＲＮＡレベル及び（図３Ｃ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカーレベルの評価によって測定した。また、１２週間を通して（図３Ｄ）ビリルビンレベル（有効性バイオマーカー）及び（図３Ｅ）ビリルビン減少の百分率も測定した。

【図4】齢に対するマウス肝臓重量のグラフを示す。肝臓を標的とする遺伝子療法において、マウス齢をヒト年齢と対応させることは、それぞれの肝臓重量百分率を評価することによってなされ得る。

【図5A】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して異なる相同性アーム長を含んでいる様々なヒトＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集効率を示す。ベクターを、（図５Ａ）ヒト細胞アッセイにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで、及び（図５Ｂ）肝臓ヒト化マウスモデル（ＰＸＢ）においてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。（図５Ｃ）ＰＸＢマウスは、ＰＸＢマウス肝臓におけるヒト肝細胞マーカーに対するＩＨＣ染色によって示されるように、移植されたヒト肝細胞による高度に一様な肝臓ヒト化を特徴としていた。

【図5B】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して異なる相同性アーム長を含んでいる様々なヒトＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集効率を示す。ベクターを、（図５Ａ）ヒト細胞アッセイにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで、及び（図５Ｂ）肝臓ヒト化マウスモデル（ＰＸＢ）においてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。（図５Ｃ）ＰＸＢマウスは、ＰＸＢマウス肝臓におけるヒト肝細胞マーカーに対するＩＨＣ染色によって示されるように、移植されたヒト肝細胞による高度に一様な肝臓ヒト化を特徴としていた。

【図5C】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して異なる相同性アーム長を含んでいる様々なヒトＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集効率を示す。ベクターを、（図５Ａ）ヒト細胞アッセイにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで、及び（図５Ｂ）肝臓ヒト化マウスモデル（ＰＸＢ）においてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。（図５Ｃ）ＰＸＢマウスは、ＰＸＢマウス肝臓におけるヒト肝細胞マーカーに対するＩＨＣ染色によって示されるように、移植されたヒト肝細胞による高度に一様な肝臓ヒト化を特徴としていた。

【図6-1】ＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子を含んでいるヒト及びマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集活性を示す。試験したベクターは、予めヒト（図５）またはマウス（図２）の系において活性が最適化されたものであった。

【図6-2】同上。

【図7A】ＦｖＢ野生型マウスで試験した、ヒトＡ１ＡＴ導入遺伝子に隣接して異なる相同性アーム長を含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集活性を示す。様々なベクターデザインでの相同性アーム長の模式図である。

【図7B】ＦｖＢ野生型マウスで試験した、ヒトＡ１ＡＴ導入遺伝子に隣接して異なる相同性アーム長を含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集活性を示す。様々なベクターデザインにおけるＡＬＢ－２Ａバイオマーカー及びヒトＡ１ＡＴ（ｈＡ１ＡＴ）のレベルである。

【図8】ＦｖＢ野生型マウスで試験した、ｃｙｎｏ－Ａ１ＡＴ導入遺伝子に隣接して同じ長さの相同性アームを含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集活性を示す。両方のデザインについてＡＬＢ－２Ａバイオマーカーレベルを測定した。

【図9-1】ヒトＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に隣接して５’側に１３００ｎｔ及び３’側に１４００ｎｔの相同性アームを含んでいる単一のマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの編集活性を示す。新生仔期（ＰＮＤ１）及び出生後１４日目（ＰＮＤ１４）のＣ５７Ｂ６マウスにベクターを３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与した。編集効率を、マウス肝細胞におけるｈＵＧＴ１Ａ１染色、及びＡＬＢ－２Ａバイオマーカーのレベルの評価によって測定した。

【図9-2】同上。

【図10A】ヒトＵＧＴ１Ａ１またはヒト第９因子（ＦＩＸ）導入遺伝子を含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のマウスにベクターを投与した。編集効率を、（図１０Ａ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカー（例えば、ＧｅｎｅＲｉｄｅバイオマーカー）のレベル、（図１０Ｂ）アクチン参照体に対して正規化した導入遺伝子発現、及び（図１０Ｃ）ＡＬＢ－２Ａレベルと対比される導入遺伝子発現レベルの比較の評価によって測定した。

【図10B】ヒトＵＧＴ１Ａ１またはヒト第９因子（ＦＩＸ）導入遺伝子を含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のマウスにベクターを投与した。編集効率を、（図１０Ａ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカー（例えば、ＧｅｎｅＲｉｄｅバイオマーカー）のレベル、（図１０Ｂ）アクチン参照体に対して正規化した導入遺伝子発現、及び（図１０Ｃ）ＡＬＢ－２Ａレベルと対比される導入遺伝子発現レベルの比較の評価によって測定した。

【図10C】ヒトＵＧＴ１Ａ１またはヒト第９因子（ＦＩＸ）導入遺伝子を含んでいる様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のマウスにベクターを投与した。編集効率を、（図１０Ａ）ＡＬＢ－２Ａバイオマーカー（例えば、ＧｅｎｅＲｉｄｅバイオマーカー）のレベル、（図１０Ｂ）アクチン参照体に対して正規化した導入遺伝子発現、及び（図１０Ｃ）ＡＬＢ－２Ａレベルと対比される導入遺伝子発現レベルの比較の評価によって測定した。

【図11】ヒトＦＩＸ導入遺伝子を含む様々なマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。ベクターを様々な齢のマウス（新生仔、若齢及び成体マウス）に投与した。ＡＬＢ－２Ａバイオマーカーのレベルを様々な齢（新生仔、若齢及び成体マウス）で測定した。

【図12】ヒトＦＩＸ導入遺伝子に隣接して５’側に１０００ｎｔ及び３’側に１６００ｎｔの相同性アームを含んでいる単一のマウスＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの有効性データを示す。新生仔期（ＰＮＤ２）、出生後２８日目（ＰＮＤ２８）及び出生後８４日目（ＰＮＤ８４）のマウスにベクターを投与した。ＡＬＢ－２Ａバイオマーカー及び導入遺伝子発現のレベルを測定した。

【図13A】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。不揃いな相同性アームを有する例示的なポリヌクレオチドカセットを示す。

【図13B】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。例示的な療法時間経過を示す。

【図13C】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。循環バイオマーカーの評価を示す。

【図13D】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。処置マウスの体重変化を示す。

【図13E】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。図１３Ｅ及び図１３Ｆは、処置マウスにおける肝機能のマーカー（例えば、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ビリルビン）のレベルを示す。

【図13F】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。図１３Ｅ及び図１３Ｆは、処置マウスにおける肝機能のマーカー（例えば、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ビリルビン）のレベルを示す。

【図13G】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。フマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）抗体による肝臓試料の免疫組織化学染色を示す。

【図13H】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。宿主ゲノムＤＮＡ中への組み込み（ｇＤＮＡ ＩＮＴ）の評価を示す。

【図13I】遺伝性チロシン血症を有するマウスを本明細書に記載の療法で処置した結果を示す。臨床検証済みの肝細胞癌（ＨＣＣ）生存バイオマーカーであるアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）の存在の評価を示す。

【図14A】本明細書に記載の療法による遺伝性チロシン血症マウスの処置の結果及び淘汰的優位性を示す。例示的なベクター及び処置計画を示す。

【図14B】本明細書に記載の療法による遺伝性チロシン血症マウスの処置の結果及び淘汰的優位性を示す。ＡＬＢ－２Ａバイオマーカー（例えば、ＧｅｎｅＲｉｄｅバイオマーカー）の評価を示す。

【図14C】本明細書に記載の療法による遺伝性チロシン血症マウスの処置の結果及び淘汰的優位性を示す。処置マウスの生存率を示す。

【図14D】本明細書に記載の療法による遺伝性チロシン血症マウスの処置の結果及び淘汰的優位性を示す。図１４Ｄ及び図１４Ｅは、処置マウスにおける肝機能のマーカー（例えば、ＡＬＴ、スクシニルアセトン（ＳＵＡＣ））を示す。

【図14E】本明細書に記載の療法による遺伝性チロシン血症マウスの処置の結果及び淘汰的優位性を示す。図１４Ｄ及び図１４Ｅは、処置マウスにおける肝機能のマーカー（例えば、ＡＬＴ、スクシニルアセトン（ＳＵＡＣ））を示す。

【図15A】本明細書に記載の療法による小児期ＨＴ１マウスの処置の結果を示す。処置時間経過を示す。

【図15B】本明細書に記載の療法による小児期ＨＴ１マウスの処置の結果を示す。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）バイオマーカーの評価を示す。

【図15C】本明細書に記載の療法による小児期ＨＴ１マウスの処置の結果を示す。処置マウスの体重変化を示す。

【図15D】本明細書に記載の療法による小児期ＨＴ１マウスの処置の結果を示す。処置マウスのアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）レベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

定義
本発明が、より容易に理解されるために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書全体にわたって記載される。本発明の背景を説明し、その実践に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照した刊行物及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0011】

冠詞「ａ」、及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用している。例として、「１つの（ａｎ）要素」とは、１つの要素または１つ超の要素を意味する。

【0012】

約：用語「約」または「およそ」は、本明細書において値に関して使用される場合、参照される値との文脈において、類似の値を指す。一般に、その文脈に精通している当業者であれば、その文脈における「約」に含まれる関連する変動の程度を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以内の値の範囲を包含し得る。

【0013】

併用療法：本明細書で使用する場合「併用療法」という用語は、対象が２つ以上の治療レジメン（例えば、２つ以上の治療薬）に同時に曝露される臨床介入を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の治療レジメンを同時に施してもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の治療レジメンを連続的に施してもよい（例えば、第２のレジメンの任意の用量を投与する前に第１のレジメンを施す）。いくつかの実施形態では、２つ以上の治療レジメンは、重複する投与レジメンで施される。いくつかの実施形態では、併用療法の投与は、他の薬剤（複数可）またはモダリティを受けている対象への１つ以上の治療剤またはモダリティの実施を含み得る。いくつかの実施形態では、併用療法は、個々の薬剤を単一の組成物中で一緒に投与することを必ずしも必要としない（または同時に投与することも必ずしも必要としない）。いくつかの実施形態では、２つ以上の治療剤または併用療法のモダリティが、対象に対して別々に、例えば、別々の投与経路（例えば、１つの薬剤は経口、もう１つの薬剤は静脈内）を介して、別の組成物中で、及び／または異なる時点で、実施される。いくつかの実施形態では、２つ以上の治療薬は、併用組成物中で、またはさらには併用化合物中で（例えば、単一の化学複合体または共有結合体の一部として）、同じ投与経路を介して、及び／または同時に、一緒に投与されてもよい。

【0014】

同等の：本明細書で使用する場合、「同等の」という用語は、互いに同一ではない場合があるが、それらの間の比較を可能にするのに十分に類似しており、その結果当業者であれば、観察された相違点または類似点に基づいて合理的に結論を導くことができることを理解する、２つ以上の因子、実体、状況、一連の条件のセットなどを指す。いくつかの実施形態では、同等の状態、状況、個体または集団のセットは、複数の実質的に同一の特徴及び１つまたは少数の様々な特徴により特性評価される。当業者であれば、状況に応じて、２つ以上のそのような因子、実体、状況、条件のセットなどが同等であるとみなされるためには、任意の状況においてどの程度の同一性が必要であるかを理解するであろう。例えば、当業者であれば、状況、個体または集団の異なるセット下でまたはそれらにより得られた結果または観察された現象における相違が、変更されるこれらの特徴における変化によって引き起こされるか、またはそれを示すという妥当な結論を保証するために十分な数及び種類の実質的に同一の特徴によって特性評価されるとき、この状況、個体または集団のセットは互いに同等であることを理解するであろう。

【0015】

含んでいる：１つ以上の指定された要素またはステップを「含む」として本明細書に記載される組成物または方法は、オープンエンドであり、このことは、指定された要素またはステップは必須であるが、他の要素またはステップが組成物または方法の範囲内で追加されてもよいことを意味する。重複を避けるために、１つ以上の指定された要素またはステップを「含んでいる」（または「含む」）と記載されている任意の組成物または方法は、同じ指定された要素またはステップから「本質的にからなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（またはそれ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」）対応する、より限定された組成物または方法も説明していることも理解されたい。このことは、この組成物または方法が指定された必須の要素またはステップを含み、組成物または方法の基本的及び新規な特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加の要素またはステップも含み得ることを意味する。１つ以上の指定された要素またはステップを「含む」またはそれ「から本質的になる」として本明細書に記載される任意の組成物または方法は、指定された要素またはステップ「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」（またはそれ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」）対応する、より限定された、クローズドエンドの組成物または方法も説明しており、他の指定されていない要素またはステップは除外されることも理解される。本明細書に開示される任意の組成物または方法において、任意の指定された必須の要素またはステップの既知または開示された等価物で、その要素またはステップを置き換えてもよい。

【0016】

～に対応する：本明細書で使用する場合、「に対応する」という用語は、適切な参照化合物または組成物との比較を通じて、化合物または組成物中の構造要素の位置／同一性を指定するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマー中のモノマー残基（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基またはポリヌクレオチド中の核酸残基）は、適切な参照ポリマー中の残基に「対応する」ものとして識別され得る。例えば、当業者であれば、簡略化の目的で、ポリペプチド中の残基は、多くの場合、参照関連ポリペプチドに基づく標準的な番号付けシステムを使用して指定されるため、１９０位の残基に「対応する」アミノ酸とは、例えば、実際には特定のアミノ酸鎖の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ参照ポリペプチドの１９０番目に見られる残基に対応することを理解するであろう。当業者であれば、「対応する」アミノ酸を同定する方法を容易に理解することができる。例えば、当業者は、例えば、本開示によるポリペプチド及び／または核酸中の「対応する」残基を識別するために利用され得る、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＣＵＳＡＳＷ＋＋、ＤＩＡＭＯＮＤ、ＦＡＳＴＡ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ／ＧＬＳＥＡＲＣＨ、Ｇｅｎｏｏｇｌｅ、ＨＭＭＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ／ＨＨｓｅａｒｃｈ、ＩＤＦ、Ｉｎｆｅｒｎａｌ、ＫＬＡＳＴ、ＵＳＥＡＲＣＨ、ｐａｒａｓａｉｌ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｓｅａｒｃｈ、ＳｃａｌａＢＬＡＳＴ、Ｓｅｑｕｉｌａｂ、ＳＡＭ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＳＷＡＰＨＩ、ＳＷＡＰＨＩ－ＬＳ、ＳＷＩＭＭ、またはＳＷＩＰＥなどのソフトウェアプログラムを含む種々の配列アラインメントストラテジーを承知している。

【0017】

操作された：一般に、「操作された」という用語は、人の手によって操作されたという側面を指す。例えば、自然界ではその順序で結合していない２つ以上の配列が人の手によって操作されて、操作されたポリヌクレオチド内で互いに直接結合される場合、そのポリヌクレオチドは「操作された」とみなされる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、自然界では第１のコード配列と作動可能に結合しているが、第２のコード配列とは作動可能に結合していないことが見出される、人の手によって連結されて、その結果第２のコード配列と作動可能に会合している調節性配列を含む。同様に、細胞または生物は、その遺伝情報が変更されるように操作された場合（例えば、以前には存在していなかった新しい遺伝物質は、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、もしくは他の機構によって導入されているか、あるいは以前に存在していた遺伝物質が、例えば置換もしくは欠失突然変異によって、または交配プロトコールによって変更または除去される）、「操作された」とみなされる。一般的な慣例であり当業者には理解されているように、実際の操作が以前の実体に対して行われたとしても、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、典型的には依然として「操作された」と呼ばれる。

【0018】

賦形剤：本明細書で使用する場合、例えば、所望の粘稠度または安定化効果を提供する、またはそれに寄与するために、医薬組成物中に含まれ得る非治療剤を指す。いくつかの実施形態では、好適な薬学的賦形剤には、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含まれ得る。

【0019】

発現：本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」とは、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’ｃａｐ形成、及び／または３’末端形成による）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；及び／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。

【0020】

遺伝子：本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えば、特定の遺伝子産物をコードする配列）を含む；いくつかの実施形態では、遺伝子は非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えば、エキソン）及び非コード配列（例えば、イントロン）の両方を含んでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、遺伝子発現の１つ以上の側面（例えば、細胞型特異的発現、誘導的発現）を制御するか、またはそれに影響を与え得る１つ以上の調節性エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、終止シグナル）を含んでもよい。

【0021】

遺伝子産物または発現産物：本明細書で使用する場合、「遺伝子産物」または「発現産物」という用語は、一般に、遺伝子から転写されたＲＮＡ（プロセシング前及び／またはプロセシング後）またはその遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前及び／または修飾後）を指す。

【0022】

相同性：本明細書で使用する場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間の、例えばポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、抗体などのポリマー分子は、それらの配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「相同」であるとみなされる。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％類似している場合、互いに「相同」であるとみなされる。

【0023】

ヒト化マウス：本明細書で使用する場合、「ヒト化マウス」という用語（「キメラマウス」と互換的にも使用される）は、機能しているヒト遺伝子、細胞、組織及び／または器官を保有しているマウスを指す。いくつかの実施形態では、ヒト化マウスは、ヒトのモデル系として使用され得る（例えば、ヒト化肝細胞を有するマウスはヒト肝臓のモデル系として使用され得る）。いくつかの実施形態では、ヒト化マウスは、ヒト細胞及び／または組織が移植されている。いくつかの実施形態では、ヒト化マウスは、ヒト遺伝子または遺伝子産物を発現するように操作されている。

【0024】

同一性：本明細書で使用する「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。２つの核酸またはポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的で２つの配列をアラインメントさせることによって実行し得る（例えば、最適なアラインメントのために、第１配列と第２配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、同一でない配列は比較目的では無視し得る）。特定の実施形態では、比較目的でアラインメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占有される場合には、その分子は、その位置にて同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１－１７）を使用して決定され得る。いくつかの例示的な実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムで行われる核酸配列の比較は、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用する。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。

【0025】

「改善された」、「増加した」、または「減少した」：本明細書で使用する場合、これらの用語、または文法的に比較可能な比較用語は、同等の参照測定値と比較した値を示す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の薬剤（例えば、治療剤）で達成される評価値は、同等の参照薬剤で得られる評価値と比較して「改善」され得る。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、目的の対象またはシステムで達成された評価値は、異なる条件下（例えば、目的の薬剤の投与などの事象の前または後）で同じ対象もしくはシステムで、または異なる同等の対象（例えば、目的の特定の疾患、障害もしくは状態の１つ以上の指標の存在下で目的の対象もしくはシステムとは異なる同等の対象もしくはシステムにおいて、または状態もしくは因子に以前に曝露された場合など）で得られた評価値と比較して「改善」され得る。いくつかの実施形態では、比較用語は、統計的に関連する差異（例えば、統計的関連性を達成するのに十分な普及率及び／または大きさのもの）を指す。当業者は、所与の状況において、そのような統計的有意性を達成するために必要または十分な差異の程度及び／または蔓延を知っているか、または容易に決定することができるであろう。

【0026】

インビトロ：本明細書において使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物体中ではなく、人工環境において、例えば、試験管もしくは反応容器中に、細胞培養中等で起こる事象を指す。

【0027】

インビボ：本明細書で使用される場合、ヒト及びヒト以外の動物などの多細胞生物内で起こる事象を指す。細胞ベースのシステムの文脈では、この用語は、（例えば、インビトロシステムとは対照的に）生きた細胞内で発生する事象を指すために使用される場合がある。

【0028】

マーカー：本明細書で使用されるマーカーは、その存在またはレベルが特定の状態または事象の特徴である実体または部分を指す。いくつかの実施形態では、特定のマーカーの存在またはレベルは、疾患、障害、または状態の存在または段階の特徴であり得る。一例を挙げると、いくつかの実施形態では、この用語は、特定の腫瘍、腫瘍サブクラス、腫瘍の段階などに特徴的な遺伝子発現産物を指す。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、特定のマーカーの存在またはレベルは、例えば、特定のクラスの腫瘍に特徴的である場合がある、特定のシグナル伝達経路の活性（または活性レベル）と相関している。マーカーの有無の統計的有意性は、特定のマーカーに応じて異なる場合がある。いくつかの実施形態では、マーカーの検出は、腫瘍が特定のサブクラスのものである可能性が高いことを反映するという点で、非常に特異的である。このような特異性は感度を犠牲にして得られる場合がある（すなわち、腫瘍がマーカーを発現すると予想される腫瘍であっても陰性結果が生じる場合がある）。逆に、感度が高いマーカーは、感度が低いマーカーに比べて特異性が低い場合がある。本発明によれば、有用なマーカーは、特定のサブクラスの腫瘍を１００％の精度で区別する必要はない。

【0029】

核酸：本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸とは、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。文脈から明らかなように、いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す；いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」とはＲＮＡであるか、またはそれを含む；いくつかの実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然の核酸残基であるか、それを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然の核酸類似体であるか、それを含む、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、当技術分野で公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それらを含むか、またはそれらからなり、本発明の範囲に含まれるものとする。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート結合及び／または５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然の核酸と比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組換え細胞または系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の長さの残基である。いくつかの実施形態では、核酸は部分的または全体的に一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は酵素活性を有する。

【0030】

ペプチド：本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、典型的には比較的短い、例えば、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、約４０アミノ酸未満、約３０アミノ酸未満、約２５アミノ酸未満、約２０アミノ酸未満、約１５アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指す。

【0031】

薬学的に許容される担体：本明細書において用いる場合、「薬学的に許容される担体」とは、対象の化合物を身体の１つの器官または部分から身体の別の器官または部分に搬送または輸送することに関与する、液体もしくは固体充填材、希釈剤、賦形剤、または溶媒カプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ対象に有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る物質の幾つかの例としては：糖類、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース、及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び座剤ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油；グリコール類、例えば、プロピレングリコール；ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝化溶液；ポリエステル、ポリカーボネート類及び／またはポリ無水物類；ならびに薬学的製剤に用いられる他の非毒性の適合性材料が挙げられる。

【0032】

医薬組成物：本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、１つ以上の薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された活性薬剤を指す。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、関連する集団に投与された場合に所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンにおける投与に適切な単位用量で存在する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、固体または液体形態で投与するために特別に製剤化してもよく、これには、以下：経口投与、例えば、水薬（水性もしくは非水性溶液または懸濁液）、錠剤（例えば頬、舌下、及び全身吸収を標的とするもの）、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト；例えば、無菌液もしくは懸濁液、または徐放性製剤として、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による非経口投与；例えば、皮膚、肺または口腔に適用するクリーム、軟膏、または徐放性パッチもしくはスプレーとして、局所適用；例えば、ペッサリー、クリーム、または泡として膣内または直腸内；舌下；眼；経皮；または経鼻、肺及び他の粘膜表面のために適合される形態を含む。

【0033】

ポリペプチド：本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、一般に、少なくとも３つのアミノ酸のポリマーの当該技術分野で認識されている意味を有する。当業者は、「ポリペプチド」という用語が、本明細書に列挙される完全な配列を有するポリペプチドを含有するだけでなく、このような完全なポリペプチドの機能的断片（すなわち、少なくとも１つの活性を保持する断片）に相当するポリペプチドも包含するほど十分に一般的なものであることを意図していることを理解するであろう。さらに、当業者は、タンパク質配列が一般に、活性を破壊することなく何らかの置換を許容することを理解する。したがって、活性を保持し、１つ以上の高度に保存された領域で、少なくとも約３０～４０％の全配列同一性、多くの場合は約５０％、６０％、７０％、または８０％超を共有し、さらに通常ははるかに高い同一性、多くの場合９０％超、またはさらには９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％超の少なくとも１つの領域を含む、任意のポリペプチドは、通常は少なくとも３～４個、多くの場合最大２０個以上のアミノ酸を含み、同じクラスの別のポリペプチドを有し、本明細書で使用する関連用語「ポリペプチド」に包含される。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその両方を含んでもよく、当技術分野で公知の様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含んでもよい。有用な修飾には、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが含まれる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。「ペプチド」という用語は、一般に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すように使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質とは、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、及び／またはその特徴的な部分である。

【0034】

予防するまたは予防：疾患、障害、及び／または状態の発生に関連して本明細書で使用される場合、疾患、障害、及び／または状態を発症するリスクを軽減すること、及び／または疾患、障害、もしくは状態の１つ以上の特徴、徴候、もしくは症状の発症を遅らせることを指す。疾患、障害、または状態の発症が事前に定義された期間遅延した場合、予防は完了したとみなされる場合がある。

【0035】

リスク：文脈から理解されるように、疾患、障害、及び／または状態の「リスク」とは、特定の個人がその疾患、障害、及び／または状態を発症する可能性を指す。いくつかの実施形態では、リスクはパーセンテージとして表される。いくつかの実施形態では、リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０から１００％以下である。いくつかの実施形態では、リスクは、参照サンプルまたは参照サンプルの群に関連するリスクと比較したリスクとして表現される。いくつかの実施形態では、参照サンプルまたは参照サンプルの群は、疾患、障害、状態及び／または事象の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態では、参照サンプルまたは参照サンプルの群は、特定の個体と同等の個体に由来する。いくつかの実施形態では、相対リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。

【0036】

対象：本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態では出生前ヒト形態を含む）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害、または状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害、または状態に罹患しやすい。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害、または状態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害、または状態のいかなる症状も特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象とは、ある疾患、障害、または状態に対する感受性またはリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有する人である。いくつかの実施形態では、対象とは患者である。いくつかの実施形態では、対象とは、診断及び／または治療が施されているか、及び／または施された個体である。

【0037】

実質的に：本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の完全またはほぼ完全な程度または度合いを示す定性的な状態を指す。生物学的技術分野の当業者であれば、生物学的及び化学的現象は、たとえあったとしても、完了に至ること、及び／または完全に進むこと、または絶対的な結果を達成するもしくは回避することはまれであることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために本明細書で使用される。

【0038】

影響を受けやすい：疾患、障害、及び／または状態の「影響を受けやすい」個体とは、一般人よりもその疾患、障害、及び／または状態を発症するリスクが高い人のことである。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、その疾患、障害、及び／または状態と診断されていない場合もある。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、その疾患、障害、及び／または状態の症状を示す場合がある。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、その疾患、障害、及び／または状態の症状を示さない場合がある。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、その疾患、障害、及び／または状態を発症する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、その疾患、障害、及び／または状態を発症しない。

【0039】

治療剤：本明細書で使用する場合、「治療剤」という語句は、対象に投与すると、治療効果を有する、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、治療剤は、疾患、障害及び／または状態の１つ以上の症状または特徴を緩和する、改善する、軽減する、阻害する、予防する、その発症を遅らせる、その重症度を軽減する、及び／またはその発生率を低下させるために使用され得る任意の物質である。

【0040】

処置：本明細書で使用する場合、用語「処置」（また「処置する」または「処置すること」）とは、特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の徴候、症状、特徴、及び／または原因を部分的または完全に緩和する、改善する、回復する、阻害する、その発症を遅らせる、その重症度を軽減する、及び／またはその発生率を低減する療法を施すことを指す。いくつかの実施形態では、そのような処置は、関連疾患、障害、及び／または状態の徴候を示さない対象の処置、及び／またはその疾患、障害、及び／または状態の初期徴候のみを示す対象の処置であってよい。代替的にまたは付加的に、そのような処置は、関連疾患、障害、及び／または状態のうちの１つ以上の確立された徴候を示す対象の処置であってよい。いくつかの実施形態では、処置は、関連疾患、障害、及び／または状態に罹患していると診断された対象の処置であってよい。いくつかの実施形態では、処置は、関連疾患、障害、及び／または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象の処理であってよい。したがって、いくつかの実施形態では、処置は予防的であってもよい。いくつかの実施形態では、処置は治療的であってもよい。

【0041】

バリアント：本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、参照実体と有意な構造的同一性を示すが、参照実体と比較される場合、１つ以上の化学部分の存在または非存在またはレベルが参照実体とは構造的に異なる実体を指す。いくつかの実施形態では、バリアントはまた、その参照実体と機能的に異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「バリアント」であると適切にみなされるか否かは、参照実体との構造的同一性の程度に基づく。当業者には理解されるように、任意の生物学的または化学的参照実体は、特定の特徴的な構造要素を有する。バリアントとは、定義上、そのような特徴的な構造要素を１つ以上共有する別個の化学物質である。ほんの数例を挙げると、小分子は、特徴的なコア構造要素（例えば、大環状コア）及び／または１つ以上の特徴的なペンダント部分を有する場合があり、その結果、小分子のバリアントは、コア構造要素及び特徴的なペンダント部分を共有するものとなり、ただし、他のペンダント部分及び／またはコア内に存在する結合の種類（一重対二重、Ｅ対Ｚなど）が異なり、ポリペプチドは、線形または三次元空間内で互いに対して指定された位置を有する、及び／または特定の生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸からなる特徴的な配列エレメントを有し得、核酸は、線形または三次元空間内で互いに指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的な配列エレメントを有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列における１つ以上の違い、及び／またはポリペプチドもしくは核酸の共有結合成分である（例えば、ポリペプチドまたは核酸骨格に結合している）、化学部分（例えば、炭水化物、脂質、リン酸基）の１つ以上の違いの結果として、参照ポリペプチドまたは核酸とは異なる場合がある。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的な配列同一性を示す。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸と少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを共有しない。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたは核酸は、１つ以上の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントのポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性の１つ以上を共有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性の１つ以上を欠く。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸と比較して、１つ以上の生物学的活性のレベルの低下を示す。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドまたは核酸は、参照のものと同一だが、特定の位置での少数の配列変更があるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する場合、親または参照のポリペプチドまたは核酸の「バリアント」であるとみなされる。典型的には、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、または約２％未満のバリアント内の残基が、参照と比較して、置換、挿入、または欠失されている。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照と比較して、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１個の置換残基（複数可）を含む。多くの場合、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照と比較して、非常に少数（例えば、約５、約４、約３、約２、または約１未満）の置換、挿入、または欠失した機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を含む。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、約５、約４、約３、約２、または約１個以下の付加（複数可）または欠失（複数可）を含み、いくつかの実施形態では、参照と比較して、追加または削除がない。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照と比較して、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６未満、通常は約５、約４、約３、または約２未満の追加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたは核酸は、自然界に見られるものである。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたは核酸は、ヒトのポリペプチドまたは核酸である。

【0042】

特定の実施形態の詳細な説明
遺伝子治療
遺伝子の機能不全によって引き起こされる遺伝性疾患は、２０１９年時点で報告された約７，１３６件の疾患のうち８０％近くを占めると報告されている（Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｇｅｎｅｓを参照）。世界中で３億３，０００万人超の人々が遺伝性疾患に罹患しており、そのうちほぼ半数が子供であると推定されている。しかし、利用可能な薬剤で治療できるヒト疾患はわずか約５００と推定されており、これらの遺伝性疾障害のかなりの部分に対処するには新しい治療法及び治療の選択肢が必要であることが示されている。遺伝子治療は、対象への遺伝物質の伝達を通じて遺伝性障害の影響を媒介することを目的とした、新興の処置法である。いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、移入された遺伝物質の転写及び／または翻訳、及び／または核酸、ウイルス、もしくは遺伝子操作された微生物の投与を介して、移入された遺伝物質を宿主ゲノムに組み込むことを含み得る（ＦＤＡガイドラインを参照のこと）。遺伝子治療は、処置のために対象の任意の特定の細胞、組織、及び／または器官に治療用遺伝物質を送達することを可能にし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、宿主細胞への治療用遺伝子または導入遺伝子の移入を伴う。

【0043】

ウイルス遺伝子治療
ウイルスは、高レベルのペイロード（例えば、導入遺伝子）を発現する能力、及びいくつかの実施形態では、宿主のゲノムの中でペイロード（例えば、導入遺伝子）を安定して発現する能力に起因して、遺伝子治療のための魅力的なビヒクルとして浮上している。組換えＡＡＶは、多くの場合、高いウイルス収量、穏やかな免疫応答を生成し、様々な細胞型に感染できるので、遺伝子治療用の一般的なウイルスベクターである。

【0044】

従来のＡＡＶ遺伝子治療では、ｒＡＡＶを操作して、染色体ＤＮＡに組み込むことなく治療ペイロード（例えば、導入遺伝子）を標的細胞に送達し得る。１つ以上のペイロード（例えば導入遺伝子）は、細胞核内に存在するエピソームと呼ばれる非組み込み遺伝エレメントから発現される場合がある。従来の遺伝子治療は、最初に形質導入された細胞には効果的であり得るが、エピソーム発現は一時的であり、とりわけ細胞代謝回転に伴って経時的に徐々に減少する。より長い寿命を有する細胞（例えば、対象の寿命のかなりの部分にわたって存在する細胞）の場合、エピソーム発現が効果的である可能性がある。しかし、従来の遺伝子治療は、発育中の急速な組織成長によりペイロード（例えば、導入遺伝子）の治療効果が希釈され、最終的には失われ得るので、人生の早い段階（例えば小児期）に対象に適用される場合には欠点がある場合がある。

【0045】

ＡＡＶ遺伝子治療の２番目のタイプであるＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、細胞ゲノムの忠実度を維持する、自然に存在するＤＮＡ修復プロセスである相同組換え（ＨＲ）を利用する。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）はＨＲを使用して、１つ以上のペイロード（例えば、導入遺伝子）をゲノム配列内の特定の標的遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、１つ以上の標的遺伝子座で内因性プロモーターを利用して、高レベルの組織特異的発現を駆動する。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は外因性ヌクレアーゼまたはプロモーターの使用を必要としないため、これらの要素に関連することが多い有害な影響を軽減する。さらに、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）プラットフォーム技術は、特に小児対象における遺伝性疾患の処置によく適した方法で、従来の遺伝子治療と従来の遺伝子編集アプローチの両方の重要な制限の一部を克服する可能性がある。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、ＡＡＶベクターを使用して遺伝子を細胞の核に送達する。次に、ＨＲを使用して対象のゲノムにおいて、内因性プロモーターによって調節される位置に修正遺伝子を安定して組み込むことで、身体が成長し時間の経過とともに変化しても、生涯にわたるタンパク質生産が可能になる（これは従来のＡＡＶ遺伝子治療では実現できない）。

【0046】

非破壊的遺伝子ターゲティングに関する以前の研究は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１５８３０９に記載されている。ヌクレアーゼを使用しないゲノム編集に関する以前の研究は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１４３１７７に記載されている。ＭＭＡの処置のための非破壊的遺伝子治療に関する以前の研究は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／０３２９８６に記載されている。遺伝子治療のモニタリングに関する以前の研究は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／２１４５８２に記載されている。

【0047】

ウイルスの構造及び機能
ウイルスベクター
ウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス染色体物質を含み、その中に異種核酸配列を挿入して目的の標的配列に移入し得る（例えば、細胞内のゲノムＤＮＡに移入するため）。例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルス、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルス、及び／またはライフサイクルにＤＮＡ段階を有するＲＮＡウイルスを含む、様々なウイルスをウイルスベクターとして使用し得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もしくはＡＡＶバリアントであるか、またはそれらを含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、ベクター粒子は、ウイルスベースのポリヌクレオチドをカプシド化するカプシドを含むウイルスの単一単位である（例えば、野生型ウイルスゲノムまたは組換えウイルスベクター）。いくつかの実施形態では、ベクター粒子は、ＡＡＶベクター粒子であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクター粒子とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド化ＡＡＶベクターから構成されるベクター粒子を指す。いくつかの実施形態では、ベクター粒子（ウイルスベクターとも呼ばれる）は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド化ＡＡＶベクターを含み、ベクターは１つ以上の異種ポリヌクレオチド配列をさらに含む。

【0049】

カプシドタンパク質
いくつかの実施形態では、発現構築物は、天然に存在するＡＡＶ及び組換えＡＡＶを含む、１つ以上のＡＡＶサブタイプに由来するカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＣ１１．０１、ＡＡＶＣ１１．０２、ＡＡＶＣ１１．０３、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０５、ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．０７、ＡＡＶＣ１１．０８、ＡＡＶＣ１１．０９、ＡＡＶＣ１１．１０、ＡＡＶＣ１１．１１（本明細書では互換的にｓＬ６５と呼ばれる）、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶＣ１１．１３、ＡＡＶＣ１１．１４、ＡＡＶＣ１１．１５、ＡＡＶＣ１１．１６、ＡＡＶＣ１１．１７、ＡＡＶＣ１１．１８、ＡＡＶＣ１１．１９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．Ｋ、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ．８、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ハイブリッドＡＡＶ（例えば、１つのＡＡＶサブタイプの１つ以上の配列及び第２のサブタイプの１つ以上の配列を含むＡＡＶ）、及び／または変異体ＡＡＶカプシドタンパク質もしくはキメラＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶの２つ以上の異なる血清型に由来するポリヌクレオチド配列を有するカプシド）を含むＡＡＶ、またはそれらのバリアント由来のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、カプシドタンパク質（例えば、１つ以上のＡＡＶサブタイプ由来のカプシドタンパク質）内にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、参照カプシドタンパク質と比較して、細胞（例えば、ヒトまたはマウス細胞）の形質導入の増加または増強を提供する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、参照カプシドタンパク質と比較して、特定の細胞または組織型（例えば、肝臓向性、筋肉向性、ＣＮＳ向性、肺向性）の形質導入の増加または増強をもたらす。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、細胞または組織（例えば、肝臓、筋肉、及び／またはＣＮＳ）の形質導入を参照カプシドタンパク質と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上増加または増強する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、細胞または組織（例えば、肝臓、筋肉、肺及び／またはＣＮＳ）の形質導入を、参照カプシドタンパク質と比較して、少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上増加または増強する。

【0051】

ＡＡＶの構造及び機能
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、正二十面体のタンパク質カプシドと一本鎖ＤＮＡゲノムで構成されるパルボウイルスである。ＡＡＶウイルスのカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３の３つのサブユニット、ならびにゲノム配列の末端にある２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を含む。ＩＴＲは複製起点として機能し、ウイルスのパッケージングにおいて役割を果たす。ウイルスゲノムには、それぞれ複製とカプシドパッケージングに関連するｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子も含まれている。ほとんどの野生型ＡＡＶでは、ｒｅｐ遺伝子はウイルス複製に必要な４つのタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードする。ｃａｐ遺伝子は、カプシドサブユニットと、ウイルス粒子のアセンブリを促進するアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）とをコードする。ＡＡＶは一般に複製欠損であり、感染細胞内で複製するにはヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及び／またはアデノウイルス（ＡｄＶ））の存在を必要とする。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、宿主細胞内で複製するために、アデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を必要とする。

【0052】

組換えＡＡＶ
一般に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、類似のカプシド配列及び構造、ならびにＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（例えば、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）を含む、野生型ＡＡＶに見られる同じエレメントの多くを含み得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、天然の野生型ＡＡＶ配列を、ペイロードをコードするポリヌクレオチド配列で置き換えることになる。例えば、いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、治療目的（例えば、遺伝子治療）を目的とした１つ以上の遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含むことになる。ｒＡＡＶは、１つ以上の野生型ウイルスコード配列を除去するように修飾されてもよい。例えば、ｒＡＡＶは、１つのみのＩＴＲ、及び／または野生型ＡＡＶに見られるよりもパッケージングに必要な１つ以上の少ない遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を含むように操作されてもよい。より大きな配列はウイルスカプシド内に効率的にパッケージングされないので、ｒＡＡＶによる遺伝子発現は一般に合計５ｋｂ以下の１つ以上の遺伝子に限定される。いくつかの実施形態では、例えば、通常は大きすぎて単一のＡＡＶに収まらないであろう遺伝子のコード配列全体を提供するために、２つ以上のｒＡＡＶを使用して、より大きなペイロードの一部を提供し得る。

【0053】

とりわけ、本開示は、本明細書に記載される１つ以上のポリペプチドを含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、１つ以上のカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶＣ１１．０１、ＡＡＶＣ１１．０２、ＡＡＶＣ１１．０３、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０５、ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．０７、ＡＡＶＣ１１．０８、ＡＡＶＣ１１．０９、ＡＡＶＣ１１．１０、ＡＡＶＣ１１．１１（本明細書では同義でｓＬ６５と呼ばれる）、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶＣ１１．１３、ＡＡＶＣ１１．１４、ＡＡＶＣ１１．１５、ＡＡＶＣ１１．１６、ＡＡＶＣ１１．１７、ＡＡＶＣ１１．１８、ＡＡＶＣ１１．１９、ＡＡＶ－ＤＪ及び／またはＡＡＶ－ＬＫ０３）、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．Ｋ、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ．８、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ハイブリッドＡＡＶ（例えば、１つのＡＡＶサブタイプの１つ以上の配列及び第２のサブタイプの１つ以上の配列を含むＡＡＶ）、及び／または変異体ＡＡＶカプシドタンパク質もしくはキメラＡＡＶカプシド（例えば、２つ以上の異なるＡＡＶ血清型に由来するポリヌクレオチド配列を有するカプシド）を含むＡＡＶに由来する、１つ以上のカプシドタンパク質）を含み得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、目的の遺伝子または核酸（例えば、遺伝性疾患／障害の処置のための遺伝子及び／または阻害性核酸配列）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0054】

ＡＡＶベクターは、感染した宿主細胞内で複製することができる（複製コンピテント）場合もあれば、感染した宿主細胞内で複製できない（複製不能）場合もある。複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）は、１つ以上の機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。組換えＡＡＶベクターは、一般に、ＡＡＶパッケージング遺伝子をコードする配列との組換えによってｒｃＡＡＶが生成される可能性を減らすために、哺乳動物細胞において複製不能となるように設計される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、ｒｃＡＡＶベクターを含むとしても、ほとんど含まないように設計される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター調製物は、１０^２ｒＡＡＶベクターあたり約１未満のｒｃＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター調製物は、１０^４ｒＡＡＶベクターあたり約１未満のｒｃＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター調製物は、１０^８ｒＡＡＶベクターあたり約１未満のｒｃＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター調製物は、１０^１２ｒＡＡＶベクターあたり約１未満のｒｃＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター調製物は、ｒｃＡＡＶベクターを含まない。

【0055】

異種核酸
特に、本開示は、少なくとも１つのペイロード及び２つの相同性アームを含んでいるポリヌクレオチドカセットであって、片方の相同性アームがポリヌクレオチドカセットの５’末端にあり、もう片方の相同性アームがポリヌクレオチドカセットの３’末端にある、当該ポリヌクレオチドカセットを提供する。

【0056】

ペイロード
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターまたは構築物は、１つ以上のペイロードをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。様々な態様によれば、様々なペイロードのいずれか（例えば、診断及び／または治療目的のもの）を、単独で使用しても、または組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、病状を治療するための生物学的プロセスを促進する細胞内在性または細胞外性の活性を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、導入遺伝子（本明細書では目的の遺伝子（ＧＯＩ）とも呼ばれる）であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つ以上の末端逆位配列（ＩＴＲ）配列（例えば、１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲ）であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、隣接するＩＴＲ配列を有する１つ以上の導入遺伝子であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、レポーター遺伝子（例えば、蛍光レポーターまたは発光レポーター）をコードする１つ以上の異種核酸配列であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つ以上のバイオマーカー（例えば、ペイロード発現のプロキシ）であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ポリシストロニック発現のための配列（例えば、２Ａペプチド、またはイントロン配列、内部リボソーム侵入部位を含む）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、単一のコード配列内で２つ以上の別個のタンパク質産物の共発現を可能にする小さな（例えば、約１８～２２アミノ酸）ペプチド配列である。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、タンパク質コード配列の配置に関係なく、２つ以上の別個のタンパク質産物の共発現を可能にする。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドはコンセンサスモチーフ（例えば、ＤＶＥＸＮＰＧＰ）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドはタンパク質の切断を促進する。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、ウイルス配列（例えば、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマＡ型鼻炎ウイルス、ブタテスコウイルス－１（Ｐ２Ａ）、またはＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ））であるか、またはそれらを含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、２Ａペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及び／またはＦ２Ａ）であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、フリン切断モチーフであるか、またはそれらを含む（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦｕｒｉｎＤＢ：Ａ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ２０－Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｆｕｒｉｎ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ Ｍｏｔｉｆｓ，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ，（２０１１），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１２：１０６０－１０６５を参照）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、タグ（例えば、免疫学的タグ）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つ以上の機能的核酸（例えば、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つ以上の阻害性核酸（例えば、とりわけ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを含む）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つ以上のヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質、エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ）を含んでもよい。

【0058】

導入遺伝子
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、疾患、障害、または状態の１つ以上の徴候及び／または症状を改善するために選択される修正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ）遺伝子である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本開示に包含されるベクター（複数可）の使用を通じて宿主細胞ゲノムに恒久的に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞内で見出される疾患関連遺伝子（すなわち、疾患、障害または状態の発現または悪化に関連する遺伝子アイソフォーム（複数可））の機能的バージョンである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞に見出される疾患関連遺伝子の最適化されたバージョン（例えば、コドン最適化または発現最適化されたバリアント）である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞内で見出される疾患関連遺伝子のバリアント（例えば、その機能的遺伝子断片またはバリアント）である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子とは、１つ以上の健康な組織で通常発現されるペプチドの発現を引き起こす遺伝子である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子とは、肝細胞で通常発現されるペプチドの発現を引き起こす遺伝子である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子とは、筋肉細胞で通常発現されるペプチドの発現を引き起こす遺伝子である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子とは、中枢神経系細胞で通常発現されるペプチドの発現を引き起こす遺伝子である。

【0059】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の健康な組織では通常発現されないペプチド（例えば、異所的に発現されるペプチド）の発現を引き起こす遺伝子であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の健康な組織（例えば、肝臓、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、肺）において異所的に発現されるペプチドの発現を引き起こす遺伝子である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子とは、１つ以上の健康な組織において異所的に発現され、１つ以上の健康な組織（例えば、肝臓、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、肺）において正常に発現されるペプチドの発現を引き起こす遺伝子である。

【0060】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、機能的核酸をコードする遺伝子であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、治療剤は、宿主細胞または対象に対して治療効果を有する薬剤であるか、またはそれらを含む（例えば、リボザイム、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び／またはｓｈＲＮＡを含む）。例えば、いくつかの実施形態では、治療剤は、医学的状態、例えば、疾患、障害、または状態の少なくとも１つの症状を治療するための生物学的プロセスを促進する。

【0061】

いくつかの実施形態では、対象における導入遺伝子の発現は、実質的に標的遺伝子座での組み込みから生じる。いくつかの実施形態では、対象における総導入遺伝子発現の７５％以上（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、９９．５％以上）は、標的遺伝子座での導入遺伝子の組み込みによるものである。いくつかの実施形態では、対象における総導入遺伝子発現の２５％以下（例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下）は、標的遺伝子座での導入遺伝子の組み込み以外の起源に由来する（例えば、エピソーム発現、非標的遺伝子座での組み込み）。

【0062】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は対象内で一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、対象における総導入遺伝子発現の７５％以上（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、９９．５％以上）は、一過性発現に由来する。いくつかの実施形態では、対象における総導入遺伝子発現の２５％以下（例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下）は、一過性発現以外の起源に由来する（例えば、非標的遺伝子座での組み込み）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後、１週間以上にわたって、対象で一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後、１か月以上にわたって、対象で一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。

【0063】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後１日以上以内に観察されるレベルと同等のレベルで、処置から１週間以上後に対象において一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後１日以上以内に観察されるレベルと同等のレベルで、処置から１か月以上後に対象において、一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。

【0064】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後１日以上以内に観察されるレベルと比較して低下したレベルで、処置から１週間以上後に対象において一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後１日以上以内に観察されるレベルと比較して低下したレベルで、処置から１か月以上後に対象において一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。

【0065】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後１か月以内の間、対象において、一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後２か月以内の間、対象において、一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後３か月以内の間、対象において、一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後４か月以内の間、対象において、一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後５か月以内の間、対象において、一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、処置後６か月以内の間、対象において、一時的に発現される（例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルスなどからのエピソーム発現）。

【0066】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子及び相同性アームの合計サイズは、これらの導入遺伝子が送達ビヒクル中に効率的にパッケージングされるのに適した配列長を有する可能性を増大させるように最適化され得、これにより、最終的に患者において導入遺伝子が適切に送達されることになる可能性が増大し得る。

【0067】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、ある特定の細胞型（例えば、哺乳動物、昆虫、細菌、真菌など）のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、特定の組織型（例えば、肝臓、筋肉、ＣＮＳ、肺）のヒト細胞のためにコドン最適化されている。

【0068】

ある特定の実施形態では、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列（例えば、野生型遺伝子配列）との１００％未満のヌクレオチド相同性を有するようにコドン最適化され得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との間のヌクレオチド相同性は、１００％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７８％未満、７６％未満、７４％未満、７２％未満、７０％未満、６８％未満、６６％未満、６４％未満、６２％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満及び４０％未満である。

【0069】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、対応する野生型参照ヌクレオチド配列（例えば、野生型遺伝子配列）との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する配列であり得る、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、対応する野生型参照ヌクレオチド配列（例えば、野生型遺伝子配列）の一部との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する配列であり得る、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、以下の表５中の例示的な配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する配列であり得る、またはそれを含み得る。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【0070】

相同性アーム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、標的遺伝子座に対して有意な配列相同性を有する１つ以上の隣接ポリヌクレオチド配列（例えば、相同性アーム）を含む。いくつかの実施形態では、相同性アームは、ペイロードをコードするポリヌクレオチド配列に隣接する（例えば、１つの相同性アームがペイロードに対して５’側にあり（本明細書では５’相同性アームとも呼ばれる）、１つの相同性アームがペイロードに対して３’側にある（本明細書では３’相同性アームとも呼ばれる））。いくつかの実施形態では、相同性アームは、ペイロードが部位特異的に組み込まれるように導く。

【0071】

いくつかの実施形態では、相同性アームは、同じ長さのもの（本明細書では、釣り合いのとれた相同性アーム、または揃った相同性アームとも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、同じ長さの相同性アームを含んでおり、この相同性アームが少なくとも特定の長さであるウイルスベクターは、改善された効果（例えば、標的組み込み率の改善）をもたらす。いくつかの実施形態では、相同性アームの長さは１００ｎｔ～１０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、相同性アームの長さは２００ｎｔ～１０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、相同性アームの長さは５００ｎｔ～１５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、相同性アームの長さは１０００ｎｔ～２０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、相同性アームの長さは２０００ｎｔを上回る。いくつかの実施形態では、各相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、各相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、各相同性アームの長さは少なくとも１２５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、相同性アームの長さは１０００ｎｔ未満である。いくつかの実施形態では、相同性アームは標的座位との少なくとも７０％の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは標的座位との少なくとも８０％の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは標的座位との少なくとも９０％の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは標的座位との少なくとも９５％の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは標的座位との少なくとも９９％の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは標的座位との１００％の相同性を含有する。

【0072】

いくつかの実施形態では、相同性アームは、異なる長さのもの（本明細書では、不釣り合いな相同性アーム、または不揃いな相同性アームとも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、異なる長さを有する不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターは、参照配列と比較して改善された効果（例えば、標的部位組み込み率の向上）をもたらす。いくつかの実施形態では、異なる長さの相同性アームを含み、各相同性アームが少なくとも特定の長さであるウイルスベクターは、参照配列（例えば、同じ長さの相同性アームを含むウイルスベクター、または長さが１０００ｎｔ未満の１つ以上の相同性アームを含むウイルスベクター）と比較して改善された効果（例えば、標的部位組み込み率の向上）をもたらす。

【0073】

いくつかの実施形態では、各相同性アームの長さは５００ｎｔを超える。いくつかの実施形態では、各相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、各相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１１００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１３００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１４００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１６００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１７００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１８００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１９００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも７５０ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも２０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１１００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１２００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１３００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１４００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１５００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１６００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１７００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１８００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１９００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１０００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも２０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、１つの相同性アームの長さは少なくとも１３００ｎｔであり、別の相同性アームの長さは少なくとも１４００ｎｔである。いくつかの実施形態では、５’相同性アームは３’相同性アームよりも長い。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは５’相同性アームよりも長い。

【0074】

いくつかの実施形態では、相同性アームを含むウイルスベクターは、参照配列（例えば、相同性アームを欠くウイルスベクター）と比較して改善された効果（例えば、標的部位組み込み率の向上）をもたらす。いくつかの実施形態では、相同性アームを含むウイルスベクターは、０．０１％以上（例えば、０．０５％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上、０．５％以上、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上、１％以上、１．５％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上）の標的部位組み込み率をもたらす。いくつかの実施形態では、相同性アームを含むウイルスベクターは、経時的な標的部位組み込み率の向上をもたらす。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、標的部位組み込みの初期測定値と比較して経時的に向上する。いくつかの実施形態では、経時的な標的部位組み込み率は、標的部位組み込みの最初の測定値より少なくとも１．５倍高い（例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍）。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１日以上後に測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１週間以上後に測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１か月以上後に測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１年以上後に測定される。

【0075】

いくつかの実施形態では、異なる長さの相同性アームを含むウイルスベクターは、参照配列（例えば、同じ長さの相同性アームを有するウイルスベクター、５００ｎｔ未満の相同性アームを少なくとも１つ有するウイルスベクター）と比較して改善された効果（例えば、標的部位組み込み率の向上）をもたらす。いくつかの実施形態では、異なる長さの相同性アームを含むウイルスベクターは、参照組成物（例えば、同じ長さの相同性アームを有するウイルスベクター、５００ｎｔ未満の相同性アームを少なくとも１つ有するウイルスベクター）と比較して少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍または少なくとも４．０倍改善された編集活性をもたらす。

【0076】

いくつかの実施形態では、異なる長さの相同性アームを含むウイルスベクターは、０．０１％以上（例えば、０．０５％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上、０．５％以上、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上、１％以上、１．５％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上）の標的部位組み込み率をもたらす。いくつかの実施形態では、異なる長さの相同性アームを含むウイルスベクターは、経時的な標的部位組み込み率の向上をもたらす。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、標的部位組み込みの初期測定値と比較して経時的に向上する。いくつかの実施形態では、経時的な標的部位組み込み率は、標的部位組み込みの最初の測定値より少なくとも１．５倍（例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍）高い。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１日以上後に測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１週間以上後に測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１か月以上後に測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１年以上後に測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１つ以上のバイオマーカー（例えば、２Ａペプチドを含むバイオマーカー）の評価によって測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、１つ以上の単離核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｇＤＮＡ）の評価によって測定される。いくつかの実施形態では、標的部位組み込み率は、遺伝子発現の評価によって（例えば、免疫組織化学染色によって）測定される。

【0077】

【表1】

【0078】

いくつかの実施形態では、異なる長さの相同性アームを含むウイルスベクターは、種または種のモデルシステム（例えば、マウス、ヒト、またはそれらのモデル）における遺伝子編集の改善を提供し得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の種または特定の種のモデルシステム（例えば、マウス、ヒト、またはそれらのモデル）における発現のために最適化される場合、相同性アーム長の異なる組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、相同性アーム長の特定の組み合わせを含むウイルスベクターは、ある種またはある種のモデルシステム（例えば、ヒト、ヒト化マウスモデル）において、第２の種または第２の種のモデルシステム（例えば、マウス、純粋なマウスモデル）と比較して遺伝子編集の改善を提供し得る。いくつかの実施形態では、相同性アーム長の特定の組み合わせを含むウイルスベクターは、ある種またはある種のモデル（例えば、ヒト、ヒト化マウスモデル）において、第２の種または第２の種のモデルシステム（例えば、マウス、純粋なマウスモデル）と比較して高レベルの遺伝子編集に最適化され得る。

【0079】

いくつかの実施形態では、相同性アームは、高度に発現される内因性遺伝子の直後に導入遺伝子が組み込まれるように導く。いくつかの実施形態では、相同性アームは、内因性遺伝子発現を破壊することなく導入遺伝子が組み込まれるように導く（非破壊的組み込み）。

【0080】

相同性アームデザイン及び最適化
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、発現が最適化された場合、異なる組み合わせの相同性アーム長を含み得る。

【0081】

本開示は、異なるデザインの相同性アームが、様々なウイルスベクター（例えば、導入遺伝子及び２Ａ配列を含む異なる発現カセットを含むウイルスベクター）との関連において有益となり得る、という認識を包含する。例えば、いくつかの実施形態において、ウイルスベクターが、導入遺伝子と２Ａ配列（例えばＰ２Ａ）とＩＴＲとを全部の合計長さが少なくとも２．７ｋｂとなるように含んでいる（例えば、典型的なＡＡＶのパッケージング容量を前提とすればおよそ２ｋｂ以下を相同性アームのために残している）発現カセットを含む場合、各相同性アームについて可能な限り１ｋｂに近い長さを維持するためには同じ長さ（すなわち、釣り合いのとれたデザイン）の相同性アームを使用することが好ましくなり得る。そのようなデザインは、改善された組み込み効率をもたらし得る。

【0082】

他のいくつかの実施形態では、図２に示されているように、ウイルスベクターが、導入遺伝子と２Ａ配列（例えばＰ２Ａ）とＩＴＲとを全部で２．７ｋｂ未満となるように含んでいる（例えば、典型的なＡＡＶのパッケージング容量を前提とすれば２ｋｂよりも多くを相同性アームのために残している）発現カセットを含む場合、異なる長さ（すなわち、不釣り合いなデザイン）の相同性アームを使用することが好ましく、これは、改善された組み込み効率をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１ｋｂの３’相同性アームとより長い（例えば、ベクターのパッケージング容量によって許容される最大限の）５’相同性アームとを有する異なる長さの相同性アームを含み得る。そのようなデザインは、種（例えば、ヒト）において、改善された組み込み効率をもたらし得ることが企図される。

【0083】

本開示は、異なるデザインの相同性アームが、種または種のモデル系（例えば、マウス、ヒト、またはそのモデル）における遺伝子編集との関連において有益となり得る、という認識を包含する。例えば、いくつかの実施形態では、図５に示されるように、ウイルスベクターが、導入遺伝子と２Ａ配列（例えばＰ２Ａ）とＩＴＲとを全部で２．７ｋｂ未満となるように含んでいる（例えば、典型的なＡＡＶのパッケージング容量を前提とすれば２ｋｂよりも多くを相同性アームのために残している）発現カセットを含む場合、１ｋｂの３’相同性アームとより長い（例えば、ベクターのパッケージング容量によって許容される最大限（例えば、１．６ｋｂ）の）５’相同性アームとを有する異なる長さ（すなわち、不釣り合いなデザイン）の相同性アームを使用することが好ましく、これは、種（例えばヒト）において改善された組み込み効率をもたらし得る。対照的に、いくつかの実施形態では、図２に示されるように、本明細書に記載のウイルスベクターが、導入遺伝子と２Ａ配列（例えばＰ２Ａ）とＩＴＲとを全部で２．７ｋｂ未満となるように含んでいる（例えば、典型的なＡＡＶのパッケージング容量を前提とすれば２ｋｂよりも多くを相同性アームのために残している）発現カセットを含む場合、１ｋｂの５’相同性アームとより長い（例えば、ベクターのパッケージング容量によって許容される最大限（例えば、１．６ｋｂ）の）３’相同性アームとを有する異なる長さ（すなわち、不釣り合いなデザイン）の相同性アームを使用することが好ましく、これは、種（例えばマウス）において改善された組み込み効率をもたらし得る。

【0084】

処置の方法
本明細書に開示される組成物及び構築物は、標的遺伝子座及びその周囲の内因性遺伝子の発現を維持しながら、細胞内の特定の標的遺伝子座からのペイロード（例えば、導入遺伝子）の発現を行う任意のインビトロまたはインビボ用途で使用してもよい。例えば、本明細書に開示される組成物及び構築物は、対象における障害、疾患、または病状を処置するために（例えば、遺伝子治療を通じて）使用され得る。

【0085】

いくつかの実施形態では、処置は、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果を得ることまたは維持することを含む。いくつかの実施形態では、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果は、疾患を完全または部分的に予防すること（例えば、疾患の症状を予防すること）を含み得る。いくつかの実施形態では、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果は、疾患を完全または部分的に治癒すること（例えば、疾患に関連する副作用を治癒すること）を含み得る。いくつかの実施形態では、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果は、疾患の再発の予防を含み得る。いくつかの実施形態では、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果は、疾患の進行を遅らせることを含み得る。いくつかの実施形態では、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果は、疾患の症状を軽減することを含み得る。いくつかの実施形態では、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果は、疾患の悪化（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）の予防を含み得る。いくつかの実施形態では、所望の薬理学的効果及び／または生理学的効果は、疾患に関連する症状の安定化及び／または軽減を含み得る。

【0086】

いくつかの実施形態では、処置は、疾患の発症前、発症中、または発症後（例えば、疾患に関連する症状の出現前、出現中、または出現後）に組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、処置は（例えば、異なるタイプの療法を含む１つ以上の療法との）併用療法を含む。

【0087】

目的の疾患
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、疾患の構成要素として遺伝子欠損または異常を含む目的の任意の疾患を処置するために使用され得る。

【0088】

特定の例として、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるもののような組成物及び構築物は、分枝鎖有機酸尿症（例えば、メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、プロピオン酸血症（ＰＡ）、イソ吉草酸血症（ＩＶＡ）、アルギニノコハク酸尿症）を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＢＣＫＤＨ複合体（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及びＥ２サブユニット）、メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（アルファ及びベータサブユニット）、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、分枝鎖有機酸尿症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、分枝鎖有機酸尿症に関連する徴候及び／または症状（例えば、筋緊張低下、発達遅延、発作、視神経萎縮、急性脳症、過換気、呼吸窮迫、体温不安定、反復性嘔吐、ケトアシドーシス、膵炎、便秘、好中球減少症、汎血球減少症、続発性血球貪食症、不整脈、心筋症、慢性腎不全、皮膚炎、難聴）の低減を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、脂肪酸酸化障害（例えば、三機能性タンパク質欠損症、長鎖Ｌ－３ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＬＣＡＤ）欠損症、中鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＨＡＤ）欠損症、超長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＨＡＤ）欠損症）を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＨＡＤＨＡ、ＨＡＤＨＢ、ＬＣＨＡＤ、ＡＣＡＤＭ、ＡＣＡＤＶＬ、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、脂肪酸酸化障害に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、脂肪酸酸化障害に関連する徴候及び／または症状（例えば、肝臓肥大、精神的及び身体的発達の遅延、心筋力低下、不整脈、神経損傷、肝機能異常、横紋筋融解症、ミオグロビン尿症、低血糖、代謝性アシドーシス、呼吸困難、肝腫大、筋緊張低下、心筋症不整脈）の軽減を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、グリコーゲン貯蔵疾患（例えば、１型グリコーゲン貯蔵疾患（ＧＳＤ１）、２型グリコーゲン貯蔵疾患（ポンペ病、ＧＳＤ２）を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、Ｇ６ＰＣ（ＧＳＤ１ａ）、Ｇ６ＰＴ１（ＧＳＤ１ｂ）、ＳＬＣ１７Ａ３、ＳＬＣ３７Ａ４（ＧＳＤ１ｃ）、酸性アルファ－グルコシダーゼ、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、グリコーゲン貯蔵疾患に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、グリコーゲン貯蔵疾患に関連する徴候及び／または症状（例えば、肝臓肥大、低血糖、筋力低下、筋けいれん、疲労、発育遅延、肥満、出血性障害、肝機能異常、腎機能異常、呼吸機能の異常、心機能の異常、口内炎、痛風、肝硬変、線維症、肝腫瘍）の軽減を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、カルニチンサイクル障害を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＯＣＴＮ２、ＣＰＴ１、ＣＡＣＴ、ＣＰＴ２、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、カルニチンサイクル障害に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、カルニチンサイクル障害に関連する徴候及び／または症状（例えば、低ケトン性低血糖、心筋症、筋力低下、疲労、運動発達の遅延、浮腫）の軽減を含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、尿素サイクル異常症を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＣＰＳ１、ＡＲＧ１、ＡＳＬ、ＯＴＣ、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、尿素サイクル異常症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、尿素サイクル障害に関連する徴候及び／または症状（例えば、嘔吐、悪心、行動異常、疲労、昏睡、精神病、嗜眠、周期性嘔吐、近視、高アンモニア血症、オルニチンレベルの上昇）の軽減を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、クリグラー・ナジャール症候群を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＵＧＴ１Ａ１、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、クリグラー・ナジャール症候群に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、クリグラー・ナジャール症候群に関連する徴候及び／または症状（例えば、黄疸、核黄疸、無気力、嘔吐、発熱、異常な反射、筋けいれん、強硬緊張、痙縮、筋緊張低下、アテトーゼ、ビリルビン値の上昇、下痢、ろれつが回らない、混乱、嚥下困難、発作）の軽減を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、遺伝性チロシン血症を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＦＡＨ、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、遺伝的チロシン血症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、遺伝性チロシン血症に関連する徴候及び／または症状（例えば、肝腫大、黄疸、肝疾患、肝硬変、肝癌、発熱、下痢、メレナ、嘔吐、脾腫、浮腫、凝固障害、腎機能異常、くる病、衰弱、筋緊張亢進、イレウス、頻脈、高血圧、神経学的危機、呼吸不全、心筋症）の軽減を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、表皮水疱症を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１７Ａ１、ＭＭＰ１、ＫＲＴ５、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＩＴＧＢ４、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、表皮水疱症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、表皮水疱症に関連する徴候及び／または症状（例えば、脆弱な皮膚、異常な爪の成長、水疱、肥厚した皮膚、瘢痕性脱毛症、萎縮性瘢痕、稗粒腫、歯の問題、嚥下障害、皮膚のかゆみ、及び疼痛）の減少を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、アルファ－１アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＴＤ）を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、アルファ－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、Ａ１ＡＴＤに関連する徴候及び／または症状（例えば、肺気腫、慢性咳嗽、痰生成、喘鳴、慢性呼吸器感染症、黄疸、肝臓肥大、出血、異常な体液蓄積、肝酵素の上昇、肝機能障害、門脈圧亢進症、疲労、浮腫、慢性活動性肝炎、肝硬変、肝癌、脂肪織炎）の軽減を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、ウィルソン病を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＡＴＰ７Ｂ、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、ウィルソン病に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、ウィルソン病に関連する徴候及び／または症状（例えば、疲労、食欲不振、腹痛、黄疸、カイザー・フライシャー輪、浮腫、言語障害、嚥下障害、身体的調整の喪失、制御不能な動き、筋肉の硬直、肝疾患、貧血、うつ病、統合失調症、無月経、不妊症、腎臓結石、腎尿細管損傷、関節炎、骨粗鬆症、骨棘）の軽減を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、血液疾患（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ）を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、血液疾患に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、血液疾患に関連する徴候及び／または症状（例えば、過度の出血、異常な打撲傷、関節の疼痛及び腫れ、血尿、血便、異常な鼻血、頭痛、嗜眠、嘔吐、複視、衰弱、けいれん、発作）の軽減を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、遺伝性血管浮腫を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ｉｎｈ））をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、遺伝性血管浮腫に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、遺伝性血管浮腫に関連する徴候及び／または症状（例えば、浮腫、掻痒症、蕁麻疹、悪心、嘔吐、急性腹痛、嚥下障害、発声障害、喘鳴）の軽減を含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、パーキンソン病を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ドーパミンデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ））をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、パーキンソン病に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、パーキンソン病に関連する徴候及び／または症状（例えば、振戦、運動緩慢、筋肉の硬直、姿勢及びバランスの障害、自動運動の喪失、発話の変化、書き方の変化）の軽減を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、筋疾患を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー）、Ｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチー）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、筋疾患に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、筋疾患に関連する徴候及び／または症状（例えば、動作困難、ふくらはぎの筋肉の肥大、筋肉の疼痛及び硬直、発達の遅延、学習障害、異常な歩行、側弯症、呼吸の問題、嚥下困難、不整脈、心筋症、関節機能の異常、筋緊張低下、呼吸困難、反射の欠如など）の軽減を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、ムコ多糖症（ＭＰＳ）（例えば、ＭＰＳ ＩＨ、ＭＰＳ ＩＨ／Ｓ、ＭＰＳ ＩＳ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＣ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＡ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ Ｖ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ）を処置するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ、ＩＤＳ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＨＧＳＮＡＴ、ＧＮＳ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＧＵＳＢ、ＨＹＡＬ１）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、ムコ多糖症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、ＭＰＳに関連する徴候及び／または症状（例えば、心臓異常、呼吸不規則、肝臓肥大、脾臓肥大、神経学的異常、発達遅延、再発性感染症、持続的な鼻汁、騒々しい呼吸、角膜の混濁、舌の肥大、脊椎の変形、関節の硬直、手根管、大動脈弁逆流、進行性難聴、発作、不安定な歩行、ヘパラン硫酸の蓄積、酵素欠乏、骨格及び筋肉の異常、心臓病、嚢胞、軟部組織の塊）の軽減を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＬＩＰＡ及び／またはそのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症に関連する徴候及び／または症状（例えば、嘔吐、下痢、腹部膨満、及び体重増加不良、体重減少、黄疸、発熱、石灰化、貧血、肝機能不全または肝不全、悪液質、吸収不全、胆管の問題、心疾患、脳卒中）の軽減を含む。

【0104】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、ホモシスチン血症（ＨＣＵ）を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、シスタチオニンベータ合成酵素、もしくはＣＢＳ遺伝子、ＭＴＨＦＲ、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、対象がメチオニンを代謝する能力の増大を含む。いくつかの実施形態では、処置は、ＨＣＵに関連する徴候及び／または症状（例えば、近視、知的障害、体重増加能力の欠如、弱い骨、発作、血餅）の軽減を含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、胆汁酸代謝、輸送及び／または胆汁鬱滞に関連する障害を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２、ＰＦＩＣ３、ＡＢＣＢ４、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、胆汁酸代謝、輸送及び／または胆汁鬱滞に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、胆汁酸代謝、輸送及び／または胆汁鬱滞に関連する徴候及び／または症状（例えば、掻痒、黄疸、発育障害、門脈圧亢進、肝脾腫、下痢、膵炎、肝細胞癌）の軽減を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、フェニルケトン尿症を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、フェニルアラニン加水分解酵素（ＰＡＨ）及び／またはそのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、フェニルケトン尿症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、フェニルケトン尿症に関連する徴候及び／または症状（例えば、呼気、皮膚及び／または尿のかび臭さ、発作、皮疹、小頭症、多動性、知的障害、喘息、湿疹、貧血、体重増加、腎不全、骨粗鬆症、胃炎、食道及び腎臓欠損、腎臓結石、高血圧、精神的問題、目眩）の軽減を含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、原発性高シュウ酸尿症を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＡＧＴ、ＡＧＸＴ、ＧＲＨＰＲ、ＨＯＧＡ１、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、原発性高シュウ酸尿症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、フェニルケトン尿症に関連する徴候及び／または症状（例えば、側腹部痛、シュウ酸症、腎臓結石、及び／または尿路の他の箇所、例えば膀胱もしくは尿道における結石、腎石灰化症、血尿、排尿障害、頻尿、腎疝痛、尿路閉塞、反復性尿路感染症、腎損傷、腎不全、発達障害）の軽減を含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、ポルフィリン症を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＡＬＡＤ、ＨＭＢＳ、ＵＲＯＳ、ＵＲＯＤ、ＣＰＯＸ、ＰＰＯＣＸ、ＦＥＣＨ、ＡＬＡＳ２、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、ポルフィリン症に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、ポルフィリン症に関連する徴候及び／または症状（例えば、腹痛、四肢の痛み、全身性の虚弱、嘔吐、錯乱、便秘、頻脈、血圧変動、心因性尿閉、幻覚、発作、擦り傷、発疹、皮膚ただれ、皮膚病変、むかつき、血圧上昇、錯乱）の軽減を含む。

【0109】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、抗体の産生に関連する障害（例えば、自己免疫障害）を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子（例えば、ＰＯＬＢ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＩＬ７Ｒ、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＩＲＦ５、ＰＴＰＮ２２、ＲＢＰＪ、ＲＮＸ１、ＳＴＡＴ４、及び／またはそれらのバリアント）をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、抗体の産生に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、抗体の産生に関連する徴候及び／または症状（例えば、関節の腫脹、関節のこわばり、疲労感、発熱、食欲減退、視力の問題、振戦、不安定な歩行、目眩、皮疹、病変、痛覚過敏）の軽減を含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び構築物は、分泌型タンパク質の産生に関連する障害を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置は、１つ以上の目的の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の導入を含む。いくつかの実施形態では、処置は、分泌型タンパク質の産生に関連する異常タンパク質（例えば、非機能性タンパク質）の減少を含む。いくつかの実施形態では、処置は、分泌型タンパク質の産生に関連する徴候及び／または症状の軽減を含む。

【0111】

指向的組み込み
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び構築物は、標的遺伝子座（例えば、内因性遺伝子）でペイロード（例えば、導入遺伝子及び／または機能的核酸）が組み込まれるように導く。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び構築物は、特定の細胞型の標的遺伝子座（例えば、組織特異的遺伝子座）でペイロードが組み込まれるように導く。いくつかの実施形態では、ペイロードの組み込みは、特定の組織（例えば、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、筋肉、腎臓、血管、肺）で起こる。いくつかの実施形態では、ペイロードの組み込みは、複数の組織（例えば、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、筋肉、腎臓、血管、肺）で起こる。

【0112】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び構築物は、セーフハーバー部位とみなされる標的遺伝子座（例えば、アルブミン、アポリポタンパク質Ａ２（ＡｐｏＡ２）、ハプトグロビン）にペイロードが組み込まれるように導く。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、本明細書で提供される方法及び組成物での使用に適切な任意のゲノム部位から選択され得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、対象（例えば、疾患、障害、もしくは状態に罹患していない対象、または疾患、障害、もしくは状態に罹患している対象）において高度に発現されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ペイロードの組み込みは、１つ以上の内因性遺伝子（例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子）の５’末端または３’末端で起こる。いくつかの実施形態では、ペイロードの組み込みは、１つ以上の内因性遺伝子（例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子）の５’または３’末端の間で起こる。

【0113】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び構築物は、オフターゲット組み込み（例えば、非標的遺伝子座での組み込み）を最小限に抑えて、またはそれなしに、標的遺伝子座でのペイロード組み込みを指示する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び構築物は、参照組成物または構築物と比較して（例えば、隣接する相同配列のない組成物または構築物と比較して）オフターゲット組み込みが減少した、標的遺伝子座でのペイロードの組み込みを指示する。

【0114】

いくつかの実施形態では、標的遺伝子座での導入遺伝子の組み込みにより、内因性遺伝子の発現を破壊することなくペイロードの発現が可能になる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座での導入遺伝子の組み込みにより、内因性プロモーターからのペイロードの発現が可能になる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座への導入遺伝子の組み込みは、内因性遺伝子発現を破壊する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座への導入遺伝子の組み込みは、標的細胞及び／または対象に悪影響を与えることなく（例えば、セーフハーバー部位を標的とすることによって）内因性遺伝子発現を破壊する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座での導入遺伝子の組み込みは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質、エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ）の使用を必要としない。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座での導入遺伝子の組み込みは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質、エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ）の使用により支援される。

【0115】

いくつかの実施形態では、標的遺伝子座への導入遺伝子の組み込みは、選択的利点（例えば、組織内の他の細胞と比較した複数の細胞における生存率の増大）を与える。いくつかの実施形態では、選択的利点により、導入遺伝子を発現する１つ以上の組織内の細胞の割合の増大が生じ得る。

【0116】

組成物
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供される方法及び構築物（例えば、ウイルスベクター）を使用して生成され得る。いくつかの実施形態では、組成物には、液体、固体、及び気体の組成物が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は追加の成分（例えば、希釈剤、安定剤、賦形剤、アジュバント）を含む。いくつかの実施形態では、追加の成分は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、有機酸緩衝液）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基未満）、様々なタンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン）、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、デキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム、カリウム）、及び／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））をとりわけ含み得る。いくつかの実施形態では、水性担体はｐＨ緩衝水溶液である。

【0117】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、ある範囲の用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、単回用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、複数用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、組成物はある期間にわたって提供される。いくつかの実施形態では、組成物は特定の間隔（例えば、変動する間隔、設定された間隔）で提供される。いくつかの実施形態では、用量は、剤形及び投与経路に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ｅ１１～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ｅ１１～１ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ｅ１２～１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ｅ１２～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ｅ１４～１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ以下の用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ以下の用量で提供され得る。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、特定の時間点（例えば、対象の齢）で対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、生まれたばかりの対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、新生仔期の対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、新生仔期のマウス対象は０～７日齢である。いくつかの実施形態では、新生児期のヒト対象は０日齢～１か月齢である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、７日齢～３０日齢の対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、３か月齢～１歳の対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１歳～５歳の対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、４歳～７歳の対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、５歳以上の対象に投与され得る。

【0119】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、特定の組織または器官の成長段階（例えば、推定／平均成体サイズまたは体重の百分率）を基準とする特定の時間点で対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、組織または器官（例えば、肝臓、筋肉、ＣＮＳ、肺など）が推定／平均成体サイズまたは体重の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９９％である対象に、投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、組織または器官が推定／平均成体サイズまたは体重のおよそ２０％（＋／－５％）である対象に、投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、組織または器官が推定／平均成体サイズまたは体重のおよそ５０％（＋／－５％）である対象に、投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、組織または器官が推定／平均成体サイズまたは体重のおよそ６０％（＋／－５％）である対象に、投与され得る。いくつかの実施形態では、特定の組織または器官の推定／平均成体サイズまたは体重は、当技術分野で記載がなされているように決定され得る（Ｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１９９７、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００５、及びＳｚｐｉｎｄａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１５を参照されたく、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。

【0120】

投与の経路
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、当技術分野で知られている様々な経路（例えば、非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、筋肉内、膣内、腹腔内、皮膚上、皮内、直腸、肺、骨内、経口、頬側、門脈内、動脈内、気管内、または鼻腔内）のうちのいずれか１つ（またはそれ以上）を介して対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は細胞に導入されてもよく、次いで対象（例えば、肝臓、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、肺、血液細胞）に導入される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、当技術分野で公知の送達方法（例えば、注射、カテーテル）を介して導入され得る。

【0121】

ウイルスベクターの作製方法
ウイルスベクターの作製
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶウイルスベクター）の産生は、ウイルスベクターを生成する上流ステップ（例えば、細胞ベースの培養）と、ウイルスベクターを処理する下流ステップ（例えば、精製、製剤化など）の両方を含み得る。いくつかの実施形態では、上流ステップは、細胞増殖、細胞培養、細胞トランスフェクション、細胞溶解、ウイルスベクター産生、及び／またはウイルスベクター収集のうちの１つ以上を含み得る。

【0122】

いくつかの実施形態では、下流ステップは、分離、濾過、濃縮、清澄、精製、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティー、イオン交換、疎水性、混合モード）、遠心分離（例えば、超遠心分離）、及び／または製剤化のうちの１つ以上を含み得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物及び方法は、例えば、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．１９９８及びＧｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）のものなどの参照構築物または方法と比較して、ウイルスベクター収量（例えば、ＡＡＶベクター収量）を増加させるか、複製コンピテントウイルスベクター（例えば、複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ））のレベルを低下させるか、ウイルスベクターのパッケージング効率（例えば、ＡＡＶベクターカプシドパッケージング）を改善させるか、及び／またはそれらの任意の組み合わせのために設計される。

【0124】

細胞株及びトランスフェクション試薬
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの産生は、細胞（例えば、細胞培養物）の使用を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの産生は、１つ以上の細胞株（例えば、哺乳動物細胞株）の細胞培養を使用することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの産生は、ＨＥＫ２９３細胞株またはそのバリアント（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株）の使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞は懸濁液中で増殖され得る。いくつかの実施形態では、細胞は接着細胞から構成される。いくつかの実施形態では、細胞は、動物成分（例えば、動物血清）を含まない培地中で増殖され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、無血清培地（例えば、Ｆ１７培地、Ｅｘｐｉ２９３培地）中で増殖され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの産生は、発現構築物（例えば、プラスミド）による細胞のトランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の高発現のために選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルスベクターの高いパッケージング効率（例えば、ＡＡＶベクターのカプシドパッケージング）のために選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスフェクション効率の改善のために選択される（例えば、カチオン性分子を含む化学的トランスフェクション試薬を用いて）。いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の高発現のために操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルスベクターの高いパッケージング効率（例えば、ＡＡＶベクターのカプシドパッケージング）のために操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスフェクション効率の改善のために操作される（例えば、カチオン性分子を含む化学的トランスフェクション試薬を用いて）。いくつかの実施形態では、細胞は、上記の属性のうちの２つ以上に関して操作または選択され得る。いくつかの実施形態では、細胞を１つ以上の発現構築物（例えば、プラスミド）と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のトランスフェクション試薬（例えば、脂質、ポリマー、及びカチオン性分子を含む化学的トランスフェクション試薬）及び１つ以上の発現構築物と接触される。いくつかの実施形態では、細胞を、１つ以上のカチオン性分子（例えば、カチオン性脂質、ＰＥＩ試薬）及び１つ以上の発現構築物と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞を、ＰＥＩＭＡＸ試薬及び１つ以上の発現構築物と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞を、ＦｅｃｔｏＶｉｒ－ＡＡＶ試薬及び１つ以上の発現構築物と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞を、特定の比率で１つ以上のトランスフェクション試薬及び１つ以上の発現構築物と接触させる。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬と発現構築物の比は、ウイルスベクターの産生を改善する（例えば、ベクター収量の改善、パッケージング効率の改善、及び／またはトランスフェクション効率の改善）。

【0125】

発現構築物
いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド配列（例えば、プラスミド）であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定のポリヌクレオチド配列エレメント（例えば、ペイロード、プロモーター、ウイルス遺伝子など）を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ウイルス遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント、１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子または遺伝子バリアント）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、特定のタイプの発現構築物は、ポリヌクレオチド配列エレメントの特定の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、特定のタイプの発現構築物は、ポリヌクレオチド配列エレメントの特定の組み合わせを含まない。いくつかの実施形態では、特定の発現構築物は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の両方及び／または遺伝子バリアントをコードするポリヌクレオチド配列エレメントを含まない。

【0126】

いくつかの実施形態では、発現構築物は、野生型ウイルス遺伝子（例えば、野生型ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、ウイルスヘルパー遺伝子、またはそれらの組み合わせ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ウイルスヘルパー遺伝子または遺伝子バリアント（例えば、ヘルペスウイルス遺伝子または遺伝子バリアント、アデノウイルス遺伝子または遺伝子バリアント）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上の野生型Ｒｅｐタンパク質を発現する１つ以上の遺伝子コピー（例えば、１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピーなど）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上の野生型Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ７８、またはそれらの組み合わせ）を発現する単一遺伝子コピーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上の野生型Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ７８、またはそれらの組み合わせ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、少なくとも４つの野生型Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ７８）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ７８のそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上の野生型アデノウイルスヘルパータンパク質（例えば、Ｅ２及びＥ４）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0127】

いくつかの実施形態では、発現構築物は、野生型ウイルス遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子）をコードする野性型ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、野生型ウイルス遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子）をコードする修飾ポリヌクレオチド配列（例えば、コドン最適化された）を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、修飾されたウイルス遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子）をコードする修飾ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ウイルス遺伝子は、特定の改善（例えば、形質導入の改善、組織特異性、サイズの減少、免疫応答の減少、パッケージングの改善、ｒｃＡＡＶレベルの減少など）のために設計及び／または操作される。

【0128】

様々な実施形態によれば、本明細書に開示される発現構築物は、以前の技術と比較して、可塑性及びモジュール性の向上を提供し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発現構築物は、特定の改善（例えば、ウイルスベクター収量の増加、パッケージングの増大、ｒｃＡＡＶレベルの低下など）を提供しながら、様々なポリヌクレオチド配列（例えば、異なるｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、ペイロード、ヘルパー遺伝子、プロモーターなど）の交換を可能にし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発現構築物は、様々な上流生産プロセス（例えば、異なる細胞培養条件、異なるトランスフェクション試薬など）と適合し、同時に特定の改善（例えば、ウイルスベクター収量の増加、パッケージングの増加、ｒｃＡＡＶレベルの低下など）を提供する。

【0129】

いくつかの実施形態では、異なるタイプの発現構築物は、ポリヌクレオチド配列の異なる組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つのタイプの発現構築物は、異なるタイプの発現構築物には存在しない１つ以上のポリヌクレオチド配列エレメント（例えば、ペイロード、プロモーター、ウイルス遺伝子など）を含む。いくつかの実施形態では、１つのタイプの発現構築物は、ウイルス遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）をコードするポリヌクレオチド配列エレメントと、ペイロード（例えば、導入遺伝子及び／または機能的核酸）をコードするポリヌクレオチド配列エレメントとを含む。いくつかの実施形態では、１つのタイプの発現構築物は、１つ以上のウイルス遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント及び／または１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子）をコードするポリヌクレオチド配列エレメントを含む。いくつかの実施形態では、１つのタイプの発現構築物は、１つ以上のウイルス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列エレメントを含み、ここで、ウイルス遺伝子は、１つ以上のウイルスタイプに由来する（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルスに由来する遺伝子または遺伝子バリアント）。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来のウイルス遺伝子は、遺伝子及び／または遺伝子バリアントである。いくつかの実施形態では、アデノウイルス由来のウイルス遺伝子は、Ｅ２Ａ（例えば、Ｅ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）、Ｅ４（例えば、Ｅ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ６／７）、ＶＡ及び／またはそれらのバリアントのうちの１つ以上である。

【0130】

いくつかの実施形態では、発現構築物は、（例えば、細胞培養を通じて）ウイルスベクターの産生のために使用される。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上のトランスフェクション試薬（例えば、化学的トランスフェクション試薬）と組み合わせて細胞と接触される。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上のトランスフェクション試薬と組み合わせて、特定の比率で細胞と接触される。いくつかの実施形態では、異なるタイプの発現構築物は、１つ以上のトランスフェクション試薬と組み合わせて、特定の比率（例えば、重量比）で細胞と接触される。いくつかの実施形態では、異なるタイプの発現構築物は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の比率（例えば、重量比）で細胞と接触される。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第１の発現構築物及び１つ以上のペイロードを含む第２の発現構築物は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の第２の発現構築物に対する第１の発現構築物の比（例えば、重量比）で、細胞と接触される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードを含む第１の発現構築物及び１つ以上のウイルスヘルパー遺伝子を含む第２の発現構築物は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の第２の発現構築物に対する第１の発現構築物の比（例えば、重量比）で、細胞と接触される。いくつかの実施形態では、特定の比率の発現構築物は、ＡＡＶの産生を改善する（例えば、ウイルスベクター収量の増加、パッケージング効率の増加、及び／またはトランスフェクション効率の増加）。いくつかの実施形態では、細胞を２つ以上の発現構築物と（例えば、連続的にまたは実質的に同時に）接触させる。いくつかの実施形態では、３つ以上の発現構築物が細胞と接触される。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上のプロモーター（例えば、１つ以上の外因性プロモーター）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＣＡＧ、ＥＦ１アルファ、ＰＧＫ、Ａ１ＡＴ、Ｃ５－１２、ＭＣＫ、デスミン、ｐ５、ｐ４０、もしくはそれらの組み合わせであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定のポリヌクレオチド配列エレメント（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）の上流に１つ以上のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定のポリヌクレオチド配列エレメント（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）の下流に１つ以上のプロモーターを含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、発現構築物は、細胞培養（例えば、細菌細胞培養、哺乳動物細胞培養）に必要なエレメント（例えば、選択マーカー、複製起点）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、細菌の複製起点（例えば、ｃｏｌＥ１複製起点）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上の転写終結配列（例えば、ポリＡ配列）を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ＢＧＨポリＡ、ＦＩＸポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、合成ポリＡ、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定の配列エレメント（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）の下流に１つ以上の転写終結配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定の配列エレメント（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）の上流に１つ以上の転写終結配列を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上のイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、限定されないが、ＦＩＸイントロン、アルブミンイントロン、またはそれらの組み合わせを含む、異なる起源（例えば、既知の遺伝子）の１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、異なる長さ（例えば、１３３ｂｐ～４ｋｂ）の１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定の配列エレメント（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）の上流に１つ以上のイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定の配列エレメント（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）内に１つ以上のイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、特定の配列エレメント（例えば、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子または遺伝子バリアント）の下流に１つ以上のイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、プロモーター（例えば、ｐ５プロモーター）の後に１つ以上のイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ｒｅｐ遺伝子または遺伝子バリアントの前に１つ以上のイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、プロモーターとｒｅｐ遺伝子または遺伝子バリアントとの間に１つ以上のイントロン配列を含む。

【0134】

ＡＡＶウイルスベクターを特性評価する方法
様々な実施形態によれば、ウイルスベクターは、様々な特性及び／または特徴の評価を通じて特性評価され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの評価は、生産プロセスの様々な時点で実施され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの評価は、上流の生産ステップの完了後に実施され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの評価は、下流の生産ステップの完了後に実施され得る。

【0135】

ウイルス収量
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、ウイルス収量（例えば、ウイルス力価）の評価を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または濾過前のウイルス収量の評価を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または濾過後のウイルス収量の評価を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、ウイルス収量が１ｅ１０ｖｇ／ｍＬ以上であるか否かを評価することを含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗細胞溶解物中のウイルス収量が１ｅ１１ｖｇ／ｍＬ以上であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗細胞溶解物中のウイルス収量が５ｅ１１ｖｇ／ｍＬ以上であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗細胞溶解物中のウイルス収量が１ｅ１２ｖｇ／ｍＬ以上であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗溶解物中のウイルス収量が５ｅ９ｖｇ／ｍＬと５ｅ１１ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗溶解物中のウイルス収量が５ｅ９ｖｇ／ｍＬと１ｅ１０ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗溶解物中のウイルス収量が１ｅ１０ｖｇ／ｍＬと１ｅ１１ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗溶解物中のウイルス収量が１ｅ１１ｖｇ／ｍＬと１ｅ１２ｖｇ／ｍＬの間であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、粗溶解物中のウイルス収量が１ｅ１２ｖｇ／ｍＬと１ｅ１３ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製された薬物生成物中のウイルス収量が１ｅ１１ｖｇ／ｍＬ以上であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製された薬物生成物中のウイルス収量が１ｅ１２ｖｇ／ｍＬ以上であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製された薬物生成物中のウイルス収量が１ｅ１０ｖｇ／ｍＬと１ｅ１５ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製された薬物生成物中のウイルス収量が１ｅ１１ｖｇ／ｍＬと１ｅ１５ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製された薬物生成物中のウイルス収量が１ｅ１２ｖｇ／ｍＬと１ｅ１４ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製された薬物生成物中のウイルス収量が１ｅ１３ｖｇ／ｍＬと１ｅ１４ｖｇ／ｍＬとの間であるか否かを評価することを含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、当技術分野で公知の以前の方法と比較して、同等または増加したウイルスベクター収量を提供し得る。例えば、いくつかの実施形態では、２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを産生及び／または製造するために提供される方法では、３－プラスミドシステムと比較して同等または増加したウイルスベクター収量が提供される。いくつかの実施形態では、配列エレメントの特定の組み合わせを有する２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを産生及び／または製造するために提供される方法では、配列エレメントの異なる組み合わせを有する２－プラスミドシステムと比較して、同等または増加したウイルスベクター収量が提供される。いくつかの実施形態では、特定のプラスミド比を有する２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを生成及び／または製造するために提供される方法では、異なるプラスミド比を有する２－プラスミドシステムと比較して、同等または増加したウイルスベクター収量が提供される。

【0139】

ウイルスパッケージング
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、ウイルスパッケージング効率（例えば、完全カプシド対空カプシドの割合）の評価を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または完全カプシド濃縮（例えば、塩化セシウムベースの密度勾配、イオジキサノールベースの密度勾配またはイオン交換クロマトグラフィー）前のウイルスパッケージング効率の評価を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または濾過の前にウイルスパッケージング効率が２０％以上（例えば、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）であるか否かを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または完全カプシド濃縮後のウイルスパッケージング効率の評価を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または濾過の後にウイルスパッケージング効率が５０％以上（例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）であるか否かを評価することを含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、当技術分野で公知の以前の方法と比較して、同等または増加したパッケージング効率を提供し得る。例えば、いくつかの実施形態では、２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを産生及び／または製造するために提供される方法では、３－プラスミドシステムと比較して同等または増加したパッケージング効率が提供される。いくつかの実施形態では、配列エレメントの特定の組み合わせを有する２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを産生及び／または製造するために提供される方法では、配列エレメントの異なる組み合わせを有する２－プラスミドシステムと比較して、同等または増加したパッケージング効率が提供される。いくつかの実施形態では、特定のプラスミド比を有する２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを生成及び／または製造するために提供される方法では、異なるプラスミド比を有する２－プラスミドシステムと比較して、同等または増加したパッケージング効率が提供される。

【0141】

複製コンピテントベクターレベル
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、複製コンピテントベクターのレベルの評価を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または濾過の前に複製コンピテントベクターのレベルを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、精製及び／または濾過の後に複製コンピテントベクターのレベルを評価することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの特性評価は、複製コンピテントベクターレベルが１Ｅ１０ｖｇ中の１ｒｃＡＡＶ以下であるか否かを評価することを含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、当技術分野で公知の以前の方法と比較して、同等または低減された複製コンピテントベクターレベルを提供し得る。例えば、いくつかの実施形態では、２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを産生するために提供される方法では、３－プラスミドシステムと比較して同等または低減された複製コンピテントベクターレベルが提供される。いくつかの実施形態では、配列エレメントの特定の組み合わせを有する２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含む、ウイルスベクターを産生するために提供される方法では、配列エレメントの異なる組み合わせを有する２－プラスミドシステムと比較して、同等または減少した複製コンピテントベクターレベルが提供される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを産生するために提供される方法は、ｒｅｐ遺伝子に挿入された１つ以上のイントロン配列を有する２－プラスミドトランスフェクションシステムの使用を含み、前記イントロン配列（複数可）を含まない２－プラスミドシステムと比較して、同等または低減された複製コンピテントベクターレベルを提供する。

【実施例】

【0143】

実施例１：材料及び方法
動物
動物の取扱い及びすべての実験手順は、ＬｏｇｉｃＢｉｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの実験動物委員会の指針に従って行われた。ＦｖＢまたはＣ５７ＢＬ／６動物（野生型マウスと呼ばれる）はＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、ＰＸＢ動物はＰｈｏｅｎｉｘ Ｂｉｏ（Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。試験前にすべての動物を最低５日間にわたって順化させた。試験で使用したＢ６．１２９－Ｕｇｔ１ｔｍ１Ｒｈｔｕ／Ｊマウスモデル（Ｕｇｔ１^－／－とも表示される）マウスについては以前に記載がなされた。Ｕｇｔ１^－／－マウスの繁殖用動物は、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＷＴマウスとの９回の戻し交配の後にＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。すべての動物を、１２時間の明／暗サイクルで温度（２３±３℃）及び湿度（５０％±２０％）が管理された施設に収容し、標準的な食餌及び水を自由に摂らせた。ベクター投与に関しては、釣り合いのとれた（同じ長さの）または不釣り合いな（異なる長さの）相同性アームデザインを有するｒＡＡＶベクター組成物を３ｅ１３、１ｅ１４、２ｅ１４または３Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量で動物に与えた。新生仔期の動物には側頭静脈を介して与え、小児期の動物（出生後１４日目、ＰＮＤ１４）には後眼窩注射によって与え、ＰＮＤ２８（出生後２８日目）の小児期から成体齢までの動物には外側尾静脈を介して与えた。試験中のいくつかの時点で、顔面静脈を介して血液試料を採取した。試験終了時に動物を安楽死させ、心臓穿刺によって血液試料を採取した。肝臓を採取し、瞬間冷凍した。

【0144】

光線療法
Ｕｇｔ１^－／－マウスの新生仔を生後２１日目まで、（明暗サイクルの明期間と同期した）１２時間／日にわたって青色蛍光（λ＝４５０ｎｍ、平均２５μＷ／ｃｍ２／ｎｍ、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＴＬ ２０Ｗ／５２ランプ）に曝露し、その後、通常光条件下に維持した。ランプの強度は毎月、ＩＬＴ７４高ビリルビン血症光測定器（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で計測監視されることになる。

【0145】

実施例２：不揃いな相同性アームはマウスにおける編集活性を改善し得る
本実施例は、特に、不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターがマウスモデル系における編集活性を改善し得ることを実証する。

【0146】

ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列、及び隣接する相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図１）。ウイルスベクター組成物を３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの投薬量で出生後２８日目（ＰＮＤ２８）にＣ５７Ｂｌ／６野生型マウスに投与した。融合ｍＲＮＡ及びＡＬＢ－２Ａバイオマーカーのレベルを測定してＧｅｎｅＲｉｄｅ活性を判定した。固定された肝臓試料を薄片化し、ｈＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子に対して染色して（抗体はヒトＵＧＴ１Ａ１タンパク質に対して特異的であり、内因性マウスＵＧＴ１Ａ１とは交差反応しない）、ＧｅｎｅＲｉｄｅで編集された肝細胞の存在を同定した（図２）。図２のパネルＡ及びＢに示されているのは、それぞれ１．０／１．０ベクター及び１．０／１．６ベクターで処置した動物からの代表的なＩＨＣ画像である。茶色の点は、ｈＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子を発現しているＧｅｎｅＲｉｄｅで編集された肝細胞を表す。画像を、半定量的アルゴリズム（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ）を使用して非視覚的に解析して、肝細胞編集の頻度を算出した。

【0147】

試験したベクターは、様々な長さの相同性アームを含んでいた。図２に示すように、１．０／１．６と表示されている構築物は、長さ１０００ｎｔの５’相同性アーム、及び長さ１６００ｎｔの３’相同性アームを含む。

【0148】

本開示は、特に、異なる長さの相同性アームの特定の配置が動物（例えば、マウス）における編集活性を改善し得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図２で実証されているように、不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターは、釣り合いのとれた相同性アームを含むウイルスベクターに比べて改善された編集活性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１つ以上の導入遺伝子（例えば、ＵＧＴ１Ａ１）を含み得る。

【0149】

実施例３：ウイルスベクター組成物は特定の時間点で編集活性の増大を呈示し得る
本実施例は、特に、ウイルスベクター組成物が、特定の時間点で投与された場合にマウスモデル系における編集活性を改善し得ることを、実証する。

【0150】

ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、マウスＵＧＴ１Ａ１（ｍＵＧＴ１Ａ１）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列、長さ１０００ｎｔの５’相同性アーム、及び長さ１６００ｎｔの３’相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図３）。ウイルスベクター組成物を様々な投薬量（ｖｇ／ｋｇ）で新生仔期、出生後１４日目（ＰＮＤ１４）及び出生後２８日目（ＰＮＤ２８）のＵｇｔ１^－／－マウスに投与した。融合ｍＲＮＡ及びＡＬＢ－２Ａバイオマーカーのレベルを測定して編集活性を判定した。また、マウス肝細胞をｍＵＧＴ１Ａ１で染色して（Ｕｇｔ１ ＫＯであるため、編集されていない肝細胞はｍＵＧＴ１Ａ１染色において陰性である）、ＧｅｎｅＲｉｄｅで編集された肝細胞の存在を同定した。画像を、半定量的アルゴリズム（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ）を使用して非視覚的に解析して、肝細胞編集の頻度を算出した。実験の全体を通して、ビリルビンレベル（有効性バイオマーカー）を測定した。

【0151】

ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列、長さ１３００ｎｔの５’相同性アーム、及び長さ１４００ｎｔの３’相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図９）。ウイルスベクター組成物を３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの投薬量で新生仔期（ＰＮＤ１）及び出生後１４日目（ＰＮＤ１４）のＣ５７Ｂ６マウスに投与した。マウス肝細胞をｈＵＧＴ１Ａ１で染色して、ＧｅｎｅＲｉｄｅで編集された肝細胞の存在を同定し、編集された細胞の百分率を算出した。

【0152】

本開示は、特に、ウイルスベクターが、出生後の特定の時間点（例えば、ＰＮＤ１４またはＰＮＤ２８）に投与された場合に、新生仔期の投与と比較して改善された編集活性をもたらし得ることを実証している。さらには、不揃いな相同性アームを含むウイルスベクターを特定の時間点で投与することで、遺伝子編集効率における相乗的な改善がもたらされ得る。図３で実証されているように、長さ１０００ｎｔの５’相同性アームと長さ１６００ｎｔの３’相同性アームとを有するウイルスベクターのＰＮＤ１４及びＰＮＤ２８での投与は、１２週間にわたって、編集活性を増大させ、ビリルビンのレベルを低下させた。図９に示されるように、長さ１３００ｎｔの５’相同性アームと長さ１４００ｎｔの３’相同性アームとを有するウイルスベクターの投与は、ＰＮＤ１４で投与された場合、新生仔期（ＰＮＤ１）の時間点と比較して増大した編集活性を呈した。これらの投薬時間点は、将来のヒト実験での投薬のタイミングについての情報を与えるものであり得る。なぜなら、マウス齢は、各時間点での肝臓重量の百分率に基づいてヒト年齢と相関し得るからである（図４）。

【0153】

実施例４：不揃いな相同性アームはヒトにおける編集活性を改善し得る
本実施例は、特に、不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターがヒト細胞における編集活性を改善し得ることを実証する。

【0154】

ＡＡＶ－ＬＫ０３ウイルスカプシド、ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列及び隣接する相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図１）。ウイルスベクター組成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞株（ＨｅｐＧ２）に（図５、パネルＡ）、または肝臓ヒト化ＰＸＢマウスモデルに（図５、パネルＢ）、投与した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では融合ｍＲＮＡのレベルを測定し、ＰＸＢマウス実験ではゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）組み込み率を測定した。

【0155】

試験したベクターは、様々な長さの相同性アームを含んでいた。図５に示すように、１．０／１．６と表示されている構築物は、長さ１０００ｎｔの５’相同性アーム、及び長さ１６００ｎｔの３’相同性アームを含む。

【0156】

本開示は、特に、異なる長さの相同性アームの特定の配置がヒトにおける編集活性を改善し得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図５で実証されているように、不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターは、釣り合いのとれた相同性アームを含むウイルスベクターと比較して改善された編集活性をもたらし得る。

【0157】

実施例５：不揃いな相同性アームは、異なる種をまたいで編集効率を改善し得る。
本実施例は、特に、不釣り合いな相同性アームを含む本開示のウイルスベクターが、異なる種または異なる種のモデル系（例えば、マウス及びヒト）における編集活性をもたらし得ることを実証する。

【0158】

ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列及び隣接する相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図１）。Ｕｇｔ１^－／－マウスにおける投与のためのベクターは、ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、長さ１０００ｎｔの５’相同性アーム、及び長さ１６００ｎｔの３’相同性アームを含んでいた。ヒト化ＰＸＢマウスにおける投与のためのベクターは、ＡＡＶ－ＬＫ０３カプシド、長さ１６００ｎｔの５’相同性アーム、及び長さ１０００ｎｔの３’相同性アームを含んでいた。ウイルスベクター組成物を、示された濃度（ｖｇ／ｋｇ）でＵｇｔ１^－／－またはＰＸＢマウスに投与した。ｇＤＮＡ組み込み及びＵＧＴ１Ａ１染色のレベルを測定した（図６）。

【0159】

本開示は、特に、本明細書に開示されるウイルスベクター組成物が、異なる種または異なる種のモデル系（例えば、マウス及びヒト）において同程度の編集活性をもたらし得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図６で実証されているように、不釣り合いな相同性アームの特定の配置を含むウイルスベクターは、異なる種または異なる種のモデル系（例えば、マウス及びヒト）において、改善された編集活性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ある種またはある種のモデル系における発現が最適化されたウイルスベクター組成物は、異なる種または異なる種のモデル系における発現が最適化されたウイルスベクター組成物とは異なり得る（例えば、ベクターは、異なる組み合わせの相同性アーム長を含み得る）。

【0160】

実施例６：相同性アーム長は編集活性に影響を与え得る
本実施例は、特に、ある特定の長さの相同性アームを含む本開示のウイルスベクターが編集活性をもたらし得ることを実証する。

【0161】

ヒトＡ１ＡＴ（ｈＡ１ＡＴ）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列及び隣接する相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図７、図８）。ＦｖＢ野生型マウスにおける投与のためのベクターは、図７及び図８に示されているように、ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、及び様々な長さの相同性アームを含んでいた。ウイルスベクター組成物を１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与した。ＡＬＢ－２Ａバイオマーカー（図７及び図８）及びｈＡ１ＡＴのレベルを測定した（図７）。

【0162】

本開示は、特に、相同性アームを含むウイルスベクターが、少なくとも片方の相同性アームが特定の長さ未満（例えば、７５０ｎｔ以下）である場合に、低下した編集活性を示し得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図７で実証されているように、少なくとも片方のアームが５００ｎｔ以下の長さを有している不釣り合いな相同性アームデザインは、１０００ｎｔの長さを有する釣り合いのとれた相同性アームデザインと比較して低下した編集効率を呈した。加えて、図８で実証されているように、いくつかの実施形態では、１０００ｎｔの長さを有する釣り合いのとれた相同性アームデザインは、７５０ｎｔの長さを有する釣り合いのとれた相同性アームデザインと比較して改善された編集効率を呈した。

【0163】

実施例７：相同性アームがＧＥＮＥＲＩＤＥ活性に対して及ぼす影響の比較
本実施例は、特に、ある特定の長さ（または、ある特定の長さの比率）を有する相同性アームを含む本開示のウイルスベクターが、そのような相同性アームを含まないウイルスベクターと比較して増強された編集活性をもたらし得ることを確認する。

【0164】

ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）またはＦＩＸ（ｈＦＩＸ）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列、及び隣接する相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図１０参照）。マウスにおける投与のためのベクターは、図１０に示されているように、ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、及び様々な長さの相同性アームを含んでいた。ウイルスベクター組成物を適切な投薬量で投与した。アクチンに対するＡＬＢ－２Ａバイオマーカー及び導入遺伝子（例えば、ｈＵＧＴ１Ａ１及び／またはｈＦＩＸ）のレベルの比率を測定した（図１０、パネルＡ～Ｂ）。導入遺伝子発現レベルをＡＬＢ－２Ａレベルと比較した（図１０、パネルＣ）。

【0165】

この実施例は、特に、異なる長さの相同性アームの特定の配置が、動物（例えば、マウス）における編集活性を改善し得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図１０で実証されているように、不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターは、釣り合いのとれた相同性アームを含むウイルスベクターと比較して改善された編集活性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、図１０で実証されているように、ヒトＵＧＴ１Ａ１及び／またはＦＩＸ導入遺伝子に隣接する５’側の１０００ｎｔ及び３’側の１６００ｎｔの相同性アームを含むＧｅｎｅＲｉｄｅベクターは、動物（例えば、マウス）において、釣り合いのとれた相同性アームを含むウイルスベクターと比較して改善された、（ＡＬＢ－２Ａレベル及び／または導入遺伝子（ＵＧＴ１Ａ１及び／またはＦＩＸ）発現によって測定したときの）アクチンに対する編集活性の比率をもたらし得る。

【0166】

実施例８：不揃いな相同性アームは、より高齢のマウスにおける編集活性を改善し得る
本実施例は、特に、不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターが、そのような相同性アームを含まないウイルスベクターと比較して、特定の時間点（例えば、より高齢の投薬齢）で投与された場合にマウスモデル系における編集活性を改善し得ることを確認する。

【0167】

ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、ヒトＦＩＸ（ｈＦＩＸ）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列及び隣接する相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した。マウスにおける投与のためのベクターは、図１１に示されているように、ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、及び様々な長さの相同性アームを含んでいた。３ｅ１３ｖｇ／ｋｇのウイルスベクター組成物を様々な齢のマウスに投与した。編集活性を、ＡＬＢ－２Ａバイオマーカー（例えば、ＧＥＮＥＲＩＤＥバイオマーカー）及び／または導入遺伝子発現のレベルを測定することによって判定した（図１２）。

【0168】

この実施例は、特に、不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターが、特定の出生後時点（例えば、若齢及び／または成体）で投与された場合に新生仔期の投与と比較して改善された編集活性をもたらし得ることを実証している。さらには、図１１及び図１２で実証されているように、ヒト（例えば、ＦＩＸ）導入遺伝子に隣接する５’側の１０００ｎｔ及び３’側の１６００ｎｔの相同性アームを含むウイルスベクターを特定の出生後時点（例えば、若齢及び／または成体）で投与することで、新生仔期の投与と比較して、動物（例えば、マウス）における編集効率の相乗的な改善がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、図１２で実証されているように、ヒト（例えば、ＦＩＸ）導入遺伝子に隣接する５’側の１０００ｎｔ及び３’側の１６００ｎｔの相同性アームを含むウイルスベクターを特定の出生後時点（例えば、ＰＮＤ８４）で投与することで、新生仔期の投与と比較して、動物（例えば、マウス）における投薬の少なくとも３週間後の遺伝子編集効率の改善がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、図１２で実証されているように、ヒト（例えば、ＦＩＸ）導入遺伝子に隣接する５’側の１０００ｎｔ及び３’側の１６００ｎｔの相同性アームを含むウイルスベクターを特定の出生後時点（例えば、ＰＮＤ８４）で投与することで、新生仔期の投与と比較して、動物（例えば、マウス）における投薬後の少なくとも６週間にわたる遺伝子編集効率の持続的改善がもたらされ得る。

【0169】

いくつかの実施形態では、図４に示すように、これらの投薬時点は、将来のヒト実験での投薬のタイミングについての情報を与えるものであり得る。なぜなら、マウス齢は、各時点での肝臓重量の百分率に基づいてヒト年齢と相関し得るからである。

【0170】

実施例９：不揃いな相同性アームはｉｎ ｖｉｖｏで肝機能を改善し得る
この実施例は、特に、フマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）をコードする配列に隣接する不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターが、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、１つ以上のマウスモデルにおいて）チロシン血症を治療または予防するために使用され得ることを実証する。

【0171】

材料及び方法
動物試験
ＦＡＨノックアウト（Ｆａｈ－／－、ＫＯ）及びヘテロ接合型Ｆａｈ＋／－同腹仔（ＨＥＴ）動物を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＦＲＧマウスを、Ｙｅｃｕｒｉｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。

【0172】

チロシン血症ＦＲＧマウスにおけるＧｅｎｅＲｉｄｅの概念実証（ＰｏＣ）
４週齢のＦＲＧ雄性動物を、麻酔下で後眼窩洞を介して、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇのビヒクルまたはｒＡＡＶ．ＤＪ－ＧＲ－ｈＦＡＨのどちらかで処置した。すべてのマウスを、試験開始前及び投薬の１週間後の８ｍｇ／Ｌのニチシノン（ＮＴＢＣ）の下に保ち、その後、体重減少に基づいて投薬の５週間後までを限度としてＮＴＢＣのサイクルに供し、その後、ＮＴＢＣを中断した。試験の間、動物の試料採取を顎下採血によって定期的に行い、血漿を回収してさらなる分析のために－８０℃で保存した。投薬の９及び１６週間後に終末採取を行った。屠殺時に、血漿を得るために心臓穿刺によって血液を採集した。動物から全肝臓を切り出したか、あるいは肝臓灌流を行って肝細胞を採集した。全肝臓を切り出した動物については、１枚の肝葉を１０％のホルマリンで固定し、残りを瞬間冷凍して－８０℃で保存した。翌日、ホルマリン固定された肝臓をパラフィン包埋のために７０％のエタノールへ移した。肝臓灌流の後には、単離された肝細胞を４℃で５分間にわたって３００ｘｇで遠心分離に掛け、－８０℃で保存した。

【0173】

ＦＡＨマウスにおけるＧｅｎｅＲｉｄｅの用量応答のＰｏＣ
１４日齢の小児期Ｆａｈ－／－（ＫＯ）及びＦａｈ＋／－（ＨＥＴ）動物を、麻酔科で後眼窩洞を介して、１ｅ１３、３ｅ１３または１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量のｒＡＡＶ．ＤＪ－ＧＲ－ｍＦＡＨで処置した。すべてのマウスを、試験開始前及び投薬の１週間後の８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣの下に保ち、その後、体重減少に基づいて投薬の２週間後までを限度としてＮＴＢＣのサイクルに供した。試験の間、動物の試料採取を顎下採血によって定期的に行い、血漿を回収してさらなる分析のために－８０℃で保存した。投薬の１６週間後に終末採取を行った。屠殺時に、血漿を得るために心臓穿刺によって血液を採集した。動物から肝臓灌流を行って肝細胞を採集した。灌流開始前にホルマリン固定のために１枚の肝葉を縫合して切り出した。肝臓灌流の後、単離された肝細胞を４℃で５分間にわたって３００ｘｇで遠心分離に掛け、－８０℃で保存した。翌日、ホルマリン固定された肝臓をパラフィン包埋のために７０％のエタノールへ移した。

【0174】

ＮＴＢＣとＧｅｎｅＲｉｄｅとの間で対比される肝細胞癌（ＨＣＣ）リスクの評価
Ｆａｈ－／－動物を出生時から８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣの下に維持した。４週齢の時にＦａｈ－／－動物の群を無作為に選択し、麻酔下で後眼窩洞を介して、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量のｒＡＡＶ．ＤＪ－ＧＲ－ｍＦＡＨで処置し、その後、ＮＴＢＣを中止した（ＧｅｎｅＲｉｄｅ処置群）。Ｆａｈ－／－動物の別の群を８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣの下に維持した（標準治療群）。Ｆａｈ＋／－同腹仔の第３の群は、試験に参加していたが、何ら処置を受けていなかった（ＮＴＢＣもＧｅｎｅＲｉｄｅもなし）。すべての動物の経過観察を１歳になるまで行い、ＨＣＣバイオマーカー（ＡＦＰレベル）を定期的に評価した。

【0175】

ＮＴＢＣ（標準治療）とＧｅｎｅＲｉｄｅとの間の適合性の評価
４週齢のＦａｈ－／－動物を、麻酔科で後眼窩洞を介して、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投薬量のｒＡＡＶ．ＤＪ－ＧＲ－ｍＦＡＨで処置した。すべてのマウスを、試験開始前から投薬の４週間後まで８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣの下に保ち、その後、ＮＴＢＣを８ｍｇ／Ｌに維持したか（対照）、あるいは８週間にわたって３ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌまたは０．３ｍｇ／Ｌに漸減した。試験の間、動物の試料採取を顎下採血によって定期的に行い、血漿を回収してさらなる分析のために－８０℃で保存した。屠殺時に、血漿を得るために心臓穿刺によって血液を採集した。肝臓切出しのために、１枚の肝葉を１０％のホルマリンで固定し、残りを瞬間冷凍して－８０℃で保存した。翌日、ホルマリン固定された肝臓をパラフィン包埋のために７０％のエタノールへ移した。

【0176】

肺における指向的ゲノムＤＮＡ組み込み
ゲノムＤＮＡを凍結肝臓組織から抽出し、適格な方法を用いて長範囲ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及びこれに続く定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）定量によって指向的ゲノムＤＮＡ組み込みを分析した（以下の図を参照）。長範囲ＰＣＲは、順方向プライマー（Ｆ１）及び逆方向プライマー（Ｒ１）を使用して実施した。ＰＣＲ産物を固相可逆的固定化ビーズ（ＡＢＭ，Ｇ９５０）によって浄化し、順方向プライマー（Ｆ１）、逆方向プライマー（Ｒ２）及びプローブ（Ｐ１）を使用するｑＰＣＲのための鋳型として使用した。プライマー及びプローブは、（Ｆ１）５’－ＡＴＧＴＴＣＣＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡ－３’、（Ｒ１）５’－ＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＴＴＧＧＴ－３、（Ｒ２）５’－ＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＡ－３’、（Ｐ１）５’－ＡＧＧＣＡＡＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴ－３’である。マウストランスフェリン受容体（Ｔｆｒｃ）をｑＰＣＲでの内部対照として使用した。

【化1】

【0177】

血漿アルブミン－２Ａ融合タンパク質定量
血漿中のマウスアルブミン－２Ａは、捕捉のために独自のウサギポリクローナル抗２Ａ抗体を使用し、検出のためにＨＲＰ標識ポリクローナルヤギ抗マウスアルブミン抗体（ａｂｃａｍ ａｂ１９１９５）を使用する化学発光ＥＬＩＳＡによって測定された。哺乳動物細胞に発現し、親和性精製された組換えマウスアルブミン－２Ａを使用して、マトリックス効果を考慮するための１％対照マウス血漿の標準曲線を作成した。１％の乳（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９９９９Ｓ）を含んだＰＢＳを遮断のために使用し、１％のＢＳＡをＰＢＳＴによる試料希釈のために使用した。

【0178】

血漿中の肝損傷バイオマーカーの定量
肝損傷についてのバイオマーカーとしてマウス血漿のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性及び総ビリルビンレベルを定量した。血漿ＡＬＴ活性は、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性比色アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を供給業者の指示に従って使用して定量した。血漿の総ビリルビンは、認証済みの臨床用分析器であるＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）ＢＲ２ビリルビンＳｔａｔ－Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ）を製造業者のプロトコールに従って使用して測定した。

【0179】

血漿中アルファフェトタンパク質の定量
化学発光ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコールに従って使用して血漿中アルファフェトタンパク質を定量した。

【0180】

免疫組織化学
ロボットプラットフォーム（Ｖｅｎｔａｎａ ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｕｌｔｒａ 染色モジュール、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）で免疫組織化学を実施した。組織切片（４μｍ）の脱パラフィンを行い、熱誘導抗原回復を６４分間にわたって行った。内因性ペルオキシダーゼをペルオキシダーゼ阻害剤（ＣＭ１）で８分間にわたって遮断し、その後、切片を、１：４００の希釈倍率の抗ＦＡＨ抗体（Ｙｅｃｕｒｉｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）で６０分間にわたって室温でインキュベートした。その後、ＤＩＳＣ．ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギ多量体ＲＵＯ検出システム、及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＣｈｒｏｍｏＭａｐ ＤＡＢキットＶｅｎｔａｎａ Ｃｏ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して抗原－抗体複合体を検出した。次いで、すべてのスライドをヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で対比染色し、脱水し、透明化し、デジタルスライドスキャナ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を使用する画像スキャンのために載置した。スキャンした画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して非視覚的に評価して、陽性染色の面積を定量した。
本実施例及び実施例１０に使用した例示的な配列を以下に示す：
配列番号１：ＡＡＶ－ＤＪ－ｍｈａ－ｍＦＡＨ（ＰＭ－０５５０）
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【0181】

ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、ヒトＦＡＨ（ｈＦＡＨ）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列、隣接する１０００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの５’相同性アーム及び１６００ｎｔの長さの３’相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図１３Ａ）。相同性アームは、マウスゲノムアルブミン標的組み込み部位との相補性を有するように設計された。チロシン血症のマウスモデルである４週齢のＦＲＧマウスにウイルスベクターを静脈内注射によって投与し、出生から投薬の１週間後まではＮＴＢＣ飲水（８ｍｇ／Ｌ）の下に維持した（図１３Ｂ）。投薬の１～４週間後は、ＮＴＢＣ投薬量を必要に応じて調整した（例えば、動物の体重が前の週の測定から１０％低下した場合、動物を１週間にわたって８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣ飲水のサイクルに戻した）。投薬の４週間後から屠殺時（投薬の９または１６週間後）まではＮＴＢＣ投与を中断した。

【0182】

マウスを、処置後の最長９週間にわたって循環ＧｅｎｅＲｉｄｅバイオマーカー（例えば、ＡＬＢ－２Ａのレベル）について評価し（図１３Ｃ）、（体重変化パーセントによる）身体成長について処置後の最長１６週間にわたって評価した（図１３Ｄ）。肝機能のマーカー（例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ビリルビン）も評価した（図１３Ｅ及び図１３Ｆ）。マウスを処置の９週間後（９ＷＫ；４匹の動物を採取した）及び１６週間後（１６ＷＫ；４匹の動物を採取した）に屠殺し、マウス肝臓を単離した。処置マウスのサブセットを屠殺し、肝臓試料を採取し、抗ＦＡＨ抗体による免疫組織化学染色によって分析した（図１３Ｇ）。肝臓を灌流していた処置マウスの別個のサブセット（ｎ＝２）から肝細胞を単離した。単離された肝細胞をｇＤＮＡ組み込みについて評価した（図１３Ｈ）。また、マウスからの血漿試料を、肝細胞癌（ＨＣＣ）のマーカーであるアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）の存在について、健常Ｆａｈ＋／－ヘテロ接合型（ＨＥＴ）マウスとビヒクルのみで処置したマウスとで対比して評価した（図１３Ｉ）。

【0183】

結果
この実施例は、特に、ヒトＦＡＨ（ｈＦＡＨ）をコードする配列に隣接する不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターによる処置が、遺伝性チロシン血症１（ＨＴ１）に罹患している対象において（例えば、ＦＲＧマウスモデル系において）、参照（例えば、未処置またはビヒクル）と比較して改善された肝機能をもたらし得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図１３のパネルＥ及び／またはパネルＦで実証されているように、本開示のウイルスベクターによる対象の処置は、参照（例えば、未処置またはビヒクル）と比較して、肝機能低下に関連するバイオマーカー（例えば、ＡＬＴ、ビリルビン）のレベルの低下をもたらし得る。いくつかの実施形態では、図１３のパネルＤで実証されているように、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、参照（例えば、未処置またはビヒクル）と比較して、（例えば、経時的な体重変化百分率によって測定される）正常な成長を可能にし得る、または回復させ得る。いくつかの実施形態では、図１３のパネルＩで実証されているように、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、疾患（例えば、ＨＣＣを含めたがん）に関連するバイオマーカー（例えば、ＡＦＰ）のレベルの低下をもたらし得る。いくつかの実施形態では、図１３で実証されているように、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、（例えば、肝機能のマーカーの評価によって測定される）改善された肝機能、参照（例えば、未処置またはビヒクル）と比較したときの（例えば、経時的な体重変化パーセントによって測定される）正常な成長、及び疾患（例えば、ＨＣＣを含めたがん）に関連するバイオマーカー（例えば、ＡＦＰ）の低下したレベルのうちの１つ以上をもたらし得る。

【0184】

特にこれは、図１３のパネルＨに示されるように、本開示のウイルスベクターが導入遺伝子配列（例えば、ＦＡＨ）を対象のゲノム標的部位に組み込むことができることを実証している。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列（例えば、ＦＡＨ）の組み込みは、対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の中の細胞（例えば、肝細胞）に淘汰的優位性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、特定の組織型（例えば、肝臓）の中の細胞（例えば、肝細胞）における送達された導入遺伝子（例えば、ＦＡＨ）の１０％を上回る（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％の）ゲノムＤＮＡ組み込みを可能にし得る。いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、細胞（例えば、肝細胞）の５０％超（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％など）が、送達された導入遺伝子（例えば、ＦＡＨ）を成功裏に組み込まれた細胞からなることを可能にし得る。

【0185】

実施例１０：不揃いな相同性アームは、編集された細胞がｉｎ ｖｉｖｏで選択的に速やかに増殖することを可能にし得る
本実施例は、特に、フマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）をコードする配列に隣接する不釣り合いな相同性アームを含むウイルスベクターが、ある特定の投薬量で対象（例えば、遺伝性チロシン血症１型に罹患している対象）に投与され得、ＦＡＨコード配列を成功裏に組み込まれた細胞に淘汰的優位性をもたらし得ることを、実証する。特に明記しない限り、用いた材料及び方法は上記実施例９と同様であった。

【0186】

ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、マウスＦＡＨ（ｍＦＡＨ）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列、隣接する１０００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの５’相同性アーム及び１６００ｎｔの長さの３’相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図１４のパネルＡ参照）。相同性アームは、マウスゲノムアルブミン標的組み込み部位との相補性を有するように設計された。本明細書に記載のベクターを、２週齢のＦａｈ－／－マウスに静脈内注射によって投与した（図１４、パネルＡ）。マウスには出生時からＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの投与の１週間後（３週齢）まで８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣを供給した。３～４週齢においては、前の週からの１０％の体重減少が認められた動物にのみ、８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣ飲水を供給した。４週齢から屠殺時（少なくとも１８週齢）まではＮＴＢＣ投与を中断した。Ｆａｈ－／－マウスの別の群は常に８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣ飲水で維持し、標準治療群としての役割を果たした。マウスを循環バイオマーカー（例えば、ＡＬＢ－２Ａのレベル）について処置後の最長８週間にわたって評価し（図１４、パネルＢ）、ＮＴＢＣ除去後の生存率（図１４、パネルＣ）、肝機能のマーカー（例えば、ＡＬＴ）及び毒性代謝物（例えば、スクシニルアセトン（ＳＵＡＣ））の存在を評価した（図１４のパネルＤ、及び図１４のパネルＥ）。

【0187】

ＡＡＶ－ＤＪウイルスカプシド、マウスＦＡＨ（ｍＦＡＨ）導入遺伝子、Ｐ２Ａ配列、隣接する１０００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの５’相同性アーム及び１６００ｎｔの長さの３’相同性アームを含む、ウイルスベクターを構築した（図１４、パネルＡ）。相同性アームは、マウスゲノムアルブミン標的組み込み部位との相補性を有するように設計された。本明細書に記載のベクターを、１か月齢のＦａｈ－／－マウスに静脈内注射によって投与した（図１５、パネルＡ）。マウスを出生時からＧｅｎｅＲｉｄｅベクターの投与時まで８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣで処置した。１か月齢から屠殺時（少なくとも１２か月齢）まではＮＴＢＣ投与を中断した。マウスを循環バイオマーカー（例えば、ＡＬＢ－２Ａのレベル）について少なくとも５か月齢にわたって評価し（図１５、パネルＢ）、処置後の少なくとも６か月間にわたって体重を追跡評価した（図１５、パネルＣ）。ＨＣＣリスク（ＡＦＰレベル）もこれらのマウス（少なくとも６か月齢）で評価した（図１５、パネルＤ）。

【0188】

特に、この実施例は、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症１型に罹患している対象）の処置が、細胞（例えば、肝細胞）に速やかな淘汰的優位性をもたらして、処置後４週間以内に罹患肝臓の完全な再増殖につながり得ることを、実証している。いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、処置後４週間以内に特定の組織型（例えば、肝臓）の中の細胞（例えば、肝細胞）の５０％超（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％など）が、送達された導入遺伝子（例えば、ＦＡＨ）を成功裏に組み込まれた細胞からなることを可能にし得る。いくつかの実施形態では、ある特定の用量（例えば、３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）の本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、処置後４週間以内に細胞（例えば、肝細胞）に淘汰的優位性をもたらし得る。

【0189】

特に、この実施例は、マウスＦＡＨ（ｍＦＡＨ）をコードする配列を含むウイルスベクターによる処置が、遺伝性チロシン血症１（ＨＴ１）に罹患している対象において（例えば、ＦＡＨ－／－マウスモデル系において）、参照（例えば、未処置）と比較して改善された肝機能をもたらし得ることを実証している（図１４、パネルＢ）。いくつかの実施形態では、図１４のパネルＤで実証されているように、本開示のウイルスベクターによる対象の処置は、参照（例えば、未処置）と比較して、肝機能低下に関連するバイオマーカー（例えば、ＡＬＴ）のレベルの低下をもたらし得る。いくつかの実施形態では、図１４のパネルＥで実証されているように、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、参照（例えば、未処置またはＮＴＢＣ処置）と比較して、有害な代謝物（例えば、ＳＵＡＣ）のレベルの低下をもたらし得る。

【0190】

特に、この実施例は、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置が、成体期の継続的な導入遺伝子発現を示し得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図１５のパネルＢで実証されているように、少なくとも１か月齢の対象に本開示のウイルスベクターを投与することで、投薬の少なくとも５か月後に循環バイオマーカー（例えば、ＡＬＢ－２Ａ）の継続的発現が実証された。いくつかの実施形態では、図１５のパネルＣで実証されているように、本開示のウイルスベクターで処置された対象は、参照（例えば、ＮＴＢＣ処置対象）と比較して同程度の体重を示した。

【0191】

特に、この実施例は、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置が、参照（例えば、未処置またはＮＴＢＣ処置対象）と比較してＨＣＣを低下させ得ることを実証している。いくつかの実施形態では、図１５のパネルＤで実証されているように、本開示のウイルスベクターによる対象（例えば、遺伝性チロシン血症に罹患している対象）の処置は、少なくとも６か月齢において、参照（例えば、未処置またはＮＴＢＣ処置対象）と比較して疾患（例えば、ＨＣＣを含めたがん）に関連するバイオマーカー（例えば、ＡＦＰ）のレベルの低下をもたらし得る。

【0192】

等価物
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得るであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載される通りである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6-1】

【図6-2】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図13G】

【図13H】

【図13I】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【配列表】

2024517743000001.app

【国際調査報告】